JP4444652B2 - G−csf結合体 - Google Patents
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Description
さらにもう一つの態様において、本発明はG−CSF活性を示すポリペプチドを含むポリペプチド結合体に関し、これは、hG−CSFのアミノ酸配列(配列番号1に示すアミノ酸配列を有する)と、非ポリペプチド部分の結合基を含む導入された、または除去されたアミノ酸から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列、および公知組み換えG−CSF産物と比較して、増大した半減期および/またはさらに迅速な好中球回復を有する結合体を提供するために十分な数および種類の非ポリペプチド部分を含む。
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列、かかるヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびかかるヌクレオチド配列または発現ベクターを含む宿主細胞を含む本発明の結合体の調製法に関する。
最後の態様において、本発明は、本発明の結合体またはポリペプチドを含む組成物、医薬組成物の調製法、本発明の結合体または組成物の医薬としての使用、およびかかる組成物で哺乳動物を治療する方法に関する。特に、本発明のポリペプチド、結合体または組成物は、ある種の放射線治療、化学療法、および骨髄移植を受けている癌患者において感染を予防するため、末梢血前駆細胞移植における採集のために前駆細胞を動員するため、重い慢性または相対的白血球減少症(原因に関係なく)の治療のため、および急性骨髄性白血病の患者の治療をサポートするために用いることができる。加えて、本発明のポリペプチド、結合体または組成物は、AIDSまたは他の免疫不全疾患ならびに細菌感染症の治療のために用いることができる。
本出願および本発明に関して、次の定義を適用する:
「結合体(conjugate)」なる用語は、1以上のポリペプチド、典型的には単一のポリペプチドの、1以上の非ポリペプチド部分、特にポリマー分子との共有結合により形成される異種分子を示す。加えて、結合体は、1以上の炭水化物部分と、特にN−またはO−グリコシル化により結合させることができる。共有結合なる用語は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド部分が、互いに直接共有結合するか、またはそうでなければ、ブリッジ、スペーサー、またはリンケージ部分などの介在する部分を介して互いに間接的に共有結合することを意味する。好ましくは、結合体は関連する濃度および条件で可溶性である。すなわち、血液などの生理学的液体中に可溶性である。「非結合ポリペプチド」なる用語は、結合体のポリペプチド部分について用いることができる。
「ポリペプチド」なる用語は、本発明においては「タンパク質」なる用語と交換可能に用いられる。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」なる用語は、熱安定性DNAポリメラーゼを用いたインビトロでの所望のヌクレオチド配列の増幅のための周知の方法を意味する。
「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養」は本明細書中、互換的に用いられ、かかる用語はある細胞の成長または培養の結果得られる子孫を包含すると理解される。「形質転換」および「トランスフェクション」は、互換的に用いられ、DNAを細胞中に導入するプロセスを意味する。
親ポリペプチドに関連して置換が行われる場合、これらは好ましくは「保存的置換」、言い換えれば、類似した特性を有するアミノ酸、たとえば小アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸および芳香族アミノ酸のグループ内で行われる置換である。
前記のように、第一の態様において、本発明はG−CSF活性を示すポリペプチドを含む結合体であって、配列番号1のアミノ酸配列と、非ポリペプチド部分の結合基、および非ポリペプチドの結合基と結合した少なくとも一つの非ポリペプチド部分を含む特定の導入または除去されたアミノ酸残基から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列、およびポリペプチドの結合基に結合した少なくとも一つの非ポリペプチド部分を含むものに関する。導入および/または除去されるアミノ酸残基を次のセクションにおいてさらに詳細に記載する。結合体それ自身もG−CSF活性を示すと理解される。
ポリペプチドは任意の起源、特に哺乳動物起源のものであってよいが、これは目下ヒト起源であるのが好ましく、特に配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチド変異体である。
非ポリペプチド部分の結合部位の除去および/または導入を目的とする本発明において開示されるアミノ酸変更に加えて、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、必要ならば、結合部位の導入または除去に関する必要がない他の変更、すなわち、他の置換、挿入または欠失を含んでもよいと理解される。これらは、例えば、N−および/またはC−末端の1以上のアミノ酸残基による切断、またはN−および/またはC−末端での1以上の余分な残基の添加、例えばN−末端でのメチオニン残基の添加を包含する。
本出願において用いられる「一つの違い」なる用語は、さらに別の違いが存在する可能性があることが意図される。従って、特定のアミノ酸の違いに加えて、特定されたもの以外のアミノ酸残基を突然変異させることができる。
一般に、ポリペプチド結合体は:
i)配列番号1に示すアミノ酸配列と、T1K、P2K、L3K、G4K、P5K、A6K、S7K、S8K、L9K、P10K、Q11K、S12K、F13K、L14K、L15K、E19K、Q20K、V21K、Q25K、G26K、D27K、A29K、A30K、E33K、A37K、T38K、Y39K、L41K、H43K、P44K、E45K、E46K、V48K、L49K、L50K、H52K、S53K、L54K、I56K、P57K、P60K、L61K、S62K、S63K、P65K、S66K、Q67K、A68K、L69K、Q70K、L71K、A72K、G73K、S76K、Q77K、L78K、S80K、F83K、Q86K、G87K、Q90K、E93K、G94K、S96K、P97K、E98K、L99K、G100K、P101K、T102K、D104K、T105K、Q107K、L108K、D109K、A111K、D112K、F113K、T115K、T116K、W118K、Q119K、Q120K、M121K、E122K、E123K、L124K、M126K、A127K、P128K、A129K、L130K、Q131K、P132K、T133K、Q134K、G135K、A136K、M137K、P138K、A139K、A141K、S142K、A143K、F144K、Q145K、S155K、H156K、Q158K、S159K、L161K、E162K、V163K、S164K、Y165K、V167K、L168K、H170K、L171K、A172K、Q173KおよびP174Kからなる群から選択される少なくとも1つの置換において異なるアミノ酸配列を含む、G−CSF活性を示すポリペプチド、および
ii)ポリペプチドのリシン残基、および所望によりN−末端アミノ酸残基と結合した少なくとも1つの非ポリペプチド部分を含む。
一具体例において、ポリペプチドは置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含み、2〜6、典型的には3〜6個の分子量約1000〜10000Daのポリエチレングリコール部分と結合する。
特に、結合体は2〜6、典型的には3〜6個の分子量約5000〜6000Daのポリエチレングリコール部分、たとえば分子量約5kDaのmPEGが結合している。好ましくは、結合体は4〜5個の、分子量約5000〜6000のポリエチレングリコール部分、たとえば5kDamPEGが結合している。
もう一つの具体例において、単一の数のPEG部分のみ、たとえばポリペプチドあたり2、3、4、5または6個のいずれかのPEG部分が結合しているように、あるいは異なる数のPEG部分が結合したポリペプチド結合体の所望の混合物、たとえば2−5、2−4、3−5、3−4、4−6、4−5または5−6個の結合したPEG部分を有する混合物を有する結合体を産生することができる。前記のように、好ましい結合体混合物の一例は、約5kDaの4−5PEG部分を有するものである。
このセクションにおいて規定したアミノ酸変化、特に置換は、特定のアミノ酸修飾、特にグリコシル化部位の導入および/または除去を開示する本明細書の他のセクションにおいて規定された任意のアミノ酸変化、好ましくは置換と組み合わせることができる。
前記のような導入および除去されたリシンを有することに加えて、本発明の結合体は、hG−CSF(T133)の天然のグリコシル化部位および/または導入されたグリコシル化部位でグリコシル化される、グリコシル化宿主細胞において発現されるポリペプチドの結果として1以上の炭水化物部分を含むことができる。結合体はしたがって、配列番号1に示すアミノ酸配列と、少なくとも1つの天然に存在しないグリコシル化部位がアミノ酸配列中に、L3N+P5S/T、P5N、A6N、S8N+P10S/T、P10N、Q11N+F13S/T、S12N+L14S/T、F13N+L15S/T、L14N+K16S/T、K16N+L18S/T、E19N+V21S/T、Q20N+R22S/T、V21N+K23S/T、R22N+I24S/T、K23N+Q25S/T、Q25N+D27S/T、G26N+G28S/T、D27N+A29S/T、A29N+L31S/T、A30N+Q32S/T、E33N+L35S/T、A37N+Y39S/T、T38N+K40S/T、Y39N+L41S/T、P44N+E46S/T、E45N+L47S/T、E46N+V48S/T、V48N+L50S/T、L49N+G51S/T、L50N+H52S/T、H52N+L54S/T、S53N+G55S/T、P60N、L61N、S63N+P65S/T、P65N+Q67S/T、S66N+A68S/T、Q67N+L69S/T、A68N+Q70S/T、L69N+ L71S/T、Q70N+A72S/T、L71N+G73S/T、G73N+L75S/T、S76N+L78S/T、Q77N+H79S/T、L78N、S80N+L82S/T、F83N+Y85S/T、Q86N+L88S/T、G87N+L89S/T、Q90N+L92S/T、E93N+I95S/T、P97N+L99S/T、L99N+P101S/T、P101N+L103S/T、T102N+D104S/T、D104N+L106S/T、T105N+Q107S/T、Q107N+D109S/T、L108N+V110S/T、D109N+A111S/T、A111N+F113S/T、D112N+A114S/T、F113N、T115N+I117S/T、T116N+W118S/T、W118N+Q120S/T、Q119N+M121S/T、 Q120N+E122S/T、M121N+E123S/T、E122N+L124S/T、E123N+G125S/T、 L124N+M126S/T、M126N+P128S/T、P128N+L130S/T、L130N+P132S/T、P132N+Q134S/T、T133N+G135S/T、Q134N+A136S/T、A136N+P138S/T、P138N+F140S/T、A139N+A141S/T、A141N+A143S/T、S142N+F144S/T、A143N+Q145S/T、F144N+R146S/T、Q145N+R147S/T、R146N+A148S/T、R147N+G149S/T、S155N+L157S/T、H156N+Q158S/T、S159N+L161S/T、L161N+V163S/T、E162N、V163N+Y165S/T、S164N+R166S/T、Y165N+V167S/T、R166N+L168S/T、V167N+R169S/T、L168N+H170S/T、R169N+L171S/TおよびH170N+A172S/T(ここにおいて、S/TはSまたはT残基、好ましくはT残基を示す)からなる群から選択される少なくとも1つの置換により導入されている点で異なるアミノ酸配列を含む、G−CSF活性を示すグリコシル化されたポリペプチドであってもよい。
別法として、この態様の結合体は、配列番号1に示すアミノ酸配列と、P5N、A6N、P10N、P60N、L61N、L78N、F113NおよびE162N、特に、P5N、A6N、P10N、P60N、L61N、F113NおよびE162N、たとえばP60N、L61N、F113NおよびE162Nからなる群から選択される少なくとも1つの置換において異なるアミノ酸配列を含むG−CSF活性を示すポリペプチドを含む。
別法として、この態様の結合体は、配列番号1に示すアミノ酸配列と、D27N+A29S、D27N+A29T、D104N+L106S、D104N+L106T、D109N+A111S、D109N+A111T、D112N+A114SおよびD112N+A114T、さらに好ましくは、D27N+A29S、D27N+A29T、D104N+L106S、D104N+L106T、D112N+A114SおよびD112N+A114T、たとえばD27N+A29S、D27N+A29T、D104N+L106SおよびD104N+L106Tからなる群から選択される少なくとも1つの置換において異なるアミノ酸配列を含む、G−CSF活性を示すポリペプチドを含む。
次のセクション、「ポリマー分子との結合」および「オリゴサッカライド部分との結合」において、特定の種類の非ポリペプチド部分との結合を記載する。一般に、本発明のポリペプチド結合体は、ポリペプチドを発現すを行うための条件下で適当な宿主細胞を培養し、ポリペプチドを回収し、その後、ポリペプチドをインビトロで非ポリペプチド部分と結合させることにより生成させることができる。少なくとも1つのN−またはO−グリコシル化部位を含むグリコシル化されたポリペプチドの場合、グリコシル化は好ましくは、インビボグリコシル化ができる真核宿主細胞の使用により得られる。
ポリマー分子との結合
ポリペプチドとカップリングされるポリマー分子は、任意の適当なポリマー分子、例えば天然または合成のホモポリマーまたはヘテロポリマーで、典型的には約300〜100000Daの範囲、例えば約500〜20000Da、さらに好ましくは約1000〜15000Daの範囲、さらに一層好ましくは約2000〜12000Daの範囲、たとえば約3000〜10000の範囲の分子量を有する。本明細書においてポリマー分子について使用される場合、「約」なる語は、およその平均分子量を示し、所定のポリマー調製においてはある分子量分布が通常存在するという事実を反映する。
ホモポリマーの例としては、ポリオール(すなわち、poly−OH)、ポリアミン(すなわち、poly−NH2)およびポリカルボン酸(すなわち、poly−COOH)が挙げられる。ヘテロポリマーは、異なるカップリング基、たとえばヒドロキシル基とアミン基を含むポリマーである。
ポリマー分子のポリペプチドとの共有結合を行うために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基を活性化された形態において、すなわち、反応性官能基を有する形態において提供する。適当な活性化ポリマー分子は、たとえばShearwater Corp.(Huntsville,AL,USA)から、またはpolyMASC Pharmaceuticals plc、UKから商業的に入手可能である。別法として、ポリマー分子は当該分野において慣例の方法により、たとえば、WO90/13540に開示されているようして活性化することができる。本発明において使用される活性化直鎖または分岐鎖ポリマー分子の例は、Shearwater Corp.1997年および2000年カタログに記載されている(Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives、出典明示により本発明の一部とする)。活性化PEGポリマーの特定の例は、次の直鎖PEG:NHS−PEG(例えば、SPA−PEG、SSPA−PEG、SBA−PEG、SS−PEG、SSA−PEG、SC−PEG、SG−PEGおよびSCM−PEG)、およびNOR−PEG)、BTC−PEG、EPOX−PEG、NCO−PEG、NPC−PEG、CDI−PEG、ALD−PEG、TRES−PEG、VS−PEG、IODO−PEG、およびMAL−PEG、並びに分岐鎖PEG、たとえば、PEG2−NHSおよびUS5,932,462およびUS5,643,575に開示されているもの(両方とも出典明示により本発明の一部として参照される)を包含する。さらに、出典明示により本発明の一部として参照される次の刊行物は、有用なポリマー分子および/またはPEG化反応を開示している:US5,824,778、US5,476,653、WO97/32607、EP229,108、EP402,378、US4,902,502、US5,281,698、US5,122,614、US5,219,564、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO96/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140、WO96/40791、WO98/32466、WO95/06058、EP439508、WO97/03106、WO96/21469、WO95/13312、EP921131、US5,736,625、WO98/05363、EP809996、US5,629,384、WO96/41813、WO96/07670、US5,473,034、US5,516,673、EP605963、US5,382,657、EP510356、EP400472、EP183503およびEP154316。
さらに好ましい具体例において、本発明の結合体は1)少なくとも大部分が少なくとも約50kDaの見かけの分子量を有し、2)前記のようにhG−CSFと比べて減少したインビトロ生物活性(減少したレセプター結合親和力)を有する。かかる結合体は、大きな見かけのサイズの結果としての低い腎臓クリアランスおよび低いインビトロ生物活性(低いレセプター結合親和力)の結果としての低いレセプター性クリアランスの両方を有することが見いだされた。全体の結果は、好中球の有効な刺激の点において、著しく増大したインビボ半減期、従って重要な臨床的利点をもたらす長期間の作用とあわせて優れた性能である。
結合の後、残存する活性化ポリマー分子を当該分野において公知の方法、たとえば第一アミンを反応混合物に添加することによりブロックし、結果として得られる不活化ポリマー分子を適当な方法により除去する(たとえば、物質および方法参照)。
好ましい具体例において、本発明のポリペプチド結合体は、PEG化に利用可能なポリペプチドにおけるいくつか、大部分または好ましくは実質的にすべてのリシン残基と結合したPEG分子、特に直鎖または分岐鎖PEG分子、たとえば約1−15kDa、典型的には約2−12kDa、たとえば約3−10kDa、たとえば約5または6kDaの分子量を有するものを含む。
さらにもう一つの具体例において、本発明のポリペプチド結合体は、PEG化に利用可能なポリペプチド中のリシン残基およびさらにポリペプチドのN−末端アミノ酸残基に結合したPEG分子を含むことができる。
オリゴサッカライド部分との結合は、インビボまたはインビトロ、好ましくはインビボで行われる。1以上のグリコシル化部位を有するG−CSF分子のインビボグリコシル化を達成するために、ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列をグリコシル化真核発現宿主中に挿入しなければならない。発現宿主細胞は、真菌(糸状菌または酵母)、昆虫または動物細胞あるいはトランスジェニック植物細胞から選択することができる。一具体例において、宿主細胞は哺乳動物、たとえばCHO細胞、BHKまたはHEK、たとえばHEK293細胞、または昆虫細胞、たとえばSF9細胞、または酵母細胞、たとえば、エス・セレビシエ(S. cerevisiae)またはピチア・パストリス(Pichia pastoris)、あるいは後述の宿主細胞のいずれかである。たとえば、WO87/05330およびAplin et al., CRC Crit Rev. Biochem., pp. 259-306, 1981に記載されているように、グリコシド(たとえばデキストラン)のポリペプチドのアミノ酸残基とのインビトロ共有カップリングも用いることができる。
TG’aseは一般に非常に特異的な酵素であり、タンパク質の表面上に露出しているすべてのGln残基が、アミノ含有物質とのTG’aseにより触媒される架橋に利用可能であるわけではない。反対に、ごくわずかのGln残基がTG’ase基質として本来機能するが、どのGln残基が良好なTG’ase基質であるかを支配する正確なパラメータはわかっていない。従って、タンパク質をTG’aseにより触媒される架橋反応を受けやすくするために、都合の良い位置でTG’ase基質として非常によく機能することが知られているアミノ酸配列を添加することがあらかじめ必要である場合が多い。いくつかのアミノ酸配列が優れた天然のTG’ase基質、たとえばサブスタンスP、エラフィン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、α2−プラスミン阻害物質、α−カゼイン、およびβ−カゼインであるか、またはこれを含むことが知られている。
過剰のポリマー結合は、ポリマーが結合しているポリペプチドの活性の損失につながる可能性があることが報告されている。この問題は、たとえば機能的部位に位置する結合基の除去または機能的部位が結合中にブロックされるように結合前に機能的部位をブロックすることにより排除することができる。後者の方法は、本発明のさらに別の態様を構成する(第一の方法はすでに例示し、たとえば機能的部位の近くに位置するリシン残基の除去による)。さらに詳細には、第二の方法に従って、ポリペプチドと非ポリペプチド部分間の結合は、ポリペプチドの機能的部位が、ポリペプチドの機能的部位と結合できるヘルパー分子によりブロックされる条件下で行われる。
結合を行う前にポリペプチドをヘルパー分子と相互作用させる。これにより、ポリペプチドの機能的部位がシールドまたは保護され、その結果、ポリマーなどの非ポリペプチド部分による誘導化に利用できなくなる。ヘルパー分子から溶出した後、非ポリペプチド部分とポリペプチド間の結合は少なくとも部分的に保存された機能的部位で回復できる。
ポリペプチドの機能的部位を結合からシールドするために用いられるヘルパー分子の性質とは無関係に、ヘルパー分子は、かかる基との結合がヘルパー分子からの結合したポリペプチドの脱着を阻害する分子の一部において適当な非ポリペプチド部分の結合基を含まないか、またはごくわずかしか含まないのが望ましい。この結果、ポリペプチドのシールドされていない部分に存在する結合基との選択的結合を得ることができ、ヘルパー分子を結合の繰り返されるサイクルに再使用することができる。たとえば、非ポリペプチド部分が、結合基としてリシンのイプシロンアミノ基またはN−末端アミノ酸残基を有するPEGなどのポリマー分子である場合、ヘルパー分子は結合可能なイプシロンアミノ基が実質的にないのが望ましく、イプシロンアミノ基がないのが好ましい。従って、好ましい具体例において、ヘルパー分子は、ポリペプチドの機能的部位と結合できるタンパク質またはペプチドであり、該タンパク質またはペプチドは、適当な非ポリペプチド部分の結合可能な結合基がない。
さらにもう一つの具体例において、ヘルパー分子はまず、たとえばセファデクスまたはアガロースビーズなどのカラム充填物質などの固相、あるいは反応容器などの表面と共有結合する。次に、ヘルパー分子を有するカラム物質上にポリペプチドをかけ、当該分野において公知の方法に従って、たとえば前記のようにして結合を行う。この手順により、ポリペプチド結合体が溶出によりヘルパー分子から分離される。ポリペプチド結合体は、ポリペプチド結合体の本質的な分解に至らない物理化学的条件下で慣用の技術により溶出される。ポリペプチド結合体を含有する液相を、ヘルパー分子が共有結合したままである液相から分離する。分離は、他の方法で行うことができる:たとえば、ヘルパー分子を特異的バインダー(たとえば、ストレプトアビジン)により認識できる第二の分子(たとえば、ビオチン)で誘導化させることができる。特異的バインダーを固相と結合させることができ、これにより、その後の溶出に際し、ヘルパー分子−第二分子複合体を保持するが、ポリペプチド結合体を保持しない第二のヘルパー−固相カラム上に通すことにより、ポリペプチド結合体をヘルパー分子−第二分子複合体から分離することができる。ポリペプチド結合体は、任意の適当な方法でヘルパー分子から放出させることができる。脱保護は、ヘルパー分子が結合しているG−CSFの機能的部位からこれが解離する条件を提供することにより達成できる。たとえば、ポリマーが結合する抗体と抗イディオタイプ抗体間の複合体は、pHを酸性またはアルカリ性pHに調節することにより解離させることができる。
もう一つ別の具体例において、ポリペプチドは標識、すなわち、典型的には1−30、たとえば1−20アミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはペプチド鎖を有する融合タンパク質として発現される。迅速で簡単な精製を可能にすることに加えて、標識は、標識されたポリペプチドと非ポリペプチド部分間の結合を達成するための都合の良い手段である。特に、標識はマイクロタイタープレートまたは標識されたポリペプチドが標識により固定化される他の担体、たとえば常磁性体ビーズにおける結合を達成するために用いることができる。標識されたポリペプチドの、たとえばマイクロタイタープレートにおける結合は、標識されたポリペプチドをマイクロタイタープレートにおいて培養ブロスから直接(原則として精製しない)固定化し、結合に付すことができる利点を有する。これにより、プロセス工程の合計数(発現から結合まで)を減少させることができる。さらに、標識はスペーサー分子として機能することができ、結合される固定化されたポリペプチドの向上された利用可能性を確実にする。標識されたポリペプチドを使用した結合は、本発明において開示された任意の非ポリペプチド部分、たとえばPEGなどのポリマー分子に対するものであってよい。
Met−Lys−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−Gln−Gln(配列番号5)
His−His−His−His−His−His(配列番号9)
Met−Lys−His−His−His−His−His−His(配列番号10)
Met−Lys−His−His−Ala−His−His−Gln−His−His(配列番号11)
Met−Lys−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−Gln(配列番号12)
または次のうちの任意のものである:
EQKLI SEEDL(配列番号13)(Mol. Cell. Biol. 5:3610-16, 1985に記載されているC−末端標識)
DYKDDDDK(配列番号14)(C−またはN−末端標識)
YPYDVPDYA(配列番号15)。
前記標識に対する抗体は、たとえばADI、Aves Lab and Research Diagnoticsから商業的に入手可能である。
PEG化のために標識されたポリペプチドを使用する都合の良い方法を以下の物質および方法のセクションに記載する。その後の標識のポリペプチドからの開裂は、商業的に入手可能な酵素の使用により達成することができる。
本発明のポリペプチドまたは本発明の結合体のポリペプチド部分(所望によりグリコシル化形態であってよい)は、当該分野において公知の任意の適当な方法により産生することができる。かかる方法は、ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を構築し、該配列を適当な形質転換またはトランスフェクトされた宿主において発現することを含む。しかしながら、本発明のポリペプチドは、あまり効率的ではないが、化学合成または化学合成の組み合わせまたは化学合成と組み換えDNA技術の組み合わせにより産生することができる。
ヌクレオチド配列は、都合の良い方法にしたがって、部位特異的突然変異誘発により都合良く修飾される。別法として、ヌクレオチド配列は、化学合成、たとえばオリゴヌクレオチドが所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチド合成器を使用し、好ましくは組み換えポリペプチドが産生される宿主細胞において有利なコドンを選択することにより調製される。たとえば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小オリゴヌクレオチドを、PCR、結紮または結紮連鎖反応(LCR)により合成し、組み立てることができる(Barany, PNAS 88:189-193, 1991)。個々のオリゴヌクレオチドは典型的には相補アセンブリの5’または3’オーバーハングを含む。
もちろん、本明細書に記載されるポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を発現するために十分等しくすべてのベクターおよび発現調節配列が機能するわけではないことは理解される。また、すべての宿主が同じ発現系について等しく機能するわけではない。しかしながら、これらのベクター、発現調節配列および宿主間で実験を行わずに選択を行うことができる。たとえば、ベクターの選択において、ベクターはその中で複製するかまたは染色体中に統合できなければならないので、宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数は、コピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのベクターによりエンコードされる任意の他のタンパク質の発現も考慮すべきである。発現調節配列の選択において、様々な因子を考慮しなければならない。これらは、たとえば配列の相対的強度、その調節可能性、およびそのポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列との適合性、特に潜在的二次構造を含む。宿主は、その選択されたベクターとの適合性、ヌクレオチド配列によりコードされた生成物の毒性、その分泌特性、そのポリペプチドを正確に折り畳む能力、その発酵または培養要件、およびヌクレオチド配列によりコードされる生成物の精製の容易性を考慮することにより選択すべきである。
ベクターは好ましくは、本発明のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の転写に必要なさらなるセグメントと作動可能に結合した発現ベクターである。ベクターは典型的にはプラスミドまたはウイルスDNAから誘導される。本明細書において記載される宿主細胞における発現に適当な多くの発現ベクターは、商業的に入手可能であるか、または文献に記載されている。真核宿主の有用な発現ベクターは、例えば、SV40、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスからの発現調節配列を含むベクターを包含する。具体的なベクターは、例えば、pCDNA3.1(+)/Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)およびpCI−neo(Stratagene, La Jolla, CA, USA)である。酵母細胞の有用な発現ベクターは、2μプラスミドおよびその誘導体、POT1ベクター(US4,931,373)、Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996に記載されているpJSO37ベクター、およびpPICZ、A、BまたはC(Invitrogen)を包含する。昆虫細胞の有用なベクターは、pVL941、pBG311(Cate et al., ”Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells”, Cell, 45, pp. 685-98 (1986))、pBluebac4.5およびpMelbac(両方ともInvitrogenから入手可能)を包含する。細菌宿主の有用な発現ベクターは、公知細菌プラスミド、例えばイー・コリから得られるプラスミド(pBR322、pET3aおよびpET12a(両方ともNovagen Inc.,WI,USAから得られる)を含む)、さらに広範囲の宿主プラスミド、たとえばRP4、ファージDNA、たとえばファージラムダの多くの誘導体、例えば、NM989、および他のDNAファージ、たとえばM13および糸状一本鎖DNAファージを包含する。
組み換えベクターはさらに、問題の宿主細胞においてベクターの複製を可能にするDNA配列を含んでもよい。かかる配列の例(宿主細胞が哺乳動物細胞である場合)は、複製のSV40起源である。宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターの複製を可能にする適当な配列は酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1−3および複製起源である。
ベクターは選択可能なマーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠点を補完する遺伝子、たとえばジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードする遺伝子またはシゾサッカロミセス・ポンベTPI遺伝子(P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130により記載)、またはアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬剤の耐性を賦与するものを含む。サッカロミセス・セレビシエに関して、選択可能なマーカーは、ura3およびleu2を包含する。糸状菌に関して、選択可能なマーカーはamdS、pyrG、arcB、niaDおよびsCを包含する。
哺乳動物において転写を行うための適当な調節配列の例は、SV40およびアデノウイルスの初期および後期プロモーター、たとえばアデノウイルス2主要後期プロモーター、MT−1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター(CMV)、ヒト延長因子1α(EF−1α)プロモーター、ショウジョウバエ最小熱ショックタンパク質70プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、ヒトユビキチン(UbC)プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、SV40またはアデノウイルスElb領域ポリアデニル化シグナルおよびコザックのコンセンサス配列(Kozak, M. J Mol Biol 1987 Aug 20;196(4):947-50)を含む。
昆虫細胞における転写を行うための適当な調節配列の例は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター、Autographa californica多核体症ウイルス塩基性タンパク質プロモーター、バクロウイルス最初期遺伝子1プロモーター、バクロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモーター、およびSV40ポリアデニル化配列を含む。酵母宿主細胞において使用するために適当な調節配列の例は、酵母α−接合型システムのプロモーター、酵母トリオースホスフェートイソメラーゼ(TPI)プロモーター、酵母解糖遺伝子またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのプロモーター、ADH2−4cプロモーター、および誘導GALプロモーターを包含する。糸状菌宿主細胞において使用するために適当な調節配列の例は、ADH3プロモーターおよびターミネーター、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼトリオースホスフェートイソメラーゼまたはアルカリプロテアーゼ、エイ・ニガー(A. niger)α−アミラーゼ、エイ・ニガーまたはエイ・ニデュランス(A. nidulans)グルコアミラーゼ、エイ・ニデュランスアセトアミダーゼ、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼまたはリパーゼをエンコードする遺伝子から誘導されるプロモーター、TP11ターミネーターおよびADH3ターミネーターを包含する。細菌宿主細胞における使用に適当な調節配列の例は、lacシステム、trpシステム、TACまたはTRCシステムのプロモーター、およびファージラムダの主要プロモーター領域を包含する。
ポリペプチドは、これらに限定されないが、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除)、電気泳動法(例えば、調製的等電点フォーカシング)、溶解度差(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、SDS−PAGE、または抽出(例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989参照)を包含する当該分野において公知の様々な方法により精製することができる。G−CSF活性を示すポリペプチドを精製するための特定の方法は、D. Metcalf and N. A. Nicola in The hemopoietic colony-stimulating factors, p. 5051, Cambridge University Press (1995), by C. S. Bae et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 52:338-344 (1999)およびUS4,810,643に記載されている。
さらにもう一つの態様において、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドまたは結合体および少なくとも一つの医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物を含む。
本発明のポリペプチド、結合体または医薬組成物は、疾患の治療、特に化学療法、放射線療法および骨髄移植を受けている癌患者における感染症の予防、末梢血前駆細胞移植における採集のための前駆細胞の動員、重い慢性または相対的白血球減少症の治療、急性骨髄性白血病の患者の治療、AIDSまたは他の免疫不全疾患の治療、および抗真菌療法、特に全身性または侵襲性カンジダ症の治療用医薬を製造するために用いることができる。
本発明のポリペプチドまたは結合体は、「そのまま」および/またはその塩形態において用いることができる。適当な塩としては、これらに限定されないが、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、たとえばナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムとの塩、ならびに亜鉛塩が挙げられる。これらの塩または複合体は、結晶および/またはアモルファスな構造として存在し得る。
「医薬的に許容される」とは、採用された用量および濃度で、それが投与される患者において都合の悪い効果を引き起こさない担体または賦形剤を意味する。このような医薬的に許容される担体および賦形剤は当該分野において周知である(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000] ;およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]参照)。
本発明の医薬組成物は、単独または他の治療薬と組み合わせて投与することができる。これらの薬剤は、同じ医薬組成物の一部として組み入れてもよいし、あるいは別の治療スケジュールと同時にまたはこれと一致して、本発明のポリペプチドまたは結合体と別に投与してもよい。加えて、本発明のポリペプチド、結合体または医薬組成物は、他の治療のアジュバントとして用いることができる。
本発明の目的についての「患者」は、ヒトおよび他の哺乳動物の両方を包含する。従って、該方法はヒトの治療および獣医学的用途の両方に適用可能である。
投与経路
本発明の処方の投与は、これらに限定されないが、経口、皮下、静脈内、大脳内、鼻内、経皮、腹膜組織内、筋肉内、肺臓内、経膣、経直腸、眼内を含む様々な方法、または任意の他の許容される方法で行うことができる。処方は、注入により連続して投与できるが、当該分野において周知の技術を用いたボーラス注射が許容される。典型的には、処方はたとえば皮下経路による非経口投与用に設計される。
医薬組成物の一例は、非経口投与用に設計された溶液である。多くの場合において医薬溶液処方は、即座に使用するのに適した液体形態で提供されるが、このような非経口処方は、凍結または凍結乾燥された形態においても提供できる。前者の場合において、組成物は使用前に解凍しなければならない。凍結乾燥製剤は一般に液体の対応するものよりも安定であることが当業者により認識されているので、後者の形態は、様々な貯蔵条件下で組成物中に含まれる活性化合物の安定性を向上させるためにしばしば用いられる。このような凍結乾燥製剤は、1以上の適当な医薬的に許容される希釈剤、例えば注射用滅菌水または滅菌生理食塩水を添加することにより使用前に復元される。
さらに他のミセル性賦形剤は、増量剤またはフィラー(例えばデンプン)、キレート化剤(例えばEDTA)、酸化防止剤(例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE)および補助溶剤を包含する。
活性成分は、例えばヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ(メチルメタクリレート)ミクロカプセルなどの、例えばcoascervation技術または界面重合により調製されるミクロカプセル中、コロイド状ドラッグデリバリーシステム中(たとえばリポソーム、アルブミン微小球、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)またはマクロエマルジョン中に封入することができる。このような技術は、前出のRemington's Pharmaceutical Sciencesに開示されている。
インビボ投与に用いられる非経口処方は無菌でなければならない。これは、たとえば滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
持続性放出製剤の適当な例は、ポリペプチドまたは結合体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス、フィルムまたはミクロカプセルなどの適当な形態を有するマトリックスを包含する。持続性放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド、L−グルタミン酸およびエチルL−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばProLeaseテクノロジーまたはLupron Depot(乳酸−グリコール酸コポリマーおよびレオプロリドアセテートからなる注射可能な微小球)、およびポリ−D−(−)−ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、100日までまたはそれ以上などの長期間の分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルはさらに短い期間タンパク質を放出する。封入されたポリペプチドが長時間体内に残存する場合、これらは37℃で湿度にさらされる結果、変性または凝集し、その結果、生物学的活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。関与するメカニズムに応じて安定化のために合理的な方法を考案することができる。例えば、凝集のメカニズムがチオジスルフィド交換による細胞間S−S結合形成であることが見いだされるならば、安定化はスルフィドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、湿分を調節し、適当な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成することができる。
本明細書に記載される全ての文献はあらゆる目的に関して出典明示により全体として本発明の一部として参照される。
本発明を以下の非制限的実施例においてさらに説明する。
修飾されるアミノ酸を決定するために用いられる方法
利用可能な表面積(ASA)
NMR分光分析(Zink et al. (1994) Biochemistry 33: 8453-8463)により決定された3Dアンサンブルの10の構造は、Protein Data Bank(PDB)から入手可能である(www.rcsb.org/pdb/)。この情報は、コンピュータープログラムアクセス(B. Lee and F.M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971))バージョン2((
著作権) 1983 Yale University)に入力することができ、構造中の各原子の利用可能な表面積(ASA)を計算するために用いることができる。この方法は典型的には1.4Åのプローブサイズを使用し、利用可能な表面積(ASWA)をプローブの中心により形成される面積と定義する。この計算の前に、タンパク質に直接関連しない他の原子同様、全ての水分子および全ての水素原子を同格の組から除去しなければならない。
側鎖における原子のASAの合計を、延長されたALA−x−ALAトリペプチドにおける残基タイプの側鎖原子のASAを表す値で割ることにより、側鎖原子のASA率を計算する。Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J.Mol.Biol.220, 507-530参照。この例に関して、CA原子はグリシン残基の側鎖の一部と見なされるが、残りの残基についてはみなされない。次の表の値は、側鎖の標準100%ASAとして使用される:
原子間の距離は、分子グラフィクスソフトウェア、たとえばInsightII v。98.9、MSI INC.を用いて最も容易に決定される。
修飾されるアミノ酸残基に関する一般的問題
すでに説明したように、本発明にしたがって修飾されるアミノ酸は、好ましくはその側鎖の表面が露出しているもの、特に側鎖の約25%が分子の表面で露出しているもの、さらに好ましくは、側鎖の50%以上が露出しているものである。別の問題は、レセプター界面に位置する残基は、好ましくはレセプター結合または活性化との干渉の可能性を回避するか、または少なくとも最小限に抑えるために好ましくは排除されることである。さらなる問題は、最も近いLys(Glu、Asp)CB−CB(GlyについてCA)から10Å未満である残基も排除すべきことである。最後に、修飾の好ましい位置は、特に親水性および/または荷電残基、すなわち、Asp、Asn、Glu、Gln、Arg、His、Tyr、SerおよびThrを有するものであり、アルギニン残基を有する位置が特に好ましい。
以下の情報は、本発明に従って修飾されるアミノ酸残基を同定する場合に一般に考慮すべき因子を説明する。
X線結晶学((Hill et al. (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 51675171)およびNMR分光学(Zink et al. (1994) Biochemistry 33: 8453-8463)により、ヒトG−CSFについて三次元構造が報告されている。前記のように、Aritomiら(Nature 401:713-717, 1999)は、次のhG−CSF残基をレセプター結合界面の一部であると同定した:G4、P5、A6、S7、S8、L9、P10、Q11、S12、L15、K16、E19、Q20、L108、D109、D112、T115、T116、Q119、E122、E123、およびL124。従って、これらの残基を修飾することが可能であるが、これらの残基は修飾から除外するのが好ましい。
hG−CSFおよびその変異体の溶液中でのPEG化
ヒトG−CSFおよびその変異体を、50mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl、pH8.5中で250μg/mlの濃度でPEG化する。PEGのモル過剰は、タンパク質上のPEG化部位に関して5〜100倍である。反応混合物をサーモミキサー中37℃、1200rmpで30分間入れる。30分後、1モル過剰のグリシンを添加することにより、反応を停止させる。
カチオン交換クロマトグラフィーを適用して、反応混合物から過剰のPEG、グリシンおよび他の副生成物を除去する。PEG化反応混合物を20mMクエン酸ナトリウムpH2.5でイオン強度が7mS/cmより低くなるまで希釈する。5N HClを用いてpHを2.5に調節する。20mM クエン酸ナトリウムpH2.5で平衡化したSP−セファロースFFカラムに混合物をかける。4カラム体積の平衡緩衝液を用いて未結合物質をカラムから洗い流す。20mMクエン酸ナトリウム、750mM 塩化ナトリウムを添加することにより、PEG化タンパク質は3カラム体積において溶出される。純粋なPEG化G−CSFを濃縮し、VivaSpin濃縮装置、分子量カットオフ(mwco):10kDaを用いて緩衝液交換を行う。
G−CSF活性を示すポリペプチドを適当な標識、例えば前記の一般的説明において説明した標識のいずれかを用いて発現し、標識されたポリペプチドを固定化できるマイクロタイタープレートの1以上のウェルに培養ブロスを移す。標識がMet−Lys−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−Gln−Glnである場合、QUIAGENから商業的に入手可能なニッケル−ニトリロトリ酢酸(Ni−NTA)HisSorbマイクロタイタープレートを使用できる。
標識されたポリペプチドをマイクロタイタープレートに固定した後、結合およびその後のPEG化に適当な緩衝液中でウェルを洗浄し、続いてウェルを適当な活性化PEGと共にインキュベートする。一例として、Shearwater Corp.から得られるM−SPA−500を使用する。活性化PEGとポリペプチドのモル比を最適化するべきであるが、典型的には10:1以上、例えば約100:1またはそれ以上までである。周囲温度で適当な反応時間後、典型的には約1時間後、活性化PEG溶液を除去することにより反応を停止させる。適当な緩衝液と共にインキュベーションすることにより、結合したタンパク質をプレートから溶出させる。適当な溶出緩衝液は、イミダゾール、過剰のNTAまたは別のキレート化化合物を含有し得る。結合したタンパク質を必要に応じて生物学的活性および免疫原性について分析する。標識は所望により当該分野において公知の方法を用いて開裂させてもよい。例えばジアミノペプチダーゼを用いて、位置1のGlnをGCT(グルタミルシクロトランスフェラーゼ)でピログルタミルに変換し、最後にPGAP(ピログルタミルアミノペプチダーゼ)で開裂させて、未標識タンパク質を得ることができる。このプロセスは、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーのいくつかの工程を含む。別法として、標識されたポリペプチドを結合させることができる。
レセプター認識に関与するリシンのPEG化を排除する方法でhG−CSFのPEG化を最適化するために、次の方法が開発された:
精製されたhG−CSFを実施例4に記載するようにして得る。2:2の化学量論比のhG−CSFポリペプチドおよびG−CSFレセプターの可溶性ドメインからなるホモダイマー複合体をリン酸塩緩衝塩溶液(PBS)緩衝液pH7中で形成する。hG−CSFポリペプチドの濃度は約2μg/mlまたは1μMであり、レセプターは等モル濃度で存在する。
Shearwater Corp.から得られるM−SPA−500を、hG−CSFポリペプチドにおける結合部位の数に対して10、25および50モル過剰に対応する3つの異なる濃度で添加する。30分の反応期間の後、反応混合物のpHをpH2.0に調節し、反応混合物をVydac C18カラムにかけ、本質的に記載されているようにしてアセトニトリル勾配で溶出する(Utsumi et al., J. Biochem., Vol. 101, 11991208, (1987))。別法として、イソプロパノール勾配を用いることができる。
本明細書に記載する一次スクリーニングアッセイを用いてフラクションを分析し、この方法により得られる活性PEG化hG−CSFポリペプチドを−80℃でPBS(pH7、1mg/mlヒト血清アルブミン(HSA)を含有する)で保存する。
hG−CSFおよびその変異体の分子サイズの決定
結合または非結合hG−CSFまたはその変異体の分子量を、SDS−PAGE、ゲル濾過、マトリックス支援レーザー脱着質量分析または平衡遠心分離のいずれかにより決定する。前記のように、SDS−PAGEは「見かけの分子量」に関する情報を提供する。実際の分子量は、質量分析を用いて有利に決定できる。SDS−PAGEは、Invitrogenから得られるNuPAGEキット(Novex高性能プレキャストゲル)を用いて行われる。15μlのサンプルをNuPAGE4012%Bis−Trisゲル(Cat.Nr.NPO321)上にかけ、NuPAGE MES SDSランニング緩衝液(Cat.Nr.NPO002−02)で35分間200Vおよび120mAで溶出する。
ポリペプチドの濃度は、280nmでの光学密度測定、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、または当該分野において周知の他のかかる免疫検出技術を用いて測定できる。さらに、サンプル中のポリペプチド濃度は、ポリペプチドについて特異的な抗体でコートされたBiacoreチップを用いてBiacore装置で測定できる。
かかる抗体は、様々な化学反応によりBiacoreチップと共有結合できる。別法として、抗体を、例えば、抗ポリペプチド抗体のFc部分について特異的な抗体により非共有結合させることができる。Fc特異的抗体をまずチップと共有結合させる。抗ポリペプチド抗体を次いでチップ上に流し、方向性のある方法で第一の抗体により結合させる。さらに、ストレプトアビジンでコートされた表面(例えば、Biacore Sensor Chip SA(登録商標)) (Real-Time Analysis of Biomolecular Interactions, Nagata and Handa (Eds.), 2000, Springer Verlag, Tokyo; Biacore 2000 Instrument Handbook, 1999, Biacore AB)を用いてビオチニル化抗体を固定化できる。
サンプルをチップ上に流す場合、ポリペプチドはコートされた抗体と結合し、質量における増加を測定できる。既知の濃度においてポリペプチドの調製物を使用することにより、標準曲線を作成でき、その後サンプル中のポリペプチドの濃度を決定できる。サンプルの各注射後、センサーチップを、結合分析物を除去する適当な溶離剤(例えば低pH緩衝液)により再生する。
一般に、適用された抗体は野生型ポリペプチドに対して生じさせたモノクローナル抗体である。突然変異の導入または野生型ポリペプチドの他の操作(特別のグリコシル化またはポリマー結合)はかかる抗体による認識を変更させることができる。さらに、ポリペプチドの分子量の増大を引き起こすかかる操作の結果、プラズモン共鳴シグナルが増大する。結果として、試験される確聞しについての標準曲線を作成する必要がある。
一次アッセイ1−インビトロG−CSF活性アッセイ
ネズミ細胞系NFS−60(J. Ihle博士(St. Jude Children's Research Hospital, Tennessee, USA)から入手)の増殖は、成長培地中の活性G−SCFの存在に依存する。従って、hG−CSFおよびその変異体のインビトロ生物学的活性は、成長培地にG−CSF活性サンプルを添加し、続いて一定期間インキュベーションした後NFS−60細胞が分割する数を測定することにより決定できる。
NFS−60細胞を、10%w/wFBS(ウシ胎仔血清)、1%w/wPen/Strep、10μg/リットルのhG−CSFおよび2mM Glutamaxを含有するIscoves DME培地中で維持する。サンプルを添加する前に、細胞をhG−CSFを含まない成長培地で2回洗浄し、1ミリリットルあたり2.2×105細胞の濃度に希釈する。100μlの細胞懸濁液を96ウェルマイクロタイタープレート(Corning)の各ウェルに添加する。
結合または非結合G−CSFまたはその変異体を含有するサンプルを成長培地中1.1×10−6Mから1.1×10−13Mの間の濃度に希釈する。10μlの各サンプルをNFS−60細胞を含有する3ウェルに添加する。10μlの哺乳動物成長培地からなる対照を各マイクロタイタープレート上の8ウェルに添加する。細胞を48時間インキュベートし(37℃、5%CO2)、WST−1細胞増殖剤(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を用いて、各ウェル中に分割された細胞の数を定量化する。0.01mlのWST−1をウェルに添加し、続いて150分間37℃で、5%CO2空気中でインキュベーションする。生存可能な細胞におけるテトラゾリウム塩WST−1のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによる開裂の結果、ホルマザンが形成され、これは450nmでの吸収を測定することにより定量化される。これによって、各ウェル中の生存細胞の数が定量化される。
これらの測定に基づいて、各結合および非結合G−CSF分子またはその変異体の用量依存曲線を計算し、その後、各分子についてEC50値を決定できる。この値は、非結合ヒトG−CSFの活性の最大増殖の50%を得るために必要な活性G−CSFタンパク質の量に等しい。従って、EC50値は、所定のタンパク質のインビトロ活性の直接測定値であり、低いEC50値は活性が高いことを示す。
ネズミ造血細胞系BaF3を、ヒトG−CSFレセプターおよび転写レギュレーターのプロモーターをルシフェラーゼレポーター遺伝子の前に有するプラスミドでトランスフェクトする。かかる細胞系をG−CSFサンプルで刺激すると、多くの細胞内反応の結果、fos発現の刺激に至り、結果としてルシフェラーゼが発現される。この刺激をSteady−Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega,Cat.No.E2510)によりモニターし、これによりG−CSFサンプルのインビトロ活性を定量化できる。
BaF3/hGCSF−R/pfos−luxを37℃で加湿した5%CO2雰囲気中、完全培養培地(RPMI−1640/HEPES(Gibco/BRL,Cat.No.22400)、10%FBS(HyClone、特徴化)、1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco/BRL、Cat.No.22400)、1×L−グルタミン(Gibco/BRL,Cat.No.25030−081)、10%WHEI−3順化培地(muIL−3の供給源)中に維持し、5×105細胞/mL(コンフルエント)の密度まで増殖させる。細胞を約2×104細胞/mLで2〜3日ごと再播種する。
これらの測定に基づいて、各結合および非結合G−CSF分子またはその変異体についての用量依存性曲線を研鑽し、その後、各分子についてのEC50値を決定できる。
rhG−CSFまたはその変異体のhG−CSFレセプターに対する結合を、標準的結合分析を用いて研究する。レセプターは生成された細胞外レセプタードメイン、精製された細胞原形質膜に結合したレセプター、または全細胞であり、細胞の供給源は、G−CSFレセプター(例えばNFS−60)を本質的に発現する細胞系またはレセプターをエンコードするcDNAでトランスフェクトされた細胞のいずれかである。rhG−CSFまたはその変異体の天然G−CSFと結合部位を競争する能力を、標識されたG−CSF類似体、たとえばビオチニル化hG−CSFまたは放射性ヨウ素標識hG−CSFと共にインキュベートすることにより分析する。かかる分析の一例は、Yamasakiら(Drugs. Exptl. Clin. Res. 24:191-196 (1998))により記載されている。
hG−CSFレセプターの細胞外ドメインは、所望によりFcと結合させ、96ウェルプレート中に固定化することができる。rhG−CSFまたはその変異体を次に添加し、特異的抗hG−CSF抗体またはビオチニル化または放射線ヨウ素標識hG−CSFのいずれかを用いてこれらの結合を検出する。
本発明の重要な態様は、ポリペプチドをポリマー部分と結合させるかにかかわらず、hG−CSFの構築により得られる延長された生物学的半減期である。hG−CSF血清濃度の急速な減少は、結合または非結合hG−CSFおよびその変異体での治療に対する生物学的反応を評価することが重要になる。好ましくは、本発明の結合および非結合hG−CSFおよびその変異体は、静脈内投与後にも延長された血清半減期を有し、例えばELISA法または一次スクリーニングアッセイにより測定することを可能にする。インビボ生物学的半減期の測定は、以下に記載するようにして行った。
オススプレーグ・ドーリーラット(7週令)を使用した。投与当日に、動物の体重を測定した(動物あたり280〜310グラム)。体重1kgあたり100μgの非結合および結合hG−CSFサンプルをそれぞれに3匹のラットの尾静脈中に静脈内注射した。注射の1分、30分、1、2、4、6、および24時間後、CO2麻酔下で500μlの血液を各ラットの眼から抜き取った。血液サンプルを室温で1時間半保存し、続いて遠心分離(4℃、1800×gで5分間)により血清を単離した。血清サンプルを−80℃で分析の日まで保存した。活性G−CSFの血清サンプル中の量をG−CSFインビトロ活性アッセイ(一次アッセイ2参照)によりサンプルを氷上で解凍した後に定量化した。
G−CSFまたはその変異体のインビボ半減期を測定するためのアッセイのもう一つの例は、US5,824,778に記載され、その内容は本発明の一部として参照される。
SPFスプレーグ・ドーリーラット(M&B A/S、Denmarkから購入)におけるhG−CSFのインビボ生物学的影響の測定を用いて、結合および非結合G−CSFおよびその変異体の生物学的有効性を評価する。
到着した日にラットをランダムに6のグループに分配する。動物を7日間順化させ、健康状態が不良であるかまたは体重が極端である動物を除外する。順化期間の最初でのラットの体重の範囲は250〜270gである。
投与当日、ラットを16時間絶食させ、続いて体重1kgあたり100μgのhG−CSFまたはその変異体を皮下注射する。各hG−CSFサンプルを6匹のランダム化したラットの1グループに注射する。投与の6、12、24、36、48、72、96、120および144時間後に、300μlのEDTA安定化血液の血液サンプルをラットの尾静脈から抜き取る。血液サンプルを次の血液学的パラメータに関して分析する:ヘモグロビン、赤血球数、ヘマトクリット、平均細胞体積、平均細胞ヘモグロビン濃度、平均細胞ヘモグロビン、白血球数、白血球数の差(好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球、単球)。これらの測定に基づいて、結合および非結合hG−CSFおよびその変異体の生物学的有効性を評価する。hG−CSFまたはその変異体のインビボ生物学的活性の測定についての分析のさらなる例は、US5,681,720、US5,795,968、US5,824,778、US5,985,265およびBowen et al., Experimental Hematology 27:425-432 (1999)により記載されている。
SPFスプレーグ・ドーリーラットをM&B A/S、Denmarkから購入した。到着日にラットをランダムに6のグループに分配する。動物を7日間順化させ、健康状態が不良であるかまたは体重が極端である動物を除外する。順化期間の最初でのラットの体重の範囲は250〜270gである。
hG−CSFサンプル投与の24時間前に、ラットに体重1kgあたり50または90mgのシクロホスファミド(CPA)を腹膜組織内注射する。PEG化hG−CSF変異体を1回の用量として0日に皮下注射し、一方非結合hG−SFを1回の用量として0日または毎日のいずれかで皮下注射する。0日に1回の用量で投与されたhG−CSFまたは変異体について、用量は体重1kgあたり100μgfである。毎日投与された非結合hG−CSF(Neopogen)について、投与量は変化し、以下の実施例に記載する。各hG−CSFサンプルを6匹のランダム化したラットの1グループに注射する。300μlのEDTA安定化血液の血液サンプルを、投与前および投与後6、12、24、36、48、72、96、120、144および168時間に、ラットを16時間絶食させ、続いて体重1kgあたり100μgのhG−CSFまたはその変異体を皮下注射する。各hG−CSFサンプルを6匹のランダム化したラットの1グループに注射する。投与の6、12、24、36、48、72、96、120および144時間後にラットの尾静脈から300μlのEDTA安定化血液の血液サンプルを抜き取る、血液サンプルを次の血液学的パラメータに関して分析する:ヘモグロビン、赤血球数、ヘマトクリット、平均細胞体積、平均細胞ヘモグロビン濃度、平均細胞ヘモグロビン、白血球数、白血球数の差(好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球、単球)。これらの測定に基づいて、結合および非結合hG−CSFおよびその変異体の生物学的有効性を評価する。
レセプターとリガンド間の結合の強度は、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、または当該分野において周知の他のかかる免疫検出技術を用いて測定できる。リガンド−レセプター結合相互作用は、プラズモン共鳴検出を利用するBiacore装置で測定することもできる(Zhou et al., Biochemistry, 1993, 32, 8193-98; Faegerstram and O'Shannessy, 1993, In Handbook of Affinity Chromatography, 229-52, Marcel Dekker, Inc., NY)。
681,720、US5,795,968、US5,824,778、US5,985, Biacore技術により、レセプターを金表面と結合させ、リガンドをその上に流すことが可能になる。プラズモン共鳴検出は、実時間で表面に結合する質量を直接定量化する。この技術により、オン速度およびオフ速度定数の両方を得、従ってリガンド−レセプター解離定数および親和定数を直接決定できる。
本発明の結合体の減少した免疫原性は、参照分子または製剤に対する結合体の免疫反応性を測定するELISA法の使用により決定できる。参照分子または製剤は通常組み換えヒトG−CSF製剤、たとえばNeupogenまたは別の組み換えヒトG−CSF製剤、たとえばUS5,824,784に記載されているようなN−末端PEG化rhG−CSF分子である。ELISA法は、これらの組み換えG−CSF製剤の1つで治療された患者から得られる固体に基づく。免疫原性は、本発明の結合体が、参照分子または製剤よりも分析において統計的に有意に低い反応を有する場合に、減少すると見なされる。
抗G−CSF血清によるhG−CSF結合体の中和を、前記のG−CSFバイオアッセイを用いて分析する。
G−CSF参照分子で治療された患者または免疫化された動物から得られた血清を使用する。血清を、一定濃度(希釈度1:20〜1:500(患者血清)または20〜1000ng/ml(動物血清))または1:20(患者血清)または1000ng/ml(動物血清)で出発した血清の5倍連続希釈のいずれかで添加する。hG−CSF結合体を」、10nMから出発する7倍希釈または一定濃度(1−100pM)のいずれかで、合計体積80μlDMEM培地+10%FCSで添加する。血清を1時間37度でhG−CSF結合体と共にインキュベートする。
サンプル(0.01ml)を次に、0.1ml DMEM培地中NFS−60細胞を含有する96ウェル組織培養プレートに移す。培養物を48時間37℃で5%CO2雰囲気中でインキュベートする。生存可能な細胞におけるミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩WST−1の開裂の結果、ホルマゾンが形成され、これは450nmでの吸収を測定することにより定量化される。
hG−CSF結合体サンプルを一定量の血清の存在下で滴定する場合、中和効果は、EC50(血清あり)/EC50(血清無し)として定量化されるフォールド阻害(FI)として定義される。G−CSF変異タンパク質の抗体中和の減少は、次のように定義される:
(FI変異体1)
(1 - _____________________) x 100%
(FI重量 1)
Stemmer et al. (1995), Gene 164, pp. 49-53により記載されている一般的手順にしたがって、次のDNAフラグメントを合成した。
BamHI消化部位、YAP3シグナルペプチドをエンコードする配列(WO98/32867)、TA57リーダー配列をエンコードする配列(WO98/32867)、KEX2プロテアーゼ認識部位(AAAAGA)をエンコードする配列、そのコドン使用がイー・コリ(配列番号2)における発現に最適化されたhG−SFをエンコードする配列およびXbaI消化部位からなるフラグメント1。
BamHI消化部位、YAP3シグナルペプチドをエンコードする配列(WO98/32867)、TA57リーダー配列をエンコードする配列(WO98/32867)、ヒスチジン標識(配列番号5)をエンコードする配列、KEX2プロテアーゼ認識部位(AAAAGA)をエンコードする配列、そのコドン使用がイー・コリ(配列番号2)における発現に最適化されたhG−SFをエンコードする配列およびXbaI消化部位からなるフラグメント2。
NdeI消化部位、OmpAシグナルペプチドをエンコードする配列(配列番号3)、そのコドンの使用がイー・コリにおける発現に最適化されたhG−CSFをエンコードする配列およびBamHI消化部位からなるフラグメント3。
BamHI消化部位、Kozakコンセンサス配列(Kozak, M. J Mol Biol 1987 Aug 20;196(4):947-50)、hG−CSFシグナルペプチドをエンコードする配列(配列番号7)およびその使用がCHO細胞における発現に最適化されたhG−CSF(配列番号8)およびXbaI消化部位からなるフラグメント4。
DNAフラグメント1および2を、標準的DNA技術を用いて、プラスミドpJSO37におけるBamHIおよびXbaI消化部位中に挿入した(Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782:202-207, 1996)。この結果、プラスミドpG=CSFセレビシエおよびpHISG−CSFセレビシエが得られた。
DNAフラグメント3を、標準的DNA技術を用いてプラスミドpET12a(Invitrogen)におけるNdeIおよびBamHI消化部位中に挿入した。この結果、pG−CSFコリが得られた。
DNAフラグメント4を、標準的DNA技術を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)(Invitrogen)中BamHIおよびXbaI消化部位中に挿入した。この結果、プラスミドpG−CSFCHOが得られた。
サッカロミセス・セレビシエYNG318(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、VA,USAからATCC208973として入手可能)のプラスミドpG−CSFセレビシエまたはpHISG−CSFセレビシエのいずれかでの形質転換、2つのプラスミドのいずれかを含有する形質転換体の単離、およびHIS標識の有無にかかわらずhG−CSFの細胞外発現は、それぞれ、文献に記載されている標準的技術を用いて行った。イー・コリBL21(DE3)(Novagen、Cat.No.69387−3)のpG−CSFコリでの形質転換、プラスミドを含有する形質転換体の単離およびその後の上清中および細胞の外質におけるhG−CSFの発現は、NovagenからのpET System Manual(第8版)に記載されているようにして行った。
エス・セレビシエおよびイー・コリによるhG−CSFの発現を、ImmunoPure Ultra−Sensitive ABCウサギIgG染色キット(Pierce)およびhG−CSFに対するポリクローナル抗体(Pepro Tech EC Ltd.)を用いて、ウェスタンブロット分析により実証した。タンパク質が正しい大きさを有することが観察された。
hG−CSF(N−末端ヒスチジン標識の有無によらない)のエス・セレビシエおよびイー・コリにおける発現レベルを、商業的に入手可能なG−CSF特異的ELISAキット(Quantikine Human G-CSF Immunoassay, R&D Systems Cat. No. DCS50)を用いて定量化した。測定値を以下に記載する。
トランスフェクションの前日、CHO K1細胞系(ATCC#CC1−61)を、10%w/wFBSFBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンで補足された5ml DMEM/F−12培地(Gibco#31330−038)中でT−25フラスコ中に播種する。次の日(ほぼ100%コンフルエンシー)、トランスフェクションを調製する:90μlの補足無しのDMEM培地を14mlのポリプロピレン試験管(Corning)中に等分する。10μlのFugene6(Roche)を培地中に直接添加し、5分間室温でインキュベートする。その間に、5μgのプラスミドpG−CSFCHOをもう一つの14mlポリプロピレン試験管中に等分する。インキュベーション後、Fugnene6ミックスをDNA溶液に直接添加し、15分間室温でインキュベートする。インキュベーション後、全体積を細胞培地に滴下する。
翌日、培地を、360μg/mlのヒグロマイシン(Gibco)を含有する新鮮な培地と交換する。その後毎日、一次トランスフェクションプールが100%コンフルエンシーコンフルエンシーに達するまで選択培地を更新する。一次トランスフェクションプールを制限希釈によりサブクローンする(300細胞を5つの96ウェルプレート中に播種する)。
hG−CSFの精製を次のようにして行った:
細胞を遠心分離により除去する。細胞減少上清を次に0.22μmフィルターを通して濾過滅菌する。濾過滅菌された上清を10mM酢酸ナトリウムpH4.5中で5倍に希釈する。5リットルの希釈された上清につき10mlの濃酢酸を添加することにより、pHを調節する。イオン強度はカチオン交換樹脂に適用する前に8mS/cmより低くなければならない。
カラムからの流出液が安定なUVおよび伝導性ベースラインに達するまで、50mM酢酸ナトリウムpH4.5で平衡化されたSP−セファロースFF(Pharmacia)カラム上に希釈された上清を90cm/時の直線的流速でかける。未結合物質を除去するために、カラムからの流出液がUV吸収および導電性に関して安定なレベルに達するまで、平衡緩衝液を用いてカラムを洗浄する。直線的勾配;30カラム体積;0−80%緩衝液B(50mM NaAc、pH4,5、750mM NaCl)を45cm/時の流速で用いて、結合G−CSFタンパク質をカラムから溶出させる。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づいて、G−CSFを含有するフラクションをためる。溶液のイオン強度が80mS/cm以上になるまで塩化ナトリウムを添加する。
タンパク質溶液を、50mM NaAc、pH4.5、750mM NaClで平衡化させたPhenyl Toyo Pearl650Sカラム上にかける。平衡緩衝液を用いて未結合物質をカラムから洗い流す。G−CSFを含有するフラクションをためる。この2段階下流プロセッシング法を用いることにより、90%以上の純粋なG−CSFを得ることができる。精製されたタンパク質を次に、280nmでの分光光度測定値の使用および/またはアミノ酸分析により定量化する。
G−CSFを含有するフラクションをためる。VivaSpin濃縮器(mwco:5kDa)を用いて緩衝液交換および濃縮を行う。
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
精製され、濃縮されたG−CSFをSDS−PAGEにより分析した。約17kDaの見かけの分子量を有する1つのバンドが優性であった。
吸収
G−CSF濃度の評価を分光光度法により得られる。280nmでの吸収を測定し、0.83の理論的吸光係数を用いることにより、タンパク質濃度を計算できる。
アミノ酸分析
さらに精密なタンパク質測定は、アミノ酸分析により得ることができる。精製されたG−CSFに関して行われるアミノ酸分析により、実験的に決定されたアミノ酸組成は、DNA配列に基づいて予想されるアミノ酸措定と一致することが明らかになった。
PEG化wtG−CSFおよび選択されたPEG化G−CSF変異体に結合したPEG−基の数を評価するために、MALDI−TOF質量分析を使用した。
wtG−CSFは、SPA−PEGの予想される結合部位である5の第一アミンを含有する(K16、K23、K34およびK40上のN−末端アミノ基およびε−アミノ基)。wtG−CSFのSPA−PEG5000でのPEG化の後、MALDI−TOF質量分析により、主に4、5および6PEG基が結合したwtG−CSFの種の存在が示された。加えて、7PEG基を有するwtG−CSFは少量ながら明らかに見られた。
置換K16R、K34R、K40R、Q70K、Q90K、およびQ120Kを有するG−CSF変異体はさらに、5の第一アミン(K23、K70、K90およびK120上のN−末端アミノ基およびε−アミノ基)も含有する。このG−CSF変異体のSPA−PEG5000でのPEG化の後、MALDI−TOF質量分析により、主に4、5および6PEG基が結合したG−CSF種の存在が示された。加えて、7PEG基が結合したG−CSF変異体は、少量ながら明らかに見られた。
置換K16R、K34R、およびK40Rを有するG−CSF変異体は、2の第一アミン(K23上のN−末端アミノ基およびε−アミノ基)を含有する。このG−CSF変異体のSPA−PEG12000でのPEG化の後、MALDI−TOF質量分析により、主に2および3PEG基が結合したG−CSF種の存在が示された。加えて、4PEG基が結合したG−CSF変異体は、少量ながら明らかに見られた。
I消化部位からなるフラグメント1YAP3シグナルペプチド
実施例12に記載するように、SPA−PAG化学反応が使用される場合にヒスチジン17は完全にPEG化されることが示された。さらに、K23およびS159は部分的にPEG化される。これは、hG−CSFおよび生成された変異体における第一アミンの他に1〜2の余分なPEG化部位の存在を証明する。
予想されるPEG化部位の数を最小に減少させるために少数のアミン基を有するG−CSF変異体を選択した。選択されたG−CSF変異体は、置換K16R、K34R、K40RおよびH170Qを有する。従来のデータから大部分がPEG化されていないことが証明されているK23上のε−アミノ基を除いて、この変異体はN−末端で1つの第一アミンを含有するだけである。従って、アミン基上のバックグラウンドPEG化はこのG−CSF変異体において著しく減少する。SPA−PEG5000を用いてG−CSF変異体をPEG化した。PEG化後、G−CSF変異体を変性させ、ジスルフィド結合を還元し、結果として得られるチオール基をアルキル化し、アルキル化され、PEG化されたタンパク質をグルタミン酸特異的プロテアーゼで分解した。最後に、結果として得られるペプチドを逆相HPLCにより分離した。
これと対応して、参照HPLCクロマトグラムを得るために、置換K16R、K34R、およびK40Rを有するG−CSFの非PEG化されたバージョンを同じように処理した。
PEG化G−CSF変異体および非PEG化G−CSF変異体の分解のHPLCクロマトグラムの比較により、どのペプチドがPEG化により消失したかが明らかになる。非PEG化G−CSF変異体から得られるペプチドのN−末端アミノ酸配列化によるこれらのペプチドの同定から、PEG化された位置が間接的に示される。
原則として、全ての置換K16R、K34R、K40RおよびH170Qを有するG−CSF変異体の使用が好ましいが、全ての実用的な目的に関して、これは重要ではない。
より詳細には、置換K16R、K34R、K40RおよびH170Qを有する約1mgのPEG化G−CSF変異体および置換K16R、K34R、およびK40RおよびH170Qを有する約500μgの非PEG化バージョンを使用かG−CSF変異体をSpeedVac濃縮器中で乾燥した。2つのサンプルをそれぞれ400μlの6Mグアニジニウム、0.3M Tris−HCl、pH8.3中に溶解させ、一夜37℃で変性させた。変性後、50μlの6Mグアニジニウム中0.1M DTT、0.3M Tris−HCl、pH8.3を添加することによりタンパク質におけるジスルフィド結合を還元した。2時間周囲温度でインキュベーションした後、50μlの6Mグアニジニウム中0.6Mヨードアセトアミド、0.3M Tris−HCl、pH8.3を添加することにより、存在するチオール基をアルキル化した。アルキル化が30分間周囲温度で起こった後、NAP5カラムを用いて、還元され、アルキル化されたタンパク質を50mM NH4HCO3中に緩衝液交換した。SpeedVac濃縮器中でサンプルの体積を約200μlに減少させた後、それぞれ20μgおよび10μgのグルタミン酸特異性プロテアーゼを添加した。グルタミン酸特異性プロテアーゼでの分解を16時間37℃で行った。結果として得られるペプチドを、Phenomenex Jupiter C18カラム(0.2×5cm)を用いた逆相HPLCにより、0.1%水性TFA中アセトニトリルの直線的勾配で溶出して分離した。集められたフラクションをMALDI−TOF質量分析により分析し、その後、選択されたペプチドをN−末端アミノ酸配列分析に付した。
N−末端アミノ基は容易にPEG化されるので、G−CSFのN−末端ペプチドは、この方法を用いて同定されることが予想された。しかしながら、SPA−PEG5000の追加の結合のいずれもこの方法を用いて同定されなかった。
PEG5000結合部位の間接的確認の代替法は、PEG化ペプチドにおける結合部位の直接的確認である。しかしながら、分解PEG化G−CSF変異体のHPLC分離におけるPEG化ペプチドを含有するフラクションは、互いに、また非PEG化ペプチドを含有するいくつかのフラクションから十分に分離されない。従って、これらのフラクションのN−末端アミノ酸分析の結果、K23が部分的にPEG化できるということが示されることを除いては有用なデータが得られなかった。
これらの問題を克服するために、PEG化ペプチドの2つのプールを、第一のHPLC分子殻のフラクションから生成した。これらの2つのプールをSpeedVac濃縮器中で乾燥し、200μlの新たに調製された50mM NH4HCO3中に溶解させ、さらに1μgのキモトリプシンで分解した。結果として得られるペプチドを、Phenomenex Jupiter C18カラム(0.2×5cm)を使用し、0.1%水性TFA中アセトニトリルの直線的勾配で溶出して、逆相HPLCにより分離した。集められたフラクションをMALDI−TOF質量分析により分析し、続いて選択されたペプチドをN−末端アミノ酸配列分析に付した。
N−末端アミノ酸配列決定から、K23ならびにS159は部分的にPEG化されることが確認できた。これらの2つの位置でのPEG化の正確な程度は確認できなかったが、K23およびS159が未修飾であるペプチドが確認され、初期HPLCから配列決定されたので、PEG化は部分的である。
生成されたwtG−CSFおよびG−CSF変異体をMADI−TOF質量分析により分析する場合の一貫した観察は、分析されたG−CSF分子の質量よりも約324Da大きい質量を有するさらなる成分の存在である。最低の質量を有す売る成分は一様にG−CSF分子の質量を有し、G−CSF分子は正しいN−末端アミノ酸配列を有するので、さらなる成分は、2つのヘキソース残基を有する修飾されたB−CSF分子であると結論づけられた。多くの場合において、未修飾G−CSF分子は最も強いシグナルを生じるが、いくつかの場合においては修飾されたG−CSF分子の強度が最も強い。
さらなるPEG化部位を同定することを目的として生成したペプチドの分析中、グリコシル化の部位を同定するための関心のある2つのペプチドを各分気合いにおいて同定した。
両HPLC分離において、2つのペプチドは互いの次に溶出し、MALDI−TOF質量分析は2つのペプチドの差が約324Daであることを示した。質量分析データは、ペプチドが124−162のアミノ酸残基を包含することを示す。4ペプチド全てのN−末端アミノ酸配列分析は、この指定が正しく、Thr133が唯一の修飾の部位であることを示す。未修飾ペプチドの分子量を有するペプチドにおいて、Thr133は明らかに配列において見られるが、さらなる324Daの分子量を有するペプチドにおいて位置133にアミノ酸残基をわりあてることができない。他のアミノ酸残基はすべて配列において割り当てられるので、Thr133が唯一の修飾の部位であると結論づけられた。このグリコシル化部位はCHO細胞において発現された組み換えG−CSFにおいて用いられることがすでに報告されているが、グリカンは酵母により結合される物とは異なる。
MALDI−TOF質量分析により示されるフラクションはwtG−CSF7PEG基を有の非グリコシル化形態を含むだけなので、0.1%TFA中51%アセトニトリルで定組成溶離されたVydac C18カラム(0.21×5cm)を用いた逆相HPLCを用いて、非グリコシル化wtG−DSFはグリコシル化wtG−CSFから分離された。
4、5または6PEG基に共有結合したG−CSF分子の分離は次のようにして得られた。20mMクエン酸ナトリウムpH2.5中PEG化タンパク質を、20mM クエン酸ナトリウムpH2.5で平衡化したSPセファロースFFカラムにかけた。未結合物質をカラムから洗い流した。pH勾配を用いて溶出を行った。PEG化されたG−CSFは約pH3.8でカラムから溶出し始め、pH3.8から4.5を包含するフラクションにおいて溶出を続けた。
フラクションをSDS−PAGEおよび質量分析に付した。これらの分析は、最も高い程度のPEG化を有するG−CSFは「低いpHフラクション」中にあることを示す。最低のPEG化を有するPEG化されたG−CSFは、「高いpHフラクション」中で溶出される。
PEG化されたG−CSFについて行われたアミノ酸分析は、理論的および実験的に決定された発酵係数間に良好な一致を示した。
hjG−CSFに存在するアミノ酸の他のアミノ酸残基に対する特定の置換、たとえば一般的説明においてすでに記載した特定の置換は、当該分野において公知の標準的DNA技術を用いて導入された。新規G−CSF変異体変異体は、PCR反応におけるDNAテンプレートとしてHIS標識無しのhG−CSFをエンコードする遺伝子を含有するプラスミドpG−CSFセレビシエを用いて調製された。変異体は、エス・セレビシエにおいて発現され、実施例4において記載されたように精製された。構築されたG−CSF変異体のいくつかを以下に記載する(実施例12および13参照)。
ヒトG−CSF活性およびその変異体は、前記のように(「溶液中のhG−CSFおよびその変異体のPEG化」)、SPA−PEG5000、SPA−PEG12000およびSPA−PEG20000(Shearwater)に共有結合した。結合体のインビトロ活性を実施例13に記載する。
SPA−PEGはG−CSFにおけるリシン以外のアミノ酸残基と結合することができる。SPA−PEGがヒスチジン、セリン、スレオニンおよびアルギニンと結合するかどうかを決定するために、これらのアミノ酸がリシン、アラニンまたはグルタミンに置換された変異体を調製した。変異体をエス・セレビシエにおいて発現し、精製し、PEG化の後、SDS−PAGE上で結合したSPA−PEG分子の数の分析を行った。この分析は、SDS−PAGEゲルの目視検査により行い、すべて3つの主要なバンドを含んでいた。バンドの相対的なサイズに基づいて各バンドについてPEG化の程度はほぼ5%と評価された。所定のアミノ酸のグルタミンまたはアラニンでの置換後、結合したSPA−PEG分子の数における減少は、このアミノ酸がSPA−PEGによりPEG化されたことを示し、この観察は、アミノ酸がリシンに置換された後にPEG化の程度が変化しないことによりさらに裏付けられる。分析された変異体を以下に記載する。
結合および非結合hG−CSFおよびその変異体のインビトロ生物学的活性を「一次アッセイ2−インビトロhG−CSF活性アッセイ」においてすでに記載したようにして測定した。利用可能なPEG化部位に対するSPA−PEG5000の結合の有無にかかわらず各変異体について測定されたEG50値により表されるインビトロ生物活性を以下に記載する。この値は、非結合hG−CSF(Neupogen)のEC50値に関して標準化されている。すなわち、表の値は非結合hG−CSFの活性に対する活性(%)を表す。値は、同じ分析条件下で各回で変異体と同時に測定した。記載された分析においてhG−CSFのEC50値は30pMであった。
さらに、SPA−PEGの共有結合12000およびSPA−PEG20000を選択されたhG−CSF変態の基に結合させた。インビトロ活性を以下に記載する(Neupogenの%)。
非結合hG−CSF(Neupogen)、SPA−PEG5000結合hG−CSFK16R K34R K40R Q70K Q90K Q120KおよびSPA−PEG 5000結合hGCSF K16R K34R K40R Q90K T105K S159Kのインビボ半減期を前記のようにして測定した(「結合および非結合rhG−CSFおよびその変異体のインビボ半減期の測定」)。結果を図1および2に示す。Neopogenのインビボ半減期はそれぞれ2.10時間および1.40時間であると測定された。以前の同様の実験において(US5,824,778)、hG−CSFのインビボ半減期は1.79時間であると決定された。本発明に記載された実験の結果は、従って、該実験と直接比較できる。SPA−PEG 5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K and SPA−PEG 5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q90K T105K S159Kのインビボ半減期はそれぞれ12.15時間および16.10時間であると測定された。hG−CSF中に新規PEG化部位を導入し、これらとSPA−PEGを結合させると、インビボ半減期が著しく増大した。
すでに記載した以前の実験において(US5,824,778)、大きなN−末端結合PEG分子(10kDa)と結合したhG−CSFのインビボ半減期は7.05時間であると測定された。したがって、hGCSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120KおよびSPA−PEG 5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q90K T105K S159Kは、Neupogenおよび10kDaのN−末端結合PEG分子を有するhG−CSFの両方よりも著しく長い半減期を有する。SPA−PEG5000結合hGCSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K and SPA−PEG 5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q90K T105K S159Kは両方とも3つの除去された内因性PEG化部位および3つの新しい導入されたPEG化部位を有し、従って大きさが同じである。2つの化合物間の唯一の差は、インビトロ活性であり、それぞれNeupogenの12%および5%である。この違いの結果、SPA−PEG5000結合K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120Kと比較して、SPA−PEG5000結合K16R K34R K40R Q90K T105K S159Kのインビボ半減期は長くなる。インビボ活性は化合物のレセプター結合親和力と相関するので、SPA−PEG5000結合K16R K34R K40R Q90K T105K S159Kのレセプターによるクリアランスは、SPA−PEG 5000結合K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120Kよりも遅いと結露運づけることができる。従って、G−CSFの大きさが増大し、インビトロ活性が減少する組み合わせの結果、すでに記載された化合物よりも著しく長いインビボ半減期を有するG−CSF化合物が得られる。
非結合hG−CSF(Neupogen)、SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K、SPA−PEG5000結合hGCSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K、SPA−PEG 5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K T133KおよびSPA−PEG 5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q90K Q120K T133Kのインビボ生物学的活性を前記尿にして測定した(「結合および非結合hG−CSFおよびその変異体の健康なラットにおけるインビボ生物学的活性の測定」。結果を図3および4に示す。
t=0時に体重1kgあたり100μgの注射をした後48時間でNeupogenの活性は検出できなかった。SPA−PEG 5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K、SPA−PEG 5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K T133KおよびSPA−PEG 5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q90K Q120K T133Kの活性は、初回注射後72時間まで検出できたが、SPA−PEG 5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120Kは初回注射後96時間までインビボで活性であった。従って、これらの結合変異体はすべてNeupogenよりも長いインビボ生物学的活性を有し、SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120KはNeupogen(登録商標)の2倍長くインビボで活性であった。SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K T133KおよびSPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q90K Q120K T133Kは、両方ともNeupogen(登録商標)の2%のインビトロ活性を有するが(実施例13)、Neupogen(登録商標)、SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q120KおよびSPA−PEG5000 conjugated hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120Kの投与後観察されるのと同じレベルの白血球形成を投与後の初めの12時間に誘発しなかった。従って、Neupogenと比べて2%以下のインビトロ活性を有する化合物は、投与直後に白血球の完全な形成を刺激できなかった。
すでに観察されたように、結合hG−CSF変異体はNeupogenよりも著しく長い作用の期間を有していた。これら3つの結合hG−CSF変異体のそれぞれを投与した結果、投与後の初めの12時間にNeupogenの投与後に観察されるのと同じ速度で、同じレベルまで白血球が形成された。SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K、SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R 34R 40R Q90K T105K S159KおよびSPA−PEG 20000結合hG−CSF K16R 34R 40R T105K S159Kのインビトロ活性は、それぞれNeupogenの12%、5%、および5%であり、したがって、インビトロでNeupogen活性の5%を有するhG−CSF化合物は投与後に完全な白血球形成を誘発できる。
Neupogen、SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K、SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R 34R 40R Q90K T105K S159KおよびSPA−PEG20000結合hG−CSF K16R 34R 40R T105K S159KのSDS−PAGE上の見かけのサイズはそれぞれ、18kDa、60kDa、60kDaおよび>100kDaである。SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R 34R 40R Q90K T105K S159KおよびSPA−PEG20000結合hG−CSF K16R 34R 40R T105K S159Kはほとんど同じインビボでの作用期間を有し、作用期間は、結合hG−CSF変異体はNeupogenよりも化合物の分子サイズを約60kDaの見かけのサイズを超えて増大させることによって増大されないことを示す。そのかわりに、結合hG−CSF化合物の見かけのサイズが約60kDaより大きい場合、インビトロ活性を減少させることにより作用の期間、従って化合物のレセプター結合親和力を増大させることができる。このさらなる例(前記参照)は、SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R 34R 40R Q70K Q90K Q120KおよびSPA−PEG5000結合hG−CSF K16R 34R 40R Q90K T105K S159Kのインビボの作用期間を比較することにより観察できる。2つの化合物や両方とも60kDaの見かけのサイズを有し、インビトロ活性は、それぞれ12%および5%である。この差は、2つの化合物のインビボの作用期間(それぞれ96時間および144時間)に反映される。
非結合hG−CSF(Neupogen(登録商標))、SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K T105KおよびSPA−PEG 20000結合hGCSF K16R K34R K40R Q90Kの化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性を、体重1kgあたり50mgのCPAおよび1回量(体重1kgあたり100μg)のG−CSFを用いて前記のようにして測定した(「非結合hG−CSFおよびその変異体の化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性の測定」)。結果を図7に示す。3つの化合物は同じ速度で白血球の初期形成を誘発した。従って、結合hG−CSF化合物が投与直後にインビボで白血球形成を十分に刺激するためには、Neupogenの4%のインビトロ活性で十分である。36時間後、Neupogen処置されたラットにおける白血球数(WBC)は、未処置群において観察されるレベルまで降下した(<3×109細胞/リットル)。この時点で、ラットは好中球減少状態であった。両群におけるWBCのレベルは144時間後に正常なレベル(9×109細胞/リットル)に達した。
SPA−PEG5000結合hGCSF K16R K34R K40R Q70K Q90K T105KおよびSPA−PEG20000結合hGCSF K16R K34R K40R Q90Kで処置された2群におけるWBCのレベルは、48時間後に最低の4x109細胞/リットルまで減少し、次いで直ちに増大しはじめた。両群におけるWBCレベルは96時間後に正常に戻った。従って、2つの結合hG−CSF化合物は好中球減少症の程度を軽減し、かつWBCレベルが正常に戻るまでの時間(好中球減少の期間)をNeupogen処置群における112時間からSPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K T105KおよびSPA−PEG 20000結合hGCSF K16R K34R K40R Q90Kのいずれかで処置された群における48時間まで著しく減少させることができる。
SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K T105Kは、SPA−PEG20000結合hGCSF K16R K34R K40R Q90Kとくらべてさらに有効に好中球減少の期間を短縮した。両分子の見かけのサイズは60kDaより大きい(それぞれ60kDaおよび80kDa)ので、これはSPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K T105Kの腎臓クリアランスがSPA−PEG20000結合hGCSF K16R K34R K40R Q90Kよりも低いことにより説明できない。SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K T105KおよびSPA−PEG20000結合hGCSF K16R K34R K40R Q90Kのインビトロ活性はそれぞれNeupogen(登録商標)の4%および7%である。このことは、SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K T105Kの結合親和力、従ってレセプターによるクリアランスが、SPA−PEG2000結合hGCSF K16R K34R K40R Q90Kよりも、白血球レベルが増大する投与後の最初の48時間において低いことを意味する。したがって、ラットが48時間後に好中球減少症になる場合、SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K T105Kのインビボ濃度は、SPA−PEG 20000結合hGCSF K16R K34R K40R Q90Kよりも高い。好中球前駆細胞に関するG−CSFレセプターの完全な活性化を得るためにはNeupogen(登録商標)の4〜5%の比較的低いインビトロG−CSF活性で十分であるので(前記参照)、48時間後のこの高いG−CSF濃度は、SPA−PEG5000結合hG−CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K T105K−処置群においてWBCレベルが速く増大することを証明する。従って、化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおいて、見かけのサイズが少なくとも約60kDaであり、Neupogen(登録商標)の4%のインビトロ活性を有する本発明の結合G−CSF化合物は、さらに高いインビトロ活性を有する類似したサイズの化合物よりも優れている。
この実施例は、hG−CSFおよびG−CSF変異体を精製するための実施例4の方法の代替法を提供する。
細胞を、5000rpmで10分間4℃での遠心分離により除去し、清澄化された上清を0.22μmフィルターを通して濾過する。清澄化し、濾過された上清を濃縮し、10kDa膜を用いたTangential Flow Filtrationにより、50mM酢酸ナトリウムpH4.5中に透析するか。
結果として得られる限外濾液を、少なくとも5カラムt哀惜の50mM酢酸ナトリウムで平衡化したSP−セファロースカラム(200ml充填床)上にかける。サンプルを流速約20ml/分でかける。平衡化緩衝液を用いて、280nmでの吸収により測定して安定な流出液が得られるまでカラムを洗浄する。段階的な緩衝液勾配を用いて(例えば、10%、20a%、30%および35%の緩衝液)、G−CSFを35%緩衝液で周囲流速で溶出する(ここに、緩衝液は50mM酢酸ナトリウム中750mM NaClである)。
この一段法により、>95%の純度のG−CSFを得る(SDS−PAGEにより測定)。
前記実施例9は、異なる数のPEG基が結合したG−CSF分子の分離法を記載する。この実施例は、結合したPEG基の数の点で所望の均一度を有するG−CSF生成物を得るためにこのような多PEG化G−CSF種を分離するための代替法を提供する。
例えば前記(「溶液中のhG−CSFおよびその変異体のPEG化」)のSPA−PEG5000(Shearwater)と共有結合したPEG化されたG−CSFの混合物を、20mMクエン酸塩緩衝液、pH2.5で希釈する。導電性は<3.5mS/cmである。必要に応じて希HClを用いてpHwo2.5に調節する。次の緩衝液を分離に用いる:
緩衝液A:20mMクエン酸ナトリウム、pH2.5(平衡化および洗浄緩衝液)。
緩衝液B:20mMクエン酸ナトリウム、pH2.5;750mM塩化ナトリウム(溶出緩衝液)。
分離されるサンプルを、平衡化されたSP−セファロースHPカラム(7ml)に2ml/分の流速でかける。A280によりモニターして安定なベースラインが得られるまで、カラムを緩衝液Aで洗浄する。
0〜50%<例えば少なくともやく緩衝液Bの直線的勾配を180分間4ml/分の流速でかけ、2mlのフラクションを集めることにより、多PEG化種を分離する。集められたフラクションをSDS−PAGEにより分析し、所望の数の結合したPEG基を有するフラクションをプールする。これにより、はじめに、たとえば3〜6の結合したPEG器を有する種を含むPEG化G−CSF混合物を精製して、例えば4または5PEG基の数G−CSF基が結合した生成物、または単数の結合したPEG基を有する生成物を得ることが可能になる。
実施例7においてすでに記載したのと類似しているが、トリプシンでの分解に基づく手順を用いて、本発明のG−CSF結合体のPEG化パターンをペプチドマッピングにより決定した。この場合において、ポリペプチドはCHO細胞(実施例3参照)において産生され、本来のヒトG−CSFの配列に関して、置換K16R、K34R、K40R、T105K and S159Kを有していた。これを前記のようにして5kDaSPA−PEGでPEG化して、主に3、4または5のPEG部分とわずかに6PEG部分を有する修飾タンパク質を得た。6の可能なPEG結合部位のうち5が既知であり、これらはN−末端アミノ基、Lys23、Lys105、Lys159およびHis170である。
このペプチドマッピング分析により、結合タンパク質が、N−末端およびLys105およびLys159で本質的に完全にPEG化され、一方、Lys23は部分的にPEG化されたことがわかった。His170は先の実験において部分的にPEG化されることが示されたが、このことは驚くべきことにこの実験においては見いだされなかった。この観察についての一つの可能な説明は、PEG基の数G−CSFとHis170残基間の結合は、ペプチドマッピングの前に行われるサンプル調製中は不安定であるということである。この場合のような考えられる不安定なPEG化は、ヒスチジン残基を別の残基、特にさらに安定なPEG化が望ましいならばリシン残基で、あるいはPEG化を回避すべきならばグルタミンまたはアルギニン残基で置換することにより回避できる。
本発明の2つPEG化されたG−CSF変異体のインビボ生物学的活性を化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおいて試験した。変異体は、配列番号1に関して、それぞれ、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159K(以下、「105/159」と称する)およびK16R、K34R、K40R、Q90K、T105KおよびS159K(「90/105/159」と称する)を有する。両変異体は、酵母(エス・セレビシエ)において産生され、前記のようにSPA−PEG5000と結合される。1回量の2つの変異体のインビボ生物学的活性を、1日量の非結合hG−CSF(Neupogen)および対象(ビヒクル)の活性に対して試験した。
G−CSFサンプル投与の24時間前に、ラットに体重1kgあたり50mgのCPAを与えた。本発明のPEG化変異体を体重1kgあたり100μgの1回量で時間0に投与し、一方、Neupogenを体重1kgあたり30μgの1日量で5日間投与した(0時間から96時間)。
インビボ生物学的活性を前記のようにして測定した(「結合および非結合hG−CSFおよびその変異体の化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性の測定」)。結果を図8(白血球数、WBC)および図9(絶対好中球数、ANC)に示す。
図8に示すように、105/159、90/105/159およびNeupogenの投与は全て初めの12時間で白血球レベルをまず増大させ、その後、白血球レベルは化学療法の結果として減少し、約48時間後に最小値に達する。48時間後、白血球の数は3処置群全てにおいて増大するが、増大速度は、Neupogenで処置した群よりも、本発明の2つのPEG化変異体で処置した群において明らかに大きかった。PEG化変異体105/159および90/105/159での処置の結果、96時間後に白血球の正常なレベル(10×109/l以上)になるが、Neupogen処置群は120時間後で白血球レベルが依然として10×109/lより低かった。5回毎日のNeupogenでの処置の最後は96時間に投与したので、この段階における白血球レベルは120時間後に再び減少した。対照的に、1回量の本発明のPEG化変異体で処置された2群における白血球レベルは96時間から実験期間中216時間まで10×109/lを少し上回って比較的安定であった。
好中球数について同様のパターンを図9に示し、これはPEG化変異体105/159で処置された群についての好中球レベルは、Neupogenで処置された群よりも著しく速く増大したことを示す(90/105/159群についてはANCは測定しなかった)。
化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおいて、非結合hG−CSF(Neupogen)および1つのN−末端結合した20kDaPEG基を有するhG−CSF(Neulasta)を本発明の2つのPEG化G−CSF変異体と比較した。それぞれ酵母(エス・セレビシエ)およびCHO細胞において産生された、これらの2つの変異体、すなわち、K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159KをSPA−PEG5000の配列と結合させた。当初3〜6PEG基が結合した多PEG化種からなる本発明のPEG化変異体を分離して、4〜5のPEG基が結合したさらに均一な生成物を得る。これらの変異体を以下、「G20」(酵母において産生)および「G21」(CHO細胞において産生)と称する。
G−CSFサンプルをCPA(体重1kgあたり90mg)の投与後24時間に投与した。PEG化変異体、すなわちNeulasta、G20およびG21を、体重1kgあたり100μgの1回量として投与し、一方、Neupogenを体重1kgあたり10μgの一日量で7日間投与した。
インビボ生物学的活性を前記のようにして測定した(「結合および非結合hG−CSFおよびその変異体の化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性の測定」)。結果を図10(白血球数、WBC)および図11(絶対好中球数、ANC)に示す。
図10および図11は、G−CSF化合物はすべて、初めの12時間にほぼ同じ速度で白血球および好中球の初期形成を誘発し、その後白血球および好中球のレベルは化学療法の結果減少することを示す。96時間後、白血球および好中球数は再び全ての場合において増大するが、その増加率は、G20またはG21で処置されたラットに関しthe、NeupogenまたはNeulastaのいずれかで処置されたラットよりも著しく高かった。図10は、G20またはG21で処置されたラットの白血球レベルは144時間後に約109/lの正常なレベルに達するが、NeupogenまたはNeulastaで処置されたラットは168時間後までこのレベルに達しなかったことを示す。図11に示すように、同じパターンが、好中球数を見た場合にも見られる。すなわち、G20またはG21で処置されたラットの好中球数は、NeupogenまたはNeulastaで処置されたラットが同じレベルに達する前約24時間で正常なレベルに達する。本発明のこれらのPEG基の数G−CSF化G−CSF変異体は、現在入手可能なG−CSF製品NeupogenおよびNeulastaでの処置と比べてラットにおける化学療法により誘発される好中球減少の期間を約24時間減少させることができると結論できる。
添付の配列表配下の配列を含む:
配列番号1:ヒトG−CSFのアミノ酸配列。
配列番号2:コドンの使用がイー・コリにおける発現に最適化されたヒトG−CSFをエンコードする合成DNA配列
配列番号3:OmpAシグナル配列のアミノ酸配列
配列番号4:OmpAシグナル配列をエンコードする合成DNA配列
配列番号5:合成ヒスチジン標識
配列番号6:配列番号5のヒスチジン標識をエンコードする合成DNA
配列番号7:ヒトG−CSFシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号8:配列番号7のシグナルペプチドを含み、コドンの使用がCHO細胞における発現に最適化された、ヒトG−CSFをエンコードする合成DNA配列
配列番号9〜15:様々な合成標識
Claims (30)
- G−CSF活性を示すポリペプチドであって、配列番号1に示されるhG−CSFのアミノ酸配列から15残基まで異なるアミノ酸配列を含み、そして、配列番号1に関して、置換K16R、K34R、K40R、T105KおよびS159Kを含む、ポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドを含み、そして、該ポリペプチドの結合基に結合した、少なくとも1つのポリエチレングリコール(PEG)部分を有する、G−CSF活性を示すポリペプチド結合体。
- PEG部分が、少なくとも1つのリジン残基に結合している、請求項2に記載のポリペプチド結合体。
- PEG部分が、N末端アミノ基に結合している、請求項3に記載のポリペプチド結合体。
- PEG部分が、約1−15kDaの分子量を有する、請求項2−4のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
- PEG部分が、約2−12kDaの分子量を有する、請求項5に記載のポリペプチド結合体。
- PEG部分が、約3−10kDaの分子量を有する、請求項5に記載のポリペプチド結合体。
- PEG部分が、約5または6kDaの分子量を有する、請求項5に記載のポリペプチド結合体。
- 1−8個の結合したPEG部分を有する、請求項2−8のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
- 1−6個の結合したPEG部分を有する、請求項2−8のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
- 2−8個の結合したPEG部分を有する、請求項9に記載のポリペプチド結合体。
- 2−6個の結合したPEG部分を有する、請求項9または請求項10に記載のポリペプチド結合体。
- 3−6個の結合したPEG部分を有する、請求項9または請求項10に記載のポリペプチド結合体。
- 4−6個の結合したPEG部分を有する、請求項9または請求項10に記載のポリペプチド結合体。
- 2−8個の約5000−6000Daの分子量を有するPEG部分が結合した、請求項2に記載のポリペプチド結合体。
- 2−6個の約5000−6000Daの分子量を有するPEG部分が結合した、請求項2に記載のポリペプチド結合体。
- 3−6個の約5000−6000Daの分子量を有するPEG部分が結合した、請求項2に記載のポリペプチド結合体。
- 4−6個の約5000−6000Daの分子量を有するPEG部分が結合した、請求項2に記載のポリペプチド結合体。
- ポリペプチドがN末端メチオニン残基を含む、請求項1−18のいずれかに記載のポリペプチドまたはポリペプチド結合体。
- ルシフェラーゼアッセイによる測定で、非結合hG−CSFの2−30%の範囲であるインビトロ生物活性を有する、請求項2−18のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
- 請求項1−19のいずれかに記載のポリペプチドまたはポリペプチド結合体および少なくとも一つの医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。
- 請求項1−20のいずれかに記載のポリペプチドまたはポリペプチド結合体を含む、医薬組成物。
- 造血障害を有する哺乳類の処置用である、請求項22に記載の医薬組成物。
- 造血障害が、放射線療法または化学療法に起因する造血障害である、請求項23に記載の医薬組成物。
- 白血球減少症の処置用である、請求項22に記載の医薬組成物。
- 好中球減少症の処置用である、請求項25記載の組成物。
- 造血障害を有する哺乳類の処置用医薬組成物を製造するための、請求項1−20のいずれかに記載のポリペプチドまたはポリペプチド結合体の使用。
- 造血障害が、放射線療法または化学療法に起因する造血障害である、請求項27に記載の使用。
- 白血球減少症の処置に使用される医薬組成物を製造するための、請求項1−20のいずれかに記載のポリペプチドまたはポリペプチド結合体の使用。
- 白血球減少症が、好中球減少症である、請求項29に記載の使用。
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