ES2354653T3 - Muteínas de lipocalina lacrimal y procedimientos para obtener las mismas. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la generación de una muteína de lipocalina lacrimal humana, en el que la muteína se une a un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión detectable, que comprende: (a) someter a una molécula de ácido nucleico que codifica una lipocalina lacrimal humana a mutagénesis en al menos 12, 14 ó 16 de los codones de cualquiera de las posiciones de la secuencia de aminoácidos 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura nativa, en la que al menos uno de los codones que codifica restos de cisteína en las posiciones de secuencia 61 y 153 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura se ha mutado para codificar cualquier otro resto aminoacídico, obteniendo de este modo una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican muteínas de lipocalina lacrimal humana, (b) expresar las una o más moléculas de ácido nucleico de muteína obtenidas en (a) en un sistema de expresión, obteniendo de este modo una o más muteínas y (c) enriquecer las una o más muteínas obtenidas en la etapa (b) y que tienen afinidad de unión detectable por un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana por medio de selección y/o aislamiento, A condición de que el ligando no natural de la lipocalina lacrimal humana no sea el correceptor de linfocitos T humanos CD4.

Description

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/821.073 presentada el 1 de agosto de 2006 y de la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/912.013 presentada el 16 de abril de 2007.

La presente invención se refiere a nuevas muteínas derivadas de lipocalina lacrimal humana que se unen a un 5 ligando no natural dado con afinidad detectable. La invención también se refiere a las moléculas de ácido nucleico correspondientes que codifican dicha muteína y a un procedimiento para su generación. La invención se refiere adicionalmente a un procedimiento para producir dicha muteína. Finalmente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicha muteína de lipocalina, así como a diversos usos de la muteína.

Los miembros de la familia de proteínas de la lipocalina (Pervaiz, S., y Brew, K. (1987) FASEB J. 1, 209-214) son 10 típicamente proteínas secretadas pequeñas que se caracterizan por una serie de diferentes propiedades de reconocimiento molecular: su capacidad para unirse a diversas moléculas principalmente hidrófobas (tales como retinoides, ácidos grasos, colesteroles, prostagladinas, biliverdinas, feromonas, saborizantes y odorizantes), su unión a receptores de superficie celular específicos y su formación de complejos macromoleculares. Aunque en el pasado se han clasificado principalmente como proteínas de transporte, está claro ahora que las lipocalinas cumplen una diversidad de 15 funciones fisiológicas. Éstas incluyen papeles en el transporte de retinol, olfacción, señalización con feromonas y síntesis de prostaglandinas. Las lipocalinas también se han implicado en la regulación de la respuesta inmune y la mediación de la homeostasis celular (revisado, por ejemplo, por Flower, D. R. (1996) Biochem J. 318, 1-14 y Flower, D. R. y col. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 9-24).

Las lipocalinas comparten niveles inusualmente bajos de conservación de secuencia global, con frecuencia con 20 identidades de secuencia de menos del 20%. Muy por el contrario, su patrón de plegamiento global está altamente conservado. La parte central de la estructura de la lipocalina consiste en una única lámina  de ocho cadenas antiparalelas cerrada sobre sí misma para formar un barril  unido por enlaces de hidrógeno de forma continua. Un extremo del barril está bloqueado estéricamente por el segmento peptídico N-terminal que atraviesa su parte inferior, así como tres bucles peptídicos que conectan las cadenas . El otro extremo del barril  está abierto al disolvente y abarca un 25 sitio de unión a diana, que está formado por cuatro bucles peptídicos. Es esta diversidad de los bucles en el armazón de lipocalina que de otro modo sería rígido lo que da origen a una diversidad de diferentes modos de unión, cada uno capaz de alojar dianas de diferente tamaño, forma y carácter químico (revisado, por ejemplo, por Flower, D. R. (1996), mencionado anteriormente; Flower, D. R. y col. (2000), mencionado anteriormente o Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350). 30

La prealbúmina lacrimal humana, llamada ahora lipocalina lacrimal (TLPC o Tlc), se describió originalmente como una proteína principal del fluido lacrimal humano (aproximadamente un tercio del contenido proteico total), pero también se ha identificado recientemente en varios otros tejidos secretores incluyendo próstata, mucosa nasal y mucosa traqueal. Se han encontrado proteínas homólogas en rata, cerdo, perro y caballo. La lipocalina lacrimal es un miembro de lipocalina inusual debido a su alta promiscuidad para lípidos relativamente indisolubles y a sus características de unión, 35 que difieren de otros miembros de esta familia de proteínas (revisado por Redl, B. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 241-248). Una cantidad notable de compuestos lipófilos de diferentes clases químicas tales como ácidos grasos, alcoholes grasos, fosfolípidos, glucolípidos y colesterol son ligandos endógenos de esta proteína. De forma interesante, al contrario que otras lipocalinas, la fuerza de la unión al ligando (diana) está correlacionada con la longitud de la cola de hidrocarbono tanto para alquilamidas como para ácidos grasos. De este modo, la lipocalina lacrimal se une más fuertemente a los 40 lípidos menos solubles (Glasgow, B. J. y col. (1995) Curr. Eye Res. 14, 363-372; Gasymov, O. K. y col. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1433, 307-320).

La función biológica precisa de la lipocalina lacrimal humana no se ha aclarado completamente hasta el momento y aún es un tema controvertido. En el fluido lacrimal, parece ser la más importante para la integridad de la película lacrimal, eliminando los lípidos de la superficie mucosa del ojo a la fase líquida (revisado por Gasymov, O. K. y col. 45 (1999), mencionado anteriormente). Sin embargo, presenta actividades adicionales in vitro que son muy inusuales entre las lipocalinas, en concreto la inhibición de proteinasas de cisteína, así como actividad endonucleasa inespecífica (van’t Hof, W. y col. (1997) J. Biol. Chem. 272, 1837-1841; Yusifov, T. N. y col. (2000) Biochem. J. 347, 815-819). Recientemente, se ha demostrado que la lipocalina lacrimal es capaz de unirse a varios productos de peroxidación lipídica in vitro, dando como resultado la hipótesis de que podría funcionar como eliminador de moléculas lipófilas potencialmente 50 nocivas inducido por estrés oxidativo fisiológico (Lechner, M. y col. (2001) Biochem. J. 356, 129-135).

Las proteínas, que se unen selectivamente a sus diales correspondientes por medio de interacciones no covalentes, desempeñan un papel crucial como reactivos en biotecnología, medicina, bioanalítica, así como en las ciencias biológicas y de la vida en general. Los anticuerpos, es decir, las inmunoglobulinas, son un ejemplo prominente de esta clase de proteínas. A pesar de las múltiples necesidades para estas proteínas junto con el reconocimiento, unión y/o 55 separación de ligandos/dianas, actualmente se usan casi exclusivamente inmunoglobulinas. La aplicación de otras proteínas con características de unión a ligando definidas, por ejemplo las lectinas, ha permanecido restringida a casos

especiales.

Muy recientemente, los miembros de la familia de la lipocalina se han convertido en sujetos de investigación con respecto a proteínas que tienen propiedades de unión a ligando definidas. La publicación PCT WO 99/16873 desvela polipéptidos de la familia de la lipocalina con posiciones de aminoácidos mutadas en la región de los cuatro bucles peptídicos, que se disponen al final de la estructura de barril  cilíndrica que abarca el bolsillo de unión, y que 5 corresponden a los segmentos de la secuencia polipeptídica lineal que comprenden las posiciones de aminoácidos 28 a 45, 58 a 69, 86 a 99 y 114 a 129 de la proteína de unión a bilina de Pieris brassicae.

La publicación PTC WO 00/75308 desvela muteínas de la proteína de unión a bilina, que se unen específicamente a digoxigenina, mientras que las solicitudes de Patente Internacional WO 03/029463 y WO 03/029471 se refieren a muteínas de la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana (hNGAL) y apolipoproteína D, 10 respectivamente. Para mejorar adicionalmente y ajustar con exactitud la afinidad a ligando, la especificidad, así como la estabilidad de plegamiento de una variante de lipocalina, se han propuesto diversos enfoques usando diferentes miembros de la familia de la lipocalina (Skerra, A. (2001) Rev. Mol. Biotechnol. 74, 257-275; Schlehuber, S. y Skerra, A. (2002) Biophys. Chem. 96, 213-228), tales como el reemplazo de restos de aminoácidos adicionales. La publicación PCT WO 2006/56464 desvela muteínas de la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana con afinidad de unión por 15 CTLA-4 en un intervalo nanomolar bajo.

La publicación PCT WO 2005/19256 desvela muteínas de lipocalina lacrimal con al menos un sitio de unión para el mismo o diferentes ligandos diana, y proporciona un procedimiento para la generación de dichas muteínas de lipocalina lacrimal humana. De acuerdo con esta solicitud PCT, ciertas extensiones de aminoácidos dentro de la secuencia primaria de la lipocalina lacrimal, en particular las regiones de bucle que comprenden los aminoácidos 7-14, 24-36, 41-49, 53-66, 20 69-77, 79-84, 87-98 y 103-110 de la lipocalina lacrimal humana madura, se someten a mutagénesis para generar muteínas con afinidades de unión. Las muteínas resultantes tienen afinidades de unión por el ligando seleccionado (KD) en el intervalo nanomolar, en la mayoría de los casos >100 nM.

La solicitud PCT WO 2007/107563, que es un documento a tenor del artículo 54 (3) EPC, desvela muteínas de lipocalina lacrimal que se unen al correceptor de linfocitos T humanos CD4 como ligando. 25

A pesar de este progreso aún sería deseable tener un procedimiento para la generación de muteínas de lipocalina lacrimal humana que posean propiedades de unión mejoradas para una molécula diana seleccionada, por ejemplo en el intervalo picomolar, simplemente con motivo de mejorar adicionalmente la idoneidad de las muteínas de lipocalina lacrimal humana en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas.

En consecuencia, un objeto de la invención es proporcionar muteínas de lipocalina lacrimal humana que tienen 30 alta afinidad de unión por una diana dada.

Este objeto se logra mediante un procedimiento para la generación de una muteína de lipocalina lacrimal humana que tiene las características de las reivindicaciones independientes.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la generación de una muteína de lipocalina lacrimal humana, en el que la muteína se une a un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana con 35 afinidad de unión detectable, que incluye:

(a) someter a una molécula de ácido nucleico que codifica una lipocalina lacrimal humana a mutagénesis en al menos 12, 14 ó 16 de los codones de cualquiera de las posiciones de la secuencia de aminoácidos 26-34, 6-58, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura nativa, en la que al menos uno de los codones que codifica restos de cisteína en las posiciones de secuencia 61 y 153 de la secuencia 40 polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura se ha mutado para codificar cualquier otro resto aminoacídico, obteniendo de este modo una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican muteínas de lipocalina lacrimal humana,

(b) expresar las una o más moléculas de ácido nucleico de muteína obtenidas en (a) en un sistema de expresión, obteniendo de este modo una o más muteínas y 45

(c) enriquecer las una o más muteínas obtenidas en la etapa (b) y que tienen afinidad de unión detectable por un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana por medio de selección y/o aislamiento, siempre que el ligando no natural de la lipocalina lacrimal humana no sea el correceptor de linfocitos T humanos CD4.

En este contexto, se observa que los inventores han descubierto sorprendentemente que la eliminación del enlace disulfuro estructural (a nivel de una genoteca de ácido nucleico sin tratamiento previo respectiva) de la lipocalina 50 lacrimal de tipo silvestre que está formado por los restos de cisteína 61 y 153 (consúltese Breustedt, y col. (2005), The 1.8-Å crystal structure of human tear lipocalin reveals an extended branched cavity with capacity for multiple ligands. J. Biol. Chem. 280, 484-493) proporciona muteínas de lipocalina lacrimal que no sólo están plegadas de forma estable, sino que además también son capaces de unirse a un ligando no natural dado con afinidad en el intervalo picomolar bajo. Sin

desear quedar ligado a teoría alguna, también se cree que la eliminación del enlace disulfuro estructural proporciona la ventaja adicional de posibilitar la generación (espontánea) o introducción deliberada de enlaces disulfuro artificiales no naturales en muteínas de la invención (véanse los Ejemplos), aumentando de este modo la estabilidad de las muteínas, por ejemplo.

El término “mutagénesis”, como se usa en el presente documento, significa que las condiciones experimentales 5 se seleccionan de modo que el aminoácido de origen natural en una posición de secuencia dada de la lipocalina lacrimal humana (entrada del banco de datos Swiss-Prot P31025) puede sustituirse por al menos un aminoácido que no está presente en esta posición específica en la secuencia polipeptídica natural respectiva. El término “mutagénesis” también incluye la modificación (adicional) de la longitud de segmentos de secuencia por deleción o inserción de uno o más aminoácidos. De este modo, dentro del ámbito de la invención está que, por ejemplo, un aminoácido en una posición de 10 secuencia seleccionada se reemplaza por una extensión de tres mutaciones aleatorias, conduciendo a una inserción de dos restos aminoacídicos en comparación con la longitud del segmento respectivo de la proteína de tipo silvestre. Dicha inserción o deleción pueden introducirse de forma independiente entre sí en cualquiera de los segmentos peptídicos que pueden someterse a mutagénesis en la invención. En una realización ejemplar de la invención, puede introducirse una inserción de varias mutaciones en el bucle AB del armazón de lipocalina seleccionado (consúltese la solicitud de Patente 15 Internacional WO 2005/19256, que se incorpora por referencia en su totalidad en el presente documento). La expresión “mutagénesis aleatoria” significa que ningún aminoácido individual predeterminado (mutación) está presente en una cierta posición de secuencia, pero que pueden incorporarse al menos dos aminoácidos con una cierta probabilidad en una posición de secuencia predefinida durante la mutagénesis.

La secuencia codificante de la lipocalina lacrimal humana (Redl, B. y col. (1992) J. Biol. Chem. 267, 20282-20 20287) se usa como punto de partida para la mutagénesis de los segmentos peptídicos seleccionados en la presente invención. Para la mutagénesis de las posiciones aminoacídicas enumeradas, el experto en la materia tiene a su disposición los diversos procedimientos convencionales establecidos para la mutagénesis dirigida (Sambrook, J. y col. (1989), mencionado anteriormente). Una técnica usada de forma habitual es la introducción de mutaciones por medio de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) usando mezclas de oligonucleótidos sintéticos, que portan una composición 25 de bases degenerada en las posiciones de secuencia deseadas. Por ejemplo, el uso del codón NNK o NNS (en el que N = adenina, guanina o citosina o timina; K = guanina o timina; S = adenina o citosina) permite la incorporación de los 20 aminoácidos más el codón de terminación ámbar durante la mutagénesis, mientras que el codón VVS limita el número de aminoácidos posiblemente incorporados a 12, puesto que excluye que los aminoácidos Cys, IIe, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val se incorporen en la posición seleccionada de la secuencia polipeptídica; el uso del codón NMS (en el que M = adenina 30 o citosina), por ejemplo, restringe el número de aminoácidos posibles a 11 en una posición de secuencia seleccionada puesto que excluye que los aminoácidos Arg, Cys, Gly, IIe, Leu, Met, Phe, Trp, Val se incorporen en una posición de secuencia seleccionada. A este respecto, se observa que los codones para otros aminoácidos (distintos de los 20 aminoácidos de origen natural normales), tales como selenocisteína o pirolisina, también pueden incorporarse en un ácido nucleico de una muteína. También es posible, como se describe por Wang, L., y col. (2001) Science 292, 498-500 o 35 Wang, L., y Schultz, P. G. (2002) Chem. Comm. 1, 1-11, usar codones “artificiales” tales como UAG que se reconocen habitualmente como codones de terminación para insertar otros aminoácidos inusuales, por ejemplo, o-metil-L-tirosina o p-aminofenilalanina.

El uso de componentes básicos de nucleótidos con especificad de pares de bases reducida, como por ejemplo inoxina, 8-oxo-2’-desoxiguanosina o 6(2-desoxi--D-ribofuranosil)-3,4-dihidro-8H-pirimidn-1,2-oxazin-7-ona (Zaccolo y col. 40 (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603), es otra opción para la introducción de mutaciones en un segmento de secuencia seleccionado.

Una posibilidad adicional es la denominada mutagénesis de triplete. Este procedimiento usa mezclas de diferentes tripletes de nucleótidos, cada uno de los cuales codifica un aminoácido, para su incorporación en la secuencia codificante (Virnekäs B, Ge L, Plückthun A, Schneider KC, Wellnhofer G, Moroney SE. 1994 Trinucleotide 45 phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutageneses. Nucleic Acids Res 22, 5600-5607).

Una posible estrategia para introducir mutaciones en las regiones seleccionadas de los polipéptidos respectivos está basada en el uso de cuatro oligonucleótidos, cada uno de los cuales procede parcialmente de uno de los segmentos de secuencia correspondientes a mutar. Cuando se sintetizan estos oligonucleótidos, un experto en la materia puede 50 emplear mezclas de componentes básicos de ácidos nucleicos para la síntesis de esos tripletes de nucleótidos que corresponden a las posiciones de aminoácidos a mutar, de modo que los codones que codifican todos los aminoácidos naturales surjan aleatoriamente, dando como resultado al final la generación de una biblioteca de péptidos de lipocalina. Por ejemplo, el primer oligonucleótido corresponde en su secuencia —aparte de las posiciones mutadas— a la cadena codificante para el segmento peptídico a mutar en la posición más N-terminal del polipéptido de lipocalina. En 55 consecuencia, el segundo oligonucleótido corresponde a la cadena no codificante para el segundo segmento de secuencia que le sigue en la secuencia polipeptídica. El tercer oligonucleótido corresponde a su vez a la cadena codificante para el tercer segmento de secuencia correspondiente. Finalmente, el cuarto oligonucleótido corresponde a la

cadena no codificante para el cuarto segmento de secuencia. Puede realizarse una reacción en cadena de la polimerasa con el primer y segundo oligonucleótidos respectivos y, de forma separada, si fuera necesario, con el tercer y cuarto oligonucleótidos respectivos.

Los productos de amplificación de ambas reacciones pueden combinarse por diversos procedimientos conocidos en un solo ácido nucleico que comprende la secuencia del primer al cuarto segmentos de secuencia, en el que se han 5 introducido mutaciones en las posiciones seleccionadas. Con este fin, ambos productos pueden someterse, por ejemplo, a una nueva reacción en cadena de la polimerasa usando oligonucleótidos flanqueantes, así como una o más moléculas de ácido nucleico mediadoras, que contribuyen a la secuencia entre el segundo y tercer segmentos de secuencia. En la elección del número y disposición dentro de la secuencia de los oligonucleótidos usados para la mutagénesis, el experto en la materia tiene numerosas alternativas a su disposición. 10

Las moléculas de ácido nucleico definidas anteriormente pueden conectarse por ligación con las secuencias 5’ y 3’ ausentes de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de lipocalina y/o el vector, y pueden clonarse en un organismo huésped conocido. Están disponibles una multitud de procedimientos establecidos para ligación y clonación (Sambrook, J. y col. (1989), mencionado anteriormente). Por ejemplo, las secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción presentes también en la secuencia del vector de clonación pueden introducirse por ingeniería genética en la 15 secuencia de los oligonucleótidos sintéticos. De este modo, después de la amplificación del producto de PCR y de la escisión enzimática respectivas, el fragmento resultante pude clonarse fácilmente usando la secuencias de reconocimiento correspondientes.

También pueden someterse segmentos de secuencia más largos dentro del gen que codifica la proteína seleccionada para mutagénesis a mutagénesis aleatoria mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, mediante el 20 uso de la reacción en cadena de la polimerasa en condiciones de tasa de errores aumentada, por mutagénesis química o usando cepas bacterianas mutagénicas. Dichos procedimientos pueden usarse también para una optimización adicional de la afinidad o especificad de diana de una muteína de lipocalina. Las mutaciones que se producen posiblemente fuera de los segmentos de mutagénesis experimental con frecuencia se toleran o pueden incluso demostrar ser ventajosas, por ejemplo si contribuyen a una eficacia de plegamiento o estabilidad de plegamiento mejoradas de la muteína de lipocalina. 25

La expresión “lipocalina lacrimal humana”, como se usa en el presente documento, se refiere a lipocalina lacrimal humana madura con el número de acceso del banco de datos SWISS-PROT P31025.

La expresión “ligando no natural” se refiere a un compuesto que no se une a la lipocalina lacrimal humana madura nativa en condiciones fisiológicas. La diana (ligando) puede ser cualquier compuesto químico en forma libre o conjugada que muestre las características de un hapteno inmunológico, una hormona tal como hormonas esteroideas o 30 cualquier biopolímero o fragmento de las mismas, por ejemplo, una proteína o dominio proteico, un péptido, un oligodesoxinucleótido, un ácido nucleico, un oligo- o polisacárido o conjugados de los mismos, un lípido u otra macromolécula.

En la invención, el procedimiento para la generación de una muteína de lipocalina lacrimal humana incluye mutar al menos 12, 14, 15, 16 ó 17 de los codones de cualquiera de las posiciones de la secuencia de aminoácidos 26-34, 56-35 58, 80, 83 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura. En otra realización, los 18 codones de las posiciones de la secuencia de aminoácidos 26, 27, 28, 29, 30, 31 32, 33, 34, 56, 57, 58, 80, 83, 104, 105, 106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura están mutados.

En una realización adicional de la invención, los procedimientos de acuerdo con la invención incluyen la mutación de ambos codones que codifican las cisteínas en las posiciones 61 y 153 en la secuencia polipeptídica lineal de la 40 lipocalina lacrimal humana madura. En una realización, la posición 61 se muta para codificar un resto de alanina, fenilalanina, lisina, arginina, treonina, asparagina, tirosina, metionina, serina, prolina o triptófano, por nombrar sólo algunas posibilidades. En realizaciones en las que la posición 153 está mutada, puede introducirse un aminoácido tal como serina o alanina en la posición 153.

En otra realización de la invención como se describe en el presente documento, los codones que codifican las 45 posiciones de la secuencia de aminoácidos 111 y/o 114 de la secuencia polipéptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura se mutan para codificar, por ejemplo, una arginina en la posición 111 y un triptófano en la posición 114.

Otra realización de los procedimientos de la invención implica la mutagénesis del codón que codifica la cisteína en la posición 101 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura, de modo que este codón codifica cualquier otro aminoácido. En una realización, el codón mutado que codifica la posición 101 codifica una serina. 50 En consecuencia, en algunas realizaciones, o dos o los tres codones de cisteína en las posiciones 61, 101 y 153 se reemplazan por un codón de otro aminoácido.

De acuerdo con el procedimiento de la invención, se obtiene una muteína a partir de un ácido nucleico que codifica lipocalina lacrimal humana. Dicho ácido nucleico se somete a mutagénesis y se introduce en un organismo huésped bacteriano o eucariota adecuado por medio de tecnología de ADN recombinante. La obtención de una genoteca 55

de ácido nucleico de lipocalina lacrimal puede llevarse a cabo usando cualquier técnica adecuada que se conozca en la materia para generar muteínas de lipocalina con propiedades de tipo anticuerpo, es decir, muteínas que tienen afinidad hacia una diana dada. Se describen en detalle ejemplos de dichos procedimientos combinatorios en las solicitudes de patente internacional WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256 o WO 2006/56464, por ejemplo. El contenido de cada una de estas solicitudes de 5 patente se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad. Después de la expresión de las secuencias de ácido nucleico que se sometieron a mutagénesis en un huésped apropiado, los clones que portan la información genética para la pluralidad de muteínas de lipocalina respectivas, que se unen a una diana dada, pueden seleccionarse de la biblioteca obtenida. Pueden emplearse técnicas bien conocidas para la selección de estos clones, tales como presentación en fagos (revisada por Kay, B.K. y col. (1996) mencionado anteriormente; Lowman, H.B. (1997) mencionado 10 anteriormente o Rodi, D.J. y Makowski, L. (1999) mencionado anteriormente), exploración de colonias (revisada por Pini, A. y col (2002). Comb. Chem. Hight Throughput Screen. 5, 503-510), presentación en ribosomas (revisada por Amstutz, P. y col (2001). Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405) o presentación en ARNm como se indica por Wilson, D.S. y col (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755 o los procedimientos descritos específicamente en los documentos WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 15 2005/019256 o WO 2006/56464.

De acuerdo con esta divulgación, la etapa (c) comprende adicionalmente en otra realización de los procedimientos anteriores:

(i) proporcionar como un ligando dado un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un compuesto químico en forma libre o conjugada que muestra características de un hapteno inmunológico, un péptido, una proteína u otra 20 macromolécula, tal como un polisacárido, una molécula de ácido nucleico (ADN o ARN, por ejemplo) o una partícula de virus completa o viroide, por ejemplo,

(ii) poner en contacto la pluralidad de muteínas con dicho ligando para permitir la formación de complejos entre dicho ligando y muteínas que tienen afinidad de unión por dicho ligando, y

(iii) eliminar las muteínas que no tienen afinidad de unión o que no tienen una afinidad de unión sustancial. 25

En algunas realizaciones de la invención, el ligando puede ser una proteína o un fragmento de la misma en el que se excluyen las muteínas que se unen al correceptor de linfocitos T humanos CD4.

En una realización de los procedimientos de la invención, la selección de la etapa (c) se lleva a cabo en condiciones competitivas. La expresión condiciones competitivas, como se usa en el presente documento, significa que la selección de muteínas abarca al menos una etapa en la que las muteínas y el ligando no natural dado de lipocalina 30 lacrimal humana (diana) se ponen en contacto en presencia de un ligando adicional, que compite con la unión de las muteínas a la diana. Este ligando adicional puede ser un ligando fisiológico de la diana, un exceso de la propia diana o cualquier otro ligando no fisiológico de la diana que se une al menos a un epítopo que solapa con el epítopo reconocido por las muteínas de la invención e interfiere por lo tanto con la unión a diana de la muteínas. Como alternativa, el ligando adicional compite con la unión de las muteínas formando un complejo de un epítopo distinto del sitio de unión de las 35 muteínas con la diana por efectos alostéricos.

Se proporciona una realización de la técnica de presentación en fagos (revisada por Kay, B.K. y col. (1996), mencionada anteriormente, Lowman, H. B. (1997) mencionada anteriormente o Rodi, D. J y Makowski, L. (1999), mencionada anteriormente) usando el fago M13 atemperado como un ejemplo de procedimiento de selección que puede emplearse en la presente invención. Otra realización de la tecnología de presentación en fagos que puede usarse para la 40 selección de muteínas de la invención es la tecnología de fagos con hiperfago, como se describe por Broders y col (Broders y col (2003) “Hyperphage. Improving antibody presentation in phage display”. Methods Mol. Biol. 205:295-302). También puede emplearse otro fago atemperado tal como f1 o fago lítico tal como T7. Para el procedimiento de selección ejemplar, se producen fagémidos M13 que permiten la expresión de la secuencia de ácido nucleico de lipocalina mutada como una proteína de fusión con una secuencia señal en el extremo N-terminal, preferentemente la secuencia señal 45 OmpA, y con la proteína de cápside pIII del fago M13 o fragmentos de la misma, capaz de incorporarse en la cápside del fago en el extremo C-terminal. El fragmento C-terminal pIII de la proteína de la cápside del fago que comprende los aminoácidos 217 a 406 de la secuencia de tipo silvestre se usa preferentemente para producir las proteínas de fusión. Se prefiere especialmente en una realización un fragmento C-terminal de pIII, en el que el resto de cisteína en la posición 201 está ausente o se reemplaza por otro aminoácido. 50

En consecuencia, una realización adicional de los procedimientos de la invención implica fusionar operativamente un ácido nucleico que codifica la pluralidad de muteínas de la lipocalina lacrimal humana y que se obtiene como resultado de la mutagénesis en el extremo 3’ con un gen que codifica la proteína de cubierta pIII o un bacteriófago filamentoso de M13 o un fragmento de esta proteína de cubierta, para seleccionar al menos una muteína para la unión de un ligando dado. 55

La proteína de fusión puede comprender componentes adicionales tales como una etiqueta de afinidad, que

permite la inmovilización, detección y/o purificación de la proteína de fusión o sus partes. Adicionalmente, puede localizarse un codón de terminación entre las regiones de la secuencia que codifican la lipocalina o sus muteínas y el gen de la cápside del fago o fragmentos del mismo, traduciéndose el codón de terminación, preferentemente un codón de terminación ámbar, al menos parcialmente en un aminoácido durante la traducción en una cadena supresora adecuada.

Por ejemplo, el vector fasmídico pTLPC27, también denominado ahora pTlc27 que se describe en el presente 5 documento puede usarse para la preparación de una biblioteca de fagémidos que codifican muteínas de lipocalina lacrimal humana. Las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican las muteínas de lipocalina lacrimal se insertan en el vector usando los dos sitios de restricción BstXI. Después de la ligación, una cepa huésped adecuada tal como E. coli XL1-Blue se transforma con la mezcla de ácido nucleico resultante para producir un gran número de clones independientes. Puede generarse un vector respectivo para la preparación de una biblioteca de hiperfagémidos, si se 10 desea.

La biblioteca resultante se superinfecta posteriormente en cultivo líquido con un hiperfago o fago auxiliar M13 para producir fagémidos funcionales. El fagémido recombinante presenta la muteína de lipocalina en su superficie como una fusión con la proteína de cubierta pIII o un fragmento de la misma, mientras que la secuencia señal N-terminal de la proteína de fusión normalmente se elimina por escisión. Por otro lado, también porta una o más copias de la proteína de la 15 cápside nativa plll suministrada por el fago auxiliar y es capaz por lo tanto de infectar a un receptor, en general una cepa bacteriana que porta un plásmido F o F’. En caso de presentación en hiperfagos, los hiperfagémidos presentan las muteínas de lipocalina en su superficie como una fusión con la proteína de cubierta infecciosa pIII pero sin proteína de la cápside nativa. Durante o después de la infección con hiperfago o fago auxiliar, la expresión génica de la proteína de fusión entre la muteína de lipocalina y la proteína de la cápside pIII puede inducirse, por ejemplo, mediante la adición de 20 anhidrotetraciclina. Las condiciones de inducción se seleccionan de modo que una fracción sustancial de los fagémidos obtenidos presente al menos una muteína de lipocalina en su superficie. En el caso de presentación en hiperfagos, las condiciones de inducción dan como resultado una población de hiperfagémidos que portan entre tres y cinco proteínas de fusión que consisten en la muteína de lipocalina y la proteína de la cápside pIII. Se conocen diversos procedimientos para aislar los fagémidos, tales como precipitación con polietilenglicol. Típicamente se produce aislamiento después de un 25 periodo de incubación de 6-8 horas.

Los fásmidos aislados pueden someterse después a selección por incubación con la diana deseada, en la que la diana está presente en una forma que permite al menos una inmovilización temporal de los fagémidos que portan muteínas con la actividad de unión deseada, como proteínas de fusión en su cubierta. Entre las diversas realizaciones conocidas para los expertos en la materia, la diana puede, por ejemplo, conjugarse con una proteína de vehículo tal como 30 albúmina de suero, y unirse mediante esta proteína de vehículo a una superficie de unión a proteína, por ejemplo, poliestireno. Pueden usarse preferentemente placas de microtitulación adecuadas para técnicas de ELISA o las denominadas “inmuno-sticks” para una inmovilización de este tipo de la diana. Como alternativa, pueden usarse conjugados de la diana con otros grupos de unión, tales como biotina. La diana puede inmovilizarse después en una superficie que se une selectivamente a este grupo, por ejemplo, placas de microtitulación o partículas paramagnéticas 35 revestidas con estreptavidina, neutravidina o avidina. Si la diana se fusiona con una porción Fc de una inmunoglobulina, la inmovilización también puede conseguirse con superficies, por ejemplo, placas de microtitulación o partículas paramagnéticas, que están revestidas con proteína A o proteína G.

Los sitios de unión a fagémido inespecíficos presentes en las superficies pueden saturarse con soluciones de bloqueo como se conocen para los procedimientos de ELISA. Los fagémidos típicamente se ponen después en contacto 40 con la diana inmovilizada en la superficie en presencia de un tampón fisiológico. Los fagémidos no unidos se eliminan por múltiples lavados. Las partículas de fagémido que permanecen en la superficie se eluyen posteriormente. Para la elución, son posibles varios procedimientos. Por ejemplo, los fagémidos pueden eluirse por adición de proteasas o en presencia de ácidos, bases, detergentes o sales caotrópicas, o en condiciones moderadamente desnaturalizantes. Un procedimiento preferido es la elución usando tampones de pH 2,2, en los que el eluido se neutraliza posteriormente. Como alternativa, 45 puede añadirse una solución de la diana libre para competir con la diana inmovilizada por la unión a los fagémidos, o pueden eluirse los fagémidos específicos de diana por competición con inmunoglobulinas o proteínas de ligando natural que se unen específicamente a la diana de interés.

Posteriormente, se infecta a células de E. coli con los fagémidos eluidos. Como alternativa, los ácidos nucleicos pueden extraerse de los fagémidos eluidos y usarse para análisis de secuencia, amplificación o transformación de células 50 de otro modo. A partir de los clones de E. coli obtenidos de este modo, se producen de nuevo fagémidos o hiperfagémidos de nueva síntesis por superinfección con hiperfagos o fagos auxiliares M13 de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, y los fagémidos amplificados de este modo se someten una vez más a una selección sobre la diana inmovilizada. Con frecuencia son necesarios múltiples ciclos de selección para obtener los fagémidos con las muteínas de la invención en una forma suficientemente enriquecida. El número de ciclos de selección se elige preferentemente de 55 modo que en el análisis funcional posterior al menos el 0,1% de los clones estudiados produzcan muteínas con una afinidad detectable por la diana dada. Dependiendo del tamaño, es decir, la complejidad de la biblioteca empleada, típicamente se requieren de 2 a 8 ciclos con este fin.

Para el análisis funcional de las muteínas seleccionadas, se infecta una cepa de E. coli con los fagémidos obtenidos a partir de los ciclos de selección y se aísla el ADN de fásmido bicatenario correspondiente. A partir de este ADN de fásmido, o también del ADN monocatenario extraído de los fagémidos, las secuencias de ácido nucleico de las muteínas seleccionadas de la invención pueden determinarse por los procedimientos conocidos en la técnica y puede deducirse la secuencia de aminoácidos a partir de las mismas. La región mutada o la secuencia de la muteína de 5 lipocalina lacrimal completa puede subclonarse en otro vector de expresión y expresarse en un organismo huésped adecuado. Por ejemplo, el vector pTLPC26, también denominado ahora pTlc26, puede usarse para la expresión en cepas de E. coli tales como E. coli TG1. Las muteínas de lipocalina lacrimal producidas de este modo pueden purificarse por diversos procedimientos bioquímicos. Las muteínas de lipocalina lacrimal producidas, por ejemplo, con pTlc26, portan el péptido de afinidad Strep-tag II (Schmidt y col., mencionada anteriormente) en sus extremos C-terminales y, por lo tanto, 10 pueden purificarse preferentemente mediante cromatografía de afinidad de estreptavidina.

La selección también puede llevarse a cabo por medio de otros procedimientos. El experto en la materia conoce muchas realizaciones correspondientes o éstas se describen en la bibliografía. Además, puede aplicarse una combinación de procedimientos. Por ejemplo, los clones seleccionados o al menos enriquecidos por “presentación en fagos” pueden someterse además a “exploración de colonias”. Este procedimiento tiene la ventaja de que pueden aislarse directamente 15 clones individuales con respecto a la producción de una muteína de lipocalina lacrimal con afinidad de unión detectable por un diana.

Además del uso de E. coli como organismo huésped en la técnica de “presentación en fagos” o del procedimiento de “exploración de colonias”, pueden usarse con este fin otras cepas bacterianas, de levadura o también células de insectos o células de mamíferos. Además de la selección de una muteína de lipocalina lacrimal a partir de una 20 biblioteca aleatoria como se ha descrito anteriormente, también pueden aplicarse procedimientos evolutivos incluyendo mutagénesis limitada para optimizar una muteína que ya posea algo de actividad de unión por la diana con respecto a la afinidad o especificidad por la diana después de ciclos de exploración repetidos.

Una vez que se ha seleccionado una muteína con afinidad hacia una diana dada, es posible además someter a dicha muteína a otra mutagénesis para seleccionar posteriormente variantes de afinidad aún mayor o variantes con 25 propiedades mejoradas tales como mayor termoestabilidad, mayor estabilidad en suero, estabilidad termodinámica, mejor solubilidad, mejor comportamiento monomérico, mayor resistencia frente a la desnaturalización térmica, desnaturalización química, proteolisis o detergentes, etc. Esta mutagénesis adicional, que en caso de tener como objetivo una mayor afinidad puede considerarse como “maduración de afinidad” in vitro, puede conseguirse por mutación específica basándose en el diseño racional o una mutación aleatoria. Otro enfoque posible para obtener una afinidad mayor o 30 propiedades mejoradas es el uso de PCR propensa a errores, que da como resultado mutaciones puntuales a lo largo de un intervalo seleccionado de posiciones de secuencia de la muteína de lipocalina. La PCR propensa a errores puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier protocolo conocido tal como el descrito por Zaccolo y col. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603. Otros procedimientos de mutagénesis aleatoria que son adecuados para dichos fines incluyen mutagénesis de inserción/deleción aleatoria (RID) como se describe por Murakami H., y col (2002) Nat. Biotechnol 20, 76-81 o 35 recombinación aleatoria no homóloga (NRR) como se describe por Bittker, J. A. y col (2002) Nat. Biotechnol 20,1024-1029. Si se desea, también puede llevarse a cabo una maduración de afinidad de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 00/75308 o Schlehuber, S. y col., (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120, en el que se obtuvieron muteínas de la proteína de unión a bilina que tenían alta afinidad hacia digoxigenina.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una muteína de lipocalina lacrimal humana que tiene 40 una afinidad de unión detectable hacia un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana, que puede obtenerse o se obtiene mediante los procedimientos de la invención anteriormente detallados.

La muteína de lipocalina lacrimal humana obtenida de acuerdo con los procedimientos anteriores incluye la sustitución de al menos uno o ambos restos de cisteína que aparecen en cada una de las posiciones de secuencia 61 y 153 por otro aminoácido, y la mutación de al menos un resto aminoacídico en una cualquiera de las posiciones de 45 secuencia 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura. Las posiciones 24-36 están comprendidas en el bucle AB, las posiciones 53-66 están comprendidas en el bucle CD, las posiciones 69-77 están comprendidas en el bucle EF y las posiciones 103-110 están comprendidas en el bucle GH en el sitio de unión en el extremo abierto de la estructura de barril- de la lipocalina lacrimal. La definición de estos cuatro bucles se usa en el presente documento de acuerdo con Flower (Flower, D. R. (1996), mencionada anteriormente y 50 Flower, D.R. y col (2000), mencionada anteriormente). Habitualmente, una muteína de este tipo comprende al menos 12, 14, 15, 16, 17 ó 18 restos aminoacídicos mutados en las posiciones de secuencia 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de lipocalina lacrimal humana madura. En una realización específica, la muteína comprende las sustituciones de aminoácidos Cys61  Ala, Phe, Lys, Arg, Thr, Asn, Tyr, Met, Ser, Pro o Trp y Cys 153  Ser o Ala. Dicha sustitución ha demostrado ser útil para prevenir la formación del puente disulfuro de origen natural que 55 une la Cys 61 y la Cys 153 y facilitar de este modo la manipulación de la muteína.

En otra realización más, la muteína comprende al menos una sustitución de aminoácidos adicional seleccionada

de Arg 111  Pro y Lys 114  Trp. Una muteína de la invención puede comprender adicionalmente la cisteína en la posición 101 de la secuencia de la lipocalina lacrimal humana madura nativa sustituida por otro aminoácido. Esta sustitución puede, por ejemplo, ser la mutación Cys 101  Ser o Cys 101  Thr.

El ligando no natural al que se une la muteína puede ser una proteína o un fragmento de la misma a condición de que el correceptor de linfocitos T humanos CD4 se excluya como diana no natural. 5

Las muteínas de lipocalina de la invención pueden comprender la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre (natural) fuera de las posiciones de la secuencia de aminoácidos mutadas. Por otro lado, las muteínas de lipocalina desveladas en el presente documento también pueden contener mutaciones de aminoácidos fuera de las posiciones de secuencia sometidas a mutagénesis, siempre que esas mutaciones no interfieran con la actividad de unión y el plegamiento de la muteína. Dichas mutaciones pueden lograrse muy fácilmente a nivel de ADN usando procedimientos 10 convencionales establecidos (Sambrook, J. y col (1989) Molecular Clonning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Son posibles alteraciones de la secuencia de aminoácidos inserciones o deleciones, así como sustituciones de aminoácidos. Dichas sustituciones pueden ser conservativas, es decir, un resto aminoacídico se reemplaza con un resto aminoacídico químicamente similar. Son ejemplos de sustituciones conservativas los reemplazos entre los miembros de los grupos siguientes: 1) alanina, serina y treonina; 2) ácido aspártico y ácido 15 glutámico; 3) asparagina y glutamina; 4) arginina y lisina; 5) isoleucina, leucina, metionina y valina; y 6) fenilalanina, tirosina y triptófano. Por otro lado, también es posible introducir alteraciones no conservativas en la secuencia de aminoácidos. Además, en lugar de reemplazar restos de un solo aminoácido, también es posible insertar o delecionar uno o más aminoácidos continuos de la estructura primaria de la lipocalina lacrimal siempre que estas deleciones o inserciones den como resultado una muteína plegada estable/funcional (véase por ejemplo, la sección experimental en la que se generan 20 muteínas con extremos N- y C-terminales truncados).

Dichas modificaciones de la secuencia de aminoácidos incluyen la mutagénesis dirigida de posiciones de de un solo aminoácido para simplificar la subclonación del gen de lipocalina mutado o sus partes mediante la incorporación de sitios de escisión para ciertas enzimas de restricción. Además, estas mutaciones también pueden incorporarse para mejorar adicionalmente la afinidad de una muteína de lipocalina por una diana dada. Adicionalmente, pueden introducirse 25 mutaciones para modular ciertas características de la muteína tales como mejorar la estabilidad de plegamiento, estabilidad en suero, resistencia proteica o solubilidad en agua o para reducir la tendencia a la agregación si fuera necesario. Por ejemplo, los restos de cisteína de origen natural pueden mutarse a otros aminoácidos para evitar la formación de puentes disulfuro. Sin embargo, también es posible mutar deliberadamente otra posición de la secuencia de aminoácidos a cisteína para introducir nuevos grupos reactivos, por ejemplo, para la conjugación con otros compuestos, 30 tales como polietilenglicol (PEG), hidroxietil almidón (HES), biotina, péptidos o proteínas, o para la formación de enlaces disulfuro de origen no natural. Las posibilidades ejemplares de dicha mutación para introducir un resto de cisteína en la secuencia de aminoácidos de una muteína de lipocalina lacrimal humana incluyen las sustituciones Thr 40  Cys, Glu 73  Cys, Arg 90  Cys, Asp 95  Cys y Glu 131  Cys. El resto de tiol generado en el lateral de cualquiera de las posiciones de aminoácidos 40, 73, 90, 95 y/o 131 puede usarse para PEGilar o HESilar la muteína, por ejemplo, para 35 aumentar la semivida en suero de una muteína de lipocalina lacrimal respectiva. La muteína S236.1-A22 en la que se introduce una cisteína en cualquiera de estas posiciones de secuencia (véase el Ejemplo 46) es un ejemplo ilustrativo de dichas muteínas de la invención.

La presente invención también abarca muteínas como se han definido anteriormente, en las que los primeros cuatro restos aminoacídicos N-terminales de la secuencia de la lipocalina lacrimal humana madura (His-His-Leu-Leu; 40 posiciones 1-4) y/o los dos últimos restos aminoacídicos C-terminales (Ser-Asp; posiciones 157-158) de la secuencia de la lipocalina lacrimal humana madura se han delecionado (consúltense también los Ejemplos y las Listas de Secuencias adjuntas).

Las muteínas de lipocalina de la invención son capaces de unirse a la diana deseada con afinidad detectable, es decir, con una constante de disociación de al menos 200 nM. Actualmente se prefieren en algunas realizaciones muteínas 45 de lipocalina, que se unen a la diana deseada con una constante de disociación para una diana dada de al menos 100, 20, 1 nM o incluso menos. La afinidad de unión de una muteína a la diana deseada puede medirse por una multitud de procedimientos tales como valoración de la fluorescencia, ELISA de competición o resonancia de plasmón superficial (BIAcore).

Resulta fácilmente evidente para el experto que la formación de complejos depende de muchos factores tales 50 como la concentración de los compañeros de unión, la presencia de competidores, la fuerza iónica del sistema de tampón, etc. La selección y enriquecimiento generalmente se realizan en condiciones que permiten el aislamiento de muteínas de lipocalina que tienen, en complejo con la diana deseada, una constante de disociación de al menos 200 nM. Sin embargo, las etapas de lavado y elución pueden llevarse a cabo en rigurosidad variable. También es posible una selección con respecto a las características cinéticas. Por ejemplo, la selección puede realizarse en condiciones que favorecen la 55 formación de complejos de la diana con muteínas que muestran una disociación lenta de la diana o, en otras palabras, una velocidad koff baja. Como alternativa, la selección puede realizarse en condiciones que favorecen la formación rápida

del complejo entre la muteína y la diana o, en otras palabras, una velocidad kon alta. Como una alternativa ilustrativa adicional, la exploración puede realizarse en condiciones que seleccionen a favor de una termoestabilidad mejorada de las muteínas (en comparación con la lipocalina lacrimal de tipo silvestre o una muteína que ya tiene afinidad hacia una diana preseleccionada).

Una muteína de lipocalina lacrimal de la invención existe típicamente como una proteína monomérica. Sin 5 embargo, también es posible que una muteína de lipocalina de la invención sea capaz de dimerizarse u oligomerizarse espontáneamente. Aunque el uso de muteínas de lipocalina que forman monómeros estables puede preferirse para algunas aplicaciones, por ejemplo, debido a una difusión más rápida y una mejor penetración tisular, el uso de muteínas de lipocalina que forman espontáneamente homodímeros o multímeros estables puede ser ventajoso en otros casos, puesto que dichos multímeros pueden proporcionar una afinidad y/o avidez aumentada (adicionalmente) hacia una diana 10 dada. Además, las formas oligoméricas de la muteína de lipocalina pueden tener velocidades de disociación más lentas o semividas en suero prolongadas. Si se desea la dimerización o multimerización de muteínas que forman monómeros estables, ésta puede conseguirse, por ejemplo, fusionando los dominios de oligomerización respectivos tales como dominios jun-fos o cremalleras de leucina con muteínas de la invención o mediante el uso de “Duocalinas” (véase también a continuación). 15

Una muteína de lipocalina lacrimal de la invención puede usarse para la formación de complejos con una diana dada. La diana puede ser una diana/ligando no natural. La diana (ligando) puede ser cualquier compuesto químico en forma libre o conjugada que muestra características de un hapteno inmunológico, una hormona tal como hormonas esteroideas o cualquier biopolímero o fragmento del mismo, por ejemplo, una proteína o dominio de proteína, un péptido, un oligodesoxinucleótido, un ácido nucleico, un oligo- o polisacárido o conjugados de los mismos. En una realización de la 20 invención, la diana es una proteína a condición de que se excluya el correceptor de linfocitos T humanos CD4. La proteína puede ser cualquier proteína soluble globular o una proteína receptora, por ejemplo, una proteína transmembrana implicada en la señalización celular, un componente del sistema inmune tal como una molécula del MHC o receptor de superficie celular que sea indicativo de una enfermedad específica. La muteína también puede ser capaz de unirse solamente a fragmentos de una proteína. Por ejemplo, una muteína puede unirse a un dominio de un receptor de 25 superficie celular, cuando es parte del receptor anclado en la membrana celular, así como al mismo dominio en solución, si este dominio puede producirse también como una proteína soluble. Sin embargo, la invención no se limita de ningún modo a muteínas que se unen solamente a tales dianas macromoleculares. Pero también es posible obtener muteínas de lipocalina lacrimal por medio de mutagénesis que muestren una afinidad de unión específica hacia ligandos de bajo (menor) peso molecular tales como biotina, fluoresceína o digoxigenina. 30

En una realización de la invención, el ligando que está unido por la muteína de lipocalina lacrimal es una proteína o fragmento de la misma seleccionada del grupo de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 (VEGF-R2) y cadena alfa del receptor de interleucina 4 (receptor alfa de IL-4) o fragmentos de los mismos. También se incluyen como ligandos una región extracelular o un dominio de VEGF-R2 o receptor alfa de IL-4. Estos ligandos son típicamente de origen de mamífero. En una realización, estos ligandos son de 35 origen humano, pero también pueden ser de origen de ratón, rata, porcino, equino, canino, felino o bovino o mono cynomolgus, por nombrar sólo algunos ejemplos ilustrativos.

Puede seleccionarse VEGF humano del grupo que consiste en VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C y VEGF-D y puede tener las secuencias de aminoácidos expuestas en los Nº de Acceso del Banco de Datos SWISS PROT P15692, P49765, P49767 y 043915 (SEC ID Nº: 22-25) o de fragmentos de las mismas. Uno de tales fragmentos ejemplares consiste en los 40 aminoácidos 8 a 109 de VEGF-A. El receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF-R2) puede tener la secuencia de aminoácidos del Nº de Acceso del Banco de Datos SWISS PROT P35968 (SEC ID Nº: 21) o de fragmentos de la misma. Los ejemplos ilustrativos de dichos fragmentos incluyen los dominios de tipo C2 similares a Ig extracelulares 1 a 7 de VEGF-R2, que comprenden los aminoácidos 46 a 110, 141 a 207, 224 a 320, 328 a 414, 421 a 548, 551 a 660 y 667 a 753, respectivamente. La cadena alfa del receptor de interleucina 4 humano puede tener la 45 secuencia de aminoácidos del Nº de Acceso del Banco de Datos SWISS PROT P24394 (SEC ID Nº: 20) o de fragmentos de la misma. Un ejemplo ilustrativo de un fragmento de la cadena alfa del receptor de interleucina 4 humano incluye los aminoácidos 26 a 232 del receptor alfa de IL-4.

En general, el término “fragmento”, como se usa en el presente documento con respecto a ligandos proteicos de las muteínas de lipocalina lacrimal de la invención, se refiere a ligandos de proteicos o peptídicos acortados en el extremo 50 N-terminal y/o C-terminal, que conservan la capacidad del ligando de longitud completa para ser reconocidos por y/o unirse a una muteína de acuerdo con la invención.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a una muteína de lipocalina lacrimal humana que comprende al menos un resto aminoacídico mutado en dos o más cualesquiera de las posiciones de secuencia 24-36, 53-66, 79-84 y 103-110 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura y se une al receptor alfa 55 de IL-4, VEGF-R2 o VEGF.

Las muteínas de lipocalina lacrimal humana que se unen al receptor alfa de IL-4 pueden actuar como

antagonistas de IL-4 y/o antagonistas de IL-13. En una realización, las muteínas de lipocalina lacrimal humana actúan como antagonistas de IL-4 y/o IL-13 humanas. En otra realización, la muteína reacciona de forma cruzada con los ligandos de mono cynomolgus tales como IL-4 y/o IL-13, y como tal actúa como un antagonista del receptor alfa de IL-4 de mono cynomolgus.

Una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención que se une al receptor alfa de IL-4 puede 5 comprender con respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana madura al menos dos sustituciones de aminoácidos de restos aminoacídicos nativos por restos de cisteína en cualquiera de las posiciones 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 y 108 de la lipocalina lacrimal humana madura nativa. Generalmente, tal muteína se une a una región extracelular o un dominio del receptor alfa de IL-4 con una KD de 200 nM o menos, 100 nM o menos, 20 nM o menos o 1 nM o incluso menos con una KD en el intervalo picomolar. De este modo, la invención también abarca muteínas 10 de lipocalina lacrimal que se unen al receptor de IL-4 con una KD de 900 pM o menos, 600 pM o menos, 500 pM o menos, 250 pM, 100 pM o menos, 60 pM o menos o 40 pM o menos. Los expertos en la materia conocen procedimientos adecuados para determinar los valores de KD de un complejo de muteína-ligando, e incluyen valoración de la fluorescencia, ELISA de competición, procedimientos calorimétricos, tales como calorimetría de valoración isotérmica (ITC) y resonancia de plasmón superficial. Se detallan a continuación ejemplos para dichos procedimientos (véase, por 15 ejemplo, los Ejemplos 6, 8, 14, 16, 22, 24 y 27).

En este contexto también se observa que la formación de complejos entre la muteína respectiva y su ligando está influenciada por muchos factores diferentes tales como las concentraciones de los compañeros de unión respectivos, la presencia de competidores, el pH y la fuerza iónica del sistema de tampón usado, y el procedimiento experimental usado para la determinación de la constante de disociación KD (por ejemplo, valoración de la fluorescencia, ELISA de 20 competición o resonancia de plasmón superficial, por nombrar sólo algunos) o incluso el algoritmo matemático que se usa para la evaluación de los datos experimentales.

Por lo tanto, también está claro para el experto que los valores de KD (constante de disociación del complejo formado entre la muteína respectiva y su ligando) dados en el presente documento pueden variar dentro de un cierto intervalo experimental, dependiendo del procedimiento y preparación experimental que se use para determinar la afinidad 25 de una muteína de lipocalina particular para un ligando dado. Esto significa que puede haber una ligera desviación en los valores de KD medidos o un intervalo de tolerancia dependiendo, por ejemplo, de si el valor de KD se determinó por resonancia de plasmón superficial (Biacore) o por ELISA de competición.

En una realización específica de la invención dicha muteína comprende con respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana madura al menos 6, 8, 10, 12, 14 ó 16 sustituciones de aminoácidos 30 seleccionadas del grupo que consiste en Arg 26  Ser, Pro; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr, His; Leu 33 Tyr; Glu 34  Gly, Ser, Ala, Asp, Lys, Asn, Thr, Arg; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Ile, Ala, Arg, Val, Thr, Asn, Lys, Tyr, Leu, Met; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu  105 Cys; His 106  Pro; y Lys 108  Gln.

Adicionalmente, dicha muteína puede comprender adicionalmente al menos una sustitución de aminoácido 35 seleccionada del grupo que consiste en Met 39  Val; Thr 42  Met, Ala; Thr 43  Ile, Pro, Ala; Glu 45  Lys, Gly; Asn 48  Asp, His, Ser, Thr; Val 53  Leu, Phe, Ile, Ala, Gly, Ser; Thr 54  Ala, Leu; Met 55  Leu, Ala, Ile, Val, Phe, Gly, Thr, Tyr; Glu 63  Lys, Gln, Ala, Gly, Arg; Val 64  Gly, Tyr, Met, Ser, Ala, Lys, Arg, Leu, Asn, His, Thr, Ile; Ala 66  Ile, Leu, Val, Thr, Met; Glu 69  Lys, Gly; Lys 70  Arg, Gln, Glu; Thr 78  Ala; Ile 89  Val; Asp 95  Asn, Ala, Gly; y Tyr 100  His. 40

En una realización, la muteína de lipocalina lacrimal humana que se une al receptor alfa de IL-4 comprende las sustituciones de aminoácidos: Arg 26  Ser, Glu 27  Arg, Phe 28  Cys, Glu 30  Arg; Met 31  Ala, Leu  33 Tyr, Leu 56  Gin, Ile 57  Arg, Asp 80  Ser, Lys 83  Arg, Glu 104  Leu, Leu 105  Cys, His 106  Pro y Lys 108  Gln.

En otra realización, la muteína de lipocalina lacrimal humana que se une al receptor alfa de IL-4 comprende uno 45 de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:

(1) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 34  Gly; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Ile; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln;

(2) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 34 50  Lys; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Asn; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln;

(3) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys, Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Arg; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln; 55

(4) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 34  Ser; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln;

(5) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  His; Leu 33  Tyr; Glu 34  Ser; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Ala; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; 5 His 106  Pro; Lys 108  Gln;

(6) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 34  Asp; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Lys; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln; y

(7) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  0 Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 10 34  Gly; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln.

La muteína de lipocalina lacrimal humana que se une al receptor alfa de IL-4 puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 2-8 o un fragmento o variante de las mismas. En una realización, la muteína de acuerdo con la invención comprende, consiste 15 esencialmente en o consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 5 ó 6 o un fragmento o variante de las mismas.

El término “fragmento”, como se usa en la presente invención en relación con las muteínas de la invención se refiere a proteínas o péptidos derivados de lipocalina lacrimal humana madura de longitud completa que se han acortado en el extremo N-terminal y/o C-terminal, es decir, que carecen de al menos uno de los aminoácidos N- terminales y/o C-20 terminales. Dichos fragmentos comprenden preferentemente al menos 10, más preferentemente 20, más preferentemente 30 o más aminoácidos consecutivos de la secuencia primaria de la lipocalina lacrimal humana madura y son detectables habitualmente en un inmunoensayo de lipocalina lacrimal humana madura.

El término “variante”, como se usa en la presente invención, se refiere a derivados de una proteína o péptido que comprenden modificaciones de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo por sustitución, deleción, inserción o 25 modificación química. Preferentemente, dichas modificaciones no reducen la funcionalidad de la proteína o péptido. Dichas variantes incluyen proteínas, en las que uno o más aminoácidos se han reemplazado por sus D-estereoisómeros respectivos o por aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural, tales como, por ejemplo, ornitina, hidroxiprolina, citrulina, homoserina, hidroxilisina, norvalina. Sin embargo, dichas sustituciones también pueden ser conservativas, es decir, se reemplaza un resto aminoacídico con un resto aminoacídico químicamente similar. Son 30 ejemplos de sustituciones conservativas los reemplazos entre los miembros de los grupos siguientes: 1) alanina, serina y treonina; 2) ácido aspártico y ácido glutámico; 3) asparagina y glutamina; 4) arginina y lisina; 5) isoleucina, leucina, metionina y valina; y 6) fenilalanina, tirosina y triptófano.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una muteína de lipocalina lacrimal humana que se une al receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-R2) o una región extracelular o un dominio del 35 mismo. Habitualmente, dicha muteína actúa como un antagonista de VEGF y se une a una región extracelular o un dominio de VEGF-R2 con una KD de 200 nM o menos, 100 nM o menos, 20 nM o menos, 15 nM o menos, 10 nM o menos o incluso 1 nM o menos.

Dicha muteína puede comprender con respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana madura al menos 6, 8, 10, 12, 14 ó 16 sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en Arg 26  40 Ser; Glu 27  Ile; Glu 30  Ser; Met 31  Gly; Asn 32  Arg; Leu 33  Ile; Glu 34  Tyr; Leu 56  Lys, Glu, Ala, Met; Ile 57  Phe; Ser 58  Arg; Asp 80  Ser, Pro; Lys 83  Glu, Gly; Glu 104  Leu; Leu 105  Ala; His 106  Val; y Lys 108  Thr y puede comprender adicionalmente al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupos que consiste en Leu 41Phe; Glu 63  Lys; Val 64  Met; Asp 72  Gly; Lys 76  Arg, Glu; Ile 88  Val, Thr; Ile 89  Thr; Arg 90  Lys; Asp 95  Gly; Phe 99  Leu; y Gly 107  Arg, Lys, Glu. 45

En una realización específica, dicha muteína comprende las sustituciones de aminoácidos: Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, lle 57  Phe, Ser 58  Arg, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val y Lys 108  Thr.

Una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención que se une a una región extracelular o un dominio de VEGF-R2 con afinidad detectable puede comprender uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos: 50

(1) Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, Leu 56  Lys, Ile 57Phe, Ser 58  Aug, Asp 80  Ser, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val, Lys 108  Thr;

(2) Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, Leu 56 

Glu, Ile 57  Phe, Ser 58  Arg, Asp 80  Ser, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val, Lys 108  Thr;

(3) Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, Leu 56  Ala, Ile 57  Phe, Ser 58  Arg, Asp 80  Ser, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val, Lys 108  Thr; y 5

(4) Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, Leu 56  Glu, Ile 57  Phe, Ser 58  Arg, Asp 80  Pro, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val, Lys 108  Thr.

En una realización de la invención, la muteína que se une a VEGF-R2 comprende, consiste esencialmente o consiste en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 34-39. 10

En un aspecto adicional más, la presente invención se refiere a una muteína de lipocalina lacrimal humana que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Habitualmente, dicha muteína actúa como un antagonista de VEGF inhibiendo la unión de VEGF al receptor de VEGF y se une a VEGF con una KD de 200 nM o menos, 100 nM o menos, 20 nM, 5 nM o menos o incluso 1 nM o menos.

Dicha muteína obtenible por los procedimientos de la invención puede comprender con respecto a la secuencia 15 de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana madura al menos 6, 8, 10, 12, 14, 16 sustituciones de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Arg 26  Ser, Pro, Val, Leu, Ile; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His, Arg, Tyr, Gln; Ile 57  Val, Thr, Leu; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile, Val; Glu 104  Cys; His 106  Asn, Ser, Asp; y Lys 108  Ala, Val y puede comprender adicionalmente al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en Val 36 20  Met; Thr 37  Ala; Met 39  Thr; Thr 40  Ala, Ser; Asn 48  Asp; Ala 51  Val; Lys 52  Arg; Thr 54  Val; Met 55  Val; Ser 61  Pro; Lys 65  Arg; Ala 66  Val; Val 67  Ile; Glu 69  Gly, Ser, Thr; Lys 76  Arg, Ile, Ala, Met, Pro; Tyr 87  Arg, His, Lys, Gln; Ile 89  Thr, Val, Gly, His, Met, Lys; Arg 90  Gly; Ile 98  Val; y Gly 107  Glu.

En una realización, dicha muteína de lipocalina lacrimal humana que se une a VEGF comprende las sustituciones de aminoácidos: Glu 27  Gly, Phe 28  Ala, Pro 29  Leu, Glu 30  Arg, Met 31  Cys, Asn 32  Leu, 25 Leu 33  Ala, Glu 34  Gly, Asp 80  Ile, Lys 83  Ile, Glu 104  Cys y Lys 108  Val.

En otra realización específica, la muteína de lipocalina lacrimal humana que se une a VEGF puede comprender uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:

(1) Arg 26  Ser; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Asn; Lys 30 108  Val;

(2) Arg 26  Pro; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Glu; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val;

(3) Arg 26  Pro; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33 35  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Asn; Lys 108  Val;

(4) Arg 26  Pro; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  Arg; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val; 40

(5) Arg 26  Pro; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val;

(6) Arg 26  Ser; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 45 108  Val;

(7) Arg 26  Val; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val;

(8) Arg 26  Leu; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33 50  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val; y

(9) Arg 26  Ile; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33

 Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val.

En una realización de la invención, la muteína que se une a VEGF comprende, consiste esencialmente en o consiste en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 26-33 o SEC ID Nº: 44-47.

También se incluyen en el ámbito de la presente invención las muteínas anteriores, que se han alterado con 5 respecto a su inmunogenicidad potencial.

Los linfocitos T citotóxicos reconocen antígenos peptídicos en la superficie celular de una célula presentadora de antígenos en asociación con una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC). La capacidad de los péptidos para unirse a moléculas del MHC específica de alelo y se correlaciona con su inmunogenicidad. Para reducir la inmunogenicidad de una proteína dada, la capacidad para predecir qué péptidos en una proteína tienen el potencial 10 para unirse a una molécula del MHC dada es de gran valor. Se han descrito previamente estrategias que emplean un enfoque de reconocimiento de plegamiento computacional para identificar epítopos potenciales de linfocitos T para predecir la unión de una secuencia peptídica dada a moléculas del MHC de clase I (Altuvia y col. (1995) J. Mol. Biol. 249: 244-250).

Dicho enfoque también puede utilizarse para identificar epítopos potenciales de linfocitos T en las muteínas de la 15 invención y para realizar, dependiendo de su uso deseado, una selección de una muteína específica basándose en su inmunogenicidad predicha. Puede además ser posible someter regiones peptídicas que se ha predicho que contienen epítopos de linfocitos T a mutagénesis adicional para reducir o eliminar estos epítopos de linfocitos T y minimizar de este modo la inmunogenicidad. Se ha descrito la eliminación de epítopos anfipáticos de anticuerpos desarrollados por ingeniería genética (Mateo y col. (2000) Hybridoma 19 (6): 463-471) y puede adaptarse a las muteínas de la presente 20 invención.

Las muteínas obtenidas de este modo pueden poseer una inmunogenicidad minimizada, siendo deseable para su uso en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico, tales como las descritas a continuación.

Para algunas aplicaciones, también es útil emplear las muteínas de la invención de una forma marcada. En consecuencia, la invención también se refiere a muteínas de lipocalina que están conjugadas con un marcador 25 seleccionado del grupo que consiste en marcadores enzimáticos, marcadores radiactivos, marcadores coloreados, marcadores fluorescentes, marcadores cromogénicos, marcadores luminiscentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complejos metálicos, metales y oro coloidal. La muteína también puede conjugarse con una molécula orgánica. La expresión “molécula orgánica”, como se usa en el presente documento, indica preferentemente una molécula orgánica que comprende al menos dos átomos de carbono, pero preferentemente no más de 7 ó 12 enlaces de carbono rotatorios, 30 que tienen un peso molecular en el intervalo de entre 100 y 2000 Dalton, preferentemente entre 100 y 1000 Dalton, y que incluye opcionalmente uno o dos átomos metálicos.

En general, es posible marcar la muteína de lipocalina con cualquier sustancia química o enzima apropiada, que genera directa o indirectamente un compuesto o señal detectable en una reacción química, física, óptica o enzimática. Un ejemplo para una reacción física y al mismo tiempo reacción óptica/marcador es la emisión de fluorescencia tras la 35 irradiación o la emisión de rayos X cuando se usa un marcador radiactivo. La fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano rusticano o la -galactosidasa son ejemplos de marcadores enzimáticos (y al mismo tiempo marcadores ópticos) que catalizan la formación de productos de reacción cromogénicos. En general, todos los marcadores usados comúnmente para anticuerpos (excepto los usados exclusivamente con el resto de azúcar en la parte Fc de las inmunoglobulinas) pueden usarse también para la conjugación con las muteínas de la presente invención. Las muteínas de la invención 40 también pueden conjugarse con cualquier agente terapéuticamente activo adecuado, por ejemplo, el suministro dirigido de dichos agentes a una célula, tejido u órgano dados o para la dirección selectiva de células, por ejemplo, de células tumorales sin afectar a las células normales circundantes. Los ejemplos de dichos agentes terapéuticamente activos incluyen radionúclidos, toxinas, moléculas orgánicas pequeñas y péptidos terapéuticos (tales como péptidos que actúan como agonistas/antagonistas de un receptor de superficie de celular o péptidos que compiten por un sitio de unión a 45 proteína en una diana celular dada). Las muteínas de lipocalina de la invención también pueden, sin embargo, conjugarse con ácidos nucleicos terapéuticamente activos tales como moléculas de ácido nucleico antisentido, ARN de interferencia pequeños, micro-ARN o ribozimas. Dichos conjugados pueden producirse por procedimientos bien conocidas en la técnica.

En una realización, las muteínas de la invención también pueden acoplarse a un resto de dirección que se dirige 50 a una región específica del cuerpo para suministrar las muteínas de la invención a una región o área deseada dentro del cuerpo. Un ejemplo en el que dicha modificación puede ser deseable es el cruce de la barrera hematoencefálica. Para atravesar la barrera hematoencefálica, las muteínas de la invención pueden acoplarse a restos que facilitan el transporte activo a través de esta barrera (véase Gaillard PJ, y col, Diphtheria-toxin receptor-targeted brain drug delivery. International Congress Series. 2005 1277: 185-198 o Gaillard PJ, y col. Targeted delivery across the blood-brain barrier. Expert Opin 55 Drug Deliv. 2005 2(2): 299-309. Dichos restos están disponibles, por ejemplo, con el nombre comercial 2B-Trans (to-

BBB technologies BV, Leiden, NL).

Como se ha indicado anteriormente, una muteína de la invención puede conjugarse en algunas realizaciones con un resto que prolongue la semivida en suero de la muteína (a este respecto véase también la Publicación PCT WO 2006/56464 en la que se describen dichas estrategias de conjugación con referencias a muteínas de la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana con afinidad de unión por CTLA-4). El resto que prolonga la semivida en suero puede 5 ser una molécula de polialquilenglicol, hidroxietil almidón, moléculas de ácidos grasos, tales como ácido palmítico (Vajo y Duckworth 2000, Pharmacol. Rev. 52, 1-9), una parte Fc de una inmunoglobulina, un dominio CH3 de una inmunoglobulina, un dominio CH4 de una inmunoglobulina, albúmina o un fragmento de la misma, un péptido de unión a albúmina o una proteína de unión a albúmina, transferrina por nombrar sólo unos pocos. La proteína de unión a albúmina puede ser una proteína de unión a albúmina bacteriana, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo incluyendo anticuerpos 10 de dominio (véase la patente de Estados Unidos 6.696.245, por ejemplo) o una muteína de lipocalina con actividad de unión por albúmina. En consecuencia, los compañeros de conjugación adecuados para prolongar la semivida de una muteína de lipocalina de la invención incluyen albúmina (Osborn, B.L. y col (2002) Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomolgus monkeys J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548), o una proteína de unión a albúmina, por ejemplo, un dominio de unión a albúmina bacteriana, tal como el de la 15 proteína G estreptocócica (König, T. y Skerra, A. (1998) Use of an albumin-binding domain for the selective immobilisation of recombinant capture antibody fragments on ELISA plates. J. Immunol. Methods 218, 73-83). Otros ejemplos de péptidos de unión a albúmina que pueden usarse como compañero de conjugación son, por ejemplo, los que tienen una secuencia de consenso Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, en la que Xaa1 es Asp, Asn, Ser, Thr o Trp; Xaa2 es Asn, Gln, His, Ile, Leu o Lys; Xaa3 es Ala, Asp, Phe, Trp o Tyr; y Xaa4 es Asp, Gly, Leu, Phe, Ser o Thr, como se describe en la solicitud de patente 20 de Estados Unidos 2003/0069395 o en Dennis y col. (Dennis, M. S., Zhang, M., Meng, Y. G. Kadkhodayan, M., Kirchhofer, D., Combs, D. y Damico, L. A. (2002). “Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins”. J. Biol Chem 277, 35035-35043).

En otras realizaciones, la propia albúmina o un fragmento biológico activo de albúmina pueden usarse como compañeros de conjugación de una muteína de lipocalina de la invención. El término “albúmina” comprende todas las 25 albúminas de mamífero tales como albúmina de suero humano o albúmina de suero bovino o albúmina de rata. La albúmina o fragmento de la misma puede producirse de forma recombinante, como se describe en la patente de Estados Unidos 5.728.553 o en las solicitudes de patente europea EP 0 330 451 y EP 0 361 991. La albúmina humana recombinante (Recombumin) Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, Reino Unido) puede conjugarse o fusionarse con una muteína de lipocalina para prolongar la semivida de la muteína. 30

Si la proteína de unión a albúmina es un fragmento de anticuerpo este puede ser un anticuerpo de dominio. Los anticuerpos de dominio (dAb) se desarrollan por ingeniería genética para permitir un control preciso de las propiedades biofísicas y de la semivida in vivo para crear el perfil de producto de seguridad y eficacia óptimas. Los anticuerpos de dominio están disponibles en el mercado, por ejemplo, en Domantis Ltd. (Cambridge, Reino Unido y MA, Estados Unidos).

Usando transferrina como un resto para prolongar la semivida en suero de las muteínas de la invención, las 35 muteínas pueden fusionarse genéticamente al extremo N- o C-terminal, o ambos, de una transferrina no glucosilada. La transferrina no glucosilada tiene una semivida de 14-17 días y una proteína de fusión con transferrina tendrá de forma similar una semivida prolongada. El vehículo de transferrina también proporciona una alta biodisponibilidad, biodistribución y estabilidad en circulación. Esta tecnología está disponible en el mercado en BioRexis (BioRexis Pharmaceutical Corporation, PA, Estados Unidos). La transferrina humana recombinante (DeltaFerrin) para su uso como un 40 estabilizador de proteína/compañero de prolongación de semivida también está disponible en el mercado en Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, Reino Unido).

Si se usa una parte Fc de una inmunoglobulina con el fin de prolongar la semivida en suero de las muteínas de la invención, puede usarse la tecnología SynFusion, disponible en el mercado en Syntonix Pharmaceuticals, Inc (MA, Estados Unidos). El uso de esta tecnología de fusión con Fc permite la creación de productos biofarmacéuticos de acción 45 más prolongada y puede consistir, por ejemplo, en dos copias de la muteína unidas a la región Fc de un anticuerpo para mejorar la farmacocinética, solubilidad y eficacia de producción.

Otra alternativa más para prolongar la semivida de una muteína de la invención es fusionar al extremo N- o C-terminal de una muteína de la invención secuencias ricas en glicina largas, no estructuradas, flexibles (por ejemplo, una poliglicina con de aproximadamente 20 a 80 restos de glicina consecutivos). Este enfoque desvelado en el documento 50 WO2007/038619, por ejemplo, también se ha denominado “rPEG” (PEG recombinante).

Si se usa polialquilenglicol como compañero de conjugación, el polialquilenglicol puede estar sustituido, no sustituido, ser lineal o ramificado. También puede ser un derivado de polialquileno activado. Son ejemplos de compuestos adecuados moléculas de polietilenglicol (PEG) como se describe en el documento WO 99/64016, en la patente de Estados Unidos 6.177.074 o en la patente de Estados Unidos 6.403.564 en relación con interferón, o como se describe 55 para otras proteínas tales como asparaginasa modificada con PEG, PEG-adenosina desaminasa (PEG-ADA) o PEG-superóxido dismutasa (véase, por ejemplo, Fuertges y col. (1990) The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified

Proteins J. Control Release 11, 139-148). El peso molecular de dicho polímero, preferentemente polietilenglicol, puede variar de aproximadamente 300 a aproximadamente 70.000 Dalton, incluyendo, por ejemplo, polietilenglicol con un peso molecular de aproximadamente 10.000, de aproximadamente 20.000, de aproximadamente 30.000 o de aproximadamente 40.000 Dalton. Además, como se describe por ejemplo en las patentes de Estados Unidos 6.500.930 o 6.620.413, pueden conjugarse oligómeros y polímeros de carbohidrato tales como almidón o hidroxietil almidón (HES) con 5 una muteína de la invención con el fin de prolongar la semivida en suero.

Si uno de los restos anteriores está conjugado con la muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención, la conjugación con una cadena lateral de aminoácidos puede ser ventajosa. Las cadenas laterales de aminoácidos adecuadas pueden aparecer de forma natural en la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana o introducirse por mutagénesis. En caso de que se introduzca un sitio de unión adecuado mediante mutagénesis, una 10 posibilidad es el reemplazo de un aminoácido en la posición apropiada por un resto de cisteína. En una realización, dicha mutación incluye al menos una de las sustituciones Thr 40  Cys, Glu 73  Cys, Arg 90  Cys, Asp 95  Cys o Glu 131  Cys. El resto de cisteína de nueva creación en cualquiera de estas posiciones puede utilizarse a continuación para conjugar la muteína con un resto que prolonga la semivida en suero de la muteína, tal como PEG o un derivado activado del mismo. 15

En otra realización, para proporcionar cadenas laterales de aminoácidos adecuadas para conjugar uno de los restos anteriores con las muteínas de la invención, pueden introducirse aminoácidos artificiales por mutagénesis. Generalmente, dichos aminoácidos artificiales están diseñados para ser más reactivos y de este modo facilitar la conjugación con el resto deseado. Un ejemplo de dicho aminoácido artificial que puede introducirse mediante un ARNt artificial es para-acetil-fenilalanina. 20

Para varias aplicaciones de las muteínas desveladas en el presente documento puede ser ventajoso usarlas en forma de proteínas de fusión. En algunas realizaciones, la muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención se fusiona en su extremo N-terminal o C-terminal con una proteína, un dominio proteico o un péptido, tal como una secuencia señal y/o una etiqueta de afinidad.

Para aplicaciones farmacéuticas puede fusionarse una muteína de la invención con un compañero de fusión que 25 prolongue la semivida en suero in vivo de la muteína (véase de nuevo la publicación de PCT WO 2006/56464 en la que se describe un compañero de fusión adecuado con referencias a muteínas de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo humana con afinidad de unión por CTLA-4). De forma similar a los conjugados descritos anteriormente, el compañero de fusión puede ser una parte Fc de una inmunoglobulina, un dominio CH3 de una inmunoglobulina, un dominio CH4 de una inmunoglobulina, albúmina, un péptido de unión a albúmina o una proteína de unión a albúmina, por nombrar sólo 30 algunos. De nuevo, la proteína de unión a albúmina puede ser una proteína de unión a albúmina bacteriana o una muteína de lipocalina con actividad de unión por albúmina. En consecuencia, los compañeros de fusión adecuados para prolongar la semivida de una muteína de lipocalina de la invención incluyen albúmina (Osborn, B.L. y col (2002) mencionado anteriormente J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548) o una proteína de unión a albúmina, por ejemplo, un dominio de unión a albúmina bacteriana, tal como el de la proteína G estreptocócica (König, T. y Skerra, A. (1998) mencionado 35 anteriormente J. Inmunol Methods 218, 73-83). Los péptidos de unión a albúmina descritos en Dennis y col, mencionado anteriormente (2002) o la solicitud de patente de Estados Unidos 2003/0069395 que tienen una secuencia de consenso Cys-Xaa1-Xaa2 -Xaa3-Xaa4-Cys, en la que Xaa1 es Asp, Asn, Ser, Thr o Trp; Xaa2 es Asn, Gln, His, Ile, Leu o Lys; Xaa3 es Ala, Asp, Phe, Trp o Tyr; y Xaa4 es Asp, Gly, Leu, Phe, Ser o Thr, también pueden usarse como compañero de fusión. También es posible usar la propia albúmina o un fragmento biológico activo de la albúmina como compañero de fusión de 40 un muteína de lipocalina de la invención. El término “albúmina” comprende todas las albúminas de mamífero tales como albúmina de suero humano o albúmina de suero bovino o albúmina de suero de rata. La producción recombinante de albúmina o fragmentos de la misma se conoce bien en la técnica y se describe, por ejemplo, en la patentes de Estados Unidos 5.728.553, la solicitud de patente europea EP 0 330 451 o EP 0 361 991.

El compañero de fusión puede conferir nuevas características a la muteína de lipocalina de la invención tales 45 como actividad enzimática o afinidad de unión por otras moléculas. Son ejemplos de proteínas de fusión adecuadas la fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano rusticano, glutation-S-transferasa, el dominio de unión a albúmina de la proteína G, proteína A, fragmentos de anticuerpo, dominios de oligomerización, muteínas de lipocalina de la misma o diferente especificidad de unión (que da como resultado la formación de “Duocalinas”, consúltese Schlehuber, S. y Skerra, A. (2001), Duocalins, engineered ligand-binding proteins with dual specificity derived from the lipocalin fold. Biol. Chem. 382, 50 1335-1342) o toxinas.

En particular, puede ser posible fusionar una muteína de lipocalina de la invención con un sitio activo de enzima separado de modo que ambos “componentes” de la proteína de fusión resultante actúen juntos sobre una diana terapéutica dada. El dominio de unión de la muteína de lipocalina se une a la diana causante de enfermedad, permitiendo que el dominio de enzima impida la función biológica de la diana. Etiquetas de afinidad tales como Strep-tag o Strep-55 tag II (Schmidt, T.G.M. y col. (1996) J. Mol. Biol. 255, 753-766), la etiqueta myc, la etiqueta FLAG-tag, la etiqueta His6 o la etiqueta HA o proteínas tales como la glutatión-S-transferasa también permiten una detección y/o purificación fácil de las

proteínas recombinantes y son ejemplos adicionales de compañeros de fusión preferidos. Finalmente, las proteínas con propiedades cromogénicas o fluorescentes tales como la proteína verde fluorescente (GFP) o la proteína amarilla fluorescente (YFP) son compañeros de fusión adecuados para una muteína de lipocalina de la invención.

La expresión “proteína de fusión” como se usa en el presente documento también comprende muteínas de lipocalina de acuerdo con la invención que contienen una secuencia señal. Las secuencia señal en el extremo N-terminal 5 de un polipéptido dirigen este polipéptido a un compartimiento celular específico, por ejemplo el periplasma de E. coli o el retículo endoplásmico de células eucariotas. En la técnica se conocen muchas secuencias señal. Una secuencia señal preferida para la secreción de un polipéptido al periplasma de E. coli es la secuencia señal de OmpA.

La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico (ADN y ARN) que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican muteínas como se describe en el presente documento. Puesto que la 10 degeneración del código genético permite sustituciones de ciertos codones por otros codones que especifican el mismo aminoácido, la invención no se limita a una molécula de ácido nucleico específica que codifica una muteína de la invención sino que incluye todas las moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una muteína funcional.

Por lo tanto, la presente invención también incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una muteína de 15 acuerdo con la invención que comprende una mutación en el codón de al menos 12 posiciones de secuencia de cualquiera de las posiciones de secuencia de aminoácidos 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura nativa, en la que los codones que codifican al menos uno de los restos de cisteína en las posiciones de secuencia 61 y 153 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura se han mutado para codificar cualquier otro resto aminoacídico. 20

La invención, como se desvela en el presente documento, también incluye moléculas de ácido nucleico que codifican muteínas de lipocalina lacrimal, que comprenden mutaciones adicionales fuera de las posiciones de secuencia indicadas de la mutagénesis experimental. Dichas mutaciones se toleran con frecuencia o incluso pueden demostrar ser ventajosas, por ejemplo si contribuyen a una mejora de la eficacia de plegamiento, estabilidad en suero, estabilidad térmica o afinidad de unión a ligando de la muteína. 25

Una molécula de ácido nucleico desvelada en la presente solicitud puede estar “unida operativamente” a una secuencia reguladora (o secuencias reguladoras) para permitir la expresión de esta molécula de ácido nucleico.

Una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, se considera “capaz de expresar una molécula de ácido nucleico” o capaz “de permitir la expresión de una secuencia de nucleótidos” si comprende elementos de secuencia que contienen información con respecto a la regulación transcripcional y/o traduccional, y dichas secuencias están “unidas 30 operativamente” a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Un enlace operable es un enlace en el que los elementos de secuencia reguladores y la secuencia a expresar están conectados de modo que permiten la expresión génica. La naturaleza exacta de las regiones reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar entre especies, pero en general estas regiones comprenden un promotor que, en procariotas, contiene el promotor de por sí, es decir elementos de ADN que dirigen el indicio de la transcripción, así como elementos de ADN que, cuando se transcriben 35 a ARN, señalizarán el inicio de la traducción. Dichas regiones promotoras incluyen normalmente secuencias no codificantes 5’ implicadas en el inicio de la transcripción y la traducción, tales como las cajas -35/-10 y el elemento de Shine-Dalgarno en procariotas o la caja TATA, las secuencias CAAT y los elementos de protección terminal 5’ en eucariotas. Estas regiones también pueden incluir elementos potenciadores o represores, así como señales traducidas y secuencias líder para dirigir el polipéptido nativo a un compartimento específico de una célula huésped. 40

Además, las secuencias no codificantes 3’ pueden contener elementos reguladores implicados en la terminación de la transcripción, la poliadenilación o similares. Sin embargo, si estas secuencias de terminación no son satisfactoriamente funcionales en una célula huésped particular, entonces pueden sustituirse con señales funcionales en esa célula.

Por lo tanto, una molécula de ácido nucleico de la invención puede incluir una secuencia reguladora, 45 preferentemente una secuencia promotora. En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico de la invención comprende una secuencia promotora y una secuencia de terminación de la transcripción. Son promotores procariotas adecuados, por ejemplo, el promotor tet, el promotor lacUV5 o el promotor de T7. Son ejemplos de promotores útiles para la expresión en células eucariotas el promotor de SV40 o el promotor de CMV.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención también pueden ser parte de un vector o cualquier otro tipo de 50 vehículo de clonación, tal como un plásmido, un fagémido, un fago, un baculovirus, un cósmido o un cromosoma artificial.

En una realización, la molécula de ácido nucleico está comprendida en un fásmido. Un vector fasmídico indica un vector que codifica la región intergénica de un fago atemperado, tal como M13 o f1, o una parte funcional del mismo fusionada con el ADNc de interés. Después de la superinfección de las células huésped bacterianas con dicho vector fagémido y un fago auxiliar apropiado (por ejemplo, M13K07, VCS-M13 o R408) se producen partículas de fago intactas, 55

permitiendo de este modo un acoplamiento físico del ADNc heterólogo codificado con su polipéptido correspondiente presentado en la superficie del fago (revisado, por ejemplo, por Kay, B.K. y col. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual, 1ª Ed., Academic Press, Nueva York NY; Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424 o Rodi, D.J., y Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93).

Dichos vehículos de clonación pueden incluir, además de las secuencias reguladoras descritas anteriormente y 5 una secuencia de ácido nucleico que codifica una muteína de lipocalina de la invención, secuencias de replicación y control derivadas de una especie compatible con la célula huésped que se usan para la expresión, así como marcadores de selección que confieren un fenotipo seleccionable en células transformadas o transfectadas. Se conocen en la técnica una gran cantidad de vectores de clonación adecuados, y están disponibles en el mercado.

La molécula de ADN que codifica muteínas de lipocalina de la invención y, en particular, un vector de clonación 10 que contiene la secuencia codificante de dicha muteína de lipocalina, puede transformarse en una célula huésped capaz de expresar el gen. La transformación puede realizarse usando técnicas convencionales (Sambrook, J. y col. (1989), mencionado anteriormente). De este modo, la invención también se refiere a una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico como se desvela en el presente documento.

Las células huésped transformadas se cultivan en condiciones adecuadas para la expresión de la secuencia de 15 nucleótidos que codifica una proteína de fusión de la invención. Las células huésped adecuadas pueden ser procariotas, tales como Escherichia coli (E. coli) o Bacillus subtilis, o eucariotas, tales como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, células de insecto SF9 o High5, líneas celulares de mamíferos inmortalizadas (por ejemplo, células HeLa o células CHO) o células de mamífero primarias.

La invención también se refiere a un procedimiento para la producción de una muteína de la invención, en el que 20 la muteína, un fragmento de la muteína o una proteína de fusión de la muteína y otro polipéptido se producen a partir del ácido nucleico que codifica la muteína por medio de procedimientos de ingeniería genética. El procedimiento puede llevarse a cabo in vivo, la muteína puede producirse, por ejemplo, en un organismo huésped bacteriano o eucariota y aislarse después a partir de este organismo huésped o su cultivo. También es posible producir una proteína in vitro, por ejemplo mediante el uso de un sistema de traducción in vitro. 25

Cuando se produce la muteína in vivo se introduce un ácido nucleico que codifica una muteína de la invención en un organismo huésped bacteriano o eucariota adecuado por medio de tecnología de ADN recombinante (como ya se ha descrito anteriormente). Con este fin, la célula huésped se transforma primero con un vector de clonación que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una muteína de la invención usando procedimientos convencionales establecidos (Sambrook, J. y col. (1989), mencionado anteriormente). La célula huésped se cultiva después en 30 condiciones que permiten la expresión del ADN heterólogo y, por lo tanto, la síntesis del polipéptido correspondiente. Posteriormente, el polipéptido se recupera a partir de la célula o del medio de cultivo.

En muteínas de lipocalina lacrimal de la invención, se elimina el enlace disulfuro de origen natural entre Cys 61 y Cys 153. En consecuencia, dichas muteínas (o cualquier otra muteína de lipocalina lacrimal que no comprenda un enlace disulfuro intramolecular) pueden producirse en un compartimento celular que tenga un entorno redox reductor, por 35 ejemplo, en el citoplasma de bacterias Gram negativas. En el caso de que una muteína de lipocalina de la invención comprenda enlaces disulfuro intramoleculares, puede preferirse dirigir el polipéptido naciente a un compartimento celular que tenga un entorno redox oxidante usando una secuencia señal apropiada. Tal entorno oxidante puede proporcionarse por el periplasma de bacterias Gram-negativas tales como E. coli, en el entorno extracelular de bacterias Gram-positivas o en la luz del retículo endoplásmico de células eucariotas y habitualmente favorece la formación de enlaces disulfuro 40 estructurales. Sin embargo, también es posible producir una muteína de la invención en el citosol de una célula huésped, preferentemente E. coli. En este caso, el polipéptido puede obtenerse directamente en un estado soluble y plegado o recuperarse en forma de cuerpos de inclusión, seguido de renaturalización in vitro. Una opción adicional es el uso de cepas huésped específicas que tienen un entorno intracelular oxidante, pudiendo permitir por lo tanto la formación de enlaces disulfuro en el citosol (Venturi M, Seifert C, Hunte C. (2002) "High level production of functional antibody Fab 45 fragments in an oxidizing cytoplasm." J. Mol. Biol. 315, 1-8.).

Sin embargo, una muteína de la invención puede no generarse o producirse necesariamente sólo mediante uso de ingeniería genética. En su lugar, una muteína de lipocalina también puede obtenerse por síntesis química tal como síntesis de polipéptidos en fase sólida de Merrifield o mediante transcripción y traducción in vitro. Por ejemplo, es posible que se identifiquen mutaciones prometedoras usando modelado molecular, y después sintetizar el polipéptido deseado 50 (diseñado) in vitro e investigar la actividad de unión para una diana dada. Los procedimientos para la síntesis en fase sólida y/o en fase de solución de proteínas se conocen bien en el técnica (revisados, por ejemplo, por Lloyd-Williams, P. y col (1997) Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC Press, Boca Raton, Fields, G.B., y Colowick, S.P. (1997) Solid-Phase Peptide Synthesis. Academic Press, San Diego o Bruckedorfer, T. y col. (2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-43). 55

En otra realización, las muteínas de la invención pueden producirse mediante transcripción/traducción in vitro,

empleando procedimientos bien establecidos conocidos por los expertos en la materia.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos una muteína de la invención de lipocalina lacrimal humana o una proteína de fusión o conjugado de la misma y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las muteínas de lipocalina de acuerdo con la invención pueden administrarse mediante cualquier vía parenteral 5 o no parenteral (enteral) que sea terapéuticamente eficaz para fármacos proteicos. Los procedimientos de aplicación parenteral comprenden, por ejemplo, técnicas de inyección e infusión intracutánea, subcutánea, intramuscular, intratraqueal, intranasal, intravítrea o intravenosa, por ejemplo, en forma de soluciones para inyección, soluciones para infusión o tinturas, así como instilación e inhalación de aerosol, por ejemplo en forma de mezclas en aerosol, pulverizaciones o polvos. Se presenta una visión de conjunto sobre el suministro pulmonar de fármacos, es decir, por 10 inhalación de aerosoles (que también pueden usarse en la administración intranasal) o instilación intratraqueal por J.S. Patton y col. The lungs as a portal of entry for systemic drug delivery. Proc. Amer. Thoracic Soc. 2004 Vol. 1 páginas 338-344, por ejemplo). Los modos de suministro no parenterales son, por ejemplo, por vía oral, por ejemplo, en forma de píldoras, comprimidos, cápsulas, soluciones o suspensiones, o por vía rectal, por ejemplo, en forma de supositorios. Las muteínas de la invención pueden administrarse por vía sistémica o tópica en formulaciones que contienen excipientes o 15 medios de soporte, aditivos y vehículos convencionales no tóxicos farmacéuticamente aceptables según se desee.

En una realización de la presente invención, el producto farmacéutico se administra por vía parenteral a un mamífero, en particular a seres humanos. Los procedimientos de administración correspondientes incluyen, sin limitación, por ejemplo, técnicas de inyección e infusión intracutáneas, subcutáneas, intramusculares, intatraqueales o intravenosas, por ejemplo, en forma de soluciones para inyección, soluciones para infusión o tinturas, así como instilación e inhalación 20 de aerosol, por ejemplo, en forma de mezclas en aerosol, pulverizaciones o polvos. Una combinación para infusión y/o inyección intravenosa y subcutánea podría ser la más conveniente en el caso de compuestos con una semivida en suero relativamente corta. La composición farmacéutica puede ser una solución acuosa, una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite.

A este respecto se observa que las tecnologías de suministro transdérmico, por ejemplo, iontoforesis, 25 sonoforesis o suministro mejorado con microagujas, como se describe por Meidan VM y Michniak BB 2004 Am. J. Ther. 11(4): 312-316, también pueden usarse para suministro transdérmico de las muteínas descritas en el presente documento. Son modos de suministro no parenteral, por ejemplo, el oral, por ejemplo, en forma de píldoras, comprimidos, cápsulas, soluciones o suspensiones, o la administración rectal, por ejemplo en forma de supositorios. Las muteínas de la invención pueden administrarse por vía sistémica o tópica en formulaciones que contienen una diversidad de excipientes o 30 medios de soporte, aditivos y vehículos convencionales no tóxicos farmacéuticamente aceptables.

La dosificación de la muteína aplicada puede variar dentro de amplios límites para conseguir el efecto preventivo o la respuesta terapéutica deseados. Dependerá, por ejemplo, de la afinidad del compuesto para un ligando seleccionado, así como de la semivida del complejo entre la muteína y el ligando in vivo. Adicionalmente, la dosificación óptima dependerá de la biodistribución de la muteína o su proteína de fusión o su conjugado, del modo de administración, de la 35 gravedad de la enfermedad/trastorno que se trata, así como del estado médico del paciente. Por ejemplo, cuando se usa en una pomada para aplicaciones tópicas, puede usarse una concentración alta de la muteína de lipocalina lacrimal. Sin embargo, si se desea, la muteína también puede administrarse en una formulación de liberación prolongada, por ejemplo, dispersiones liposomales o microesferas poliméricas basadas en hidrogel, como PolyActive™ u OctoDex™ (consúltese Bos y col., Business Briefing: Pharmatech 2003: 1-6). Otras formulaciones de liberación prolongada disponibles son, por 40 ejemplo, polímeros basados en PLGA (PR pharmaceuticals), hidrogeles basados en PLA-PEG (Medincell) y polímeros basados en PEA (Medivas).

En consecuencia, las muteínas de la presente invención pueden formularse en composiciones que usan ingredientes farmacéuticamente aceptables, así como procedimientos de preparación establecidos (Gennaro, A.L. y Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª Ed., Lippincott Williams & Wilkins, 45 Philadelphia, PA). Para preparar las composiciones farmacéuticas, pueden usarse excipientes inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente inertes. Para preparar, por ejemplo, píldoras, polvos, cápsulas de gelatina o supositorios pueden usarse, por ejemplo, lactosa, talco, ácido esteárico y sus sales, grasas, ceras, polioles sólidos o líquidos, aceites naturales y aceites hidrogenados. Los excipientes adecuados para la producción de soluciones, suspensiones, emulsiones, mezclas de aerosol o polvos para reconstitución en soluciones o mezclas de aerosol antes de su uso incluyen agua, alcoholes, 50 glicerol, polioles y mezclas adecuadas de los mismos, así como aceites vegetales.

La composición farmacéutica también puede contener aditivos tales como, por ejemplo, cargas, aglutinantes, agentes humectantes, emolientes, estabilizantes, conservantes, emulsionantes y además disolventes o solubilizantes o agentes para conseguir un efecto de liberación prolongada. Este último es que las proteínas de fusión pueden incorporarse en sistemas de liberación lenta o sostenida o de suministro dirigido, tales como liposomas y microcápsulas. 55

Las formulaciones pueden esterilizarse por numerosos medios, incluyendo filtración a través de un filtro de

retención de bacterias, o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio estéril justo antes del uso.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno, que comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una muteína como se ha definido anteriormente a un sujeto que lo necesite. 5

El sujeto que necesita dicho tratamiento puede ser un mamífero, tal como un ser humano, un perro, un ratón, una rata, un cerdo, un simio tal como un mono cynomolgus, por nombrar sólo algunos ejemplos ilustrativos.

La naturaleza precisa de las enfermedades y trastornos que van a tratarse de acuerdo con el procedimiento de la invención depende del ligando al que pretende unirse la muteína utilizada. En consecuencia, las muteínas de la presente invención pueden usarse para tratar cualquier enfermedad siempre que una molécula diana que se sabe que está 10 implicada en el desarrollo de la enfermedad o trastorno pueda presentarse al producto de expresión de una genoteca de ácidos nucleicos de la presente invención o se presente a muteínas obtenidas de otro modo de lipocalina lacrimal.

Las muteínas descritas anteriormente que se unen al receptor alfa de IL-4 con alta afinidad o las composiciones farmacéuticas que las contienen pueden utilizarse en un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno asociado con un aumento de la respuesta inmune de Th2. Dicha enfermedad o trastorno puede, por ejemplo, ser una reacción 15 alérgica o una inflamación alérgica. La inflamación alérgica, a su vez, puede asociarse con asma alérgico, rinitis, conjuntivitis o dermatitis (consúltese, Hage y col., Crystal Structure of the Interleukin-4 Receptor alpha chain reveals a mosaic binding interface, Cell, Vol. 97, 271-281, 16 de abril de 1999 o Mueller y col, Structure, binding and antagonists in the IL-4/IL-13 receptor system, Biochemica et Biophysica Acta (2002), 237-250).

En este contexto, se observa que una diversidad de células tumorales expresan un mayor número de receptores 20 de IL-4 de alta afinidad que las células normales. Dichas células incluyen tumores humanos sólidos tales como melanoma, cáncer de mama, carcinoma de ovario, mesotelioma, glioblastoma, astrocitoma, carcinoma de células renales, carcinoma de cabeza y cuello, sarcoma de Kaposi asociado con SIDA = SK SIDA, células de carcinoma de próstata dependiente e independiente de hormonas y cultivos primarios de tumores de próstata, por ejemplo, (consúltese, Garland L, Gitlitz B, y col., Journal of Immunotherapy. 28: 376-381, Nº 4, jul-ago 2005; Rand RW, Kreitman RJ, y col. Clinical Cancer Research. 25 6: 2157-2165, jun 2000; Husain SR, Kreitman RJ, y col. Nature Medicine. 5: 817-822, jul 1999; Puri RK, Hoon DS y col. Cancer Research. 56: 5631-5637, 15 dic 1996, 10. Debinski W, Puri R y col o Husain SR, Behari N, y col. Cancer Research. 58: 3619-3653, 15 ago 1998, Kawakami K, Leland P, y col. Cancer Research. 60: 2981-2987, 1 jun 2000; o Strome SE, Kawakami, y col. Clinical Cancer Research. 8: 281-286, ene 2002, por ejemplo. Los ejemplos específicos de células con sobreexpresión documentada de receptores de IL-4 incluyen, pero sin limitación, línea celular de linfoma de 30 Burkitt Jijoye (linfoma de linfocitos B), carcinoma de próstata (LNCaP, DU145), carcinoma de cabeza y cuello (SCC, KCCT873), cáncer pancreático (línea celular PANC-1), línea celular de cáncer de cabeza y cuello SCC-25: 13,000 (+/- 500) h (ATCC). La cadena alfa de IL4R juega un papel principal en la internalización de IL4. En consecuencia, cuando se fusionan o conjugan con una toxina, las muteínas de lipocalina lacrimal que se unen a la cadena alfa del receptor de IL-4 pueden usarse por lo tanto también para el tratamiento de tumores (cáncer). Los ejemplos de toxinas adecuadas incluyen 35 exotoxina de Pseudomonas, toxina pertúsica, toxina diftérica, ricina, saporina, exotoxina de Pseudomonas, caliqueamicina o un derivado de la misma, un taxoide, un maitansinoide, una tubulisina y un análogo de dolastatina. Los ejemplos de análogos de dolastatina incluyen, pero sin limitación, auristatina E, monometilauristatina E, auristatina PYE y auristatina PHE.

Para el tratamiento del cáncer, también es posible conjugar muteínas que se unen a la cadena alfa del receptor 40 de IL-4 con un agente citostático. Los ejemplos de tales agentes citostáticos incluyen Cisplatino, Carboplatino, Oxaliplatino, 5-Fluorouracilo, Taxotere (Docetaxel), Paclitaxel, Antraciclina (Doxorubicina), Metotrexato, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina, Dacarbazina, Ciclofosfamina, Etopósido, Adriamicina, Camptotecina, compuestos relacionados con Combretatastina A4, sulfonamidas, oxadiazolinas, piranos de espiroquetas benzo[b]tiofenosintéticos, compuestos de monotetrahidrofurano, curacina y derivados de curacina, derivados de metoxiestradiol y leucovorina. 45

A este respecto, también se señala que las fusiones o conjugados de muteínas de lipocalina lacrimal de la invención con toxinas o agentes citostáticos no se limitan por supuesto a muteínas con afinidad hacia la cadena alfa del receptor de IL-4. Más bien, como resulta inmediatamente evidente para el experto en la materia, puede usarse cualquier muteína de lipocalina lacrimal que se una a un receptor expresado en una superficie de células cancerosas en forma de una proteína de fusión o un conjugado para el tratamiento del cáncer. 50

Las muteínas de lipocalina lacrimal humana que se unen a VEGF-R2 o VEGF con alta afinidad o composiciones farmacéuticas que las contienen pueden utilizarse en un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con una vascularización aumentada tal como cáncer, degeneración macular húmeda neovascular relacionada con la edad (AMD), retinopatía diabética o edema macular, retinopatía del prematuridad u oclusión de la vena retiniana. Un cáncer tal puede seleccionarse del grupo que consiste en carcinomas del tracto gastrointestinal, recto, colon, próstata, 55 ovario, páncreas, mama, vejiga, riñón, endometrio y pulmón, leucemia y melanoma, por nombrar sólo algunos ejemplos

ilustrativos.

Como resulta evidente de la divulgación anterior, una muteína de la presente invención o una proteína de fusión o conjugado de la misma puede emplearse en muchas aplicaciones. En general, dicha muteína puede usarse en todas la aplicaciones en las que se usan anticuerpos, excepto en las que dependen específicamente de la glucosilación de la parte Fc. 5

Por lo tanto, en otro aspecto de la invención, las muteínas de lipocalina lacrimal humana de la invención se usan para la detección de un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana. Dicho uso puede comprender las etapas de poner en contacto la muteína con una muestra sospechosa de contener el ligando dado en condiciones adecuadas, permitiendo de este modo la formación de un complejo entre la muteína y el ligando dado y detectando la muteína en complejo mediante una señal adecuada. 10

La señal detectable puede causarse por un marcador, como se ha explicado anteriormente, o mediante un cambio de las propiedades físicas debido a la unión, es decir, la formación del complejo en sí misma. Un ejemplo es la resonancia de plasmón superficial, cuyo valor cambia durante la unión de los compañeros de unión, estando uno de ellos inmovilizado en una superficie tal como papel de oro.

Las muteínas de lipocalina lacrimal humana desveladas en el presente documento también pueden usarse para 15 la separación de un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana. Dicho uso puede comprender las etapas de poner en contacto la muteína con una muestra que se supone que contiene dicho ligando en condiciones adecuadas, permitiendo de este modo la formación de un complejo entre la muteína y el ligando dado, y separando el complejo de muteína/ligando de la muestra.

Tanto en el uso de la muteína para la detección de un ligando no natural dado como en la separación de un 20 ligando dado, la muteína y/o la diana pueden inmovilizarse en una fase sólida adecuada.

Las muteínas de lipocalina lacrimal humana de la invención también pueden usarse para dirigir un compuesto a un sitio preseleccionado. Para dicho propósito la muteína se pone en contacto con el compuesto de interés para permitir la formación del complejo. Después, se suministra el complejo que comprende la muteína y el compuesto de interés al sitio preseleccionado. Este uso es adecuado en particular, pero sin restricción, para suministrar un fármaco (de forma selectiva) 25 a un sitio preseleccionado en un organismo, tal como una parte corporal, tejido u órgano infectado que se supone que debe tratarse con el fármaco. Aparte de la formación de un complejo entre la muteína y el compuesto de interés, la muteína también puede reaccionar con el compuesto dado para producir un conjugado de muteína y compuesto. De forma similar al complejo anterior, dicho conjugado puede ser adecuado para suministrar el compuesto al sitio diana preseleccionado. Dicho conjugado de muteína y compuesto también puede incluir un engarce que una covalentemente la 30 muteína y el compuesto entre sí. Opcionalmente, dicho engarce es estable en el torrente sanguíneo pero puede escindirse en un entorno celular.

Las muteínas desveladas en el presente documento y sus derivados pueden usarse por lo tanto en mucho campos similares a anticuerpos o fragmentos de los mismos. Además de su uso para unirse a un soporte, permitiendo que la diana de una muteína dada o un conjugado o una proteína de fusión de esta diana se inmovilice o se separe, las 35 muteínas pueden usarse para marcar con una enzima, un anticuerpo, una sustancia radiactiva o cualquier otro grupo que tenga actividad bioquímica o características de unión definidas. Haciendo esto, sus dianas respectivas o conjugados o proteínas de fusión de las mismas pueden detectarse o ponerse en contacto con ellas. Por ejemplo, las muteínas de la invención pueden servir para detectar estructuras químicas por medio de procedimientos analíticos establecidos (por ejemplo, ELISA o Transferencia de Western) o por microscopía o inmunosensores. Aquí, la señal de detección puede 40 generarse directamente mediante el uso de un conjugado o proteína de fusión con muteína adecuado, o indirectamente por detección inmunoquímica de la muteína unida mediante un anticuerpo.

También existen numerosas aplicaciones posibles para las muteínas de la invención en medicina. Además de su uso en el diagnóstico y el suministro de fármacos, puede generarse un polipéptido mutante de la invención, que se une, por ejemplo, a moléculas de superficie celular específicas de tejido o de tumor. Dicha muteína puede, por ejemplo, 45 emplearse en forma conjugada o como una proteína de fusión para "formación de imágenes de tumores" o directamente para la terapia del cáncer.

De este modo, la presente invención también implica el uso de las muteínas de lipocalina lacrimal humana de la invención para la formación de complejos con un ligando no natural dado.

Otro uso relacionado y preferido de una muteína descrita en el presente documento es la validación de dianas, 50 es decir, el análisis de si un polipéptido que se asume que está implicado en el desarrollo o progreso de una enfermedad o trastorno es de hecho causante de algún modo de esa enfermedad o trastorno. Este uso para validar una proteína como una diana de fármaco de uso farmacológico aprovecha la capacidad de una muteína de la presente invención para reconocer de forma específica un área de superficie de una proteína en su conformación nativa, es decir, unirse a un epítopo nativo. A este respecto, debe señalarse que esta capacidad se ha indicado solamente para un número limitado de 55

anticuerpos recombinantes. Sin embargo, el uso de un muteína de la invención para la validación de una diana de fármaco no se limita a la detección de proteínas como dianas, si no que también incluye la detección de dominios proteicos, péptidos, moléculas de ácido nucleico, moléculas orgánicas o complejos de metales.

La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes Ejemplos no limitantes y los dibujos adjuntos en los que:

La Figura 1 muestra un mapa del vector de expresión pTLPC10 (SEC ID Nº 1). 5

La Figura 2 muestra la secuencia polipeptídica de S148.3 J14, una muteína de lipocalina lacrimal humana que posee afinidad de unión por el receptor alfa de IL-4.

La Figura 3 muestra el procedimiento de exploración de afinidad mediante ELISA y los resultados obtenidos para las muteínas con afinidad por el receptor alfa de IL-4.

La Figura 4 muestra las secuencias polipeptídicas de las muteínas con la mayor afinidad por el receptor alfa de IL-4 10 (SEC ID Nº: 3-8).

La Figura 5 muestra mediciones de BIAcore de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S148.3 J14; SEC ID Nº 2) al receptor alfa de IL-4.

La Figura 6 muestra mediciones de BIAcore de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S191.5 K12; SEC ID Nº 3) al receptor alfa de IL-4. 15

La Figura 7 muestra mediciones de BIAcore de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S148.3 J14AM2C2; SEC ID Nº 4) al receptor alfa de IL-4.

La Figura 8 muestra mediciones de BIAcore de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S191.4 B24; SEC ID Nº 5) al receptor alfa de IL-4.

La Figura 9 muestra mediciones de BIAcore de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la 20 invención (S191.4 K19; SEC ID Nº 6) al receptor alfa de IL-4

La Figura 10 muestra mediciones de BIAcore de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención S191.5 H16; SEC ID Nº 7) al receptor alfa de IL-4.

La Figura 11 muestra mediciones de BIAcore de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S197.8 D22; SEC ID Nº 8) al receptor alfa de IL-4. 25

La Figura 12 muestra mediciones de ELISA de competición de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S148.3 J14; SEC ID Nº 2) al receptor alfa de IL-4.

La Figura 13 muestra mediciones de ELISA de competición de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S191.5 K12; SEC ID Nº 3) al receptor alfa de IL-4.

La Figura 14 muestra mediciones de ELISA de competición de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal 30 humana de la invención (S148.3 J14AM2C2; SEC ID Nº 4) al receptor alfa de IL-4.

La Figura 15 muestra mediciones de ELISA de competición de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S191.4 B24; SEC ID Nº 5) al receptor alfa de IL-4.

La Figura 16 muestra mediciones de ELISA de competición de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S191.4 K19; SEC ID Nº 6) al receptor alfa de IL-4. 35

La Figura 17 muestra mediciones de ELISA de competición de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S191.5 H16; SEC ID Nº 7) al receptor alfa de IL-4.

La Figura 18 muestra mediciones de ELISA de competición de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S197.8 D22; SEC ID Nº 8) al receptor alfa de IL-4.

La Figura 19 muestra un ensayo de proliferación celular de TF-1 en presencia de IL-4 o IL-13 y muteínas de 40 lipocalina lacrimal humana de la invención (S191.5 K12, S148.3 J14AM2C2, S191.4 B24, S191.4 K19, S191.5 H16, y S197.8 D22 SEC ID Nº: 3-8).

La Figura 20 muestra un mapa del vector de expresión pTLPC27 (SEC ID Nº 9).

La Figura 21 muestra un ensayo de proliferación con células endoteliales cultivadas de vena umbilical humana (HUVEC) en presencia de VEGF165 humano y muteínas de lipocalina lacrimal humana de la invención 45 (S209.2 C23, S209.2 D16, S209.2 N9, S209.6 H7, S209.6 H10, S209.2 M17, S209.2 O10 SEC ID Nº: 27-33), lipocalina lacrimal de tipo silvestre (producto génico de pTLPC10; control) o Avastin (Roche; control).

La Figura 22 muestra mediciones de BIAcore de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana PEGilada de

la invención (S148.3 J14; SEC ID Nº 2) al receptor alfa de IL-4.

La Figura 23 muestra mediciones de BIAcore de la unión de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S236.1-A22; SEC ID Nº 44) a VEGF8-109 inmovilizado.

La Figura 24 muestra mediciones de BIAcore de la unión de hVEGP8-109, hVEGF121, forma de corte y empalme hVEGF165 y el ortólogo de ratón respectivo mVEGF164 a la muteína de lipocalina lacrimal humana 5 S236.1-A22 (SEC ID Nº 44).

La Figura 25 muestra los resultados del ensayo de estabilidad de la muteína de lipocalina lacrimal S236.1-A22 (SEC ID Nº 44) en plasma humano y humor vítreo (Fig. 25 A) y los resultados de ensayos de estabilidad de una proteína de fusión de la muteína S236.1-A22 con un dominio de unión a albúmina (ABD) (SEC ID Nº 51) (Fig. 25B). 10

La Figura 26 muestra el vector de expresión pTLPC51 que codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia señal OmpA (OmpA), una lipocalina lacrimal humana mutada (Tlc), fusionada con un dominio de unión albúmina (abd), seguida de una etiqueta Strep-II.

La Figura 27 muestra mediciones de BIAcore de la unión de muteína de lipocalina lacrimal S236.1-A22 (SEC ID Nº 44) y una proteína de fusión de muteína S236.1-22 con ABD (SEC ID Nº 51) a VEGF recombinante. 15

La Figura 28 muestra la inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF mediante S236.1-A22 con ABD (SEC ID Nº 51) en ausencia o presencia de albúmina de suero humano (HSA).

La Figura 29 muestra la inhibición de la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales cultivadas de vena umbilical humana (HUVEC) mediante la muteína de lipocalina S236.1-A22 (SEC ID Nº 44) en comparación con la inhibición conseguida mediante Avastin y lipocalina lacrimal de tipo silvestre. 20

La Figura 30 muestra la inhibición de la activación de MAP quinasa mediada por VEGF en HUVEC mediante la muteína de lipocalina S236.1-A22 (SEC ID Nº 44) en comparación con la inhibición conseguida mediante Avastin.

La Figura 31 muestra los resultados de un ensayo de permeabilidad vascular con administración local de la muteína de lipocalina lacrimal S209.2_O10 (SEC ID Nº 33) en comparación con Avastin y lipocalina lacrimal de 25 tipo silvestre.

La Figura 32 muestra los resultados de un ensayo de CAM que compara la mediana del índice angiogénico para la muteína de lipocalina lacrimal S209.2_O10 SEC ID Nº 33) y Avastin y lipocalina lacrimal de tipo silvestre.

La Figura 33 muestra la concentración de muteína de lipocalina en plasma en ratones NMRI para la muteína de 30 lipocalina lacrimal S236.1-A22 (SEC ID Nº 44) y una proteína de fusión de muteína S236.1-A22 con ABD (SEC ID Nº 51).

La Figura 34 muestra los resultados de un ensayo de permeabilidad vascular después de la administración sistémica de una proteína de fusión de muteína de lipocalina lacrimal S236.1-A22 con ABD (SEC ID Nº 51) en comparación con lipocalina lacrimal de tipo silvestre, tampón PBS y Avastin. 35

La Figura 35 muestra los resultados de un modelo de xenoinjerto de tumor (ratones Swiss atímicos) para la administración intraperitoneal de una proteína de fusión de muteína de lipocalina lacrimal S236.1-A22 con ABD (SEC ID Nº 51) en comparación con lipocalina lacrimal de tipo silvestre, tampón PBS y Avastin.

La Figura 36 muestra los resultados de un ensayo de secreción de Eotaxina-3 con células A549 estimuladas con IL-40 4 o IL-13 en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de la muteína de unión al receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (SEC ID Nº 4).

La Figura 37 muestra la expresión de CD23 inducida por IL-4/IL-13 en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimuladas en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de la muteína de unión al receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (SEC ID Nº 4). 45

La Figura 38 muestra los resultados de un análisis de Schild de la muteína de unión al receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (SEC ID Nº 4).

La Figura 39 muestra el resultado de una evaluación de afinidad de la muteína de unión al receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (SEC ID Nº 4) para linfocitos B primarios humanos.

La Figura 40 muestra los resultados de un ensayo de biodisponibilidad de la muteína de unión al receptor alfa de IL-4 50 S191.4 B24 después de la administración intravenosa, subcutánea o intratraqueal.

La Figura 41 muestra una evaluación de la potencia in vitro de la muteína S236.1-A22 (SEC ID Nº 44) con y sin PEGilación con PEG20, PEG30 o PEG40 en un ensayo de proliferación de HUVEC estimuladas con VEGF.

La Figura 1 muestra el vector de expresión pTLPC10 que codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia señal OmpA (OmpA), la etiqueta de afinidad T7 y una lipocalina lacrimal humana mutada (Tlc), seguido de la 5 etiqueta Strep-II. Ambos sitios de restricción BstXI usadas para la clonación del casete génico mutado y los sitios de restricción que flanquean el gen estructural están marcados. La expresión génica está bajo el control del promotor/operador de tetraciclina (tetp/o). La trascripción se termina en el terminador de la transcripción de lipoproteína (tlpp). El vector comprende adicionalmente un origen de replicación (ori), la región intergénica del fago filamentoso f1 (fI-IG), el gen de resistencia a ampicilina (amp) y el gen represor de tetraciclina (tetR). Un segmento relevante de la secuencia de 10 ácido nucleico de pTLPC10 se reproduce junto con la secuencia de amino ácidos codificada en la lista de secuencias como SEC ID Nº1. El segmento comienza con el sitio de restricción Xbal y termina con el sitio de restricción HindIII. Los elementos del vector fuera de esta región son idénticos al vector pASK75, cuya secuencia de nucleótidos completa se proporciona en la publicación de patente alemana DE 44 17 598 A1.

La Fig. 2 muestra la estructura primaria de una muteína de lipocalina lacrimal humana de la invención (S148.3 15 J14) que muestra la afinidad de unión por el receptor alfa de IL-4. Los primeros 21 restos (subrayados) constituye la secuencia señal, que se escinde tras la expresión periplásmica. La etiqueta N-terminal de T7 (en cursiva) y la etiqueta Strep-II C-terminal (en negrita) son parte de la proteína caracterizada. La Fig. 2 también muestra que los restos aminoacídicos N-terminales (H1 H2 L3 A4), así como los dos últimos restos aminoacídicos C-terminales (S157 y D158) están delecionados en esta muteína ilustrativa de la invención. 20

La Fig. 3 muestra resultados de experimentos de exploración de afinidad. Se revistió la placa de ELISA con anticuerpo monoclonal anti-etiqueta Strep (Qiagen) para capturar las muteínas expresadas de lipocalina lacrimal humana y se detectó la unión del receptor alfa de IL-4-Fc (R&D Systems; 3 nM y 0,75 nM) a las muteínas capturadas usando un anticuerpo policlonal conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) contra el dominio Fc del receptor alfa de IL-4-Fc. Los clones con afinidad mejorada dieron señales mayores (izquierda). Se revistió la placa de ELISA con IL-4 y se 25 incubó el receptor alfa de IL-4-Fc (3 nM) con las muteínas expresadas. La unión del receptor alfa de IL-4-Fc que tenía un sitio de unión a IL-4 desocupado se detectó usando un anticuerpo policlonal conjugado con HRP contra el dominio de Fc del receptor alfa de IL-4-Fc. Los clones con afinidad antagonista mejorada dieron señales menores (derecha). Las señales que corresponden a la muteína de la invención S148.3 J14 (SEC ID Nº 2) están marcadas con flechas y las señales de clones individuales se representan por rombos. 30

La Fig. 4 muestra las secuencias polipeptídicas de las seis muteínas de lipocalina lacrimal humana con la mayor afinidad de unión por el receptor alfa de IL-4 (S191.5 K12, S148.3 J14AM2C2, S191.4 B24, S191.4 K19, S191.5 H16 y S197.8 D22 SEC ID Nº 3-8) obtenidas por maduración de afinidad de la SEC ID Nº 2 (S148.3 J 14). Los primeros 21 restos (subrayados) de la estructura primaria representada constituyen la secuencia señal, que se escinde tras la expresión periplásmica. La etiqueta Strep-II C-terminal (en negrita) es parte de la proteína caracterizada. La Figura 4 35 también muestra que, por ejemplo, los primeros 4 restos aminoacídicos N-terminales (HHLA), así como los dos últimos restos aminoacídicos C-terminales (SD) pueden delecionarse en una muteína de lipocalina lacrimal de la invención sin afectar a la función biológica de la proteína.

Las Fig. 5-11 muestran mediciones de BIAcore de las muteínas de lipocalina lacrimal humana con afinidad por el receptor alfa de IL-4 (S148.3 J14, S191.5 K12, S148.3 J14AM2C2, S191.4 B24, S191.4 K19, S191.5 H16 y S197.8 D22 40 SEC ID Nº 2-8. Se capturaron aproximadamente 400 UR del receptor alfa de IL-4-Fc en una microplaca CM-5, que se había revestido previamente con un anticuerpo monoclonal anti-Fc humano. Posteriormente, se pasó la muteína en diferentes concentraciones (Fig. 5: 20 nM; 40 nM; 80 nM, 160 nM; 320 nM) o en una concentración única de 25 nM (Fig. 6-11) sobre la celda de flujo y se registraron los cambios en unidades de resonancia. Las señales de referencia de una celda de flujo que se trató igual aparte de no tener ningún receptor alfa de IL-4-Fc se restaron y los datos resultantes se 45 ajustaron a un modelo de Langmuir 1:1 usando el programa informático BIAevalutation. Debido a la cinética de disociación lenta de la interacción en los experimentos ilustrados en las Fig. 6-11 se usó una doble referencia restando las señales de una celda de flujo que se trató de igual forma aparte de no tener ningún receptor alfa de IL-4-Fc, y restando la señal de un experimento en el que sólo se inyectó tampón de muestras. Los datos resultantes se ajustaron a un modelo de Langmuir 1:1 con limitación de transporte de masa usando el programa informático BIAevaluation. En las Figuras 6-11 se muestra el 50 resultado de un experimento representativo de cinco experimentos.

La Fig. 12 muestra mediciones de ELISA de competición de una muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por el receptor alfa de IL-4 (S148.3 J14; SEC ID Nº 2). Se revistió una placa de ELISA con IL-4 (20 g/ml) y se incubó receptor alfa de IL-4-Fc (15 nM) junto con diversas concentraciones de muteína de lipocalina lacrimal humana o anticuerpo monoclonal específico de receptor de IL-4 (MAB230, R&D Systems) durante 1 hora a temperatura 55 ambiente. Se administró después la mezcla de receptor alfa de IL-4-Fc y muteína a las placas revestidas con IL-4 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detectó el receptor alfa de IL-4-Fc unido con un anticuerpo de cabra anti-Fc

humano conjugado con HRP. Los datos se ajustaron a la expresión: 0,5*(-m0+m2-m1+raíz cuadrada((-m0+m2-ml)^2+4*m1*m2)). Se proporciona la Ki mediante la variable ml. Se muestra el resultado de un experimento representativo de tres.

Las Fig. 13-18 muestran mediciones de ELISA de competición de las muteínas de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por el receptor alfa de IL-4 y lipocalina lacrimal de tipo silvestre (TLPC10; producto génico de 5 pTLPC10) como control. Se revistió una placa de ELISA con anticuerpo monoclonal específico de receptor alfa de IL-4 MAB230 (R&D Systems) contra receptor de IL-4 y se incubó receptor alfa de IL-4 biotinilado (IL-4 R alfa-bio; 0,5 nM) junto con diversas concentraciones de las muteínas de la invención o TLPC10 durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de IL-4R alfa-bio y muteína se incubó en las placas revestidas con MAB230 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detectó el IL-4R alfa-bio unido con Extravidina-HRP. Los datos se ajustaron a la expresión: 0,5*(-m0+m2-10 m1+raíz cuadrada((-m0+m2-m1)2+4*m1*m2)). Se proporciona la KD mediante la variable ml. Se muestra el resultado de un experimento representativo de tres.

La Fig. 19 muestra los resultados de ensayos de proliferación de células TF-1. Se incubaron células TF-1 durante 1 hora a 37ºC con las muteínas indicadas, un anticuerpo monoclonal específico de receptor alfa de IL-4 o un control de isotipo de anticuerpo IgG2a en una serie de diluciones antes de la adición de IL-4 0,8 ng/ml (a, b) o IL-13 12 15 ng/ml (c, d) durante 72 horas. Se midió la proliferación mediante la incorporación de 3H-timidina.

La Fig. 20 muestra el vector fasmídico pTLPC27 que codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de señal OmpA (OmpA), Tlc seguido de la etiqueta Strep-II y una forma truncada de la proteína de cubierta de M13 pIII, que comprende los aminoácidos 217 a 406 (pIII). Un codón de terminación ámbar, que está parcialmente traducido a Gln en la cepa huésped supresora de ámbar SupE, se localiza entre la región codificante de Tlc, que incluye la 20 etiqueta Strep-II, y la región codificante de la proteína de cubierta de fago truncada pIII, para permitir la expresión soluble de la muteína Tlc sin la proteína de cubierta de M13 pIII cuando se emplea una cepa de E. coli no supresora. Ambos sitios de restricción de BstXI usados para la clonación del casete génico mutado y los sitios de restricción que flanquean el gen estructural están marcados. La expresión génica está bajo el control del promotor/operador de tetraciclina (tetp/o). La trascripción se termina en el terminador de transcripción de lipoproteína (tlpp). El vector comprende adicionalmente un 25 origen de replicación (ori), la región intergénica del fago filamentoso f1 (f1-IG), el gen de resistencia a cloranfenicol (cat) que codifica la cloranfenicol acetil transferasa y el gen represor de tetraciclina (tetR). Un segmento relevante de la secuencia de ácido nucleico de pTLPC27 se reproduce junto con la secuencia de aminoácidos codificada en la lista de secuencias como SEC ID Nº 9.

La Fig. 21 muestra los resultados de un ensayo de proliferación que emplea las muteínas de lipocalina lacrimal 30 humana con afinidad de unión por VEGF humano, lipocalina lacrimal de tipo silvestre (TLPC10) o el anticuerpo terapéutico específico de VEGF Avastin. Se sembraron aproximadamente 1400 células HUVEC en medio completo y después de una incubación durante 1 noche a 37ºC, las células se lavaron y se añadió medio basal que contenía FCS al 0,5%, hidrocortisona y gentamicina/anfotericina. Se añadió muteína específica de VEGF S209.2-C23, S209.2-D16, S209.2-N9, S209.6-H7, S209.6-H10, S209.2-O10 (SEC ID Nº 27-33), lipocalina lacrimal de tipo silvestre (producto génico de 35 pTLPC10; como control) o anticuerpo monoclonal específico de VEGF terapéutico Avastin (Roche; como control) a la concentración indicada en pocillos por triplicado. Después de 30 minutos, se añadió VEGF 165 humano o FGF-2 humano como un control para la proliferación no inducida por VEGF (no mostrado) y se evaluó la viabilidad de las células después de 6 días con el ensayo cromogénico CellTiter 96 Aqueous One (Promega).

La Fig. 22 muestra mediciones de Biacore de la muteína PEGilada S148.3 J14 (SEC ID Nº: 2) de lipocalina 40 lacrimal humana con afinidad por el receptor alfa de IL-4. Se capturan aproximadamente 400 UR de receptor alfa de IL-4-Fc en una microplaca CM-5, que se había revestido previamente con un anticuerpo monoclonal anti-Fc humano. Posteriormente, se pasó la muteína a diferentes concentraciones (200 nM; 67 nM; 22 nM) sobre la celda de flujo y se registraron los cambios en unidades de resonancia. Las señales de referencia de una celda de flujo que se trató igual aparte de no tener ningún receptor alfa de IL-4-Fc se restaron y los datos resultantes se ajustaron a un modelo de 45 Langmuir 1:1 usando el programa informático BIAevaluation.

La Fig. 23 muestra mediciones de Biacore ejemplares de la unión de muteína de lipocalina lacrimal humana S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44) a VEGF8-109 inmovilizado. Se inmovilizó VEGF8-109 en una microplaca CM5 usando química de amina convencional. Se aplicó muteína de lipocalina S236.1-A22 con un caudal de 30 l/minuto a seis concentraciones de 500 nM a 16 nM. Se realizó una evaluación de los sensogramas con el programa informático BIA T100 para determinar 50 las kon, koff y KD de la muteína.

La Fig. 24 muestra mediciones de afinidad de la muteína S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44) que se inmovilizó sobre una microplaca sensora con diferentes formas de VEGF. Las mediciones de afinidad se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 9 del documento WO 2006/56464 con las modificaciones de que la muteína estaba inmovilizada y se inyectaron 70 l de muestra que contenía las diferentes variantes de VEGF a una concentración de 250 nM. La 55 comparación cualitativa de los resultados ilustra que la forma truncada de hVEGF8-108 y hVEGF121 muestran básicamente sensogramas idénticos, lo que indica una afinidad similar hacia la muteína de lipocalina lacrimal S236.1-A22 (SEC ID Nº:

44). La forma de corte y empalme hVEGF165 también muestra una fuerte unión a la muteína de lipocalina, mientras que el ortólogo de ratón respectivo mVEGF164 tiene una afinidad ligeramente reducida.

La Fig. 25 muestra un ensayo de estabilidad de la muteína de unión a VEGF 5236.1-A22 a 37ºC en PBS y suero humano que se realizó esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 15 de la solicitud de patente Internacional WO2006/056464, excepto por que la concentración utilizada fue de 1 mg/ml. No se pudo detectar ninguna alteración de la 5 muteína durante el periodo de incubación de siete días en PBS según se juzgó mediante HPLC-SEC (datos no mostrados). La incubación de la muteína de lipocalina en suero humano dio como resultado una disminución de la afinidad después de 7 días hasta aproximadamente el 70% en comparación con la referencia (Fig. 25a). La estabilidad de la fusión con ABD de S236.1-A22 (SEC ID Nº: 51) en suero humano también se ensayó, como se ha descrito anteriormente. No pudo detectarse pérdida de actividad durante el periodo de incubación de 7 días (Figura 25b). 10

La Fig. 26 muestra el vector de expresión pTLPC51 que codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia señal OmpA, una lipocalina lacrimal humana mutada (T1c), fusionada con un dominio de unión a albúmina (abd), seguida de una etiqueta Strep II. Ambos sitios de restricción BstXI usados para la clonación del casete génico mutado y los sitios de restricción que flanquean el gen estructural están marcados. La expresión génica está bajo el control del promotor/operador de tetraciclina (tetp/o). La transcripción se termina en el terminador de transcripción de lipoproteína 15 (tIpp). El vector comprende adicionalmente un origen de replicación (ori), la región intergénica del fago filamentoso f1 (fl-IG), el gen de resistencia a ampicilina (amp) y el gen represor de tetraciclina (tetR). Se reproduce un segmento relevante de la secuencia de ácido nucleico de pTLPC51 junto con la secuencia de aminoácidos codificada en la lista de secuencias como SEC ID Nº: 48 y 49. El segmento comienza con el sitio de restricción Xbal y termina con el sitio de restricción HindIII. Los elementos del vector fuera de esta región son idénticos al vector pASK75, cuya secuencia de nucleótidos completa se 20 proporciona en la publicación de patente alemana DE 44 17 598 Al.

La Fig. 27 muestra mediciones de afinidad de la fusión con ABD de la muteína de lipocalina lacrimal S236.1-A22 (A22-ABD) (SEC ID Nº: 51) (200 pM) hacia el VGEF8-109 recombinante usando resonancia de plasmón superficial (Biacore). Las mediciones de afinidad se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 9 del documento WO 2006/56464 con las modificaciones de que aproximadamente 250 UR de VGEF8-109 recombinante se acoplaron 25 directamente a la microplaca sensora usando química convencional de amina y se inyectaron 40 l de la muteína a una concentración de 400 nM. Se descubrió que la afinidad básicamente no se alteró y se midió que era de 260 pM.

La Fig. 28 muestra un ensayo de la funcionalidad de la muteína de lipocalina A22-ABD (fusión con ABD de S236.1-A22) en presencia de albúmina de suero humano mediante la evaluación de su capacidad para inhibir la proliferación de HUVEC inducida por VEGF. Se propagaron HUVEC (Promocell) en placas revestidas de gelatina y se 30 usaron entre los pases P2 y P8. El día 1 se sembraron 1400 células por pocillo en una placa de 96 pocillos en medio completo. El día 2 se lavaron las células y se añadieron 100 l de medio basal que contenía FCS al 0,5%, hidrocortisona y gentamicina/anfotericina. Se estimuló la proliferación con VEGF165 20 ng/ml o FGF-2 10 ng/ml, que se mezclaron con la muteína de lipocalina S236.1-A22-ABD (SEC ID Nº: 51), se incubaron durante 30 minutos y se añadieron a los pocillos. Se determinó la viabilidad el día 6 y los resultados se expresaron como % de inhibición. Se añadió albúmina de suero humano 35 (HSA, 5 M) donde se indica. A HSA 5 M, se asocia >99,8% de la A22-ABD con HSA en cualquier momento dado.

La Fig. 29 muestra la inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF mediante muteínas de la invención. Se propagaron HUVEC (Promocell) en placas revestidas de gelatina y se usaron entre los pases P2 y P8. El día 1, se sembraron 1400 células por pocillo en una placa de 96 pocillos en medio completo. El día 2, las células se lavaron y se añadieron 100 l de medio basal que contenía FCS al 0,5%, hidrocortisona y gentamicina/anfotericina. Se 40 estimuló la proliferación con VEGF165 20 ng/ml o FGF-2 10 ng/ml, que se mezclaron con la muteína de lipocalina S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44), se incubaron durante 30 minutos y se añadieron a los pocillos. Se determinó la viabilidad el día 6 y los resultados se expresaron como % de inhibición.

La Fig. 30 muestra la inhibición de la activación de MAP Quinasa mediada por VEGF en HUVEC mediante muteínas de la presente invención. Se sembraron HUVEC en placas de 96 pocillos a 1400 células por pocillo en medio 45 convencional (Promocell, Heidelberg). El día siguiente, se redujo el FCS al 0,5% y se prolongó el cultivo durante 16 horas. Después se privó a las células de suero en BSA al 0,5% en medio basal durante 5 horas. Se estimuló a las HUVEC con VEGF165 (Realiatech, Braunschweig) durante 10 minutos en presencia de concentraciones crecientes de muteína de lipocalina lacrimal A22 o Avastin (bevacizumab, Genentech/Roche) para obtener una curva de respuesta a la dosis. Se cuantificó la fosforilación de las MAP quinasas ERK1 y ERK2 usando un ELISA de acuerdo con el manual del fabricante 50 (Active Motif, Rixensart, Bélgica). Se determinó que el valor de CI 50 era de 4,5 nM para la muteína A22 (SEC ID Nº: 44) y 13 nM para Avastin®.

La Fig. 31 muestra un ensayo de permeabilidad vascular con administración local de muteína de lipocalina lacrimal. Se afeitaron en el hombro y en el dorso cobayas Duncan-Hartley que pesaban 350  50 g. Los animales recibieron una inyección intravenosa a través de la vena de la oreja de 1 ml de colorante azul de Evan al 1%. Treinta 55 minutos después, se mezclaron 20 ng de VEGF165 (Calbiochem) con sustancia de ensayo o artículo de control a un exceso molar de diez veces y se inyectaron por vía intradérmica en una cuadrícula de 3 x 4. Treinta minutos después, se

sacrificaron los animales mediante asfixia con CO2. Una hora después de las inyecciones de VEGF, se retiró la piel que contenía el patrón de cuadrícula y se limpió de tejido conjuntivo. El área de extravasación del colorante se cuantificó mediante el uso de un analizador de imágenes (Image Pro Plus 1.3, Media Cybernetics).

La Fig. 32 muestra un ensayo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM). Se colocaron sobreimplantes de colágeno que contenían FGF-2 (500 ng), VEGF (150 ng) y muteína de lipocalina lacrimal (1,35 g) o Avastin (10 g) como 5 se indica sobre la CAM de embriones de pollo de 10 días (4/animal, 10 animales/grupo). A las 24 horas se volvió a aplicar la muteína de lipocalina lacrimal o Avastin por vía tópica al sobreimplante a la misma dosis. Después de 72 horas se recogieron los sobreimplantes y se capturaron imágenes. El porcentaje de cuadrículas positivas que contenían al menos un vaso se determinó por un observador a ciegas. La mediana del índice angiogénico se indica para los antagonistas de VEGF 5209.2-O10 (SEC ID Nº: 33) y Avastin®, así como el control de lipocalina lacrimal de tipo silvestre como la fracción 10 de cuadrículas positivas.

La Fig. 33 muestra la determinación de parámetros farmacocinéticos (PK) para A22 y A22-ABD en ratones. Los parámetros farmacocinéticos (PK) (semivida de la concentración en plasma, biodisponibilidad) para la muteína de lipocalina lacrimal S236.1 A22 (SEC ID Nº: 44) (4 mg/kg) después de la administración i.v. y la proteína de fusión de muteína S236.1 A22 con ABD (SEC ID Nº: 51) (5,4 mg/kg) después de una sola administración en embolada i.v. o i.p. se 15 determinaron en ratones NMRI. Se preparó el plasma de muestras de sangre terminales tomadas a puntos temporales predeterminados y se determinaron las concentraciones de la muteína de lipocalina mediante ELISA. Los resultados se analizaron usando el programa informático WinNonlin (Pharsight Corp., Mountain View, Estados Unidos). T1/2 A22 i.v.: 0,42 h; T1/2 A22-ABD i.v.: 18,32 h; T1/2 A22-ABD i.p.: 20,82 h. La biodisponibilidad después de la administración i.p. de la proteína de fusión A22-ABD fue del 82,5%. 20

La Fig. 34 muestra un ensayo de permeabilidad vascular con administración sistémica de muteína de lipocalina lacrimal. Doce horas antes del experimento, se inyectaron sustancias de ensayo o controles por vía intravenosa a 3 animales por grupo. Grupo 1: vehículo de PBS; Grupo 2: Avastin, 10 mg/kg; Grupo 3: muteína S236.1 A22-ABD, 6,1 mg/kg; Grupo 4: TLPC51: 6,1 mg/kg. Se inyectó azul de Evan a tiempo = 0. Treinta minutos después, se inyectaron 4 dosis de VEGF (5, 10, 20 ó 40 ng) por vía intradérmica por triplicado en una cuadrícula de 3 x 4. Treinta minutos después 25 de las inyecciones de VEGF, los animales se sacrificaron y se cuantificó la extravasación de colorante mediante el uso de un analizador de imágenes (Image Pro Plus 1.3, Media Cybernetics).

La Fig. 35 muestra el efecto de las muteínas de la invención en un modelo de xenoinjerto de tumor. Se inoculó a ratones atímicos Swiss irradiados (2,5 Gy, Co60) por vía subcutánea 1 x 107 células de rabdomiosarcoma A673 (ATTC) en matrigel en el flanco derecho (n = 12 por grupo). Se administraron tratamientos por vía intraperitoneal y se iniciaron el 30 mismo día y continuaron durante 21 días. Grupo 1: vehículo de PBS, diariamente; Grupo 2: Avastin (bevacizumab, Genentech/Roche), 5 mg/kg cada 3 días; Grupo 3: muteína de lipocalina A22-ABD (SEC ID Nº: 51), diariamente, 3,1 mg/kg; Grupo 4: TLPC51, diariamente, 3,1 mg/kg. La dosis de la muteína de lipocalina A22-ABD se seleccionó para conseguir la presencia constante de un número equimolar de sitios de unión a VEGF de la muteína y Avastin basándose en los datos de PK de A22-ABD y semivida en suero estimada de anticuerpos en ratones. El tamaño del tumor se midió 35 dos veces por semana con un calibrador y se estimó el volumen tumoral de acuerdo con la fórmula (longitud x anchura2)/2. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen tumoral superó los 2.000 mm3.

La Fig. 36 muestra los resultados de un ensayo de secreción de Eotaxina-3 con células A549. Las células A549 se estimularon con IL-4 0,7 nM o IL-13 0,83 nM, respectivamente, en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de la muteína de unión al receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (SEC ID Nº: 4). La secreción de Eotaxina-3 se evaluó después 40 de 72 horas midiendo las concentraciones de Eotaxina 3 en el sobrenadante de cultivo celular usando un kit disponible en el mercado.

La Fig. 37 muestra la expresión de CD23 inducida por IL-4/IL-13 sobre células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimuladas después de 48 horas en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de la muteína de unión al receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (SEC ID Nº: 4). Se aislaron PBMC humanas totales de la capa 45 leucoplaquetaria. Se añadieron concentraciones de la muteína de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 y se estimuló a las células con IL-4 y IL-13 a concentraciones finales de 1,0 nM o 2,5 nM, respectivamente. Después de 48 horas, se cuantificaron los monocitos CD14+ que expresaban CD23 activados mediante citometría de flujo.

La Fig. 38 muestra los resultados de un análisis de Schild de la muteína de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (SEC ID Nº: 4). Se evaluó la proliferación dependiente de dosis de IL-4 de células TF-1 en ausencia o presencia de 50 varias concentraciones fijas de la muteína de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (Fig. 38A). El análisis de Schild de los resultados obtenidos (Fig. 38B) produjo una Kd de 192 pM (regresión lineal) y 116 pM (regresión no lineal).

La Fig. 39 muestra el resultado de una evaluación de afinidad de la muteína de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (SEC ID Nº: 4) para linfocitos B primarios humanos. Las PBMC se aislaron de sangre humana y se incubaron con diferentes concentraciones de la muteína de lipocalina lacrimal humana de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 o 55 la lipocalina lacrimal humana de tipo silvestre (TLPC26). Las células se tiñeron después con anticuerpos monoclonales

anti-CD20-FITC y un antisuero anti-lipocalina biotinilado, seguido de estreptavidina-PE. Los resultados para la lipocalina de tipo silvestre y la muteína de lipocalina de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 se muestran en las Figs. 39A y B, respectivamente. El porcentaje determinado de linfocitos B positivos a PE se ajustó frente a la concentración de las lipocalinas (Fig. 39C) y se calculó la CE50 a partir de la curva obtenida. La CE50 de la muteína de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (SEC ID Nº: 4) se calculó como 105 pM. 5

La Fig. 40 muestra los resultados de un ensayo de biodisponibilidad de la muteína de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 después de la administración intravenosa, subcutánea o intratraqueal. Ratas Sprague-Dawley recibieron una dosis única de la muteína S191.4 B24 a 4 mg/kg a través de las vías indicadas. La administración intratraqueal se realizó con un dispositivo de dosificación de micropulverización (PennCentury, Estados Unidos). Se obtuvieron muestras de plasma a puntos temporales predeterminados y se sometieron a un análisis de Elisa tipo sándwich para determinar las 10 concentraciones restantes de la muteína funcionalmente activa. Las concentraciones se analizaron mediante análisis de PK no compartimental. La biodisponibilidad fue del 100% después de la administración subcutánea y del 13,8% después del suministro intratraqueal.

La Fig. 41 muestra una evaluación de potencia in vitro de la muteína S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44) PEGilada o no PEGilada con PEG20, PEG30 o PEG40 en comparación con lipocalina lacrimal humana de tipo silvestre (wt). Los valores 15 de CI50 se determinaron mediante valoración de la muteína de lipocalina lacrimal humana respectiva en un ensayo de proliferación de HUVEC estimuladas con VEGF y determinando la inhibición de la proliferación.

Ejemplos

A menos que se indique otra cosa, se usaron los procedimientos establecidos de tecnología génica recombinante, por ejemplo, como se describe en Sambrook y col. (mencionado anteriormente). 20

Ejemplo 1: Generación de una biblioteca con 2x109 muteínas de Tlc independientes

Se preparó una biblioteca aleatoria de lipocalina lacrimal (Tlc) con alta complejidad mediante mutagénesis concertada de las 18 posiciones aminoacídicas seleccionadas 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 56, 57, 58, 80, 83, 104, 105, 106 y 108 de la lipocalina lacrimal humana de tipo silvestre madura. Con este fin, se ensambló un casete génico en el que los codones correspondientes se aleatorizaron de un modo dirigido mediante reacción en cadena de la polimerasa 25 (PCR) con oligodesoxinucleótidos cebadores degenerados en dos etapas de acuerdo con una estrategia descrita anteriormente (Skerra; A. (2001) “Anticalins”: a new class of engineered-ligand-binding proteins with antibody-like properties. J. Biotechnol. 74, 257-275). En este diseño de biblioteca los primeros 4 restos aminoacídicos N-terminales (HHLA), así como los dos últimos restos aminoacídicos C-terminales (SD) de la secuencia de tipo silvestre de la lipocalina lacrimal estaban delecionados (por este motivo, todas las muteínas de lipocalina lacrimal mostradas en la lista de 30 secuencias adjunta tienen la Ala5 de la secuencia de tipo silvestre como resto N-terminal y Gly156 como resto C-terminal (este último fusionado opcionalmente con una etiqueta de afinidad, por ejemplo).

En la primera etapa de la generación de la biblioteca aleatoria, se preparó un fragmento de PCR con codones aleatorizados para el primer y segundo bucle expuestos de Tlc usando los cebadores TLA6 (SEC ID Nº: 10) y TL47 (SEC ID Nº: 11) mientras que se preparaba en paralelo otro fragmento de PCR con codones aleatorizados para el tercer y 35 cuarto bucles expuestos de Tlc usando los cebadores TLA48 (SEC ID Nº: 12) y TL49 (SEC ID Nº: 13). En la segunda etapa estos dos fragmentos de PCR se combinaron con un oligodesoxinucleótido de conexión y se usaron como moldes en una reacción de PCR con los cebadores AN-14 (SEC ID Nº: 14), TL50 bio (SEC ID Nº: 15) y TL51 bio (SEC ID Nº: 16) para producir el casete génico aleatorizado ensamblado.

Las dos reacciones de PCR (1a y 1b) para la primera etapa se realizaron cada una en un volumen de 100 l 40 usando 10 ng de ADN del plásmido pTLPC10 (Fig. 1) para cada reacción como molde, junto con 50 pmoles de cada par de cebadores (TL46 y TL47 o TL48 y TL49, respectivamente), que se sintetizaron de acuerdo con el procedimiento de fosforamidita convencional. Además, la mezcla de reacción contenía 10 l de tampón de reacción de Taq 10x (Tris/HCl 100 mM pH 9,0, KCl 500 mM, MgCl2 15 mM, Triton X-100 al 1% v/v) y 2 l de mezcla de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 mM). Después de llevarlo hasta el volumen con agua, se añadieron 5 U de ADN polimerasa Taq (5 U/l, 45 Promega) y se llevaron a cabo 20 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 58ºC y 1,5 minutos a 72ºC en termociclador programable con una tapa caliente (Eppendorf), seguidos de una incubación durante 5 minutos a 60ºC para la finalización. Los productos de amplificación con el tamaño deseado de 135 pb y 133 pb, respectivamente, se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa preparativo usando agarosa GTQ (Roth) y el kit de extracción de ADN Wizard (Promega).

Para la segunda etapa de PCR se preparó una mezcla de 1000 l, en la que se usaron aproximadamente 500 50 fmol de ambos fragmentos de las reacciones de PCR 1a y 1b como moldes en presencia de 500 pmoles de cada uno de los cebadores flanqueantes TL50 bio (SEC ID Nº: 15) y TL51 bio (SEC ID Nº: 16) y 10 pmoles del cebador de mediación AN-14 (SEC ID Nº: 14). Ambos cebadores flanqueantes portaban un grupo de biotina en sus extremos 5’, permitiendo de este modo la separación del producto de PCR después de la escisión con BstXI de producto digerido incompletamente mediante perlas paramagnéticas revestidas con estreptavidina. Además, la mezcla de reacción contenía 100 l de tampón 55 de Taq 10x, 20 l de mezcla de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 mM), 50 U de ADN polimerasa Taq (5 U/l,

Promega) y agua para llevarla hasta el volumen final de 1000 l. La mezcla se dividió en alícuotas de 100 l y se realizó una PCR con 20 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 57ºC, 1,5 minutos a 72ºC, seguido de una incubación final durante 5 minutos a 60ºC. El producto de PCR se purificó usando el kit E.Z.N.A. Cycle-Pure (PeqLab).

Para la clonación posterior, este fragmento que representa la parte central de la biblioteca de muteínas de Tlc en forma de ácido nucleico se cortó primero con la enzima de restricción BstXI (Promega) de acuerdo con las instrucciones 5 del fabricante y se purificó después mediante electroforesis en gel de agarosa preparativo como se ha descrito anteriormente, dando como resultado un fragmento de ADN bicatenario de un tamaño de 301 pares de bases.

Los fragmentos de ADN no digeridos o incompletamente digeridos se eliminaron mediante sus etiquetas de biotina 5’ usando perlas paramagnéticas revestidas con estreptavidina (Merck). Con este fin, se lavaron 150 l de la suspensión disponible en el mercado de partículas paramagnéticas revestidas con estreptavidina (a una concentración de 10 10 mg/ml) tres veces con 100 l de tampón TE (Tris/HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1mM). Las partículas se escurrieron después con la ayuda de un imán y se mezclaron con 70 pmoles del fragmento de ADN digerido en 100 l de tampón TE durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las partículas paramagnéticas se recogieron después en la pared del recipiente Eppendorf con la ayuda de un imán y se recuperó el sobrenadante que contenía el fragmento de ADN completamente digerido purificado para su uso en la siguiente reacción de ligación. 15

El vector pTLPC27 (Fig. 20) se cortó con la enzima de restricción BstXI (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y el fragmento de vector grande obtenido se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa preparativo como se ha descrito anteriormente, dando como resultado un fragmento de ADN bicatenario de un tamaño de 3772 pares de bases que representa la cadena principal del vector.

Para la reacción de ligación, se incubaron 40 pmoles del fragmento de PCR y 40 pmoles de fragmento de vector 20 (pTLPC27) en presencia de 1074 Unidades Weiss de ADN ligasa de T4 (Promega) en un volumen total de 10,76 ml (Tris/HCl 50 mM pH 7,8, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, BSA 50 mg/ml) durante 48 horas a 16ºC. El ADN en la mezcla de ligación se precipitó después 1,5 horas mediante la adición de 267 l de ARNt de levadura (solución de 10 mg/ml en H2O (Roche)), 10,76 ml de acetato de amonio 5 M y 42,7 ml de etanol. Después de la precipitación, el sedimento de ADN se lavó con EtOH al 70% y después se secó. Al final el ADN se disolvió hasta una concentración final de 200 25 g/ml en un volumen total de 538 l de agua.

La preparación de células bacterianas electrocompetentes de la cepa de E. coli XL1-Blue (Bullock y col., mencionado anteriormente) se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos descritos por Tung y Chow (Trends Genet. 11 (1995), 128-129) y por Hengen (Trends Biochem. Sci. 21 (1996), 75-76). Se ajustó el medio 11LB (Bacto Triptona 10 g/l, Bacto Extracto de Levadura 5 g/l, NaCl 5 g/l, pH 7,5) a una densidad óptica a 600 nm de DO600 = 0,08 mediante la 30 adición de un cultivo de una noche de XL1-Blue y se incubó a 140 rpm y 26ºC en un matraz Erlenmeyer 21. Después de alcanzar una DO600 = 0,6, el cultivo se enfrió durante 30 minutos en hielo y se centrifugó posteriormente durante 15 minutos a 4000 g y 4ºC. Las células se lavaron dos veces con 500 ml de glicerol helado al 10% p/v y finalmente se resuspendieron en 2 ml de medio GYT helado (glicerol al 10% p/v, extracto de levadura al 0,125% p/v, triptona al 0,25% p/v). Las células se repartieron después en alícuotas (200 l), se congelaron por choque en nitrógeno líquido y se 35 almacenaron -80ºC.

Se realizó una electroporación con un sistema Micro Pulser (Biorad) junto con cubetas del mismo proveedor (distancia de electrodo de 2 mm) a 4ºC. Se mezclaron alícuotas de 10 l de la solución de ADN ligada (que contenía 1 g de ADN) con 100 l de la suspensión celular, se incubaron primero durante 1 minuto en hielo y después se transfirieron a la cubeta previamente enfriada. Se realizó la electroporación usando parámetros de 5 ms e intensidad de campo de 12,5 40 kV/cm y la suspensión se diluyó inmediatamente después en 2 ml de medio SOC helado (Bacto Triptona 20 g/l, Bacto Extracto de Levadura 5 g/l, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, pH 7,5, esterilizado en autoclave, antes de la electroporación se añadieron 10 ml/l de MgCl2 1 M y MgSO4 1 M con 20 ml/l de glucosa al 20%), seguido de incubación durante 60 minutos a 37ºC y 140 rpm. Después de eso, se diluyó el cultivo en 2 l de medio 2 x YT (Bacto Triptona 16 g/l, Bacto Extracto de Levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l, pH 7,5) que contenía cloranfenicol 100 g/ml (2 YT/Cam), dando como resultado una DO550 45 de 0,26. El cultivo se incubó a 37ºC hasta que la DO550 había aumentado de nuevo 0,6 unidades.

Empleando un total de 107,6 g de ADN ligado en 54 ejecuciones de electroporación, se obtuvieron un total de aproximadamente 2,0 x 109 transformantes. Los transformantes se usaron adicionalmente para la preparación de fagémidos que codifican la biblioteca de las muteínas de Tlc como proteínas de fusión.

Para la preparación de la biblioteca de fagémidos, se infectaron 41 de los cultivos anteriores con 1,3 x 1012 ufp 50 de fago auxiliar VCS-M13 (Stratagene). Después de la agitación a 37ºC durante 45 minutos, la temperatura de incubación se redujo a 26ºC. Después de 10 minutos de equilibrado de la temperatura se añadió anhidrotetraciclina 25 g/l para inducir expresión génica de la proteína de fusión entre las muteínas de Tlc y la proteína de cubierta de fago. La producción de fagémido se permitió durante 11 horas a 26ºC. Después de la retirada de las bacterias mediante centrifugación se precipitaron los fagémidos del sobrenadante de cultivo dos veces con polietilenglicol 8000 al 20% (p/v) (Fluka), NaCl al 55 15% (p/v) y finalmente se disolvieron en PBS (KH2PO4 4 mM, Na2HPO4 16 mM, NaCl 115 mM).

Ejemplo 2: Presentación de fagémidos y selección de muteínas de Tlc con afinidad por el receptor alfa de IL-4

La presentación y selección de fagémidos se realizó empleando los fagémidos obtenidos del Ejemplo 1 esencialmente como se describe en el documento WO 2006/56464 Ejemplo 2 con las modificaciones siguientes: La proteína diana (el receptor alfa de IL-4, Peprotech) se empleó a una concentración de 200 nM y se presentó a la biblioteca como una proteína biotinilada con captura posterior del complejo de fago-diana usando perlas de estreptavidina (Dynal). 5 Como alternativa, la proteína diana se empleó como proteína de fusión con Fc (receptor alfa de IL-4-Fc, R&D Systems) a una concentración de 200 nM y posterior captura del complejo de fago-diana usando perlas de proteína G (Dynal) y mediante inmovilización de la proteína de fusión con Fc en Immunostick (Nunc) revestidos con anticuerpo de captura anti-Fc humano (Jackson Immuno Research) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron tres o cuatro rondas de selección. 10

Ejemplo 3: Identificación de muteínas específicas del receptor alfa de IL-4 usando una exploración de ELISA de alto rendimiento

La exploración de las muteínas seleccionadas de acuerdo con el Ejemplo 2 se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 3 del documento WO 2006/56464 con las siguientes modificaciones: El vector de expresión fue pTLPC10 (Fig. 1). La proteína diana usada fue el receptor alfa de IL-4-Fc (R&D Systems) y el receptor alfa de IL-4 15 (Peprotech) ambos a 2 g/ml.

La exploración de 5632 clones, seleccionados como se describe en el Ejemplo 2, condujo a la identificación de 2294 éxitos primarios, indicando que había tenido lugar el aislamiento exitoso de muteínas de la biblioteca. Usando este enfoque se identificó el clon S148.3 J14 (SEC ID Nº: 2). La secuencia de S148.3 J14 también está representada en la Figura 2. 20

Ejemplo 4: Maduración de afinidad de la muteína S148.3 J14 usando PCR propensa a errores

La generación de una biblioteca de variantes basándose en la muteína S 148.3 J14 (SEC ID Nº: 2) se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 5 del documento WO 2006/56464 usando los oligonucleótidos TL50 bio (SEC ID Nº: 15) y TL51 bio (SEC ID Nº: 16) dando como resultado una biblioteca con 3 sustituciones por gen estructural de media. 25

Se llevó a cabo una selección de fagémidos como se describe en el Ejemplo 2 pero empleando una concentración de diana limitada (2 nM, 0,5 nM y 0,1 nM de receptor alfa de IL-4, (Peprotech Ltd), tiempos de lavado prolongados junto con un anticuerpo monoclonal antagonista contra receptor alfa de IL-4 (MAB230, R&D Systems; 1 hora de tiempo de lavado y 2 horas de tiempo de lavado) o tiempos de incubación cortos (30 segundos, 1 minuto y 5 minutos). Se realizaron tres o cuatro rondas de selección. 30

Ejemplo 5: Maduración de afinidad de la muteína S 148.3 J14 usando un enfoque aleatorio dirigido

Se diseñó una biblioteca de variantes basándose en la muteína S148.3 J14 (SEC ID Nº: 2) mediante aleatorización de las posiciones 34, 53, 55, 58, 61, 64 y 66 para permitir los 20 aminoácidos en estas posiciones. La biblioteca se construyó esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 con la modificación de que se usaron los desoxinucleótidos TL70 (SEC ID Nº: 17), TL71 (SEC ID Nº: 18) y TL72 (SEC ID Nº: 19) en lugar de TL46, TL 47 y AN-14, 35 respectivamente.

La selección de fagémidos se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 2 usando una concentración de diana limitada (0,5 nM y 0,1 nM de receptor alfa de IL-4, Peprotech), combinada con tiempos de lavado prolongados junto con un anticuerpo monoclonal competitivo contra el receptor alfa de IL-4 (MAB230, R&D Systems; lavado de 1 hora) o tiempos de incubación cortos (10 minutos), respectivamente. Se realizaron tres o cuatro rondas de selección. 40

Ejemplo 6: Exploración de afinidad de muteínas de unión a receptor alfa de IL-4 usando exploración de ELISA de alto rendimiento

La exploración se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 3 con la modificación de que se usó una concentración de receptor alfa de IL-4-Fc 3 nM (R&D Systems) y las adiciones de que i) se revistió la placa de ELISA con un anticuerpo monoclonal anti-etiqueta Strep (Qiagen) para capturar las muteínas producidas y se detectó la unión de 45 receptor alfa de IL-4-Fc (R&D Systems, 3 nM y 0,75 nM) a las muteínas capturadas de lipocalina lacrimal usando un anticuerpo policlonal conjugado con HRP (peroxidasa de rábano rusticano) contra el dominio Fc del receptor alfa de IL-4-Fc. Adicionalmente, en una preparación de exploración alternativa ii) se revistió la placa de ELISA con IL-4 y se incubó el receptor alfa de IL-4-Fc (R&D Systems, 3 nM) con las muteínas expresadas y se detectó la unión del receptor alfa de IL-4-Fc con un sitio de unión a IL-4 desocupado usando un anticuerpo policlonal conjugado con HRP contra el dominio Fc del 50 receptor alfa de IL-4-Fc.

Un resultado de tal exploración se representa en la Figura 3. Se identificó un gran número de muteínas seleccionadas como se describe en los Ejemplos 4 y 5 que tenían una afinidad mejorada por el receptor alfa de IL-4 en comparación con la muteína S148.3 J14 (SEC ID Nº: 2) que sirvió como la base para la maduración de afinidad. Usando

este enfoque se identificaron las muteínas S191.5 K12, S191.4 B24, S191.4 K19, S191.5 H16, S197.8 D22 y S148.3 J14 (SEC ID Nº: 3-8). Las secuencias de S191.5 K12, S191.4 B24, S191.4 K19, S191.5 H16, S197.8 D22 y S148.3 J14AM2C2 también están representadas en la Figura 4.

Ejemplo 7: Producción de muteínas de unión al receptor alfa de IL-4

Para la producción preparativa de muteínas específicas de receptor alfa de IL-4, se cultivó E. coli K12 cepa JM83 5 que portaba la muteína respectiva codificada en el vector de expresión pTLPC10 (Fig. 1) en un cultivo de matraz en agitación de 2 l en medio de LB-Ampicilina de acuerdo con el protocolo descrito en Schlehuber, S. y col. (J. Mol. Biol. (2000), 297, 1105-1120). Cuando eran necesarias cantidades mayores de proteína, se utilizó la cepa de E. coli W3110 que portaba el vector de expresión respectivo para la producción periplásmica mediante cultivo en un fermentador de sobremesa en un recipiente de 11 l o 10 l basándose en el protocolo descrito en Schiweck, W., y Skerra, A. Proteins 10 (1995) 23, 561-565).

Las muteínas se purificaron a partir de la fracción periplásmica en una etapa única mediante cromatografía de afinidad de estreptavidina usando una columna de volumen de lecho apropiado de acuerdo con el procedimiento descrito por Skerra, A. y Schmidt, T. G. M. (2000) (Use of the Strep-tag and streptavidin for detection and purification of recombinant proteins. Methods Enzymol. 326A, 271-304). Para conseguir una mayor pureza y para eliminar cualquier 15 proteína recombinante agregada, se llevó a cabo finalmente una filtración en gel de las muteínas en una columna Superdex 75 HR 10/30 (volumen de lecho de 24 ml, Amersham Pharmacia Biotech) en presencia de tampón PBS. Las fracciones de proteína monomérica se agruparon, se comprobó su pureza mediante SDS-PAGE y se usaron para su caracterización bioquímica adicional.

Ejemplo 8: Medición de afinidad usando Biacore 20

Las mediciones de afinidad se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 9 del documento WO 2006/56464 con las modificaciones de que se inmovilizaron aproximadamente 400 UR de receptor alfa de IL-4-Fc (R&D Systems) (en lugar de 2000 UR de CTLA-4 humano o CTLA-4 murino-Fc usados como diana en el documento WO 2006/56464) y que se inyectaron 100 l de muteína a una concentración de 25 nM (en lugar de 40 l de muteínas de lipocalina purificadas de muestra en concentraciones de 5-0,3 M como se usan en el documento WO 2006/56464). 25

Se representan los resultados de las mediciones de afinidad que emplean S148.3 J14, S191.5 K12, S191.4 B24, S191.4 K19, S191.5 H16, S197.8 D22 y S148.3 J14AM2C2 en las Figuras 5-11 y se resumen en la Tabla I.

Tabla I. Afinidades de muteínas seleccionadas de la invención por el receptor alfa de IL-4 según se determinó mediante Biacore. Se muestran las medias (desviación típica) de cinco experimentos.

Clon

Afinidad de Biacore (pM) kon (1/Ms x 105) koff (1/s x 10-5)

S148.3 J14

37500 1,4 517

S191.5 K12

13,5 (2,9) 58 (27) 7,7 (3,3)

S148.3 AM2C2

17,9 (2,7) 23 (1,7) 4,2 (0,7)

S191.4 B24

19,3 (3,3) 26 (6,7) 4,9 (1,0)

S191.4 K19

20,1 (14) 17 (2,7) 3,6 (2,8)

S191.5 H16

24,3 (12) 17 (1,8) 4,1 (1,6)

S197.8 D22

55,8 (4,2) 11 (1,3) 6,3 (1,0)

30

Ejemplo 9: identificación de antagonistas de IL-4 usando un ELISA de inhibición

Se evaluó la inhibición de la interacción entre IL-4 y el receptor alfa de IL-4 mediante las muteínas seleccionadas en un ELISA de inhibición. Por lo tanto, se incubó una concentración constante de receptor alfa de IL-4 (receptor alfa de IL-4 biotinilado 0,5 nM, Peprotech o receptor alfa de IL-4-Fc 15 nM, R&D Systems) con una serie de diluciones de muteína de lipocalina lacrimal, y se cuantificó la cantidad de receptor alfa de IL-4 con un sitio de unión a IL-4 desocupado en un 35 ELISA en el que la placa se había revestido con IL-4 o un anticuerpo monoclonal anti-receptor alfa de IL-4 antagonista. Se detectó el receptor alfa de IL-4 biotinilado unido usando Extravidina conjugada con HRP (Sigma) y se comparó con una curva patrón de cantidades definidas de receptor alfa de IL-4 biotinilado. Los resultados de las mediciones que emplean las muteínas de S148.3 J14, S191.5 K12, S191.4 B24, S191.4 K19, S191.5 H16, S197.8 D22 y S148.3 J14AM2C2 se representan en las Figuras 12-18 y se resumen en la Tabla II. 40

Tabla II: Capacidad antagonista y afinidades por el receptor alfa de IL-4 de muteínas de lipocalina lacrimal seleccionadas

de la invención según se determinó mediante ELISA de competición. Se muestran las medias (desviación típica) de tres experimentos.

Clon

Afinidad de ELISA de Competición (pM)

S148.3 J14

17300

S191.5 K12

25,3 (9,9)

S148.3 AM2C2

40,7 (14,8)

S191.4 B24

49,2 (14)

S191.4 K19

120 (32)

S191.5 H16

61,7 (11,4)

S197.8 D22

140 (37)

Ejemplo 10: Identificación de antagonistas de la señalización de IL-4 e IL-13 usando un ensayo de proliferación de TF-1 5

Se realizaron ensayos de proliferación de células TF-1 estimuladas con IL-4 e IL-13 esencialmente como se describe en Lefort y col. (Lefort S., Vita N., Reeb R., Caput D., Ferrara P. (1995) FEBS Lett. 366(2-3), 122-126). Los resultados de un ensayo de proliferación de TF-1 se representan en la Figura 19 y muestran que las variantes de alta afinidad S191.5 K12, S191.4 B24, S191.4 K19, S191.5 H16, S197.8 D22 y S148.3 J14AM2C2 son antagonistas potentes de IL-4, así como de la señalización y proliferación inducida por IL-13. 10

Ejemplo 11: Las muteínas anti-receptor alfa de IL-4 de lipocalina lacrimal humana inhiben la ruta mediada por STAT6

Se cultivaron células TF-1 en RPMI 1640 que contenía suero de ternera fetal inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 g/ml y complementado con factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos humano recombinante 2 ng/ml. Se sembraron las células a 5 x 104 células/ml en un 15 volumen total de 20 ml de medio en placas de cultivo tisular de 100 mm de diámetro, se dividieron y se volvieron a sembrar a esta concentración cada 2 a 3 días y se cultivaron a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO2 al 5%.

Se recogieron las células TF-1 mediante centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos y se lavaron dos veces mediante centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos en RPMI 1640 que contenía suero de ternera fetal inactivado por calor al 1%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 g/ml (RPMI-FCS al 1%). Se 20 resuspendieron las células a 1 x 106 células/ml en RPMI-FCS al 1%, se sembraron a 1 ml en placas de 24 pocillos y se cultivaron durante una noche. El día siguiente, se cultivaron las células TF-1 durante 1 hora con 20 g/ml de muteínas específicas de receptor alfa de IL-4 o muteínas de control negativo. Se cultivaron alícuotas adicionales de células con medio solamente durante 1 hora a 37º C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% en aire. Posteriormente, se añadieron IL-4 o IL-13 recombinante humana a una concentración final de 0,8 ng/ml o 12 ng/ml respectivamente y se 25 incubaron los cultivos durante 10 minutos a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% en aire.

Las células se fijaron durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) mediante la adición de 42 l de formaldehído al 37% (concentración final del 1,5%) y se trasfirieron a tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml (BD Falcon). Las células se lavaron con 2 ml de PBS que contenía FCS al 1% (PBS-FCS), se sedimentaron por centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante. Se permeabilizaron las células mediante la adición de 500 l 30 de metanol helado mientras se agitaba vorticialmente enérgicamente. Después de 10 minutos de incubación a 4ºC las células se lavaron dos veces mediante centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos con 2 ml de PBS-FCS. Las células se resuspendieron en 100 l de PBS-FCS y se tiñeron con 20 l de anticuerpo anti-STAT-6 fosforilada marcado con ficoeritrina (PE) (clon Y641; BD Biosciences) durante 30 minutos a TA protegidas de la luz. Finalmente, las células se lavaron dos veces con 2 ml de PBS-FCS por centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en 500 l 35 de PBS-FCS. Las células se analizaron mediante citometría de flujo usando un citómetro FACScalibur (BD Biosciences). Se recogieron datos de al menos 10000 células seleccionadas.

La capacidad de las muteínas específicas del receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (SEC ID Nº 5) y S191.4 K19 (SEC ID Nº 6) para inhibir la fosforilación de STAT-6 mediada por IL-4 e IL-13 en células TF-1 se midió mediante citometría de flujo. Se estableció una ventana de análisis sobre células intactas para excluir el 99% de la población no 40 teñida de control basándose en los valores de FL2 (fluorescencia de canal 2; intensidad de PE) usando células TF-1 de control (no estimuladas y no teñidas) basándose en el tamaño celular (dispersión frontal; FSC) y la granularidad celular (dispersión lateral; SSC). Se tiñó una alícuota adicional de células no estimuladas con anticuerpo anti-STAT6 fosforilada marcado con PE.

Los resultados del ensayo de fosforilación de STAT-6 muestran claramente que las muteínas específicas del receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 y S191.4 K19 inhiben de forma notable la fosforilación de STAT-6 inducida por IL-4 e IL-13 en células TF-1 (datos resumidos en la Tabla III).

Tabla III. Se midió la capacidad de S191.4 B24 y S191.4 K19 (SEC ID Nº 5 y 6) para inhibir la fosforilación de STAT-6 inducida en células TF por IL-4 e IL-13 mediante citometría de flujo. Se representa el porcentaje de células seleccionadas 5 con tinción positiva para fosforilación de STAT-6 y la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) de todas las células seleccionadas.

Tratamiento

% Positivas MFI

No teñidas

1 3,8

Teñidas no estimuladas

6 5,8

IL-4

75 15,8

IL-13

77 16,4

pTLPC10 + IL-4 (control neg.)

72 13,1

pTLPC10 + IL-13 (control neg.)

84 18,6

S191.4 K19 + IL-4

6 4,9

S191.4 K19 + IL-13

8 5,0

S191.4 K24 + IL-4

6 4,8

S191.4 B24 + IL-13

11 5,5

Ejemplo 12: Las muteínas anti receptor alfa de IL-4 humano reaccionan de forma cruzada contra linfocitos de sangre periférica de mono cynomolgus 10

Se recogió sangre completa de voluntarios humanos sanos por la unidad de farmacología clínica (CPU) en Astra Zeneca (Macclesfield, Reino Unido) en tubos de heparina de litio de 9 ml. Las muestras de sangre completa heparinizada de mono cynomolgus (agrupadas de un mínimo de dos animales) se obtuvieron de Harlan Sera-Lab (Bicester, Reino Unido) o B and K Universal Ltd (Hull, Reino Unido).

Se diluyó sangre completa de mono cynomolgus y ser humano 1:5 con tampón de lisis de eritrocitos (NH4Cl 0,15 15 M, KHCO3 1,0 mM EDTA 0,1 mM, pH 7,2-7,4) y después de la inversión se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en tampón de lisis y se repitió el procedimiento hasta que el sobrenadante no contenía hemoglobina. Las células se resuspendieron en el mismo volumen de medio de congelación (1:10, dimetilsulfóxido: suero de ternera fetal) que el volumen original de sangre y se trasfirieron a viales criogénicos. Cada vial contenía las células de 1 ml de sangre. 20 Las células se congelaron durante 1 noche a -80ºC y se trasfirieron a nitrógeno líquido para su almacenamiento.

Las células de sangre periférica congeladas se descongelaron rápidamente a 37ºC y se lavaron con tampón FACS (PBS/FCS al 1%). Se resuspendieron los sedimentos celulares en tampón FACS (1 ml de tampón/vial). Se colocaron alícuotas de 100 l en placas de fondo redondo de 96 pocillos, se añadieron 100 l de tampón FACS por pocillo, se centrifugaron las placas a 1200 rpm durante 5 minutos a 4ºC y se descartó el sobrenadante. Posteriormente, las 25 células se resuspendieron mediante agitación vorticial a baja velocidad y se añadieron 100 l de anticuerpo primario diluido (anti-CD 124 o control de isotipo de IgG1, eBioscience, 10 g/ml) o muteínas anti-receptor alfa de IL-4 (10 g/ml) y se incubaron las células en hielo durante 30 minutos. Se lavaron las células una vez mediante la adición de 100 l de tampón FACS y centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos a 4ºC, se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron mediante agitación vorticial a baja velocidad. Esto se repitió dos veces más usando 200 l de tampón 30 FACS para lavar las células. Después de la centrifugación final, el sedimento celular se resuspendió en 100 l del anticuerpo secundario apropiado a 5 g/ml (anticuerpo anti-lipocalina 1 humana biotinilado (R&D Systems) o de rata anti-IgG de ratón biotinilado (Insight Biotechnology Ltd) y se incubaron las células en hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron una vez en 100 l de tampón FACS mediante centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos a 4ºC, se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron mediante agitación vorticial a baja velocidad. Se analizaron dos lavados 35 adicionales usando 200 l de tampón FACS y centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación final el sedimento celular se resuspendió en 100 l del reactivo de detección (estreptavidina marcada con ficoeritrina PE (eBioscience); 1,25 g/ml) y se incubó durante 30 minutos en hielo en la oscuridad. Después de tres etapas de lavado adicionales como anteriormente, las células se recogieron en 200 l de tampón FACS, se trasfirieron a tubos de ensayo de 40 x 6 mm y se analizaron mediante citometría de flujo usando un citómetro FACScalibur. Las células 40 control no estaban teñidas. Usando las células control no teñidas, se estableció una ventana de análisis celular de

linfocitos intactos sobre el tamaño celular (dispersión frontal; FSC) y la granularidad celular (dispersión lateral; SSC) (Chrest. F. J, y col. (1993). Identification and quantification of apoptotic cells following anti-CD3 activation of murine G0 T cells. Cytometry 14: 883-90). Esta región no estaba alterada entre las muestras analizadas el mismo día. Se extrajo un marcador para discriminar entre poblaciones de receptor alfa+ de IL-4 y de receptor 4 alfa- de IL-4, basándose en los valores de FL2 (fluorescencia de canal 2; intensidad de PE) en la población de control no teñida; el marcador 1 (M1) de 5 células IL-4R+ se estableció basándose en la exclusión del 99% de la población no teñida. Para cada muestra, se adquirieron datos de al menos 1 x 104 células.

Las muteínas S191.5 K12, S148.3 J14-AM2C2, S191.4 B24, S.191.4 K19 y S.197.8 D22 (SEC ID Nº 3-6 y 8) presentaron altos niveles de unión a linfocitos de mono cynomolgus, las células de receptor alfa+ de IL-4 variaban entre el 61% y el 81% y los valores de MFI variaban entre 6,0 y 9,2 (Tabla 2). La variante S.191.5 H16 (SEC ID Nº 7) también se 10 une específicamente a linfocitos de mono cynomolgus pero con una afinidad reducida en comparación con las muteínas restantes (41% de las células con receptor alfa+ de IL-4; valores de MFI de 4,1).

Paralelamente, se analizó también la capacidad de estas muteínas específicas del receptor alfa de IL-4 para unirse a linfocitos de sangre periférica de un donante humano mediante citometría de flujo. Todas las muteínas anti-receptor alfa de IL-4 mostraron en niveles considerablemente más altos de unión a células humanas que los observados 15 para el control negativo de pTLPC10. Las células de receptor alfa+ de IL-4 variaban entre el 60 y 76% y los valores de MFI variaban entre 7,4 y 9,7. Las células teñidas con control negativo de pTLPC10 presentaron bajos niveles de unión inespecífica, registrándose el 9% de las células como receptor alfa+ de IL-4 con valores de MFI de 3,2. Las muteínas S191.5 K12, S191.4 B24 y S.191.4 K19 (SEC ID Nº 3, 5 y 6) presentaron una afinidad de unión similar a linfocitos de sangre periférica de un segundo donante humano (datos no mostrados). 20

Tabla IV. Capacidad de las muteínas específicas de receptor alfa de IL-4 para unirse a linfocitos de sangre periférica de ser humano y de mono cynomolgus, analizada por citometría de flujo. Se muestra el porcentaje de células seleccionadas con tinción positiva para el receptor alfa de IL-4 y la mediana de la intensidad de florescencia (MFI) de todas las células seleccionadas.

Células de sangre periférica humana Células de sangre periférica de cynomolgus

Tratamiento

% Positivas MFI % Positivas MFI

No teñidas

1 2,4 1 1,7

PTLPC10 (control neg.)

9 3,2 5 1,9

S.191.4 K19

72 8,9 65 6,6

S.191.5 K12

74 9,7 78 9,0

S.191.4 B24

74 9,3 80 9,2

S.148.3 J14-AM2C2

76 9,6 68 6,8

S.191.5 H16

72 9,0 42 4,1

S.197.8 D22

72 9,3 70 7,1

25

Ejemplo 13: Presentación de fagémidos y selección de muteínas de Tlc con afinidad por VEGF humano.

La presentación de fagémidos y la selección empleando los fagémidos obtenidos del Ejemplo 1 se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 2 con la siguientes modificaciones: La proteína diana, es decir un fragmento recombinante de VEGF-A humano (VEGF8-109, aminoácidos 8-109 de la cadena polipeptídica madura) se empleó a una concentración de 200 nM y se presentó a la biblioteca de fagémidos como proteína biotinilada con captura 30 posterior del complejo de fago-diana usando perlas de estreptavidina (Dynal) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron cuatro rondas de selección.

La proteína diana se obtuvo mediante la introducción de los ácidos nucleicos que codifican los aminoácidos 8 a 109 de la cadena polipeptídica madura de VEGF A humano (Nº de Acceso del Banco de Datos SWISS PROT P15692) en el vector de expresión pET11c (Novagen). Por lo tanto, se introdujeron sitios de restricción BamHI y Ndel en el extremo 3’ 35 y 5’ del ADNc del fragmento de VEGF humano, respectivamente, y se usaron para subclonar el fragmento del gen de VEGF.

Se transformaron E. coli BL21 (DE3) con el plásmido de expresión resultante y se consiguió la producción citoplasmática de VEGF8-109 después de la inducción de un cultivo de expresión en medio LB que contenía ampicilina con

IPTG durante 3 horas a 37ºC. Después de una centrifugación a 5000 g durante 20 minutos se resuspendió el sedimento celular en 200 ml de PBS por cada 2 l de caldo de cultivo y se centrifugó de nuevo a 5000 g durante 10 minutos antes de la incubación a -20ºC durante una noche. Cada sedimento celular obtenido de 500 ml de caldo de cultivo se resuspendió en 20 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), EDTA 5 nM y se sonicó en hielo, cuatro veces durante 10 segundos. Después de una centrifugación durante 10 minutos con 10000 g a 4ºC, se solubilizaron los cuerpos de inclusión con 15 ml de tampón 5 IB previamente enfriado (urea 2 M, Tris-HCI 20 mM (pH 7,5), NaCl 0,5 M), se sonicaron y centrifugaron como anteriormente. A continuación, los sedimentos celulares se solubilizaron con 20 ml de tampón IB y se centrifugaron de nuevo como anteriormente antes de su solubilización en 25 ml de tampón de solubilización (urea 7,5 M, Tris-HCI 20 mM (pH 7,5), DTT 4 mM). Se agitó la suspensión celular durante 2 horas a temperatura ambiente, se centrifugó a 40000 g durante 15 minutos a 4ºC y se filtró el sobrenadante que contenía el VEGF recombinante (0,45 m). El replegamiento se 10 consiguió mediante diálisis (límite de peso molecular de 3,5 kDa) a temperatura ambiente durante 1 noche contra 5 l de tampón 1 (Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), NaCl 400 mM, cisteína 1 mM), seguido de diálisis contra 5 l de tampón 2 (Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), cisteína 1 mM) y 2 etapas de diálisis posteriores con 5 l de tampón 3 (Tris-HCl 20 Mm (pH 8,4)). Después de la centrifugación (40000 g, 20 minutos, 4ºC) y concentración, el fragmento de VEGF recombinante se purificó de acuerdo con metodologías convencionales mediante cromatografía de intercambio iónico (Q-Sepharose) y cromatografía de 15 exclusión por tamaño (Superdex 75) posterior.

Ejemplo 14: Identificación de muteínas de unión a VEGF usando una exploración de ELISA de alto rendimiento

La exploración de las muteínas de Tlc obtenidas en el Ejemplo 13 se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 3, con la modificación de que la proteína diana recombinante VEGF8-109 obtenida del Ejemplo 11 se empleó a 5 g/ml y se revistió directamente en la placa de microtitulación. La exploración de 2124 clones en total condujo a la 20 identificación de 972 éxitos primarios, indicando que había tenido lugar un aislamiento exitoso de muteínas de la biblioteca. Usando este enfoque se identificó la muteína de Tlc S168.4-L01 (SEC ID Nº 26).

Ejemplo 15: Maduración de afinidad de la muteína de Tlc S168.4-L01 usando PCR propensa a errores

La generación de una biblioteca de variantes basadas en la muteína S168.4-L01 se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 4 usando los oligonucleótidos TL50 bio (SEC ID Nº 15) y TL51 bio (SEC ID Nº 16), dando como 25 resultado una biblioteca con 5 sustituciones por gen estructural de media.

La selección de fagémidos se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 13 usando una concentración de diana limitada (VEGF8-109 10 nM, 1 nM y 0,2 nM) o tiempos de incubación cortos (1 y 5 minutos) con y sin concentraciones de diana limitantes (10 nM, 100 nM)). Se realizaron cuatro rondas de selección.

Ejemplo 16: Exploración de afinidad de muteínas de unión a VEGF usando una exploración de ELISA de alto 30 rendimiento

La exploración de las muteínas seleccionadas en el Ejemplo 15 se realizó como se describe en el Ejemplo 14 con la modificación de que se revistió la placa de ELISA con un anticuerpo monoclonal anti-etiqueta de T7 (Novagen) para capturar las muteínas producidas y se detectó la unión de VEGF8-109 biotinilado (500 nM y 50 nM) a las muteínas de Tlc capturadas usando Extravidina conjugada con HRP. 35

Se identificó un gran número de clones que tienen una afinidad mejorada en comparación con la muteína S168.4L01, que sirvió como la base para la maduración de afinidad. Usando este enfoque se identificaron los clones S209.2-C23, S209.2-D16, S209.2-N9, S209.6-H7, S209.6-H10, S209.2-M17, S209.2-O10 (SEC ID Nº 27-33).

Ejemplo 17: Producción de muteínas de unión de VEGF

La producción se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 7. 40

Ejemplo 18: Determinación de afinidad de muteínas específicas de VEGF empleando Biacore

Las mediciones de afinidad se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 8, con la modificación de que aproximadamente 250 UR de VEGF recombinante se acoplaron directamente a la microplaca sensora usando química de amina convencional. Se inyectaron 40 l de las muteínas de Tlc obtenidas del Ejemplo 15 a una concentración de 400 nM. 45

Los resultados de las determinaciones de afinidad de las muteínas S209.2-C23, S209.2-D16, S209.2-N9, S209.6-H7, S209.6 H10, S209.2-M17 y S209.2-O10 (SEC ID Nº 27-33) se resumen en la Tabla 5.

Tabla V. Afinidades de muteínas seleccionadas de la invención por VEGF como se determinó mediante mediciones de Biacore a 25ºC

Clon

kon koff Afinidad

104 1/Ms 10-5 1/s nM

S209.2-C23

3,6 1,3 0,37

S209.2-D16

3,8 3 0,79

S209.2-N9

5,9 7,1 1,2

S209.6-H7

6,4 4,4 0,68

S209.6-H10

4,6 4,4 0,68

S209.2-M17

2,8 2,0 0,72

S209.2-O10

3,2 0,67 0,21

Ejemplo 19: Identificación de antagonistas de VEGF usando un ELISA de inhibición

La inhibición de la interacción entre VEGF y el receptor 2 de VEGF (VEGF-R2) se evaluó en un ELISA de inhibición. Con este fin, se incubó una concentración constante de VEGF8-109 biotinilado (1 nM) con una serie de diluciones de la muteína de Tlc respectiva y la cantidad de VEGF con un sitio de unión a VEGF-R2 desocupado se cuantificó en un 5 ELISA, en el que se había usado para revestimiento un anticuerpo anti-VEGF que interfiere con la interacción de VEGF/VEGF-R2 (MAB293, R&D Systems). Se detectó el VEGF unido usando Extravidina conjugada con HRP (Sigma) y se comparó con una curva patrón de cantidades definidas de VEGF. Los resultados de mediciones empleando las muteínas S209.2-C23, S209.2-D16, S209.2-N9, S209.6-H7, S209.6-H10, S209.2-M17 y S209.2-O10 (SEC ID Nº 27-33) se resumen en la Tabla VI. 10

Tabla VI. Capacidad antagonista y afinidades por VEGF de muteínas de lipocalina lacrimal seleccionadas de la invención según se determinó mediante ELISA de competición.

Clon

Afinidad de ELISA de Competición

Ki nM

S209.2-C23

2,3

S209.2-D16

3,9

S209.2-N9

2,8

S209.6-H7

2,4

S209.6-H10

1,3

S209.2-M17

2,0

S209.2-O10

0,83

Ejemplo 20: Identificación de antagonistas de VEGF usando un ensayo de proliferación de HUVEC

La inhibición de la proliferación celular de HUVEC estimulada por VEGF y FGF-2 se evaluó esencialmente como 15 se ha descrito previamente (Korherr C., Gille H, Schafer R., Koenig-Hoffmann K., Dixelius J., Egland K.A., Pastan I. y Brinkmann U. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 103 (11) 4240-4254) con las siguientes modificaciones: las células HUVEC (Promocell) se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y se usaron entre el paso 2 y 6. El día 1, se sembraron 1400 células en medio completo (Promocell). El día siguiente, se lavaron las células y se añadió medio basal que contenía FCS al 0,5%, hidrocortisona y gentamicina/anfotericina pero sin otros suplementos (Promocell). 20 Se añadió muteína específica de VEGF S209.2-C23, S209.2-D16, S209.2-N9, S209.6-H7, S209.6-H10, S209.2-O10 (SEC ID Nº: 27-33), lipocalina lacrimal de tipo silvestre (producto génico de pTLPC10; como control) o anticuerpo monoclonal terapéutico específico de VEGF Avastin® (Roche; como control) en una serie de diluciones a la concentración indicada en pocillos por triplicado y, después de 30 minutos, se añadió VEGF 165 humano (R&D Systems) o FGF-2 humano (Reliatech). Se evaluó la viabilidad de las células después de 6 días con el CellTiter 96 Aqueous One (Promega) de 25 acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados de las mediciones empleando las muteínas S209.2-C23, S209.2-D16, S209.2-N9, S209.6-H7, S209.6-H10, S209.2-M17 y S209.2-O10 (SEC ID Nº: 27-33) se muestran en la Figura 21. Todas las muteínas de la invención muestran una inhibición notable de la proliferación de células HUVEC inducida por VEGF, que es comparable a o superior a la inhibición inducida por Avastin®, mientras que la lipocalina lacrimal de tipo silvestre no inhibe la proliferación celular inducida por VEGF. La proliferación celular inducida por FGF-2 no 30 se ve afectada por ninguna de las muteínas específicas de VEGF, TLPC10 o Avastin® (no mostrado).

Ejemplo 21: Presentación de fagémidos y selección de muteínas de Tlc contra VEGF-R2

La presentación de fagémidos y la selección empleando los fagémidos obtenidos del Ejemplo 1 se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 2 con las siguientes modificaciones: Se empleó la proteína diana VEGF-R2-Fc (R&D Systems) a una concentración de 200 nM y se presentó a la biblioteca como proteína de fusión con Fc con la captura posterior del complejo de fago-diana usando perlas de proteína G (Dynal) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron cuatro rondas de selección. 5

Ejemplo 22: Identificación de muteínas de unión a VEGF-R2 usando una exploración de ELISA de alto rendimiento

Se realizó la exploración esencialmente como se describe en el Ejemplo 3, con la modificación de que la proteína diana VEGF-R2-Fc (R&D Systems) se usó a una concentración de 2,5 g/ml.

La exploración de 1416 clones, obtenidos del procedimiento descrito en el Ejemplo 21, condujo a la identificación 10 de 593 éxitos primarios indicando que había tenido lugar un aislamiento exitoso de muteínas de la biblioteca de la invención. Usando este enfoque se identificó la muteína S175.4 H11 (SEC ID Nº: 34).

Ejemplo 23: Maduración de afinidad de la muteína específica de VEGF-R2 S175.4 H11 usando PCR propensa a errores

La generación de una biblioteca de variantes basadas en la muteína S175.4 H11 se realizó esencialmente como 15 se describe en el Ejemplo 4 usando los oligodesoxinucleótidos TL50 bio (SEC ID Nº: 15) y TL51 bio (SEC ID Nº: 16), dando como resultado una biblioteca con 2 sustituciones por gen estructural de media.

La selección de fagémidos se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 21, usando una concentración de diana limitada (5 nM, 1 nM y 0,2 nM de VEGF-R2-Fc), tiempos de lavado prolongados (1 h) en presencia de VEGF8-109 recombinante de competición (100 nM) o tiempos de incubación cortos (2 y 5 minutos) con y sin concentraciones de diana 20 limitantes (10 nM, 100 nM). Se realizaron cuatro rondas de selección.

Ejemplo 24: Exploración de afinidad de muteínas de unión a VEGF-R2 usando una exploración de ELISA de alto rendimiento

Se realizó la exploración como se ha descrito en el Ejemplo 3, con la modificación de que la placa de ELISA se revistió con anticuerpo monoclonal anti-etiqueta de T7 (Novagen) para capturar las muteínas de Tlc producidas y se 25 detectó la unión de VEGF-R2-Fc (R&D Systems, 3 nM y 1 nM) a las muteínas capturadas usando un anticuerpo conjugado con HRP contra el dominio Fc de VEGF-R2-Fc.

Se identificó un gran número de clones que tenían una afinidad mejorada en comparación con las muteínas S175.4 H11, que sirvieron como base para la maduración de afinidad. Usando este enfoque se identificaron los clones S197.7-N1, S197.2-I18, S197.2-L22, S197.7-B6 y S197.2-N24 (SEC ID Nº: 35-39). 30

Ejemplo 25: Producción de muteínas de unión a VEGF-R2

La producción se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 7.

Ejemplo 26: determinación de afinidad de muteínas específicas de VEGF-R2 usando Biacore

Se realizaron mediciones de afinidad esencialmente como se describe en el Ejemplo 8, con las modificaciones de que se capturaron aproximadamente 500 UR de VEGF-R2-Fc (R&D System) y se inyectaron 80 l de muteína a una 35 concentración de 1,5 M.

Los resultados de las mediciones que emplean S175.4-H11, S197.7-N1, S197.2-I18, S197.2-L22, S197.7-B6 y S197.2-N24 (SEC ID Nº: 35-39) se resumen en la Tabla VII.

Tabla VII. Afinidades de muteínas seleccionadas de la invención por VEGF-R2 según se determinó mediante mediciones de Biacore. 40

Clon

kon koff Afinidad

[104 1/Ms] [10-5 1/s] [nM]

S175.4-H11

0,9 36 35

S197.7-N1

2,1 11 5,5

S197.2-I18

2,7 8,3 3,1

S197.2-L22

1,2 2,4 3,3

S197.7-B6

2,3 13 6

S197.2-N24

2,4 6,4 2,7

Ejemplo 27: Identificación de antagonistas de VEGF usando un ELISA de inhibición

La inhibición de la interacción entre VEGF y VEGF-R2 mediante las muteínas específicas de VEGF-R2 se evaluó en un ELISA de inhibición. Por lo tanto, se incubó una concentración constante de VEGF-R2 (VEGF-R2-Fc 4 nM, R&D Systems) con una serie de diluciones de la muteína respectiva y se cuantificó la cantidad de VEGF-R2 con un sitio 5 de unión a VEGF desocupado en un ELISA en el que se había usado VEGF8-109 para revestimiento. Se detectó el VEGF-R2 unido usando anticuerpo anti-Fc humano conjugado con HRP (Dianova) y se comparó con una curva patrón de cantidades definidas de VEGF-R2-Fc. Los resultados de la mediciones de S175.4-H11, S197.7-N1, S197.2-I18, S197.2-L22, S197.7-B6 y S197.2-N24 (SEC ID Nº: 35-39) se resumen en la Tabla VIII.

Tabla VIII. Capacidad antagonista y afinidades por VEGF-R2 de muteínas de lipocalina lacrimal seleccionadas de la 10 invención como se determinó por ELISA de competición.

Clon

Afinidad de Elisa de competición

Ki [nM]

S175.4-H11

12,9

S197.7-N1

12

S197.2-I18

5,5

S197.2-L22

3,5

S197.7-B6

3,8

S197.2-N24

2,3

Ejemplo 28: Modificación específica de sitio de muteínas específicas de receptor alfa de IL-4 con polietilenglicol (PEG)

Se introdujo un resto de cisteína no emparejado en lugar del aminoácido Glu en la posición 131 de la muteína 15 específica de receptor alfa de IL-4 S148.3 J14 (SEC ID Nº: 2) mediante mutación puntual para proporcionar un grupo reactivo para el acoplamiento con PEG activado. La muteína recombinante que porta el resto de Cys libre se produjo posteriormente en E. coli como se describe en el Ejemplo 7.

Para el acoplamiento de la muteína S148.3 J14 con PEG, se mezclaron 5,1 mg de maleimida de polietilenglicol (peso molecular medio de 20 kDa, cadena de carbono lineal; NOF) con 3 mg de la proteína en PBS y se agitó durante 3 20 horas a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de beta-mercaptoetanol hasta una concentración final de 85 M. Después de una diálisis contra Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), se aplicó la mezcla de reacción a una columna HiTrap Q-XL Sepharose (Amersham) y se descartó el flujo continuo. La muteína PEGilada se eluyó y se separó de la proteína sin reaccionar aplicando un gradiente salino lineal de NaCl de 0 mM a 100 mM.

Ejemplo 29: Medición de afinidad de la muteína PEGilada S148.3 J14 usando Biacore 25

Las mediciones de afinidad se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 8 con las modificaciones de que se inmovilizaron aproximadamente 500 UR de receptor alfa de IL-4-Fc (R&D Systems) y se inyectaron 80 l de la muteína PEGilada modificada a concentraciones de 200 nM, 67 nM y 22 nM. El resultado de la medición se representa en la Figura 22 y se resume en la Tabla IX. La afinidad de la muteína S148.3 J14 en su forma PEGilada (aproximadamente 30 nM) casi no cambia en comparación con la muteína no PEGilada (aproximadamente 37 30 nM, consúltese el Ejemplo 8).

Tabla IX. Afinidad de la muteína PEGilada de la invención S148.3 J14 por el receptor alfa de IL-4 según se determinó mediante Biacore.

Clon

kon koff Afinidad

[105 1/Ms] [10-3 1/s] [nM]

S148.3 J14

1,64 4,93 30

Ejemplo 30: Maduración de afinidad de la muteína S209.6-H10 usando un enfoque aleatorio dirigido

Se diseñó una biblioteca de variantes basándose en la muteína S209.6-H10 (SEC ID Nº: 30) mediante aleatorización de las posiciones de los restos 26, 69, 76, 87, 89 y 106 para permitir los 20 aminoácidos en estas posiciones. La biblioteca se construyó esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 con la modificación de que se usaron los desoxinucleótidos TL107 (abarcando la posición 26), TL109 (abarcando las posiciones 87 y 89), TL110 5 (abarcando la posición 106) y TL111 (abarcando las posiciones 69 y 76) en lugar de TL46, TL47, TL48 y TL49, respectivamente. La selección de fagémidos se llevó a cabo esencialmente como se describe en el Ejemplo 13 usando una concentración de diana limitada (10 pM y 2 pM y 0,5 pM de VEGF8-109) o combinada con un anticuerpo monoclonal competitivo contra VEGF (Avastin®). Se realizaron cuatro rondas de selección.

TL 107 (SEC ID Nº: 40) 10

GAAGGCCATGACGGTGGACNNSGGCGCGCTGAGGTGCCTC

TL 109 (SEC ID Nº: 41)

GGCCATCGGGGGCATCCACGTGGCANNSATCNNSAGGTCGCACGTGAAGGAC

TL 110 (SEC ID Nº: 42)

CACCCCTGGGACCGGGACCCCSNNCAAGCAGCCCTCAGAG 15

TL 111 (SEC ID Nº: 43)

CCCCCGATGGCCGTGTASNNCCCCGGCTCATCAGTTTTSNNCAGGACGGCCCTCACCTC

Ejemplo 31: Exploración de afinidad de muteínas de unión a VEGF usando exploración de ELISA de alto rendimiento

Se realizó la exploración como se describe en el Ejemplo 14 con la modificación de que se usó concentración de 20 VEGF de 1 g/ml y las adiciones de

i) se revistió una placa de ELISA con un anticuerpo monoclonal anti-etiqueta de T7 (Novagen) para capturar las muteínas producidas y se detectó la unión de VEGF biotinilado (3 nM y 1 nM) a las muteínas capturadas de lipocalina lacrimal usando una extravidina conjugada con HRP (peroxidasa de rábano rusticano). Adicionalmente, en preparaciones de exploración alternativas 25

ii) en lugar de VEGF8-109 humano la placa de microtitulación se revistió directamente (1 g/ml) con VEGF164 de ratón (R&D Systems);

iii) el extracto que contenía las muteínas de unión a VEGF se calentó a 60ºC durante 1 hora;

iv) se revistió la placa de ELISA con mAB293 (R&D Systems, 5 g/ml) y se preincubó VEGF8-109 biotinilado con las muteínas expresadas. La unión de VEGF8-109 a mAB293 se detectó usando extravidina conjugada con HRP 30 (peroxidasa de rábano rusticano).

Se identifico un gran número de clones que tenían una afinidad mejorada en comparación con la muteína S209.6-H10, que se sirvió como base para la maduración por afinidad. Usando este enfoque se identificaron los clones S236.1-A22, S236.-J20, S236.1-M11 y S236.1L03 (SEC ID Nº: 44-47).

En este contexto se observa que debido a la deleción de los primeros 4 aminoácidos de la lipocalina lacrimal en 35 las muteínas de la invención, la secuencia de aminoácidos está representada comenzando desde la posición de secuencia 5 (alanina) de la secuencia de lipocalina lacrimal de tipo silvestre depositada, de modo que la Ala5 se representa como aminoácido N-terminal. Además, el aminoácido C-terminal Asp 158 de la lipocalina lacrimal de tipo silvestre se reemplaza por un resto de alanina (resto 154 en la SEC ID Nº: 44-47, véanse también las otras muteínas de la invención tales como SEC ID Nº: 26-40). Además, la secuencia de aminoácidos de las muteínas S236.1-A22, S236.1-J20, 40 S236.1-M11 y S236.1L03 junto con la etiqueta STREP-TAG® II que está fusionada al extremo C-terminal de la lipocalina lacrimal para la construcción de la biblioteca sin exposición previa del Ejemplo 1 se muestra en la SEC ID Nº: 52 (S236.1-A22-Strep), SEC ID Nº: 53 (S236.1-J20-Strep), SEC ID Nº: 54 (S236.1-M11-Strep) y SEC ID Nº: 55 (S236.1-L03-Strep). Esto ilustra además la variabilidad de la secuencia de las muteínas de lipocalina lacrimal de la invención aparte de las posiciones mutadas/mutaciones indicadas que son necesarias para proporcionar la muteína respectiva con la capacidad 45 de unirse específicamente a la diana dada tal como VEGF o VEGF-R2 o la cadena alfa del receptor de interleucina 4 (receptor alfa de IL-4).

Ejemplo 32: Producción de muteínas de unión a VEGF

La producción se realizó esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 7.

Ejemplo 33: Determinación de afinidad de muteínas específicas de VEGF empleando Biacore 50

Se realizaron mediciones de afinidad esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 18. (Véase también la Figura 23, en la que se ilustran mediciones de Biacore de la unión de la muteína de lipocalina lacrimal humana S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44) a VEGF8-109 inmovilizado). Brevemente, se inmovilizó VEGF8-109 sobre una microplaca CM5 usando química de amina convencional. La muteína de lipocalina se aplicó con un caudal de 30 l/minuto a seis concentraciones de 500 nM a 16 nM. La evaluación de los sensogramas se realizó con el programa informático BIA T100 para determinar 5 la Kon, Koff y KD de las muteínas respectivas.

Tabla X. Afinidades de muteínas seleccionadas de la invención por VEGF según se determinó mediante mediciones de Biacore a 25ºC

Muteína

kon koff Afinidad

[104 1/Ms] [10-5 1/s] [nM]

S236.1-A22

8,8 2,2 0,25

S236.1-J20

7,9 2,2 0,28

S236.1-L03

6,8 4,4 0,64

S236.1-M11

7,3 2,3 0,31

Ejemplo 34: Identificación de antagonistas de VEGF usando un ELISA de inhibición 10

La inhibición de la interacción entre VEGF y el Receptor 2 de VEGF (VEGF-R2) se evaluó en un ELISA de inhibición esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 19, con la modificación de que el tiempo de incubación de 1 hora se redujo a 10 minutos. Las constantes de inhibición se resumen en la siguiente Tabla:

Tabla XI. Capacidad antagonista y afinidades por VEGF de muteínas de lipocalina lacrimal seleccionadas de la invención según se determinó por ELISA de competición 15

Muteína

Afinidad de ELISA de Competición

Ki [nM]

S236.1-A22

5,8

S236.1-J20

6,3

S236.1-L03

9,4

S236.1-M11

6,4

Ejemplo 35: Determinación de reactividad cruzada de muteínas específicas de VEGF S236.1-A22 usando Biacore

La mediciones de afinidad se realizaron esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 18, con la modificación de que se inmovilizó la muteína S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44) sobre la microplaca sensora. Se inyectaron 70 l de muestra a una concentración de 250 nM. 20

La comparación cualitativa del resultado como se muestra en la Figura 24 ilustra que la forma truncada hVEGF8-109 y hVEGF121 muestran básicamente sensogramas idénticos, lo que indica una afinidad similar hacia la muteína de lipocalina lacrimal S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44). La forma de corte y empalme hVEGF165 también muestra una fuerte unión a la muteína de lipocalina, mientras que el ortólogo de ratón respectivo mVEGF164 tiene una afinidad ligeramente reducida. Las isoformas VEGF-B, VEGF-C y VEGF-D y la proteína relacionada PIGF no mostraron unión en este 25 experimento (datos no mostrados).

Ejemplo 36: Determinación de la desnaturalización térmica para muteínas de unión a VEGF mediante el uso de espectroscopía de CD

Las mediciones de dicroísmo circular se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 14 de la solicitud de patente Internacional WO2006/056464, con la modificación de que la longitud de onda usada fue de 228 nm. 30 La temperatura de fusión Tm de la muteína de lipocalina lacrimal S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44), por ejemplo, se determinó que era de 75ºC.

Ejemplo 37: Ensayo de estabilidad de S236.1-A22

La estabilidad de la muteína de unión a VEGF S236.1-A22 a 37ºC en PBS y suero humano se ensayó esencialmente como se describe en el Ejemplo 15 de la solicitud de patente Internacional WO2006/056464, excepto por 35 que la concentración utilizada fue de 1 mg/ml. No pudo detectarse ninguna alteración de la muteína durante el periodo de

incubación de siete días en PBS según se juzgó mediante HPLC-SEC (datos no mostrados). La incubación de la muteína de lipocalina en suero humano dio como resultado una reducción de la afinidad después de 7 días hasta aproximadamente el 70% en comparación con la referencia (véase también la Figura 25a).

Ejemplo 38: Fusión de muteínas anti-VEGF con un dominio de unión a albúmina

Con el fin de prolongar la semivida en suero las muteínas anti-VEGF se fusionaron C-terminalmente con un 5 dominio de unión a albúmina (ABD). La construcción genética usada para expresión se denomina pTLPC51_S236.1-A22 (SEC ID Nº: 50). (Véase la Figura 26).

La producción preparativa de fusiones de muteína específica de VEGF-ABD o Tlc-ABD (como control) se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 7.

Se realizaron mediciones de afinidad usando resonancia de plasmón superficial (Biacore) esencialmente como 10 se ha descrito en el Ejemplo 18. La afinidad de la fusión con ABD de la muteína de lipocalina lacrimal S236.1-A22 (A22-ABD) (SEC ID Nº: 51) (200 pM) hacia el VEGF recombinante se descubrió que básicamente no se alteraba y se midió que era de 260 pM (véase la Figura 27).

Adicionalmente, la integridad del dominio ABD se ensayó mediante el mismo procedimiento, como se ha descrito en el Ejemplo 8, con la modificación de que aproximadamente 850 UR de albúmina de suero humano se acoplaron 15 directamente a la microplaca sensora usando química de amina convencional. Se inyectaron 60 l de fusiones de muteína-ABD (A22-ABD (SEC ID Nº: 51) o Tlc-ABD de tipo silvestre (SEC ID Nº: 49)) a una concentración de 500 nM. Su afinidad se midió que era de aproximadamente 20 nM.

La estabilidad de la fusión con ABD de S236.1-A22 (SEC ID Nº: 51) en suero humano se ensayó esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 37. No se pudo detectar ninguna pérdida de actividad durante el periodo de incubación 20 de siete días (véase la Figura 25b).

La funcionalidad de la muteína de lipocalina A22-ABD (fusión con ABD de S236.1-A22) en presencia de albúmina de suero humano se ensayó mediante su capacidad para inhibir la proliferación de HUVEC inducida por VEGF. El ensayo se realizó como se ha descrito en el Ejemplo 39, excepto por que se añadió albúmina de suero humano (HSA, 5 M) donde se indica. A HSA 5 M, >99,8% de A22-ABD se asocia con HSA en cualquier momento dado debido a la 25 afinidad nanomolar de A22-ABD por HSA (véase la Figura 28). Se determinó que los valores de CI50 eran los siguientes:

S236.1-A22-ABD

CI50: 760 pM

S236.1-A22-ABD (+HSA)

CI50: 470 pM

Ejemplo 39: Inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF

Se propagaron HUVEC (Promocell) en placas revestidas con gelatina y se usaron entre los pases P2 y P8. El día 1 se sembraron 1400 células por pocillo en placas de 96 pocillos en medio completo. El día 2, se lavaron las células y se añadieron 100 l de medio basal que contenía FCS al 0,5%, hidrocortisona y gentamicina/anfotericina. Se estimuló la 30 proliferación con VEGF165 20 ng/ml o FGF-2 10 ng/ml, que se mezclaron con la muteína de lipocalina S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44), se incubaron durante 30 minutos y se añadieron a los pocillos. La viabilidad se determinó el día 6, los resultados se expresan como % de inhibición. Se determinó que los valores de CI50 eran los siguientes (véase también la Figura 29).

S236.1-A22

CI50: 0,51 nM

Avastin

CI50: 0,56 nM

La estimulación mediada por FGF-2 no se vio afectada por los antagonistas de VEGF (datos no mostrados). 35

Ejemplo 40: Inhibición de la activación de MAP Quinasa mediada por VEGF en HUVEC

Se sembraron HUVEC en placas de 96 pocillos a 1400 células por pocillo en medio convencional (Promocell, Heidelberg). Al día siguiente, se redujo el FCS al 0,5% y el cultivo continuó durante 16 horas. Después, las células se privaron de suero en BSA al 0,5% en medio basal durante 5 horas. Se estimularon las HUVEC con VEGF165 (Reliatech, Braunschweig) durante 10 minutos en presencia de concentraciones crecientes de muteína de lipocalina lacrimal A22 o 40 Avastin (bevacizumab, Genentech/Roche) para obtener una curva de respuesta a la dosis. Se cuantificó la fosforilación de las MAP quinasas ERK1 y ERK2 usando un ELISA de acuerdo con el manual del fabricante (Active Motif, Rixensart, Bélgica). Se determinó que el valor de CI 50 era de 4,5 nM para la muteína A22 (SEC ID Nº: 44) y de 13 nM para Avastin® (véase la Figura 30).

Ejemplo 41: Ensayo de permeabilidad vascular con administración local de muteína de lipocalina lacrimal 45

Se afeitó el hombro y el dorso de cobayas Duncan-Hartley que pesaban 350  50 g. Los animales recibieron una inyección intravenosa a través de la vena de la oreja de 1 ml de colorante Azul de Evan al 1%. Treinta minutos después se mezclaron 20 ng de VEGF165 (Calbiochem) con sustancia de ensayo o artículo control a un exceso molar de diez veces y

se inyectó por vía intradérmica en una cuadrícula de 3 x 4. Treinta minutos después, se sacrificó a los animales mediante asfixia con CO2. Una hora después de las inyecciones de VEGF, se retiró la piel que contenía el patrón de cuadrícula y se limpió de tejido conjuntivo. El área de extravasación de colorante se cuantificó mediante el uso de un analizador de imágenes (Image Pro Plus 1.3, Media Cybernetics) (véase la Figura 31).

Ejemplo 42: Ensayo de CAM (membrana corioalantoidea de pollo) 5

Se colocaron sobreimplantes de colágeno que contenían FGF-2 (500 ng), VEGF (150 ng) y muteína de lipocalina lacrimal (1,35 g) o Avastin (10 g) según se indica sobre la CAM de embriones de pollo de 10 días (4/animal, 10 animales/grupo). A las 24 horas la muteína de lipocalina lacrimal o Avastin se volvió a aplicar por vía tópica al sobreimplante a la misma dosis. Después de 72 horas se recogieron los sobreimplantes y se capturaron imágenes. El porcentaje de cuadrículas positivas que contenían al menos un vaso se determinó por un observador a ciegas. La 10 mediana del índice angiogénico se indica para los antagonistas de VEGF S209.2-O10 (SEC ID Nº: 33) y Avastin®, así como para el control de lipocalina lacrimal de tipo silvestre, como la fracción de cuadrículas positivas (véase la Figura 32).

Ejemplo 43: Determinación de los parámetros farmacocinéticos (PK) para A22 y A22-ABD en ratones

Se determinaron los parámetros farmacocinéticos (PK) (semivida de la concentración en plasma, biodisponibilidad) para la muteína de lipocalina lacrimal S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44) (4 mg/kg) después de administración 15 i.v. y la proteína de fusión de la muteína S236.1-A22 con ABD (SEC ID Nº: 51) (5,4 mg/kg) después de una sola administración en embolada i.v. o i.p. en ratones NMRI. Se preparó el plasma a partir de muestras de sangre terminales tomadas a puntos temporales predeterminados y se determinaron las concentraciones de muteína de lipocalina mediante ELISA. Los resultados se analizaron usando el programa informático WinNonlin (Phasight Corp., Mountain View, Estados Unidos). T1/2, A22 i.v.: 0,42 h; T1/2, A22-ABD i.v.: 18,32 h; T1/2, A22-ABD i.p.: 20,82 h. La biodisponibilidad después de la 20 administración i.p. de la proteína de fusión A22-ABD fue del 82,5% (véase la Figura 33).

Ejemplo 44: Ensayo de la permeabilidad vascular con administración sistémica de muteína de lipocalina lacrimal

Doce horas antes del experimento, se inyectaron sustancias de ensayo o controles por vía intravenosa a 3 animales por grupo. Grupo 1: vehículo de PBS; Grupo 2: Avastin, 10 mg/kg; Grupo 3: muteína S236.1 A22-ABD, 6,1 mg/kg; Grupo 4: TLPC51: 6,1 mg/kg. A tiempo = 0 se inyectó Azul de Evan. Treinta minutos después, se inyectaron por 25 vía intradérmica 4 dosis de VEGF (5, 10, 20 ó 40 ng) por triplicado en una cuadrícula de 3 x 4. Treinta minutos después de las inyecciones de VEGF los animales se sacrificaron y se cuantificó la extravasación de colorante como se ha indicado anteriormente (véase la Figura 34).

Ejemplo 45: Modelo de xenoinjerto de tumores

Se inoculó a ratones atímicos Swiss irradiados (2,5 Gy, Co60) por vía subcutánea 1 x 107 células de 30 rabdomiosarcoma A673 (ATTC) en matrigel en el flanco derecho (n = 12 por grupo). Se administraron los tratamientos por vía intraperitoneal y se iniciaron el mismo día y continuaron durante 21 días. Grupo 1: vehículo de PBS, diario; Grupo 2: Avastin (bevacizumab, Genentech/Roche), 5 mg/kg cada 3 días; Grupo 3: muteína A22-ABD (SEC ID Nº: 51), diaria, 3,1 mg/kg; Grupo 4: TLPC51, diaria, 3,1 mg/kg. La dosis de la lipocalina A22-ABD se seleccionó para conseguir la presencia constante de un número equimolar de sitios de unión a VEGF de la muteína y Avastin basándose en los datos PK de A22-35 ABD y la semivida en suero estimada de anticuerpos en ratones. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana con un calibrador y se estimó el volumen tumoral de acuerdo con la fórmula (longitud x anchura2)/2. Se sacrificó a los ratones cuando el volumen tumoral superaba los 2000 mm3 (véase la Figura 35).

Ejemplo 46: Exploración de variantes de Muteína de Lipocalina con Cys

Para proporcionar un grupo reactivo para el acoplamiento con, por ejemplo, PEG activado, se introdujo un resto 40 de cisteína no emparejado mediante mutagénesis dirigida. La muteína recombinante que portaba el resto de Cys libre se produjo posteriormente en E. coli como se describe en el Ejemplo 7, se determinó el rendimiento de la expresión y se midió la afinidad mediante ELISA, esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 14. De forma ejemplar, los resultados de la exploración con Cys de la muteína específica de VEGF S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44) se proporcionan en la tabla a continuación. Se introdujo cisteína en lugar de los aminoácidos Thr 40, Glu 73, Asp 95, Arg 90 y Glu 131 usando los 45 oligonucleótidos siguientes

A22_D95C directo: GAGGTCGCACGTGAAGTGCCACTACATCTTTTACTCTGAGG (SEC ID Nº: 56),

A22_D95C inverso: CCTCAGAGTAAAAGATGTAGTGGCACTTCACGTGCGACCTC (SEC ID Nº: 57),

A22_T40C directo: GGGTCGGTGATACCCACGTGCCTCACGACCCTGGAAGGG (SEC ID Nº: 58),

A22_T40C inverso: CCCTTCCAGGGTCGTGAGGCACGTGGGTATCACCGACCC (SEC ID Nº: 59), 50

A22_E73C directo: CCGTCCTGAGCAAAACTGATTGCCCGGGGATCTACACGG (SEC ID Nº: 60),

A22_E73C inverso: CCGTGTAGATCCCCGGGCAATCAGTTTTGCTCAGGACGG (SEC ID Nº: 61),

A22_E131C directo: GCCTTGGAGGACTTTTGTAAAGCCGCAGGAG (SEC ID Nº: 62),

A22_E131C inverso: CTCCTGCGGCTTTACAAAAGTCCTCCAAGGC (SEC ID Nº: 63),

A22_R90C directo: CGTGGCAAAGATCGGGTGCTCGCACGTGAAGGACC (SEC ID Nº: 64), y

A22_R90C inverso: GGTCCTTCACGTGCGAGCACCCGATCTTTGCCACG (SEC ID Nº: 65).

5

Tabla XII. Afinidad de las muteínas S236.1-A22 y sus mutantes Thr 40  Cys (SEC ID Nº: 66), Glu 73  Cys (SEC ID Nº: 68), Arg 90  Cys (SEC ID Nº: 69) y Glu 131  Cys (SEC ID Nº: 70) por VEGF según se determinó mediante ELISA.

Clon

Rendimiento Afinidad

[g/l] [nM]

S236.1-A22

1.000 10

S236.1-A22 T40C

420 14

S236.1-A22 E73C

300 13

S236.1-A22 D95C

750 10

S236.1-A22 R90C

470 10

S236.1-A22 E131C

120 >100

Ejemplo 47: Ensayo de secreción de Eotaxina-3

Se realizó un ensayo de secreción de Eotaxina-3 en células A549 durante 72 horas. Las células epiteliales de 10 pulmón, tales como las células A549 secretan eotaxina-3 tras la estimulación con IL-4/IL-13. De este modo, se trató a las células A549 con concentraciones crecientes de la muteína de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (SEC ID Nº: 4) y se las estimuló con IL-4 0,7 nM o IL-13 0,83 nM, respectivamente. La secreción de eotaxina-3 se evaluó después de 72 horas usando un ELISA de tipo sándwich comercial (R&D Systems). Los resultados (Figura 36) demuestran que la muteína de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 inhibe la secreción de eotaxina-3 mediada por IL-4 e IL-13 en células 15 A549 con un valor de CI50 de 32 y 5,1 nM, respectivamente (Tabla XIII).

Tabla XIII. Valores de CI50 de S191.4 B24 para secreción de eotaxina-3 mediada por IL-4 e IL-13 en células A549.

CI50 (nM)

IL-4

32

IL-13

5,1

Ejemplo 48: Inducción de CD23 mediada por IL-4/IL-13 en células mononucleares de sangre periférica

Se aislaron PBMC humanas totales a partir de la capa leucoplaquetaria. Se trató a las PBMC con 20 concentraciones crecientes de la muteína de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 y se añadió IL-4 o IL-13 a una concentración final de 1,0 nM y 2,5 nM, respectivamente. Se cultivaron las PBMC durante 48 horas en medio RPMI que contenía FCS al 10%. Las células se tiñeron con anticuerpos anti-CD14-FITC y anti-CD23-PE y se analizaron mediante citometría de flujo. Para cada punto, se determinó el porcentaje de células doblemente positivas de todos los monocitos positivos para CD14 y se representó en función de la concentración de muteína. 25

A partir de los resultados obtenidos, se calcularon los valores de CI50 de la muteína S191.4 B24 para la inhibición de la expresión de CD23 en monocitos mediada por IL-4 e IL-13 (Tabla XIV).

Tabla XIV. Valores de CI50 de S191.4 B24 para la expresión de CD23 mediada por IL-4 e IL-13 en PBMC.

CI50 (nM)

IL-4

905

IL-13

72

Ejemplo 49: Análisis de Schild de la afinidad de la muteína de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24

Se llevó a cabo un análisis de Schild para confirmar el modo de unión competitiva formulado como hipótesis de 30 las muteínas y para determinar la Kd en células. Las células TF-1 se trataron con una concentración fija de la muteína de

unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (0, 4,1, 12,3, 37, 111,1, 333,3 o 1.000 nM) y se valoró con IL-4 y se evaluó la viabilidad celular después de 4 días (Figura 38A). Se determinaron los valores de CE50 mediante regresión no lineal. El análisis de Schild tradicional de los resultados obtenidos (Figura 38B) produjo una Kd de 192 pM (regresión lineal) y la regresión no lineal más precisa produjo 116 pM. La pendiente de Schild de 1,084 indica una inhibición competitiva, es decir la muteína y la IL-4 compiten por la unión al receptor alfa de IL-4. 5

Ejemplo 50: Unión picomolar de la muteína S191.4 B24 a linfocitos B primarios

Se aislaron PBMC de sangre humana y se incubaron con diferentes concentraciones de la muteína de lipocalina lacrimal humana de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 o la lipocalina lacrimal humana de tipo silvestre (TLPC26). Se tiñeron después las células con anticuerpos monoclonales anti-CD20-FITC y un antisuero anti-lipocalina biotinilado, seguido de estreptavidina-PE. Los resultados para la lipocalina de tipo silvestre y la muteína de lipocalina de unión a 10 receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 se muestran en la Figura 39 A y B, respectivamente. El porcentaje determinado de linfocitos B positivos para PE se ajustó frente a la concentración de las muteínas de lipocalina (Figura 39C) y se calculó la CE50 a partir de la curva obtenida. La CE50 de la muteína de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 (SEC ID Nº: 4) para la unión a linfocitos B primarios se calculó como de 105 pM.

Ejemplo 51: Biodisponibilidad de las muteínas después de la administración subcutánea e intratraqueal 15

La biodisponibilidad de la muteína de unión a receptor alfa de IL-4 S191.4 B24 se determinó después de la administración intravenosa, subcutánea o intratraqueal, mediante el control de las concentraciones plasmáticas de la muteína S191.4 B24 durante 4 horas después de una inyección en embolada de 4 mg/kg en ratas. La administración intratraqueal se llevó a cabo usando un dispositivo de dosificación intratraqueal disponible en el mercado (MicroSprayer®, Penn-Century Inc, Philiadelphia, PA, Estados Unidos) que genera un aerosol desde la punta de un tubo largo y fino unido 20 a una jeringa. El tamaño del aerosol fue de aproximadamente 20 m. Los resultados del análisis farmacocinético (PK) no compartimental demuestran una biodisponibilidad del 100% tras la inyección subcutánea y que, al contrario que los anticuerpos, el suministro pulmonar de las muteínas de lipocalina lacrimal humana parece ser factible. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla XV.

Tabla XV. Semivida y biodisponibilidad de S191.4 B24 después de la administración intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.) e 25 intratraqueal (i.t.).

i.v. s.c. i.t.

T1/2[h]

0,78 1,6 2,36

Biodisponibilidad (AUCfin)

n/d 97,2% 10%

Biodisponibilidad (AUCinf)

n/d 119% 13,8%

Ejemplo 52: Potencia in vitro de antagonistas de VEGF PEGilados usando un ensayo de proliferación de HUVEC

Se evaluó la inhibición de la proliferación de células HUVEC estimuladas con VEGF esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 20, con las modificaciones siguientes: La muteína específica de VEGF S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44) 30 se acopló a PEG 20, PEG 30 o PEG 40 en la posición 95C como se ha descrito en el Ejemplo 28 anterior. La muteína, sus derivados PEGilados y la lipocalina lacrimal de tipo silvestre (producto génico de pTLPC26; como control) se añadieron en una serie de diluciones a VEGF165 y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las mezclas se añadieron a células HUVEC en pocillos por triplicado para dar una concentración final de VEGF de 20 ng/ml y concentraciones entre 0,003 nM y 2.000 nM según se indica. La viabilidad de las células se evaluó después de 6 días con CellTiter-Glo 35 (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los resultados de las mediciones empleando las muteínas mencionadas anteriormente se muestran en la Figura 41. S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44) y sus derivados PEGilados muestran una inhibición notable de la proliferación de células HUVEC inducida por VEGF que disminuye con el peso molecular del resto de PEG unido, mientras que la lipocalina lacrimal de tipo silvestre no inhibe la proliferación celular inducida por VEGF (Tabla XVI). 40

Tabla XVI. Valores de CI50 de S236.1-A22 (SEC ID Nº: 44) y sus derivados PEGilados con PEG 20, PEG 30 o PEG 40 para la inhibición de la proliferación de células HUVEC.

CI50 (nM)

S236.1-A22

0,4

S236.1-A22-PEG20

0,53

S236.1-A22-PEG30

2,13

S236.1-A22-PEG40

3,27

Las invenciones descritas de forma ilustrativa en el presente documento pueden ponerse en práctica convenientemente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no desvelados específicamente en el presente documento. De este modo, por ejemplo, las expresiones “que comprende” “que incluye”, “que contiene”, etc. deberán entenderse de forma amplia y sin limitación. Adicionalmente, los términos y expresiones 5 empleados en el presente documento se han usado como términos de descripción y no de limitación, y no existe intención en el uso de dichos términos y expresiones de excluir ningún equivalente de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, sino que se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del ámbito de la invención reivindicada. De este modo, debería entenderse que aunque la presente invención se ha desvelado específicamente mediante realizaciones preferidas y características opcionales, los expertos en la materia pueden recurrir a la modificación 10 y variación de las invenciones incorporadas en las mismas desveladas en el presente documento, y que tales modificaciones y variaciones se consideran dentro del ámbito de la presente invención. La invención se ha descrito de forma amplia y genérica en el presente documento. Cada una de las especies y agrupamientos subgenéricos más estrechos que quedan dentro de la divulgación genérica también forman parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una salvedad o limitación negativa que elimine cualquier materia objeto del género, 15 independientemente de si el material escindido se cita o no específicamente en el presente documento. Además, cuando se describen características o aspectos de la invención en términos de grupos de Markush, los expertos en la materia reconocerán que la invención también se describe por lo tanto en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush. Realizaciones adicionales de la invención resultarán evidentes a partir de las reivindicaciones siguientes. 20

Lista de secuencias

<110> Pieris Proteolab AG

<120> Muteínas de lipocalina lacrimal humana

25

<130> P30056

<160> 70

<170> Patentln versión 3.3 30

<210> 1

<211> 3700

<212> ADN

<213> Artificial 35

<220>

<223> Vector de expresión pTLPC10

<400> 1 40

<210> 2

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Proteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por IL-4R alfa

10

<400> 2

<210> 3

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por IL-4R alfa

<400> 3 10

<210> 4

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por IL-4R alfa

10

<400> 4

<210> 5

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por IL-4R alfa.

10

<400> 5

<210> 6

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por IL-4R alfa

10

<400> 6

<210> 7

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por IL-4R alfa

10

<400> 7

<210> 8

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por IL-4R alfa

10

<400> 8

<210> 9

<211> 4041

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> Vector fasmídico pTlc27

10

<400> 9

<210> 10

<211> 63

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico TL46 (bucle 1/2 directo)

<220>

<221> misc_feature

<222> (19) .. (20)

<223> n es a, c, g, o t 5

<220>

<221> mist-features

<222> (22) .. (23)

<223> n es a, c, g, o t 10

<220>

<221> misc_feature

<222> (25) .. (26)

<223> n es a, c, g, o t 15

<220>

<221> misc_feature

<222> (28) .. (29)

<223> n es a, c, g, o t 20

<220>

<221> misc_feature

<222> (31) .. (32)

<223> n es a, c, g, o t 25

<220>

<221> misc_feature

<222> (34) .. (35)

<223> n es a, c, g, o t 30

<220>

<221> misc_feature

<222> (37) .. (38)

<223> n es a, c, g, o t 35

<220>

<221> misc_feature

<222> (90) .. (41)

<223> n es a, c, g, o t 40

<220>

<221> misc_feature

<222> (43) .. (44)

<223> n es a, c, g, o t

5

<400> 10

<210> 11

<211> 45 10

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico TL47 (bucle 1/2 inverso) 15

<220>

<221> misc_feature

<222> (20) .. (21)

<223> n es a, c, g, o t 20

<220>

<221> misc_feature

<222> (23) .. (24)

<223> n es a, c, g, o t 25

<220>

<221> misc_feature

<222> (26) .. (27)

<223> n es a, c, g, o t 30

<400> 11

<210> 12 35

<211> 54

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 40

<223> Cebador oligonucleotídico TL48 (bucle 3/4 directo)

<220>

<221> misc_feature

<222> (25) .. (26) 5

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (39) .. (.35) 10

<223> n es a, c, g, o t

<400> 12

15

<210> 13

<211> 56

<212> ADN

<213> Artificial

20

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico TL49 (bucle 3/4 inverso)

<220>

<221> misc_feature 25

<222> (24) .. (25)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature 30

<222> (30) .. (31)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature 35

<222> (33) .. (34)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature 40

<222> (36) .. (37)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 13

5

<210> 14

<211> 56

<212> ADN

<213> Artificial

10

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico AN-14

<400> 14

15

<210> 15

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

20

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico TL50bio (conjunto 5')

<400> 15

25

<210> 16

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

30

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico TL51 bio (conjunto 3')

<400> 16

35

<210> 17

<211> 64

<212> ADN

<213> Artificial 40

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico TL70 bucle de cebador aleatorio 1

<220> 5

<221> misc_feature

<222> (44) .. (45)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 17 10

<210> 18

<211> 78

<212> ADN 15

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico TL71 bucle de cebador aleatorio 2

20

<220>

<221> misc_feature

<222> (21) .. (22)

<223> n es a, c, g, o t

25

<220>

<221> misc_feature

<222> (27) .. (28)

<223> n es a, c, g, o t

30

<220>

<221> misc_feature

<222> (36) .. (37)

<223> n es a, c, g, o t

35

<220>

<221> misc_feature

<222> (45) .. (46)

<223> n es a, c, g, o t

40

<220>

<221> misc_feature

<222> (59) .. (55)

<223> n es a, c, g, o t

5

<220>

<221> misc_feature

<222> (60) .. (61)

<223> n es a, c, g, o t

10

<400> 18

<210> 19

<211> 25 15

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico TL72 cebador de conjunto 20

<400> 19

<210> 20 25

<211> 825

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20 30

<210> 21

<211> 1356

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<400> 21

<210> 22

<211> 232

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 207

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 419

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<400> 24

<210> 25

<211> 354

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGF

10

<400> 26

<210> 27

<211> 154

<212> PRT

<213> Artificial 5

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGF

<400> 27 10

<210> 28

<211> 154

<212> PRT 15

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGF

<400> 28 5

<210> 29

<211> 154

<212> PRT 10

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGF

15

<400> 29

<210> 30

<211> 154 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGF 10

<400> 30

<210> 31

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGF

10

<400> 31

<210> 32

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGF

10

<400> 32

<210> 33

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGF

10

<400> 33

<210> 34

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGFR2

10

<400> 34

<210> 35

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGFR2

10

<400> 35

<210> 36

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGFR2

10

<400> 36

<210> 37

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGFR2

10

<400> 37

<210> 38

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGFR2

10

<400> 38

<210> 39

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Muteína de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión por VEGFR2

10

<400> 39

<210> 40

<211> 40

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico TL 107

10

<220>

<221> misc_feature

<222> (20) .. (21)

<223> n es a, c, g, o t

15

<400> 40

<210> 41

<211> 52

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico TL 109

10

<220>

<221> misc_feature

<222> (26) .. (27)

<223> n es a, c, g, o t

15

<220>

<221> misc_feature

<222> (32) .. (33)

<223> n es a, c, g, o t

20

<400> 41

<210> 42

<211> 40 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico TL 110 30

<220>

<221> misc_feature

<222> (23) .. (24)

<223> n es a, c, g, o t 35

<400> 42

<210> 43

<211> 59 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico TL 111 5

<220>

<221> misc_feature

<222> (19) .. (20)

<223> n es a, c, g, o t 10

<220>

<221> misc_feature

<222> (40) .. (41)

<223> n es a, c, g, o t 15

<400> 43

<210> 44 20

<211> 154

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 25

<223> S236.1-A22

<400> 44

<210> 45

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> S236.1-J20

10

<400> 45

<210> 46

<211> 162

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> S236.1-M11

10

<400> 46

<210> 47

<211> 162

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> S236.1-L03

10

<400> 47

<210> 48

<211> 745

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> pTLPC51 118-862 Xbal/HindlII nt

10

<400> 48

<210> 49

<211> 238

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia señal OmpA de proteína de fusión - lipocalina lacrimal humana - dominio de unión a albúmina (abd) - Etiqueta Strep II 10

<400> 49

<210> 50

<211> 745

<212> ADN

<213> Artificial

5

<220>

<223> pTLPC51_S236.1-A22 118-862 Xbal/HindlII (secuencia de nt que codifica una proteína de fusión de OmpA, muteína de lipocalina lacrimal humana S236.1-A22, abd y Etiqueta Strep II)

<400> 50 10

<210> 51

<211> 238

<212> PRT 15

<213> Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión de ompA, muteína de lipocalina lacrimal humana S236.1-A22, dominio de unión a albúmina (abd) y Etiqueta Strep II 20

<400> 51

<210> 52

<211> 162

<212> PRT

<213> Artificial 5

<220>

<223> S236.1-A22-strep

<400> 52 10

<210> 53

<211> 162

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220> <223> S236.1-J20-strep.

<400> 53 10

<210> 54

<211> 162

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> S236.1-M 11-strep

10

<400> 54

<210> 55

<211> 162 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> S236.1-L03 10

<400> 55

<210> 56

<211> 41

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico A22_D95C directo

10

<400> 56

<210> 57

<211> 41

<212> ADN

<213> Artificial

5

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico A22_D95C inverso

<400> 57

10

<210> 58

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial 15

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico A22_T40C directo

<400> 58

20

<210> 59

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial 25

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico A22_T40C inverso

<400> 59 30

<210> 60

<211> 40

<212> ADN 35

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico A22_E73C directo

40

<400> 60

<210> 61

<211> 40

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico A22_E73C inverso

10

<400> 61

<210> 62

<211> 31 15

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico A22_E131C directo 20

<400> 62

<210> 63 25

<211> 31

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 30

<223> Cebador oligonucleotídico A22_E131C inverso

<400> 63

35

<210> 64

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

40

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico A22_R90C directo

<400> 64

5

<210> 65

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial 10

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico A22_R90C inverso

<400> 34 15

<210> 66

<211> 154

<212> PRT 20

<213> Artificial

<220>

<223> S236.1-A22 Thr 40-Cys

25

<400> 66

<210> 67

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> S236.1-A22 Glu73-Cys

10

<400> 67

<210> 68

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> S236.1-A22 Asp95-Cys

10

<400> 68

<210> 69

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> S236.1-A22 Arg90-Cys

10

<400> 69

<210> 70

<211> 154

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> S236.1-A22 Glu131-Cys

10

<400> 70

Claims (82)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para la generación de una muteína de lipocalina lacrimal humana, en el que la muteína se une a un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana con afinidad de unión detectable, que comprende:

   (a) someter a una molécula de ácido nucleico que codifica una lipocalina lacrimal humana a mutagénesis en al menos 12, 14 ó 16 de los codones de cualquiera de las posiciones de la secuencia de aminoácidos 26-34, 56-58, 80, 5 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura nativa, en la que al menos uno de los codones que codifica restos de cisteína en las posiciones de secuencia 61 y 153 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura se ha mutado para codificar cualquier otro resto aminoacídico, obteniendo de este modo una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican muteínas de lipocalina lacrimal humana, 10

   (b) expresar las una o más moléculas de ácido nucleico de muteína obtenidas en (a) en un sistema de expresión, obteniendo de este modo una o más muteínas y

   (c) enriquecer las una o más muteínas obtenidas en la etapa (b) y que tienen afinidad de unión detectable por un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana por medio de selección y/o aislamiento,

   A condición de que el ligando no natural de la lipocalina lacrimal humana no sea el correceptor de linfocitos T humanos 15 CD4.
2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los 18 codones de las posiciones de la secuencia de aminoácidos 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 56, 57, 58, 80, 83, 104, 105, 106 y 108 de la secuencia de polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura están mutados.
3. 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que al menos uno de los codones que codifican las 20 posiciones de la secuencia de aminoácidos 61 y 153 de la secuencia polipeptídica lineal de lipocalina lacrimal humana madura está mutado para codificar en la posición la 61 una alanina, fenilalanina, lisina, arginina, treonina, asparagina, tirosina, metionina, serina, prolina o triptófano y/o en la posición 153 una serina o alanina.
4. 4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende adicionalmente someter el ácido nucleico a mutagénesis en los codones que codifican las posiciones de la secuencia de aminoácidos 111 y 114 de la 25 secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura para codificar en la posición 111 una arginina y en la posición 114 un triptófano.
5. 5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende adicionalmente someter el ácido nucleico a mutagénesis en el codón que codifica la cisteína en la posición 101 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura para codificar cualquier otro aminoácido. 30
6. 6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el codón que codifica la cisteína en la posición 101 de la secuencia polipeptídica lineal de lipocalina lacrimal humana madura está mutado para codificar una serina.
7. 7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la etapa (c) comprende adicionalmente:

   (a) proporcionar como un ligando dado un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un compuesto 35 químico en forma libre o conjugada que muestra características de un hapteno inmunológico, un péptido, una proteína u otra macromolécula,

   (b) poner en contacto la pluralidad de muteínas con dicho ligando para permitir la formación de complejos entre dicho ligando y muteínas que tienen afinidad de unión por dicho ligando y

   (c) eliminar las muteínas que no tienen afinidad de unión o que no tienen una afinidad de unión sustancial. 40
8. 8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el ligando es una proteína o un fragmento de la misma.
9. 9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la selección en la etapa (c) se lleva a cabo en condiciones competitivas.
10. 10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que un ácido nucleico que codifica 45 la pluralidad de muteínas de lipocalina lacrimal humana, dicho ácido nucleico resulta de mutagénesis, se fusiona operativamente en el extremo 3’ con un gen que codifica la proteína de cubierta pIII de un bacteriófago filamentoso de la familia M13 o un fragmento de esta proteína de cubierta, para seleccionar al menos una muteína para la unión de un ligando dado.
11. 11. Una muteína de la lipocalina lacrimal humana que tiene afinidad de unión detectable hacia un ligando no natural dado 50 de lipocalina lacrimal humana, en la que los restos de cisteína que aparecen en las posiciones de secuencia 61 y 153 de

    la lipocalina lacrimal de tipo silvestre se reemplazan por otros aminoácidos, y en la que al menos 12, 14 ó 16 restos aminoacídicos mutados están presentes en cualquiera de las posiciones de secuencia 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura, con a condición de que el ligando no natural de lipocalina lacrimal humana no sea el correceptor de linfocitos T humanos CD4.
12. 12. La muteína de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la muteína comprende restos aminoacídicos mutados en las 5 18 posiciones de secuencia 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 56, 57, 58, 80, 83, 104, 105, 106 y 108.
13. 13. La muteína de acuerdo con las reivindicaciones 11 ó 12, en la que la muteína al menos una de las sustituciones de aminoácidos Cys61  Ala, Phe, Lys, Arg, Thr, Asn, Tyr, Met, Ser, Pro o Trp y Cys 153  Ser o Ala.
14. 14. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en la que la muteína al menos una sustitución de aminoácidos adicional seleccionada de Arg 111  Pro y Lys 114  Trp. 10
15. 15. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en la que la muteína comprende adicionalmente una sustitución de aminoácidos adicional del resto de cisteína en la posición 101 de la secuencia de la lipocalina lacrimal humana madura.
16. 16. La muteína de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la muteína comprende la mutación Cys 101  ser 15
17. 17. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en la que la muteína está en su extremo N-terminal o C-terminal fusionada operativamente con una enzima, una proteína o un dominio proteico, un péptido, una secuencia señal y/o una etiqueta de afinidad.
18. 18. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en la que la muteína está fusionada con un resto que prolonga la semivida en suero de la muteína. 20
19. 19. La muteína de acuerdo con la reivindicación 18, en la que el resto que prolonga la semivida en suero se selecciona del grupo que consiste en una parte Fc de una inmunoglobulina, un dominio CH3 de una inmunoglobulina, un dominio CH4 de una inmunoglobulina, albúmina o un fragmento de albúmina, un péptido de unión a albúmina, una proteína de unión a albúmina y transferrina.
20. 20. La muteína de acuerdo con la reivindicación 19, en la que la proteína de unión a albúmina es una proteína de unión a 25 albúmina bacteriana, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido contra albúmina o una muteína de lipocalina con actividad de unión por albúmina.
21. 21. La muteína de acuerdo con la reivindicación 20, en la que el dominio de albúmina bacteriana es un dominio de unión a albúmina de la proteína G estreptocócica.
22. 22. La muteína de acuerdo con la reivindicación 19, en la que el péptido de unión a albúmina tiene la fórmula Cys-Xaa1-30 Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, en la que Xaa1 es Asp, Asn, Ser, Thr o Trp; Xaa2 es Asn, Gln, His, Ile, Leu o Lys; Xaa3 es Ala, Asp, Phe, Trp o Tyr; y Xaa4 es Asp, Gly, Leu, Phe, Ser o Thr.
23. 23. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-16, en la que la muteína está conjugada con un marcador seleccionado del grupo que consiste en moléculas orgánicas, marcadores enzimáticos, marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores cromogénicos, marcadores luminiscentes, haptenos, digoxigenina, biotina, 35 complejos metálicos, metales, oro coloidal y un resto que prolonga la semivida en suero de la muteína.
24. 24. La muteína de acuerdo con la reivindicación 23, en la que el resto que prolonga la semivida en suero se selecciona del grupo que consiste en una molécula de polialquilenglicol, hidroxietil almidón, ácido palmítico u otras moléculas de ácidos grasos, una parte Fc de una inmunoglobulina, un dominio CH3 de una inmunoglobulina, un dominio CH4 de una inmunoglobulina, albúmina o un fragmento de albúmina, un péptido de unión a albúmina, una proteína de unión albúmina 40 y transferrina.
25. 25. La muteína de acuerdo con la reivindicación 24, en la que la proteína de unión a albúmina es una proteína de unión a albúmina bacteriana o una muteína de lipocalina con actividad de unión por albúmina.
26. 26. La muteína de acuerdo con la reivindicación 25, en la que el dominio de albúmina bacteriana es un dominio de unión a albúmina de la proteína G estreptocócica. 45
27. 27. La muteína de acuerdo con la reivindicación 24, en la que el polialquilenglicol es polietilenglicol (PEG) o un derivado activado del mismo.
28. 28. La muteína de acuerdo con la reivindicación 24, en la que el péptido de unión a albúmina tiene la fórmula Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, en la que Xaa1 es Asp, Asn, Ser, Thr o Trp; Xaa2 es Asn, Gln, His, Ile, Leu o Lys; Xaa3 es Ala, Asp, Phe, Trp o Tyr; y Xaa4 es Asp, Gly, Leu, Phe, Ser o Thr. 50
29. 29. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-28, en la que dicho ligando no natural es una proteína o un fragmento de la misma, a condición de que el ligando no natural no sea el correceptor de linfocitos T

    humanos CD4.
30. 30. La muteína de la reivindicación 29, en la que la proteína o fragmento de la misma se selecciona del grupo de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-R2) y cadena alfa del receptor de interleucina 4 (receptor alfa de IL-4).
31. 31. La muteína de acuerdo con la reivindicación 30, en la que la proteína es el receptor alfa de IL-4. 5
32. 32. La muteína de acuerdo con la reivindicación 31, en la que la proteína es el receptor alfa de IL-4 humano.
33. 33. La muteína de acuerdo con la reivindicación 31 ó 32, en la que la proteína es una región o dominio extracelular del receptor alpha de IL-4.
34. 34. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en la que la muteína actua como un antagonista de IL-4. 10
35. 35. La muteína de acuerdo con la reivindicación 34, en la que la muteína actua como un antagonista de IL-4 humana.
36. 36. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31-35, en la que la muteína actua como un antagonista de IL-13.
37. 37. La muteína de acuerdo con la reivindicación 36, en la que la muteína actua como un antagonista de IL-13 humana.
38. 38. La muteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31-37, reaccionando de forma cruzada la muteína con el 15 receptor alfa de IL-4 de cynomolgus.
39. 39. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31-38, en la que la muteína comprende al menos dos sustituciones de aminoácidos de aminoácidos nativos por restos de cisteína en cualquiera de las posiciones 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 y 108 con respecto a la secuencia de aminoácidos de lipocalina lacrimal humana madura.
40. 40. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31-39, en la que la muteína se une a una región 20 extracelular o un dominio del receptor alfa de IL-4 con una KD de 200 nM o menor.
41. 41. La muteína de acuerdo con la reivindicación 40, en la que la muteína se une a una región extracelular o un dominio del receptor alfa de IL-4 con una KD de 100 nM o menor, o en la que la muteína se une a una región extracelular o un dominio del receptor alfa de IL-4 con una KD de 20 nM o menos, o en la que la muteína se une a una región extracelular o un dominio del receptor alfa de IL-4 con una KD de 1 nM o menor. 25
42. 42. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 41, en la que la muteína comprende al menos 12, 14 ó 16 sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana madura, que se seleccionan del grupo que consiste en Arg 26  Ser, Pro; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr, His; Leu  33, Tyr; Glu 34  Gly, Ser, Ala, Asp, Lys, Asn, Thr, Arg; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Ile, Ala, Arg, Val, Thr, Asn, Lys, Tyr, Leu, Met; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu  105 30 Cys; His 106  Pro; y Lys 108  Gln.
43. 43. La muteína de acuerdo con la reivindicación 42, que comprende adicionalmente al menos una sustitución de aminoácido adicional seleccionada del grupo que consiste en Met 39  Val; Thr 42  Met, Ala; Thr 43  Ile, Pro, Ala; Glu 45  Lys, Gly; Asn 48  Asp, His, Ser, Thr; Val 53  Leu, Phe, Ile, Ala, Gly, Ser; Thr 54  Ala, Leu; Met 55  Leu, Ala, Ile, Val, Phe, Gly, Thr, Tyr; Glu 63  Lys, Gln, Ala, Gly, Arg; Val 64  Gly, Tyr, Met, Ser, Ala, Lys, Arg, Leu, Asn, His, Thr, 35 Ile; Ala 66  Ile, Leu, Val, Thr, Met; Glu 69  Lys, Gly; Lys 70  Arg, Gln, Glu; Thr 78  Ala; Ile 89  Val; Asp 95  Asn, Ala, Gly; y Tyr 100  His.
44. 44. La muteína de acuerdo con la reivindicación 42 ó 43, en la que la muteína comprende las sustituciones de aminoácidos: Arg 26  Ser, Glu 27  Arg, Phe 28  Cys, Glu 30  Arg; Met 31  Ala, Leu  33 Tyr, Leu 56  Gin, Ile 57  Arg, Asp 80  Ser, Lys 83  Arg, Glu 104  Leu, Leu 105  Cys, His 106  Pro y Lys 108  Gln. 40
45. 45. La muteína de una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, en la que la muteína comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:

    (1) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 34  Gly; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Ile; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln; 45

    (2) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 34  Lys; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Asn; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln;

    (3) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys, Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Arg; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; 50 Lys 108  Gln;

    (4) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 34  Ser; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln;

    (5) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  His; Leu 33  Tyr; Glu 34  Ser; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Ala; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; 5 His 106  Pro; Lys 108  Gln;

    (6) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 34  Asp; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Ser 58  Lys; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln; y

    (7) Arg 26  Ser; Glu 27  Arg; Phe 28  Cys; Glu 30  Arg; Met 31  Ala; Asn 32  0 Tyr; Leu 33  Tyr; Glu 10 34  Gly; Leu 56  Gln; Ile 57  Arg; Asp 80  Ser; Lys 83  Arg; Glu 104  Leu; Leu 105  Cys; His 106  Pro; Lys 108  Gln.
46. 46. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 45, en la que la muteína tiene una secuencia de aminoácidos como se define en una cualquiera de las SEC ID Nº: 2-8 o de un fragmento de las mismas.
47. 47. La muteína de acuerdo con la reivindicación 46, en la que la muteína tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 15 Nº: 5 o de un fragmento de la misma, o en la que la muteína tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6 o de un fragmento de la misma.
48. 48. La muteína de acuerdo con la reivindicación 30, en la que el ligando es VEGF-R2.
49. 49. La muteína de acuerdo con la reivindicación 48, en la que el ligando es una región extracelular o un dominio de VEGF-R2. 20
50. 50. La muteína de acuerdo con la reivindicación 48 ó 49, en la que dicha muteína actua como un antagonista de VEGF.
51. 51. La muteína de una cualquiera de las reivindicaciones 48 a 50, en la que la muteína está undia a VEGF-R2 con una KD de 200 nM o menor, o en la que la muteína está unida a VEGF-R2 con una KD de 100 nM o menor, o en la que la muteína está unida a VEGF-R2 con una KD de 20 nM o menor, o en la que la muteína está unida a VEGF-R2 con una KD de 1 nM o menor. 25
52. 52. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 48 a 51, en la que la muteína comprende al menos 12, 14 ó 16 sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana madura, que se seleccionan del grupo que consiste en Arg 26  Ser; Glu 27  Ile; Glu 30  Ser; Met 31  Gly; Asn 32  Arg; Leu 33  Ile; Glu 34  Tyr; Leu 56  Lys, Glu, Ala, Met; Ile 57  Phe; Ser 58  Arg; Asp 80  Ser, Pro; Lys 83  Glu, Gly; Glu 104  Leu; Leu 105  Ala; His 106  Val; y Lys 108  Thr. 30
53. 53. La muteína de acuerdo con la reivindicación 52, que comprende adicionalmente al menos una sustitución de aminoácido adicional seleccionada del grupo que consiste en Leu 41Phe; Glu 63  Lys; Val 64  Met; Asp 72  Gly; Lys 76  Arg, Glu; Ile 88  Val, Thr; Ile 89  Thr; Arg 90  Lys; Asp 95  Gly; Phe 99  Leu; y Gly 107  Arg, Lys, Glu.
54. 54. La muteína de acuerdo con la reivindicación 52 ó 53, en la que la muteína comprende las sustituciones de 35 aminoácidos: Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, lle 57  Phe, Ser 58  Arg, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val y Lys 108  Thr.
55. 55. La muteína de una cualquiera de las reivindicaciones 52 a 54, en la que la muteína comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:

    (1) Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, Leu 56  40 Lys, Ile 57Phe, Ser 58  Arg, Asp 80  Ser, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val, Lys 108  Thr;

    (2) Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, Leu 56  Glu, Ile 57  Phe, Ser 58  Arg, Asp 80  Ser, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val, Lys 108  Thr; 45

    (3) Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, Leu 56  Ala, Ile 57  Phe, Ser 58  Arg, Asp 80  Ser, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val, Lys 108  Thr; y

    (4) Arg 26  Ser, Glu 27  Ile, Glu 30  Ser, Met 31  Gly, Asn 32  Arg, Leu 33  Ile, Glu 34  Tyr, Leu 56  Glu, Ile 57  Phe, Ser 58  Arg, Asp 80  Pro, Lys 83  Glu, Glu 104  Leu, Leu 105  Ala, His 106  Val, Lys 50 108  Thr.
56. 56. La muteína de cualquiera de las reivindicaciones 48 a 55, en la que la muteína tiene una secuencia de aminoácidos

    como se define en las SEC ID Nº: 34-39.
57. 57. La muteína de acuerdo con la reivindicación 30, en la que el ligando es VEGF o un fragmento del mismo.
58. 58. La muteína de acuerdo con la reivindicación 57, en la que dicha muteína actua como un antagonista de VEGF mediante la inhibición de la unión de VEGF a su receptor, en la que el receptor de VEGF se selecciona del grupo que consiste en VEGF-R1, VEGF-R2 y Neuropilina-I. 5
59. 59. La muteína de acuerdo con la reivindicación 58, en la que el receptor de VEGF es VEGF-R2.
60. 60. La muteína de una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 59, en la que la muteína está unida a VEGF con una KD de 200 nM o menor, en la que la muteína está unida a VEGF con una KD de 100 nM o menor, en la que la muteína está unida a VEGF con una KD de 20 nM o menor o en la que la muteína está unida a VEGF con una KD de 1 nM o menor.
61. 61. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 60, en la que la muteína comprende al menos 10 12, 14, 16 sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana madura, que se seleccionan del grupo que consiste en Arg 26  Ser, Pro, Val, Leu, Ile; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His, Arg, Tyr, Gln; Ile 57  Val, Thr, Leu; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile, Val; Glu 104  Cys; His 106  Asn, Ser, Asp; y Lys 108  Ala, Val. 15
62. 62. La muteína de acuerdo con la reivindicación 61, que comprende adicionalmente al menos una sustitución de aminoácidos adicional seleccionada del grupo que consiste en Val 36  Met; Thr 37  Ala; Met 39  Thr; Thr 40  Ala, Ser; Asn 48  Asp; Ala 51  Val; Lys 52  Arg; Thr 54  Val; Met 55  Val; Ser 61  Pro; Lys 65  Arg; Ala 66  Val; Val 67  Ile; Glu 69  Gly, Ser, Thr; Lys 76  Arg, Ile, Ala, Met, Pro; Tyr 87  Arg, His, Lys, Gln; Ile 89  Thr, Val, Gly, His, Met, Lys; Arg 90  Gly; Ile 98  Val; y Gly 107  Glu. 20
63. 63. La muteína de acuerdo con la reivindicación 61 ó 62, en la que la muteína comprende las sustituciones de aminoácidos: Glu 27  Gly, Phe 28  Ala, Pro 29  Leu, Glu 30  Arg, Met 31  Cys, Asn 32  Leu, Leu 33  Ala, Glu 34  Gly, Asp 80  Ile, Lys 83  Ile, Glu 104  Cys y Lys 108  Val.
64. 64. La muteína de una cualquiera de las reivindicaciones 61 a 63, en la que la muteína comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos: 25

    (1) Arg 26  Ser; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Asn; Lys 108  Val;

    (2) Arg 26  Pro; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Glu; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 30 108  Val;

    (3) Arg 26  Pro; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Asn; Lys 108  Val;

    (4) Arg 26  Pro; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33 35  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  Arg; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val;

    (5) Arg 26  Pro; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val; 40

    (6) Arg 26  Ser; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val;

    (7) Arg 26  Val; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 45 108  Val;

    (8) Arg 26  Leu; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val; y

    (9) Arg 26  Ile; Glu 27  Gly; Phe 28  Ala; Pro 29  Leu; Glu 30  Arg; Met 31  Cys; Asn 32  Leu; Leu 33 50  Ala; Glu 34  Gly; Leu 56  His; Ser 58  Lys; Asp 80  Ile; Lys 83  Ile; Glu 104  Cys; His 106  Ser; Lys 108  Val.
65. 65. La muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 64, en la que la muteína tiene una secuencia de aminoácidos como se define en las SEC ID Nº: 26-33 ó 44-47.
66. 66. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una muteína de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 65.
67. 67. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 66, comprendida en un vector. 5
68. 68. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 67, comprendida en un vector fagémido.
69. 69. Una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 66 a 68.
70. 70. Una composición farmacéutica que comprende una muteína de lipocalina lacrimal humana, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 30, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, o que comprende una muteína de lipocalina lacrimal humana, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 45, y un 10 excipiente farmacéuticamente aceptable, o que comprende una muteína de lipocalina lacrimal humana, como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 65, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
71. 71. Un procedimiento para producir una muteína de lipocalina lacrimal humana, como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 65, en la que la muteína se produce a partir del ácido nucleico que codifica la muteína por medio de procedimientos de ingeniería genética en un organismo huésped bacteriano o eucariota y aislándose de este organismo 15 huésped o su cultivo.
72. 72. Una muteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 65, para su uso como un medicamento.
73. 73. Uso de una muteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 65, para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, en el que la enfermedad o trastorno está asociado con un aumento de la respuesta inmune de Th2 o en el que la enfermedad es cáncer. 20
74. 74. El uso de la reivindicación 73, en el que la enfermedad o trastorno es una reacción alérgica o una inflamación alérgica.
75. 75. El uso de la reivindicación 74, en el que la inflamación alérgica está asociada con asma alérgica, rinitis, conjuntivitis o dermatitis.
76. 76. Uso de una muteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 65 para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, en el que la enfermedad o trastorno se selecciona del 25 grupo que consiste en enfermedades o trastornos que están causados o promovidos por un aumento de la vascularización.
77. 77. El uso de acuerdo con la reivindicación 76, en el que la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en cáncer, degeneración macular húmeda neovascular relacionada con la edad (AMD), retinopatía diabética, edema macular, retinopatía de prematuridad y oclusión de la vena retiniana. 30
78. 78. El uso de acuerdo con la reivindicación 77, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinomas del tracto gastrointestinal, recto, colon, próstata, ovario, páncreas, mama, vejiga, riñón, endometrio y pulmón, leucemia y melanoma.
79. 79. Uso de una muteína de lipocalina lacrimal humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-65 para la detección de un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana en una muestra, que comprende las etapas de 35

    (a) poner en contacto la muteína con una muestra sospechosa de contener el ligando dado en condiciones adecuadas, permitiendo de este modo la formación de un complejo entre la muteína y el ligando dado, y

    (b) detectar la muteína en complejo mediante una señal adecuada.
80. 80. Uso de una muteína de lipocalina lacrimal humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-65 para la separación de un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana, que comprende las etapas de 40

    (a) poner en contacto la muteína con una muestra que se supone contiene dicho ligando en condiciones adecuadas, permitiendo de este modo la formación de un complejo entre la muteína y el ligando dado, y

    (b) separar el complejo de muteína/ligando de la muestra.
81. 81. El uso de acuerdo con la reivindicación 79 u 80, en el que el complejo de muteína/ligando está unido a un soporte sólido. 45
82. 82. Uso de una muteína de lipocalina lacrimal humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-65 para la formación de un complejo in vitro con un ligando no natural dado de lipocalina lacrimal humana.