ES2335386T3

ES2335386T3 - Gen fgf-21 humano y productos de expresion genica.

Info

Publication number: ES2335386T3
Application number: ES00982154T
Authority: ES
Inventors: Nobuyuki Itoh; W. Michael Kavanaugh
Original assignee: Kyoto University NUC; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Kyoto University NUC; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1999-11-18
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2010-03-26
Anticipated expiration: 2020-11-16
Also published as: EP2163626A1; WO2001036640A2; ATE446365T1; JP2003516731A; EP1232264A2; PT1232264E; AU1922101A; DE60043197D1; EP1232264B1; WO2001036640A3; CA2392103A1

Abstract

Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende: (a) un polinucleótido que codifica los aminoácidos 1 a 209 de SEQ ID NO:4; o (b) el polinucleótido complementario de (a).

Description

Gen FGF-21 humano y productos de expresión génica.

Campo técnico

La presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que codifican un miembro de la familia del factor de crecimiento fibroblástico (FGF), y a polipéptidos codificados por la secuencia del ácido nucleico.

Antecedentes de la invención

Los factores de crecimiento fibroblástico prototípicos (FGFs), FGF-1 y FGF-2, se aislaron originalmente de cerebro y pituitaria como mitógenos para los fibroblastos. Sin embargo, FGF-1 y FGF-2 están ampliamente expresados en tejidos en desarrollo y adultos, y son polipéptidos con múltiples actividades biológicas que incluyen angiogénesis, mitogénesis, diferenciación celular y reparación de tejido dañado (Baird, A. et al., Cancer Cells 3:239-243 (1991); Burgess, W.H. et al., Annu. Biochem. 58:575-606 (1989). Según la literatura publicada, la familia de FGF ahora consiste en al menos diecinueve miembros, FGF-1 a FGF-19. FGF-3 se identificó como una diana común para la activación por el virus de tumor mamario de ratón (Dickson et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 638:18-26 (1991); FGF-4 a FGF-6 se identificaron como productos oncogénicos (Yoshida et al., Ann. NY Acad. Sci. 638: 27-37 (1991)); Goldfarb et al., Ann. NY Acad. Sci. 638: 38-52 (1991); Coultier et al., Ann. NY Acad. Sci 638:53-61 (1991)). FGF-10 se identificó a partir de pulmón de rata por la reacción en cadena de la polimerasa basada en homología (PCR) (Yamasaki et al., J. Biol.. Chem. 271:15918-15921 (1996)). FGF-11 a FGF-14 (factores homólogos a FGF (FHFs) 1 a 4) se identificaron a partir de la retina humana por una combinación de secuenciación de ADNc al azar, búsquedas en bases de datos y PCR basada en homología (Smallwood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9850-9857 (1996)). FGF-15 se identificó como una diana aguas abajo de una oncoproteína quimérica de homeodominio (McWhirter et al., Development 124:3221-3232 (1997)). FGF-16, FGF-17, y FGF-18 se identificaron a partir de corazón y embriones de rata por PCR basada en homología, respectivamente (Miyake et al., Biochem. Biophys. Res. Común. 243:148-152 (1998); Hoshikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 244:187-191 (1998); Ohbayashi et al., J. Biol. Chem. 273:18161-18164 (1998)). Recientemente, FGF-19 se identificó a partir de cerebro fetal humano por búsqueda en bases de datos (Nishimura et al., Biochim. Biophys. Acta 1444:148-151 (1999)). Éstos tienen un núcleo de \sim120 restos aminoacídicos conservados con una identidad aminoacídica de \sim30 a 60%. Estos FGF también parece que juegan papeles importantes en tejidos en desarrollo y adultos. Por ello, existe la necesidad en el estado de la técnica de moléculas FGF adicionales que tienen funciones y actividades que difieren de los FGFs conocidos y de moléculas de FGF expresadas específicamente en tejidos implicados en enfermedad en seres humanos.

Compendio de la invención

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende:

(a) un polinucleótido que codifica aminoácidos del 1 al 209 de SEQ ID NO:4; o

(b) el polinucleótido complementario de (a).

Según un aspecto adicional, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende:

(a) el polinucleótido de SEQ ID NO:1; o

(b) el polinucleótido complementario de (a).

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ADN.

La invención también proporciona un método para hacer un vector recombinante que comprende insertar una molécula de ácido nucleico como se define más arriba dentro de un vector en una unión operativa con un promotor. También se proporciona un vector recombinante producido por este método.

La invención también proporciona un método para hacer una célula hospedadora recombinante que comprende introducir el vector recombinante de la invención dentro de la célula hospedadora. También se proporciona una célula hospedadora producida por este método.

Según un aspecto aún más adicional, la presente invención proporciona un método recombinante para producir un polipéptido, polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 210 de SEQ ID NO:2 o los aminoácidos 1 a 209 de SEQ ID NO:4, que comprende cultivar la célula hospedadora recombinante de la reivindicación 7 bajo condiciones tales que dicho polipéptido es expresado y recuperado.

La invención también proporciona un polipéptido aislado que comprende los aminoácidos 1 a 209 de SEQ ID NO:4, y una composición farmacéutica que comprende un polipéptido y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

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La invención también proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 9. También se proporciona un kit para detectar la presencia de polipéptido FGF-21 en una muestra de un paciente, que comprende dicho anticuerpo.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Comparación de la secuencia aminoacídica de FGF-21 humano con FGF-15 de ratón. Los asteriscos indican restos aminoacídicos de las secuencias idénticos.

Figura 2. Comparación de la secuencia aminoacídica de FGF-21 humano con FGF-19 humano. Los asteriscos indican restos aminoacídicos de las secuencias idénticos.

Figura 3. Expresión de FGF-21 en tejidos humanos.

Figura 4. Secuencia de ADN (SEQ ID NO:1) y secuencia aminoacídica (SEQ ID NO:2) de FGF-21 de ratón.

Figura 5. Secuencia de ADN (SEQ ID NO:3) y secuencia aminoacídica (SEQ ID NO:4) de FGF-21 humano.

Figura 6. Alineación de las secuencias aminoacídicas de FGF-21 humano (SEQ ID NO:4) y de ratón (SEQ ID NO:2).

Figura 7. La figura 7 proporciona el uso de codones para levaduras. El primer campo de información sobre cada línea de la tabla contiene un código de tres letras para un aminoácido. El segundo campo contiene un codón no ambiguo para ese aminoácido. El tercer campo enumera el número de incidencias de ese codón en los genes a partir de los cuales se recopila la tabla. El cuarto campo enumera el número esperado de incidencias de ese codón por 1000 codones en genes cuyo uso de codones es idéntico al recopilado en la tabla de frecuencia de codones. El último campo contiene la fracción de incidencias del codón en su familia de codones sinónima.

Figura 8. La figura 8 proporciona el uso de codones para Drosophila.

Figura 9. La figura 9 proporciona el uso de codones para E. coli.

Descripción detallada de la invención

Debido a sus potentes actividades para promover el crecimiento, la proliferación, la supervivencia y la diferenciación de una amplia variedad de tipos celulares y tisulares, los FGFs continúan siendo buscados como agentes terapéuticos para un número de diferentes indicaciones, que incluyen cicatrización de heridas, tales como afecciones músculo-esqueléticas, por ejemplo, fracturas de hueso, reparación de ligamentos y tejidos, tendinitis, bursitis, etc.; afecciones de la piel, por ejemplo, quemaduras, cortes, laceraciones, úlceras de decúbito, úlceras de cicatrización lenta etc.; protección tisular, reparación, y la inducción de angiogénesis durante infarto de miocardio e isquemia, en el tratamiento de afecciones neurológicas, por ejemplo, enfermedad neurodegenerativa y apoplejía, en el tratamiento de enfermedad ocular, que incluye degeneración macular, y similares.

Las proteínas del factor de crecimiento fibroblástico (FGF) identificadas hasta la fecha pertenecen a una familia de moléculas de señalización que regulan el crecimiento y la diferenciación de una variedad de tipos celulares. La importancia de las proteínas FGF para la fisiología y patología humana se relaciona, en parte, con sus papeles claves en embriogénesis, en desarrollo y crecimiento de vasos sanguíneos, y en crecimiento óseo. Los experimentos in vitro han demostrado un papel para FGF en la regulación del crecimiento celular y la división de las células endoteliales, células del músculo liso vascular, fibroblastos, y miocitos del esqueleto y cardiacos. Otros miembros de la familia FGF y sus papeles biológicos están descritos en Crossley et al., Development 121:439-451 (1995); Ohuchi et al., Development 124:2235-2244 (1997); Gemel et al., Genomics 35:253-257 (1996); y Ghosh et al., Cell Growth and Differentiation 7:1425-1434 (1996).

Las proteínas FGF también son importantes en la salud y en la enfermedad humana debido a su papel en el crecimiento de células cancerosas. Por ejemplo, FGF-8 se identificó como un factor de crecimiento inducido por andrógenos en células de cáncer de mama y próstata. (Tanaka et al., FABS Lett. 363:226-230 (1995) y P.N.A.S. 89:8928-8932 (1992)).

El papel de FGF en el desarrollo normal está siendo aclarado en parte por estudios de receptores de FGF. Wilke et al., Dev. Dynam. 210:41-52 (1997) encontraron que los transcritos de FGFR1, FGFR2, y FGFR3 estaban localizados en regiones específicas de la cabeza durante el desarrollo embrionario en pollos. El patrón de expresión se correlacionaba con las áreas afectadas por mutaciones de FGFR humano en el síndrome de Crouzon, una afección de formación anormal de hueso intramembranoso. Belluardo, N. et al., Jour. Comp. Neur. 379:226-246 (1997) estudiaron la localización de los ARNm de FGFR1, 2, y 3 en cerebro de rata, y encontraron especificidad celular en varias regiones del cerebro. Además, los ARNm de FGFR1 Y FGFR2 estaban expresados en células de la astroglía reactiva tras la lesión del cerebro, confirmando un papel de ciertos FGFs en enfermedades y daños cerebrales. Ozawa et al., Mol. Brain Res. 41:279-288 (1996) describieron que la expresión de FGF1 y FGF-5 aumentaba tras el nacimiento, mientras que los genes de FGF3, FGF-6, FGF-7, y FGF-8 mostraban más expresión en los estadios embrionarios tardíos que en los estadios post-natales.

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Aquí hay descritos nuevos miembros de la familia de FGF, donde la proteína de FGF es expresada en una variedad de tejidos, pero casi más abundantemente en hígado. Un polinucleótido que codifica el FGF de ratón de la invención tiene la secuencia como se muestra en SEQ ID NO:1. Un polinucleótido que codifica el FGF humano de la invención tiene la secuencia como se muestra en SEQ ID NO:3. El polinucleótido de ratón se identificó como que codifica un miembro de la familia de FGF por las regiones conservadas a través de la secuencia aminoacídica y por las regiones de homología compartidas por el polinucleótido y los genes que codifican proteínas de FGF conocidas.

Los inventores creen que FGF-21 es un miembro de la familia de FGF previamente no identificado. Hasta la fecha, se han identificado 19 proteínas de FGF humano. En muchos casos, las proteínas homólogas en otros mamíferos, particularmente ratones y ratas, también han sido identificadas. Las proteínas humanas varían en diferentes grados en términos de secuencia aminoacídica, especificidad de receptor, patrones de expresión tisular, y actividad biológica.

El FGF-21 presente difiere en secuencia de todas las proteínas FGF descritas hasta la fecha en las publicaciones. Como se discute en la presente memoria, el conocimiento sobre los papeles representados por varias proteínas de FGF continúa creciendo, pero están incompletos.

La presente invención se añade a este conocimiento describiendo que el FGF de SEQ ID NO:1 está altamente expresado en hígado, y el FGF-21 humano puede jugar un papel en el desarrollo de y en la recuperación de una enfermedad hepática. Además, FGF-21 también está expresado en testículo y timo, y por ello, puede jugar un papel en el desarrollo o recuperación de trastornos de la función testicular o la función de las células derivadas del timo. Por ello, la invención está basada en la identificación, aislamiento y secuenciación de un nuevo factor de crecimiento fibroblástico (FGF-21).

Aislamiento y análisis de ADNc de ratón que codifica FGF-21. Según la invención, se ha identificado un ADN que codifica un nuevo FGF de ratón. La secuencia nucleotídica de la región codificante total se determinó por reacción en cadena de la polimerasa mediada por ligación con adaptador usando ADNc embrionario de ratón como molde. La secuencia nucleotídica de la región codificante permitió dilucidar la secuencia aminoacídica completa de FGF de ratón (210 aminoácidos) (Figura 4). Esta proteína es denominada tentativamente FGF-21.

Aislamiento y análisis de ADNc humano que codifica FGF-21. Se localizó un gen humano que codifica FGF-21 en le extremo 5' de la región flanqueante de un gen putativo de \alpha-fucosiltransferasa humana. El ADNc que codifica la región codificante total de FGF-21 humano se amplificó a partir de ADNc de cerebro fetal por PCR usando cebadores específicos de FGF como sigue: cebador sentido: 5'agccattgatggactcggac 3' (SEQ ID NO:5); cebador antisentido: 5' tggcttcaggaagcgtagct 3' (SEQ ID NO:6).

Expresión de ARNm de FGF-21 en Tejidos de Ratón Adulto. Se examinó la expresión de ARNm de FGF-21 en los tejidos principales de ratón adulto que incluyen cerebro, corazón, pulmón, hígado, riñón, bazo, pulmón, timo, testículos, músculo, piel, e intestino delgado por la reacción en cadena de la polimerasa. Se detectó expresión de ARNm de FGF-21 a altos niveles en el hígado (Figura 3). También se vio expresión en testículo y timo. Para confirmar la expresión de ARNm de FGF-21 en tejidos de ratón, se examinó ARN (A+) de tejidos de ratón por análisis por Transferencia Northern usando una sonda de ADNc de FGF-21 de rata etiquetada con ^{32}P. Los resultados confirmaron un alto nivel de expresión en hígado de ratón. También se vio expresión en timo; se vieron grandes transcritos en tejido testicular.

En referencia a FGF-21 en la presente memoria, pretende estar construido para incluir factores de crecimiento de cualquier origen que son sustancialmente homólogos a y que son biológicamente equivalentes al FGF-21 caracterizado y descrito en la presente memoria. Tales factores de crecimiento sustancialmente homólogos pueden ser naturales de cualquier tejido o especie y, de forma similar, la actividad biológica puede estar caracterizada por cualquier número de sistemas de ensayo biológico.

El término "biológicamente equivalente" pretende significar que las composiciones de la presente invención son capaces de demostrar alguna o todas de las mismas propiedades de crecimiento de una manera similar, no necesariamente en el mismo grado que el FGF-21 aislado como se describe en la presente memoria o FGF-21 humano producido de forma recombinante de la invención.

Por "sustancialmente homólogo" quiere decir que el grado de homología de FGF-21 humano con FGF-21 de cualquier especie es superior a aquella entre FGF-21 y cualquier miembro de la familia FGF anteriormente descrito.

Identidad de secuencia o porcentaje de identidad pretende significar el porcentaje de los mismos restos entre dos secuencias, con referencia a FGF humano cuando se determina el porcentaje de identidad con FGF-21 no humano, con referencia a FGF-21 cuando se determina el porcentaje de identidad con factores de crecimiento de FGF-21 no humano, cuando las dos secuencias están alineadas usando el método Clustal (Higgins et al., Cabios 8:189-191, 1992) de alineación de secuencias múltiples en el software de biocomputación Lasergene (DNASTAR, INC, Madison, WI). En este método, se llevan a cabo múltiples alineaciones de una manera progresiva, en el cual grandes grupos de alineación son solapados usando valores de similitud calculados a partir de una serie de alineaciones en pareja. Las alineaciones de secuencia óptimas se obtienen al encontrar el máximo valor de alineación, que es el promedio de todos los valores entre los restos separados en la alineación, determinados a partir de una tabla de peso de restos que representa la probabilidad de un cambio de aminoácido que se da en dos proteínas relacionadas en un intervalo de evolución dado. Las penalizaciones para los huecos vacíos y de extensión en la alineación contribuyen al valor. Los parámetros por defecto usados con este programa son como siguen: penalización de hueco para alineación múltiple = 10; penalización de longitud de hueco para alineación múltiple = 10; valor k-tuple en alineación en pareja = 1; penalización de hueco en alineación en pareja = 3; valor ventana en alineación en pareja = 5; diagonales salvadas en alineación en pareja = 5. La tabla de peso de restos usada para el programa de alineación es PAM250 (Dayhoff et al., en Atlas of Protein Séquense and Structure, Dayhoff, Ed., NDRF, Washington, Vol. 5, supl. 3, pág. 345,
1978).

El porcentaje de conservación se calcula a partir de la alineación de más arriba añadiendo el porcentaje de restos idénticos al porcentaje de posiciones en la que los dos restos presentan una sustitución conservada (definida como que tiene un valor impar logarítmico de más de o igual a 0,3 en el la tabla de peso de restos PAM250). La conservación se denomina como FGF-21 humano cuando se determina el porcentaje de conservación con FGF-21 no humano, y se denomina como FGF-21 cuando se determina el porcentaje de conservación con factores de crecimiento de FGF-21 no humano. Los cambios de aminoácidos conservados que satisfacen este requerimiento son: R-K; E-D; Y-F; L-M; V-I; Q-H.

La invención proporciona proteínas FGF-21 o variantes de las mismas que tienen uno o más polímeros unidos covalentemente unidos a una o más cadenas laterales aminoacídicas reactivas. A modo de ejemplo, sin limitación, tales polímeros incluyen polietilenglicol (PEG), que puede estar unido a uno o más restos de sulfhidril cisteína, bloqueando así la formación de enlaces disulfuro y la agregación cuando la proteína se expone a condiciones oxidantes. Además, la pegilación de proteínas y/o muteínas de FGF-21 se espera que proporcione tales propiedades mejoradas como semi-vida aumentada, solubilidad, y resistencia a proteasas. Las proteínas y/o muteínas de FGF-21 alternativamente pueden ser modificadas por la adición covalente de polímeros a grupos amino libres como la lisina epsilon o el grupo amino N-terminal. Cisteínas y lisinas preferidas para la modificación covalente serán aquellas no implicadas en la unión a receptor o heparina o al plegamiento apropiado de la proteína. Por ejemplo, pueden ser modificadas cys 24 y cys 104. Será evidente para un experto en la materia que los métodos para ensayar la bioquímica y/o la actividad biológica de FGF-21 pueden ser empleados con el fin de determinar si la modificación de un resto aminoacídico en particular afecta a la actividad de la proteína como se desea.

Puede ser ventajoso mejorar la estabilidad de FGF-21 modificando uno o más sitios de escisión de proteasas. Así, la presente invención proporciona variantes de FGF-21 en los que han sido alterados uno o más sitios de escisión de proteasas, por, por ejemplo, sustitución de uno o más aminoácidos en el sitio de escisión con el fin de crear una variante de FGF-21 con estabilidad mejorada. Tal estabilidad de proteína mejorada puede ser beneficiosa durante la producción y/o uso terapéutico de la proteína. Un sitio preferido es un sitio monobásico dentro de dos restos de prolina, tal como el resto cercano a 160 de SEQ ID NO:4.

Los sitios de escisión de proteasas adecuados para la modificación son bien conocidos en la materia y variarán dependiendo de la aplicación en particular empleada. Por ejemplo, las sustituciones típicas podrían incluir reemplazo de lisinas o argininas con otros aminoácidos tales como alanina. La pérdida de actividad, tal como unión a receptor o unión a heparina, puede ser ensayada tal como se describe en la presente memoria.

FGF-21 también puede incluir formas híbridas y modificadas de FGF-21 que incluyen proteínas de fusión y fragmentos de FGF-21 y formas híbridas y modificadas en las que se han deleccionado o reemplazado ciertos aminoácidos y las modificaciones tales como donde uno o más aminoácidos han sido cambiados a un aminoácido modificado o aminoácido inusual y las modificaciones tales como glicosilaciones así como la forma híbrida o modificada mantienen la actividad biológica de FGF-21. Las proteínas de fusión pueden consistir en el FGF-21 de la invención o fragmente del mismo y una secuencia señal de una proteína heteróloga para promover la secreción del producto proteico.

Las proteínas de fusión que comprenden FGF-21 o un fragmento antigénico del mismo biológicamente activo pueden se producidas usando métodos conocidos en el estado de la técnica. Tales proteínas de fusión pueden ser usadas de forma terapéutica o pueden ser producidas con el fin de simplificar los procedimientos de aislamiento y purificación. Se pueden incorporar restos de histidina para permitir la purificación por cromatografía de afinidad inmovilizada en metal. Los restos EQKLISEEDL contienen el determinante antigénico reconocido por el anticuerpo monoclonal myc y puede ser incorporado para permitir la purificación por afinidad basada en el anticuerpo monoclonal myc. Se puede incorporar un sitio de escisión por trombina para permitir la escisión de la molécula en el lugar elegido; un sitio de escisión por trombina preferido consiste en restos LVPGR. La purificación de la molécula se puede facilitar incorporando una secuencia, tal como restos SAWRHPQFGG, que se une a perlas de estreptavidina paramagnéticas. Tales realizaciones se describen en WO 97/25345.

La invención además incluye moléculas quiméricas entre FGF-21 y el factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) (Reich-Slotky, R. et al., J. Biol. Chem. 270:29813-29818 (1995)). La molécula quimérica puede contener regiones específicas o fragmentos de una o ambas moléculas FGF-21 y KGF, tal como los fragmentos de FGF-21 descritos más abajo.

La invención también incluye fragmentos de FGF-21. Fragmentos preferidos de SEQ ID NO:4 y 2, respectivamente, incluyen: aminoácidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 209 (210 para SEQ ID NO:2); aminoácidos de aproximadamente 2 a aproximadamente 209 (210 para SEQ ID NO:2); aminoácidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 177; aminoácidos de aproximadamente 40 a aproximadamente 209 para SEQ ID NO:2 y aminoácidos de aproximadamente 40 a aproximadamente 177. Tales fragmentos pueden ser preparados a partir de proteínas por métodos clásicos, o por expresión de un polinucleótido que codifica el fragmento.

FGF-21, o un fragmento del mismo, puede ser producido como una proteína de fusión que comprende albúmina sérica humana (HSA) o una porción de la misma. Tales construcciones de fusión son apropiadas para potenciar la expresión del FGF-21, o fragmento del mismo, en una células hospedadora eucariótica. Porciones de HSA a modo de ejemplo incluyen el polipéptido N-terminal (aminoácidos 1-369, 1-419, y longitudes intermedias que empiezan con el aminoácido 1), como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.766.883, y a publicación WO 97/24445. Otros polipéptidos quiméricos pueden incluir una proteína de HAS con FGF-21, o fragmento del mismo, unido a cada extremo N-terminal y C-terminal de HSA. Tales construcciones de HSA se describen en la Patente de EE.UU. Nº 5.876.969.

También incluidas en el alcance de la invención están las moléculas de FGF-21 que difieren de FGF-21 natural en virtud de cambios en sitios biológicamente activos.

Se piensa que los factores de crecimiento actúan en receptores específicos. Según la invención, FGF-21 y todavía miembros desconocidos de esta familia de factores de crecimiento actúan a través de receptores específicos que tienen distintas distribuciones como se ha mostrado para otras familias de factores de crecimiento.

Ha sido identificado un hFGF-21 preferido de la presente invención. También es preferido el hFGF-21 preparado por tecnología de ADN recombinante. Incluidos dentro del alcance de la invención están los polinucleótidos, que incluyen ADN y ARN, con 80% de homología con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; preferiblemente al menos 85% de homología, más preferiblemente al menos 90% de homología, lo más preferiblemente 95% de homología. Los polinucleótidos con 96%, 97%, 98%, y 99% de homología con SEQ ID NO:1 o 3 también están incluidos. El porcentaje de homología se calcula usando métodos conocidos en el estado de la técnica. Un ejemplo no limitante de tal método es el logaritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando una búsqueda de hueco afín con una penalización de hueco abierto de 12 y una penalización de extensión de hueco de 1.

FGF-21 también puede incluir formas híbridas y modificadas de FGF-21 que incluyen proteínas de fusión y fragmentos de FGF-21 y formas híbridas y modificadas en las que han sido delecionados o reemplazados ciertos aminoácidos y las modificaciones tales como donde se han cambiado uno o más aminoácidos a un aminoácido modificado o aminoácido inusual y las modificaciones tales como las glicosilaciones así como la forma híbrida o modificada mantienen la actividad biológica de FF-21. Mantener la actividad biológica, significa que está conservada la capacidad de FGF-21 para promover el crecimiento, supervivencia o diferenciación de células sensibles, aunque no necesariamente al mismo nivel de potencia que el de FGF-21 aislado como se describe en la presente memoria o que el FGF-21 producido de forma recombinante.

También está incluido dentro del significado de sustancialmente homólogo cualquier FGF-21 que pueda ser aislado en virtud de la reacción cruzada con anticuerpos al FGF-21 descrito en la presente memoria o cuyas secuencias nucleotídicas codificantes que incluyen ADN c genómico, ARNm o ADNc puedan ser aisladas a través de hibridación con la secuencia complementaria de secuencias nucleotídicas genómicas o subgenómicas o ADNc de FF-21 de la presente memoria o fragmentos del mismo. También se apreciará por un experto en la materia que las secuencias de ADN degeneradas pueden codificar FGF-21 humano y estas también pretendían estar incluidas dentro de la presente invención como están las variantes alélicas de FGF-21.

El FGF-21 humano recombinante se puede hacer expresando las secuencias de ADN que codifican FGF-21 en una célula hospedadora transformada adecuada.. Usando métodos bien conocidos en el estado de la técnica, el ADN que codifica FGF-21 puede unirse a un vector de expresión, transformarse dentro de una célula hospedadora y condiciones establecidas que son adecuadas para la expresión de FGF-21 por la célula transformada.

El ADN que codifica FGF-21 puede manipularse para tener ventajas de uso de codón preferido de las células hospedadoras. El uso de codones en Pseudomonas aeruginosa se describe en, por ejemplo, West et al., Nucleic Acid Res. 11:9323-9335 (1988). El uso de codones en Saccharomyces cerevisiae está descrito en, por ejemplo, Lloyd et al., Nucleic Acids Res. 20:5289-5295 (1992). La preferencia de codones en Corynebacterias y una comparación con preferencia por E. coli está proporcionada por Malumbres et al., Gene 134:15-24 (1993). El uso de codones en Drosophila melanogaster está descrita en, por ejemplo, Akashi, Genetics 136:927-935 (1994). El uso de codones en levaduras también se muestra en la Figura 7, el uso de codones en Drosophila se muestra en la Figura 8, y el uso de codones para E. coli se muestra en la Figura 9.

Puede ser empleado cualquier vector de expresión adecuado para producir FGF-21 humano recombinante tal como vectores de expresión para uso en células de insecto. También pueden ser empleados sistemas de expresión de Baculovirus. Un método preferido es la expresión en células de insecto, tal como células Tr5 o Sf9, usando vector baculovirus.

La presente invención incluye secuencias de ácidos nucleicos que incluyen secuencias que codifican FGF-21 humano. También están incluidas dentro del alcance de esta invención secuencias que son sustancialmente las mismas que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican FGF-21. Estas secuencias sustancialmente las mismas pueden, por ejemplo, ser sustituidas por codones más fácilmente expresados en una célula hospedadora dada, tal como E. coli, según procedimientos conocidos y clásicos. Tales secuencias de ácidos nucleicos están incluidas dentro del alcance de esta invención.

Las secuencias de ácidos nucleicos específicos pueden ser modificadas por aquellos expertos en la materia y, por ello, todas las secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias aminoacídicas de FGF-21 también pueden ser modificadas. Por ello, la presente invención también incluye secuencia de ácidos nucleicos que hibridará con todas las secuencias de ácidos nucleicos, o complementos de las secuencias de ácidos nucleicos cuando sea apropiado, y codifica un polipéptido que tiene la actividad de supervivencia, crecimiento o diferenciación celular de FGF-21. La presente invención también incluye secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen actividad de promoción de supervivencia celular y que son reconocidas por anticuerpos que se unen a FGF-21. Los métodos y epítopos preferidos para obtener anticuerpos están descritos en el Ejemplo 4.

La presente invención también abarca vectores que comprenden elementos de regulación de la expresión unidos operativamente a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos incluidas dentro del alcance la invención. Esta invención también incluye células hospedadoras de cualquier variedad que han sido transformadas con vectores que comprenden elementos de regulación de la expresión unidos operativamente a cualquier secuencia de ácido nucleico incluida dentro del alcance de la presente invención.

También se proporcionan en la presente memoria métodos para producir FGF-21. La preparación puede ser por aislamiento a partir del medio condicionado a partir de una variedad de tipos celulares mientras que el tipo celular produzca FGF-21. Un segundo y preferido método implica la utilización de métodos recombinantes aislando u obteniendo una secuencia de ácido nucleico que codifica FGF-21, clonando la secuencia junto con secuencias reguladoras apropiadas dentro de vectores y tipos celulares adecuados, y expresando la secuencia para producir FGF-21.

Aunque FGF-21 ha sido descrito en base a su alto nivel de expresión en hígado, este factor puede actuar en otros tipos celulares. Es probable que FGF-21 actúe en células no hepáticas para promover su estado o función de supervivencia, crecimiento, diferenciación. Esta expectativa está basada en la actividad de factores de crecimiento conocidos. Los miembros de la familia de FGF actúan en tipos celulares de diferente función y origen embrionario, incluso cuando su expresión está limitada a uno o unos pocos tejidos.

Los inventores de la presente memoria han identificado que FGF-21 está expresado a un nivel superior en hígado. Esto sugiere un papel para FGF-21 en, por ejemplo, lesiones precancerosas, hepatoma, cirrosis, reparación, de enfermedades inflamatorias, trauma u otros tipos de daño y otras enfermedades del hígado. Además, FGF-21 también está expresado en timo y testículo. Esto sugiere un papel para FGF-21 en, por ejemplo, esterilidad, control de la producción de testosterona, cáncer de testículo o células asociadas, y otros trastornos de los testículos, y en trastornos de células tales como células inmunitarias derivadas del timo, por ejemplo, trastornos inmunes, leucemias y linfomas, estados de deficiencia inmune, y similares.

La presente invención también incluye composiciones terapéuticas y farmacéuticas que comprenden FGF-21 en una cantidad eficaz para tratar pacientes con enfermedad hepática y del timo, y un método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de FGF-21. Estas composiciones y métodos son útiles para tratar un número de enfermedades. Las composiciones y métodos de la presente memoria también pueden ser útiles para prevenir la degeneración y/o promover la supervivencia de otra tejidos no hepáticos, tales como promover la angiogénesis, supervivencia neuronal, cicatrización de heridas, y similares. Un experto en la materia fácilmente puede usar una variedad de ensayos conocidos en el estado de la técnica para determina si FGF-21 podría ser útil para promover la supervivencia o el funcionamiento en un tipo celular en particular. Promover la supervivencia neuronal es útil en el tratamiento de enfermedades y afecciones del sistema nervioso, que incluyen enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, daño traumático de los nervios, y enfermedad degenerativa del sistema nervioso.

En ciertas circunstancias, puede ser deseable modular o disminuir la cantidad de FGF-21 expresado. Por ello, en otro aspecto de la presente invención, pueden hacerse oligonucleótidos antisentido de FGF-21, y un método utilizado para disminuir el nivel de expresión de FGF-21 por una célula que comprende administrar uno o más oligonucleótidos antisentido de FGF-21. Por oligonucleótidos antisentido de FGF-21 se hace referencia a oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica que interacciona a través de emparejamiento de bases con una secuencia de ácido nucleico complementaria específica implicada en la expresión de FGF-21 de forma que la expresión de FGF-21 está reducida. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico específica implicada en la expresión de FGF-21 es una molécula de ADN genómico o molécula de ARNm que codifica FGF-21. Esta molécula de ADN genómico puede comprender regiones reguladoras del gen de FGF-21, o la secuencia codificante para la proteína FGF-21 madura. El término complementario a una secuencia nucleotídica en el contexto de oligonucleótidos antisentido de FGF-21 y métodos de los mismos significa complementario suficientemente a una secuencia para permitir la hibridación con esa secuencia en una célula, es decir, bajo condiciones fisiológicas. Los oligonucleótidos antisentido de FGF-21 preferiblemente comprenden una secuencia que contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 100 nucleótidos y más preferiblemente los oligonucleótidos antisentido de FGF-21 comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos. Los oligonucleótidos antisentido de FGF-21 también pueden contener una variedad de modificaciones que confieren resistencia a la degradación nucleolítica, tal como por ejemplo, linajes internucleósidos modificados (Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90:543-548 1990; Schneider y Banner, Tetrahedron Lett. 31:335, 1990, bases y/o azúcares de ácidos nucleicos modificados y similares.

Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas por cualquier ruta adecuada conocida en el estado de la técnica incluyendo por ejemplo intravenosa, subcutánea, intramuscular, transdérmica, intratecal o intracerebral. La administración puede ser o rápida como por inyección o durante un periodo de tiempo como por infusión lenta o administración de formulación de liberación lenta.

FGF-21 también puede estar unido o conjugado con agentes que proporcionan propiedades farmacéuticas o farmacodinámicas deseables. Por ejemplo, FGF-21 puede estar acoplado a cualquier sustancia conocida en el estado de la técnica para promover la penetración o transporte a través de la barrera hematoencefálica tal como un anticuerpo al receptor de transferencia, y administrado por inyección intravenosa (véase, por ejemplo, Friden et al., Science 259:373-377, 1993). Además, FGF-21 puede estar unido de forma estable a un polímero tal como polietilenglicol para obtener propiedades deseables de solubilidad, estabilidad, semi-vida y otras propiedades farmacéuticamente ventajosas. (Véase, por ejemplo, Davis et al., Enzyme Eng. 4:169-73, 1978; Burnham, Am. J. Hosp. Pharm. 51:210-218, 1994).

Normalmente, las composiciones se emplean en forma de preparaciones farmacéuticas. Tales preparaciones se hacen de una manera bien conocida en la materia farmacéutica. Una preparación preferida utiliza un vehículo de solución salina fisiológica, pero está contemplado que se puedan usar también otros vehículos farmacéuticamente aceptables tales como concentraciones fisiológicas de otras sales no tóxicas, solución acuosa de glucosa al 5 por ciento, agua estéril o similares. También puede ser deseable que esté presente en la composición un tampón salino. Tales soluciones pueden, si se desea, estar liofilizadas y almacenadas en una ampolla estéril preparada para la reconstitución por adición de agua estéril para inyección. El disolvente principal puede ser acuoso o alternativamente no acuoso. FGF-21 también puede estar incorporado dentro de una matriz sólida o semi-sólida biológicamente compatible que puede ser implantada dentro de tejidos que necesiten el tratamiento.

El vehículo también puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH, la osmolaridad, viscosidad, claridad, color, esterilidad, estabilidad, ritmo de disolución, u olor de la formulación. De forma similar, el vehículo puede contener todavía otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener la liberación o absorción o penetración a través de la barrera hematoencefálica. Tales excipientes son aquellas sustancias empleadas normalmente y tradicionalmente para formular posologías para la administración parenteral en posología en forma de monodosis o multidosis o para la infusión directa dentro del líquido cerebroespinal por infusión continua o periódica.

La administración de la dosis puede repetirse dependiendo de los parámetros farmacocinéticos de la formulación de la posología y de la ruta de administración usadas.

También está contemplado que ciertas formulaciones que contienen FGF-21 son administradas oralmente. Tales formulaciones preferiblemente están encapsuladas y formuladas con vehículos adecuados en formas de posología sólidas. Algunos ejemplos de vehículos, excipientes, y diluyentes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, fosfato cálcico, alginatos, silicato cálcico, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, gelatina, sirope, metilcelulosa, metil- y propilhidroxibenzoatos, talco, magnesio, estearato, agua, aceite mineral, y similares. Las formulaciones adicionalmente pueden incluir agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsificantes y suspensores, agentes conservantes, agentes edulcorantes o agentes saborizantes. Las composiciones pueden estar formuladas con el fin de proporcionar liberación rápida, sostenida o retardada de los ingredientes activos tras la administración al paciente empleando procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica. Las formulaciones también pueden contener sustancias que disminuyen la degradación proteolítica y promuevan la absorción tales como, por ejemplo, agentes de superficie activos.

Dependiendo del régimen de tratamiento contemplado, puede ser deseable controlar el ritmo de liberación de la proteína FGF-21 o variante de la misma para proporcionar tratamiento a largo plazo mientras se minimiza la frecuencia de administración. Tales regímenes de tratamiento pueden ser deseables, por ejemplo, cuando la proteína FGF-21 se encuentra relativamente inestable de forma que la concentración localizada de proteína activa está a un nivel eficaz para un periodo de tiempo suficiente. Por ello, por ejemplo, para ciertas enfermedades, no puede ser deseable o práctico realizar inyecciones repetidas y frecuentes. Las ventajas principales de tales sistemas de liberación sostenida incluyen liberación local selectiva de fármacos a un ritmo constante, menos fármaco necesario para tratar el estado de la enfermedad, minimización de posibles efectos secundarios, y eficacia potenciada del tratamiento. También, estas formas de sistemas de liberación son capaces de proteger fármacos que son inestables in vivo y que normalmente pueden necesitar un intervalo de posología frecuente. Bajo tales circunstancias, la liberación sostenida puede lograrse por uno de los métodos fácilmente disponibles en el estado de la técnica tal como la encapsulación de perlas de heparina-Sepharose conjugadas con FGF-21 para formar microsferas de heparina-alginato o la preparación de microsferas PLG FGF-21.

Las microsferas de heparina-alginato han sido empleadas con éxito para la liberación al tejido del Factor de Crecimiento fibroblástico Básico (Lopez et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 282(1):385-390 (1997)): De forma similar, las microsferas y películas de Alginato/heparina-Sepharose han sido usadas como vehículos de fármacos para controlar la liberación de un conjugado básico de FGF-saponina con el fin de controlar su liberación en pequeñas dosis. La adición de heparina a soluciones de bFGF evita pérdidas en la actividad que acompaña cambios en el pH o la elevación en la temperatura. Véase, por ejemplo, Gospodarowicz et al., J. Cell. Physiol. 128:475-484 (1986).

La unión de FGF-21 a heparina se puede emplear con el fin de potenciar su estabilidad tanto durante la expresión o la administración in vivo como in vitro durante varios estados de la purificación de la proteína. Por ello, por la presente invención, la heparina puede ser añadida a una solución de FGF-21 y la actividad ensayada por los métodos descritos en la presente memoria.

Las perlas de heparina-Sepharose unidas a FGF-21 pueden ser encapsuladas dentro de microsferas de alginato cálcico para permitir la liberación controlada de la proteína de FGF-21 estabilizada con heparina. Por ejemplo, las microsferas pueden ser construidas haciendo caer gota a gota una solución de alginato sódico con perlas de heparina-Sepharose unidas a FGF-21 dentro de una solución endurecedora de cloruro cálcico. Las esferas se forman instantáneamente mientras la mezcla entra en la solución endurecedora. El tamaño de la microsfera puede ajustarse haciendo pasa las perlas de heparina-Sepharose unidas a FGF-21 a través de un cilindro de área de sección reducida tal como a través de una aguja hipodérmica.

La eficacia de encapsulación puede estar determinada comparando la cantidad de factor de crecimiento encapsulado con aquel presente inicialmente en la solución. Por ejemplo, el FGF-21 puede quitarse de las perlas de heparina-Sepharose con una solución de NaCl 3 M y se pueden llevar a cabo ensayos de actividad funcional.

La dosis específica se calcula según el peso corporal aproximado o el área de superficie corporal aproximado del paciente o el volumen de espacio corporal a ocupar. La dosis también será calculada dependiendo de la ruta de administración en particular seleccionada. Un refinamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la posología apropiada para el tratamiento se hace de forma rutinaria por aquellos expertos en la materia. Tales cálculos se pueden hacer sin excesiva experimentación por los expertos en la materia en virtud de la actividad descrita en la presente memoria en preparaciones de ensayo de células diana. Las posologías exactas se determinan junto con estudios clásicos de dosis-respuesta. Se entenderá que la cantidad de la composición actualmente administrada será determinada por un médico, en virtud de las circunstancias relevantes que incluyen la condición o afecciones a ser tratadas, la elección de la composición a administrar, la edad, peso, y respuesta del paciente individual, la severidad de los síntomas del paciente, y la ruta de administración elegida.

En una realización de esta invención, FGF-21 puede ser administrado de forma terapéutica implantando vectores o células, dentro de los pacientes, capaces de producir una forma biológicamente activa de FGF-21 o un precursor de FGF-21, es decir, una molécula que pueda ser convertida fácilmente a una forma biológicamente activa de FGF-21 por el cuerpo. En una aproximación, las células que secretan FGF-21 pueden ser encapsuladas dentro de membranas semipermeables para la implantación dentro de un paciente. Las células pueden ser células que normalmente expresan FGF-21 o un precursor del mismo o las células pueden ser transformadas para expresar FGF-21 o un precursor del mismo. Se prefiere que la célula sea de origen humano y que el FGF-21 sea FGF-21 humano cuando el paciente es un ser humano. Sin embargo, las formulaciones y métodos de la presente memoria pueden ser usado para uso veterinario así como aplicaciones humanas y el término "paciente" tal como se usa en la presente memoria pretende incluir pacientes humanos y veterinarios.

Las células se pueden hacer crecer ex vivo para uso en el transplante o injerto dentro de los pacientes (Muench et al., Leuk. & Lymph. 16:1-11, 1994). En otra realización del a presente invención, FGF-21 es usado para promover la expansión ex vivo de células para transplante o injerto. Loa métodos actuales han usado sistemas de cultivo en bio-reactor que contienen factores tales como eritropoyetina, factores estimulantes de colonias, factor de células madre, e interleuquinas para expandir células progenitoras hematopoyéticas para eritrocitos, monocitos, neutrófilos, y linfocitos (Verfailie, Stem Cells 12:466-476, 1994). Estas células madre pueden ser aisladas de la médula de donantes humanos, de sangre periférica humana, o de células sanguíneas del cordón umbilical. Las células sanguíneas expandidas se usan para tratar pacientes que carecen de estas células como resultado de condiciones específicas de enfermedad o como resultado de altas dosis de quimioterapia para el tratamiento del cáncer (George, Stem Cells 12(Supl. 1):249-255, 1944). En el caso de transplante celular tras quimioterapia, se pueden llevar a cabo transplantes autólogos separando células de la médula ósea antes de la quimioterapia (para revisión, véase Rummel y Van Zant, J. Hematotherapy 3:213-218, 1994. Ya que FGF-21 se expresa en células de hígado, se cree que FGF-21 puede funcionar para prevenir o ralentizar la progresión de cambios cirróticos en células del hígado, y para promover la regeneración de células hepáticas tras daño o tras separación por cirugía de parte del hígado debido a enfermedad.

En un número de circunstancias podría ser deseable determinar los niveles de FGF-21 en un paciente. La identificación de FGF-21 junto con la presente descripción que muestra la expresión de FGF-21 proporciona la base para la conclusión de que la presencia de FGF-21 sirve una función normal fisiológica relacionada con el crecimiento y supervivencia celular. FGF-21 producido de forma endógena puede también jugar un papel en ciertas condiciones de la enfermedad.

Dado que FGF-21 está expresado en el hígado, el timo y el tejido testicular, parece que el nivel de FGF-21 puede ser alterado por una variedad de condiciones y esa cuantificación de los niveles de FGF-21 podría proporcionar información clínicamente útil. Además, en el tratamiento de condiciones degenerativas, la función fisiológica alterada o en recuperación del daño al hígado, testículo o células del timo, pueden ser administradas composiciones que contienen FGF-21 y esto puede ser deseable para lograr ciertos niveles diana de FGF-21 en el suero o en cualquier compartimento tisular deseado. Por ello, puede ser ventajoso ser capaces de monitorizar los niveles de FGF-21 en un paciente. Por consiguiente, la presente invención también proporciona métodos para detectar la presencia de FGF-21 en una muestra de un paciente.

El término "detección" tal como se usa en la presente memoria en el contexto de detectar la presencia de FGF-21 en un paciente pretende incluir determinar la cantidad de FGF-21 o la capacidad de expresar una cantidad de FGF-21 en un paciente, distinguir FGF-21 de otros factores de crecimiento, la estimación del pronóstico en términos de resultado probable de enfermedad degenerativa y posibilidad de recuperación, monitorizar los niveles de FGF-21 en un periodo de tiempo como medida de estado de la condición, y monitorizar los niveles de FGF-21 para determinar un régimen terapéutico preferido para el paciente.

Para determinar la presencia de FGF-21 en un paciente, se obtiene un muestra del paciente. La muestra puede ser una muestra de biopsia tisular o una muestra de sangre, plasma, suero, CSF o similar. FGF-21 es expresado en tejidos hepáticos, como se discute en el Ejemplo 2. Las muestras para detectar FGF-21 se pueden tomar a partir de este tejido. Cuando se evalúan los niveles de FGF-21 en el hígado, timo o testículo, una muestra preferida es una muestra tomada de estos tejidos o a partir de venas que drenan estos tejidos.

En algunos casos es deseable determinar si el gen de FGF-21 está intacto en el paciente o en un tejido o línea celular dentro del paciente. Por gen de FGF-21 intacto significa que no hay alteraciones en el gen tales como mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, rotura cromosómica, reordenamientos cromosómicos y similares donde tal alteración puede alterar la producción de FGF-21 o alterar su actividad biológica, estabilidad o similar para dar lugar a procesos de enfermedad o susceptibilidad a condiciones degenerativas celulares. Así, en una realización de la presente invención se proporciona un método para detectar y caracterizar cualquier alteración en el gen de FGF-21. El método comprende proporcionar un oligonucleótido que contiene el ADNc de FGF-21, ADN genómico o un fragmento de los mismos o un derivado de los mismos. Por derivado de un oligonucleótido, significa que el oligonucleótido derivado es sustancialmente el mismo que la secuencia de la que deriva en la que la secuencia derivada tiene suficiente complementariedad de secuencia con la secuencia de la cual deriva para hibridarse al gen de FGF-21. La secuencia nucleotídica derivada no está necesariamente derivada físicamente de la secuencia nucleotídica, pero puede ser generada de cualquier manera que incluye por ejemplo, síntesis química o replicación de ADN o transcripción reversa o transcripción.

Típicamente, al ADN genómico del paciente se aísla de una muestra celular del paciente y se digiere con una o más endonucleasas de restricción tales como, por ejemplo, TaqI y AluI. Usando el protocolo de transferencia Southern, que es bien conocido en la materia, este ensayo determina si un paciente o un tejido en particular en un paciente tiene un gen de FGF-21 intacto o una anomalía en el gen de FGF-21.

La hibridación con un gen de FGF-21 puede implicar desnaturalizar el ADN cromosómico para obtener un ADN de cadena sencilla; poner en contacto el ADN de cadena sencilla con un una sonda génica asociada con la secuencia del gen de FGF-21; e identificar el hibridado ADN-sonda para detectar al ADN cromosómico que contiene al menos una porción de un gen de FGF-21 humano.

El término "sonda" tal como se usa en la presente memoria se refiere a una estructura comprendida por un polinucleótido que forma una estructura híbrida con una secuencia diana, debido a la complementariedad de la secuencia sonda con una secuencia en la región diana. Los oligómeros adecuados para uso como sondas pueden contener un mínimo de aproximadamente 8-12 nucleótidos contiguos que son complementarios a la secuencia diana y preferiblemente un mínimo de aproximadamente 20.

Las sondas del gen de FGF-21 de la presente invención pueden ser oligonucleótidos de ADN o ARN y pueden hacerse por cualquier método conocido en la materia tal como, por ejemplo, excisión, transcripción o síntesis química. Las sondas se pueden etiquetar con cualquier etiqueta detectable en es estado de la técnica tal como, por ejemplo, etiquetas radiactivas o fluorescentes o marcadores enzimáticos. El etiquetado de la sonda puede ser llevado a cabo por cualquier método conocido en el estado de la técnica tal como por PCR, cebador al azar, etiquetado final, traducción por cortes ("nick translation") o similar. Un experto en la materia también reconoce que se pueden usar otros métodos que no emplean sonda etiquetada para determinar la hibridación. Ejemplos de métodos que se pueden usar para detectar hibridación incluyen transferencia Southern, hibridación por fluorescencia in situ, y polimorfismo por conformación de cadena sencilla con amplificación por PCR.

La hibridación típicamente se lleva a cabo a 25º-45ºC, más preferiblemente a 32º-40ºC y más preferiblemente a 37º-38ºC. El tiempo necesario para la hibridación es de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 96 horas, más preferiblemente de aproximadamente una a aproximadamente 72 horas, y lo más preferiblemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 24 horas.

Las anormalidades del gen de FGF-21 también se pueden detectar usando el método de PCR y cebadores que flanquean o se unen al gen de FGF-21. El método de PCR es bien conocido en la materia. En pocas palabras, este método se lleva a cabo usando dos cebadores de oligonucleótidos que son capaces de hibridarse a las secuencias de ácido nucleico que flanquean una secuencia diana que está dentro de un gen de FGF-21 y amplificar la secuencia diana. Los término "cebador de oligonucleótido" tal como se usa en la presente memoria se refiere a una cadena corta de ADN o ARN que está en el intervalo de longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 bases. Los cebadores aguas arriba y aguas abajo son típicamente de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 pares de bases de longitud e hibridan con las regiones flanqueantes para la replicación de la secuencia nucleotídica. La polimerización se cataliza por la ADN polimerasa en presencia de desoxinucleótidos trifosfato o análogos de nucleótidos para producir moléculas de ADN de doble cadena. Luego, las cadenas dobles son separadas por cualquier método desnaturalizante que incluye físico, químico o enzimático. Comúnmente, el método de desnaturalización física se usa calentando el ácido nucleico, típicamente a una temperatura de aproximadamente 80ºC a 105ºC durante tiempos en un intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 minutos. El proceso se repite durante el número de ciclos deseado.

Los cebadores se seleccionan para ser sustancialmente complementarios con la hebra de ADN a amplificar. Por ello, los cebadores no necesitan reflejar la secuencia exacta del molde, pero deben ser suficientemente complementarios para hibridar selectivamente con la hebra a amplificar.

Tras la amplificación por PCR, la secuencia de ADN que comprende FGF-21 o pre-pro-FGF-21 o una fragmento de los mismos luego se secuencia y analiza por comparación de la secuencia con las secuencias descritas en la presente memoria para identificar alteraciones que pueden cambiar la actividad o niveles de expresión o similares.

En otra realización, se proporciona un método para detectar FGF-21 basado en un análisis de tejido que expresa el gen de FGF-21. Se ha encontrado que ciertos tejidos tales como aquellos identificados más abajo en el Ejemplo 2, expresan el gen de FGF-21. El método comprende hibridar un polinucleótido con ARNm de una muestra de tejidos que normalmente expresan el gen de FGF-21. La muestra se obtiene a partir de un paciente sospechoso de tener una anomalía en el gen de FGF-21 o en el gen de FGF-21 de células en particular.

Para detectar la presencia de ARNm que codifica la proteína FGF-21, se obtiene una muestra de un paciente. La muestra puede ser de sangre o de una muestra de biopsia tisular. La muestra puede ser tratada para extraer los ácidos nucleicos contenidos en la misma. El ácido nucleico resultante de la muestra es sometido a electroforesis en gel u otras técnicas de separación por tamaño.

El ARNm de la muestra se pone en contacto con una secuencia de ADN que sirve como sonda para formar duplex híbridos. El uso de una sonda etiquetada tal como se discute más arriba permite la detección del duplex resultante.

Cuando se usa el ADNc que codifica la proteína FGF-21 o un derivado del ADNc como sonda, se pueden usar condiciones de alta severidad con el fin de evitar falsos positivos, que es la hibridación y detección aparente de secuencias nucleotídicas de FGF-21 cuando de hecho no está presente un gen de FGF-21 intacto y funcional. Cuando se usan secuencias derivadas del ADNc de FGF-21, se pueden usar condiciones menos restrictivas, sin embargo, esto puede ser un enfoque menos preferido debido a la probabilidad de falsos positivos. La severidad de la hibridación se determina por un número de factores durante la hibridación y durante el procedimiento de lavado, que incluyen temperatura, fuerza iónica, longitud de tiempo y concentración de formamida. Estos factores están descritos en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed. (1989). Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.

Con el fin de aumentar la sensibilidad de la detección en una muestra de ARNm que codifica la proteína FGF-21, se puede usar la técnica de transcripción reversa/reacción en cadena de la polimerasa (RT/PCR) para amplificar ADNc transcrito a partir de ARNm que codifica la proteína FGF-21. El método de RT/PCR es bien conocido en la materia, y puede ser llevado a cabo como sigue. Se aísla ARN total celular por, por ejemplo, el método clásico de isotiocianato de guanidinio y el ARN total se transcribe de forma reversa. El método de transcripción reversa implica la síntesis de ADN sobre un molde de ARN usando una enzima de transcripción reversa y un cebador para el extremo 3'. Típicamente, el cebador contiene una secuencia oligo(dT). Luego, el ADNc producido es amplificado usando el método de PCR y cebadores específicos de FGF-21. (Belyavsky et al., Nucl. Acid Res. 17:2919-2932, 1989; Krug y Berger, Methods in Enzymology, 152:316-325, Academic Press, NY, 1987).

El método de la reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo como se describe más arriba usando dos cebadores de oligonucleótidos que son sustancialmente complementarios a las dos regiones flanqueantes del segmento de ADN a amplificar.

Tras la amplificación, el producto de PCR luego se separa por electroforesis y se detecta por tinción con bromuro de etidio o por formación de imágenes fotográficas.

La presente invención proporciona métodos para detectar la presencia de la proteína FGF-21 en una muestra obtenida de un paciente. Puede usarse cualquier método conocido en la materia para detectar proteínas. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, inmunodifisión, inmunoelectroforesis, métodos inmunoquímicos, ensayos enlazador-ligando, técnicas inmunohistoquímicas, ensayos de aglutinación y complemento (por ejemplo, véase Basic and Clinical Immunology, 217-262, Sites y ETR, Eds., Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1991). Los métodos preferidos son los de inmunoensayo enlazador-ligando que incluyen anticuerpos que reaccionan con un epítopo o epítopos de la proteína FGF-21 y desplazan de forma competitiva una proteína de FGF-21 etiquetada o derivado de la misma. Los anticuerpos preferidos son los preparados según el Ejemplo 4.

Tal como se usa en la presente memoria, un derivado de la proteína FGF-21 pretende incluir un polipéptido en el que ciertos aminoácidos han sido delecionados o reemplazados con aminoácidos modificados o inusuales donde el derivado de FGF-21 es biológicamente equivalente a FGF-21 y donde el derivado polipeptídico reacciona de forma cruzada con anticuerpos obtenidos contra la proteína FGF-21. Por reacción cruzado quiere decir que un anticuerpo reacciona con un antígeno distinto de del que indujo su formación.

Se conocen en el materia numerosos inmunoensayos de unión competitiva y no competitiva a proteínas. Los anticuerpos empleados en tales ensayos pueden no estar etiquetados, por ejemplo como se usa en los ensayos de aglutinación, o estar etiquetados para uso en una amplia variedad de métodos de ensayo. Las etiquetas que se pueden usar incluyen radionúclidos, enzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o co-factores, inhibidores enzimáticos, partículas, tinciones y similares para uso en inmunorradioensayo (RIA), inmunoensayos enzimáticos, por ejemplo, ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA), inmunoensayos de fluorescencia y similares.

Los anticuerpos policlonales o monoclonales de la proteína FGF-21 o un epítopo de la misma se pueden hacer para uso en inmunoensayos por cualquier número de métodos conocidos en la materia. Por epítopo se hace referencia a un determinante antigénico de un polipéptido. Un epítopo puede comprender 3 aminoácidos en una conformación en espiral que es única en el epítopo. Generalmente, un epítopo consiste en al menos 5 aminoácidos. Los métodos para determinar la conformación en espiral de los aminoácidos son conocidos en la materia, e incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones.

Un enfoque para preparar anticuerpos para una proteína es la selección y preparación de una secuencia aminoacídica de toda o parte de la proteína, sintetizar químicamente la secuencia e inyectarla dentro de un animal apropiado, normalmente un conejo o un ratón (véase Ejemplo 4).

Los oligopéptidos se pueden seleccionar como candidatos para la producción de un anticuerpo para la proteína FGF-21 en base a los oligopéptidos que están en regiones hidrofílicas, que por ello están probablemente expuestos en la proteína madura. Oligopéptidos preferidos son RQRYLYTDDAQQTEAH (restos 46-61 de SEQ ID NO:4) y HLPGNKSPHRDPAPR (restos 146-160 de SEQ ID NO:4). Los oligopéptidos adicionales se pueden determinar usando, por ejemplo, el Índice de Antigenicidad de Welling, G.W. et al., FEBS Lett. 188:215-218, 1985.

Los anticuerpos para FGF-21 también se pueden obtener contra oligopéptidos que incluyen una o más regiones conservadas identificadas en la presente memoria de forma que el anticuerpo puede reaccionar de forma cruzada con otros miembros de la familia. Tales anticuerpos pueden ser usados para identificar y aislar los otros miembros de la familia.

Los métodos para preparar la proteína FGF-21 o un epítopo de la misma incluyen, pero no se limitan a síntesis química, técnicas de ADN recombinante o aislamiento a partir de muestras biológicas. La síntesis química de un péptido puede llevarse a cabo, por ejemplo, por el método clásico Merrifeld de síntesis peptídica en fase sólida (Merrifeld, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963) o la estrategia FMOC en un sistema de Síntesis Rápida Automatizada Múltiple de Péptidos (E. I. du Pont de Nemours Company, Wilmington, DE) (Caprino y Han, J. Org. Chem. 37:3404, 1972).

Los anticuerpos policlonales se pueden preparar inmunizando conejos u otros animales por inyección del antígeno seguido de estímulos posteriores a intervalos apropiados. Los animales se sangran y se ensayan los sueros contra la proteína FGF-21 purificada normalmente por ELISA o por bioensayo basado en la capacidad para bloquear la acción de FGF-21 en hígado u otras células. Cuando se usan especies avícolas, por ejemplo, pollos, pavos y similares, el anticuerpo puede ser aislado a partir de la tema del huevo. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse tras el método de Milstein y Kohler fundiendo esplenocitos de ratones inmunizados con células tumorales que se replican continuamente tales como células de melanoma o linfoma. (Milstein y Kohler, Nature 256:495-497, 1975; Gulfre y Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone y Banatis eds., Academic Press, 1981). Las células de hibridoma formadas así luego se clonan por métodos de dilución limitante y los sobrenadantes se ensayan para la producción de anticuerpos por ELISA, RIA o bioensayo.

La capacidad única de los anticuerpos para reconocer y unirse específicamente a proteínas diana proporciona un enfoque para tratar una sobre expresión de la proteína. Por ello, otro aspecto de la presente invención proporciona un método para prevenir o tratar enfermedades que implican la sobre expresión de la proteína FGF-21 por tratamiento de un paciente con anticuerpos específicos para la proteína FGF-21.

Los anticuerpos específicos, tanto policlonales como monoclonales, para la proteína FGF-21 pueden ser producidos por cualquier método adecuado conocido en la materia tal como se discute más arriba. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos o de múrido se pueden producir por tecnología de hibridoma o, de forma alternativa, la proteína FGF-21, o un fragmento inmunológicamente activo de la misma, o un anticuerpo anti-idiotípico, o fragmento del mismo se puede administrar a un animal para provocar la producción de anticuerpos capaces de reconocer y unirse a la proteína FGF-21. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de anticuerpos, que incluyen, pero no se limitan a, IgG, IgA, IgM, IgD, e IgE o en el caso de especies avícolas, IgY y de cualquier subclase de anticuerpos.

Los polipéptidos codificados por los polinucleótidos del momento y que corresponden a genes de longitud total se pueden usar para escrutar bibliotecas peptídicas, bibliotecas de proteínas, bibliotecas de pequeñas moléculas, y bibliotecas de exposición de fagos, y otros métodos conocidos, para identificar análogos o antagonistas.

Los polipéptidos de FGF naturales pueden jugar un papel en el cáncer. Por ejemplo, los miembros de la familia de FGF pueden inducir marcada transformación morfológica de células NIH 3T3, y exhibir fuerte tumorigenicidad en ratones desnudos. Los miembros de la familia de FGF han exhibido actividad angiogénica. Por ello, se pueden usar inhibidores de FGF para tratar el cáncer, tal como el cáncer de próstata.

Una biblioteca peptídica se puede sintetizar siguiendo los métodos descritos en la Patente de EE.UU. Nº 5.010.175, y en el documento PCT Nº WO 91/17823. Como se describe más abajo en pocas palabras, se prepara una mezcla de péptidos, que luego se escruta para identificar los péptidos que exhiben la transducción de señal deseada y la actividad de unión al receptor. Según el método de la patente '175, un soporte de síntesis peptídica adecuado (por ejemplo, una resina) se acopla a una mezcla de aminoácidos activados, protegidos de forma apropiada. La concentración de cada aminoácido en la mezcla de reacción se equilibra o ajusta en proporción inversa a su ritmo de reacción de acoplamiento, de forma que el producto es una mezcla equimolar de aminoácidos acoplados a la resina de inicio. Los aminoácidos unidos luego se desprotegen, y se hacen reaccionar con otra mezcla de aminoácidos equilibrados para formar una mezcla equimolar de todos los dipéptidos posibles. Este proceso se repite hasta que se forma la mezcla de péptidos de longitud deseada (por ejemplo, hexámeros). Nótese que se no necesita incluir todos los aminoácidos en cada etapa: se pueden incluir sólo uno o dos aminoácidos en algunas etapas (por ejemplo, donde se conoce que un aminoácido en particular es esencial en una posición dada), reduciendo así la complejidad de la mezcla. Tras completar la síntesis de la biblioteca peptídica, se escruta la mezcla de péptidos para unirlos al polipéptido seleccionado. Luego, los péptidos se ensayan para su capacidad para inhibir o potenciar la actividad. Los péptidos que exhiben la actividad deseada luego se aíslan y secuencian.

El método descrito en el documento PCT Nº WO 97/17823 es similar. Sin embargo, en lugar de hacer reaccionar la resina de síntesis con una mezcla de aminoácidos activada, la resina se divide en veinte porciones iguales (o en un número de porciones que corresponden al número de aminoácidos diferentes a añadir en cada etapa), y cada aminoácido se acopla individualmente a su porción de resina. Las porciones de resina luego se combinan, mezclan, y de nuevo se dividen en un número de porciones iguales para hacerlas reaccionar con el segundo aminoácido. De esta manera, cada reacción puede conducirse fácilmente hasta completarla. De forma adicional, se pueden mantener "subconjuntos" separados tratando las porciones en paralelo, en lugar de combinar todas las resinas en cada etapa. Esto simplifica el proceso de determinar qué péptidos son responsables de cualquier unión a receptor o actividad de transducción de señales observada.

En tales casos, los subconjuntos que contienen, por ejemplo, 1-2.000 candidatos son expuestos a uno o más polipéptidos de la invención. Cada subconjunto que produce un resultado positivo luego se resintetiza como un grupo de subconjuntos más pequeños (sub-subconjuntos) que contienen, por ejemplo, 20-100 candidatos, y se re ensaya. Los sub-subconjuntos positivos se pueden resintetizar como compuestos individuales, y se ensayan finalmente para determinar los péptidos que exhiben una alta constante de unión. Estos péptidos se pueden ensayar para su capacidad para inhibir o potenciar la actividad natural. Los métodos descritos en el documento PCT Nº WO 91/7823 y la Patente de EE.UU. Nº 5.194.392 permiten la preparación de tales conjuntos y subconjuntos por técnicas automatizadas en paralelo, de forma que todas las síntesis y resíntesis pueden llevarse a cabo en cuestión de días.

Los agonistas o antagonistas peptídicos son escrutados usando cualquier método disponible, tal como ensayos de transducción de señales, de unión a anticuerpos, de unión a receptores y ensayos mitogénicos. Las condiciones de ensayo idealmente deben parecerse a las condiciones bajo las cuales se exhibe la actividad natural in vivo, que es, bajo pH fisiológico, temperatura y fuerza iónica. Los agonistas o antagonistas adecuados exhibirán fuerte inhibición o potenciación de la actividad natural a concentraciones que no causan efectos secundarios tóxicos en el individuo. Los agonistas y antagonistas que compiten por la unión al polipéptido natural pueden necesitar concentraciones iguales o superiores a las concentración natural, mientras que los inhibidores capaces de unirse de forma irreversible al polipéptido pueden ser añadidos en concentraciones del orden de la concentración natural.

La disponibilidad de hFGF-21 y mFGF-21 permite la identificación de pequeñas moléculas y compuestos de bajo peso molecular que inhiben la unión de FGF-21 a su receptor, a través de aplicación rutinaria de métodos de escrutinio de alto rendimiento (HTS). Los métodos HTS generalmente se refieren a tecnologías que permiten el ensayo rápido de compuestos de plomo para potencial terapéutico. Las técnicas HTS emplean manejo robótico de materiales de ensayo, detección de señales positivas, e interpretación de datos. Los compuestos de plomo pueden ser identificados vía la incorporación de radiactividad o a través de ensayos ópticos que dependen de absorbancia, fluorescencia o luminiscencia como lectura de salida. González, J.E. et al., (1998) Curr. Opin. Biotech. 9:624:631. Los ensayos para detectar la interacción entre una molécula de FGF y un receptor de FGF se describen en, por ejemplo, Blunt, A.G. et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:3733-3738, tales ensayos pueden estar adaptados para determinar si una molécula candidata puede inhibir la interacción entre FGF-21 y su receptor.

Hay sistemas modelo disponibles que pueden ser adaptados para uso en escrutinio de alto rendimiento para compuestos que inhiben la interacción de FGF-21 con su receptor, por ejemplo por competición con FGF-21 por la unión al receptor. Sarubbi et al., (1996) Anal. Biochem. 237:70-75 describen ensayos no isotópicos libres de células para identificar moléculas que compiten con ligandos naturales por la unión al sitio activo del receptor de IL-1. Martens, C. et al., (1999) Anal. Biochem. 273:20-31 describen un método genérico no radiactivo basado en partículas en el que un ligando etiquetado se une a su receptor inmovilizado sobre una partícula; el etiquetado sobre la partícula disminuye en presencia de una molécula que compite con el ligando etiquetado por la unión al receptor.

Los polinucleótidos y polipéptidos terapéuticos de FGF-21 de la presente invención pueden ser utilizados en vehículos de administración génica. El vehículo de administración génica puede ser de origen viral o no viral (véanse generalmente, Cancer Gene Therapy 1:51-64 (1994); Kimura, Human Gene Therapy 5:845-852 (1994); Connelly, Human Gene Therapy 1:185-193 (1995); y Kaplitt, Nature Genetics 6:148-153 (1994)). Los vehículos de terapia génica para administrar construcciones que incluyen una secuencia codificante de un agente terapéutico de la invención se pueden administrar de forma local o sistémica. Estas construcciones pueden usar enfoques de vector viral o no viral. La expresión de tales secuencias codificantes puede inducirse usando promotores de mamíferos o heterólogos. La expresión de la secuencia codificante puede estar constitutiva o regulada.

La presente invención puede emplear retrovirus recombinantes que son construidos para llevar o expresar una molécula de ácido nucleico seleccionada de interés. Los vectores retrovirales que se pueden emplear incluyen aquellos descritos en los documentos EP 0 415 731; WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; Patente de EE.UU. Nº 5.219.470; WO 93/11230; WO 93/10218; Vile y Hart, Cancer Res. 53:3860-3864 (1993); Vile y Hart, Cancer Res. 53:962-967 (1993); Ram et al., Cancer Res. 53:83-88 (1993); Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33: 493-503 (1992); Baba et al., J. Neurosurg. 79:729-735 (1993); Patente de EE.UU. No. 4,777,127; Patente de GB No. 2,200,651; y EP 0 345 242. Retrovirus recombinantes preferidos incluyen aquellos descritos en el documento WO 91/02805.

Las líneas celulares empaquetadoras adecuadas para uso con las construcciones de vectores retrovirales arriba descritas pueden ser preparadas fácilmente (véase las publicaciones PCT WO 95/30763 y WO 92/05266), y usadas para crear líneas celulares productoras (también denominadas líneas celulares vector) para la producción de partículas de vectores recombinantes. Dentro de realizaciones de la invención particularmente preferidas, las líneas celulares empaquetadoras se hacen de líneas celulares de humano (tal como células HT1080) o líneas celulares parientes de visón, que permiten por ello la producción de retrovirus recombinantes que pueden sobrevivir a la inactivación en suero humano.

La presente invención también emplea vectores basados en alfavirus que pueden funcionar como vehículos de administración de genes. Tales vectores se pueden construir a partir de una amplia variedad de alfavirus, que incluyen, por ejemplo, vectores del virus Sindvis, virus del bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus del Río Ross (ATCC VR-373; ATCC-VR1246) y el virus de la encefalitis equina de Venezuela (ATCC VR-953; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532). Ejemplos representativos de tales sistemas de vectores incluyen aquellos descritos en las Patentes de EE.UU. Nos. 5.091.309; 5.217.879; y 5.185.440; y las publicaciones PCT Nos. WO 92/10578; WO 94/21792; WO 95/27069; WO 95/27044; y WO 95/07994.

Los vehículos de administración de genes de la presente invención también pueden emplear parvovirus tales como vectores de virus adeno asociados (AAV). Ejemplos representativos incluyen los vectores AAV descritos por Srivastava el WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. 63:3822-3828 (1989); Mendelson et al., Virol. 166:154-165 (1988); y Flotte et al., P.N.A.S. 90:10613-10617 (1993).

Ejemplos representativos de vectores adenovirales incluyen aquellos descritos por Berner, Biotechniques 6: 616-627 (Biotechniques); Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); WO 93/19191; Kolls et al., P. N. A. S.:215-219 (1994); KassEisler et al., P. N. A. S. 90:11498-11502 (1993); Guzman et al., Circulation 88:28382848 (1993); Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202-1207 (1993); Zabner et al., Cell 75:207216 (1993); Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403-409 (1993); Cailaud et al., Eur. J. Neurosci. 5:1287-1291 (1993); Vincent et al., Nat. Genet. 5:130-134 (1993); Jaffe et al., Nat. Genet. 1:372-378 (1992); y Levrero et al., Gene 101:195-202 (1992). Vectores adenovirales para terapia génica ejemplares que se emplean en esta invención también incluyen aquellos descritos en WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655. También se puede emplear la administración de ADN unido a adenovirus muertos como se describe en Curiel, Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992).

Se pueden emplear otros vehículos y métodos de administración génica, que incluyen ADN policatiónico condensado unido o no unido sólo a adenovirus muertos, por ejemplo Curiel, Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992); AND unido a ligando. Por ejemplo, véase Wu, J. Biol. Chem. 264:16985-16987 (1989); células vehículo que administran células eucarióticas, por ejemplo véasele Nº de Serie de EE.UU. 08/240,030, presentada el 9 de Mayo de 1994, y el Nº de Serie de EE.UU. 08/404,796; deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizado; pistola manual de partículas de transferencia génica, como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5,149,655; radiación ionizante como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5,206,152 y en el documento WO 92/11033; neutralización de carga nucleica o fusión con membranas celulares. Enfoques adicionales se describen en Philip, Mol. Cell Biol. 14:2411-2418 (1994), y en Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1581-1585 (1994).

También se puede emplear el ADN desnudo. Ejemplos de métodos de introducción de ADN desnudo se describen en el documento WO 90/11092 y el la Patente de EE.UU. Nº 5.580.859. La eficacia de captación también se puede mejorar usando perlas de látex biodegradables. Las perlas de látex cubiertas con ADN son transportadas de forma eficaz dentro de las células tras la iniciación de la endocitosis por las perlas. El método se puede mejorar además por tratamiento de las perlas para aumentar la hidrofobicidad y facilitar así la interrupción del endosoma y liberar el ADN dentro del citoplasma. Los liposomas que pueden actuar como vehículos de administración génica se describen en la Patente de EE.UU. Nº 5.422.12, los números de Publicación de Patente PCT WO 95/13796, WO 94/23697, y WO 91/14445 y EP Nº 0 524 968.

Administración adicional no viral adecuada para su uso incluye sistemas de administración mecánica tales como el enfoque descrito en Woffendin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24):11581-11585. Además, la secuencia codificante y el producto de expresión de esta se pueden administrar a través de la deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizado. Otros métodos convencionales para administración génica que pueden ser usados para administrar la secuencia codificante incluyen, por ejemplo, uso de pistola manual de partículas de transferencia génica, como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.149.655; uso de radiación ionizante para activar el gen transferido, como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.206.152 y la Publicación de Patente PCT Nº WO 92/11033.

FGF ha estado implicado en enfermedades caracterizadas por pérdida de función, número/función no adecuada, función anormal o muerte celular, de tejidos u órganos de las cuales se puede prolongar/rescatar su función o supervivencia, y anormalidades revertidas o prevenidas por terapia con FGF.

La pérdida de función o de células pulmonares, bronquiales o alveolares, la cicatrización de heridas pulmonares o bronquiales, el infarto pulmonar, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica/enfisema, asma, las secuelas de enfermedad infecciosa o autoinmune, las secuelas de hipertensión de arterias o venas pulmonares, la fibrosis pulmonar, la enfermedad pulmonar de la inmadurez, y la fibrosis quística son condiciones susceptibles para el tratamiento con FGF.

La enfermedad isquémica vascular puede ser susceptible de tratamiento con FGF-21, donde la enfermedad se caracteriza por flujo sanguíneo inadecuado al(los ) órgano(s). El tratamiento puede inducir angiogénesis terapéutica o conservar la función/supervivencia de células (isquemia/infarto de miocardio, enfermedad vascular periférica, enfermedad de arteria renal, apoplejía). Las cardiomiopatías caracterizadas por pérdida de función o muerte de miocitos cardiacos o células de soporte en el corazón (fallo cardiaco congestivo, miocarditis) también pueden ser tratadas usando FGF-21, como puede ser la enfermedad musculoesquelética caracterizada por pérdida de función, función inadecuada o muerte de células del músculo esquelético, células óseas o células de soporte. Ejemplos incluyen miopatías esqueléticas, enfermedad ósea, y artritis.

Los polinucleótidos y polipéptidos de FGF-21 pueden ayudar a corregir los defectos congénitos debidos a la pérdida de molécula FGF-21 o su función (hígado, corazón, pulmón, cerebro, extremidades, riñón, etc.).

El tratamiento de cicatrización de heridas todavía es otro uso de polipéptidos y polinucleótidos de FGF-21, tanto debido a trauma, enfermedad, tratamiento médico o quirúrgico, que incluye regeneración de poblaciones celulares y tisulares mermadas por estos procesos. Ejemplos incluyen regeneración hepática, cicatrización de heridas vigentes, re-endotelización de vasos sanguíneos dañados, cicatrización de heridas traumáticas, cicatrización de úlceras debido a enfermedad vascular, metabólica, etc., fracturas óseas, pérdida de células debido a enfermedad inflamatoria, etc.

FGF-21 también puede usarse en escrutinios para identificar fármacos para tratamiento de cánceres que implican sobre actividad de la molécula, o nuevas dianas que podrían se útiles en la identificación de nuevos fármacos.

Para todas las realizaciones anteriores, el médico determinará, en base a la condición específica, si los polipéptidos o polinucleótidos de FGF-21, los anticuerpos para FGF-21, o las pequeñas moléculas tales como análogos o antagonistas peptídicos, serán la forma más adecuada de tratamiento. Estas formas están todas dentro del alcance de la invención.

La realizaciones preferidas de la invención se describen en los siguientes ejemplos. Otras realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones de la presente memoria serán evidentes para un experto en la materia a partir de la consideración de la descripción o práctica de la invención como se describe en la presente memoria. Se pretende que la descripción, junto con los ejemplos, sea considerada sólo como ejemplo, con el alcance y el espíritu de la invención estando indicados por las reivindicaciones que siguen a los ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento y Análisis de FGF-21 de Ratón

Se preparó ADN a partir de ADNc de embriones de ratón. El ADN se amplificó a partir de ADNc de embriones de ratón por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) durante 30 ciclos en 25 \mul de una mezcla de reacción que contiene cada uno de los cebadores degenerados sentido y antisentido que representan todos los posibles codones que corresponden a las secuencias aminoacídicas de FGF-19, RPYDGYN y LPMLPM, respectivamente. El producto amplificado se amplificó adicionalmente por PCR con cada cebador degenerado sentido y antisentido que representan todos los posibles codones que corresponden a las secuencias aminoacídicas de FGF-19, RPYDGYN y HFLPML, respectivamente. Se clonaron los ADNs amplificados de tamaño esperado (aproximadamente 120 pares de bases). Determinando las secuencias nucleotídicas de los ADNs clonados se identificó un nuevo ADNc de FGF de ratón, FGF-21. Para determinar la región codificante total del nuevo ADNc de FGF, se amplificó la región codificante a partir de ADNc de embriones de ratón por PCR mediada por adaptador-ligación usando un kit de amplificación de ADNc Marathon (Clontech, Palo Alto, California) y cebadores específicos para el FGF. El ADNc que codifica la región codificante total del FGF se amplificó a partir de ADNc de embriones de ratón por PCR usando los cebadores específicos para FGF que incluyen secuencias no codificantes 5' y 3', y se clonaron dentro del ADN del vector pGEM-T. La secuencia nucleotídica se muestra en SEQ ID NO:1 y la secuencia aminoacídica se muestra en SEQ ID NO:2.

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Ejemplo 2 Expresión de FGF-21 en Tejidos de Ratón

Se disolvió ARN poli (A)^{+} (10 \mug) a partir de tejidos de ratón en un gel desnaturalizante de agarosa (1%) que contiene formaldehído, y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa en SSC 20X (SSC 1X: NaCl 0,15 M/citrato sodio 0,015 M) durante toda la noche. Se etiquetó una sonde de ADNc de FGF-21 etiquetada con ^{32}P (\sim650 pares de bases) con un kit de etiquetado al azar de cebadores (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y desoxicitidina 5'-[\alpha-^{32}P]-trifosfato (\sim110 TBq/mmol) (ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, California). La membrana se incubó en solución de hibridación que contiene la sonda etiquetada como se describe (Hoshikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Común. 244:187-191 (1998)), y se analizó con un analizador de formación de radioimágenes (BAS 2000, Fuji Photo Co., Tokio, Japón). Como se muestra en la Figura 3, la expresión de FGF-21 fue la más predominante en hígado, con expresión también en testículo y timo.

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Ejemplo 3 Aislamiento y Análisis de FGF-21 Humano

El gen de FGF-21 humano se localizó en la región flanqueante 5' de un gen de alfa 1,2-fucosiltransferasa humano. El ADNc que codifica la región codificante total de FGF-21 humano se amplificó a partir de ADNc de cerebro fetal por PCR usando los cebadores específicos para FGF que incluyen las secuencias no codificantes 5' y 3', y se clonó dentro del ADN del vector pGEM-T. La proteína contiene 209 aminoácidos, como se muestra en SEQ ID NO:4 (Figura 5), y está codificada por la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:3. Los cebadores para amplificar el la región codificante del ADNc de FGF-21 humano son: cebador sentido para FGF-21: 5' agccattgatggactcggac 3'; cebador antisentido para FGF-21: 5' tggcttcaggaagcgtagct 3'.

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Ejemplo 4 Preparación de Antisueros para FGF-21 por Inmunización de Conejos con un Péptido FGF-21

Se sintetizó una secuencia peptídica que corresponde a aminoácidos contiguos seleccionados de la proteína FGF-21 humana y se acopló a hemocianina lapa en ojo de cerradura (KLH) como se describe (Harlow y Land, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, NY). El péptido acoplado a KLH se usa para inmunizar conejos. Los antisueros se ensayaron para la especificidad a FGF-21, y para la reactividad cruzada con otras proteínas FGF.

Secuencias peptídicas ejemplares son:

1. RQRYLYDDAQQTEAH (restos 46-61 de SEQ ID NO:4)

2. HLPGNKSPHRDPAPR (restos 146-160 de SEQ ID NO:4)

Aunque se han descrito ciertas realizaciones en la presente memoria, no se pretende en tales realizaciones constituir una limitación en el alcance de la invención excepto lo que se muestra en las reivindicaciones.

Claims

1. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende:

(a) un polinucleótido que codifica los aminoácidos 1 a 209 de SEQ ID NO:4; o

(b) el polinucleótido complementario de (a).

2. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende:

(a) un polinucleótido de SEQ ID NO:1; o

(b) el polinucleótido complementario de (a).

3. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, que es ADN.

4. Un método para hacer un vector recombinante, que comprende insertar una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2 dentro de un vector en unión operativa con un promotor.

5. Un vector recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2 en unión operativa a un promotor.

6. Un método para hacer una célula hospedadora recombinante, que comprende introducir el vector recombinante de la reivindicación 5 dentro de una célula hospedadora.

7. Una célula hospedadora recombinante, que comprende el vector recombinante de la reivindicación 5.

8. Un método recombinante para producir un polipéptido, polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 210 de SEQ ID NO:2 o los aminoácidos 1 a 209 de SEQ ID NO:4, que comprende cultivar la célula hospedadora recombinante de la reivindicación 7 bajo condiciones tales que es expresado dicho polipéptido y recuperar dicho polipéptido.

9. Un polipéptido aislado que comprende los aminoácidos 1 a 209 de SEQ ID NO:4.

10. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según la reivindicación 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Un anticuerpo aislado que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 9.

12. Un kit para detectar la presencia del polipéptido FGF-21 en una muestra de un paciente, kit que comprende un anticuerpo según la reivindicación 11, empaquetado en un recipiente.