JP2013523184A - ヒトＦＧＦ受容体およびβ−ＫＬＯＴＨＯ結合性タンパク質 - Google Patents

ヒトＦＧＦ受容体およびβ−ＫＬＯＴＨＯ結合性タンパク質 Download PDF

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Abstract

本発明は、β−Ｋｌｏｔｈｏ、またはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体に関連または由来する組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発する。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合成分は、完全なヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、そのような抗体の結合断片および誘導体、ならびにβ−Ｋｌｏｔｈｏ、またはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合するポリペプチドである。他の実施形態は、そのような抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体、ならびにその断片および誘導体、ならびにポリペプチドをコードする核酸；そのようなポリヌクレオチドを含む細胞；そのような抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体、ならびにその断片および誘導体、ならびにポリペプチドの作製方法；ならびに、２型糖尿病、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎、メタボリックシンドロームおよび関連する障害または状態を患っている対象を治療または診断する方法を含む、そのような抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体、その断片および誘導体、ならびにポリペプチドの使用方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本出願は、ともに参照によりその全体が組み入れられる、２０１０年４月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／３２４，６９１号、および２０１０年１０月１３日に出願された米国特許仮出願第６１／３９２，８５９号の利益を主張する。
配列表
本出願には、ＥＦＳ−ウェブ経由で提出された配列表が含まれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。２０１０年１０月１２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は、Ａ−１５５４−ＷＯ−ＰＣＴ．ｔｘｔであり、サイズは４２１，４４３バイトである。
本開示は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と結合する抗原結合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本開示はまた、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発する、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数に結合する抗原結合タンパク質、ならびにＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発する抗原結合タンパク質を含む、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数に結合する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにそのような核酸、ポリペプチド、または医薬組成物を使用する、代謝障害の治療方法を提供する。抗原結合タンパク質を使用した診断方法もまた提供される。
繊維芽細増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３を含む繊維芽細増殖因子（ＦＧＦ）のサブファミリーに属する分泌ポリペプチドである（Itoh et al., (2004) Trend Genet. 20:563-69）。ＦＧＦ２１は、ヘパリン非依存性でありかつグルコース、脂質、およびエネルギー代謝の調節においてホルモンとして機能する点において、非定型ＦＧＦである。
ＦＧＦ２１は、肝臓および膵臓で非常に多く発現し、主として肝臓で発現する、ＦＧＦファミリーの唯一のメンバーである。ＦＧＦ２１を過剰発現しているトランスジェニックマウスは、成長率が低く、血漿グルコースおよびトリグリセリド値が低く、加齢性２型糖尿病、膵島過形成、および肥満症を発症しないという代謝表現型を示す。げっ歯類および霊長類モデルにおける組換え型ＦＧＦ２１タンパク質の薬理学的投与は、血漿グルコースの正常化、トリグリセリドおよびコレステロール値の低下、ならびに耐糖能およびインスリン感受性の改善をもたらす。さらに、ＦＧＦ２１は、エネルギー消費、身体活動性、および代謝率を増加させることにより、体重および体脂肪を減少させる。実験的研究は、ヒトにおける２型糖尿病、肥満症、脂質異常症、および他の代謝状態または障害の治療のためのＦＧＦ２１の薬理学的投与を支持している。
ＦＧＦ２１は、その受容体を活性化することにより、脂肪細胞のグルコース取り込みおよび脂質恒常性を促進する、肝臓由来の内分泌ホルモンである。興味深いことに、基準のＦＧＦ受容体に加え、ＦＧＦ２１受容体は必須補因子として膜結合性β−Ｋｌｏｔｈｏをも含む。ＦＧＦ２１受容体の活性化は、種々の代謝パラメーターに対して多様な効果をもたらす。
哺乳類においては、ＦＧＦは、４つのＦＧＦ受容体のセット、ＦＧＦＲ１〜４によりその活性を媒介し、該受容体は次に複数のスプライス変異体、例えばＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４中に発現する。各ＦＧＦ受容体は、リガンドと結合すると活性化され、ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）、ＲＡＦ１、ＡＫＴ１およびＳＴＡＴを含む下流シグナル経路へ誘導する、細胞内のチロシンキナーゼドメインを含有する（Kharitonenkov et al., (2008) BioDrugs 22:37-44）。いくつかの報告においては、ＦＧＦＲ１〜３の“ｃ”−レポータースプライス変異体は、β−Ｋｌｏｔｈｏに対して特異的親和性を示し、ＦＧＦ２１に対する内在性受容体として働き得ることが示唆されている（Kurosu et al., (2007) J. Biol. Chem. 282:26687-26695); Ogawa et al., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7437); Kharitonenkov et al., (2008) J. Cell Physiol. 215:1-7）。β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ４の両方を豊富に発現する肝臓では、ＦＧＦ２１がβ−Ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ４複合体に強く結合しているにも関わらず、ＦＧＦ２１はＭＡＰＫのリン酸化を誘発しない。３Ｔ３−Ｌ１細胞および白色脂肪組織においては、ＦＧＦＲ１は飛抜けて豊富な受容体であり、従ってこの組織中のＦＧＦ２１の主な機能性受容体がβ−Ｋｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１複合体である可能性が最も高い。
本開示は、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発する、モノクローナル抗体などのヒト（またはヒト化）抗原結合タンパク質、例えばＦＧＦ２１の機能を模倣する抗原結合タンパク質を提供する。そのような抗体は、ＦＧＦ２１様の活性および選択性を有するが、抗体に典型的な追加の治療的に望ましい特質、例えばタンパク質安定性、免疫原性の欠如、作製しやすさ、およびｉｎ ｖｉｖｏでの長い半減期などを有する分子である。
Itoh et al., (2004) Trend Genet. 20:563-69 Kharitonenkov et al., (2008) BioDrugs 22:37-44 Kurosu et al., (2007) J. Biol. Chem. 282:26687-26695 Ogawa et al., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7437 Kharitonenkov et al., (2008) J. Cell Physiol. 215:1-7
単離された抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態において、抗原結合タンパク質は以下から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む：（ａ）以下から成る群から選択される配列を含む軽鎖ＣＤＲ３：（i）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１のＣＤＲ３配列と、２つ以下のアミノ酸の付加、置換、欠失およびその組み合わせにより異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；（ii）ＭＱＡＸ１ＥＦＰＷＴ（配列番号１７４）；（iii）ＧＴＷＤＳＳＬＳＸ２ＶＸ３（配列番号１７５）；（iv）ＱＱＹＤＮＬＦＴ（配列番号１２２）；（v）ＱＱＹＧＳＡＰＬＴ（配列番号１２３）；（vi）ＶＬＹＭＧＳＧＩＷＶ（配列番号１２４）；（vii）ＥＴＷＤＳＳＬＳＡＧＶ（配列番号１２７）；ここで、Ｘ１はＬまたはＩであり；Ｘ２はＶまたはＡであり；およびＸ３はＶまたはＡである；（ｂ）以下から成る群から選択される配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列：（i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のＣＤＲ３配列と、１つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびまたはその組み合わせにより異なる重鎖ＣＤＲ３配列；（ii）ＧＷＦＤＸ６（配列番号１７８）；（iii）ＧＴＳＦＤＹ（配列番号９９）；（iv）ＹＧＧＳＦＤＹ（配列番号１００）；（v）ＭＶＹＶＬＤＹ（配列番号１０１）；（vi）ＶＡＧＰＦＤＦ（配列番号１０２）；ここで、Ｘ６はＹ、ＩまたはＦである；および（ｃ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ３配列および（ｂ）の重鎖ＣＤＲ３配列および（c）のFc配列；ここで、前記抗原結合タンパク質は、β−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する。
さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は以下を含む：（ａ）以下から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列:（i）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１のＣＤＲ１配列と２つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；（ii）ＲＳＳＱＳＬＶＸ２２ＹＸ２３ＤＧＮＴＹＬＳ（配列番号１７７）；（iii）ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号１０７）；（vi）ＱＡＳＱＤＩＮＮＹＬＮ（配列番号１０８）；（v）ＲＡＳＱＳＶＳＧＮＹＬＡ（配列番号１０９）；（vi）ＧＶＳＳＧＳＶＳＴＲＹＹＰＳ（配列番号１１０）；ここで、Ｘ２２はＨであるかまたは存在せず；およびＸ２３はＳであるかまたは存在しない；（ｂ）以下から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ２配列：（i）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１のＣＤＲ２配列と、２つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；（ii）ＫISＮＲＦＳ（配列番号１１２）；（iii）ＤＮＮＸ４ＲＰＸ５（配列番号１７６）；（iv）ＤＴＳＮＬＥＴ（配列番号１１４）；（v）ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１１５）；（vi）ＳＴＮＴＲＳＳ（配列番号１１６）；ここで、Ｘ４はＫ、ＮまたはＲであり；およびＸ５はＳであるかまたは存在しない；および（ｃ）以下から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ１配列：（i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のＣＤＲ１配列と、３つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる重鎖ＣＤＲ１配列；（ii）Ｘ１９ＹＸ２０ＭＸ２１；ここで、Ｘ１９はＡ，Ｇ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，またはＩであり；Ｘ２０はＹ，ＧまたはＡであり；およびＸ２１はＨまたはＳである；（ｄ）以下から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ２：（ｉ）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のＣＤＲ２配列と、５つ以下のアミノ酸付加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；（ii）ＷＩＮＰＸ７ＳＧＧＴＮＳＡＱＫＦＱＧ（配列番号１７９）；（iii）ＶＩＸ８Ｘ９ＤＧＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８０）；（iv）Ｘ１３ISＧＸ１４ＧＸ１５Ｘ１６ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８１）；（v）ＶＩＸ１７ＹＤＧＲＮＫＹＸ１８ＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８２）；ここで、Ｘ７はＮまたはＹであり；Ｘ８はＷまたはＧであり；Ｘ９はＦまたはＹであり；Ｘ１０はＲまたはＳであり；Ｘ１１はＮまたはＹであり；Ｘ１２はＱまたはＫであり；Ｘ１３はＡまたはＤであり；Ｘ１４はＳまたはＲであり；Ｘ１５はＶまたはＧであり；Ｘ１６はＳまたはＹであり；Ｘ１７はＷまたはＳであり；およびＸ１８はＹまたはＨである；（ｅ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１および（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２；（ｆ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１および（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１；（ｇ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；（ｈ）（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ１および（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１；（i）（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；（ｊ）（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；（ｋ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１、（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２、および（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１；（ｌ）（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２、（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１、および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；（ｍ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１、（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１、および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；または（ｎ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１、（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２、（ｃ）の重鎖ＣＤＲ２、および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；ここで、前記抗原結合タンパク質はβ−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する。
さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は以下を含む：（ａ）以下を含む軽鎖可変領域：（i）配列番号１０６〜１１１から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１配列；（ii）配列番号１１２〜１１９から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２配列；（iii）配列番号１２０〜１２７から選ばれる軽鎖ＣＤＲ3配列；および（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：（i）配列番号８３〜８８から選ばれる重鎖ＣＤＲ１配列；（ii）配列番号８９〜９７から選ばれる重鎖ＣＤＲ２配列；および（iii）配列番号９８〜１０５から選ばれる重鎖ＣＤＲ３配列；または（ｃ）（ａ）の軽鎖可変領域および（ｂ）の重鎖可変領域；ここで、前記抗原結合タンパク質はβ−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する。
さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は以下を含む：（ａ）以下から成る群から選択される軽鎖可変領域配列：（i）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１から選択される軽鎖可変領域配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸；（ii）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１の軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；（ｂ）以下から成る群より選択される重鎖可変領域配列：（i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１の重鎖可変領域配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列；（ii）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１の重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；または（ｃ）（ａ）の軽鎖可変領域および（ｂ）の重鎖可変領域；ここで前記抗原結合タンパク質はβ−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する。
別の実施形態において、請求項５に記載の単離された抗原結合タンパク質は以下のいずれかを含む：（ａ）以下から成る群から選択される軽鎖可変領域配列：配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１；（ｂ）以下から成る群から選択される重鎖可変領域配列：配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１；または（ｃ）（ａ）の軽鎖可変領域および（ｂ）の重鎖可変領域；ここで前記抗原結合タンパク質はβ−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する。
軽鎖可変領域および重鎖可変領域は以下から成る組み合わせの群から選択することができる：Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０およびＬ１１Ｈ１１；ここで前記抗原結合タンパク質はβ−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質はさらに以下を含む：（ａ）配列番号１３の軽鎖定常配列；（ｂ）配列番号１５の軽鎖定常配列；（ｃ）配列番号９の重鎖定常配列；または（ｄ）配列番号１３または配列番号１５の軽鎖定常配列；および配列番号９の重鎖定常配列。
抗原結合タンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合抗体断片、単鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体（triabody）、四重特異性抗体（tetrabody）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ｆａ’）ｘ断片、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、およびＩｇＧ４抗体、ならびにヒンジ領域に少なくとも１つの変異を有するＩｇＧ４抗体から成る群から選択され得る。
β−Ｋｌｏｔｈｏと結合する際：（ａ）参照抗体と実質的に同じＫｄでβ−Ｋｌｏｔｈｏと結合し；（ｂ）ＥＬＫ−ルシフェラーゼレポーターアッセイでの測定において、配列番号２の成熟型を含む野生型ＦＧＦ２１標準物質により誘発されるシグナル伝達の１０％以上のＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発し；（ｃ）以下から成る群から選択されるアッセイにおいて、１０ｎＭ以下のＥＣ５０のＦＧＦ２１様シグナル伝達を示し：（ｉ）ＦＧＦＲ１ｃ／β−Ｋｌｏｔｈｏを介する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え細胞ベースアッセイ；（ｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え型ＦＧＦＲ１ｃ受容体媒介レポーターアッセイにおいて、β−Ｋｌｏｔｈｏが存在する場合、ＦＧＦＲ１ｃ上で、１０ｎＭ未満のＥＣ５０のアゴニスト活性を示し；および（ｅ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え型ＦＧＦＲ１ｃ受容体媒介レポーターアッセイにおいて、β−Ｋｌｏｔｈｏが存在しない場合、ＦＧＦＲ１ｃ上で、１μＭ超のＥＣ５０のアゴニスト活性を示し；ならびに（ｆ）β−Ｋｌｏｔｈｏとの結合に関して参照抗体と競合する、抗原結合タンパク質もまた提供され；
ここで、前記参照抗体は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０およびＬ１１Ｈ１１から成る群から選択される軽鎖および重鎖可変領域配列の組み合わせを含む。
以下から成る群から選択される配列を含むポリペプチドもまた提供される：ＴＲＬＷＫＹＷＶ（配列番号１８４）；ＲＲＬＹＩＦＷＥ（配列番号１８５）；ＹＫＡＷＧＹＹＶ（配列番号１８６）；ＹＱＡＷＧＹＹＶ（配列番号１８７）；ＹＱＡＷＧＹＬＶ（配列番号１８８）；ＹＱＡＷＧＹＦＶ（配列番号１８９）；ＦＴＷＶＦＷＮＶ（配列番号１９０）；ＹＱＶＷＧＹＦＶ（配列番号１９１）；ＹＫＷＬＫＷＮＬ（配列番号１９２）；ＲＲＬＹＩＦＥＷ（配列番号１９３）；ＷＡＥＲＧＧ（配列番号１９４）；ＧＧＷＡＶＧＲＩ（配列番号１９５）；ＹＫＹＬＶＦＷＶ（配列番号１９６）；ＹＫＹＬＳＹＷＶ（配列番号１９７）；ＹＫＴＡＷＹＷＫ（配列番号１９８）；ＹＶＦＨＫＷＷＶ（配列番号１９９）；ＹＶＦＹＬＷＷＫ（配列番号２００）；ＹＲＷＬＨＷＨＶ（配列番号２０１）；ＹＫＦＬＦＷＨＡ（配列番号２０２）；ＲＲＱＷＧＦＷＶ（配列番号２０３）；ＹＳＡＷＳＦＷＶ（配列番号２０４）；ＬＡＲＷＧＦＷＶ（配列番号２０５）；ＹＤＡＷＧＹＷＶ（配列番号２０６）；ＷＲＫＹＹＨＦＷＶＳ（配列番号２０７）；ＫＲＬＹＧＬＦＷＹＤ（配列番号２０８）；ＫＫＨＷＳＳＬＦＦＥ（配列番号２０９）；ＫＡＷＰＹＳＷＥＡＶ（配列番号２１０）；ＥＷＹＣＧＶＬＦＮＣＱＱ（配列番号２１１）；ＨＦＧＣＧＶＩＦＮＣＶＳＤ（配列番号２１２）；ＷＥＬＣＡＳＧＹＧＷＣＹＬＨ（配列番号２１３）；ＡＰＳＣＫＳＹＩＧＦＧＬＹＨＣＷＤＧ（配列番号２１４）；およびＨＦＫＣＧＭＧＬＦＥＣＡＤＰ（配列番号２１５）。
ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合するペプチドを含む、抗原結合タンパク質重鎖もまた提供される。一実施形態において、抗原結合タンパク質重鎖は、以下から成る群から選択されるペプチド配列を含む：ＴＲＬＷＫＹＷＶ（配列番号１８４）；ＲＲＬＹＩＦＷＥ（配列番号１８５）；ＹＫＡＷＧＹＹＶ（配列番号１８６）；ＹＱＡＷＧＹＹＶ（配列番号１８７）；ＹＱＡＷＧＹＬＶ（配列番号１８８）；ＹＱＡＷＧＹＦＶ（配列番号１８９）；ＦＴＷＶＦＷＮＶ（配列番号１９０）；ＹＱＶＷＧＹＦＶ（配列番号１９１）；ＹＫＷＬＫＷＮＬ（配列番号１９２）；ＲＲＬＹＩＦＥＷ（配列番号１９３）；ＷＡＥＲＧＧ（配列番号１９４）；ＧＧＷＡＶＧＲＩ（配列番号１９５）；ＹＫＹＬＶＦＷＶ（配列番号１９６）；ＹＫＹＬＳＹＷＶ（配列番号１９７）；ＹＫＴＡＷＹＷＫ（配列番号１９８）；ＹＶＦＨＫＷＷＶ（配列番号１９９）；ＹＶＦＹＬＷＷＫ（配列番号２００）；ＹＲＷＬＨＷＨＶ（配列番号２０１）；ＹＫＦＬＦＷＨＡ（配列番号２０２）；ＲＲＱＷＧＦＷＶ（配列番号２０３）；ＹＳＡＷＳＦＷＶ（配列番号２０４）；ＬＡＲＷＧＦＷＶ（配列番号２０５）；ＹＤＡＷＧＹＷＶ（配列番号２０６）；ＷＲＫＹＹＨＦＷＶＳ（配列番号２０７）；ＫＲＬＹＧＬＦＷＹＤ（配列番号２０８）；ＫＫＨＷＳＳＬＦＦＥ（配列番号２０９）；ＫＡＷＰＹＳＷＥＡＶ（配列番号２１０）；ＥＷＹＣＧＶＬＦＮＣＱＱ（配列番号２１１）；ＨＦＧＣＧＶＩＦＮＣＶＳＤ（配列番号２１２）；ＷＥＬＣＡＳＧＹＧＷＣＹＬＨ（配列番号２１３）；ＡＰＳＣＫＳＹＩＧＦＧＬＹＨＣＷＤＧ（配列番号２１４）；およびＨＦＫＣＧＭＧＬＦＥＣＡＤＰ（配列番号２１５）。抗原結合タンパク質重鎖はＣＨ２ループ、ＣＨ３ループ、またはＣＨ２およびＣＨ３ループの両方を含んでもよい。様々な実施形態において、重鎖はＣＨ３ループを含み、ＣＨ３ループはペプチドを含んでもよい。他の実施形態において、重鎖はＣＨ２ループを含み、ＣＨ２ループはペプチドを含んでもよい。
さらなる別の実施形態において、抗原結合タンパク質はペプチドを含む重鎖を含んでもよく、さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質の重鎖は以下から成る群から選択される配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列を含む：（i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のＣＤＲ３配列と、１つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる重鎖ＣＤＲ３配列；（ii）ＧＷＦＤＸ６（配列番号１７８）；（iii）ＧＴＳＦＤＹ（配列番号９９）；（iv）ＹＧＧＳＦＤＹ（配列番号１００）；（v）ＭＶＹＶＬＤＹ（配列番号１０１）；（vi）ＶＡＧＰＦＤＦ（配列番号１０２）；ここで、Ｘ６はＹ、ＩまたはＦである；ここで前記抗原結合タンパク質はβ−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する。
さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質はさらに以下を含む：（ａ）以下から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ１配列：（ｉ）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のＣＤＲ１配列と３つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる、重鎖ＣＤＲ１配列；（ii）Ｘ１９ＹＸ２０ＭＸ２１；ここで、Ｘ１９はＡ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＩであり；Ｘ２０はＹ、ＧまたはＡであり；およびＸ２１はＨまたはＳである；（ｂ）以下から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ２：（i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のＣＤＲ２配列と、５つ以下のアミノ酸付加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；（ii）ＷＩＮＰＸ７ＳＧＧＴＮＳＡＱＫＦＱＧ（配列番号１７９）；（iii）ＶＩＸ８Ｘ９ＤＧＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８０）；（iv）Ｘ１３はISＧＸ１４ＧＸ１５Ｘ１６ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８１）；（v）ＶＩＸ１７ＹＤＧＲＮＫＹＸ１８ＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８２）；ここで、Ｘ７はＮまたはＹであり；Ｘ８はＷまたはＧであり；Ｘ９はＦまたはＹであり；Ｘ１０はＲまたはＳであり；Ｘ１１はＮまたはＹであり；Ｘ１２はＱまたはＫであり；Ｘ１３はＡまたはＤであり；Ｘ１４はＳまたはＲであり；Ｘ１５はＶまたはＧであり；Ｘ１６はＳまたはＹであり；Ｘ１７はＷまたはＳであり；およびＸ１８はＹまたはＨである；ここで、前記抗原結合タンパク質は、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する。別の実施形態において、抗原結合タンパク質は以下を含む：（ａ）以下を含む重鎖可変領域：（i）配列番号８３〜８８から選択される重鎖ＣＤＲ１配列；（ii）配列番号８９〜９７から選択される重鎖ＣＤＲ２配列；および（iii）配列番号９８〜１０５から選択される重鎖ＣＤＲ３配列；または、ここで前記抗原結合タンパク質はβ−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する。さらなる別の実施形態において、抗原結合タンパク質は以下を含む：（ａ）以下から成る群から選択される重鎖可変領域配列：（i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１の重鎖可変領域配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列；（ii）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１の重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；ここで前記抗原結合タンパク質は、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的結合する。単離された抗原結合タンパク質は以下を含んでもよい：（ａ）以下から成る群から選択される重鎖可変領域配列：配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１；ここで前記抗原結合タンパク質は、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的結合する。
β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する、単離された抗原結合タンパク質もまた提供される。一実施形態において、抗原結合タンパク質の重鎖は以下から成る群から選択される配列を含む：ＴＲＬＷＫＹＷＶ（配列番号１８４）；ＲＲＬＹＩＦＷＥ（配列番号１８５）；ＹＫＡＷＧＹＹＶ（配列番号１８６）；ＹＱＡＷＧＹＹＶ（配列番号１８７）；ＹＱＡＷＧＹＬＶ（配列番号１８８）；ＹＱＡＷＧＹＦＶ（配列番号１８９）；ＦＴＷＶＦＷＮＶ（配列番号１９０）；ＹＱＶＷＧＹＦＶ（配列番号１９１）；ＹＫＷＬＫＷＮＬ（配列番号１９２）；ＲＲＬＹＩＦＥＷ（配列番号１９３）；ＷＡＥＲＧＧ（配列番号１９４）；ＧＧＷＡＶＧＲＩ（配列番号１９５）；ＹＫＹＬＶＦＷＶ（配列番号１９６）；ＹＫＹＬＳＹＷＶ（配列番号１９７）；ＹＫＴＡＷＹＷＫ（配列番号１９８）；ＹＶＦＨＫＷＷＶ（配列番号１９９）；ＹＶＦＹＬＷＷＫ（配列番号２００）；ＹＲＷＬＨＷＨＶ（配列番号２０１）；ＹＫＦＬＦＷＨＡ（配列番号２０２）；ＲＲＱＷＧＦＷＶ（配列番号２０３）；ＹＳＡＷＳＦＷＶ（配列番号２０４）；ＬＡＲＷＧＦＷＶ（配列番号２０５）；ＹＤＡＷＧＹＷＶ（配列番号２０６）；ＷＲＫＹＹＨＦＷＶＳ（配列番号２０７）；ＫＲＬＹＧＬＦＷＹＤ（配列番号２０８）；ＫＫＨＷＳＳＬＦＦＥ（配列番号２０９）；ＫＡＷＰＹＳＷＥＡＶ（配列番号２１０）；ＥＷＹＣＧＶＬＦＮＣＱＱ（配列番号２１１）；ＨＦＧＣＧＶＩＦＮＣＶＳＤ（配列番号２１２）；ＷＥＬＣＡＳＧＹＧＷＣＹＬＨ（配列番号２１３）；ＡＰＳＣＫＳＹＩＧＦＧＬＹＨＣＷＤＧ（配列番号２１４）；およびＨＦＫＣＧＭＧＬＦＥＣＡＤＰ（配列番号２１５）。
さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は以下から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む：（ａ）以下から成る群から選択される配列を含む軽鎖ＣＤＲ３：（i）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１のＣＤＲ３配列と２つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；（ii）ＭＱＡＸ１ＥＦＰＷＴ（配列番号１７４）；（iii）ＧＴＷＤＳＳＬＳＸ２ＶＸ３（配列番号１７５）；（iv）ＱＱＹＤＮＬＦＴ（配列番号１２２）；（v）ＱＱＹＧＳＡＰＬＴ（配列番号１２３）；（vi）ＶＬＹＭＧＳＧＩＷＶ（配列番号１２４）；（vii）ＥＴＷＤＳＳＬＳＡＧＶ（配列番号１２７）；ここで、Ｘ１はＬまたはＩであり；Ｘ２はＶまたはＡであり；およびＸ３はＶまたはＡである；（ｂ）以下から成る群から選択される配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列：（i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のＣＤＲ３配列と１つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる重鎖ＣＤＲ３配列（ii）ＧＷＦＤＸ６（配列番号１７８）；（iii）ＧＴＳＦＤＹ（配列番号９９）；（iv）ＹＧＧＳＦＤＹ（配列番号１００）；（v）ＭＶＹＶＬＤＹ（配列番号１０１）；（vi）ＶＡＧＰＦＤＦ（配列番号１０２）；ここで、Ｘ６はＹ、ＩまたはＦである；（ｃ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ３配列および（ｂ）の重鎖ＣＤＲ３配列および（ｃ）のＦｃ配列；ここで、抗原結合タンパク質は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する。
別の実施形態において、抗原結合性タンパク質は以下のいずれかを含む：（ａ）以下から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列：（i）配列番号２７〜３７のＬ１〜Ｌ１１のＣＤＲ１配列と、２つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；（ii）ＲＳＳＱＳＬＶＸ２２ＹＸ２３ＤＧＮＴＹＬＳ（配列番号１７７）（iii）ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号１０７）；（iv）ＱＡＳＱＤＩＮＮＹＬＮ（配列番号１０８）；（v）ＲＡＳＱＳＶＳＧＮＹＬＡ（配列番号１０９）；（vi）ＧＶＳＳＧＳＶＳＴＲＹＹＰＳ（配列番号１１０）；ここで、Ｘ２２はＨであるかまたは存在せず；およびＸ２３はＳであるかまたは存在しない；（ｂ）以下から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ２配列：（i）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１のＣＤＲ２配列と、２つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる、軽鎖ＣＤＲ２配列；（ii）ＫＩＳＮＲＦＳ（配列番号１１２）；（iii）ＤＮＮＸ４ＲＰＸ５（配列番号１７６）；（iv）ＤＴＳＮＬＥＴ（配列番号１１４）；（v）ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１１５）；（vi）ＳＴＮＴＲＳＳ（配列番号１１６）；ここで、Ｘ４はＫ、ＮまたはＲであり；およびＸ５はＳであるかまたは存在しない；（ｃ）以下から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ１配列：（i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のＣＤＲ１配列と、３つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる重鎖ＣＤＲ１配列；（ii）Ｘ１９ＹＸ２０ＭＸ２１；ここで、Ｘ１９はＡ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＩであり；Ｘ２０はＹ、ＧまたはＡであり；およびＸ２１はＨまたはＳである；（ｄ）以下から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ２：（i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のＣＤＲ２配列と、５つ以下のアミノ酸付加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；（ii）ＷＩＮＰＸ７ＳＧＧＴＮＳＡＱＫＦＱＧ（配列番号１７９）（iii）ＶＩＸ８Ｘ９ＤＧＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８０）；（iv）Ｘ１３ＩＳＧＸ１４ＧＸ１５Ｘ１６ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８１）；（v）ＶＩＸ１７ＹＤＧＲＮＫＹＸ１８ＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８２）；ここで、Ｘ７はＮまたはＹであり；Ｘ８はＷまたはＧであり；Ｘ９はＦまたはＹであり；Ｘ１０はＲまたはＳであり；Ｘ１１はＮまたはＹであり；Ｘ１２はＱまたはＫであり；Ｘ１３はＡまたはＤであり；Ｘ１４はＳまたはＲであり；Ｘ１５はＶまたはＧであり；Ｘ１６はＳまたはＹであり；Ｘ１７はＷまたはＳであり；およびＸ１８はＹまたはＨである；（ｅ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１および（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２；（ｆ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１および（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１；（ｇ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；（ｈ）（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ１および（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１；（ｉ）（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；（ｊ）（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；（ｋ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１、（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２、および（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１；（ｌ）（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２、（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１、および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；（ｍ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１、（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１、および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；または（ｎ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１、（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２、（ｃ）の重鎖ＣＤＲ２、および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；ここで、前記抗原結合性タンパク質はβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する。
さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は以下を含む：（ａ）以下を含む軽鎖可変領域；（i）配列番号１０６〜１１１から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列；（ii）配列番号１１２〜１１９から選択される軽鎖ＣＤＲ２配列；（iii）配列番号１２０〜１２７から選択される軽鎖ＣＤＲ３配列；および（ｂ）以下を含む重鎖可変領域：（i）配列番号８３〜８８から選択される重鎖ＣＤＲ１配列；（ii）配列番号８９〜９７から選択される重鎖ＣＤＲ２配列；および（iii）配列番号９８〜１０５から選択される重鎖ＣＤＲ３配列；または（ｃ）（ａ）の軽鎖可変領域および（ｂ）の重鎖可変領域；ここで、前記抗原結合タンパク質は、β−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する。
さらなる別の実施形態において、抗原結合タンパク質は以下を含む：（ａ）以下から成る群から選択される軽鎖可変領域配列：（i）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１から選択される軽鎖可変領域配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するアミノ酸；（ii）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１の軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列；（ｂ）以下から成る群から選択される重鎖可変領域配列：（i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１の重鎖可変領域配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸の配列；（ii）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１の重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列；または（ｃ）（ａ）軽鎖可変領域および（ｂ）の重鎖可変領域；ここで、前記抗原結合タンパク質は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する。
さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は以下を含む：（ａ）以下から成る群から選択される軽鎖可変領域配列：配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１；（ｂ）以下から成る群から選択される重鎖可変領域配列：配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１；または（ｃ）（ａ）の軽鎖可変領域および（ｂ）の重鎖可変領域；ここで前記抗原結合タンパク質は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する。
さらなる別の実施形態において、抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域および重鎖可変領域は以下から成る組み合わせの群から選択される：Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０およびＬ１１Ｈ１１；ここで前記抗原結合タンパク質は、β−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する。
さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は以下を含む：（ａ）配列番号１３の軽鎖定常配列；（ｂ）配列番号１５の軽鎖定常配列；（ｃ）配列番号９の重鎖定常配列；または（ｄ）配列番号１３または配列番号１５の軽鎖定常配列：および配列番号９の重鎖定常配列。
実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合抗体断片、単鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体（triabody）、四重特異性抗体（tetrabody）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ｆａ’）ｘ断片、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、およびＩｇＧ４抗体、ならびにヒンジ領域に少なくとも１つの変異を有するＩｇＧ４抗体から成る群から選択され得る。
β−Ｋｌｏｔｈｏと結合する際：（ａ）参照抗体と実質的に同じＫｄでβ−Ｋｌｏｔｈｏと結合し；（ｂ）ＥＬＫ−ルシフェラーゼレポーターアッセイでの測定において、配列番号２の成熟型を含む野生型ＦＧＦ２１標準物質により誘発されるシグナル伝達の１０％以上のＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発し；（ｃ）以下から成る群から選択されるアッセイにおいて、１０ｎＭ以下のＥＣ５０のＦＧＦ２１様シグナル伝達を示し：（i）ＦＧＦＲ１ｃ／β−Ｋｌｏｔｈｏを介する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え細胞ベースのアッセイ；（ｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え型ＦＧＦＲ１ｃ受容体媒介レポーターアッセイにおいて、β−Ｋｌｏｔｈｏが存在する場合、ＦＧＦＲ１ｃ上で、１０ｎＭ未満のＥＣ５０のアゴニスト活性を示し；および（ｅ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え型ＦＧＦＲ１ｃ受容体媒介レポーターアッセイにおいて、β−Ｋｌｏｔｈｏが存在しない場合、ＦＧＦＲ１ｃ上で、１μＭ超のＥＣ５０のアゴニスト活性を示し；（ｆ）β−Ｋｌｏｔｈｏとの結合に関して参照抗体と競合する、抗原結合タンパク質もまた提供され；ここで、前記参照抗体は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、およびＬ１１Ｈ１１から成る群から選択される軽鎖および重鎖可変領域配列の組み合わせを含む。開示される抗原結合タンパク質は、治療用途に使用することができ、実施形態において、抗原結合タンパク質は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と結合した際、（ａ）動物モデルにおいて血糖を低下させ；（ｂ）動物モデルにおいて血清脂質値を低下させ；または（ｃ）（ａ）かつ（ｂ）である。
開示される抗原結合タンパク質を、その薬剤的に許容できる担体との混合物中に含む医薬組成物もまた提供される。一実施形態において、医薬組成物は、放射性同位元素、放射性核種、毒素、または治療的および化学療法的な基から成る群から選択される追加の活性薬剤を含んでもよい。
β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する抗原結合タンパク質の製造方法が提供される。一実施形態において、前記方法は、開示される宿主細胞を、前記宿主細胞が前記抗原結合タンパク質を発現することを可能にする条件下でインキュベートすることを含む。
状態を予防または治療することを、そのような治療を必要とする対象において行う方法もまた提供される。一実施形態において、前記方法は、治療的有効量の開示される医薬組成物を、前記対象に投与することを含み、ここで前記状態は血糖を下げることにより治療可能である。前記状態は、例えば２型糖尿病、肥満症、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎、心血管疾患、およびメタボリックシンドロームから選択され得る。
一般的に、血糖を下げることにより治療可能である状態を、そのような治療を必要とする対象において、予防または治療する方法。一実施形態において、前記方法は、治療的有効量の本明細書に開示される医薬組成物を、前記対象に投与することを含む。前記状態は、例えば２型糖尿病、肥満症、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎、心血管疾患、およびメタボリックシンドロームから選択され得る。
一実施形態は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と結合する抗原結合タンパク質の製造のための細胞株を含む発現系、ならびにヒトＦＧＦ２１に関連する疾患の診断および治療方法を含む。
さらに別の態様において、単離された抗原結合タンパク質は、ヒトまたは非ヒト型のβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数、例えばβ−Ｋｌｏｔｈｏ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、またはＦＧＦＲ４の細胞外の部分のうちの１つまたは複数との結合において、開示される抗原結合タンパク質と競合し得る。
一実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、２型糖尿病または他の代謝疾患を有する患者に投与する場合、血漿グルコース値を低下させ、循環トリグリセリドおよびコレステロール値を低下させ、リポ蛋白の異常を改善し、心血管の危険因子特性を実質的に改善するために有効である。
別の態様において、単離された抗原結合タンパク質は、β−Ｋｌｏｔｈｏ、例えばヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏと特異的にまたは選択的に結合し、および別の態様において、単離された抗原結合タンパク質は、β−Ｋｌｏｔｈｏ、例えばβ−Ｋｌｏｔｈｏと結合して、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発する。
別の態様において、単離された抗原結合タンパク質は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的にまたは選択的に結合し、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発する。
別の態様において、単離された抗原結合タンパク質は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的にまたは選択的に結合し、α−Ｋｌｏｔｈｏ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、またはＦＧＦＲ４とは特異的にまたは選択的に結合しない。
別の態様において、単離された抗原結合タンパク質は、β−Ｋｌｏｔｈｏ、例えばヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏ、およびＦＧＦＲ１ｃ、例えばヒトＦＧＦＲ１ｃを含む複合体と特異的にまたは選択的に結合し、および別の態様において、単離された抗原結合タンパク質は、そのような複合体と結合し、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発する。
さらなる態様において、本明細書に開示される抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸分子もまた提供される。いくつかの例において、単離された核酸分子は、制御配列に機能的に連結されている。
別の態様において、本明細書に開示される抗原結合タンパク質をコードする前述の単離された核酸分子を含む発現ベクター、および前記発現ベクターで形質転換または形質移入された宿主細胞もまた提供される。
別の態様において、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的にまたは選択的に結合する抗原結合タンパク質を作製する方法もまた提供され、抗原結合タンパク質を分泌する宿主細胞から抗原結合タンパク質を作製するステップも含まれる。
他の実施形態はさらに、患者における、ＦＧＦ２１に関連する状態を治療または予防する方法を提供し、前記方法は患者に有効量の少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質を投与することを含む。一実施形態において前記状態は糖尿病であり、別の実施形態において前記状態は肥満症であり、および別の実施形態において前記状態は脂質異常症である。
抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体もまた提供される。一実施形態において、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は以下を含む：（ａ）抗原結合成分；および（ｂ）ＦＧＦ２１成分。抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、本明細書で提供される抗原結合成分のいずれをも含んでよい。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体のＦＧＦ２１成分は、配列番号３４１の少なくとも２５個の連続した残基を含む。他の実施形態において、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体のＦＧＦ２１成分は、（ａ）配列番号３４２および（ｂ）配列番号３４３のうちの１つを含む。抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体はさらに、リンカーを含んでもよい。さらなる別の実施形態において、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は以下を含む：（ａ）抗原結合成分２Ｇ１０；および（ｂ）以下から成る群から選択されるＦＧＦ２１成分：（i）配列番号３４２；および（ii）配列番号３４３。抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の一実施形態において、抗原結合成分は、ＦＧＦ２１成分に、（Ｇ４Ｓ）３、（配列番号３３６）（Ｇ４Ｓ）６（配列番号３３７）、（Ｇ４Ｓ）９（配列番号３３８）、（Ｇ４Ｓ）１２（配列番号３３９）および（Ｇ４Ｓ）１５（配列番号３４０）から成る群から選択されるリンカーによって連結される。さらなる別の実施形態において、ＦＧＦ２１成分は、２Ｇ１０抗原結合成分の重鎖に連結されている。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の重鎖は、配列番号３１６、３２０、３２２、３２４、３２６、３１８、３２８、３３０、３３２、および３３４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。あるいは、ＦＧＦ２１成分は、２Ｇ１０抗原結合成分の軽鎖に連結されていてもよい。
提供される抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、様々な生物活性を有し得る。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、β−Ｋｌｏｔｈｏ、またはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と結合した際：（ａ）動物モデルにおいて血糖を低下させ；（ｂ）動物モデルにおいて血清脂質値を低下させ；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方であり得る。
抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合成分の軽鎖、重鎖、または両方をコードする単離された核酸もまた提供され、ここで前記配列は、配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１；配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１；ならびに配列番号３１６、３２０、３２２、３２４、３２６、３１８、３２８、３３０、３３２、および３３４から選択される。開示される核酸を含む発現ベクター、ならびに開示される核酸および前記核酸を含む発現ベクターを含む単離された細胞もまた提供される。
本明細書に開示される抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体、さらに薬剤的に許容できる担体を含む医薬組成物もまた提供される。状態を予防または治療することを、そのような治療を必要とする対象において行う方法が提供され、一実施形態においては、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体を含む治療的有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、ここで前記状態は血糖を低下させることにより治療可能である。様々な実施形態において、前記状態は２型糖尿病、肥満症、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎、心血管疾患、およびメタボリックシンドロームから選択される。
これらおよび他の態様を、本明細書においてより詳細に説明する。提供される各々の態様は、本明細書で提供される種々の実施形態を包含する。従って１つの要素または要素の組み合わせを含む実施形態のそれぞれは記載される各態様に包含され得、上述の態様および実施形態のすべてのそのような組み合わせは明示的に考慮されるものと予想される。開示される抗原結合タンパク質および関連する方法および組成物の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な記載において明白である。
図１ａ〜１ｂは、ヒトＦＧＦＲ１ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１１３６２；配列番号３０５）およびマウスＦＧＦＲ１ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３４３３６；配列番号３０６）間の配列相同性を示す配列比較であり；シグナルペプチド、膜貫通配列、ヘパリン結合領域、およびタンパク質キナーゼドメインを含む種々の特徴がハイライトされており、コンセンサス配列（配列番号３０７）が提供される。 同上 図２ａ〜２ｃは、ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿７８３８６４；配列番号３０８）およびマウスβ−Ｋｌｏｔｈｏ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿１１２４５７；配列番号３０９）間の配列相同性を示す配列比較であり；膜貫通配列および２つのグリコシルヒドロラーゼドメインを含む種々の特徴がハイライトされており、コンセンサス配列（配列番号３１０）が提供される。 同上 同上 図３は、抗原結合タンパク質を生成するために免疫原として使用されたＦＧＦ２１−Ａｌｅｘａ ６４７で染色された細胞のフローサイトメトリープロファイルであり；この図はＦＧＦ２１Ｒの発現レベル（ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏを含む複合体）およびＦＧＦ２１との結合を示す。 同上 同上 同上 同上 同上 図４は、Ｇｌｙ５リンカー（配列番号３０４）によりＩｇＧ１ Ｆｃと融合したヒトＦＧＦＲ１ｃの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む抗原結合タンパク質を生成するために使用された免疫原を示す配列（配列番号３１１）であり；ＦＧＦＲ１ｃ成分は大文字、リンカーはイタリックおよび下線、Ｆｃは小文字で記載されている。 図５は、Ｇｌｙ５リンカー（配列番号３０４）によりＩｇＧ１ Ｆｃと融合したヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む抗原結合タンパク質を生成するために使用された免疫原を示す配列（配列番号３１２）であり；β−Ｋｌｏｔｈｏ成分は大文字、リンカーはイタリックおよび下線、Ｆｃは小文字で記載されている。 図６は、抗原結合タンパク質を生成するために免疫原として使用された、ＦＧＦＲ１ｃ ＥＣＤ−Ｆｃおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ−Ｆｃを含む可溶性ＦＧＦ２１受容体複合体の作製により達成された純度を示す、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルの図である。 図７は、β−Ｋｌｏｔｈｏ結合タンパク質、１０Ｈ３、１Ａ２、１Ｂ５、３Ｂ４、９Ｄ１０、３Ｆ４、１Ｃ１０、２Ｇ１０、および８Ｆ９の等電点ｐＨの計算値を示す表である。 図８は、いくつかの開示されるβ−Ｋｌｏｔｈｏ結合タンパク質の重鎖および軽鎖において特定された構造的特徴のいくつかを示す配列比較である。配列番号２３の残基１〜１１２、配列番号２４の残基１〜１１２、配列番号２２の残基１〜１１２、配列番号１７の残基１〜１１２、配列番号２６の残基１〜１１０、配列番号２７の残基１〜１１０、配列番号３１３、配列番号２５の残基１〜１１０、および配列番号１８の残基１〜１１０として開示される、軽鎖配列。配列番号３４の残基１〜１１８、配列番号３５の残基１〜１１８、配列番号３３の残基１〜１１８、配列番号２８の残基１〜１１８、配列番号３１４、配列番号３８の残基１〜１２０、配列番号３７の残基１〜１２０、配列番号３６の残基１〜１２０、および配列番号２９の残基１〜１２０として開示される、重鎖配列。 図９Ａおよび９Ｂは、抗原結合タンパク質１Ａ２、１Ｂ５、２Ｇ１０、３Ｂ４、３Ｅ１０、３Ｆ４、８Ｆ９、９Ｄ１０および１０Ｈ３において実施された結合実験の結果を表す図であり；図９Ａはβ−Ｋｌｏｔｈｏ結合タンパク質のβ−Ｋｌｏｔｈｏとの結合を実証する結合アッセイから得た一連のトレースを示す図であり；図９Ｂは結合アッセイで得られた結合定数を示す表である。 同上 図１０は、開示されるβ−Ｋｌｏｔｈｏ結合タンパク質のいくつかを使用して実施した競合結合アッセイから得た一連のトレースを示す図である。 図１１は、β−Ｋｌｏｔｈｏ結合抗原結合タンパク質、３Ｂ４、１Ａ２、１Ｂ５、１０Ｈ３、９Ｄ１０、２Ｇ１０、３Ｆ４および８Ｆ９の結合特性を要約した表である。 図１２は、ＦＧＦＲ１ｃ結合ペプチド、Ｒｍ２６（配列番号２１１）、Ｒｍ２７（配列番号２１２）、Ｒｍ３３（配列番号２１３）、Ｒｍ３７（配列番号２１４）、Ｒｍ４０（配列番号２１５）およびＳＲ４（配列番号１８７）の配列および特性を要約した表である。 図１３は、一連の結合アッセイの結果を表す一連のプロットであり、二重特異性抗原結合タンパク質１Ａ２−Ｒｍ２６、１Ａ２−ＳＲ４、２Ｇ１０−Ｒｍ２６、２Ｇ１０−Ｒｍ４０、２Ｇ１０−ＳＲ４はヒトおよびマウス両方のβ−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃに結合し、抗原結合タンパク質１Ａ２−Ｒｍ４０および２Ｇ１０−Ｒｍ４０はヒトおよびマウス両方のβ−Ｋｌｏｔｈｏに結合し、ならびにペプチドＲｍ２６、Ｒｍ４０およびＳＲ４はヒトおよびマウスのＦＧＦＲ１ｃに結合することを実証している。 同上 図１４は、抗原結合タンパク質１Ａ２−Ｒｍ２６、１Ａ２−Ｒｍ４０、１Ａ２−ＳＲ４、２Ｇ１０−Ｒｍ２６、２Ｇ１０Ｒｍ４０、２Ｇ１０ＳＲ４、抗原結合タンパク質１Ａ２および２Ｇ１０、ならびにペプチドＲｍ２６、Ｒｍ４０、ＳＲ４およびＫＲｍ２において実施された一連のルシフェラーゼアッセイの結果を表す一連のプロットであり、二重特異性抗原結合タンパク質２Ｇ１０−ＳＲ４はβ−Ｋｌｏｔｈｏ／ＦＧＦＲ１ｃ細胞株においてアゴニスト活性を示したが、ＦＧＦＲ１ｃ細胞株においては示さなかったことを実証しており；左のパネルはｂ−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃを発現しているＡＭＩＤレポーター細胞を使用したルシフェラーゼアッセイの結果を示し、２Ｇ１０−ＳＲ４のアゴニスト活性を表しており、右のパネルはＦＧＦＲ１ｃを発現しているＡＭＩＤレポーター細胞を使用したルシフェラーゼアッセイの結果を示している。 図１５は、一連のルシフェラーゼアッセイの結果を示す一連のプロットであり、二重特異性抗原結合タンパク質２Ｇ１０−ＳＲ４は、β−Ｋｌｏｔｈｏ／ＦＧＦＲ１ｃ細胞株においてアゴニスト活性（左のパネル）およびアンタゴニスト活性（右のパネル）を示したことを実証しており；左のパネルは、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃを発現しているＡＭＩＤレポーター細胞を使用したルシフェラーゼアッセイの結果を示し、２Ｇ１０−ＳＲ４のアゴニスト活性を表しており、右のパネルは３ｎ ＭＦＧＦ２１とともにインキュベートした際、２Ｇ１０−ＳＲ４およびＳＲ４がアンタゴニスト活性を示したことを表している。 図１６は、一連の結合アッセイの結果を示すプロットであり、融合体の構造がＦＧＦ２１−リンカー−２Ｇ１０（ＮからＣ末端）残基である場合は残基１〜１６９（配列番号３４２）、または融合体の構造が２Ｇ１０−リンカー−ＦＧＦ２１（ＮからＣ末端）である場合は残基１〜１７０（配列番号３４３）のどちらかを含む欠失型ＦＧＦ２１にリンカーにより連結された、抗−β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０を含む抗原結合タンパク質融合体は、マウスβ−Ｋｌｏｔｈｏと結合することを実証している。 図１７は、一連の結合アッセイの結果を示すプロットであり、融合体の構造がＦＧＦ２１−リンカー−２Ｇ１０（ＮからＣ末端）残基である場合は残基１〜１６９（配列番号３４２）、または融合体の構造が２Ｇ１０−リンカー−ＦＧＦ２１（ＮからＣ末端）である場合は残基１〜１７０（配列番号３４３）のどちらかを含む欠失型ＦＧＦ２１にリンカーにより連結された、抗−β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０を含む抗原結合タンパク質融合体は、ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏと結合することを実証している。 図１８は、ルシフェラーゼアッセイの結果を示すプロットであり、融合体の構造がＦＧＦ２１−リンカー−２Ｇ１０（ＮからＣ末端）残基である場合は残基１〜１６９（配列番号３４２）、または融合体の構造が２Ｇ１０−リンカー−ＦＧＦ２１（ＮからＣ末端）である場合は残基１〜１７０（配列番号３４３）のどちらかを含む欠失型ＦＧＦ２１にリンカーにより連結された、抗−β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０を含む抗原結合タンパク質融合体の活性は、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃを発現しているＡＭＩＤレポーター細胞を使用したルシフェラーゼアッセイにおいて、ＦＧＦ２１が存在しない場合、ＦＧＦ２１成分に対する配向に依存し、リンカーの長さには依存しないことを実証している。 図１９は、一連のルシフェラーゼアッセイの結果を示すプロットであり、融合体の構造がＦＧＦ２１−リンカー−２Ｇ１０（ＮからＣ末端）残基である場合は残基１〜１６９（配列番号３４２）、または融合体の構造が２Ｇ１０−リンカー−ＦＧＦ２１（ＮからＣ末端）である場合は残基１〜１７０（配列番号３４３）のどちらかを含む欠失型ＦＧＦ２１にリンカーにより連結された、抗−β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０を含む抗原結合タンパク質融合体は、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃを発現しているＡＭＩＤレポーター細胞を使用したルシフェラーゼアッセイにおいて、３ｎＭ ＦＧＦ２１とともにインキュベートした際、検出可能なアンタゴニスト活性は示さないことを実証している。 図２０は、一連のルシフェラーゼアッセイの結果を示すプロットであり、融合体の構造がＦＧＦ２１−リンカー−２Ｇ１０（ＮからＣ末端）残基の場合は残基１〜１６９（配列番号３４２）、または融合体の構造が２Ｇ１０−リンカー−ＦＧＦ２１（ＮからＣ末端）である場合は残基１〜１７０（配列番号３４３）のどちらかを含む欠失型ＦＧＦ２１にリンカーにより連結された、抗−β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０を含む抗原結合タンパク質融合体が、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃを発現しているＡＭＩＤレポーター細胞を使用したルシフェラーゼアッセイにおいて、ＦＧＦ２１が存在しない状態で３ｎＭのα−Ｋｌｏｔｈｏとともにインキュベートした際、検出可能な活性を示さないことを実証している。 図２１は、一連のルシフェラーゼアッセイの結果を示すプロットであり、融合体の構造がＦＧＦ２１−リンカー−２Ｇ１０（ＮからＣ末端）残基の場合は残基１〜１６９（配列番号３４２）、または融合体の構造が２Ｇ１０−リンカー−ＦＧＦ２１（ＮからＣ末端）である場合は残基１〜１７０（配列番号３４３）のどちらかを含む欠失型ＦＧＦ２１にリンカーにより連結された、抗−β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０を含む抗原結合タンパク質融合体は、ＦＧＦＲ１ｃを発現しているがβ−Ｋｌｏｔｈｏを発現していないＡＭＩＤレポーター細胞を使用したルシフェラーゼアッセイにおいて、ＦＧＦ２１が存在しない場合、検出可能な活性は示さないことを実証している。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のためのみのものであり、記載される主題を限定するものとは解釈されない。
本明細書において特に定義されない限り、本出願に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者に一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈において特に必要とされない限り、単数の用語は複数の意味を包含し、複数の用語は単数の意味を包含するものとする。
一般に、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションとの関連において使用される用語、およびこれらの技術は公知であり、当技術分野で一般に使用されているものである。本出願の方法および技術は、特に指示がない限り、一般に当技術分野で公知の従来の方法、および本明細書全体において引用および記載される種々の一般的およびより具体的な引用文献における記載に従って実施される。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), および Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)、を参照のこと。酵素反応および精製技術は、一般に当技術分野において達成される通り、または本明細書に記載されるとおり、製造者の仕様に従って実施される。本明細書に記載される、分析化学、有機合成化学、ならびに医化学および薬化学との関連において使用される用語、ならびにこれらの実験方法および技術は、当技術分野において公知であり一般に使用されているものである。標準技術は、化学合成、化学分析、医薬品、製剤、および送達、および患者の治療のために使用され得る。
本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、したがって変化し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのみのものであり、本開示の範囲を限定することを意図してはいない。
実施例において以外、または特に指示がある場合以外において、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語で修飾されると理解されるべきである。「約」という用語は、パーセンテージと関連して使用される場合は、±５％、例えば１％、２％、３％、４％または５％を意味し得る。
定義
本明細書において使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は、特定的に明言されていない限り「１つまたは複数」を意味する。
「抗原結合タンパク質」とは、抗原に特異的に結合する部分を含み、および、抗原結合性部分が抗原結合タンパク質の抗原との結合を促進する立体構造をとることを可能にする骨格（scaffold）またはフレームワーク部分を所望により含むタンパク質である。抗原結合タンパク質の例としては、ヒト抗体、ヒト化抗体；キメラ抗体；組換え抗体；単鎖抗体；二重特異性抗体；三重特異性抗体（triabody）；四重特異性抗体（tetrabody）；Ｆａｂ断片；Ｆ（ａｂ’）２断片；ＩｇＤ抗体；ＩｇＥ抗体；ＩｇＭ抗体；ＩｇＧ１抗体；ＩｇＧ２抗体；ＩｇＧ３抗体；またはＩｇＧ４抗体、およびそれらの断片が挙げられる。抗原結合タンパク質は、例えば、移植されたＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を有する代替のタンパク質骨格または人工骨格を含んでもよい。そのような骨格としては、限定されないが、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化させるために導入された変異を含む抗体由来の骨格、および、例えば生体適合性ポリマーなどを含む完全に合成の骨格が挙げられる。例えばKorndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 53(1):121-129 (2003); Roque et al., Biotechnol. Prog. 20:639-654 (2004)を参照のこと。さらに、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）を使用することができ、フィブロネクチン成分を骨格として利用する抗体模倣体をベースにした骨格を使用することもできる。
抗原結合タンパク質は、例えば、天然の免疫グロブリンの構造などを有し得る。「免疫グロブリン」は四量体分子である。天然の免疫グロブリンにおいて、各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対から成り、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分には、主に抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変量域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒトの軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、それぞれ抗体のアイソタイプＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結されており、重鎖はさらに約１０個多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的には、Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる)を参照のこと。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。
天然の免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域により連結された、比較的保たれたフレームワーク領域（ＦＲ）という同じ一般構造を呈する。軽鎖および重鎖はともに、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４ドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当てはKabatらによるSequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991の定義に従う。所望により、代替の命名法スキーム、例えばChothiaのもの（Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; or Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883を参照のこと）などに従って、ＣＤＲを再定義することもできる。
抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、解離定数（ＫＤ）が≦１０−８Ｍである場合、その標的抗原に「特異的に結合する」と言われる。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍである場合は「高い親和性」で、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍである場合は「非常に高い親和性」で、抗原と特異的に結合する。一実施形態において、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、β−Ｋｌｏｔｈｏ（例えばヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏ）またはβ−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃもしくはＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数（例えば、ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧＦＲ１ｃ、ヒトＦＧＦＲ２ｃ、ヒトＦＧＦＲ３ｃ、またはヒトＦＧＦＲ４）と、約１０−７Ｍ〜１０−１２ＭのＫＤで結合し、さらなる別の実施形態において、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、ＫＤ≦５×１０−９Ｍで結合する。
本明細書で使用される「抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体」という用語は、以下を含むポリペプチドを意味する：（ａ）β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃもしくはＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する、本明細書で定義される「抗原結合タンパク質」を含む、抗原結合タンパク質成分；および（ｂ）ＦＧＦ２１またはその断片を含む、ＦＧＦ２１成分。β−Ｋｌｏｔｈｏポリペプチドは、例えばヒト、マウスまたはラットなど、いずれの種に由来してもよい。同様に、ＦＧＦ２１ポリペプチドは、例えばヒト、マウスまたはラットなどのいずれの種に由来してもよい。抗原結合タンパク質は、本明細書の表１〜表３および表６に記載される抗原結合タンパク質を含む、β−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合するいずれの抗原結合タンパク質を含んでもよい。
ＦＧＦ２１ポリペプチド成分は、完全長（配列番号２）または成熟型（配列番号３４１）ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の欠失型を含んでもよい。ＦＧＦ２１ポリペプチド配列は、Ｃ末端、Ｎ末端またはＣ末端の両方で切断されていてもよく、１８０個以下のアミノ酸〜２５個以上のアミノ酸長、例えば１８０、１７９、１７８、１７７、１７６、１７５，１７４、１７３、１７２、１７１、１７０、１６９、１６８、１６７、１６６、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、または２５個のアミノ酸長の範囲であってよい。
抗原結合タンパク質成分をＦＧＦ２１成分と連結するために、リンカーを使用してもよい。例えば（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｙ（配列番号３３５）の形態のリンカーなどの、いずれの簡便なリンカーを使用してもよく、ここでｘおよびｙは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上である。リンカーの具体例としては、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号３３６）、（Ｇ４Ｓ）６（配列番号３３７）、（Ｇ４Ｓ）９（配列番号３３８）、（Ｇ４Ｓ）１２（配列番号３３９）、および（Ｇ４Ｓ）１５（配列番号３４０）が挙げられる。
抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の具体例としては、ヒトＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）３−２Ｇ１０（配列番号３１６）、ヒトＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）６−２Ｇ１０（配列番号３２０）、ヒトＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）９−２Ｇ１０（配列番号３２２）、ヒトＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）１２−２Ｇ１０（配列番号３２４）、ヒトＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）１５−２Ｇ１０（配列番号３２６）、２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）３−ヒトＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号３１８）、２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）６−ヒトＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号３２８）、２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）９−ヒトＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号３３０）、２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）１２−ヒトＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号３３２）、および２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）１５−ヒトＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号３３４）が挙げられる。
融合体のＦＧＦ２１成分は、抗原結合成分の重鎖もしくは軽鎖Ｎ末端、または抗原結合成分の重鎖Ｃ末端のどちらかにおいて、融合体の抗原結合成分に連結され得る。２つの成分は、リンカー配列により連結されてもよく、または直接融合されていてもよい。融合体は、所望より、非哺乳類の発現系における発現の結果導入され得るＮ末端メチオニンを含んでもよい。
「抗体」とは、特に指示がない限り、特異的な結合に対してインタクトな抗体と競合する、インタクトな免疫グロブリンまたはその抗原結合性部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的開裂により作製することができる。抗原結合部分には、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体（triabodies）、四重特異性抗体（tetrabodies）、およびポリペプチドに特異的抗原結合性を与えるのに十分な、免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが含まれる。
Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価の断片であり；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を有する二価の断片であり；Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１領域を有し；Ｆｖ断片は抗体の１本のアームのＶＬおよびＶＨドメインを有し；およびｄＡｂ断片は、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、またはＶＨまたはＶＬドメインの抗原結合断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号、同６，６９６，２４５号、米国特許出願公開第０５／０２０２５１２号、同０４／０２０２９９５号、同０４／００３８２９１号、同０４／０００９５０７号、同０３／００３９９５８号、Ward et al., Nature 341:544-546 (1989))。
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域が、リンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）により連結されて連続したタンパク質鎖を形成している抗体であり、前記リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体に折り重なって一価の抗原結合部位を形成するのに十分な長さである（例えばBird et al., Science 242:423-26 (1988)およびHuston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83 (1988)を参照のこと）。二重特異性抗体は、２つのポリペプチド鎖を含む二価の抗体であり、各ポリペプチド鎖はリンカーにより連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含み、前記リンカーは同一の鎖上の２つのドメイン間で対形成を可能にするには短すぎるために、各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対形成することを可能にする（例えばHolliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)、およびPoljak et al., Structure 2:1121-23 (1994)を参照のこと）。二重特異性抗体の２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対形成の結果生じる二重特異性抗体は２つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、２つの異なる抗原結合部位を有する二重特異性抗体を作製することができる。同様に、三重特異性抗体（triabodies）および四重特異性抗体（tetrabodies）は、同じであっても違ってもよい、それぞれ３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ３つおよび４つの抗原結合部位を形成する抗体である。
所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、KabatらのSequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991に記載されるシステムを使用して特定することができる。１つまたは複数のＣＤＲを、共有結合または非共有結合によって分子中に組み込むことにより、分子を抗原結合タンパク質にすることができる。抗原結合タンパク質は、より大きなポリペプチド鎖の部分としてＣＤＲを組み込むことができ、ＣＤＲを共有結合により別のポリペプチド鎖に結合させることができ、またはＣＤＲを非共有結合により組み込むことができる。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が、特定の目的の抗原と特異的に結合することを可能にする。
抗原結合タンパク質は、１つまたは複数の結合部位を有し得る。１つ以上の結合部位が存在する場合、結合部位は互いに同一であっても異なっていてもよい。例えば、天然のヒト免疫グロブリンは一般的に２つの同一の結合部位を有し、一方「二重特異性」または「二機能性」抗体は２つの異なる結合部位を有する。
「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列由来の１つまたは複数の可変領域および定常領域を有する全ての抗体を包含する。一実施形態において、全ての可変領域および定常領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全なヒト抗体）。これらの抗体は、以下にその例が記載される種々の方法によって作製することができ、それらにはヒト重鎖および／または軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するよう遺伝的に改変されたマウスの目的抗原で免疫化することによる方法が含まれる。
ヒト化抗体は、ヒト対象に投与された際、非ヒト種抗体と比較して、ヒト化抗体が免疫応答をより誘発しにくいような、および／またはより重篤でない免疫応答を誘発するような、非ヒト種由来の抗体の配列と１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または付加により異なっている配列を有する。一実施形態において、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常領域中のあるアミノ酸が、ヒト化抗体を生成するように、変異している。別の実施形態において、ヒト抗体由来の定常領域が、非ヒト種の可変領域に融合する。別の実施形態において、非ヒト抗体の１つまたは複数のＣＤＲ配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基が、ヒト対象に投与された際、非ヒト抗体の、可能性のある免疫原性を減少させるように変化しており、変化したアミノ酸残基は、その抗原に対する抗体の免疫特異的結合において決定的でないか、またはアミノ酸配列に起こされた変化が、抗原に対するヒト化抗体の結合が抗原に対する非ヒト抗体の結合よりも有意に悪化していないような保存的変化であるかのどちらかである。ヒト化抗体を生成する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同５，８８６，１５２号および同５，８７７，２９３号に記載されている。
「キメラ抗体」という用語は、１つの抗体由来の１つまたは複数の領域および１つまたは複数の他の抗体由来の１つまたは複数の領域、例えばＣＤＲまたはＣＨ２、ＣＨ３、またはＦｃ領域などを含有する抗体を指す。一実施形態において、ＣＤＲのうちの１つまたは複数は、ヒトまたはマウスのβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と結合するヒト抗体に由来する。別の実施形態において、全てのＣＤＲは、ヒトまたはマウスのβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と結合するヒト抗体に由来する。別の実施形態において、ヒトまたはマウスのβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と結合する１つ以上のヒト抗体由来のＣＤＲは、キメラ抗体中で組み合わされる。例えば、キメラ抗体は、ヒトまたはマウスのβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と結合する第１ヒト抗体軽鎖由来のＣＤＲ１、ヒトもしくはマウスβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と結合する第２ヒト抗体軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはヒトもしくはマウスβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と結合する第３ヒト抗体の重鎖由来のＣＤＲを含んでもよく、これらは、さらに別の抗体または別の抗体源由来のＣＨ２、ＣＨ３またはＦｃ領域に連結され得る。さらに、フレームワーク領域は、ヒトまたはマウスβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と結合する同一の抗体のうちの１つ、ヒト抗体などの１つまたは複数の異なる抗体、またはヒト化抗体に由来し得る。キメラ抗体の１つの例において、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種由来の抗体、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体と同一であるか、相同であるか、またはその抗体に由来し、一方、鎖の残りの部分は、別の種由来の抗体、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属す抗体または複数の抗体と同一であるか、相同であるか、またはその抗体に由来する。所望の生物活性（例えば、β−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する能力）を示す、そのような抗体の断片もまた含まれる。
「軽鎖」という用語には、完全長の軽鎖、および結合特異性を与えるのに十分な可変量域配列を有するそれらの断片が包まれる。完全長の軽鎖には、可変量域ドメインＶＬ、および定常領域ドメインＣＬが含まれる。軽鎖の可変量域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖には、カッパ鎖およびラムダ鎖が含まれる。
「重鎖」という用語には、完全長の重鎖、および結合特異性を与えるのに十分な可変量域配列を有するそれらの断片が含まれる。完全長の重鎖には、可変量域ドメインＶＨ、および３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３が含まれる。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ポリペプチドのカルボキシ末端に最も近いところにあるのはＣＨ３である。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む、いずれのアイソタイプのものであってもよい。
本明細書で使用される、抗原結合タンパク質、例えば抗体または免疫グロブリン鎖（重鎖または軽鎖）などの「免疫学的に機能的な断片」（または単に「断片」）という用語は、完全長の鎖中に存在する少なくともいくつかのアミノ酸を欠いているが抗原と特異的に結合することが可能な抗体の一部（その部分がどのように入手されたかまたは合成されたかに関わらず）を含む、抗原結合タンパク質である。そのような断片は、特異的に標的抗原と結合し、所定のエピトープに対する特異的結合において、インタクトな抗体を含む他の抗原結合タンパク質と競合するという点において、生物学的に活性である。一態様において、そのような断片は、完全長の軽鎖または重鎖に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持し、いくつかの実施形態においては、単一の重鎖および／または軽鎖またはその部分を含む。これらの生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ技術により作製することができ、またはインタクトな抗体を含む抗原結合タンパク質の酵素的または化学的開裂により作製することができる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および単鎖抗体が含まれ、限定されないがヒト、マウス、ラット、ラクダ類またはウサギを含むいずれの哺乳類起源に由来してもよい。本明細書に開示される抗原結合タンパク質の機能性部分、例えば１つまたは複数のＣＤＲを、第二のタンパク質または小分子と共有結合させることにより、二機能性の治療特性を有するかまたは延長された血清半減期を有する、体内の特定の標的を対象とする治療薬を作製し得るということが、さらに考慮される。
「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、１つまたは２つの重鎖断片を含み、および抗体のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含んでもよい。２つの重鎖断片が存在する場合、２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合により、およびＣＨ３ドメインの疎水性の相互座用により連結されている。Ｆｃ領域は天然起源（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ等に由来するＦｃ領域）であってもよく、または天然の重鎖断片またはＦｃ配列を構成する断片に導入された、１つまたは複数の（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等）変異、欠失または挿入を含む操作された配列であってもよい。
「Ｆａｂ’断片」は、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されＦ（ａｂ’）２分子を形成し得るように、１つの軽鎖、ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン、さらにＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の領域を含む１つの重鎖の一部を含む。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、２つの軽鎖、ならびにＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の定常領域の一部を含む２つの重鎖を含む。従ってＦ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合により連結されている２つのＦａｂ’断片から成る。
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変量域を含むが、定常領域を欠いている。
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変量域または軽鎖の可変量域のみを含有する、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。いくつかの例において、２つ以上のＶＨ領域は、ペプチドリンカーで共有結合により連結され、二価のドメイン抗体を生成する。二価のドメイン抗体２つのＶＨ領域は、同一のまたは異なる抗原を標的とし得る。
「二価の抗原結合タンパク質」または「二価の抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの例において、２つの結合部位は、同一の抗原特異性を有する。二価の抗原結合タンパク質および二価の抗体は、二重特異性であり得る。例えば下記を参照のこと。
「多選択性抗原結合タンパク質」または「多選択性抗体」は、２つ以上の抗原またはエピトープを標的とするものである
「二重特異性」または「二機能性」抗原結合タンパク質または抗体とは、それぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。二重特異性抗原結合タンパク質および抗体は、多選択性抗原結合タンパク質または多選択性抗体の一種であり、限定されないが、ハイブリドーマの融合、ＦｃとＦａｂ’断片の結合またはＦａｂ’断片同士の結合などを含む、種々の方法により作製することができる。例えばSongsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553を参照のこと。二重特異性抗原結合タンパク質または抗体の２つの結合部位は、同一または異なるタンパク質標的上に存在し得る、２つの異なるエピトープと結合する。
「ＦＧＦ２１様シグナル伝達」および「ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発する」という用語は、本開示の抗原結合タンパク質（二重特異性抗原結合タンパク質を含む）に対して使用される場合、抗原結合タンパク質が、ＦＧＦ２１のＦＧＦ受容体（例えばＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃまたはＦＧＦＲ４）およびβ−Ｋｌｏｔｈｏとの結合により誘発されるｉｎ ｖｉｖｏの生物学的効果を模倣または調節すること、およびそれ以外においてはＦＧＦ２１のＦＧＦ受容体（例えばＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、またはＦＧＦＲ４）およびβ−Ｋｌｏｔｈｏとの結合によりｉｎ ｖｉｖｏで生じる生物学的応答を誘発することを意味する。例えば抗体または免疫学的に機能的なその断片などの、抗原結合タンパク質の結合性および特異性および生物学的応答の誘発の評価において、抗体または断片は、その応答が、配列番号２の成熟型を含む野生型ＦＧＦ２１標準物質（すなわち、ヒトＦＧＦ２１配列の成熟型）の活性の５％以上である場合、および好ましくは１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上である場合、および以下の特性を有する場合、生物学的応答を誘発するとみなされる：（１）実施例５および１１の、組換え型ＦＧＦ２１受容体媒介ルシフェラーゼ−レポーター細胞アッセイ、および（２）実施例５および１１の、組換え型ＦＧＦ２１受容体媒介細胞アッセイでのＥＲＫ−リン酸化；において、ＦＧＦ２１標準物質の５％以上の有効性レベルと、１００ｎＭ以下、例えば９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、または１０ｎＭのＥＣ５０を示す。抗原結合タンパク質の「効力」とは、以下のアッセイにおいて、抗原結合タンパク質の１００ｎＭ以下、例えば９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、および好ましくは１０ｎＭ未満のＥＣ５０を示すことと定義される：（１）実施例５および１１の、組換え型ＦＧＦ２１受容体媒介ルシフェラーゼ−レポーター細胞アッセイおよび（２）実施例５および１１の、組換え型ＦＧＦ２１受容体媒介細胞アッセイでのＥＲＫ−リン酸化。
本開示の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体のうちのいくつかは、治療的に適用可能なレベルではＦＧＦ２１を介するシグナル伝達を誘発しないこともあり、またこの特徴がすべての状況において必ずしも望ましくはないということが、留意される。それにもかかわらず、ＦＧＦ２１を介するシグナル伝達を誘発しない抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、本開示の態様を形成し、診断用の試薬または他の用途において有用であり得る。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語には、一本鎖および二本鎖ヌクレオチドポリマーの両方が含まれる。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはどちらかの型のヌクレオチドの改変形態であってもよい。前記改変には、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体などの塩基改変、２’,３’−ジデオキシリボースなどのリボース改変、およびホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、ホスホロセレノ酸、ホスホロジセレノ酸、ホスホロアニロチオ酸、ホスホラニラド酸およびホスホロアミド酸などの、ヌクレオチド間結合の改変が含まれる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００個以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子の作成において使用するために、一本鎖または二本鎖であってよい。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのための、放射標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識を含む標識を含んでもよい。オリゴヌクレオチドを、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニング用プライマー、またはハイブリダイゼーション・プローブとして使用してもよい。
「単離された核酸分子」とは、単離されたポリヌクレオチドが天然に存在するポリヌクレオチドのすべてまたは一部と関連していないか、または天然では結合していないポリヌクレオチドに結合している、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成起源の、またはそれらのいくつかの組合せのＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本開示の目的において、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」とは、インタクトな染色体を包含しないということを理解するべきである。指定の核酸配列「を含む」単離された核酸分子は、指定の配列に加え、最大１０または最大２０もの他のタンパク質のコード配列またはその部分を含んでもよく、または記載の核酸配列のコード領域の発現を制御する、機能的に連結された制御配列を含んでもよく、および／またはベクター配列を含んでもよい。
特に指示がない限り、本明細書で論じられるいずれの一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の端は５’末端であり；二重鎖ポリヌクレオチド配列の左側の方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’付加の方向は、転写方向と呼ばれ；ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５'末端に対して５'側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と呼ばれ；ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の３'末端に対して３'側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
「制御配列」という用語は、それが結合しているコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼし得るポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物の制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み得る。例えば、真核生物の制御配列は、転写因子のための１つまたは複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、および転写終結配列を含み得る。「制御配列」はリーダー配列および／または融合パートナー配列を含み得る。
「ベクター」という用語は、タンパク質をコードする情報を宿主細胞に伝達するために使用される、あらゆる分子または実体（例えば核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
「発現ベクター」または「発現構築体」という用語は、宿主細胞の形質転換に好適であり、そこに機能的に連結された１つまたは複数の異種のコード領域の発現を指示および／または制御する（宿主細胞とともに）核酸配列を含むベクターを指す。発現構築体は、限定されないが、転写、翻訳に影響を及ぼすかまたは制御し、および、イントロンが存在する場合は、そこに機能的に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含み得る。
本明細書に使用される「機能的に連結された」とは、この用語が適用される成分が、好適な条件下で、それら固有の機能を果たすことを可能にする関係にあることを意味する。例えば、タンパク質のコード配列に「機能的に連結された」ベクター中の制御配列は、タンパク質のコード配列の発現が、制御配列の転写活性と適合する条件下において達成されるように、そこに結合している。
「宿主細胞」という用語は、核酸配列により形質転換されたか、または形質転換され得、それによって目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。該用語は、親細胞の子孫がその形態または遺伝的構造において起源の親細胞と同一であるか否かに関わらず、目的の遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫を含む。
「形質導入」という用語は、通常はバクテリオファージによる、１つの細菌から別の細菌への遺伝子の移動を意味する。「形質導入」はまた、複製欠損性レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得および移動も指す。
「形質移入」という用語は、外来性または外因性ＤＮＡの細胞による取り込みを意味し、外因性のＤＮＡが細胞膜内部に導入されている場合、細胞は「形質移入されている」。いくつかの形質移入技術は、当技術分野において公知であり、本明細書に開示されている。例えばGraham et al., (1973) Virology 52:456; Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., (1981) Gene 13:197を参照のこと。このような技術を使用することにより、１つまたは複数の外因性ＤＮＡ部分を、好適な宿主細胞に導入することができる。
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含有するように改変されている場合、細胞は形質転換されている。例えば、形質移入、形質導入、または他の技術によって新しい遺伝的材料を導入することにより、未変性の状態から遺伝的に改変された場合、細胞は形質転換されている。形質移入または形質導入後、細胞の染色体中に物理的に統合することにより、形質転換ＤＮＡは細胞のそれと組み替わることができ、または複製されることなく一過性にエピソーム要素として維持されることができ、またはプラスミドとして独立して複製することができる。形質転換ＤＮＡが細胞の分割により複製される場合、細胞は「安定に形質転換された」とされる。
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用される。該用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の類似体または模倣体であるアミノ酸ポリマー、および天然アミノ酸ポリマーにも適用される。これらの用語は、例えば炭水化物残基の付加などにより改変され糖タンパク質を形成するアミノ酸ポリマー、またはリン酸化されたアミノ酸ポリマーを包含する。開示されるポリペプチドおよびタンパク質は天然起源および非組換えの細胞により作製することができ；または遺伝的に操作されたまたは組換え細胞により生成することができ、未変性のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または未変性の配列において１つまたは複数のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されている分子を含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、特異的または選択的にβ−Ｋｌｏｔｈｏと結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体、および以下と結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体を包含する：（i）ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃまたはＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数、および（ii）β−Ｋｌｏｔｈｏ、またはβ−ＫｌｏｔｈｏもしくはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏの両方と特異的または選択的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体において１つまたは複数のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されている配列。「ポリペプチド断片」という用語は、完全長のタンパク質と比較して、アミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失、および／または内部欠失を有するポリペプチドを指す。そのような断片はまた、完全長のタンパク質と比較して改変されているアミノ酸を含んでもよい。ある実施形態において、断片は約５〜５００アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であってよい。有用なポリペプチド断片には、結合ドメインを含む、抗体の免疫学的に機能的な断片が含まれる。β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の場合、有用な断片には、限定されないが、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖の可変領域、２つのＣＤＲを含む抗体鎖の一部またはその可変量域のみ等が含まれる。
「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）該タンパク質が通常ともに存在するであろう、少なくともいくつかの他のタンパク質を含有せず、（２）同一の起源、例えば同じ種由来の他のタンパク質を本質的に含有せず、（３）異なる種由来の細胞により発現され、（４）少なくとも約５０パーセントのポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、またはそれが天然で関連する他の材料から分離されており、（５）天然では関連しないポリペプチドと機能的に関連（共有結合的または非共有結合的な相互座用により）し、または（６）天然では発生しない、ことを意味する。一般的に、「単離されたタンパク質」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、またはそれらのいずれの組み合わせも、そのような単離されたタンパク質をコードすることができる。好ましくは、単離されたタンパク質は、治療的、診断的、予防的、調査的、および他の使用の妨げとなる、タンパク質またはポリペプチドまたは天然に存在する他の混入物を実質的に含有しない。
ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体または抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列と比較して、アミノ酸配列において１つまたは複数のアミノ酸残基が付加、欠失および／または置換されたアミノ酸配列を含む。変異体には融合タンパク質が含まれる。
ポリペプチドの「誘導体」とは、挿入、欠失、または置換変異体とは性質が異なる何らかの方法で化学的に改変された、例えば別の化学的部分への結合により改変された、ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体または抗体）である。
本明細書を通して、ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物材料との関連において使用される「天然の」という用語は、天然に存在する材料を指す。
「抗原結合領域」とは、指定の抗原、例えばβ−Ｋｌｏｔｈｏ、またはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４のうちの１つの両方と特異的に結合する、タンパク質、またはタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体に、その抗原に対する特異性および親和性を与えるアミノ酸残基を含む、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体のその部分を、「抗原結合領域」と呼ぶ。抗原結合領域は一般に、１つまたは複数の「相補性結合領域」（「ＣＤＲ」）を含む。ある抗原結合領域はまた、１つまたは複数の「フレームワーク」領域も含む。「ＣＤＲ」とは、抗原結合特異性および親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、ＣＤＲの適切な立体構造の維持を支援し、抗原結合領域と抗原間の結合を促進し得る。
ある態様において、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数と結合する、組換え型抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が提供される。この状況において、「組換え型タンパク質」とは、組換え技術を使用して、すなわち本明細書に記載の組換え型核酸の発現により作成されたタンパク質である。組換え型タンパク質を作製するための方法および技術は、当技術分野で公知である。
「競合する」という用語は、同一のエピトープに対して競合する、抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体（例えば中和抗原結合タンパク質、中和抗体、アゴニスト抗原結合タンパク質またはアゴニスト抗体）との関連において使用される場合、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の間の競合が、試験される抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体（例えば抗体または免疫学的に機能的なその断片）が参照抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体（例えばリガンド、または参照抗体）の共通抗原（例えばＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ４、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはその断片）に対する特異的結合を予防または阻止するアッセイによって決定されることを意味する。多数の種類の競合結合アッセイを使用することができ、例としては以下が挙げられる：固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ(例えばStahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242-253を参照のこと)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えばKirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619を参照のこと）固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えばHarlow and Lane, (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pressを参照のこと）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（例えばMorel et al., (1988) Molec. Immunol. 25:7-15を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えばCheung, et al., (1990) Virology 176:546-552を参照のこと）；および直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82）。一般的に、このようなアッセイは、標識されていない試験抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体、および標識された参照抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体、のうちのどちらかを有する固体表面または細胞に結合した精製された抗原の使用を含む。競合阻害は、試験抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の存在下で、固体表面または細胞に結合した標識の量を定量することにより測定する。通常は試験抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、過剰に存在している。競合アッセイによって特定される抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体（競合する抗原結合タンパク質）には、参照抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体と同一のエピトープに結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体、および立体障害が起こるように、参照抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が結合しているエピトープに十分近意の隣接するエピトープに結合している抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が含まれる。競合的結合を測定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例において提供される。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、共通抗原に対する参照抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の特異的結合が、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害される。いくつかの例において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％以上、阻害される。
「抗原」という用語は、選択的結合剤により結合され得る分子または分子の一部、例えば抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体（例えば、抗体または免疫学的に機能的なその断片を含む）を指し、さらにその抗原に結合可能な抗体を作製するために動物において使用することができる分子または分子の一部を指す。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、例えば抗体と相互作用することが可能な１つまたは複数のエピトープを含んでもよい。
「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体（例えば、抗体など）が結合する分子の部分を指す。該用語は、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体、例えば抗体に、特異的に結合することができるいずれの決定因子をも含む。エピトープは、隣接していてもいなくてもよい（例えば（i）単鎖ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列中で互いに隣接していないが、分子の構成においては抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が結合しているアミノ酸残基、または（ii）２つ以上の個々の成分、例えばＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃまたはＦＧＦＲ４、およびβ−Ｋｌｏｔｈｏを含む多量体受容体において、１つまたは複数の個々の成分上に存在するがなお抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が結合しているアミノ酸残基）。ある実施形態において、それらが抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体を生成するために使用されるエピトープに類似した３次元構造を含むが、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体を生成するために使用されるエピトープに存在するアミノ酸残基を全く含まないか一部しか含まない、という点において、エピトープは模倣体であってよい。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、いくつかの例においては、例えば核酸などの、他の種類の分子上に存在することもあり得る。エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基などの、化学的に活性な表面分子群を含んでもよく、特異的な３次元構造特性、および／または特異的な電荷特性を有し得る。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中の標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
「同一性」という用語は、配列のアライメントおよび比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子間の配列の関係を指す。「同一性パーセント」とは、比較される分子中のアミノ酸間またはヌクレオチド間の同一の残基の割合（％）を指し、比較される分子の最小のサイズのものに基づいて計算される。これらの計算においては、アライメント中のギャップ（存在する場合）を、特定の数理モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって扱わなければならない。整列された（aligned）核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用し得る方法としては、Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), (1988) New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., (1988) SIAM J. Applied Math. 48:1073に記載されるものが挙げられる。
同一性パーセントの計算においては、比較される配列を、配列間において最大の一致が得られるように整列させる。同一性パーセントを決定するために使用されるコンピュータプログラムは、例えばＧＣＧプログラムパッケージであってもよく、それにはＧＡＰ（Devereux et al., (1984) Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI）が含まれる。コンピュータアルゴリズムＧＡＰが、配列同一性パーセントを決定しようとする２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを整列させるために使用される。配列は、それらそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最大の一致（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）をもたらすように整列させる。ギャップオープンペナルティ（平均ダイアゴナルの３倍で計算され、「平均ダイアゴナル」は、使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリックスによって、それぞれの完全なアミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数字である）およびギャップエクステンションペナルティ（通常ギャップオープンペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ ２５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリックスが、アルゴリズムとともに使用される。ある特定の実施形態において、標準の比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスに関してはDayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352;ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスに関してはHenikoff et al.,(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919を参照のこと）はアルゴリズムによっても使用される。
ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するための推奨パラメーターは以下の通りである：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、１９７０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３〜４５３頁
比較マトリックス：上記のＨｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２年からの、ＢＬＯＳＵＭ ６２；
ギャップペナルティ：１２（しかし末端ギャップについてはゼロペナルティ）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
２つのアミノ酸配列を整列させるためのあるアライメントスキームは、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらすこともあり、この小さなアライメント領域は、２つの完全長の配列間に有意な関連がなくても、非常に高い配列同一性を有し得る。従って所望により、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の隣接するアミノ酸にわたるアライメントをもたらすように、選択されたアライメントの方法（例えばＧＡＰプログラム）を調節することができる。
本明細書で使用される「実質的に純粋な」とは、記載される分子の種が、存在する主要な種であること、すなわち、モルベースで、同一の混合物中においていずれの他の個々の種よりもそれがより豊富であることを意味する。ある実施形態において、実質的に純粋な分子は、目的種が、存在する高分子種の少なくとも５０％（モルベースで）を構成する組成物である。他の実施形態において、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を構成する。他の実施形態において、目的種は本質的に均一に精製されており、ここでは、従来の検出方法によって混入種を組成物中に検出ないため、組成物は単一の検出可能な高分子種から成る。
「治療する」という用語は、傷害、病理または状態の治療または回復におけるあらゆる成功の証拠を指し、寛解；緩解；症状を軽減するかまたは傷害、病理もしくは状態を患者にとってより許容できるものにすること；変性または衰退の速度を遅くすること；変性の最終点の衰弱度をより軽くすること；患者の身体的または精神的幸福を改善することなどの、いかなる客観的または主観的パラメーターをも含む。症状の治療または回復は、身体検査、神経精神医学的検査、および／または精神医学的評価の結果を含む、客観的または主観的パラメーターに基づいてよい。例えば、本明細書に記載のある方法は、糖尿病、肥満症、および脂質異常症を予防的にまたは急性の治療のどちらかとして首尾よく治療し、ならびに／または血漿グルコース値および循環トリグリセリドおよびコレステロール値を減少させ、ならびに／または２型糖尿病、肥満症もしくは脂質異常症に関連する症状を回復させる。
「有効量」とは、一般に、重症度および／もしくは症状の頻度を低減させ、症状および／もしくは根本原因を排除し、症状および／またはそれらの根本原因の発生を予防し、ならびに／または糖尿病、肥満症もしくは脂質異常症から生じるかもしくはそれらに関連した損傷を改善もしくは治療するのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は、治療的有効量または予防的有効量である。「治療的有効量」とは、疾患状態（例えば糖尿病、肥満症、もしくは脂質異常症）または症状、特に疾患状態に関連した状態または症状を治療するのに十分な量であるか、さもなければ、いかなる方法によっても疾患状態または疾患に関連するすべての他の望ましくない症状の進行を予防する、妨げる、遅らせるまたは逆転させるのに十分な量である。「予防的有効量」とは、対象に投与される際、意図される予防的効果、例えば糖尿病、肥満症、もしくは脂質異常症の発症（もしくは再発）を予防または遅らせること、または糖尿病、肥満症、もしくは脂質異常症もしくは随伴症状の発症（もしくは再発）の可能性を低下させることなどをもたらす、医薬組成物の量である。完全な治療的または予防的効果は必ずしも一用量の投与により起こるわけではなく、一連の用量の投与後のみに起きてもよい。従って、治療的または予防的有効量は、１回または複数回の投与により投与することができる。
「アミノ酸」という用語は、当技術分野における通常の意味として使用される。２０個の天然アミノ酸およびそれらの略称は、従来の使用法に従う。例えば、すべての目的のために参照により本明細書に組み入れられている、Immunology-A Synthesis, 2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991)を参照のこと。２０個の通常のアミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、異常なまたは非天然のアミノ酸、例えば、α−，α−二置換型アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の特殊アミノ酸もまた、ポリペプチドの好適な成分であり得、「アミノ酸」という用語に含まれる。非天然アミノ酸（所望により、本明細書に記載のいずれかの配列に存在する、いずれの天然アミノ酸の代用ともし得るアミノ酸）の例としては以下が挙げられる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−リン酸化セリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用されるポリペプチドの表示法では、標準の使用法および慣例に従って、左側の方向はアミノ末端（または「Ｎ末端」）方向であり、右側の方向はカルボキシル末端（または「Ｃ末端」）方向である。「アミノ酸」という用語はまた、非天然のアミノ酸をも包含する。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体配列に挿入され得るか、または抗原結合性配列において野生型残基を置換し得る、非天然アミノ酸の例の非限定的なリストとしては、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、および誘導体化された側鎖を有するアミノ酸があげられる。例としては以下が挙げられる（Ｌ型またはＤ型における例；括弧内は略称）：シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα−メチルホモシトルリン（Ｎα−ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα−メチルオルニチン（Ｎα−ＭｅＯｒｎまたはＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＬｙｓまたはｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇまたはｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα−メチルロイシン（Ｎα−ＭｅＬまたはＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタハイドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、３−（１−ナフチル）アラニン（１−Ｎａｌ）、３−（２−ナフチル）アラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２−インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ−ヨード−フェニルアラニン（ｐＩ−Ｐｈｅ）、パラ−アミノ−フェニルアラニン（４ＡｍＰまたは４−Ａｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、４−グアニジノ−フェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリジン（「Ｋ（Ｎε−グリシル）」または「Ｋ（グリシル）」または「Ｋ（ｇｌｙ）」と略記）、ニトロ−フェニルアラニン（ｎｉｔｒｏｐｈｅ）、アミノ−フェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅまたはＡｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、ベンジル−フェニルアラニン（ｂｅｎｚｙｌｐｈｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏ）、ｐ−カルボキシル−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα−メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ−α−メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα−メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（ａｃｅｔｙｌａｒｇ）、α、β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α、γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β、β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（またはビフェニルアラニン；４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、βアラニン、β−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−リン酸化セリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−メチルアルギニン、４−アミノ−Ｏ−フタル酸（４ＡＰＡ）、および他の類似アミノ酸、および具体的に記載されたもののうちのいずれかの誘導体化された形態。
総括
ＦＧＦ２１は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のサブファミリーメンバーである分泌ポリペプチドである。ＦＧＦ２１を過剰発現する遺伝子導入マウスは、低成長率、低血漿グルコースレベルおよび低トリグリセリドレベルの代謝表現型を示し、加齢性２型糖尿病、膵島過形成、および肥満症を発症しない。組換えＦＧＦ２１タンパク質をげっ歯類糖尿病モデルに薬理学的に投与することより、血漿グルコースのレベル正常化、トリグリセリドおよびコレステロールのレベル低下、耐糖性およびインスリン感受性の向上がもたらされる。さらに、ＦＧＦ２１は、エネルギー消費、身体活動性、および代謝率を増加させることにより、体重および体脂肪を減少させる。
β−ｋｌｏｔｈｏおよび線維芽細胞増殖因子受容体１ｃ（ＦＧＦＲ１ｃ）を含む複合体によって、ＦＧＦ２１により誘導される作用と同様のｉｎ ｖｉｖｏ作用を誘導できることが示されている。この知見に基づき、二重特異性抗体および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の骨格に基づいて設計された。開示される二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ領域を介してβ−ｋｌｏｔｈｏに、またＦｃ領域のＣＨ３ループを介してＦＧＦＲ１ｃに、特異的に結合する。本明細書にて提供される抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、抗原結合タンパク質成分およびＦＧＦ２１成分を含み；抗原結合タンパク質成分は、抗原結合成分のＦａｂ領域を介してβ−Ｋｌｏｔｈｏに結合し、該融合体のＦＧＦ２１成分を介してＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよび／またはＦＧＦＲ４に結合する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、抗原結合成分のＦａｂ領域を介してＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよび／またはＦＧＦＲ４と会合することができ、該融合体のＦＧＦ２１成分を介してβ−Ｋｌｏｔｈｏに会合することができる。抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の特異性は、ＦＧＦ２１成分のＮ末端とＣ末端のどちらが切断されているか、および抗原結合成分の特異性によって決まるだろう。
本明細書で開示される抗原結合タンパク質において、β‐ｋｌｏｔｈｏ結合部位はＦａｂドメイン上に配置され、次いで、Ｆａｂドメインは、Ｆｃ領域のＣＨ３ループに位置するＦＧＦＲ１ｃ結合ペプチドを含むＦｃ領域に結合される。
β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数と結合する抗原結合タンパク質、ならびに抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体も本明細書にて提供される。本明細書で開示される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の独特な性質は、これらのタンパク質のアゴニスト的な性質、具体的にはＦＧＦ２１様シグナル伝達の誘導能であり、該誘導能は、抗原結合タンパク質の場合、Ｆａｂ領域を介してβ−Ｋｌｏｔｈｏに結合し、未変性Ｆｃ領域に挿入された該ペプチドを介してＦＧＦＲ１ｃに結合することによるものであり、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の場合、（ａ）抗原結合タンパク質成分のＦａｂ領域を介してβ−Ｋｌｏｔｈｏと結合し、ＦＧＦ２１成分を介してＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、および／もしくはＦＧＦＲ４と結合すること、または（ｂ）抗原結合タンパク質成分のＦａｂ領域を介してＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよび／もしくはＦＧＦＲ４と結合し、ＦＧＦ２１成分を介してβ−Ｋｌｏｔｈｏと結合することのいずれかによるものである。
より明白かつ具体的には、本明細書で開示される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の中には、下記の条件下での実施例５および１１のＥＬＫ−ルシフェラーゼレポーターアッセイを含む、いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞機能性試験で、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘導するものがあり、その条件は、（１）ＦＧＦ２１受容体への結合および該受容体の活性がβ−Ｋｌｏｔｈｏ依存的であること；（２）該活性がＦＧＦＲ１ｃ／β‐Ｋｌｏｔｈｏ複合体に選択的であること；（３）該ＦＧＦＲ１ｃ／β−Ｋｌｏｔｈｏへの結合がＦＧＦ２１様シグナル経路を惹起すること、並びに（４）その効力（ＥＣ５０）が、以下の細胞機能性試験で測定された時に、配列番号２の成熟型を含む野生型ＦＧＦ２１標準と同等であることであり、その細胞機能性試験は：（１）実施例５および１１の組換えＦＧＦ２１受容体により仲介されるルシフェラーゼ‐レポーター細胞アッセイ；並びに（２）実施例５および１１の組換えＦＧＦ２１受容体により仲介される細胞アッセイにおけるＥＲＫ−リン酸化である。従って、開示された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、ＦＧＦ２１の天然の生物学的機能と一致するｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すことが期待される。この性質により、開示された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、２型糖尿病、肥満症、異脂肪血症、ＮＡＳＨ、心臓血管病、メタボリックシンドローム等の代謝疾患、およびＦＧＦ２１のｉｎ ｖｉｖｏ作用を模倣または増強することが望ましい広範囲のあらゆる疾患または状態を治療するための実行可能な治療となる。
提供される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体は、一つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、本明細書に記載されるように、組み込まれたおよび／または連結されたポリペプチドである。いくつかの抗原結合タンパク質において、ＣＤＲは「フレームワーク」領域に組み込まれるが、フレームワーク領域は、ＣＤＲの適切な抗原結合特性が得られるようにＣＤＲを配置する。一般的に、提供される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、ＦＧＦＲ１ｃとβ−Ｋｌｏｔｈｏの間の相互作用を促進または増強することができ、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を実質的に誘導することができる。
本明細書に記載のある種の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、抗体であるか、または抗体由来である。ある実施形態では、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は抗体、例えば、限定はされないが、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ（minibody）、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「擬似抗体」と呼ぶ場合もある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書では「抗体複合体」と呼ぶ場合もある）、およびそれらのフラグメントに基づく。種々の構造が本明細書の下記にさらに記載される。
本明細書にて提供される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数、とりわけヒト型のＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏに、様々な程度で結合することが示された。提供される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、ＦＧＦ２１の天然のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性を模倣している。結果として、本明細書にて提供される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、ＦＧＦ２１様シグナル伝達活性を様々な程度で活性化することができる。特に、これらのエピトープに結合している抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、以下のｉｎ ｖｉｖｏ活性のうちの一つまたは複数を有し得る：例えば２型糖尿病、肥満症、異脂肪血症、ＮＡＳＨ、心臓血管病、およびメタボリックシンドローム等の状態での、ＦＧＦ２１様シグナル伝達経路の誘導、血糖値低下、循環脂質レベルの低下、代謝パラメーターーの向上、並びにＦＧＦＲ１ｃ、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ２１の三元複合体形成によりｉｎ ｖｉｖｏで誘導される他の生理作用。
本明細書で開示される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、様々な有用性を有する。抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体のいくつかは、例えば、特異的結合アッセイ、ＦＧＦＲ１ｃおよび／もしくはβ−Ｋｌｏｔｈｏ、具体的にはヒトＦＧＦＲ１ｃおよび／もしくはβ−Ｋｌｏｔｈｏ、またはこれらタンパク質のリガンドのアフィニティ精製、並びにＦＧＦ２１様シグナル伝達活性の他のアゴニストを同定するためのスクリーニング検査に有用である。
本明細書で開示される、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、本明細書で説明するように、種々の治療的応用に使用され得る。例えば、ある種の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、２型糖尿病、肥満症、異脂肪血症、ＮＡＳＨ、心臓血管病、およびメタボリックシンドロームを低減する、軽減する、治療する等、患者のＦＧＦ２１様シグナル伝達過程に関連する状態を治療するのに有用である。抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の他の使用には、例えば、β−Ｋｌｏｔｈｏ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ４またはＦＧＦ２１に関連する疾患または状態の診断、およびこれらの分子が存在するか否かを調べるためのスクリーニング検査が含まれる。本明細書に記載の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、ＦＧＦ２１様シグナル伝達活性の低下に関連する状態、症状および／または病状を治療するのに有用であり得る。状態の例には、限定はされないが、糖尿病、肥満症、ＮＡＳＨおよび異脂肪血症が挙げられる。
ＦＧＦ２１
本明細書で開示される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体は、様々な程度で、本明細書で定義したような、ＦＧＦ２１を介するシグナル伝達を誘導することができる。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＦＧＦ２１の成熟型が該分子の活性型である。完全長ＦＧＦ２１をコードするヌクレオチド配列が提供され；シグナル配列をコードするヌクレオチドには下線が引かれている。
ATG GAC TCG GAC GAG ACC GGG TTC GAG CAC TCA GGA CTG TGG GTT TCT GTG CTG GCT GGT CTT CTG CTG GGA GCC TGC CAG GCA CAC CCC ATC CCT GAC TCC AGT CCT CTC CTG CAA TTC GGG GGC CAA GTC CGG CAG CGG TAC CTC TAC ACA GAT GAT GCC CAG CAG ACA GAA GCC CAC CTG GAG ATC AGG GAG GAT GGG ACG GTG GGG GGC GCT GCT GAC CAG AGC CCC GAA AGT CTC CTG CAG CTG AAA GCC TTG AAG CCG GGA GTT ATT CAA ATC TTG GGA GTC AAG ACA TCC AGG TTC CTG TGC CAG CGG CCA GAT GGG GCC CTG TAT GGA TCG CTC CAC TTT GAC CCT GAG GCC TGC AGC TTC CGG GAG CTG CTT CTT GAG GAC GGA TAC AAT GTT TAC CAG TCC GAA GCC CAC GGC CTC CCG CTG CAC CTG CCA GGG AAC AAG TCC CCA CAC CGG GAC CCT GCA CCC CGA GGA CCA GCT CGC TTC CTG CCA CTA CCA GGC CTG CCC CCC GCA CCC CCG GAG CCA CCC GGA ATC CTG GCC CCC CAG CCC CCC GAT GTG GGC TCC TCG GAC CCT CTG AGC ATG GTG GGA CCT TCC CAG GGC CGA AGC CCC AGC TAC GCT TCC TGA（配列番号１）
完全長ＦＧＦ２１のアミノ酸配列が提供され；シグナル配列を構成するアミノ酸には下線が引かれている：
M D S D E T G F E H S G L W V S V L A G L L L G A C Q A H P I P D S S P L L Q F G G Q V R Q R Y L Y T D D A Q Q T E A H L E I R E D G T V G G A A D Q S P E S L L Q L K A L K P G V I Q I L G V K T S R F L C Q R P D G A LY G S L H F D P E A C S F R E L L L E D G Y N V Y Q S E A H G L P L H L P G N K S P H R D P A P R G P A R F L P L P G L P P A P P E P P G I L A P Q P P D V G S S D P L S M V G P S Q G R S P S Y A S（配列番号２）
従って、成熟型ＦＧＦ２１は以下のアミノ酸配列を含む：
H P I P D S S P L L Q F G G Q V R Q R Y L Y T D D A Q Q T E A H L E I R E D G T V G G A A D Q S P E S L L Q L K A L K P G V I Q I L G V K T S R F L C Q R P D G A LY G S L H F D P E A C S F R E L L L E D G Y N V Y Q S E A H G L P L H L P G N K S P H R D P A P R G P A R F L P L P G L P P A P P E P P G I L A P Q P P D V G S S D P L S M V G P S Q G R S P S Y A S（配列番号３４１）
１〜１６９番目の残基を含む切断型ＦＧＦ２１は、以下のアミノ酸配列を含む：
hpipdsspllqfggqvrqrylytddaqqteahleiredgtvggaadqspesllqlkalkpgviqilgvktsrflcqrpdgalygslhfdpeacsfrellledgynvyqseahglplhlpgnksphrdpaprgparflplpglppappeppgilapqppdvgssdplsmv（配列番号３４２）
１〜１７０番目の残基を含む切断型ＦＧＦ２１は、以下のアミノ酸配列を含む：
hpipdsspllqfggqvrqrylytddaqqteahleiredgtvggaadqspesllqlkalkpgviqilgvktsrflcqrpdgalygslhfdpeacsfrellledgynvyqseahglplhlpgnksphrdpaprgparflplpglppappeppgilapqppdvgssdplsmvg（配列番号３４３）
ＦＧＦ２１は少なくとも２種類の異なる形態で存在する可能性があり、それらは１４６位（上記配列番号３４１の下線且つ太字）で互いに異なっており；一方の形態ではこの位置の残基は配列番号３４１のようにプロリンであり、もう一方の形態ではロイシンである。本開示全体を通じて、特に指示しない限り、ＦＧＦ２１という用語には、これらおよび別の既知のまたは発見された配列番号３４１のあらゆるアイソフォームが包含される）。
本明細書では、ＦＧＦ２１にはフラグメントも含まれ得る。本明細書で使用される場合、前記用語は同義的に用いられ、β−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよび／またはＦＧＦＲ４と結合することでＦＧＦ２１様シグナル伝達活性を誘導するタンパク質、具体的には、特に断りがない限り、ヒトタンパク質を意味する。
ＦＧＦＲ１ｃ
本明細書で開示される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、β−Ｋｌｏｔｈｏと会合した場合、様々な程度で、ＦＧＦＲ１ｃ、具体的にはヒトＦＧＦＲ１ｃと結合または会合する。ヒトＦＧＦＲ１ｃ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２３１１０）をコードするヌクレオチド配列が提供される：
ATGTGGAGCTGGAAGTGCCTCCTCTTCTGGGCTGTGCTGGTCACAGCCACACTCTGCACCGCTAGGCCGTCCCCGACCTTGCCTGAACAAGCCCAGCCCTGGGGAGCCCCTGTGGAAGTGGAGTCCTTCCTGGTCCACCCCGGTGACCTGCTGCAGCTTCGCTGTCGGCTGCGGGACGATGTGCAGAGCATCAACTGGCTGCGGGACGGGGTGCAGCTGGCGGAAAGCAACCGCACCCGCATCACAGGGGAGGAGGTGGAGGTGCAGGACTCCGTGCCCGCAGACTCCGGCCTCTATGCTTGCGTAACCAGCAGCCCCTCGGGCAGTGACACCACCTACTTCTCCGTCAATGTTTCAGATGCTCTCCCCTCCTCGGAGGATGATGATGATGATGATGACTCCTCTTCAGAGGAGAAAGAAACAGATAACACCAAACCAAACCGTATGCCCGTAGCTCCATATTGGACATCACCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGCATGCAGTGCCGGCTGCCAAGACAGTGAAGTTCAAATGCCCTTCCAGTGGGACACCAAACCCAACACTGCGCTGGTTGAAAAATGGCAAAGAATTCAAACCTGACCACAGAATTGGAGGCTACAAGGTCCGTTATGCCACCTGGAGCATCATAATGGACTCTGTGGTGCCCTCTGACAAGGGCAACTACACCTGCATTGTGGAGAATGAGTACGGCAGCATCAACCACACATACCAGCTGGATGTCGTGGAGCGGTCCCCTCACCGGCCCATCCTGCAAGCAGGGTTGCCCGCCAACAAAACAGTGGCCCTGGGTAGCAACGTGGAGTTCATGTGTAAGGTGTACAGTGACCCGCAGCCGCACATCCAGTGGCTAAAGCACATCGAGGTGAATGGGAGCAAGATTGGCCCAGACAACCTGCCTTATGTCCAGATCTTGAAGACTGCTGGAGTTAATACCACCGACAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGGACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCCATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTAACAGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTGGAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA（配列番号３）。
ヒトＦＧＦＲ１ｃ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０７５５９８）のアミノ酸配列が提供される：
MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHPGDLLQLRCRLRDDVQSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPADSGLYACVTSSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRMPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTSPLYLEIIIYCTGAFLISCMVGSVIVYKMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGGLKRR（配列番号４）。
本明細書に記載の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、ＦＧＦＲ１ｃの細胞外部分と様々な程度で結合または会合し、一部の実施形態では、β−Ｋｌｏｔｈｏと結合または会合している場合がある。ＦＧＦＲ１ｃの細胞外領域の一例は以下である：
MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHPGDLLQLRCRLRDDVQSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPADSGLYACVTSSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRMPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTSPLY（配列番号５）。
本明細書に記載のように、ＦＧＦＲ１ｃタンパク質にはフラグメントも含まれ得る。
本明細書で使用される場合、前記用語は同義的に用いられ、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ２１と会合したときにＦＧＦ２１様シグナル伝達活性を誘導する受容体、具体的には、特に断りがない限り、ヒト受容体を意味する。
ＦＧＦＲ１ｃという用語には、ＦＧＦＲ１ｃのアミノ酸配列、例えば、Ｎ結合型糖鎖付加が起こり得る部位の翻訳後修飾物も含まれる。従って、抗原結合タンパク質は、前記位置の一つまたは複数で糖鎖付加されたタンパク質に結合できる、または該タンパク質から生成できる。
β−Ｋｌｏｔｈｏ
本明細書で開示される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、β−Ｋｌｏｔｈｏの細胞外ドメインと様々な程度で、具体的にはヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏと結合する。完全長ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７５７３７）をコードするヌクレオチド配列が提供される：
ATGAAGCCAGGCTGTGCGGCAGGATCTCCAGGGAATGAATGGATTTTCTTCAGCACTGATGAAATAACCACACGCTATAGGAATACAATGTCCAACGGGGGATTGCAAAGATCTGTCATCCTGTCAGCACTTATTCTGCTACGAGCTGTTACTGGATTCTCTGGAGATGGAAGAGCTATATGGTCTAAAAATCCTAATTTTACTCCGGTAAATGAAAGTCAGCTGTTTCTCTATGACACTTTCCCTAAAAACTTTTTCTGGGGTATTGGGACTGGAGCATTGCAAGTGGAAGGGAGTTGGAAGAAGGATGGAAAAGGACCTTCTATATGGGATCATTTCATCCACACACACCTTAAAAATGTCAGCAGCACGAATGGTTCCAGTGACAGTTATATTTTTCTGGAAAAAGACTTATCAGCCCTGGATTTTATAGGAGTTTCTTTTTATCAATTTTCAATTTCCTGGCCAAGGCTTTTCCCCGATGGAATAGTAACAGTTGCCAACGCAAAAGGTCTGCAGTACTACAGTACTCTTCTGGACGCTCTAGTGCTTAGAAACATTGAACCTATAGTTACTTTATACCACTGGGATTTGCCTTTGGCACTACAAGAAAAATATGGGGGGTGGAAAAATGATACCATAATAGATATCTTCAATGACTATGCCACATACTGTTTCCAGATGTTTGGGGACCGTGTCAAATATTGGATTACAATTCACAACCCATATCTAGTGGCTTGGCATGGGTATGGGACAGGTATGCATGCCCCTGGAGAGAAGGGAAATTTAGCAGCTGTCTACACTGTGGGACACAACTTGATCAAGGCTCACTCGAAAGTTTGGCATAACTACAACACACATTTCCGCCCACATCAGAAGGGTTGGTTATCGATCACGTTGGGATCTCATTGGATCGAGCCAAACCGGTCGGAAAACACGATGGATATATTCAAATGTCAACAATCCATGGTTTCTGTGCTTGGATGGTTTGCCAACCCTATCCATGGGGATGGCGACTATCCAGAGGGGATGAGAAAGAAGTTGTTCTCCGTTCTACCCATTTTCTCTGAAGCAGAGAAGCATGAGATGAGAGGCACAGCTGATTTCTTTGCCTTTTCTTTTGGACCCAACAACTTCAAGCCCCTAAACACCATGGCTAAAATGGGACAAAATGTTTCACTTAATTTAAGAGAAGCGCTGAACTGGATTAAACTGGAATACAACAACCCTCGAATCTTGATTGCTGAGAATGGCTGGTTCACAGACAGTCGTGTGAAAACAGAAGACACCACGGCCATCTACATGATGAAGAATTTCCTCAGCCAGGTGCTTCAAGCAATAAGGTTAGATGAAATACGAGTGTTTGGTTATACTGCCTGGTCTCTCCTGGATGGCTTTGAATGGCAGGATGCTTACACCATCCGCCGAGGATTATTTTATGTGGATTTTAACAGTAAACAGAAAGAGCGGAAACCTAAGTCTTCAGCACACTACTACAAACAGATCATACGAGAAAATGGTTTTTCTTTAAAAGAGTCCACGCCAGATGTGCAGGGCCAGTTTCCCTGTGACTTCTCCTGGGGTGTCACTGAATCTGTTCTTAAGCCCGAGTCTGTGGCTTCGTCCCCACAGTTCAGCGATCCTCATCTGTACGTGTGGAACGCCACTGGCAACAGACTGTTGCACCGAGTGGAAGGGGTGAGGCTGAAAACACGACCCGCTCAATGCACAGATTTTGTAAACATCAAAAAACAACTTGAGATGTTGGCAAGAATGAAAGTCACCCACTACCGGTTTGCTCTGGATTGGGCCTCGGTCCTTCCCACTGGCAACCTGTCCGCGGTGAACCGACAGGCCCTGAGGTACTACAGGTGCGTGGTCAGTGAGGGGCTGAAGCTTGGCATCTCCGCGATGGTCACCCTGTATTATCCGACCCACGCCCACCTAGGCCTCCCCGAGCCTCTGTTGCATGCCGACGGGTGGCTGAACCCATCGACGGCCGAGGCCTTCCAGGCCTACGCTGGGCTGTGCTTCCAGGAGCTGGGGGACCTGGTGAAGCTCTGGATCACCATCAACGAGCCTAACCGGCTAAGTGACATCTACAACCGCTCTGGCAACGACACCTACGGGGCGGCGCACAACCTGCTGGTGGCCCACGCCCTGGCCTGGCGCCTCTACGACCGGCAGTTCAGGCCCTCACAGCGCGGGGCCGTGTCGCTGTCGCTGCACGCGGACTGGGCGGAACCCGCCAACCCCTATGCTGACTCGCACTGGAGGGCGGCCGAGCGCTTCCTGCAGTTCGAGATCGCCTGGTTCGCCGAGCCGCTCTTCAAGACCGGGGACTACCCCGCGGCCATGAGGGAATACATTGCCTCCAAGCACCGACGGGGGCTTTCCAGCTCGGCCCTGCCGCGCCTCACCGAGGCCGAAAGGAGGCTGCTCAAGGGCACGGTCGACTTCTGCGCGCTCAACCACTTCACCACTAGGTTCGTGATGCACGAGCAGCTGGCCGGCAGCCGCTACGACTCGGACAGGGACATCCAGTTTCTGCAGGACATCACCCGCCTGAGCTCCCCCACGCGCCTGGCTGTGATTCCCTGGGGGGTGCGCAAGCTGCTGCGGTGGGTCCGGAGGAACTACGGCGACATGGACATTTACATCACCGCCAGTGGCATCGACGACCAGGCTCTGGAGGATGACCGGCTCCGGAAGTACTACCTAGGGAAGTACCTTCAGGAGGTGCTGAAAGCATACCTGATTGATAAAGTCAGAATCAAAGGCTATTATGCATTCAAACTGGCTGAAGAGAAATCTAAACCCAGATTTGGATTCTTCACATCTGATTTTAAAGCTAAATCCTCAATACAATTTTACAACAAAGTGATCAGCAGCAGGGGCTTCCCTTTTGAGAACAGTAGTTCTAGATGCAGTCAGACCCAAGAAAATACAGAGTGCACTGTCTGCTTATTCCTTGTGCAGAAGAAACCACTGATATTCCTGGGTTGTTGCTTCTTCTCCACCCTGGTTCTACTCTTATCAATTGCCATTTTTCAAAGGCAGAAGAGAAGAAAGTTTTGGAAAGCAAAAAACTTACAACACATACCATTAAAGAAAGGCAAGAGAGTTGTTAGCTAA（配列番号６）。
完全長ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿７８３８６４）のアミノ酸配列が提供される：
MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSWKKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREALNWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFLGCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS（配列番号７）。
β−Ｋｌｏｔｈｏの細胞外領域の一例は以下である：
MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSWKKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREALNWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKP（配列番号８）。
本明細書に記載のように、β−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質にはフラグメントも含まれ得る。本明細書で使用される場合、これらの用語は同義的に用いられ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃまたはＦＧＦＲ４およびＦＧＦ２１と結合した時にＦＧＦ２１様シグナル伝達活性を誘導する補助受容体、具体的には、特に断りがない限り、ヒト補助受容体を意味する。
β−Ｋｌｏｔｈｏという用語には、例えば、Ｎ結合型糖鎖付加部位での糖鎖付加等の、β−Ｋｌｏｔｈｏアミノ酸配列の翻訳後修飾された形態も含まれる。従って、抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、これらの位置の一つまたは複数で糖鎖付加されたタンパク質に結合できる、または該タンパク質から生成できる。
β-Ｋｌｏｔｈｏまたはβ-ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ４ｃのうち一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体
ＦＧＦ２１様シグナル伝達を調節するのに有用な種々の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が提供される。これらの薬剤には、抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖抗体、ドメイン抗体、免疫接着（immunoadhesion）、および抗原結合領域を有するポリペプチド）を含み、β−Ｋｌｏｔｈｏに、または、ＦＧＦＲ結合ペプチドが存在する場合、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃもしくはＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数の両方に、具体的にはヒトＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃまたはＦＧＦＲ４およびヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏの両方に特異的に結合する、例えば、抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体も含まれる。前記薬剤のいくつかは、例えば、ＦＧＦ受容体（例えば、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃまたはＦＧＦＲ４）のβ−Ｋｌｏｔｈｏとの結合、およびＦＧＦ２１との結合によりｉｎ ｖｉｖｏで発生するシグナル伝達効果を模倣するのに有用であるため、ＦＧＦ２１様シグナル伝達に関連するＦＧＦ２１様シグナル伝達を増強または調節するのに使用され得る。
一般的に、提供される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、典型的には、本明細書に記載の一つまたは複数のＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５または６個）を含み、ＦＧＦＲ結合ペプチドも含み得る。ある場合には、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、（ａ）ポリペプチド構造並びに（ｂ）ポリペプチド構造に挿入および／または連結された一つもしくは複数のＣＤＲを含む。ポリペプチド構造は種々の異なる形態をとり得る。例えば、ポリペプチド構造は、天然抗体のフレームワーク、またはそのフラグメントもしくは変異体であるか、それらを含むか、性質上完全に合成されたものであり得る。種々の抗原結合タンパク質構造および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の例が、本明細書にさらに記載される。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のポリペプチド構造は、ＦＧＦＲ結合ペプチドを含み、該ペプチドはＣＨ２およびＣＨ３ループ中等、重鎖のいかなるポイントにも組み込まれ得る。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のポリペプチド構造は抗体であるか、または抗体に由来し、該抗体には、限定はされないが、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ（minibody）、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「擬似抗体」と呼ぶ場合もある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（「抗体複合体」と呼ぶ場合もある）、およびそれぞれの部分もしくはフラグメントが含まれる。ある場合には、抗原結合タンパク質は抗体の免疫フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖ）である。抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、野生型ＣＨ３配列中には通常見られない、ＦＧＦＲ結合ペプチド等のペプチド成分を含むようさらに改変されているＣＨ３領域を含み得る。あるいは、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、抗原結合タンパク質に融合された切断型ＦＧＦ２１を含み得る。これら種々の構造は、本明細書でさらに記載され、定義される。
本明細書にて提供される、ある種の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する。一実施形態において、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、配列番号５のアミノ酸配列（ＦＧＦＲ１ｃの細胞外領域）を含むヒトＦＧＦＲ１ｃおよび配列番号８のアミノ酸配列（β−Ｋｌｏｔｈｏの細胞外領域）を含むヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏの両方に特異的に結合し、別の実施形態では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、配列番号５のアミノ酸配列を含むヒトＦＧＦＲ１ｃおよび配列番号８のアミノ酸配列を有するヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏの両方に特異的に結合し、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体により、ＦＧＦ２１様シグナル伝達が誘導される。本開示の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体はＦＧＦ２１様シグナル伝達を、必要ではないが誘導でき、さらに、開示された発明の一態様を形成することに注意されたい。
抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の構造
本明細書にて提供される、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のいくつかは、天然抗体と通常関連する構造を含む。これら抗体の構造単位は、一つまたは複数の四量体を通常含み、各四量体は２つの同一なポリペプチド鎖対から成るが、哺乳動物の種の中には、単一の重鎖のみを有する抗体を産生するものもある。典型的な抗体では、各対またはカプレットには、１つの完全長「軽」鎖（ある実施形態では、約２５ｋＤａ）および１つの完全長「重」鎖（ある実施形態では、約５０〜７０ｋＤａ）が含まれる。個々の免疫グロブリン鎖はいくつかの「免疫グロブリンドメイン」から成り、それぞれはおよそ９０〜１１０個のアミノ酸から成り、特徴的な折り畳みパターンを発現している。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。各鎖のアミノ末端部は通常、抗原認識に関与する可変領域を含む。Ｃ末端部は鎖のもう一方の末端部よりも進化的に保存されており、「定常領域」または「Ｃ領域」と呼ばれる。ヒト軽鎖は一般的にκおよびλ軽鎖に分類され、各々は１つの可変領域および１つの定常領域を含んでいる。重鎖は通常、μ、δ、γ、α、またはε鎖に分類され、これらによって、抗体のアイソタイプがそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと決定される。ＩｇＧにはいくつかのサブタイプがあり、限定はされないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が含まれる。ＩｇＭサブタイプには、ＩｇＭ、およびＩｇＭ２が含まれる。ＩｇＡサブタイプには、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２が含まれる。ヒトにおいて、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプは４個の重鎖および４個の軽鎖を含み；ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは２つの重鎖および２つの軽鎖を含み；ＩｇＭアイソタイプは５個の重鎖および５個の軽鎖を含む。重鎖のＣ領域は通常、エフェクター機能に関与し得る一つまたは複数のドメインを含む。重鎖の定常領域ドメインの数は、そのアイソタイプによって決まる。ＩｇＧの各重鎖は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインを含む。提供される抗体は、これらのアイソタイプおよびサブタイプのいずれをも有し得る。ある実施形態では、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃもしくはＦＧＦＲ４のうちの一つまたは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４サブタイプの抗体であり、重鎖の定常領域に組み入れられたＦＧＦＲ結合ペプチドを含み得る。
完全長の軽鎖および重鎖において、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸から成る「Ｊ」領域によって連結され、同時に、重鎖には約１０個以上のアミノ酸から成る「Ｄ」領域も含まれる。例えば、Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press（その全体が参照によりあらゆる目的で本明細書に組み込まれる）を参照。各軽鎖／重鎖対の可変領域は通常、抗原結合部位を形成する。
野生型のＣＨ２およびＣＨ３ループを含み、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する、例示的なモノクローナル抗体のＩｇＧ２重鎖定常領域の一例は、以下のアミノ酸配列を有する：
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyqstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk（配列番号９）。
前記アミノ酸配列は以下のヌクレオチド配列（nuceleotide sequence）にコードされる：
gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa（配列番号１０）。
別の態様では、いずれのアイソタイプの重鎖も、ＦＧＦＲ結合ペプチドを所望により含むことができ、重鎖の定常領域中に挿入することができる。あらゆるＦＧＦＲ結合ペプチドが重鎖に挿入可能であり、本明細書、例えば表４Ａに開示されるＦＧＦＲ結合ペプチドなどが挙げられる。ＦＧＦＲ結合ペプチドは重鎖定常領域のあらゆる領域、例えば重鎖のＣＨ２またはＣＨ３ループ領域に、組み入れ可能である。ＦＧＦＲ結合ペプチドを含む重鎖の例は表５Ａに記載される。
ＦＧＦＲ結合ペプチドを含むＩｇＧ２重鎖の一つの具体例は以下のアミノ酸配列を有し：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASRFSFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGRNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRVEDTAVYYCARDHPVVGTSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELGGCYQAWGYYVCGGTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１１）；
前記アミノ酸配列は以下のヌクレオチド配列にコードされる：
caggtgcagttggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctagattctccttcagtagatatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtttgatggaagaaatcaatactatgcagactccgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaattccaagaatacgctgtttctgcaaatgaacagcctgagagtcgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagatcacccagtagttggtacgagctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctctagtgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtaccagagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgggtggttgctaccaggcctggggctactacgtgtgcggtggtaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa（配列番号１２）。
β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に結合する例示的なモノクローナル抗体のκ軽鎖定常領域の一例は、以下のアミノ酸配列を有し：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号１３）、
前記アミノ酸は以下のヌクレオチド配列にコードされる：
cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt（配列番号１４）。
β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に結合する例示的なモノクローナル抗体のλ軽鎖定常領域の一例は、以下のアミノ酸配列を有し：
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS（配列番号１５）、
前記アミノ酸配列は以下のヌクレオチド配列にコードされる：
ggtcagcccaaggccaaccccactgtcactctgttcccgccctcctctgaggagctccaagccaacaaggccacactagtgtgtctgatcagtgacttctacccgggagctgtgacagtggcctggaaggcagatggcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccaaaccctccaaacagagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcccgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca（配列番号１６）。
一般に、免疫グロブリン鎖の定常領域は同じ一般的構造を示し、３つの超可変領域（「相補性決定領域」またはＣＤＲと呼ばれることが多い）によって連結された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含んでいる。各重鎖／軽鎖対の２本の鎖のＣＤＲは通常、フレームワーク領域によって並列され、標的タンパク質（例えば、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数）上の特異的なエピトープと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端に向かって、天然の軽鎖および重鎖可変領域は共に、典型的には以下の構成要素の順序に従う：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。これらの各ドメイン中の位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるために付番方式が考え出されている。この付番方式は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD)、またはChothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917;またはChothia et al., 1989, Nature 342:878-883、またはAHoにおいて定義され、そのいずれも開示された抗原結合タンパク質の領域を説明するのに使用することができる。
本明細書にて提供される種々の重鎖および軽鎖可変領域が、表２Ａおよび２Ｂに示される。これらの各可変領域は、開示された重鎖および軽鎖の定常領域に結合して、完全抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれ形成することができる。さらに、重鎖および軽鎖の各配列を組み合わせて、完全抗体構造を形成することができる。本明細書にて提供される重鎖および軽鎖可変領域は、上記の例示的な配列とは別の、異なる配列を有する定常領域にも結合できることが理解されよう。
いくつかの提供される抗体の完全長軽鎖および重鎖の特定例、並びにそれらに対応するアミノ酸配列が表１Ａおよび１Ｂにまとめられている。表１Ａは軽鎖配列の例を示しており、表１Ｂは重鎖配列の例を示している。表１Ｂに示される重鎖はＦＧＦＲ結合ペプチドを含まず；ＦＧＦＲ結合ペプチドを含む重鎖は表５Ａに示される。
Figure 2013523184
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ここでも、表１Ｂに記載される例示的な各重鎖（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３等）、あるいは表５Ａに記載されるＦＧＦＲ−結合タンパク質を含む例示的な各重鎖は、表１Ａに示される例示的な軽鎖のいずれとも組み合されて抗体を形成することができる。そのような組み合わせの例には、Ｈ１とＬ１〜Ｌ１１のいずれかとの組み合わせ；Ｈ２とＬ１〜Ｌ１１のいずれかとの組み合わせ；Ｈ３とＬ１〜Ｌ１１のいずれかとの組み合わせ、ＦＧＦＲ結合ペプチドを含むあらゆる重鎖（例えば、表５に示されるもの）とＬ１〜Ｌ１１のいずれかと組み合わせ、ＦＧＦＲ結合ペプチドを含むあらゆる重鎖（例えば、表５に示されるもの）とＬ１〜Ｌ１１のいずれかと組み合わせ等が挙げられる。ある場合には、抗体には表１Ａ、１Ｂおよび５Ａに記載のものからの、少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖が含まれる。ある場合には、抗体には表１Ａ、１Ｂおよび５Ａに記載される２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖が含まれる。別の場合には、抗体には２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖が含まれる。一例として、抗体またはその免疫学的に機能するフラグメントには、２つのＨ１重鎖および２つのＬ１軽鎖、または２つのＨ２重鎖および２つのＬ２軽鎖、または２つのＨ３重鎖および２つのＬ３軽鎖並びに表１Ａ、１Ｂおよび５Ａに記載される軽鎖対および重鎖対の他の同様の組み合わせが含まれ得る。
本明細書にて提供される他の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、表１Ａ、１Ｂおよび５Ａに示される重鎖および軽鎖の組み合わせによって形成される抗体の変異体が含まれ、これら鎖のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する軽鎖および／または重鎖が含まれる。ある場合には、そのような抗体には少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖が含まれるが、別の場合には前記変異体には２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖が含まれる。
抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の可変領域
表２Ｂに示されるＶＨ１〜ＶＨ１１からなる群から選択される抗体重鎖可変領域および／または表２Ａに示されるＶＬ１〜ＶＬ１１からなる群から選択される抗体軽鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分、並びにこれらの軽鎖および重鎖可変領域の免疫学的機能性フラグメント、誘導体、変異タンパク質および変異体もまた提供される。
このタイプの抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、一般に式「ＶＨｘ／ＶＬｙ」で表わすことができ、式中、「ｘ」は重鎖可変領域の番号に対応し、「ｙ」は軽鎖可変領域の番号に対応している。
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表２Ｂに記載される各重鎖可変領域は、表２Ａに示される軽鎖可変領域のいずれとも組み合わせて、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を形成することができる。そのような組み合わせの例には、ＶＨ１とＶＬ１〜ＶＬ１１のいずれかとの組み合わせ；ＶＨ２とＶＬ１〜ＶＬ１１のいずれかとの組み合わせ；ＶＨ３とＶＬ１〜ＶＬ１１のいずれかとの組み合わせ；等が含まれる。
ある場合には、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、表２Ａおよび２Ｂに記載のものからの少なくとも１つの重鎖可変領域および／または１つの軽鎖可変領域が含まれる。ある場合には、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、表２Ｂに記載のものからの少なくとも２つの異なる重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域が含まれる。そのような抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の一例では、（ａ）１つのＶＨ１、および（ｂ）ＶＨ２〜ＶＨ１１のうちの１つが含まれる。別の例では、（ａ）１つのＶＨ２、および（ｂ）ＶＨ１またはＶＨ３〜ＶＨ１１のうちの１つが含まれる。さらに別の例では、（ａ）１つのＶＨ３、および（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ２、またはＶＨ５またはＶＨ１１等のうちの１つが含まれる。
そのような抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のさらに別の例では、（ａ）１つのＶＬ１、および（ｂ）ＶＬ２〜ＶＬ１１のうちの１つが含まれる。そのような抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のさらに別の例では、（ａ）１つのＶＬ２、および（ｂ）ＶＬ１、またはＶＬ３−ＶＬ１１等のうちの１つが含まれる。そのような抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のさらに別の例では、（ａ）１つのＶＬ３、および（ｂ）ＶＬ１、ＶＬ２、またはＶＬ４〜ＶＬ１１等のうちの１つが含まれる。
重鎖可変領域の種々の組み合わせは、軽鎖可変領域の種々の組み合わせのいずれとも組み合わせることができる。
別の場合では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、２つの同一な軽鎖可変領域および／または２つの同一な重鎖可変領域を含む。一例として、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、表２Ａおよび２Ｂに記載される軽鎖可変領域の対並びに重鎖可変領域の対を組み合わせた、２つの軽鎖可変領域および２つの重鎖可変領域を含む抗体または免疫学的機能性フラグメントであり得る。
提供されるいくつかの抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸残基のみでＶＨ１〜ＶＨ１１から選択される重鎖可変領域の配列と異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、そのような各配列差異は独立して１個のアミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかであり、該欠失、挿入および／または置換によって上記可変領域配列に対して１５個以下のアミノ酸変化が生じる。いくつかの抗原結合タンパク質およびいくつかの抗原結合タンパク質‐ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分における重鎖可変領域は、ＶＨ１〜ＶＨ１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
ある種の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸残基のみでＶＬ１〜ＶＬ１１から選択される軽鎖可変領域の配列と異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、そのような各配列差異は独立して１個のアミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかであり、該欠失、挿入および／または置換によって上記可変領域配列に対し１５個以下のアミノ酸変化が生じる。いくつかの抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分中の軽鎖可変領域は、ＶＬ１〜ＶＬ１１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
さらなる場合において、抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、以下の軽鎖および重鎖可変領域の対合を含む：ＶＬ１とＶＨ１、ＶＬ２とＶＨ２、ＶＬ３とＶＨ３、ＶＬ４とＶＨ４、ＶＬ５とＶＨ５、ＶＬ６とＶＨ６、ＶＬ７とＶＨ７、ＶＬ８とＶＨ８、ＶＬ９とＶＨ９、ＶＬ１０とＶＨ１０、ＶＬ１１とＶＨ１１。ある場合には、上記対合における抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、特定の可変領域と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
さらに他の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分、例えば、抗体または免疫学的機能性フラグメントには、前述の変異重鎖および変異軽鎖の変異型が含まれる。
抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のＣＤＲ
本明細書で開示される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、一つまたは複数のＣＤＲが移植、挿入および／または連結されたポリペプチドである。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを有し得る。従って、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、例えば、１つの重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）を有し得る。いくつかの抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３の両方が含まれる。具体的な重鎖および軽鎖のＣＤＲは、それぞれ、表３Ａおよび３Ｂで特定される。
所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991(Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883も参照）に記載される方式等の、当業者に周知の付番方式のいずれかを用いて、特定することができる。本明細書で開示されるある種の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、表３Ａ（ＣＤＲＨ）および表３Ｂ（ＣＤＲＬ）に示される一つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列と同一である、または実質的な配列同一性を有する一つまたは複数のアミノ酸配列を含む。
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天然の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分（例えば、抗体）中のＣＤＲの構造および特性は、上に記載されている。簡潔には、従来の抗体において、ＣＤＲは重鎖および軽鎖可変領域のフレームワーク中に組み込まれており、そこで抗原結合および抗原認識に関与する領域を構成している。可変領域は、少なくとも３つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを（例えばKabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD参照；また、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883も参照）、フレームワーク領域（上記Kabat et al., 1991によりフレームワーク領域１〜４を、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と命名；また、上記Chothia and Lesk, 1987も参照）に含んでいる。しかし、本明細書にて提供されるＣＤＲは、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の抗原結合ドメインを決定するために使用できるだけではなく、本明細書に記載の種々の他のポリペプチド構造に組み込むこともできる。
一つの態様では、提供されるＣＤＲは、（ａ）（ｉ）配列番号８３〜８８からなる群から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号８９〜９７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号９８〜１０５からなる群から選択されるＣＤＲＨ３；並びに（ｉｖ）５、４、３、２、または１個以下のアミノ酸の、一つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群から選択されるＣＤＲＨ；（Ｂ）（ｉ）配列番号１０６〜１１１からなる群から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号１１２〜１１９からなる群から選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号１２０〜１２７からなる群から選択されるＣＤＲＬ３；並びに（ｉｖ）５、４、３、２、または１個以下のアミノ酸の、一つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる群から選択されるＣＤＲＬである。
別の態様では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、表３Ａおよび３Ｂに記載されるＣＤＲの１、２、３、４、５、または６個の変異型が含まれ、そのそれぞれは表３Ａおよび３Ｂに記載されるＣＤＲ配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有している。いくつかの抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、表３Ａおよび３Ｂに記載されるＣＤＲのうちの１、２、３、４、５、または６個が含まれ、そのそれぞれはこれらの表に記載されるＣＤＲとは１、２、３、４または５個以下のアミノ酸だけ異なっている。
さらに別の態様では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、以下の組み合わせのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が含まれる：配列番号：１０６、１１２および１２０；配列番号：１０７、１１３、１２１；配列番号１０８、１１４、１２２；配列番号：１１０、１１６、１２４；配列番号：１１１、１１２、１２５；配列番号：１１１、１１２、１２７；配列番号：１１１、１１２、１２５；配列番号：１０７、１１７、１２６；配列番号：１０７、１１８、１２７および配列番号：１０７、１１９、１２６。
さらなる態様では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、以下の組み合わせのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が含まれる：配列番号：８３、８９、および９８；配列番号８４、９０、９９；配列番号：８５、９１、１００；配列番号：８７、９３、１０２；配列番号：８８、８９、１０３；配列番号：８８、８９、１０４；配列番号：８８、９４、１０４；配列番号：８５、９５、１０５；配列番号：８５、９６、１０５；および配列番号：８５、９７、１０５。
別の態様では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、以下の組み合わせのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が含まれる：配列番号：１０６、１１２および１２０並びに配列番号：８３、８９、および９８；配列番号：１０７、１１３、１２１および配列番号８４、９０、９９；配列番号１０８、１１４、１２２および配列番号：８５、９１、１００；配列番号：１１０、１１６、１２４および配列番号：８７、９３、１０２；配列番号：１１１、１１２、１２５および配列番号：８８、８９、１０３；配列番号：１１１、１１２、１２７および配列番号：８８、８９、１０４；配列番号：１１１、１１２、１２５および配列番号：８８、９４、１０４；配列番号：１０７、１１７、１２６および配列番号：８５、９５、１０５；配列番号：１０７、１１８、１２７および配列番号：８５、９６、１０５；並びに配列番号：１０７、１１９、１２６および配列番号：８５、９７、１０５。
コンセンサス配列
さらに別の態様では、本明細書で開示されるＣＤＲには、関連する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分、特にモノクローナル抗体の群に由来するコンセンサス配列が含まれる。本明細書で記載されるとき、「コンセンサス配列」とは、多くの配列で共通している保存アミノ酸および所与のアミノ酸配列中で変化する可変アミノ酸を有するアミノ酸配列を指す。提供されるＣＤＲコンセンサス配列には、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３のそれぞれに対応するＣＤＲが含まれる。
コンセンサス配列は、開示された抗体のＶＨおよびＶＬに対応するＣＤＲの標準的な系統学的分析によって決定され、そのいくつかはβ−ＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４に特異的に結合する。コンセンサス配列は、ＶＨまたはＶＬに対応する同一配列内で、ＣＤＲを隣接させ続けることにより決定された。
軽鎖ＣＤＲ３
１群
ＭＱＡ Ｉ ＥＦＰＷＴ（配列番号１２０）
ＭＱＡ Ｌ ＥＦＰＷＴ（配列番号１２５）
ＭＱＡ Ｘ１ ＥＦＰＷＴ（配列番号１７４）
ここで、Ｘ１はＬまたはＩである。
２群
ＧＴＷＤＳＳＬＳ Ｖ Ｖ Ａ（配列番号１２１）
ＧＴＷＤＳＳＬＳ Ａ Ｖ Ｖ（配列番号１２６）
ＧＴＷＤＳＳＬＳ Ｘ２ Ｖ Ｘ３（配列番号１７５）
ここで、Ｘ２はＶまたはＡでありＸ３はＶまたはＡである。
３群
ＱＱＹＤＮＬＦＴ（配列番号１２２）
４群
ＱＱＹＧＳＡＰＬＴ（配列番号１２３）
５群
ＶＬＹＭＧＳＧＩＷＶ（配列番号１２４）
６群
ＥＴＷＤＳＳＬＳＡＧＶ（配列番号１２７）
軽鎖ＣＤＲ２
１群
ＫＩＳＮＲＦＳ（配列番号１１２）
２群
ＤＮＮ Ｋ ＲＰ （配列番号１１３）
ＤＮＮ Ｎ ＲＰ Ｓ（配列番号１１８）
ＤＮＮ Ｒ ＲＰ Ｓ（配列番号１１７）
ＤＮＮ Ｘ４ ＲＰ Ｘ５（配列番号１７６）
ここで、Ｘ４はＫ、ＮまたはＲであり、Ｘ５はＳであるかまたは存在しない。
３群
ＤＴＳＮＬＥＴ（配列番号１１４）
４群
ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１１５）
５群
ＳＴＮＴＲＳＳ（配列番号１１６）
軽鎖ＣＤＲ１
１群
ＲＳＳＱＳＬＶ Ｙ Ｓ ＤＧＮＴＹＬＳ（配列番号１０６）
ＲＳＳＱＳＬＶ Ｈ Ｙ ＤＧＮＴＹＬＳ（配列番号１１１）
ＲＳＳＱＳＬＶ Ｘ22 Ｙ Ｘ23 ＤＧＮＴＹＬＳ（配列番号１７７）
ここで、Ｘ２２はＨであるかまたは存在せず、Ｘ２３はＳであるかまたは存在しない。
２群
ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号１０７）
３群
ＱＡＳＱＤＩＮＮＹＬＮ（配列番号１０８）
４群
ＲＡＳＱＳＶＳＧＮＹＬＡ（配列番号１０９）
５群
ＧＶＳＳＧＳＶＳＴＲＹＹＰＳ（配列番号１１０）
重鎖ＣＤＲ３
１群
ＧＷＦＤ Ｙ（配列番号９８）
ＧＷＦＤ Ｉ（配列番号１０３）
ＧＷＦＤ Ｆ（配列番号１０４）
ＧＷＦＤ Ｘ６（配列番号１７８）
ここで、Ｘ６はＹ、ＩまたはＦである。
２群
ＧＴＳＦＤＹ（配列番号９９）
３群
ＹＧＧＳＦＤＹ（配列番号１００）
４群
ＭＶＹＶＬＤＹ（配列番号１０１）
５群
ＶＡＧＰＦＤＦ（配列番号１０２）
重鎖ＣＤＲ２
１群
ＷＩＮＰ Ｎ ＳＧＧＴＮＳＡＱＫＦＱＧ（配列番号８９）
ＷＩＮＰ Ｎ ＳＧＧＴＮＳＡＱＫＦＱＧ（配列番号８９）
ＷＩＮＰ Ｎ ＳＧＧＴＮＳＡＱＫＦＱＧ（配列番号８９）
ＷＩＮＰ Ｙ ＳＧＧＴＮＳＡＱＫＦＱＧ（配列番号９４）
ＷＩＮＰ Ｘ7 ＳＧＧＴＮＳＡＱＫＦＱＧ（配列番号１７９）
ここで、Ｘ７はＮまたはＹである。
２群
ＶＩ Ｗ Ｆ ＤＧ Ｒ Ｎ Ｑ ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９０）
ＶＩ Ｇ Ｙ ＤＧ Ｓ Ｙ Ｋ ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９１）
ＶＩ Ｇ Ｙ ＤＧ Ｓ Ｙ Ｋ ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９１）
ＶＩ Ｘ8 8 Ｘ9 ＤＧ Ｘ10 Ｘ11 Ｘ12 ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８０）
ここでＸ８はＷまたはＧであり；Ｘ９はＦまたはＹであり；Ｘ１０はＲまたはＳであり；Ｘ１１はＮまたはＹであり、Ｘ１２はＱまたはＫである。
３群
Ａ ＩＳＧ Ｓ Ｇ Ｖ Ｓ ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９２）
Ｄ ＩＳＧ Ｒ Ｇ Ｇ Ｙ ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９３）
Ｘ13 ＩＳＧ Ｘ14 Ｇ Ｘ15 Ｘ16 ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８１）
ここで、Ｘ１３はＡまたはＤであり；Ｘ１４はＳまたはＲであり；Ｘ１５はＶまたはＧであり；Ｘ１６はＳまたはＹである。
４群
ＶＩ Ｗ ＹＤＧＲＮＥＹ Ｙ ＡＤＳＶＫＧ（配列番号９５）
ＶＩ Ｓ ＹＤＧＳＮＫＹ Ｙ ＡＤＳＶＫＧ（配列番号９６）
ＶＩ Ｗ ＹＤＧＲＮＫＹ Ｈ ＡＤＳＶＫＧ（配列番号９７）
ＶＩ Ｘ17 ＹＤＧＲＮＫＹ Ｘ18 ＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８２）
ここで、Ｘ １７ はＷまたはＳであり、Ｘ １８ はＹまたはＨである。
重鎖ＣＤＲ１
１群
Ｇ Ｙ Ｙ Ｍ Ｈ（配列番号８３）
Ｒ Ｙ Ｇ Ｍ Ｈ（配列番号８４）
Ｓ Ｙ Ｇ Ｍ Ｈ（配列番号８５）
Ｔ Ｙ Ａ Ｍ Ｓ（配列番号８６）
Ｉ Ｙ Ａ Ｍ Ｓ（配列番号８７）
Ａ Ｙ Ｙ Ｍ Ｈ（配列番号８８）
Ｘ19 Ｙ Ｘ20 Ｍ Ｘ21（配列番号１８３）
ここで、Ｘ１９はＡ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＩであり、Ｘ２０はＹ、ＧまたはＡであり、Ｘ２１はＨまたはＳである。
ある場合では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、上記コンセンサス配列のうちの１つを有する少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む。ある場合では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、上記コンセンサス配列のうちの１つを有する少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む。他の場合では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、上記コンセンサス配列に記載の少なくとも２つの重鎖ＣＤＲ、および／または上記コンセンサス配列に記載の少なくとも２つの軽鎖ＣＤＲを含む。さらに他の場合、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、上記コンセンサス配列に記載の少なくとも３つの重鎖ＣＤＲ、および／または上記コンセンサス配列に記載の少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
ＦＧＦＲ結合ペプチド
ＦＧＦＲ、例えば、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、またはＦＧＦＲ４に特異的に結合するペプチドもまた提供される。そのようなペプチドは、重鎖の構成要素を形成することができ、同様に、β−Ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する抗体等の抗原結合タンパク質の構成要素を形成することができる。挿入によって、抗体の特異性を、単一の標的に対する特異性から、２つ以上の異なる標的と会合および／または特異的に結合する能力に変えることができる。様々な実施形態において、開示されたペプチドは、本明細書に記載の、重鎖のＦｃ領域のＣＨ２またはＣＨ３ループ領域に挿入される。
ペプチドライブラリーをスクリーニングし、ＥＬＩＳＡ実験を行って結合性を測定し、その結果、いくつかのペプチドがＦＧＦＲ、例えば、ＦＧＦＲ１ｃに結合した。表４Ａにより、同定されたＦＧＦＲ１ｃ結合ペプチドの例が開示される（図１２も参照）：
Figure 2013523184
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ＦＧＦＲ結合ペプチドを含む完全長重鎖
重鎖可変領域の例が提供されているので、別の態様では、表４Ａに開示されるペプチド等のＦＧＦＲ結合ペプチドを含む抗原結合タンパク質の重鎖が提供される。本態様では、ＦＧＦＲ結合ペプチドは重鎖の一次配列に挿入され、重鎖の統合された構成要素を形成する。ＦＧＦＲ結合ペプチドは重鎖のいかなるポイントにも位置することができ、一例では、ＦＧＦＲ結合ペプチドは重鎖のＣＨ２またはＣＨ３ループに位置している。
ＦＧＦＲ結合ペプチドは、隣接残基により、Ｎ、Ｃまたは両方の末端に隣接することができる。グリシン残基等の隣接残基により、隣接するシステイン残基間にジスルフィド結合の形成がもたらされる柔軟性レベルが得られ得る。一例では、表４Ａに示されるもの等のＦＧＦＲ結合ペプチドは、ＧＧＣ残基によってＮ末端に、ＣＧＧ残基によってＣ末端に隣接することができる。フランキング配列は１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基を含み得る。
Figure 2013523184
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抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の例
一態様によれば、（Ａ）（ｉ）配列番号８３〜８８からなる群から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号８９〜９７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号９８〜１０５からなる群から選択されるＣＤＲＨ３；並びに（ｉｖ）５、４、３、２または１個以下のアミノ酸の一つもしくは複数のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群から選択される一つもしくは複数の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）；（Ｂ）（ｉ）配列番号１０６〜１１１からなる群から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号１１２〜１１９からなる群から選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号１２０〜１２７からなる群から選択されるＣＤＲＬ３；並びに（ｉｖ）５、４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の一つもしくは複数のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる群から選択される一つもしくは複数の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）；または（Ｃ）（Ａ）の一つもしくは複数の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の一つもしくは複数の軽鎖ＣＤＲＬ、を含む単離された抗原結合タンパク質。
別の実施形態では、ＣＤＲＨは配列番号８３〜１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有し、および／またはＣＤＲＬは配列番号１０６〜１２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する。更なる実施形態において、ＶＨは配列番号７２〜８２からなる群から選択され、および／またはＶＬは配列番号６１〜７１からなる群から選択される。
一態様によれば、（Ａ）（ｉ）配列番号７２〜８２；および（ｉｉ）５、４、３、４、２もしくは１個以下のアミノ酸の一つもしくは複数のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を含む（ｉ）のＶＨ、からなる群から選択される一つもしくは複数の重鎖可変領域（ＶＨ）；（Ｂ）（ｉ）配列番号６１〜７１、および（ｉｉ）５、４、３、２または１個以下のアミノ酸の一つもしくは複数のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を含む（ｉ）のＶＬからなる群から選択される一つもしくは複数の軽鎖可変領域（ＶＬ）；または（Ｃ）（Ａ）の一つもしくは複数の重鎖可変領域および（Ｂ）の一つもしくは複数の軽鎖可変領域を含む単離された抗原結合タンパク質。
別の実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号７２〜８２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号６１〜７１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する。
一つの態様では、β−Ｋｌｏｔｈｏと会合したとき、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＲＦ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃまたはＦＧＦＲ４由来のアミノ酸残基を含むエピトープ（eptiope）と会合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分もまた提供される。特定の一実施形態において、エピトープはＦＧＦＲ１ｃ由来のアミノ酸残基を含む。
一つの態様では、β−Ｋｌｏｔｈｏ由来のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分もまた提供される。
別の態様では、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、またはＦＧＦＲ４由来のアミノ酸残基の両方から得たアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分もまた提供される。
更に別の実施形態において、本明細書の上記に記載の単離された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、本明細書で開示されるＣＤＲＨコンセンサス配列のうちの少なくとも１つを含む第一アミノ酸配列、および本明細書で開示されるＣＤＲＬコンセンサス配列のうちの少なくとも１つを含む第二アミノ酸配列を含む。一つの態様では、第一のアミノ酸配列はＣＤＲＨコンセンサス配列のうちの少なくとも２つを含み、および／または第二のアミノ酸配列はＣＤＲＬコンセンサス配列のうちの少なくとも２つを含む。
ある実施形態では、第一および第二のアミノ酸配列は互いに共有結合している。
更なる実施形態では、単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第一アミノ酸配列は、配列番号９８のＣＤＲＨ３、配列番号８９のＣＤＲＨ２、および配列番号８３のＣＤＲＨ１を含み、並びに／または単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第二アミノ酸配列は、配列番号１２０のＣＤＲＬ３、配列番号１１２のＣＤＲＬ２、および配列番号１０６のＣＤＲＬ１を含む。
別の実施形態では、単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第一アミノ酸配列は、配列番号９９のＣＤＲＨ３、配列番号９０のＣＤＲＨ２、および配列番号８４のＣＤＲＨ１を含み、並びに／または単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第二アミノ酸配列は、配列番号１２１のＣＤＲL３、配列番号１１３のＣＤＲL２、および配列番号１０７のＣＤＲL１を含む。
更なる実施形態において、単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第一アミノ酸配列は配列番号１００のＣＤＲＨ３、配列番号９１のＣＤＲＨ２、および配列番号８５のＣＤＲＨ１を含み、並びに／または単離された抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第二アミノ酸配列は、配列番号１２２のＣＤＲL３、配列番号１１４のＣＤＲL２、および配列番号１０８のＣＤＲL１を含む。
別の実施形態では、単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第一アミノ酸配列は、配列番号１０２のＣＤＲＨ３、配列番号９３のＣＤＲＨ２、および配列番号８７のＣＤＲＨ１を含み、並びに／または単離された抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第二アミノ酸配列は、配列番号１２４のＣＤＲL３、配列番号１１６のＣＤＲL２、および配列番号１１０のＣＤＲL１を含む。
更なる実施形態において、単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第一アミノ酸配列は、配列番号１０３のＣＤＲＨ３、配列番号８９のＣＤＲＨ２、および配列番号８８のＣＤＲＨ１を含み、および／または単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第二アミノ酸配列は、配列番号１２５のＣＤＲL３、配列番号１１２のＣＤＲL２、および配列番号１１１のＣＤＲL１を含む。
別の実施形態では、単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第一アミノ酸配列は、配列番号１０４のＣＤＲＨ３、配列番号８９のＣＤＲＨ２、および配列番号８８のＣＤＲＨ１を含み、および／または単離された抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第二アミノ酸配列は、配列番号１２７のＣＤＲL３、配列番号１１２のＣＤＲL２、および配列番号１１１のＣＤＲL１を含む。
別の実施形態では、単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第一アミノ酸配列は、配列番号１０４のＣＤＲＨ３、配列番号９４のＣＤＲＨ２、および配列番号８８のＣＤＲＨ１を含み、並びに／または単離された抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第二アミノ酸配列は、配列番号１２５のＣＤＲL３、配列番号１１２のＣＤＲL２、および配列番号１１１のＣＤＲL１を含む。
更なる実施形態において、単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第一アミノ酸配列は、配列番号１０５のＣＤＲＨ３、配列番号９５のＣＤＲＨ２、および配列番号８５のＣＤＲＨ１を含み、および／または単離された抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第二アミノ酸配列は、配列番号１２６のＣＤＲL３、配列番号１１７のＣＤＲL２、および配列番号１０７のＣＤＲL１を含む。
別の実施形態では、単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第一アミノ酸配列は、配列番号１０５のＣＤＲＨ３、配列番号９６のＣＤＲＨ２、および配列番号８５のＣＤＲＨ１を含み、並びに／または単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第二アミノ酸配列は、配列番号１２７のＣＤＲL３、配列番号１１８のＣＤＲL２、および配列番号１０７のＣＤＲL１を含む。
別の実施形態では、単離された抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第一アミノ酸配列は、配列番号１０５のＣＤＲＨ３、配列番号９７のＣＤＲＨ２、および配列番号８５のＣＤＲＨ１を含み、および／または単離された抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の第二アミノ酸配列は、配列番号１２６のＣＤＲL３、配列番号１１９のＣＤＲL２、および配列番号１０７のＣＤＲL１を含む。
更なる実施形態において、抗原結合タンパク質は、表３Ａに示される重鎖配列Ｈ１〜Ｈ１１のうちの少なくとも１つのＣＤＲＨ配列または表５Ａに示される１Ａ２−ＳＲ４、２Ｇ１０−ＳＲ４、１４Ｅ８−ＳＲ４、２５Ｂ１０−ＳＲ４、１Ａ２−Ｒｍ２６、１Ａ２−Ｒｍ４０、２Ｇ１０−Ｒｍ２６、２Ｇ１０−Ｒｍ４０を含む。また、さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は、表３Ｂに示される軽鎖配列Ｌ１〜Ｌ１１のうちの少なくとも１つのＣＤＲＬ配列を含む。
また、さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は、表３Ａに示される重鎖配列Ｈ１〜Ｈ１１のうちの少なくとも２つのＣＤＲＨ配列、または表５Ａに示される１Ａ２−ＳＲ４、２Ｇ１０−ＳＲ４、１４Ｅ８−ＳＲ４、２５Ｂ１０−ＳＲ４、１Ａ２−Ｒｍ２６、１Ａ２−Ｒｍ４０、２Ｇ１０−Ｒｍ２６、２Ｇ１０−Ｒｍ４０、および表３Ｂに示される軽鎖配列Ｌ１〜Ｌ１１のうちの少なくとも２つのＣＤＲＬ配列を含む。
さらに別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、表３Ａに示される重鎖配列Ｈ１〜Ｈ１１のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列、または表５Ａに示される１Ａ２−ＳＲ４、２Ｇ１０−ＳＲ４、１４Ｅ８−ＳＲ４、２５Ｂ１０−ＳＲ４、１Ａ２−Ｒｍ２６、１Ａ２−Ｒｍ４０、２Ｇ１０−Ｒｍ２６、２Ｇ１０−Ｒｍ４０を含む。更に別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、表３Ｂに示される軽鎖配列Ｌ１〜Ｌ１１のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。
更に別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ｌ１およびＨ１、もしくはＬ２およびＨ２、もしくはＬ３およびＨ３、もしくはＬ４およびＨ４、もしくはＬ５およびＨ５、Ｌ６およびＨ６、Ｌ７およびＨ７、Ｌ８およびＨ８、Ｌ９およびＨ９、Ｌ１０およびＨ１０もしくはＬ１１およびＨ１１の６つ全てのＣＤＲ、または表６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示される１Ａ２−ＳＲ４、２Ｇ１０−ＳＲ４、１４Ｅ８−ＳＲ４、２５Ｂ１０−ＳＲ４、１Ａ２−Ｒｍ２６、１Ａ２−Ｒｍ４０、２Ｇ１０−Ｒｍ２６および２Ｇ１０−Ｒｍ４０のうちの６つのＣＤＲを含む。
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一つの態様では、本明細書にて提供される、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異的抗体、またはそれらの抗体フラグメントであり得る。
別の実施形態では、本明細書にて提供される単離された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、または一本鎖抗体分子であり得る。
更なる実施形態において、本明細書にて提供される、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、ヒト抗体であり、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型またはＩｇＧ４型であり得る。
別の実施形態では、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、表１および５に記載される軽鎖または重鎖ポリペプチドのみを含む。いくつかの実施形態では、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、表２に記載されるもの等の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のみから成る。そのような抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、一つまたは複数のＰＥＧ分子、例えば５Ｋ、１０Ｋ、２０Ｋ、４０Ｋ、５０Ｋ、６０Ｋ、８０Ｋ、１００Ｋまたは１００Ｋ超からなる群から選択される分子量を有するＰＥＧ分子でペグ化することができる。
さらに別の態様では、本明細書にて提供される、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、標識基にカップリングすることができ、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数の細胞外部分への結合能において、本明細書にて提供される単離された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のうちの一つの抗原結合タンパク質と競合することができる。一実施形態において、本明細書にて提供される単離された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、患者に投与したとき、血糖値を減少、トリグリセリドおよびコレステロールレベルを減少、または他の血糖パラメーターおよび心血管リスク因子を改善することができる。
示された配列由来の２つ以上のＣＤＲを含むあらゆる抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分について、示された配列から独立して選択されるＣＤＲのいかなる組み合わせも有用であることは十分に理解されるであろう。従って、１、２、３、４、５または６個の独立して選択されたＣＤＲを有する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を生成することができる。しかし、十分に理解されることであろうが、特定の実施形態では通常、反復的でないＣＤＲの組み合わせが使用され、例えば、抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は通常、２つのＣＤＲＨ２領域等からは作成されない。
本明細書にて提供される、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のいくつかについては、以下により詳細に記載される。
抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分並びに結合エピトープおよび結合ドメイン
例えば、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分が、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数、またはその細胞外領域上のエピトープに結合すると言われる場合に、それが意味することは、該抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分が、β−Ｋｌｏｔｈｏの特定の部分またはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＲＲ４のうちの一つもしくは複数を含む複合体の特定の部分に特異的に結合するということである。いくつかの実施形態では、例えば、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分がβ-Ｋｌｏｔｈｏにのみ結合する場合に、該抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、特定の残基（例えば、β-Ｋｌｏｔｈｏの特定のセグメント）から成るポリペプチドに特異的に結合することができる。他の実施形態では、例えば、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分が、β−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４のうちの一つまたは複数の両方と相互作用する場合に、該抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分がどの受容体を認識するかに応じて、該抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃまたはＦＧＦＲ４の両方における残基、残基配列、または領域に結合するであろう。さらに他の実施形態において、抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃを含む複合体の残基、配列もしくは残基または領域に結合するであろう。上記実施形態のいずれにおいても、そのような抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、通常、β−Ｋｌｏｔｈｏ並びに／またはＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数のすべての残基と接触する必要はない。β−Ｋｌｏｔｈｏおよび／もしくはＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃもしくはＦＧＦＲ４、またはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数、または列挙されたタンパク質もしくは複合体の細胞外領域中のすべてのアミノ酸置換または欠失が必ずしも結合親和性に有意に影響するわけではない。
抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のエピトープ特異性および結合ドメインは、種々の方法によって決定できる。例えば、いくつかの方法では抗原の切断された部分が使用され得る。他の方法では、例えば、アラニンスキャニングもしくはアルギニンスキャニングタイプの手法を使用することにより、または種々のドメイン、領域もしくはアミノ酸が２つのタンパク質間で交換されるキメラタンパク質の生成と研究により、またはプロテアーゼ保護アッセイにより、一つまたは複数の特定の残基で変異した抗原が使用される。
競合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分
別の態様では、本明細書に記載のエピトープに結合している例示された抗体または機能性フラグメントの一つと、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数への特異的結合に対して競合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分が提供される。そのような抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、本明細書で例示した抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のうちの一つと同一のエピトープ、または重複するエピトープに結合することもできる。例示した抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分と同一のエピトープと競合または結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分並びにそのフラグメントは、同様の機能特性を示すことが予想される。例示した抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分並びにそのフラグメントには、それぞれ、重鎖および軽鎖、可変領域ドメインＶＬ１〜ＶＬ１１およびＶＨ１〜ＶＨ１１、並びに表１および３に含まれるＣＤＲを有するものが含まれる。従って、具体例として、提供される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、以下を有する抗体またはフラグメントと競合するものが含まれる：
（ａ）表３に記載される抗体のために記載されたＣＤＲの６つ全て；
（ｂ）表２に記載される抗体のためのＶＬ１〜ＶＬ１１およびＶＨ１〜ＶＨ１１から選択されるＶＨおよびＶＬ；または
（ｃ）表１および５に記載される抗体のための明記された２つの軽鎖および２つの重鎖
従って、一実施形態では、本開示はβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数への結合に対して参照抗体と競合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を提供し、該参照抗体は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ０またはＬ１１Ｈ１１からなる群から選択される軽鎖および重鎖可変領域配列の組み合わせを含む。
別の実施形態では、本開示は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数への結合に対して参照抗体と競合するヒト抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を提供し、該参照抗体は１Ａ２、２Ｇ１０、１４Ｅ８、２５Ｂ１０、３Ｂ４、１Ｂ５、１０Ｈ３、９Ｄ１０、３Ｆ４または８Ｆ９を含む。
さらなる実施形態では、１Ａ２、２Ｇ１０、１４Ｅ８、２５Ｂ１０、３Ｂ４、１Ｂ５、１０Ｈ３、９Ｄ１０、３Ｆ４または８Ｆ９からなる群から選択される参照抗体と実質的に同じＫｄで、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイにおいて該参照抗体と同程度にＦＧＦ２１様シグナル伝達を惹起し、血糖を低下させ、血清脂質レベルを低下させ、並びに／または該参照抗体とβ−Ｋｌｏｔｈｏもしくはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数への結合に対して競合する、単離されたヒト抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分が提供される。
抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分との競合能は、あらゆる適切なアッセイを用いて測定することができ、その中で１Ａ２、２Ｇ１０、１４Ｅ８、２５Ｂ１０、３Ｂ４、１Ｂ５、１０Ｈ３、９Ｄ１０、３Ｆ４、８Ｆ９、１Ａ２−ＳＲ４、２Ｇ１０−ＳＲ４、１４Ｅ８−ＳＲ４、２５Ｂ１０−ＳＲ４、１Ａ２−Ｒｍ２６、１Ａ２−Ｒｍ４０、２Ｇ１０−Ｒｍ２６、または２Ｇ１０−Ｒｍ４０が参照抗体として使用され得る。
モノクローナル抗体
提供される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に結合し、様々な程度でＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘導するモノクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、該技術分野で周知のあらゆる技術を用いて、例えば、免疫スケジュール完了後の遺伝子導入動物から回収した脾臓細胞を不死化することによって生成することができる。脾臓細胞は、該技術分野において周知のあらゆる技術を用いて、例えば、それらを骨髄腫細胞と融合しハイブリドーマを作成することによって不死化することができる。ハイブリドーマ作成融合法で用いる骨髄腫細胞は、好ましくは非抗体産生型であり、高い融合効率、および所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの生育を支援するある種の選択培地中で生育できないようにする酵素欠損症を有する。マウス融合で用いる適切な細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７およびＳ１９４／５ＸＸＯ Ｂｕｌが含まれ；ラット融合で用いる細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
ある例では、ハイブリドーマ細胞株は、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有する遺伝子導入動物）を、ＦＧＦＲ１ｃ、β-ＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦＲ１ｃおよび／もしくはβ-Ｋｌｏｔｈｏの免疫原（例えば、実施例２および３に示されるＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃもしくはＦＧＦＲ４および／もしくはβ-Ｋｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン、実施例１および３に示されるＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃもしくはＦＧＦＲ４および／もしくはβ-Ｋｌｏｔｈｏの細胞外ドメインが発現された膜、または実施例１および３に示されるＦＧＦＲ１ｃおよび／もしくはβ-Ｋｌｏｔｈｏを発現している細胞全体を含む可溶性複合体）で免疫し、前記免疫動物から脾臓細胞を回収し、回収した脾臓細胞を骨髄腫細胞株と融合することによりハイブリドーマ細胞を作成し、該ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を確立し、β-Ｋｌｏｔｈｏまたはβ-Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数（例えば、本明細書に記載）に特異的に結合し、ＦＧＦ２１様シグナル伝達（例えば、実施例５〜７に記載）を誘導できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定することによって、作成される。そのようなハイブリドーマ細胞株、およびそれらによって産生されたモノクローナル抗体により本開示の態様が形成される。
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、該技術分野において周知のあらゆる技術を用いて精製することができる。ハイブリドーマまたはｍＡｂをさらにスクリーニングして、ＦＧＦ２１様シグナル伝達の誘導能等の特定の性質を有するｍＡｂを同定することができる。そのようなスクリーニングの例は、本明細書にて提供される。
キメラおよびヒト化抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分
開示された配列に基づくキメラおよびヒト化の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分（例えば、モノクローナル抗体等の抗体）もまた提供される。治療薬として用いるモノクローナル抗体は、使用前に様々な方法で改変される。一例としてはキメラ抗体が挙げられるが、該抗体は、共有結合して機能性免疫グロブリンの軽鎖もしくは重鎖またはその免疫機能性部分を生成する異なる抗体に由来するタンパク質セグメントから成る抗体である。一般に、重鎖および／または軽鎖の部分は、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一または相同であるが、鎖の残部は別の種に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一または相同である。キメラ抗体に関する方法としては、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ＣＤＲグラフティングは、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号、および第５，５３０，１０１号に記載される。
一般に、キメラ抗体を作成する目的は、意図した患者の種に由来するアミノ酸の数が最大化されたキメラを作ることである。一つの例は「ＣＤＲ移植」抗体であり、その中で該抗体は特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する一つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、抗体鎖の残部は別の種に由来する、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同である。ヒトでの使用用に、げっ歯類抗体由来の可変領域または選択されたＣＤＲがしばしばヒト抗体に、ヒト抗体の天然の可変領域またはＣＤＲを置換することで移植される。
キメラ抗体の一つの有用な種類は「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は非ヒト動物で最初に産生されたモノクローナル抗体から作成される。この抗体中のある種のアミノ酸残基は、典型的には該抗体の非抗原認識部分に由来するものであり、対応するアイソタイプのヒト抗体における対応する残基と相同となるよう改変される。例えば、種々の方法を用いて、げっ歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域で置換することにより、ヒト化を行うことができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号，および同第５，６９３，７６２号；Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536を参照）。
一つの態様では、本明細書にて提供される抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲ（表３および６を参照）が、同一または異なる系統種から得られた抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）に移植される。例えば、重鎖および軽鎖可変領域ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４もしくはＶＨ５および／またはＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４もしくはＶＬ５のＣＤＲが、コンセンサスヒトＦＲに移植され得る。コンセンサスヒトＦＲを作成するために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖のアミノ酸配列由来のＦＲを整列させることで、コンセンサスアミノ酸配列を同定することができる。他の実施形態では、本明細書で開示される重鎖または軽鎖のＦＲが、異なる重鎖または軽鎖由来のＦＲで置換される。一つの態様では、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の重鎖および軽鎖のＦＲにおける稀アミノ酸は置換されないが、残りのＦＲのアミノ酸は置換される。「稀アミノ酸」とは、ある位置に存在する特定のアミノ酸であり、通常、ＦＲ中のその位置にこの特定のアミノ酸は見られない。あるいは、１つの重鎖または軽鎖に由来する移植された可変領域は、本明細書に記載されるその特定の重鎖または軽鎖の定常領域とは異なる定常領域と共に使用され得る。他の実施形態では、移植された可変領域は、一本鎖Ｆｖ抗体の一部である。
ある実施形態では、ヒト以外の種に由来する定常領域が、ヒト可変領域と共に使用され、ハイブリッド抗体が作成され得る。
完全ヒト抗体
完全ヒト抗体もまた、本開示により提供される。ヒトを抗原に曝露することなく、所与の抗原に特異的な完全ヒト抗体を作成するための方法が利用可能である（「完全ヒト抗体」）。完全ヒト抗体の生成を実行するために提供される１つの具体的な手段は、マウス体液性免疫機構の「ヒト化」である。ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の、内在性Ｉｇ遺伝子が非活性化されているマウスへの導入は、あらゆる所望の抗原で免疫化可能な動物であるマウスにおいて、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を生成する１つの手段である。完全ヒト抗体の使用は、マウスまたはマウス由来ｍＡｂｓを治療薬としてヒトに投与することにより往々引き起こされ得る、免疫原性およびアレルギー性の反応を最小限にすることができる。
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生なしで、ヒト抗体レパートリーを産生する能力がある遺伝子導入動物（通常、マウス）を免疫化することによって、産生することができる。この目的に用いられる抗原は、通常、６個以上の連続したアミノ酸を有し、所望によりハプテン等の担体に複合される。例えば、Jakobovits et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., (1993) Nature 362:255-258; and Bruggermann et al., (1993) Year in Immunol. 7:33を参照されたい。そのような方法の一例では、マウスにおけるマウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖をコードしている内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能力化し、該マウスゲノムにヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含むヒトゲノムＤＮＡの大断片を挿入することにより、遺伝子導入動物は作成される。部分的に改変された動物は、全てのヒト免疫グロブリン遺伝子座を有していないが、その後交雑することにより所望の免疫系改変の全てを有する動物が得られる。免疫原を投与されたとき、これらの遺伝子導入動物は、免疫原に対し免疫特異的であるがマウスではなくヒトのアミノ酸配列、例えば可変領域を有する抗体を産生するそのような方法のさらなる詳細に関しては、例えば、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９４／０２６０２を参照されたい。ヒト抗体を作成するための遺伝子導入マウスに関するさらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号；同第６，７１３，６１０号；同第６，６７３，９８６号；同第６，１６２，９６３号；同第５，５４５，８０７号；同第６，３００，１２９号；同第６，２５５，４５８号；同第５，８７７，３９７号；同第５，８７４，２９９号および同第５，５４５，８０６号；国際公開第ＷＯ９１／１０７４１号、同第ＷＯ９０／０４０３６号、並びにＥＰ５４６０７３Ｂ１およびＥＰ５４６０７３Ａ１に記載されている。
上記の遺伝子導入マウスは、本明細書では「ＨｕＭａｂ」マウスと称され、未組換えのヒトの重鎖（［μ、ミュー］および［γ、ガンマ］）並びに［κ、カッパ］軽鎖の免疫グロブリン配列を、内因性μ［ミュー］およびκ［カッパ］鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異と共にコードするヒト免疫グロブリン遺伝子の小座位（ minilocus）を含む（Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859）。従って、前記マウスのマウスＩｇＭまたは［κ、カッパ］の発現は減少し、免疫化に応答して、導入されたヒトの重鎖および軽鎖導入遺伝子によりクラススイッチおよび体細胞突然変異が引き起こされ、高親和性のヒトＩｇＧ［κ、カッパ］モノクローナル抗体が産生される（Lonberg et al., supra.; Lonberg and Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding and Lonberg, (1995) Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭａｂマウスの作成については、Taylor et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368:856-859; Lonberg, (1994) Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg and Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, (1995) Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851で詳細に記述がなされており；上記参考文献はその全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号；並びに米国特許第５，５４５，８０７号；国際公開第ＷＯ９３／１２２７号；同第ＷＯ９２／２２６４６号；および同第ＷＯ９２／０３９１８号を参照（その全ての開示全体が参照によりあらゆる目的で本明細書に組み込まれる）。これらの遺伝子導入マウスにおいてヒト抗体を産生するために用いる技術もまた、ＷＯ９８／２４８９３、およびMendez et al., (1997) Nature Genetics 15:146-156（参照により本明細書に組み込まれる）で開示されている。例えば、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２遺伝子導入マウス系統は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に結合してＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘導する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を生成するのに用いることができる。遺伝子導入マウスを用いるヒト抗体作成に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例で提供される。
ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂは、上記のような遺伝子導入マウスから作成および選択可能である。そのような抗体は、適切なベクターおよび宿主細胞を用いることでクローン化および発現でき、あるいは該抗体はハイブリドーマ培養細胞から回収できる。
完全ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーから得ることもできる（Hoogenboom et al., (1991) J. Mol. Biol. 227:381; and Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222:581で開示される）。ファージディスプレイ技術は、糸状バクテリオファージ表面上への抗体レパートリーの提示と、続く選択された抗原への結合によるファージの選択を通じて、免疫選択を模倣している。そのような技術の一つは国際公開第ＷＯ９９／１０４９４号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、そのような手法を用いた、ＭＰＬ受容体およびｍｓｋ受容体に対し高親和性であり且つ機能性アゴニストとして働く抗体の単離について記載されている。
二重特異性または二機能性の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分
また、提供される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、本明細書に記載の一つもしくは複数のＣＤＲまたは一つもしくは複数の可変領域を含む二重特異性および二機能性の抗体も含まれる。二重特異性または二機能性の抗体は、場合によっては、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体であり得る。二重特異性抗体は、種々の方法、例えば、限定はされないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結によって、作成され得る。例えば、Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553を参照されたい。一実施形態において、本開示の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に結合することができ、それにより実施例５〜７に記載されるＦＧＦ２１様機能およびシグナル伝達アッセイによって測定されるＦＧＦ２１様活性の活性化を引き起こし得る。
抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体
ＦＧＦ−２１のＮ末端はＦＧＦ受容体に対する特異性を与えるが、ＦＧＦ−２１のＣ末端はβ−Ｋｌｏｔｈｏに対する特異性を与えることが明らかにされた。従って、成熟ＦＧＦ２１のシグナル伝達能を模倣し、（ａ）β−Ｋｌｏｔｈｏに対する特異性を有する抗原結合タンパク質成分、および（ｂ）ＦＧＦ２１受容体に対する特異性を保持するＦＧＦ２１ポリペプチド配列の可変長Ｎ末端を含むＦＧＦ２１成分を含み得る抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が設計可能である。あるいは、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、（ａ）一つまたは複数のＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４に対する特異性を有する抗原結合タンパク質成分、並びに（ｂ）β−Ｋｌｏｔｈｏに対する特異性を保持するＦＧＦ２１ポリペプチド配列の可変長Ｃ末端を含むＦＧＦ２１成分を含み得る。所望により、ＦＧＦ２１成分を抗原結合タンパク質成分に連結するために、リンカーが含まれ得る。このようにして、本開示の別の態様では、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が提供される。
一実施形態において、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、（ａ）β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質成分；並びに（ｂ）ＦＧＦ２１の切断型を含むＦＧＦ２１成分を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合し、ヒトＦＧＦ２１の切断型を含むＦＧＦ２１成分と融合した抗原結合タンパク質成分を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質成分は、表１〜３および６の抗原結合タンパク質から選択される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１成分には、配列番号３４１の２５〜１８０のアミノ酸が含まれる。特定の一実施形態において、抗原結合タンパク質成分は、抗体２Ｇ１０であり、ＦＧＦ２１成分は、ＦＧＦ２１の残基１〜１７０（配列番号３４３）を含む。
融合体のＦＧＦ２１成分は、抗原結合タンパク質成分の重鎖または軽鎖のいずれかのＮ末端で、融合体の抗原結合タンパク質成分に直接連結され得る。他の実施形態では、融合体のＦＧＦ２１成分は、抗原結合タンパク質成分の重鎖のＣ末端で、融合体の抗原結合タンパク質成分に直接連結され得る。所望により、抗原結合タンパク質の重鎖のＮもしくはＣ末端のいずれかで、または抗原結合タンパク質の軽鎖のＮ末端で、融合体の前記成分を互いに連結するために、リンカーを使用することができる。
開示された抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、（ｉ）完全長成熟型のＦＧＦ２１と同様また同等のｉｎ ｖｉｖｏ効力；（ｉｉ）ＦＧＦ２１受容体またはβ−Ｋｌｏｔｈｏに対する高い結合親和性および特異性；（ｉｉｉ）切断型ＦＧＦ−２１の天然配列の存在により減少した免疫原性；並びに（ｉｖ）抗体に特有な延長された半減期等の種々の特徴を提示し得る。
抗原結合タンパク質成分
抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、（ａ）β−Ｋｌｏｔｈｏ、（ｂ）ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数、または（ｃ）β−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合するタンパク質を含む。抗原結合タンパク質の特異性は融合体の全体構造に依存するが、全ての設計がＦＧＦ２１のシグナル伝達活性を模倣する融合体を生成することが好ましい。本明細書に記載のいずれの抗原結合タンパク質型も、抗体、ヘミボディ（hemibodies）、Ｆａｂフラグメント等の融合体で採用され得る。表１〜３および６に提供された抗原結合タンパク質およびその構成要素（例えば、重鎖、軽鎖、可変領域およびＣＤＲ）は、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合成分として機能し得る。
一実施形態において、抗原結合タンパク質成分はβ−Ｋｌｏｔｈｏに特異的に結合する。本実施形態において、前記融合体のＦＧＦ２１成分は、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数と特異的と会合し、ＦＧＦ２１のＮ末端切断型を含むだろう。抗原結合成分は、β−Ｋｌｏｔｈｏに加えて、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数にも結合できる。
別の実施形態では、抗原結合タンパク質成分は、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する。本実施形態において、前記融合体のＦＧＦ２１成分は、β−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に会合し、ＦＧＦ２１のＣ末端切断型を含むだろう。抗原結合タンパク質成分は、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に加えて、β−Ｋｌｏｔｈｏにも結合できる。
抗原結合成分が抗体である場合、抗体は、クローン１Ａ２、２Ｇ１０、１４Ｅ８、２５Ｂ１０、３Ｂ４、１Ｂ５、１０Ｈ３、９Ｄ１０、３Ｆ４、および８Ｆ９から分泌されるもの等、表１〜３および６に記載されるもの等の本明細書にて提供される抗体を含み得る。Ｆａｂフラグメントおよび可変領域を含む、開示されたＣＤＲの一つまたは複数を含む抗体もまた、抗原結合タンパク質成分に使用され得る。
ＦＧＦ−２１成分
抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体のＦＧＦ２１成分は、少なくとも２５個のアミノ酸長である、いかなる長さのＦＧＦ２１も含むことができる。
様々な実施形態において、抗原結合タンパク質のＦＧＦ２１成分は、２５〜１８０個のアミノ酸、例えば１８０、１７９、１７８、１７７、１７６、１７５，１７４、１７３、１７２、１７１、１７０、１６９、１６８、１６７、１６６、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０または２５個のアミノ酸を含むＦＧＦ２１（配列番号３４１）のフラグメントを含む。ＦＧＦ２１成分は、Ｎ末端、Ｃ末端または両方のＣ末端から切断されており２５〜１８０個のアミノ酸を含むフラグメントを生成する配列番号３４１のフラグメントであり得る。
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１成分は、Ｃ末端で切断されたＦＧＦ２１配列（例えば、配列番号３４１）を含み得る。例えば、ＦＧＦ２１成分は、配列番号３４１の残基１〜１８０、１〜１７９、１〜１７８、１〜１７７、１〜１７６、１〜１７５、１〜１７４、１〜１７３、１〜１７２、１〜１７１、１〜１７０、１〜１６９、１〜１６８、１〜１６７、１〜１６６、１〜１６５、１〜１６０、１〜１５５、１〜１５０、１〜１４５、１〜１４０、１〜１３５、１〜１３０、１〜１２５、１〜１２０、１〜１１５、１〜１１０、１〜１０５、１〜１００、１〜９５、１〜９０、１〜８５、１〜８０、１〜７５、１〜７０、１〜６５、１〜６０、１〜５５、１〜５０、１〜４５、１〜４０、１〜３５、１〜３０または１〜２５を含み得る。
他の実施形態では、ＦＧＦ２１成分は、Ｎ末端上で切断されたＦＧＦ２１配列（例えば、配列番号３４１）を含み得る。例えば、ＦＧＦ２１成分は残基２〜１８１、３〜１８１、４〜１８１、５〜１８１、６〜１８１、７〜１８１、８〜１８１、９〜１８１、１０〜１８１、１１〜１８１、１２〜１８１、１３〜１８１、１４〜１８１、１５〜１８１、２０〜１８１、２５〜１８１、３０〜１８１、３５〜１８１、４０〜１８１、４５〜１８１、５０〜１８１、５５〜１８１、６０〜１８１、６５〜１８１、７０〜１８１、７５〜１８１、８０〜１８１、８５〜１８１、９０〜１８１、９５〜１８１、１００〜１８１、１０５〜１８１、１１０〜１８１、１１５〜１８１、１２０〜１８１、１２５〜１８１、１３０〜１８１、１３５〜１８１、１４０〜１８１、１４５〜１８１、１５０〜１８１、１５５〜１８１、１６０〜１８１または１６５〜１８１を含み得る。
さらに他の実施形態において、ＦＧＦ２１成分は、ＮおよびＣ末端の両方で切断されたＦＧＦ２１配列（例えば、配列番号３４１）を含み得る。例えば、ＦＧＦ２１成分は２〜１８１、３〜１８０、４〜１７９、５〜１７８、６〜１７７、７〜１７６、８〜１７５、９〜１７４、１０〜１７３、１１〜１７２、１２〜１７１、１３〜１７０、１４〜１６５、１５〜１６０、２０〜１５５、２５〜１５０、３０〜１４５、３５〜１４０、４０〜１３５、４５〜１３０、５０〜１２５、５５〜１２０、６０〜１１５、６５〜１１０、７０〜１０５または７５〜１００を含み得る。
リンカー
融合体の抗原結合タンパク質成分は、リンカー配列を介して融合体のＦＧＦ２１成分と結合されてもされなくてもよい。リンカーの例は本明細書で提供され、ペプチド、多糖類、ＰＥＧおよび他のタイプのポリマーを含み得る。適切なペプチドリンカーの例は、米国特許第４，７５１，１８０号および同第４，９３５，２３３号に記載される。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、２回以上反復されるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３４４）モチーフを含む。従って、リンカーは、例えば、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号３３６）、（Ｇ４Ｓ）６（配列番号３３７）、（Ｇ４Ｓ）９（配列番号３３８）、（Ｇ４Ｓ）１２（配列番号３３９）、または（Ｇ４Ｓ）１５（配列番号３４０）を含み得る。ポリマーリンカーの他の例としては、ＰＥＧ２０、ＰＥＧ４０またはＰＥＧ６０等のＰＥＧ分子が挙げられる。
開示された抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、本明細書、例えば実施例１７に記載の標準的な実験技術を用いて、発現および精製可能である。前記融合体は単一の完全長タンパク質として発現可能であり、あるいは、前記融合体は構成成分として発現された後、化学反応を介して連結され得る。プロテインＡ、サイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー等の標準的な精製技術が、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体を単離するのに使用され得る。
抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の他の形態
提供される、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のいくつかは、本明細書で開示される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分（例えば、表１〜３および６に記載される配列のうちの一つまたは複数を含むもの）の変異型も含まれ得る。
様々な実施形態において、本明細書で開示される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、一つまたは複数の非天然アミノ酸を含み得る。例えば、抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のいくつかは、表１〜３および６に記載される重鎖または軽鎖、可変領域またはＣＤＲのうちの一つまたは複数中に一つまたは複数の非天然アミノ酸置換を有し得る。非天然アミノ酸（所望により、本明細書で開示されるあらゆる配列に見出されるあらゆる天然アミノ酸に置換され得る）の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、並びに他の類似アミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表示法において、標準的な用法と慣習に従い、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシル末端方向である。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の一次アミノ酸配列に挿入され得る、または抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分配列中の野生型残基と置換され得る非天然アミノ酸の非限定的な例を列挙すると、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸および誘導体化した側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。例としては（Ｌ型またはＤ型で；括弧内に省略語）：シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα‐メチルホモシトルリン（Ｎα−ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα−メチルオルニチン（Ｎα−ＭｅＯｒｎまたはＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＬｙｓまたはｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇまたはｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα‐メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα−メチルロイシン（Ｎα−ＭｅＬまたはＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、３−（１−ナフチル）アラニン（１−Ｎａｌ）、３−（２−ナフチル）アラニン（２‐Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２−インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩ‐Ｐｈｅ）、パラ−アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰまたは４−Ａｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリジン（「Ｋ（Ｎε−ｇｌｙｃｙｌ）」または「Ｋ（ｇｌｙｃｙｌ）」または「Ｋ（ｇｌｙ）」と省略）、ニトロフェニルアラニン（ｎｉｔｒｏｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅまたはＡｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ｂｅｎｚｙｌｐｈｅ）、γ‐カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏ）、ｐ−カルボキシル−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα−メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ−α−メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα‐メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（ａｃｅｔｙｌａｒｇ）、α、β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α、γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β、β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（またはビフェニルアラニン；４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプリオ酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ‐エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ‐メチルグリシン、Ｎ‐メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３‐メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−メチルアルギニン、４−アミノ−Ｏ−フタル酸（４ＡＰＡ）、および他の類似アミノ酸、並びに具体的に列挙されたもののいずれかの誘導型が挙げられる。
さらに、抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、表１〜６に記載される重鎖または軽鎖、可変領域またはＣＤＲのうちの一つまたは複数の中に一つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有し得る。天然アミノ酸は、共通の側鎖性質に基づいて種類分けできる：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性・親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
保存的アミノ酸置換は、これらの種類のうちの１つのあるメンバーを、同じ種類の他のメンバーで交換することを含み得る。保存的アミノ酸置換は、非天然アミノ酸残基を包含し得るが、これは通常、生体系での合成によってではなく、キメラペプチド合成によって組み込まれる。これらには、ペプチド模倣薬、およびアミノ酸部分を逆転させたまたは逆位させた他の形態も含まれる。
非保存的置換は、上記の種類のうちのあるメンバーを、他の種類からのあるメンバーに交換することを含み得る。そのような置換された残基は、ヒト抗体と相同的である抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の領域に、または該分子の非相同領域に導入することができる。
そのような変更を行う際、ある特定の実施形態によれば、アミノ酸のハイドロパシー指標が考慮され得る。タンパク質のハイドロパシープロファイルは、各アミノ酸にある数値（「ハイドロパシー指標」）を割当て、続いてペプチド鎖に沿ってそれらの値を繰り返し平均していくことにより計算される。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づくハイドロパシー指標が割り当てられている。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与える際のハイドロパシープロファイルの重要性は、当該技術分野では理解されていることである（例えば、Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131参照）。あるアミノ酸が同様のハイドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換されて、なお同様の生物活性を保持し得ることが知られている。ハイドロパシー指標に基づき変化を起こす際、ある実施形態では、ハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換も含まれる。いくつかの態様では、±１以内であるものが含まれ、別の態様では、±０．５以内のものが含まれる。
また、類似アミノ酸の置換が親水性に基づいて効率的に行われ得ることは、特に、本ケースのように、それによって生成された生物学的な機能を持つタンパク質またはペプチドが免疫学的な実施形態での使用を意図したものである場合、当該技術分野において理解されることである。ある実施形態では、隣接するアミノ酸の親水性によって規定されるような、あるタンパク質の最大の局所平均親水性は、その免疫原性および抗原結合性または免疫原性、つまり、該タンパク質の生物学的特性と相関関係を持つ。
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づき変更を行う際、ある実施形態では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態では、±１以内のものが含まれ、さらに別の実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。ある場合には、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを特定することもできる。これらの領域は「エピトープコア領域」とも称される。
保存的アミノ酸置換の例は表７に記載される。
Figure 2013523184
当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に記載の開示された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の適切な変異体を決定することができるだろう。当業者は、活性に重要と考えられていない領域を標的にすることにより、活性を破壊することなく変化させることができる適切な分子領域を特定することができる。また当業者は、類似のポリペプチド間で保存されている分子の残基および部分を特定することもできるだろう。さらなる実施形態では、生物活性または構造にとって重要な可能性がある領域でさえ、生物活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換が行われ得る。
さらに当業者は、活性または構造に重要な類似ポリペプチド中の残基を特定している構造・機能研究を検討することができる。そのような比較を考慮して、類似タンパク質中の活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応する、あるタンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような重要性が予測されたアミノ酸残基に対し、化学的に類似したアミノ酸の置換を選択することができる。
当業者は、三次元構造およびアミノ酸配列を、類似ポリペプチド中のその構造との関連で分析することもできる。そのような情報を考慮して、当業者は、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分（例えば、抗体）のアミノ酸残基の配置構造を、その三次元の構造と関連させて、予測することができる。タンパク質の表面上にあると予測されているアミノ酸残基は他分子との重要な相互作用に関与し得るため、当業者は、そのような残基に極端な変化を起こさないよう選択することができる。さらに当業者は、所望の各アミノ酸残基に一アミノ酸置換を含んでいる試験変異体を生成することができる。その後、これらの変異体は、ＦＧＦ２１様シグナル伝達用のアッセイ（例えば、本明細書にて提供される実施例に記載の通り）を用いてスクリーニングすることができ、それによって、どのアミノ酸が変化可能でどれが変化してはならないかに関する情報が得られる。言い換えれば、そのような通例の実験から集められた情報に基づき、当業者は、単独でまたは他の変異と併せて、さらなる置換は避けられるべきアミノ酸の位置を容易に決定することができる。
いくつかの科学出版物が二次構造の予測をテーマに扱っている。Moult, (1996) Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., (1974) Biochem. 13:222-245; Chou et al., (1974) Biochemistry 113:211-222; Chou et al., (1978) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., (1979) Ann. Rev. Biochem. 47:251-276;およびChou et al., (1979) Biophys. J. 26:367-384参照。さらに、二次構造予測を支援するのにコンピュータプログラムが現在使用可能である。二次構造予測の１つの方法は、相同性モデリングに基づいている。例えば、３０％超の配列同一性、または４０％超の類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似した構造トポロジーを有し得る。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の発達により、ポリペプチドまたはタンパク質構造中の可能な折り畳み回数を含む、二次構造の予測が増強されている。Holm et al., (1999) Nucl. Acid. Res. 27:244-247参照。所与のポリペプチドまたはタンパク質には折り畳みの限界回数があること、および臨界数（critical number）の構造が決定されてしまえば、構造予測が劇的に正確になるであろうことが示されている（Brenner et al., (1997) Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376）。
二次構造予測のさらなる方法には「スレッディング」が含まれる（Jones, (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et al., (1996) Structure 4:15-19）, “profile analysis” (Bowie et al., (1991) Science 253:164-170; Gribskov et al., (1990) Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358),および“evolutionary linkage” (上記Holm, (1999);および上記Brenner, (1997)参照)。
いくつかの実施形態では、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させ、（４）リガンドもしくは抗原の結合親和性を変化させ、および／または（４）そのようなポリペプチドに他の物理化学的もしくは機能的特性を与えるもしくは改変するアミノ酸置換が、開示された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分で行われ得る。例えば、一または多アミノ酸置換（ある実施形態では、保存的アミノ酸置換）が本明細書で開示される配列で行われ得る。
他の実施形態では、開示された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の、分子間接触を形成するドメインの外側に存在する部分で置換が起こる。そのような実施形態では、親配列の構造特性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換（例えば、親または未変性の抗原結合タンパク質を特徴付ける二次構造を破壊しない一つまたは複数の置換アミノ酸）が使用され得る。当該技術分野において承認されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing;およびThornton et al., (1991) Nature 354:105に記載され、それぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる好ましい抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の変異体には、親または天然のアミノ酸配列中の一つまたは複数のシステイン残基が削除されている、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている、システイン変異体が含まれる。特に、抗体が生物学的に活性な高次構造にリフォールディングされなければならないときに、システイン変異体は有用である。システイン変異体には未変性の抗体よりも少ないシステイン残基しか存在し得ず、典型的には偶数を有するため、不対のシステインに起因する相互作用が最小化される。
開示される重鎖および軽鎖、可変領域ドメインおよびＣＤＲは、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合し、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘導できる抗原結合領域を含むポリペプチドを得るのに使用され得る。例えば、表３および６に記載されるＣＤＲのうちの一つまたは複数は、分子（例えば、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分）中に共有結合的または非共有結合的に組み込まれ、免疫接着（immunoadhesion）を生成し得る。免疫接着（immunoadhesion）によって、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを組み込むことができ、共有結合的にＣＤＲを別のポリペプチド鎖に連結でき、または非共有結合的にＣＤＲを組み込むことができる。ＣＤＲは、免疫接着（immunoadhesion）が、特定の重要な抗原（例えば、β-Ｋｌｏｔｈｏまたはβ-Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数あるいはそれらのエピトープ）に特異的に結合することを可能にする。
開示される重鎖および軽鎖、可変領域ドメインおよびＣＤＲは、β−Ｋｌｏｔｈｏのうちの一つもしくは複数またはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合し、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘導できる抗原結合領域を含む抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を得るのに用いられ得る。例えば、表３および６に記載されるＣＤＲのうちの一つまたは複数が、抗原結合領域が一価（Ｆａｂフラグメントの様に）であるが二量体のＦｃ部分を有するようにＦｃフラグメントと対合した抗原結合タンパク質の重鎖、軽鎖を含む「半」抗体に構造的に類似した分子（例えば、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分）に組み込まれ得る。
本明細書に記載される可変領域ドメインおよびＣＤＲに基づく模倣薬（例えば、「ペプチド模倣薬」または「ペプチド模倣薬」）もまた提供される。これらの類似体は、ペプチド、非ペプチドまたはペプチドおよび非ペプチド領域の組み合わせであり得る。例えば、Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392;およびEvans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229（あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。治療に有益なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣薬が使用され、同様の治療または予防効果を生むことができる。そのような化合物はしばしば、コンピュータ分子モデリングを活用して開発される。一般に、ペプチド模倣薬は、本開示との関連ではβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する能力等の、所望の生物活性を示す抗体に構造的に類似しているが、該技術分野において周知の方法により−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ−ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯから選択される結合によって所望により置換される一つまたは複数のペプチド結合を有するタンパク質である。コンセンサス配列の一つまたは複数のアミノ酸の、同種のＤ−アミノ酸との系統的な置換（例えば、Ｌ−リジンをＤ−リジンで置換）は、ある実施形態では、より安定なタンパク質をつくり出すのに使用され得る。加えて、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列変異を含むコンストレインドペプチドは、該技術分野において周知の方法（例えば、Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387を参照（参照により本明細書に組み込まれる））、例えば、ペプチドを環化させる分子内のジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を加えることによって、つくり出すことができる。
本明細書に記載の、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の誘導体もまた提供される。誘導体化された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、特定の使用における半減期の増加等、所望の特性を抗体またはフラグメントに与えるあらゆる分子または基質を含み得る。誘導体化された抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、例えば、検出可能な（または標識）部分（例えば、放射性の、比色定量の、抗原性の、または酵素的な分子、検出可能なビーズ（磁性もしくは電子密集（electrodense）（例えば、金）ビーズ等）、または別の分子（例えば、ビオチンもしくはストレプトアビジン）に特異的に結合する分子）、治療的もしくは診断的部分（例えば、放射性の、細胞傷害性の、もしくは薬剤的に活性な部分）、または特定の使用（例えば、ヒト患者等の対象への投与、または他のｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用）のために、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の安定性を増加させる分子を含み得る。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を誘導化するのに用いられ得る分子の例としては、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のアルブミン結合型およびＰＥＧ化誘導体は、該技術分野において周知の技術を用いて調製できる。ある種の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分には、本明細書に記載のＰＥＧ化された一本鎖ポリペプチドが含まれる。一実施形態において、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体に複合または連結される。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体は、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン・オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択される化学物質で化学的に修飾され得る。
他の誘導体には、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘導する抗原結合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合された異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現等による、本明細書で開示されるβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合性または集合性の複合体が含まれる。例えば、複合されたペプチドは、異種性のシグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母のα因子リーダー、またはエピトープ標識等のペプチドになり得る。本開示の抗原結合タンパク質含有融合タンパク質は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の精製または特定を容易にするために加えられるペプチド（例えば、ポリ‐Ｈｉｓ）を含み得る。β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分はまた、Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1204；および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、ＦＬＡＧペプチドに結合され得る。ＦＬＡＧペプチドは抗原性が高く、特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により可逆的に結合されるエピトープを与え、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所与のポリペプチドに融合している融合タンパク質を調製するのに有用な試薬が市販されている（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）。
β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する一つまたは複数の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を含む多量体は、本開示の別の態様を形成する。多量体は、共有結合した、または非共有結合した二量体、三量体、またはより高次の多量体の形態をとり得る。β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に結合し、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘導する２つ以上の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を含む多量体は、治療薬、診断薬としての使用、および他の使用用としてもまた企図されおり、そのような多量体の１例はホモ二量体である。多量体の他の例としては、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体等が挙げられる。
一実施形態は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分に融合したペプチド部分間の共有結合的または非共有結合的な相互作用を介して連結した、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する複数の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を含む多量体を対象としている。そのようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、または多量体化を促進する特性を有するペプチドであり得る。本明細書でより詳細に記載されるように、ロイシンジッパーおよび抗体由来のある種のポリペプチドは、それに結合した抗原結合タンパク質の多量体化を促進できるペプチドの1つである。
特定の実施形態では、前記多量体は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に結合する２〜４つの抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を含む。前記多量体の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分部分は、上記形態のいずれか、例えば、変異体またはフラグメントであり得る。好ましくは、多量体は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する能力を有する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を含む。
一実施形態において、オリゴマーは、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて調製される。抗体由来ポリペプチド（例えばＦｃドメイン）の様々な部分に融合したある異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製については、例えば、Ashkenazi et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., (1990) Nature 344:677;およびHollenbaugh et al., 1992 “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11よって説明がなされている。
一実施形態は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を、抗体のＦｃ領域と融合することにより生成される２つの融合タンパク質を含む二量体を対象としている。前記二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入し、該組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞中で該遺伝子融合体を発現させ、発現した融合タンパク質がまさに抗体分子のように構築することにより生成することができ、その際、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間で形成されることにより、前記二量体が生成される。
「Ｆｃポリペプチド」という用語には、本明細書で使用される場合、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの未変性および変異タンパク質形態が含まれる。二量体化を促進するような、ヒンジ領域を含むポリペプチドの切断型もまた含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそれから形成されたオリゴマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にするという利点を提供する。
国際出願第ＷＯ９３／１０１５１号および米国特許第５，４２６，０４８号および同第５，２６２，５２２号に記載の１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端のヒンジ領域から天然のＣ末端まで伸びている一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号、およびBaum et al., (1994) EMBO J. 13:3992-4001に記載のＦｃ変異タンパク質である。この変異タンパク質のアミノ酸配列は、ＷＯ９３／１０１５１に示される未変性Ｆｃ配列のアミノ酸配列と、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化しており、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化しており、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化している以外は、同一である。変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し減少した親和性を示す。
他の実施形態では、本明細書で開示されるような抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質-ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の重鎖および／または軽鎖の可変部分は、抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分と置換することができる。
あるいは、オリゴマーは、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する複数の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を含み、場合によってはペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含む、融合タンパク質であり得る。適切なペプチドリンカーの１つは、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものである。
β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を含むオリゴマー誘導体を調製するための別の方法には、ロイシンジッパーの使用が関わる。ロイシンジッパードメインは、それらが見出されたタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーはいくつかのＤＮＡ結合タンパク質中に初めて確認され（Landschulz et al., (1988) Science 240:1759）、それ以後、種々の異なるタンパク質で発見されている。既知のロイシンジッパーの１つは、二量体化または三量体化する天然ペプチドおよびその誘導体である。可溶性のオリゴマータンパク質を生成するのに適切なロイシンジッパードメインの例はＷＯ９４／１０３０８に記載されており、肺の界面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーはHoppe et al., (1994) FEBS Letters 344:191に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。それに融合される異種タンパク質の安定的な三量体化を可能にする改変されたロイシンジッパーの使用は、Fanslow et al., (1994) Semin. Immunol. 6:267-278に記載されている。１つの手法では、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合し、ロイシンジッパーペプチドと融合する、抗原結合タンパク質もしくは抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のフラグメントまたは誘導体を含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、形成する可溶性オリゴマー抗原結合タンパク質のフラグメントまたは誘導体は培養上清から回収される。
ある実施形態では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭまたは５０ｎＭ未満のＫＤ（平衡結合親和性）を有する。
別の態様により、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、ヒト患者に投与された時）において、少なくとも１日の半減期を有する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分（またはその部分）が提供される。一実施形態において、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、少なくとも３日の半減期を有する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分（またはその部分）は４日以上の半減期を有する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分（またはその部分）は８日以上の半減期を有する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分（またはその部分）は、非誘導体化または非改変抗原結合タンパク質と比較してより長い半減期を有するように、誘導体化または改変される。別の実施形態では、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、点変異を含むことにより血清中の半減期が増加するが、このことは例えば２０００年２月２４日に公開されたＷＯ００／０９５６０（参照により組み込まれる）に記載される。
糖鎖付加
β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、天然の種で見出されるものとは異なる、または改変されている糖鎖付加パターンを有し得る。当該技術分野において周知であるように、糖鎖付加パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で考察される、特定の糖鎖付加アミノ酸残基の有無）、またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物の両方に依存する。特定の発現系については以下で考察する。
ポリペプチドの糖鎖付加は通常、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、炭水化物部分の、アスパラギン残基の側鎖への結合を指す。Ｘがプロリン以外のいずれかのアミノ酸である、トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、炭水化物部分がアスパラギン側鎖へ酵素的に結合するための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらトリペプチド配列のいずれかの存在により、糖鎖付加可能な部位がつくられる。Ｏ結合型糖鎖付加とは、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの、ヒドロキシアミノ酸（通常セリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用可能）のうちの１つへの結合を指す。
糖鎖付加部位の抗原結合タンパク質への付加は、一つまたは複数の前述のトリペプチド配列（Ｎ結合型糖鎖付加部位用）を含むようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成される。前記改変は、一つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の開始配列（Ｏ結合型糖鎖付加部位のための）への付加または置換によっても行うことができる。容易にするため、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化を通じて、特に、標的ポリペプチドをコードしているＤＮＡを、所望のアミノ酸に翻訳されるであろうコドンがつくられるように事前に選択した塩基で変異させることによって、改変され得る。
抗原結合タンパク質上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドのタンパク質への化学的または酵素的カップリングによるものである。これらの方法は、Ｎ−およびＯ結合型糖鎖付加のための糖鎖付加能を有するタンパク質の宿主細胞中での産生を必要としないという利点がある。使用されるカップリング様式に依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システイン等の遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリン等の遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファン等の芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合し得る。これらの方法はＷＯ８７／０５３３０およびAplin and Wriston, (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306に記載がある。
最初の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的に、または酵素的に達成できる。化学的糖鎖除去は、タンパク質を、化合物、トリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物に曝す必要がある。この処理は、ポリペプチドは損なわないまま、結合している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分または全ての糖類の切断を引き起こす。化学的糖鎖除去については、Hakimuddin et al., (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 and by Edge et al., (1981) Anal. Biochem. 118:131に記載がある。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., (1987) Meth. Enzymol. 138:350に記載されるような種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することにより達成され得る。糖鎖付加可能な部位での糖鎖付加は、Duskin et al., (1982) J. Biol. Chem. 257:3105に記載されるような、ツニカマイシン化合物を使用することにより阻止できる。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻止する。
従って、本開示の態様には、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質、ＮＳ抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の、糖鎖付加部位の数および／または種類が親ポリペプチドのアミノ酸配列と比べて改変されている糖鎖付加変異体が含まれる。ある実施形態では、抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の変異体には、天然配列より数が多いまたは少ないＮ結合型糖鎖付加部位が含まれる。Ｎ結合型糖鎖付加部位は、Ｘとして割り当てられるアミノ酸残基がプロリン以外のいずれかのアミノ酸残基であり得る、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列によって特徴付けられる。この配列をつくるためにアミノ酸残基を置換することにより、Ｎ結合型炭水化物鎖が付加可能な新しい部位が提供される。あるいは、この配列を除去または改変する置換によって、天然のポリペプチド中に存在するＮ結合型炭水化物鎖の付加が阻止されるだろう。例えば、糖鎖付加は、Ａｓｎの欠失によって、またはＡｓｎの異なるアミノ酸への置換によって減少され得る。他の実施形態では、一つまたは複数の新しいＮ結合型部位がつくられる。抗体は通常、Ｆｃ領域にＮ結合型糖鎖付加部位を有する。
標識およびエフェクター基
いくつかの実施形態では、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、一つまたは複数の標識を含む。「標識基」または「標識」という用語は、あらゆる検出可能な標識をも意味する。適切な標識基の例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素的な基（enzymatic group）（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または２次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）。いくつかの実施形態では、標識基は、起こり得る立体障害を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分にカップリングされる。タンパク質を標識するための種々の方法は該技術分野において周知であり、適当と思われるように使用され得る。
「エフェクター基」という用語は、細胞毒として機能する、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分にカップリングされるあらゆる基をも意味する。適切なエフェクター基の例は、放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）である。他の好適な基には、毒素、治療的な基（therapeutic group）、または化学治療的な基（chemotherapeutic group）が含まれる。好適な基の例には、カリチアマイシン、アウリスタチン、ゲルダナマイシンおよびカンタンシン（cantansine）が含まれる。いくつかの実施形態では、エフェクター基は、潜在的な立体障害を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分にカップリングされる。
一般的に、標識は検出が行われるアッセイに応じて種々の種類に分類される：（ａ）放射性または重同位元素であり得る同位体標識；（ｂ）磁気標識（例えば、磁性粒子）；（ｃ）酸化還元活性のある部分；（ｄ）光学色素；酵素的な基（enzymatic group）（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；（ｅ）ビオチニル化された基；および（ｆ）２次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識等）。いくつかの実施形態では、標識基は、可能性のある立体障害を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分にカップリングされる。タンパク質を標識するための様々な方法が該技術分野において知られている。
特定の標識には、光学色素、例えば、限定はされないが、発色団、蛍光体およびフルオロフォアが含まれ、多くの場合後者が特異的である。フルオロフォアは、「小分子」蛍光物質（fluores）、またはタンパク質性の蛍光物質（fluores）のいずれかであり得る。
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性によって検出できるあらゆる分子を意味する。適切な蛍光標識には、限定はされないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Malacite green）、スチルベン、ルシファーイエロー（Lucifer Yellow）、カスケードブルー（Cascade Blue）、テキサスレッド（Texas Red）、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ７０５、オレゴングリーン（Oregon green）、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０）、カスケードブルー（Cascade Blue）、カスケードイエロー（Cascade Yellow）およびＲフィコエリスリン（ＰＥ）（モレキュラー・プローブ社、オレゴン州ユージン）、ＦＩＴＣ、ローダミン（Rhodamine）、およびテキサスレッド（Texas Red）（ピアス社、イリノイ州ロックフォード）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャム・ライフサイエンス社、ペンシルバニア州ピッツバーグ）が含まれる。フルオロフォアを含む、適切な光学色素については、Molecular Probes Handbook by Richard P. Hauglandに記載があり、これは参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
また、適切なタンパク質性蛍光標識には、限定はされないが、ウミシイタケ（Renilla）、ウミシイタケ（Ptilosarcus）、またはオワンクラゲ（Aequorea）種のＧＦＰ（Chalfie et al., (1994) Science 263:802-805）を含む緑色蛍光タンパク質、ＥＧＦＰ（クロンテック社（Clontech Labs., Inc.）,Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ，クアンタムバイオテクノロジー社（Quantum Biotechnologies, Inc.）,カナダ、ケベック州; Stauber, (1998) Biotechniques 24:462-471; Heim et al., (1996) Curr. Biol. 6:178-182）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、クロンテック社（Clontech Labs., Inc.））、ルシフェラーゼ（Ichiki et al., (1993) J. Immunol. 150:5408-5417）、βガラクトシダーゼ（Nolan et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607）およびウミシイタケ（Renilla）（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５２９２６５８号、同第５４１８１５５号、同第５６８３８８８号、同第５７４１６６８号、同第５７７７０７９号、同第５８０４３８７号、同第５８７４３０４号、同第５８７６９９５号、同第５９２５５５８号）も含まれる。
抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の調製
提供される非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長類（サル（例えば、カニクイザルもしくはアカゲザル）または類人猿（例えば、チンパンジー）等）等の、あらゆる抗体産生動物に由来し得る。非ヒト抗体は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養および細胞培養に基づく応用、または抗体への免疫応答が起こらない、もしくはごくわずかである、予防できる、懸念されない、もしくは望まれる、あらゆる他の応用に使用できる。ある実施形態では、抗体は、完全長β−Ｋｌｏｔｈｏで（実施例１）、β−Ｋｌｏｔｈｏの細胞外領域で（実施例２）、β−Ｋｌｏｔｈｏを発現している細胞全体で、β−Ｋｌｏｔｈｏを発現している細胞から得た膜で（実施例１）、融合タンパク質、例えば、Ｆｃに融合したβ−Ｋｌｏｔｈｏ（またはその細胞外領域）を含むＦｃ融合体で免疫化することにより、または、例えば、本明細書で提供される実施例に記載されるような他の該技術分野において周知の方法で産生され得る。あるいは、非ヒト抗体は、本明細書にて提供されるある抗体が結合するエピトープの一部を形成するβ−Ｋｌｏｔｈｏのセグメントであるアミノ酸で免疫化することにより産生され得る。抗体はポリクローナル、モノクローナルであってよく、または組換えＤＮＡを発現することにより宿主細胞中で合成され得る。
完全ヒト抗体は、本明細書に記載のように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む遺伝子導入動物を免疫化することによって、またはヒト抗体レパートリーを発現しているファージディスプレイライブラリーを選択することによって作成することができる。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体の手法、例えば、Kohler and Milstein, (1975) Nature 256:495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含む種々の技術によって生成できる。あるいは、モノクローナル抗体を生成するための他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス形質転換または発癌性形質転換を用いることができる。ハイブリドーマを作成する１つの適切な動物系はマウス系であり、これは確立された方法である。免疫方法および融合用の免疫化脾細胞を単離する技術は、該技術分野において周知である。そのような方法のために、免疫化マウスから得たＢ細胞は、マウス骨髄腫細胞株等の適切な不死化された融合パートナーと融合される。必要に応じて、ラットまたは他の哺乳動物をマウスの代わりに免疫化することができ、そのような動物から得たＢ細胞をマウス骨髄腫細胞株と融合させ、ハイブリドーマを形成させることができる。あるいは、マウス以外の供給源から得た骨髄腫細胞株が使用できる。ハイブリドーマを作成するための融合方法もまた周知である。ＳＬＡＭ技術もまた、抗体産生で用いることができる。
提供される一本鎖抗体は、重鎖および軽鎖の可変領域（Ｆｖ領域）フラグメントを、アミノ酸架橋（短ペプチドリンカー）を介して連結させ、結果として単一のポリペプチド鎖にすることによって形成され得る。そのような単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、前記２つの可変領域ポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間にペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合することにより作成できる。得られたポリペプチドは、それ自体で再び折り畳まれ、抗原結合単量体を形成することができ、またはそれらは前記２つの可変領域間の可動性リンカーの長さに依存して、多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体）を形成することができる（Kortt et al., (1997) Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., (2001) Biomol. Eng. 18:95-108）。ポリペプチドを含む異なるＶＬおよびＶＨを組み合わせることにより、異なるエピトープに結合する多量体のｓｃＦｖを形成することができる（Kriangkum et al., (2001) Biomol. Eng. 18:31-40）。一本鎖抗体生成のために開発された技術には、米国特許第４，９４６，７７８号；Bird, (1988) Science 242:423; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879; Ward et al., (1989) Nature 334:544, de Graaf et al., (2002) Methods Mol Biol. 178:379-387に記載されるものが含まれる。本明細書にて提供される抗体由来の単鎖抗体には、限定はされないが、表２Ａ〜２Ｄに示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の可変領域組み合わせを含むｓｃＦｖ、または表３および６に示されるＣＤＲを含む軽鎖可変領域および重鎖可変領域の組み合わせが含まれる。
本明細書にて提供されるあるサブクラスの抗体は、サブクラススイッチ法を用いて、異なるサブクラス由来の抗体に変化させることができる。従って、例えば、ＩｇＧ抗体はＩｇＭ抗体から得ることができ、逆の場合も同じである。そのような技術は、所与の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、親抗体の生物学的特性とは異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスに関連する生物学的特性も示す新しい抗体の作成を可能にする。組換えＤＮＡ技術を使用することができる。特定の抗体ポリペプチドをコードしているクローン化ＤＮＡ、例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常領域をコードしているＤＮＡを、そのような方法に使用することができる。例えば、Lantto et al., (2002) Methods Mol. Biol. 178:303-316を参照。
従って、提供される抗体には、例えば、所望のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）を有する上記の可変領域組み合わせを含むものおよびそのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが含まれる。さらに、ＩｇＧ４が望まれる場合、Bloom et al., (1997) Protein Science 6:407、（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ヒンジ領域中のＣＰＳＣＰ−＞ＣＰＰＣＰ（それぞれ、配列番号２６６〜２６７））に点変異を導入し、ＩｇＧ４抗体中で不均一性を生じさせ得るＨ鎖内ジスルフィド結合が形成される傾向を緩和することも求められる。
さらに、異なる特性（すなわち、それらが結合する抗原に対する異なる親和性）を有する抗体を派生させるための技術も知られている。そのような技術の１つは鎖シャフリング（chain shuffling）と称され、しばしばファージディスプレイと呼ばれる糸状バクテリオファージの表面上に免疫グロブリン可変領域の遺伝子レパートリーを提示させることを含む。鎖シャフリングは、Marks et al., (1992) BioTechnology 10:779に記載されるように、ハプテン２-フェニルオキサゾール-５−オンに対する高親和性抗体を作成するために使用されている。
保存的改変が表２に記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または表３に記載のＣＤＲに対して行われ（およびコード核酸に対する対応する改変）、機能的および生化学的特徴を有する抗原結合タンパク質が生成され得る。そのような改変を達成するための方法は、上記に記載される。
β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、様々な方法でさらに改変することができる。例えば、それらを治療目的に用いようとするならば、それらをポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）と複合させることで、血清中の半減期を伸ばし、あるいはタンパク質送達を増強することができる。あるいは、対象の抗体またはそのフラグメントのＶ領域を、異なる抗体分子のＦｃ領域と融合することができる。このために用いられるＦｃ領域は、補体に結合しないように改変することができ、その結果、該融合タンパク質を治療薬として用いたときに、患者において細胞融解を誘導する可能性を減少させることができる。さらに、対象の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分またはその機能性フラグメントは、ヒト血清アルブミンと複合することで、該抗体またはそのフラグメントの血清中の半減期を伸ばすことができる。抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分またはそのフラグメントに対する別の有用な融合パートナーは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）である。ＴＴＲは四量体を形成する能力を有するため、抗体−ＴＴＲ融合タンパク質は、その結合親和力を増加させ得る多価抗体を形成することができる。
あるいは、本明細書に記載の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の機能的および／または生化学的特徴における実質的な改変は、（ａ）例えばシートもしくはヘリックス高次構造等の、置換領域中の分子の主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さ、を維持することに対するそれらの影響の点で大きく異なる、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列中での置換を起こすことによって達成できる。「保存的アミノ酸置換」は、元の（native）アミノ酸残基を、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に対する影響がほとんどない別の（nonnative）残基で置換することを含み得る。本明細書に示される表７を参照。さらに、ポリペプチド中のあらゆる天然残基は、アラニンスキャニング変異誘発について前述したように、アラニンで置換することもできる。
対象の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のアミノ酸置換（保存的、非保存的に関わらず）は、常用手法を適用することにより当業者によって実行され得る。アミノ酸置換は、本明細書にて提供される抗原結合タンパク質の重要な残基を特定するために、あるいはβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に対するこれらの抗原結合タンパク質の親和性を増加または減少させるために、あるいは本明細書に記載の他の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の結合親和性を変更するために、使用され得る。
抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の発現方法
発現系および上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写または発現カセットの形態のコンストラクト、並びにそのような発現系またはコンストラクトを含む宿主細胞もまた、本明細書にて提供される。
本明細書にて提供される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、いくつかの従来技術のうちのいずれかによって作成することができる。例えば、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、該技術分野において周知のあらゆる技術を用いて、組換え発現系によって生成することができる。例えば、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, New York (1980)；および抗体：A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)を参照。
抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、ハイブリドーマ細胞株（例えば、具体的には、抗体はハイブリドーマで発現され得る）またはハイブリドーマ以外の細胞株で発現され得る。前記抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分をコードする発現コンストラクトは、哺乳類、昆虫または微生物の宿主細胞を形質転換するのに用いることができる。形質転換はポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するためのあらゆる既知の方法を用いて行うことができ、その方法には、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ中にポリヌクレオチドをパッケージングし、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，９１２，０４０号；同第４，７４０，４６１号；同第４，９５９，４５５号に例示されるような、該技術分野において周知の形質転換法によって、該コンストラクトで宿主細胞を形質導入することが含まれる。使用される最適な形質転換法は、どの種類の宿主細胞が形質転換されるかによるだろう。異種性のポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入する方法は、該技術分野において周知であり、例えば、限定はされないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチド封入、核酸と正電荷脂質の混合、およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが挙げられる。
組換え発現コンストラクトは、通常、以下のうちの一つまたは複数を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む：本明細書にて提供される一つまたは複数のＣＤＲ；軽鎖定常領域；軽鎖可変領域；重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）；および／または抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の別の骨格部分。これらの核酸配列は、標準的なライゲーション技術を用いて、適切な発現ベクターに挿入される。一実施形態において、前記重鎖または軽鎖の定常領域は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分に特有の重鎖または軽鎖可変領域のＣ末端に付加され、発現ベクターにライゲーションされる。前記ベクターは、通常、使用される特定の宿主細胞中で機能的であるよう選択される（すなわち、該ベクターが宿主細胞機構に適合することで、前記遺伝子の増幅および／または発現が可能となる）。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸還元酵素等のレポータータンパク質を用いるタンパク質−フラグメント相補性アッセイを使用するベクターが用いられる（例えば、米国特許第６，２７０，９６４号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。適切な発現ベクターは、、例えば、インビトロジェン・ライフテクノロジーズ社またはＢＤバイオサイエンス社（旧「クロンテック社」）から購入可能である。抗体およびフラグメントをクローニングおよび発現するための他の有用なベクターには、Bianchi and McGrew, (2003) Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが含まれる。さらに適切な発現ベクターについては、例えば、Methods Enzymol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Pressで考察がなされている。
通常、いずれの宿主細胞においても使用される発現ベクターには、プラスミド保持並びに外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列が含まれるだろう。そのような配列は、ある実施形態では集合的に「フランキング配列」と呼ばれ、典型的には、以下のヌクレオチド配列のうちの一つまたは複数が含まれるだろう：プロモーター、一つまたは複数のエンハンサー配列、複製開始点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を装入するためのポリリンカー領域、および選択可能なマーカーエレメント。これらの各配列については以下で論じられる。
所望により、前記ベクターは、「タグ」をコードする配列、すなわち、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分をコードする配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含むことができ；該オリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓ（配列番号２６８）等）、またはＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（ヘマグルチニン（hemaglutinin）インフルエンザウイルス）、もしくはｍｙｃ等の別の「タグ」をコードしており、これらについては、市販の抗体が存在する。このタグは、通常、ポリペプチドが発現する際にポリペプチドに融合され、宿主細胞から得た抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のアフィニティ精製または検出のための手段として機能し得る。アフィニティ精製は、例えば、タグに対する抗体をアフィニティーマトリックスとして用いるカラムクロマトグラフィによって達成することができる。所望により、その後タグは、切断のためのある種のペプチダーゼを用いる等の種々の方法によって、精製された抗原結合タンパク質から除去することができる。
フランキング配列は、相同（すなわち、宿主細胞と同一の種および／または菌株由来）、異種（すなわち、宿主細胞種または菌株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源由来のフランキング配列の組み合わせ）、合成または天然であり得る。従って、フランキング配列の供給源は、フランキング配列が宿主細胞機構において機能的であり、且つ宿主細胞機構によって活性化され得るならば、いかなる原核生物もしくは真核生物であってもよく、いかなる脊椎動物もしくは無脊椎動物であってもよく、またはいかなる植物であってもよい。
ベクターにおいて有用なフランキング配列は、該技術分野において周知のいくつかの方法のうちのいずれかによって得ることができる。通常、本明細書において有用なフランキング配列は、マッピングおよび／または制限酵素消化によって事前に特定されているであろうから、適切な制限酵素を用いて適切な組織供給源から単離できる。ある場合では、フランキング配列の完全長ヌクレオチド配列は既知のものであり得る。ここで、フランキング配列は、核酸の合成またはクローニングのための本明細書に記載の方法を用いて合成することができる。
知られているフランキング配列が全てであっても一部のみであっても、フランキング配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、並びに／またはオリゴヌクレオチド等の適切なプローブおよび／もしくは同一種もしくは別の種から得たフランキング配列フラグメントでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、得ることができる。フランキング配列が知られていない場合、例えば、コード配列または別の１つもしくは複数の遺伝子までも含み得るより大きなＤＮＡ断片から、フランキング配列を含むＤＮＡのフラグメントを単離することができる。単離は、制限酵素消化による適切なＤＮＡフラグメントの生成、続くアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィ（カナダ、チャッツワース）を用いる単離によって、または当業者に周知の他の方法によって、達成できる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者には容易に明らかであろう。
複製開始点は通常、市販の原核生物の発現ベクターの一部であり、該開始点は宿主細胞中でのベクターの増幅を補助する。最適なベクターが複製開始点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターにライゲーションすることができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（ニューイングランドバイオラボ社（New England Biolabs）、マサチューセッツ州ベバリー）由来の複製開始点は、大部分のグラム陰性菌に適切であり、種々のウイルスの開始点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitus virus）（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶ等のパピローマウイルス）は、哺乳類細胞中でベクターをクローニングするのに有用である。一般に、複製開始点構成要素は、哺乳類の発現ベクターに必要ではない（例えば、ＳＶ４０の開始点は、ただ該ウイルスの初期プロモーターも含むという理由だけでしばしば使用される）。
転写終結配列は通常、ポリペプチドをコードする領域の末端に対し３′側に位置し、転写を終結させるよう機能する。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメントと、それに続くポリＴ配列である。前記配列はライブラリーから容易にクローニングされ、またはベクターの一部として市販もされているが、本明細書に記載の方法等の核酸合成の方法を用いて容易に合成することもできる。
選択マーカー遺伝子は、選択培地中で増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードしている。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に、抗菌剤または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、もしくはカナマイシンに対する耐性を与える；（ｂ）細胞の栄養要求性欠乏を補う；あるいは（ｃ）複合培地または合成培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしている。具体的な選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。好都合なことに、ネオマイシン耐性遺伝子を、原核生物および真核生物の宿主細胞の両方で、選別に用いることもできる。
発現される遺伝子を増幅するために、他の選択遺伝子を用いることができる。増幅は、増殖または細胞生存に重要なタンパク質の産生に必要な遺伝子が、組換え細胞の後に続く世代の染色体内で縦列をなして反復されるプロセスである。哺乳類細胞の適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびプロモーターを持たないチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳類細胞の形質転換体は、ベクターに存在する選択遺伝子によって形質転換体だけが唯一適応、生存する選択圧下に置かれる。培地中の選択試薬の濃度が連続的に上昇する条件下で形質転換細胞を培養することにより選択圧がかけられ、それによって選択遺伝子並びに、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分等の他の遺伝子をコードするＤＮＡの両方の増幅が引き起こされる。結果として、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分等の増量されたポリペプチドが、増幅ＤＮＡから合成される。
リボソーム結合部位は通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要とされ、シャイン・ダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴づけられる。前記構成要素は通常、プロモーターに対して３’側に、発現されるポリペプチドのコード配列に対して５’側に位置する。
ある場合、例えば真核生物の宿主細胞発現系での糖鎖付加が望まれる場合等、種々のプレ配列またはプロ配列を操作して、糖鎖付加または収量を向上させることができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更する、またはプロ配列を加えることで、糖鎖付加に影響を与えることもできる。最終タンパク質産物は、−１位（成熟タンパク質の第一アミノ酸に対して）に、発現に付随する一つまたは複数のさらなるアミノ酸を有し得るが、これは完全に除去しておくことはできない。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断する場合、いくつかの酵素切断部位の使用によって、所望のポリペプチドのわずかに切断された形態が生じ得る。
発現およびクローニングは通常、宿主生物によって認識され、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分をコードする分子に機能的に連結されるプロモーターを含むだろう。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンに対し上流（すなわち、５’側）に位置する（一般的に約１００〜１０００ｂｐ以内）、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。プロモーターは、慣習的に、２つのクラス、すなわち誘導性プロモーターおよび構成的プロモーター、のうちの１つに分類される。誘導性プロモーターは、栄養の有無または温度変化等の培地条件におけるいくつかの変化に応答して、その制御下でＤＮＡから増加したレベルの転写を開始する。一方で、構成的プロモーターは、それが機能的に連結した遺伝子を、一律に、つまり遺伝子発現に対してほとんど制御を行わずに、転写する。種々の有望な宿主細胞によって認識記される多数のプロモーターが周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化で除去し、所望のプロモーター配列を該ベクターに挿入することによって、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を含む重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに機能的に連結される。
酵母との使用に適切なプロモーターもまた、該技術分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に用いるのが好都合である。哺乳類宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、限定はされないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシのパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得たプロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳類プロモーターには、異種哺乳類のプロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。
関心対象となり得るさらなるプロモーターには、限定はされないが：ＳＶ４０初期プロモーター（Benoist and Chambon, (1981) Nature 290:304-310）；ＣＭＶプロモーター（Thornsen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663）；ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列中に含まれるプロモーター（Yamamoto et al., (1980) Cell 22:787-797）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445）；メタロチオネイン（metallothionine）遺伝子由来のプロモーターおよび制御配列（Prinster et al., (1982) Nature 296:39-42）；およびβラクタマーゼプロモーター等の原核生物のプロモーター（Villa-Kamaroff et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731）；またはｔａｃプロモーター（DeBoer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25）が含まれる。組織特異性を示し、遺伝子導入動物において使用されている以下の動物転写調節領域もまた関心対象である：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Swift et al., (1984) Cell 38:639-646; Ornitz et al., (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, (1987) Hepatology 7:425-515）；膵β細胞において活性なインスリン遺伝子調節領域（Hanahan, (1985) Nature 315:115-122）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域（Grosschedl et al., (1984) Cell 38:647-658; Adames et al., (1985) Nature 318:533-538; Alexander et al., (1987) Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444）；精巣細胞、乳腺細胞、リンパ系細胞およびマスト細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Leder et al., (1986) Cell 45:485-495）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子調節領域（Pinkert et al., (1987) Genes and Devel. 1 :268-276）；肝臓において活性なαフェトプロテイン遺伝子調節領域（Krumlauf et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., (1987) Science 253:53-58）；肝臓において活性なα１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Kelsey et al., (1987) Genes and Devel. 1:161-171）；骨髄性細胞において活性なβグロビン遺伝子調節領域（Mogram et al., (1985) Nature 315:338-340; Kollias et al., (1986) Cell 46:89-94）；脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Readhead et al., (1987) Cell 48:703-712）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Sani, (1985) Nature 314:283-286）；並びに視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子調節領域（Mason et al., (1986) Science 234:1372-1378）。
エンハンサー配列をベクターに挿入することで、高等真核生物による、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を含む軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を増加させることができる。エンハンサーは、通常約１０〜３００ｂｐ長であり、プロモーターに作用して転写を増加させる、ＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーは配向および位置に比較的依存せず、転写ユニットに対し５’側および３’側の両方の位置で見出されている。哺乳類遺伝子由来で利用可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテインおよびインスリン）。しかし、通常は、ウイルス由来のエンハンサーが用いられる。該技術分野において周知の、ＳＶ４０のエンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターのエンハンサー、ポリオーマのエンハンサー、およびアデノウイルスのエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化を増強するエレメントの例である。エンハンサーはベクター中でコード配列に対し５’側または３’側のいずれかに位置し得るが、通常プロモーターから５’側の部位に位置する。適切な、天然のまたは異種のシグナル配列をコードする配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）を、発現ベクター中に挿入し、抗体の細胞外分泌を促進することができる。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、抗体が産生される宿主細胞の種類に依存し、異種シグナル配列を天然シグナル配列と置き換えることができる。哺乳類宿主細胞において機能的なシグナルペプチドの例としては以下が挙げられる：米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン‐７（ＩＬ−７）に対するシグナル配列；Cosman et al., (1984) Nature 312:768に記載のインターロイキン−２受容体に対するシグナル配列；欧州特許第０３６７ ５６６号に記載のインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０ ４６０ ８４６号に記載のＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド。
提供される発現ベクターは、市販のベクター等の出発ベクター（starting vector）から構築できる。そのようなベクターは、所望のフランキング配列の全てを含んでもよいし、含まなくても良い。本明細書に記載の一つまたは複数のフランキング配列がまだベクター中に存在しない場合、それらを個々に入手しベクター中にライゲーションできる。各フランキング配列を得るために用いる方法は、当業者に周知である。
ベクターを構築し、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分の軽鎖、重鎖、または軽鎖および重鎖の成分をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入することができる。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分のための発現ベクターの、選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、または他の既知の技術を含む周知の方法によって達成できる。選択される方法は、部分的には、使用される宿主細胞種の機能であるだろう。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、上記のSambrook et al., (2001)に記載される。
宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を合成し、その後、該抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分は、培地から（宿主細胞が培地中に分泌した場合）、またはそれを産生している宿主細胞から直接（分泌されない場合）回収できる。適切な宿主細胞の選択は、所望される発現レベル、活性（糖鎖付加またはリン酸化等）および生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さに望ましいまたは必要であるポリペプチド改変等の種々の因子によって決まるだろう。
発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、該技術分野において周知であり、限定はされないが、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば、限定はされないがチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、およびいくつかの他の細胞株が含まれる。ある特定の実施形態では、細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有し、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃまたはＦＧＦＲ４のうちの一つまたは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の抗原結合タンパク質成分を恒常的に産生するかを測定することを通して選択され得る。別の実施形態では、それ自身の抗体を産生しないが、異種抗体を産生し分泌する能力を有するＢ細胞系統由来の細胞株が選択され得る。ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘導する能力によって、選択基準が形成され得る。
診断的および治療的目的のための抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の使用
本明細書で開示される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、生物試料中でβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数の存在を検出するのに、並びにβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数を産生する細胞または組織を特定するのに有用である。例えば、本明細書で開示される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、診断アッセイ、例えば、組織または細胞中で発現されたβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数を検出および／または定量するための結合アッセイに用いられ得る。β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４の一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、２型糖尿病、肥満症、異脂肪血症、ＮＡＳＨ、心臓血管病、およびメタボリックシンドローム等のＦＧＦ２１様シグナル伝達に関連する疾患の、必要とする患者における治療で用いられ得る。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体、β−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数を含む情報伝達複合体を形成することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ４およびβ−Ｋｌｏｔｈｏ等のＦＧＦＲに結合し、シグナル伝達を開始するＦＧＦ２１の天然のｉｎ ｖｉｖｏ活性を模倣および／または増強し、治療効果を生じさせることができる。
適応症
ヒトＦＧＦ２１に関連する疾患または状態には、患者における発症が、少なくとも部分的には、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃまたはＦＧＦＲ４、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ２１を含む複合体の形成によりｉｎ ｖｉｖｏで惹起されるＦＧＦ２１様シグナル伝達の誘導によって引き起こされる、あらゆる疾患または状態が含まれる。また、疾患または状態の重症度は、ＦＧＦ２１様シグナル伝達の誘導によって減少され得る。抗原結合タンパク質で治療され得る疾患および状態の例としては、２型糖尿病、肥満症、異脂肪血症、ＮＡＳＨ、心臓血管病、およびメタボリックシンドロームが挙げられる。
本明細書に記載の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、２型糖尿病、肥満症、異脂肪血症、ＮＡＳＨ、心臓血管病、およびメタボリックシンドロームを治療するのに用いることができ、あるいは、例えば、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月、半年ごと等に投与される予防的治療として使用し、症状、例えば、血漿グルコースレベルの上昇、トリグリセリドおよびコレステロールレベルの上昇の頻度および／または重症度を予防または減少させ、それによって血糖および心血管リスク因子プロフィールを改善することができる。
診断法
本明細書に記載の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ４、β−Ｋｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２１またはそれらの組み合わせに関連する疾患および／または症状を検出する、診断する、またはモニターするための診断目的に用いることができる。当業者に周知の古典的な免疫組織学的な方法を用いる、試料中のβ-Ｋｌｏｔｈｏまたはβ-Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数の存在を検出するための方法も提供される（Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam); Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., (1985) J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al., (1987) J. Cell Biol. 105:3087-3096)。β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数の検出は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。
本明細書にて提供される診断的適用には、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数の発現を検出するための抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の使用が含まれる。β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数の存在の検出に有用な方法の例としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイが挙げられる。
診断への適用のために、前記抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、通常、検出可能な標識基で標識されるだろう。適切な標識基には、限定はされないが、以下が含まれる：放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素的な基（enzymatic group）（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または２次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）。いくつかの実施形態では、標識基は、潜在的な立体障害を減少させるために、種々の長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質にカップリングされる。タンパク質を標識するための種々の方法が該技術分野において周知であり、使用可能である。
別の態様では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数を発現する１つまたは複数の細胞を特定するのに用いられ得る。特定の実施形態では、前記抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、標識基で標識され、標識された抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体のβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数への結合が検出される。さらなる特定の実施形態では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体のβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数への結合は、ｉｎ ｖｉｖｏで検出される。さらなる特定の実施形態では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は単離され、該技術分野において周知の技術を用いて測定される。例えば、Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 and periodic supplements); John E. Coligan, ed., (1993) Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sonsを参照。
別の態様は、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数への結合について、本明細書に記載され、提供される抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体と競合する試験分子の存在を検出することを提供する。１つのそのようなアッセイの例には、試験分子の存在下または非存在下で、ある量のβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数を含む溶液中の遊離した抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の量を検出することが含まれ得る。遊離した抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体（すなわち、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に結合していない抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体）の量の増加は、試験分子がβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数への結合において、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体と競合できることを示すであろう。一実施形態において、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は標識基で標識される。あるいは、試験分子が標識され、遊離した試験分子の量が抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の存在下および非存在下でモニターされる。
治療の方法：医薬製剤、投与経路
また、抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体を用いる方法も提供される。いくつかの方法において、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が患者に与えられる。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘導する。
また、開示された抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体のうちの１つまたは複数の治療有効量、並びに薬剤的に許容できる希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、および／またはアジュバントを含む医薬組成物も提供される。さらに、そのような医薬組成物を投与することにより患者を治療する方法も含まれる。「患者」という用語にはヒト患者が含まれる。
許容できる製剤材料は、使用される用量および濃度で受容者（recipient）に対し毒性を示さない。特定の実施形態では、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する治療有効量のヒト抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体を含む医薬組成物が提供される。
ある実施形態では、許容できる製剤材料は、好ましくは、使用される用量および濃度で受容者（recipient）に対し毒性を示さない。ある実施形態では、前記医薬組成物は、例えば、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは溶出の速度、組成物の吸着もしくは浸透を、変更、維持または保存するための製剤材料を含み得る。そのような実施形態では、適切な製剤材料には、限定はされないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン等）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム等）；緩衝剤（ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス塩酸、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸等）；増量剤（マンニトールまたはグリシン等）；キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等）；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリン等）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等）；着色剤、香味剤および賦形剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウム等）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素等）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトール等）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート等のポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（tyloxapal）等）；安定性強化剤（stability enhancing agent）（スクロースまたはソルビトール等）；張性増強剤（tonicity enhancing agent）（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール等）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または補助剤（pharmaceutical adjuvant）が含まれる。Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Companyを参照。
ある実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達様式および所望の用量に応じて当業者によって決定されるだろう。例えば、上記Remington’s Pharmaceutical Sciencesを参照。ある特定の実施形態では、そのような成分は開示された抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏでの放出速度およびｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス速度に影響し得る。ある実施形態では、医薬組成物中の主なビヒクルまたは担体は、水性であっても非水性であってもよい。例えば、適切なビヒクルまたは担体は、注射用蒸留水、生理食塩水または人工脳脊髄液であってよく、それらは非経口投与用の組成物中によく用いられる他の物質が補充されている可能性がある。中性の緩衝食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。特定の実施形態において、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝溶液を含み、さらにソルビトールまたは適切な代替物を含み得る。ある実施形態では、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体を含む組成物は、所望される程度の純度を有する選択された組成物と、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意の製剤化剤（formulation agent)(上記Remington’s Pharmaceutical Sciences)とを混合することにより、保存用に調製できる。さらに、ある実施形態では、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、スクロース等の適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤できる。
前記医薬組成物は、非経口的な送達用に選択され得る。あるいは、前記組成物は、吸入用または経口等の消化管を通じた送達用に選択され得る。そのような薬剤的に許容できる組成物の調製は、当業者の技能の範囲内である。
製剤成分は、好ましくは投与部位に許容される濃度で存在する。ある実施形態では、緩衝液は、組成物を生理的ｐＨに、またはわずかにより低いｐＨに、典型的には約５〜約８のｐＨの範囲内に維持するのに用いられる。
非経口投与が意図される場合、前記治療用組成物は、薬剤的に許容できるビヒクル中に所望の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体を含む、発熱物質なしの、非経口的に許容できる水溶液の形態で提供され得る。非経口的注射用に特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、その中で前記抗原結合タンパク質は無菌の等張液として製剤化され、適切に保存される。ある実施形態では、調製には、所望の分子を注射用ミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸等）、ビーズまたはリポソーム等の作用物質と一緒に製剤化することが含まれ得るが、これにより蓄積注射を介して送達され得る産物の制御されたまたは徐放性の放出が提供され得る。ある特定の実施形態では、循環血液中の滞留時間（sustained duration）を長くする効果を有するヒアルロン酸も使用され得る。ある実施形態では、埋め込み型薬物送達装置を用いて、所望の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が導入され得る。
ある種の医薬組成物は吸入用に製剤化される。いくつかの実施形態では、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、乾燥した、吸入可能な粉末として製剤化される。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の吸入用溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤と共に製剤化され得る。ある実施形態では、溶液は噴霧され得る。従って、経肺投与および製剤法は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載されており、該出願は参照により組み込まれ、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達について記載している。いくつかの製剤は経口投与され得る。この様式で投与されるβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、錠剤およびカプセル剤等の固形の投与剤形の配合で習慣的に用いられる担体を場合によっては使用して、製剤化され得る。ある実施形態では、カプセルは、生物学的利用能が最大となり、且つ全身に行きわたる前の（pre-systemic）分解が最小となる胃腸管のポイントで製剤の有効成分を放出するように設計され得る。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の吸収を促進するためにさらなる薬剤が含まれ得る。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も用いられ得る。
いくつかの医薬組成物は、錠剤の製造に適切な毒性のない賦形剤との混合物中に、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合するヒト抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体のうちの１つまたは複数の有効量を含む。錠剤を滅菌水、または別の適切な溶媒に溶解させることにより、溶液は単位投与剤形に調製され得る。適切な賦形剤には、限定はされないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム等の不活性希釈剤；またはデンプン、ゼラチン、もしくはアカシア等の結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくは滑石等の滑沢剤が含まれる。
持続的または制御的に送達される製剤中にβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体を含む製剤をはじめとするさらなる医薬組成物が、当業者に明らかであろう。リポソーム担体、生体内分解性の微小粒子または多孔質ビーズおよび蓄積注射等の、様々な他の持続的または制御的な送達手段を製剤化する技術も、当業者に周知である。例えば、参照により組み込まれ、医薬組成物の送達用の多孔性の高分子微粒子の制御放出について記載している国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照されたい。除放性調製物は、半透性のポリマーマトリックスを、成形品（shaped article）、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形状で含み得る。除放性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開第ＥＰ０５８４８１号に開示され、それぞれが参照により組み込まれる）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−イネサクリレート）（Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 および Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105）、エチレン酢酸ビニル（上記Langer et al., 1981）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３，９８８号）が含まれ得る。徐放性組成物には、該技術分野において既知のいくつか方法のいずれかで調製できるリポソームが含まれ得る。例えば、参照により組み込まれる、Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692；欧州特許出願公開第ＥＰ０３６，６７６号；同第ＥＰ０８８，０４６号および同第ＥＰ１４３，９４９号を参照されたい。
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に用いられる医薬組成物は、通常、無菌調製物として提供される。滅菌は、無菌のろ過膜を通す濾過によって達成され得る。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかに行われ得る。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥状態で、または溶液の状態で保存され得る。非経口組成物は、一般的に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射用針で貫通可能な栓を有する静脈注射用溶液が充填されたバッグまたはバイアル中に配される。
ある実施形態では、本明細書に記載されるような組換え抗原結合タンパク質を発現している細胞が、送達のためにカプセル化される（Invest. Ophthalmol Vis Sci (2002) 43:3292-3298およびProc. Natl. Acad. Sciences USA (2006) 103:3896-3901参照）。
ある種の製剤では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌまたは１５０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。いくつか製剤には、緩衝液、スクロースおよびポリソルベートが含まれる。製剤の一例は、５０〜１００ｍｇ／ｍｌの抗原結合タンパク質、５〜２０ｍＭの酢酸ナトリウム、５〜１０％ｗ／ｖのスクロース、および０．００２〜０．００８％ｗ／ｖのポリソルベートを含む製剤である。ある種の製剤には、例えば、９〜１１ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、８〜１０％ｗ／ｖのスクロース、および０．００５〜０．００６％ｗ／ｖのポリソルベート中に６５〜７５ｍｇ／ｍｌの抗原結合タンパク質が含まれる。そのようなある種の製剤のｐＨは、４．５〜６の範囲内である。他の製剤は、５．０〜５．５のｐＨ（例えば、５．０、５．２または５．４のｐＨ）を有する。
医薬組成物は製剤化されるとすぐに、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固形物、結晶として、または脱水もしくは凍結乾燥した粉末として、無菌のバイアル中に保存され得る。そのような製剤は、すぐ使用できる形態で、または投与前に再構成される（例えば、凍結乾燥した）形態で、保存され得る。また、単一用量投与単位を生成するためのキットも提供される。ある種のキットは、乾燥したタンパク質を有する第一の容器および水性製剤を有する第二の容器を含む。ある実施形態では、単一および複数のチャンバーを有する事前充填シリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（lyosyringe））を含むキットが提供される。使用される抗原結合タンパク質含有医薬組成物の治療有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存するだろう。治療に適切な投与量レベルは、部分的には、送達される分子、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が用いられている徴候、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表または臓器サイズ）および／または状態（年齢および全体的な健康）に依存して変化するであろうことが当業者には理解されるだろう。ある実施形態では、臨床医は最適な治療効果を得るために、投与量を設定し、投与経路を変更することができる。
典型的な投与量は、上記の要因に依存して、約１μｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ以下あるいはそれ以上の範囲であり得る。特定の実施形態では、投与量は、１０μｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ以下、所望により０．１ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ以下、あるいは０．３ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ以下の範囲であり得る。いくつかの適用において、投与量は０．５ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまでである。ある場合には、抗原結合タンパク質は、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの治療計画における投与スケジュールは、０．３ｍｇ／ｋｇ（週１回）、０．５ｍｇ／ｋｇ（週１回）、１ｍｇ／ｋｇ（週１回）、３ｍｇ／ｋｇ（週１回）、１０ｍｇ／ｋｇ（週１回）、または２０ｍｇ／ｋｇ（週１回）の投与量で行われる。
投与頻度は、使用される製剤中の特定の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の薬物動態パラメーターに依存するだろう。通常、臨床医は、所望の効果を達成する用量に達するまで、組成物を投与する。従って、組成物は単一用量として、または２回以上の用量（同じ量の所望の分子を含んでも含まなくてもよい）として長い期間をかけて、または移植デバイスもしくはカテーテルを介した持続注入として、投与され得る。適切な用量は、適切な用量反応のデータを使用することにより確かめることができる。ある実施形態では、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、長期間にわたって患者に投与され得る。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の長期投与は、完全なヒト由来ではない、例えばヒト以外の動物中でヒト抗原に対し産生された抗体、例えばヒト以外の種で産生された不完全ヒト抗体または非ヒト抗体である、抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が共通して関わる有害な免疫またはアレルギー反応を最小にする。
医薬組成物の投与経路は、既知の方法、例えば、経口、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内経路による注射を通じた方法；除放製剤による方法または移植デバイスによる方法に従う。ある特定の実施形態では、組成物はボーラス投与によって、または点滴によって持続的に、または移植デバイスによって投与され得る。
組成物はまた、所望の分子が吸収または封入されている膜、スポンジまたは別の適切な物質の移植を介して局所的に投与され得る。ある実施形態では、埋め込みデバイスが使用される場合、デバイスは適切な組織または器官のいずれにも埋め込み可能であり、所望の分子の送達は、拡散、持続放出型のボーラス、または持続的な投与を介したものとなり得る。
また、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体 医薬組成物をｅｘ ｖｉｖｏで用いることも望ましい。そのような場合、患者から取り出された細胞、組織または器官を、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体の医薬組成物に曝し、その後引き続いて該細胞、組織および／または器官を患者に移植して戻す。
具体的には、β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−Ｋｌｏｔｈｏ並びにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの一つもしくは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、本明細書に記載されているような方法を用いて、該ポリペプチドを発現および分泌するように遺伝子操作されているある種の細胞を移植することにより送達することができる。ある実施形態では、そのような細胞は動物またはヒト細胞であり得、自己の、異種性の（heterologous）、または異種間の（xenogeneic）ものであり得る。ある実施形態では、前記細胞は不死化され得る。他の実施形態では、免疫応答のリスクを減らすために、前記細胞をカプセルに包むことで周囲の組織への浸潤を回避できる。さらなる実施形態では、カプセル化のための物質は、典型的には、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系による、または周囲組織からの他の有害因子による細胞の破壊を妨げる、生体適合性、半透性のポリマー封入物または膜である。
併用療法
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の完全ヒト抗体医薬等の本開示の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体治療薬を、一つまたは複数の他の治療と一緒に用いて、糖尿病の対象を治療する方法を提供する。一実施形態では、そのような併用療法によって相加または相乗効果が達成される。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、現在用いられている一つまたは複数の２型糖尿病または肥満症の治療に併せて投与することができる。これらの糖尿病の治療には、ビグアナイド（メトホルミン（metaformin））、およびスルホニルウレア（グリブリド、グリピジド等）が含まれる。グルコース恒常性の維持を目的とするさらなる治療には、ＰＰＡＲγアゴニスト（ピオグリタゾン、ロシグリタゾン等）；グリニド系薬（メグリチニド、レパグリニド、およびナテグリニド等）；ＤＰＰ−４阻害剤（Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標）およびＯｎｇｌｙｚａ（登録商標）等）並びにαグルコシダーゼ阻害剤（アカルボース、ボグリボース等）が含まれる。
糖尿病のさらなる併用療法には、インスリンおよびインクレチン模倣薬（Ｂｙｅｔｔａ（登録商標）等の注射可能な治療薬（treatment）、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ（登録商標）等）、リラグルチド等の他のＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド）類似体、他のＧＬＰ−１Ｒアゴニスト並びにＳｙｍｌｉｎ（登録商標）（プラムリンチド）が含まれる。
体重減少薬を目的としたさらなる治療には、メリディアおよびゼニカルが含まれる。
実施された実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示的目的のためにのみ提供され、限定するものとは解釈されない。
実施例１
抗原としての使用のための、発現細胞上でのＦＧＦＲ１ｃの作製
完全長のヒトＦＧＦＲ１ｃポリペプチド（配列番号３０５；図１ａ〜ｂ）をコードする核酸配列、および完全長のヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏポリペプチド（配列番号３０８；図２ａ−ｃ）をコードする別個の配列を、好適な哺乳類細胞発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｚｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇ（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）またはｐＤＳＲα０）中にサブクローニングした。ｐＤＳＲα２０ベクターは、目的の遺伝子を発現するためのＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサー、および、例えばＡＭ１ ＣＨＯ（ＤＧ４４の誘導体、ＣＨＯ ＤＨＦＲ（−））などのＣＨＯ ＤＨＦＲ（−）宿主細胞中での選択のためのマウスのＤＨＦＲ発現カセットを含有する。
ＡＭ−１ ＣＨＯ細胞を、１００ｍｍのディッシュあたり１．５ｘ１０６細胞で播種した。２４時間後、ＦｕＧｅｎｅ６（ロッシュ・アプライド・サイエンス社（Roche Applied Science））を用いて、ｐＤＳＲα２０／ｈｕＦＧＦＲ１ｃおよびｐＤＳＲα２０／ｈｕβ−Ｋｌｏｔｈｏの直線化ＤＮＡを細胞に同時導入した。形質移入された細胞を、形質移入の２日後にトリプシン処理し、１０％の透析されたＦＢＳを含有しヒポキサンチン／チミジンを補充していないＣＨＯ ＤＨＦＲ選択的増殖培地中に播種した。２週間後、得られた形質移入されたコロニーをトリプシン処理し、プールした。
ＣＨＯの形質移入および選択と同様の手順に従い、対応する薬剤によって、ｐｃＤＮＡ３．１シリーズまたはｐＴＴ１４（カナダ国家研究会議（NRCC)のＤｕｒｏｃｈｅｒにより開発された、ｐＴＴ５に類似したＣＭＶプロモーターおよびＥＢＶ ｏｒｉ、およびピューロマイシン選択マーカーを有する発現ベクター）ベースのベクター中で、完全長のｈｕＦＧＦＲ１ｃおよびｈｕβ−Ｋｌｏｔｈｏを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入し、選択した。
ＦＧＦ２１Ｒ（すなわち、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏ）で形質移入されたＡＭ１ＣＨＯまたは２９３Ｔ細胞プールを、Ａｌｅｘａ６４７で標識されたＦＧＦ２１を使用して、繰り返し選別した。細胞表面を染色する試薬として、ＦＧＦ２１を、製造者（モレキュラープローブス社（Molecular Probes, Inc.）ＣａｔＡ２００６）推奨の方法に従って、Ａｌｅｘａ６４７−ＮＨＳで標識した。Ａｌｅｘａ６４７で標識したＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１Ｒ受容体を発現している細胞の特異的染色を示し、形質移入されていない親細胞の特異的染色は示さなかった（図３）。高発現細胞を、最終選別の最後に収集し、増殖させ、バイアル中で凍結した。ＡＭ−１／ｈｕＦＧＦ２１Ｒ細胞を免疫化のために作成し、２９３Ｔ／ｈｕＦＧＦ２１Ｒ細胞を、免疫化後にマウスの血清をＦＡＣＳにより滴定するために、およびＦＭＡＴによるハイブリドーマ上清の結合スクリーニングの際に、使用した（実施例４を参照のこと）。
実施例２
抗体としての使用のための可溶性ＦＧＦＲ１ｃ／β−ＫＬＯＴＨＯ複合体の作成
可溶性ＦＧＦ２１受容体構築物を、ｐＴＴ１４またはｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター中に生成した。ＦＧＦＲ１ｃ ＥＣＤ−Ｆｃ構築物（配列番号３１１、図４）は、ＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号２０）と融合した、ＦＧＦＲ１ｃのＮ末端細胞外ドメイン（アミノ酸残基＃１〜３７４；配列番号５）を含む。β−Ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ−Ｆｃ構築物（配列番号３１２、図５）は、ＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号２０）と融合したβ−Ｋｌｏｔｈｏ（アミノ酸残基＃１〜９９６；配列番号８）のＮ末端細胞外ドメインを含む。
ＨＥＫ２９３細胞（２９３Ｆ、インビトロジェン社（Invitrogen））を、ヒトＦＧＦＲ１ｃ ＥＣＤ−Ｆｃ／ｐＴＴ５、ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ−Ｆｃ／ｐＴＴ１４−ｐｕｒｏ、およびｄＧＦＰ／ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎｅｏで形質移入し、対応する薬剤の存在下で選択し、続いてｄＧＦＰの発現に基づいて繰り返しＦＡＣＳ選別した。細胞を、ＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ（コーニング社（Corning））中の、可欠アミノ酸を添加した血清非含有のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で４日間増殖させ、馴化培地（ＣＭ）を精製のために回収した。
２９３ＣＭを６倍に濃縮し、ＰＢＳ中で平衡化したプロテインＡ ＦＦに適用した。タンパク質をＰｉｅｒｃｅ Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ／Ａｂ溶出緩衝液で溶出した。プロテインＡプールを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７、１０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析し、ｐＨ７．０のＳＰ ＨＰに適用した。ＦＧＦＲ１ｃ ＥＣＤ−Ｆｃは素通り画分に存在し、ヘテロ二量体を、０〜０．４Ｍの直線勾配のＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．０で溶出した。Ｎ末端アミノ酸配列により、精製された可溶性ＦＧＦ２１Ｒが、（１：１）の比率のＦＧＦＲ１ｃ ＥＣＤ−Ｆｃおよびβ−ＫｌｏｔｈｏＥＣＤ−Ｆｃから成るヘテロ二量体であることが立証された。精製された可溶性ＦＧＦ２１Ｒ−Ｆｃ（図６）を、免疫化のための抗原として使用した。
実施例３
モノクローナル抗体の作成
免疫化は、以下を含む、ＦＧＦ２１受容体抗原の１つまたは複数の好適な形態を使用して行った：（１）配列番号３０５（図１ａ〜ｂも参照のこと）のヒト完全長のＦＧＦＲ１ｃポリペプチドをコードするｃＤＮＡおよび配列番号３０８（図２ａ〜ｃも参照のこと）のヒトβ−ＫｌｏｔｈｏポリペプチドをコードするｃＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質移入することにより得た、完全長のヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏを細胞表面に発現しているＣＨＯ形質移入体の細胞結合受容体（cell bound receptor）；（２）ＦＧＦ２１Ｒ受容体複合体を発現している上述の細胞由来の膜抽出物；または（３）ＦＧＦＲ１ｃ（配列番号３１１；図４も参照のこと）のＮ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびβ−Ｋｌｏｔｈｏ（配列番号３１２；図５も参照のこと）のＮ末端細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を同時発現させることにより得られる、可溶性ＦＧＦ２１Ｒ受容体；または（４）それらの組み合わせ。
好適な量の免疫原（すなわち、１０μｇ／マウスの可溶性ＦＧＦ２１Ｒまたは３〜４×１０６細胞／マウスの安定に形質移入されたＣＨＯ細胞または安定にＦＧＦ２１Ｒを発現しているＣＨＯ細胞から作成された１５０μｇ／マウスの精製されたＦＧＦ２１Ｒ膜）を、参照により本明細書に組み入れられる、１９９６年、１２月３日に出願された米国特許出願番号第０８／７５９，６２０号、および国際特許出願番号第ＷＯ９８／２４８９３号、および同ＷＯ００／７６３１０号に開示される方法に従い、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）において初回の免疫化で使用した。初回の免疫化後、免疫原（５μｇ／マウスの可溶性ＦＧＦ２１Ｒまたは１．７×１０６のＦＧＦ２１Ｒで形質移入された細胞／マウスまたは７５μｇの精製されたＦＧＦ２１Ｒ膜）のその次のブースト免疫化を、マウスにおいて好適な抗ＦＧＦ２１Ｒ力価を誘発するのに必要なスケジュールによりおよび必要な期間行った。力価を好適な方法、例えば、酵素イムノアッセイ、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）、または他の方法（酵素イムノアッセイおよびＦＡＣＳの組み合わせを含む）によって決定した。
好適な力価を示している動物を特定し、リンパ節を排液することによりリンパ球を得、必要な場合は、コホートごとにプールした。好適な培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地；ＤＭＥＭ；インビトロジェン社（Invitrogen）社製、カリフォルニア州、カールスバッド）中で粉砕することにより、リンパ球をリンパ系組織から分離して、細胞を組織から遊離させ、ＤＭＥＭ中に懸濁した。Ｂ細胞を、通常の方法を使用して選択しおよび／または増殖させ、好適な融合体パートナー、例えば、非分泌型骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（American Type Culture Collection CRL 1580; Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550）と、当技術分野で公知の技術を使用して融合させた。
１つの好適な融合方法においては、リンパ球を１：４の比率で、融合パートナー細胞と混合した。細胞混合物を静かに４００ｘｇで４分間遠心分離することにより静かにペレット化し、上清をデカントし、細胞混合物を静かに混合した（例えば、１ｍｌピペットを使用することにより）。融合はＰＥＧ／ＤＭＳＯ（ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシド；シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）製、ミズーリ州、セントルイス；リンパ球１００万個あたり１ｍｌ）で誘導した。ＰＥＧ／ＤＭＳＯを、１分間かけて静かに撹拌しながら徐々に添加し、続いて１分間混合した。次いでＩＤＭＥＭ（グルタミンを含まないＤＭＥＭ；Ｂ細胞１００万個あたり２ｍｌ）を、２分間にわたり静かに撹拌しながら添加し、続いてさらにＩＤＭＥＭ（Ｂ細胞１００万個あたり８ｍｌ）を、３分間にわたり添加した。
融合した細胞をペレット化し（４００ｘｇで６分間）、Ｂ細胞１００万個あたり、２０ｍｌの選択培地（例えば、アザセリンおよびヒポキサンチン［ＨＡ］および必要に応じて他の追加の材料を含有するＤＭＥＭ）中で再懸濁した。細胞を、３７℃で２０〜３０分間インキュベートし、次いで２００ｍｌの選択培地中で再懸濁し、Ｔ１７５フラスコ中で３〜４日間培養した後、９６ウェルにプレーティングした。
得られたコロニーのクローン性を最大化するために、通常の技術を使用して、細胞を９６ウェルプレートに分散した。数日間の培養後、上清を収集し、以下の実施例に詳述される通り、ヒトＦＧＦ２１受容体に対する結合性、特異性および／または異種間反応性の確認を含む、スクリーニングアッセイに付した。陽性細胞をさらに選択し、通常のクローニングおよびサブクローニング技術に付した。クローン系をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、分析のために分泌されたヒト抗体を得た。
このように、約１〜３カ月半の期間にわたり、１１〜１７回の免疫化の範囲で、完全長のＦＧＦ２１Ｒ細胞を発現している細胞または膜、または可溶性のＦＧＦ２１Ｒ細胞外ドメインのどちらかで、マウスを免疫化した。ＦＧＦ２１Ｒ特異抗体を分泌しているいくつかの細胞株を得、抗体をさらに特徴付けした。それらの配列は本明細書および配列表に提示され、これらの抗体を使用した様々な試験の結果が提供される。
実施例４
ＦＭＡＴによる結合抗体の選択
培養の１４日後、ＣＨＯ ＡＭ１／ｈｕＦＧＦ２１Ｒ細胞株またはヒトＦＧＦ２１Ｒで形質移入された組み換え型ＨＥＫ２９３細胞のどちらかに対してスクリーニングし、親ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞に対してカウンタースクリーニングすることにより、ハイブリドーマ上清を、蛍光微量アッセイ（ＦＭＡＴ）によりスクリーニングしてＦＧＦ２１Ｒ−特異性モノクローナル抗体を得た。簡単に説明すると、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（インビトロジェン社（Invitrogen））中の細胞を、安定な形質移入体用には、４，０００細胞／ウェルの密度で、親細胞用には１６，０００細胞／ウェルの密度で、３８４−ウェルのＦＭＡＴプレート中に５０μＬ／ウェルの体積で播種し、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。次いで１０μＬ／ウェルの上清を添加し、プレートを４℃で約１時間インキュベートし、その後１０μＬ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ５二次抗体を２．８μｇ／ｍｌ（４００ｎｇ／ｍｌ最終濃度）の濃度で添加した。次いでプレートを４℃で１時間インキュベートし、ＦＭＡＴ細胞検出システム（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））を使用して蛍光を読み取った。
ＦＭＡＴ法により、合計で３，０００を超えるハイブリドーマ上清が、細胞を発現しているＦＧＦ２１受容体には結合するが親細胞には結合しないことが特定された。次いでこれらの上清を、下に記載するＦＧＦ２１機能性アッセイにおいて試験した。
実施例５
抗体ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発する抗体の選択
野生型ＦＧＦ２１活性（例えば、ＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発する能力）を模倣する機能性抗体を特定するために、好適なＦＧＦ２１レポーターアッセイを使用して、実験を実施した。開示されるＦＧＦ２１レポーターアッセイは、ＭＡＰＫ経路の読み出し情報によって、ＦＧＦＲシグナル伝達の活性化を測定する。β−ＫｌｏｔｈｏはＦＧＦ２１シグナル伝達のための共受容体であり、β−Ｋｌｏｔｈｏは細胞質ドメインが極めて短いためにいかなる固有のシグナル伝達能力をも持たないと信じられているが、ＦＧＦ２１はＦＧＦＲを介してシグナル伝達を誘発する必要がある。
５．Ａ ＥＬＫ−ルシフェラーゼレポーターアッセイ
組換え型ヒト２９３Ｔ腎細胞またはＣＨＯ細胞系を使用して、ＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイを実施した。具体的には、宿主細胞は、β−Ｋｌｏｔｈｏおよびルシフェラーゼレポーター構築物を過剰発現するように操作された。レポーター構築物はＧＡＬ４−ＥＬＫ１および５ｘＵＡＳ−Ｌｕｃをコードする配列、Ｇａｌ４結合部位の５つのタンデムコピーを含有するプロモーターによって制御されるルシフェラーゼレポーターを含む。これらの組換え型レポーター細胞株中のＦＧＦ２１受容体複合体の活性化は、細胞内のシグナル伝達を誘発し、該シグナル伝達は次に、ＥＲＫおよびＥＬＫのリン酸化をもたらす。ルシフェラーゼ活性はリン酸化されたＥＬＫのレベルによって制御され、ＦＧＦ２１活性を間接的にモニターしおよび定量するために使用される。
１つの例において、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００形質移入試薬（インビトロジェン社（Invitrogen））を製造者のプロトコルに従って使用し、β−Ｋｌｏｔｈｏ、ＦＧＦＲ１ｃおよびレポータープラスミド：５ｘＧａｌ４−ルシフェラーゼ（ルシフェラーゼの上流の５ｘＧａｌ４結合部位を有する最小ＴＫプロモーター）およびＧａｌ４−ＥＬＫ１を発現している受容体構築物で、ＣＨＯ細胞を順次形質移入した。Ｇａｌ４−ＥＬＫ１は、ＥＲＫによってリン酸化されると、Ｇａｌ４結合部位に結合して転写を活性化する。ルシフェラーゼの転写、およびそれによる、この状況での対応する酵素的活性がリン酸化されたＥＬＫ１のレベルにより制御され、ＦＧＦ２１活性を間接的にモニターし定量するために使用される。
一桁のｎＭの範囲のＥＣ５０を示す未変性のＦＧＦ２１の１０〜２０倍の最適なアッセイウィンドウに基づいて、クローン２Ｅ１０を、ＦＧＦ２１ルシフェラーゼレポーター細胞株として選択した。
このアッセイのために、ＥＬＫ−ルシフェラーゼレポーター細胞を９６ウェルアッセイプレートにプレーティングし、一晩血清飢餓にさせた。ＦＧＦ２１または試験試料を、３７℃で６時間添加した。次いでプレートを室温まで冷却させ、細胞可溶化物中のルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（プロメガ社（Promega））で測定した。
５．Ｂ ＥＲＫ−リン酸化アッセイ
代替の宿主細胞株、具体的には、Ｌ６（ラット筋芽細胞株）を展開し、ＦＧＦ２１様シグナル伝達活性を有する抗体を特定するために使用した。ラットＬ６細胞株は、最小レベルの内在性ＦＧＦ受容体を発現することが知られているため、活性アッセイにおいて望ましい宿主細胞株である。Ｌ６細胞は、β−Ｋｌｏｔｈｏ発現ベクターで形質移入された場合でもＦＧＦ２１に応答しないため、より問題の少ない環境を提供する（Kurosu et al., (2007) J. Biol. Chem. 282, 26687-26695）。
Ｌ６細胞を１０％ウシ胎児の血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００形質移入試薬（インビトロジェン社（Invitrogen））を製造者のプロトコルに従って使用し、β−Ｋｌｏｔｈｏおよび個々のＦＧＦＲを発現しているプラスミドで、細胞を形質移入した。
Ｌ６細胞におけるＦＧＦシグナル伝達の分析を以下の文献に記載される通りに実施した：（Kurosu et al., (2007) J. Biol. Chem. 282, 26687-26695）。細胞培養物を、ＦＧＦ２１または試験分子の処理の１０分後に収集し、液体窒素中で瞬間冷凍し、溶解緩衝液中で均質化し、抗ホスホ−ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１／２）抗体および抗ＥＲＫ抗体（セルシグナリング社（Cell Signaling））を使用して、ウェスタンブロット分析に付した。リン酸化されたＥＲＫの総ＥＲＫタンパク質に対する割合を、このようにして測定した。
さらに、サイトカイン受容体に頻繁に使用される、因子依存性マウスＢａＦ３細胞ベースの増殖アッセイを、発展させ適用してもよい。
ＣＨＯ細胞（クローン２Ｅ１０）ベースのヒトＦＧＦ２１ ＥＬＫ−ルシフェラーゼレポーターアッセイで試験されたハイブリドーマ上清のうち、３０超が、陽性対照である２０ｎＭのＦＧＦ２１と比較した際、陽性であると特定された（ＦＧＦ２１の活性の＞５％）。次いで抗体を、これらの陽性細胞のハイブリドーマ培養物の馴化培地から精製し、ＣＨＯ細胞ベースのＥＬＫ−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて再度試験した。（図７）は１μｇ／ｍｌ（または６．７ｎＭ）未満のＥＣ５０推測値を有する、用量反応効力アッセイにおける代表的な抗体を示した。該活性は、Ｌ６細胞ベースのＥＲＫ１／２−リン酸化アッセイ（図８）において、ＣＨＯ安定細胞株２Ｅ１０におけるＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイと一致する１０ｎＭ未満のＥＣ５０を示し、確認された。
実施例６
ＦＧＦＲ１ｃ結合剤のＥＬＩＳＡ
ＦＧＦＲ１ｃと結合するペプチドを特定し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。続いて、ヒトＦＧＦＲ１ｃ（ｈｕ−ＦＧＦＲ１ｃ）、およびマウスＦＧＦＲ１ｃ（ｍｕ−ＦＧＦＲ１ｃ）を発現させ、精製した。抗Ｍ１３−ＨＲＰをジーイーヘルスケア社（G E healthcare）（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）から購入した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific）；イリノイ州、ロックフォード）を、ＰＢＳ中のそれぞれ２μｇ／ｍｌのｈｕ−ＦＧＦＲ１ｃおよびｍｕ−ＦＧＦＲ１ｃでコーティングした。次いでプレートを４℃で一晩インキュベートし、翌日、２％のＭＰＢＳ中、室温で１時間ブロックした。次いでプレートを、２％ＭＰＢＳ中に希釈した試料で１時間インキュベートし、１時間のインキュベート後、ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。抗Ｍ１３−ＨＲＰを２％のＭＰＢＳ中に１：１００００で希釈し、各ウェルに添加し、次いで１時間インキュベートした。１時間のインキュベート後、プレートを、３００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。Ｌｕｍｉｇｌｏ化学発光試薬（ケーピーエル社（ＫＰＬ）；メリーランド州、ゲイサーズバーグ）を添加し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ｒｅａｄｅｒ（パーキンエルマー社（Perkin Elmer）；マサチューセッツ州、ウォルトハム）を使用して蛍光を測定した。
実施例７
二重特異性ＦＧＦ２１模倣性抗体結合タンパク質の作成
ベクターｐＴＴ５ ＳＮＳ（カナダ国家研究会、カナダ、オタワ）を重鎖として使用した。ＩｇＧ１中のＮ−結合グリコシル化部位を、Ｎｏｖａｇｅｎ（ドイツ、ダルムシュタット社（Darmstadt））ホットスタートＫＯＤ ＰＣＲキット７１０８６を使用して、以下のように、オーバーラップＰＣＲにより除去した。反応物は、３０．５μｌ Ｈ２Ｏ、２．５μｌ ＤＭＳＯ、５μｌ １０×＃１緩衝液、最終濃度０．２ｍＭのための５μｌ ｄＮＴＰ、最終濃度１ｍＭのための２μｌ ＭｇＣｌ２（カタログ番号７１１５３）、キアゲン社（Qiagen）スピンミニプレップ（spin Mini-prep）（カルフォルニア州、バレンシア）により作成された１μｌの鋳型ＤＮＡ、それぞれ最終濃度０．３μＭのための１０ｐｍｏｌ／μｌの各１．５μｌのフォワードおよびリバースオリゴ、および１μｌのＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有した。反応物を９４℃で２分間熱サイクルにかけ、次いで［９４℃で１５秒、４５℃で３０秒、および６８℃で３分間］を３０サイクル行った。２つの最初のＰＣＲ反応は、変異を導入するために行った。プライマー対の配列は、ＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＣＡＧＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣ（配列番号２６９）とＣＴＴＣＣＧＡＧＴＧＡＧＡＧＡＣＡＣ（配列番号２７０）およびＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧ（配列番号２７１）とＴＧＣＴＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＧＣＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧ（配列番号２７２）である。ＰＣＲ生成物を、キアゲン社（Qiagen）スピンカラムキット（spin column kit）（カルフォルニア州、バレンシア）を使用してゲル精製し、次いで、プライマーＣＴＴＣＣＧＡＧＴＧＡＧＡＧＡＣＡＣ（配列番号２７３）およびＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧ（配列番号２７４）を使用したオーバーラップＰＣＲ反応に一緒に添加した。最終ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ｐＴＴ５ ＳＮＳベクター中で、制限部位ＢｓｍＢＩおよびＮｏｔＩを使用して、元の断片を置き換えるために使用した。ニューイングランド・バイオラブズ社（New England Biolabs）（マサチューセッツ州、イプスウィッチ）製のクイックリガーゼキット、およびインビトロジェン社（Invitrogen）（カリフォルニア州、カールスバッド）製の化学的にコンピテントな細胞、上位１０種をクローニングに使用し、次いでＤＮＡ構築物を精製し、配列を検証した。
重鎖ＣＤＲをＰＣＲに付し、ＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｍＢＩ、ならびに１Ａ２のためにプライマーＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣ（配列番号２７５）およびＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号２７６）、または２Ｇ１０のためにプライマーＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣ（配列番号２７７）およびＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号２７８）を使用して、このベクター中にクローニングした。
１Ａ２軽鎖を、ＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｉＷＩ、ならびにプライマーＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣ（配列番号２７９）およびＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣ（配列番号２８０）を使用して、ｐＴＴ５カッパ中にクローニングした。
２Ｇ１０軽鎖を、ＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｍＢＩならびにプライマーＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＣＣ（配列番号２８１）およびＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ（配列番号２８２）を使用して、ｐＴＴ５ラムダ中にクローニングした。
全てのオリゴ（表８を参照のこと）を、水中で１０μＭに希釈した。９μｌのＵＢおよびＬＡオリゴを、５’内部リン酸化に使用した。９０％のＮＥＢ ＰＮＫ緩衝液（マサチューセッツ、イプスウィッチ）および１０％のＮＥＢ ＰＮＫ（マサチューセッツ、イプスウィッチ）の混合物（１μｌ）を添加した。混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、次いで６０℃で２０分間（ＰＣＲ機器中で）インキュベートした。次いで９μｌの相補的オリゴを添加した。すべてのオリゴ対を、９５℃で２０秒サイクルにかけ、次いで０．１℃／秒で５０℃まで（７：３０分の温度勾配）低減させた。両方のオリゴ対を混合し、２５℃までの５分の温度勾配（０．１℃／秒の低減）を使用して、５５℃で２０秒「縫い合わせた」。次いで１５０μｌの５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５／０．１ｍＭ ＥＤＴＡを、リンカー調剤に添加した。リンカーを、ＢｓｒＧＩおよびＳｅｘＡＩで分解しゲル精製したｐＴＴ５−１Ａ２または２Ｇ１０中にライゲーションした。
表８
Figure 2013523184
Figure 2013523184
ＦＧＦＲ１ｃ結合剤ＳＲ４を、以下の通り、１Ａ２または２Ｇ１０のＮ末端にも添加した：ＰＣＲ反応は、重鎖プラスミド上で、プライマーＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣ（配列番号２９５）およびＴＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＧＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号２９６）を使用して行った。次いでこの反応物１μｌを、プライマーＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣ（配列番号２９７）およびＴＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＧＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号２９８）を使用するＰＣＲの鋳型として使用した。このＰＣＲにより、ＳＲ４−ＣＤＲ断片を得、該断片を次いでキアゲン社（Qiagen）ＰＣＲクリーンアップキット（カルフォルニア州、バレンシア）を使用して精製し、ｐＴＴ５−ＩｇＧ１ ＡｇｌｙｃｏのＢｓｓＨＩＩからＢｓｍＢＩにライゲーションした。
ＳＲ４を、以下の通り、１Ａ２または２Ｇ１０のＣ末端にも添加した：ＰＣＲ反応は、ｐＴＴ５−ＩｇＧ１ Ａｇｌｙｃｏ上で、プライマーＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧ（配列番号２９９）およびＡＡＴＡＧＣＣＣＣＡＣＧＣＣＴＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ（配列番号３００）を使用して行った。次いでこの反応物１μｌを、プライマーＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧ（配列番号３０１）およびＧＡＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣＣＣＣＡＣＧＣＣＴＧＡＴＡＧ（配列番号３０２）を使用するＰＣＲの鋳型として使用した。このＰＣＲによりＩｇＧ１−ＳＲ４断片を得、該断片を次いでキアゲン社（Qiagen）ＰＣＲクリーンアップキット（カルフォルニア州、バレンシア）を使用して精製し、ｐＴＴ５−ＩｇＧ１ ＡｇｌｙｃｏのＳａｃＩＩからＮｏｔＩにライゲーションした。ライゲーションの前に、ロッシュ社（Roche）ｒＡＰｉｄ ＡＰキット（ドイツ、マンハイム）を使用して、ベクターを３０分間の反応により脱リン酸化した。
実施例８
二重特異性ＦＧＦ２１模倣性抗原結合タンパク質の発現
ｐＴＴ５ベクター中の二重特異性ＦＧＦ２１模倣性抗原結合性タンパク質を、（２５μｇ／ｍｌ）ジェネテシン（インビトロジェン社（Invitrogen Corporation）、カリフォルニア州、カールスバッド）および０．１％のプルロニックＦ６８（インビトロジェン社（Invitrogen））を添加したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（インビトロジェン社（Invitrogen））中に維持した２９３−６Ｅ細胞に適合した血清非含有の懸濁液中に、一過的に発現させた。形質移入を、１Ｌの培養液として実施した。簡単に説明すると、細胞接種材料を３Ｌフェルンバッハ振盪フラスコ（コーニング社（Corning,Inc.）中で１．１×１０６細胞ｓ／ｍｌまで増殖させた。振盪フラスコ培養液を、３７℃および５％ ＣＯ２に維持した加湿インキュベーター中に設置した、Ｉｎｎｏｖａ ２１５０振盪プラットフォーム（ニューブランズウィックサイエンティフィック社（News Brunswick Scientific）ニュージャージー州、エジソン）上で、６５ＲＰＭに維持した。形質移入の際、２９３−６Ｅ細胞を１．０×１０６細胞ｓ／ｍｌまで希釈した。形質移入複合体を１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地中に形成させた。１ｍｇのプラスミドＤＮＡをまず培地に添加し、続いて３ｍｌのＦｕＧｅｎｅ ＨＤ形質移入試薬（ロッシュ・アプライド・サイエンス社（Roche Applied Science）、インディアナ州、インディアナポリス）を添加した。形質移入複合体を室温で約１５分間インキュベートし、ついで振盪フラスコ中の細胞に添加した。形質移入の２０時間後、２０％（ｗ／ｖ）のペプトンＴＮ１（オルガノテクニー社（Organo Technie S.A．）、テクニーサイエンス社（Teknie Science）、カナダ、ケベック州）を、最終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）に達するように、添加した。形質移入／発現を４〜７日間実施し、その後４℃で６０分間、４，０００ＲＰＭで遠心分離することにより、馴化培地を回収した。
実施例９
一過性細胞培養液からの抗原結合タンパク質の精製
ＦＧＦ２１模倣性抗原結合性タンパク質を、一過性細胞培養液から、以下のように精製した。すべての精製プロセスは、室温または４℃で行われた。１つの精製スキームを種々の二重特異性ＦＧＦ２１模倣性抗体を精製するために使用し、アフィニティークロマトグラフィーを使用した。
９．Ａ
プロテインＡクロマトグラフィー
宿主細胞培養液（ＣＣＦ）を、カラム形態のプロテインＧクロマトグラフィー媒体、ＰＢＳ中で平衡化したプロテインＡハイ・パフォーマンス（ジーイーヘルスケア社（G E Healthcare）、前アマシャム・バイオサイエンシズ社（Amersham Biosciences））の上に充填した。
充填後、素通り画分の２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに戻るまで、プロテインＡカラムをＰＢＳで洗浄した。次いで１０ｍＭ、ｐＨ３．５の酢酸を使用して、抗体をカラムから溶離し、溶出体積のｍＬあたり１Ｍのトリス塩基のストック溶液８０μＬを添加することにより、即座に中和した。溶出液の２８０ｎｍでの吸光度をモニタし、タンパク質を含有する画分を収集してプロテインＡプールを作製した。
９．Ｂ
製剤化および濃縮
精製後、ＤＰＢＳ（８．１ｍＭ ＮａＨＰＯ４−Ｈ２Ｏ、１３８ｍＭ ＮａＣｌ２、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ ＫＣＬ ｐＨ７．４）中で、１０，０００ＭＷＣＯ膜（ピアス社（Pierce）、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ）を使用して透析することにより、抗体を製剤化した。抗体の濃度の測定が必要な場合、１０，０００ＭＷＣＯ膜を備えた遠心性の装置（Ｍａｃｒｏｃｅｐ、ポール社（Pall））を使用した。製剤化後、抗体を無菌の０．２μｍフィルターに通し、４℃でまたは凍結して保管した。
実施例１０
二重特異性ＦＧＦ２１模倣体抗体のＥＬＩＳＡ
ビオチン−ｈｕ−β−Ｋｌｏｔｈｏ−Ｈｉｓ、ビオチン−ｍｕ−β−Ｋｌｏｔｈｏ−Ｈｉｓ、ｈｕ−ＦＧＦＲ１ｃ−Ｈｉｓ、およびｍｕ−ＦＧＦＲ１ｃ−Ｆｃを発現させ、精製した。抗Ｆｃ−ＨＲＰをサーモフィッシャーサイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific）（イリノイ州、ロックフォード）から購入した。Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ ９６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific）（イリノイ州、ロックフォード）を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのビオチン−ｈｕ−β−Ｋｌｏｔｈｏ−Ｈｉｓまたはビオチン−ｍｕ−β−Ｋｌｏｔｈｏ−Ｈｉｓ（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）でコーティングした。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific）（イリノイ州、ロックフォード）を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのｈｕ−ＦＧＦＲ１ｃ−Ｈｉｓまたはｍｕ−ＦＧＦＲ１ｃ−Ｆｃでコーティングした。次いでプレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートを２％の牛乳−ＰＢＳ中、室温で１時間ブロックした。各ウェルを次いで、２％の牛乳−ＰＢＳ中に希釈した試料とともに１時間インキュベートした。プレートを３００μｌ ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（インビトロジェン社（Invitrogen））；カリフォルニア州、カールスバッド、およびシグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）；ミズーリ州、セントルイス）で３回洗浄した。抗ｈｕ−Ｆｃ−ＨＲＰを２％牛乳−ＰＢＳ中で１：１００００に希釈し、各ウェルに添加した。プレートを再度、３００μｌ ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。Ｌｕｍｉｇｌｏ試薬（ケーピーエル社（ＫＰＬ）；メリーランド州、ゲイサーズバーグ）を添加し、蛍光を測定した（パーキンエルマー社（Perkin Elmer）；マサチューセッツ州、ウォルトハム）。
実施例１１
二重特異性ＦＧＦ２１模倣体抗体のルシフェラーゼアッセイ
β−Ｋｌｏｔｈｏを伴ってまたは伴わずにＦＧＦＲ１ｃ、Ｅｌｋおよびルシフェラーゼを発現しているＡＭ１Ｄ細胞を作製した。ＦＧＦ２１を発現させ、精製した。ＦＧＦＲ１ｃ、β−Ｋｌｏｔｈｏ、Ｅｌｋ、およびルシフェラーゼを発現しているＡＭ１Ｄ細胞を、１０％の透析されたウシ胎児の血清（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）、４μｇ／ｍｌのピューロマイシン（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）、ピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）、およびＭＥＭ可欠アミノ酸（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）を添加したＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）中に維持した。ＦＧＦＲ１ｃ、Ｅｌｋ、およびルシフェラーゼを発現しているＡＭＩＤ細胞を、１０％の透析したウシ胎児の血清、４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ、６μｇ／ｍｌのピューロマイシン、ＨＴサプリメント（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、およびＭＥＭ可欠アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地中に維持した。
細胞を、３０μｌ／ウェルの総体積に対して０．１％ＢＳＡ（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）；ミズーリ州、セントルイス）を含有するＦ−１２培地（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）中、９６ハーフウェルプレート（コーニング社（Corning））；マサチューセッツ、ローウェル）に、３×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。次いで細胞を、３７℃で２０〜２２時間インキュベートした。試料をＰＢＳ（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）中に希釈し、１５μｌを各ウェルに添加した。ついで細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。ヒトＦＧＦ２１をＦ−１２培地中に希釈し、最終濃度３ｎＭになるように５μｌを細胞に添加した。次いで細胞を、３７℃で５〜７時間インキュベートした。ルシフェラーゼ試薬（パーキンエルマー社（Perkin Elmer）；マサチューセッツ州、ウォルトハム）を添加し、蛍光を測定した（パーキンエルマー社（Perkin Elmer）；マサチューセッツ州、ウォルトハム）。
実施例１２
抗β−ＫＬＯＴＨＯ抗体の動態研究
ビオチン化されたｈｕ−β−ｋｌｏｔｈｏを調製した。精製された抗β−ｋｌｏｔｈｏ抗体の親和性測定を、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ（フォルテバイオ社（forteBIO Inc）、カリフォルニア州、メンロパーク）を使用し、供給業者のプロトコルに従って実施した。抗原コーティングのために、ストレプトアビジン高結合性ＦＡバイオセンサーを、ビオチン化されたｈｕ−β−ｋｌｏｔｈｏとともに、動的緩衝液（Kinetic buffer）（フォルテバイオ社（forteBIO Inc）、カリフォルニア州、メンロパーク）中１００ｎＭで１時間インキュベートし、ベースラインを確立するために、動的緩衝液（Kinetic buffer）中で１分間インキュベートした。会合を測定するために、バイオセンサーを、対照ＩｇＧとともに動的緩衝液（Kinetic buffer）中２μｇ／ｍｌで１５分間インキュベートし、次いで解離を測定するために動的緩衝液（Kinetic buffer）中で１５分間インキュベートした。親和性のデータは、組み込みの分析ソフトウェアを使用して得た。
実施例１３
抗β−ＫＬＯＴＨＯ抗体のエピトープ結合
オフラインの間は、抗原コーティングのために、ストレプトアビジン高結合性ＦＡバイオセンサーのカラムを、動的緩衝液（Kinetic buffer）中の１００ｎＭのビオチン化されたｈｕ−β−ｋｌｏｔｈｏ（フォルテバイオ社（forteBIO Inc）、カリフォルニア州、メンロパーク）で１時間インキュベートしてもよく、次いで、動的緩衝液（Kinetic buffer）中で２分間、続いて各カラムごとに異なる抗β−ｋｌｏｔｈｏ抗体とのインキュベーションを、動的緩衝液（Kinetic buffer）中１１μｇ／ｍｌで２．５時間行ってもよい。最初に充填する抗体はカラム１中のＡｂ１、カラム２中のＡｂ２等であってよい。初めに、各カラムのセンサーを、特定の最初に充填したＩｇＧとともに前もって充填してもよく、異なるウェル中の異なる試験ＩｇＧとともに、１１μｇ／ｍｌで３０分間、インキュベートしてもよい。二番目に充填するＩｇＧの順番は、ウェルＡのＡｂ１、ウェルＢのＡｂ２などである。第二のＩｇＧの結合シグナルは、読み取り値のとおり記録してよい。
実施例１４
アルギニン走査
ここで記載するように、ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、またはＦＧＦＲ４のうちの１つ、すなわちＦＧＦＲ１ｃ、の両方と結合するＦＧＦ２１模倣体抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体を、作製し特徴付けした。これらの種々の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が結合するヒトＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏの中和決定基を決定するため、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏの選択されたアミノ酸残基にアルギニン置換を有する、いくつかの変異体ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を作製することができる。アルギニン走査は、抗体または他のタンパク質がどこで別のタンパク質に結合しているかを評価する、当技術分野で公知の方法である。例えばNanevicz et al., (1995) J. Biol. Chem. 270:37, 21619-21625 and Zupnick et al., (2006) J. Biol. Chem. 281:29, 20464-20473を参照のこと。一般に、アルギニン側鎖は正に荷電しており、他のアミノ酸に比べて比較的かさ高であり、変異が導入される抗原の領域への抗体の結合を撹乱させ得る。アルギニン走査は、残基が中和決定基および／またはエピトープの部分であるかどうかを、測定する方法である。
アルギニンに対する変異に対して、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏ細胞外ドメインに分散している種々のアミノ酸を選択することができる。残基が表面上に存在する可能性を最大化し、かつ変異の結果ミスフォールドしたタンパク質となる可能性を減少させるために、選択は、電荷または極性アミノ酸に偏り得る。当技術分野で公知の標準的技術を使用して、変異した残基を含有するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ストラタジーン社製Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）IIプロトコルキット（ストラタジーン／アジレント社（Stratagene/Agilent）、カリフォルニア州、サンタクララ）により提供される基準に基づいてを設計することができる。野生型（ＷＴ）ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏ配列の変異誘発は、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）IIキット（Stratagene）を使用して実施することができる。ポリＨｉｓタグによる精製を容易にするために、細胞外ドメインのカルボキシ末端にＦＬＡＧ−ヒスチジンタグ（６個のヒスチジン（配列番号２６８））をコードするように、キメラ構築物を操作することができる。
Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘワークステーションおよびソフトウェア（バイオラッド社（BioRad）、カルフォリニア州、ハーキュリーズ）を使用した多重分析を実施して、野生型ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質と比較した、例示的なヒトＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏモノクローナル抗体のアルギニン変異体に対する差次的結合を分析することにより、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏ上の中和決定基を決定することができる。ヒスチジンタグされたタンパク質を捕捉するために、いかなる数のペンタ−Ｈｉｓでコーティングされたビーズ（配列番号３０３として開示される「ペンタ−Ｈｉｓ」）（キアゲン社（Qiagen）、カルフォルニア州、バレンシア）のビーズコードを使用してもよい。ビーズコードは、ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏアルギニン変異体および野生型ヒトＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏの多重化を可能にすることができる。
ビーズを作製するために、一過性発現培養から得た１００μｌの野生型ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏアルギニン変異体の上清を、激しく振盪させながら、４℃で一晩または室温で２時間、ペンタ−Ｈｉｓでコーティングされたビーズ（配列番号３０３として開示される「ペンタ−Ｈｉｓ」）に結合させた。次いで製造者のプロトコルに従ってビーズを洗浄し、ビーズをプールし、それぞれ、二重または３重のアッセイポイントのために、９６−ウェルのフィルタープレート（ミリポワ社（Millipore）、マサチューセッツ州、ビラリカ、製品＃ＭＳＢＶＮ１２５０）の２または３列に分注した。４倍に希釈した１００μｌの抗ＦＧＦＲ１ｃおよび／または抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗原結合タンパク質をウェルに添加し、１時間室温でインキュベートし、洗浄した。１：１００に希釈した１００μｌのＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ジャクソンラブズ社（Jackson Labs.）、メイン州、バーハーバー、製品＃１０９−１１６−１７０）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、洗浄した。ビーズを１％ＢＳＡ中に再懸濁し、３分間振盪し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘワークステーションで解析した。ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏアルギニン変異体タンパク質に対する抗体の結合を、同じプールから得たヒトＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏ野生型に対する抗体の結合と比較した。約５ｌｏｇ規模にわたる抗体の滴定を実施することができる。ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏアルギニン変異体タンパク質の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、野生型ヒトＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏのシグナル最大値に対するパーセントとして、グラフ化することができる。すべての抗原結合タンパク質からのシグナルがカットオフ値、例えば３０％よりも低い野生型ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏの変異体は、一過性培養における発現が少なすぎるためにビーズ上のタンパク質濃度が低すぎるか、またはミスフォールドされている可能性があり分析から除外され得るかのどちらかであるとみなされ得る。ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏ抗原結合タンパク質に対するＥＣ５０をカットオフ値、例えば３倍以上（例えばＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）により計算される通り）に増加させる変異（すなわち、アルギニンの置換）は、ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏ抗原結合タンパク質の結合に負の影響を与えたと考えられる。これらの方法により、種々のFＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏ抗原結合タンパク質について、中和決定基およびエピトープを解明することができる。
実施例１５
キメラ受容体の作成
これらの種々の抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が結合するヒトＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏ上の活性化決定因子を測定する別の方法において、前述され試験された、一過性または安定な２９３細胞またはＣＨＯ細胞中に発現する、ヒトおよびマウスタンパク質由来の配列を含む特異的なキメラＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を作製することができる。例えば、ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏ上の選択された領域または配列が、対応するマウス特異的残基で系統的に置き換えられている（例えば図２を参照のこと）、キメラのヒトまたはマウスβ−Ｋｌｏｔｈｏと対を成す、未変性のヒトＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２Ｃ、ＦＧＦＲ３ｃまたはＦＧＦＲ４、１つの例においてはＦＧＦＲ１ｃを含む、キメラのＦＧＦ２１受容体を作製することができる。同様に、未変性のヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏは、ヒトＦＧＦＲ１ｃ上の選択された領域または配列が、対応するマウス特異的残基で系統的に置き換えられている、キメラのヒト／マウスＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃまたはＦＧＦＲ４、１つの例においてはＦＧＦＲ１ｃ、と対を成す。抗原結合タンパク質の結合および／または活性に関わる重要な配列は、キメラのＦＧＦ２１受容体に基づき、結合アッセイまたは本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の活性測定法によって得ることができる。
実施例１６
プロテアーゼ保護分析
ヒトＦＧＦ２１受容体、例えばＦＧＦＲ１ｃ、β−ＫｌｏｔｈｏまたはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏを含む複合体に結合する抗原結合タンパク質および抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が結合しているヒトＦＧＦ２１受容体の領域は、例えば、ＡｓｐＮ、Ｌｙｓ−Ｃ、キモトリプシンまたはトリプシンなどの特異的なプロテアーゼでヒトＦＧＦ２１受容体をペプチドに断片化することにより特定できる。次いで、得られたヒトＦＧＦ２１受容体ペプチドの配列（すなわち、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏの部分由来のジスルフィドおよび非−ジスルフィド含有ペプチド断片の両方）を決定することができる。１つの例において、実施例、ヒトＦＧＦ２１受容体複合体の可溶性形態、例えば明細書に記載のＦＧＦＲ１ｃ ＥＣＤ−Ｆｃおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏ ＥＣＤ−Ｆｃヘテロ二量体を含む複合体は、０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中の１．０ｍｇ／ｍｌの可溶性ＦＧＦ２１受容体約１００μｇを、３７℃で２０時間、２μｇのＡｓｐＮとともにインキュベートすることにより、ＡｓｐＮ（アミノ末端のアスパラギン酸およびいくつかのグルタミン酸残基の後で切断する）で消化することができる。
次いで、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより、ＡｓｐＮ分解物のペプチド・プロファイルを生成することができ、一方、類似量の抗体を使用した対照の消化物は、ＡｓｐＮエンドプロテイナーゼに対して本質的に耐性であることが期待される。次いでプロテアーゼ保護アッセイを行うことにより、抗原結合タンパク質の存在下での、ヒトＦＧＦ２１受容体のタンパク質消化を測定することができる。本アッセイの一般的原則は、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体のＦＧＦ２１受容体との結合は、ある特異的なプロテアーゼ切断部位の保護をもたらし得、その情報を用いて、抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が結合する、ＦＧＦ２１受容体の領域または部分を決定することができる。
簡単に説明すると、ペプチド消化物を、ＨＰＬＣペプチドマッピングに付し；個々のピークを採取し、オンラインのエレクトロスプレーイオン化ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ）分析よび／またはＮ末端配列決定法により、ペプチドを特定しマッピングする。これらの調査のためのＨＰＬＣ分析は、オフラインでの分析のための小口径逆相Ｃ１８カラム（アジレントテクノロジーズ社（Agilent Technologies））を使用して、およびＬＣ−ＭＳのための（ザ・セパレーショングループ社（The Separation Group））キャピラリー逆相Ｃ１８カラムを使用して、実施することができる。ＨＰＬＣペプチドマッピングは、０．０５％トリフルオロ酢酸中の０．０５％トリフルオロ酢酸（移動相Ａ）〜９０％アセトニトリルの直線勾配で実施することができる。カラムは、オフラインまたはオンラインＬＣ−ＭＳ分析用の小口径ＨＰＬＣ向けに、およびオンラインＬＣ−ＭＳ分析用のキャピラリーＨＰＬＣ向けに、望ましい流量で展開することができる。
配列分析は、ＨＰＬＣにより回収したペプチドピーク上で、オンラインＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびＥｄｍａｎ配列決定法により実施することができる。ペプチド分解物のオンラインＥＳＩ ＬＣ−ＭＳ分析を行うことにより、ＨＰＬＣにより分離されたペプチドの正確な質量および配列を測定することができる。プロテアーゼ分解物からのペプチドピークに存在する選択されたペプチドの同一性は、このように測定される。
実施例１７
抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体
ＦＧＦ２１のＣ末端は、β−Ｋｌｏｔｈｏ結合特異性において決定的なモチーフであることが報告されている（Wu, et al., J. Biol. Chem. 283, 33304-33309 (2008)）。Ｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づき、プロテアーゼ高感受性の切断部位のクラスタが、ＦＧＦ２１のＣ末端の近位、具体的にはＰｒｏ１７１およびＳｅｒ１７２の間に特定されている。この残基のクラスタにおける切断は、β−Ｋｌｏｔｈｏに対する結合を低減させ、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＦＧＦ２１を失活させた。本明細書に記載の一連の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体はＦＧＦ２１中の未変性のβ−Ｋｌｏｔｈｏ結合モチーフを高親和性抗原結合タンパク質で置き換えるように設計された。
以下を含む、１０個の１連の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が生成された：（ａ）β−Ｋｌｏｔｈｏまたはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数に特異的に結合する抗原結合タンパク質成分；ならびに（ｂ）ＦＧＦ２１またはその断片を含むＦＧＦ２１成分。１０個の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体は、抗原結合タンパク質成分がヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏ特異的に結合し、ＦＧＦ２１成分がＦＧＦＲ１ｃと会合し、最終的にはＦＧＦ２１に誘発されるシグナル伝達を引き起こす複合体を形成することを目的として、操作された。従って、融合体はＦＧＦ２１模倣体として設計された。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイにおいて、以下のとおり、融合体を試験した。
１７．Ａ．
構築
１０個の特異抗原結合タンパク質融合体を生成した。これらの融合体はそれぞれが、残基１〜１６９（配列番号３４２）または成熟型ＦＧＦ２１（配列番号３４３）の１〜１７０に、様々な配向で、リンカー（すなわち、（Ｇ４Ｓ）１５（配列番号３４０）、（Ｇ４Ｓ）１２（配列番号３３９）、（Ｇ４Ｓ）９（配列番号３３８）、（Ｇ４Ｓ）６（配列番号３３７）、および（Ｇ４Ｓ）３（配列番号３３６））により融合している抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０（表１〜３および６に記載される通り）を含む。
以下を含む抗原結合タンパク質融合体が生成され、これらをＮ末端からＣ末端の方向で表す：
（ａ）ＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）３−２Ｇ１０（配列番号：３１５（コード配列）および３１６（アミノ酸配列））；
（ｂ）ＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）６−２Ｇ１０（配列番号：３１９（コード配列）および３２０（アミノ酸配列））；
（ｃ）ＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）９−２Ｇ１０（配列番号：３２１（コード配列）および３２２（アミノ酸配列））；
（ｄ）ＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）１２−２Ｇ１０（配列番号：３２３（コード配列）および３２４（アミノ酸配列））；
（ｅ）ＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）１５−２Ｇ１０（配列番号：３２５（コード配列）および３２６（アミノ酸配列））；
（ｆ）２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号：３１７（コード配列）および３１８（アミノ酸配列））；
（ｇ）２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）６−ＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号：３２７（コード配列）および３２８（アミノ酸配列））；
（ｈ）２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）９−ＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号：３２９（コード配列）および３３０（アミノ酸配列））；
（ｉ）２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）１２−ＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号：３３１（コード配列）および３３２（アミノ酸配列））；ならびに
（ｊ）２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）１５−ＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号：３３３（コード配列）および３３４（アミノ酸配列））。
抗原結合タンパク質融合体を、以下のように構築した：
ＦＧＦ２１（１−１６９）−（Ｇ４Ｓ）３−２Ｇ１０コード配列（配列番号：３１６）の構築
完全長野生型ヒトＦＧＦ２１（配列番号２）のアミノ酸１〜１９７、すなわちシグナル配列、およびＦＧＦ２１（配列番号３４２）の成熟型の残基１〜１６９をコードする核酸配列を２つのプライマーで増幅し、ＳａｌＩ制限部位およびＫｏｚａｋ配列を５’末端に付け、および（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３３６）の２つのコピー＋ＢａｍＨＩ制限部位を３’末端に付けた。
抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０成熟型（すなわち、シグナルペプチドを除いた）を２つのプライマーを用いて増幅した。第一プライマーをＢａｍＨＩ部位および（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３３６）の１つのコピーを５’末端に付け、第二プライマーをＮｏｔＩ制限部位を停止コドンの後に付加した。
ＦＧＦ２１含有ＰＣＲ断片をＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、同様に抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０のＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化した。両方の断片、およびＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化されたｐＴＴ５発現プラスミド断片をゲル精製し、得られた断片をライゲーションし、ｐＴＴ５−ヒトＦＧＦ２１（１〜１９７（すなわち、残基１〜１６９プラス２８残基のシグナル配列））−（Ｇ４Ｓ）３−抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０を得た。
ＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）６−２Ｇ１０（配列番号３２０）、ＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）９−２Ｇ１０（配列番号３２２）、ＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）１２−２Ｇ１０（配列番号３２４）、ＦＧＦ２１（１〜１６９）−（Ｇ４Ｓ）１５−２Ｇ１０（配列番号３２６）コード配列の構築
一過性発現クローンｐＴＴ５−ヒトＦＧＦ２１（１〜１９７）−（Ｇ４Ｓ）３−抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０を使用して、全ての後続のクローンを、より大きなリンカーを使用して作成した。（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３３６）および全クローンの内部の固有のＢａｍＨＩ制限部位を利用して、追加の（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３３６）をコードする２つのリン酸化されかつアニールされたオリゴマーを挿入した。これらのアニールされたオリゴマーは、ｐＴＴ５−ヒトＦＧＦ２１（１〜１９７）−（Ｇ４Ｓ）３−抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０クローンのＢａｍＨＩ直線化断片中へのライゲーションを可能にする、ＢａｍＨＩ適合性の末端を含有した。この工程において、アニールされたオリゴマーの一端にただ１つのＢａｍＨＩ制限部位が再生成され、ｐＴＴ５−ヒトＦＧＦ２１（１〜１９７）−（Ｇ４Ｓ）６−抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０を得た。同様に、ｐＴＴ５−ヒトＦＧＦ２１−（Ｇ４Ｓ）６−抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０クローンを使用して、（Ｇ４Ｓ）９バージョンを作成した。最終的に、（Ｇ４Ｓ）１２クローンから（Ｇ４Ｓ）１５クローンを作製した。
２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号３１８）コード配列の構築
完全長の抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０成熟型（＋シグナルペプチド）をコードするが、末端リジンを欠く核酸配列を、２つのプライマーを使用して増幅した。第一プライマーは、ＳａｌＩ制限部位およびＫｏｚａｋ配列を５’末端に付け、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３３６）の２つのコピー＋ＢａｍＨＩ制限部位を３’末端に付けた。
ＦＧＦ２１成熟型（配列番号３４３）のアミノ酸１〜１７０をコードする核酸配列を、２つのプライマーを使用して増幅した。第一プライマーは、ＢａｍＨＩ部位および（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３３６）の１つのコピーを５’末端に付け、第二プライマーは停止コドンの後にＮｏｔＩ制限部位を付加した。
ＰＣＲ断片を含有する抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０をＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、同様にＦＧＦ２１のＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化した。両断片ならびにＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化されたｐＴＴ５発現プラスミド断片をゲル精製し、得られた断片をライゲーションし、ｐＴＴ５−抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）３−ヒトＦＧＦ２１（１−１７０）を得た。
２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）６−ＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号３２８）、２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）９−ＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号３３０）、２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）１２−ＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号３３２）、２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）１５−ＦＧＦ２１（１〜１７０）（配列番号３３４）コード配列の構築
一過性発現クローンｐＴＴ５−抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）３−ヒトＦＧＦ２１（１〜１７０）を使用して、全ての後続のクローンを、より大きなリンカーを使用して作成した。（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３３６）および全クローンの内部の固有のＢａｍＨＩ制限部位を利用して、追加の（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３３６）をコードする２つのリン酸化されかつアニールされたオリゴマーを挿入した。これらのアニールされたオリゴマーは、ｐＴＴ５−抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）３−ヒトＦＧＦ２１（１〜１７０）の直線化断片中へのライゲーションを可能にするＢａｍＨＩ適合性の末端を含有した。この工程において、アニールされたオリゴマーの一端にただ１つのＢａｍＨＩ制限部位が再生成され、ｐＴＴ５−抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）６−ヒトＦＧＦ２１（１−１７０）を得た。同様に、ｐＴＴ５−抗β−Ｋｌｏｔｈｏ抗体２Ｇ１０−（Ｇ４Ｓ）６−ヒトＦＧＦ２１（１−１７０）クローンを使用して、（Ｇ４Ｓ）９バージョンを作製した。最終的に、（Ｇ４Ｓ）１２クローンから（Ｇ４Ｓ）１５クローンを作製した。
１７．Ｂ．
発現および精製
各融合体のタンパク質をコードするｃＤＮＡを生成し、Ｃ末端融合体に使用されたｄｅｓＫ ２Ｇ１０重鎖とともにｐＴＴ５発現ベクター中に挿入した。
一過的に形質移入された２９３細胞中に、構築物を発現させた。エプスタイン・バーウイルス核抗原−１（２９３−６Ｅ細胞）を安定に発現しているヒト胎児腎臓２９３細胞株を、カナダ国家研究会議（カナダ、モントリオール）から入手した。細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミン（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州、カールスバッド）、１．１％のＦ−６８プルロニック（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州、カールスバッド）および５０μｇ／μｌのジェネテシン（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）を付加したＦ１７培地（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州、カールスバッド）を使用し、血清を含まない懸濁培養液として維持した。細胞懸濁培養液を、エルレンマイヤー振盪フラスコ培養において維持した。培養フラスコを、加湿した５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃、６５ｒｐｍで振盪した。細胞を、月曜日と水曜日に３．０ｅ５生存可能な細胞／ｍｌまで希釈し、金曜日に１．５ｅ５生存可能な細胞／ｍｌまで希釈するという工程をルーチン的に３カ月間行い、その後新たに解凍した細胞のバイアルと取り換えた。
２５−ｋＤａ ｌｉｎｅａｒ ＰＥＩｍａｘ（ポリサイエンシズ社（Polysciences）；ペンシルバニア州、ワーリントン）のストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を水中に作成し、ＨＣｌで、溶解するまで、ｐＨ２．０に酸性化し、次いでＮａＯＨで中和し、濾過（０．２μｍ）により殺菌し、分注し、使用されるまで−２０℃で保管した。Ｔｒｙｐｔｏｎｅ Ｎ１をオルガノテクニーＳ．Ａ．（Organo Techni S.A.）（テクニーサイエンス社（TeknieScience）、カナダ、ケベック州）から入手した。ストック溶液（２０％、ｗ／ｖ）を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（インビトロジェン社（Invitrogen）；カリフォルニア州、カールスバッド）中に作成し、０．２μｍフィルターによる濾過により殺菌し、使用されるまで４℃で保管した。
形質移入のために、細胞を１．１ｅ６細胞／ｍｌまで希釈した。ＤＮＡおよびＰＥＩｍａｘの形質移入混合物を、新しい培地中、培養液体積の１０％で作製した。形質移入混合物は、培養液のｍｌあたり５００μｇのＤＮＡに、ＤＮＡのμｇあたり３μｇのＰＥＩｍａｘを添加したものから成り、それを１０分間インキュベートし、その後細胞培養液に添加した。培養物は通常、形質移入後６〜７日に回収した。
馴化培地を回収し、ｐＨ３．５でプロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ミリポワ社（Millipore）を使用して、融合体を精製した。溶出プールをｐＨ７．０前後まで滴定し、次いで緩衝液をＰＢＳ中へ交換した。
１７．Ｃ．
結合アッセイ
ＥＬＩＳＡフォーマットを使用して、ヒトおよびマウス両方のβ−Ｋｌｏｔｈｏに対する融合体の結合性についてアッセイした。図１６に示す通り、全ての融合体がヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏと結合することが観察され、図１７は、すべての融合体がマウスのβ−Ｋｌｏｔｈｏと結合することが観察されたことを示す。観察された結合性は、２Ｇ１０抗体成分に対する、ＦＧＦ２１成分の相対的な配向には依存しなかった。
１７．Ｄ．
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイ
次いで、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃを発現しているＡＭ１Ｄレポーター細胞を使用して、融合体をルシフェラーゼアッセイにおいて試験した。図１８は、すべての融合体が、レポーターアッセイにおいて活性であることを示す。さらに、図１８は、観察された活性はリンカーの長さと無関係であるが、融合体の２Ｇ１０抗体成分に対する、ＦＧＦ２１成分の相対的な配向が重要であることを示す。より具体的には、融合体の抗体成分が融合体のＮ末端に位置している融合体が、抗体成分が融合体全体のＣ末端に位置している融合体よりも、より高いレベルの活性を示すことが観察された。
次いで、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃを発現しているＡＭ１Ｄレポーター細胞を使用して、ルシフェラーゼアッセイにおいて融合体を試験した。図１９に示す通り、融合タンパク質を３ｎＭのＦＧＦ２１とともにインキュベートした際、いずれの融合体も検出可能なアンタゴニスト活性を示さなかった。さらに、図２０は、融合体がヒトα−Ｋｌｏｔｈｏと相互作用しなかったことを示し、融合体のβ−Ｋｌｏｔｈｏに対する特異性を裏付けている。また、β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦＲ１ｃを発現しているＡＭ１Ｄレポーター細胞を使用したルシフェラーゼアッセイにおいて、β−Ｋｌｏｔｈｏが存在しない場合、いかなる活性も検出されなかった。
１７．Ｅ．
結論
要約すると、本実施例１７に示された実験の結果は、生成された抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体が、（ａ）ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合して、ＦＧＦ２１を介する活性を誘発し；および（ｂ）ヒトβ−Ｋｌｏｔｈｏが存在しない場合、ＦＧＦ２１を介する活性を誘発しないことを示す。
開示される融合タンパク質は、天然ＦＧＦ２１活性の利点を併せ持つと同時に、本来なら分解によってＦＧＦ２１の不活性化をもたらすＣ末端のタンパク分解感受性領域を除去する。β−Ｋｌｏｔｈｏ結合抗体は、ＦＧＦ２１単独よりもより高い親和性を有する、標的特異的な結合を提供した。とりわけ、ＦＧＦ２１のβ−Ｋｌｏｔｈｏに対する結合親和性は、１０〜２０ｎＭの範囲であるが、β−Ｋｌｏｔｈｏ特異的抗体に対する結合親和性は、一般的にｎＭ以下またはピコモルの範囲である。この高度に強化された親和性はｉｎ ｖｉｖｏ標的化の効率を改善すると期待される。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏで観察された、外因的に投与されたＦＧＦ２１の迅速な消失に比べ（ｔ１／２＜３０分）、これらの抗体ベースの融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける典型的な抗体さながらの、何日または何週もの長期にわたる半減期を示すことが期待される。これらの有益な属性を兼ね備えていることが、開示される融合タンパク質を、治療的役割に比類なく適したものする。
本明細書に引用される各参考文献は、それが教示するすべてのために、およびすべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態により、その範囲が限定されるものではなく、それらは本開示の個別の態様の例示を意図しており、機能的に等価な方法および構成要素は、本開示の態様を構成する。実際に、本明細書に示され記載されたものに加えて、本開示の様々な改変が、前述の記載および添付の図面から、当業者には明らかとなるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

Claims (51)

  1. （ａ）以下のうち１つまたは複数を含む軽鎖ＣＤＲ３：
    （i）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１のＣＤＲ３配列と、２つ以下のアミノ酸の付加、置換、欠失およびその組み合わせにより異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；
    （ii）ＭＱＡＸ１ＥＦＰＷＴ（配列番号１７４）；
    （iii）ＧＴＷＤＳＳＬＳＸ２ＶＸ３（配列番号１７５）；
    （iv）ＱＱＹＤＮＬＦＴ（配列番号１２２）；
    （v）ＱＱＹＧＳＡＰＬＴ（配列番号１２３）；
    （vi）ＶＬＹＭＧＳＧＩＷＶ（配列番号１２４）；
    （vii）ＥＴＷＤＳＳＬＳＡＧＶ（配列番号１２７）；
    ここで、
    Ｘ１はＬまたはＩであり；
    Ｘ２はＶまたはＡであり；および
    Ｘ３はＶまたはＡである；
    （ｂ）以下のうちの１つまたは複数を含む重鎖ＣＤＲ３：
    （i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のＣＤＲ３配列と、１つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびまたはその組み合わせにより異なる重鎖ＣＤＲ３配列；
    （ii）ＧＷＦＤＸ６（配列番号１７８）；
    （iii）ＧＴＳＦＤＹ（配列番号９９）；
    （iv）ＹＧＧＳＦＤＹ（配列番号１００）；
    （v）ＭＶＹＶＬＤＹ（配列番号１０１）；
    （vi）ＶＡＧＰＦＤＦ（配列番号１０２）；
    ここで、
    Ｘ６はＹ、ＩまたはＦである；ならびに
    （ｃ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ３配列および（ｂ）の重鎖ＣＤＲ３配列；
    のうちの１つまたは複数を含む単離された抗原結合タンパク質であって、β−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する、単離された抗原結合タンパク質。
  2. 抗原結合タンパク質が、
    （ａ）以下のうちの１つまたは複数を含む、軽鎖ＣＤＲ１：
    （i）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１のＣＤＲ１配列と２つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；
    （ii）ＲＳＳＱＳＬＶＸ２２ＹＸ２３ＤＧＮＴＹＬＳ（配列番号１７７）；
    （iii）ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号１０７）；
    （vi）ＱＡＳＱＤＩＮＮＹＬＮ（配列番号１０８）；
    （v）ＲＡＳＱＳＶＳＧＮＹＬＡ（配列番号１０９）；
    （vi）ＧＶＳＳＧＳＶＳＴＲＹＹＰＳ（配列番号１１０）；
    ここで、
    Ｘ２２はＨであるかまたは存在せず；および
    Ｘ２３はＳであるかまたは存在しない；
    （ｂ）以下のうちの１つまたは複数を含む軽鎖ＣＤＲ２：
    （i）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１のＣＤＲ２配列と、２つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；
    （ii）ＫISＮＲＦＳ（配列番号１１２）；
    （iii）ＤＮＮＸ４ＲＰＸ５（配列番号１７６）；
    （iv）ＤＴＳＮＬＥＴ（配列番号１１４）；
    （v）ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１１５）；
    （vi）ＳＴＮＴＲＳＳ（配列番号１１６）；
    ここで、
    Ｘ４はＫ、ＮまたはＲであり；および
    Ｘ５はＳであるかまたは存在しない；ならびに
    （ｃ）以下のうち１つまたは複数を含む重鎖ＣＤＲ１：
    （i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のＣＤＲ１配列と、３つ以下のアミノ酸付加、置換、欠失、およびその組み合わせにより異なる重鎖ＣＤＲ１配列；
    （ii）Ｘ１９ＹＸ２０ＭＸ２１、
    ここで、
    Ｘ１９はＡ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＩであり；
    Ｘ２０はＹ、ＧまたはＡであり；および
    Ｘ２１はＨまたはＳである；
    （ｄ）以下のうち１つまたは複数を含む重鎖ＣＤＲ２：
    （i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のＣＤＲ２配列と、５つ以下のアミノ酸付加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；
    （ii）ＷＩＮＰＸ７ＳＧＧＴＮＳＡＱＫＦＱＧ（配列番号１７９）；
    （iii）ＶＩＸ８Ｘ９ＤＧＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８０）；
    （iv）Ｘ１３ISＧＸ１４ＧＸ１５Ｘ１６ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８１）；
    （v）ＶＩＸ１７ＹＤＧＲＮＫＹＸ１８ＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８２）；
    ここで、
    Ｘ７はＮまたはＹであり；
    Ｘ８はＷまたはＧであり；
    Ｘ９はＦまたはＹであり；
    Ｘ１０はＲまたはＳであり；
    Ｘ１１はＮまたはＹであり；
    Ｘ１２はＱまたはＫであり；
    Ｘ１３はＡまたはＤであり；
    Ｘ１４はＳまたはＲであり；
    Ｘ１５はＶまたはＧであり；
    Ｘ１６はＳまたはＹであり；
    Ｘ１７はＷまたはＳであり；および
    Ｘ１８はＹまたはＨである；
    （ｅ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１および（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２；
    （ｆ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１および（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１；
    （ｇ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；
    （ｈ）（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ１および（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１；
    （i）（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；
    （ｊ）（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；
    （ｋ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１、（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２、および（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１；
    （ｌ）（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２、（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１、および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；
    （ｍ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１、（ｃ）の重鎖ＣＤＲ１、および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；ならびに
    （ｎ）（ａ）の軽鎖ＣＤＲ１、（ｂ）の軽鎖ＣＤＲ２、（ｃ）の重鎖ＣＤＲ２、および（ｄ）の重鎖ＣＤＲ２；
    のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１の抗原結合タンパク質であって、β−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する、抗原結合タンパク質。
  3. 抗原結合タンパク質が、
    （ａ）以下を含む軽鎖可変領域：
    （i）配列番号１０６〜１１１のうちの１つまたは複数を含む軽鎖ＣＤＲ１；
    （ii）配列番号：１１２〜１１９のうちの１つまたは複数を含む軽鎖ＣＤＲ２；
    （iii）配列番号１２０〜１２７のうちの１つまたは複数を含む軽鎖ＣＤＲ３；および
    （ｂ）以下を含む重鎖可変領域：
    （i）配列番号８３〜８８のうちの１つまたは複数を含む重鎖ＣＤＲ１；
    （ii）配列番号８９〜９７のうちの１つまたは複数を含む重鎖ＣＤＲ２；および
    （iii）配列番号９８〜１０５のうちの１つまたは複数を含む重鎖ＣＤＲ３；または
    （ｃ）（ａ）の軽鎖可変領域および（ｂ）の重鎖可変領域；
    のうちの１つまたは複数を含む、請求項１の抗原結合タンパク質であって、β−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する、抗原結合タンパク質。
  4. 抗原結合タンパク質が、
    （ａ）以下のうちの１つまたは複数を含む軽鎖可変領域：
    （i）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１のうちの１つまたは複数を含む、軽鎖可変領域配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸；
    （ii）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１の軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
    （ｂ）以下のうちの１つまたは複数を含む重鎖可変領域：
    （i）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１の重鎖可変領域配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列；
    （ii）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１の重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；ならびに
    （ｃ）（ａ）の軽鎖可変領域および（ｂ）の重鎖可変領域；
    のうちの１つまたは複数を含む、請求項１の抗原結合タンパク質であって、β−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する、抗原結合タンパク質。
  5. 抗原結合タンパク質が、
    （ａ）配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１のうちの１つまたは複数を含む、軽鎖可変領域配列；
    （ｂ）配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１のうちの１つまたは複数を含む、重鎖可変領域配列；ならびに
    （ｃ）（ａ）の軽鎖可変領域および（ｂ）の重鎖可変領域；
    のうちの１つまたは複数を含む、請求項４の単離された抗原結合タンパク質であって、β−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する、抗原結合タンパク質。
  6. 軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０およびＬ１１Ｈ１１から成る組み合わせの群から選択され、抗原結合タンパク質がβ−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する、請求項５の抗原結合タンパク質。
  7. 抗原結合タンパク質が、
    （ａ）配列番号１３の軽鎖定常配列；
    （ｂ）配列番号１５の軽鎖定常配列；
    （ｃ）配列番号９の重鎖定常配列；ならびに
    （ｄ）配列番号１３または配列番号１５の軽鎖定常配列および配列番号９の重鎖定常配列；
    を含む、請求項６の抗原結合タンパク質。
  8. 抗原結合タンパク質が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合抗体断片、単鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体（triabody）、四重特異性抗体（tetrabody）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ｆａ’）ｘ断片、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、またはヒンジ領域に少なくとも１つの変異を有するＩｇＧ４抗体を含む、請求項１の抗原結合タンパク質。
  9. β−Ｋｌｏｔｈｏと結合する際、
    （ａ）参照抗体と実質的に同じＫｄでβ−Ｋｌｏｔｈｏと結合し；
    （ｂ）ＥＬＫ−ルシフェラーゼレポーターアッセイで測定して、配列番号２の成熟型を含む野生型ＦＧＦ２１標準物質により誘発されるシグナル伝達の１０％以上のＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘発し；
    （ｃ）以下から成る群から選択されるアッセイにおいて、１０ｎＭ以下のＥＣ５０のＦＧＦ２１様シグナル伝達を示し：
    （i）ＦＧＦＲ１ｃ／β−Ｋｌｏｔｈｏを介する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え細胞ベースのアッセイ；
    （ｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え型ＦＧＦＲ１ｃ受容体媒介レポーターアッセイにおいて、β−Ｋｌｏｔｈｏが存在する場合、ＦＧＦＲ１ｃ上で、１０ｎＭ未満のＥＣ５０のアゴニスト活性を示し；および
    （ｅ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え型ＦＧＦＲ１ｃ受容体媒介レポーターアッセイにおいて、β−Ｋｌｏｔｈｏが存在しない場合、ＦＧＦＲ１ｃ上で、１μＭ超のＥＣ５０のアゴニスト活性を示し；ならびに
    （ｆ）β−Ｋｌｏｔｈｏとの結合に対して参照抗体と競合する、
    請求項１の抗原結合タンパク質であって、前記参照抗体が、軽鎖および重鎖可変領域配列の以下の組み合わせ：Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０およびＬ１１Ｈ１１のうちの１つまたは複数を含む、抗原結合タンパク質。
  10. β−Ｋｌｏｔｈｏと結合する際、
    （ａ）動物モデルにおいて血糖を低下させ；
    （ｂ）動物モデルにおいて血清脂質値を低下させ；または
    （ｃ）（ａ）かつ（ｂ）である、
    請求項９の抗原結合タンパク質。
  11. 請求項１または９の抗原結合タンパク質を、その薬剤的に許容できる担体との混合物中に含む医薬組成物。
  12. 請求項４の抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域、重鎖可変領域、または両方をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  13. 配列が、配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１、配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１、または両方から選ばれる、請求項１２の単離された核酸。
  14. 請求項１３の核酸を含む発現ベクター。
  15. 請求項１３の核酸を含む単離された細胞。
  16. 核酸を含む発現ベクターを含む、請求項１５の単離された細胞。
  17. β−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する抗原結合タンパク質の製造方法であって、請求項１６の宿主細胞を、前記宿主細胞が前記抗原結合タンパク質を発現することを可能にする条件下でインキュベートすることを含む、方法。
  18. 以下のうちの１つまたは複数を含むポリペプチド：ＴＲＬＷＫＹＷＶ（配列番号１８４）；ＲＲＬＹＩＦＷＥ（配列番号１８５）；ＹＫＡＷＧＹＹＶ（配列番号１８６）；ＹＱＡＷＧＹＹＶ（配列番号１８７）；ＹＱＡＷＧＹＬＶ（配列番号１８８）；ＹＱＡＷＧＹＦＶ（配列番号１８９）；ＦＴＷＶＦＷＮＶ（配列番号１９０）；ＹＱＶＷＧＹＦＶ（配列番号１９１）；ＹＫＷＬＫＷＮＬ（配列番号１９２）；ＲＲＬＹＩＦＥＷ（配列番号１９３）；ＷＡＥＲＧＧ（配列番号１９４）；ＧＧＷＡＶＧＲＩ（配列番号１９５）；ＹＫＹＬＶＦＷＶ（配列番号１９６）；ＹＫＹＬＳＹＷＶ（配列番号１９７）；ＹＫＴＡＷＹＷＫ（配列番号１９８）；ＹＶＦＨＫＷＷＶ（配列番号１９９）；ＹＶＦＹＬＷＷＫ（配列番号２００）；ＹＲＷＬＨＷＨＶ（配列番号２０１）；ＹＫＦＬＦＷＨＡ（配列番号２０２）；ＲＲＱＷＧＦＷＶ（配列番号２０３）；ＹＳＡＷＳＦＷＶ（配列番号２０４）；ＬＡＲＷＧＦＷＶ（配列番号２０５）；ＹＤＡＷＧＹＷＶ（配列番号２０６）；ＷＲＫＹＹＨＦＷＶＳ（配列番号２０７）；ＫＲＬＹＧＬＦＷＹＤ（配列番号２０８）；ＫＫＨＷＳＳＬＦＦＥ（配列番号２０９）；ＫＡＷＰＹＳＷＥＡＶ（配列番号２１０）；ＥＷＹＣＧＶＬＦＮＣＱＱ（配列番号２１１）；ＨＦＧＣＧＶＩＦＮＣＶＳＤ（配列番号２１２）；ＷＥＬＣＡＳＧＹＧＷＣＹＬＨ（配列番号２１３）；ＡＰＳＣＫＳＹＩＧＦＧＬＹＨＣＷＤＧ（配列番号２１４）；およびＨＦＫＣＧＭＧＬＦＥＣＡＤＰ（配列番号２１５）。
  19. 重鎖が、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数に特異的に結合するペプチドをさらに含む、請求項１から１０のいずれかの抗原結合タンパク質。
  20. ペプチドが以下のうちの１つまたは複数を含む、請求項１９に記載の抗原結合タンパク質重鎖：ＴＲＬＷＫＹＷＶ（配列番号１８４）；ＲＲＬＹＩＦＷＥ（配列番号１８５）；ＹＫＡＷＧＹＹＶ（配列番号１８６）；ＹＱＡＷＧＹＹＶ（配列番号１８７）；ＹＱＡＷＧＹＬＶ（配列番号１８８）；ＹＱＡＷＧＹＦＶ（配列番号１８９）；ＦＴＷＶＦＷＮＶ（配列番号１９０）；ＹＱＶＷＧＹＦＶ（配列番号１９１）；ＹＫＷＬＫＷＮＬ（配列番号１９２）；ＲＲＬＹＩＦＥＷ（配列番号１９３）；ＷＡＥＲＧＧ（配列番号１９４）；ＧＧＷＡＶＧＲＩ（配列番号１９５）；ＹＫＹＬＶＦＷＶ（配列番号１９６）；ＹＫＹＬＳＹＷＶ（配列番号１９７）；ＹＫＴＡＷＹＷＫ（配列番号１９８）；ＹＶＦＨＫＷＷＶ（配列番号１９９）；ＹＶＦＹＬＷＷＫ（配列番号２００）；ＹＲＷＬＨＷＨＶ（配列番号２０１）；ＹＫＦＬＦＷＨＡ（配列番号２０２）；ＲＲＱＷＧＦＷＶ（配列番号２０３）；ＹＳＡＷＳＦＷＶ（配列番号２０４）；ＬＡＲＷＧＦＷＶ（配列番号２０５）；ＹＤＡＷＧＹＷＶ（配列番号２０６）；ＷＲＫＹＹＨＦＷＶＳ（配列番号２０７）；ＫＲＬＹＧＬＦＷＹＤ（配列番号２０８）；ＫＫＨＷＳＳＬＦＦＥ（配列番号２０９）；ＫＡＷＰＹＳＷＥＡＶ（配列番号２１０）；ＥＷＹＣＧＶＬＦＮＣＱＱ（配列番号２１１）；ＨＦＧＣＧＶＩＦＮＣＶＳＤ（配列番号２１２）；ＷＥＬＣＡＳＧＹＧＷＣＹＬＨ（配列番号２１３）；ＡＰＳＣＫＳＹＩＧＦＧＬＹＨＣＷＤＧ（配列番号２１４）；およびＨＦＫＣＧＭＧＬＦＥＣＡＤＰ（配列番号２１５）。
  21. 重鎖がＣＨ２ループ、ＣＨ３ループ、またはＣＨ２およびＣＨ３ループの両方を含む、請求項２０の抗原結合タンパク質重鎖。
  22. 重鎖がＣＨ３ループを含む、請求項２１の重鎖。
  23. ＣＨ３ループがペプチドを含む、請求項２２の重鎖。
  24. 重鎖がＣＨ２ループを含む、請求項２１の重鎖。
  25. ＣＨ２ループがペプチドを含む、請求項２４の重鎖。
  26. 請求項２３または２５の重鎖を含む、抗原結合タンパク質。
  27. 請求項１９の抗原結合タンパク質を、その薬剤的に許容できる担体との混合物中に含む、医薬組成物。
  28. 請求項１９の抗原結合タンパク質の、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、または両方をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  29. 配列が配列番号１７〜２７のＬ１〜Ｌ１１、配列番号２８〜３８のＨ１〜Ｈ１１、または両方から選ばれる、請求項２８の単離された核酸。
  30. 請求項２９の核酸を含む発現ベクター。
  31. 請求項２９の核酸を含む単離された細胞。
  32. 核酸を含む発現ベクターを含む、請求項３１の単離された細胞。
  33. β−Ｋｌｏｔｈｏと特異的に結合する抗原結合タンパク質の製造方法であって、請求項３２の宿主細胞を、前記宿主細胞が前記抗原結合タンパク質を発現することを可能にする条件下でインキュベートすることを含む、方法。
  34. （ａ）抗原結合成分；および
    （ｂ）ＦＧＦ２１成分；
    を含む、抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体。
  35. 抗原結合成分が請求項１の抗原結合タンパク質を含む、請求項３４の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体。
  36. ＦＧＦ２１成分が、配列番号３４１の少なくとも２５個の連続した残基を含む、請求項３４の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体。
  37. ＦＧＦ２１成分が（ａ）配列番号３４２または（ｂ）配列番号３４３のうちの１つを含む、請求項３６の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体。
  38. リンカーをさらに含む、請求項３４の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体。
  39. （ａ）抗原結合成分が配列番号１８および２９を含み；ならびに
    （ｂ）ＦＧＦ２１成分が
    （i）配列番号３４２；および
    （ii）配列番号３４３；のうちの１つを含む、
    請求項３４の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体。
  40. 抗原結合成分が、（Ｇ４Ｓ）３、（配列番号３３６）（Ｇ４Ｓ）６（配列番号３３７）、（Ｇ４Ｓ）９（配列番号３３８）、（Ｇ４Ｓ）１２（配列番号３３９）および（Ｇ４Ｓ）１５（配列番号３４０）から成る群から選択されるリンカーによって、ＦＧＦ２１成分に連結されている、請求項３９の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体。
  41. ＦＧＦ２１成分が抗原結合成分の重鎖に連結されている、請求項３９の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体。
  42. 重鎖が配列番号３１６、３２０、３２２、３２４、３２６、３１８、３２８、３３０、３３２および３３４のうちの１つまたは複数を含む、請求項４１の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体。
  43. ＦＧＦ２１成分が抗原結合成分の軽鎖に連結されている、請求項３９の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体。
  44. β−Ｋｌｏｔｈｏ、またはβ−ＫｌｏｔｈｏならびにＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４のうちの１つまたは複数に結合した際、
    （ａ）動物モデルにおいて血糖を低下させ；
    （ｂ）動物モデルにおいて血清脂質値を低下させ；および
    （ｃ）（ａ）かつ（ｂ）である、請求項３４に記載の抗原結合タンパク質。
  45. 請求項３４の抗原結合成分の軽鎖、重鎖または両方をコードする単離された核酸であって、
    （ａ） 配列番号１７〜２７のＬ１−Ｌ１１；
    （ｂ） 配列番号２８〜３８のＨ１−Ｈ１１；または
    （ｃ） 配列番号３１６、３２０、３２２、３２４、３２６、３１８、３２８、３３０、３３２または３３４；
    を含む、核酸。
  46. 請求項４５の核酸を含む、発現ベクター。
  47. 請求項４６の核酸を含む、単離された細胞。
  48. 核酸を含む発現ベクターを含む、請求項４７の単離された細胞。
  49. 請求項３４に記載の抗原結合タンパク質−ＦＧＦ２１融合体を含み、薬剤的に許容できる担体をさらに含む、医薬組成物。
  50. 状態の予防または治療を、そのような治療を必要としている対象において行う方法であって、治療的有効量の請求項４９の組成物を前記対象に投与することを含み、前記状態が血糖を低下させることにより治療可能である、方法。
  51. 状態が２型糖尿病、肥満症、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎、心血管疾患、およびメタボリックシンドロームから選ばれる、請求項４９に記載の方法。
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