JP6346159B2 - 所定の標的に対して親和性を有するヒトリポカリン2(Lcn2、hNGAL)の突然変異タンパク質 - Google Patents
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Description
schul、S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25、3389−3402を参照)を用いて決定される。相同性の割合は、ペアワイズ比較の参照としてヒトポカリン2を用いた、プロペプチド配列を含む全ポリペプチド配列のアラインメントに基づく(マトリックス:BLOSUM62、ギャップコスト:11.1、切り捨て値を10〜3に設定)。それは、BLASTPプログラムアウトプットでの結果として示される「陽性」(相同アミノ酸)の数を、アラインメントのためにプログラムによって選択されたアミノ酸の総数で除した割合として計算される。これに関して、この選択されたアミノ酸の総数はヒトリポカリン2の長さとは異なり得ることに注意すべきである。
. Biophys. Acta 1482, 241−248の図1におけるもののように、公開されているアラインメントを用いて、WO99/16873(その中の図3を参照)に説明されるように実施され得る。リポカリンの三次元構造が利用可能な場合、本発明の突然変異誘発の対象となるべきこれらの配列位置の決定のために、構造の重ね合わせもまた使用され得る。多次元核磁気共鳴分光法のような他の構造解析の方法もまた、この目的のために使用され得る。
プチド配列における位置36、40、41、49、70、72、73、77、79、96、100、103、106、125、127、132、134に対応する位置に1つ又はそれ以上の突然変異したアミノ酸を含むことが想定される。
81→His、Asn96→Ser、Tyr100→Trp、Tyr106→Trp、Lys125→Arg、Ser127→Tyr、Tyr132→Phe、及びLys134→Glyのアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換が含まれる突然変異タンパク質の例は、図17に示されるN10(配列番号:26)がある。
rug delivery.InteRNAtional Congress Serie
s.2005 1277;185−198、又はGaillard PJ,et al.,
Targeted delivery across the blood−brain b
arrier.Expert Opin Drug Deliv.2005 2(2):29
9−309参照)。このような化合物は、例えば、商品名2B−Trans(登録商標)(オランダ国ライデンのto−BBB technologiesBV5社)で入手可能である。本発明の突然変異タンパク質に結合できる他の例示的な標的分子は、所望の標的分子に対して親和性を有する抗体、抗体フラグメント、又はリポカリン突然変異タンパク質を含む。標的部分の標的分子は、例えば、細胞表面抗原であってもよい。細胞表面抗原は、例えば、癌細胞のような細胞又は組織型に対して特異的であってもよい。このような細胞表面タンパク質の説明に役立つ実例として、HER−2、又はNEU−2のようなプロテオグリカンがある。
ティンガム)から商業上入手可能である。
ューセッツ州)から商業上入手可能なSyn融合(登録商標)の技術を用いてもよい。このFc融合技術の使用によって、長時間作用する生物製剤の産生が可能となり、例えば抗体のFc領域に結合される突然変異タンパク質の2のコピーからなり、薬物動態、溶解性、及び産生効率を改善することができる。
(a)ヒトリポカリン2をコードする核酸分子に、Lcn2の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置96、100、及び106に対応する配列位置のうちのいずれかの少なくとも1つをコードするヌクレオチドトリプレットで、突然変異誘発を受けさせることによって、1つ又はそれ以上の突然変異タンパク質核酸分子を生じるステップを含む。
(b)(a)で得られた1つ以上の突然変異タンパク質核酸分子を適切な発現系で発現させるステップ、及び、
(c)所定の標的に対して検出可能な結合親和性を有する1つ又はそれ以上の突然変異タンパクを、選択及び/又は単離によって濃縮するステップ、を含んでもよい。
(i)所定の標的/リガンドとして、免疫学的ハプテンの特性が示される遊離型又はコンジュゲート型の化学化合物、ペプチド、タンパク質、又は、例えば多糖、核酸分子(例えば、DNA又はRNA)、若しくは全ウイルス粒子やウイロイド等の他の高分子からなる群より選択される化合物を提供するステップと、
(ii)上記標的/リガンドと、当該標的/リガンドに対し結合親和性を有する突然変異タンパク質との間で複合体の形成を可能にするように、複数の突然変異タンパク質を上記リガンドと接触させるステップと、
(iii)結合親和性を有さない、又は実質的に有さない突然変異タンパク質を除去するステップと、
を備える。
異的な突然変異、又はランダムな突然変異によって得られる。より高い親和性又は改善された特性を得るための別の可能なアプローチは、エラープローンPCRの使用であり、リポカリン突然変異タンパク質の配列位置の選択した範囲にわたる点突然変異が生じる。エラープローンPCRはZaccoloら(1996)J.Mol.Biol.255,589−603:で記載されるもののような任意の周知のプロトコルによって行われうる。この目的に好適な他のランダムな突然変異誘発方法は、Murakami,Het al.(2002)Nat.Biotechnol.20,76−81:で記載のようなランダムな挿入/欠失(RID)か、又はBittker,J.Aら(2002)Nat.Biotechnol.20,1024−1029:で記載のような非相同性のランダムな組換えを含む。必要に応じて、親和性成熟はさらに、国際公開第00/75308号、又はSchlehuber,S.etal.(2000)J.Mol.Biol.297,1105−1120:に記載の手順によって行うことができ、ジゴキシゲニンに対し高親和性を有するビリン結合型のタンパク質の突然変異タンパク質が得られた。親和性を改善する更なるアプローチは、位置的な飽和突然変異誘発を行うことである。このアプローチにおいて、「小さな」核酸ライブラリは、アミノ酸交換/突然変異が任意の4のループセグメント内の単一位置にのみ導入されて産生されうる。これらのライブラリはその後、更なるパニングのラウンドなしに、選択ステップ(親和性スクリーニング)に直接的に供される。このアプローチによって、所望の標的の結合の改善に寄与する残基の同定が可能となり、結合に重要な「ホットスポット(hotspot)」の同定が可能となる。
a)突然変異タンパク質を前記化合物と接合するステップと、
b)突然変異タンパク質/化合物の複合体を事前選択された部位に送達するステップと、
を備える。
によって、化学的構造を検出するのに役立つ。ここで検出シグナルは、好適な突然変異タンパク質、接合体又は融合タンパク質の使用によって直接的に、又は抗体を介して結合された突然変異タンパク質の免疫化学的検出によって間接的に、のいずれかで産生できる。
また、他の実施形態において、本発明は、対象者において生体内撮像を行うために、本発明の突然変異タンパク質又は本発明の突然変異タンパク質が含まれる医薬組成物を、上記対象者に投与することを含む方法を特徴とする。その対象者は、上記のように定義されてもよい。
突然変異体Lcn2ファージディスプレイライブラリの構造
Lcn2変異のコンビナトリアルライブラリは、クローン化cDNA(Breustedtet al. (2006) Biochim. Biophys. Acta 1764, 161−173)に基づいて生成された。そのクローン化cDNAは、シングル不対チオール側鎖(Goetz et al. (2000) Biochemistry 39, 1935−1941)を除去するためにアミノ酸置換Cys87Serを運ぶとともに、第2のBstXl制限酵素認識部位を導入するためにアミノ酸置換Gln28Hisを運んだ。この領域の突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アセンブリは、基本的に(Besteet al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1898−1903、 Skerra (2001) J. Biotechnol.74, 257−275)に公開された方法に従って行っており、このとき、図1に示すように、オリゴデオキシヌクレオチド(配列番号:1-10)とのワンポット増幅反応を使用した。オリゴデオキシヌクレオチドは、配列番号:1-4のプライマーがコード鎖に対応してかつそれぞれアミノ酸位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132、又は134で縮重したコドンを運ぶ一方、配列番号:5-8のプライマーが非コード鎖に対応して且つ縮重したコドンやアンチコドンを運ばないように設計された。配列番号:9及び配列番号:10の2つの隣接するプライマーは、過剰に使用され、組み立てられたランダム化遺伝子フラグメントの増幅に役立つ。上記のように(Schlehuberet al. (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105−1120)、全てのPCRステップは、Go−TaqホットスタートDNAポリメラーゼ(Promega,Mannheim, Germany)を用いて行った。
(実施例2)
異なるフォーマットでAβ標的の調製
成熟β−アミロイド配列(Dodel et al. (2003) Lancet Neurology 2, 215−220)のアミノ酸1〜40に対応するAβ40ペプチド(配列番号:29)は、リジンスペーサ(Peptide Speciality Laboratory, Heidelberg, Germany)を介して接続されたC末端ビオチン基を有するとともに非標識の形(W.M. Keck Laboratory, New Haven, USA)で凍結乾燥されたペプチドの合成品として購入された。均一単量体のAβ40は5mg以下のペプチドを0.5mlの1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP、Sigma−Aldrich, Steinheim, Germany)に室温で少なくとも0.5時間溶解させることによって得られた。その後、HFIPをSpeedVac濃縮器で蒸発させ、Aβ40は冷水で15分間超音波処理(Bandelin,Sonorex, RK100, Germany)された後、適当量の蒸留水に溶解した。0.22μMフィルター(Spin−XCentrifuge Tube filter、 Corning, USA)ろ過した後、タンパク質の濃度は、1490M−1cm−1の計算された吸光係数を用いて280nmで吸収測定によって検出された(Gasteigeret al. (2003) ExPASy: the proteomics server for in−depthprotein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31, 3784−3788, http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)。
(実施例3)
ファージディスプレイによるAβ40ペプチドに対する親和性を有するLcn2突然変異タンパク質の選択
各パニングサイクルのために、PBS(4mM KH2PO4、16mM Na2HPO4、115mMNaCl、pH7.4)における約1012組み換え型ファージミドは、PBS/T(0.1%(v/v)のTween20[ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸モノエステルを含むPBS、AppliChem, Darmstadt, Germany])において2%(w/v)BSAで1時間ブロッキングされた。50の部分及び25μLのストレプトアビジン被覆電磁ビーズ懸濁液(DynaビーズM−280 Streptavidin; Dynal Biotech, Invitrogen, Karlsruhe,Germany and Streptavidin Magnetic Particles; Roche Diagnostics,Mannheim, Germany)は、それぞれPBS/Tで洗浄され、さらにPBS/Tにおいて2%(w/v)BSAで1時間ブロックされた。25のブロックされたビーズは、ビーズの特異的なファージミドを除去するためにブロックされたファージミドの前吸着に用いられ、50のブロックされたビーズは、その後、選択サイクルに用いられる。
(実施例4)
ファージディスプレイによるTrx−Αβ28融合タンパク質に対して親和性を有するLcn2突然変異タンパク質の選択
各パニングサイクルのために、まず、PBS(4mMKH2PO4、16mMNa2HPO4、115mMNaCl、pH7.4)における約1012の組み換え型ファージミドをサイクル1及び2のPBS/T(0.1%(v/v)のTween20を含有するPBS)に2%(w/v)のBSAで1時間ブロックした。選択サイクル3以降、PBS/Tにおける2%(w/v)のスキムミルク(Sucofin, TSI, Zeven, Germany)をブロッキング試薬として用いた。50及び25μLのanti−DIG−IgG被覆電磁ビーズ懸濁液(EuropaBioproducts Ltd, C
ambridge, UK)は、PBS/Tで洗浄され、PBS/T又はスキムミルクに2%(w/v)のBSAでそれぞれ1時間ブロックした。
(実施例5)
スクリーニングELISAによるAβに対して特異性を有するLcn2突然変異タンパク質の同定
実施例3に示すように、Aβ40とファージミド選択の4つのサイクル後、Lcn2突然変異タンパク質の濃縮したプールはphNGAL98(配列番号:27)にサブクローニングされ、E.coliスーパ株TG1−Fの形質転換に用いられ(a derivative of E.coliK12 TGI (Kim et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131, 3565−3576)、そして、スクリーニングELISAに供した。
(実施例6)
フィルターサンドイッチコロニースクリーニングアッセイによるTrx−Aβ28に対して特異性を有するLcn2突然変異タンパク質の同定
実施例4に示すように、Trx−Aβ28とファージミド選択の6つのサイクル後、突然変異したLcn2遺伝子カセットは、BstXI(Fermentas、St.Leon−Rot、Germany)によって、プラスミドphNGAL124(配列番号: 42)でサブクローニングされた。そのプラスミドphNGAL124(配列番号: 42)は、OmpAシグナルペプチドの融合物と、C末端Strep−tag II (Schmidt 及び Skerra (2007)Nat. Protoc. 2, 1528−1535)の後にアンバー終止コドンを有するLcn2コーディング領域と、連鎖球菌性のタンパク質G(Schlehuberら. (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105−1120)からのアルブミン結合ドメイン(ABD)のための遺伝子とをコードする。
Aβ及びED−Bに特異的なLcn2突然変異タンパク質の可溶性物質の生成及びその精製
組み換え型Lcn2及びその突然変異タンパク質は、E.coli BL21(Studier及びMoffat(1986)J.Mol.Biol.189,113−130),E.coli W3110(Bachmann (1990) Microbiol.Rev.54,130−197),E.coli JM83 (Yanisch−Perron ら.(1985) Gene 33,103−119)又はE.coli supE strain TG1−F(アクリジニウムオレンジを用いてそのエピソームから取り除かれたE.coli K12 TGIの誘導体 [Kimら. (2009)J.Am.Chem.Soc.131,3565−3576])におけるペリプラズム分泌により産生された。可溶性タンパク質の発現のために、成熟Lcn2タンパク質を有するOmpAシグナルペプチド(配列番号:28)とC末端Strep−tag IIの融合体をコードするプラスミドphNGAL98(配列番号:27)が用いられた。そのプラスミドは、突然変異した遺伝子カセットの一方向性サブクローニングのための2つの互換性のないBstXI制限酵素認識部位を有する。
(実施例8)
ELISA試験における種々のAβ標的の結合活性の測定
C末端Strep−tag IIを有するLcn2突然変異タンパク質の選択的捕獲(Schmidt及びSkerra (2007) Nat.Protoc.2,1528−1535)のために、96−well MaxiSorp ポリスチレンマイクロタイタープレート(Nunc,Langenselbold,Germany)は、10μg/ml StrepMAB−Immo(IBA,Gottingen,Germany)のPBS溶液を用いて4℃で一晩中コートされ、3%(w/v)BSAのPBS/T溶液を用いて室温で1時間ブロッキングされた。PBS/Tを用いた3回の洗浄ステップの後、実施例7からの精製されたLcn2突然変異タンパク質の1μM溶液50μlが1時間全てのWellにアプライされた。洗浄後、実施例2からのビオチニル化標的Aβ40、ΜΒΡ−Aβ40又はTrx−Aβ28の希釈系列の50μlが加えられ、1時間インキュベートされた。ここで、実施例2からのOva、MBP及びTrxのビオチニル化型は、陰性対照タンパク質として用いられた。Wellは、再度洗浄され、結合した接合体は、50μlの1:5000でPBS/Tにより希釈されたExtrAvidin/AP接合体(Sigma−Aldrich,Steinheim,Germany)を用いて1時間検出され、続いて、100mM Tris/HCl,pH8.8,100mM NaCl,5mM MgCl2中の0.5mg/mlパラニトロフェニルリン酸塩(AppliChem,Darmstadt,Germany)100μlの存在下でシグナルが生成された。405nmでの吸収ΔΑ/Δtのタイムコースは、SpectraMax 250リーダー(Molecular Devices,SunnyVale,USA)で測定され、データは、KaleidaGraphソフトウェア(Synergy software,Reading,PA)を用いて以下の方程式に適合された。
ΔΑ=ΔAmaxx[L]tot/(KD+[L]tot)
上記式において、[L]totは、アプライされたリガンド接合体の濃度を表し、KDは解離定数である(Voss及びSkerra(1997)Protein Eng.10,975−982)。
この式では、更なるパラメータとして曲線の傾きp(Hill係数)を有する。
表面プラズモン共鳴(SPR)を介したAβへの結合活性の測定
Lcn2突然変異タンパク質のリアルタイム分析は、ランニングバッファーとしてPBS/T(0.005%(v/v)Tween20を含むPBS)を用いて、Biacore X system (Biacore,Uppsala,Sweden)で行われる。10mM Na酢酸塩,pH4.5に溶解した、実施例2のΜΒΡ−Aβ40の50μg/ml溶液は、標準のアミンカップリング化学を用いてCMD200Iチップ(Xantec,Dusseldorf,Germany)に固定されて、リガンド濃度は1455共鳴単位(RU)であった。実施例7の精製されたLcn2突然変異タンパク質のS1−A4及びUS7は、10μL/minの流速で、2nMから125nMまでの濃度範囲でアプライされた。センサーグラムは、エタノールアミンを用いて活性化及び抑制されたコントロールチャンネルで測定された対応する信号を差し引くことにより校正された。キネティクスデータの評価は、BIAevaluationソフトウェアV 3.0を用いてフィッティングすることにより行われた(Karlssonら.(1991) J.Immunol.Methods 145,229−240)。このステップの間、kon及びkoffの比率は、全体的にフィットされ、一方、最大反応差Rmaxは、各曲線に局所的にフィットされる。
(実施例10)
SPOT膜におけるエピトープマッピングを介したAβエピトープの決定
Lcn2突然変異タンパク質S1−A4及びUS7のAβエピトープのマッピングのためのSPOT膜(Amino−PEG500−UC540シート,100x150mm, Mavis,Koln,Germany)は、MultiPep RS計測器(Intavis,Koln,Germany)及び同一の販売業者から得た活性化アミノ酸を用いて、Frank((2002) J.Immunol.Methods 26213−26)に記載されているように、自動化手順で準備された。Aβ40のアミノ酸配列(配列番号:29)は、一連のヘキサマー、デカマー及びペンタデカマーのそれぞれの1アミノ酸を転位して全体の配列をカバーして、膜において合成された。これらのペプチドのC末端は、膜に共有結合され、一方、それらのN末端は、アセチル化された。固定されたStrep−tag II は、検出方法の陽性対照として用いられた。
使用の前に、膜は、エタノールで1回、PBS(4mM KH2P04,16mM Na2HPO4,115mM NaCl,pH 7.4)で3回洗浄し、3%(w/v)BSAのPBS/T溶液(0.1%(v/v)Tween20を含むPBS)で1時間ブロッキングされた。PBS/Tで3回洗浄した後、膜は、PBS/Tに溶解されたLcn2突然変異タンパク質S1−A4(50nm)、US7(100nm)又は野生型Lcn2(100nm)と共に1時間インキュベートされ、PBS/Tで3回洗浄された。その後、Strep−tag IIを介したタンパク質検出のために、膜は、PBS/Tが溶媒である1:1500希釈されたストレプトアビジン/AP接合体(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)と共に1時間インキュベートされた。その後、膜は、PBS/Tで3回洗浄され、APバッファー(100mM Tris/HCl,pH 8.8,100mM NaCl,5mM MgCl2)で1回洗浄された後、Schlehuberら.((2000)J.Mol.Biol.297,1105−1120)に記載されているように、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸塩、4−トルイジン塩(BCIP、AppliChem,Darmstadt,Germany)及びニトロブルーテトラゾリウム(NBT、AppliChem,Darmstadt,Germany)のAPバッファー溶液を用いて発色反応を行った。
(実施例11)
ThT凝集アッセイにおけるAβへの親和性を有するLcn2突然変異タンパク質の機能分析
実施例2からの、可溶化され、均質な単量体の非ビオチニル化Aβ40に対して、様々なLcn2突然変異タンパク質の存在下又は非存在下において、チオフラビンT凝集アッセイを行った。チオフラビンT(ThT、Sigma−Aldrich,Steinheim,Germany)は、β−シートリッチのアミロイド原線維及びオリゴマー前駆体に特異的に結合するが、Aβペプチドに結合せず、それは、ThT蛍光の増大を伴う(Khurana ら.(2005)J.Struct.Biol.151,229−238)。
(実施例12)
エキストラドメインB(ED−B)を含む組み換え型フィブロネクチンフラグメントの調製
ヒトフィブロネクチンの3つの異なる組み換え型フラグメントは、選択のための標的として用いられた:単独のエキストラドメインB(ED−Bと呼ばれる、Zardiら.(1987)EMBO Journal,6,2337−2342)、その隣接するドメイン7及び8に関連して同一のドメイン(FN7B8と呼ばれる)、並びに従来型ドメイン7、8及び9を含み、ED−Bを欠失しているFN789(Carnemollaら. (1996), Int.J.Cancer,68,397−405、 Leahy ら. (1994) Proteins 19,48−54)。
.4で透析分離された。 その後、そのタンパク質は、20又は40mM Hepes/
NaOH,pH7.4を用いて平衡化されたイオン交換クロマトグラフィーカラム(Resource Q,GE Healthcare,Munich,Germany)にロードされた。結合したフィブロネクチンフラグメントを溶出するために、0から300mMまでのNaCl勾配が用いられた。
(実施例13)
ファージディスプレイによるED−Bに対する親和性を有するLcn2変異体の選択
全部で4つのファージミドディスプレイ選択サイクルは、実施例1に記載されたように、Sloning BioTechnology GmbH により最初に合成された合成遺伝子コレクションに基づくLcn2ランダムファージミドライブラリを用いて行われた。第1の選択サイクルのために、300μlのTBS/E(40mM Tris/HCl,115mM NaCl、及び1mM EDTAに溶解され、50mMベンズアミジンが添加された約5×1012の組み換え型ファージミドは、0.4%(v/v)Tween 20[ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸モノエステル、AppliChem,Darmstadt,Germany])を含むTBSに溶解された8%(w/v)BSA(Sigma−Aldrich,Munich,Germany)を100μl加えることにより30分間ブロッキングされた。その後、この溶液は、2%(w/v)BSAのTBS/T(0.1%(v/v)Tween20を含むTBS)溶液により1時間ブロッキングされた抗ジゴキシゲニンIgG電磁ビーズ(Europa Bioproducts,Cambridge,UK)と共に1時間インキュベートされ、400μlの0,1μΜジゴキシゲニン標識組み換え型FN7B8でチャージされた(実施例12を参照)。
グリシン/HCl,pH2.2を用いて8分間の第2溶出が行われた。溶出液は回収され、2M酢酸又は50μlの0.5M Tris塩基の適量をそれぞれ組み合わせて用い、すぐに中和され、対数増殖期のE.coli XLl−Blueに移すために用いられた。ファージミドは、以下の公開されたプロトコル(Besteら.(1999)PNAS 96, 1898−903、 Schlehuberら.(2000) J Mol Biol 297 1109−20)の次のパニングステップの前に、力価が上げられ、増幅された。
(実施例14)
スクリーニングELISAによるED−Bに対する親和性を有するLcn2変異体の選択
実施例13に記載されたファージディスプレイ選択から生じた、標的タンパク質ED−Bに特異的に結合するLcn2突然変異タンパク質の濃縮は、スクリーニングELISAにより観察された。最後のパニングステップからのファスミドのプールされた調製液を用いて、突然変異遺伝子カセットが発現プラスミドphNGAL98のBstXIを介してサブクローニングされた。それは、E.coliにおけるペリプラズム生産のためのOmpAシグナルペプチドとC末端Strep−tagIIを有するLcn2コーディング領域との融合体をコードする(Schmidt及びSkerra (2007)Nat. Protoc.2,1528−1535)。96−wellプレートにおける個々のLcn2突然変異タンパク質の可溶性発現は、以下のように行われた:100μg/mlアンピシリンを含む100μlTB培地(Tartof及びHobbs(1987)Bethesda Research Laboratory Focus 9,12)に、ランダムに選択された単一コロニーが播かれ、37℃で5時間振とう培養した(500rpmから800rpm、 Thermomixer comfort、Eppendorf,Hamburg,Germany)。各クローンのために、100μlの新鮮培地に、この培養液の10μlを播き、37℃で1時間から2時間振とう培養された後、22℃まで温度を下げられた。2時間から4時間の更なる培養の後に、Lcn2突然変異タンパク質の発現が、0.2μg/mlアンヒドロテトラサイクリン(Acros,Geel,Belgium)を添加して12時間から14時間の対数増殖期細胞において誘導された。タンパク質のペリプラズム放出は、1mg/mlリゾチーム(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)を含む40μlの2×BBS(0.2M ホウ酸塩/NaOH,160mM NaCl,1mM EDTA,pH8.0)を加えて室温で1時間振とう培養することにより生じた。溶解液は、40μlの10%w/v BSA(Applichem,Darmstadt,Germany)のTBS溶液及び0,5% Tween−20を用いて1時間ブロッキングされ、細胞破片は、10分間の遠心分離により粗抽出物から除去された。
Germany)の表面に吸着するために、50μlのTBSに溶解された100μg/mlタンパク質溶液が各wellに加えられ、4℃で一晩中インキュベートされた。E.coliからの粗抽出物への暴露の前に、TBS/Tを用いた3回の洗浄ステップの後に、wellはTBS/Tに溶解された2%(w/v)BSAを用いて室温で3時間ブロッキングされ、繰り返し洗浄された。ELISAのために、50μlの清澄な溶解液はwellにアプライされ、1時間インキュベートされ、続いて、TBS/Tを用いて3回洗浄された。結合したLcn2突然変異タンパク質は、4−ニトロフェニルリン酸塩基質 (pNPP, 0.5mg/ml、 AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany)を用い、0.1M Tris/HCl,0.1M NaCl,5mM MgCl2,pH8.8に溶解されたストレプトアビジン−アルカリ−ホスファターゼ結合体(TBS/Tで1:1500希釈、 GE Healthcare,Munich,Germany)を用いて検出された(実施例16を参照)。
(実施例15)
Lcn2及びその変異体の可溶性タンパク質の産生及び精製
詳細は実施例7を参照。
(実施例16)
ELISAにおけるED−Bへの結合活性の測定
96−well Nunc Maxisorp プレート(Thermo Fisher Scientific,Langenselbold,Germany)の表面へのFN7B8又はFN789の吸着のために、TBS/Eに溶解された50μlの100μg/mlタンパク質溶液は、各wellに加えられ、室温で2時間インキュベートされた。さらに、コントロールタンパク質を含むために、ブランクwellは120μlのTBS/ETに溶解された2%(w/v)BSA(AppliChem,Darmstadt,Germany)に暴露された。3回の洗浄ステップの後に、TBS/ETに溶解された120μlの2%(w/v)BSA(AppliChem,Darmstadt,Germany)を用いて室温で2時間ブロッキングされ、繰り返し洗浄され、50μlの精製Lcn2突然変異タンパク質の希釈系列が加えられ、1時間インキュベートされた。wellは再度洗浄され、結合したLcn2突然変異タンパク質は、TBS/Tで1:1500希釈された50μlのストレプトアビジン−アルカリ−ホスファターゼ結合体(GE Healthcare,Munich,Germany)を用いて1時間検出され、続いて、100mM Tris/HCl,100 mM NaCl,5mM MgCl2,pH 8.8が溶媒である50μlの0.5mg/mlパラニトロフェニルリン酸塩の存在下でシグナルを生成した。405nmにおける吸収ΔΑ/Δtの経時変化は、SpectraMax 250 リーダー(Molecular Devices,SunnyVale,CA)で測定され、データはKaleidaGraphソフトウェアを用いて下記の式に適応させた。
この式において、[L]totはアプライされたリガンド接合体の濃度を表し、KDは解離定数(Voss及びSkerra(1997)Protein Eng.10,975−982)を表す。Lcn2変異体N7A、N9B及びN10Dのそれぞれは、14.8nM(N7A)、40.1nM(N9B)、30.0nm(N7E)及び51.2(N10D)のKD値でFN7B8に特異的に結合するが、FN789又はBSAに結合しないことが分かった。
(実施例17)
表面プラズモン共鳴(SPR)を介した組み換え型フィブロネクチンFN7B8への結合活性の測定
Lcn2突然変異タンパク質のリアルタイム分析は、ランニングバッファーとして、HBS/ET(0.005%(v/v)Tween20を含む20mM Hepes,pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA)を用いてBiacore X system(Biacore,Uppsala,Sweden)で実行された。10mM Na酢酸塩,pH4.0が溶媒である200μg/ml組み換え型FN7B8溶液は、標準のアミンカップリング化学(Biacore,Uppsala,Sweden)を用いて、CMD200mセンサーチップ(XanTec bioanalytics,Duesseldorf,Germany)に固定されて、リガンド濃度は約500共鳴単位(RU)であった。精製Lcn2突然変異タンパク質は、2.5から最大で160nMの濃度において、25μl/minの流量でアプライされた。Theセンサーグラムは、コントロールチャンネルのために測定される対応するシグナルを差し引くことにより 校正された。それは、エタノールアミンを用いて活性化又は抑制された。キネティクスデータの評価は、BIAevaluationソフトウェアV4.1を用いた全体的なフィッティングにより行われた(Karlssonら.(1991) J.Immunol.Methods 145,229−240)。
(表2)表面プラズモン共鳴により測定された、選択したLcn2突然変異タンパク質のFN7B8に対するキネティクス結合データ
ED−BポジティブCaCo2細胞の免疫染色
ヒト結腸癌細胞(CaCo2細胞は、H.Daniel,Technische Universitat Miinchen,Germanyにより快く提供された;Pujuguet ら., Am.J.Pathol.148,579−592)は、細胞コンフルエンスが約50から70%となるまで37℃の湿気環境で、10%ウシ胎児血清、1x MEM非必須Lアミノ酸及び50μg/mlゲンタマイシン(PAA Laboratories,Pasching,Austria)が添加されたEarle塩及びL−グルタミンを含むMEMにおいて、Nunc Lab−TekTM II chamber slideTM system(各スライドに4つのチャンバ、Thermo Fisher Scientific,Langenselbold,Germany)で培養された。カバースライドに付着された細胞単層は、PBS(Dulbecco’s Ca2+及びMg2+非含有、 PAA Laboratories, Pasching, Austria)を用いて洗浄され、続いて蒸留水で洗浄され、その後5μg/ml DAPI(4’,6−ジアミノ−2−フェニルインドール、Sigma−Aldrich,Munich,Germany)を含む氷冷メタノールを用いて5分間固定及び対比染色された。
(実施例19)
H1−G1の配列位置36におけるフリーシステイン残基の置換によるAβ特異的Lcn2突然変異タンパク質H1GA及びH1GVの生成
Cys36は、部位特異的突然変異誘発によりAla又はValに置換された。そのために、PCRは縮重したオリゴデオキシヌクレオチドDH−4(配列番号:45)、第2のオリゴデオキシヌクレオチドJ08rev(配列番号:48)、及び鋳型としてLcn2突然変異タンパク質H1−G1をコードするプラスミドDNA(配列番号:37)を用いて行われた。増殖されたフラグメントは、発現プラスミドphNGAL98におけるBstXIを介してサブクローニングされ、個々の置換変異体を同定するために配列決定された。アミノ酸置換の導入により生じたLcn2変異体は、H1GA(配列番号:49,50)及びH1GV(配列番号:51,52)と名付けられた。
(実施例20)
高光学濃度を有するE.coli培養物を用いる新規のAβ特異的Lcn2突然変異タンパク質H1GA及びH1GVの可溶性物質及びその精製
組み換え型Lcn2及びその突然変異タンパク質は、E.coli JM83におけるペリプラズム分泌により産生された。可溶性タンパク質の発現のために、H1GA(配列番号:49)又はH1GV(配列番号:51)のいずれかをコードする対応するBstXI挿入を有するプラスミドphNGAL98が用いられた。
ロテトラサイクリン(aTc)を加えることにより、OD550=2.5の細胞濃度で誘導された。5時間の培養後、細胞は遠心分離により回収され、0.1mg/mlリゾチームを含む40ml氷冷ペリプラズム分別バッファー(0.5Mスクロース,1mM EDTA,100mM Tris−HCl pH8.0)に再懸濁され、30分間氷上でインキュベートされた。生じたスフェロプラストは、遠心分離を繰り返して沈殿され、可溶性 組み換え型タンパク質を含む上清が回収された。
(実施例21)
BiacoreX計測器での表面プラズモン共鳴を介したΜΒΡ−Aβ40に対する結合活性の測定
Lcn2突然変異タンパク質H1GA又はH1GVとΜΒΡ−Aβ40(配列番号:3
3)との相互作用のリアルタイム分析は、ランニングバッファーとしてPBS/T(0.005%(v/v)Tween20を含む4mM KH2PO4,16mM Na2HPO4, 115mM NaCl,pH7.4)を用いて、Biacore X systemで行われた。10mM Na酢酸塩,pH4.5を溶媒とした実施例2からの15μg/mlΜΒΡ−Aβ40溶液は、標準のアミンカップリング化学を用いてCMD200Iチップ(Xantec,Dusseldorf,Germany)に固定されて、リガンド濃度は1316共鳴単位(RU)であった。実施例20の精製Lcn2突然変異タンパク質H1GA及びH1GVは、20μL/minの流量で、4nMから128nMまでの濃度範囲でアプライされた。そのデータは、エタノールアミンを用いて活性化及び抑制されたコントロールチャンネルの測定された対応する信号を差し引くこと、及びバッファー注入の平均の測定信号を差し引くことにより2重参照された。キネティクスデータは、BIAevaluationソフトウェアV 3.0を用いて全体的に適合された(Karlssonら.(1991)J.Immunol.Methods 145,229−240)。
(実施例22)
Biacore T100計測器測定における表面プラズモン共鳴を介したAβ40の結合活性の測定
Lcn2突然変異タンパク質H1GAとAβ40(配列番号:29)との相互作用のリアルタイム分析は、ランニングバッファーとしてPBS/P(0.005%(v/v)Surfactant P20を含む4mM KH2PO4,16mM Na2HPO4,115mM NaCl,pH7.4)を用いて、Biacore T100 system (Biacore,Uppsala,Sweden)で行われた。10mM酢酸ナトリウム pH4.5を溶媒とした実施例2からの10μg/ml Aβ40溶液は、標準のアミンカップリング化学を用いて、CM5チップ(Biacore,Uppsala,Sweden)に固定化されて、リガンド濃度は325RUであった。実施例20の精製Lcn2突然変異タンパク質H1GAは、30μl/minの流量で、1nMから32nMまでの濃度範囲でアプライされた。H1GAの希釈系列は、konの情報を得るために、300sの結合及び解離時間の両方を用いて導入された。低koff比の正確な測定のために、最高濃度は、7200sの解離時間を用いて分析された。そのデータは、実施例21のように2重参照された。結合反応のkon及びkoffは、データ処理及びキネティクスフィッティングのためにBiacore T100 Evaluationソフトウェア V2.0.3を用いて全体のデータセットから決定された。そのデータは、1:1結合モデルを用いて、全体的に適合された。
(実施例23)
ThT凝集アッセイによるLcn2突然変異タンパク質H1GAの機能分析
チオフラビンT(ThT)凝集アッセイのために、合成Aβペプチド(配列番号:29)は、1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP、Sigma−Aldrich,Steinheim,Germany)に12時間溶解された。HFIPは、真空下で蒸発され、Aβは適量の蒸留水に溶解され、4℃で15分間超音波処理され、濾過された(Costar Spin−X遠心管フィルターセルロース酢酸塩膜,0.45μM;Corning Inc.,Corning,NY)。可溶化単量体Aβは、その後すぐに、凝集アッセイに用いられた。
(実施例24)
表面プラズモン共鳴(SPR)を介した組み換え型フィブロネクチン単一ドメインED−Bへの結合活性の測定測定
Lcn2突然変異タンパク質のリアルタイム相互作用分析は、ランニングバッファーとして、HBS/ET(0.005%(v/v)Tween 20を含む20mM Hepes,pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA)を用いて、Biacore X計測器で行われた。10mM Na酢酸塩,pH40が溶媒である100μg/ml組み換え型ED−B溶液は、標準のアミンカップリング化学を用いて、CMD200mセンサーチップに固定化されて、リガンド濃度は約180共鳴単位(RU)であった。精製Lcn2突然変異タンパク質は、25μl/minの流量で、2.5から160nmまでの濃度でアプライされた。センサーグラムは、エタノールアミンを用いて活性化及び抑制されたコントロールチャンネルの測定された対応するシグナルを差し引くことにより校正された。キネティクスデータの評価は、BIAevaluationソフトウェア V4.1を用いて全体的にフィッティングすることにより行われた(Karlssonら.(1991)J.Immunol.Methods 145,229−240)。N10Dの場合において、異種検体競合反応モデルは、データフィッティングのために用いられ、2つの速度定数を生じた。
(表3)表面プラズモン共鳴により測定されたLcn2突然変異タンパク質のED−Bに対するキネティクス結合データ
Claims (5)
- 200nM以下の解離定数(KD)で所定の非天然標的に結合することができ、ヒトリポカリン2(Lcn2、hNGAL)に由来する突然変異タンパク質の生成方法であって、
ヒトLcn2タンパク質をコードする核酸分子を、配列番号44のヒトLcn2の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置96、100、及び106に対応する配列位置のうちのいずれかの少なくとも2つをコードするヌクレオチドトリプレットで突然変異誘発させるステップ(a)と、
前記核酸分子を、さらに、ヒトLcn2の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、103、125、127、132及び134のいずれかをコードする少なくとも12、13、14、15、16又は17全てのヌクレオチドトリプレットで突然変異誘発させて、1つ又はそれ以上の突然変異タンパク質核酸分子を生じるステップ(b)と、
前記ステップ(b)で得られた1つ以上の突然変異タンパク質核酸分子を適切な発現系で発現させるステップ(c)と、
所定の標的に対して200nM以下の解離定数(KD)を有する1つ又はそれ以上の突然変異タンパクを、選択及び/又は単離によって濃縮するステップ(d)と、を備えている方法。 - 請求項1の方法において、
前記突然変異タンパク質は、ヒトLcn2の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置137及び145に対応する配列位置のいずれかで突然変異したアミノ酸残基を備えていない方法。 - 請求項1又は2の方法において、
前記非天然標的は、ペプチド、タンパク質、タンパク質のフラグメント又はドメイン、及び有機小分子からなる群から選択され、
前記ペプチドは、アミロイドベータペプチドを含み、
前記タンパク質は、フィブロネクチン又はそのドメインを含む、方法。 - 請求項3の方法において、
前記非天然標的はペプチドであり、該ペプチドは10〜45のアミノ酸を有する、方法。 - ヒトLcn2の突然変異タンパク質をコードする核酸ライブラリであって、
前記ライブラリに含まれる核酸分子内において、配列番号44のヒトLcn2の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置96、100、及び106に対応する配列位置のうちのいずれかの少なくとも2つをコードするヌクレオチドトリプレットで突然変異が生じており、
前記ライブラリに含まれる核酸分子内において、さらに、配列番号44のヒトLcn2の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、103、125、127、132及び134のいずれかをコードする少なくとも12、13、14、15、16又は17全てのヌクレオチドトリプレットで突然変異が生じている、核酸ライブラリ。
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ATE76311T1 (de) | 1986-08-19 | 1992-06-15 | Genentech Inc | Einrichtung und dispersion zum intrapulmonalen eingeben von polypeptidwuchsstoffen und zytokinen. |
JPH01215289A (ja) | 1988-02-22 | 1989-08-29 | Toa Nenryo Kogyo Kk | 遺伝子組換えによる正常ヒト血清アルブミンaの製造方法 |
FR2649991B2 (fr) | 1988-08-05 | 1994-03-04 | Rhone Poulenc Sante | Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces |
US5728553A (en) | 1992-09-23 | 1998-03-17 | Delta Biotechnology Limited | High purity albumin and method of producing |
AU696387B2 (en) | 1994-05-18 | 1998-09-10 | Inhale Therapeutic Systems, Inc. | Methods and compositions for the dry powder formulation of interferons |
DE4417598A1 (de) | 1994-05-19 | 1995-12-14 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung des Tetracyclinpromotors zur stringent regulierten Produktion von rekombinanten Proteinen in prokaryontischen Zellen |
AU5132096A (en) | 1995-01-30 | 1996-08-21 | Terrapin Technologies, Inc. | Glubodies - multiplicities of proteins capable of binding a variety of small molecules |
US5908621A (en) | 1995-11-02 | 1999-06-01 | Schering Corporation | Polyethylene glycol modified interferon therapy |
US6620413B1 (en) | 1995-12-27 | 2003-09-16 | Genentech, Inc. | OB protein-polymer chimeras |
DE19641876B4 (de) | 1996-10-10 | 2011-09-29 | Iba Gmbh | Streptavidinmuteine |
WO1998016873A1 (fr) | 1996-10-14 | 1998-04-23 | Firm Forsat Ltd. | Procede de preparation de dispersions a base de composants chromogenes |
WO1999007740A2 (en) | 1997-08-06 | 1999-02-18 | Zymogenetics, Inc. | Lipocalin homologs |
US20140080177A1 (en) | 1997-09-26 | 2014-03-20 | Pieris Ag | Anticalins |
DE19742706B4 (de) * | 1997-09-26 | 2013-07-25 | Pieris Proteolab Ag | Lipocalinmuteine |
GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
CA2233725A1 (en) | 1998-03-31 | 1999-09-30 | Hemosol Inc. | Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes |
IL139786A0 (en) | 1998-06-08 | 2002-02-10 | Hoffmann La Roche | Use of peg-ifn-alpha and ribavirin for the treatment of chronic hepatitis c |
US6403564B1 (en) | 1998-10-16 | 2002-06-11 | Schering Corporation | Ribavirin-interferon alfa combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic hepatitis C infection |
US6566073B1 (en) | 1998-10-19 | 2003-05-20 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Materials and methods involving conditional retention domains |
CA2362834C (en) * | 1999-03-04 | 2005-12-06 | Praecis Pharmaceuticals Incorporated | Modulators of beta-amyloid peptide aggregation comprising d-amino acids |
DE19926068C1 (de) | 1999-06-08 | 2001-01-11 | Arne Skerra | Muteine des Bilin-Bindungsproteins |
CA2440582A1 (en) | 2001-03-09 | 2002-10-03 | Dyax Corp. | Serum albumin binding moieties |
WO2003029462A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins |
AU2001298053A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-14 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of apolipoprotein D |
AU2003264100A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-03-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target |
AU2003275958A1 (en) * | 2003-08-25 | 2005-03-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of tear lipocalin |
JP2007284351A (ja) | 2004-07-27 | 2007-11-01 | Osaka Bioscience Institute | アミロイド蛋白質の凝集を抑制する物質とその作用 |
WO2006056464A2 (en) | 2004-11-26 | 2006-06-01 | Pieris Ag | Compound with affinity for the cytotoxic t lymphocyte-associated antigen (ctla-4) |
AU2006294644A1 (en) | 2005-09-27 | 2007-04-05 | Amunix, Inc. | Proteinaceous pharmaceuticals and uses thereof |
ES2354653T3 (es) * | 2006-08-01 | 2011-03-16 | Pieris Ag | Muteínas de lipocalina lacrimal y procedimientos para obtener las mismas. |
JP5608368B2 (ja) * | 2006-08-01 | 2014-10-15 | ピエリス アーゲー | 涙リポカリンの突然変異タンパク質およびそれを得るための方法 |
JP2011501673A (ja) * | 2007-10-19 | 2011-01-13 | アボット・ラボラトリーズ | グリコシル化された哺乳動物ngal及びその使用 |
JP5711118B2 (ja) | 2008-06-24 | 2015-04-30 | テクニッシュ ウニヴェルジテート ミュンヘン | 所与の標的に対してアフィニティーを有するhNGALおよび類縁タンパク質のムテイン |
BR112012013662B1 (pt) | 2009-12-07 | 2022-08-02 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Muteínas de lipocalina associada à gelatinase de neutrófilo humano (lcn2, hngal), seu uso e seus métodos de geração e produção, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira, composição farmacêutica e kit de diagnóstico ou analítico |
CN103154023B (zh) * | 2010-08-16 | 2017-04-05 | 皮里斯制药有限公司 | 铁调素的结合蛋白 |
DK2640740T3 (en) | 2010-11-15 | 2017-06-26 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | MUTEINS OF HUMAN LIPOCALIN 2 WITH AFFINITY FOR GLYPICAN-3 (GPC3) |
US10526384B2 (en) * | 2012-11-19 | 2020-01-07 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Interleukin-17A-specific and interleukin-23-specific binding polypeptides and uses thereof |
KR20170105609A (ko) | 2015-01-28 | 2017-09-19 | 피어이스 파마슈티컬즈 게엠베하 | 신생혈관형성에 특이적인 신규한 단백질 |
TN2017000348A1 (en) | 2015-02-18 | 2019-01-16 | Sanofi Sa | Novel proteins specific for pyoverdine and pyochelin |
DK3292137T3 (da) | 2015-05-04 | 2022-10-17 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Proteiner specifikke for cd137 |
US10273275B2 (en) | 2015-05-18 | 2019-04-30 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Muteins of human lipocalin 2 with affinity for glypican-3 (GPC3) and methods of use thereof |
TW201725212A (zh) | 2015-12-10 | 2017-07-16 | 第一三共股份有限公司 | 特異性於降鈣素基因相關胜肽的新穎蛋白 |
-
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021006024A (ja) * | 2009-12-07 | 2021-01-21 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | 所定の標的に対して親和性を有するヒトリポカリン2(Lcn2、hNGAL)の突然変異タンパク質 |
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