JPH11506722A - 細胞に核酸を送達するための核酸運搬体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 核酸を細胞に送達するための核酸運搬体に関する。核酸運搬体は、結合複合体を含む。結合複合体は、核酸に非共有結合した結合分子を含む。結合複合体は、表面リガンド、核リガンドまたは溶解剤に対合した結合分子も含む。これらは、スペーサーにより結合分子に対合されてよい。さらに、運搬体は上記結合複合体または結合分子に化合して核酸を含んでよい。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞に核酸を送達するための核酸運搬体発明の属する分野 本発明は、ナショナルインスティチュートオブヘルスにより付与された補助金 番号ＵＳ−ＰＨ５ Ｐ０１ ＨＬ５０４２２により米国政府からの助成により一 部支持された。発明の背景 本発明は、細胞へ核酸を送達するための運搬系を用いる遺伝子治療に関する。 組換えレトロウイルスベクターは生きた動物の細胞への遺伝子の送達のために 用いられてきた。Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．，６２：１９１−２１７（１９９３）。レトロウイルスベクターは、宿主 染色体ＤＮＡに移した遺伝子を永久に組み込む。レトロウイルスベクターに加え て、他のウイルスも遺伝子治療に用いられてきた。アデノウイルスは、上皮細胞 由来の組織へ遺伝子を移す手段として開発された。Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒ ｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，１：２４１ −２５６（１９９０）；Ｇｉｌａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ，２６７：６ ０−６２（１９９０）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５２：４３４１−４３４６（１９９１）；Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２：１９１−１９７（１９９３）。組換え アデノウイルスベクターは、非増殖細胞を形質導入することができるレトロウイ ルスを上回る利点、並びに、精製された高力価のウイルスを生成する能力を有す る。 ウイルス仲介遺伝子送達に加えて、より最近のＤＮＡ送達方法はリセプター仲 介飲食作用であった。飲食作用は、小さい飲食小胞の形態でプラズマ膜のセグメ ントを真核細胞が連続して摂取することによる過程である。Ａｌｂｅｒｔｓ ｅ ｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ ｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３。その中に溶解した細胞外流体およ び物質は小胞中にトラップされることになり、細胞に取り込まれる。全流体相の 飲食作用のこの過程は、細胞外流体に導入されたトレーサー例えば酵素パーオキ シダーゼを用いることにより、可視化および定量できる。構成的飲食作用の速度 は細胞種により異なる。 飲食作用小胞はさまざまな大きさおよび形態をとり、各々のその他および／ま たは他の細胞内小胞と融合することにより通常は大きくなる。Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂ ｌｏｔｅｃｈ．，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８ ８）。ほとんどの細胞において、大多数の飲食小胞は最終的には初期リポソーム と呼ばれる小胞と融合して、細胞内消化の特定部位である二次リポソームを形成 する。リポソームは酸性であり、小胞のマクロ分子含有物を消化するさまざまな 種類の消化酵素を含む。Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒ ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４６：６６９−７２２（１９７７）＋Ｓｉｍｉａｎｅ ｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６４：５８６−６０７（１ ９７５）。 飲食作用の小胞の多くはクラスリン（ｃｌａｔｈｒｉｎ）コートされており、 コートされたピットと称されるプラズマ膜のコート領域の陥入により形成される 。コートされたピットおよび小胞は細胞外流体から特定のマクロ分子を取り上げ る特定の経路を提供する。この過程は、リセプター仲介飲食作用と呼ばれる。Ｇ ｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７９：６７９−６８５（１ ９７９）；Ｐｅａｒｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ，５０：８５−１０１（１９８１）；Ｐｏｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４３：２３９−２５０（１９８１）。特定の細胞表 面リセプターに結合するマクロ分子はコートされたピットにより内在化する。Ｇ ｏｌｄｓｔｅｉｎ，前出。リセプター仲介飲食作用とは、大量の特定リガンドを 、相当する大量の細胞外流体を用いること無しに、細胞が摂取することを可能に する選択機構である。Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、前出。 そのようなマクロ分子のひとつは、低密度リポ蛋白質である（”ＬＤＬ”）。 莫大な研究がＬＤＬ並びにリセプター仲介飲食作用経路に関して実施された。Ｌ ＤＬに加えて、他の多くの細胞医表面リセプターがコートされたピットおよびリ セプター仲介飲食作用に関連することが発見された。Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４３：２３９−２５０（１９８１） 。例えば、細胞表面リセプターに結合して、コートされたピッチにより細胞内に 侵入するホルモンインスリンについて分析した研究がある。Ｓｔｙｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｇｅｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ ｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）。さらに、幾つかの細胞表面リセプターが リガンド結合後にのみコートされたピットに対合することを明らかにした。Ｐａ ｓｔａｎ，前出。 リセプター仲介飲食作用を利用することにより、インビトロにおいてＨｅｐＧ ２細胞に対しておよびインビボにおいて肝臓細胞に対してＤＮＡを標的とする際 に、アシアログリコプロテインリセプターが使用されてきた。Ｗｕ ｅｔ ａｌ ．，Ｂｉｏ．，２７：８８７−８９２（１９８８）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２０−１４６２４（１９８８）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６９８５−１６９８７（ １９８９）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６．１４３ ３８−１４３４２（１９９１）。これらの研究は、水溶性カルボジイミド、１− エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドまたは３’（２ ’ピリジル−ジチオ）プロピオン酸ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルと共に ポリリジンに共有結合させたアシアロオロソムコイドを用いた。上記研究におけ るポリリジンは、イオン性相互作用によりＤＮＡに結合させた。 他の研究は、インビトロにおいてＤＮＡを細胞に送達するためにトランスフェ リンおよびトランスフェリンリセプターを利用した。Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８７：３４１０−３４１４（１９９０）。これらの研究 は、ポリリジンにトランスフェリンを共有カップリングさせることにより、トラ ンスフェリンを修飾した。ＤＮＡの送達は、トランスフェリンリセプターを通し て細胞に生じた。そのような分析はインビトロにおいて実施された。Ｃｏｔｔｅ ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８７：４０３３−４０３７（１９９０）；Ｚ ｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８７：３６５５−３６５９（１９９ ０）。 ＤＮＡに加え、他の分子もリセプター仲介系により送達することができる。Ｌ ｅａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８８：５５７２−５５７６（１ ９９１）；Ｌｅａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７： ２４９６６−２４９７１（１９９２）。特に、これらの研究は、コートされたピ ットから排除されて小胞により細胞内および外で循環する葉酸塩リセプター、固 定されたグリコシルホスファチジル蛋白質を包含した。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４１０−４１１（１９９２）。この取り込 み機構はポトサイトーシスと呼ばれる。葉酸塩配合酵素はこのリセプター系を通 して細胞に送達されて少なくとも６時間活性を維持した。Ｌｅａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８８：５５７２−５５７６（１９９１）。葉酸塩リセ プターは組織の分配を制限して多くの組織由来の幾つかの悪性腫瘍細胞系におい て過剰発現される。Ｗｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５２：３３９６−３４０１（１９９２）；Ｗｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａ ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：６７０８−６７１１（１９９２）；Ｃａｍｐｂｅｌ ｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１：５３２９−５３３８（１９９１）；Ｃｏｎ ｅｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１：６１２５−６１２３（１９９１）。他の 研究も、細胞への蛋白質送達のためにビオチン化により蛋白質へ配合したビオチ ンまたは葉酸塩を使用した。Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１０８，９ ２１号。 ＤＮＡまたはマクロ分子が送達のために細胞を標的としたなら、ＤＮＡまたは マクロ分子はエンドームから放出されて治療剤として機能せねばならない。もし そうでないならば、ＤＮＡおよびマクロ分子の送達はリソソーム分解により妨げ られるであろう。研究は、エンドーム／リソソーム分解過程を分析した。ウイル スや他の微生物のように、リセプター仲介飲食作用またはリセプター：リガンド 系を通して内在化された生物は機能するためにリソソーム分解を逃れることが分 かってきた。幾つかのウイルスの侵入機構は、広範囲に研究された。幾つかのウ イルスに関して、膜外蛋白質がエンドームの逃げに重要であることを証明した。 Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，３６：１０７−１ ５１（１９８９）。他の研究はリソソーム分解に焦点を合わせた。これらの研究 は、エンドーム／リソソーム機能を変動させる物質を用いた。Ｍｅｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５５：６６３−７００（ １９８６）。これらの物質はインビトロにおいてのみ使用された。 さらに、完全なウイルス外殻が十分なエンドーム溶解に必要であることを研究 は示す。Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，３６：１ ０７−１５１（１９８９）。研究は、アデノウイルスがトランスフェリン−ポリ リジン仲介遺伝子送達を高めることも証明した。Ｃｕｒｕｅｌ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ ．，８８：８８５０−８８５４（１９９１）。これらの研究は、ＤＮＡ複合体に 取り込まれた複製欠損アデノウイルスの使用によりインビトロにおいて遺伝子発 現を改良した。アデノウイルスの効果は、含有物がリソソームに運搬されるかま たは細胞表面にリサイクルされうるかのいずれかの前に、エンドームを溶解する ことである。ウイルスにより誘導される細胞死を減じるため、アデノウイルスは リジンのε−ＮＨ₂とグルタミン酸のγ−カルボキシルを通して、酵素によりポ リリジンにカップリングされた。Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ ．，８９：６０９９−０３（１９９２）。ポリリジンとアデノウイルスの酸性残 基との化学カップリングも同じ目的を達成する。 アデノウイルスに加えて、他のウイルス、例えばインフルエンザからのペプチ ド配列を使用することにより、エンドームの破壊を達成した。Ｗａｇｎｅｒ ｅ ｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８９：７９３４−７９３８（１９９２）。イン フルエンザのヘマグルチニンからの溶解ペプチドを使用することにより、トラン スフェリン−ポリリジン−ＤＮＡ複合体により遺伝子運搬を増大させた。このウ イルス様遺伝子運搬小胞はインビトロで機能したが、ルシフェラーゼリポーター 構築物の送達および発現に基づくと、アデノウイルスよりも１００倍未満の効果 であったことが示された。 ヒト免疫不全ウイルス（”ＨＩＶ”）のように、他のウイルスも溶解の目的で 使用した。米国特許第５，１４９，７８２号（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９ ９２年９月２２日発行）。ＨＩＶからのペプチドセグメントは核酸を送達するた めの膜混合剤として有用であることが暗示された。これらのペプチドはフソジェ ニックであり、関連した核酸または分子配合体が細胞プラズマ膜に挿入されるの を可能にする。これらのペプチドは１０−３０アミノ酸の長さであり、疎水性で ある。用いられた融合蛋白質は反復Ｐｈｅ−Ｘ−Ｇｌｙ配列を含むが、式中、Ｘ は非極性アミノ酸残基である。 多くのバクテリアもリセプター仲介飲食作用により内在化されて、毒素の生成 によりエンドソームから遊離される。これらの毒素はエンドソームの膜を溶解す る。Ｍｏｕｌｄｅｒ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，４９：２９８−３３７（ １９８５）。リステリアの単球遺伝子は、リステリオリジンと呼ばれる膜溶解毒 素を生成する。Ｃｏｓｓａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．， ６：４６３−４７４（１９８９）；Ｔｉｌｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，１０９：１５９７−１６０８（１９８９）。研究は、他のコファク ターはリステリアの単球遺伝子のエンドソームの逃げに必要ないことを示した。 Ｂｉｅｌｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４５：１７５−１７６（１ ９９０）。 リステリオリジン毒素は、コレステロールを含む膜内で孔を形成する。これら の孔はイムノグロブリンのようなマクロ分子が通過するのに十分大きい。Ａｈｎ ｅｒｔ−Ｈｉｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３１： ６３−９０（１９８９）；Ｇｅｏｆｆｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ．，１７２：７３０１−７３０５（１９９０）。 さらに、莫大な研究が核酸を含む細胞内過程におけるポリアミンの役割を分析 した。特に、ポリアミンは転写および翻訳の両方を高めて、ｔＲＮＡ構造および 活性を維持するのに関与することを研究は示した。Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７１：１５−４２（１９７０）；Ｃｏ ｈｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２７４：２０９−２。さらに、ポリアミンはパッケージ ング過程のために細胞内で利用されるかもしれない核酸を濃縮することが示され た。Ｇｏｓｕｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２１．３１１− ３２６（１９７８）；Ｃｈａｔｔｏｒａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ ｌ．，１２１：３２７−３３７（１９７８）；Ｒｉｅｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂ ｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１７：７８５−７９４（１９７０）。さらなる研究は、 リボソーム安定化およびファージ頭部へのＤＮＡのパッケージングにポリアミン が活性を有することを見いだした。Ｓｔｅｖｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１７１．８２７−８３７（１９７０）；Ｗｉｌｓｏ ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：２１９２−２１９６（１ ９７９）。 上記研究は、ポリアミン、例えば巨大ポリ−Ｌ−リジン分子の核酸との相互作 用における静電成分を調査した。これらポリ−Ｌ−リジンの平均鎖長は５０−２ ００の範囲であった。ポリ−Ｌ−リジンの使用は、しかしながら、ｎＭ濃度にお いて細胞に毒性であり、それによりそれらの適応性を制限することが示された。 そのような研究は、スペルミン、スペルミジンおよびプトレシンを用いても実施 された。Ｂｒａｕｎｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２１：１ ３０１−１３１４（１９８２）。発明の概要 出願人は、細胞への高められた核酸送達のための核酸運搬体系の構築が有用で あることを確かめた。これらの特定の運搬体系は、合成の溶解および核酸結合分 子を用いることにより、細胞への核酸の送達を高める。特に、特定の溶解剤がエ ンドソームを破壊するのに有用であり、それにより核酸がリソソーム分解を回避 するのが可能になる。特定の結合分子は細胞に安定化された濃縮核酸を送達する のに有用である。さらに、これらの特定の結合分子は、細胞の核に安定化濃縮核 酸を送達するのに有用である。これらの運搬体を用いることにより、適当な標的 細胞への特定の核酸の送達を高めて、疾患を治療することが可能になる。これら の運搬体は、形質転換細胞を創製すること並びに動物モデルにおいてヒト疾患を 評価するためにトランスジェニック動物を創製するためにも使用することができ る。 本発明は、細胞への核酸送達におけるエンドソーム／リソソームの分解の問題 を回避するために溶解剤を利用する。特に、本発明は、エンドソームから細胞内 部へ核酸を放出することができる特定の溶解剤を含む核酸結合複合体を伴う核酸 運搬体系の使用を特徴とする。核酸は、エンドソーム／リソソーム分解無しに効 果的に放出することができる。細胞内部へ放出されたなら、結合複合体は核酸の 核への標的化を助ける。 本発明は、ＤＮＡの安定性および細胞へのＤＮＡ送達を増加させるためにＤＮ Ａ結合分子を利用する。特に、本発明は、核酸を濃縮することができるペプチド に非共有結合した核酸を伴う核酸運搬体の使用を特徴とする。これらの結合分子 は、小さいか、または濃縮し、そしてより安定な核酸粒子を送達のために提供し 、それにより、細胞内および核内への核酸のトランスフェクション率を高める。 溶解剤および結合分子の両者の特徴を利用することにより、本発明は、核酸運 搬体系による核酸の送達を高める。これらの化合物は、単独で、あるいは以下に 記載され、全体が引用により編入される（図面も含めて）Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ． ，の「ＤＮＡ運搬体系および使用法」と題するＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１８７５ ９開示された核酸運搬体の他の化合物と共に用いることができる。溶解および結 合分子を伴う運搬体系は、安定な濃縮核酸をエンドソームから細胞内部に放出す ることを高めて特定の細胞への核酸の送達を高める。 核酸結合分子および溶解剤を含む核酸結合複合体に加え、本発明は、表面リガ ンドおよび核リガンドを同様に含むさまざまな核酸結合複合体も特徴とする。表 面リガンドは、細胞表面リセプターに結合することおよび能動輸送（例えば、エ ンドサイトーシス、ポトサイトーシス、ピノサイトーシス）を通して細胞に侵入 することができる。特定の細胞に特異的な表面リガンドを用いることにより、核 酸運搬体系を用いて、所望の組織に直接核酸が送達されうる。核のリガンドは、 核酸を認識して核膜を通して細胞核に核酸を運搬することができる。そのような 核リガンドは核酸を核標的とする該分子の結合能力を高めることを助ける。 特定の細胞および核へ核酸を送達するための上記運搬体の能力は、トランスジ ェニック動物モデルを、分子発癌性および疾患の検討のため、潜在的化学および 物 理発癌物質および腫瘍プロモーターを評価するため、モデルの治療方法並びに家 畜の農業目的の開発ために使用可能にもする。さらに、上記核酸運搬体系の利点 は、投与方法およびさまざまな疾患の治療方法も許容する。さらに、上記核酸運 搬体系を用いることにより、細胞を形質転換して、特定の蛋白質、日オリペプチ ドおよび／またはＲＮＡを生成することができる。同様に、上記核酸運搬体系は 、組織培養細胞と共にインビトロにおいて使用することができる。インビトロの 使用により、特定の標的組織培養細胞に特定の発現を目的とすることによりさま ざまな核酸の役割が研究されることになる。 本発明の第１の側面は、細胞への核酸の送達のための核酸運搬体系を特徴とす る。核酸運搬体は、核酸に非共有結合し且つ溶解剤を対合した結合分子を含む核 酸結合複合体を含む。さらに、該運搬体は核酸に非共有結合した付加的結合分子 も含みうる。核酸結合分子および／または付加的結合分子は同じ時間即ち同時に さまざまな部分において核酸に非共有結合してよい。さらに、溶解剤はスペーサ ーにより各々の結合分子と対合できる。 本明細書にて用いた用語「溶解剤」は、エンドソーム膜を分解して細胞の細胞 質に含有物を遊離させることができる分子、化合物、蛋白質またはペプチドを示 す。溶解剤は、（１）溶解剤を細胞膜に対合させるか融合させることによりエン ドソーム含有物が細胞質に漏れるようにすることによる、膜融合機構、即ちフソ ジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）；（２）溶解剤が細胞膜の構造上の配列を破 壊してそれによりエンドソームを通した細胞内への漏れを引き起こす膜不安定化 機構；または（３）エンドソーム溶解を引き起こす他の公知または非公知の機構 により作用しうる。この用語は、限定されないが、システム化された化合物、例 えばＪＴＳ−１ペプチド、ウイルス、溶解ペプチドまたはそれらの誘導体を含む 。用語「用語ペプチド」は、膜の構造上の配列および保全性が失われるように膜 を貫通する化学物質群を示す。溶解剤の存在の結果、膜は溶解、融合または両者 を受ける。 本発明において、好ましい溶解剤はＪＴＳ−１ペプチドまたはその誘導体であ る。ＪＴＳ−１溶解ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＬＦＥＡＬＬＥＬＬＥＳＬＷ ＥＬＬＬＥＡである。当業者は、そのような命名法がアミノ酸を示すのに当業界 において受容される標準表示法であることを容易に認識および理解するであろう 。ＪＴＳ−１溶解ペプチドおよびその誘導体はαヘリックスとして設計されて、 側鎖は、疎水性および親水性側鎖を有するペプチドを生ずるように分配されるよ うなアミノ酸配列を含む。そのようなαヘリックスは両親媒性（ａｍｐｈｉｐａ ｔｈｉｃまたはａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）と称される。疎水性側鎖は高度に無極 性のアミノ酸側鎖を含み、中性および非中性である。親水性側鎖は大規模な数の グルタミン酸を含むが、アスパラギン酸、並びに極性または塩基性アミノ酸も含 みうる。ＪＴＳ−１ペプチドは、バックボーンのあらゆる誘導体および変調物を 含むはずである。溶解ペプチドは、選択性溶解特性を有するオリゴマー集合体の 形成をもたらす酸性ｐＨにおいては二次構造変化を受ける。 通常、両親媒性ペプチド溶解活性のために重要なパラメーターは以下を含む。 第１、疎水性：ペプチドはリン脂質−コレステロール膜に相互作用して貫通する ために疎水表面の十分に高い疎水性を有していなければならず、即ち、脂質結合 自体は十分でない。赤血球溶解アッセイは、ペプチドが有用な活性を有すること のよりよい指標を与える。第２、ペプチド凝集：凝集能力は溶解およびトランス フェクションにおいて重要な役割を果たす。第３、ｐＨ感度：両親媒性ペプチド はｐＨ感受性でなければならない。溶解活性はリジン、アルギニンおよびヒスチ ジン残基をＪＴＳ−１の疎水性表面に導入することにより制御することができる 。第４、脂質膜相互作用：ペプチドは疎水性カルボキシル末端を有することによ り脂質膜との相互作用を許容せねばならず、例えば、トリプトファンに代えてチ ロシンを用いると活性を大きく減じる。最後、ペプチド鎖の長さ：安定なヘリッ クス形成および脂質膜貫通および破壊を得るために、長さは１２残基以上でなけ ればならない。 本明細書にて用いる用語「誘導体」は、同様の構造の他のペプチドまたは化合 物から生成または修飾されたペプチドまたは化合物を示す。これは、ひとつまた はそれ以上残り工程において生成されうる。本明細書にて用いる用語「修飾され た」または「修飾」は、化合物または分子の構造における変化を示す。しかしな がら、誘導体、修飾された化合物または分子の活性は、親化合物または分子の活 性に比して、保持されるか、高められるか、増大されるかまたは同様である。こ れは、ペプチドの配列内の一つのアミノ酸の変化またはひとつまたはそれ以上の 非天然アミノ酸または他の化合物の導入を含むはずである。これは、化学物質本 体の変化、水素置換の変化または化学変更物のあらゆる種類を含む。さらに、本 明細書にて用いられる「類似体」は他の構造に似せた化合物、例えばＪＴＳ−１ ，Ｋ₈，ＫＮまたはスペルミン（以下に記載）を示す。類似体は必ずしもアイソ マーではない。上記はほんの例示であり非限定である。 例えば、ＪＴＳ−１ペプチドは２位のＬをＦに変更して修飾されることにより 構造ＧＦＦＥＡＬＬＥＬＬＥＳＬＷＥＬＬＬＥＡを有することができる。そのよ うな変化はペプチドの疎水性を増加させる。さらに、ペプチドの長さの増加、例 えばＧＬＦＥＡＬＬＥＬＬＥＳＷＥＬＬＬＧＬＦＥＡも修飾である。そのような 変化はＪＴＳ−１ペプチドの効率を高めうる。ＪＴＳ−１をＧＬＦＥＡＬＬＥＬ ＬＥＫＬＷＥＬＬＬＥＡに修飾する１２位のＳからＫへの変化は溶解のための最 適ｐＨをシフトして蛋白質溶解性を高めることができる。上記はほんの例示であ り非限定を意味する。 他の有用な溶解剤は、限定されないが、オスロミキソビリデ（Ｏｔｈｒｏｍｙ ｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、アルファビリデ（Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ）およびア レナビリデ（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）のペプチドを含む。溶解剤は、Ｐｅｐ ２４，Ｐｅｐ２５，Ｐｅｐ２６、（図面を含めて引用により編入されるＰＣＴ公 開ＷＯ ９３／１８７５９を参照されたい）、あらゆる適当なバクテリア毒素、 バクテリア、アデノウイルス、パラインフルエンザイウイルス、ヘルペスウイル ス、レトロウイルス、肝炎ウイルス、またはウイルスまたはバクテリアのあらゆ る適当な溶解ペプチドまたは蛋白質も含む。これは、エンドソーム回避活性を提 供する上記のあらゆる副断片の使用を含む。特定のバクテリア毒素は、細胞毒性 毒素またはアルベオリジン、バイファメントリジン、ボツリノリジン、カプリシ オリジン、セレオリジンＯ、チャウベオリジン、ヒストリチコリジンＯ、イバノ リジン、レーターオスポロリジンＯ、エデマトリジンＯ、リステリオリジンＯ、 パーフリンゴリジンＯ、ニューモリジン、シーリゲロリジン、セプチコリジンＯ 、ソルデリリジン、ストレプトリジンＯ、テタノリジンまたはスリンゴリジンＯ を含んでよい。 ＪＴＳ−１に加えて、他の好ましい態様において、溶解剤は複製欠損ウイルス でありうる。本明細書にて用いられるとおり、用語「複製欠損」は、複製のため に必要な要素ひとつまたはそれ以上を欠くウイルスを意味する。一つの好ましい 態様において、溶解剤は、構造Ｆ、Ｐｅｐ２４，Ｐｅｐ２５またはＰｅｐ２６の アデノウイルスでありうる。さらに他の態様において、バクテリア毒素、リステ リオリジンまたはパーフリンゴリジンを用いることができる。上記の全てはＰＣ Ｔ公開ＷＯ ９３／１８７５９に開示されており、図面も含めて引用により編入 される。上記はほんの例示であり非限定である。 本明細書にて用いられる溶解剤はｐＨ感受性である。最適なｐＨは、配列およ び酸性および塩基性アミノ酸鎖の含有量により決定される。細胞のプラズマ膜上 にて同じコートされたピットを通して溶解剤を含む核酸複合体の共直鎖状化の後 に、エンドソーム形成直後に生じるｐＨの低下はエンドソームの自発溶解を引き 起こす。次に、核酸は細胞質に放出される。上記は非限定例である。 本明細書にて用いられる用語「結合分子」は、核酸を安定化および濃縮するこ とができる分子、化合物、蛋白質またはペプチドを示す。これは、限定されない が、静電結合、疎水性結合、水素結合、相互作用またはＤＮＡの主要および／ま たは非主要本体中の相互作用を含む核酸とのヘリックス構造形成により、核酸を 安定化および濃縮することができる成分を示す。用語結合分子は本明細書におい ては濃縮剤も示す。結合分子は、核酸に非共有結合できる。当業者は、非共有の 意味を容易に認識するであろう。結合分子は、表面リガンド、核リガンドおよび ／または溶解剤と対合することもできる。 本明細書で使用する用語「対合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ）」は、 共有または非共有手段を通して分子を結合するか（ｂｉｎｄｉｎｇ）、付着させ るか（ａｔｔａｃｈｉｎｇ）、接続するか（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ）または連結 すること（ｌｉｎｋｉｎｇ）を示す。当業者は共有および非共有の意味を容易に 認識するはずである。「対合する」は、限定されないが、表面リガンド、核リガ ンドおよび／または溶解リガンドに対合した結合分子を含む。さらに、それは、 スペーサー（以下に記載）と上記成分との会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を含 む。 本発明において、好ましい結合分子はペプチドＫ₈である。Ｋ₈のアミノ酸配列 はＹＫＡＫＫＫＫＫＫＫＫＷＫである。他の好ましい態様において、結合分子は 式ＹＫＡＫ_NＷＫを有するあらゆるペプチドであるが、式中、Ｎは１−４０の間 でありうる。この式またはアミノ酸構造は”Ｋ_N”と称される。これは、核酸安 定性および濃縮特性を提供する上記あらゆる副断片の使用を含むはずである。さ らに、これはＫ₈のあらゆる誘導体、類似体、または修飾体または一般的なＹＫ ＡＫ_NＷＫのＫ_Nを含むはずである。 上記ペプチドは、核酸への静電結合のためのリジンまたはアルギニン残基を含 むことができる。これらの陽性荷電アミノ酸は核酸を完全に保つ助けとなる。結 合分子はチロシンを含むこともでき、ペプチド濃度およびインビトロおよびイン ビボのトラッキング目的のイオン化を測定するのに有用である。トリプトファン も、インターカレーションを通して核酸相互作用の安定性を増加させる。さらに 、ペプチドのＤＮＡへの結合はトリプトファンの蛍光を抑制し、複合体形成の動 力学および熱力学が決定されるようになる。結合分子は、トリプトファン、アラ ニン、ロイシンまたはグルタミンのようなヘリックス形成残基を含むこともでき る。これらは、カチオン残基がヘリックスの様式において核酸と相互作用するた めに最適な形状を採用することを可能にしてより安定な複合体をもたらす。さら に、結合分子はＫ₈の安定化循環バージョンまたは一般構造ＹＫＡＫ_NＷＫ構造の Ｋ_Nも含むことができる。そのような循環バージョンは、ラクタムまたはジスル フィドブリッジを導入することにより形成することができる。同様に、Ｋ₈また はＫ_Nのダイマーも結合分子として使用することができる。 一般的に、結合分子に重要なパラメーターは以下を含む。第１、ペプチドは、 ＤＮＡとのイオン性相互作用を許容するのに十分なリジンまたはアルギニンを含 まねばならない。第２、ペプチドは安定なヘリックスを形成し、且つＤＮＡを小 さな粒子に濃縮するのに十分な長さ、１１または１２残基を有さねばならず、例 えばＫ_NはＫ₈より大きい粒子を形成する。第３、ＤＮＡとの相互作用に際して形 成するペプチドヘリックスは、イオン強度に敏感でない濃縮剤を与えるロイシン ジッパー形成により安定化されうる。最後に、濃縮ペプチドのリジンまたはアル ギニン配列は核局在化配列として付加的な機能を担う。 結合分子は、限定されないが、スペルミン、スペルミン誘導体、スペルミジン 、ヒストン、ポリリジン、ポリアミン類およびカチオンペプチド類を含む。Ｋ₈ またはＫ_Nの場合のように、これは限定されないが上記化合物の類似体、修飾体 または誘導体を含む。 スペルミン誘導体は、化合物Ｄ，ＩＶ，ＶＩＩ，ＸＸＩ，ＸＸＸＩＩＩ，ＸＸ ＸＶＩ，ＬＩＶ，ＬＶＩ，ＬＸＸＸＩＩ，ＬＸＸＸＩＶおよびＣＸを含み、図面 も含めて引用により編入されるＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１８７５９に記載されて いるとおりである。核酸運搬体系と共に使用する場合、結合分子、例えばＫ₈、 Ｋ_Nまたはスペルミンは表面リガンド、核リガンド、溶解剤に対合するか、また はそれから分離されており、異なるかまたは同様の結合分子であり得て、同じ時 間に、即ち同時にそしてさまざまな部分において結合することができる。好まし い態様において、結合分子はスペルミン誘導体であり、上記引用文献に記載され ているとおりである。 Ｋ₈，Ｋ_Nおよびスペルミンは、結合分子として使用されるポリ−Ｌ−リジンを 越える利点を有する。例えば、Ｋ₈，Ｋ_Nまたはスペルミンの結合特性は、ポリ− Ｌ−リジンを越える利点を有する。第１に、細胞内のＫ₈，Ｋ_Nまたはスペルミン 濃度は約３から１０ｍｍｏｌである。これはポリ−Ｌ−リジンを用いた研究より も高く、核への核酸のより効率良い移送を示唆する。第２に、Ｋ₈，Ｋ_Nまたはス ペルミンのアミノ基の間隔は、この天然に生じるポリカチオンが確実に適合して ＤＮＡの二重ヘリックスの主嬰な溝に適合するような間隔である。ポリカチオン のポリ−Ｌ−リジンはＤＮＡの溝のリン酸に静電相互作用するが、この適合は正 確ではない。最後に、ＤＮＡとＫ₈，Ｋ_Nまたはスペルミンの理論上の会合／解離 の動力学は、ＤＮＡとポリ−Ｌ−リジンの動力学よりも素早い。これは、細胞内 へのＤＮＡ放出のためのＫ8，Ｋ_Nまたはスペルミン／ＤＮＡの混合において有利 である。 本明細書にて用いられる用語「核酸運搬体系」は、細胞膜を通して核酸を効率 良く運搬することができる分子複合体を示す。この分子は核酸に非共有結合され る。核酸に加えて、他のマクロ分子、限定されないが蛋白質、脂質および糖質も 、該運搬体系を用いて送達することができる。細胞内部へ非共有結合核酸を放出 することもできる。さらに、該核酸運搬体はエンドソーム溶解による核酸の分解 を妨害する。さらに、必要ではないが、核酸運搬体系は以下のとおりに、核膜を 通して核酸を効率良く運搬することもできる。 上記核酸運搬体系は限定されないが、６つの成分を含むことができる。それは 、（１）興味のある遺伝情報を含む公知の一次配列を有する核酸または他のマク ロ分子あるいは公知の化学組成物；（２）上記（１）の核酸又はマクロ分子を安 定化および濃縮することができる試薬；（３）細胞表面からの完全複合体を直接 細胞の細胞質に運搬することができる溶解モイエティ；（４）細胞表面リセプタ ーまたは抗原を認識して該リセプターまたは抗原に結合するかあるいはサイトー シスを通して細胞に侵入することができるモイエティ；（５）核膜を通して運動 するかまたは運動を開始することができるモイエティ；および／または（６）上 記（３）、（４）および（５）のモイエティを共有結合することができる核酸ま たはマクロ分子結合モイエティからなるかまたはからなることを必須とする。用 語「からなる」は、本明細書においては当業界において認識されるとおりに使用 される。上記６つのモイエティ「からなることを必須とする」運搬体は、上記モ イエティの変更物を含む。そのような変更物は、上記のモイエティ６つすべて未 満を利用してよい。これはほんの例示であり非限定である。 用語「送達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」は、所望の細胞または任意の細胞への分子 の運搬を示す。送達は、細胞表面、細胞膜、細胞エンドソーム、細胞膜内部、核 または核内部、またな細胞のあらゆる所望のエリアに対してでありうる。送達は 、核酸を運搬することのみならず、限定されないが蛋白質、脂質、糖質およびさ まざまな他の分子を含む他のマクロ分子を運搬することを包含する。 本明細書にて用いられる用語「核酸」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを示す。これは 、はだかのＤＮＡ、核酸カセット、はだかのＲＮＡ、またはベクターあるいはウ イルス中に含まれる核酸を含むはずである。これらはほんの例示であり限定する ことを意味しない。用語「発現」は、運搬された遺伝子または核酸の細胞による 効果的な転写を示す。発現産物は、蛋白質、ポリペプチドまたはＲＮＡであって よい。さらに、核酸は同じく、アンチセンスＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたは リボザイムでありうる。 さまざまな蛋白質およびポリペプチドが核酸によりコードされうる。発現され うるそれらの蛋白質またはポリペプチドは、ホルモン、成長因子、酵素、クロッ ティング因子、アポリポプロテイン、リセプター、薬剤、オンコジーン、腫瘍抗 原、腫瘍サプレッサー、サイトカイン、ウイルス抗原、寄生虫抗原およびバクテ リア抗原を含む。これら化合物の特定例は、プロインスリン、インスリン、成長 ホルモン、アンドロジェンリセプター、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様 成長因子ＩＩ、インスリン成長因子結合蛋白質、表皮成長因子、ＴＧＦ−α、Ｔ ＧＦ−β、皮膚成長因子（ＰＤＧＦ）、脈管形成因子（酸性繊維芽成長因子、塩 基性繊維芽成長因子およびアンギオジェニン）、マトリックス蛋白質（タイプＩ Ｖコラーゲン、タイプＶＩＩコラーゲン、ラミニン）、オンコジーン（ｒａｓ， ｆｏｓ，ｍｙｃ，ｅｒｂ，ｓｒｃ，ｓｉｓ，ｊｕｎ）、Ｅ６またはＥ７形質転換 配列、ｐ５３蛋白質、サイトカインリセプター、ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−８ ，ＩＬ−２，α，β、またはγＩＦＮ，ＧＭＣＳＦ，ＧＣＳＦ，ウイルスキャプ シド蛋白質、およびウイルス、バクテリアおよび寄生虫由来の蛋白質を含む。発 現されうる他の特定の蛋白質またはポリペプチドは、フェニルアラニンヒドロキ シラーゼ、α−１−アンチトリプシン、コレステロール−７α−ヒドロキシラー ゼ、削除されたアポリポプロテインＢ、リポプロテインリパーゼ、アポリポプロ テインＥ、アポリポプロテインＡ１、ＬＤＬリセプター、各々の分子変更物、お よびそれらの混合物を含む。当業者は、これらの蛋白質が広い範囲の群の蛋白質 に属すること、およびこれらの群の蛋白質も用いることができることを容易に認 識する。これらはほんの例示であり、あらゆる意味において限定することを意味 しな い。 上記核酸運搬体系から細胞に取り込まれる遺伝物質は、（１）細胞に通常見い だされない核酸；（２）細胞に通常見いだされるが生理的に顕著なレベルで発現 されない核酸；（３）細胞に通常見いだされて生理的に所望のレベルで発現され る核酸；（４）細胞内で発現のために就職されうる他の核酸；および（５）上記 のあらゆる組み合わせを含むことも、認識されるべきである。 本明細書にて用いられる用語「核酸結合複合体」は、結合分子を含む複合体を 示す。上記定義された結合分子は核酸に非共有結合することができる。結合分子 は、表面リガンド、核リガンドおよび／または溶解剤に対合することもできる。 さらに、結合複合体は、表面、核または溶解剤を結合分子に対合させるスペーサ ーを含むことができる。スペーサーは、以下においてより詳細に定義される。 本発明の第２の側面は、核酸に非共有結合し且つ表面リガンドに対合した結合 分子を含む第１核酸結合複合体を含む細胞に核酸を送達するための核酸運搬体系 を特徴とする。運搬体は、核酸に非共有結合し且つ溶解剤に対合した結合分子を 含む第２の核酸結合も含む。さらに、運搬体は、核酸に非共有結合した付加的な 結合分子も含みうる。 上記結合複合体および／または結合分子は、同じ時間即ち同時にさまざまな部 分において、核酸に非共有結合することができる。上記のとおり、結合分子は同 じかまたは異なる分子でありうる。さらに、表面リガンドまたは溶解剤は直接結 合分子と対合するかまたはスペーサーにより対合することができ、以下に定義さ れる。 本明細書にて用いられる用語「表面リガンド」は、細胞の表面リセプターに結 合するようになる化学化合物または構造を示す。本明細書にて用いられる用語「 細胞医表面リセプター」は、リガンドを結合することができる細胞表面上の特定 の化学群（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を示す。細胞表面リセプターは特定の細胞に特異 的であることができ、即ち他の種の細胞においてよりも一つの細胞において支配 的に見いだされうる（例えば、ＬＤＬおよびアシアログリコプロテインリセプタ ーは肝細胞に特異的である）。該リセプターは、リセプターおよび付着した分子 の 内在化を促進する。細胞表面リセプターは、限定されないが、葉酸塩リセプター 、ビオチンリセプター、リポ酸リセプター、低密度リポ蛋白質リセプター、アシ アログリコプロテインリセプター、インスリン様成長因子タイプＩＩ／カチオン 依存性マンンノース−６−リン酸リセプター、カルシトニン遺伝子関連ペプチド リセプター、インスリン様成長因子Ｉリセプター、ニコチン様アセチルコリンリ セプター、肝細胞成長因子リセプター、内皮リセプター、胆汁酸リセプター、骨 形態形成蛋白質リセプター、軟骨誘導因子リセプターまたはグリコシルホスファ チジルイノシトール（ＧＰＩ）−固定蛋白質（例えば、β−アンドレナージ様（ ａｎｄｒｅｎａｒｇｉｃ）リセプター、Ｔ−細胞活性化蛋白質、Ｔｈｙ−１蛋白 質、ＧＰＩ−固定５’ヌクレオチダーゼ）を含む。 リセプターは、リガンドが特異的に且つ相対的に高い親和性で結合する分子を 示す。それは通常は蛋白質または糖蛋白質であるが、糖脂質、脂質ポリサッカラ イド、グリコサミノグリカンまたは多糖外被であってもよい。本発明の目的のた めに、抗体またはその断片が結合するエピトープはリセプターとして解釈されて よいが、抗原：抗体複合体が飲食作用を受けるからである。さらに、表面リガン ドは、能動輸送（例えば、飲食作用、ポトサイトーシス、飲作用）を通して細胞 に侵入することができるあらゆるものを含む。 本明細書にて用いられるとおり、用語「リガンド」は、リセプターに結合する 化学化合物または構造を示す。これは限定されないが、リガンド、例えばアシア ロオロソムコイド、アシアログリコプロテイン、葉酸塩、リポ酸、ビオチン並び に引用により編入されるＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１８７５９に記載された化合物 を含む。 当業者であれば、選択されたリガンドはどのリセプターが結合することになる かに依存することを容易に認識するであろう。異なる種類の細胞は異なるリセプ ターを有するので、これは、どの細胞表面が用いられるかに依存して、特定の細 胞種に対して核酸を標的とする方法を提供する。即ち、好ましい細胞表面リガン ドは標的とされた細胞種に依存してよい。 本発明の第３の側面は、核酸に非共有結合し且つ表面リガンドに対合した結合 分子を含む第１核酸結合複合体を含む細胞に核酸を送達するための核酸運搬体系 を特徴とする。運搬体は、核酸に非共有結合し且つ核酸リガンドに対合した結合 分子を含む第２の核酸結合も含む。運搬体は、核酸に非共有結合し且つ溶解剤に 対合した結合分子を含む第３の核酸結合も含む。さらに、運搬体は、核酸に非共 有結合した第４の結合分子も含みうる。 核酸結合複合体および／または結合分子は、同じ時間即ち同時にさまざまな部 分において、核酸に非共有結合することができる。上記のとおり、結合分子は同 じかまたは異なる分子の組み合わせでありうる。さらに、表面リガンド、核リガ ンドおよび溶解剤は直接結合分子と対合するかまたはスペーサーにより対合する ことができ、以下に定義される。 本明細書にて用いられる用語「核リガンド」は、核リセプターを結合するリガ ンドを示す。本明細書にて用いられる用語「核リセプター」は、特定のリガンド を結合し且つ核膜を通してリガンドの運搬を肋ける核膜上の化学群を示す。化学 リセプターは、限定されないが、核局在配列を結合するそれらリセプターであり うる。核リガンドの非限定例は、引用により編入されるＰＣＴ公開ＷＯ ９３／ １８７５９に開示されたものを含む。 上記のとおり、表面リガンド、核リガンドおよび／または溶解剤は直接結合分 子に対合するかまたはスペーサーを通して結合分子に対合することができる。本 明細書にて用いられる用語「スペーサー」は、２つの分子を違いに連結する化学 構造を示す。スペーサーは通常、スペーサー分子の異なる部分上で互いの分子を 結合する。スペーサーは、約６から３０炭素原子からなる疎水性分子でありうる 。スペーサーは、約６から１６炭素原子を含むこともできる。スペーサーは限定 されないが、［（ｇｌｙ）_i（ｓｅｒ）_j］_kの疎水性ポリマーを含むことができ 、式中、ｉは１から６の範囲であり、ｊは１から６の範囲であい、そしてｋは３ から２０の範囲である。さらに、スペーサーおよび結合分子化合物は限定されな いが、引用により編入されるＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１８７５９に開示された化 合物を含む。さらに、スペーサーは限定されないが、構造［ＮＨ−（ＣＨ₂ＣＨ₂ ）_n−ＣＯ−］_mの繰り返しのオメガアミノ酸を含んでよく、ｎが１−３であり且 つ ｍが１−２０の場合にはジスルフィド結合（ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｓ−Ｓ−ＣＨ₂ＣＨ₂− ）_nであり、ｎが１−２０である場合には、あるいは構造 を有する酸感受性二機能性分子である。 本発明の一つの好ましい態様において、溶解剤はＪＴＳ−１であるかまたはそ の誘導体であり、そして結合分子Ｋ₈またはその誘導体である。本発明のさらに 他の態様は、本明細書に開示されたとおりの表面、核リガンドおよび溶解剤、お よび結合分子Ｋ₈、Ｋ_Nまたはそれらの誘導体を含みうる。さらに他の態様におい て、表面および核リガンドは本明細書に開示されたものの一つでありえ、溶解剤 はＪＴＳ−１であるかまたはその誘導体であり、そして結合分子Ｋ₈、Ｋ_Nまたは その誘導体である。これら態様は上記されたスペーサーの使用も含む。 上記側面の好ましい態様において、葉酸塩は表面リガンドとして用いられ、Ｊ ＴＳ−１は溶解剤として用いられる。この運搬体並びに本発明に記載された他の 核酸運搬体は、限定されないが、蛋白質、脂質および糖質を含む核酸以外の細胞 質の他のマクロ分子に送達することができる。この側面の結合複合体は、同じ時 間即ち同時にさまざまな部分において核酸に非共有結合することができる。結合 分子は同じであるかまたは異なることができ、そして上記のとおり直接またはス ペーサーを通してリガンドまたは溶解剤を付着してよい。 上記態様に加えて、核酸結合分子、Ｋ₈，Ｋ_Nまたは誘導体を他の態様と関連づ けて用いることもできる。結合分子は核酸に非共有結合させることができる。１ 以上の結合分子を同じ時間に即ち同時にさまざまな部分において核酸に非共有結 合させることができる。 他の好ましい態様において、アシアログリコプロテインを表面剤として、Ｋ８ ，ＫＮまたは誘導体を結合分子として、そしてＪＴＳ−１または誘導体、リステ リオリジンまたはパーフリンゴリジンを溶解剤として用いることができる。リス テリオリジン、パーフリンゴリジンまたは活性副断片を有する毒素の部分のみを 用 いる必要がある。同様に、微生物毒素およびそれらの活性副断片を、エンドソー ム回避のために本発明の運搬体に取り込むことができる。 本発明の第４の側面は、ＪＴＳ−１組成物および誘導体を特徴とする。上記の とおり、これらの組成物はエンドソーム溶解特性を有するために有利である。上 記のとおりに各酸運搬体と共に用いる場合、ＪＴＳ−１または誘導体は細胞を標 的とした核酸の発現を高める。ＪＴＳ−１化合物および誘導体は以下に詳細に記 載される。 本発明の第５の側面は、Ｋ₈またはＫ_N組成物および誘導体を特徴とする。上記 のとおり、これらの結合分子は核酸濃縮／安定化特性を有するために有利である 。上記のとおり核酸運搬体系と共に用いる場合、Ｋ₈またはＫ_N組成物および誘導 体は、細胞を標的とした核酸の発現を高める。Ｋ₈またはＫ_N化合物および誘導体 は以下に詳細に記載される。 さらに、上記のとおり、上記すべての側面は、核酸に非共有結合し且つ表面リ ガンド、核リガンドまたは溶解剤に付着した結合分子を伴う多くの核酸結合複合 体を含む核酸運搬体系を特徴とする。上記結合複合体から分離した付加的な結合 分子が多数存在してもよい。スペーサーをもちいることにより、表面リガンド、 核リガンドおよび／または溶解剤を接続することができる。 本発明の第６の側面は、核酸または分子を細胞に送達するための上記核酸運搬 体系の使用法を特徴とする。そのような使用法は、インビボおよびインビトロ両 方の使用を含む。これは、細胞を標的とする核酸の発現のために上記核酸運搬体 系により細胞を形質転換することを含むはずである。上記定義のとおり、核酸は 、遺伝物質を含み且つさまざまな蛋白質、ポリペプチドまたはＲＮＡをコードす る核酸を含んでよい。 本明細書にて用いられる「形質転換」または「形質転換された」は、細胞また は器官による核酸の取り込みを含む遺伝子運搬の機構である。それは、細胞の特 徴（発現された表現型）における一時的または永続の変化を誘導する過程または 機構である。そのような変化は、細胞が特定の遺伝子産物を発現するかまたは内 在遺伝子産物の発現または効果を変更する形態で細胞にＤＮＡまたはＲＮＡを導 入することによる遺伝子運搬機構による。細胞への侵入に続き、形質転換核酸は 宿主の核酸と組換えられてよい。そのような形質転換は、遺伝子が取り込まれて 細胞内の遺伝物質の永久の成分となる標的細胞の染色体へ遺伝子が導入される安 定な形質転換と考えられる。安定な形質転換の後の遺伝子発現は、安定な形質転 換に通じるように細胞の特性を永久に変更することができる。さらに、形質転換 核酸は、プラスミドまたはテンペレートファージとして、あるいはエピソームに より個別に存在してよい。エピソームの形質転換は、導入された遺伝子が宿主細 胞染色体中に取り込まれないが染色体外要素として転写活性状態をまだ保持して いる、安定な形質転換の変形である。 形質転換は、以下に記載のインビボ技術によるか、または核酸を含み且つ選択 可能なマーカーも含む核酸運搬体系で細胞を共トランスフェクトするエクスビボ 枝術により実施することができる。この選択可能なマーカーを用いることにより 、形質転換されることになった細胞が選択される。形質転換研究に使用される選 択可能なマーカーの種類は、当業者によく知られている。 形質転換された細胞は、ホルモン、成長因子、酵素、クロッティング因子、ア ポリポプロテイン、リセプター、薬剤、腫瘍抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原、 およびバクテリア抗原を含む、蛋白質、ポリペプチドまたはＲＮＡから選択され るさまざまな化合物を生成することができる。他の例は、核酸の議論において前 に見いだされうる。形質転換された細胞から発現される産物は用いられる核酸に 依存する。上記はほんの例示であり限定されることを意味しない。 これらの使用法は、細胞を形質転換するのに十分な時間上記核酸運搬体系に細 胞を接触させる工程を含むはずである。興味のある細胞の種類は、限定されない が、肝臓、筋肉、肺、内皮、骨、血液、関節および皮膚を含むことができる。 該使用法は、核酸運搬体系により送達された核酸を含む細胞を有するトランス ジェニック動物も含むはずである。これらの細胞は生殖細胞または体細胞を含む 。トランスジェニック動物モデルは分子の発癌性および疾患の吟味のために使用 すること、化学および物理発癌物質および腫瘍プロモーターを評価するために使 用することこと、モデル治療法および家畜の農業目的を開発するために使用する こ とができる。 該使用法はヒトの治療法も含み、これは本発明の他の側面である。該治療法は 、上記核酸運搬体を投与することにより、細胞または組織による核酸発現の目的 で細胞または組織に所望の核酸を送達する工程を含む。興味のある細胞または組 織の種類は、限定されないが、肝臓、筋肉、肺、内皮、関節、皮膚、骨および血 液を含みうる。 該治療法または使用法は、上記核酸運搬体に肝細胞を接触させることにより、 核酸を肝臓に送達する方法を含む。核酸運搬体と共に用いる表面リガンドは、肝 細胞リガンドによる認識のための特別のものである。特に、アシアロオロソムコ イド蛋白質は細胞表面リガンドとして使用され、Ｋ₈，Ｋ_Nまたは誘導体は結合分 子として使用され、そしてＪＴＳ−１または誘導体は溶解剤として使用される。 本明細書にて用いられる用語「肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）」は、肝臓の細 胞を示す。 該治療法および使用法の側面は、上記核酸運搬体系の一つに筋肉細胞を接触さ せることによる、筋肉細胞への核酸の送達法を含む。用いられる表面リガンドは 筋肉細胞上に含まれるリガンドに特異的である。特に、表面リガンドはインスリ ン様成長因子Ｉでありうる。さらに、結合分子はＫ₈，Ｋ_Nまたは誘導体でありえ て、溶解剤はＪＴＳ−１または誘導体でありうる。さらに、これら治療法または 使用法は、ＪＴＳ−１およびＫ₈と共に運搬体を使用するが表面または核リガン ドは用いずに核酸を送達することも含む。本明細書にて用いられる用語「筋肉細 胞」は、条線のある筋肉、平滑筋または心筋に関連した細胞を示す。 該治療法または使用法の他の側面は、上記核酸運搬体系に骨形成細胞を接触さ せることによる、骨形成細胞への核酸の送達法を含む。核酸運搬体系と共に用い られる表面リガンドは、骨形成細胞に関連したリセプターに特異的である。特に 、表面リガンドは、限定されないが、形態形成蛋白質または軟骨誘導因子を含む 。さらに、核酸運搬体の結合分子はＫ₈，Ｋ_Nまたは誘導体、および溶解剤ＪＴＳ −１またはその誘導体でありうる。さらに、これらの治療法または使用法は、Ｊ ＴＳ−１およびＫ₈と共に運搬体を使用するが表面または核リガンドは用いずに 核 酸を送達することも含む。本明細書にて用いられる用語「骨形成細胞」は骨の成 長を促進する細胞を示す。非限定例は、造骨細胞、間質細胞、誘導可能な骨始原 細胞、決定された骨始原細胞、軟骨細胞、並びに骨形成を補助することが可能な 他の細胞を含む。 該治療法または使用法の他の関連する側面は、上記核酸運搬体系を用いた、細 胞への核酸の送達法を含む。核酸運搬体系は葉酸塩をリガンドとして用いる。さ らに、核酸運搬体系はＪＴＳ−１または誘導体を溶解剤として用いることができ 、また、Ｋ₈，Ｋ_Nまたは誘導体を結合分子として用いることができる。この方法 は、限定されないが肝細胞を含む葉酸塩リセプター含有細胞を標的とする。 該治療法または使用法のさらに他の関連する側面は、上記核酸運搬体系を用い て滑膜細胞またはマクロファージへ核酸を送達する方法を含む。該核酸運搬体系 は、滑膜細胞および／またはマクロファージにより認識されるリガンドを用いる 。さらに、核酸運搬体系はＪＴＳ−１または誘導体を溶解剤として用いることが でき、また、Ｋ₈、Ｋ_Nまたは誘導体を結合分子として用いることができる。さら に、この方法は、ＪＴＳ−１およびＫ₈と共に運搬体を使用するが表面または核 リガンドは用いずに核酸を送達することも含む。用語「滑膜細胞」は、関節また は関節の流体スペースに対合した細胞を示す。 上記方法に加えて、該使用法は、核リガンド結合複合体を同様に含む送達も含 む。そのような運搬体は核酸を核に向けることを助けるはずである。さらに、上 記使用法は、結合分子および溶解剤または多数のそれらと共に、核酸運搬体も含 む。 上記方法の核酸運搬体はさまざまなルートにより投与されてよい。用語「投与 」または「投与する」は、核酸運搬体または運搬体キャリアーの体内への導入ル ートを示す。投与は、静脈内、筋肉内、局所、経鼻または経口でありうる。投与 は標的組織へ直接であるかまたは全身送達でありえる。特に、投与は細胞への直 接注射であってよい。他の態様において、投与はハイポスプレーまたはＰＶＰ、 無定形粉末の使用による静脈内による。投与のルートは、筋肉内、エアロゾル、 経口、局所、全身、経鼻、接眼レンズ、腹腔および／または気管内を含む。 本発明の他の特徴および利点は、図面および請求の範囲を伴うことに関連して 以下の発明の詳細な説明から明らかになろう。図面の簡単な説明 図１は、ＪＴＳ−１のアミノ酸配列およびα−ヘリックス構造を表す。 図２は、膜脱安定化活性を伴うｎ−アシルテトラペプチドを表す。 図３は、溶解活性を有するα−ヘリックスペプチドを表す。 図４は、Ｓｋｏｖ−３，ＭＬ−３，Ｓｏｌ Ｂ，ＨＣＴ−１６αまたはＣＩＴ −２６細胞内のＪＴＳ−１仲介発現の発現結果を表す。 図５は、ＪＴＳ−１仲介遺伝子送達の発現結果を表す。 図６は、Ｋ₈ペプチドおよびさまざまなＲ基置換の描写を示す。 図７は、側鎖の長さおよび荷電基の変更によるＫ₈変更物の描写を示す。 図８は、安定性を改良するためにＫ_Nのコアのリジン配列において置換したシ ュードペプチドの描写を示す。 図９は、ペギル化された（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）Ｋ_Nペプチドの形成模式図で ある。 図１０は、Ｋ_Nペプチドを用いたトランスフェクション効率の描写である。 図１１は、ＪＴＳ／Ｋ₈配合体の模式である。 図１２は、Ｋ₈／ＪＴＳ−１／ＤＮＡ複合体によるＣ₂Ｃ₁₂筋芽細胞のトランス フェクションの描写である。 図１３は、Ｋ₆／ＪＴＳ−１／ＤＮＡ複合体による４Ｍｂｒ−５気管支細胞の トランスフェクションの描写である。 図１４は、ＪＴＳ／Ｋ₈／ＤＮＡ複合体の肝細胞への直接送達に使用された標 的リガンドの描写である。 図１５は、アシアログリコプロテインリセプターによる取り込みのために糖質 を含む標的リセプターの描写である。 図１６は、マンノースまたはマンノース−６−リン酸リセプターにより細胞に ＪＴＳ／Ｋ₈／ＤＮＡを送達するための標的リガンドの描写である。 図１７は、ＪＴＳ／Ｋ₈／ＤＮＡの結合組織、創傷への送達および修復のため のＲＧＤ標的リガンドの描写である。 図１８は、ＪＴＳ／Ｋ₈／ＤＮＡの肝臓への送達に有用なリガンドの描写であ る。 図面は必ずしもスケールどおりでない。本発明の特定の特徴は、明瞭化および 正確性の興味においてスケールを誇張するかまたは模式形態において示される。 さらに、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１８７５９の図面は引用により編入される。発明の詳細な説明 以下は、細胞への核酸の送達のための溶解および／または結合分子を伴う核酸 運搬体系を用いた本発明の実施例である。これらの実施例は例示の目的で提供さ れ、あらゆる様式に本発明を限定することを意図しない。 以下は、本発明の好ましい態様の特定例である。これらの実施例は、如何にし て特定の溶解剤が核酸を細胞内部に放出するかを示す。これらの実施例は、如何 にして特定の結合分子が細胞送達のための核酸を安定化および濃縮するかを示す 。さらに、これらの実施例は、如何にして表面および核リガンドが核酸結合モイ エティと共に用いられて細胞内部および／または細胞核に対して核酸を標的とす る事ができるかを示す。そのような標的送達は、溶解剤および結合分子の使用に より高められる。これらの実施例は、インビボおよびインビトロ技術、さまざま な細胞または動物モデルおよび如何にして核酸が細胞内に挿入されうるかを含む 。そのような核酸運搬体系の利用は本明細書において言及されて、引用により編 入されるＷｏｏ ｅｔ ａｌの「ＤＮＡ運搬体系および使用法」と題されるＰＣ Ｔ公開ＷＯ ９３／１８７５９により増大される。 以下は、核酸運搬体系において対合された核酸に対する特定の官能基を提供す るために使用することができる特定の核酸運搬体系の例を提供するが、即ちその ような対合核酸を含む形質転換細胞または動物の範囲内における。当業者は、核 酸運搬体系の特定のモイエティが核酸運搬体系の所望の特性を提供する機能領域 を含む系として同定されうることを認識するであろう。そのような領域は、日常 の欠失、変異または修飾技術またはそれらの均等物を用いて容易に最小化されう る。ＪＴＳペプチド、類似体および誘導体 エンドソーム溶解剤としてのアデノウイルスの使用を排除するために、フソジ ェニックなペプチドまたは膜破壊性ペプチドをデサインしたが、これらはエンド ソームから細胞への核酸の送達速度を増大させて、飲食作用を受けたより高い濃 度の核酸が放出されてエンドソーム内で分解されないはずであることを保証する はずである。多くのフソジェニック／溶解ペプチドは前に記載されたが、小胞性 口内炎ウイルスの糖蛋白質のアミノ末端配列および合成両親媒性ペプチドＧＡＬ Ａを含む。Ｏｊｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ，１６：２２５−２２９（１ ９９１）；Ｄｏｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ，ｐｐ／ ３１３−３３５（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．１９９１） ；Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６：２９６ ４−２９７２（１９８７）。 インフルエンザのヘマグルチニンＨＡ₂サブユニットからの短い合成ペプチド により人工脂質膜が研究された。Ｗｈａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．，６９：１８４７−１８５７（１９８８）。これらのペプチドは膜 融合および完全ヘマグルチニン分子と同様なリポソーム含有物の漏れの両方を与 える。しかしながら、速度は全く遅い。 インフルエンザペプチドを用いたエンドソーム溶解により低効率速度を増加さ せるために、新たなペプチドを創製した。エンドソーム溶解のためのこれらの新 たなペプチドの創製のために、４つの因子が考慮された：（１）膜に挿入された 後にペプチドの編成されたオリゴマー対合を支持するためのαヘリックスを有す る親水性および疎水性アミノ酸残基の含有物および間隔；（２）結合分子へのペ プチドの共有結合およびオリゴマー形成の排除並びに必要な凝集；（３）溶解を 達成するために必要な幾つかのオリゴマー構造の十分な凝集；および（４）ｐＨ 感受性エンドソームプロセシングを創製するための親水性カルボキシルおよびア ミノ側鎖並びに末端基の存在。 ペプチド鎖に沿ったアミノ酸側鎖の分配側蛋白質の２次および３次構造を決定 することはよく知られている。膜対合蛋白質に関しては、疎水性および親水性残 基により創製された両親媒性プロフィールが蛋白質の機能の主要な決定物である 。細胞のプラズマ膜とウイルスエンベロープとの融合のために必須のインフルエ ンザヘマグルチニンの領域の分析は、該蛋白質がαヘリックスになる際に大きな 疎水性表面が形成されることを明らかにする（以下を参照されたい）。 本発明において、多くの溶解ペプチド、例えばＪＴＳペプチドがデザインされ てエンドソーム溶解活性に関して試験された。これらのペプチドが機能するため には、以下のパラメーターを有さねばならない。これらのペプチドは、側鎖が分 配されたペプチドが疎水性側鎖および親水性側鎖を有するようになるようなアミ ノ酸配列を含むαヘリックスとしてデザインされた。疎水性側鎖は高度に無極性 のアミノ酸側鎖を含み、一方親水性側鎖は大規模な数のグルタミン酸を含む。 一般的に、両親媒性膜対合蛋白質は２１アミノ酸又はそれ以下を含むのが通常 である。デザインの基準は、両親媒性種を形成する高い可能性をアミノ酸が有す ることを必要とする。これは、膜対合ペプチドの２次構造、即ちヘリックス、タ ーン、ベンド、ループ、βシート、およびそれらのオリゴマー凝集並びに文献に おいて定義される他の超２次構造、例えばヘリックス−ターン−ヘリックスを呈 しうる。さらに、アミノ酸はαヘリックス内に見いだされる高い可能性およびβ シートまたはターン構造において形成される低い可能性を有するべきである。ロ イシン、リジンおよびグルタミン酸はそのような特徴のために適当である。例え ば、αヘリックスの側表面上に位置するリジンおよびロイシンの向かい側のグル タミン酸は脂質相互作用のための最適な電荷の分配を提供する。さらに、リジン およびグルタミン酸は潜在的なヘリックス安定化を利用するように配置されうる 。ヘリックス双極子安定化は、ＮＨ₂およびＣＯＯＨにおける電荷を排除するこ とにより最適化され、即ちＮＨ₂末端およびＣＯＯＨ末端アミドは有用である。 そのような可能性は２次構造予測または２次構造デザインを最適化するための類 似の方法により決定されうる。ペプチド内にヘリックス構造を誘導する性質に関 して記載された非天然アミノ酸も用いられる。 疎水性または親油性表面は脂質−ペプチド相互作用に大きな効果を有する。即 ち、親油性表面は、脂質と相互作用することが知られているペプチドの後にモデ ル化される。疎水性および脂質相互作用性残基（Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｖａ ｌ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ）は、親油性表面上で置換された 際に、単独でまたは集合して同様な膜対合作用を促進する。同様に、酸基および ／または親水性基（Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｓｐ ，Ａｓｎ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ）は目的を達成するために親水性表面に置かれうる。 親油性および親水性表面は、酸性ｐＨにおいて脂質相互作用を促進し、および／ またはエンドソーム溶解を促進する残基も含む。そのような相互作用はαヘリッ クス促進残基に限定されないが、親水性表面上に配置されたグリシンおよびセリ ンは以下の実施例に記載されるとおり都合よく活性に影響することが示されたか らである。 特定の一つＪＴＳ−１ペプチド、ＧＬＦＥＡＬＬＥＬＬＥＳＬＷＥＬＬＬＥＡ は強い無極アミノ酸ノミを含む疎水性表面を有するが、親水性表面は生理ｐＨ値 において陰性電荷したグルタミン酸残基により支配される。アミノ末端において 、ＪＴＳ−１ペプチドは、フソジェニックまたは膜破壊配列としてアミノ酸１− ２−３位においてそれぞれＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ配列を使用する。ｐＨ感受性 増加のために、Ｇｌｕをアミノ酸４位に加える。さらに、１２−１５位において 、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕを脂質結合部位として用いる。残りの配列は ＪＴＳ−１の疎水性および親水性表面を提供するのに配置される。両親媒性膜対 合ペプチドＪＴＳ−１のヘリックス機構は図１に見いだされる。この図面は、Ｊ ＴＳ−１ヘリックス鎖内の疎水性および親水性表面の分配を示す。アミノ酸１６ 、９，２，１３，６，１７，１０，３，１４，７および１８は、疎水性表面から である。アミノ酸５，１２，１，８，１５，４および１１は、疎水性表面からで ある。 以下のＪＴＳペプチドを構築して溶解活性に関して特徴付けした。 上記に加えて、フソジェニックまたは膜脱安定化活性有するｎ−アシルテトラ ペプチドを構築することができる。これらの構造は図２に示される。上記のとお りに適当なアミノ酸で置換した場合のテトラペプチドは脂質２層に相互作用する ことができてそれにより脱安定化する。アシル鎖は、構造／機能の要求に依存し て長くするかまたは短くすることができる。 さらに、上記溶解特性を維持することを念頭に入れて上記デザインモチーフを 用いて、短いαヘリックスペプチドも合成した。図３は、より小さなフソジェニ ックペプチドのヘリックス機能を示す。例えば、ＬＬＥＫＬＬＥＷＬＥ（図３の ＩＶ番）は溶解特性を有するαヘリックスペプチドである。ロイシンは疎水性特 性およびαヘリックス運動のために用いた。グルタミン酸残基は溶解活性のため に用いた。これらの残基はｐＨ４．０においてαヘリックス構造を形成する性質 を有する。さらに、ＣＯＯＨ末端のアミドはヘリックス双極子の最適化を提供す るために用いる。αヘリックス構造中の場合、疎水性表面は４，７，３および１ ０位に出現する。 図３中の上記αヘリックスペプチドにＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅフソジェニック または膜破壊活性を提供するために、ペプチドを１１マーに長くした。以下のペ プチド、Ｓｕｃ−ＧＬＦＫＬＬＥＥＷＬＥを形成するために付加的なアミノ酸を 加えることにより、３つのグルタミン酸の活性が保持された。さらに、アミノ末 端においてペプチドをスクシニル化して、ヘリックスを安定化させるためにデザ インされる１からｉ＋４の塩ブリッジを与えた。ＪＴＳ−１ペプチドの合成、精製および特徴付け ＪＴＳ−１ペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ ｓｓ（Ｎ．Ｙ．１９８０）により開発された固相方法により合成した。さらに、 修飾されたポリスチレン（Ｓｐａｒｒｏｗ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４１．１ ３５０−１３５３（１９７６））および／またはポリアミド樹脂（Ｓｐａｒｒｏ ｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔ．，３８：３８５− ３９１（１９９１））をすばやくＨＢＴＵ／ＨＯＢＴカップリングして用いる。 以下の方法を用いることにより、ＩＮＦ−７も同様に合成したことは、注目すべ きである。固相合成に含まれる方法は、（１）オキシメチルフェニルアセトアミ ド結合を通した固相への保護されたカルボキシル末端アミノ酸の付着；（２）Ｎ −末端アミノ基の脱保護；（３）アミノ基の中和；（４）ペプチド樹脂への次の Ｎ−アミノ酸のカップリング；および（５）合成完了後の固相からのペプチドの 除去を含む。 特に、Ｎ−^tブチロキシカルボニル基で保護されたカルボキシルアミノ酸をブ ロモメチル−フェニル酢酸にエステル化して、直接、アミノメチル−ポリスチレ ン樹脂または付着点とポリスチレンバックボーンの間に長いスペーサー鎖を有す る樹脂にカップリングするか、または直接アミノ−プロピルポリアミド樹脂にカ ップリングする。すばやいＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ合成プロトコルにおいては、上記 方法を以下のとおり修飾して、４５分間の全プログラムを与える。トリフルオロ 酢酸（１００％）を用いることにより、６分間でアミノ基を脱保護する。ジメチ ルホルムアミド（”ＤＭＦ”）中でＨＢＴＵ／ＨＯＢＴによりＮ−^tブチロキシ カルボニルアミノ酸を活性化するために使用される過剰量のジイソプロピルエチ ルアミンにより、その結果の塩を中和する。これは、カップリング工程と中和工 程を組み合わせる。カップリング反応を１５分間進行させて、樹脂をＤＭＦおよ びジクロロメタン（”ＤＣＭ”）により大規模に洗浄した。これらの工程は、興 味のある配列が合成されるまで繰り返される。 側鎖を保護するために、以下を用いる：（１）チロシンのヒドロキシルのため の２，６−ジクロロベンジル；（２）セリンおよびスレオニンのヒドロキシルの ためのベンジル；（３）アスパラギン酸およびグルタミン酸のβ-およびｙ-カル ボキシルのためのベンジルエステル；（４）リジンのεアミノのための２−クロ ロベンジロキシバルボニル；（５）システインのスルフィドリルのためのｐ−メ トキシベンジルまたはアセトアミドメチル；（６）トリプトファンのインドール のためのホルミル；（７）ヒスチジンのイミダゾールのためのベンジルオキシメ チル；（８）アルギニンのグアニジノのためのトリメチルベンゼンスルフォニル ；および（９）グルタミンおよびアスパラギンのアミドのためのキサンタニル。 ペプチドは、１０％アニソールおよび１％エタンジオールを含む無水フッ化水 素６０ｍｌで３０分間０℃において１ｇの樹脂を処理することにより、固相から 分割した。アルギニンを含むペプチド場合、分割は−２０℃において３次間実施 する。フッ化水素は真空下で０℃において蒸発させて、エーテルでペプチドを沈 殿させる。ペプチドおよび樹脂は濾過してエーテルで洗浄する。次に、ペプチド をトリフルオロ酢酸（”ＴＦＡ”）（３×３０ｍｌ）で抽出して、ＴＦＡを真空 下で蒸発させる。ペプチドをエーテル沈殿させて、沈殿物を遠心分離により回収 する。沈殿物を１０ｍｌの１Ｍ ＴＲＩＳおよび６Ｍ ＧｎＨＣｌに懸濁する。 さらに６Ｍ ＧｎＨＣｌを３０ｍｌ添加してペプチドを完全に溶解する。溶液の ｐＨは８．０に調節する。溶解ペプチドについては、ペプチドを０．１Ｍ重炭酸 アンモニウムにより平衡化したバイオゲルＰ−２のカラムで脱塩した。ペプチド 分画は２５４ｎｍおよび２８０ｎｍの吸収に位置し、集めて凍結乾燥する。溶解 ペプチドに関しては、凍結乾燥ペプチドを２５ｍｌの６Ｍ ＧｎＨＣｌに溶解す る。 Ａ₂₈₀を用いてペプチド濃度を測定する。これは、ＪＴＳ−１または他のペプ チドに関して６Ｍグアニジン塩酸中で実施することにより、凝集が観察されない 。以下のモル吸光度定数を６Ｍグアニジン塩酸中のＪＴＳ−１に関して用いる− ５６００。 逆相ＨＰＬＣによりペプチドを精製する。以下の方法を用いた。ペプチド（５ ｍｌの６ＭＧｎＨＣｌ中５０−１００ｍｇ）を、６ＭＧｎＨＣｌ、ｐＨ６．７中 濃度を０．１Ｍリン酸アンモニウムで希釈してｐＨを確認する。この溶液は、流 速２０ｍｌ／分において０．０１Ｍリン酸アンモニウムで平衡化された２．５× ２５ｃｍＶｙｄａｃ Ｃ４カラム（２１４ＴＰ１５２０２２）上に吸入排出する 。２つのバッファーを用いることによりペプチドを溶出する：バッファーＡ（ｄ ｄＨ₂Ｏ中の０．０１Ｍ リン酸アンモニウム、ｐＨ６．７）およびバッファー Ｂ（２−プロパノール１００％）。バッファーＡおよび３０％バッファーＢとバ ッファーＡおよび５０％バッファーＢの間の直線勾配によりペプチドを溶出する 。用いられた勾配プログラムはバッファーＡから５０％バッファーＢへの４５分 間であり、固着時間は４０−４１分間である。２５４ｎｍおよび２８０ｎｍにお ける吸収によりペプチドを検出する。 ペプチド含有画分を集めて、水酸化アンモニウムによりｐＨを８．０に調節し 、そして０．１Ｍ重炭酸アンモニウムにより平衡化したバイオゲルＰ−２カラム 上で脱塩する。ペプチド含有画分を集めて凍結乾燥する。凍結乾燥後に、ペプチ ドを水に溶解する。希釈された水酸化アンモニウムを加えてｐＨを７．２に調節 してペプチドを完全に溶解する。 以下の標準を適用して合成産物の精製度を評価した：１）０．０１Ｍリン酸ア ンモニウム、ｐＨ３．０またはｐＨ６．８と２−プロパノールおよび０．１％ ＴＦＡと２−プロパノールの間の直線勾配を用いた分析用高速液体クロマトグラ フィー、２）ファストアトムボンバードメント（ｆａｓｔ ａｔｏｍ ｂｏｍｂ ａｒｄｍｅｎｔ）または電子スプレー質量スペクトロメトリー、３）正確な組成 に関するアミノ酸分析、４）自動化アミノ酸配列決定、および５）キャピラリー 電気泳動。正確なアミノ酸組成、分解および精製度のためのペプチドのアミノ酸 分析のために、ペプチド成分のモル比の定量によりペプチドの精製度を測定する 。ファストアトムボンバードメント質量スペクトロメトリー（”ＦＡＢ”）精製 度を用いて、分子量を測定できる。ＪＴＳ−１の単一ピークは期待された質量の ２３０２ａｍｕにおいて生じる。 ２次構造は、円二色およびＦＴＩＲ分光計により測定する。これらの標準法を 用いることにより、ＪＴＳ−１の２次構造を確認する。 グアニジニウム塩酸を用いることにより、精製の間ＪＴＳ−１を可溶化するの で、グアニジニウムの汚染を試験しなければならない。ＪＴＳ−１中のグアニジ ニウムおでんは、アルギニン（グアニジニウム）を測定するためのサカグチ法に より検出する。この方法は当業界においてよく知られている。ＪＴＳ−１の合成膜破壊の挙動 ＪＴＳ−１の合成膜破壊の挙動を試験するために、ＪＴＳ−１、ポリビニルピ ロリドン（”ＰＶＰ”）またはツイーン８０（界面活性剤）のいずれかを含むリ ポソームを用いて濁度の比較を実施した。リポソームは、ジミリストイルホスハ チジルコリン（”ＤＭＰＣ”）から、当業界で公知の方法により作成した。カル セインを含むホスファチジルコリン小胞を音波処理により調製した。簡単に言え ば、１０ｍｇ／ｍｌのホスファチジルコリンを窒素流下で乾燥させた。脂質を１ ００ｍＭカルセインに再懸濁して（水酸化ナトリウムによりｐＨ７．３に調節し た）、氷の浴槽中で２０分間プローブソニケーターにより音波処理した。リポソ ームはセファデックスＧ２５カラムを用いて非トラップカルセインから分離した 。カルセインの放出は蛍光分光機を用いて５２０ｎｍにおいて測定した（励起は ４７０ｎｍ）。漏れのアッセイについては、リポソームを１５０ｍＭ ＮａＣｌ 、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０または５．０により１０００倍希 釈した。蛍光はペプチド添加前および１０分後に測定した。１００％の漏れは、 最終濃度０．５％になるまでＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加することにより測定 した。濁度は、可視波長分光計上で４００ｎｍにおける見かけ吸収測定を用いて 監視した。この実験はさまざまなｐＨにおいて実施した。 最初は、すべてのリポソームが濁っていた。透明化、即ち濁度の低下は試験試 料のリポソームへの添加後の時間函数として測定した。ＪＴＳ−１およびツイー ン８０は両方共フソジェニックまたは膜破壊の挙動を示し、即ち濁度が低下した が、ＰＶＯは低下しなかった。ＪＴＳ−１は、ｐＨ７．０よりもｐＨ５．０にお いて、ホスファチジルコリンリポソームを高い程度で溶解した。 ツイーン８０は陽性対照として用いられたことは注目されるべきである。ツイ ーン８０は乳化作用を引き起こす油と水の界面において濃縮する表面活性剤であ る。そのような特性により、ツイーン８０は合成リポソームの膜を破壊できる。 ＰＶＰを用いて、何らかの活性があるか否かを観察した。ＰＶＰは、非晶質の粉 末であり、疎水性残基および親水性残基と適合可能である。それは界面活性剤と して使用することができるが、ＰＶＰはコロイド保護特性を有する。これらの特 性から、ＰＶＰは、各粒子からの表面上で薄い層を形成することにより、懸濁液 即ちリポソームの分散体が合体することを防止する表面活性か物質として作用す る。さらに、上記アッセイはＪＴＳ−１に代えてＩＮＦ−７を用いても実施され た（以下のＩＮＦ−７の記載を参照されたい）。ＩＮＦ−７は、ホスファチジル コリンリポソーム上においてｐＨ依存性膜活性を示した。ＩＮＦ−７の活性はＪ ＴＳ−１の活性よりも約８倍低かった。ＪＴＳペプチドの溶血活性 ＪＴＳペプチドの赤血球を溶解する能力に関して研究した。赤血球は当業界に おいて公知の方法により単離した。溶血アッセイは文献にしたがって実施した。 赤血球の溶解アッセイは、バクテリア毒素および膜活性ペプチドの膜活性を測定 するのに以前に用いられた。ヒトの赤血球はリン酸緩衝塩溶液により３回洗浄し て、７×１０⁷／ｍｌの濃度において１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸 ナトリウム、ｐＨ７．０または５．０に懸濁した。１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０または５．０にて９６ウエルのプレート中 でペプチドを連続希釈した。次に、７５μｌの洗浄して懸濁液を各ウエルに加え た。プレートをｐＨ７．０または５．０にて６０分間３７℃において時折撹拌し ながらインキュベートした。未溶解の赤血球を沈殿させて溶血の程度を可視によ り決定した。溶血ユニット（ＨＵ）は、５０％より高い溶血を誘導するのに必要 な蛋白質の量として定義した。すべての溶血アッセイは二重に実施した。 ＪＴＳ−１はｐＨ５．０において溶血活性があったが、ｐＨ７．０においては なかった。ｐＨ５．０において、溶血特異活性はペプチドのμｇあたり１×１０⁷ の溶解された赤血球であった。ＪＴＳ−３はｐＨ５．０においてペプチドのμ ｇあたり８×１０⁷の溶解された赤血球であったが、ＪＴＳ−９はペプチドあた り３×１０⁷の溶解された赤血球であった。 分離溶血アッセイにおいて、ｐＨが増加するとＪＴＳの溶血活性が低下したこ とがわかった。溶血活性はｐＨ５．０において強く、ｐＨ７．０において検出不 可能である。これらの研究は、ＪＴＳペプチドはｐＨ５．０において溶解活性を 高めるのに影響することを示す。ＪＴＳ−１およびインフルエンザ（”ＩＮＦ−７”）ペプチドを比較する溶血ア ッセイ ＪＴＳ−１およびＩＮＦ−７ペプチドの赤血球溶解能力を研究した。ＩＮＦ− ７は、ＨＡ₂、インフルエンザヘマトグルチニンの活性領域であり、インフルエ ンザウイルスのエンベロープと細胞のプラズマ膜が融合するのに必須である。Ｉ ＮＦ−７は以下のアミノ酸配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤを有 する。ヘリックス機能のアミノ酸５，１６，９，２，１３，６，１７，１０，３ および１４は疎水性表面を形成する。ヘリックス機能のアミノ酸７，１８，１１ ，４，１５，８，１および１２は親水性表面を形成する。 赤血球は当業界において公知の方法により単離した。ＩＮＦ−７およびＪＴＳ −１ペプチドの連続希釈物を、洗浄したヒト赤血球と共にｐＨ７．０およびｐＨ ５．０においてインキュベートした。１時間後、未溶解の赤血球を沈殿させた。 ５０％溶解が生じる濃度を、可視読み取りにより決定した。ＩＮＦペプチドはｐ Ｈ７．０およびｐＨ５．０のいずれにおいても溶血活性を示さなかった。上記と 同様に、ＪＴＳ−１はｐＨ５．０において溶血活性を示したがｐＨ７．０におい ては示さなかった。ｐＨ５．０において、溶血特異活性はペプチドのμｇあたり １×１０⁷の溶解された赤血球であった。ＪＴＳペプチド−リポソーム漏れアッセイ リポソーム膜活性は、リポソーム漏れ活性を試験することにより測定された。 このアッセイは、ホスファチジルコリン（”ＰＣ”）小胞からのカルセイン、蛍 光染料の放出を測定する。簡単に言えば、カルセインは、該染料の蛍光が大きく 低下する（自己クエンチング）濃度においてよく知られた方法によりリポソーム 中に封入される。リポソームを溶解剤により破壊する場合、蛍光染料はリポソー ムの外に漏れてインキュベーションバッファー中で希釈される。これは、蛍光分 光計中で追及されうる蛍光の大きな増加（脱クエンチング）を引き起こす。 リポソームは、ｐＨ範囲５．０から７．０のクエン酸ナトリウムバッファー中 で０．５μｇ／ｍｌの濃度においてＪＴＳ−１．ＪＴＳ−３およびＪＴＳ−９の モノマー形態と共にインキュベートされた。溶解剤ペプチドの添加前および５分 後に、蛍光を測定した。１００％の漏れに相当する蛍光は、界面活性剤（Ｔｒｉ ｔｏｎＸ−１００；最終濃度０．５％）によるリポソームの完全な溶解により決 定されて、得られた値はパーセンテージの漏れとしてプロットされた。 ＪＴＳ−１は、ｐＨ依存性様式においてホスファチジルコリン小胞並びに赤血 球を溶解した。ｐＨ７．０においては膜活性は観察されなかった。膜活性の急激 な増加は６．０よりも低いｐＨにおいて観察された。 対するに、インフルエンザ融合ペプチドＩＮＦ−７はリポソーム上においてｐ Ｈ依存性膜活性を示した。ＪＴＳ−１に対して、ほんのわずかな溶血活性しか観 察されなかった。さらに、ＪＴＳ−９ペプチドはＪＴＳ−１およびＪＴＳ−３の 活性よりもより潜在的であることが示された。細胞系中のＪＴＳ−１仲介発現 ＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ発現ベクターを含むＤＮＡ複合体をトランスフ ェリン／ポリ−Ｌ−リジンおよび未修飾のポリ−Ｌ−リジンと共に使用すること により、細胞中においてインビトロで発現を仲介するＪＴＳ−１の能力を試験し て、陽性粒子を創製した。試験された細胞系はＡＴＣＣから得て当業界において 公知の方法により培養した。 １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（”ＥＤＣ ”）をｐＨ７．３において用いて、分子量２０，５００のポリ−Ｌ−リジンを１ から２．０の比率でトランスフェリンにカップリングさせた。反応は室温におい て２４時間インキュベートさせたのちに、２ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭ Ｈ ＥＰＥＳ，ｐＨ７．３中に濃縮および懸濁して、ファストプロテイン液体クロマ トグラフィーシステム（”ＦＰＬＣ”）上のゲル濾過により分画した。配合体を 作成して精製すれば、ＦＰＬＣからの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析して修飾 されたトランスフェリンを含んだ画分（”ＴＦ／ＰＬＬ配合体”）のみを測定し た。これらの画分を次に集めて、複合体形成前に１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３に対して透析した。 ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターの制御下に大腸菌β−ガラクトシダー ゼ遺伝子を含むＤＮＡプラスミドＣＭＶ／β−ｇａｌをリポーター遺伝子として 用いた。該プラスミドを単離して２回のＣｓＣｌバンド形成により精製した。こ のプラスミドは当業界において完全に記載された。さらに、非修飾のポリ−Ｌ− リジンを加えて陽性粒子の創製を助けた。イオン相互作用を通してＪＴＳ−１ペ プチドを該ＤＮＡ複合体に加えて結合させた。配合体／ＤＮＡ複合体は１５０μ ｌのＨＢＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳＮｐＨ７．３あたり１５０ｍＭ ＮａＣｌ） 中で配合体を希釈して３５０μｌのＨＢＳ中に６μｌのＤＮＡを希釈してするこ とにより調製した。希釈したＤＮＡを、直接、希釈した配合体に撹拌しながら加 えた。反応は分析前室温において３０分間インキュベートさせた。インキュベー ト直後に、すべての複合体を０．８％アガロースゲルおよびＴＢＥ中の電気泳動 により分析した。 ６μｇのＤＮＡ複合体を３×１０⁵の組織培養細胞とインキュベートした。複 合体を組織培養細胞に加える前に、完全培地を除去して、５ｍＭ Ｃａ²⁺および ２％ウシ胎児血清を含む低グルコースＤＭＥＭ１ｍｌに置き換えた。３７℃にお ける２時間のインキュベート後、完全培地１．５ｍｌを組織培養細胞に加えて２ ４時間３７℃においてインキュベートし続けた。 ２４時間後、Ｘ−ｇａｌを基質として用いて細胞を染色して、β−ガラクトシ ダーゼ（β−ｇａｌ）活性の分析を測定した。以下の方法を用いることにより、 β−ガラクトシダーゼ活性を分析した。細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄する。次に 、細胞を、１５分間、１％グルタルアルデヒド（５０％ストックから）、１００ ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０および１ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む 溶液中で固定する。 細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄して、０．２％ Ｘ−ｇａｌ，１０ｍＭリン酸中 でバッファー、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ₂，３． ３ｍＭ Ｋ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆３Ｈ₂Ｏおよび３．３ｍＭ Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆含有溶 液と共に３７℃において３０−６０分間インキュベートする。 染色溶液を除去して、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄した。染色された細胞は位 相差顕微鏡（４００×）下で同定されうる。生成されたβ−ガラクトシダーゼの 実際の量を定量するために、ＯＮＰＧを細胞抽出物のアリコートと共に基質とし て用いることができる。 図４および５は、発現の結果を示す。ＭＣＡ−２６細胞を用いた場合、４０％ までの細胞が青く染色されて；３Ｔ３細胞は３０％であり；Ｓｏｌ ８細胞は２ ０％であり：４ＭＢＲ−５は５０％であり；２９３細胞は９０％であり；ヒト繊 維芽細胞は３０％であり；そしてＳＫＯＶ３細胞は１％であった。ペプチドがな い場合、青い細胞は観察されなかった。 上記に加えて、上記と同じ方法およびＳｏｌ８筋原細胞をトランスフェクトす ることにより、ＪＴＳ−１仲介発現の発現をＩＮＦ−７ペプチドと比較した。Ｊ ＴＳ−１が複合体の一部であった場合、５％までの細胞が青色に陽性染色された 。ペプチドが不在の場合、細胞は青色に染色されなかった。ＩＮＦ−７ペプチド を複合体の一部として用いた場合、ほんのわずかな青い細胞（＜０．０１％）が 観察された。トランスフェリン／ＰＬＬに対するＪＴＳ−１の比をさまざまにして用いた遺伝 子発現 トランスフェリン／ポリ−Ｌ−リジンおよび未修飾のポリ−Ｌ−リジンを有す るＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ発現ベクターを濃縮してＤＮＡ複合体を作成す ることにより、陽性粒子を創製した。上記の同じ方法を用いた。溶解ペプチドを 次にＤＮＡ複合体に加えて上記イオン相互作用を通してＤＮＡ複合体の結合させ た。さまざまな濃度のＤＮＡ複合体（５−２０μｇｍ）およびトランスフェリン −ＰＬＬに対するさまざまな比率（２．５−４２．５μｇｍ）を３×１０⁵Ｓｏ １８筋原細胞とインキュベートした。さらに、一連の実験においては、１２−１ ８μｇｍのＰＬＬも用いた。２４時間後、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した 。試験されたすべてのＪＴＳ−１／トランスフェリン−ポリ−Ｌ−リジン比にお いて、顕著なβ−ガラクトシダーゼ活性が観察された。ほとんどの場合、増加し たＪＴＳ−１濃度がトランスフェクションを高め、よってβ−ガラクトシダーゼ の発現を高めた。ＬＤＬ／ＪＴＳ複合体のヒト繊維芽細胞の取り込みおよび分解 ¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ／ＪＴＳ複合体を形成させるために、¹²⁵Ｉ−ＬＤＬをジメチル スルフォキシドに溶解して１０倍過剰の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ プロピル）カルボジイミド（”ＥＤＣ”）と共に３０分間室温においてインキュ ベートした。３０倍過剰量をリン酸バッファー中にてＪＴＳペプチドに加えて（ ８９ＫＢｇ／μｇ）、４時間室温においてインキュベートした。反応は５０倍過 剰のエタノールアミンを用いて停止させた。リン酸バッファー塩溶液で平衡化し たセファデックスＧ−２５カラムに反応混合物を通過させることにより、遊離の ＪＴＳを¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ／ＪＴＳ複合体から分離した。 １０：１のモル比で¹²⁵Ｉ−ＬＤＬに結合させたＪＴＳペプチドをヒト繊維芽 細胞と共に５時間３７℃においてインキュベートした。繊維芽細胞を単離して、 当業界において公知の方法を用いて培養した。ＪＴＳ−１，ＪＴＳ−３，ＪＴＳ −８およびＪＴＳ−９ペプチドを、取り込み／分解の研究に用いた。対照として 、ＪＴＳなしの¹²⁵Ｉ−ＬＤＬも、同じ繊維芽細胞とインキュベートして、それ に従い分析した。 ５時間のインキュベート後、細胞を回収して内在放射活性を測定した。細胞を １回氷冷ＰＢＳで洗浄して、氷冷酸塩溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、氷酢酸を用 いてｐＨ３．０に調節）で３０秒間洗浄することにより、表面結合ＬＤＬを除去 して、次に氷冷ＰＢＳ中でスクラップすることにより回収した。細胞を沈殿させ て、ＰＢＳで洗浄して、次に０．１Ｍ ＮａＯＨに溶解した。半分を蛋白質の測 定（ＢＣＡ−蛋白質アッセイ）に用いて、残りの半分をシンチレーションカウン ターで計数した。競争に関しては、¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ／ＪＴＳ複合体とインキュベ ートする前に、１００倍モル過剰のＬＤＬを加えた。 ¹²⁵Ｉ−ＬＤＬの結合および取り込みは影響されなかったが、ＪＴＳペプチド は分解を５０％減じた。ＬＤＬの取り込みがＪＴＳペプチドに特異的であること を保証するために、２０倍過剰の冷却ＬＤＬの存在下で実験を繰り返した。これ らの条件下では、¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ−ＪＴＳの細胞取り込みの９０％以上が阻害さ れた。¹²⁵Ｉ−ＬＤＬを受容した細胞は、強い核周囲の蛍光を示した。ＪＴＳペ プチドと¹²⁵Ｉ−ＬＤＬの両方を受容した細胞は、拡散細胞内蛍光を有した。エ ンドソームの酸化をブロックするクロロキノンを用いると、蛍光は核周囲であっ て、ＪＴＳペプチドなしで観察されたのと同じであった。 同じ研究をＨＡＥＣ細胞で実施した。ＨＡＥＣを単離して、当業界においてよ く知られた方法を用いて培養した。¹²⁵Ｉ−ＬＤＬの結合および取り込みは影響 されなかったが、ＪＴＳ−１およびＪＴＳ−８ペプチドは、用いられたＪＴＳペ プチドの量に依存して、分解を３０％減じた。ＬＤＬの取り込みがＪＴＳペプチ ドに特異的であることを示すために、２０倍過剰の冷却ＬＤＬの存在下で実験を 繰り返した。これらの条件下で、¹²⁵Ｉ−ＬＤＬ−ＪＴＳの細胞取り込みの９０ ％以上が阻害された。Ｋ_Nペプチド類似体および誘導体 式中のＮが１−４０である、式：ＹＫＡ（Ｋ）_NＷＫを有するさまざまなペプ チドを合成した。Ｋ_Nペプチドに関するこの一般式、より特定すればＫ₈を図６に 示す。リジン（”Ｋ”）は結合分子として作用する。チロシンは一部Ａ₂₈₀の原 因となり、インビトロのトラッキング（ｔｒａｃｋｉｎｇ）のためのイオン化も 可能にする。トリプトファンは、インターカレーションを通してＤＮＡとの相互 作用の安定性を増加させて、ＤＮＡとの相互作用に際して消滅するフルオロフォ アも提供する。図６中のＲがトリプトファンの場合、より小さな粒子が得られて 、改良されたトランスフェクションが生じる。さらに、該Ｒ基は同じ効果を達成 する他のＲ基により置換することもできる。アラニンは、より安定な複合体をも たらすよりヘリカルな様式におて、チロシンおよび他の隣接リジン残基がＤＮＡ の回りに包まれることを可能にするリンカーを提供する。 これらのペプチドとＤＮＡの相互作用の大規模な特徴付けを各々のペプチドに 関して実施した。これらの実験においては、時間依存性、ペプチド濃度、および 形成されたペプチド−ＤＮＡ複合体上のペプチド内のリジンの数を試験した。Ｋ_N ペプチドおよびＤＮＡポリマーの間に形成された濃縮物は、ペプチドのｌｙｓ ：ＤＮＡのリン酸の相対比がほぼ１：１の場合に凝集する傾向を有する。これは 、より低分子量のペプチドに関して、より断定される。高分子量のペプチドは、 よ り小さく且つより単分散性の粒子をもたらす傾向がある。一定のｌｙｓ：リン酸 比においては、濃縮された粒子のサイズはＤＮＡ濃度の増加に伴い増加する傾向 がある。 Ｋ₈活性を最適化するための変更物も有用である。Ｋ₈ペプチドはポリリジンの オクタマーを含む。カチオンペプチドの核酸濃縮活性を最適化するために、図７ に示されるとおり、側鎖の長さおよび荷電基の変更物を作成する。コアのカチオ ンオリゴマーにおいて導入された修飾は、側鎖のカチオン基およびペプチドのバ ックボーンの間に置かれたメチレンの数を低下または増加させる。例えば、図７ はカチオン基の間の距離を変更するペプチドバックボーンスペーサーの使用を示 すが、但し、カチオン基は置換されたアミノ酸のα−アミノ基であり、例えばＫ₈ に関してはそれはリジンのα−アミノ基である。同様に、ＮＨ₂−およびＣＯＯ Ｈ−末端置換および欠失を用いることにより、該分子のＤＮＡ結合を最適化する こともできる。例えば、ＮＨ₂およびＣＯＯＨ末端のアシル基の変更は高められ た活性を生じるかもしれない。荷電された官能基またはカチオン性の基は、グア ニジニウム、アミンまたはイミダゾールを含む。さらに、ＮＨ₂−およびＣＯＯ Ｈ−末端の変更は、エステル、アシル基およびアミド並びに欠失を含む。 上記に加え、対合する核酸を濃縮するためにペプチドのバックボーン中におい て、アミノ荷電基を置換することもできる。式ψ［ＣＨ₂ＮＨ］のシュードペプ チドはコアリジン配列内で置換される場合に（図８を参照されたい）、安定性を 改良して、核酸のリン酸との静電相互作用を高める。式中のＸがヘテロ原子であ るψ［（ＣＨ₂）ｎＸ］を用いた他の可能性のある置換は、核酸を濃縮するため に有用な分子内イオン相互作用を最適化することを助けうる。 他の修飾は、プラズマ半減期、分解抵抗性、溶解性および抗原性並びに免疫原 性の低下を増大させるペギル化された（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）Ｋ_Nペプチド類似 体を含む。図９は、リジンのペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）のための模式図 を概要する。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｎ−（ε−ＰＥＧ）−ＯＨを合成すれば、それ を、Ｋ_Nペプチドの固相合成に用いることができる。 以下のＫ_Nペプチドを構築して特徴付けた。 K40−短いＮＬＳ（Ｔｙｒのα−アミノおよびＬｙｓ−２のε−アミノ基 において付着した） K40−長いＮＬＳ（Ｔｙｒのα−アミノおよびＬｙｓ−２のε−アミノ基 において付着した）Ｋ_Nペプチドの合成、精製および特徴付け ペプチドは上記ＪＴＳペプチドに関する記載のとおりに合成した。さらに、ペ プチドは、ＪＴＳペプチドに関する記載に以下の変更を加えて固相支持体から分 割した。エーテルでペプチドを沈殿後、沈殿物を同じ溶液に懸濁したが、しかし 、水を６Ｍ ＧｎＨＣｌに代えて、ｐＨを上記で用いた８．０に代えて３．５に 調節した。さらに、、ＪＴＳペプチドに関して居合された０．１Ｍアンモニウム の代えて５％酢酸で平衡化したバイオゲルＰ−２カラム上でペプチドを脱塩した 。回収されたペプチドを凍結乾燥した後、溶解ペプチドについての６Ｍ ＧｎＨ Ｃｌに代えて水２５ｍｌ中に溶解した。 Ａ₂₈₀を用いてペプチド濃度を測定する。これは、凝集が観察されないように 、Ｋ_Nに関しては水中で実施する。以下のモル吸光定数をＫ８に関して用いる− ６８６０。 ペプチドは逆相ＨＰＬＣにより精製する。ペプチド（５ｍｌ水中の５０−１０ ０ｍｇ）を２０ｍｌの１％ ＴＦＡに溶解して、０．１％ ＴＦＡ（バッファー Ａ）で平衡化した２．５×２５ｃｍのＶｙｄａｃ Ｃ１８カラム（２１８ＴＰ１ ５２０２２，３００Åポアサイズ）上に溶液をポンプでくみ上げる。このペプチ ドを、０．１％ ＴＦＡと０．１％ ＴＦＡ、１０％ ２−プロパノールの間の 直線勾配を用いて、２０ｍｌ／分の流速で溶出する。用いた勾配は１００％Ａか ら１０％Ｂ３０分間である。 次に、カラムを１０％Ｂから９０％Ｂで５分間、９０％Ｂで５分間、次に９０ ％Ｂから１００％Ａで５分間洗浄する。固着時間は６．０から６．８である。ペ プチドは２５４ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸収により検出される。ペプチド 含有画分を集めて、凍らせて凍結乾燥する。次に、ペプチドを水に溶解する。精 製度は分析用逆相ＨＰＬＣにより確認する。 精製度および分子量は電子スプレー質量分光機（”ＥＳＭＳ”）により測定す る。ＥＳＭＳをＫ₈ペプチドに関して実施する。Ｋ₈に関する単一ピークは１７２ ０ａｍｕの予測された質量において生じる。分解および精製度は、ペプチドのア ミノ酸分析により測定される。ペプチド成分のモル比の定量はペプチドの精製度 を決定する。 ２次構造は円二色およびＦＩＴＲ分光計により測定される。これらの標準法を 用いることにより、Ｋ₈および他のＫ_Nペプチドの２次構造を確認する。Ｋ_N細胞毒性研究 ポリ−Ｌ−リジンをＤＮＡ／蛋白質複合体と共に用いた以前の研究は、ｎｍ濃 度における生きた細胞への毒性を示した。これは、そのようなポリ−Ｌ−リジン の一般的な応用を限定する。そのようなペプチドは平均５０−２００の鎖長であ った。そのような毒性を避けるために、Ｋ_Nペプチドを構築した。これらの短い ポリリジンペプチドを上記のとおりに合成したが、例えば、Ｋ₈は８つのリジン の中心クラスターを含む。Ｋ_Nペプチドが細胞に対して毒性ではないことを示す ために、ＨｅｐＧ２細胞をＫ₈およびＰＬＬとインキュベートした。ＨｅｐＧ２ は肝細胞系であり、当業界において公知の標準法を用いて培養した。ＨｅｐＧ２ 細胞はＫ₈またはポリ−Ｌ−リジン（１００マー）の濃度を増加させて３７℃に おいて２４時間インキュベートし、その後、生きた細胞を計数した。０．１μＭ より大きいポリ−Ｌ−リジン濃度はＨｅｐＧ２細胞を死なせた。対照的に、試験 さ れた最も高い濃度である１００μＭまでのＫ₈は毒性が観察されなかった。これ は、Ｋ₈がＨｅｐＧ２細胞に関してはポリ−Ｌ−リジンよりも少なくとも１００ 倍未満毒性が低いことを示す。Ｃ₂Ｃ₁₂筋管中のＤＮＡ／Ｋ_Nトランスフェクション効率 Ｋ_Nペプチドのトランスフェクション効率を測定するために、Ｃ₂Ｃ₁₂筋管にＫ_N ／ＤＮＡ複合体をトランスフェクトした。 フィッシュブランド培養管中のウエルあたり３００μｌを含む体積で各々のウ エルにＤＮＡを加えた。ＤＮＡを含む各ウエルにＫ_Nペプチドを加えて、次に２ つの溶液を混合する前にボルテックス撹拌する。次に、サンプルを少なくとも３ ０分間おく。 以下の研究におけるとおり、ＪＴＳ−１ペプチドを添加され、次に各ＤＮＡ− Ｋ_NペプチドサンプルにＪＴＳ−１を加えて、２つの溶液を混合する前にボルテ ックス撹拌する。次に、サンプルを少なくとも３０分間おく。 １０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のＣ₂Ｃ₁₂筋管をトランスフェクション３０− ５０分前にインキュベートする。次に、３００μｌの溶液複合体を２４ウエルプ レート中の各ウエルに加え、３７℃において５時間インキュベートする。５時間 後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ１ｍｌを加える。 各ウエル（２４ウエルプレート）に１００μｌの溶解液を加えることにより、 細胞抽出物を調製する。細胞をミクロ遠心管に移し代えて、４℃において１０分 間遠心分離することにより、あらゆる残渣を沈殿させる。上清を新らしいミクロ 遠心管に移して、未来の使用まで、すべての細胞抽出物を−７０℃にて凍結させ る。 細胞抽出物をｄｄＨ₂Ｏにより５０倍希釈する。５−２０μｌアリコート中の 細胞抽出物を希釈して、全体積を２０μｌとする。反応］バッファー（２００ｍ ｌ）をサンプルと共にルミノメーター管に加えて、混合して、次に室温において ２−３時間インキュベートする。次に、３００μｌの促進剤を注入してサンプル を計数する。 ２日後に細胞を回収してβ−ガラクトシダーゼ活性を観察する。化学発光アッ セイを記載されたとおりに実施する。 図１０は、Ｃ₂Ｃ₁₂筋管中のトランスフェクション効率に対するＫ_Nペプチドの 分子量の効果を示すグラフである。用いられたペプチド（Ｋ₅，Ｋ₆，Ｋ₇および Ｋ₈）のうち、Ｋ₈がＣ₂Ｃ₁₂筋管においてもっとも高いトランスフェクション効 果を提供した。核局在配列（”ＮＬＳ”）Ｋ_N 上記特徴に加えて、Ｋ₈は核標的能力も有する。ペプチドＧＹＧＰＰＫＫＫＲ ＫＶＥＡＰＹＫＡ（Ｋ）_NＷＫを含む核局在リガンドを用いることにより、上記 と同じ方法で核結合分子を形成させた。チロシンを¹²⁵Ｉ取り込みに用いて結合 パラメーターを定量してＤＮＡ複合体のストイキオメトリーを測定することがで きる。ＤＮＡへのペプチドの結合はトリプトファンの蛍光を消滅させて、複合体 形成の動力学および熱力学が決定されることになる。ＥＡＰ配列の機能はリジン バックボーンの右側において核局在配列ＧＹＧＰＰＫＫＫＲＫＶに広がる。ペプ チドは、逆相ＨＰＬＣにより均一化され、電子スプレー質量分光計により決定さ れた予測分子量を有する。ＪＴＳ−１のＫ₈へのカップリングまたは対合 ＪＴＳとＫ₈は、ＪＴＳ−１とＫ₈を共有結合させることにより図１１に描写さ れた２機能性濃縮／エンドソームペプチドを形成することができる。ＪＴＳ−１ ペプチドを１６μＭの濃度のＫ₈ペプチドと、最終濃度１３０μＭ（低ＥＤＣ） から２６００μＭ（高ＥＤＣ）の濃度の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と共に最終体積４ｍｌにおいて化合した。 氷上で４時間インキュベートして未反応成分を、１．３５ｇ／ｍｌのＣｓＣｌ濃 度のＣｓＣｌ勾配中で１８時間の超遠心分離（１５０，０００×ｇ）により除去 した後、ＪＴＳ−１／Ｋ₈複合体は図１１に示される。複合体形成において用い たＤＮＡはプラスミドｐＣＭＶ／βＧａｌであったが、該プラスミドはＣＭＶプ ロモーター制御下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む。この複合体は以下のと おりに構築された。 ＪＴＳ−１／Ｋ₈／ＤＮＡ複合体は、２５０μｌのＨＢＳ中の１０μｇのＤＮ Ａを２５０μｌ中のＪＴＳ−１／Ｋ₈配合体に加えて、連続撹拌して、次に室温 において３０分間インキュベートすることにより作成した。上記のとおりに、Ｊ ＴＳ−１／Ｋ₈配合体を合成して精製した。ＤＮＡ分子上の電荷を７５％中和す るために、十分なＪＴＳ−１／Ｋ₈配合体を用いた。複合体形成後、複合体を電 子顕微鏡により分析するかまたは分析のために細胞系と共に用いた。 上記に加えて、ＬＤＬ−リセプター遺伝子／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体も上記の とおりに構築した。ＬＤＬ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体を用いて、上記トランスフ ェクション法により繊維芽細胞をトランスフェクトした。これらの複合体はワタ ナベ繊維芽細胞中のＬＤＬ−リセプターの機能発現に通じた（以下を参照された い）。ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体はさまざまな細胞系内で高いレベルの遺 伝子発現を仲介した（以下を参照されたい）。 ＪＴＳ−１とＫ₈は非共有対合させることもできる。核酸、Ｋ₈およびＪＴＳ− １は、ＤＮＡの陰性電荷（リン酸基）並びにＪＴＳ−１の陰性電荷（５α−カル ボキシル基）、およびＫ₈の陽性電荷（１０ε−アミノ基）を濃縮することのみ により、ＤＮＡ、Ｋ₈およびＪＴＳ−１の相違比を計算して、対合された。５０ ０ｍｌのシュークロース中６μｇのＤＮＡを、アミノ基比１：２，１：３または １：４においてリン酸と混合した。室温における３０分間のインキュベーション 後、７−３８ｍＭのＪＴＳ−１を加えて、陽性荷電、中性または陰性荷電のＤＮ Ａ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体のいずれかを創製した。陽性荷電複合体は全＋／− 荷電比０．６６から０．７を有し、中性複合体は１：１の比を有し、そして陰性 荷電複合体は１：１．５の比を有した。ＤＮＡ／Ｋ₈／ＩＮＦ−７も上記と同様 にして調製することができた。効率よいトランスフェクションのために、好まし い態様は核酸／Ｋ₈／ＪＴＳ−１の相対荷電比１／ｘ／ｙを利用したが、その際 、ｘ＞１であり、そして０．２５＜ｙ＜２（ｘ＝Ｋ₈；ｙ＝ＪＴＳ−１）であっ た。最適なトランスフェクションは２＜ｘ＜６および０．７５＜ｙ＜２を用いた 場合に生じる。ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の粒子サイズに対するｐＨの効果 以下はＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の特徴を知るのに有用である。１００ μｇ／ｍｌのｐＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の粒子サイズに対するｐＨの効 果を試験した。複合体は上記のとおりに形成させた。ｐＨがｐＨ７より低くなる と、ＪＴＳ−１は複合体を沈殿させた。ｐＨは９より高くなると、Ｋ₈は脱プロ トン化して（ｄｅｐｒｏｔｏｎａｔｅ）、ＤＮＡへの効果的な結合能力を損失す る。即ち、複合体は離れることになる。したがって、複合体のための最適なｐＨ はｐＨ７−９の間である。ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の粒子サイズに対するＮａＣｌ濃度の効果 以下はＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の特徴を知るのに有用である。０．１ −０．４Ｍ ＮａＣｌから、増加した塩濃度はイオン雰囲気スクリーニングを通 してデバイ長（Ｄｅｂｙｅ ｌｅｎｇｔｈ）を低下させることにより、複合体粒 子間の静電析力を低下させる。これは、粒子が凝集する機会を増やす。粒子は、 秒あたりの計数を大きく低下させることにより示されるとおりの０．４Ｍ Ｎａ Ｃｌにより、完全に脱複合する。ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の粒子サイズに対する異なる等張溶液の効果 以下はＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の特徴を知るのに有用である。１００ および２５０μｇ／ｍｌのＤＮＡ両者を異なる等張溶液内で試験して、粒子サイ ズに何らかの作用が有ったかを測定した。マニトール溶液は、小さなサイズの粒 子を提供した。粒子サイズは、等張トレハロース、シュークロース、ラクトース 、マニトールまたはＮａＣｌに加えて１時間後同じままであった。１００μｇ／ｍｌのＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体に対するツイーン８０の効 果 以下はＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の特徴を知るのに有用である。粒子サ イズに対するツイーン８０の効果を試験した。複合体を注射のために水中に（” ＷＦＩ”）および５％マニトール中に溶解した。ツイーン８０は粒子サイズを高 めなかった。粒子サイズに対するペプチド−ＤＮＡ複合体の濾過の効果 以下はＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の特徴を知るのに有用である。粒子サ イズに対するペプチド−ＤＮＡ複合体の濾過の効果を研究した。１００−５００ μｇ／ｍｌの範囲のＤＮＡ調製物を用いた。結果は、ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１ 複合体の濾過後にも大きな粒子が存在することを示す。Ｋ₈／ＤＮＡ／ＪＴＳ−１複合体の連続添加および濾過の効果 以下はＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の特徴を知るのに有用である。Ｋ₈／Ｄ ＮＡ／ＪＴＳ−１複合体の連続添加および濾過の効果を試験した。１００μｇ／ ｍｌ増加分（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ）中のＤＮＡ調製物を試験した。小さな粒子（ ＜２００ｎｍ）が得られたが、溶液中のＤＮＡおよびペプチド物質の量の限界が 存在する。すべての粒子は安定であり注射に適しているらしい。ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１の小さな複合体を得るための凝集体の遠心分離の効果 以下はＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の特徴を知るのに有用である。凝集体 の遠心分離効果を試験した。粒子サイズは、１１，０００から１４，０００ｒｐ ｍの範囲の選択速度における遠心分離を用いて減じることができる。ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１粒子サイズおよびトランスフェクション効率に対する ＪＴＳ−１濃度の効果 以下はＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の特徴を知るのに有用である。ＪＴＳ −１の濃度を変えて、粒子サイズおよび筋管中のトランスフェクション効率への 効果を試験した。粒子サイズは５％マニトール中の４００μｇ／ｍｌのＤＮＡま たは水中の１００またはｇ／ｍｌのＤＮＡにて測定した。これらの実験から、粒 子サイズは、ＪＴＳ−１／ＤＮＡ比が０．３より大きい場合に顕著に増加するこ とが明らかである。Ｋ₆またはＫ₇ペプチドおよびＪＴＳ−１ペプチドによる４Ｍｂｒ−５気管支細胞 のトランスフェクション 図１３は、ＪＴＳ−１と共にＫ₆またはＫ₇ペプチドを用いた４Ｍｂｒ−５（サ ルの気管支上皮）細胞のトランスフェクションを試験する。ＣＭＶ−β−ガラク トシダーゼ発現ベクターをトランスフェリン／Ｋ₆またはＫ₇および未修飾Ｋ₆ま たはＫ₇により濃縮することによりＤＮＡ複合体を作成して、陽性粒子を創製し た。次に、溶解ペプチドを加えて、イオン相互作用を通してＤＮＡ複合体に結合 させた。４Ｍｂｒ細胞を用いるトランスフェクション実験は上記に従った。３− １２μｇの間のＤＮＡ複合体を３×１０⁵の４Ｍｂｒ細胞とインキュベートした 。２４時間後、β−ガラクトシダーゼ発現のために細胞をＸ−ｇａｌにより染色 した（以下を参照されたい）。９μｇのＤＮＡ複合体を使用した場合には５０％ までの細胞が陽性に青く染色され、対するにＫ₆を用いた場合には４０％であっ た。ペプチドが不在の場合には、どの細胞も青く染色されなかった。Ｃ₂Ｃ₁₂筋肉細胞の細胞トランスフェクション Ｃ₂Ｃ₁₂筋肉細胞を用いたさらなる研究は、トランスフェクションに対する荷 電比および血清付加、並びに他の因子の効果を考慮する。上記方法を用いて、Ｃ₂ Ｃ₁₂細胞をＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体により、１／３／１の比でトランス フェクトした。２０ｍｇのＤＮＡ複合体を用いて、６０％までの細胞が陽性に青 く染色された。ペプチドが不在の場合には、いずれの細胞も染色されなかった。 比を１／３／１から１／６／１に変更した場合には、トランスフェクション率が ２倍低下した。ウエルあたり１０ｍｇのＤＮＡを用いたアッセイに血清を加えて 荷電比を１／３／１から１／６／１に変更した場合に、トランスフェクション率 が７５％だけ低下し；同じパラメーターにおいて２０ｍｇのＤＮＡを用いた場合 には、トランスフェクション比が４０％低下し；３０ｍｇのＤＮＡを用いると９ ０％であり；そして４０ｍｇのＤＮＡを用いると８０％であった。リポフクタミ ンと複合されたＤＮＡは全くトランスフェクション率を示さなかった。Ｋ₈／ＪＴＳ−１／ＤＮＡを用いたＲＡＷ２６４細胞のトランスフェクション マクロファージ（ＲＡＷ２６４）細胞中のＤＮＡトランスフェクションに対す るＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の効果、並びに滑膜細胞（ＨＩＧ８２）中の Ｋ₈／ＪＴＳ−１／ＤＮＡ複合体のトランスフェクションを研究した。上記と同 じトランスフェクション法を用いた。 ＲＡＷ２６４細胞の場合、ＤＮＡトランスフェクション効率は、少なくとも以 下のパラメーター：（１）結合分子即ち濃縮成分の存在；（２）フソジェニック 成分の存在；および（３）ＤＮＡ用量と相関しうる。ＨｅｐＧ２細胞へのＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１仲介遺伝子送達 上記のとおり、イオン相互作用によりＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体を共有 対合させた。この方法により、ＤＮＡ複合体あたりのより多い膜活性ペプチドの 添加が可能になった。ＤＮＡの陰性電荷（リン酸基）並びにＪＴＳ−１の陰性電 荷（５α−カルボキシル基）、およびＫ₈の陽性電荷（ε−アミノ基）を濃縮す ることにより、ＤＮＡ、Ｋ₈およびＪＴＳ−１の異なる比を計算した。ＤＮＡを 、アミノ基比１：２，１：３または１；４においてリン酸においてＫ₈と混合し た。次に、ＪＴＳ−１を加えて、陽性、中性または陰性荷電ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴ Ｓ−１複合体を形成した。これらの複合体は、時間をかけてゆっくりとミクロ凝 集体を形成する傾向があった。これらの複合体がＨｅｐＧ２細胞内にいて遺伝子 発現を可能にするか否かを測定するために、初期サイトメガロウイルス（”ＣＭ Ｖ”）エンハンサーおよびプロモーター制御下のフォチヌスピラリス（Ｐｈｏｔ ｌｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼ遺伝子をリポーター遺伝子として 用いた。細胞を、Ｋ₈およびＪＴＳ−１量を増加させて含むのＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴ Ｓ−１複合体とインキュベートした。遺伝子送達から２４時間後、細胞を回収し て細胞抽出物をルシフェラーゼ活性に関して分析した。 細胞をＤＮＡまたはＤＮＡとＪＴＳ−１と共にインキュベートした場合、ルシ フェラーゼ活性の顕著な増加は観察されなかった。細胞をＤＮＡ／Ｋ₈複合体と インキュベートしたら、ルシフェラーゼ活性の５０倍から１００倍の増加につな がった。ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体を細胞とインキュベートした場合、遺 伝子発現の劇的な増加が観察された。最大の遺伝子発現は少なくともバックグラ ウンドの１００，０００倍であり、リン酸対アミノ基の比１：３または１：４を 有する陽性荷電の中性ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体において達成された。細 胞をＤＮＡまたはＤＮＡと最大量のＪＴＳ−１とインキュベートした場合には、 バックグラウンド以上の遺伝子発現は観察されなかった。さらに、細胞をＤＮＡ ／Ｋ₈複合体とインキュベートすることにより、ルシフェラーゼ発現の５０−１ ００倍増加に通じた。即ち、効率よい遺伝子発現はＫ₈、並びにＪＴＳ−１を用 いることにより得られた。 遺伝子運搬はリセプターリガンド、即ちリセプターリガンドに非依存性である 。高いレベルの遺伝子発現のために、リセプターリガンドは必要ない。試験され た すべての条件下において陽性荷電および中性ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体は 陰性荷電複合体に比して２−４倍高いレベルの遺伝子発現を導いたから、細胞表 面における細胞結合イオン性相互作用は重要であるらしい。これはＤＮＡ／カチ オンリポソーム複合体に類似しており、細胞表面上のアニオン性基に結合してフ ァゴサイトーシスまたは他の未知の機構により細胞内に侵入する。リセプター非 依存性遺伝子発現は、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リジン／インフルエンザペプチド複合 体に関しても報告された。トランスフェリンのようなリガンドの存在のみが、遺 伝子発現において１．５−８倍の差異を生じた。さらに、リガンドの効果は細胞 種依存性であった。 複合体形態中のＤＮＡと遺伝子発現レベルの相関を調査するために、用量応答 曲線を実施した。１×１０⁵のＨｅｐＧ２細胞を、複合体形態中のＤＮＡ０，１ ，３，６，９，１２，１５，１８μｇとインキュベートして、遺伝子送達後にル シフェラーゼ活性を測定した。細胞と増加させた量のＤＮＡのインキュベーショ ンは非直線応答の遺伝子発現を生じた。１μｇのＤＮＡを用いて１×１０³光ユ ニット／ｍｇ蛋白質が達成され、３μｇのＤＮＡを用いて１×１０⁷光ユニット ／ｍｇ蛋白質が達成され、そして６から１５μｇのＤＮＡを用いて１×１０⁸光 ユニット／ｍｇ蛋白質が達成された。事実、６から９μｇのＤＮＡを用いた場合 に、最大レベルの遺伝子発現が達成された。より高いＤＮＡ量に関して、さらな る増加は観察されなかった。この増加の欠如はＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体 の細胞変性効果によらなかったが、細胞の形態形成は変化しておらず、且つ細胞 ホメジェネートの蛋白質濃度は顕著に低下しなかったからである。したがって、 これは閾値であり、高いレベルの遺伝子発現を達成するためには越えなければな らない。臨界数の膜活性ペプチドがエンドソーム区画内に存在することによりＤ ＮＡの細胞質への放出を仲介せねばならない。 遺伝子送達後に何パーセントの細胞がリポーター遺伝子を発現したかを測定す るために、ＣＭＶ−大腸菌β−ガラクトシダーゼ発現カセット含有プラスミドを 用いた。細胞を陽性ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体とインキュベートして、遺 伝子送達２４時間後に細胞をＸ−ｇａｌで染色した。２５から３０％の細胞がβ −ガラクトシダーゼ発現に関して陽性であった。対照的に、対照細胞においては 青い細胞は観察されなかった。ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体とＤＮＡ／Ｋ₈／ＩＮＦ−７複合体および組換え アデノウイルスベクターのの遺伝子送達活性の比較 ＤＮＡ／Ｋ₈／複合体に関してのＪＴＳ−１仲介遺伝子送達を、ＩＮＦ−７の 遺伝子運搬活性と比較した。陽性、中性および陰性電荷複合体をＤＮＡ／Ｋ₈／ ＪＴＳ−１複合体と同様に形成して、遺伝子送達２４時間後のルシフェラーゼ活 性を測定した。試験された各ＤＮＡ／Ｋ₈／ＩＮＦ−７複合体条件に関して、達 成された遺伝子発現レベルはＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体に直接比較して少 なくとも１０００倍低かった。遺伝子運搬活性におけるこの差異は、本明細書に て記載された溶血アッセイプロトコルを用いてＪＴＳ−１およびＩＮＦ−７の溶 血活性において観察された差異によく対応する。しかしながら、ペプチドの膜活 性は遺伝子送達活性を決定する唯一の因子ではない。ＪＴＳ−１配列中の単一の アミノ酸置換は遺伝子送達活性中の顕著な差異に通じる。 該新規なＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体を公知のウイルス送達系と比較する ために、ＨｅｐＧ２細胞に、上記プラスミドと同じＣＭＶ−ルシフェラーゼ発現 カセットを含む組換えアデノウイルス（Ａｄｖ／ＣＭＶ−ｌｕｃ）を感染させた 。アデノウイルスは２９３細胞内で生育させてＣｓＣｌ勾配の２回のバンド形成 により精製した。ウイルスの濃度は分光光度分析およびプラークアッセイにより 測定して、ウイルスは１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中において−７０℃にて保 存した。アデノウイルスを溶解して直後に実験に用いた。 ＨｅｐＧ２細胞を増加Ｍ．０．１．のＡｄｖ／ＣＭＶ−ｌｕｃとインキュベー トした。感染から２４時間後、細胞を回収してルシフェラーゼ活性を測定した。 Ｍ．Ｏ．Ｉ．０．１から１００の遺伝子発現において直線の増加が存在した。Ｍ ．Ｏ．Ｉ．１０００においては組換えアデノウイルスの細胞変性効果のために、 さらなる増加は観察されなかった。最大達成レベルの遺伝子発現は１０⁹光ユニ ット／ｍｇ蛋白質付近であった。これは、ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体で達 成された遺伝子発現より１０から５０倍高かった。この結果は、培養された細胞 中 における遺伝子運搬へのＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の使用能力を示す。組 換えアデノウィルスとＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体の間に観察された差異は 多くの理由によりうる。例えば、細胞質へのアデノウイルスの侵入後、ウイルス ＤＮＡの核への効率よい送達のためにウイルスは核に輸送される。この発見は重 要でありえるが、核局在配列のＤＮＡベクターへの取り込みが遺伝子発現を５か ら１０倍増加させたからである。哺乳類細胞へのＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１仲介遺伝子送達 異なる種および生物からの細胞系を試験した。上記のとおりに大腸菌β−ガラ クトシダーゼをリポーター遺伝子として用いて、細胞を陽性ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴ Ｓ−１複合体とインキュベートした（前の記載を参照されたい）。遺伝子送達２ ４時間後に、細胞をＸ−ｇａｌで染色して青い細胞のパーセンテージを測定した 。１４の細胞系のトランスフェクション効率は１から５０％の間で変わり、平均 は２３％であった。これらの結果から、ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体を用い ることにより、広範囲の細胞をインビトロにおいて形質導入することができる。 しかしながら、他の非ウイルスおよびウイルス性送達系により観察されたとおり 、効率は細胞により変化しうる。リセプター依存性遺伝子送達に関しては、細胞 の形質導入は特定のリセプターの発現レベルとうまく相関する。リセプター非依 存性遺伝子送達に関しては、細胞種の変化に関する基礎機構はよく理解されてい ないが、特にＤＮＡ／カチオンリポソーム複合体に関しては、証拠により証明さ れた。試験された細胞の種類は、繊維芽細胞、グリオーム、筋原細胞、結腸癌、 肝癌、卵巣癌および胚の腎臓を含んだ。試験された細胞系は３Ｔ３、ワタナベ、 ９Ｌ，Ｃ６，Ｃ₂Ｃ₁₂，Ｓｏｌ８，ＭＣＡ−２６，ＨＣＴ−１１６，ＭＬ３，Ｈ ｅｐＧ２，Ｓｋｏｖ３および２９３を含んだ。ワタナベ繊維芽細胞へのウサギＬＤＬ−リセプターのＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１ 仲介送達 ＬＤＬ−リセプター（”ＬＤＬ−Ｒ”）欠損は、冠動脈アテローム硬化症およ び心筋梗塞に通じるほとんどの破壊性脂質疾患のひとつである。ＬＤＬ−Ｒ遺伝 子を含む組換えアデノウイルスベクターを用いることにより、高コレステロール 血症に関する２つの動物モデルにおいてコレステロールレベルを一時的に調節し た。非ウイルスベクターがＬＤＬ−Ｒの細胞への送達に利用できるか否かを評価 するために、ワタナベ繊維芽細胞をＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体とインキュ ベートした。ワタナベ繊維芽細胞をワタナベウサギの皮膚バイオプシーから誘導 したが、ＬＤＬ−Ｒのシステイン富裕リガンド結合ドメインからの４アミノ酸を 除去する１２ヌクレオチドのインフレーム欠失を生む。この欠失はＬＤＬ粒子の ＬＤＬ−Ｒ仲介取り込みおよび分解を阻害して、プラズマのコレステロールレベ ルの劇的な増加をもたらす。プラスミドｐＡｄＬ１／ＲＳＶ−ｒｂＬＤＬ−Ｒを ＸｂａＩおよびＨｉｄＩＩＩにより消化することにより、ウサギＬＤＬリセプタ ーを含むプラスミドＣＭＶ−ｒｂＬＤＬ−Ｒを構築した。単離された断片は、Ｃ ＭＶ発現カセットを含むプラスミドｐｃＤＮＡ３中にクローン化した。 ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体を用いることにより、ＣＭＶエンハンサーお よびプロモーター制御下のウサギＬＤＬ−Ｒ（”ｒｂＬＤＬ−Ｒ”）遺伝子をワ タナベ繊維芽細胞へ送達した。遺伝子送達から２４時間後、細胞を［¹²⁵Ｉ］− 標識ヒトＬＤＬと共に５時間インキュベートして、ＬＤＬ結合／取り込みおよび 分解を測定した。研究は２００倍過剰の非標識ＬＤＬの不在および存在下で実施 した。対照細胞との比較において、ｒｂＬＤＬ−Ｒ遺伝子／Ｋ₈／ＪＴＳ−１仲 介遺伝子送達後のワタナベ繊維芽細胞におけるＬＤＬの特異的結合および取り込 みの４から５倍の増加があった。さらに、ＬＤＬ分解の２倍の増加が観察された ことから、ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体は機能的な治療用遺伝子を発現する のに利用できることが示唆される。ＬＤＬリセプター置換のこのレベルは、ＬＤ Ｌ欠損マウスまたはウサギ肝細胞におけるアデノウイルス仲介ＬＤＬリセプター 置換に比して低い。しかしながら、ＤＮＡ／ペプチド複合体は代謝性疾患を直す ことが可能であることが証明される。標的／ＤＮＡ／Ｋ₈／ＪＴＳ−１複合体 図１４−１８は、特定の細胞に核酸を直接送達するために、結合分子、例えば Ｋ₈とカップリングさせることができるか、またはＪＴＳ−１とカップリングさ せることができるさまざまな表面リガンドを示す、以下を参照されたい。肝細胞 への送達に関しては、アシアログリコプロテインリセプターによる取り込みのた めの糖質含有ペプチトを構築した（図１４および１５）。マンノースまたはマン ノース−６−リン酸リセプターをもちた細胞への送達のために、図１６のリガン ドをＪＴＳ−１またはＫ₈にカップリングさせた。以下は、これも構築されて特 徴付けられたＫ₈またはＪＴＳ−１にカップリングさせた他のリセプターのリス トである。 上記に加えて、図１７に示したとおりに、ＲＧＤ標的リガンドもＫ₈ペプチド に付着させた。そのようなリガンドは、治療用遺伝子の結合組織、創傷への送達 に、そして治癒に有用である。同様に、図１８の脂質は肝細胞への送達に用いる ことができる。細胞形質転換 本発明の一つの態様は、上記の核酸運搬体系に関連した核酸による細胞形質転 換を包含する。細胞が形質転換されたなら、該細胞は核酸によりコードされる蛋 白質、ポリペプチドおよびＲＮＡを発現する。細胞は限定されないが、肝臓、筋 肉および皮膚を含んだ。これはあらゆる様式に限定されることを意図しない。 興味のある遺伝物質を含む核酸は、核酸が形質転換細胞中でＲＮＡに転写され て、必要であれば蛋白質またはポリペプチドに翻訳されるように、宿主またはベ クター内で連続して配置される。さまざまな蛋白質およびポリペプチドが形質転 換細胞中で核酸カセット中の配列により発現されうる。これらの産物は細胞内ま たは細胞外構造嬰素、リガンド、ホルモン、神経伝達物質、成長制御因子、アポ リポプロテイン、酵素、血清蛋白質、リセプター、小分子量化合物のためのキャ リアー、薬剤、免疫変調剤、オンコジーン、腫瘍サプレッサー、毒素、腫瘍抗原 、抗原、アンチセンス阻害剤、３重鎖形成阻害剤、リボザイム、または活性修飾 の目的のための細胞構造上のリガンド認識特定構造決定素として機能してよい。 形質転換はインビボまたはエクスビボ技術のいずれかにより達成できる。当業 者は、形態質転換のためのそのような技術に精通する。エクスビボ技術による形 質転換は、選択可能なマーカーを含むＤＮＡによる細胞の共トランスフェクトを 含む。この選択可能なマーカーを用いることにより、それらの細胞は形質転換さ れることになった。選択可能なマーカーは当業者によく知られている。 例えば、肝臓疾患の遺伝子治療のための一つのアプローチは罹患する個人から 肝細胞を取り出して、一般的にはインビトロにおいてそれらを変化させ、そして 受容位置にそれらを再度移植することである。エクスビボのアプローチは、肝細 胞を回収して、該肝細胞を培養して、該肝細胞を形質導入するかまたはトランス フェクトし、そして該トランスフェクトされた細胞を罹患した個人に導入するこ とを含む。 肝細胞はさまざまな方法により得てよい。それら細胞は、形質転換された肝細 胞をのちに注射される人から取ってよいし、または形質転換されて次に目的の個 人の注射された他の源から得ることもできる。 エクスビボで肝細胞を回収したなら、核酸運搬体を含み且つ肝細胞の取り込み および形質転換に適切な条件下で十分な時間培地中で培養された肝臓細胞を維持 する培地に肝細胞を接触させることにより、形質転換してよい。次に、肝細胞を 正常な位置に（肝臓本体または門脈血管系）導入するかまたは細胞懸濁液の組織 への注入による異所の位置に導入してよい。当業者は、細胞懸濁液が、細胞を維 持するための塩、バッファーまたは栄養；細胞安定性を保証するための蛋白質； 移植細胞の血管形成および成長を促進するための因子を含んでよいことを認識で あろう。 別の方法において、回収された肝細胞は、形質導入後に正常な位置または異所 の位置に外科移植されてよい、プラスチック、ファイバーまたはゼラチン様物質 からなるマトリックス上にてエクスビボで成長させてよい。このマトリックスは 、移植された細胞の血管形成および成長を促進する因子に浸潤させてよい。次に 、細胞を再移植する。上記はほんの例示であり非限定である。投与 本明細書の投与は体内への核酸運搬体の導入ルート示す。投与は、静脈内、筋 肉内、局所または経口送達法を含む。投与は直接の標的組織への投与でもまたは 全身送達でもありうる。 特に、本発明は、細胞中で特定の核酸配列を発現させるための核酸投与に使用 できる。投与のルートは細胞内、エアロゾル、嗅覚、経口、局所、全身、眼球、 腹腔内および／または気管内を含む。核酸運搬体を投与するための好ましい方法 は、静脈内送達による。投与の他の好ましい方法は、直接の細胞内への注射であ る。 遺伝子の運搬は直接が極めて効果的であった。実験は、ＤＮＡの関節および甲 状腺への直接の注射による投与が注射エリアにおける遺伝子発現をもたらすこと を示す。ＩＬ−１含有プラスミドの関節スペースへの注射は延長された時間の遺 伝子発現をもたらす。注射されたＤＮＡは非組み込みにより染色体外の状態で維 持されるらしい。この運搬手段は好ましい態様のひとつである。 さらに、本発明の核酸運搬体を投与するための他の手段は、吸入のために乾燥 粉末を用いることによる。用いられうる一つの化合物は、ポリビニルピロリドン （”ＰＶＰ”）、非晶質粉末である。ＰＶＰはさまざまな物質と複合体を形成す るポリアミドであり、化学および生理学上不活性である。適切なＰＶＰの特定例 は、プラスドン−Ｃ（商標名）１５、分子量１０，０００およびプラスドン−Ｃ （商標名）３０、分子量５０，０００である。さらに、投与は、エアロゾル組成 物を通すかまたは噴霧器の霧への液体形態により吸入されてもよい。 任意の選択されたベクター構築物の特定の送達ルートは、核酸運搬体に関連し た核酸の特定用途に依存する。一般的に、用いられる各々の核酸運搬体の特定の 送達プログラムは、特定の標的とされた組織に関する取り込みに焦点を合わせら れ、効果が証明される。取り込みの研究は核酸の細胞内取り込み並びに選択され た特定の核酸の発現を評価する取り込みアッセイを含む。そのようなアッセイは 取り込み後の標的核酸の位置を決定して、発現された蛋白質の定常状態の濃度の 維持のための要求を確立する。次に、効果および細胞質毒性が試験される。毒性 は細胞生存性を含むばかりでなく細胞機能も含む。 運搬体に取り込まれて飲食作用を受けたＤＮＡは、本明細書にて記載されたと おり、細胞外スペースからの外来遺伝子を取り込む細胞種の範囲を増加させる。 送達のための選択された方法は、細胞質の蓄積および最適用量をもたらすべき である。用量は疾患および投与ルートに依存するが、１−１０００ｍｇ／ｋｇ体 重／日であるべきである。このレベルは、多かれ少なかれ最適用量に依存するこ とができる。治療の期間は、疾患の兆候の経過を通して伸びて、おそらくは連続 的である。用量の回数は疾患送達小胞および臨床試験の効率データに依存するで あろう。 細胞内のＤＮＡの治療レベルの確立は、取り込み及び分解速度に依存する。分 解度の低下は、ＤＮＡの細胞内半減期を延長させるであろう。使用法 筋肉への直接ＤＮＡ送達 筋ジストロフィーは、多くの異なる理由により異常な筋肉の発達をもたらす疾 患の一群である。これらの疾患は、正常な遺伝子産物の生成をもたらす本発明の 核酸運搬体を用いることにより治療することができる。本発明を用いた筋肉への 送達は、ウイルスおよび寄生虫起源の両者の複数感染に対するワクチンのさまざ まな抗原を生成する遺伝子を付与するように実施される。加齢により引き起こさ れる障害作用は、上記の核酸送達系を用いて治療することもできる。成長ホルモ ンの注射は筋肉組織の成長および増殖を促進するから、成長ホルモン遺伝子を筋 肉に送達することができ、筋肉の成長および発達の両者をもたらして、加齢の進 行の遅い部分の間で低下する。他の成長関連因子を発現する遺伝子、例えばイン スリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）を送達することができる。さらに、あらゆ る数の異なる遺伝子をこの方法により筋肉組織に送達してよい。 ＩＧＦ−１を用いることにより筋肉にＤＮＡを送達することができるが、リセ プター仲介飲食作用により細胞への取り込みを受けるからである。このポリペプ チドは７０アミノ酸の長さであり、構造上インスリンに関連した成長促進ポリペ プチドのメンバーである。それは組織の成長の制御および増殖に影響する細胞分 化および広範囲のさまざまな細胞種の代謝活性に関与するが、該ポリペプチドが 多くの種類の組織上にリセプターを有するからである。結果として、本発明の核 酸運搬体送達系は組織特異的な核酸の筋肉への送達のためのリガンドとしてＩＧ Ｆ−１を利用するからである。ＩＧＦ−１／核酸送達系の利点は、リセプター仲 介の飲食作用を通した取り込みによりリガンド／核酸複合体に接触するようにな る多数の細胞のために、送達の特異性および効果が大幅に増加するからである。 筋肉細胞への核酸送達のための特定のリガンドの使用を伴う、本発明の送達系に おける上記核酸の使用は、疾患および筋肉組織に影響する異常性の治療を提供す る。 上記に加えて、因子ＩＸも筋肉細胞に送達することができる。因子ＩＸをコー ドするＤＮＡは本発明の核酸運搬体を用いて送達することができる。結果として 、本発明の核酸運搬体送達系は、因子ＩＸ欠損であり且つそのような欠損による 疾患および異常性を受けやすい細胞を治療するために、因子ＸＩをコードする核 酸を利用する。因子ＩＸをコードするＤＮＡを、上記のとおりにＫ₈およびＪＴ Ｓ−１にカップリングするかまたは対合させることができる。該複合体は、次に 、発現のための筋肉細胞に直接送達されうる。ＤＮＡのＫ₈およびＪＴＳ−１に 対する好ましい比は、１：３：１である。上記複合体の直接の注射は好ましい。 筋肉細胞に因子ＩＸを発現する核酸を送達するための本発明の上記核酸送達系は 、筋肉組織に影響する疾患および異常性の治療を提供する。骨形成細胞への直接のＤＮＡ送達 加年の進行の間に生じる多くの他の問題があるが、一つの主要な問題は骨粗鬆 症状であり、該疾患は全骨質量および強度を低下させる。本発明の直接の核酸送 達系を用いることにより、骨の成長を促進する細胞に遺伝子を送達することがで きる。骨形成細胞は体内の主要な骨形成細胞であるが、骨衛生を助ける他の細胞 がある。骨髄の幹細胞は誘導可能な骨始原細胞（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｏｓｔｅ ｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ：ＩＯＰＣ）の集団に分化し、続いて成長 因子の誘導下で決定された骨始原細胞（Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｏｓｔｅｏｐｒ ｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ：ＤＯＰＣ）に分化する。成熟により直接骨生産 細胞になるのは、この集団の細胞である。ＩＯＰＣも筋肉および軟結合組織内に おいて見いだされる。骨形成過程に関与する他の細胞は軟骨細胞として知られて いる軟骨生産細胞である。 分化のためにＩＯＰＣを刺激することに関与することが分かった因子は、骨形 態形成蛋白質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭ Ｐ）である。この分子量１９，０００の蛋白質は無機質除去した骨から最初に同 定された。ＢＭＰに類似した他の因子は軟骨誘導因子（Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｉ ｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ：ＣＩＦ）であり、軟骨形成、軟骨カルシウム 沈着、血管侵入、カルシウム沈着軟骨の吸収、および新たな骨形成の最後の誘導 の経路を開始するためにも分化するようにＩＯＰＣを刺激するよう機能する。軟 骨誘導因子は形質転換成長因子βに類似であるとして同定された。 造骨細胞は骨の生成に関与するから、造骨細胞活性を高める遺伝子を直接これ らの細胞に送達することができる。遺伝子はＩＯＰＣおよび軟骨細胞にも送達す ることができ、造骨細胞に分化することができて、骨形成に通じる。ＢＭＰおよ びＣＩＦはこれらの細胞に遺伝子を送達するために用いることができる。これら の細胞に送達された遺伝子は骨形成または造骨細胞の増殖を促進する。ポリペプ チドＩＧＦ−１は、造骨細胞によるかまたは該ポリペプチドと軟骨細胞の相互作 用による、ポリペプチドの特定の取り込みによる可能性がある下垂体切除された ラットにおける成長を刺激し、造骨細胞の形成をもたらす。他の特定の骨細胞お よび成長因子は、骨形成に関与するさまざまな細胞との相互作用により、造骨細 胞を促進するのに用いることができる。これらの細胞種に送達されうる以下の成 長因子を発現する遺伝子の非限定例は、インスリン、インスリン様成長因子−１ 、 インスリン様成長因子−２、表皮成長因子、形質転換成長因子−α、形質転換成 長因子−β、誘導成長因子、賛成繊維芽細胞成長因子、塩基姓繊維芽細胞成長因 子、骨誘導成長因子、骨形態形成蛋白質、軟骨誘導因子、エストラジオールおよ び成長ホルモンである。これら因子のすべては造骨細胞、関連する幹細胞、およ び軟骨細胞の増殖に対して陽性の効果を有する。結果として、ＢＭＰまたはＣＩ Ｆは、本発明の核酸／蛋白質複合体の静脈内注射により、これらの成長因子を発 現する遺伝子を標的細胞に送達するための配合体として使用可能である。骨細胞 に核酸を送達するための特定のリガンドと共に本発明の送達系中の上記核酸を用 いることは、骨組織に影響する疾患および異常性の治療を提供する。滑膜細胞への直接のＤＮＡ送達 動物モデルおよびヒト疾患の関節への炎症の攻撃は、一部、局所炎症姓応答を 刺激するサイトカイン例えばＩＬ−１およびＩＬ−６の分泌により仲介される。 炎症姓反応は、これらのリガンドのためのリセプターの可溶性断片の局所分泌に より修飾されてよい。リガンドと可溶性リセプターの間の複合体は、細胞表面上 に通常は存在するリセプターへのリガンドの結合を阻害し、即ち炎症作用の刺激 を阻害する。治療は適当なサイトカイン（例えば、ＩＬ−１）のリセプターの可 溶性形態を含むベクターであって、関節構造中での高いレベルの発現を誘導する ことが可能なプロモーターを含むベクターの構築物並びにこのベクターを効率よ く取り込むことが可能な製剤からなる。次に、このＤＮＡを本発明のＤＮＡ運搬 体と共に用いる。ＩＬ−１のための阻害剤、例えば可溶性ＩＬ−１リセプターま たは天然ＩＬ−１阻害剤の分泌が局所炎症応答およびその結果の関節炎を修飾す る場合、このＤＮＡは影響された関節に直接注射される。 この方法は、多くの「自己免疫」または「コラーゲン血管」疾患を特徴付ける 関節炎のエピソードを治療するのに有用である。この方法は、炎症性関節炎によ る大きな関節のけがを予防することもできる。 上記に加えて、本発明は、以下の方法と共に用いることもできる。重大な関節 炎の現在の治療は、炎症性応答を消失させるステロイドを含む薬剤の投与を含む 。ステロイドは、全身にまたは関節スペースへの直接の注射により局所に投与で き る。 ステロイドは、細胞の細胞質ないのリセプターに結合することにより、通常は 機能する。ステロイド−リセプター複合体の形成はリセプターの構造を変化させ て、核への転移および特定遺伝子の発現の変更が可能になる。ステロイドリセプ ターの遺伝情報は、高い親和性で天然に生じるステロイドに該リセプターを結合 させるか、または非天然の合成ステロイド例えばＲＵ４８６を結合することが可 能なように作成できる。天然または合成ステロイドの処理後に天然ステロイドリ セプターが遺伝子発現を制御するのと同じ方法により、ＤＮＡに結合してステロ イドの不在下で遺伝子発現を制御できることを意味する「構成的に活性」である ステロイドリセプターを創製するために、他の修飾を作成することができる。 特に重要なのは、関節炎の治療のために利用可能な最も重要な薬剤である、グ ルココルチコイドステロイド、例えばコルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニ ソン、またはデキサメタゾンの効果である。関節炎を治療する一つのアプローチ は、核酸カセットが遺伝上修飾されたステロイドリセプターを発現させるベクタ ーを関節の細胞内に導入することであり、即ち、グルココルチコイドの効果を模 倣するが作用のためにグルココルチコイドの存在を必要としない遺伝上修飾され たステロイドリセプターである。これは、グルココルチコイド模倣リセプターと 呼ばれる。これは、グルココルチコイドリセプターのＤＮＡ結合ドメインを含む 関節の細胞内における構成的に活性なステロイドホルモンリセプターの発現によ り達成される。これは、これらの薬剤の全身毒性なしにステロイドの治療効果を 誘導する。別法として、天然または合成グルココルチコイドに高い親和性を有す るステロイドリセプター、例えばＲＵ４８６は、関節に導入することができる。 これらのリセプターは、非天然の濃度のステロイドまたは低用量の薬学上投与さ れたステロイドにより刺激された場合に、抗炎症効果の増加を及ぼす。別法とし て、新規で、通常は不活性なステロイドにより活性化されるステロイドリセプタ ーの構成により、このリセプターを取り込む細胞のみに影響するはずの薬剤の使 用を可能にする。これらの戦略は、これらの薬剤に関連した極度の全身性併発症 なしに、関節炎に対してのステロイドの治療効果を得る。特に重要なのは、特定 の細胞に対してこれらの遺伝子を別々に標的とさせて（例えば、滑膜細胞対リン パ球）、それによりこれらの細胞の活性に影響する能力である。 引用により編入される（図面も含む）、Ｖｅｇｅｔｏ，ｅｔ ａｌ．，に対す る「Ｃ末端のホルモン結合ドメインの削除を有するプロゲステロンリセプター」 と題する米国特許第５，３６４，７９１号、およびＶｅｇｅｔｏ，ｅｔ ａｌ． ，により１９９２年９月２日に出願された「変異ステロイドホルモンリセプター 、それらの使用法および遺伝子治療のたのめ分子スイッチ」と題する米国出願番 号第０７／９３９，２４６号に記載されるとおり、遺伝上修飾されたリセプター 、例えばグルココルチコ−模倣リセプターを用いることにより、グルココルチコ イド模倣活性を伴うリセプターを包含する新規ステロイドリセプターを創製する ことができる。遺伝子制御蛋白質のステロイドリセプターファミリーは、そのリ ガンドがステロイドからレチノイド、脂肪酸、ビタミン、甲状腺ホルモンおよび 他の現在未同定の小分子までを含みうるリガンド活性化転写因子の理想のセット である。これらの化合物はリセプターに結合して、亢進制御（ｕｐ−ｒｅｇｕｌ ａｔｅ）または抑制制御（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）の転写の何れかを行う 。 本発明の好ましいリセプターは、グルココルチコイドリセプターの修飾、すな わちグルココルチコイド模倣リセプターである。これらのリセプターは修飾され て、天然に生じるリガンドとは異なる構造を有するさまざまなリガンドに結合す るようになり、例えばＲＵ４８６である。例えば、削除を含むアミノ酸内のＣ末 端の小さな変化は、変更された親和性およびリガンドの変更された機能をもたら す。リガンド変異体をスクリーニングすることにより、宿主細胞自身のリセプタ ーを活性化しないリガンドに応答するようにリセプターをあつらえることができ る。 しかしながら、当業者は、さまざまな変異、例えばカルボキシル末端アミノ酸 の小さな欠失が、特定のステロイドホルモンリセプター蛋白質の有用な変異体の 創製に必要であることを認識するであろう。変異されてよいステロイドホルモン リセプターは、ステロイドホルモンリセプタースーパーファミリーを含むそれら 任意のリセプターであり、例えば、エストロジェン、プロゲステロン、グルココ ルチコイド−α、グルココルチコイド−β、ミネラルコルチコイド、アンドロジ ェン、甲状腺ホルモン、レチノイン酸のリセプター、およびビタミンＢ３のリセ プターである。さらに、他の変異ステロイド、例えばトランス抑制のみまたはト ランス活性化のみ可能なそれらをコードするＤＮＡも、本発明の範囲である。そ のようなステロイドは、トランス抑制を活性化するために、ＲＵ４８６に応答す る事ができる。 上記に加え、本発明は、以下の方法と共に使用することもできる。酵素プロス タグランジンシンターゼを阻害する薬剤は関節炎の治療において重要な薬剤であ る。これは、一部には、局所免疫応答を刺激する際の特定のプロスタグランジン の重要な役割による。サリチル酸塩は広範囲に使用される薬剤であるが、重病の 関節炎にはしばしば不十分な限定用量において投与されうる。 本発明の遺伝子運搬を用いることにより、プロスタグランジンシンターゼのア ンチセンスＲＮＡの発現により影響された関節において特異的にプロスタグラン ジンシンターゼの作用を阻害する。アンチセンスＲＮＡとプロスタグランジンシ ンターゼのｍＲＮＡの間に形成された複合体は、このｍＲＮＡの正確なプロセッ シングおよび転写を干渉して、標的とされた細胞内のこの酵素のレベルを低下さ せる。別法として、プロスタグランジン合成に必要な遺伝子の制御領域内にて３ 重ヘリックスを形成するために、ＲＮＡ分子を用いる。別法として、プロスタグ ランジン合成に必要な酵素の活性部位を結合してこの活性を阻害するＲＮＡ分子 を同定する。 別法として、プロスタグランジン代謝を変更する酵素をコードする遺伝子を関 節に運搬することができる。これらは、炎症性プロスタグランジンの化学組成ま たは濃度を変更することにより、重要な抗炎症効果を有する。 同様に、本発明は、関節の修復および再生を高めるために有用である。関節の 再生活性は、軟骨細胞が軟骨組織例えば腱および軟骨を改編および修復できない との事実により制限される。さらに、損傷に応答して生成されたコラーゲンは正 常なコラーゲンの引張り強度を欠く、異なる種類のものである。さらに、損傷コ ラーゲンは、利用可能なコラーゲナーゼにより効率よく編されない。さらに、特 定のメタロプロテイナーゼの不適切な発現は関節の破壊の構成成分である。 軟骨細胞に特異的なプロモーター（即ち、コラーゲンプロモーター）を用いた 遺伝子運搬を用いることにより、関節内の機能の修復を改良する目的で異なるコ ラーゲンまたは適切なコラーゲナーゼを発現させて瘢痕の形成を妨害する。 これらの目的のための遺伝子運搬は、軟骨細胞および滑膜細胞に接触すること になる関節スペースにＤＮＡを直接導入することにより影響される。さらに、遺 伝子が繊維芽細胞、筋原細胞、および関節組織の他の構成物により取り込まれる 場合に、遺伝子は関節の環境に広がる。肺への直接の送達 本発明の核酸運搬体は、肺に含まれる疾患例えば肺癌の進行を破棄するかまた はくい止めるのにも使用できる。一つの態様は、肺において疾患を治療するため に必要な分子をコードする核酸を送達するための静脈内投与法の使用を含む。必 要な蛋白質またはＲＮＡを発現する核酸運搬体は直接に肺または血液サプライに 注射されることができ、直接肺に到達する。さらに、エアロゾルまたは噴霧器中 の液体の使用は、所望の核酸を肺に投与するために使用できる。最後に、乾燥粉 末形態、例えば上記のＰＶＰを用いることにより、肺の疾患を治療することがで きる。乾燥粉末形態は吸引により送達される。これらの治療を用いて、選択され た核酸によりコードされる特定の蛋白質を発現させることにより、肺癌または他 の肺疾患を制御または抑圧することができる。 当業者は、本発明が、目的を実行して記載された結果および利点、並びにその 内在物を得るために適合されることを容易に認識するであろう。本明細書に記載 された変異ステロイドリセプター、並びに方法、手続き、処理、分子、特定の化 合物は好ましい態様の代表であり、例示であり、発明の範囲を限定するために意 図されたものではない。その中の変更および他の使用は、請求の範囲により定義 される発明の範囲ないに包含されることを当業者は思い浮かべるであろう。 当業者は、発明の範囲および精神から離れることなく、本明細書に開示された 発明に対して変更のための置換および修飾がなされてよいことを、容易に認識す るであろう。 明細書に言及されたすべての特許および刊行物は、発明が属する分野のレベル を示唆する。すべての特許および刊行物は、個々の刊行物が特別に且つ個別に引 用により編入されるように、本明細書に取り込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウォー，サヴィオ・エル・シー アメリカ合衆国テキサス州77096，ヒュー ストン，ラザーグレン 5343

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸に非共有結合し且つ溶解剤に対合した結合分子を含む核酸結合複合体 を含む、細胞に核酸を送達するための核酸運搬体。 ２．核酸に非共有結合した第２結合分子をさらに含む、請求項１記載の運搬体 。 ３．核酸結合複合体または第２結合分子をさらに複数含む、請求項１または２ 記載の運搬体。 ４．結合分子がＫ₈である、請求項１または２記載の運搬体。 ５．溶洗剤がＪＴＳ−１である、請求項１記載の運搬体。 ６．スペーサーにより溶解剤を結合分子に付着させた、請求項１または５記載 の運搬体。 ７．請求項１または２記載の核酸運搬体を用いて核酸を細胞に送達するために 、細胞を核酸運搬体に接触させる工程を含む方法。 ８．請求項１または２記載の核酸運搬体を投与して、核酸を細胞に送達させ、 そして細胞中で核酸を発現させる工程からなる、核酸によりヒトを治療するため の方法。 ９．請求項１または２記載の核酸運搬体により形質転換された細胞 １０．核酸に非共有結合し且つ表面リガンドに対合した第１結合分子を含む第 １核酸結合複合体；および 核酸に非共有結合し且つ溶解剤に対合した第２結合分子を含む第２核酸 結合複合体； を含む、核酸送達のための核酸運搬体。 １１．溶解剤がＪＴＳ−１である、請求項１０記載の運搬体。 １２．核酸に非共有結合した第３の結合分子をさらに含む、請求項１０記載の 運搬体。 １３．第１または第２核酸結合複合体または第３結合分子をさらに複数含む、 請求項１０または１２記載の運搬体。 １４．第１、第２または第３結合分子がＫ₈である、請求項１０または１２記 載の運搬体。 １５．表面リガンドまたは溶解剤がスペーサーにより各々の結合分子に付着さ れた、請求項１０または１１記載の運搬体。 １６．請求項１０または１２記載の核酸運搬体を用いて核酸または分子を細胞 に送達するために、細胞を核酸運搬体に接触させる工程を含む方法。 １７．請求項１０または１２記載の核酸運搬体を投与して、核酸を細胞に送達 させ、そして細胞中で核酸を発現させる工程からなる、核酸によりヒトを治療す るための方法。 １８．請求項１０または１２記載の核酸運搬体により形質転換された細胞。 １９．核酸に非共有結合し且つ表面リガンドに対合した第１結合分子を含む第 １核酸結合複合体； 核酸に非共有結合し且つ核リガンドに対合した第２結合分子を含む第２ 核酸結合複合体；および 核酸に非共有結合し且つ溶解剤に対合した第３結合分子を含む第３核酸 結合複合体； を含む、核酸送達のための核酸運搬体系。 ２０．溶解剤がＪＴＳ−１である、請求項１９記載の運搬体。 ２１．核酸に非共有結合した第４の結合分子をさらに含む、請求項１９記載の 運搬体。 ２２．第１、第２または第３核酸結合複合体または第４結合分子をさらに複数 含む、請求項１９または２１記載の運搬体。 ２３．第１、第２、第３または第４結合分子がＫ₈である、請求項１９または ２１記載の運搬体。 ２４．表面リガンド、核リガンドまたは溶解剤がスペーサーにより各々の結合 分子に付着された、請求項１９または２０記載の運搬体。 ２５．請求項１９または２１記載の核酸運搬体を用いて核酸または分子を細胞 に送達するために、細胞を核酸運搬体に接触させる工程を含む方法。 ２６．請求項１９または２１記載の核酸運搬体を投与して、核酸を細胞に送達 させ、そして細胞中で核酸を発現させる工程からなる、核酸によりヒトを治療す るための方法。 ２７．請求項１９または２１記載の核酸運搬体により形質転換された細胞。 ２８．ＪＴＳ−１またはその誘導体。 ２９．Ｋ₈またはその誘導体。 ３０．ＪＴＳ−１またはその誘導体に対合したＫ₈またはその誘導体。 ３１．ｎが１−４０である構造ＹＫＡＫ_NＷＫを有する化合物、またはその誘 導体。