KR101623906B1 - 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합단백질은 기존의 인간 G-CSF에 비하여 비활성도 (specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고, 기존의 반감기가 늘어난 페길화 G-CSF에 비하여 정제 효율이 높으므로, 허혈성 질환 또는 호중구 감소증 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 {Pharmaceutical compositions comprising mutant proteins of Granulocyte-colony stimulating factor or transferrin fusion proteins thereof}
본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질에 관한 것이다.
과립구 콜로니자극인자 (Granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF)는 호중구 (Neutrophil) 및 과립구 (Granulocyte) 프로제니터 (Progenitor) 세포 및 성숙 호중구 (Mature neutrophils)의 생존, 증식, 분화 및 기능을 자극하는 당단백질이다.
임상적으로 사용되고 있는 천연형 G-CSF는 필그라스팀 (Filgrastim)이라고 불리며, 인간 아미노산 서열에서 유래된 175개 아미노산으로 구성된 재조합 단백질이다. 대장균 (E. coli)에서 발현되어, 천연형과는 달리 당화되어 있지 않다.
G-CSF는 호중성 과립구 형성 (neutrophil granulopoiesis)을 자극함으로서, 임상적으로 항암 치료에 따른 호중구 감소증 (neutropenia)에 의한 감염성 합병증 예방을 위해 항암 보조제로 사용되고 있다. 암 화학치료 및 방사선 치료로 인해 발생한 발열성 호중구 감소증의 부작용의 발생을 감소시켜 암 화학치료로 인한 사망률을 저하시켜, 암 환자들에게 큰 이점을 주는 임상적 효능을 보이고 있다. G-CSF는 조혈 프로제니터 세포 (hematopoietic progenitor cells)의 수를 증가시켜 그와 같은 부작용을 완화시키는 것으로 보고되고 있다.
또한, G-CSF는 골수 줄기 세포를 허혈성 심장으로 이동하도록 하여, 심근 재생을 통해 혈관 세포 및 심근 세포로의 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다.
재조합 인간 G-CSF (rhG-CSF)는 단시간동안 약리학적 효과를 가지고 있어서, 허혈성 질환의 치료시, 또는 암 화학요법 혹은 방사선요법 이후 발생하는 백혈구 감소증 지속기간 동안 하루에 한 번 이상 투여해야 하는 불편함이 있다. 생체내에서 긴 순환 반감기(Half-life)를 갖는 물질은 백혈구 감소증 등의 완화를 위하여 필요한 투여 횟수를 감소시키고, 결과적으로 감염성 합병증을 예방하는 효과를 갖게 될 것이다.
G-CSF의 N-말단에 생체에서 분해되지 않는 화학 중합체인 Polyethylene glycol (PEG)를 부착시킨 물질은 페그필그라스팀 (Pegfilgrastim)이라고 불리며, 임상적으로 백혈구 감소증 치료에 사용되고 있다. 이 물질은 생체내에서 순환 반감기가 늘어나며, 백혈구 감소증 지속기간 동안 1 ~ 2 주에 한 번씩 투여하면서도 임상적 효과를 나타내고 있다. 그러나, 단백질과 화학 중합체를 화학적 반응 통해 결합시킴으로서, 물질 결합 효율과 정제 방법이 복잡해지는 문제점을 안고 있다.
G-CSF의 17번째 아미노산인 시스테인은 비황화 결합 상태로 단백질 표면에 노출되어 있다. 중성 pH에서, 노출된 시스테인은 주변 G-CSF의 시스테인과 상호적으로 황화 결합을 하여 응집되어 활성이 떨어지게 된다. 17번 시스테인이 세린으로 치환된 G-CSF 변이체는 중성 pH에서 단백질의 안정성이 증가된다고 보고되어 있다.
트랜스페린 (transferrin)은 혈장 단백질 중에서 세 번째로 많은 양으로 존재하며, 혈액에 존재하는 철 이온을 다양한 조직으로 운반하는 역할을 한다. 알부민 (Albumin)이나 면역글로불린 G (Immunoglobulin G, IgG)보다는 짧지만 8일의 비교적 긴 반감기를 가지며, 세포 표면의 트랜스페린 수용체를 통해 세포 내부에 유입되어 철 이온을 공급한 후, 수용체와 결합한 상태로 세포 외부로 유리되어 순환하는 특징이 있다. 이러한 특징을 이용하여, 종래의 반감기가 짧은 단백질을 결합하여 순환 반감기를 증가시키기 위한 융합 파트너로 사용되고 있다.
본 발명은 인간 G-CSF의 116번째 아미노산인 트레오인 (Threonine)을 시스테인으로 치환하여, G-CSF의 본래 아미노산 서열상에 있는 17번째 시스테인과 황화 결합을 할 수 있도록 유도하였다. 이러한 황화 결합은 단백질의 구조를 안정화하여 단백질분해효소들에 대한 분해 저항성을 갖도록 하였다. 이러한 변이체의 제작을 통해 혈중 단백질분해효소들에 대한 분해 저항성을 갖도록 사용된 예는 전혀 없으며, 이로 인한 효과 역시 보고된 바 없다.
또한, 인간 G-CSF의 116번째 아미노산을 시스테인으로 치환한 변이체를 트랜스페린과 융합하여 인간 G-CSF의 혈중 반감기를 증가시키기 위하여 사용한 예는 전혀 보고된 바 없다.
본 발명자들은 인간 G-CSF의 116번째 아미노산을 시스테인으로 치환한 변이체를 트랜스페린과 융합하여, 비 융합된 원형 인간 G-CSF에 비해 비활성도 (specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질, 및 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질, 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질을 유효성분으로 포함하는 호중구 감소증, 허혈증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 항암 치료 보조제를 제공한다.
또한 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질, 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질을 암호화 하는 유전자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질, 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질, 상기 단백질을 암호화 하는 유전자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합단백질은 기존의 인간 G-CSF에 비하여 비활성도 (specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고, 기존의 반감기가 늘어난 페길화 G-CSF에 비하여 정제 효율이 높으므로, 허혈성 질환 또는 호중구 감소증 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 pcDNA3.1(+)/preTf 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 2는 pcDNA3.1(+)/preTf(B) 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 3은 pcDNA3.1(+)/Tf(B) 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 4는 pcDNA3.1(+)/G-CSF(T116C)-Tf 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 5는 G-CSF(T116C)-Tf 플라스미드로 형질전환된 Expi293F 세포주의 G-CSF(T116C)-Tf 발현양을 나타내는 도이다.
도 6은 디이에이이아피젤블루 (DEAE Affi-gel blue) 크로마토그래피로 분리한 G-CSF(T116C)-Tf 단백질을 나타내는 도이다.
도 7은 철(Fe3+)이 결합된 G-CSF(T116C)-Tf의 holo (전효소)형태의 제조 및 농축 분리를 나타내는 도이다.
도 8은 G-CSF(T116C)-Tf의 holo 형태의 트랜스페린 수용체 결합력을 나타내는 도이다.
도 9는 G-CSF, G-CSF-Tf, G-CSF(T116C)-Tf를 처리한 HL-60세포들의 세포 증식 활성도를 나타내는 도이다.
도 10은 G-CSF, G-CSF(T116C) 단백질의 단백질분해효소에 의한 분해 저항성 비교를 나타내는 도이다.
도 11은 G-CSF-Tf, G-CSF(T116C)-Tf 단백질들의 생체 내 혈장 반감기의 비교를 나타내는 도이다.
도 12는 호중구 백혈구 감소증의 렛트에서 G-CSF, G-CSF(T116C)-Tf 단백질들의 생리 활성 비교를 나타내는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 (G-CSF 변이 단백질) 또는 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 (G-CSF 변이 단백질)의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질을 제공한다.
본 발명에 사용된 G-CSF 또는 트랜스페린은 동물, 식물, 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며, 인간 유래 G-CSF 또는 트랜스페린인 것이 바람직하나, 인간 유래 G-CSF 또는 트랜스페린과 동등한 활성을 가지는 이종 유래 단백질일 수 있다.
상기 단백질에는 추가적으로 인산화, 아세틸화, 메틸화, 당쇄화 등의 변형이 있을 수 있으며, 다른 단백질과 결합할 수 있으나, 이로 인하여 단백질의 기능이 상실될 만큼 변하지 않는 한 변형 전의 단백질과 동일한 것으로 볼 수 있다.
상기의 116번째 트레오닌이 치환되는 다른 아미노산은 소수성 아미노산일 수 있으며, 구체적으로 G-CSF 서열의 17번째 시스테인 (Cysteine)과 이황화결합이 가능한 시스테인 (Cysteine)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 트랜스페린이 연결되는 말단은 아미노 말단(5’ 말단, N-말단) 또는 카복시 말단(3’말단, C-말단) 중 어느 것이라도 가능하다.
상기 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 단백질은 <서열번호 1>의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF)을 암호화 하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 서열로 구성될 수 있다.
상기 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 단백질은 <서열번호 1>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 트랜스페린은 <서열번호 2>의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 트랜스페린을 암호화 하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 트랜스페린 단백질은 <서열번호 2>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 변이 단백질은 <서열번호 3>의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 트랜스페린을 암호화 하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 변이 단백질은 <서열번호 3>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질은 <서열번호 4>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질은 <서열번호 5>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질, 또는 트랜스페린은, 유전자 조작을 위하여 유전자 내 제한 효소 인식 부위의 염기서열을 상기 염기서열이 암호화 하는 아미노산과 동일한 아미노산, 또는 단백질의 활성을 변화시키지 않는 범위내에서 다른 아미노산을 암호화 하는 염기서열로 치환한 것일 수 있고, 유전자 말단 부위의 일부가 제거, 치환, 또는 첨가되어 제한 효소 인식 부위가 삽입된 것일 수 있다. 예를 들어, 단백질 유전자 내의 BamHI 제한 효소 인식 부위 염기서열(GGATCC)의 타이민 (Thymine)을 사이토신 (Cytosine)으로 치환한 단백질일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 제한 효소의 종류에는 EcoRI, BamHI, HindⅢ, kpnⅠ, NotⅠ, PstⅠ, SmaⅠ, XhoⅠ, FokⅠ, Alw26Ⅰ, BbvⅠ, BsrⅠ, EarⅠ, HphⅠ, MboⅠ, SfaNⅠ, Tth111Ⅰ, NaeⅠ, NheI, NgoMⅣ, NheI, Eco57Ⅰ, BcgⅠ, BpⅠ, Bsp24Ⅰ, BaeⅠ, CjeⅠ, EcoPⅠ, HintⅢ, StyLTⅠ 등이 있으며, 사용하고자 하는 유전자, 발현 벡터 또는 유전자 조작 환경에 따라 당업계에서 사용되는 모든 제한 효소가 제한 없이 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질, 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질을 유효성분으로 포함하는 호중구 감소증, 허혈증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 항암 치료 보조제를 제공하고, 상기 단백질을 암호화 하는 유전자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 '호중구 감소증 (neutropenia)'란, 호중구의 수가 비정상적으로 감소된 것을 말하며 혈액 μl 당 호중구의 수가 1500 이하인 경우 가벼운 증세, 1000 이하인 경우 중간 정도의 증세, 500 이하인 경우 심각한 호중구 감소증으로 분류된다. 백혈구 감소증 (neucopenia)도 넓은 의미의 호중구 감소증으로 볼 수 있다.
본 발명의 '허혈성 질환'이란 출혈, 색전 (embolism) 및 경색 (infarction) 등에 의해 조직으로의 혈류공급이 중단되어 세포손상이 일어나는 것을 말하며, 외상, 이식 거부반응, 뇌졸중, 뇌경색, 허혈성 신질환, 허혈성 폐질환, 감염에 의한 허혈성 질환, 사지의 허혈성 질환, 허혈성 심근증, 심근경색증, 심부전 등이 있다.
상기의 116번째 트레오닌이 치환되는 다른 아미노산은 소수성 아미노산일 수 있으며, 구체적으로 이황화결합이 가능한 시스테인 (Cysteine)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 단백질은 <서열번호 1>의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF)을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 서열로 구성될 수 있다.
상기 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 단백질은 <서열번호 1>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 트랜스페린은 <서열번호 2>의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 트랜스페린을 암호화 하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 트랜스페린 단백질은 <서열번호 2>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 변이 단백질은 <서열번호 3>의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 트랜스페린을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 변이 단백질은 <서열번호 3>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질은 <서열번호 4>의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질 혹은 트랜스페린을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질은 <서열번호 4>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질은 <서열번호 5>의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질 혹은 트랜스페린을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질은 <서열번호 5>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질, 또는 트랜스페린은, 유전자 조작을 위하여 유전자 내 제한 효소 인식 부위의 염기서열을 상기 염기서열이 암호화 하는 아미노산과 동일한 아미노산, 또는 단백질의 활성을 변화시키지 않는 범위 내에서 다른 아미노산을 암호화하는 염기서열로 치환한 것일 수 있고, 유전자 말단 부위의 일부가 제거, 치환, 또는 첨가되어 제한 효소 인식 부위가 삽입된 것일 수 있다. 예를 들어, 단백질 유전자 내의 BamHI 제한 효소 인식 부위 염기서열(GGATCC)의 타이민 (Thymine)을 사이토신 (Cytosine)으로 치환한 단백질일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 제한 효소의 종류에는 EcoRI, BamHI, HindⅢ, kpnⅠ, NotⅠ, PstⅠ, SmaⅠ, XhoⅠ, FokⅠ, Alw26Ⅰ, BbvⅠ, BsrⅠ, EarⅠ, HphⅠ, MboⅠ, SfaNⅠ, Tth111Ⅰ, NaeⅠ, NheI, NgoMⅣ, Eco57Ⅰ, BcgⅠ, BpⅠ, Bsp24Ⅰ, BaeⅠ, CjeⅠ, EcoPⅠ, HintⅢ, StyLTⅠ 등이 있으며, 사용하고자 하는 유전자, 발현 벡터 또는 유전자 조작 환경에 따라 당업계에서 사용되는 모든 제한 효소가 제한 없이 이용될 수 있다.
본 발명의 '발현 벡터'란 목적 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 숙주 세포에 도입하기 위한 수단으로서, 플라스미드, 코스미드, BAC, 바이러스 핵산 등의 여러 형태를 포함한다. 상기 벡터에는 목적 유전자가 성공적으로 숙주세포에 도입되었음을 확인할 수 있는 항생제 내성 유전자 등의 선택적 마커를 포함하고 있는 것이 일반적이며, 목적 유전자의 발현을 유도하기 위한 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 서열, 인핸서, 코작 서열, 샤인-달가노 서열 등을 목적에 따라 다양하게 포함할 수 있다. 복제 가능한 발현벡터의 경우 복제 기원을 포함한다.
상기 숙주세포는 대장균, 효모, 곰팡이, 식물세포, 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지 않고 당업계에서 재조합 단백질 생산에 사용되는 모든 숙주세포가 이용 가능하다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트(magnesium stearate), 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 흉부내 또는 뇌혈관내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유한다.
일회 투여량은 단백질의 양을 기준으로 1 내지 100 밀리그램이고, 바람직하게는 3 내지 50 밀리그램이고, 더욱 바람직하게는 6 내지 30밀리그램이며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있으며, 이때 여러 부위에 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질, 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체의 제조방법을 제공한다.
상기 단백질은 화학적으로 합성하거나, 자연적으로 존재하는 세포에서 생산되거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 변형된 숙주세포에서 정제하여 얻을 수 있고, 수득한 단백질에는 추가적으로 인산화, 아세틸화, 메틸화, 당쇄화 등의 변형이 있을 수 있으며, 다른 단백질과 결합한 상태에 있을 수 있으나, 이로 인하여 단백질의 기능이 상실될 만큼 변하지 않는 한 변형 전의 단백질과 동일한 것으로 볼 수 있다.
상기 유전자 재조합 기술을 이용한 단백질의 제조방법은
발현하고자 하는 유전자를 발현벡터에 삽입하는 단계;
상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계;
숙주세포를 배양하여 생산된 단백질을 수득하는 단계로 구성될 수 있으나, 이에 한정되지 않고 당업계에 공지된 모든 방법이 이용 가능하다.
상기 단백질을 수득하는 단계는 단백질 침전제, 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 겔 여과, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 당업계에 공지된 정제 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 트랜스페린 유전자 내부의 제한효소 인식서열을 제거하고, 5’말단에 제한효소 부위 서열을 삽입하고, 3’말단에 제한효소 부위와 stop 코돈을 삽입한 유전자를 포함한 플라스미드를 제조하였고, 상기 플라스미드에 G-CSF 유전자 내부의 제한효소 인식서열을 제거한 유전자를 삽입하여 트랜스페린 유전자와 G-CSF 유전자가 연결된 플라스미드를 제조하였다.
또한 본 발명의 일 실시예에서, G-CSF 유전자의 116번째 아미노산을 시스테인으로 치환한 G-CSF 변이체를 제조한 후, 유전자 내부의 제한효소 인식서열을 제거하고, 5’말단에 제한효소 부위와 코작 서열을 삽입하고, 3’말단에 제한효소 부위 삽입한 유전자를 포함한 플라스미드를 제조하였다. 이후 트랜스페린 유전자를 상기 플라스미드와 융합하여 트랜스페린 유전자와 G-CSF 변이체 유전자가 연결된 플라스미드를 제조하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 플라스미드 제작
<1-1> 트랜스페린 발현 플라스미드 제작
총 mRNA를 얻기 위해 인간 간암 세포인 HepG2을 이용하였다. HepG2 세포를 10% 소태아 혈청 (fetal bovine serum, WelGNE)과 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco)이 포함된 DMEM (HyClone)를 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소 항온기에서 계대배양하였다. 계대배양 후 이틀간 배양한 HepG2 세포의 배지를 제거하고 인산완충액(HyClone)을 이용하여 세척 후, 세포 펠렛을 수거하여 원심분리하여 배지를 제거 후 -70℃에 보관하여 사용하였다. -70℃에 보관되어 있던 세포를 꺼내 해동한 후 RnaUs ToTal Tissue Premium RNA Preps (LeGene)을 사용하여 지침서에서 제시한 표준 조건으로 수행하여 총 mRNA를 얻었다. 얻어진 총 mRNA를 Premium Express 1st Strand cDNA synthesis system (Legene)으로 oligo(dT)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
만들어진 cDNA를 주형으로 DNA 중합효소 (Phusion)를 사용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 실시하였다. 반응에 사용하는 프라이머들은 코스모진텍에서 주문 제작하여 사용하였으며 트랜스페린 유전자의 5’말단에 NheI 제한효소 부위, 코작(Kozak) 서열을 위치시키고 3’말단에 Xho I 제한 효소 부위, Stop 코돈(TAA)이 위치하도록 제작하였다. 센스 프라이머 (5’-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3’, 서열번호 9) 및 안티센스 프라이머 (5’-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3’, 서열번호 10)를 10 pmol로 사용하였고 cDNA 주형과 함께 DNA 중합효소와 완충액에 증류수를 가하여 총 부피를 50 μl로 하였다. PCR 기기를 이용하여 98℃에서 30초간 반응시키고, 순환 프로그램은 98℃에서 10초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분간을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 증폭된 트랜스페린 유전자를 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 크기를 확인하고 원하는 부분의 아가로즈 겔을 잘라 MEGAquick-spinTM Total Fragment DNA purification kit (iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다.
정제를 통해 얻어진 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 플라스미드 (Invitrogen)를 NheI (Enzynomics)과 XhoI (Enzynomics) 제한효소를 처리하였다. 제한 효소 10 unit과 완충용액 2 (10 mM Tris-HCL pH 7.9, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA)를 넣고 37℃에서 2 ~ 3 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔 상에서 전기영동으로 크기를 확인하고 아가로즈 겔을 잘라 MEGAquick-spinTM Total Fragment DNA purification kit (iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다.
정제한 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 벡터를 T4 DNA 접합효소 (Takara)와 함께 16℃에서 16 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 대장균 DH10B에 형질전환하였고 엠피실린 항생제가 포함된 한천 (Agar) 플레이트에 도포한 후 37℃에서 16시간 배양하여 대장균 콜로니를 선별하였다.
pcDNA3.1(+) 플라스미드에 트랜스페린 유전자가 성공적으로 삽입되었는지 확인하기 위해서 DNA 중합효소를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 확인하였다. 대장균 콜로니를 물에 희석하여 주형으로 사용하였고 트랜스페린 유전자 증폭에 사용된 센스프라이머(5’-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3’, 서열번호 9) 및 안티센스 프라이머 (5’-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3’, 서열번호 10)를 이용하였으며 98℃에서 30초간 반응시키고, 순환 프로그램은 98℃ 10초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 30회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 중합효소 연쇄반응 (PCR)이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전자를 확인하였으며 확인된 대장균 콜로니를 LB 액체 배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl)에 접종하여 16시간 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균을 원심분리하여 상층액과 세포펠렛으로 분리한 후 세포펠렛을 ExprepTM Plasmid SV,mini (GeneAll)를 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제한 플라스미드의 염기서열 분석은 코스모진텍사에서 진행되었다. 이렇게 만들어진 트랜스페린 발현 플라스미드를 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/preTf (서열번호 6)로 명명한다 (도 1).
플라스미드 제작시 제한효소 BamHI 부위를 이용하기 위해 트랜스페린 유전자에 존재는 BamHI 부위를 위치선택적 돌연변이(site-direct mutagenesis)를 실시하여 BamHI 제한 효소 부위를 제거하는 작업을 하였다. 트랜스페린 유전자에 존재하는 BamHI 제한 효소 부위를 제거하기 위해 핵산을 타이민(Thymine, T)에서 사이토신(cytosine, C)로 치환하였으나 아미노산 서열은 아스파트산(Aspartic acid)으로 유지된다. BamHI 제한 효소 부위, GGATCC를 GGACCC로 핵산을 치환하기 위해 센스프라이머 (5’-CTATGGGTCAAAAGAGGACCCACAGACTTTCTATT-3’, 서열번호 11) 및 안티센트 프라이머 (5’-AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCTTTTGACCCATAG-3’, 서열번호 12)를 코스모진텍사에서 주문제작하여 사용하였다. 기 제작된 pcDNA3.1(+)/preTf 플라스미드를 주형으로 사용하였으며 Muta-direct Site Directed Mutagenesis kit (iNtRON)을 이용하여 제조사에서 제공하는 지침서대로 수행하였다. 중합효소 연쇄 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전자를 확인하였으며 확인된 대장균 콜로니를 엠피실린 항생제가 포함된 LB 액체 배지에 접종하여 16시간 동안 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균을 원심분리하여 상층액과 세포펠렛으로 분리한 후 세포펠렛을 플라스미드 추출 키트 (GeneAll)를 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였고, 염기서열 분석을 통해 트랜스페린 유전자에 존재하는 BamHI 제한효소 부위의 핵산이 치환된 것을 확인하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/preTf(B) (서열번호 7)로 명명한다 (도 2).
트랜스페린은 분비 단백질로서 N-말단에 합성된 단백질이 세포막으로 전달되도록 도와주는 신호 펩타이드 (Signal peptide)를 포함하고 있으며, 아미노산 서열은 MRLAVGALLVCAVLGLCLA (서열번호 13) 이다. 인간 백혈구 생성 촉진인자의 유전자를 트랜스페린 유전자의 5’말단에 삽입하기 위하여 트랜스페린에 존재하는 신호 펩타이드를 제거하고 5’말단에 제한효소 BamHI을 위치시킨 플라스미드를 제조하였다. 3’말단에는 Xho I과 Stop 코돈(TAA)을 위치시켰다. pcDNA3.1(+)/preTf(B)를 주형으로 DNA 중합효소를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 반응에 사용하는 프라이머들은 코스모진텍에서 주문 제작하여 사용하였다. 센스프라이머 (5’-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3’, 서열번호 14) 및 안티센스 프라이머 (5’-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3’, 서열번호 10)를 10 pmol로 사용하였고 주형과 함께 DNA 중합효소와 완충용액에 증류수를 가하여 총 부피를 50 μl로 하였다. PCR 기기를 이용하여 98℃에서 30초간 반응시키고, 순환 프로그램은 98℃ 10초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 30회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 증폭된 트랜스페린 유전자를 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 크기를 확인하고 아가로즈 겔을 잘라 MEGAquick-spinTM Total Fragment DNA purification kit (iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다. 정제된 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 플라스미드를 각각 BamHI (Enzynomics)와 XhoI (Enzynomics) 제한 효소를 처리하였다. 제한 효소 10 unit과 완충용액 2 (10 mM Tris-HCL pH 7.9, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA)를 넣고 37℃에서 2 ~ 3 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 걸어 전기영동 한 후 크기를 확인하고 아가로즈 겔을 잘라 MEGAquick-spinTM Total Fragment DNA purification kit (iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다. 정제한 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 벡터를 다시 1% 아가로즈 겔에 걸어 전기영동 한 후 DNA를 정량하였고 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 플라스미드를 T4 DNA 접합효소 (Takara)를 첨가하여 16℃에서 16 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 대장균 DH10B에 형질전환하였고 엠피실린이 포함된 한천 플레이트에 도포한 후 37℃에서 16시간 배양하여 대장균 콜로니를 선별하였다. pcDNA3.1(+) 플라스미드에 트랜스페린 유전자가 성공적으로 삽입되었는지는 중합효소 연쇄반응을 통해 실행하였다. 대장균 콜로니를 물에 희석하여 주형으로 사용하였고 트랜스페린 유전자 증폭에 사용된 센스프라이머 (5’-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3’, 서열번호 14) 및 안티센스 프라이머 (5’-AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3’, 서열번호 10)를 이용하였으며 98℃에서 30초간 반응시키고, 순환 프로그램은 98℃ 10초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 30회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 중합효소 연쇄 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전자의 삽입 여부를 확인하였고 유전자 삽입이 확인된 대장균 콜로니를 LB 액체 배지 (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl)에 접종하여 16시간 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균을 원심분리하여 상층액과 세포펠렛으로 분리한 후 세포펠렛을 ExprepTM Plasmid SV,mini (GeneAll)를 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 정제한 플라스미드는 염기서열분석을 통해 signal peptide가 제거된 트랜스페린 유전자가 성공적으로 pcDNA3.1(+)에 삽입되었는지를 확인하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/Tf(B) (서열번호 8)로 명명하였다 (도 3).
<1-2> G- CSF - Tf 발현 플라스미드 제조
pcDNA6/G-CSF의 BamHI 제한효소 부위를 제거하기 위해, pcDNA6/G-CSF 플라스미드에 BamHI (Enzynomics) 제한효소 20 units를 처리하여 37℃에서 3시간 반응시켰다. 반응된 플라스미드 45 ng을 10 pmol의 센스 프라이머 (5’-CATGCTAGCTCCACCA TGGCTGGACCTGCCACCCAG-3’, 서열번호 15)와 안티센스 프라이머 (5’-CATGGATCCGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3’, 서열번호 16)로 PCR 방법을 통해 증폭시켜, 5’말단에는 Nhe I 제한효소 부위와 코작(Kozak) 서열을, 그리고 3’말단에는 BamHI 제한효소 부위를 갖는 G-CSF 유전자 절편을 제조하였다. 제조된 G-CSF 유전자 절편 1 ㎍과 pcDNA3.1(+)/Tf(B) 플라스미드 365 ng을 각각 NheI 제한효소 10 units과 BamHI 제한효소 20 units로 37℃에서 4시간 반응시킨 후, DNA 아가로즈 겔 (0.5X TAE, 1% 아가로즈)에 전기영동을 걸어 겔을 추출하였다. pcDNA3.1(+)/G-CSF-Tf 제조를 위해, 정제된 pcDNA3.1(+)/Tf(B) 플라스미드와 G-CSF 유전자 절편을 1대3의 몰 비율로 섞고 T4 DNA 접합효소 350U와 25℃에서 1시간 반응시킨 후, 대장균 DH5α에 형질전환시켰고 엠피실린 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. pcDNA3.1(+)/G-CSF-Tf 플라스미드가 성공적으로 제조되었는지는 콜로니 중합효소 연쇄반응(Colony PCR)로 확인하였다. 대장균 DH5α에 형질전환되어 선별된 콜로니는 10 pmol의 센스 프라이머 (5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’, 서열번호 17)와 안티센스 프라이머 (5’-AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCCTTTGACCCATAG-3’, 서열번호 18)로 콜로니 PCR 방법을 통해 증폭시킨 후, 아가로즈 겔 (0.5X TAE, 1% 아가로즈)에 걸어 크기를 확인하였다. 확인된 콜로니는 엠피실린 (100 ㎍/ml) 이 들어있는 LB 액체배지 (5 mL당 트립톤 50 mg, 효모추출물 25 mg, 염화나트륨 50 mg)에 접종하여 15시간 배양하고, 플라스미드 추출 키트로 pcDNA3.1(+)/G-CSF-Tf를 추출한 후, 염기서열분석을 통해 pcDNA3.1(+)/G-CSF-Tf이 성공적으로 제조된 것을 확인하였다.
<1-3> G- CSF ( T116C ) 및 G- CSF ( T116C )- Tf 발현 플라스미드 제작
센스 프라이머 (5’-GCCGACTTTGCCACCTGCATCTGGCAGCAGAT-3’, 서열번호 19)와 안티센스 프라이머 (5’-ATCTGCTGCCAGATGCAGGTGGCAAAGTCGGC-3’, 서열번호 20) 각각 10 pmol를 pET21a(+)/G-CSF와 혼합 후 연쇄중합반응을 통해 상기 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 위치선택적 돌연변이를 실시하여 G-CSF(T116C) 유전자를 제작하였고. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서 pET21a(+)/G-CSF(T116C)라 명한다.
pET21a(+)/G-CSF(T116C)를 DNA 아가로즈 겔 (0.5X TAE, 1% 아가로즈)에 걸어 크기를 확인한 후, 그 부분의 겔만 잘라내어 겔 추출 키트(코스모진텍)로 정제하였다. 정제된 pET21a(+)/G-CSF(T116C)로 대장균 DH10B에 형질전환 시켰고, 엠피실린 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니는 엠피실린 (100 μg/mL) 이 들어있는 LB 액체배지 (5 mL당 트립톤 50 mg, 염화나트륨 50 mg, 효모추출물 25 mg)에 접종하여 15시간 배양하고, 플라스미드 추출 키트로 pET21a(+)/G-CSF(T116C)를 추출한 후, 염기서열법으로 염기서열이 성공적으로 치환된 것을 확인하였다.
먼저, 센스 프라이머 (5’-GCCGACTTTGCCACCTGCATCTGGCAGCAGAT-3’, 서열번호 19)와 안티센스 프라이머 (5’-ATCTGCTGCCAGATGCAGGTGGCAAAGTCGGC-3’, 서열번호 20)를 각각 10 pmol/㎕가 되도록 녹이고, 각 각의 프라이머를 10 pmol씩 취하여 pcDNA6에 삽입된 G-CSF 유전자 100 ng과 PCR 방법으로 반응시켜 상기 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 위치선택적 돌연변이를 실시하여 G-CSF(T116C) 유전자를 얻었다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서 pcDNA6/G-CSF(T116C)라 명한다.
pcDNA6/G-CSF(T116C)를 DNA 아가로즈 겔 (0.5X TAE, 1% 아가로즈)에 걸어 크기를 확인한 후, 그 부분의 겔만 잘라내어 겔 추출 키트(코스모진텍)로 정제하였다. 정제된 pcDNA6/G-CSF(T116C)로 대장균 DH10B에 형질전환 시켰고, 엠피실린 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니는 엠피실린 (100 ㎍/ml) 이 들어있는 LB 액체배지 (5 mL당 트립톤 50 mg, 염화나트륨 50 mg, 효모추출물 25 mg)에 접종하여 15시간 배양하고, 플라스미드 추출 키트로 pcDNA6/G-CSF(T116C)를 추출한 후, 염기서열법으로 염기서열이 성공적으로 치환된 것을 확인하였다. pcDNA6/G-CSF(T116C)의 BamHI 제한효소 부위를 제거하기 위해, pcDNA6/G-CSF(T116C) 플라스미드 1㎍에 BamHI (Enzynomics) 제한효소 20 units를 처리하여 37℃에서 3시간 반응시켰다. 반응된 플라스미드 45 ng을 10 pmol의 센스 프라이머 (5’-CATGCTAGCTCCACCATGGCTGGACCTGCCACCCAG-3’, 서열번호 15)와 안티센스 프라이머 (5’-CATGGATCCGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3’, 서열번호 16)로 PCR 방법을 통해 증폭시켜, 5’말단에는 Nhe I 제한효소 부위와 코작(Kozak) 서열을, 그리고 3’말단에는 BamHI 제한효소 부위를 갖는 G-CSF(T116C) DNA 절편을 제조하였다. 제조된 G-CSF(T116C) DNA절편 1 ㎍과 pcDNA3.1(+)/Tf(B) 플라스미드 365 ng을 각각 NheI 제한효소 10 units과 BamHI 제한효소 20 units로 37℃에서 4시간 반응시킨 후, DNA 아가로즈 겔 (0.5X TAE, 1% 아가로즈)에 전기영동을 걸어 겔 추출 키트로 정제하였다. pcDNA3.1(+)/G-CSF(T116C)-Tf를 제조를 위해, 정제된 pcDNA3.1(+)/Tf(B) 플라스미드와 G-CSF(T116C) DNA절편을 1대3의 몰비율로 섞고 T4 DNA 중합효소 350U와 25℃에서 1시간 반응시킨 후, 대장균 DH5α에 형질전환시켰고 엠피실린 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. pcDNA3.1(+)/G-CSF(T116C)-Tf 플라스미드가 성공적으로 제조되었는지를 콜로니 중합효소 연쇄반응으로 확인하였다. 대장균 DH5α에 형질전환되어 선별된 콜로니는 10 pmol의 센스 프라이머 (5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’, 서열번호 17)와 안티센스 프라이머 (5’-AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCCTTTGACCCATAG-3’, 서열번호 18)로 콜로니 PCR 방법을 통해 증폭시킨 후, 아가로즈 겔 (0.5X TAE, 1% 아가로즈)에 걸어 크기를 확인하였다. 확인된 콜로니는 엠피실린 (100 ㎍/ml) 이 들어있는 LB 액체배지 (5 mL당 트립톤 50 mg, 효모추출물 25 mg, 염화나트륨 50 mg)에 접종하여 15시간 배양하고, 플라스미드 추출 키트로 pcDNA3.1(+)/G-CSF(T116C)-Tf를 추출한 후, 염기서열분석법으로 pcDNA3.1(+)/G-CSF(T116C)-Tf(서열번호 21)이 성공적으로 제조된 것을 확인하였다(도 4).
< 실시예 2> 일시적 형질 전환을 통한 단백질 발현
<2-1> G- CSF ( T116C ) 발현
pET21a(+)/G-CSF(T116C) 플라스미드 1 ㎕를 발현균주인 Rosetta2 (DE3) 20 ㎕에 접종하여 42℃에서 90초 반응하여 형질전환 시켰다. 형질전환된 발현균주를 50 μg/mL 엠피실린이 포함된 LB 배지 플레이트에 도말하고 37℃에서 15시간 배양하여 콜로니를 얻었다. 50 μg/mL 엠피실린과 25 μg/mL 클로람페니콜이 포함된 100 mL LB 배지에 콜로니를 접종하여 37℃에서 15시간 배양하였다. 배양된 균주 20 mL은 50 μg/mL 엠피실린과 25 μg/mL 클로람페니콜이 포함된 1L LB 배지에 접종하여 OD600 = 0.8에 도달 할 때까지 37℃에서 4시간 교반배양 하였다. 1mM IPTG를 첨가하여 37℃에서 4시간 교반배양 하였다. 6000rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액과 침전물을 분리한 후, SDS-PAGE를 통해 단백질이 inclusion body로 발현되는 것을 확인하였다.
<2-2> G- CSF ( T116C )- Tf 발현
본 발명에 사용되는 단백질들은 부유배양을 위해 변형된 인간 배아 신장암 세포주인 Expi293FTM 세포 (Gibco)를 이용하여 세포 밖으로 단백질들을 분비하여 발현하였다. Expi293FTM Expression system Kit (Gibco)에 포함되어 있는 Expi293FTM 세포를 해동 후, 30 mL 현탁 배양용 무혈청 배지 (Serum-free media for animal cell culture, Gibco)가 담긴 멸균 125 mL 플라스크 (Thermo)에 접종하여 37℃, 5% 이산화탄소 항온 배양기에서 125 rpm의 교반 속도로 진탕배양하였다.
Expi293FTM 세포주를 3 ~ 5x106 cells/mL의 세포 밀도로 유지하며 3 ~ 4일마다 계대 배양하여 세포를 안정화시킨 후 형질전환을 위해 2x106 cells/mL의 세포 밀도로 무혈청 배지에 접종하여 24시간 진탕배양하였다. 형질 전환 직전에 세포의 밀도를 다시 2x106 cells/mL로 맞추고 세포의 생존능력이 90% 이상 인지 확인하고 실험에 사용하였다.
G-CSF-Tf, G-CSF(T116C)-Tf 플라스미드 DNA 22.5 ㎍을 준비하여 Opti-MEM (Gibco)으로 희석하여 준비하고 ExpiFectamineTM 293 Reagent 45 μL 역시 Opti-MEM® 배지로 희석하여 실온에서 5분간 방치하였다. 플라스미드와 ExpiFectamineTM 293 Reagent 혼합물을 잘 섞어준 후 실온에서 20분간 방치하고 준비된 세포에 골고루 넣어 주었다. 형질전환 후 16 ~ 18시간 사이에 단백질 발현을 증가시키기 위해, 첨가물 ExpiFectamine™ 293 Transfection Enhancers 1, 2 (Gibco)를 넣고 다시 32시간을 상기 진탕배양 조건에서 추가 배양한 후, 얻어진 세포 배양액을 2,000 xg에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻었다.
단백질 발현을 확인하기 위해, 상층액을 5x loading dye (Biosesang)와 혼합하여 95℃에서 20분간 끊이고 10% SDS-PAGE에 점적하여 160 V에서 1시간동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 겔을 PVDF 재질의 Immobilon-P-Transfer Membrane (Millipore)으로 단백질을 이동시켰다. 5% Skim milk 용액상에서 상온에서 1시간 반응시키고 인산완충세척액 (0.05% Tween 20를 포함하는 인산완충액)으로 세척한 후 트랜스페린 항체 (Santa Cruz)를 2,000배로 희석하여 상온에서 두시간 반응시키고 인산완충세척액으로 세척한 후 Horseradish perixidase가 결합된 항체 (Santa Cruz)를 10,000배로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨다. 항체 결합 반응이 끝난 후 인산완충세척액으로 세척하고 SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo)를 이용하여 발색시켰다. G-CSF-Tf와 G-CSF(T116C)-Tf의 분자량은 105.7 kDa으로 단백질이 정상적으로 발현되었음을 확인하였다 (도 5).
<실시예 3> 단백질 정제
<3-1> G- CSF ( T116C ) 단백질 정제
Inclusion body를 정제하기 위하여, 파쇄 완충액 (50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 2 mM EDTA, 1 mM PMSF)에 녹인 후 초음파분쇄기를 이용해 세포를 파쇄하였다 (파쇄시간 5분, 초음파 30초, 대기 40초). 4℃에서 10,000 rpm으로 30 분 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 세척완충액 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 2 mM EDTA, 0.3% Triton)에 녹여 초음파분쇄기를 이용해 침전물을 파쇄하였다 (파쇄시간 5분, 초음파 30초, 대기 40초). 4℃에서 10,000 rpm으로 30 분 원심분리로 상층액을 제거 후, 세척완충액 (50mM Tris-Cl, pH8.0, 2 mM EDTA, 1 M NaCl)으로 녹여 초음파분쇄기를 이용해 침전물을 파쇄하였다 (파쇄시간 5분, 초음파 30초, 대기 40초). 4℃에서 10,000 rpm으로 30 분 원심분리로 상층액을 제거 후, 가용화 완충액 (8 M Urea, 50 mM Tris-Cl, pH8.0)에 세척된 Inclusion body를 용해하였다. 용해된 단백질 시료 10 mL를 투석(dialysis) 튜브에 넣어 2 L의 투석 완충액 (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 0.1% Tween20)에서 4℃에서 16시간 동안 단백질 방치하면서 refolding을 진행하였다. 반응 시료에 2 M Acetic acid를 점적하여 pH를 4.5로 조정한 후, 4℃에서 10,000 rpm으로 30 분 원심분리를 하였다. AKTA prime plus FPLC에 Hiprep 26/10에 연결된 Desalting column (17-5087-05)를 Desalting buffer (25 mM Na-Acetate pH 4.5, 5% Sucrose, 0.004% Tween20)로 충전하고 원심분리된 상층액을 투과시켜 완충액 교환을 수행하였다.
<3-2> G- CSF ( T116C ) 단백질 정량
정제된 G-CSF(T116C)는 은염색법 (silver staining)을 이용해 정량하였다. G-CSF 표준물질인 그라신 (30 ng 이하의 양/SDS-PAGE 웰)을 이용해 표준 정량 곡선을 확보한 후, 각 시료의 미지의 양을 표준 정량 곡선과 비교하여 단백질을 정량하였다.
<3-3> G- CSF ( T116C )- Tf 단백질 정제
G-CSF-Tf 혹은 G-CSF(T116C)-Tf가 포함되어있는 상등액 30 mL을 20 mM 인산칼륨 완충용액 (pH 7.5)의 4 L에 투석(dialysis)하여 완충용액을 교환하였다. 인산칼륨 완충용액에 포함된 G-CSF-Tf 혹은 G-CSF(T116C)-Tf는 디이에이이 아피젤블루 크로마토그래피 (DEAE Affi-gel Blue) 컬럼에 0.5 mL/min의 유속으로 충전한 후, 72 mM 인산칼륨을 계단구배 (step gradient)로 흘려주어 레진에 흡착된 단백질들을 배양액에 포함된 다른 단백질들로부터 분리하였다 (도 6).
<3-4> 철( Fe3 +)이 결합된 형태 제조
본 발명의 G-CSF(T116C)-Tf의 holo 형태 제조는 문헌 [Zhang et al. BMC Biotechnology 2012, 12:92]에 기초하였다. 정제된 G-CSF-Tf 혹은 G-CSF(T116C)-Tf에 단백질과 동일한 양의 구연산 철 암모늄을 처리하여 37℃에서 2시간 반응시키고 인산 완충 식염수 2L로 4℃에서 15시간 투석 (dialysis)하여 완충용액을 교환하였으며, 농축기 (Millipore)를 이용하여 시료를 10배 농축하였다 (도 7).
<3-5> 단백질 정량
정제된 단백질의 정량은 트랜스페린 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 진행하였다. 10% SDS-PAGE에 정량된 트랜스페린을 각각 웰당 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng 씩을 점적하였고, 농도가 미결정된 정제된 단백질을 다른 웰에 함께 점적하여 전기영동하였으며, 웨스턴 블롯을 하여 정량된 트랜스페린의 표준곡선에 정제된 단백질을 비교하여 단백질 시료를 정량화 하였다.
< 실시예 4> 트랜스페린 수용체와의 결합력 측정
트랜스페린은 세포 표면에 발현된 트랜스페린 수용체와 결합 후, 세포 내부로 엔도시토시스로 들어와 철을 유리하고 수용체와 결합한 상태로 다시 세포 표면으로 이동하여 혈액으로 분비된다. 이러한 과정을 반복하여 세포 내부에 철을 공급하면서 세포내 리소좀에서 분해되는 과정을 회피하게 되는 생체내 재활용 대사 과정을 통해 반감기가 증가되게 된다. 반감기가 짧은 목적 단백질을 트랜스페린과 융합하면 트랜스페린의 생체내 재활용 대사 과정을 동행함으로서 목적 단백질이 생체에서 분해 대사 과정을 회피할 수 있게 된다. 따라서, G-CSF를 트랜스페린에 융합시킨 단백질은 트랜스페린 수용체에 대한 결합력을 유지해야만 효율적으로 생체에서 분해 대사 과정을 회피 할 수 있다.
따라서 본 발명의 단백질들의 세포외 표면 트랜스페린 수용체 (Transferrin receptor; TfR)와의 결합력을 확인하기 위해 TfR의 세포 막 발현 비중이 높은 인간 간암 세포주 HepG2를 이용하여 실험하였다. HepG2 세포를 웰당 5x105 세포수로 96-웰 플레이트에 접종하여 24시간 배양하였다. 플레이트에 부착된 HepG2를 인산 완충액으로 세척한 후, 우혈청 알부민 (Bovine Serum Albumin; BSA)을 1 mg/ml 포함한 무혈청 DMEM 배지 (HyClone)를 넣고 37℃, 5% 이산화탄소 항온기에서 30분간 방치하여 세포에 기 존재하는 내인성 트랜스페린을 제거 하였다. 인산 완충액으로 다시 세척한 후, 시험물질 및 형광이 표지된 인간 트랜스페린 Alexa Fluor® 647 (Life Technologies)를 각각 133 nM 및 5 ㎍/mL 농도가 되도록 1 mg/mL BSA를 포함하는 무혈청 DMEM 배지에 혼합한 후, 이 혼합액을 상기 기술에 의하여 준비된 HepG2 세포에 처리한 후 37℃, 5% 이산화탄소 항온기에서 30분간 방치하였다. 차가운 인산완충액으로 배지 속에 남아있는 단백질 시료를 세척하고 형광 측정기를 이용하여 트랜스페린 수용체에 결합된 형광-트랜스페린의 양을 측정하였다. 형광 측정은 650 nm에서 광원을 주고 668 nm에서 나오는 형광의 세기를 측정하였다.
상기 실시예 <3-4>에서 제조된 G-CSF(T116C)-Tf의 holo 형태의 트랜스페린 수용체 결합력을 <도 8>에 나타내었다. <도 8>에서 보는 바와 같이, 실험 결과 G-CSF-Tf와 G-CSF(T116C)-Tf 융합 단백질의 트랜스페린 수용체 결합력은 천연형 인간 홀로-트랜스페린 (Holo-transferrin, SIGMA)과 유사한 결합력을 나타내었다. 이러한 결과는 G-CSF-Tf와 G-CSF(T116C)-Tf 융합 단백질은 인간 트랜스페린 처럼, 트랜스페린 수용체와 결합으로 생체에서 재활용되는 과정을 통해 생체 반감기가 증대됨을 반영한다.
< 실시예 5> G- CSF 변이 단백질들의 생물학적 활성 측정
정제된 G-CSF-Tf 변이체 단백질들의 생물학적 활성도 측정은 1.25% DMSO에 의해 분화 유도된 HL-60 세포의 증식 정도를 측정하여 비교하였다.
<5-1> 인간 골수 기원 세포주인 HL -60의 준비 및 처리
본 발명에 사용된 인간 골수 기원의 세포주인 HL-60 세포는 한국생명공학연구원 미생물자원센터 (KCTC)로부터 분양받아 실험에 이용하였다. 상기 세포주를 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI-1640 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에서 배양하였으며, 2일-3일 간격으로 새로운 배지로 교체하였다. 세포는 부착 의존성이지 않다. 세포 배양과 관련된 시약은 하이클론 (HyClone) 사에서 구입하였다.
<5-2> G- CSF 변이 단백질들의 세포 증식 활성 측정
세포의 수를 계수하여 약 2 x 105 cells/mL 이 되도록 조정한 후, 분화 유도 물질인 DMSO (dimethylsulfoxide, culture grade, SIGMA)를 최종 1.25% (v/v)가 되도록 첨가하여 3일 동안 배양하여 과립구 계열로 분화하도록 유도하였다. 시험 물질을 첨가하기 전에, 상기 세포주를 원심 분리하여 수확하고 인산완충용액 (D-PBS)으로 세척한 다음, 96-웰 플레이트(CORNING)의 각 웰에 100 μL씩 넣어 웰 당 약 4 x104 세포가 되도록 분주하였다.
대조군으로 사용되는 폐길화 인간 G-CSF (GenScript)와 천연형 G-CSF (GenScript), 시험물질인 G-CSF-Tf, G-CSF(T116C)-Tf, G-CSF(T116C) 단백질들을 각각 탈염 버퍼(5mM Sodium Phosphate, 5% Sucrose, 0.004% Tween-20) 중에 희석하여 분화된 세포주 HL-60이 들어있는 각 웰에 농도별로 첨가한 후 72시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 최종 농도는 300, 200, 100, 30, 15, 3, 0.3, 0.03 ng/mL 이 되도록 하였다.
시험물질 투여에 의한 세포의 증식 정도를 알아보기 위해 CellTiter96TM (Promega) 용액 15 μL를 각 웰(well)에 첨가하고, 4시간 동안 배양하였다. 이후, solublization/Stop solution 100μL를 각 웰에 참가하여 반응을 정지하였다. ELISA 흡광기 (TECAN)를 이용하여 발색된 각 웰의 흡광도를 570 nm 파장에서 측정하여 증가한 세포주의 숫자를 측정하고 분석하였다. 시험물질들의 세포 증식 활성도는 G-CSF에 동량으로 농도를 환산하여 나타내었다.
G-CSF, PEG.G-CSF, G-CSF(T116C), G-CSF-Tf, G-CSF(T116C)-Tf의 세포 증식 활성도를 <도 9>에 나타내었다. <도 9>에서 보는 바와 같이, G-CSF(T116C)는 천연형 G-CSF에 비하여 세포 증식 활성도가 떨어졌으며, 페길화 G-CSF와 유사한 세포 활성도를 보였다. 그러나, G-CSF(T116C) 변이 단백질을 트랜스페린에 융합한 G-CSF(T116C)-Tf 융합 단백질은 G-CSF(T116C)에 비하여 세포 증식 활성도가 크게 증대되었으며, 페길화 G-CSF보다 훨씬 세포 증식 활성도가 증대되었다. 따라서, G-CSF(T116C)-Tf는 현재 시판되고 있는 페길화 G-CSF보다 높은 세포 활성도를 가짐으로써, G-CSF가 적용되는 치료에 사용시 약물학적 의미를 갖을 것으로 기대된다.
< 실시예 6> 혈액 내 단백질분해효소들에 대한 분해 저항성 측정
본 발명의 G-CSF(T116C) 변이 단백질의 혈액 내 단백질분해효소에 대한 분해 저항성 정도를 측정하기 위하여, 단백질을 인간 혈청 (Serum)과 반응 후, 정해진 시간에 혈청 내에 잔존하는 G-CSF의 양을 측정하였다.
<6-1> 인간 혈청과 G- CSF 단백질과의 반응
본 발명의 G-CSF 변이 단백질의 안정성이 혈액 내 단백질분해효소에 대한 분해 저항성과 밀접한 관련성이 있는지를 측정하였다. 인간 혈청 (SIGMA)을 56℃에서 약 30분간 불활성화시킨 후 2.8 μg/ml 의 단백질 시료를 24 : 1 (v/v) 비율로 37℃ 조건에서 반응시켰다. 반응시간 조건은 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18 시간이며, 각 시간대마다 시료에 각각 Complete protease inhibitor cocktail (Roche)을 처리한 후 -70℃ 에 보관하여 반응을 종료시켰다.
<6-2> 잔존 G- CSF 단백질의 양 측정
인간 혈청과 반응시킨 후, 남아있는 G-CSF의 양은 얼음에서 시료를 해동시킨 후 Sandwich ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)를 통해 수치화하였다. 표준액에 대한 단백질 농도에 따른 흡광도의 검량선을 작성하여 회귀분석을 통해 검액 중의 G-CSF 단백질 함량을 결정하였다.
토끼 다클론 항 G-CSF 항체 (KOMA BIOTECH)가 약 2 μg/ml 농도로 코팅된 High protein binding microtiter plate (Corning)를 준비하였다. Blocking buffer 는 1% Casein sodium salt 이 포함된 1X 인산완충액을 이용하고, 표준액 및 검액은 Blocking buffer를 10배로 희석시킨 완충액에 섞어 준비한다. 단백질 시료 및 시약은 웰당 100 μl씩 분주하고, 각 단계마다 웰당 300 μl의 세척액 (1X PBS, 0.05% Tween-20)를 3회씩 처리하여 반응하지 않은 시료를 세척하였다. 단백질 시료 및 검출 항체 (토끼 다클론 항-G-CSF 항체, KOMA BIOTECH)를 차례로 상온에서 약 2시간 처리한 후 Streptavidin-horseradish peroxidase (Pierce)를 37℃에서 약 30분간 반응시켰다. 기질 (TMB(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine), Pierce)를 처리하고 상온에서 약 7 ~ 10 분간 기다린 후 2 M 황산으로 발색반응을 종료시켰다. 마이크로플레이트 흡광계 (TECAN)를 이용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
흡광도에 따른 농도환산은 표준액에 대한 단백질 농도-흡광도의 검량선에 기준하여 계산하였다. 표준곡선은 엑셀 프로그램을 이용하여 작성하였다. 각 G-CSF 표준액에 해당하는 흡광도의 평균값과 완충액만을 처리한 웰의 흡광도의 차이값을 이용하여 작성하였다. 검액 농도의 결정은 각 시료의 흡광도 수치가 표준액의 검량선 범위 내에 포함될 때에만 유효하며, 상관계수(R2)을 루트(√)로 계산한 절대값 (│R│)기준은 0.98 이상으로 지정하였다. 잔존 G-CSF 단백질 양 (% G-CSF) 은 반응시간이 0 h 일 때의 G-CSF 단백질 농도 (pg/ml) 를 100% 로 기준하여 표기한다.
G-CSF, G-CSF(T116C)의 시간대별 잔존 G-CSF 양(%)을 <도 10>에 나타내었다. G-CSF(T116C) 단백질은 천연형 인간 G-CSF보다 15시간 이후부터, 잔존 G-CSF(T116C)의 양이 천연형 인간 G-CSF 대비 약 30% 이상 높았다. Cys116와 Cys17 간의 이황화 결합 형성이 단백질의 혈중 단백질분해효소에 대한 저항성 증대에 도움을 주는 것을 알 수 있다.
< 실시예7 > G- CSF 변이 단백질들의 생체 내 반감기 측정
본 발명의 G-CSF 변이체 및 이의 트랜스페린 융합 단백질이 생체에 투여되었을 때, 단백질의 생체 반감기를 결정하기 위하여 생쥐에서 단백질을 투여 후 혈청내에 존재하는 G-CSF의 양을 측정하였다. 상기 기술된 "생체 내 반감기"는 "혈장 내 단백질의 반감기" 즉, G-CSF 단백질이 혈장 내에서 순환하면서 초기 농도에서 약 50% 남아있는 시간대를 수치화하여 나타낸다. 약물동역학적 계산은 PKsolver v2.0을 사용하여 수행하였다.
<7-1> G- CSF 변이 단백질들의 동물 투여 시험
본 발명의 G-CSF 변이 단백질 및 이의 트랜스페린 융합 단백질이 체내에 남아있는 기간을 측정하기 위해 동물실험을 실시하였다. 실험동물의 구입, 사육, 투여 및 혈액 채취 등의 전 과정을 (주) 큐베스트컨설팅에 의뢰하여 수행하였다.
실험동물은 6 주령의 ICR, 특정병원체 부재동물 (SPF) 수컷 생쥐 (mouse)를 (주)샘타코로부터 구입하여 사용하였다. 최소 6일 간의 순응기간을 거쳐 검역 및 순화기간 종료일에 개체 별 체중을 측정하였으며, 이때의 체중을 기초로 하여 체중증가 및 일반증상에 이상이 없는 건강한 동물을 선발하여 각 군의 평균 체중이 가능한 한 균등하도록 (동물당 35 ~ 45 g) 무작위로 배치하여 각 시험군당 6마리씩 구성하였다.
시험물질 투여 당일에 투여직전 측정한 체중에 근거하여 개체 별 투여액량을 환산 (5 mL/kg)한 후, 체중 (kg) 당 20㎍ G-CSF 변이체 또는 100 ㎍ G-CSF 변이체의 트랜스페린 융합 단백질을 1회용 주사기 (1 mL, 26G needle)로 취하여 미정맥 (Intravenous Bolus)에 천천히 주입하였다. 투여일을 시험 1일차 (Day 1)로 정의하였다.
주사 후 0.25, 0.5, 1, 3, 6, 12, 24, 48 및 72시간에서 동물에서 혈액을 안와채혈로써 채취되었다. 채혈 후 혈액은 10,000 ~ 13,000 rpm 에서 1 ~ 2 분간 원심 분리하여 혈장을 분리한 후 분리된 혈장을 시험구분, 동물번호 및 채혈시간이 표시된 1개의 tube에 각각 약 ~ 50 μL/tube 씩 담아 분석일까지 초저온 냉장고 (약 -70℃)에 보관하였다.
<7-2> G- CSF 변이 단백질들의 마우스 약물동태학
혈장 내 활성 G-CSF의 양은 얼음에서 시료를 해동시킨 후 ELISA를 통해 수치화하였다. ELISA를 통한 혈장 내 G-CSF 의 정량은 Human G-CSF ELISA Kit, pink-ONE (Koma biotech.)을 구입하여 수행하였으며, 실험방법은 해당 시약의 매뉴얼에 따라 진행하였다. 표준액에 대한 단백질 농도에 따른 흡광도의 검량선을 작성하여 회귀분석을 통해 검액 중의 G-CSF 변이 단백질들의 함량을 결정하였다.
각 시험 화합물의 평균 농도-시간 프로파일로부터 비구획 약동학 분석을 PKsolver v2.0 프로그램에 IV Bolus non-compartment analysis input을 적용하여 수행한다. 약동학 파라미터는 말단 반감기(t1 /2)를 평가한다.
단백질들의 혈장내 단백질의 반감기를 하기 <도 11>에 나타내었다. <도 11>에서 보는 바와 같이 G-CSF(T116C) 변이 단백질은 천연형 인간 G-CSF와 유사한 혈중 반감기를 보였다. 이는 G-CSF와 유사한 단백질 반경을 갖고 있기 때문에, 신장에서의 여과 속도가 유사함을 보여 주는 결과이다. G-CSF-Tf 단백질은 G-CSF에 비하여 개선된 혈중 반감기를 나타내었다. 이는 G-CSF 단백질에 트랜스페린를 융합함으로서 단백질의 반경이 커짐으로서 신장 여과 속도가 현저히 낮아진 결과이다. G-CSF(T116C) 단백질을 트랜스페린에 융합한 G-CSF(T116C)-Tf 융합 단백질은 G-CSF-Tf 단백질보다 반감기가 더욱 증대되었으며, 페길화 G-CSF와 유사한 반감기를 보였다. 이는 혈중 단백질분해효소에 대한 저항성이 증대된 G-CSF(T116C) 변이 단백질을 트랜스페린에 융합시킴으로서, 신장 여과 속도의 감소와 혈중 안정성이 모두 개선됨으로서 생체에서의 혈중 반감기가 극대화되어 나타난 결과이다 (도 11).
< 실시예 8> G- CSF 변이 단백질들의 백혈구 감소증 렛트에서의 약력학
본 발명의 단백질들의 약동학적 지표를 구하기 위하여 백혈구 감소증 렛트 (Neutropenic Rat) 질환모델을 이용해 혈액학 분석을 실시하였다. 실험동물의 구입, 사육, 투여 및 혈액학적 분석 등의 전 과정을 ㈜ 큐베스트에 의뢰하여 수행하였다. 혈액학적 분석항목은 WBC, NEU, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT, Diffential leucocyte count 등을 포함한다.
5주령의 SPF Sprague Dawley 수컷 랫트 (샘타코)는 최소 5일 간의 순응기간을 거쳐 무작위적으로 4 그룹으로 배당된다. 개체별 체중 범위는 350 ~ 400 g 이다. 시험물질 투여 1일 전에 Cyclophosphamide (90 mg/kg) 를 복강으로 1회 투여하여 백혈구 감소증 (Neutropenic)을 유발한 SD Rat 에게 과립구 콜로니 자극 인자 G-CSF를 미정맥으로 1회 투여한 후 5일간의 혈액학 검사를 실시하였다. 시험 화합물은 부형제 (Phosphate Buffered Saline)에서 0.004 mg/mL의 최종 농도로 희석한다. 시험물질은 투여 당일 투여직전에 측정한 체중에 근거하여 개체 별 투여액량을 환산 (2 mL/kg)한 후, 1회용 주사기(1 mL, 26G needle)로 취하여 미정맥 (Intravenous Bolus)에 천천히 주입한다. 투여일을 시험 1일차 (Day 1)로 정의하였다.
투여 전 및 투여 후 6, 12, 24, 48 및 72시간에서 1회용 주사기 (1 mL, 26G needle)를 이용하여 경정맥에서 채혈 (약 200 ㎕)을 실시한다. 채혈 후 즉 시 혈액이 굳지 않도록 항응고제 (5% sodium EDTA)가 처리된 튜브에 보관하고, 3시간 이내에 냉장상태에서 자동혈액분석기를 이용하여 혈액 내 성분을 분석하였다. 측정 결과는 평균치와 표준편차로 나타내며, 일원배치 등분산분석(One-way ANOVA) 검정 및 Dunnett 검정을 이용하여 대조군과 각각의 투여군간 차이를 GraphPad Prism을 사용하여 통계적으로 비교하였다.
G-CSF-Tf 및 이의 변이 단백질들의 투여 후 시간에 따른 호중구 수치의 변화를 <도 12> 에 나타내었다. <도 12> 에서 시험물질 간의 투여 후 호중구 (Neutrophil) 수치를 비교한 결과, 6, 12 시간차에서 G-CSF(T116C)-Tf 투여군이 G-CSF 와 페길화 G-CSF 투여군보다 더 높은 호중구 절대값을 나타냄을 확인하였다 . G-CSF의 경우 24시간차에 호중구 절대값은 대조군에 비하여 다소 높았으나 유의적 차이는 없던 반면, 페길화 G-CSF와 G-CSF(T116C)-Tf은 Cyclophosphamide 유발 백혈구 감소증 렛트 질환모델에서 투여 후 24 시간까지 백혈구 (White blood cell, WBC) 및 호중구 (neutrophil) 수치를 증가시키는 효과를 관찰하였다. G-CSF(T116C)-Tf 융합 단백질은 트랜스페린을 매개로 생체에서 순환하면서 G-CSF보다 생체 내 활성유지기간이 증대되었고 페길화 G-CSF와 유사함을 보였다. 반면 약동학적 파라미터 (Cmax 및 AUC0-t) 값이 페길화 G-CSF 보다 높게 측정된 것은 <도 9>에서 보는 바와 같이 페길화 G-CSF 보다 동일 시간 내 더 많은 neutrophilic precursor cell을 증식시킨 결과로 판단된다.(도 12)
본 발명으로 유도된 물질은 임상적으로 사용되고 있는 G-CSF의 생물학적 효능을 가지고 있으므로, 허혈성 질환의 치료에 사용되거나, 호중성 과립구 형성 (neutrophil granulopoiesis)을 자극하여, 암 화학치료 및 방사선 치료로 발생한 호중구 감소증 (neutropenia)에 의한 감염성 합병증 예방을 위한 항암 보조제로 사용될 수 있다.
<110> EQUIS&ZAROO <120> Pharmaceutical compositions comprising mutant proteins of Granulocyte-colony stimulating factor or transferrin fusion proteins thereof <130> 2014p-07-033 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> G-CSF protein <400> 1 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45 Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 <210> 2 <211> 679 <212> PRT <213> Transferrin protein <400> 2 Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala 1 5 10 15 Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser 20 25 30 Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys 35 40 45 Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala 50 55 60 Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val 65 70 75 80 Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr 85 90 95 Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu 100 105 110 Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp 115 120 125 Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys 130 135 140 Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro 145 150 155 160 Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly 165 170 175 Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe 180 185 190 Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser 195 200 205 Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu 210 215 220 Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp 225 230 235 240 Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met 245 250 255 Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu 260 265 270 His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro 275 280 285 His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys 290 295 300 Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val 305 310 315 320 Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr 325 330 335 Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg 340 345 350 Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys 355 360 365 Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly 370 375 380 Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly 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ggtgtgcgct gagccaccac gagaggctca agtgtgatga gtggagtgtt 1080 aacagtgtag ggaaaataga gtgtgtatca gcagagacca ccgaagactg catcgccaag 1140 atcatgaatg gagaagctga tgccatgagc ttggatggag ggtttgtcta catagcgggc 1200 aagtgtggtc tggtgcctgt cttggcagaa aactacaata agagcgataa ttgtgaggat 1260 acaccagagg cagggtattt tgctgtagca gtggtgaaga aatcagcttc tgacctcacc 1320 tgggacaatc tgaaaggcaa gaagtcctgc catacggcag ttggcagaac cgctggctgg 1380 aacatcccca tgggcctgct ctacaataag atcaaccact gcagatttga tgaatttttc 1440 agtgaaggtt gtgcccctgg gtctaagaaa gactccagtc tctgtaagct gtgtatgggc 1500 tcaggcctaa acctgtgtga acccaacaac aaagagggat actacggcta cacaggcgct 1560 ttcaggtgtc tggttgagaa gggagatgtg gcctttgtga aacaccagac tgtcccacag 1620 aacactgggg gaaaaaaccc tgatccatgg gctaagaatc tgaatgaaaa agactatgag 1680 ttgctgtgcc ttgatggtac caggaaacct gtggaggagt atgcgaactg ccacctggcc 1740 agagccccga atcacgctgt ggtcacacgg aaagataagg aagcttgcgt ccacaagata 1800 ttacgtcaac agcagcacct atttggaagc aacgtaactg actgctcggg caacttttgt 1860 ttgttccggt 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gtgtggtctg gtgcctgtct tggcagaaaa ctacaataag 1860 agcgataatt gtgaggatac accagaggca gggtattttg ctgtagcagt ggtgaagaaa 1920 tcagcttctg acctcacctg ggacaatctg aaaggcaaga agtcctgcca tacggcagtt 1980 ggcagaaccg ctggctggaa catccccatg ggcctgctct acaataagat caaccactgc 2040 agatttgatg aatttttcag tgaaggttgt gcccctgggt ctaagaaaga ctccagtctc 2100 tgtaagctgt gtatgggctc aggcctaaac ctgtgtgaac ccaacaacaa agagggatac 2160 tacggctaca caggcgcttt caggtgtctg gttgagaagg gagatgtggc ctttgtgaaa 2220 caccagactg tcccacagaa cactggggga aaaaaccctg atccatgggc taagaatctg 2280 aatgaaaaag actatgagtt gctgtgcctt gatggtacca ggaaacctgt ggaggagtat 2340 gcgaactgcc acctggccag agccccgaat cacgctgtgg tcacacggaa agataaggaa 2400 gcttgcgtcc acaagatatt acgtcaacag cagcacctat ttggaagcaa cgtaactgac 2460 tgctcgggca acttttgttt gttccggtcg gaaaccaagg accttctgtt cagagatgac 2520 acagtatgtt tggccaaact tcatgacaga aacacatatg aaaaatactt aggagaagaa 2580 tatgtcaagg ctgttggtaa cctgagaaaa tgctccacct catcactcct ggaagcctgc 2640 actttccgta gaccttaa 2658

Claims (16)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF)의 116번째 아미노산인 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질(G-CSF 변이 단백질)의 말단에, 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 트랜스페린은 아미노말단 부위의 신호 펩타이드가 제거된 것인 융합 단백질.
  6. 제 4항의 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 호중구 감소증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 4항의 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 항암 치료 보조제.
  8. 제 4항의 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제 4항의 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 단백질을 암호화 하는 유전자는 유전자 내 제한 효소 인식 부위의 염기서열을 상기 염기서열이 암호화 하는 아미노산과 동일한 아미노산을 암호화 하는 다른 염기서열로 치환한 것인 발현벡터.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 내의 BamHI 제한 효소 인식 부위 염기서열(GGATCC)의 타이민 (Thymine)을 사이토신 (Cytosine)으로 치환한 것인 발현벡터.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 말단에 제한효소 인식부위를 추가적으로 포함하는 것인 발현벡터.
  13. 제 9항에 있어서, 상기 발현 벡터는 서열번호 6, 7, 8 및 21로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  14. 제 9항의 발현벡터가 대장균, 효모, 곰팡이, 식물세포 및 인간을 제외한 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 숙주세포에 도입된 형질전환체.
  15. 삭제
  16. 제 4항의 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 대장균, 효모, 곰팡이, 식물세포 및 인간을 제외한 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 숙주세포에 도입한 형질전환체로부터 상기 융합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 단백질 제조 방법.
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