KR20110074871A

KR20110074871A - 멀티 페길화 과립구 콜로니 자극 인자(ｇ-ｃｓｆ) 변종을 투여하여 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증을 치료하는 방법

Info

Publication number: KR20110074871A
Application number: KR1020117008889A
Authority: KR
Inventors: 그랜트 요네히로; 토마스 제이. 맥비티
Original assignee: 맥시겐, 인크.
Priority date: 2008-09-19
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2011-07-04
Also published as: US20100183543A1; CN102215876A; BRPI0918553A2; RU2011115187A; CA2737756A1; MX2011003014A; WO2010033884A3; WO2010033884A2; EP2344203A2; AU2009293025A1; JP2012503014A

Abstract

본 발명은, 환자에게 멀티 페길화 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 변종을 투여하여 방사선에 노출된 환자에서 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

멀티 페길화 과립구 콜로니 자극 인자(Ｇ-ＣＳＦ) 변종을 투여하여 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증을 치료하는 방법{METHOD FOR THE TREATMENT OF RADIATION-INDUCED NEUTROPENIA BY ADMINISTRATION OF A MULTI-PEGYLATED GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR(G-CSF) VARIANT}

관련 출원에 대한 상호 참조

35 U.S.C. §119(e)항에 의거하여, 본 출원은 2008년 9월 19일자로 출원된 미국 가특허 출원 제 61/098,569호의 우선권을 주장하며, 그 개시 내용 전문은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함한다.

본 발명은, 멀티 페길화 과립구 콜로니 자극 인자(multi-PEGylated granulocyte colony stimulating factor)(G-CSF) 변종을 투여하여 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증(neutropenia)을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

골수에서 백혈구가 성장하고, 분할되고, 분화하는 과정을 조혈작용(hematopoiesis)이라 한다 (Dexter and Spooncer, Ann. Rev. Cell. Biol., 3:423, 1987). 각각의 혈구(blood cell) 타입은 만능 줄기 세포로부터 발생한다. 일반적으로 3가지 클래스의 혈구: 즉, 적혈구(erythrocytes), 혈소판, 및 백혈구(leukocytes)가 생체 내에서 생산되고, 백혈구의 대부분은 숙주 면역 방어에 관여되고 있다. 조혈 전구체 세포의 증식 및 분화는 G-CSF 및 인터류킨과 같은 콜로니-자극 인자(CSFs)를 포함하는 사이토킨의 패밀리에 의해 조절된다(Arai et al, Ann. Rev. Biochem., 59:783-836, 1990). 생체 내 G-CSF의 주요 생물학적 효과는, 호중성 과립구 또는 호중성 백혈구로 공지된 특정 백혈구의 성장 및 발달을 자극하는 것이다(Welte et al, PNAS 82:1526- 1530, 1985; Souza et al, Science, 232:61-65, 1986). 호중성 과립구는 혈류 내로 방출된 경우 세균 및 다른 감염증과 싸우는 기능을 한다.

인간 G-CSF(hG-CSF)의 아미노산 서열은 Nagata 등에 의해 보고되었다(Nature 319:415-418, 1986). hG-CSF는 2개의 G-CSF 분자 및 2개의 수용체의 2:2 착물의 형성에 의해 G-CSF 수용체를 이량체화하는 단량체성 단백질이다(Horan et al, Biochemistry 35(15): 4886-96, 1996). 더욱 최근의 발행물(PNAS 103:3135-3140, 2006)에서, Tamada 등은 인간 G-CSF와 GCSF 수용체의 리간드 결합 영역 사이의 시그널링 착물의 결정 구조를 기재하였다.

백혈구 감소증(감소된 수준의 백혈구) 및 호중성 백혈구 감소증(감소된 수준의 호중성 백혈구)은 다양한 유형의 감염증에 대한 증가한 민감성을 초래하는 장애이다. 약 500 세포/mm³ 미만의 절대 호중성 백혈구 수치(ANC)로 나타나는 심각한 호중성 백혈구 감소증(열성 호중성 백혈구 감소증이라 칭하기도 함)인 환자에 대해, 심지어 비교적 소소한 감염증 조차 심각해질 수 있고 심지어 생명을 위협할 수 있다. 재조합 인간 G-CSF(rhG-CSF)는 종종 백혈구 감소증 및 호중성 백혈구 감소증의 여러 가지 형태를 치료 및 예방하기 위해 사용된다. rhG-CSF의 제법은 예를 들면 글리코실화되지 않고 재조합 E. coli 세포에서 생산되는 Neupogen®(Filgrastim) 및 Neupogen®과 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단일의 N-말단에 링크된 20 kDa 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 그룹을 갖는 Neulasta®(Pegfilgrastim)로서 상업적으로 입수할 수 있다. 이러한 모노 페길화 rhG-CSF 분자는 페길화되지 않은 G-CSF에 비해 증가된 반감기를 갖는 것으로 보이고, 따라서 페길화되지 않은 G-CSF 제품보다 빈번하지 않게 투여될 수 있고, 페길화되지 않은 G-CSF의 투여와 거의 동일한 날수에 이르기까지 호중성 백혈구 감소증의 기간을 감소시킨다.

방사선병 또는 방사선 질병으로서 공지되기도 한 급성 방사선 증후군(ARS)은 혈액학적, 위장관계 및 심장혈관계에 영향을 미치는 높은 방사선 조사량에 노출됨으로써 촉진된 일련의 합병적인 병리생리학적 과정을 포함한다. ARS는 일반적으로 비교적 단시간에 걸쳐 약 0.7 내지 1 gray(Gy) 이상의 방사선이 전신으로 또는 중요한 신체 일부에 전달된 후에 발생한다(Waselenko J.K. et al, Annals of Internal Medicine 140(12):1037-1051, 2004; Jarrett D.G. et al, 방사선 Measurements 42:1063-1074, 2007). ARS의 잠복기, 중증도, 및 여러 출현 기간은 방사선 조사량, 조사량 속도, 및 방사선의 타입, 뿐만 아니라 촉진되는 노출의 이질성 또는 균질성의 함수이다.

ARS는 다소 예측되는 과정에 따르고 방사선에 대한 여러 세포, 조직, 및 장기 시스템의 특이적 반응의 발현인 증상을 특징으로 한다(예, Waselenko et al, supra, 특히 도 1, 표 1-3 및 표 5 참조). ARS와 연관된 증상은 메스꺼움, 구토, 설사, 호중성 백혈구 감소증, 피부 작열감 및 통증, 피로, 탈수, 염증, 탈모, 구강 점막 및 GI 시스템의 궤양, 구강건조증, 및 출혈(예, 코, 입 및 직장으로부터)을 포함한다. 조혈 전구 세포, 정모세포, 및 장 선와(crypt) 세포와 같이 고속으로 복제하는 세포는 대부분 급성 방사선 노출에 즉각적으로 취약하다. 측정 가능한 임상적 효과의 확률은 전체 조사량 또는 조사량 속도가 증가함에 따라 증가한다. 그러나, 단일의 고속 노출 후에 관찰되는 효과를 내는 전체 방사선 조사량은 더욱 장기간에 걸쳐 주어지는 경우에 작은 측정 가능한 효과에 견뎌낼 수 있다.

순환 조혈 세포 및 조혈 전구(골수) 세포가 가장 높은 방사선 민감성 세포들 사이에 있다. 방사선병과 연관된 증상에 대한 통상의 근본적인 원인은 그러한 세포에 대한 방사선의 효과이다. 조혈 증후군(H-ARS)은 일반적으로 약 0.7 ~ 1 Gy를 초과하는 상당한 일부-신체 또는 전신 방사선 수준, 및 드물게는 임상적으로 이 수준보다 상당히 낮은 방사선 수준에 노출된 인간에서 나타난다(Jarrett et al., supra; Waselenko et al., supra). 체세포 분열 활성 조혈 전구 세포는 2 내지 3 Gy의 전신 방사선 조사량 후 분열되는 제한된 용량을 갖는다. ARS의 조혈 증후군은 혈구 - 백혈구(WBC; 호중성 백혈구 및 림프구), 혈소판(thrombocytes라 칭하기도 함) 및 적혈구(RBC) - 수의 감소를 특징으로 하고, 임상적으로 현저한 결과의 가능성이 있다. 이온화 방사선에 대한 노출은 WBC 카운트의 감소를 유도할 수 있고, 이는 호중성 백혈구 감소증(호중성 백혈구/과립구의 감소) 및 림프구감소증(림프구의 감소)으로서 발현된다. RBC 감소는 빈혈을 초래할 수 있는 반면에, 혈소판 감소는 혈소판감소증을 유도할 수 있다. 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증, 혈소판감소증 및 빈혈의 동력학은 수용한 조사량, 조사량 속도, 및 신체가 조사받은 정도에 의존한다(Waselenko et al., supra). 골수에서 세포 생산에 대한 방사선에 의해 유발된 손상은 노출 시점에 시작된다. 대부분의 골수 전구 세포는 충분히 높은 방사선 조사량 후에 세포 사멸에 민감하지만, 줄기 세포 또는 액세서리 세포의 하위-개체군들은 아마도 그들의 비순환(G₀) 상태 때문에 더욱 방사선 치료에 저항성인 것으로 밝혀졌으며, 이는 잠재적으로 치명적인 조사량에 노출된 후 조혈작용의 회복에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다 (Waselenko et al., supra).

방사선 효과는 또한 노출된 신체 표면적의 양에 의존한다. 인간 신체는 즉각적인 사망 위험 없이 전신 영역에 걸쳐 약 2 Gy에 이르는 단일 조사량을 흡수할 수 있는 것으로 믿어진다. 치료되지 않은 경우, 약 2 Gy 이상의 조사량은 골수 기능 부전으로 인해 있음직한 또는 확실한 죽음을 유도한다. 단기간에 걸쳐 주어진 약 8 Gy 이상의 전신 조사량은 거의 확실히 치명적이다. 이와 대조적으로, 수십 Gy는 장기간에 걸쳐, 및/또는 작은 부피의 조직으로(예, 암 치료를 위해서와 같음) 전달될 때 허용될 수 있다.

방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증은 부패성 및 병원성 미생물에 의한 생명을 위협하는 감염증에 대한 감수성을 증가시키고, 피하 조직에서 및 장 벽의 무결성의 파괴로부터 세균 확산에 대한 면역성 저항을 감소시킨다. 감염 및 패혈증에 대한 이러한 감수성은 2 ~ 8 Gy 범위의 이온화 방사선에 노출된 환자들에서 사망률의 주요 원인이다. 호중성 백혈구 감소증과 동시에, 혈소판감소증의 변화하는 정도 역시 관찰될 수 있다. 심각한 혈소판감소증은 치료받지 않고 방치되는 경우 생명을 위협하는 출혈에 대한 민감성을 증가시킬 수 있다.

ARS와 연관된 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증은 예를 들면, 핵 사고 또는 우발적 방사선 노출을 통해 높은 수준의 방사선에 노출된 환자들에서 상당한 사망률 및 이병률을 유도한다. ARS와 연관된 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증을 감소시키기 위해 안전하게 투여될 수 있는 장기간-작용하는 G-CSF 제품, 특히 멀티 페길화 G-CSF, 및 그러한 G-CSF 제품을 사용하여 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증을 치료 및 예방하기 위한 방법에 대한 필요성이 있다.

본 발명의 목적은, 예를 들면 핵 폭발 또는 우발적인 방사선 노출의 결과로서 방사선에 노출된 환자들에서 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 기간 및/또는 중증도를 감소시키고, 이에 따라 이러한 환자의 생명을 위협하는 감염증의 위험을 감소시킴으로써 생존 가능성을 증진시키는 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명의 일 국면은 급성 방사선 증후군(ARS), 예, ARS의 조혈 증후군(H-ARS)과 연관된 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증과 같이, 방사선-유도된 호중성 백혈구 감소증을 감소시키는데 효과적인 양으로 멀티 페길화 G-CSF 변종을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방사선에 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 국면은 본원에 기재된 방법에 의해 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하기 위한 멀티 페길화 G-CSF 변종에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 이러한 국면은 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증을 치료하기 위한 멀티 페길화 G-CSF 변종에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 국면은 또한 멀티 페길화 G-CSF 변종을 환자에게 투여하여 방사선에 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하기 위한 멀티 페길화 G-CSF 변종에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 국면은 본원에 기재된 방법에 의해 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하기 위한 의약품을 제조하기 위해 멀티 페길화 G-CSF 변종을 사용하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 이러한 국면은 멀티 페길화 G-CSF 변종이 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증을 감소시키는데 효과적인 양으로 환자에게 투여되는, 방사선에 노출된 환자에서 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하기 위한 의약품을 제조하기 위해 멀티 페길화 G-CSF 변종을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 국면은 또한 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 치료를 위한 의약품을 제조하기 위해 멀티 페길화 G-CSF 변종을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 국면은 또한 멀티 페길화 G-CSF 변종을 환자에게 투여하여 방사선에 노출된 환자에서 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하기 위한 의약품을 제조하기 위해 멀티 페길화 G-CSF 변종을 사용하는 방법에 관한 것이다.

몇몇 실시예에서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 동물 모델 시스템(예를 들면, 인간 아닌 영장류 모델 시스템)에서 멀티 페길화 G-CSF 변종으로 치료받지 않은 그룹에 비해 상대적으로 멀티 페길화 G-CSF 변종으로 치료받은 그룹에서 중증 호중성 백혈구 감소증 기간을 감소시키는데 효과적인 양으로 환자에게 투여된다. 다른 실시예에서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 동물 모델 시스템(예를 들면, 인간 아닌 영장류 모델 시스템)에서 멀티 페길화 G-CSF 변종으로 치료받지 않은 그룹에 비해 상대적으로 멀티 페길화 G-CSF 변종으로 치료받은 그룹에서 방사선 노출 후 30일 또는 60일에 생존자들의 수를 증가시키는데 효과적인 양으로 환자에게 투여된다.

본 발명의 이들 국면 및 다른 국면 및 특징은 다음 상세한 설명이 수반된 도면과 관련하여 읽힐 때 더욱 완전히 명백해질 것이다.

본 발명은, 멀티 페길화 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 변종을 투여하여 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 효과를 갖는다.

도 1은 붉은 털 원숭이에서 60일 조혈 증후군 치사 조사량 반응 관계를 로그 스케일로 프로빗(probit) 치사율 % 대 TBI 조사량을 Gy(grays)로 보여준다. 2 MV LINAC 광자에 노출되고 지원 치료를 받은 붉은 털 원숭이에 대해 생성된 LD50/60 값은 LD50_LINAC(괄호 [ ]에 95% 신뢰 구간 가짐)로 표시된다. 이 도면은 또한 공동-60 감마 및 2 MV X-방사선(각각 LD50_co60 및 LD50_Xray로 표시)에 노출된 붉은 털 원숭이의 TBI 조사량 반응 및 계산된 LD50/30 값(괄호 []에 95% 신뢰 구간 포함)을 보여주는 2개의 병력 데이터 세트를 보여준다. 병력적 연구에서 동물은 지원 치료를 받지 않았다.
도 2는 LD30/60(720 센티그레이(cGy)), LD50/60(755 cGy), 및 LD70/60(805 cGy)에 근사하는 조사량으로 전신 조사에 노출되고, 지원 치료 받은 후 붉은 털 원숭이에서 평균 절대 호중성 백혈구 수치(ANC)의 변화의 시간별 과정을 보여준다.
도 3은 본 발명의 전형적인 멀티 페길화 G-CSF 변종(본원에서 "Maxy-G21"로 식별됨)이 모노 페길화 rhG-CSF에 대해 상대적으로 방사선 노출 후 인간 아닌 영장류에서 호중성 백혈구 회복을 개선시킴을 보여준다. 붉은 털 원숭이에서 절대 호중성 백혈구 수치(ANC)는 600 cGy(6.00 Gy) 조사 후 및 조사 후 1일에 Maxy-G21, Neulasta® 또는 대조군(혈청)의 투여에 의해 측정되었다. 심각한 호중성 백혈구 감소증(ANC < 500/㎕)은 수평선으로 표시된다.
도 4는 300 ㎍/kg의 Maxy-G21 또는 300 ㎍/kg의 Neulasta®에 의해 조사 후 1일에 투사된 600 cGy-조사된 붉은 털 원숭이의 약물동력학적(PK) 프로파일을 보여준다.
도 5는 776 cGy 방사선에 노출되고, 후속하여 본 발명의 전형적인 멀티 페길화 G-CSF 변종("G34", 또한 본원에서 "Maxy-G34"으로 식별됨)으로 또는 희석제("비히클")로 처리된 생쥐의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 보여준다. C57BL/6 생쥐들은 조사되고 노출 후 24시간 및 7일에(열린 다이아몬드), 또는 노출 후 24시간, 7일, 및 14일에(열린 정사각형) G34(1.0 mg/kg = 20 ㎍/20 gm 생쥐)로 피하로 주사받았다. 대조군 생쥐는 노출 후 24시간, 7일, 및 14일에(닫힌 삼각형) 희석제로 주사받았다. 생쥐들은 항생제로 치료받지 않았다.
도 6은 796 cGy 방사선에 노출되고, 후속하여 본 발명의 전형적인 멀티 페길화 G-CSF 변종("G34", 또한 본원에서 "Maxy-G34"로 식별됨)으로 또는 희석제("비히클")로 처리된 생쥐들의 카플란-마이어 생존 곡선을 보여준다. C57BL/6 생쥐들은 조사되고, 이어서 노출 후 24시간 및 7일에(열린 다이아몬드), 또는 노출 후 24시간, 7일, 및 14일에(열린 정사각형) G34(1.0 mg/kg = 20 ㎍/20 gm 생쥐)로 피하로 주사받았다. 대조군 생쥐는 노출 후 24시간, 7일, 및 14일에(닫힌 삼각형) 비히클로 주사받았다. 생쥐들은 항생제로 치료받지 않았다.

정의

이하의 명세서 및 특허 청구의 범위에서, 다음 정의가 적용된다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 임의의 특정 길이의 아미노산 서열로 제한되지 않고, 아미노산들의 중합체를 의미하는 것으로 본원에서 교환 가능하게 사용될 수 있다. 이들 용어는 전장 단백질뿐만 아니라, 예를 들면 임의의 주어진 단백질 또는 폴리펩티드의 단편 또는 끝이 잘린 버전, 변종, 도메인, 등을 포함하도록 의도된다.

"G-CSF 폴리펩티드"는 SEQ ID NO:1에 나타낸 바의 인간 과립구 콜로니 자극 인자(hG-CSF)의 서열, 또는 G-CSF 활성을 나타내는 hG-CSF의 변종을 갖는 폴리펩티드이다. "G-CSF 활성"은 G-CSF 수용체에 결합하는 능력일 수 있지만(Fukunaga et al., J. Bio. Chem, 265:14008, 1990, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨), 바람직하게는 G-CSF 세포 증식 활성일 수 있고, 이는 예를 들면 쥐의 세포주 NFS-60(ATCC Number: CRL-1838)를 사용한 시험관내 활성 분석에서 결정될 수 있다. NFS-60 세포주를 사용한 G-CSF 활성에 대한 적합한 시험관내 분석은 문헌 [Hammerling et al. in J. Pharm. Biomed. Anal. 13(l):9-20, 1995, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]에 기재되어 있다. "G-CSF 활성을 나타내는" 폴리펩티드는 측정 가능한 함수로서 예를 들면 시험관내 분석에서 측정 가능한 세포 증식 활성을 나타낼 때 그러한 활성을 갖는 것으로 고려된다.

"변종(variant)"(예, "G-CSF 변종")은 부모 폴리펩티드로부터 1개 이상의 아미노산 잔기가 상이한 폴리펩티드이고, 여기서 부모 폴리펩티드는 일반적으로 천연, 야생형 아미노산 서열을 갖는 것, 통상적으로 천연 포유류 폴리펩티드, 및 더욱 통상적으로 천연 인간 폴리펩티드이다. 따라서, 이 변종은 천연 폴리펩티드에 비해 1개 이상의 치환, 삽입 또는 결실을 함유한다. 이들은 예를 들면 1개 이상의 아미노산 잔기만큼 N- 및/또는 C-말단의 절삭, 또는 N- 및/또는 C-말단에서 1개 이상의 아미노산 잔기의 첨가, 예를 들면, N-말단에서 메티오닌 잔기의 첨가를 포함한다. 이 변종은 가장 빈번하게는 부모 폴리펩티드로부터 15개에 이르기까지 아미노산 잔기가 상이할 것이고, 예를 들면 12, 10, 8 또는 6개에 이르는 아미노산 잔기가 상이할 것이다. 일부 G-CSF 변종은 특히 N-말단에서 메티오닌 잔기의 첨가의 존부하에 G-CSF 서열에서 아미노산 치환을 갖는다.

용어 "개질된(modified)" G-CSF는, 예를 들면, 글리칸 구조의 변경에 의해 개질된 인간 G-CSF의 서열을 갖는 G-CSF 분자 또는 인간의 G-CSF의 변종을 의미한다. 예를 들면, G-CSF의 글리칸 구조는 WO 2005/055946(이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함)에 기재된 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜 모이어티가 시알산 모이어티와 같은 글리코실 링킹 그룹에 부착된 글리코 페길화 G-CSF 분자를 제공할 목적으로 개질될 수 있다. 개질된 G-CSF 분자의 또 다른 예는 야생형 폴리펩티드에 존재하지 않는 적어도 1개의 O-링크된 글리코실화 부위를 함유하는 것이다. 그와 같이 비-천연적으로 발생하는 O-링크된 글리코실화 부위들을 갖는 G-CSF 분자 뿐만 아니라 G-CSF의 개질된 당의 페길화(PEGylation)는 WO 2005/070138(이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.

달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 바의 용어 "G-CSF"는 천연 인간 서열(SEQ ID NO:1) 뿐만 아니라 인간 G-CSF 서열의 변종을 갖는 G-CSF 분자를 포함하도록 의도된다. 두 경우, 용어 "G-CSF"는 또한 G-CSF 글리코실화 변종 등의 개질된 G-CSF를 포함하도록 의도된다.

"다수의 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는"(본원에서 "멀티 페길화 G-CSF"라 칭하기도 함) 페길화 G-CSF는 폴리펩티드에 공유 부착된 단 하나의 PEG 모이어티를 갖는 "모노 페길화 G-CSF"와 대조적으로, 직접 또는 간접적으로 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 공유 부착된 2개 이상의 PEG 모이어티를 갖는 G-CSF 폴리펩티드를 의미한다. 적합한 부착 부위는 예를 들면, 리신 잔기의 ε-아미노 그룹 또는 N-말단 아미노 그룹, 유리 카복시산 그룹(예, C-말단 아미노산 잔기 또는 아스파르트산의 그것 또는 글루탐산 잔기), 시스테인 잔기의 티올 그룹, 적합하게 활성화된 카보닐 그룹, 산화된 탄수화물 모이어티 및 머캅토 그룹을 포함한다. PEG 부착 부위 및 단백질에 PEG 모이어티를 부착시키기 위한 방법에 대한 더 많은 정보는 예를 들면, WO 01/51510, WO 03/006501, 및 the Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006(Nektar Therapeutics)에서 찾을 수 있으며, 이들 문헌 모두는 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함한다. 페길화에 대한 또 다른 가능성은 예를 들면 글리칸 개질화(상기 참조)에 의해 G-CSF의 글리칸 구조에 PEG 모이어티를 부착시키는 것이다.

"멀티 페길화 G-CSF 변종"은 직접 또는 간접적으로 변종의 아미노산 잔기에 공유 부착된 2개 이상의 PEG 모이어티를 갖는 G-CSF 변종을 의미한다.

본 출원에서, 아미노산 명칭 및 원자 명칭(예, CA, CB, NZ, N, O, C, 등)은 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 의해 정의된 바와 같이 사용되고, 이는 IUPAC 명명법(IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acid and Peptides(residue names, atom names 등), Eur. J. Biochem., 138, 9-37(1984) together with their corrections in Eur. J. Biochem., 152, 1(1985)을 기반으로 한다. 용어 "아미노산 잔기"는 임의의 천연 발생 또는 비-천연 발생 아미노산 잔기, 특히 20개의 천연 발생 아미노산으로 이루어진 그룹에 함유된 아미노산 잔기, 즉, 알라닌(Ala 또는 A), 시스테인(Cys 또는 C), 아스파르트산(Asp 또는 D), 글루탐산(GIu 또는 E), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 글리신(GIy 또는 G), 히스티딘(His 또는 H), 이소류신(He 또는 I), 리신(Lys 또는 K), 류신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 아스파라긴(Asn 또는 N), 프롤린(Pro 또는 P), 글루타민(GIn 또는 Q), 아르기닌(Arg 또는 R), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 발린(VaI 또는 V), 트립토판(Trp 또는 W), 및 티로신(Tyr 또는 Y) 잔기를 지시하도록 의도된다.

본원에서 아미노산 위치/치환을 식별하기 위해 사용된 용어법은 다음과 같이 예시된다: F13은 기준 아미노산 서열에서 페닐알라닌 잔기에 의해 점유된 13번 위치를 지시한다. F13K는 리신 잔기로 치환된 13번 위치의 페닐알라닌 잔기를 의미한다. 달리 지적되지 않는 한, 본원에서 이루어진 아미노산 잔기의 번호 매김은 SEQ ID NO:1에 나타낸 hG-CSF의 아미노산 서열에 상대적으로 이루어진다. 대체 치환은 "/"로 지시되고, 예를 들여 K16R/Q는 16번 위치의 리신이 아르기닌 또는 글루타민으로 치환된 아미노산 서열을 의미한다. 다중 치환은 "+"로 지시되고, 예를 들면 K40R+T105K는 아르기닌 잔기에 의한 40번 위치의 리신 잔기의 치환 및 리신 잔기에 의한 105번 위치의 트레오닌 잔기의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 의미한다.

용어 "기능성 생체내 반감기"는 그의 통상적인 의미, 즉 시험 분자(예, 페길화 컨쥬게이트)의 생물학적 활성의 50%가 신체/타겟 장기에 여전히 존재하는 시점, 또는 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트의 활성이 초기 값의 50%인 시점으로 사용된다. "혈청 반감기"는 컨쥬게이트 분자의 50%가 세정되기에 앞서 혈장 또는 혈류 내에서 순환하는 시점으로 정의된다. 혈청 반감기에 대한 대체 용어는 "혈장 반감기", "순환하는 반감기", "혈청 청소율", "혈장 청소율" 및 "청소율 반감기"를 포함한다. 시험 분자(예, 페길화 컨쥬게이트)는 1개 이상의 세망내피계(RES), 신장, 비장 또는 간의 작용에 의해, 수용체-매개된 저하에 의해, 또는 특이적 또는 비-특이적 단백질 가수분해에 의해, 특히 수용체-매개된 청소율 및 신장 청소율의 작용에 의해 세정된다. 통상적으로, 청소율은 크기(사구체 여과에 대한 차단에 상대적임), 전하, 부착된 탄수화물 사슬, 및 단백질에 대한 셀룰러 수용체의 존재에 좌우된다. 유지되어야 하는 기능성은 통상적으로 증식성 또는 수용체-결합 활성으로부터 선택된다. 기능성 생체내 반감기 및 혈청 반감기는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다.

생체내 반감기 또는 혈청 반감기를 기준하여 사용된 바의 용어 "증가된"은 시험 분자, 즉, 멀티 페길화 G-CSF 변종의 반감기가 기준 분자, 예를 들면 비-컨쥬게이트된(즉, 페길화되지 않은) hG-CSF(예 Neupogen®)의 그것에 상대적으로 또는 바람직하게는 필적하는 조건 하에 측정된 바와 같이(통상적으로 쥐, 토끼, 돼지 또는 원숭이와 같은 실험실 동물에서 측정됨) 모노 페길화 G-CSF Neulasta®에 상대적으로 통계학적으로 현저하게 증가되었음을 지시하기 위해 사용된다. 예를 들면, 시험 분자의 혈청 반감기(t₁ _/2)는 기준 분자의 그것에 적어도 약 1.2 ×{즉,(시험 분자의 t₁ _/2)/(기준 분자의 t₁ _/2) = 1.2}, 예를 들면 기준 분자의 그것의 적어도 약 1.5 × 만큼과 같이 적어도 약 1.4 ×, 예를 들면 적어도 약 1.8 × 만큼과 같이 적어도 약 1.6 ×, 예를 들면 적어도 약 2.0 ×, 2.5 ×, 3 ×, 5 ×, 또는 10 × 만큼 증가될 수 있다.

용어 "AUC" 또는 "곡선 아래 면적(Area Under the Curve)"은 그의 통상적인 의미, 즉, 시험 분자가 환자에게 투여된 혈청 농도 대 시간 곡선 아래 면적으로서 사용된다. 일단 실험실 농도-시간 지점이 결정되면, AUC는 GraphPad Prism®(GraphPad Software, Inc.) 등의 컴퓨터 프로그램에 의해 편리하게 산출될 수 있다.

AUC를 기준으로 사용된 바의 용어 "증가된"은 시험 분자, 즉, 멀티 페길화 G-CSF 변종의 AUC가 기준 분자, 예를 들면 비-컨쥬게이트된(즉, 페길화되지 않은) hG-CSF(예 Neupogen®)의 그것에 상대적으로 또는 바람직하게는 필적하는 조건 하에 측정된 바와 같이(통상적으로 쥐, 토끼, 돼지 또는 원숭이와 같은 실험실 동물에서 측정됨) 모노 페길화 hG-CSF Neulasta®에 상대적으로 통계학적으로 현저하게 증가되었음을 지시하기 위해 사용된다. 예를 들면, 시험 분자의 AUC는 기준 분자의 그것에 적어도 약 1.2 ×{즉,(시험 분자의 AUC)/(기준 분자의 AUC) = 1.2}, 예를 들면 기준 분자의 그것의 적어도 약 1.5 × 만큼과 같이 적어도 약 1.4 ×, 예를 들면 적어도 약 1.8 × 만큼과 같이 적어도 약 1.6 ×, 예를 들면 적어도 약 2.0 ×, 2.5 ×, 3 ×, 5 ×, 또는 10 × 만큼 증가될 수 있다.

용어 "환자"는 비-영장류(예, 소, 돼지, 말, 고양이, 또는 개) 또는 영장류(예, 원숭이, 침팬지, 또는 인간), 예를 들면 인간 아닌 영장류(예, 원숭이 또는 침팬지), 또는 인간을 포함하는 포유류와 같은 동물을 의미한다. 몇몇 예에서, 환자는 방사선에 노출된 인간과 같은 포유류이다. 용어 "피검자"는 본원에서 "환자"와 교환 가능하게 사용된다.

용어 "급성 방사선 노출"은 단기간, 즉, 24시간 미만(예를 들면, 20시간 미만, 16시간 미만, 12시간 미만, 10시간 미만, 8시간 미만, 6시간 미만, 2시간 미만, 1시간 미만, 30분 미만, 20분 미만, 10분 미만, 5분 미만, 또는 1분 미만) 동안 발생하는 방사선에 대한 노출을 의미한다. 급성 방사선 노출은 핵 사고(예를 들면, 핵 폭발); 실험실 또는 제조 사고; 분 또는 시간 경과에 따른 고도로 방사선 활성 제공원을 취급하는 동안 폭발; 또는 우발적인 또는 의도적인 높은 의료적 조사량으로부터 초래될 수 있다.

용어 "방사선 조사량(radiation dose)"은 물질 또는 조직에 의해 흡수된 방사선의 총량을 의미하고, 일반적으로 센티그레이(cGy) 또는 그레이(Gy)로 표시된다.

용어 "방사선 조사량 속도(radiation dose rate)"는 단위 시간당 흡수된 방사선 조사량(투약량)을 의미한다.

용어 "LDx/y"는 y일까지 환자의 x %의 사망을 초래하는 방사선의 평균 조사량을 의미한다. 예를 들면, 용어 LD50/30 및 LD50/60은 각각 30 또는 60일까지 환자의 50%의 사망을 초래하는 방사선의 평균 조사량을 의미한다.

여러 가지 추가 용어가 본원에 정의되거나 또는 달리 특성화된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은, 방사선에 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 이 방법은 상기 환자에게 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증을 감소시키는데 효과적인 양으로 멀티 페길화 G-CSF 변종을 투여하는 것을 포함한다.

우리는 멀티 페길화 G-CSF 변종의 투여가 조사된 인간이 아닌 영장류 모델에서 모노 페길화 hG-CSF(Neulasta)®의 투여와 비교할 때 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 기간을 감소시키는데 더욱 효과적임을 발견하였다. 절대 호중성 백혈구 회복(ANC)까지의 시간의 감소는 역시 대조군 및 모노 페길화 hG-CSF(Neulasta®) 모두에 비교할 때 현저히 개선되었다. 본원에 사용된 바의 용어 "ANC 회복까지의 시간"은 화학 요법의 1일부터 시작하여 환자가 0.5 × 10⁹ ANC 세포/L를 초과하는, 즉, 심각한 호중성 백혈구 감소증에 대해 한정된 한계를 초과하는 2개의 연속적인 일 수중 첫 번째에 이르기까지의 일 수로 정의된다. ANC 회복까지의 시간, 백혈구 감소증의 기간/일, 및 심각한 호중성 백혈구 감소증의 기간/일은 모두 방사선에 노출된 환자가 면역 억제된 상태에 있는 동안의 기간을 지시한다(용어 "호중성 백혈구 감소증의 일수" 및 "심각한 호중성 백혈구 감소증의 일수"는 본원에서 교환 가능하게 사용된다). 이러한 기간 동안, 환자는 급성 방사선 증후군의 다른 증상을 악화시킬 수 있는 감염증에 취약할 수 있고, 사망률로 이어질 수 있다. 본원 예에 기재된 결과에 비추어, 멀티 페길화 G-CSF 변종의 투여는 환자에서 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 크기 및 기간을 감소시키는데 있어서 모노 페길화 hG-CSF(Neulasta®)의 투여보다 더 효과적인 것으로 예상된다.

본 발명의 방법은 ANC 회복까지의 시간, 백혈구 감소증의 일수, 및 호중성 백혈구 감소증의 일수를 감소시키는데 효과적이다. 등가의 조사량에서, 이 방법은 모노 페길화 hG-CSF(Neulasta®)에 비교할 때 ANC 회복에 이르는 시간, 백혈구 감소증의 일 수, 및 호중성 백혈구 감소증의 일 수를 감소시키는데 더욱 효과적이다.

본 발명의 방법에 따라, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 방사선 노출 후 7일 내에 투여되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 방사선 노출 후 약 4일 내에, 예를 들면 방사선 노출 후 3일 내에, 예, 방사선 노출 후 2일 내, 예를 들면 방사선 노출 후 1일(24시간) 내에 투여될 수 있다. 환자의 예후에 좌우되어, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 치료 처방의 과정에 걸쳐 2회 이상 투여될 수 있다. 예를 들면, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 주간으로 예를 들면 2주, 3주 또는 4주 동안 투여될 수 있다. 페길화되지 않은 hG-CSF(예, Neupogen®) 및 모노 페길화 hG-CSF(예, Neulasta®)에 비하여 멀티 페길화 G-CSF 변종의 우수한 생체 적합성 덕택에, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 바람직하게는 환자의 예후에 좌우되어 장기간에 걸쳐, 예를 들면, 10일마다, 2주마다, 18일마다, 또는 3주마다 투여될 수 있다.

멀티 페길화 G- CSF 변종

멀티 페길화 단백질은 당 분야에 잘 공지된 많은 방식으로 제조될 수 있다. 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티의 공유 결합 부착(즉, 컨쥬게이션)("PEGylation")은 예를 들면 순환 반감기를 개선하고/개선하거나 잠재적인 에피토프(epitopes)를 차폐하고, 그에 따라 원치않는 면역 응답의 가능성을 줄이기 위해, 그러한 단백질 또는 폴리펩티드, 특히 제약학적 단백질의 특성을 개선시키기 위한 잘 공지된 기술이다. 활성화된 PEG에 기초한 많은 기술이 단백질 상의 1개 이상의 그룹에 대한 PEG 모이어티의 부착을 제공하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA, Nektar Therapeutics로부터 입수할 수 있음)는 일반적으로 아미드 결합을 통해 N-말단 및 리신 잔기의 ε-아미노 그룹으로의 부착에 선택적인 것으로 간주된다. 상기한 바와 같이, 상업적으로 입수할 수 있는 페길화 G-CSF 제품 Neulasta®은 G-CSF 분자의 N-말단에 부착된 단일 20 kDa PEG 모이어티를 함유한다.

몇몇 실시예에서, 본원에 기재된 멀티 페길화 G-CSF 변종은 쥐 등의 실험실 동물에서 시험하였을 때 모노 페길화 G-CSF Neulasta®(pegfilgrastim)에 상대적으로 증가된 혈청 반감기 및/또는 증가된 곡선 아래 면적(AUC)과 같이 개선된 약물동력학을 나타낸다. 본 발명에 따라, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 동물 모델에서 모노 페길화 G-CSF Neulasta®에 비해 유리하고, 등가의 조사량에서 회복에 이르는 단기간의 시간 및 단기간의 호중성 백혈구 감소증/백혈구 감소증을 제공하는 것으로 밝혀졌다.

일 실시예에서, 본 발명에 따라 투여된 멀티 페길화 G-CSF 변종은 아미드 결합을 통해 리신 잔기의 N-말단 아미노 그룹 및/또는 ε-아미노 그룹에 우선적으로 부착되는 아민-특이적 활성화된 PEG에 의해 페길화될 수 있다. 아민-특이적 활성화된 PEG 유도체의 예는 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA), mPEG-숙신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA) 및 mPEG-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트(mPEG-SMB)(Nektar Therapeutics로부터 입수할 수 있음; the Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006, "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation" 참조); PEG-SS(숙신이미딜 숙시네이트), PEG-SG(숙신이미딜 글루타레이트), PEG-NPC(p-니트로페닐 카보네이트), 및 SunBio Corporation으로부터 입수할 수 있는 PEG-이소시아네이트; 및 NOF Corporation으로부터 입수할 수 있는 PEG-SCM을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 분지형일 수 있다.

페길화 단백질을 획득하기 위한 방법들은 당 분야에 잘 공지되어 있고; 예를 들면 the Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006을 참고하고, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다. 페길화 G-CSF 변종, 및 이들의 제조 방법은 예를 들면 WO 01/51510, WO 03/006501, US 6,646,110, US 6,555,660 및 US 6,831,158에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.

바람직한 실시예에서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 N-말단에 부착된 PEG 모이어티 및 리신 잔기에 부착된 적어도 1개의 PEG 모이어티를 포함한다.

일 실시예에서, 투여된 멀티 페길화 G-CSF 변종은 페길화가 바람직한 위치에 리신 잔기를 도입하기 위해 SEQ ID NO: 1의 hG-CSF 서열 내에 적어도 1개의 치환을 포함한다. 특히, 리신 잔기는 TlK, P2K, L3K, G4K, P5K, A6K, S7K, S8K, L9K, PlOK, Q1lK, S12K, F13K, L14K, L15K, E19K, Q20K, V21K, Q25K, G26K, D27K, A29K, A30K, E33K, A37K, T38K, Y39K, L41K, H43K, P44K, E45K, E46K, V48K, L49K, L50K, H52K, S53K, L54K, I56K, P57K, P60K, L61K, S62K, S63K, P65K, S66K, Q67K, A68K, L69K, Q70K, L71K, A72K, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K, S96K, P97K, E98K, L99K, GlOOK, PlOlK, T102K, D104K, T105K, Q107K, L108K, D109K, A111K, D112K, F113K, T115K, T116K, W118K, Q119K, Q120K, M121K, E122K, E123K, L124K, M126K, A127K, P128K, A129K, L130K, Q131K, P132K, T133K, Q134K, G135K, A136K, M137K, P138K, A139K, A141K, S142K, A143K, F144K, Q145K, S155K, H156K, Q158K, S159K, L161K, E162K, V163K, S164K, Y165K, V167K, L168K, H170K, L171K, A172K, Q173K 및 P174K로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상의 치환체에 의해 도입될 수 있다(여기서 잔기 위치는 SEQ ID NO: 1에 상대적임).

그래서, 바람직한 아미노산 치환체의 예는, Q70K, Q90K, T105K, Q120K, T133K, S159K 및 H170K/Q/R 중 1개 이상, 예를 들면 이들 치환체 중, 2, 3, 4 또는 5개, 예를 들면: Q70K+Q90K, Q70K+T105K, Q70K+Q120K, Q70K+T133K, Q70K+S159K, Q70K+H170K, Q90K+T105K, Q90K+Q120K, Q90K+T133K, Q90K+S159K, Q90K+H170K, T105K+Q120K, T105K+T133K, T105K+S159K, T105K+H170K, Q120K+T133K, Q120K+S159K, Q120K+H170K, T133K+S159K, T133K+H170K, S159K+H170K, Q70K+Q90K+T105K, Q70K+Q90K+Q120K, Q70K+Q90K+T133K, Q70K+Q90K+S159K, Q70K+Q90K+H170K, Q70K+T105K+Q120K, Q70K+T105K+T133K, Q70K+T105K+S159K, Q70K+T105K+H170K, Q70K+Q120K+T133K, Q70K+Q120K+S159K, Q70K+Q120K+H170K, Q70K+T133K+S159K, Q70K+T133K+H170K, Q70K+S159K+H170K, Q90K+T105K+Q120K, Q90K+T105K+T133K, Q90K+T105K+S159K, Q90K+T105K+H170K, Q90K+Q120K+T133K, Q90K+Q120K+S159K, Q90K+Q120K+H170K, Q90K+T133K+S159K, Q90K+T133K+H170K, Q90+S159K+H170K, T105K+Q120K+T133K, T105K+Q120K+S159K, T105K+Q120K+H170K, T105K+T133K+S159K, T105K+T133K+H170K, T105K+S159K+H170K, Q120K+T133K+S159K, Q120K+T133K+H170K, Q120K+S159K+H170K, T133K+S159K+H170K, Q70K+Q90K+T105K+Q120K, Q70K+Q90K+T105K+T133K, Q70K+Q90K+T105K+S159K, Q70K+Q90K+T105K+H170K, Q70K+Q90K+Q120K+T133K, Q70K+Q90K+Q120K+S159K, Q70K+Q90K+Q120K+H170K, Q70K+Q90K+T133K+S159K, Q70K+Q90K+T133K+H170K, Q70K+Q90K+S159K+H170K, Q70K+T105K+Q120K+T133K, Q70K+T105K+Q120K+S159K, Q70K+T105K+Q120K+H170K, Q70K+T105K+T133K+S159K, Q70K+T105K+T133K+H170K, Q70K+T105K+S159K+H170K, Q70K+Q120K+T133K+S159K, Q70K+Q120K+T133K+H170K, Q70K+T133K+S159K+H170K, Q90K+T105K+Q120K+T133K, Q90K+T105K+Q120K+S159K, Q90K+T105K+Q120K+H170K, Q90K+T105+T133K+S159K, Q90K+T105+T133K+H170K, Q90K+T105+S159K+H170K, Q90K+Q120K+T133K+S159K, Q90K+Q120K+T133K+H170K, Q90K+Q120K+S159K+H170K, Q90K+T133K+S159K+H170K, T105K+Q120K+T133K+S159K, T105K+Q120K+T133K+H170K, T105K+Q120K+S159K+H170K, T105K+T133K+S159K+H170K 또는 Q120K+T133K+S159K+H170K를 포함한다. 상기 열거된 임의의 변종에서, 치환체 H170K는 대신에 H170Q 또는 H170R일 수 있다. 리신을 도입하기 위한 특히 바람직한 치환체는 T105K 및 S159K 중의 하나 또는 둘을 포함한다.

추가 실시예에서, G-CSF 폴리펩티드는 위치 16, 23, 34 및 40에서 1개 이상의 천연 리신 잔기가 이들 위치에서 페길화를 피하기 위해 제거되는 G-CSF 변종을 제거하기 위해 변경될 수 있다. 예를 들면, 1개 이상의 이들 리신 잔기는 치환에 의해, 바람직하게는 아르기닌 또는 글루타민 잔기에 의해, 더욱 바람직하게는 아르기닌 잔기에 의해 제거될 수 있다. 바람직하게는, 위치 16, 34 및 40에서 1개 이상의 리신 잔기는 치환에 의해 제거되고, 더욱 바람직하게는 이들 리신 중의 2개 또는 3개가 제거되고, 가장 바람직하게는 이 위치에서 3개의 리신 모두가 치환에 의해 제거된다. 따라서, 바람직한 실시예에서 G-CSF 변종은 K16R, K16Q, K34R, K34Q, K40R 및 K40Q로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 1개의 치환체; 즉, K16R/Q, K34R/Q 및 K40R/Q로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 1개의 치환체를 갖는 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함한다. 특히 바람직한 실시예에서, 변종은 치환체 K16R/Q + K34R/Q + K40R/Q, 예를 들면, K16R+K34R+K40R 또는 K16Q+K34R+K40R 또는 K16R+K34Q+K40R 또는 K16R+K34R+K40Q 또는 K16Q+K34Q+K40R 또는 K16R+K34Q+K40Q 또는 K16Q+K34Q+K40Q를 포함한다.

또 다른 실시예에서, G-CSF 변종은 상기 설명된 바와 같이 리신 잔기를 제거하기 위한 적어도 1개의 치환체와 함께 리신 잔기를 도입하기 위한 적어도 1개의 치환체를 포함한다.

또 다른 실시예에서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 아르기닌 또는 글루타민 잔기에 의해서와 같이, 예를 들면 아르기닌 잔기에 의한 위치 16, 34, 및 40에서 1개 이상의 리신 잔기의 치환체 및 Q70K, Q90K, T105K, Q120K, T133K, 및 S159K로부터 선택된 1개 이상의 치환체를 포함하고, 각각 약 1000~10,000 Da의 분자량을 갖는 2~6, 예를 들면 2~4, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 컨쥬게이트된다.

또 다른 실시예에서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 K16R, K34R, 및 K40R로부터 선택된 1개 이상의 치환체, 및 Q70K, Q90K, T105K, Q120K, T133K, 및 S159K로부터 치환된 1개 이상의 치환체를 포함하고, 각각 약 1000~10,000 Da의 분자량을 갖는 2~6, 예를 들면 2~4, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 컨쥬게이트된다.

또 다른 실시예에서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 아르기닌 또는 글루타민 잔기에 의해서와 같이, 예를 들면 아르기닌 잔기에 의한 위치 16, 34, 및 40에서 1개 이상의 리신 잔기의 치환체 및 T105K 및 S159K로부터 선택된 적어도 1개의 치환체를 포함하고, 각각 약 1000-10,000 Da의 분자량을 갖는 2~6, 예를 들면 2~4, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 컨쥬게이트된다.

또 다른 실시예에서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 K16R, K34R, 및 K40R로부터 선택된 1개 이상의 치환체, 및 T105K 및 S159K로부터 선택된 적어도 1개의 치환체를 포함하고, 각각 약 1000~10,000 Da의 분자량을 갖는 2~6, 예를 들면 2~4, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 컨쥬게이트된다.

특정 실시예에서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 치환체 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하고, 각각 약 1000~10,000 Da의 분자량을 갖는 2~6, 예를 들면 2~4, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 컨쥬게이트된다.

특정 실시예에서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 약 5000~6000 Da의 분자량을 갖는 2~6, 통상적으로 2~5, 예를 들면 2~4, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 예를 들어, 약 5 kDa의 분자량을 갖는 mPEG가 부착될 수 있다. 바람직하게는, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 약 5000~6000 Da의 분자량을 갖는 2~4 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 예를 들어, 5 kDa mPEG가 부착된다. 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 특히 바람직한 멀티 페길화 G-CSF 변종은 치환체 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하고, 약 5 kDa의 분자량을 갖는 2~4 PEG 모이어티, 예를 들면 3개의 그러한 PEG 모이어티를 함유한다.

또 다른 실시예에서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 단지 단일 수의 PEG 모이어티가 부착되도록, 예, 컨쥬게이트당 2, 3, 4 또는 5 PEG 모이어티를 갖도록, 또는 컨쥬게이트와 상이한 수의 PEG 모이어티와의 바람직한 혼합물이 부착되도록, 예를 들어, 2~5, 2~4, 3~5, 3~4, 4~6, 4~5 또는 5~6 부착된 PEG 모이어티를 갖는 컨쥬게이트의 혼합물을 갖도록 생산될 수 있다. 상기한 바와 같이, 바람직한 컨쥬게이트 혼합물의 예는 약 5 kDa의 2~4 PEG 모이어티를 갖는 것, 예를 들면 컨쥬게이트당 주로 3 PEG 모이어티가 부착되지만, 2 또는 4 PEG 모이어티가 부착된 컨쥬게이트의 작은 부분을 갖는 컨쥬게이트이다.

특정 수의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 컨쥬게이트, 또는 제한된 범위의 수의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 컨쥬게이트의 혼합물이 적합한 페길화 조건을 선택하고, 임의로 목적하는 수의 PEG 모이어티를 갖는 컨쥬게이트를 분리하기 위해 후속 정제를 사용함으로써 획득될 수 있음이 이해될 것이다. 상이한 수의 PEG 모이어티가 부착된 G-CSF 컨쥬게이트들을 분리하기 위한 방법 뿐만 아니라 부착되는 PEG 모이어티의 수를 결정하는 방법의 예는 WO 01/51510 및 WO 03/006501에 기재되어 있으며, 이들 모두 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함한다. 본 발명의 목적 상, 컨쥬게이트는 SDS-PAGE 겔 상의 분리가 주어진 수(들)의 PEG 모이어티에 대응하는 밴드(들) 이외에 어떠한 밴드도 보이지 않거나 또는 단지 하찮은 밴드를 보이는 경우에 주어진 수의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 것으로 고려될 수 있다. 예를 들면, 컨쥬게이트의 샘플은 샘플이 그 위에서 진행되는 SDS-PAGE 겔이 3 PEG 그룹 각각에 대응하는 주요 밴드를 보이고, 단지 하찮은 밴드를 보이거나 또는 바람직하게는 2 또는 4 PEG 그룹에 대응하는 어떠한 밴드도 보이지 않는 경우에 3 부착된 PEG 그룹을 갖는 것으로 고려된다.

몇몇 경우에, mPEG-SPA와 같이 아민-특이적 활성화된 PEG 유도체는 리신 잔기의 N-말단 및 ε-아미노 그룹에 아미드 결합을 통해 배타적으로 부착될 수 없지만, 에스테르 결합을 통해 세린, 티로신 또는 트레오닌 잔기의 히드록시 그룹에 부착될 수도 있다. 결과적으로, 페길화 단백질은 충분한 정도의 균일성을 가질 수 없고, 의도되었던 것 이외의 많은 상이한 PEG 이성질체를 함유할 수 있다. 에스테르 결합을 통한 그러한 PEG 모이어티 결합은 통상적으로 불안정할 수 있고, US 가특허 출원 No. 60/686,726,(본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨)에 기재된 방법에 의해 제거될 수 있고, 이 특허 출원은 히드록시 그룹에 부착된 불안정한 PEG 모이어티를 제거하기에 충분한 시간 동안 상승된 pH에 페길화 폴리펩티드를 적용시키는 것을 포함한다. 이 방법은 또한 USSN 11/420,546(U.S. Pat. No. 7,381,805) 및 WO 2006/128460에 기재되어 있고, 이들 각각은 참고 문헌으로 본 명세서에 포함된다.

바람직한 실시예에서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 위치상의 PEG 이성질체 종의 혼합물이다. 본원에 사용된 바의, 용어 단백질의 "위치상의 PEG 이성질체"는 PEG 그룹이 단백질의 상이한 아미노산 위치에 존재하는 경우의 단백질의 상이한 페길화 형태를 의미한다. 본 발명을 실시하는데 사용된 바람직한 멀티 페길화 G-CSF 변종은 리신/N-말단 PEG 이성질체의 혼합물이다. 용어 단백질의 "리신/N-말단 PEG 이성질체"는 PEG 그룹이 단백질의 아미노-말단 및/또는 단백질 내의 리신 잔기의 입실론 아미노 그룹에 부착되었음을 의미한다. 예를 들면, 어구 "3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 리신/N-말단 위치상의 PEG 이성질체"는 G-CSF에 적용되는 바와 같이, 3개의 PEG 그룹이 단백질의 리신 잔기의 입실론 아미노 그룹 및/또는 N-말단에 부착된 G-CSF 위치상의 PEG 이성질체의 혼합물을 의미한다. 통상적으로, "3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 리신/N-말단 위치상의 PEG 이성질체"는 리신 잔기에 부착된 2개의 PEG 모이어티 및 N-말단에 부착된 1개의 PEG 모이어티를 가질 것이다. 위치상의 PEG 이성질체의 분석은 WO 2006/128460에 기재된 바의 양이온 교환 HPLC를 사용하여 수행될 수 있고, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.

통상적으로, 위치상의 PEG 이성질체 종의 혼합물은 리신/N-말단 위치상의 PEG 이성질체의 실질적으로 정제된 혼합물이다. 폴리펩티드의 "리신/N-말단 위치상의 PEG 이성질체의 실질적으로 정제된 혼합물"은 비-리신/N-말단 위치상의 PEG 이성질체와 같은 불순물을 제거하기 위해 크로마토그래피 또는 다른 정제 과정에 적용된 리신/N-말단 위치상의 PEG 이성질체의 혼합물에 관한 것이다. 예를 들면, "리신/N-말단 위치상의 PEG 이성질체의 실질적으로 정제된 혼합물"은 그렇지 않으면 부분 디페길화 단계 및 본원에 기재된 바의 후속 정제 없이 존재할 수 있었던 히드록실 그룹에 부착된 가장 불안정한 PEG 모이어티가 없을 수 있고, 통상적으로 히드록실 그룹에 부착된 불안정한 PEG 모이어티를 함유하는 약 20% 미만, 더욱 통상적으로 약 15% 미만의 폴리펩티드를 함유할 것이다. 바람직하게는, 히드록실 그룹에 부착된 불안정한 PEG 모이어티를 함유하는 약 10% 미만, 예를 들면, 5% 미만의 폴리펩티드가 존재할 것이다.

바람직하게는, 위치상의 PEG 이성질체 종의 혼합물은 G-CSF 변종의 위치상의 PEG 이성질체의 균일 혼합물이다. 용어 "폴리펩티드(G-CSF) 변종의 위치상의 PEG 이성질체의 균일 혼합물"은 상이한 위치상의 PEG 이성질체의 폴리펩티드 모이어티가 동일함을 의미한다. 이는 혼합물의 상이한 위치상의 PEG 이성질체들 모두가 단일 폴리펩티드 변종 서열에 기초함을 의미한다. 예를 들면, 페길화 G-CSF 폴리펩티드 변종의 위치상의 PEG 이성질체의 균일 혼합물은 이 혼합물의 상이한 위치상의 PEG 이성질체들이 단일 G-CSF 폴리펩티드 변종에 기초함을 의미한다.

통상적으로, G-CSF 변종의 위치상의 PEG 이성질체의 균일 혼합물은 실질적인 균일성을 나타낸다. 본원에 사용된 바의, "균일성"은 상이한 위치상의 이성질체의 수, 즉, 상이한 위치에 부착된 상이한 수의 PEG 모이어티를 함유하는 상이한 폴리펩티드 이성질체 뿐만 아니라 이들 위치상의 이성질체의 상대적 분포의 견지에서, 페길화 폴리펩티드의 균일성을 의미한다. 인간 또는 동물에서 치료용으로 의도된 제약학적 폴리펩티드들에 대해, 일반적으로 상이한 위치상의 PEG 이성질체 및 상이한 페길화 종의 수가 최소화되는 것이 바람직하다.

일 실시예에서(아래 예에서 "Maxy-G21"로 언급됨), 멀티 페길화 G-CSF 변종은 G-CSF 변종 성분이 치환체 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K(SEQ ID NO:1에 상대적임)와 함께 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, 각각 4 또는 5개의 부착된 모이어티를 갖는 위치상의 이성질체들을 포함하고, Ser66 또는 Tyrl65 중의 하나 또는 둘 다에서 불안정한 PEG 모이어티, 뿐만 아니라 N-말단에서 및 위치 K23, K105 및 K159중의 1개 또는 2개에서 안정한 PEG 모이어티를 포함하는 위치상의 PEG 이성질체의 혼합물이다. 본원에서 Maxy-G21로서 언급된 멀티 페길화 G-CSF 변종은 각각 5000 Da의 평균 분자량을 갖는 mPEG-SPA(Nektar)인 PEG 모이어티를 포함한다.

용어, "부분 디페길화"는 본원에서 히드록실 그룹에 부착된 불안정한 PEG 모이어티의 제거를 의미하는 한편, 리신 잔기의 N-말단 또는 아미노 그룹에 더욱 안정하게 부착된 PEG 모이어티는 손상되지 않고 유지된다. 이러한 과정을 수행하기 위한 방법은 USSN 60/686,726, USSN 11/420,546(U.S. Pat. No. 7,381,805), 및 WO 2006/128460에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함된다.

또 다른 실시예에서(아래 예에서 "Maxy-G34"로 언급됨), 멀티 페길화 G-CSF 변종은 G-CSF 변종 성분이 치환체 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K(SEQ ID NO:1에 상대적임)와 함께 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 위치상의 PEG 이성질체의 혼합물이고, 여기서 이 혼합물의 적어도 80%는 각각 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 위치상의 PEG 이성질체들 중의 2종을 함유하고, 이성질체들 중의 하나는 N-말단, Lys 23 및 Lys 159에 부착된 PEG 그룹을 갖고, 나머지 이성질체는 N-말단, Lys 105 and Lys 159에 부착된 PEG 그룹을 갖는다. 본원에서 Maxy-G34로서 언급된 멀티 페길화 G-CSF 변종은 각각 5000 Da의 평균 분자량을 갖는 mPEG-SPA(Nektar)인 PEG 모이어티를 포함한다.

상기 모든 실시예에 대해, G-CSF 변종 및 멀티 페길화 G-CSF 변종은 임의로 N-말단에 부착된 메티오닌 잔기를 포함할 것이다.

추가 실시예에서, 본 발명에 따라 투여될 멀티 페길화 G-CSF 변종은 다음중 임의의 문헌에 기재된 바와 같이 제조될 수 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참고 문헌으로서 인용된다:

ㆍ WO 89/05824(G-CSF의 리신-소진된 변종)

ㆍ US 5,824,778(상기 아미노산의 카복실 그룹을 통해 폴리펩티드의 적어도 1개의 아미노산에 공유 부착된 적어도 1개의 PEG 분자를 갖는 G-CSF)

ㆍ WO 99/03887(G-CSF의 페길화 시스테인 변종)

ㆍ WO 2005/055946(온전한 글리코실 링킹 그룹을 통해 연결된 PEG 모이어티를 갖는 "글리코 페길화" G-CSF 컨쥬게이트)

ㆍ WO 2005/070138(대응하는 야생형 폴리펩티드에 존재하지 않는 O-링크된 글리코실화 부위를 인코딩한 돌연변이 펩티드 서열을 포함하는 G-CSF 폴리펩티드).

ㆍ US 2005/0114037 Al(많은 상이한 지정된 아미노산 위치 중 적어도 1개에 부착된 적어도 1개의 중합성 모이어티를 갖는 G-CSF)

또 다른 실시예에서, 본 발명에 따라 투여되어야 할 멀티 페길화 G-CSF 변종은 모노 페길화 hG-CSF, Neulasta®에 비해 증가된 혈청 반감기 및/또는 증가된 AUC와 같이 개선된 약물동태학적 특성을 나타낸다. 바람직하게는, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 Neulasta®의 혈청 반감기 또는 AUC의 적어도 약 1.2× 만큼, 예를 들면 적어도 약 1.5× 만큼과 같이 적어도 약 1.4× 만큼, 예를 들면 적어도 약 1.8× 만큼과 같이 적어도 약 1.6× 만큼, 예를 들면 모노 페길화 hG-CSF, Neulasta®의 그것의 적어도 약 2.0×, 2.5×, 3×, 5×, 또는 10× 만큼 증가된 혈청 반감기 또는 AUC를 나타낸다.

방사선 노출 및 치료

A. 조혈 시스템에 대한 방사선 노출의 효과

방사선 사고 시나리오는 심각하게-방사선 조사된 개인에 대한 비상 대비 모델 및 치료 전략의 설계에 유용한 여러 가지 정의하는 특성을 제공해 왔다. 소스에 상대적인 신체 위치, 우연한 차폐 및 거리는 개개인의 임의의 그룹에 대한 일방적이고, 균일하지 않고 이질적인 노출을 초래할 것이다. 추가로, 노출과 치료 개시 사이의 시간 간격은 최적보다 적을 수 있다. 이러한 노출 측면은 정확한 흡수 조사량; 환자 분류 및 치료를 위한 기초를 을 결정하는 데 어려움을 강조하고, 추가로 생물학적 조사량 평가(biodosimetry)에 대한 치료의 효과는 공지되어 있지 않다. 방사선 노출에 관하여, 골수-유도된 조혈 줄기 및 전구 세포("BM-유도된 HSC 및 HPC") 및 흉선 조직의 가능한 남김, 및 그에 따라 조혈 성장 인자("HGF")의 시기 적절한 투여에 대한 응답으로 조혈 및 림프성 재생에 대한 잠재력을 증진시키는, 고도로 가변적인 조사량 분포를 예측하는 상기 특성들을 가정하는 것이 타당하다.

조혈 시스템은 급성 전신 조사(TBI)에 따른 가장 방사선 민감성이고, 조사량-제한 장기 시스템이다. HSC 및 HPC는 최소한 수리 능력을 갖는 조사량-의존형 지수 형식으로 사멸되고, 노출 조사량의 완만한 증가가 HSC 및 HPC의 불균형적으로 증가된 사멸을 초래함을 말한다. 성숙하고, 더욱 분화된 세포는 고도의 증식성 줄기 및 전구 세포보다 더 방사선 저항성이다. HSC의 서브세트가 비교적 방사선 저항성임이 제안되어 있다. 활성 골수 전반적인 불균일한 방사선 노출 및 결과의 가변적인 조사량 분포의 현실성에 의해 콘서트에서 HSC 및 HPC에 대한 세포 사멸의 지수, 조사량-의존 특성은 HSC 및 HPC의 작은 또는 적합한 분수뿐만 아니라, 각각의 BM(osteoblast)의 세포, 혈관 및 흉선(상피 세포) 틈새(niches)가 조혈 증후군에서 방사선의 잠재적으로 치명적인 조사량에 생존하고 여기에 개략된 대로 치료 접근법에 순응할 것임을 시사한다.

핵 폭발 또는 사고로 인한 급성 노출은 어느 정도의 부분 신체 차폐에 의해 일방적이고 불균일하기 쉬울 것이다. 결과적으로, 골수 및 혈관 틈새 내에 위치한 HSC 및 HPC의 일 분획이 노출되지 않거나, 또는 방사선의 현저히 낮은 조사량에만 노출될 것이다. 동물 모델에서 부분-신체 또는 불균일한 방사선 조사의 절약 효과를 나타내는 일관성 있는 데이터 베이스가 있다. 일방적인 노출은 일방 대 쌍방 노출에 대해 LD50/30 값(30일 내에 대상자의 50%의 사망을 초래하는 방사선의 평균 조사량)의 대략 20% 증가를 초래할 수 있다. 방사선 소스로의 방향은 또한 생물학적 용어로 평가되어야 한다. 등의 노출은 젊은 성인의 척추 및 갈비뼈 및 골반의 등 측면에서 큰 퍼센트의 활성 골수로 인해 골수 손상을 극대화시킨다. 반대로, 복부 노출은 대량의 활성 골수의 복부 차폐로 인해 골수 손상을 최소화시킨다. 불균일한 노출은 골수의 부분 신체 차폐만큼 효과적인 것으로 검토되지 않아야 한다. 이것은 방사선 조사량과 HSC/HPC 생존 사이의 지수 관계 때문에 HSC 생존을 증가시키지 않는 전신 조사량을 50%로 반감하지만, 단지 10%까지 감소시키는 것이 중요하다.

B. 방사선 조사량

인간이 아닌 영장류("NHP")에서 급성, 방사선에 의해 유발된 조혈 증후군에 대한 데이터 베이스는 250 킬로볼트 피크(kVp)의 X-방사선 또는 Co-60 감마 및 2 메가볼트(MV)의 X-방사선에 의한 전신 조사(TBI)를 포함하는 실험으로부터 유도되었다. Co-60 감마 방사선에 의해 유발된 치사율에 대한 데이터 베이스는 1967에 수행된 단일의 공개되지 않은 실험(n=90 NHP)이다. Dalrymple 등(방사선 Res. 25:377-400, 1965)은 2 MV X-방사선을 사용하여 TBI 및 조혈 증후군 치사율에 대한 조사량-응답 관계를 확립하였다. 이들 2 연구는 지원 치료를 받지 못한 감마 방사선 또는 고에너지 X-선(2 MV) 에 노출된 NHP에서 방사선에 의해 유발된 조혈 증후군 치사율의 조사량-응답 관계를 수립하기 위한 기초로서 사용된다. 이러한 데이터 베이스는 그로부터 방사선의 단일 조사량 및 연관된 치사율이 어느 정도의 확실성으로 선택될 수 있는지의 대조 집단으로서 사용되어 왔다. 이러한 초기 연구로부터 획득된 NHP에 대한 LD50/30 값은 각각 6.40 Gy [6.06, 7.75] 및 6.65 Gy [6.00, 10.17](괄호 [ ] 안의 95% 신뢰도 구간(CI))였다. 비교를 위해, 250 kVp X-선으로 TBI에 노출된 NHP에 대한 각각의 LD50/30 값은 2 MV X-선이 Dalrymple 실험에 사용된 저 에너지 X-선에 의한 상대적인 생물학적 효과를 나타내는 대략적으로 4.80 Gy이다.

인간에서 전신 또는 현저한 부분-신체 조사의 효과에 관한 데이터는 필연적으로 히로시마 폭발과 체르노빌 사고와 같은 과거의 핵 사건에서 획득되었다. 그러한 데이터는 테네시주 Oak Ridge 소재 방사선 긴급 지원 센터/트레이닝 사이트(REAC/TS)에서 레지스트리에 유지된다. 이러한 데이터에 기초하여, 절대 림프구 카운트(ALC)는 침투하는 방사선에 대한 노출 후에 곧 강하되기 때문에, 48시간에 걸쳐 림프구 카운트의 감소 속도를 결정함으로써 개개인에서 방사선 조사량을 추정하기 위한 방법이 개발되어 왔다(Goans R.E., et al. Health Phys. 81:446-449, 2001). 그러한 추정치는 4- 내지 6-시간 간격으로 위치하는 2개 이상의 ALC 결정을 요구한다. 그러한 측정이 대량 사상자 상황에서와 같이 실제적이지 않은 경우, 방사선 조사량의 또 다른 추정치는 대상자가 구토하기 전에 방사선에 노출된 후의 시간의 길이에 기초한다. Berger, M. E. 등(Occupational Medicine 56:162-172, 2006)은 적어도 2 Gy의 급성 전신 조사에 노출된 대부분의 개개인들(70~90%)이 노출 후 1 내지 2시간 내에 구토할 것인 반면, 적어도 4 Gy의 방사선에 노출된 개개인 100%는 반드시 1시간 이내에 구토할 것이다. 적어도 6 Gy의 방사선에 노출된 자들은 30분 내에 구토할 것임을 보여주는 표를 제공한다. 급성, 전신 방사선 노출과 연관된 다른 물리적 증상(체온, 두통, 설사 등)의 중증도 및 착수 시점은 또한 Berger 등,(supra)에 표화되었다.

C. 지원 치료

항생제, 유체, 혈액 제품, 진통제 및 영양제의 사용은 방사선의 골수 억제량 및 치사량에 노출된 환자에 대한 "치료의 표준"이다. 항생제, 전체 혈액 또는 혈소판 수혈, 유체 및 영양과 같은 지원 치료는 방사선 조사된 환자들의 생존율을 현저히 증가시킬 수 있다. 방사선의 치사량에 노출된 동물에서 지원 치료와 조혈 증후군 생존 사이의 관계는 개들에서 나타났지만, 인간이 아닌 영장류(NHPs)에서는 나타나지 않았다. Byron 등에 의한 단일 연구는 100% 치사량에 노출된 붉은 털 원숭이에서 생존율을 72%까지 현저히 증가시키는 항생제 처방 단독의 능력을 나타냈다. 추가로, 공군 방사선 생물학 연구소(AFRRI)의 MacVittie/Farese 실험실 및 볼티모어의 매릴랜드 대학(UMB)은 아래 나타낸 데이터 베이스로부터 추정된 TBI(LD70/30)의 단일 치사량에서 지원 치료의 효과를 확립하였다. 이들 데이터는 LD70/30에 등가인 조사량으로(즉, 지원 치료의 부재 하에 30일 내에 대상자들의 70%의 사망을 초래하는 조사량) Co-60 감마 방사선으로부터 TBI로 NHP를 조사하는 것이 치원 치료가 투여될 때 30일에 걸쳐 대상자의 대략적으로 14%(즉, LD 14/30)에 이르는 사망자들의 수를 감소시키는 것을 보여준다. 유사한 연구들이 250 kVp X-선에 의해 TBI에 노출된 붉은 털 원숭이에 의해 수행되었다(MacVittie/Farese UMB lab). 6.00 Gy TBI와 연관되어 추정된 70% 치사율은 지원 치료 단독의 부가에 의해 9%까지 감소되었다.

상기한 바와 같이, 지원 치료를 수용하지 않은 NHP에서 방사선에 의해 유발된 조혈 증후군 치사율의 조사량-응답 연구에서 획득된 결과는 지원 치료를 수용한 NHP에서 치사량 응답 관계를 결정하기 위해 최근에 블라인드 시험된 방사선 조사량-무작위 연구를 고안하도록 사용되었다(예 1). LD50/60에 대한 결과 값은 지원되지 않은 병력적인 대조 집단의 대략적인 6.50 Gy LD50/60에 대해 상대적으로 7.52 Gy였다. 이는 지원 치료의 생존-증진 효과를 확인할 뿐만 아니라 달리는 조혈 증후군의 의료 관리로서 공지된 지원 치료에 투여된 방사선의 치사량에 노출된 NHP에 대해 각각의 LD30/60, LD50/60 및 LD70/60를 결정하는 조사량 관계를 제공하도록 작용하였다.

이러한 생존-증진 효과는 2가지 상태에 의존한다. 첫째, 생존하는 HSC 및 HPC는 자발적으로 재생될 수 있어야 하고, 둘째, 조혈 회복은 한계적인 임상적으로 관리 가능한 시간 내에 기능성 호중성 백혈구 및/또는 혈소판의 생산을 초래할 수 있다.

D. ARS의 치료에 있어서 조혈 성장 인자의 역할

조혈 성장 인자(HGFs)가 이들의 최적의 스케줄로 지원 치료와 병행하여 투여되었을 때 지원 치료 단독에 대해 주지된 것을 넘어 호중성 백혈구 및 혈소판의 생존 및 회복을 현저히 증진시키는 것을 보여주는 골수 억제량 및/또는 치사량의 방사선 노출된 크고 작은 동물 모델에서 실질적이고 일관된 데이터 베이스가 존재한다. MacVittie 실험실은 지원 치료 단독의 유용성을 이전에 확립하였을 뿐만 아니라, 완전한 조혈 증후군을 유도하는 레벨로 Co-60 TBI에 노출된 개들에서 G-CSF의 투여와 함께 확립하였다. 어떠한 지원 치료도 없는 LD50/30은 2.60 Gy이었고, 이는 지원 치료에 의해 3.38 Gy로 증가되고, 추가로 그의 최적 투여 스케줄 하에 G-CSF의 첨가에 의해 4.88 Gy로 증가된다. 이 연구는 적절한 조사량-속도로 균일한 TBI를 포함하는 조사의 표준 실험실 모델을 사용하였다.

HGFs의 투여를 위한 통상적인 스케줄은 조사 후 24시간 내에 치료를 조기에 시작하고, 조혈 전구 세포의 재생 및 호중성 백혈구 및/또는 혈소판의 생산을 보장하기 위해 매일 투여를 계속하는 것이다. 그러나, 핵 폭발 또는 사고에 이은 치료에 관하여 더욱 현실적인 스케줄은 조사 후 48-72시간 동안 지연된 투여이다. 많은 임상전 연구들이 HGF의 지연된 투여의 효과를 평가하도록 수행되었다. 이들 연구의 대부분은 조혈 반응의 크기가 HGF 투여와 조사 사이의 증가된 시간 만큼 현저히 완화되었음을 보여준다. G-CSF 및 페길화 G-CSF와 함께, ARS의 치료에 때때로 사용된 다른 HGFs는 과립구 매크로파지 콜리니 자극 인자(GM-CSF), 줄기 세포 인자(SCF), FLT3-리간드(FL), 인터류킨-3(IL-3), 거핵 세포 성장 및 발달 인자(MGDF), 트롬보포이에틴(TPO), TPO-수용체 작용질, 및 에리스로포이에틴(EPO)을 포함한다(Drouet, M. et al., Haematologica 93(3)465-466, 2008; Herodin F. et al, Experimental Hematology 35:1172-1181, 2007). 이들 중에서, 단일 시약으로서, G-CSF 및 GM-CSF 만이 "오프 라벨(off-label)"로 사용된 경우 잠재적으로 치사량으로-조사되는 개개인들을 치료하기 위해 현재 이용되고 있다. 이들 HGFs는 "동물 규칙"(AR)하에 승인하기 위해 FDA에 제안된 최초의 것일 수 있다. HGF "칵테일"의 고려는 각각의 독성 및 노출 후 투여 시간의 분석을 포함해야 한다.

E. 동물 모델 시스템에서 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 치료에서 멀티 페길화 G-CSF 변종

붉은 털 원숭이에서 방사선에 의해 유발된 혈구 감소증은 혈소판감소증 및 호중성 백혈구 감소증을 치료하는데 있어서 제약품의 효능을 연구하기 위한 효과적인 모델 시스템인 것으로 입증되었다. 예 2에 기재된 연구에서, 본 발명에 따른 전형적인 멀티 페길화 G-CSF 변종(본원에서 "Maxy-G21"로 식별됨)의 단일 주사는 말초 혈액에서 전체 핵화된 세포, 호중성 백혈구, 단핵 세포 및 말초 혈액 내로 콜로니 형성 세포의 현저한 이동성의 현저한 증가를 유도하였다. 14.8 ~ 15.2일의 호중성 백혈구 감소증의 기간을 나타내는 6.0 Gy TBI에 노출된 대조군 동물에 비교하여, 동물들은 7.3±1.1일의 현저히 단축된 호중성 백혈구 감소증의 기간을 나타내는 TBI 후 24시간에 300 ㎍/kg의 조사량으로 Maxy-G21을 투여받았다. 호중성 백혈구 감소증의 기간은 동물이 500/㎕ 미만의 관찰된 또는 귀속된 ANC를 갖는 날 수로서 결정되었다. 시험 화합물의 첫 투사 후 최소 2일에 발생한 최초의 최저 관찰 또는 귀속된 ANC로서 정의된 ANC 최하점은 또한 대조군 동물에서 49±22/㎕로부터 140 ±45/㎕로 현저히 개선되었다. 500/㎕ 이상의 관찰 또는 귀속된 ANC와 함께 처음 2 연속일까지 연구일 1일부터 일수로서 결정된 횟수까지의 시간은 마찬가지로 Maxy-G21 치료된 집단에서 21.2±0.4일의 대조값으로부터 15.5±0.3일로 개선되었다.

내부-연구 Neulasta® 그룹 및 병력적 집단(n=9)을 포함하는 조합된 Neulasta® 집단에 비교함에 따라, Maxy-G21은 호중성 백혈구 감소증의 기간(p=0.02) 뿐만 아니라 회복까지의 시간을 현저히 단축시켰다. 항생제 요건은 또한, Maxy-G21 치료 집단은 단지 9.8일 동안 항생제를 필요로 하고, 조합된 Neulasta® 치료 집단은 14.7일의 항생제 지원을 필요로 하는 것과 같이 Neulasta® 그룹과 현저히 다르다.

예 2에 기재된 연구는 본 발명에 따른 전형적인 멀티 페길화 G-CSF 변종(본원에서 Maxy-G21로 식별됨)은 조사된 NHP에서 호중성 백혈구 감소증의 기간을 현저히 단축시키기 위해 붉은 털 원숭이에게 피하로 투여되는 것을 보였다. 이 영향은 또한 내부-연구 Neulasta® 집단 및 병력적 Neulasta® 집단(N=9)을 포함하는 집단에 비교하였을 때 Neulasta®의 그것을 초과하는 것으로 밝혀졌다. 약물동력학적 데이터는 멀티 페길화 G-CSF 변종이 조사된 원숭이에서 Neulasta®에 비해 현저히 연장된 혈장 반감기를 나타낸다는 증거를 제공한다(도 4). 따라서 PK 데이터는 멀티 페길화 G-CSF 변종이 심각한 방사선에 의해 유발된 골수 억제 상태를 겪은 NHP 뿐만 아니라 건강한(비-조사된) NHP에서 모두 모노 페길화 hG-CSF, Neulasta®보다 더 큰 생체 적합성을 갖는다는 작업 가설을 지원한다.

전체적인, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 인간이 아닌 영장류에서 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 기간을 현저히 단축시키는 것으로 밝혀졌다. 호중성 백혈구 감소증 기간의 감소는 추가로 병력적 Neulasta® 집단에 비해 Neulasta®의 그것을 초과하는 것으로 밝혀졌다. 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 정도 및 기간은 본 발명의 방법에 따라 멀티 페길화 G-CSF 변종을 투여하여 현저히 감소되었다.

예 3에 기재된 연구에서, 생쥐는 미처리된 대조군 동물(7.76 Gy; LD20/30)의 20% 또는 미처리된 대조군 동물(7.96 Gy; LD45/30)의 45%를 사멸시키기에 충분한 방사선 조사량에 노출되었다. TBI 후 1일째에, 동물은 본 발명에 따른 전형적인 멀티 페길화 G-CSF 변종(본원에서 "Maxy-G34"로 식별됨)을 20 ㎍/생쥐 20g의 투약량으로, 또는 희석제를 투여받았다. 그 투약량은 7일째에, 어떤 동물에서는 14일째에 반복되었다. LD20/30 수준 및 LD45/30 수준에서 조사 후 멀티 페길화 G-CSF 변종을 투여받은 생쥐는 미처리된 동물에 비교하여 30일 후 현저히 큰 생존 백분율을 나타냈다(각각 도 5 및 6).

예 2와 3에 제공된 연구는 본 발명에 따라 멀티 페길화 G-CSF 변종이 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 정도 및 기간을 감소시키고, 2가지 동물 모델 시스템에서 생존율을 연장시키는데 효과적임을 나타낸다. 따라서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 핵 비상 사태의 경우의 ARS에서와 같이 생명을 위협하는 방사선 노출과 연관된 호중성 백혈구 감소증의 치료에 효과적일 수 있다.

멀티 페길화 G- CSF 변종의 투여

A. 투약량

본 발명에 따라 투여된 멀티 페길화 G-CSF 변종의 투약량은 일반적으로 화학요법적 용도에서 모노 페길화 hG-CSF(Neulasta®)에 대해 현재 승인된 투약량과 유사한 크기의 순서일 것이고, 이는 성인 인간 환자(예, 60 kg 환자에 대해 100 ㎍/kg) 당 6mg이다. 따라서, 멀티 페길화 G-CSF 변종의 적합한 투약량은 약 1 mg 내지 약 30 mg의 범위, 예를 들면 약 2 mg 내지 약 20 mg, 예, 약 3 mg 내지 약 15 mg의 범위로 예상된다. 따라서, 적합한 조사량은 예를 들면, 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 6 mg, 약 9 mg, 약 12 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 또는 약 30 mg일 수 있다. 대안으로 투약량은 환자의 체중에 기초할 수 있고, 예를 들면 멀티 페길화 G-CSF 변종의 적절한 조사량은 약 20 ㎍/kg 내지 약 500 ㎍/kg, 예를 들면 약 30 ㎍/kg 내지 약 400 ㎍/kg, 예를 들면 약 40 ㎍/kg 내지 약 300 ㎍/kg, 예, 약 50 ㎍/kg 내지 약 200 ㎍/kg의 범위에 있는 것으로 예상된다. 따라서, 적합한 조사량은 예를 들면, 약 20 ㎍/kg, 약 30 ㎍/kg, 약 40 ㎍/kg, 약 50 ㎍/kg, 약 60 ㎍/kg, 약 75 ㎍/kg, 약 100 ㎍/kg, 약 125 ㎍/kg, 약 150 ㎍/kg, 약 175 ㎍/kg, 약 200 ㎍/kg, 약 250 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 400 ㎍/kg, 또는 약 500 ㎍/kg일 수 있다. 멀티 페길화 G-CSF 변종은 바람직하게는 방사선 노출 후 가능한 한 즉시, 예, 방사선 노출 후 7일 이내, 4일 이내, 3일 이내, 2일 이내(즉, 48시간 이내)에 투여되고, 또는 더욱 바람직하게는 방사선 노출 후 1일 이내(즉, 24시간 이내) 투여된다. 질병의 특성 환자의 예후 및 반응에 따라, 멀티 페길화 G-CSF 변종의 제 2 및 가능하게는 제 3 투여는 선행 투여 후 1 내지 4주(예, 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 18일, 약 21일, 약 24일, 약 28일) 사이에 제공될 것이다.

멀티 페길화 G-CSF 변종의 정확한 투약량 및 투여 빈도는 많은 인자, 예를 들면 멀티 페길화 G-CSF 변종의 특이적 활성 및 약물동력학적 특성뿐만 아니라, 당 분야의 숙련자들에게 공지된 다른 인자들 중에서 치료 중인 상태의 특성 및 심각도(예를 들면, 방사선 노출의 수준 및/또는 기간, 노출된 신체의 면적 및 양, 방사선의 타입, ARS-연관된 증상의 심각도)에 의존할 것이다. 통상적으로, 조사량은 환자의 호중성 백혈구 감소증의 정도 및/또는 기간을 예방 또는 약화시킬 수 있어야 한다. 그러한 조사량은 "효과적인" 또는 "치료학적으로 효과적인" 양이라는 용어일 수 있다. 본 발명의 멀티 페길화 G-CSF 변종의 효과적인 양은 무엇보다도, 치료 중인 증상의 심각도, 조사량, 투여 스케줄, 멀티 페길화 G-CSF 변종이 단독으로 투여되든지 또는 다른 치료학적 시약과 병용하여 투여되든지 무관하게, 멀티 페길화 G-CSF 변종의 혈청 반감기 및 다른 약물동력학적 특성, 뿐만 아니라 환자의 체격, 연령 및 일반적 건강에 의존한다는 것이 당 분야의 숙련자들에게 명백할 것이다. 투약량 및 투여 빈도는 공지된 기술을 사용하는 당 분야의 숙련자에 의해 확인될 수 있다.

B. 제약 조성물

본 발명에 따라 투여된 멀티 페길화 G-CSF 변종은 1개 이상의 제약학적으로 허용되는 담체(carrier) 또는 부형제(excipient)를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 멀티 페길화 G-CSF 변종은 충분히 저장-안정성인 제약품을 초래하는 당업계에 공지된 방식 자체로 제약 조성물 내로 제제화될 수 있고, 인간 또는 동물에 투여하기 적합하다. 제약 조성물은 액체 또는 겔, 또는 동결 건조된, 또는 임의의 다른 적합한 형태를 포함하는 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 바람직한 형태는 치료 중인 특정 증상에 의존할 것이고, 당 분야의 숙련자에게 명백할 것이다.

"제약학적으로 허용되는"이라는 것은, 담체 또는 부형제가 사용된 투약량 및 농도에서 그것이 투여된 환자들에게서 어떠한 부작용도 유발하지 않음을 의미한다. 그러한 제약학적으로 허용되는 담체 및 부형제는 당 분야에 잘 공지되어 있다(예, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company(1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis(2000); and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press(2000) 참조).

C. 비경구 조성물

제약 조성물의 예는 비경구적 투여를 위해, 예를 들면 피하 경로에 의해 고안된 용액이다. 많은 경우에 제약적 용액 제형은 즉시 사용하기 적절한 액체 형태로 제공되지만, 그러한 비경구적 제형은 동결된 또는 동결 건조된 형태로 제공될 수도 있다. 전자의 경우에, 이 조성물은 사용 전에 해동되어야 한다. 후자의 형태는 종종 더욱 다양한 저장 조건 하에 조성물에 함유된 활성 화합물의 안정성을 증진시키기 위해 사용되고, 동결 건조된 제제들이 일반적으로 이들의 액체 상응물보다 더 안정하다는 것은 당 분야의 숙련자들에 의해 인식되는 바와 같다. 그러한 동결 건조된 제제는 주사용 멸균수 또는 멸균 생리적 염수 용액과 같은 1개 이상의 적합한 제약학적으로 허용되는 희석제를 첨가함으로써 사용 전에 재구성된다.

비경구적 제형의 경우에, 이들은 적절한 경우 목적하는 순도를 갖는 폴리펩티드를 당 분야에 통상적으로 사용되는 1개 이상의 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제(이들 모두는 "부형제"라 칭함), 예를 들면 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비-이온성 세제, 항산화제 및/또는 기타 잡다한 첨가제들과 혼합함으로써 동결 건조된 제형 또는 수용액으로서 저장하도록 제조된다.

완충제는 생리적 상태에 근사하는 범위로 pH를 유지하는데 도움을 준다. 이것들은 통상적으로 약 2 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에 사용하기 적합한 완충제는 유기산 및 무기산 모두 및 이들의 염, 예를 들면 시트레이트 완충제(예, 모노소듐 시트레이트-디소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노소듐 시트레이트 혼합물, 등), 숙시네이트 완충제(예, 숙신산-모노소듐 숙시네이트 혼합물, 숙신산-수산화 나트륨 혼합물, 숙신산-디소듐 숙시네이트 혼합물, 등), 타르트레이트 완충제(예, 타르타르산-소듐 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-칼륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-수산화 나트륨 혼합물, 등), 푸마레이트 완충제(예, 푸마르산-모노소듐 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디소듐 푸마레이트 혼합물, 모노소듐 푸마레이트-디소듐 푸마레이트 혼합물, 등), 글루코네이트 완충제(예, 글루콘산-소듐 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-수산화 나트륨 혼합물, 글루콘산-칼륨 글리코네이트 혼합물, 등), 옥살레이트 완충제(예, 옥살산-소듐 옥살레이트 혼합물, 옥살산-수산화 나트륨 혼합물, 옥살산- 칼륨 옥살레이트 혼합물, 등), 락테이트 완충제(예, 락트산-소듐 락테이트 혼합물, 락트산-수산화 나트륨 혼합물, 락트산-칼륨 락테이트 혼합물, 등) 및 아세테이트 완충제(예, 아세트산-소듐 아세테이트 혼합물, 아세트산-수산화 나트륨 혼합물, 등)을 포함한다. 추가 가능 물질은 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염, 예를 들면 Tris이다.

보존제는 미생물의 성장을 저지하기 위해 첨가되고, 통상적으로 약 0.2% ~ 1%(w/v)의 양으로 첨가된다. 본 발명에 사용하기 적합한 보존제는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드(예, 벤잘코늄 클로라이드, 브로마이드 또는 요오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 리조르시놀, 시클로헥사놀 및 3-펜탄올을 포함한다.

등장화제는 액체 조성물의 등장성을 보장하기 위해 첨가되고, 그 예는 다가 당 알콜, 바람직하게는 3가 또는 고급 당 알콜, 예를 들면 글리세린, 에리쓰리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 다가 알콜은 다른 성분의 상대적인 양을 고려하여 0.1 중량% 내지 25 중량%, 통상적으로 1 중량% 내지 5 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

안정제(stabilizer)는 벌크제(bulking agent)로부터 치료제를 안정화시키거나 또는 변성 또는 용기 벽으로의 접착을 방지하는데 조력하는 첨가제에 이르는 기능 범위에 있을 수 있는 광범위한 범주의 부형제를 의미한다. 전형적인 안정제는, 다가 당 알콜(상기 열거됨); 아미노산, 예를 들면 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 등, 유기 당 또는 당 알콜, 예를 들면 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등,(이노시톨과 같은 시클리톨을 포함함); 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황-함유 환원제, 예를 들면 우레아, 글루타치온, 티옥트산(thioctic acid), 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 소듐 티오설페이트; 저분자량 폴리펩티드(즉 <10 잔기); 단백질, 예를 들면 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈; 단당류, 예를 들면 크실로스, 만노스, 프럭토스 및 글루코스; 이당류, 예를 들면 락토스, 말토스 및 수크로스; 삼당류, 예를 들면 리파노스, 및 다당류, 예를 들면 덱스트란일 수 있다. 안정제는 통상적으로 활성 단백질 중량에 기초하여 0.1 내지 10,000 중량부 범위로 존재한다.

비-이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로서 공지되기도 함)는 치료제를 용해시키는데 조력할 뿐만 아니라 치료용 폴리펩티드를 진탕-유도된 집성에 반하여 보호하기 위해 존재할 수 있고, 이는 또한 폴리펩티드의 변성을 유발하지 않고 제형이 전단 표면 스트레스에 노출되도록 허용한다. 적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), Pluronic® 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(Tween®-20, Tween®-80, 등)를 포함한다.

추가 잡다한 부형제는, 벌크제 또는 충전제(예 전분), 킬레이트제(예 EDTA), 항산화제(예, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E) 및 공용매(cosolvents)를 포함한다.

활성 성분은, 또한 예를 들면, 코아서베이션(coascervation) 기술 또는 계면 중합 반응에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면 히드록시메틸셀룰로스, 젤라틴 또는 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀전, 나노-입자 및 나노캡슐) 내에 또는 매크로에멀전 내에 포집될 수 있다. 그러한 기술은 상기 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기재되어 있다.

생체내 투여를 위해 사용되어야 할 비경구적 제형은 멸균되어야 한다. 이는 예를 들면, 멸균 여과 막을 통해 여과함으로써 용이하게 수행된다.

본 발명은 다음 비제한적인 예로 추가 기재된다.

예

예 1

방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 인간 아닌 영장류 모델에서 치명적인 방사선 조사량 응답 및 지원 치료의 효과

다음은 전신 이온화 방사선(TBI)의 증가하는 조사량에 노출되고 지원 치료("의료 관리"라 칭하기도 함)를 수용한 붉은 털 원숭이에서 조사량 응답을 정의하도록 고안된 시험적 연구를 기재한다. 이 연구는 다음을 평가하도록 고안되었다:

1. LINAC-유도된 6 MV(평균 에너지, 2MV) 광자와 함께 치사량의 TBI에 노출되고 의료 관리를 받은 붉은 털 원숭이에 대한 LD50/30 및 지원하는 방사선-조사량 생존 곡선, 및

2. 병력적 데이터 세트에 비교하여 TBI 단독에 대한 각각의 LD50/30 및 조사량 응답 관계에 대한 의료 관리의 효과

재료와 방법

마흔 여덟(48) 마리의 수컷 붉은 털 원숭이가 6 메가볼트(MV)의 LINAC 광자 소스(Varian 모델 #EX-21)(평균 2 MV 광자)를 사용하여 80±2.5 cGy/분의 조사량 속도로 양측성의 균일한 전신 조사(TBI)에 노출되었다. 방사선 조사량당 2~8의 그룹 내의 동물들이 TBI의 6개의 무작위화된 조사량: 7.20 Gy, 7.55 Gy, 7.85 Gy, 8.05 Gy, 8.40 Gy, 및 8.90 Gy에서 방사선 조사받았다. 항생제, 유체, 수혈, 영양 지원, 설사억제제, 궤양억제제, 해열제 및 통증 관리로 이루어진 의료 관리가 제공되었다. 방사선 조사된 동물들이 TBI 후 60일 동안 관찰되었다.

주요한 임상적으로 관련된 파라미터는 60일 사망률이었다. 제 2 종말점은 각각의 호중성 백혈구 및 혈소판 최하점, 호중성 백혈구 감소증(ANC < 500/㎕) 혈소판감소증(PLT < 20,000/㎕)의 기간, 및 ANC > 1,000/㎕ 및 PLT > 20,000/㎕의 회복까지 이르는 시간을 포함하는 중요한 호중성 백혈구- 및 혈소판(PLT)-관련된 파라미터였다. ANC <100/㎕의 기간의 일 수 역시 기록되었다. 다른 파라미터는 열이 난 일 수(Temp > 103℉), 문서 상의 감염증의 발병률, 열성 호중성 백혈구 감소증 및 사망자들의 평균 생존 시간(MST)을 포함하였다.

데이터는 60일 동안 각각 8마리 동물의 6개의 조사량 그룹에서 7.20, 7.55, 7.85, 8.05, 8.40 및 8.90 Gy로 TBI에 노출된 48 수컷 붉은 털 원숭이에 대해 수집되었다. 사망률이 각각의 조사량 그룹에 대해 산출되었다.

설명적 분석 및 로지스틱 회귀분석은 AS 버전 9를 사용하여 수행되었고 LD 견적은 SPLUS 버전 6.2를 사용하여 수행되었다. 로지스틱 회귀분석은 주요 효과에 대해 0.05 및 한계 효과에 대해 0.10의 알파 수준을 갖는 2-측면으로 수행되었다. 빈도 및 백분율이 카운트 데이터로 제공되고; 평균, 표준 편차, 중앙값, 최소값 및 최대값이 연속 데이터로 제공된다. 결과로서 60-일 사망률에 의한 로지스틱 회귀분석은 조사량의 효과를 시험하였고, 조사량의 자연 로그를 사용하여 계산이 수행되었다.

결과

A. 방사선 조사량 및 치사율

마흔 여덟(48) 마리의 수컷 붉은 털 원숭이가 7개의 집단(집단 1, n=2; 집단 2, n=6; 집단 3 내지 7, n=8)에서 7.20 Gy 내지 8.90 Gy의 조사량 범위에 걸쳐 방사선 조사받고, 의료 관리를 받았다. 전체 48 마리 동물 중 서른 두(32) 마리(66.6%)가 조혈 증후군으로 쓰러졌다. 조사량 응답 관계는 도 1 및 표 1에 나타낸다. 방사선 조사량은 더 큰 조사량에서 증가된 사망률을 갖는 사망률의 유효 예측 계수(P = 0.01)였다.

붉은 털 원숭이에서 방사선 노출 후 생존율 및 평균 생존 시간

방사선 노출(Gy)	7.20	7.55	7.85	8.05	8.40	8.90
치사율 %	38%	50%	75%	63%	75%	100%
사망자/전체	3/8	4/8	6/8	5/8	6/8	8/8
사망자들의 생존 시간(일)
평균	20.0	18.3	22.2	16.2	17.5	21.1
중앙값	15.0	18.5	16.5	14.0	17.5	18.0

이 연구에서 TBI에 노출된 붉은 털 원숭이에 대해 추정된 LD30/60, LD50/60, 및 LD70/60 값(괄호 안에 95% CI를 갖음)은 각각 7.09 Gy [6.50,7.73], 7.52 Gy [7.12, 7.93], 및 7.97 Gy [7.60,8.36]였다. 더욱이, LD95/60(9.05 Gy) [8.45, 12.93] 및 LD90/60(8.68 Gy) [8.22, 11.27]에 상대적인 LD5/60(6.24 Gy) [3.56, 6.91] 및 LD10/60(6.51 Gy) [4.09, 7.09]의 견적은 "소수" 및 "다수" 동물에 대한 치사량 사이의 각각의 비율을 결정하였다. LD5:LD95는 1.45 [1.24, 3.57]이고 LD10:LD90은 1.33 [1.18, 2.70]이었다. "소수" 및 "다수" 치명적 사건 사이의 각각의 Gy의 차이는 대략적으로 2.81 내지 2.17이다.

B. LD50에 대한 의료 관리의 효과.

도 1에 나타낸 바와 같이, 유사한 질의 TBI에 노출된 붉은 털 원숭이에 이용할 수 있는 2개의 병력적 연구로부터 LD50/30은 지원 치료(의료 관리)의 부재 하에 6.40 Gy(Co-60 γ-방사선, LD50_Co60) 및 6.65 Gy(2 MV X-방사선, LD50_Xray)로 추정되었다. 2 MV 평균 LINAC 광자를 갖는 TBI 플러스 의료 관리를 사용하는 현행 연구로부터 추정되는 LD50/60에 대한 값은 7.52 Gy이다. 이러한 소급적인 비교는 의료 관리가 치명적인 조혈 증후군 방사선 투약량 범위에 걸쳐 LD50 값 및 생존율을 증진시킬 것임을 지시한다(도 1 및 표 2).

각각의 방사선 조사량에서 사망자들의 평균 생존 시간(MST)은 16.2일 내지 22.2일 범위이다(표 1). 이 연구를 위한 전체적인 조사량에 걸쳐 전체적인 평균 MST는 19.4일이었다. 의료 관리를 수용하지 않은 동물에 대한 치사율 조사량-응답 연구는 수행되지 않았기 때문에, MST는 붉은 털 원숭이를 사용한 모든 공개된 조사량 응답 연구에 대해 산출되었다. 이 연구는 모든 공지된 연구에 걸쳐 14.0일의 평균 MST를 산출하였다(표 2).

전신 조사 및 60일 사망률: 의료 관리를 받은 모든 동물에 대해 추정된 LD30/60, LD50/60, 및 LD70/60 및 사망자들의 MST

조혈 증후군에 대한 치사량
시험적 연구 추정 조사량(Gy[95% CI])	문헌 값*(Gy[95% CI])
LD30/60 = 7.09 [6.50, 7.73]	LD50/30 = 6.40 [6.06, 6.75] Co-60
LD50/60 = 7.52 [7.12, 7.93]	LD50/30 = 6.65 [5.00, 10.17] 2MV x-선
LD70/60 = 7.97 [7.60, 8.36]
평균 생존 시간(일)
TBI, LINAC + 의료 관리 = 19.4일
TBI, Co-60, 의료 관리 없이 ＠MV x-선 = 14.0일

* 하나의 완전한 조사량 응답 연구(2 MV x-선)는 문헌(Dalrymple, et al. 1965)에서 입수할 수 있고; 나머지 연구(Co-60)는 Dr. MacVittie에게 개인적인 통신으로서 제공되었다. 어떠한 의료 관리도 본 연구에서 제공되지 않았다.

** 14.0일의 평균 MST는 의료 관리 없이 조혈 증후군인 붉은 털 원숭이에 대한 치사율 조사량 응답을 결정하는 모든 유효 문헌으로부터 산출되었다.

의료 관리를 수용한 사망자들은 의료 관리를 수용하지 않은 동물에 비해 대략적으로 5.4일의 MST의 평균 증가를 보였다. 이러한 관찰은 잠재적인 완화제, 예를 들면 본 발명의 멀티 페길화 G-CSF 변종(예를 들면, Maxy-G34)을 효과적인 의료 관리를 수용한 치명적으로 방사선 조사받은 동물에게 투여하는 맥락에서 고려하였을 때 현저하다. 이 경우에, 후보 완화제는 성숙한 세포, 예를 들면 호중성 백혈구의 골수 재생 및 생산을 증진시키기 위해 추가 5일의 이점을 가질 수 있다.

C. 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 기간.

호중성 백혈구는 기회 감염에 대한 최초의 방어선을 제공한다. 이 연구에 투여된 TBI의 치사량은 방사선 조사량과 무관하게 TBI 후 대략적으로 5일 내에 순환하는 절대 호중성 백혈구 수치(ANC)를 500/㎕로 감소시켰다(표 3).

혈구감소증의 기간: 호중성 백혈구-관련된 파라미터

TBI	ANC 최초일(d)		기간(d)		ANC로 회복	항생제 투여일	최하점 (ANC/㎕)
조사량 (Gy)	< 500/㎕	< 100/㎕	< 500/㎕	< 100/㎕	≥ 1000/㎕
7.20	4.6±0.3	7.3±0.3	11.5	11.5	23.74	19	0
7.55	5.5±0.6	7.1±0.4	24.0	9.8	26.7	28	0
7.85	4.6±0.3	6.5±0.4	14.3	10.3	21.7	18	5
8.05	5.0±0.0	6.5±0.3	15.0	10.3	22.3	11	0
8.40	5.0	6.4	19.0	15.0	42.0	19	0
8.90	4.6	6.0	...	...	...	...	0

* 기간(d)은 사망 전에 그 수준, 예, ANC > 100/㎕ 또는 > 500/㎕까지 회복이 발생하지 않는 한 사망한 동물로부터의 데이터를 포함하지 않는다.

항생제는 ANC가 < 100/㎕인 값까지 계속 감소할지도 모른다고 예상되었기 때문에 ANC < 500/㎕일 경우에 투여되었다. 심각한 등급 4 호중성 백혈구 감소증(ANC < 100/㎕)에서, 그 동물은 감염 및 부패에 대한 큰 위험에 있다. 또한, 이들 값은 기본 항생제 예방 치료제 투여의 유효성을 결정한다. 모든 치명적으로 방사선 조사된 동물에서 ANC는 다음 1.5 내지 3.0일 내에 < 100/㎕로 감소하였고, 하나(7.85Gy)를 제외한 모든 조사량 집단에서 절대 호중성 백혈구 감소증(ANC ~ 0/㎕)까지 계속하여 감소하였다. 7.85Gy 집단에 대한 평균 최하점은 5/㎕였다(표 3). 조사량 집단에 걸쳐 생존자들에 대한 등급 4 호중성 백혈구 감소증(ANC < 100/㎕)의 기간은 9.8 내지 15.0일 범위이고, 여기서 ANC < 500/㎕의 기간에 대한 모든 조사량 집단에 걸친 범위는 11.5 내지 24.0일이었다. 추가 호중성 백혈구-관련된 파라미터는 표 3에 나타낸다. 도 2에 나타낸 것은 LD30/60, LD50/60, 및 LD70/60 수준에 근사하는 조사량의 TBI에 노출된 모든 동물에 대한 호중성 백혈구 회복 곡선이다.

결론적으로, 이 연구는 평균 2 MV LINAC 광자를 갖는 균일한 TBI의 조사량이 치사율의 유효 예측 계수임을 나타낸다. 본원에 사용된 TBI의 조사량은 ARS의 조혈 증후군과 연관된 치사율을 완화시키는 시약을 위한 효능 시험의 고안을 위한 LD30/60, LD50/60, 및 LD70/60 수준의 추정을 허용하였다. 이 연구에서, LD30/60, LD50/60, 및 LD70/60 수준은 각각 7.09, 7.52 및 7.97 Gy였다. 의료 관리의 장점 없이 붉은 털 원숭이의 치명적인 방사선 조사량 응답을 평가하도록 고안된 연구에서 결정된 이론 값에 비교한 바, 의료 관리(본원에 적용된 연구에서 투여된 바와 같음)는 ARS의 조혈 증후군과 연관된 LD50/60을 증가시켰고, 사망자들의 MST를 증가시켰다.

예 2

방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 인간 아닌 영장류 모델에서 멀티 페길화 G- CSF 변종의 약력학 및 약물동태학

연구 프로토콜:

이 연구는 실험실 동물의 치료 및 이용을 위한 지침서(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(The Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, 1996)에 명시된 원리에 따라 수행되었다. 4.6 +/- 0.7 kg의 평균 체중을 갖는 수컷 붉은 털 원숭이(Macaca mulatto)는 후방-전방 위치에서 일방적으로 0.13 Gy/분으로 250 kVp X-조사에 노출되었고 전체 6.00 Gy 노출의 완료를 위해 전방-후방 위치까지 중간-조사량(3.00 Gy)으로 108E로 회전되었다. 동물들은 필요에 따라 항생제, 갓 방사선 조사된 전혈, 및 유체로 이루어진 임상 지원을 수용하였다. 젠타마이신(Elkin Sinn, Cherry Hill NJ)은 치료한지 최초 7일 동안 근육내로(i.m.) 매일(q.d.) 10 mg/일로 투여되었다. Baytril®(Bayer Corp., Shawnee Mission, KS)은 전체 항균 치료 기간 동안 10 mg/일로 i.m. q.d.로 투여받았다. 항생제는 동물이 연속 3일 동안 WBC > 1,000/㎕를 유지하고 ANC > 500/㎕를 획득할 때까지 투여되었다. 동물은 혈소판(PLT) 카운트가 < 20,000/㎕이고 헤마토크릿(HCT)이 < 18%인 경우에 원숭이들의 랜덤 공여자 푸울로부터 대략적으로 30 ml/주입으로 갓 방사선 조사된(15.00 Gy Co⁶⁰-조사된) 전혈을 수용하였다.

9마리의 방사선 조사된 및 2마리의 비-조사된 수컷 붉은 털 원숭이를 본 발명에 따른 전형적인 멀티 페길화 G-CSF 변종(본원에서 "Maxy-G21"로 식별됨)으로 치료하고, 4마리의 방사선 조사된 붉은 털 원숭이를 Neulasta®로 치료하였다. 4마리의 동물을 대조군으로서 작용하는 희석제("비히클") 만으로 치료하였다. Neulasta® 그룹에서, 2마리의 동물이 PK 분석을 위해 샘플링된 반면, 모든 Maxy-G21-처리된 동물들이 약물동력학적 평가에 포함되었다. 각각의 동물은 전신 조사 후 24시간에 시험 화합물 또는 비히클의 단일 피하 조사량을 투여받았다.

Maxy-G21의 2개의 상이한 투약량이 사용되었다: 각각 4 및 5마리 원숭이를 사용하여 100 및 300 ㎍/kg. Neulasta® 그룹은 300 ㎍/kg를 투여받았다. 300 ㎍/kg Maxy-G21을 투여받은 2마리의 비-조사된 동물이 CD34+ 세포 및 시험관내 콜로니 형성 세포(CFC)의 동원(mobilization)을 연구하기 위해 사용되었다. 혈액 샘플들은 복재 정맥(saphenous vein)으로부터 수집되었다. 이 시험 설계의 개관이 표 4에 제공된다.

연구 프로토콜의 요약

약물	조사량(㎍/kg)	동물들의 수	경로
비히클	N/A	4	S.C.
Maxy-G21	300	5	S.C.
Maxy-G21	300	4	S.C.
Maxy-G21*	100	2	S.C.
Neulasta	300	4	S.C.

* 이들 동물은 CD34+ 세포 및 시험관내 콜로니 형성 세포(CFC)의 동원을 연구하기 위해 사용되었다

결과:

14.8-15.7일의 호중성 백혈구 감소증의 기간을 나타내는 자가 조직 혈청(AS)에 의해 투약된 6.00 Gy TBI에 노출된 대조군 동물에 비해, 300 ㎍/kg Maxy-G21로 투약된 방사선 조사된 동물은 7.3±1.1일의 단축된 호중성 백혈구 감소증의 기간을 나타냈다. ANC 최하점은 또한 대조군 동물에서 49±22/㎕만큼으로부터 140±45/㎕로 현저히 개선되었다. 마찬가지로, 회복까지의 시간은 21.2±0.4 및 23.0±0.0일의 대조값(3개의 개별 대조 집단에서)으로부터 Maxy-G21 처리된 집단에서 15.5±0.3일로 현저히 개선되었다. 등가의 조사량의 Neulasta®(300 ㎍/kg)를 사용하는 내부-연구 Neulasta® 집단(N=4) 에 비교한 바, Maxy-G21은 호중성 백혈구 감소증의 기간을 2일 만큼(9.3일에서 7.3일로), 회복까지의 시간을 3일만큼(18.5일에서 15.5일로) 및 항생제 요구 기간을 3일 만큼(11.5일에서 9.8일로; 표 5) 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

6.00 Gy x-방사선 조사된 붉은 털 원숭이에서 호중성 백혈구-관련된 파라미터에 대한 Maxy-G21 투여의 효과 대 Neulasta® 또는 대조군 자가 조직 혈청(AS)에 의한 치료: 호중성 백혈구감소 기간, 최하점, 회복까지의 시간 및 임상적 지원

치료 그룹	n	호중성 백혈구 감소증 기간(일)	ANC 최하점 (/)	회복까지 시간(일)	항생제 요구기간(일)
대조군 집단: AS FY01-02* AS FY01-03* AS 본 연구	11 7 4	14.8±0.6 15.2±0.6 15.7±0.8	49±22 80±30 109±37	21.2±0.4 22.0±0.3 23.0±0.0	16.8±0.6 15.4±0.3 16.0±0.0
Maxy-G21	4	7.3±1.1	140±45	15.5±0.3	9.8±1.5
Neulasta®집단: 본 연구 병력적 **Neulasta®	4 5 9	9.3±1.5 14.4±1.4 12.1±1.3	135±16 80±24 104±17	18.5±1.7 21.2±1.6 20.0±1.2	11.5±2.4 17.2±1.2 14.7±1.5

* 별개의 대조군 집단

** 본 연구 및 MacVittie 실험실로부터 공개된 집단을 포함하는 조합된 Neulasta® 집단

병력적 Neulasta® 집단(n=5)으로부터 데이터가 현행 내부-연구 Neulasta® 집단(n=4)과 합해졌을 때, 호중성 백혈구 감소증의 기간은 12.1±1.3일이었다. 호중성 백혈구 감소증의 기간은 조합된 Neulasta® 그룹(P = 0.02)에 비해 Maxy-G21 그룹에서 현저히 짧았다(도 3, 표 5). 대조군 및 Maxy-G21-처리된 집단은 단지 9.8일 동안 항생제를 필요로한 한편, 합해진 Neulasta®-처리된 집단은 14.7일의 항생제 지원을 필요로 하였다. 100 ㎍/kg로 투여된 Maxy-G21(데이터는 도시되지 않음)은 모든 호중성 백혈구-관련된 파라미터로 평가된 바, 본 연구의 조건 하에 호중성 백혈구 회복을 자극하는데 있어서 효과적이지 못하였다.

Maxy-G21의 피하 투여 후, 약물은 방사선 조사된 및 비-조사된 붉은 털 원숭이 모두에서 24 내지 96시간 내에 피크 혈장 농도에 도달하였다. 2개의 300 ㎍/kg 투약량 그룹에서, 피크 혈장 농도는 100 ㎍/kg 그룹에서보다 약 3배 높았다. 2상 Maxy-G21 제거 패턴은 정상 동물 및 300 ㎍/kg의 약물로 처리된 방사선 조사된 동물 모두에서 나타난다(도 4).

300 ㎍/kg Maxy-G21로 처리된 방사선 조사된 동물은 59시간의 평균 혈청 반감기를 갖는 초기의 느린 제거 페이스를 나타냈다. 초기의 느린 페이스의 기간은 12~13일이었다(도 4). 초기 프로파일은 5마리의 원숭이들(macaques) 사이에서 균일성을 특징으로 한다. 약물 주사 15일 후에, 느린 페이스는 더 빠른 페이스로 대체되었고, 이는 16시간의 평균 혈장 반감기를 보였다. 3마리 동물로부터 데이터의 분석에 기초한 후기 제거 페이스는 혈장 반감기에서 더 많은 동물내 변화를 특징으로 하였다. 100 ㎍/kg Maxy-G21로 처리된 방사선 조사된 동물에서, 약물은 49시간의 평균 혈청 반감기를 갖는 단일 페이스에서 제거되었다.

비-조사된("정상적") 동물은 빠른-초기 및 느린-후기 페이스 운동 프로파일에서 Maxy-G21(300 ㎍/kg)을 제거하였다. 후기 페이스의 평균 혈장 반감기는 공개된 연구(데이터는 도시되지 않음)에서 비-조사된 동물에서 Neulasta®에 대해 35시간 미만인 것에 비교한 바 62시간이었다. 비-조사된 동물 및 방사선 조사된 동물의 비교는 300 ㎍/kg의 Maxy-G21과 동일한 조사량에서 AUC에서 3-배의 차이를 보인다(표 6).

Neulasta®은 23시간의 평균 혈장 반감기를 갖는 단일 페이스에서 제거되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 Maxy-G21에 대해 관찰된 것보다 현저히 빠르다(도 4). Neulasta®의 피크 혈장 농도는 Maxy-G21에 비교한 바 5~6배 느린 것으로 밝혀졌다(표 6). 11 내지 15일 후, Neulasta®는 혈장에서 검출되지 않았고, Neulasta®에 대한 AUC는 Maxy-G21에 비교한 바 대략적으로 9~10배 더 낮았다.

Maxy-G21 및 Neulasta® 처리된 방사선 조사된 붉은 털 원숭이 및 Maxy-G21 처리된 비-조사된 붉은 털 원숭이의 약물동태학

PK 파라미터	Maxy-G21 300 ㎍/kg 조사됨	Maxy-G21 100 ㎍/kg 조사됨	Maxy-G21 100 ㎍/kg 비-조사됨	Neulasta® 300 ㎍/kg 조사됨
C_max(ng/mL)	7219±1476	1961±172	5953±490	1239±658
T_max(시간)	53±31	50±4	31±0	15±13
AUC(시간/mL)	928609±88114	165798±45705	359040±18837	198684±124275

결론:

본 연구는 붉은 털 원숭이에게 피하로 투여된 본 발명에 따른 전형적인 멀티 페길화 G-CSF 변종(본원에서 Maxy-G21로 식별됨)이 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소성 NHP에서 호중성 백혈구 감소증의 기간을 현저히 단축시킬 수 있다는 증거를 제공한다. 더욱이, 그 효과는 내부-연구 Neulasta® 집단 및 병력적 Neulasta® 집단(N=9)을 포함하는 집단과 비교하였을 때 Neulasta®의 효과를 초과하는 것으로 밝혀졌다.

전체적으로, 전형적인 멀티 페길화 G-CSF 변종 Maxy-G21는 중증의 방사선에 의해 유발된 골수 억제 상태를 겪고 있는 NHP에서 뿐만 아니라 건강한(비-조사된) 인간이 아닌 영장류에서 모노 페길화 hG-CSF Neulasta®에 비해 현저히 연장된 혈장 반감기를 나타냈다. PK 데이터는 멀티 페길화 G-CSF 변종, 예를 들면 Maxy-G21이 더 큰 생체 적합성 및 중증의 방사선에 의해 유발된 골수 억제 상태 동안, 뿐만 아니라 정상적인(비-방사선 조사된) NHP에서 모노 페길화 Neulasta®에 상대적인 행동의 지속 기간을 갖는다는 작업 가설을 지원한다.

예 3

C57BL /6 생쥐들에서 치명적인 방사선 노출 후 피하로 투여받은 멀티 페길화 G- CSF 변종의 방사선완화 활성

전형적인 멀티 페길화 G-CSF 변종(본원에서 Maxy-G34로 식별됨)의 효능은 1 mg/kg 투약량에서 및 2개의 상이한 치사량의 방사선에서 시험되었다. 각각의 방사선 조사량 수준에서 생쥐들은 각각 1, 7, 및 14일에 Maxy-G34를 수용하고, 이어서 7.76 Gy 또는 7.96 Gy로 방사선 조사받은 20마리의 생쥐들(10마리의 암컷 및 10마리의 수컷)의 치료 그룹 내로 배분되었다. 비히클-처리된 생쥐들은 1, 7, 및 14일에 희석제(10 mM 소듐 아세테이트 멸균 액체 용액, 45 mg/ml 만니톨, 0.05 mg/ml 폴리소르베이트 20, pH 4.0)를 수용하였다. 따라서, 3개의 생쥐들의 그룹은 다음 치료들 중의 하나를 수용하였다:

1. 7.76 Gy 조사 후 Maxy-G34; 24 ± 4hr 및 7d ± 4hr

(Maxy-G34 dl, d7)

2. 7.76 Gy 조사 후 Maxy-G34; 24 ± 4hr, 7d ± 4 hr 및 14d ± 4hr

(Maxy-G34 dl, d7, dl4)

3. 7.76 Gy 조사 후 비히클; 24 ± 4hr, 7d ± 4hr 및 14d ± 4hr

(비히클 dl, d7, dl4)

4. 7.96 Gy 조사 후 Maxy-G34; 24 ± 4hr 및 7d ± 4hr

(Maxy-G34 dl, d7)

5. 7.96 Gy 조사 후 Maxy-G34; 24 ± 4hr, 7d ± 4hr 및 14d ± 4hr

(Maxy-G34 dl, d7, dl4)

6. 7.96 Gy 조사 후 비히클; 24 ± 4hr, 7d ± 4hr 및 14d ± 4hr

(비히클 dl, d7, dl4)

생쥐들은 다음 조사량에서 14-16 마리의 동물의 그룹에서 조사되었다:

7.76 Gy: 66.104 cGy/분(11분 44초 노출 시간)

7.96 Gy: 66.104 cGy/분(12분 02초 노출 시간)

생쥐들은 항생제를 투여받지 않았다. 1차 종말점은 30일의 전체적인 생존율이고, 제 2 종말점은 평균 생존 시간(MST)이었다.

결과:

30일에 걸친 생존율 및 평균 생존 시간(MST)은 표 7, 표 8, 도 5 및 도 6에 나타낸다.

30-일 생존율 및 MST

그룹	방사선 조사량 (Gy)	그룹 설명	생존자 수/ 전체	생존자 백분율	사망자의 평균 생존시간
1 2 3	7.76 7.76 7.76	Maxy-G34 dl, d7 Maxy-G34 dl, d7, dl4 비히클 dl, d7, dl4	19/20 19/20 16/20	95 95 80	16.0 12.0 17.5
4 5 6	7.96 7.96 7.96	Maxy-G34 dl, d7 Maxy-G34 dl, d7, dl4 비히클 dl, d7, dl4	15/20 17/20 11/20	75 85 55	12.6 8.3 15.1

생존율 및 평균 생존 시간의 통계학적 분석(7.76Gy 및 7.96Gy의 푸울링된 데이터)

비교	일방적 p-값
"비히클 dl, d7, dl4"에 비교한 "Maxy-G34 dl, d7"의 30일 생존율	0.0499
"비히클 dl, d7, dl4"에 비교한 "Maxy-G34 dl, d7, dl4"의 30일 생존율	0.017
"비히클 dl, d7"에 비교한 "Maxy-G34 dl, d7"의 MST	현저하지 않음
"비히클 dl, d7, dl4"에 비교한 "Maxy-G34 dl, d7, dl4"의 MST	현저하지 않음

7.76Gy 방사선 조사량에서 생쥐들의 방사선 조사는 노출 후 dl, d7 및 dl4에 비히클에 의한 치료를 받은 후 30일 후 80% 생존율(즉, LD20/30)을 초래하였다. 노출 후 dl, d7 및 dl4에, 또는 노출 후 dl 및 d7에 1 mg/kg Maxy-G34로 7.76Gy(LD20/30) 방사선 조사된 생쥐들의 치료는 모두 30일 후 생존율을 95%로 증가시켰다(표 7).

7.96 Gy 방사선 조사량에서, 비히클 dl, d7, dl4 그룹에서 생존율은 노출 후 30일에 55%(즉, LD 45/30)였다. dl 및 d7에 1 mg/kg Maxy-G34로 치료받은 7.96 Gy(LD45/30) 방사선 조사된 생쥐들은 노출 후 30일에 75% 생존율을 보였고, Maxy-G34 dl, d7, dl4 그룹은 노출 후 30일에 85% 생존율을 보였다. 이러한 방사선 조사량 수준에서, 3-주 조사량 레지멘(dl, d7, dl4)은 2-주 조사량 레지멘(dl, d7)에 비해 더욱 효과적인 것으로 보였다.

2가지 방사선 수준에서 획득한 데이터가 합해졌다(표 8). 이 연구의 조건 하에, 3-주 Maxy-G34 조사량 그룹 및 2-주 Maxy-G34 조사량 그룹은 둘 다 비히클 대조군 그룹의 그것에 비해 조사 후 30일에 생존율을 통계학적으로 현저히 증가시킴을 보였다. 이 연구에 사용된 방사선 투약량에서, 치료 그룹과 비히클 대조군 그룹 사이의 MST의 차이는 통계학적으로 현저하지 않았다.

상기 발명이 명확성 및 이해의 목적으로 일부 내용을 자세하게 기술하고 있지만, 형태와 내용의 다양한 변화는 발명의 진정한 범위에서 출발하지 않고도 이루어질 수 있다는 것을 본원 개시 내용을 판독함에 따라 당 분야의 숙련자들에게 명백할 것이다. 본원에 기재된 예와 실시예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 그에 비추어 여러 가지 변형 또는 변화가 당 분야의 숙련자들에게 제안될 것이고, 본원의 정신 및 범위 및 첨부된 특허 청구의 범위에 포함되어야 함이 이해될 것이다. 본 명세서에 포함된 모든 공고, 특허, 특허 출, 및/또는 다른 문서는 마치 각각의 개별 공고, 특허, 특허 출, 및/또는 다른 문서가 모든 목적을 위해 그 전문으로 참고 문헌으로 본 명세서에 포함되도록 지시된 것과 동일한 정도까지 모든 목적을 위해 그들의 전문으로 참고 문헌으로서 본원에 포함된다.

Claims

방사선 노출 후 환자에게 멀티 페길화 G-CSF 변종(multi-PEGylated G-CSF variant)을 투여하는 단계를 포함하는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증(neutropenia)을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서,
상기 멀티 페길화 G-CSF 변종은,
G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1에 나타낸 아미노산 서열로부터 15 이하의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 서열을 포함하는, G-CSF 활성을 나타내는 폴리펩티드와,
2개 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티로서, 각각의 PEG 모이어티는 직접 또는 간접적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 공유 부착된, 2개 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를
포함하는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종은, TlK, P2K, L3K, G4K, P5K, A6K, S7K, S8K, L9K, PlOK, QI lK, S12K, F13K, L14K, L15K, E19K, Q20K, V21K, Q25K, G26K, D27K, A29K, A30K, E33K, A37K, T38K, Y39K, L41K, H43K, P44K, E45K, E46K, V48K, L49K, L50K, H52K, S53K, L54K, I56K, P57K, P60K, L61K, S62K, S63K, P65K, S66K, Q67K, A68K, L69K, Q70K, L71K, A72K, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, E93K, G94K, S96K, P97K, E98K, L99K, GlOOK, PlOlK, T102K, D104K, T105K, Q107K, L108K, D109K, A111K, D112K, F113K, T115K, T116K, W118K, Q119K, Q120K, M121K, E122K, E123K, L124K, M126K, A127K, P128K, A129K, L130K, Q131K, P132K, T133K, Q134K, G135K, A136K, M137K, P138K, A139K, A141K, S142K, A143K, F144K, Q145K, S155K, H156K, Q158K, S159K, L161K, E162K, V163K, S164K, Y165K, V167K, L168K, H170K, L171K, A172K, Q173K 및 P174K로 이루어진 그룹으로부터 선택된 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 1에 상대적인 적어도 하나의 치환체를 포함하는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종의 아미노산 서열은, Q70K, Q90K, T105K Q120K, T133K, S159K 및 H170K로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 치환체를 포함하는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종의 아미노산 서열은, K16R/Q, K34R/Q, 및 K40R/Q로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 치환체를 더 포함하는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종의 아미노산 서열은 치환체 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종의 아미노산 서열은 치환체 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K 및 임의로 N-말단에 있는 메티오닌 잔기로 이루어진, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종은 각각 약 1~10 kDa의 분자량을 갖는 2~6개의 PEG 모이어티를 포함하는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종은 N-말단에 부착된 PEG 모이어티와 리신(lysine) 잔기에 부착된 PEG 모이어티를 포함하는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF는 각각 약 4~6 kDa의 분자량을 갖는 2~4개의 PEG 모이어티를 포함하는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종의 아미노산 서열은 K16R/Q, K34R/Q, 및 K40R/Q로부터 선택된 1개 이상의 치환체, 및 Q70K, Q90K, T105K, Q120K, T133K, 및 S159K로부터 선택된 1개 이상의 치환체를 포함하고, 각각 약 1~10 kDa의 분자량을 갖는 2~6개의 부착된 PEG 모이어티를 포함하는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종의 아미노산 서열은 K16R/Q, K34R/Q, 및 K40R/Q로부터 선택된 1개 이상의 치환체 및 T105K와 S159K로부터 선택된 적어도 하나의 치환체를 포함하고, 각각 약 1~10 kDa의 분자량을 갖는 2~4개의 부착된 PEG 모이어티를 포함하는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종의 아미노산 서열은 치환체 K16R, K34R, K40R, T105K 및 S159K를 포함하고, 각각 약 4~6 kDa의 분자량을 갖는 2~4개의 부착된 PEG 모이어티를 포함하는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종은 위치상의 PEG 이성질체 종의 혼합물인, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 위치상의 PEG 이성질체 종의 혼합물은 각각 3개의 부착된 PEG 모이어티를 갖는 위치상의 PEG 이성질체의 적어도 2개의 종을 포함하고, 여기서 상기 이성질체 중 하나는 N-말단에 부착된 PEG 모이어티인 Lys23과 Lysl59를 갖고, 나머지 이성질체는 N-말단에 부착된 PEG 모이어티인 LyslO5와 Lysl59를 갖는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 PEG 모이어티 각각은 약 1~1O kDa의 분자량을 갖는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 15항에 있어서, 상기 PEG 모이어티 각각은 약 5 kDa의 분자량을 갖는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1항에 있어서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 동물 모델에서 필적하는 조건에서 시험될 때 Neulasta®(pegfilgrastim)에 비하여 개선된 약물동태학적 특성(pharmacokinetics)을 나타내는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 17항에 있어서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 동물 모델에서 Neulasta®에 비해 증가된 혈청 반감기를 나타내는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 17항에 있어서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 동물 모델에서 Neulasta®에 비해 증가된 AUC를 나타내는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1항에 있어서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 동물 모델 시스템에서 멀티 페길화 G-CSF 변종으로 치료받지 않은 그룹에 비해 상대적으로 멀티 페길화 G-CSF 변종으로 치료받은 그룹에서 중증 호중성 백혈구 감소증의 기간을 감소시키는데 효과적인 양으로 환자에게 투여되는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1항에 있어서, 멀티 페길화 G-CSF 변종은 방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 동물 모델 시스템에서 멀티 페길화 G-CSF 변종으로 치료받지 않은 그룹에 비해 상대적으로 멀티 페길화 G-CSF 변종으로 치료받은 그룹에서 방사선 노출 후 30일에 생존자의 수를 증가시키는데 효과적인 양으로 환자에게 투여되는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종은 약 20 ug/환자 체중 kg 내지 약 300 ug/환자 체중 kg의 조사량으로 환자에게 투여되는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 환자는 성인 인간이고 멀티 페길화 G-CSF 변종은 환자당 약 1~30 mg의 조사량으로 환자에게 투여되는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1항에 있어서, 1개 이상의 추가 조혈 성장 인자(hematopoietic growth factor)가 투여되는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 24항에 있어서, 상기 추가 조혈 성장 인자는, 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 줄기 세포 인자(SCF), FLT3-리간드(FL), 인터류킨-3(IL-3), 거핵 세포 성장 및 발달 인자(MGDF), 트롬보포이에틴(TPO), TPO-수용체 작용질, 및 에리스로포이에틴(EPO)으로부터 선택되는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종은 방사선 노출 후 약 3일 내에 피검자에게 투여되는, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방사선 노출은 약 1 Gy 이상인, 방사선 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
방사선에 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하기 위한 의약품을 제조하기 위해 멀티 페길화 G-CSF 변종을 사용하는 방법에 있어서,
방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 동물 모델 시스템에서 멀티 페길화 G-CSF 변종으로 치료받지 않은 그룹에 비해 상대적으로 멀티 페길화 G-CSF 변종으로 치료받은 그룹에서 중증 호중성 백혈구 감소증의 기간을 감소시키는데 효과적인 양으로 환자에게 멀티 페길화 G-CSF 변종을 투여하는 단계를
포함하는, 멀티 페길화 G-CSF 변종을 사용하는 방법.
방사선에 노출된 환자의 호중성 백혈구 감소증을 치료 또는 예방하기 위한 의약품을 제조하기 위해 멀티 페길화 G-CSF 변종을 사용하는 방법에 있어서,
방사선에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증의 동물 모델 시스템에서 멀티 페길화 G-CSF 변종으로 치료받지 않은 그룹에 비해 상대적으로 멀티 페길화 G-CSF 변종으로 치료받은 그룹에서 방사선 노출 후 30일에 생존자의 수를 증가시키는데 효과적인 양으로 상기 환자에게 멀티 페길화 G-CSF 변종을 투여하는 단계를
포함하는, 멀티 페길화 G-CSF 변종을 사용하는 방법.
제 28항 또는 제 29항에 있어서, 상기 동물 모델 시스템은 인간이 아닌 영장류 모델 시스템인, 멀티 페길화 G-CSF 변종을 사용하는 방법.
제 28항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 멀티 페길화 G-CSF 변종과 이를 사용하는 방법은 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 멀티 페길화 G-CSF 변종을 사용하는 방법.