JP5562257B2 - ヒトc−met受容体のチロシンキナーゼに対し親和性を有する涙液リポカリンの変異タンパク質、及びそれを得るための方法 - Google Patents
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Description
(a)ヒト涙液リポカリンをコード化する核酸分子を、天然型の成体ヒト涙液リポカリンの、直鎖状のポリペプチド配列のアミノ酸配列位置26ないし34、56ないし58、80、83、104ないし106、及び108のうちのいずれかの少なくとも1のコドンでの突然変異誘発のために供するステップであって、成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列の配列位置61及び153で、システイン残基をコード化するコドンのうちの少なくとも1つが、その他のアミノ酸残基をコード化するように突然変異されており、これによって、ヒト涙液リポカリンの変異タンパク質をコード化する複数の核酸を得るステップと、
(b)発現系において、(a)で得られた1又はそれ以上の変異タンパク質の核酸分子を発現するステップであって、これによって、1又はそれ以上の変異タンパク質を得るステップと、
(c)ステップ(b)で得られた1又はそれ以上の変異タンパク質の核酸分子を濃縮し、選択及び/又は分離によって、Metに対し検出可能な結合親和性を有するステップと
を具える。
(a)成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列のアミノ酸配列位置34、80、及び104のいずれかのうち少なくとも1のコドンで、ヒト涙液リポカリンをコード化する核酸分子を突然変異誘発に供するステップであって、これによってヒト涙液リポカリンの変異タンパク質をコード化する複数の核酸を得るステップと、
(b)発現系において、(a)で得られた1又はそれ以上の変異タンパク質の核酸分子を発現するステップであって、これによって、1又はそれ以上の変異タンパク質を得るステップと、
(c)ステップ(b)で得られた1又はそれ以上の変異タンパク質の核酸分子を濃縮し、選択及び/又は分離によって、ヒト涙液リポカリンの所定の非天然型リガンドとしてのc−Metに対し、検出可能な結合親和性を有するステップと、
を具える。
(i)所定のリガンドとして、c−Met又はそのドメイン又はフラグメントを提供するステップと、
(ii)前記リガンドと、当該リガンドに対し結合親和性を有する変異タンパク質との間で複合体の形成を可能にするように、複数の変異タンパク質を前記リガンドと接触させるステップと、
(iii)結合親和性を有さない、あるいは実質的に有さない変異タンパク質を除去するステップと、
を具える。
1)アラニン、セリン、及びスレオニン;
2)アスパラギン酸及びグルタミン酸;
3)アスパラギン及びグルタミン;
4)アルギニン及びリジン;
5)イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリン;
ならびに、
6)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン;
の要素間での置換である。他方では、アミノ酸配列中で非保存的変質を誘導することは更に可能である。更に、単一アミノ酸残基を置換する代わりに、涙液リポカリンの一次構造の1又はそれ以上の連続的なアミノ酸を挿入する、あるいは欠失させることは更に、この欠失又は挿入が安定して折り畳まれた/機能的な変異タンパク質(例えば、切断型のN及びC末端を有する変異タンパク質が産生される実験上の切片を参照)を生じさせる限りにおいては可能である。
(1)Arg26→Thr;Glu27→Gln;Phe28→Met;Glu30→Leu;Met31→Ser;Asn32→Leu;Leu33→Tyr;Glu34→Val;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;、及びLys108→Gly;
(2)Arg26→Thr;Glu27→Gln;Phe28→Asp;Glu30→Leu;Met31→Ser;Asn32→Leu;Leu33→Tyr;Glu34→Val;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Val;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;、及びLys108→Gly;
(3)Arg26→Thr;Glu27→Gln;Phe28→Asp;Glu30→Leu;Met31→Ser;Asn32→Leu;Leu33→Tyr;Glu34→Val;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;、及びLys108→Gly;
(4)Arg26→Val;Glu27→Gly;Phe28→Asp;Pro29→Leu;Glu30→Gly;Met31→Ser;Asn32→Arg;Leu33→Val;Glu34→Val;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;、及びLys108→Gly;
(5)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Asp;Pro29→Ile;Glu30→Arg;
Met31→Ser;Asn32→Leu;Leu33→Ile;Glu34→Val;Leu56→Asn;
Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;
Leu105→Thr;His106→Trp;、及びLys108→Gly;
(6)Arg26→Ser;Phe28→Asp;Pro29→Ala;Glu30→Phe;Met31→Ser;Asn32→Val;Leu33→Thr;Glu34→Val;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105
→Thr;His106→Trp;、及びLys108→Gly;
(7)Arg26→Val;Glu27→Val;Phe28→Asp;Pro29→Trp;Glu30→
Arg;Met31→Ser;Asn32→Gln;Leu33→Val;Glu34→Arg;Leu56
→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104
→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;、及びLys108→Gly;ならびに、
(8)Arg26→Gly;Glu27→Ser;Phe28→Asp;Pro29→Trp;Met31→
Ser;Asn32→Val;Leu33→Phe;Glu34→Ala;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;、及びLys108→Gly;
のうちの少なくとも1つを含んでもよい。
1)アラニン、セリン、及びスレオニン;
2)アスパラギン酸及びグルタミン酸;
3)アスパラギン及びグルタミン;
4)アルギニン及びリジン;
5)イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリン;
ならびに、
6)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン;
の要素間での置換である。
a)変異タンパク質を前記化合物と接合するステップと、
b)変異タンパク質/化合物の複合体を事前選択された部位に送達するステップと、
を具える。
他に示されない限り、確立された組換え遺伝子技術の方法は、例えば、Sambrookら(上記を参照)に記載のように用いられた。
高い複雑性を有する涙液リポカリン(Tlc)のランダムライブラリは本質的にはPCT出願PCT/EP2007/057971に記載のように調製され、その開示は、ファージディスプレイpTLPC59用のライブラリ遺伝子コントラクト(図1a及び1b)がtetプロモータの代わりにlacプロモータの制御下に置かれ、VCSM13ファージの全長遺伝子IIIに遺伝学的に融合されることを除いて、全体として本明細書中に引用によって組み込まれる。
ファージミドの提示及び選択は以下の修飾で、国際公開第2005/019256号の実施例3に記載のように実質的に、実施例1で得られたファージミドを用いて行われた:標的タンパク質(c−Met受容体−Fc、R&D systems社)は200nMの濃度で用いられ、プロテインGビーズ(Dynal社)を用いた、ファージと標的との複合体の後の捕捉とともに、Fc融合タンパク質としてライブラリに提示された。天然リガンドHGFに対し非拮抗に作用する結合剤を選択するために、更なる洗浄ステップは、c−Met結合型ライブラリのファージが塩基性条件下で溶出される前に、200nMの可溶性のHGF(R&D systems社)を用いて導入された。4回の選択が行われた。
実施例2により選択された変異タンパク質のスクリーニングは、国際公開第2006/56464号の実施例3に記載のように実質的に行われた。修飾プロトコルは以下に述べられる:発現ベクタはpTLPC10であった(図2)。用いられた標的タンパク質は1μg/mlのc−Met受容体−Fc(R&D Systems社)であり、3%の乳状液がヒト血清アルブミンの代わりに関連づけられないコントロールの標的として用いられた。
変異タンパク質S225.4−K24(配列番号1)に基づく変異体のライブラリの産生は、平均して構造遺伝子につき5の置換を有するライブラリに生じる、オリゴヌクレオチドTL50 bio:TATCTGAAGGCCATGACGGTGGAC(配列番号2)とTL51 bio:TGCCCACGAGCCACACCCCTGGGA(配列番号3)とを有する国際公開第2006/56464号の実施例5に記載のように実質的に実行される。
スクリーニングは、2.5μg/ml又は0.6μg/mlの濃度のc−Met受容体−Fc(R&D Systems社)が用いられる修飾で、実施例3に記載のように行った。全部で2880のクローンがスクリーニングされ、1510のヒットを生じさせ、ライブラリからの成熟した変異タンパク質の完全な濃縮が生じていることを示した。更に、代替的なスクリーニング設定においては、モノクローナル抗T7抗体は、ポリスチロールプレート上にコーディングされ、発現された変異タンパク質は限定された濃度のc−Met受容体−Fc(60nM、15nM、及び2.5nM)でインキュベーション前に、T7タグを介して捕捉された。c−Met受容体−Fcの結合は、ヒトIgG−Fcドメインに対するHRP接合型のポリクローナル抗体を用いて検出された。
c−Met受容体型の変異タンパク質の産生の調製のために、発現ベクタpTLPC10(図2)上にコード化される各々の変異タンパク質を有する大腸菌K12株JM83は、2L振盪フラスコの培養において、Schlehuber,S et al.(J.Mol.Biol.(2000),297,1105−1120)に記載されるプロトコルによるLBアンピシリン培地で成長させた。多量のタンパク質が必要とされる場合、各々の発現ベクタを有する大腸菌株W3110は、Schiweck,W.及びSkerra,A.Proteins(1995)23,561−565;に記載のプロトコルに基づいて、1l又は10l容器中の卓上の発酵培養を介した周辺質の産生に用いられた。
親和性測定は、約9000RUのc−Met受容体−Fc(R&D Systems社)が(国際公開第2006/56464号において標的として用いられる2000RUのヒトCTLA−4又はマウスCTLA−4−Fcの代わりに)、CM5チップの表面上に直接的に固定化され、かつ、80μlの変異タンパク質が(国際公開第2006/56464号における標的として用いられるような、5ないし0.3μMの濃度で調製されたリポカリンの変異タンパク質の40μlのサンプルの代わりに)、0.2ないし0.5μMの濃度で注入された修飾とともに、国際公開第2006/56464号の実施例9に記載のように実質的に行われた。チップの表面は測定の間に、pH10の50mMのNaOH、2.5MのNaClの5ないし10μlの注入によって再生された。流速は10μl/分で一定に維持された。
リポカリンの変異タンパク質は、HGFR/c−Metの内在性発現を示すHT−29細胞(ATCC)上で滴定された。リポカリンの変異タンパク質は、総容積30μlで10μMの濃度から開始して24の1:2の希釈で試験された。各々の結合反応用に、100,000の細胞が、2%のウシ胎仔血清(FCS)を含むPBS中で、4℃で2時間インキュベートされた。細胞はPBS、2%のFCSで2回洗浄され、反応につき30分間、375ngのビオチン化され、親和的に精製されたヤギ抗涙液リポカリンの抗血清でインキュベートされた。洗浄後の更なる30分のストレプトアビジンフィコエリトリンでのインキュベーション後に、検出が得られた。細胞は洗浄され、蛍光はFACS Caliburフローサイトメータで分析された。平均蛍光強度(MFI)はリポカリンの変異タンパク質の濃度に対してプロットされ、S字形の用量反応曲線に合致し、EC50値はGraphPad Prismソフトウェアを用いて決定された。
例えば、活性化したPEG又は薬学的に関連する標識との部位特異的結合用の反応基を提供するために、不対のシステイン残基は部位特異的突然変異誘発によって導入された。遊離Cys残基を保有する組換え型の変異タンパク質は次いで、実施例6に記載のように大腸菌中で産生され、発現収量が決定され、親和性は実施例7に記載のように実質的にSPRによって測定された。
H08_T40C forward CGTCTCGGTAACACCCATATGCCTCACGACCCTGGAAGGG(配列番号10)、
及び、
H08 T40C reverse CCCTTCCAGGGTCGTGAGGCATATGGGTGTTACCGAGACG(配列番号11);
H08_D95C forward CAGGTCGCACGTGAAGTGCCACTACATCTTTTACTCTGAGGG(配列番号12)、
及び、
H08_D95C reverse CCCTCAGAGTAAAAGATGTAGTGGCACTTCACGTGCGACCTG(配列番号13);
H08_R90C forward CGTGGCATACATCAGCTGCTCGCACGTGAAGGATCAC(配列番号14)、
及び、
H08_R90C GTGATCCTTCACGTGCGAGCAGCTGATGTATGCCACG(配列番号15);
A22_K121C forward GGCAGAGACCCCTGCAACAACCTGGAAGCCTTG(配列番号16)、
及び、
A22_K121C reverse CAAGGCTTCCAGGTTGTTGCAGGGGTCTCTGCC(配列番号17);
A22_N123C forward GGCAGAGACCCCAAGAACTGCCTGGAAGCCTTGGAG(配列番号18)、
及び、
A22_N123C forward GGCAGAGACCCCAAGAACTGCCTGGAAGCCTTGGAG(配列番号19);
あるいは、
H08_V93C forward CATCAGCAGGTCGCACTGCAAGGATCACTACATCTTTTAC(配列番号20)、
及び、
H08_V93C riverse GTAAAAGATGTAGTGATCCTTGCAGTGCGACCTGCTGATG(配列番号21);
をそれぞれ用いて、アミノ酸Thr40、Asp95、Arg90、Lys121、Asn123、又はVal93の代わりに導入された。
変異タンパク質S225.4−K24(配列番号1)に基づく変異体のライブラリは、残基位置28、39、52、5、58、65、及び89のランダム化によって設計されて、これらの位置の総ての20のアミノ酸を準備した。ライブラリは、3のランダム化されたPCRフラグメントが、対でのデオキシヌクレオチド:
K24_1:GCCATGACGGTGGACACGCAGNNSCCGCTGAGCCTCTAC(配列番号27)(被覆位置28)、
及び、
K24_2:CAGGGTCGTGAGGGTSNNGGGTGTCACCGAGAC(配列番号28)(被覆位置39);
K24_3:GGGGGCAACCTGGAAGCCNNSGTCACCNNSAACCAGNNSGGCCGGTCCCAGGAGGTG(配列番号29)(被覆位置52、55、及び58)、
及び、
K24_4:GTATTTTCCCGGCTCATCAGTTTTCTCCAGGACGGCSNNCACCTCCTGGGACCGGCC(配列番号30)(被覆位置65);
K24_5:GTGCTCACGTGGCATACATCNNSAGGTCGCACGTGAAGGAC(配列番号31)(被覆位置89)、
及び、
TL51bio(配列番号3);
をそれぞれ、TL46、TL47、TL48、及びTL49の代わりに用いて産生される修飾とともに、実施例1に記載のように実質的に構成された。ファージミドの表示及び選択は、標的タンパク質が標的の捕捉を可能にするビオチン化された形態における、Fc部分のない単量体c−Met受容体(R&D systems社)であり;ニュートラアビジン(Pierce社)を介したファージミドの複合体はポリスチロールプレートで固定化される;という修飾とともに、実施例2に記載のように実質的にファージミドを用いて行われた。選択は限定された標的濃度(1.5nM、0.5nM、及び0.1nMのビオチン化されたc−Met受容体)、あるいは限定された標的濃度(3μg/ml、1μg/ml、及び0.3μg/ml)のいずれかを用いて行われ、実施例5に示したようなエラープローン性の成熟で得られる、高過剰(10μM)の精製されたc−Met特異性の変異タンパク質S244.2−H08(配列番号4)を用いて、短いインキュベーション時間(10分)又は競合的アプローチと組合わせられた。3回の選択が行われた。
スクリーニングは実質的に実施例5に記載のように、
i)モノクローナル抗T7抗体はポリスチロールプレートにコーティングされ、発現した変異タンパク質は、限定された濃度の単量体c−Met受容体−bio(50nM、10nM、及び2.5nM)で、インキュベートする前にT7タグを介して捕捉された。標的の結合はHRP(ホースラディシュペルオキシダーゼ)接合型のExtravidinを用いて検出された;
ii)ビオチン化されたc−Met受容体(1μg/ml)はニュートラアビジンプレートに捕捉された。発現されたc−Met特異性の変異タンパク質の結合は無制限(60分)又は限定された(5分)のインキュベーション時間の後のいずれかにHRP接合型の抗T7mAb(Novagen社)を介して検出された;
iii)c−Met結合する変異タンパク質を含む抽出物は70℃で1時間加熱された;
iv)ビオチン化されたc−Met受容体(R&D Systems社、2.5μg/ml)はニュートラアビジンプレートで捕捉された。変異タンパク質の抽出物は標的結合の競合相手として、実施例5による高過剰(1μM)の精製されたc−Met特異性の変異タンパク質S244.2−H08(配列番号4)でプレインキュベートされた。発現されたc−Met特異性の変異タンパク質の結合はHRP接合型の抗T7mAb(Novagen社)を介して検出された;
といった修飾とともに、代替的なスクリーニング設定で行われた。
発酵培養を介した0.75lのバイオリアクタ中の周辺質産生は実質的に、各々の変異タンパク質がpTLPC10の代わりに発現ベクタpTLPC47(図10)でコード化されるという修飾とともに、実施例6によって実行された。pTLPC47のベクタ成分は、ヘキサHisタグ及びN末端融合型のT7タグにC末端で融合されるTlc変異タンパク質に対するpTLPC47コードが除去されるという修飾とともに、pTLPC10と同一となる。
親和性測定は、実施例7に記載のように実質的に行われた。
リポカリンの変異タンパク質は、実施例8に記載のように実質的にHT−29細胞(ATCC)上で滴定された。
選択されたc−Met特異性の変異タンパク質による、HGF(肝細胞増殖因子、R&D Systems社)とc−Met受容体との間の相互作用のモードは、競合ELISAで評価された。従って、一定濃度の2.5μg/mlのc−Met受容体−Fc(R&D Systems社)は、前にポリスチロールプレートの表面に固定化された抗ヒトIgG−Fcに特異的なmAb(Jackson Immuno Research社)を介して捕捉された。以下において、標的は室温で1時間インキュベートされ、c−Met特異性の変異タンパク質の希釈系列は、2ステップの希釈系列で100nMから開始し、結合は競合相手として300nMのHGFがある場合、ない場合のいずれでも生じる。結合したc−Met受容体特異性の変異タンパク質は、ポリクローナル性のビオチン化された抗リポカリン1抗体(R&D Systems社)を用いて検出され、結合したHGFはポリクローナル性の抗HGF−bio抗体(R&D Systems社)を用いて検出された。双方の場合において、HRP接合型のExtravidin(Sigma社)は第2の検出試薬として用いられた。
円偏光二色性測定は、用いられる波長が230nMであり、変異タンパク質濃度が250μg/mlであるという修飾とともに、国際公開第2006/056464号の実施例14に記載のように実質的に行われた。涙液リポカリンの変異タンパク質S261.1−L12、S261.1−J01、S261.1−L17(配列番号32ないし34)及びS244.2−H08(配列番号4)の融解温度Tmは、表6−1に要約される。
c−Met特異性の変異タンパク質S261.1−L12_C123(配列番号35)の産生の調製は、アミノ酸Asn123が後の部位特異的な接合に対し不対のシステインを導入するために、システインに変更されるという修飾とともに、実施例6に記載のように実質的に行われた。システイン123は不対のシステインのない元の変異タンパク質S261.1−L12(配列番号32)と比較して、良好な発現収量及び親和性を示す、実施例9に記載のシステインのスクリーニングによる結果を伝達することにより選択された。
実施例17で精製された変異タンパク質S262.1−112_C123(配列番号35)は、pH7.4のPBSバッファ中で0.8mg/mlの濃度で用いられ、不対のシステインは100mMのTCEP(Sigma社)の1mMの最終濃度への添加によって活性化させた。室温で2時間のインキュベーション後、未反応のTCEPの過剰量は生産者の推奨によるNAP−5カラム(GE)を用いたゲル濾過により除去された。過剰量の10モルのHYNIC(SoluLink社から購入した3−N−マレイミド−6−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩)が添加され、室温で2時間インキュベートされた。接合型の変異タンパク質から未反応のHYNICを除去するために、反応混合物はUltracentricon(Amicon社)中に濃縮され、適切な量のPBSバッファを用いて少なくとも5回洗浄された。
接合型のHYNICを有する及び有しないc−Met特異性の変異タンパク質S261.1−L12_C123(配列番号35)は、実施例8に記載のように実質的にHT−29細胞(ATCC)上で滴定された。
実施例12により精製された変異タンパク質S261.1−J01は、pH3ないしpH9.2の範囲の異なるpHで60分間インキュベートされた。変異タンパク質は、pH7.4に中和後、製造者の推奨による分析用のSuperdex75カラム(GE)を用いることによって、分子ふるいクロマトグラフィを介して分析された。
部位特異的な突然変異誘発は、結合親和性が有意に影響を及ぼしうるかどうかを評価するために、親和性成熟された涙液リポカリンの変異タンパクL17、O24、M02、K22、A22、K15、L03、O07、及びK06の配列位置26、27、及び29で行われた。図15に示されるように、総ての産生された変異体は本質的に同一の親和性を示す。
変異タンパク質S261.1−L17(配列番号34)に基づく8×108の変異体のライブラリは、位置26、27、29、30、32、33、34、及び79のランダム化によって設計されて、これらの位置で総ての20のアミノ酸を準備した。ライブラリは、ランダム化のために、デオヌクレオチド:
L12−1:GAAGGCCATGACGGTGGACNNKNNKGACNNKNNKAGCNNKNNKNNKTCGGTGACACCCATCACC(配列番号50);
L12−2:CACGTGAGCACCTCCGTAMNNCGTGTATTTTCCCGGCTC(配列番号51);
及び、
L12−3:ACGGAGGTGCTCACGTGGCATACATCCAGAGG(配列番号52);
が国際特許出願PCT/EP2007/057971に開示されたものの代わりに用いられるという修飾とともに、国際公開第2008/015239号として公表された、国際特許出願PCT/EP2007/057971の実施例1に記載されるように実質的に構成された。ファージミドの表示及び選択は、標的タンパク質(c−Met受容体Fc、R&D systems社)が限定した濃度(40pM、及び6pM、及び1pM)で用いられ、プロテインGビーズ(Dynal社)を用いたファージと標的との複合体の後の捕捉とともに、Fc融合タンパク質としてライブラリに提示されるか、あるいは、標的はライブラリのファージミドに標的とビーズの複合体を提示する前に、限定された濃度(50ng/ml、及び10ng/ml、及び1ng/ml)で最初にプロテインGビーズに捕捉されるかのいずれか;という修飾とともに、国際公開第2005/019256号の実施例3に記載のように実質的にファージミドを用いて行われた。c−Met結合型のライブラリのファージは酸性条件下で、次いで塩基性条件下で溶出された。3回の選択が行われた。
スクリーニングは実質的に実施例5に記載のように、
i)モノクローナル抗T7抗体は5μg/mlの濃度でポリスチロールプレートにコーティングされ、発現した変異タンパク質は、限定された濃度のc−Met受容体−Fc(1nM、0.2nM、及び0.1nM)で、インキュベートする前にT7タグを介して捕捉された。標的の結合はHRP(ホースラディシュペルオキシダーゼ)接合型のヤギ抗ヒトIgG−Fcに特異的な抗体を用いて検出された;
ii)c−Met結合する変異タンパク質を含む抽出物は、c−Met受容体−Fcの標的と複合体形成する前に、70℃まで1時間加熱された。この設定において、c−Met受容体−Fcはマウス抗ヒトIgG−Fcに特異的なモノクローナル抗体を介して捕捉され、5μg/mlの濃度でポリスチロールプレートに固定化される;
といった修飾とともに、代替的なスクリーニング設定で行われた。
各々の変異タンパク質(実施例6参照)のC末端に融合されるStrep−Tagを用いて、親和性クロマトグラフィを介した変異タンパク質の発現及び精製後に、c−Met特異性の変異タンパク質S318.1−C10、S318.1−L13、S318.1−A16、S318.2−I24、及びS318.1−O12(配列番号42、44、45、46、及び49)は実質的に実施例8に記載されるように、HT−29細胞(ATCC)に滴定され、その結合親和性はそのC末端でHis6タグを保有する変異タンパク質S261.1−L17(配列番号34)の親和性と比較した。
円偏光二色性測定は、用いられる波長が230nMであり、変異タンパク質濃度が250μg/mlであるという修飾とともに、国際公開第2006/056464号の実施例14に記載のように実質的に行われた。涙液リポカリンの変異タンパク質S318.1−C10(配列番号42)及びS318.1−O12(配列番号49)の融解温度Tmは表9に要約され、それが得られる(His6タグを具備する)変異タンパク質S261.1−L17(配列番号34)の融解温度と比較された。
Claims (51)
- ヒト涙液リポカリンの所定の非天然型リガンドに対し検出可能な結合親和性を有する、ヒト涙液リポカリンの変異タンパク質(hTLc)であって、前記非天然型リガンドが、ヒトMet受容体のチロシンキナーゼ(c−Met)であり、前記変異タンパク質が、成体ヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列(SWISSPROT DATABANK ENTRY P31025;配列番号36)について少なくとも6個のアミノ酸置換を含み、Arg26→Thr、Val、Pro、Ser、Gly;Glu27→Gln、Gly、Val、Ser;Phe28→Met、Asp;Pro29→Leu、Ile、Ala、Trp;Glu30→Leu、Gly、Arg、Phe;Met31→Ser;Asn32→Leu、Arg、Val、Gln;Leu33→Tyr、Val、Ile、Thr、Phe;Glu34→Val、Arg、Ala;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile、Val;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;及びLys108→Gly;からなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質がアミノ酸置換:Cys61→Ser;Cys101→Ser;及びCys153→Ser;のうちの少なくとも1つを更に含むことを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1又は2に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が、Arg111→Pro及びLys114→Trpから選択される、少なくとも1の更なるアミノ酸置換を含むことを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質がそのN末端又はそのC末端で、酵素、タンパク質若しくはタンパク質ドメイン、ペプチド、シグナル配列、及び/又は親和性標識に動作可能に融合されることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が有機薬剤の分子と、酵素標識と、毒素と、分裂停止剤(cytostatic agent)と、光活性化でき、かつ光線力学的治療に好適な標識と、薬学的に好適な放射性標識と、ハプテンと、ジゴキシゲニンと、ビオチンと、化学療法用金属錯体又は金属と、コロイド金と、前記変異タンパク質の血清半減期を延長する部分とからなる群から選択される接合相手に接合することを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項5に記載の変異タンパク質において、前記血清半減期を延長する部分がポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸又は他の脂肪酸分子、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン又はアルブミンフラグメント、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質、及びトランスフェリンからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項6に記載の変異タンパク質において、前記アルブミン結合タンパク質が、アルブミンに向けられる細菌性のアルブミン結合タンパク質、抗体、又は抗体フラグメントか、あるいはアルブミンに対し結合活性を有するリポカリンの変異タンパク質であることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項7に記載の変異タンパク質において、細菌性のアルブミンドメインが連鎖球菌性プロテインGのアルブミン結合ドメインであることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項6に記載の変異タンパク質において、前記アルブミン結合ペプチドが式Cys−Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Cysを有し、Xaa1がAsp、Asn、Ser、Thr、又はTrpであり、Xaa2がAsn、Gln、His、Ile、Leu、又はLysであり、Xaa3がAla、Asp、Phe、Trp、又はTyrであり、Xaa4がAsp、Gly、Leu、Phe、Ser、又はThrであることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項6に記載の変異タンパク質において、前記ポリアルキレングリコールがポリエチレン(PEG)又はその活性誘導体であることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし10のいずれか1項に記載の変異タンパク質において、前記非天然型リガンドが、前記ヒトMet受容体のチロシンキナーゼの細胞外領域又はドメインであることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項5に記載の変異タンパク質において、前記毒素が百日咳毒素、ジフテリア毒素、リシン、サポリン、緑膿菌外毒素、カリチアマイシン又はその誘導体、タキソイド、マイタンシノイド、ツブリシン、及びドラスタチンアナログからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項12に記載の変異タンパク質において、前記ドラスタチンアナログがアウリスタチンE、モノメチルアウリスタチンE、アウリスタチンPYE、及びアウリスタチンPHEからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項5に記載の変異タンパク質において、前記分裂停止剤がシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、5−フルオロウラシル、タキソテール(ドセタキセル)、パクリタキセル、アントラサイクリン(ドキソルビシン)、メトトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ダカルバジン、シクロホスファミド、エトポシド、アドリアマイシン、カンプトテシン、コンブレタスタチンA−4関連化合物、スルホンアミド、オキサジアゾリン、ベンゾ[b]チオフェン、合成型スピロケタールピラン、モノテトラヒドロフラン化合物、クラシン及びクラシン誘導体、メトキシエストラジオール誘導体、及びロイコボリンからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし14のいずれか1項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が、ヒト肝細胞増殖因子(HGF)又はヒト散乱因子(SF)のアンタゴニストとして作用しないことを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし15のいずれか1項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が200nM以下のKDで細胞外領域又はMet受容体のドメインを結合することを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項16に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が100nM以下のKDで細胞外領域又はMet受容体のドメインを結合することを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項17に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が20nM以下のKDで細胞外領域又はMet受容体のドメインを結合することを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項18に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が1nM以下のKDで細胞外領域又はMet受容体のドメインを結合することを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし19のいずれか1項に記載の変異タンパク質が、Thr37→Ser;Met39→Ile、Leu;Asn48→Ser;Lys52→Thr、Met;Met55→Leu;Lys65→Arg、Leu;Ala79→Leu、Ser;Ala86→Thr;及びIle89→Ser、Gln、Thr、His;からなる群から選択される少なくとも1個のアミノ酸置換を更に含むことを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし20のいずれか1項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質がアミノ酸置換:Arg26→Thr;Glu27→Gln;Glu30→Leu;Met31→Ser;Asn32→Leu;Leu33→Tyr;Glu34→Val;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;及びLys108→Gly;を含むことを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし20のいずれか1項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質がアミノ酸置換:Met31→Ser;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;及びLys108→Gly;を含むことを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし22のいずれか1項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質がアミノ酸置換:Cys61→Ser;Cys101→Ser;Arg111→Pro;Lys114→Trp;及びCys153→Ser;を含むことを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし23のいずれか1項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質がアミノ酸置換の集合:
(1)Arg26→Thr;Glu27→Gln;Phe28→Met;Glu30→Leu;Met31→Ser;Asn32→Leu;Leu33→Tyr;Glu34→Val;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;及びLys108→Gly;
(2)Arg26→Thr;Glu27→Gln;Phe28→Asp;Glu30→Leu;Met31→Ser;Asn32→Leu;Leu33→Tyr;Glu34→Val;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Val;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;及びLys108→Gly;
(3)Arg26→Thr;Glu27→Gln;Phe28→Asp;Glu30→Leu;Met31→Ser;Asn32→Leu;Leu33→Tyr;Glu34→Val;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;及びLys108→Gly;
(4)Arg26→Val;Glu27→Gly;Phe28→Asp;Pro29→Leu;Glu30→Gly;Met31→Ser;Asn32→Arg;Leu33→Val;Glu34→Val;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;及びLys108→Gly;
(5)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Asp;Pro29→Ile;Glu30→Arg;Met31→Ser;Asn32→Leu;Leu33→Ile;Glu34→Val;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;及びLys108→Gly;
(6)Arg26→Ser;Phe28→Asp;Pro29→Ala;Glu30→Phe;Met31→Ser;Asn32→Val;Leu33→Thr;Glu34→Val;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;及びLys108→Gly;
(7)Arg26→Val;Glu27→Val;Phe28→Asp;Pro29→Trp;Glu30→Arg;Met31→Ser;Asn32→Gln;Leu33→Val;Glu34→Arg;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;及びLys108→Gly;ならびに、
(8)Arg26→Gly;Glu27→Ser;Phe28→Asp;Pro29→Trp;Met31→Ser;Asn32→Val;Leu33→Phe;Glu34→Ala;Leu56→Asn;Ile57→Gln;Ser58→Ile;Asp80→Tyr;Lys83→Ala;Glu104→Asp;Leu105→Thr;His106→Trp;及びLys108→Gly;
のうちの1つを含むことを特徴とする変異タンパク質。 - 請求項1ないし24のいずれか1項に記載の変異タンパク質が、Thr40→Cys;Glu73→Cys;Arg90→Cys;Asp95→Cys;Lys121→Cys;Asn123→Cys;及びGlu131→Cys;からなる群から選択される、成熟野生型の配列に対する突然変異のうちの少なくとも1つを更に含むことを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項25に記載の変異タンパク質が、配列位置40、73、90、95、121、123、又は131でのCys残基のいずれかを介して前記変異タンパク質に結合されている接合相手を更に含むことを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項26に記載の変異タンパク質において、前記接合相手が、有機分子と、酵素標識と、毒素と、分裂停止剤と、薬学的に好適な放射性標識と、蛍光標識と、色素標識と、発光標識と、ハプテンと、ジゴキシゲニンと、ビオチンと、金属錯体と、金属と、コロイド金と、前記変異タンパク質の血清半減期を延長する部分とからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし24のいずれか1項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が配列番号1、配列番号4ないし9、配列番号22ないし26、配列番号32ないし35、又は配列番号37ないし49のうちのいずれか1つに示されるようなアミノ酸配列を有することを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし28のいずれか1項に記載の変異タンパク質が、2.5から9.5までの範囲のpHで安定することを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項29に記載の変異タンパク質が、3.0から9.3までの範囲のpHで安定することを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし4、請求項7ないし9、請求項11、請求項15ないし25および請求項28ないし30のいずれか1項に記載の変異タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸分子。
- ベクタに含まれることを特徴とする、請求項31に記載の核酸分子。
- ファージミドベクタに含まれることを特徴とする、請求項31に記載の核酸分子。
- 請求項31ないし33のいずれか1項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする宿主細胞。
- 請求項1ないし30のいずれか1項に記載のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
- 請求項1ないし30のいずれかに記載のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質を産生する方法であって、前記変異タンパク質が、遺伝子工学的方法によって、細菌性又は真核の宿主生物において前記変異タンパク質をコード化する核酸から産生され、前記宿主生物又はその培養物から分離されることを特徴とする方法。
- 疾患又は障害の治療用医薬品の製造における、請求項1ないし30のいずれかに記載の変異タンパク質、あるいは請求項35に記載の医薬組成物の使用。
- 請求項37に記載の使用において、前記疾患又は障害が細胞増殖性障害であることを特徴とする使用。
- 請求項37又は38に記載の使用において、前記疾患又は障害が癌であることを特徴とする使用。
- 請求項39に記載の使用において、前記癌が肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、乳頭型腎がん、頭頸部扁平上皮癌(HNSC)、又は頭頸部扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする使用。
- ヒトMet受容体のチロシンキナーゼ(Met)あるいはそのドメイン又はフラグメントの生体外検出のための、請求項1ないし30のいずれか1項に記載のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質の使用であって、
a)好適な条件下で、ヒトMet受容体のチロシンキナーゼ(Met)あるいはそのドメイン又はフラグメントを有するとされるサンプルと前記変異タンパク質を接触させ、これによって前記変異タンパク質と、ヒトMet受容体のチロシンキナーゼ(Met)あるいはそのドメイン又はフラグメントとの間での複合体形成を可能にするステップと、
b)好適なシグナルによって、複合体形成された前記変異タンパク質を検出するステップと、
を具えることを特徴とする使用。 - ヒトMet受容体のチロシンキナーゼ(Met)あるいはそのドメイン又はフラグメントの生体外分離のための、請求項1ないし30のいずれか1項に記載のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質の使用であって、
a)好適な条件下で、ヒトMet受容体のチロシンキナーゼ(Met)あるいはそのドメイン又はフラグメントを有するとされるサンプルと前記変異タンパク質を接触させ、これによって前記変異タンパク質と、ヒトMet受容体のチロシンキナーゼ(Met)あるいはそのドメイン又はフラグメントとの間での複合体形成を可能にするステップと、
b)前記サンプルから前記変異タンパク質/Metの複合体を分離するステップと、
を具えることを特徴とする使用。 - 請求項41又は42に記載の使用であって、前記変異タンパク質/c−Metの複合体が固体担体上に結合されることを特徴とする使用。
- ヒトc−Met受容体のチロシンキナーゼ(c−Met)機能に関連する疾病又は障害の生体外診断のための請求項1ないし30のいずれか1項に記載のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質の使用であって、
a)好適な条件下で、ヒトMet受容体のチロシンキナーゼ(c−Met)あるいはそのドメイン又はフラグメントを有するとされるサンプルと前記変異タンパク質を接触させ、これによって前記変異タンパク質と、前記ヒトMet受容体のチロシンキナーゼ(c−Met)あるいはそのドメイン又はフラグメントとの間での複合体形成を可能にするステップと、
b)好適なシグナルによって、複合体形成された前記変異タンパク質を検出するステップと、
を具えることを特徴とする使用。 - 生物又は組織中の事前選択された部位を、薬学的に能動的な化合物が標的とするために使用される、請求項1ないし30のいずれか1項に記載のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質において、
前記変異タンパク質は前記化合物と接合されており、
前記変異タンパク質/化合物の複合体は前記事前選択された部位に送達される、
ことを特徴とする変異タンパク質。 - 請求項45に記載の変異タンパク質において、前記薬学的に能動的な化合物が、毒素、分裂停止剤、又はc−Metアンタゴニストからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項46に記載の変異タンパク質において、前記毒素が百日咳毒素、ジフテリア毒素、リシン、サポリン、緑膿菌外毒素、カリチアマイシン又はその誘導体、タキソイド、マイタンシノイド、ツブリシン、及びドラスタチンアナログからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項47に記載の変異タンパク質において、前記ドラスタチンアナログが、アウリスタチンE、モノメチルアウリスタチンE、アウリスタチンPYE、及びアウリスタチンPHEからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項46の変異タンパク質において、前記分裂停止剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、5−フルオロウラシル、タキソテール(ドセタキセル)、パクリタキセル、アントラサイクリン(ドキソルビシン)、メトトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ダカルバジン、シクロホスファミド、エトポシド、アドリアマイシン、カンプトテシン、コンブレタスタチンA−4関連化合物、スルホンアミド、オキサジアゾリン、ベンゾ[b]チオフェン、合成型スピロケタールピラン、モノテトラヒドロフラン化合物、クラシン及びクラシン誘導体、メトキシエストラジオール誘導体、及びロイコボリンからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項46に記載の変異タンパク質において、前記c−Metアンタゴニストが、モノクローナル抗体と、1,3,5,トリアジン−2,4−ジアミン誘導体と、2−(2,6−ジクロロフェニル−イミダゾール誘導体と、窒素含有型で二環式の誘導体と、5−ベンジルスルホニル及びスルホンアミド置換型のピロールインドリン(pyrrole indoline)とからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
- 請求項1ないし24のいずれか1項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が配列番号42に示されるようなアミノ酸配列を有することを特徴とする変異タンパク質。
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