JP6535361B2 - 改変ノッチンペプチドを含む融合タンパク質及びその使用 - Google Patents

Description

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１０年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６１／４１１,３５０号
に基づく優先権を主張し、参照することにより前記仮特許出願の全体が本明細書に含まれ
るものとする。

［政府支援の陳述］
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約ＣＡ１５１７０６の下で政府支援によ
ってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

［配列表への言及］
本国際出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩ形式で提出している配列を含み、参照
することによりその全体が本明細書に含まれるものとする。この配列表は、２０１１年１
１月７日に作成され、６１,４４０バイトの大きさを有し、“381593pct.txt”と名付けら
れている。

本発明は、タンパク質工学の分野に関し、ノッチンペプチド、すなわち、特に詳細に明
らかにされた骨格及び高い安定性を有し、本技術分野でシスチンノット・ミニタンパク質
とも呼ばれるペプチドの分野に関する。

［関連技術］
発明の詳細な説明において言及される技術的特徴に関し得るため、本発明の特定態様に
関する背景情報を下に示すが、詳細に説明する必要はない。つまり、本発明で使用される
個別の部分又は方法は、下記で論じる材料において更に詳細に説明でき、これら材料は、
当業者に対し、特許請求の範囲に記載された本発明の特定態様を創出する又は使用するた
めの更なる案内を提供し得る。下記の論述は、本願のあらゆる請求項又は記載される材料
の先行技術的効果に対する情報の関係性についての同意として解釈されるべきでない。

タンパク質−タンパク質相互作用は、生体のほぼ全ての過程及び遺伝子の複製を媒介し
、組み換えは、タンパク質機能の進化にとって重要であると考えられる。指向進化はタン
パク質の最適化にとって計り知れないほど貴重なツールであるが、試験管内での進化スト
ラテジーは、一般に、対象のタンパク質の活性部位又は結合部位を直接的に操作すること
に焦点を合わせる。タンパク質機能の指向進化における遺伝子の複製及び組み合わせの力
を利用する例は限られている。

特異的な分子認識事象は、生体においてリガンドと受容体との間の相互作用を規定する
。これら相互作用は、多くの生物学的過程を媒介し、多数の生理学的過程における分子認
識の重要性を強調する。分子認識の操作は、タンパク質に基づくバイオセンサー、イメー
ジング剤、及び治療薬候補を開発するためにバイオテクノロジー分野で幅広く用いられて
いる。認識の増強を図るための従来方法は、特異的相互作用を最適化すること、例えば、
天然のタンパク質−タンパク質相互作用の抗体認識又は親和性成熟を増強すること、に焦
点を合わせる。しかしながら、事実上、分子認識は、しばしば複数のドメインの境界面で
起こり、遺伝子組み換えによるタンパク質ドメインの結合は、タンパク質機能の進化に強
力な役割を果たすと考えられる。この方法を生体外でのタンパク質機能の操作に用いた文
献は数例である。既存の例は、完全に人工的な相互作用を進化させることか、又はタンパ
ク質−ペプチド相互作用を最適化することに限られている。従来の指向進化研究がタンパ
ク質の自然進化を理解する手掛かりを与えてきたのと同様に、ドメインの付加及び進化の
自然のやり方を利用することは、自然進化経路を調査するための新たな手段を提供するで
あろう。更に、既存の高親和性タンパク質−タンパク質相互作用を増強することに焦点を
合わせるドメインの付加及び進化の詳細解析は、分子認識の研究及びタンパク質操作ツー
ルとしての使用に対する本方法の有用性の厳密な検査を提供するであろう。

［具体的な特許及び出版物］
ノッチンは、様々なノッチンペプチドの配列及び構造を提供するノッチンデータベース
ｈｔｔｐ：／／ｋｎｏｔｔｉｎ．ｃｂｓ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／Ｋｎｏｔｔｉｎｓ．ｐｈｐに
記載されている。

２０１０年３月９日に特許された、“速度論的に制御されたライゲーションによるタン
パク質の収束合成”と題されたＫｅｎｔらの米国特許第７,６７４,８８１号明細書は、Ｅ
ＥＴＩ−ＩＩの合成を開示する。

“Ａｘｌ癌遺伝子”と題されたＬｉｕの米国特許第５,４６８,６３４号明細書は、ａｘ
ｌ癌遺伝子活性を示す哺乳動物ａｘｌ受容体をコードする単離ＤＮＡ配列を開示する。

２００９年１０月１５日に公開された、「インテグリン結合性改変ペプチド」と題され
たＣｏｃｈｒａｎらの米国特許出願公開第２００９／０２５７９５２号明細書は、フィブ
ロネクチンの細胞表面受容体（α５β１インテグリン）又はビトロネクチンの細胞表面受
容体（αｖβ３インテグリン及びαｖβ５インテグリン）に対して高い親和性（低い平衡
解離常数(Ｋ_Ｄ)）で結合するように操作したペプチドを開示する。

下記概要は、本発明の特徴及び態様を全て包含することを意図するものでなく、本発明
が本概要で論じる特徴及び態様を全て包含しなければならないことを暗示するものでもな
い。簡潔にするため、選択的な組み合わせ又は部分組み合わせが明確に列挙されていなく
とも、様々な実施形態の特定の特徴を組み合わせ得ることを理解できる。

従って、特定の態様において、本発明は、（ａ）第一の標的に結合するための結合ルー
プを中に有するノッチンポリペプチドと、（ｂ）第二の標的に結合するための配列を中に
有する第二ポリペプチドであって、（i）該第二の標的に結合する細胞表面受容体か又は
（ii）該第二の標的に結合する細胞表面受容体リガンドである第二ポリペプチドと、を含
む。ノッチンについて知られるように、結合ループは、典型的に、束縛されたシステイン
残基間に存在する。これらループは、ランダム化配列のライブラリーを調製することによ
って改変することができる。本態様において、ノッチンポリペプチドは、その結合ループ
内に非天然配列を含有する。つまり、前記配列は、ノッチンに天然に存在しない；好まし
くは、前記配列は、高度な結合に対するスクリーニング手法によって選択される。本発明
の特定の態様では、融合タンパク質が、細胞とそれを取り囲む組織との間の接着を媒介す
る非天然配列を含有するであろう。本発明の特定の態様では、ノッチンポリペプチドが、
（ａ）αｖβ３インテグリン、（ｂ）αｖβ５インテグリン、及び（ｃ）α５β１インテ
グリンのうちの１又は２以上との結合を媒介する配列を含有する。本発明の特定の態様で
は、融合タンパク質が、受容体型チロシンキナーゼの細胞外ドメインである第二ポリペプ
チドを含む。本発明の特定の態様では、前記第二ポリペプチドが、受容体型チロシンキナ
ーゼのＩｇ１ドメインである。本発明の特定の態様では、前記Ｉｇ１ドメインが、Ａｘｌ
受容体、ＭｕＳＫ受容体、又はＦＧＦ受容体に由来する。本発明の特定の態様では、前記
受容体型チロシンキナーゼがＡｘｌ受容体である。本発明の特定の態様では、前記ノッチ
ンポリペプチドが、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ及びアガトキシンからなる群より選択され
る。本発明の特定の態様では、融合タンパク質が、（ａ）αｖβ３インテグリン、（ｂ）
αｖβ５インテグリン、及び（ｃ）α５β１インテグリンのうちの１又は２以上と結合す
るように操作されている結合ループドメインを有する。

本発明の特定の態様では、融合タンパク質が、（ａ）インテグリンに対して高い親和性
を有する結合ループを含む、ＥＥＴＩ−ＩＩ又はＡｇＲＰノッチンポリペプチドと、（ｂ
）（i）Ａｘｌ細胞外ドメイン、及び（ii）肝細胞増殖因子のＮＫ１断片からなる群より
選択されるポリペプチドと、を含む。

本発明の特定の態様は、（ａ）ＤＮＡ構築物内に前記融合タンパク質及び多数のランダ
ム化ＤＮＡ配列をコードする多数のＤＮＡ構築物を有するライブラリーを調製する工程と
、（ｂ）該ライブラリーの該ＤＮＡ構築物を酵母で発現させ、発現したＤＮＡ構築物が該
酵母表面上にランダム化配列を有するポリペプチドとして提示される工程と、（ｃ）クロ
ーンを標的と接触させることによって、該発現したＤＮＡ構築物と第一の標的又は第二の
標的との結合について該クローンをスクリーニングする工程と、（ｄ）該標的と高い親和
性で結合する翻訳されたＤＮＡ構築物を発現するクローンを選択する工程と、（ｅ）該選
択されたクローンのコード配列を得ることによって、前記融合タンパク質を調製すること
ができる工程と、を具える、融合タンパク質を調製する方法を含む。

本発明の特定の態様は、(ａ)（i）阻害される受容体の細胞外ドメインをコードするポ
リペプチドと、（ii）阻害される受容体でない細胞表面受容体に結合するように操作され
たループドメインを有するノッチンポリペプチドと、を含む一定量の可溶性融合タンパク
質を投与する工程を具える、受容体に対するリガンドの結合を阻害する方法を含む。

様々な前記方法の特定の態様では、前記チロシンキナーゼがＴＡＭ受容体型チロシンキ
ナーゼである。

特定の態様において、本発明は、改変ノッチン部分と、好ましくは受容体、受容体リガ
ンド又は該天然分子の結合特性を有するそれらの断片である別の結合部分とを含有する、
二重特異性又は多重特異性の融合タンパク質を調製する方法を含む。このように調製され
る融合タンパク質は、２個の異なる結合部分と２個の異なるリガンドとを有する。ノッチ
ン部分は、そのＣ末端で、結合部分のＮ末端と融合する。あるいは、ノッチン部分は、そ
のＮ末端で結合部分のＣ末端と融合してもよい。

特定の態様において、本発明は、（ａ）前記融合タンパク質及び多数のランダム化ルー
プドメインをコードする多数のＤＮＡ構築物を有し、一定の結合多様性とライブラリーか
ら選択される多数の強力な結合体とを提供するライブラリーを調製する工程、（ｂ）ライ
ブラリー中のＤＮＡ構築物をタンパク質変異型として発現させる工程と、（ｃ）第二結合
パートナーに対するタンパク質変異型の結合についてライブラリーをスクリーニングする
工程と、（ｄ）第二結合パートナーに高い親和性で結合するＤＮＡ構築物を発現するクロ
ーンを選択する工程と、（ｅ）選択したクローンのコード配列を得る工程とを具え、これ
によって融合タンパク質を調製することができる、第二結合パートナーに対して高い親和
性で結合するように操作されたループドメインを有する第二ポリペプチド（例えば、ノッ
チン）に融合する第一結合パートナー（例えば、受容体又は受容体リガンド）に結合する
第一ポリペプチドを含む融合タンパク質を調製する方法を含む。選択される第二結合パー
トナーは、完全に異なる分子（タンパク質、糖タンパク質、多糖、脂質、細胞構造体、ウ
イルスエピトープ等）であっても、又は第一結合パートナー（受容体若しくは受容体リガ
ンド）に対する結合部位上の異なるエピトープであってもよい。特定の態様において、本
発明は、受容体断片である第一ポリペプチドを利用する。例えば、様々なドメインを有す
る細胞表面受容体を、細胞外リガンド結合ドメインをコードする断片の形態で用いる。細
胞表面受容体は、受容体型チロシンキナーゼでもよい。本発明の特定の態様では、第一ポ
リペプチドが、受容体リガンドであっても、又は受容体に結合する該リガンドの断片であ
ってもよい。リガンドは、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよい。第一ポ
リペプチドは、Ａｘｌ、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体及びＧａｓ６か
らなる群より選択される配列の少なくとも一部分である配列を有し得る。

本発明の特定の態様では、第二ポリペプチドが、ノッチン足場であり、ＥＥＴＩ−ＩＩ
、ＡｇＲＰ及びアガトキシンからなる群より選択され得る。ノッチン足場がω−コノトキ
シンであり得ることも考えられる。本発明の特定の態様では、ノッチンループドメインが
インテグリンに結合するように操作されている。本発明の特定の態様では、前記方法が、
対象の標的との結合について選択されたループ部分を有するランダム酵母ディスプレイラ
イブラリーをクローン化する工程を具える。

特定の態様において、本発明は、受容体リガンドポリペプチドを含む融合タンパク質を
含み、前記受容体リガンドは、特異的受容体結合部位で受容体と結合し、受容体リガンド
に対する特異的受容体結合部位でない結合パートナーに高い親和性で結合するように操作
されたループドメインを有するノッチンポリペプチドに融合されている。本発明の特定の
態様では、前記受容体リガンドポリペプチドが天然リガンドの断片である。本発明の特定
の態様では、前記融合タンパク質が、第一クリングルドメインでＨＧＦアミノ末端を構成
する、肝細胞増殖因子のＮＫ１断片のような増殖因子断片である断片を含む。

本発明の特定の態様は、受容体ポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、前記受容体
は、特異的リガンド結合部位でリガンドに結合し、特異的リガンド結合部位でない結合パ
ートナーに高い親和性で結合するように操作されたループドメインを有するノッチンポリ
ペプチドに融合されている。受容体型チロシンキナーゼは、固形腫瘍進行に関与する受容
体型チロシンキナーゼであるＡｘｌ及び肝細胞増殖因子受容体であるＭＥＴからなる群よ
り選択され得る。受容体型チロシンキナーゼは、Ｔｙｒｏ−３及びＭｅｒのような、Ａｘ
ｌの近縁種である近縁な受容体型チロシンキナーゼを含み得る。

本発明の特定の態様では、前記融合タンパク質が、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ及びアガ
トキシンからなる群より選択されるノッチンポリペプチドを含む。本発明の特定の態様で
は、前記融合タンパク質が、α_５β_１インテグリン、α_ｖβ_３インテグリン又はα_ｖβ_５
インテグリンのうちの少なくとも１つに結合するように操作されたループドメインを含む
。本発明の特定の態様では、前記ループドメインがβ_３インテグリンに結合するように操
作されている。本発明の特定の態様では、前記ループドメインがα_ｖインテグリンサブユ
ニット又はβ_３インテグリンサブユニットに結合するように操作されている。

Ａｘｌ細胞外ドメインの模式図である。 ＥＥＴＩ−ＩＩ結晶構造のリボンレンダリングである。 Ｇａｓ６リガンドに結合したＡｘｌ−ＥＥＴＩ−ＩＩ融合体の模式図である。 ＥＥＴＩ−ＩＩ−ａｘｌ融合体ライブラリー作成並びに融合体ＥＡ ７．０１、７．０３、７．０５、８．０４及び８．０５を得るためのスクリーニングの説明である。ループ１及びループ２両方ともランダム化されているのが分かる；Ａｘｌ１のＩｇ１配列の一部分のみが表示されている。これら配列は、ＡｘｌのＩｇ１部分の長さのため、短縮されている。 酵母提示構築物の模式図である。 野生型Ａｘｌ Ｉｇ１による結合と出発Ｅ−Ａｘｌライブラリーによる結合との比較を示す一組の散布図である。 ＥＡ−Ａｘｌライブラリーのスクリーニングの結果及び分取進行過程の一組の散布図である。 野生型Ａｘｌ Ｉｇ１、野生型ＥＥＴＩ−Ａｘｌ及びＥＡ（“ＥＥＴＩ−ＩＩ−Ａｘｌ”）変異体のＧａｓ６に対する平衡結合を示すグラフである。実験の代表データは、別々の日に３連で実施した。 野生型Ａｘｌ Ｉｇ１又はＥＡ変異体の可溶性Ｇａｓ６からの解離速度を示すグラフである。野生型Ａｘｌ Ｉｇ１は単一指数デコイモデルに充分にあてはまり、一方ＥＡ変異体は二重指数デコイモデルにあてはまった。実験の代表データは、別々の比に３連で実施した。 ＥＡ変異体中の個々のループの貢献を示す一連のグラフである。（図６Ａ）ＥＡ７．０１、（図６Ｂ）ＥＡ７．０６、（図６Ｃ）ＥＡ８．０４の野生型への復帰である。ｗｔＬ１又はｗｔＬ３は、それぞれロープ１又はループ３の野生型ＥＥＴＩ−ＩＩループ配列を指す。参考のために各プロットに野生型(ｗｔ)ＥＥＴＩ−Ａｘｌに対する持続的結合が示されており、ループ１とループ３の双方の野生型ＥＥＴＩ−ＩＩ配列への“復帰”を表す。データは別々の３日で実施した実験の平均値であり、エラーバーは±標準偏差である。 表面提示されたＡｇＲＰ−Ａｒａｓ４融合タンパク質の可溶性α_ｖβ_３インテグリン及びＭｅｔ受容体に対する結合を、ＡｇＲＰ７Ａ及びＮＫ１変異体Ａｒａｓ４と比較して示す一対の棒グラフである。 α_ｖβ_３インテグリン及びＭｅｔ受容体を発現する細胞に対する融合タンパク質ＡｇＲＰ７Ａ−Ａｒａｓ４の結合滴定を示す線グラフである。 Ａｘｌ−ＥＥＴＩ直接融合タンパク質のＧａｓ６に対する結合（図９Ａ）及びαｖβ３インテグリンに対する結合（図９Ｂ）を示す一対のグラフである。 ビトロネクチンでコーティングしたマイクロタイタープレートに対するＰＣ３腫瘍細胞接着の阻害を示すグラフである。ノッチン２．５Ｆ−Ｆｃ及び２．５Ｄ−Ｆｃ（Ｆｃ部分に融合したノッチン−インテグリン）は、低ナノモル範囲の濃度でＰＣ３細胞接着を阻害する。陰性コントロールは、無関係のタンパク質である。

［要約］
本発明は、異なる結合機能を提供する第二の異なるペプチド又はタンパク質と融合した
操作したノッチンペプチドを含む新規な融合タンパク質の創出を含む。第二ポリペプチド
は、受容体又は受容体リガンドである。好ましくは、ノッチンペプチドの一部分が、イン
テグリンに結合するように作成された配列で置き換えられている。加えて、融合タンパク
質は、ノッチンの適切な発現及び折り畳みを促す別のタンパク質に融合したノッチンペプ
チドを含み得る。

本発明は、受容体リガンド結合を増強するのに用い得る。リガンド−受容体相互作用に
関与する天然タンパク質は、治療薬候補の操作の有望な出発点である。タンパク質−タン
パク質相互作用の操作に関する従来のアプローチは、既存の相互作用を最適化することに
焦点を合わせてきた。しかしながら、本来、タンパク質−タンパク質相互作用は、しばし
ば、複数のドメインの接合部で起こり、遺伝子組み換えは、タンパク質機能の進化に強力
な役割を果たす。これらの知見を用いて、我々は、我々が“ドメインの付加及び進化”と
呼び、合成結合ドメインの付加及びそれに続く試験管内進化を通じて結合境界面を拡張す
ることによって増強を達成する、既存のタンパク質−タンパク質相互作用の操作に関する
遺伝的アプローチを開発した。

図１は、本発明の融合が、受容体−リガンド結合に対し別のエピトープを実際に付加す
ることを示す。図１Ａは、Ａｘｌ細胞外ドメインが、２個の免疫グロブリン様ドメイン（
Ｉｇ１及びＩｇ２）、そして２個のフィブロネクチンＩＩＩ型様（Ｆｎ）ドメインを含む
ことを示す。図１Ｂは、ＥＥＴＩ−ＩＩ結晶構造（ＰＤＢ番号２ＥＴＩ）を示す。ドメイ
ンの付加及び進化ライブラリー用にランダム化したループ１及び３は、黒色で示す。シス
テインＩ〜ＶＩを記す。図１Ｃは、ドメイン付加ストラテジーを示す概略図である。ＥＥ
ＴＩ−ＩＩ変異体ライブラリーは、Ａｘｌ Ｉｇ１のＮ末端（構造の左下へ向かう黒色リ
ボン）に結合され、Ｇａｓ６リガンド上の隣接エピトープに結合するＥＥＴＩ−ＩＩ変異
体をスクリーニングする。Ａｘｌ−Ｇａｓ６構造は、ＰＤＢ番号２Ｃ５Ｄから出典されて
いる。図１Ｄは、ランダム化したＥＥＴＩ−ＩＩのループＩ領域及びループ３領域並びに
Ａｘｌ Ｉｇ１ドメインへの融合を示すアミノ酸配列のリストを示す。図は、ＰｙＭｏｌ
を用いて作成した。

図２Ａ及び２Ｂは、酵母提示構築物及びＡｘｌに連結した出発Ｅ−Ａｘｌライブラリー
ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体（ランダム化ループ）の評価を示す。（２Ａ）酵母提示Ｅ−Ａｘｌ
構築物。対象のタンパク質は、酵母Ａｇａ１タンパク質にジスルフィド結合した酵母Ａｇ
ａ２タンパク質に対する遺伝的融合体として発現される。Ａｇａ１タンパク質が酵母細胞
壁に共有結合することによって、提示構築物全体を酵母細胞表面に連結する。酵母ディス
プレイにおけるＡｇａ１タンパク質及びＡｇａ２タンパク質の使用は、抗体の表面提示と
関連して既に報告されている。例えば、Ｋ．Ｄａｎｅ Ｗｉｔｔｒｕｐらによる“タンパ
ク質の酵母細胞表面ディスプレイ及びその使用”と題された米国特許第６４２３５３８号
明細書を参照されたい。

対照のタンパク質に隣接するＨＡエピトープタグ及びｃ−ｍｙｃエピトープタグは、市
販の抗体を用いて相対的酵母表面発現レベルについて染色することができる（参考のため
に示すｃ−ｍｙｃ染色）。可溶性Ｇａｓ６は、酵母提示タンパク質に対する結合を検査す
るのに用いることができる；Ｇａｓ６結合は、Ｇａｓ６上のヘキサヒスチジンタグ（配列
番号７７）に対する蛍光標識抗体で装飾される。図２Ｂは、野生型Ａｘｌ Ｉｇ１による
結合と出発Ｅ−Ａｘｌライブラリーによる結合との比較を示す散布図を表す。

［I. 二重特異性又は多重特異性結合を有するノッチン融合体］
特定の態様において、本発明は、治療効果の増加のために２個以上の受容体若しくは受
容体リガンドに結合する及び／又はそれらを阻害することができるという点で二重特異的
又は多重特異的である融合タンパク質を含む。これら融合体は、一例として、インテグリ
ン結合部分を含有するように操作されたＮ末端又はＣ末端ノッチンを含み得る。インテグ
リン結合ノッチンは、Ｃｏｃｈｒａｎらによる“改変インテグリン結合ペプチド”と題さ
れた米国出願公開第２００９／０２５７９５２号明細書に記載されている。フィブロネク
チン（α_５β_１インテグリン）又はビトロネクチン（α_ｖβ_３インテグリン及びα_ｖβ_５
インテグリン）に高い親和性（低い平衡解離常数(Ｋ_Ｄ)）で結合する改変ペプチドが開示
される。新規な結合特性を有するノッチンは、融合して、ヘテロオリゴマー二重特異性タ
ンパク質を生成することができる。この手法は、最終段落に記載されている通り、参照に
より本明細書に含まれるものとし、インテグリン結合ノッチンの説明のため更に閲覧され
得る。ここで用いる具体的なインテグリン結合パートナーは、αインテグリン鎖とβイン
テグリン鎖の両方に特異的であっても、又はβ鎖のみに特異的であってもよい。後者の場
合、様々なα−βインテグリンの組み合わせが存在するであろうことから、インテグリン
結合は多重特異的であろう。

例えば、インテグリン結合ノッチン−リガンド融合体は、増殖因子ＮＫ１の断片を用い
て創出されている。インテグリン結合ノッチンは、α_５β_１、α_ｖβ_３及びα_ｖβ_５、特
にα_ｖβ_３インテグリンのような選択したインテグリンに特異的に結合するように操作さ
れているループを含有する。ＮＫ１は、ＭＥＴ受容体のアゴニストとして働くポリペプチ
ド増殖因子ＨＧＦ／ＳＦの断片である。これは、Ｇｈｅｒａｒｄｉによる“肝細胞増殖因
子／散乱係数（ｈｇｆ／ｓｆ）のＮＫ１断片及びその変異型、並びにそれらの使用”と題
された米国出願公開第２００４号／０２３６０７３号により詳細に記載されている。簡単
に述べると、ＨＧＦ／ＳＦは、血液プロテイナーゼ前駆体プラスミノーゲンのものに似て
、６個のドメイン：プラスミノーゲン活性化ペプチドと相同なＮ末端（Ｎ）ドメインと、
クリングル（Ｋ）ドメインの４個のコピーと、触媒的に不活性なセリンプロテイナーゼド
メインとからなるユニークなドメイン構造を有する。一次ＨＧＦ／ＳＦ転写物の選択的ス
プライシングの２種の生成物は、Ｎドメインと第一ＫドメインであるＫ１とを含有する断
片であるＮＫ１と、ＮとＫ１と第二クリングルドメインであるＫ２とを含有する断片であ
るＮＫ２とをコードする。その配列は、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ, Ｍａｒｃｈ １９９
８, ｐ. １２７５−１２８３, Ｖｏｌ. １８, Ｎｏ. ３に見ることができる。

別の例として、Ａｘｌを用いて、インテグリン結合ノッチン−受容体融合体を調製した
。Ａｘｌ受容体は、Ｌｉｕの米国特許第５４６８６３４号明細書に記載されている。簡単
に述べると、Ａｘｌは、ＩｇＬ及びＦＮＩＩＩリピートを並べた細胞外領域の構造を有す
る受容体型チロシンキナーゼである。これは、細胞増殖の刺激に関与する。これは、ビタ
ミンＫ依存性タンパク質Ｇａｓ６に結合することができ、よって細胞質へ信号を伝達する
。Ａｘｌの細胞外ドメインは切断することができ、６５ｋＤａの可溶性細胞外ドメインを
遊離することができる。切断は、受容体のターンオーバーを増強し、部分的に活性化され
たキナーゼを生成する（Ｏ’Ｂｒｙａｎ Ｊ Ｐ, Ｆｒｉｄｅｌｌ Ｙ Ｗ, Ｋｏｓｋｉ Ｒ,
Ｖａｒｎｕｍ Ｂ, Ｌｉｕ Ｅ T. (１９９５) Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. ２７０(２)：５５
１−５５７）。しかしながら、切断されたドメインの機能は未知である。

Ａｘｌ受容体は、２個のＧａｓ６結合部位：Ｉｇ１ドメインに位置する主要な高親和性
部位と、Ｉｇ２ドメインに位置する弱い副次的な部位とを有する（図１Ａ）。Ｇａｓ６が
、その高親和性部位を介してＡｘｌと結び付くと、その後の弱い結合部位を介した結合が
受容体の二量体化及び活性化をもたらし、活性な２：２シグナル伝達複合体が形成される
。Ａｘｌ過剰発現が様々な範囲の癌細胞株において浸潤及び転移をもたらし、Ａｚｌシグ
ナル伝達の阻害が腫瘍細胞の移動及び転移を阻害するため、これは、治療上関連するリガ
ンド−受容体システムである。生成した二重特異性タンパク質は、高い親和性でインテグ
リン及びＡｘｌリガンドＧａｓ６と結合する。図１は、配列がドメインの付加及び進化ラ
イブラリー生成及びスクリーニングの概要を表すことを示し；第一行は、システイン結合
及びシステイン間のループを有する野生型ＥＥＴＩ−ＩＩ配列を示し；第二行は、ｘ残基
が加えられたループ１及び３を示し；ＥＥＴＩ−ＩＩのループ１及び３は、ランダム化さ
れてループライブラリーを生成し、Ａｘ１ Ｉｇ１のＮ末端に融合される；第三行は、Ｅ
ＥＴＩ−ＩＩ−ａｘｌ融合変異体であるＥＡ ７．０１、ＥＡ ７．０６及びＥＡ ８．
０４の配列を示す；最下行は、ＰＧＭモチーフ又はＰ−Ｇ／Ｔ−Ｍ／Ｋモチーフの同定に
由来する配列を列挙する。

Ａｘｌアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＵｎｉＧｅｎｅ２６３６２及びＧｅｎｂａｎｋアク
セッション番号Ｐ３０５３０で見ることができる。

本発明の別の態様において、ノッチンに融合した受容体又は他の融合タンパク質は、結
合目的で変異させられたノッチンに融合することに加えて、結合目的で修飾及び変異もさ
せられる。これは、実施例６に示される。この実施例において、デコイとして用いられる
べき受容体は、最初に細胞外ドメインへ短縮される。Ａｘｌの場合、シグナルペプチドの
部分及び細胞ガイドメインの小部分（約４２６アミノ酸の細胞外ドメインから約１１０ア
ミノ酸）を用いた。変異性ＤＮＡ増幅を用いて、受容体断片をコードするＤＮＡ配列に変
異を導入する。得られたクローンを天然リガンド（Ａｘｌの場合はＧａｓ６）に対する結
合性に対してスクリーニングして、より強力な結合体を、例えばセルソーティングによっ
て選択する。様々な受容体構築物を用いることができた。

このノッチン−Ａｘｌ融合体は、インテグリン結合と天然Ｇａｓ６／Ａｘｌ相互作用の
両方に同時に拮抗できる二重特異性又は多重特異性分子として機能することができる。Ｇ
ａｓ６は可溶性リガンドである一方、インテグリンは細胞表面受容体であり、両方の標的
は同時に結合することができる。Ｇａｓ６の結合は該可溶性リガンドを捕捉し、その結合
を妨げ、続いて内在性Ａｘｌ受容体の活性化を妨げる。インテグリン受容体に対する結合
は、インテグリン受容体が細胞外基質タンパク質に結合するのを妨げるであろう。

受容体型チロシンキナーゼのような増殖因子受容体又はシグナル伝達受容体に対するイ
ンテグリン結合ペプチドの融合は、インテグリンと増殖因子受容体経路との間に有意なク
ロストークが存在するため、有利である。例えば、インテグリンとＭｅｔ受容体との間に
強いクロストークが存在する。両方の受容体を標的とする薬物は、血管新生及び転移の阻
害に一層優れるであろう。治療的タンパク質とインテグリン結合性ノッチンとの融合によ
るインテグリン標的化は、第二の治療薬を腫瘍細胞に局在化させて、結合活性効果により
効力を増加させることもできる。更に、２個の腫瘍受容体を標的とすることができるイメ
ージング剤は、増加したシグナルを発生させ、早期発見のため、より小さな腫瘍を検出す
ることができる。

［ノッチン−Ｆｃ融合体］
本明細書に記載する融合タンパク質の別の例（実施例１２を参照）は、インテグリン結
合性ノッチンとマウス抗体のＦｃ部分との間の融合体である。抗体のＦｃ部分は、免疫グ
ロブリン分子を作り上げている２個の重鎖の２個のカルボキシ末端ドメインによって形成
される。ＩｇＧ分子は、２個の重鎖（それぞれ約５０ｋＤａ）及び２個の軽鎖（それぞれ
約２５ｋＤａ）を含有する。全ての抗体の全体構造は非常に類似しており、タンパク質の
先端の小さな領域が極めて可変性であり、僅かに異なる先端構造を有する何百万の抗体が
存在することを可能にする。この領域は超可変領域（Ｆａｂ）として知られている。他の
断片は、抗原結合活性を持たないが、元々は容易に結晶化することが観察され、この理由
のため、結晶可能な断片にちなんで、Ｆｃ断片と名付けられた。この断片は、対になった
ＣＨ_２及びＣＨ_３ドメインに相当し、エフェクター分子及び細胞と相互作用する抗体分子
の一部である。重鎖アイソタイプ間の機能的相違は、主にＦｃ断片にある。抗体分子のＦ
ｃ部分とＦａｂ部分とを結合するヒンジ領域は、堅固な蝶番ではなく、実際には、２個の
Ｆａｂアームの独立な動きを可能にする柔軟なつなぎなわである。このことは、ハプテン
に結合した抗体の電子顕微鏡検査によって実証されている。従って、本発明の融合タンパ
ク質は、抗体断片の各アーム上に１個が存在する２個のノッチンペプチドを含有するよう
に作成することができる。

Ｆｃ部分は、抗体のクラス（及びサブクラス）間で変動するが、そのクラスの範囲内で
は同一である。重鎖のＣ末端端部がＦｃ領域を形成する。Ｆｃ領域は、受容体結合部分と
して重要な役割を果たす。抗体のＦｃ部分は、２つの異なる方法でＦｃ受容体に結合する
。例えば、ＩｇＧ及びＩｇＭがそれらのＦａｂ部分によって病原体に結合した後に、それ
らのＦｃ部分が（マクロファージのような）食細胞上の受容体に結合して食作用を誘導す
ることができる。

本発明のノッチン−Ｆｃ融合体は、Ｆｃ部分を用いて二重の結合能力、及び／又は半減
期の延長、発現レベルの向上等を提供するように実施することができる。

［II. リガンド受容体結合の改善に用いるノッチン融合体］
本発明の本態様において、ランダム化ループを有し受容体に融合したノッチンのライブ
ラリーをスクリーニングして、改善されたリガンド結合を創出するプラットフォームとし
て用いる。一例として、ＥＥＴＩライブラリーをＡｘｌに融合させて、このライブラリー
をスクリーニングして、Ｇａｓ６リガンドに対する増加した親和性を有するＥＥＴＩ−Ａ
ｘｌ結合体を単離した。このように、ノッチンは、リガンド−受容体相互作用の親和性を
増加させるための一般的なプラットフォームとして既存のリガンド（又は受容体）と融合
させることができる。

ここで、我々は、合成ノッチン結合ドメインの付加及びそれに続く最適化によってタン
パク質を操作する可能性を示す。このアプローチの能力を実証するため、我々は、１ラウ
ンドのみの指向進化を用いて天然の高親和性（１桁台のナノモル）タンパク質−タンパク
質相互作用をナノモル以下のレベルまで増強する。この研究を通じて、我々は、エクバリ
ウム・エラテリウム（Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ ｅｌａｔｅｒｉｕｍ）のトリプシン阻害剤Ｉ
Ｉ（ＥＥＴＩ−ＩＩ）ノッチンの表面上の２個の構造的に隣接したループを同時に操作し
て、外因性標的に向けた結合面を形成することができることも実証する。つまり、受容体
及びリガンドは、融合したノッチン上のループを操作することによって、及び又は、受容
体若しくはリガンド自体のループを操作することによって、付加的な表面で結合するか又
は結合させることができる。この研究は、実験室進化研究に遺伝子の複製及び組み合わせ
の自然進化の過程を利用する可能性を実証し、タンパク質機能の調査及び最適化に広く応
用できるはずである。

ドメインの付加及び進化のストラテジーは、既存のタンパク質−タンパク質相互作用の
親和性を増大するための広範なストラテジーである。合成結合ドメインを、結合タンパク
質のＮ末端又はＣ末端に融合させて、続いて、隣接エピトープに結合することによって結
合パートナーに対する親和性を増大させるように進化させることができる。我々は、“ナ
イーブ”ライブラリーからの結合タンパク質の同定における応用も想定する。我々は、“
ナイーブ”という用語により、標的に対して天然の結合を有さないタンパク質に基づくラ
イブラリーを意味し、例えば、ＥＥＴＩ−ＩＩノッチンがＧａｓ６に対して天然の結合親
和性を示さないことである。このアプローチの更なる応用は、ナイーブライブラリーから
の結合タンパク質の同定を含む。腫瘍標的に結合するように操作したＥＥＴＩ−ＩＩペプ
チドは、生体内分子イメージング手法にとってかなり有望である。しかしながら、ナイー
ブライブラリーからの結合タンパク質の同定は、一つには、同定したタンパク質の親和性
が検出に充分な程度に高くなければならないという要求のため、難しい。例えば、酵母表
面提示結合において一桁台のμＭの範囲の親和性は検出限界を下回り、そのようなタンパ
ク質は一般にライブラリーソーティングの間に濃縮されないであろう。ドメインの付加及
び進化は、既存の相互作用を増強するが、それ自体は分離した状態で検出限界を下回る親
和性を有する合成結合ドメインの同定を可能にする“アンカーリング”ストラテジーとし
て用いることができる。下記の実施例では、ノッチン変異体をＡｘｌの不存在下で発現さ
せた場合、本発明で開発したＥＥＴＩ−ＩＩ変異体が、Ｇａｓ６に対し検出限界を下回る
弱い結合親和性を示す。それに続く従来のストラテジー又は更なるドメインの付加及び進
化による親和性成熟を用いて、高い親和性を有する合成結合薬物を充分に生成することが
できる。

［III. 折り畳まれた機能性ノッチンタンパク質の発現を増強するノッチン融合体］
ノッチンペプチドは、適切に折り畳まれた形態で得ることが困難な場合がある。ペプチ
ドの化学合成及び再折り畳みを行うことはできるが、広範囲にわたる最適化を必要とする
、この問題は、ノッチンをタンパク質に融合することによって軽減され得る。例えば、Ｅ
ＥＴＩ−ＩＩ２．５Ｄ（下記で説明する）は酵母で可溶型として発現できなかった。しか
しながら、Ａｘｌに融合した場合、高収率の折り畳まれた機能性ノッチン−Ａｘｌ融合体
が得られた。融合パートナーを切り離すためにプロテアーゼ切断部位をＥＥＴＩ−ＩＩ２
．５ＤとＡｘｌとの間に導入した。これは、いずれかの融合パートナーを発現のために用
いる場合の一般的なストラテジーであり得るか、又は、上述のような二重特異性タンパク
質の作成の一環とし得る。

これは、Ｆｃ、ヒト血清アルブミン等のような修飾ドメインの融合にも影響を与え、治
療的用途のために半減期を増加させるであろう。

発現が困難なノッチンを適切に発現したタンパク質に融合することによって、収率を向
上させることができる。プロテアーゼ認識配列をノッチンと融合パートナーとの間に挿入
する。これは、下記実施例７で例示されている。

［定義］
特に定義のない限り、本明細書中で用いる技術的及び科学的用語は全て、本発明が属す
る技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記載され
たものと類似する又は同等な方法及び材料は、本発明の実施又は試験において用いること
ができるが、好ましい方法及び材料を記載する。一般に、細胞及び分子生物学及び化学に
関連して用いられる学術用語並びに細胞及び分子生物学及び化学の技術は、本技術分野で
周知であり、通常用いられるものである。具体的に規定しないが、ある種の実験手法は、
一般に、本技術分野で周知の通常の方法に従って、また本明細書の全体を通して引用され
論じられる様々な一般的及びより詳細な参考文献に記載されたように、行われる。明確さ
の目的で、次の用語を下記で定義する。

“有効量”という用語は、改変ペプチドの同族結合パートナーとの結合を調節すること
ができる本発明の融合タンパク質の量を意味する。有効量は、投与経路及び患者の病状に
左右されるであろう。

“医薬として許容される”は、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、投与され
た宿主にとって毒性でない、あらゆる担体を包含することを意味する。例えば、非経口投
与のため、上記有効成分は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリン
ガー溶液のようなビヒクルで注射用の単位剤形に調剤することができる。

「ノッチンタンパク質」という用語は、タンパク質類、糖類及び脂質類のような様々な
分子標的に結合する、典型的には２４〜４０アミノ酸の小型タンパク質の構造ファミリー
を意味する。これらの三次元構造は、３〜５個のジスルフィド結合の特有の配置によって
本質的に規定される。２個の他の鎖内ジスルフィド結合によって制限される大環状分子を
横断する１個のジスルフィド架橋を有する特徴的な結び目構造を持つトポロジーが、この
クラスの生体分子に名前を貸した、同じシステインネットワークを有する幾つかの異なる
微小タンパク質において見出された。その二次構造含量は低いが、ノッチンは、ジスルフ
ィド結合骨格によって安定化した小型の三重鎖逆平行βシートを共有する。システインノ
ットタンパク質とも呼ばれるノッチンファミリーの生化学的によく定義されたメンバーと
しては、エクバリウム・エラテリウム種子由来のトリプシン阻害剤ＥＥＴＩ−ＩＩ、捕食
性イモガイであるアンボイナイガイ（Ｃｏｎｕｓ ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）由来の神経細
胞Ｎ型Ｃａ２＋チャネル遮断剤であるω−コノトキシン、アグーチ関連タンパク質（Ａｇ
ＲＰ、Ｍｉｌｌｈａｕｓｅｒら、“Ａｎｎ. Ｎ.Ｙ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ., Ｊｕｎｅ １,
２００３；９９４（１）：２７−３５を参照のこと）、オメガアガトキシンファミリー等
が挙げられる。適切なアガトキシン配列は、米国特許出願公開第２００９／０２５７９５
２号で与えられており、通常の発明者は本願と共に利用できる。別のアガトキシン配列は
、ＧｅｎＢａｎｋ(登録商標)アクセッション番号Ｐ３７０４５のオメガ−アガトキシン−
Ａａ４ｂ；Ｐ８１７４４のオメガ−アガトキシン−Ａａ３ｂ等で与えられる。その他のノ
ッチン配列は、ＧｅｎＢａｎｋ(登録商標)アクセッション番号ＦＪ６０１２１８．１，ｋ
ｎｏｔｔｉｎ［ベミシア・タバシ(Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ)］；ＧｅｎＢａｎｋア
クセッション番号Ｐ８５０７９，オメガ−リコトキシン；及びＧｅｎＢａｎｋアクセッシ
ョン番号ＡＡＢ３４９１７，ミュー−ＯコノトキシンＭｒＶＩＡ＝電位作動型ナトリウム
チャネル遮断剤で見出すことができる。

コノトキシン類は、一般に、長さが１０〜３０残基のペプチドからなる。具体的な例は
、食魚性のイモガイであるヤキイモ（Ｃｏｎｕｓ ｍａｇｕｓ）で見出された天然に存在
するコノペプチドの合成等価体ジコノチドであるＰＲＩＡＬＴ(登録商標)である。ジコノ
チドは、２６３９ダルトンの分子量及びＣ_１０２Ｈ_１７２Ｎ_３６Ｏ_３２Ｓ_７の分子式を有
し３個のジスルフィド架橋を含有する２５アミノ酸の多塩基性ペプチドである。

ノッチンタンパク質は、特徴的なジスルフィド結合構造を有する。この構造は、Ｇｅｌ
ｌｙら、“Ｔｈｅ ＫＮＯＴＴＩＮ ｗｅｂｓｉｔｅ ａｎｄ ｄａｔａｂａｓｅ： ａ ｎｅ
ｗ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｄｉｃａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｋｎｏｔｔ
ｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ,” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ２００４,
Ｖｏｌ. ３２, Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ Ｄ１５６−Ｄ１５９にも説明されている。
多数のノッチンに三重鎖βシートが存在する。この結び目構造に関与するシステインは、
Ｃｙｓ残基が互いに結合していることを指し示す図１Ｄの線で結ばれて、示される。Ｃｙ
ｓ残基間の空間は、本発明で重要であり、それは改変ループの分子トポロジー及び高次構
造のためである。改変ループは、ＲＧＤを含み、インテグリン結合ループを提供すること
ができる。これらの属性は、高親和性インテグリン結合にとって重要である。ＲＧＤ擬似
ループをノッチンＣｙｓ残基間に挿入するが、このループの長さは、それらＣｙｓ残基間
の三次元空間に依存する最適なインテグリン結合に応じて調節されなければならない。例
えば、フランキングＣｙｓ残基が互いに結合している場合、最適なループは、フランキン
グＣｙｓ残基が一次配列において離れたＣｙｓ残基と結合している場合よりも短くなり得
る。そうでなければ、高親和性インテグリン結合のために、より長いＲＧＤ含有ループを
抑制する特定のアミノ酸置換を最適な高次構造へ導入することができる。

本発明のノッチンタンパク質は、作られたある種の修飾を含み、ノッチンを短縮しても
又はループ若しくは不要なシステイン残基若しくはジスルフィド結合を除去してもよい。

“アミノ酸”という用語は、天然に存在するアミノ酸と合成アミノ酸の両方を包含し、
アミノ酸のＤ体とＬ体の両方及びラセミ体を包含する。より具体的には、アミノ酸は、最
大１０個の炭素原子を含む。それらは、付加的なカルボキシル基並びに窒素及び硫黄のよ
うなヘテロ原子を含み得る。好ましくは、アミノ酸がαアミノ酸及びβアミノ酸である。
αアミノ酸という用語は、カルボキシル基に直接結合した炭素であるα炭素にアミノ基が
結合したアミノ酸を指す。βアミノ酸という用語は、カルボキシル基から１個離れた炭素
であるβ炭素にアミノ基が結合したアミノ酸を指す。本明細書中で記載するアミノ酸は、
“Ｘ”がいずれかのアミノ酸を意味する標準ＩＵＰＡＣ１文字命名法で呼ぶ。

“ＥＥＴＩ”という用語は、プロテインデータバンクエントリー（ＰＤＢ）２ＥＴＩを
意味する。ノッチンデータベースにおけるこのエントリーはＥＥＴＩ−ＩＩである。これ
は、下記配列
を有する。全長ＥＥＴＩ−ＩＩは、最終プロリンが位置３０に位置する３０アミノ酸配列
を有する：

ループ１及びループ３は太字で下線を引いた。これらループは、下記で実証されるよう
に、変化させることができ、結合効率にも影響を与え得る。他のループは結合効率に影響
せずに変化させ得る。

“ＡｇＲＰ”という用語は、ＰＤＢエントリー１ＨＹＫを意味する。ノッチンデータベ
ースにおけるこのエントリーは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＡＧＲＰ＿ＨＵＭＡＮであり、１
２９アミノ酸の全長配列を見出すことができる。これは、８７番目のアミノ酸で開始する
配列を含む。追加のＧをこの構築物に加える。これは、Ｊａｃｋｓｏｎらの論文（２００
２年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１巻、７５６５頁）に記載されているＣ１０５Ａ変
異も含む。

破線を引いた部分は、下記の“小型の”異形において除外した断片を示す。ループ４由
来の太字で下線を引いた部分は、下に記載するＲＧＤ配列によって置き換えられる。ルー
プ１及びループ３は、下の括弧の間に示す。

ＡｇＲＰに関する“小型の”という用語は、ＰＤＢエントリー１ＭＲＯを意味する。こ
れはＳｗｉｓｓＰｒｏｔＡＧＲＰ＿ＨＵＭＡＮでもある。これは、上で与えられたものと
類似する下記配列を有する。
配列中、下線を引いた“Ａ”は、予想される二量体形成シスチンを排除するアミノ酸置換
を表す。（本明細書で、シスチンは１個のアミノ酸を指し；システインは二量体を指す。
）ループ４由来の太字で下線を引いた部分は、下に記載するＲＧＤ配列によって置き換え
られる。

“アガトキシン”という用語は、オメガアガトキシンＰＤＢ：１ＯＭＢ及びノッチンデ
ータベースにおけるＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリーＴＯＧ４Ｂ＿ＡＧＥＡＰを意味する。
これは、下記配列を有する。

破線は、“小型の”アガトキシンについて除外されたペプチド部分を示す。追加のグリ
シンが小型構築物のＮ末端に加えられる。太字で下線を引いた部分は、下記で記載するＲ
ＧＤ配列によって置き換えられる。

“ループドメイン”という用語は、規則正しい二次構造を有さないペプチド鎖内にあり
、一般にそのペプチドの表面上に存在するアミノ酸配列を指す。“ループ”という用語は
、αヘリックス、βシート等の形態にあるような規則正しい形態でない二次構造を指すも
のと本技術分野で理解される。

ペプチドに関連して、“実質的に同一”という用語は、ペプチドが、特定の比較ウイン
ドウによって参照配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８０％、より
好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性
を有する配列を含むことを示し、この場合、ペプチドは、ペプチド全体、分子足場部分、
又は結合ループ部分（約９〜１１残基）のいずれかである。好ましくは、Ｎｅｅｄｌｅｍ
ａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（(１９７０) Ｊ. Ｍｏｌ.
Ｂｉｏｌ., ４８：４４３ ４５３）を用いて最適なアラインメントが行われる。２個のペ
プチド配列が実質的に同一であることのしるしは、一方のペプチドが、第二のペプチドに
対して産生される抗体と免疫学的に反応性であることである。本発明の目的について、配
列が明確に例示した特定配列と実質的に同一であることの別のしるしは、問題の配列が少
なくとも参照配列と同じように高いインテグリン結合親和性を有することである。従って
、例えば、２個のぺプチドが保存的置換によってのみ相違する場合、ペプチドは、第二の
ぺプチドと実質的に同一である。“保存的置換”は周知であり、例えば、ＰＡＭ２５０ス
コアリング行列によって例示される。“実質的に類似”するペプチドは、同一でない残基
位置が保存的アミノ酸変化によって相違し得ることを除き、上述した配列を共有する。本
明細書中で使用するように、２個の核酸又はポリペプチド配列に関連して、“配列同一性
”又は“同一性”は、２個の配列の残基が特定の比較ウインドウによって最大一致を目指
して整列させた場合に同一であることを指す。タンパク質に関して配列同一性の比率を用
いる場合、同一でない残基位置は、しばしば、保存的アミノ酸置換によって相違し、この
場合、アミノ酸残基は類似の化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸
残基と置換され、よって分子の機能的特性を変えないことが認められる。配列が保存的置
換で相違する場合、配列同一性率は、置換の保存的性質を修正するように上方修正され得
る。そのような保存的置換により相違する配列は、“配列類似性”又は“類似性”を有す
るといえる。この修正を行う手法は、当業者に周知である。これは、典型的には、保存的
置換を全体的でなく部分的なミスマッチとしてスコアリングすることを含み、これにより
配列同一性の比率が増加する。従って、例えば、同一アミノ酸が１のスコアを与えられ、
非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は０と１の間のスコアを与えら
れる。保存的置換のスコアリングは、例えば、ＮＩＨ多重アラインメントワークショップ
（http://helixweb.nih.gov/multi-align/）で実行されるように計算される。三次元ツー
ルを配列比較に用いてもよい。

本明細書中で用いるように、“配列同一性の比率”は、比較ウインドウによって最適に
整列させた２個の配列を比較することによって決定される値を意味し、２個の配列の最適
アラインメントについて、比較ウインドウにおけるポリペプチド配列の部分は、（付加又
は欠失を含まない）参照配列と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る
。その比率は、両方の配列に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を測定
して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数
で割り、結果に１００をかけて配列同一性の比率を得ることによって計算される。

“受容体型チロシンキナーゼ”という用語は、その通常の意味で用いられる；具体例は
下記で与えられる。“ＴＡＭ受容体型チロシンキナーゼ”という用語は、ｔｙｒｏ３、Ａ
ｘｌ及びＭｅｒＴＫを含む受容体キナーゼのＴＡＭファミリーを指す。これらは、キナー
ゼドメイン内の保存配列及び接着分子様細胞外ドメインによって特徴付けられ、Ｌｉｎｇ
ｅｒらの論文（“ＴＡＭ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ： ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ, ｓｉｇｎａｌｉｎｇ, ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ,” Ａｄｖ
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ２００８；１００：３５−８３）によって更に説明される。

全体説明
［ノッチンペプチドの操作］
本発明の融合タンパク質の重要な特徴は、所定のリガンドへの特異的結合にノッチン部
分を用いることである。ノッチン結合は、好ましくは、天然の溶媒露出ループを所定のリ
ガンドへの結合用に選択した短い（例えば、５〜１２アミノ酸）配列で置き換えることに
よって操作される。溶媒露出（すなわち、表面上の）ループは、一般に、ジスルフィド結
合したシステイン残基によって固定されている。新しい、すなわち置換アミノ酸配列は、
好ましくは、ループ部分のコドンをランダム化し、改変ペプチドを発現させ、所定のリガ
ンドに対して最大の結合を有する変異体を選択することによって得られる。先の工程から
最も強力な結合性タンパク質を採用し、ループを再ランダム化して、この選択工程を複数
回繰り返してもよい。

ＥＥＴＩ−ＩＩノッチンペプチドは、ジスルフィド結び目構造トポロジーを含み、突然
変異誘発を行うことができる複数の溶媒露出ループを有する。Ｇａｓ６との境界面を進化
させるため、我々は構造的に隣接するループ１及びループ３をランダム化した。このＥＥ
ＴＩ−ＩＩループライブラリーの直接的なＡＣ１ Ｉｇ１のＮ末端への融合（図１Ｄに図
示）は、天然のＧａｓ６−Ａｘｌ相互作用を乱さず、これにより、数千万の一桁台のナノ
モル結合体のバックグラウンドをもたらした。このようなバックグラウンドから増強され
たクローンを単離する能力は、タンパク質工学の酵素表面ディスプレイ及び定量蛍光活性
化セルソーティングの力を語る。更に、機能喪失をこうむっていない出発ライブラリーは
、結合パートナーの一方に対する無作為変異がしばしば初期ライブラリーの大部分につい
て機能の低下をもたらす従来の指向進化ストラテジーのものと異なる。ドメイン付加ナイ
ーブライブラリーにおける野生型特性の保持は自然進化の展望に光を当て、これによって
、ドメインの付加及び進化は事実上、活性低下の代償なく、配列空間を探索しながら、タ
ンパク質機能の進化を可能にすることができる。

多種多様なノッチンペプチドを本発明の融合タンパク質に用いることができる。例えば
、酵母細胞表面上に提示される場合、下記変異体は、フィブロネクチン由来のＲＧＤ配列
を有する変異体よりも約２〜３倍良好にα_ｖβ_３インテグリンと結合する。

２００９年４月３日に出願された同時継続出願第１２／４１８,３７６号に記載される
ように、上記改変ノッチンは、ＲＧＤ結合ループを含み、インテグリンと特異的に結合す
る。そこに記載する通り、これらループは、非ＲＧＤ残基において、結合特異性及び力価
に影響することなく、ある程度まで変化させることができる。例えば、１１残基のうちの
３個を変化させた場合、２.５Ｄに対して約７０％の同一性を有するであろう。上記改変
ノッチンは、α_ｖβ_３インテグリン、α_ｖβ_５インテグリン及びα_５β_１インテグリンに
特異的に結合することが示されている。

インテグリンに結合するように操作したノッチンペプチドの別の例は、ＡｇＲＰである
。下の表２は、フローサイトメトリーによって単離し、太字の残基によって表示されるよ
うに、ループ４中にＲＧＤ配列及びフランキング残基を有するＡｇＲＰ変異体の配列を示
す。

付加的ＡｇＲＰ改変ノッチンは、上で参照したＣｏｃｈｒａｎらの米国出願公開第２０
０９／０２５７９５２号明細書に記載されているように創出することができる。ＡｇＲＰ
ノッチン融合体は、ＡｇＲＰのループ１、２及び３に加えて上で例示するループ４を用い
て調製することができる。

［改変ノッチン結合パートナー］
改変ノッチンを別のタンパク質に融合させる。このタンパク質は、本明細書の記載に従
って改変ノッチンの設計にある程度入るであろう。つまり、融合パートナー及びノッチン
結合パートナーは、それらが同じ生物学的経路に存在する点で論理的関係を有し、これら
は、結合されて治療結果等を改善する標的を対象とする。

改変ノッチン−チロシンキナーゼ受容体融合体によって下記で例示されるように、融合
体は、チロシンキナーゼに対するリガンドと結合するように操作してもよい。融合体は投
与されてリガンドと結合され、それにより、デコイとして働き、天然リガンドがチロシン
キナーゼ受容体と結合するのを妨げる。下記で更に例示するように、チロシンキナーゼ受
容体全体を使用しない；天然リガンド、好ましくはアゴニストと結合する部分のみを使用
する。Ａｘｌの場合、Ｇａｓ６リガンドと結合するＡｘｌ受容体のＩｇ１部分及びＩｇ２
部分を使用する。増殖停止特異的６であるＧａｓ６は、血漿ビタミンＫ依存性タンパク質
ファミリーに属する。Ｇａｓ６は、抗凝固タンパク質と高い構造相同性を共有し合うが、
ＴＡＭファミリーの受容体型チロシンキナーゼであるｔｙｒｏ３、Ａｘｌ及びＭｅｒＴＫ
との相互作用を通じて増殖因子様特性を有する。

改変ノッチン−タンパク質融合体の別の例は、融合パートナーが増殖因子又は増殖因子
の活性断片である融合体であり、ノッチンは、血管系中又は腫瘍に存在し得るような内皮
細胞と結合するように操作される。これは、α_ｖβ_３インテグリンと、Ｍｅｔ受容体に結
合する増殖因子又は増殖因子断片とを結びつけるように操作したノッチン（ＡｇＲＰ）に
よって例示される。α_ｖβ_３インテグリンと細胞外基質との相互作用は、毛細血管から出
芽する内皮細胞及び血管新生にとって極めて重要である。更に、インテグリン媒介性アウ
トサイドインシグナルは、増殖因子受容体と協同して、細胞の増殖及び運動性を促進する
。別の例として、Ｓｏｌｄｉらの論文（“Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｌｐｈａｖ ｂｅｔａ３ ｉｎ
ｔｅｇｒｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏf ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈ
ｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２,” Ｔｈe ＥＭＢＯ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ （１９９９） １８, ８８２−８９２）は、インテグリン系によって血管新生
誘導因子受容体の調節の可能性を見極めることを報告しており、ヒト内皮細胞においてα
_ｖβ_３インテグリンとチロシンキナーゼ血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２）
との間の相互作用を調べた。ＶＥＧＦ受容体とＭｅｔ受容体（肝細胞増殖因子受容体とし
ても知られる）の両方とも受容体型チロシンキナーゼである。

結合パートナー選択の別の例は、α_ｖβ_３インテグリンに結合する改変ノッチンと、Ｍ
ＥＴ受容体のアゴニストとして働くポリペプチド増殖因子ＨＧＦ／ＳＦの断片であるＮＫ
１との融合である。下に記載するように、ＮＫ１を修飾して、高度に安定でより効果的な
アゴニスト性リガンドを創出するか、又は高度に安定でより効果的なアンタゴニストを創
出した。

［（ドメイン付加により）合成結合ドメインを有するＥＥＴＩ−Ａｘｌ融合体］
下記の実施例で、エクバリウム・エラテリウムのトリプシン阻害剤ＩＩ（ＥＥＴＩ−Ｉ
Ｉ）は合成結合ドメインとして働き、その融合パートナーの結合を増大させる。ＥＥＴＩ
−ＩＩは、優れた安定性特性を提供する特徴的な織り合わされたジスルフィド結合骨格を
含むノッチンペプチドファミリーのメンバーである（図１Ｂ）。ＥＥＴＩ−ＩＩの溶媒露
出ループは、突然変異誘発に対して寛容性であり、新規な認識特性について既に個別に操
作されてきた。しかしながら、本研究では、ＥＥＴＩ−ＩＩ中の構造的に隣接する２個の
ループを同時にランダム化して、生じたＥＥＴＩ−ＩＩ変異体のライブラリーを野生型Ａ
ｘｌ Ｉｇ１に融合させた。Ａｘｌ配列は、Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅのＧｅｎｅＩＤ５５
８で与えられる。次に、このライブラリーをスクリーニングして、増大したＧａｓ６結合
親和性を有する新規なＥＥＴＩ−Ａｘｌ融合体を同定した。つまり、結合は、Ａｘｌ受容
体を介して、また改変ループを介して起こるであろう。１ラウンドのみの指向進化に続い
てナノモル以下の親和性を有する変異体を同定し、その変異体では、ＥＥＴＩ−ＩＩ変異
体の改変ループの両方とも、新規な結合面の創出によってＧａｓ６に対する親和性の増大
に貢献した。この研究は、ドメインの付加及び進化がタンパク質機能を増強することを裏
付け、足場としてのＥＥＴＩ−ＩＩノッチンが新規な認識特性を操作することも裏付ける
。

［ドメイン付加ライブラリーの設計及び合成］
ＡｘｌのＩｇ１ドメインはＧａｓ６に対する優位な結合部位を含むことから、Ｇａｓ６
／Ａｘｌ相互作用の親和性を増大させるために、ＥＥＴＩ−ＩＩノッチンペプチドのルー
プライブラリーをＡｘｌ Ｉｇ１に融合させた。Ｇａｓ６／Ａｘｌ複合体ではＡｘｌ Ｉ
ｇ１のＮ末端がそのＣ末端よりもＧａｓ６の近くにあり、従って、ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体
のＧａｓ６との相互作用をより可能にしやすそうであるため（図１Ｃ）、ＡｘｌのＮ末端
への融合を選択した。ＥＥＴＩ−ＩＩ及びＡｘｌの構造の解析は、ＡｘｌのＮ末端へのＥ
ＥＴＩ−ＩＩの融合が２個のタンパク質の三次構造の間におよそ１１アミノ酸の間隔を与
えるであろうことを示す。従って、更なるリンカー残基を含めることなく、ＥＥＴＩ−Ｉ
ＩループライブラリーをＡｘｌのＮ末端に直接融合させることを選択した。 ＥＥＴＩ−
ＩＩ中の最終Ｐｒｏ３０残基及びＡｘｌ Ｉｇ１のＰｒｏ２０を排除して、結合の柔軟性
を向上させ、ＥＥＴＩ−ＩＩのＳｅｒ２９をＡｘｌのＡｒｇ２１に直接融合させた。構造
的に隣接しており（図１Ｂ）、ＥＥＴＩ−ＩＩノッチン状に連続的な結合面の形成を可能
にするであろうことから、ランダム化についてＲＲＴＩ−ＩＩループ１及びループ３を選
択した。野生型のループ１及びループ３を、ＮＮＳコドンを用いて、それぞれ７〜１０ア
ミノ酸及び６〜８アミノ酸のランダム化配列で同時に置き換えた（図１Ｄ）。ＮＮＳコド
ンストラテジーは、１個の停止コドンのみをコードすることによって停止コドンの頻度を
制限しながら、２０個のアミノ酸全てを改変ループに含めることを可能にする。他の縮重
ライブライリーストラテジーを用いてもよい。他の例示的ストラテジーについては、Ｋｌ
ｅｅｂらの論文（“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔｉ
ｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｔｕｎａｂｌｅ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ,
” Ｐｒｏｃ. Ｎａｔ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. １０４： １３９０７-１３９１２ (２００７)
）を参照されたい。

直接融合は、酵母提示ｐＣＴプラスミドにおいてＡｘｌ Ｉｇ１アミノ酸Ｇｌｙ２２の
前にプロリン−アルギニンジペプチドをコードするＡｖｒＩＩ（Ｃ‘ＣＴＡＧ，Ｇ）部位
を含めることによって達成した。ＥＥＴＩ−ＩＩループライブラリーは、制限消化したＡ
ｘｒＩＩ部位の最初の塩基対を‘Ｔ’で置き換えて、ＥＥＴＩ−ＩＩのＳｅｒ２９とＡｘ
ｌ Ｉｇ１のＡｒｇ２１との所望のＳｅｒ−Ａｒｇ結合をコードするＴＣＴＡＧＧ（配列
番号４０）を与えるように設計した。

ＥＥＴＩ−ＩＩループライブラリー用ｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲアセンブリ技術を用
いて合成し、酵母提示Ｅ−Ａｘｌライブラリーは、ｐＣＴ−Ａｖｒ−Ａｘｌアクセプター
プラスミドに対する相同組み換えによって生成させた（実施例を参照）。このライブラリ
ーは、本明細書でＥ−Ａｘｌライブラリーと呼ぶ；これは、希釈物プレーティング及びコ
ロニー計数によって測定したように、１．２×１０^８個の形質転換体を含んでいた。無作
為に選択した個々のクローンの配列解析は、意図した融合ストラテジー、ループ長分布、
及びＡｘｌ配列への変異の欠如を確認した。先の複数のランダム化ループを含むライブラ
リーの報告と一致して、およそ３０％のクローンは、停止コドン又は変異を含まない全ル
ープ配列を含んでいた。

ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定は、一つには、同定したタンパク質
の親和性が検出に充分なほど高くなければならないという要求のため、努力を必要とする
。例えば、酵母表面ディスプレイにおいて、一桁台のμＭ範囲の結合親和性は検出限界を
下回り、このようなタンパク質は一般にライブラリーソーティングの間に濃縮されないで
あろう。ドメインの付加及び進化は、既存の相互作用を増強するが、それ自体は単離にお
いて検出限界を下回る親和性を有し得る合成結合ドメインの同定を可能にする“アンカー
リング”ストラテジーとして用いることができる。この裏付けとして、本発明で開発した
ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体は、ノッチン変異体がＡｘｌの不存在下で発現される場合にはＧａ
ｓ６に対して検出限界を下回る弱い結合親和性を示す。それに続く従来のストラテジー又
は更なるドメインの付加及び進化による親和性成熟を用いて、高い親和性を有する完全合
成結合薬を生成させることができる。

［ライブラリースクリーニング及び配列解析］
Ｅ−Ａｘｌライブラリーの発現及びそのＧａｓ６に対する結合を、それぞれ、酵母提示
構築物上のｃｍｙｃエピトープタグ及び可溶性Ｇａｓ６上のヘキサヒスチジンタグ（配列
番号７７）（図２Ａ）の免疫蛍光標識によって評価した。図２Ａは、酵母表面ディスプレ
イにおいて知られているように、アガトキシン構成要素Ａｇａ １ｐ及びＡｇａ ２ｐが
この順番で酵母細胞壁から伸びていることを示す。Ｈｙｌｉｔｅ４４８ ２２でタグを付
けた抗ｈｉｓ抗体をＧａｓ６上のｈｉｓタグ３２に結合させる；ｍｙｃタグ２６をチキン
抗ｍｙｃ抗体２８に結合させ、今度はＡｌｅｘａ５５５，３０で標識した抗チキン抗体に
より結合される。融合体にヘマグルチニンタグも含める。これにＡｘｌ−Ｉｇ１を融合さ
せて、Ｇａｓ６リガンドのＡｘｌに対する結合が実行される。酵母細胞表面上に発現した
出発ライブラリーの全メンバーは、野生型Ａｘｌ Ｉｇ１と同じレベルでＧａｓ６に結合
した（図２Ｂ）。これは、ＡｘｌのＮ末端へのＥＥＴＩ−ＩＩループライブラリーの直接
結合が天然のＧａｓ６−Ａｘｌ相互作用を乱さないことを実証する。結果的に、これは、
稀な改良クローンを分離しなければならない数千万の野生型の一桁台のナノモルの結合体
のバックグラウンドも生じる。

酵母表面ディスプレイを用いたライブラリースクリーニングのために、しばしば結合ク
ローンの上位１％を収集する；しかしながら、この極めて高いバックグラウンドレベルの
結合のため、結合クローンの上位６％を収集して増強された特性を有する稀なクローンを
失う可能性を低減する保存的分取ストラテジーを最初に用いた（図３）。

図３は、ライブラリーを分取するときに、可溶性Ｇａｓ６への結合についてスクリーニ
ングすることによって最初の分取を行ったことを示す。その後の分取は、Ｇａｓ６への結
合の後に解離速度の増大に対して選択圧を付与する過剰な競合相手の存在下でのインキュ
ベーションが続く‘解離速度(ｏｆｆ−ｒａｔｅ)’分取を用いた。第６ラウンド目の分取
で、ネガティブソーティングを行って、二次抗Ｈｉｓ抗体に結合している変異体を取り除
いた。第６分取の産物（下記）は、１ラウンドのみの分取でこれらが完全に排除されたこ
とを示す。最終分取の産物は、４６時間の非結合（‘解離(ｏｆｆ)’）工程の後に結合を
保持した。

後期の分取ラウンドにおけるストリンジェンシーを増加させるため、２ｎＭのＧａｓ６
と共にインキュベーションした後に、競合相手として働く１Ｍの過剰のＧａｓ６の存在下
で非結合工程を続ける‘解離’分取を行った。過剰な競合相手は、可溶性Ａｘｌ受容体と
複合した遊離Ｇａｓ６を隔離することによって酵母提示Ｅ−ＡｘｌからのＧａｓ６の解離
を付加逆性のものとし、これによって、より遅い解離速度を有するクローンに対する選択
圧を増加させる。

［インテグリン及び増殖因子受容体を標的とする二重特異性タンパク質］
実施例８に、α_ｖβ_３インテグリンに結合するように操作したノッチン（ＡｇＲＰ）と
、ＨＧＦのＮ末端及び第１クリングルドメインを含む断片（ＮＫ１と呼ばれる）との間の
融合体の調製を記載する。ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）のこの部分は、Ｍｅｔ受容体に結合
する。ｃ−Ｍｅｔ（ＭＥＴ又はＭＮＮＧ ＨＯＳ形質転換遺伝子）は、肝細胞増殖因子受
容体（ＨＧＦＲ）として知られるタンパク質をコードするがん原遺伝子である。この肝細
胞増殖因子受容体タンパク質は、チロシンキナーゼ活性を持つ。一次一本鎖前駆体タンパ
ク質は、翻訳後切断されて、ジスルフィド結合されて成熟受容体を形成するαサブユニッ
ト及びβサブユニットを生成する。

α_ｖβ_３インテグリン受容体は、数多くの固形腫瘍細胞上で過剰発現され、癌の重要な
標的とされる。シスチン−ノットペプチドであるアグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ）は
、４個のジスルフィド結合及び４個の溶媒露出ループを含む。これを、ｐＭ結合親和性で
α_ｖβ_３インテグリン受容体を標的とするように操作した。ＡｇＲＰ変異体である７Ａは
、強力な結合親和性を有することが示された。７Ａ変異体のＵ８７ＭＧ細胞及びＫ５６２
−α_ｖβ_３細胞に対するＫ_Ｄ値は、それぞれ０．７８ｎＭ及び０．８９ｎＭである。

Ｍｅｔ受容体型チロシンキナーゼ及びそのリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は
、腫瘍進行と組織再生の両方を媒介することに重要な役割を果たす。ＨＧＦのＮ末端及び
第一クリングルドメイン（ＮＫ１）は、Ｍｅｔ受容体を活性化する能力を保持する天然に
存在するスプライスバリアントである。しかしながら、ＮＫ１は、弱いアゴニストであり
、比較的不安定で、その治療上の可能性は限られている。Ｍｅｔ受容体アゴニスト及びア
ンタゴニストとして機能して増強された生化学的及び生物物理学的特性を持つＮＫ１変異
体を設計した。下に記載するように、最初に、酵母表面ディスプレイを用いて、安定性及
び組み換え発現収率の増大のためにＮＫ１を進化させた。我々のライブラリー選別から単
離したＮＫ１変異体は、ＮＫ１ホモ二量体化を媒介する残基の変異のため、弱いＭｅｔ受
容体アンタゴニストとして機能した。このＮＫ１ホモ二量体化境界面を復元してアゴニス
ト性リガンドを創出するか、又は更にこれらの相互作用を破壊してより効果的なアンタゴ
ニストを創出する点変異を導入した。最も良いアンタゴニストは、野生型由来のアンタゴ
ニストに対して１５℃の改良である最高約６４℃の融点を示し、発現収量に最大４０倍の
改良を示した。

インテグリンとｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路との間のクロストークを研究して、有意な
関係性を示した。Ｍｅｔ受容体の天然リガンドであるＨＧＦ／ＳＦのシグナル伝達は、上
皮細胞及び内皮細胞における機能的に不活性なα_ｖβ_３インテグリンにおいてリガンド結
合活性を導入することができる。従って、α_ｖβ_３インテグリンとＭｅｔ受容体の両方を
標的として阻害する二重特異性タンパク質は、特に単受容体標的薬と比較して、効果的な
癌治療薬として有望である。

［融合体で有用な受容体型チロシンキナーゼ（“ＲＴＫ”）断片］
本発明の融合タンパク質は、様々な受容体型チロシンキナーゼを含み得る。これらタン
パク質は、それらの細胞外及びリガンド結合モチーフに関して良く特徴付けられている。
これらは、ＲＴＫクラスＩ（ＥＧＦ受容体ファミリー）（ＦｒｂＢファミリー）；ＲＴＫ
クラスＩＩ（インスリン受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＩＩＩ（ＲＤＧＦ受容体ファ
ミリー）；ＲＴＫクラスＩＶ（ＦＧＦ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＶ（ＶＥＧＥ受
容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＶＩ（ＨＧＦ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＶＩＩ
（Ｔｒｋ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＶＩＩＩ（Ｅｐｈ受容体ファミリー）；ＲＴ
ＫクラスＩＸ（ＡＸＬ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＸ（ＬＴＫ受容体ファミリー）
；ＲＴＫクラスＸＩ（ＴＩＥ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＸＩＩ（ＲＯＲ受容体フ
ァミリー）；ＲＴＫクラスＸＩＩＩ（ＤＤＲ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＸＩＶ（
ＲＥＴ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラスＸＶ（ＫＬＧ受容体ファミリー）；ＲＴＫクラ
スＸＶＩ（ＲＹＫ受容体ファミリー）；及びＲＴＫクラスＸＶＩＩ（ＭｕＳＫ受容体ファ
ミリー）を含む。好ましくは、これら受容体を有する融合タンパク質の調製において、受
容体の一部のみを含む、すなわち、細胞外Ｎ末端領域を含み、免疫グロブリン（Ｉｇ）様
又は上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型リピート、又はＲＴＫ
の各サブファミリーに特徴的な高システイン領域を含む様々な保存要素を示すポリペプチ
ドを調製する；これらドメインは、主として、細胞外リガンド、例えば特定の増殖因子又
はホルモンに結合するリガンド結合部位を含む。細胞内Ｃ末端領域は、最も高い保存レベ
ルを示し、これら受容体のキナーゼ活性を担当する触媒ドメインを含み、ＲＴＫ基質の受
容体自己リン酸化及びチロシンリン酸化を触媒する。

受容体型チロシンキナーゼ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋを含む様々な情報源から入手可能で
ある。本発明に従って断片及び融合タンパク質を創出するのに用いることができる例示的
配列は、例えばＲａｎｄらの論文（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇ
ｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ.” Ｐｒｏｃ. Ｎａｔ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｏｃｔｏｂｅｒ
４, ２００５ ｖｏｌ. １０２ ｎｏ. ４０ １４３４４−１４３４９）で与えられる。下
記のリストは、その刊行物から抜粋される。

Ｌｅｅらの論文（“Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ
ｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ： ａ ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆ
ｌｔ４,” ＰＮＡＳ Ｍａｒｃｈ ５, １９９６ ｖｏｌ. ９３ ｎｏ. ５ １９８８−１
９９２）も参照されたい。

本発明で使用する受容体の正確な断片は、本教示及び既存の受容体構造の知識を考慮し
て決定することができる。リガンド結合ポケットのみをコードする正確な配列を用いるこ
とが必要ではない。追加のアミノ酸を含むある程度の柔軟性が認容される。例えば、米国
出願公開第２００４／１３２６３４号で開示されるように、全てのＥｐｈファミリーメン
バーのＮ末端細胞外領域がリガンド結合に必要なドメインを含み、具体的には、高システ
インドメイン及び２個のフィブロネクチンＩＩ型リピートが後に続く。一般に、Ｎ末端部
分の約４００、５００又は６００アミノ酸を、受容体型チロシンキナーゼのリガンド結合
断片として用い得る。

上記リストは、アミノ酸及びヌクレオチド配列を提供する。他のヌクレオチド配列は、
Ｇｅｎｂａｎｋからペプチド又はタンパク質の名称について検索することによって得るこ
とができる。ノッチンＤＮＡ配列は、与えられたアミノ酸配列から、いずれかのコドンア
サインメントを用いて得ることができる；コドンアサインメントは、酵母のような、用い
る発現ベクターに基づき選択することができる。ＥＥＴＩヌクレオチド配列は、国際公開
第０２／３４９０６号、ＧｅｎＢａｎｋのＡＸ４９７０５５で与えられており；ＡＧＲＰ
ヌクレオチド配列はＮＧ＿０１１５０１で見ることができ；アガトキシンのヌクレオチド
配列はＧｅｎｂａｎｋのＭ９５５４０．１で見ることができる。別のノッチンのアミノ酸
及びヌクレオチド配列は、ノッチンであるプサコテアシン（Ｐｓａｃｏｔｈｅａｓｉｎ）
に関する論文（Ｊ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. （２０１０）, ２０（
４）, ７０８-７１１）で見ることができる。

［融合体に有用な受容体リガンド断片］
ここで、特定の受容体リガンドである肝細胞増殖因子及び抗体Ｆｃ断片を例示する。肝
細胞増殖因子（ｃ−ｍｅｔとも呼ばれる）を断片化して、ｍｅｔ受容体に結合することが
知られている部分を得た。このＨＧＦ断片はＮＫ１断片としても知られている。例示配列
を配列番号６６で与える。この配列は、ＰＡＮ＿Ａｐｐｌｅスーパーファミリーの配列の
一部及びＫＲスーパーファミリーの配列の一部を含む。従って、本教示で与えられる本明
細書で例示する組成は、肝細胞増殖因子様タンパク質；プラスミノーゲンドメイン含有タ
ンパク質；マクロファージ刺激因子１；及び、ＲＯＮ（“recepteur d’origine Nantais
”）のような他のプラスミノーゲン関連増殖因子を含むように拡張することができる。Ｍ
ａｅｓｔｒｉｎｉらの論文（“Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｔｈｅ ＭＥＴ−ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ,“ ＰＮＡＳ Ｊａｎｕａｒｙ ２３, １９
９６ ｖｏｌ. ９３ ｎｏ. ２ ６７４−６７８）を参照されたい。哺乳動物においても、
肝細胞増殖因子はセリンプロテアーゼの相同体であるが、そのタンパク質分解活性を失っ
ていた。

［二重特異性タンパク質の投与］
本発明の融合タンパク質は、細胞培養研究におけるような試験管内で、すなわち、移植
用の細胞に投与してもよいが、生体内に投与してもよい。治療用タンパク質について使用
される様々な処方及び投与計画を用いることができる。医薬組成物は、ＣＦＰに加えて、
動物への投与に適し（例えば、生理食塩水）ひいては活性な融合タンパク質の医薬上使用
することが出来る調剤薬への加工を促す助剤（賦形剤、安定剤又は希釈剤のような）を含
む、適切な、医薬として許容される担体、生物学的に適合性のビヒクル及び添加剤を含む
ことができる。このような組成物は、最終的に、本発明のキメラタンパク質と相乗的に又
は協調的に作用する別の治療用組成物と併用することができる。あるいは、他の医薬組成
物は、特定の疾患に対して治療効果があることが知られている融合タンパク質（例えば、
乳癌に対するハーセプチン）を用いて基礎とすることができる。あるいは、可溶性のもの
を含む医薬組成物を組み合わせて、様々な治療計画で使用するための“カクテル”とする
ことができる。

医薬組成物は、投与方法の要求を満たすいずれか許容されるやり方で調剤することがで
きる。例えば、生体材料及び他の薬物送達用ポリマーの使用、更に、特定の投与方法を有
効にする様々な技術及びモデルは、文献に開示されている（Ｌｕｏ Ｂ ａｎｄ Ｐｒｅｓ
ｔｗｉｃｈ Ｇ Ｄ, ２００１； Ｃｌｅｌａｎｄ Ｊ Ｌ ｅｔ ａｌ., ２００１）。

当業者は、一般に受け入れられたあらゆる投与方法を用いて測定して、そのときの融合
タンパク質の所望の血中レベルを定めることができる。例えば、投与は、皮下、静脈内、
硬膜外、局所、皮内、髄腔内、直接脳室内、腹腔内、経皮（例えば、徐放製剤で）、筋肉
内、腹腔内、鼻腔内、肺内（吸入）、眼内のような様々な非経口経路、経口経路、又は口
腔経路によることができる。

他の特に好ましい投与経路は、エアゾール製剤及びデボー製剤である。発明した薬剤の
持続放出製剤、特にデボー製剤が明確に意図される。

非経口投与は、ボーラス注射によるもの又は時間をかけた段階的な灌流によるものとす
ることができる。非経口投与用製剤は、本技術分野で既知の助剤若しくは賦形剤を含み得
る滅菌水又は非水性溶液、懸濁液及びエマルションを包含し、常法に従って調製すること
ができる。更に、活性な融合タンパク質の懸濁液を適切な油性注射懸濁液として投与して
もよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油、又は合成脂
肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル若しくはトリグリセリドが挙げられる。水性注
射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでもよく、その物質としては、例えば
、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランが挙げ
られる。任意により、懸濁液は、安定剤を含んでもよい。医薬組成物は、注射による投与
に適する溶液を含み、約０．０１〜９９％、好ましくは約２０〜７５％の活性な融合タン
パク質を賦形剤と一緒に含む。直腸投与することができる組成物としては、坐剤が挙げら
れる。

非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）投与用に、活性なタンパク質を、医薬として
許容される非経口用ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）及び浸透
圧を維持する（例えば、マンニトール）又は化学的安定性を維持する（例えば、保存剤及
び緩衝剤）添加剤と併せて、液剤、懸濁剤、エマルション又は凍結乾燥粉末として調剤す
ることができる。製剤は、通常用いられる技術によって滅菌される。経粘膜投与用に、透
過すべき障壁に適した浸透剤を製剤に用いる。このような浸透剤は、本技術分野で一般に
知られている。

経口的に服用することができる医薬として又は生理学上許容される製剤としては、ゼラ
チンで 作られた押し込み式カプセル、及びゼラチンとグリセロール又はソルビトールの
ような可塑剤とから作られた封止ソフトカプセルが挙げられる。押し込み式カプセルは、
活性成分を、乳糖のような充填剤、デンプンのような結合剤、及び／又はタルク若しくは
ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤と、また任意により安定剤との混合物として含
むことができる。ソフトカプセルでは、活性な融合タンパク質を、脂肪油、流動パラフィ
ン、又は液状ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解又は懸濁させてもよい
。更に、安定剤を加えてもよい。全ての経口投与用製剤は、かかる投与に適する用量とす
べきである。

融合タンパク質を注射、例えば、ボーラス注射又は連続的灌流による非経口投与用に調
剤することができる。注射用製剤は、添加された保存剤と共に、単位用量形態で、例えば
、アンプルで又は多回投与容器で存在することができる。医薬組成物は、水性ビヒクル中
に懸濁剤、液剤又はエマルションのような形態とすることができ、懸濁剤、安定剤及び／
又は分散剤のような製剤化剤を含むことができる。あるいは、活性成分を、使用前にパイ
ロジェンフリーの滅菌水のような適切なビヒクルでの構成用の粉末形態又は凍結乾燥形態
とすることができる。

先に説明した製剤に加えて、融合タンパク質は、デポー製剤として調剤することもでき
る。そのような長期作用性剤は、埋め込み（例えば、皮下若しくは筋肉内に）よって又は
筋肉内注射によって投与することができる。よって、例えば、融合タンパク質を、適切な
高分子若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）若しくはイ
オン交換樹脂を用いて製剤化してもよく、又は難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩と
して調剤してもよい。更に、融合タンパク質は、治療薬を含有する固形疎水性ポリマーの
半透過性マトリックスのような持続放出システムを用いて送達してもよい。様々な持続放
出材料が本技術分野で確立されており、周知である。持続放出カプセルは、その化学的性
質に依存して、融合タンパク質を数週間から最長１００日又は１年を超えて放出すること
ができる。

投与される用量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態及び体重、もしあれば、併用
療法、処置の頻度、並びに所望される効果の性質によって左右されるであろうことが理解
される。用量は、当業者によって理解され、また決定することができるように、個々の患
者に合わせて調整されるであろう。各治療に必要な総用量は、多段階投与によって又は単
回投与で投与することができる。本発明の医薬組成物は、単独で、又はその病状若しくは
その病状の他の症状を対象とする他の治療薬と併用して投与することができる。大抵、活
性なタンパク質の１日用量は、体重１キログラム当たり０．０１〜１００ミリグラムから
なる。望む結果を得るためには、通常、分割投与で又は持続放出形態で１日当たり１キロ
グラム当たり１〜４０ミリグラム与えられることが有効である。二回目の又は後続の投与
は、個体に最初に若しくは前回投与された用量と同じ、それより少な又はそれより多い用
量で行うことができる。本発明によると、本発明の物質は、治療上有効量で、他の治療計
画又は薬物の前に、同時に又はその後に（例えば、多剤併用療法）、予防的に又は治療的
に個体に投与することができる。他の治療薬と同時に投与される活性薬剤は、同一組成物
で又は異なる組成物で投与することができる。

本発明の方法で用いるあらゆるタンパク質について、治療上有効量を最初に細胞培養試
験から見積もることができる。例えば、試験管内の系でサイトカイン発現を低減すること
が示された濃度点又は濃度範囲を含む又は包含する循環濃度範囲を達成する用量を動物モ
デルで処方することができる。このような情報を用いて、ヒトで有用な用量をより正確に
決定することができる。治療上有効量は、患者の症状の改善をもたらす融合タンパク質量
を指す。このような融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物におい
て標準製薬手順により、例えば、ＬＤ５０（被験集団のうちの５０％の致死量）及びＥＤ
５０（被験集団のうちの５０％に治療効果のある用量）を測定することによって、決定す
ることができる。毒性と治療効果の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０の比
として表現することができる。高い治療指数を示す融合タンパク質が好ましい。これら細
胞培養試験及び動物研究から得られたデータを、ヒトで使用するための用量範囲の調剤に
用いることができる。このような融合タンパク質の用量は、好ましくは、毒性が殆ど又は
全くなくＥＤ５０を含む循環濃度範囲内である。その用量は、この範囲内で、用いられる
剤形及び利用される投与経路に応じて変動し得る。的確な製剤、投与経路及び用量は、個
別の医師が患者の健康状態を考慮して選択することができる。

実施例１〜５で説明するように、我々が“ドメインの付加及び進化”と呼ぶ、既存のタ
ンパク質−タンパク質相互作用を操作する包括的な方法を開発し、その方法では、増強が
、合成結合ドメインの付加及びそれに続く試験管内進化を通じて結合境界面を拡張するこ
とによって達成される。合成ノッチン結合ドメインの付加及び進化を通じてＧａｓ６とＡ
ｘｌ受容体との間の天然の高親和性リガンド−受容体相互作用を増強する能力を示すこと
によって、この方法を検証した。

我々は、ＥＥＴＩ−ＩＩ−ａｘｌ融合変異体が、最大４倍に増大したＧａｓに対する親
和性を有することを特定した。重要なことは、Ａｘｌ Ｉｇ１が突然変異誘導及びスクリ
ーニング過程の間に変異を累積しなかったことであり、これは、親和性の増大が改変ＥＥ
ＴＩ−ＩＩ変異体によるものであり得ることを示している。改変ループの野生型ＥＥＴＩ
−ＩＩ配列への個々の復帰は、幾つかのＥＡ変異体が親和性増大のために両方の改変ルー
プを必要とすることを確かめた。我々の知る限り、これは、ノッチンの２個のループを外
因性の標的に向けた結合面へと操作した最初の例である。また、３個のＥＡ変異体の各々
は、およそ４５％の非天然ＥＥＴＩ−ＩＩアミノ酸配列を含む。合わせて、これは更に、
新規な結合試薬の生成に対するノッチンの折り畳みの頑強性を立証する。また、この研究
は、癌の転移におけるＡｘｌの役割を伝えることにも関連する。ドミナントネガティブな
Ａｘｌ受容体は、腫瘍細胞の移動及び転移を抑制し（Ｖａｊｋｏｃｚｙ ｅｔ ａｌ., ２
００６；Ｒａｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ., ２０１０）、親和性が増大したＥＡ変異体は、有用
な治療薬候補であり得る。

この方法の更なる応用は、ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定を含む。
腫瘍標的に結合するように操作したＥＥＴＩ−ＩＩペプチドは、生体内分子イメージング
法にとってかなり有望である。しかしながら、ナイーブライブラリーからの結合タンパク
質の同定は、一つには、同定したタンパク質の親和性が検出に充分な程度に高くなければ
ならないという要求のため、難しい。例えば、酵母表面提示結合において一桁台のμＭの
範囲の親和性は検出限界を下回り、そのようなタンパク質は一般にライブラリーソーティ
ングの間に濃縮されないであろう。ドメインの付加及び進化は、既存の相互作用を増強す
るが、それ自体は分離した状態で検出限界を下回る親和性を有する合成結合ドメインの同
定を可能にする“アンカーリング”ストラテジーとして用いることができる。この裏付け
として、ノッチン変異体をＡｘｌの不存在下で発現させた場合、本発明で開発したＥＥＴ
Ｉ−ＩＩ変異体は、Ｇａｓ６に対し検出限界を下回る弱い結合親和性を示す。それに続く
従来のストラテジー又は更なるドメインの付加及び進化による親和性成熟を用いて、高い
親和性を有する合成結合薬物を充分に生成することができる。

下記で説明するように、αｖβ３／αｖβ５インテグリンに結合する改変ＥＥＴＩノッ
チン変異型２．５Ｄを、野生型ＡｘｌのＩｇ１のＮ末端に直接融合させた。この多重特異
性融合タンパク質の構想を、酵母表面ディスプレイを用いて、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ
が単一特異性のタンパク質であるＥＥＴＩ２．５及びＡｘｌそれぞれに匹敵するレベルで
αｖβ３インテグリン及びＧａｓ６に結合したことを示すことによって、立証した。更に
、αｖβ３インテグリン又はＧａｓ６の結合は、飽和濃度の他の標的の存在によって影響
を受けなかった。このことは、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌがαｖβ３インテグリンとＧａ
ｓ６の両方と同時に相互作用できることを示唆する。ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タン
パク質は、微生物宿主で３５ｍｇ／Ｌの規模で組み換え的に生産することができた。生成
したタンパク質は、細胞表面上に発現したαｖβ３インテグリンに対して高い親和性（約
２ｎＭのＫ_Ｄ）を提示した。

［例１：試薬及び培地］
ＳＤ−ＣＡＡ培地は、２０ｇ／Ｌのグルコース、６．７ｇ／Ｌの酵母窒素原基礎培地（
アミノ酸を含まない）、５．４ｇ／ＬのＮａ_２ＨＰＯ_４、８．６ｇ／ＬのＮａＨ_２ＰＯ_４
・Ｈ_２Ｏ、及び５ｇ／Ｌのバクトカザミノ酸を含有した；ＳＧ−ＣＡＡ培地は、グルコー
スを２０ｇ／Ｌのガラクトースで置き換えたことを除いて、同一であった。ｐＨ４．５の
ＳＤ−ＣＡＡ培地は、リン酸塩を１３．７ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム二水和物及び８．
４ｇ／Ｌのクエン酸無水物で置き換えて、ｐＨ４．５に調整したことを除いて、ＳＤ−Ｃ
ＡＡと同一であった。Ｇａｓ６タンパク質及びＡｘｌ−Ｆｃタンパク質は、Ｒ＆Ｄシステ
ムズ社から購入し、チキン抗ｃｍｙｃ抗体及びヤギ抗チキンＡｌｅｘａ５５５抗体はイン
ビトロジェン社から購入し、マウス抗Ｈｉｓ Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ４８８モノクロ
ーナル抗体は、Ａｎａｓｐｅｃ社から購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、１
１．９ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの
塩化カリウムからなる。ＰＢＳ／ＢＳＡは、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含むＰ
ＢＳからなった。

［例２；酵母表面提示ライブラリー生成：ＥＥＴＩ／Ａｘｌ融合体］
ＥＥＴＩ−ＩＩループ１を置き換える、７、８、９又は１０個の縮重ＮＮＳコドンを有
する４種のフォワードアッセンブリープライマーと、ＥＥＴＩ−ＩＩループ３を置き換え
る、６、７又は８この縮重ＮＮＳコドンを有する３種のリバースアッセンブリープライマ
ーとを用いて、ＥＥＴＩ−ＩＩループライブラリーを構築した。（ＥＥＴＩ−ＩＩアミノ
酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ１２０７１であり；ＤＢＮＡ配列は、２
００９年４月３日に出願された同時係属米国出願第１２／４１８,３７６号で与えられ、
参照により本明細書にも含まれる。ＤＮＡ配列は、与えられたアミノ酸配列の逆翻訳によ
って所望の通りに設計できる。）プライマー配列は、ループに隣接する領域に相補性であ
った。ＥＥＴＩ−ＩＩ、ランダム化ループ１及びループ３並びにＡｘｌ中のランダム化ル
ープのアミノ酸配列を、図１Ｄに示す。１×ＫＯＤポリメラーゼバッファー、０．２ｍＭ
のｄＮＴＰ，１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１Ｍのベタイン、及び２．５ユニットのＫＯＤポ
リメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）と共に、４種のフォワードプライマーをプールしてそれ
ぞれ１μＭで用い、３種のリバースプライマーのそれぞれをプールして、それぞれ１．３
３μＭで用いた。熱サイクルパラメーターは次の通りであった。ステップ１：９５℃で２
分；ステップ２：９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分（３０サイクル）；ス
テップ３：７２℃で１０分。構築したＤＮＡ（０．６μＬ）を、２μＭのフォワード及び
リバース増幅プライマー、１×Ｐｆｘ５０バッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ及び５ユニ
ットのＰＦｘ５０ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社）を用いて増幅させた。フォ
ワード増幅プライマーはｐＣＴ骨格に対して５０ｂｐの相同性を有し、一方、リバース増
幅プライマーはＡｘｌ Ｉｇ１のＮ末端に対して５０ｂｐの相同性を持ち、ＥＥＴＩ−Ｉ
ＩのＣ末端（Ｓｅｒ２９）とＡｘｌ Ｉｇ１のＮ末端（Ａｒｇ２１）との適切なＳｅｒ−
Ａｒｇ結合を確実にするように設計した。プラスミド骨格の調製について、ＮｈｅＩ制限
部位及びＢａｍＨＩ制限部位を用いて、Ｉｇ１ドメインを含むＡｘｌアミノ酸（２２〜１
３２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ３０５３０）を、酵母提示ｐＣＴプラスミド
（Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ，１９９７）にクローン化した。Ａｘｌ配列の５’に直
接ＡｖｒＩＩ制限部位を含めた。これを、ＮｈｅＩ部位の下流に、制限消化を促す１４ｂ
ｐの“ジャンクＤＮＡ”のスペーサーとともに配置した。このプラスミドをｐＣＴ Ａｖ
ｒ−Ａｘｌと名付けた。ライブラリー合成用のプラスミド骨格は、ｐＣＴ Ａｖｒ−Ａｘ
ｌをＮｈｅＩ制限酵素及びＡｖｒＩＩ制限酵素で消化することによって作成した。合計で
約５０μｇのｃＤＮＡ挿入物と約２５μｇの制限消化ｐＣＴ Ａｖｒ−Ａｘｌ骨格とを電
気穿孔法によってＥＢＹ１００に形質転換し、相同組み換えによって生体内で構築を行っ
た。連続希釈プレーティング及びコロニー計数によって見積もったように、１．２×１０
^８個の形質転換体のライブラリーが得られた。無作為に選択したクローンの配列解析で、
ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体においてＥＥＴＩ−ＩＩとＡｘｌ Ｉｇ１との適切な融合及び所望
のループ長分布を確かめた。

酵母表面ディスプレイは、米国特許第６,４２３,５３８号で更に説明される。一般に、
少なくとも１０^４個の形質転換体が得られるであろう。

プライマーは、下記のように設計した。

［ＥＥＴＩ−Ａｘｌライブラリー合成／アッセンブリー及び増幅用ＤＮＡオリゴヌクレ
オチドプライマー］
下記配列において、プラスミド骨格に対する相同性のために用いるヌクレオチドを５’
末端から最初の斜線までで示す。プライマーの最初の斜線から二重斜線までの部分及びプ
ライマーの三重斜線から３’末端までの部分は、ＥＥＴＩ−ＩＩの残基と一致する。Ｎは
いずれかのヌクレオチドを表わし、ＳはＧ及びＣの入り交りである。プライマーの二重斜
線から三重斜線までの部分は、ＥＥＴＩ−ＩＩループ１又はループ３のランダム化残基を
生成するために用いるヌクレオチドである。

L1_7X_fwd:
Ggttctgctagc/ggttgt//nnsnnsnnsnnsnnsnnsnns///
tgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt (配列番号:６７)

L1_8X_fwd:
Ggttctgctagc/ggttgt//nnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnns///
tgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt (配列番号:６８)

L1_9X_fwd:
Ggttctgctagc/ggttgt//nnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnns///
tgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt (配列番号:６９)

L1_10X_fwd:
Ggttctgctagc/ggttgt//nnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnns///
tgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt (配列番号:７０)

下記のリバースプライマーの場合は、５’末端から最初の斜線までが、アクセプタープ
ラスミド骨格部分でもあるＡｘｌ受容体構築物のＮ末端をコードするヌクレオチドと相同
である。上のように、最初の斜線から二重斜線までの領域及び三重斜線から３’末端まで
の領域は、ＥＥＴＩ−ＩＩの残基と一致する。Ｎはいずれかのヌクレオチドを表わし、Ｓ
はＧ及びＣの入り交りである。

L3_6X_rev:
Cgtgcccct/gagaccaca//snnsnnsnnsnnsnnsnn///
acaaacacaaccagccaaacaatcag (配列番号７１)

L3_7X_rev:
Cgtgcccct/gagaccaca//snnsnnsnnsnnsnnsnnsnn///
acaaacacaaccagccaaacaatcag (配列番号７２)

L3_8X_rev:
Cgtgcccct/gagaccaca//snnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnn///
acaaacacaaccagccaaacaatcag (配列番号７３)

ＰＣＲアッセンブリーによるライブラリー合成の後に、そのライブラリーを、プラスミ
ド骨格に対して約５０塩基対の相同性（下線部、リバース増幅プライマーの場合について
はＡｘｌ配列に対する相同性を含む）を含む下記の増幅プライマーを用いて増幅した。約
５０塩基対の相同性は、“Ｒａｙｍｏｎｄ ＣＫ, Ｐｏｗｎｄｅｒ ＴＡ, Ｓｅｘｓｏｎ
ＳＬ. １９９９. Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｓｔｒ
ｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ. Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２６：１３４−１３８, １４０−１３１.”に記載されるように、
ライブラリー挿入物とプラスミド骨格とのアッセンブリーを可能にする。

Library_amplification_reverse:
Ttccctgggttgcccacgaagggactttcttcagcctgcgtgcccct/gctaccaca (配列番号７４)

Library_amplification_forward: (プラスミド骨格に対する相同性は斜線の５’側)
Ggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctgctagc/ggttgt (配列番号７５)

［例３：Ｇａｓ６を用いたライブラリースクリーニング］
様々な濃度のＧａｓ６を酵母提示ライブラリーとともにＰＢＳ／ＢＳＡ中で室温にて約
２〜３時間インキュベートした。最後の１時間は、チキン抗ｃｍｙｃ抗体を１：２５０の
最終希釈物に加えた。遠心分離によって細胞をペレット化して、１ｍＬの氷冷ＰＢＳ／Ｂ
ＳＡで洗滌し、ヤギ抗チキンＡ５５５の１：１００希釈物及びマウス抗Ｈｉｓ４８８抗体
の１：１００希釈物を含有するＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁させ、２分間氷冷した。細胞を
ペレット化し、１ｍＬの氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡで洗滌して、Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥフローサ
イトメーター（スタンフォードＦＡＣＳ）で蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）に
より分取した。収集した細胞をｐＨ４．５のＳＤ−ＣＡＡ培地中で増幅し、ＦＡＣＳの更
なるラウンドのためにＳＧ−ＣＡＡ培地中で３０℃にて発現を誘導して、変異体に富むプ
ールを得た。ＦＡＣＳによる分取の最初のラウンドは、合計およそ８×１０^７個の分取細
胞に対する３つの別個の分取からなり、その後の分取ラウンドは、先のラウンドで収集し
た酵母の数の少なくとも１０×で解析して、残りのライブラリー変種の充分な試料採取を
確実にした。Ｇａｓ６の濃度を低減することにより、分取のストリンジェンシーを増加さ
せた。後の分取ラウンドでは、Ｇａｓ６とのインキュベーションに続いて、細胞をペレッ
ト化し、洗滌し、“解離速度”分取のために発現競合者（Ａｘｌ−Ｆｃの約５０倍のモル
過剰）の存在下でインキュベートした。非結合段階の最後の１時間では、チキン抗ｃｍｙ
ｃを１：２５０の最終希釈物に加えた。細胞をペレット化し、洗滌し、上述のように二次
抗体で染色した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて酵
母培養物からプラスミドＤＮＡを回収し、プラスミドミニプレップのためにＸＬ−１ Ｂ
ｌｕｅ ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ストラタジーン社）へ形質
転換させた。ＭＣ Ｌａｂ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ社、カリフォルニ
ア）によってＤＮＡ配列決定を行った。

５ラウンドの分取の後、ライブラリーは、野生型Ａｘｌ Ｉｇ１よりも強い結合を持つ
クローンを濃縮し始めた（図３）。ランダム化配列を含むライブラリーのスクリーニング
における一般的な問題は、人為的結合体をスクリーニングする可能性である。例えば、抗
ヘキサヒスチジン二次抗体（“ヘキサヒスチジン”は配列番号７７として開示される）を
用いてＧａｓ６結合を照らすことから、幾つかの“増強された”クローンは実際に二次抗
体に結合した。これに対するコントロールのため、０ｎＭのＧａｓ６及び従来通りの二次
抗体標識を用いたネガティブソーティングを行って、収集プールから二次結合体を除去し
た（図３、分取６）。二次結合体をモニターし続けたが、この１回のみのネガティブソー
ティングはその後の分取産物全体から人為的結合体を排除するのに充分であった。最後に
、Ｇａｓ６に対して野生型Ａｘｌ Ｉｇ１を上回る増強された結合を有する変異体の濃縮
プールを得た。比較のため、４６時間の‘解離’段階を用いた最後の分取は、４時間の‘
解離’段階のみを用いた第４分取よりも高く持続的な結合を示し、動力学的解離速度の有
意な改善を実証した。

［例４：改変変異体の特徴付け］
リガンド枯渇を回避して結合平衡に達するように実験的に決定した容積、細胞数及びイ
ンキュベーション時間を用いて、Ｇａｓ（０．０５〜４００ｎＭ）を、室温でＰＢＳ／Ｂ
ＳＡ中で対象のタンパク質を提示している５×１０^４個の酵母細胞に加えた。細胞をペレ
ット化して、氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡで洗滌し、チキン抗ｃｍｙｃの１：２５０希釈物を含有
するＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁させ、氷上で４０分間インキュベートした。細胞をペレッ
ト化して、洗滌し、ヤギ抗チキン及びマウス抗Ｈｉｓ二次抗体の１：１００希釈物を含有
するＰＢＳ／ＢＳＡ中に氷上で２０分間再懸濁させた。細胞を洗滌し、ＦＡＣＳ Ｃａｌ
ｉｂｕｒフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社）及びＦｌｏｗＪｏソフト
ウエア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）を用いて解析した。結合滴定を、カレイダグラフソフトウ
エアを用いて４パラメータシグモイド曲線にあてはめて、平衡結合常数（Ｋ_Ｄ）を決定し
た。動力学的非結合試験のため、細胞を結合平衡が達成されるまで２ｎＭのＧａｓ６と共
にインキュベートし、ついで洗滌し、ペレット化して、解離速度分取のために０、１、４
、９．２５、２３又は４６時間、上述のように５０倍モル過剰のＡｘｌ−Ｆｃの存在下で
インキュベートした。フローサイトメトリーによって持続結合を解析し、カレイドグラフ
ソフトウエアを用いて、未結合のものを単一又は二重指数関数デコイ曲線に適切にあては
めた。野生型ＥＡループ変異型への復帰のための持続的結合を、非結合段階を０〜９．２
５時間行ったことを除いて、動力学的結合試験と同じく行った。

第７、第８及び第９ラウンドの分取の産物から無作為に選択した合計３１個のクローン
の配列決定は、２０個のユニークなクローンを明らかにし、第１０ラウンドの分取では、
第９ラウンドの分取段物由来のクローンのうちの２個を濃縮した（下記の表３）。全ての
クローンは、最初のライブラリー設計に沿ったループ長を示し、どのクローンもＡｘｌ配
列に変異を含まなかった。これは、ＥＡクローンの親和性の増大がＥＥＴＩ−ＩＩ変異体
に特異的であることを示す。共通Ｐ−Ｇ／Ｔ−Ｍ／Ｋモチーフについて、２０個のクロー
ンのうち３個がループ３にＰＧＭモチーフを含み、２個の更なるクローンがＰＴＭ又はＰ
ＧＫを含んだ。Ｐ−Ｇ／Ｔ−Ｍ／Ｋモチーフに先行するＬ又はＬ−Ｘ及び後続するＲ−Ｓ
も発生率がさらに少なかった（図１Ｄ）。興味深いことに、２０個のＥＡ変異体のうちの
４個であるＥＡ７．０１、ＥＡ７．０５、ＥＡ７．０６及びＥＡ８．０４のみが改変ルー
プにシステインを含まなかったが、これらのうちの１個であるＥＡ７．０５は、ループ１
に先行する保存システイン残基にｃｙｓからａｒｇへの変異を含んだ。ループ３にＰ−Ｇ
／Ｔ−Ｍ／Ｋモチーフを含む幾つかの変異体も改変ループにシステインを含み、これは、
追加のシステインがＥＥＴＩ−ＩＩループ構造を完全には乱さない場合があることを示唆
する（表３）。しかしながら、対になっていないシステインの潜在的影響を最小限にする
ため、ＥＡ７．０１、ＥＡ７．０６及びＥＡ８．０４を更なる調査のために選択した。簡
略化のため、Ａｘｌ融合体の配列全体をここでは示さないが、配列番号４１、４６及び５
０について添付した配列表で示す。Ａｘｌ Ｉｇ１配列は、天然形態と変異形態の両方で
下記に示され、下記のＥＡ配列において、注記される場合以外は天然形態で用いられるこ
とが理解される。例えば、表３に列挙するＥＡ７．０１は、図１Ｄ及び配列番号４１に示
すように、Ａｘｌ Ｉｇ１のＮ末端に融合してＡｘｌ Ｉｇ１配列のＮ末端配列を続ける
。表３に列挙する他のＥＡ類は、“ＲＧＴ．．．”で始まるＡｘｌ配列と同様に融合する
。全長配列を配列番号４１、４６及び５０で与え、図１Ｄで最長“ＱＡＥ．．．”部分ま
で図示する。繰り返すが、下記表３のポリペプチドにおいて、末端ＧＳは、下記で配列番
号８４に示すようにＡｘｌ Ｉｇ１ドメインに融合する。

［例５：Ｇａｓ６に対するＡｘｌ変異型の特徴付け］
酵母ディスプレイを用いてＧａｓと改変ＥＡ変異体との間の結合相互作用を特徴付ける
目的で、最初に、酵母ディスプレイがＧａｓ６−Ａｘｌ相互作用の正確な親和性測定を可
能にすることを確かめることを試みた。酵母提示されたＡｘｌを用いて、既に報告されて
いる表面プラズモン共鳴及び固相結合により測定されたＡｘｌ変異体の結合親和性を再現
することができた（表４）。これは、酵母提示されたＡｘｌが受容体の組み換え異形と同
様であることを立証する。

ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体のみの親和性は弱すぎて検出されなかったが、Ａｘｌ Ｉｇ１と
融合した場合、ＥＡ変異体は、野生型Ａｘｌ Ｉｇ１より最大で約４倍強いナノモル以下
の親和性を示した。ＡｘｌのＮ末端に融合した野生型ＥＥＴＩ−ＩＩは、野生型Ａｘｌと
同じ親和性を示した。これは、融合構築体が天然のＡｘｌ−Ｇａｓ６相互作用を妨げず、
親和性の向上が単純にＡｘｌのＮ末端へのＥＥＴＩ−ＩＩノッチンの融合に起因するとい
うよりもＥＥＴＩ−ＩＩループ変異体のためであることを更に実証する（図４及び表４）
。

増強された結合の性質を調査するため、結合研究を行って、解離速度をモニターした。
野生型Ａｘｌ Ｉｇ１又はＥＡ変異体を発現している酵母を２ｎＭのＧａｓ６と共にイン
キュベーションした後で、上述した‘解離速度’分取と同様なやり方で盛る過剰の競合者
と共にインキュベーションした。野生型Ａｘｌ Ｉｇ１は単一指数関数デコイモデルによ
ってよく説明される動力学的解離を示し、一方、ＥＡ変異体は、より複雑な動態を示し、
二重指数関数デコイモデルを用いてあてはめられなければならない（図５及び表５）。コ
ントロールとしての野生型ＥＥＴＩ−Ａｘｌは、野生型Ａｘｌ Ｉｇ１と識別不能な解離
速度を示し、単一指数関数デコイモデルによってよくあてはめられた（データは図示せず
）。

各々の改変ループの親和性増大への寄与を調べるため、ＥＡ変異体のループ１又は３を
個別に野生型ＥＥＴＩ−ＩＩ配列に復帰させてＧａｓ６に対する結合を試験した（図６）
。これら研究で、野生型ＥＥＴＩ−Ａｘｌを、両ループの野生型への“復帰”に対するコ
ントロールとして用いた。ＥＡ７．０６の持続的結合の評価は、ループ１の野生型ＥＥＴ
Ｉ−ＩＩ配列への復帰（ＥＡ７．０６ｗｔＬ１）は親のＥＡ７．０６変異体と同一の持続
的結合を示すことから、ループ３のみがＧａｓ６との相互作用に貢献することを明らかに
した（図６Ｂ）。ＥＡ７．０１及びＥＡ８．０４について、ループ１の野生型ＥＥＴＩ−
ＩＩ配列への復帰（ＥＡ７．０１ｗｔＬ１及びＥＡ８．０４ｗｔＬ１）は、それぞれの親
変異体よりも弱いが、野生型ＥＥＴＩ−Ａｘｌよりも強い持続的結合を示す。ループ３の
野生型への復帰（ＥＡ７．０１ｗｔＬ３及びＥＡ８．０４ｗｔＬ３）は、野生型ＥＥＴＩ
−Ａｘｌを上回る改良を完全に消失させた（図６Ａ及びＣ）。それと共に、これは、ＥＡ
７．０１及びＥＡ８．０４について、ループ３が主たる寄与因子であるが、結合の最大の
増強には両改変ループが必要であり、ＥＡ７．０６についてはループ３が単独の寄与因子
であることを実証する。

［例６：変異受容体断片（ＥＥＴＩ−ＩＩ−Ａｘｌ Ｉｇ１）を有するノッチン融合体］
下記の実施例は、インテグリンに結合するように操作した変異ＥＥＴＩ−ＩＩノッチン
に融合させたＡｘｌ Ｉｇ１受容体断片、つまりノッチン２．５Ｄ及び２．５Ｆの調製を
開示する。２．５Ｄ及び２．５Ｆは、両方ともエクバリウム・エラテリウムのトリプシン
阻害剤ＩＩ（ＥＥＴＩ−ＩＩ）ノッチンの変異型である。これらはノッチンをそれぞれ、
α_ｖβ_３インテグリン及びα_ｖβ_５インテグリン、並びにα_ｖβ_３インテグリン、α_ｖβ
_５インテグリン、α_５β_１インテグリンに特異的に結合するように操作した。これを達成
するため、ＥＥＴＩ−ＩＩのループ１を、インテグリン認識トリペプチドモチーフである
ＲＧＤを含むランダム化配列と置き換えた。ついで、酵母表面提示及び蛍光活性化セルソ
ーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、所望の結合特性を有するクローンを選択した。これら
インテグリンは臨床上重要な癌標的であり、Ａｘｌは同様に癌の治療用の新興の標的であ
る受容体型チロシンキナーゼである。Ａｘｌの過剰発現は様々な癌の侵襲性及び転移性表
現型と関連付けられており、Ａｘｌとその天然のリン癌度であるＧａｓ６との間の相互作
用に拮抗することは治療上価値があり得ることが示唆される。

ＡｘｌのＳ６−１及びＳ６−２は、Ａｘｌの天然リガンドであるＧａｓ６に野生型より
も高い親和性で結合する改変型のＡｘｌ Ｉｇ１である。エラープローンＰＣＲを用いて
、変異体を野生型Ａｘｌ Ｉｇ１遺伝子に導入し、生じた変異体ＤＮＡライブラリー酵母
の表面上で発現させた。ＦＡＣＳを用いて、Ｇａｓ６に対する結合が向上したクローンを
単離した。クローンＳ６−１及びＳ−２は、野生型をそれぞれ２０倍及び１２倍上回る平
衡結合の向上を示し、向上は主として解離速度の改善に由来する。Ｇａｓ６を強力に結合
することに加えて、Ｓ６−１は、安定性の有意な増大を表す、野生型を１３℃上回る融解
温度の改良を有する。

下記表７は、用いた様々なペプチド（ＥＥＴＩ−ＩＩ）及びＡｘｌ変異体を示す。

［アミノ酸配列］
野生型ＥＥＴＩ−ＩＩ、２．５Ｄ及び２．５Ｆのアミノ酸配列を下に示す。下に示すよ
うに１アミノ酸変異及び欠失をＡｘｌ Ｉｇ１受容体断片に導入した。角括弧付き[ＡＰ]
は、表３で示すＥＡ融合体で除外した。

融合構築物：
標準的なクローニング技術を用いて、ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体をコードする遺伝子とＡｘｌ
Ｉｇ１をコードする遺伝子とを、融合タンパク質をコードする１個の遺伝子構築物へと
組み立てた。ＥＥＴＩ−ＩＩドメインをＡｘｌ Ｉｇ１のＮ末端に融合させ、Ｎ末端ノッ
チンドメインに続くＡｘｌ Ｉｇ１ドメインからなる融合タンパク質を得た。融合体の全
体の柔軟性を改善するため、ＥＥＴＩ−ＩＩの最後のプロリンとＡｘｌの最初のアラニン
及びプロリンとを除去した。次いで融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現プラスミド
と選択プラスミドの両方に連結した。この融合タンパク質を酵母の表面上で発現させて、
可溶性に産生されることに加えて、結合研究を可能にしている。

データ：
簡単に言うと、２．５Ｄ−Ａｘｌを提示した酵母を用いて、この融合体が機能的である
かを試験した。融合体の可溶性α_ｖβ_３インテグリン及びＧａｓ６に結合する能力を測定
して、２．４単独及びＡｘｌ単独で示される結合レベルと比較した。融合体は、２．５の
もとの一致したα_ｖβ_３結合親和性を示し、同時に野生型ＡｘｌのＧａｓ６に対する親和
性を維持し、融合構築物を有効であると確認した。加えて、各可溶性標的の結合を飽和量
の第二標的の存在下で試験して、融合体のα_ｖβ_３インテグリンとＧａｓ６の両方に同時
に結合する能力を試験した。これら結合レベルは、それらを個別に測定した場合と同じで
あり、融合体が実際にその標的両方に同時に結合できることを示唆した。最後に、融合体
が安定であることを確認するため、融合体を酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ）中で可溶性に生産させた。精製組み換え体の収量は１リットルあたり５
０〜７５ｍｇ程度であった。これらタンパク質を、α_ｖβ_３インテグリンを過剰発現する
ように形質転換した細胞に対して結合する能力について試験した。それらは、２．５Ｄに
ついて先に測定したのと一致する平衡結合を示し、更に、２個のタンパク質ドメインを融
合させることは結合特性に負の影響を及ぼさなかったことを立証した。

融合体の機能：
このノッチン−Ａｘｌ融合体は、インテグリン結合と天然のＧａｓ６／Ａｘｌ相互作用
の両方に同時に拮抗することができる多重特異性分子として機能するであろう。Ｇａｓ６
が可溶性リガンドである一方でインテグリン類は細胞表面受容体であり、両方の標的は同
時に結合されることを可能にする。Ｇａｓ６の結合は、可溶性リガンドを捕捉し、可溶性
リガンドが細胞外Ａｘｌ受容体に結合して活性化するのを妨げるであろう。インテグリン
受容体に対する結合は、細胞外基質タンパク質と結合するのを妨げるであろう。

［例７：改変ノッチンの収量を向上させるノッチン融合体］
上述のように、ノッチン類は、組み換え的に産生することが困難であり得る。それらを
よく発現しているタンパク質に融合させることによって、それらを高収率で発現させるこ
とができる。ノッチンの切断は、タンパク質ドメイン間にプロテアーゼ部位を挿入するこ
とにより達成することができる。

融合構築物：
標準的なクローニング技術を用いて、ＥＥＴＩ−ＩＩ変異体をコードする遺伝子とＡｘ
ｌ Ｉｇ１をコードする遺伝子とを、融合タンパク質をコードする１個の遺伝子構築物へ
と組み立てた。ノッチン融合体のＮ末端とＣ末端の両方を、タバコエッチ病ウイルス（Ｔ
ＥＶ）認識部位であるＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号８０）を有し、タンパク質ドメイン間に
挿入されるように作成した。次いで、遺伝子を酵母発現プラスミドに連結し、酵母ピキア
・パストリスを形質転換した。

Ｎ末端融合体とＣ末端融合体の双方を１リットル当たり約５０ｍｇの精製収量で産生さ
せた。次いで、精製した融合体にＴＥＶによるタンパク質分解切断を行って、ノッチンド
メインを遊離させた。次いで、ノッチンを、ＦＰＬＣによって更に精製し、その融合パー
トナーから分離した。注目すべきは、フォールドした機能性ＥＥＴＩ変異体２．５Ｄが、
この融合タンパク質の助けなしに酵母で発現できなかったことである。

Ｎ末端融合体は、太字で示す連結配列を含むことが分かる。加えて、直接融合は、連結
配列なしに行うことができた、すなわち、２．５Ｄ ＥＥＴＩ／インテグリンペプチドの
カルボキシ末端セリンをＡｘｌ Ｉｇ１ドメインのアルギニンに直接融合させる。ＥＥＴ
Ｉ２．５ＤをＡｘｌ Ｉｇ１に融合させることによってαｖβ３／αｖβ５インテグリン
及びＧａｓ６を結合することができる多重特異性分子を形成した。Ａｘｌの結晶構造の解
析は、Ｎ末端が二次構造構成要素から充分に遠く離れており、実施例９で記載する直接融
合を用いて、ノッチンに対する直接融合が適切に生じたことを示唆した。

［例８：Ｍｅｔ受容体を結合する改変ＨＧＦ断片（ＮＫ１）に融合したα_ｖβ_３に対する
ＡｇＲＰノッチン］
Ａｒａｓ４と名付けられた最も強力な結合性ＮＫ１断片の１つでＡｇＲＰ変異体７Ａ
を連結することによって、二重特異性融合タンパク質を構築した。Ａｒａｓ４はＡｇＲＰ
７ＡのＣ末端で連結され、２つのドメイン間にアミノ酸リンカーは存在しない。

酵母表面ディスプレイを用いて、可溶性α_ｖβ_３インテグリン及びＭｅｔ受容体に対す
る結合を測定した。０．５ｎＭ及び５ｎＭのα_ｖβ_３インテグリン及びＭｅｔに対する結
合を測定してＡｇＲＰ７Ａ及びＡｒａｓ４単独と比較した（図７）。図７は、融合タンパ
ク質が、α_ｖβ_３インテグリン及びＭｅｔ受容体それぞれに対してＡｇＲＰ及びＮＫ１変
異体に匹敵する結合親和性を有することを示す。これは、融合タンパク質を発現でき、そ
の個々の構成部分がそれぞれの標的に立体障害なしに結合することを示す。

融合タンパク質ＡｇＲＰ７Ａ−Ａｒａｓ４のオープンリーディングフレームをｐＰＩＣ
Ｋ９Ｋプラスミドに組み込み、ピキア・パストリスを形質転換させた。メーカーの使用説
明書（インビトロジェン社）に従って、融合タンパク質を酵母培養物で発現させ、次いで
、ヒスチジンタグ（配列番号７７）による金属キレートクロマトグラフィーにより精製し
た。この融合タンパク質の遺伝子の概略図を下の四角形に示す。油号タンパク質ＡｇＲＰ
７Ａ−Ａｒａｓ４のタンパク質配列を表８に列挙し、下に列挙する。

上記は、ｐＰＣＩ９Ｋプラスミド中の融合タンパク質の遺伝子の模式図である。Ｓｎａ
ＢＩ、ＡｖｒＩＩ及びＭｌｕＩは制限酵素部位である。

ＮＫ１断片の変異型配列を用いることができ、これは、例えば、Ｈａｒｔｍａｎら、“
Ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｓｃ
ａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ/ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄ
ｓ ｔｈｅ ｃ−Ｍｅｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｅｌｌ ｄｉｓｓｏ
ｃｉａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ,” Ｐｒｏｃ. Ｎａｔ. Ａｃａ
ｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ Ｖｏｌ. ８９, ｐｐ. １１５７４−１１５７８, １９９２年１２月
に記載されている。
上記タンパク質（配列番号６６）の詳細を下に示す。

Ｃ末端でＨｉｓタグに下線を引いてある。ＡｇＲＰ７Ａ−Ａｒａｓ４融合タンパク質の
結合親和性を、α_ｖβ_３インテグリンとＭｅｔ受容体の双方を発現するＫ５６２−α_ｖβ
_３細胞で測定した（図８）。Ｋ５６２白血病細胞は予めα_ｖβ_３インテグリンで形質転換
した（Ｂｌｙｓｔｏｎｅ, Ｓ. Ｄ. （１９９４）. Ｊ. Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ. １２７, １
１２９-１１３７）。フローサイトメトリーにより、これら細胞株がＭｅｔ受容体も天然
に発現することも示した（データは図示せず）。

ノッチン（ＥＥＴＩ２．５Ｆ及びＡｇＲｐ７Ａ）並びにＮＫ融合タンパク質を作成して
、生物学的特徴の試験管内での研究のために精製した。これら様々なＮＫ変異型を、Ｍ２
．２、Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）及びＡｒａｓ４を含む２個の別個のノッチンタンパク質の
Ｃ末端に融合させた。従って、次のバリエーションで構成される６個のタンパク質：Ａｇ
Ｒｐ７Ａ−Ａｒａｓ４、ＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ａｒａｓ４、ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２、ＥＥ
ＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２、ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）及びＥＥＴＩ２．５Ｆ
−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）を構築して、試験管内アッセイに用いた。Ｍ２．２は指向進化
の第２ラウンドに由来し、Ａｒａｓ４は、我々の先のＮＫ１出願の指向進化の第３ラウン
ドに由来する。Ｄ１２７Ａは、アンタゴニスト活性を調節することが既に示されている点
変異である。

Ｋ５６２−α_ｖβ_３細胞結合アッセイでは、形質転換されてα_ｖβ_３インテグリンを発
現するＫ５６２細胞におけるα_ｖβ_３インテグリンに対するＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ
１２７Ａ）及びＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）の結合親和性（Ｋ_Ｄ値）が２
．１±１．１ｎＭ及び４．６±１．６ｎＭである。ＨＵＶＥＣ細胞結合アッセイでは、ヒ
ト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）及び
ＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）の結合親和性（Ｋ_Ｄ値）が９．４±１．０ｎ
Ｍ及び４．７±０．６ｎＭである。ＨＵＶＥＣは、中間レベルのα_ｖβ_３インテグリン、
α_ｖβ_５インテグリン及びＭｅｔ受容体並びに高レベルのα_ｖβ_３インテグリンを発現す
る。

加えて、デュアル受容体直接結合アッセイは、多重特異性タンパク質がＭｅｔ及びイン
テグリンに同時に結合することを示した。この実験では、可溶性Ａｌｅｘａ−４８８標識
ヒトＭｅｔ−Ｆｃ（２２０ｎＭ）と単一特異性タンパク質及び多重特異性タンパク質との
混合物をＫ５６２−αｖβ３細胞に加えた。結合はフローサイトメトリーによって検出し
た。ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２、ＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２、ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（
Ｄ１２７Ａ）及びＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）は可溶性Ｍｅｔ−Ｆｃに結
合でき、またＫ５６２−α_ｖβ_３細胞上のα_ｖβ_３インテグリンと結合した。これらの結
果は、ノッチン融合体がα_ｖβ_３インテグリン及びＭｅｔ受容体と同時に結合できること
を実証する。

タンパク質を４０％ヒト血清とともに３７℃で数日間にわたりインキュベートしたとき
に、ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）及びＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ２．２（Ｄ１２７
Ａ）の血清安定性が示された。試料をウエスタンブロットにより分析し、ＦＬＡＧエピト
ープタグに対する抗体を用いて検出した。７日間にわたり無傷の融合タンパク質の量に有
意な低減は観察されず、血清プロテアーゼ及び温度上昇に対するノッチン融合タンパク質
の安定性が示された。

細胞を０．５ｎＭのＨＧＦで刺激するＨＵＶＥＣ増殖アッセイを行った。ＡｇＲｐ７Ａ
、ＥＥＴＩ２．５Ｆ、ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）又はＥＥＴＩ２．５Ｆ−Ｍ
２．２（Ｄ１２７Ａ）タンパク質を加えて、ＨＵＶＥＣ増殖の阻害に対する効果を観察し
た。ＡｇＲｐ７Ａは、ＨＵＶＥＣ増殖に対してほとんど阻害効果を持たなかった。ＥＥＴ
Ｉ２．５Ｆ単独では、良好な阻害を示した（１μＭで７０％阻害、細胞単独の場合＝９０
％阻害）。ノッチン融合タンパク質ＡｇＲｐ７Ａ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）又はＥＥＴＩ
２．５Ｆ−Ｍ２．２（Ｄ１２７Ａ）は、陰性コントロールのものと等しい阻害レベルに近
づくＡｇＲｐ７Ａ及びＥＥＴＩ２．５Ｆと比較して、細胞増殖に対してより高い阻害効果
を示した。

Ｍｅｔ受容体リン酸化アッセイをＰＣ３（前立腺癌細胞）で行った。Ｍｅｔ受容体リン
酸化は、０．３ｎＭのＨＧＦで刺激した後にウエスタンブロットによりアッセイした。Ａ
ｇＲｐ７Ａ、Ａｒａｓ４及びＡｇＲｐ７Ａ−Ａｒａｓ４タンパク質を加えて、Ｍｅｔリン
酸化の阻害に対する効果を観察した。ＡｇＲｐ７ＡはＭｅｔリン酸化の阻害を示さなかっ
た。Ａｒａｓ４及びＡｇＲｐ７Ａ−Ａｒａｓ４の添加に対しては、Ｍｅｔ受容体リン酸化
の用量依存的な低減が観察され、ＡｇＲｐ７Ａ−Ａｒａｓ４ノッチン融合タンパク質でそ
れよりわずかに高い阻害効果が観察された。（注：ＰＣ３細胞は中間レベルのα_ｖβ_３イ
ンテグリン及びＭｅｔ並びに低レベルのα_５β_１インテグリンを発現する）

マイクロタイタープレートのウェル上にヒトビトロネクチンをコーティングし、様々な
濃度のＡｒａs４、ＡｇＲｐ７Ａ、ＥＥＴＩ２．５Ｆ、ＡｇＲｐ７Ａ−Ａｒａｓ４又はＥ
ＥＴＩ２．５Ｆ−Ａｒａｓ４の存在下で細胞を播種することによって、ビトロネクチンに
対するＰＣ３細胞接着の阻害を行った。予想通り、ＰＣ３細胞接着を阻害しなかったＡｒ
ａｓ４を除き、全ての構築物についての最大半量濃度の値は類似し、低ｎＭ範囲（約２０
〜４０ｎＭ）であった。

［例９：野生型Ａｘｌ受容体断片に直接融合したノッチン融合体］
例６で記載したように、ＥＥＴＩノッチン／インテグリン結合ペプチドのＡｘｌ膜結合
型キナーゼ受容体との直接結合体を調製した。Ａｘｌ Ｉｇ１ドメインのアミノ酸２１〜
１３２を用いた。ＥＥＴＩ２．５ＤをＡｘｌ Ｉｇ１に融合させることによって、αｖβ
３／αｖβ５インテグリン及びＧａｓ６を結合できる多重特異性分子を形成した。

配列を下に示し、ノッチンタンパク質２．５Ｄに下線を引き、Ａｘｌ部分は配列ＲＧＴ
．．．で始まる。

融合タンパク質がαｖβ３インテグリンとＧａｓ６の一方に結合する能力を、ＥＥＴＩ
２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク質を酵母提示構築物にクローン化して細胞表面上に提示さ
せる酵母提示プラットフォームを用いて試験した。ＥＥＴＩ２．５Ｄ、Ａｘｌ Ｉｇ１又
はＥＥＴＩ２．５−Ａｘｌ融合タンパク質のいずれかを発現している酵母を様々な濃度の
可溶性αｖβ３インテグリン又はＧａｓ６とともにインキュベートした。結合反応は平衡
となり、その時点で過剰なリガンドを洗滌によって除去した。適切なリガンド（インテグ
リン又はＧａｓ６）に対する蛍光標識抗体を含有する溶液中に、酵母を懸濁させた。フロ
ーサイトメトリーを用いて、二次抗体の検出によって、結合したインテグリン又はＧａｓ
６を定量した。これらの実験は、ＥＥＴＩ２．５Ｄ及びＡｘｌ Ｉｇ１がそれぞれαｖβ
３インテグリン及びＧａｓ６に結合するのみであり、一方でＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融
合体は両タンパク質にそれら単一特異性構成部分と等しいレベルで結合することを示した
。このデータは、ＥＥＴＩ２．５ＤとＡｘｌ Ｉｇ１との融合がどちらの標的タンパク質
に対する結合も破壊しないことを実証する。ＥＥＴＩ２．５Ｄ、野生型Ａｘｌ Ｉｇ１又
はＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合体を発現している酵母を２０ｎＭ、５０ｎＭ又は１００
ｎＭのαｖβ３インテグリンとともにインキュベートした。予想されるように、ＥＥＴＩ
２．５Ｄ及びＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌのみがインテグリンに結合し、野生型Ａｘｌはこ
の受容体に対する天然親和性を有さない。同一の組の酵母試料を０．２ｎＭ、２ｎＭ又は
２０ｎＭのＧａｓ６とともにインキュベートした。野生型Ａｘｌ及びＥＥＴＩ２．５Ｄ−
ＡｘｌはＧａｓ６に対する親和性を示すが、ＥＥＴＩ２．５Ｄのみ結合を検出しない。両
方の場合において、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク質は、その単一特異性構成部
分と同様の親和性でインテグリン又はＧａｓ６に結合する。

次に、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌを発現している酵母を、飽和濃度のＧａｓ６の存在下
でαｖβ３インテグリンとともにインキュベートすることによって、又は飽和濃度のαｖ
β３インテグリンの存在下でＧａｓ６とともにインキュベートすることによって、融合体
が両標的に同時に結合する能力を調べた。これらの結果の概要を図９で示す。両方の場合
において、過剰な可溶性第二リガンドの存在は、第一リガンドに対する結合を実質的に減
少させない。これらの結果は、１つの標的のＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合体タンパク質
への結合が第二の結合を妨げずＧａｓ６とαｖβ３インテグリンの双方との同時相互作用
を容認することを示す。

図９の酵母表面提示結合データを参照する。図９Ａでは、酵母を、２００ｎＭのαｖβ
３インテグリンの存在下で２０ｎＭ又は１００ｎＭのＧａｓ６とともにインキュベートし
た。二重特異性タンパク質は、過剰なインテグリンが存在する場合もＧａｓ６に対する親
和性を維持する。図９Ｂでは、酵母を、１００ｎＭのＧａｓ６の存在下で１００ｎＭ又は
２００ｎＭのαｖβ３インテグリンとともにインキュベートした。Ｇａｓ６が存在する場
合も、αｖβ３インテグリンに対する親和性は失われない。それとともに、これら実験は
、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌが両標的に同時に結合できることを示唆する。

［例１０：組み換え酵母で生産したノッチン融合体］
次いで、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク質をｐＰｉｃ９Ｋ酵母分泌ベクターに
クローン化し、メーカーのマニュアル（インビトロジェン社）に従って酵母株Ｐ．パスト
リスで可溶性タンパク質を組み換え的に生産した。ニッケル親和性クロマトグラフィーを
用いて培養上清からタンパク質を精製し、タンパク質をエンドグリコシダーゼ（ｅｎｄｏ
Ｈ）で処理することによって、異種酵母糖鎖付加を切断した。単量体のＥＥＴＩ２．５Ｄ
−Ａｘｌタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて更に精製した。最終産物
の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び分析的サイズ排除クロマトグラｆ−を用いて分析した。高
度に純粋な単量体ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク質を１リットル当たりおよそ３
５ミリグラムの収率で得た。

組み換え的に生産したＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌを、細胞表面αｖβ３インテグリンを
結合する能力について試験した、αｖβ３インテグリンを過剰発現するように形質転換さ
れているＫ５６２白血病細胞（Ｋ５６２−αｖβ３細胞）を様々な濃度のＥＥＴＩ２．５
Ｄ−Ａｘｌとともにインキュベートした。反応が平衡に達した時点で、過剰なＥＥＴＩ２
．５Ｄ−Ａｘｌを洗滌によって除去し、組み換え多重特異性タンパク質上のＦＬＡＧエピ
トープタグに対する蛍光標識抗体を含有する溶液に細胞を再懸濁させた。次いで、フロー
サイトメトリーを用い、蛍光抗ＦＬＡＧ抗体を検出することによって、結合したＥＥＴＩ
２．５Ｄ−Ａｘｌの量を定量した。ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク質のＫ５６２
−αｖβ３細胞に対する親和性（Ｋｄ）を１．７２ｎＭであると測定した。加えて、円二
色性分光法を用いて、野生型Ａｘｌと比較して、ＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合タンパク
質の熱安定性を分析した。野生型Ａｘｌ Ｉｇ１は４１℃の融解温度（Ｔｍ）を有するこ
とが分かった。ＥＥＴＩ２．５ＤをＡｘｌのｎ末端に融合させることによって、１１℃の
安定性の改善が観察された（Ｔｍ約５２℃）。これらの結合研究及びＣＤ実験の結果を下
記の表にまとめた。

Ｋ５６２−αｖβ３細胞上に発現したαｖβ３インテグリンに対する観察された結合の
特異性を、この細胞をＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ及び環状ＲＧＤ（ｃＲＧＤ）とともにイ
ンキュベートすることによって試験した。ＥＥＴＩ２．５Ｄはインテグリン上でｃＲＧＤ
と同じエピトープに結合するため、タンパク質がインテグリンに特異的に結合している場
合、モル過剰のｃＲＧＤはＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌに競合して解離させる。ｃＲＧＤは
、Ｋ５６２−αｖβ３細胞へのＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌの結合を阻害し、タンパク質が
実際に細胞表面上のαｖβ３インテグリンに特異的に結合していることを示唆する。

［例１１：自己切断ＴＥＶ−ノッチン融合体］
幾つかのノッチンは、適切に折り畳まれたモノマーよりも高次オリゴマーを生成するた
め、組み換え的に生産することが困難である。例えば、我々は、固相ペプチド合成を用い
たＥＥＴＩ２．５Ｄの化学合成及び試験管内折り畳みの確固たる方法を立証しているが、
このノッチンを酵母に基づく発現系で組み換え的に発現させることはできていない。適切
に折り畳まれたＥＥＴＩ２．５Ｄ−Ａｘｌ融合体を高い組み換え体収率で生産できるとい
う知見は、ノッチンを組み換え的に生産する手法としての自己切断ＴＥＶ−２．５Ｄ構築
物の開発につながった。

この融合体では、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼをＥＥＴＩノッチン
変異型２．５Ｄに融合させた。ＴＥＶは、アミノ酸配列中グリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）
で置き換えられてもよいＳＥＮＬＹＦＱＳ又はＧＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号８２）のどち
らかであり得る８個のアミノ酸配列を認識する。次いで、ＴＥＶは最後のＧ／Ｓの直前で
切断する。この切断部位は、ＴＥＶプロテアーゼのＣ末端に位置し、ＥＥＴＩ２．５Ｄが
続いた。ＥＥＴＩ２．５Ｄの最初のアミノ酸はグリシン（Ｇ）であり、切断後に残ったも
のから余分な残基を除外するため、そのグリシンを取り除く。翻訳の際、融合タンパク質
のプロテアーゼ部分は、別の融合体の切断部位と相互作用して、それを切断し、そのため
遊離のＥＥＴＩ２．５Ｄノッチンが生成することができる。

この自己切断融合タンパク質をＮ末端及びＣ末端にそれぞれＦＬＡＧ及び６×ＨＩＳタ
グを伴ってｐＰｉｃ９Ｋ酵母分泌ベクターにクローン化し、メーカーの指示に従って（イ
ンビトロジェン社）酵母株Ｐ．パストリスに形質転換させた。発現培養物の上清に対する
ウエスタンブロットはＦＬＡＧ又はＨＩＳタグのどちらかについて探索した。ウエスタン
ブロットは、Ｎ末端ＦＬＡＧタグについての探索がＴＥＶプロテアーゼに相当する高分子
量種を示すことを明らかにした。Ｃ末端の６×ＨＩＳタグについて染色したブロットは、
切断されたノッチンに相当する約８ｋＤａの種を示す。これら発現試験に基づき、この自
己切断構築物が、標準的な微生物系での生産が困難であるノッチンを組み換え的に発現さ
せる実行可能な方法である。

自己切断構築物は、微生物系で生産することができない他のノッチンの組み換え生産を
容認する。このストラテジーはノッチン以外のタンパク質を生産することにも使用できる
。あるいは、Ａｘｌのような融合パートナーを用いて、ノッチンとＡｘｌタンパク質との
間にプロテアーゼ切断部位を導入して、ノッチンの組み換え発現を促すことができる。

［例１２：ノッチン−Ｆｃ融合体］
この例では、マウス抗体のＦｃ部分をインテグリン結合ノッチンであるＥＥＴＩに上述
するように融合させる。ノッチン−Ｆｃ融合体を分子クローニング及び哺乳動物細胞発現
によって創出した。これら修飾したノッチンタンパク質は、数分程度の半減期を有する未
修飾ノッチンと比較して、長い循環時間（数日）を有するであろう。この系を用いて、Ｅ
ＥＴＩをベースとするノッチンペプチド２．５Ｄ及び２．５Ｆ並びに野生型ＥＥＴＩ−Ｉ
ＩをマウスＩｇ２ａのＦｃドメイン（配列番号８３）に融合させて哺乳動物ヒト胎児腎臓
（ＨＥＫ）細胞でノッチン−Ｆｃ融合タンパク質を発現できることを示した。Ｆｃドメイ
ンは既知の配列であり、ｍＲＮＡ配列については例えばアクセッション番号ＮＭ＿０１０
１８４．２を参照されたい。ノッチンペプチドを生成してＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−
トリスゲル上で泳動させた。結果は、予期したサイズの非還元型（ＮＲ）及び還元型（Ｒ
）ノッチン２２．５Ｄ−Ｆｃを示した。次いで、これらノッチンタンパク質をゲル濾過ク
ロマトグラフィーによって分析して、純粋なノッチン−Ｆｃ２は凝集の傾向を示さなかっ
た。

次いで、ノッチン−Ｆｃタンパク質の腫瘍細胞株への結合を測定した。ノッチン２．５
Ｆ−Ｆｃペプチドは、野生型ＥＥＴＩＩ−Ｆｃに対して測定した場合のノッチン２．５Ｄ
−Ｆｃペプチドと比較して、より高い親和性でｓｋ０ｖ３細胞に結合することを見出した
。対照的に、ノッチン２．５−Ｆｃ及び２．５Ｄ−Ｆｃは、αｖβ３インテグリンで形質
転換させたＫ５６２白血病細胞に同様な親和性で結合した。

別の腫瘍モデルでは、ノッチン−Ｆｃタンパク質が細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質で
あるビトロネクチンに対するＰＣ３細胞接着を阻害する能力を分析した。両ノッチン−Ｆ
ｃタンパク質は腫瘍細胞接着を強く阻害し、一方、陰性コントロールは阻害しなかった。
結果を図１０に示す。インテグリン−ＥＣＭ接着の阻害はカスパーゼ媒介性アポトーシス
を誘導するため、この生物学的メカニズムは、将来の研究で調査されるであろう。

本研究は、受容体結合親和性を乱すことなく抗体Ｆｃドメインをノッチンタンパク質に
融合させることができることの最初の実証である。このストラテジーは、インテグリン以
外の様々な生物医学的標的に対する改変ノッチンタンパク質の半減期を増加させるための
一般的なプラットフォームであろう。また、一価のノッチンを上回る増加した結合親和性
と増加又は変化した生物学的効力を有し得る二量体タンパク質（Ｆｃ融合体は二価である
ため）を作成する潜在的なプラットフォームでもある。更に、Ｆｃ融合体を骨組みとして
用いて、抗体に基づく薬物を用いて行われているものと同様な、より高次のオリゴマー又
は多価／多重特異性タンパク質を構築することができる。

［結論］
上記具体的な記載は、発明を例示する及び説明することを意図しており、添付された請
求の文字通りの等価な範囲によって定義される発明の範囲を限定するものとみなされるべ
きでない。本明細書中で言及するあらゆる特許又は刊行物も、明確に提示されていないこ
とがあり得るがこの分野の研究者によって理解されるであろう本発明の特定の態様を実施
するのに有用な方法及び材料の詳細を伝えることを意図する。このような特許又は刊行物
は、必要に応じ、参照される方法又は材料を説明する及び使用可能にする目的で、各々が
具体的及び個別に参照により援用された及び本明細書に含まれた場合と同じ程度まで、参
照により本明細書に含まれるものとする。

Claims (20)

1. 抗体の結晶可能断片（Ｆｃ断片）に融合したエクバリウム・エラテリウムのトリプシン阻害剤ＩＩ（ＥＥＴＩ−ＩＩ）ノッチンペプチドを含み、
   前記ノッチンペプチドが、インテグリンに結合する非天然配列を含む結合ループを含む、融合タンパク質。
2. 前記非天然配列が、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、及びα５β１インテグリンのうちの１又は２以上と結合する、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記非天然配列が、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、及びα５β１インテグリンのうちの２以上と結合する、請求項１に記載の融合タンパク質。
4. 前記非天然配列が、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、及びα５β１インテグリンのうちの各々と結合する、請求項１に記載の融合タンパク質。
5. 前記ノッチンペプチドが、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、
   医薬として許容される担体と
   を含む、医薬組成物。
7. 前記組成物が、非経口投与用に調剤される、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 前記組成物が、経口投与用に調剤される、請求項６に記載の医薬組成物。
9. 前記ノッチンペプチドが、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
10. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
11. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、
    請求項１０に記載の核酸を含む細胞を、前記融合タンパク質が細胞中で発現する条件下で培養する工程を含む、方法。
12. 前記細胞は、哺乳動物細胞である、請求項１１に記載の方法。
13. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、
    固相ペプチド合成により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで前記融合タンパク質を合成する工程を含む、方法。
14. 前記製造した融合タンパク質を精製する工程を更に含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は非ヒト被験者で細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質へのインテグリンの結合を阻害する方法であって、
    インテグリンと請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質とを、前記ノッチンペプチドの結合ループの非天然配列が前記インテグリンに結合する条件下で接触させ、前記インテグリンのＥＣＭタンパク質への結合を阻害する工程を含む、方法。
16. 必要とする被験者における腫瘍の治療に使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項６〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
17. 前記ノッチンペプチドが、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
18. 必要とする被験者における腫瘍を治療するための医薬の製造における、
    治療上有効量の
    請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は
    請求項６〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
19. 前記医薬は、非経口投与用又は経口投与用である、請求項１８に記載の使用。
20. 前記ノッチンペプチドが、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１８又は１９に記載の使用。