CN101516907B - 泪液脂质运载蛋白的突变蛋白及其获得方法 - Google Patents
泪液脂质运载蛋白的突变蛋白及其获得方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101516907B CN101516907B CN200780035208.5A CN200780035208A CN101516907B CN 101516907 B CN101516907 B CN 101516907B CN 200780035208 A CN200780035208 A CN 200780035208A CN 101516907 B CN101516907 B CN 101516907B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mutain
- tear lipocalin
- seq
- vegf
- people
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及来自人泪液脂质运载蛋白的新的突变蛋白。本发明还涉及编码这样的突变蛋白的相应核酸分子及其产生方法。本发明还涉及产生这样的突变蛋白的方法。最后,本发明涉及包含这样的脂质运载蛋白突变蛋白的药物组合物以及该突变蛋白的多种用途。
Description
本申请要求2006年8月1日提交的美国临时申请号60/821,073及2007年4月16日提交的美国临时申请号60/912,013的优先权,其内容就所有目的而言均整体并入本文作为参考。
本发明涉及来自人泪液脂质运载蛋白(tear lipocalin)的新型突变蛋白,该突变蛋白以可检测的亲和力与给定的非天然配体结合。本发明还涉及编码这样的突变蛋白的相应核酸分子及其产生方法。本发明还涉及用于产生这样的突变蛋白的方法。最后,本发明涉及包含这样的脂质运载蛋白突变蛋白的药物组合物以及该突变蛋白的多种用途。
脂质运载蛋白蛋白家族(Pervaiz,S.和Brew,K.(1987)FASEB J.1,209-214)的成员通常是小分泌蛋白,其通过一系列不同的分子识别特性来表征:其结合多种(注意为疏水的)分子(例如类视黄醇、脂肪酸、胆固醇、前列腺素、胆绿素、外激素、促味剂和芳香剂)的能力、其结合特异性细胞表面受体及其形成大分子复合体的能力。尽管过去它们主要归类为转运蛋白,但现在明白了脂质运载蛋白实现多种生理功能。这些生理功能包括在视黄醇转运、嗅觉、外激素信号转导和前列腺素合成中的作用。脂质运载蛋白还涉及免疫应答的调节和细胞内稳态的介导(综述于例如Flower,D.R.(1996)Biochem.J.318,1-14和Flower,D.R.等(2000)Biochim.Biophys.Acta 1482,9-24)。
脂质运载蛋白通常共有低水平的总体序列保守性,序列同一性常低于20%。与此截然相反的是,它们的总体折叠模式高度保守。脂质运载蛋白结构的中心部分由一个8条链的反向平行β折叠组成,该β折叠自身折回形成连续的氢键键合的β桶。该桶的一端被跨过其底部的N端肽区段以及连接该β链的三个肽环在空间上封闭。该β桶的另一端对溶剂开放,并包 含由四个肽环形成的靶标结合位点。正是由于其他部分为刚性的脂质运载蛋白支架中的这种环多样性才产生了多种不同的结合模式,它们各自能够容纳不同大小、形状和化学特征的靶标(综述于例如Flower,D.R.(1996),见上文;Flower,D.R.等(2000),见上文;或者Skerra,A.(2000)Biochim.Biophys.Acta 1482,337-350)。
人泪液前清蛋白(现在称为泪液脂质运载蛋白,TLPC或Tlc)最初描述为人泪液的主要蛋白质(约为总蛋白质含量的三分之一),但最近也已在若干其他分泌组织(包括前列腺、鼻粘膜和气管粘膜)中鉴定到。已经在大鼠、猪、狗和马中发现了同源蛋白。泪液脂质运载蛋白是一种不常见的脂质运载蛋白成员,因为它在相对不溶性脂质及结合特征方面高度混杂,这区别于该蛋白家族的其他成员(综述于Redl,B.(2000)Biochim.Biophys.Acta 1482,241-248)。大量不同化学类别的亲脂性化合物例如脂肪酸、脂肪醇、磷脂、糖脂和胆固醇等都是该蛋白的内源性配体。有意思的是,与其他脂质运载蛋白相反,对烷基酰胺和脂肪酸而言,配体(靶标)结合强度都与羟基尾相关。因此,泪液脂质运载蛋白与溶解性最低的脂质结合最强(Glasgow,B.J.等(1995)Curr.Eye Res.14,363-372;Gasymov,O.K.等(1999)Biochim.Biophys.Acta 1433,307-320)。
人泪液脂质运载蛋白的确切生物功能目前尚未完全阐明,并且仍然存在争论。在泪液中,它似乎通过将脂质从眼的粘膜表面移动到液相而对泪膜的完整性非常重要(综述于Gasymov,O.K.等(1999),同上)。然而,它在体外显示出在脂质运载蛋白中非常罕见的其他活性,即抑制半胱氨酸蛋白酶以及非特异性的内切核酸酶活性(van’t Hof,W.等(1997)J.Biol.Chem.272,1837-1841;Yusifov,T.N.等(2000)Biochem.J.347,815-819)。最近已经证明,泪液脂质运载蛋白能够在体外结合多种脂质过氧化产物,从而产生了这一假说,即它可能作为对可能有害的亲脂性分子的由生理氧化应激诱发的清除剂(Lechner,M.等(2001)Biochem.J.356,129-135)。
通过非共价相互作用结合其相应靶标的蛋白质总体而言作为试剂在生物技术、医学、生物分析学以及生物及生命科学中发挥重要的作用。抗 体(即免疫球蛋白)是这类蛋白质的一个突出的例子。尽管在与配体/靶标的识别、结合和/或分离方面对这些蛋白质存在多方面的需求,但几乎仅有免疫球蛋白是目前使用的。对其他具有确定的配体结合特征的蛋白质(例如凝集素)的应用仍仅限于特殊的情况。
近来,脂质运载蛋白家族的成员成为了关于具有确定配体结合特性的蛋白质的研究的主题。PCT公开WO 99/16873公开了在四个肽环的区域中具有突变氨基酸位置的脂质运载蛋白家族多肽,这四个肽环排列在包含结合口袋的圆桶状β-桶结构的末端,并对应于包含甘蓝菜粉蝶(Pierisbrassicae)后胆色素结合蛋白中28至45、58至69、86至99和114至129位氨基酸的线性多肽序列中的那些区段。
PCT公开WO 00/75308公开了特异性结合洋地黄毒苷(digoxigenin)的后胆色素结合蛋白的突变蛋白,而国际专利申请WO 03/029463和WO03/029471分别涉及人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)和载脂蛋白D的突变蛋白。为了进一步改善和细调脂质运载蛋白变体的配体亲和力、特异性和折叠稳定性,已经提出了使用不同脂质运载蛋白家族成员的多种方法(Skerra,A.(2001)Rev.Mol.Biotechnol.74,257-275;Schlehuber,S.以及Skerra,A.(2002)Biophys.Chem.96,213-228),例如替换额外的氨基酸残基。PCT公开WO 2006/56464公开了在低纳摩尔范围内对CTLA-4具有结合亲和力的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的突变蛋白。
PCT公开WO 2005/19256公开了具有不同或相同靶配体的至少一个结合位点的泪液脂质运载蛋白突变蛋白,并提供了产生这样的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的方法。根据该PCT申请,对泪液脂质运载蛋白一级序列中的某些氨基酸串(特别是包含成熟人泪液脂质运载蛋白的氨基酸7-14、24-36、41-49、53-66、69-77、79-84、87-98和103-110的环区域)进行诱变,以产生具有结合亲和力的突变蛋白。所得突变蛋白对选定的配体的结合亲和力(KD)在纳摩尔范围内,在多数情况下>100nM。
尽管存在这一进步,但即便只是为了进一步改善人泪液脂质运载蛋白 突变蛋白在诊断及治疗应用中的适用性,也仍期望能有用于产生对选定靶分子具有改善的结合特性(例如在皮摩尔范围内)的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的方法,
因此,本发明的一个目的是提供对给定靶标具有高结合亲和力的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白。
该目的通过产生具有独立权利要求中所述特征的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白来实现。
在第一个方面中,本发明提供用于产生人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的方法,其中所述突变蛋白以可检测的结合亲和力与人泪液脂质运载蛋白的给定非天然配体结合,该方法包括:
(a)将编码人泪液脂质运载蛋白的核酸分子在天然成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的26-34、56-58、80、83、104-106和108位氨基酸序列中任何位置的至少一个密码子进行诱变,其中将成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列中61和153位序列位的至少一个编码半胱氨酸残基的密码子突变成编码任一其他氨基酸残基,从而获得多种编码人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的核酸,
(b)在表达系统中表达(a)中得到的一种或多种突变蛋白核酸分子,从而获得一种或多种突变蛋白,和
(c)通过选择和/或分离富集步骤(b)中获得的对人泪液脂质运载蛋白的给定非天然配体具有可检测的结合亲和力的一种或多种突变蛋白。
在这种情况下,应该注意,本发明人出乎意料地发现,(在各个天然核酸文库水平上)除去野生型泪液脂质运载蛋白中由半胱氨酸残基61与153形成的结构二硫键(参阅Breustedt,等(2005),The crystalstructure of human tear lipocalin reveals an extended branched cavity withcapacity for multiple ligands.J.Biol.Chem.280,484-493)提供了这样的泪液脂质运载蛋白突变蛋白,其不仅稳定折叠,而且以低皮摩尔范围内的亲和力与给定的非天然配体结合。不希望被理论束缚,还认为去除结构二硫键提供了额外的优点,例如在本发明突变蛋白中(自发)产生或故意引入 非天然人工二硫键,从而提高突变蛋白稳定性(参见实施例)。
本文使用的术语“诱变”指选择这样的实验条件,其使得人泪液脂质运载蛋白(Swiss-Prot数据库条目P31025)中给定序列位置的天然氨基酸可被在各自天然多肽序列中不存在于该特定位置的至少一个氨基酸所替换。术语“诱变”还包括通过缺失或插入一个或多个氨基酸而对序列区段的长度进行(进一步)修饰。因此,本发明范围内包括例如用一段三个随机突变替换选定序列位置的一个氨基酸,使得与野生型蛋白质的各自区段的长度相比插入了两个氨基酸残基。这样的插入或缺失可彼此独立地在可进行本发明诱变的任何肽区段引入。在本发明的一个示例性实施方案中,可以在选定的脂质运载蛋白骨架的环AB中引入多个突变的插入(参阅国际专利申请WO 2005/019256,其整体并入本文作为参考)。术语“随机诱变”指在诱变过程中不存在某序列位置处预定的单个氨基酸(突变),而是在预定的序列位置处可以一定的概率掺入至少两个氨基酸。
使用人泪液脂质运载蛋白的编码序列(Redl,B.等(1992)J.Biol.Chem.267,20282-20287)作为本发明中选定的肽区段诱变的起点。对于所引用氨基酸位置的诱变,本领域技术人员根据其需求可使用多种用于定点诱变的成熟的标准方法(Sambrook,J.等(1989),同上)。一种普遍使用的技术是通过PCR(聚合酶链式反应)引入突变,其中使用在所需序列位置具有简并碱基组成的合成寡核苷酸混合物。例如,使用密码子NNK或NNS(其中N=腺嘌呤、鸟嘌呤或者胞嘧啶或胸腺嘧啶;K=鸟嘌呤或胸腺嘧啶;S=腺嘌呤或胞嘧啶)允许在诱变过程中掺入所有20种氨基酸和琥珀型终止密码子,而密码子VVS将可能掺入的氨基酸限制在12种,因为不将氨基酸Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val掺入多肽序列的选定位置;例如,使用密码子NMS(其中M=腺嘌呤或胞嘧啶)将选定序列位置处可能掺入的氨基酸数限制在11种,因为它不将氨基酸Arg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Val掺入选定的序列位置。就此而言,应该注意,(除20种天然氨基酸以外的)其他氨基酸如硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸的密码子也可掺入突变蛋白的核酸中。如Wang,L.,等(2001)Science 292,498-500或Wang,L.和Schultz,P.G.(2002)Chem.Comm.1,1-11所述,还有可能使用通常被识别为终止密码子的“人工”密码子如UAG来插入其他罕见氨基酸,例如邻甲基-L-酪氨酸或对氨基苯丙氨酸。
使用碱基对特异性降低的核苷酸构件(例如肌苷、8-氧代-2’脱氧尿苷或6(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3,4-二氢-8H-嘧啶-1,2-噁嗪-7-酮(Zaccolo等(1996)J.Mol.Biol.255,589-603)是向选定的序列区段中引入突变的另一种选择。
另一种可能性是所谓的三联体诱变。该方法使用不同核苷酸三联体的混合物(各编码一种氨基酸)掺入到编码序列中( B,Ge L,Plückthun A,Schneider KC,Wellnhofer G,Moroney SE.1994Trinucleotide phosphoramidites:ideal reagents for the synthesis of mixedoligonucleotides for random mutagenesis.Nucleic Acids Res 22,5600-5607)。
在各个多肽的选定区域中引入突变的一种可能的策略是基于使用四种寡核苷酸,其中每种均部分来自相应待突变的序列区段之一。在合成这些寡核苷酸时,本领域技术人员可利用核酸构件的混合物来合成对应于待突变氨基酸位置的那些核苷酸三联体,从而随机产生编码所有天然氨基酸的密码子,最终产生脂质运载蛋白肽的文库。例如,第一种寡核苷酸的序列(除了突变位置以外)与脂质运载蛋白多肽N末端位置处的待突变肽区段的编码链对应。相应地,第二种寡核苷酸与该多肽序列中之后的第二个序列区段的非编码链对应。第三种寡核苷酸继而与第三个序列区段的编码链对应。最后,第四种寡核苷酸与第四个序列区段的非编码链对应。聚合酶链式反应可使用各自的第一种及第二种寡核苷酸进行,必要时单独地使用各自的第三种和第四种寡核苷酸进行。
可以使用多种已知方法将这两个反应的扩增产物组合成包含第一个至第四个序列区段的单个核酸,其中突变已在选定的位置引入。为此,可以使用侧翼寡核苷酸和一种或多种中介体核酸分子(其贡献第二与第三个序列区段之间的序列)将两种产物进行新的聚合酶链式反应。在选择寡核 苷酸序列中用于诱变的数目和排列时,本领域技术人员根据其需要有多种备选方案。
可以通过连接将上述核酸分子与缺少的编码脂质运载蛋白多肽的核酸的5’及3’序列和/或载体连接在一起,并可克隆到已知的宿主生物中。有多种成熟的方法可用于连接和克隆(Sambrook,J.等(1989),同上)。例如,可将也存在于克隆载体中的限制性内切核酸酶识别序列改造到所述合成寡核苷酸序列中。这样,在扩增各个PCR产物和酶切割后,所得的片段可以容易地使用相应的识别序列进行克隆。
也可以通过已知方法将编码选择用于诱变的蛋白质的基因中更长的序列区段进行随机诱变,例如通过在提高错误率的条件下使用聚合酶链式反应、化学诱变或使用细菌增变菌株。这些方法还可用于进一步优化脂质运载蛋白突变蛋白的靶标亲和力或特异性。实验诱变区段以外可能发生的突变通常是可以接受的,甚至已证明是有利的,例如在它们有助于改善脂质运载蛋白突变蛋白的折叠效率或折叠稳定性时。
本文使用的术语“人泪液脂质运载蛋白”指SWISS-PROT数据库登记号P31025的成熟人泪液脂质运载蛋白。
术语“非天然配体”指在生理条件下不与天然成熟人泪液脂质运载蛋白结合的化合物。该靶标(配体)可以是游离或缀合形式的显示免疫半抗原特征的任何化合物、激素如甾类激素,或其任何生物聚合物或片段,例如蛋白质或蛋白质结构域、肽、寡聚脱氧核糖核苷酸、核酸、寡糖或多糖或其缀合物、脂质或另一大分子。
在本发明的一个实施方案中,用于产生人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的方法包括对成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列中26-34、56-58、80、83、104-106和108位氨基酸序列中任何位置的至少2、3、4、5、6、8、10、12、14、15、16或17个密码子进行突变。在另一实施方案中,对成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列中26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106和108位氨基酸序列的全部18个密码子进行突变。
在另一个方面中,本发明包括用于产生人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的方法,其中所述突变蛋白以可检测的结合亲和力结合人泪液脂质运载蛋白的给定的非天然配体,该方法包括:
(a)将编码人泪液脂质运载蛋白的核酸分子在天然成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的30、80和104位氨基酸序列中任何位置的至少一个密码子进行诱变,从而获得多种编码人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的核酸,
(b)在表达系统中表达(a)中得到的一种或多种突变蛋白核酸分子,从而获得一种或多种突变蛋白,和
(c)通过选择和/或分离富集步骤(b)中获得的对人泪液脂质运载蛋白的给定非天然配体具有可检测的结合亲和力的一种或多种突变蛋白。
在上述方法的一个实施方案中,另外还对天然成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的26-33、56-58、83、105-106和108位氨基酸序列中任何位置的至少2、3、4、5、6、8、10、12、14或15个密码子进行突变。
在本发明的另一实施方案中,本发明的方法包括对天然成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的61和153位编码半胱氨酸的两个密码子同时进行突变。在一个实施方案中,将61位突变成编码丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸或色氨酸残基,这只是其中的几种可能性。在突变153位的实施方案中,可以在153位引入诸如丝氨酸或丙氨酸的氨基酸。
在本文所述的本发明一个实施方案中,对编码天然成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列中氨基酸序列位置111和/或114的密码子进行突变,例如突变成111位编码精氨酸,114位编码色氨酸。。
本发明方法的另一实施方案涉及对编码成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列中101位半胱氨酸的密码子进行诱变,以使该密码子编码任何其他氨基酸。在一个实施方案中,所述突变的101位密码子编码丝氨酸。因此,在一些实施方案中,用另一氨基酸的密码子替换61、101和153位半胱氨酸密码子中的两个或全部三个。
根据本发明的方法,从编码人泪液脂质运载蛋白的核酸开始获得了突变蛋白。对这样的核酸进行诱变并通过重组DNA技术将其引入合适的细菌或真核宿主生物中。可以使用任何本领域已知的合适技术来产生泪液脂质运载蛋白的核酸文库,以产生具有抗体样特性的脂质运载蛋白突变蛋白,即对给定靶标具有亲和力的突变蛋白。这些组合方法的实例详细描述于例如国际专利申请WO 99/16873、WO 00/75308、WO 03/029471、WO03/029462、WO 03/029463、WO 2005/019254、WO 2005/019255、WO2005/019256或WO 2006/56464。这些专利申请中每篇内容均整体并入本文作为参考。在合适的宿主中表达进行了诱变的核酸序列之后,可以从所得文库中选择出带有与给定靶标结合的各个脂质运载蛋白突变蛋白的遗传信息的克隆。可以使用熟知的技术来选择这些克隆,例如噬菌体展示(综述于Kay,B.K.等(1996)同上;Lowman,H.B.(1997)同上,或者Rodi,D.J.和Makowski,L.(1999)同上)、菌落筛选(综述于Pini,A.等(2002)Comb.Chem.High Throughput Screen.5,503-510)、核糖体展示(综述于Amstutz,P.等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12,400-405)或如Wilson,D.S.等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98,3750-3755报道的mRNA展示或者具体描述于WO 99/16873、WO 00/75308、WO 03/029471、WO 03/029462、WO 03/029463、WO 2005/019254、WO 2005/019255、WO 2005/019256或WO 2006/56464的方法。
根据本文的公开内容,在上述方法的另一实施方案中,步骤(c)还包括:
(i)提供选自以下的化合物作为给定的配体:例如游离或缀合形式的显示免疫半抗原特征的化合物、肽、蛋白质或其他大分子如多糖、核酸分子(例如DNA或RNA)或完整的病毒颗粒或类病毒,
(ii)将多种突变蛋白与所述配体接触,以允许所述配体与对所述配体具有结合亲和力的突变蛋白之间形成复合体,和
(iii)除去无结合亲和力或无实质结合亲和力的突变蛋白。
在本发明的一些实施方案中,所述配体可以是蛋白质或其片段。在一 个实施方案中,排除与T细胞共同受体CD4结合的突变蛋白。
在本发明方法的一个实施方案中,步骤(c)中的选择在竞争性条件下进行。本文使用的“竞争性条件”指突变蛋白的选择包括至少一个将突变蛋白与人泪液脂质运载蛋白(靶标)的给定的非天然配体在其他配体存在下进行接触的步骤,所述其他配体与突变蛋白竞争结合靶标。这种其他配体可以是靶标的生理配体,过量的靶标本身或者靶标的任何其他生理配体,其至少与本发明突变蛋白所识别表位重叠的表位结合,因此干扰该突变蛋白的靶标结合。或者,所述其他配体通过别构效应将与突变蛋白的结合位点不同的表位与靶标络合而竞争突变蛋白的结合。
给出了使用温和噬菌体M13进行的噬菌体展示技术实施方案(综述于Kay,B.K.等(1996),同上;Lowman,H.B.(1997)同上,或者Rodi,D.J.和Makowski,L.(1999),同上)作为本发明可以使用的选择方法的实例。可用于选择本发明突变蛋白的噬菌体展示技术的另一实施方案是如Broders等(Broders等(2003)“Hyperphage.Improving antibody presentation inphage display.”Methods Mol.Biol.205:295-302)所述的超级噬菌体(hyperphage)技术。其他温和噬菌体(如f1)或溶菌性噬菌体(如T7)也可以使用。就示例性选择方法而言,产生了M13噬菌粒,其允许将突变的脂质运载蛋白核酸序列表达为在N端与信号序列(优选OmpA信号序列)融合并在C端与噬菌体M13衣壳蛋白pIII或其能掺入噬菌体衣壳的片段融合的融合蛋白。优选使用包含野生型序列的氨基酸217至406的噬菌体衣壳蛋白的C端片段ΔpIII来产生融合蛋白。在一个实施方案中,特别优选的是其中201位半胱氨酸残基缺失或被另一氨基酸替换的pIII C端片段。
因此,本发明方法的另一实施方案中包括将编码多种人泪液脂质运载蛋白突变蛋白并由3’末端诱变所导致的核酸分子与编码M13家族丝状噬菌体衣壳蛋白pIII或该衣壳蛋白片段的基因有效融合,以选择至少一种与给定配体结合的突变蛋白。
该融合蛋白可包含额外的组分,例如允许固定、检测和/或纯化该融合 蛋白或其部分的亲和标记。此外,可将终止密码子置于编码脂质运载蛋白或其突变蛋白的序列区与噬菌体衣壳基因或其片段之间,其中该终止密码子(优选为琥珀型终止密码子)在适当的抑制菌株中翻译时至少部分翻译成氨基酸。
例如,本文描述的质粒载体pTLPC27(现在也称为pTlc27),可用于制备编码人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的噬菌粒文库。使用两个BstXI限制性位点将本发明编码泪液脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子插入载体中。连接之后,用所得的核酸混合物转化合适的宿主菌株,例如大肠杆菌XL1-Blue,以获得大量独立的克隆。需要时,可产生用于制备超级噬菌粒文库的相应载体。
接着,使用适当的M13辅助噬菌体或超级噬菌体,将所得文库在液体培养物中进行超感染(superinfect),以产生功能性噬菌粒。重组噬菌粒在其表面上以带有衣壳蛋白pIII或其片段的融合蛋白形式展示泪液脂质运载蛋白突变蛋白,而该融合蛋白的N端信号序列通常被切掉。另一方面,它还带有由辅助噬菌体提供的天然衣壳蛋白pIII的一个或多个拷贝,因此它能感染受者,所述受者一般是带有F或F’质粒的细菌菌株。对于超级噬菌体展示的情况,超级噬菌粒在其表面上以带有感染性衣壳蛋白pIII而不是天然衣壳蛋白的融合蛋白形式展示脂质运载蛋白突变蛋白。在用辅助噬菌体或超级噬菌体感染过程中或感染之后,可以诱导基因表达脂质运载蛋白突变蛋白与衣壳蛋白pIII的融合蛋白,例如通过加入无水四环素来诱导。将诱导条件选择成使得所得噬菌粒中的大部分在其表面上展示至少一个脂质运载蛋白突变蛋白。对于超级噬菌体展示的情况,诱导条件产生带有3至5个融合蛋白的超级噬菌粒群,所述融合蛋白由脂质运载蛋白突变蛋白和衣壳蛋白pIII组成。已知有多种方法来分离噬菌粒,例如用聚乙二醇进行沉淀。一般在6-8小时的孵育期后进行分离。
接着通过与期望的靶标一起孵育来对所分离的噬菌粒进行选择,其中所述靶标以允许将噬菌粒至少暂时固定的形式存在,所述噬菌粒在衣壳中带有具有期望的结合活性的突变蛋白作为融合蛋白。在本领域技术人员已 知的多个实施方案中,靶标可以例如与载体蛋白(如血清白蛋白)缀合,并通过该载体蛋白与蛋白质结合表面(例如聚苯乙烯)结合。适用于ELISA技术的微量滴定板或所谓的“免疫棒(immuno-stick)”可优选地用于这样的靶标固定。或者,可以使用靶标与其他结合基团(如生物素)的缀合物。接着可将靶标固定在选择性结合该基团的表面上,例如包被有链霉亲和素、中性亲和素(neutravidin)或亲和素的微量滴定板或顺磁性颗粒。如果靶标与免疫球蛋白的Fc部分融合,那么也可以固定在表面上,例如包被有A蛋白或G蛋白的微量滴定板或顺磁性颗粒。
可以像ELISA方法中已知的那样,用封闭液饱和表面上存在的非特异性噬菌粒结合位点。接着一般在生理缓冲液存在下使噬菌粒与固定在表面上的靶标接触。多次洗涤除去未结合的噬菌粒。接着洗脱表面上剩余的噬菌粒颗粒。例如,可通过加入蛋白酶或者在酸、碱、洗涤剂或离液盐存在下或在适度变性的条件下洗脱噬菌粒。一个优选方法是使用pH 2.2的缓冲液洗脱,其中接着中和洗脱液。或者,可以加入游离靶标的溶液以与固定靶标竞争结合噬菌粒,或者可通过与特异性结合目的靶标的免疫球蛋白或中性配体蛋白竞争来洗脱靶标特异性噬菌粒。
其后,用洗脱的噬菌粒感染大肠杆菌细胞。或者,可以从洗脱的噬菌粒中提取核酸并用于后续的分析、扩增或以其他方式转化细胞。从这样获得的大肠杆菌克隆开始,根据上述方法通过用M13辅助噬菌体或超级噬菌体进行超感染而再次产生新的噬菌粒或超级噬菌粒,并将这样扩增的噬菌粒再次以固定的靶标进行选择。经常需要多个选择循环才能以足够丰富的形式获得带有本发明突变蛋白的噬菌粒。优选地,将选择循环数选择成使得在后续的功能分析中至少0.1%所研究的克隆产生对给定靶标具有可检测亲和力的突变蛋白。根据所使用文库的大小(即复杂性),一般需要2至8个循环来达到这一目的。
对于选定突变蛋白的功能分析,用从选择循环中获得的噬菌粒感染大肠杆菌菌株,并分离相应的双链噬菌粒DNA。从该噬菌粒DNA开始或者从提取自该噬菌粒的单链DNA开始,可通过本领域已知的方法测定本发 明选定突变蛋白的核酸序列,并可由此推断出氨基酸序列。可以在另一表达载体中亚克隆完整泪液脂质运载蛋白突变蛋白的突变区或序列,并在合适的宿主生物中表达。例如,可以使用载体pTLPC26(现在也称为pTlc26)在大肠杆菌菌株(如大肠杆菌TG1)中表达。可通过多种生物化学方法纯化这样产生的泪液脂质运载蛋白突变蛋白。所产生(例如用pTlc26产生)的泪液脂质运载蛋白突变蛋白在其C端带有亲和肽Strep-tag II(Schmidt等,同上),因此优选地可通过链霉亲和素亲和层析来纯化。
还可以通过其他方法进行选择。许多相应的实施方案是本领域技术人员已知的,或者已在文献中描述。此外,可以使用方法的组合。例如,可以对通过“噬菌体展示”选择或至少富集的克隆再进行“菌落筛选”。该方法在产生对靶标具有可检测的结合亲和力的泪液脂质运载蛋白突变蛋白这方面具有这样的优点,即可以直接分离各个克隆。
除了使用大肠杆菌在“噬菌体展示”技术或“菌落筛选”方法中作为宿主生物以外,其他细菌菌株、酵母或者昆虫细胞或哺乳动物细胞也可用于该目的。除了从上述随机文库中选择泪液脂质运载蛋白突变蛋白以外,还可以使用进化方法(包括限制性诱变),以在重复筛选循环后对已对靶标具有一定结合活性的突变蛋白在亲和力或特异性方面进行优化。
一旦选择了对给定靶标具有亲和力的突变蛋白,还可以对这样的突变蛋白进行另一诱变,以随后选择具有更高亲和力的变体,或者选择具有改进的特性(如更高的热稳定性;提高的血清稳定性、热力学稳定性;提高的溶解度;改进的单体行为;对热变性、化学变性、蛋白水解或去污剂提高的抗性等)。这一其他诱变(在目的为更高亲和力的情况下可认为是体外“亲和力成熟”)可通过基于推理性设计的位点特异性突变或随机突变来实现。获得更高亲和力或改进特性的另一种可能的方法是使用易错PCR,这导致在脂质运载蛋白突变蛋白的选定序列位置范围中产生点突变。易错PCR可根据任何已知的方案来进行,例如Zaccolo等(1996)J.Mol.Biol.255,589-603所述的方案。适用于这些目的的其他随机诱变方法包括如Murakami,H等(2002)Nat.Biotechnol.20,76-81所述的随机插入/缺失 (RID)诱变或者如Bittker,J.A等(2002)Nat.Biotechnol.20,1024-1029所述的非同源随机重组(NRR)。需要时,还可以根据WO 00/75308或Schlehuber,S.等,(2000)J.Mol.Biol.297,1105-1120中公开的方法进行亲和力成熟,在该方法中获得了对洋地黄毒苷具有高亲和力的后胆色素结合蛋白的突变蛋白。
在另一个方面中,本发明涉及对给定的人泪液脂质运载蛋白非天然配体具有可检测结合亲和力的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白,该突变蛋白可通过本发明上述方法获得,或者通过本发明上述方法获得。
在一个实施方案中,根据上述方法获得的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括:成熟人泪液脂质运载蛋白中序列位置61和153的半胱氨酸残基中的至少一个或两个被其他氨基酸替换,以及序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中任何位置的至少一个氨基酸残基的突变。在泪液脂质运载蛋白β-桶结构开口端的结合位点中,24-36位包含在AB环中,53-66位包含在CD环中,69-77位包含在EF环中,103-110位包含在GH环中。本文中这四个环的定义与Flower(Flower,D.R.(1996),同上,以及Flower,D.R.等(2000),同上)一致。通常,这样的突变蛋白在成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中包含至少2、3、4、5、6、8、10、12、14、15、16、17或18个突变的氨基酸残基。在一个具体的实施方案中,上述突变蛋白包含以下氨基酸替换:Cys 61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Tyr、Met、Ser、Pro或Trp,以及Cys 153→Ser或Ala。这样的替换已证明可用于防止形成连接Cys 61与Cys 153的天然二硫键,因此有利于操作该突变蛋白。
在另一实施方案中,所述突变蛋白包含选自Arg 111→Pro和Lys 114→Trp的至少一个额外的氨基酸替换。本发明的突变蛋白还可包含用其他氨基酸替换天然成熟人泪液脂质运载蛋白序列中101位的半胱氨酸。例如,该替换可以是突变Cys 101→Ser或Cys 101→Thr。
该突变蛋白所结合的非天然配体可以是蛋白质或其片段,前提为在一些实施方案中可以排除人T细胞共同受体CD4作为非天然靶标。
本发明的泪液脂质运载蛋白突变蛋白可在突变的氨基酸序列位置以外包含野生型(天然)氨基酸序列。另一方面,本文公开的泪液脂质运载蛋白突变蛋白还可在进行诱变的序列位置以外也包含氨基酸突变,只要这些突变不干扰该突变蛋白的结合活性和折叠即可。可以使用成熟的标准方法(Sambrook,J.等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)非常容易地在DNA水平实现这些突变。可能的氨基酸序列改变是插入或缺失以及氨基酸替换。这样的替换可以是保守性的,即氨基酸残基被化学上相似的氨基酸残基替换。保守性替换的实例是以下组中成员之间的替换:1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸;2)天冬氨酸和谷氨酸;3)天冬酰胺和谷氨酰胺;4)精氨酸和赖氨酸;5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸;以及6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面,还可以在氨基酸序列中引入非保守性改变。此外,作为替换单个氨基酸残基的替代,还可以插入或缺失泪液脂质运载蛋白一级结构中的一个或多个连续氨基酸,只要这些缺失或插入产生稳定折叠/功能性的突变蛋白即可(例如,参阅其中产生具有截短的N端和C端的突变蛋白的实验章节)。
这样的氨基酸序列修饰包括定向诱变单个氨基酸位置,以通过引入某些限制性酶的切割位点而简化突变的脂质运载蛋白基因或其部分的亚克隆。此外,还可掺入这些突变以进一步改善脂质运载蛋白突变蛋白对给定靶标的亲和力。另外,必要时可以引入突变以调节突变蛋白的某些特征,例如提高折叠稳定性、血清稳定性、蛋白抗性或水溶性,或者降低聚集倾向。例如,可将天然半胱氨酸残基突变成其他氨基酸,以防止形成二硫键。然而,也可以故意将其他氨基酸序列位置突变成半胱氨酸,以引入新的反应基团,例如用于缀合到其他化合物(例如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、生物素、肽或其他蛋白质)或者形成非天然的二硫键。向人泪液脂质运载蛋白突变蛋白氨基酸序列中引入半胱氨酸残基的此类突变的示例可能性包括以下替换:Thr 40→Cys、Glu 73→Cys、Arg 90→Cys、Asp 95→Cys和Glu 131→Cys。例如,在氨基酸位置40、73、90、95和 /或131中任何位置侧面产生的硫羟部分可用于对突变蛋白进行PEG化或HES化,以提高各自泪液脂质运载蛋白突变蛋白的血清半衰期。在任一这些序列位置引入半胱氨酸的突变蛋白S236.1-A22(见实施例46)是这些本发明突变蛋白的一个说明性实例。
本发明还涵盖上述突变蛋白,其中成熟人泪液脂质运载蛋白序列的前四个N端氨基酸残基(His-His-Leu-Leu;1-4位)和/或成熟人泪液脂质运载蛋白序列的C端最后两个氨基酸残基(Ser-Asp;157-158位)被缺失(还参见实施例及所附序列表)。
本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能以可检测的亲和力(即解离常数至少为200nM)与期望的靶标结合。在一些实施方案中,优选为以对给定靶标至少为100、20、1nM或更低的解离常数与期望靶标结合的脂质运载蛋白突变蛋白。突变蛋白与期望靶标的结合亲和力可通过多种方法测量,例如荧光滴定、竞争ELISA或表面等离振子共振(BIAcore)。
对本领域技术人员显而易见的是,复合体的形成取决于许多因素,例如结合配偶体的浓度、竞争剂的存在、缓冲体系的离子强度等。选择和富集通常在允许分离脂质运载蛋白的条件下进行,所述脂质运载蛋白在与期望靶标复合时解离常数至少为200nM。然而,可以在多种严格度条件下进行洗涤和洗脱步骤。还可以在动力学特征方面进行选择。例如,可以在这样的条件下进行选择,该条件有利于与靶标显示缓慢解离(即低Koff速率)的突变蛋白与靶标形成复合体。或者,可以在这样的条件下进行选择,所述条件有利于快速形成突变蛋白与靶标的复合体,换句话说,高Kon速率。作为另一示例性替代方案,筛选可以在选择突变蛋白提高的热稳定性(与野生型泪液脂质运载蛋白或对预定靶标已具有亲和力的突变蛋白相比)的条件下进行。
本发明的泪液脂质运载蛋白突变蛋白作为单体蛋白存在。然而本发明的脂质运载蛋白突变蛋白有可能能够自发二聚化或寡聚化。尽管对一些应用而言可能优选使用形成稳定单体的脂质运载蛋白突变蛋白(例如由于更快的扩散和更好的组织透过性),但在另一些情况下使用自发形成稳定同 型二聚体或多聚体的脂质运载蛋白突变蛋白可能是有利的,因为这些多聚体可提供对给定靶标(进一步)提高的亲和力和/或亲合力。此外,寡聚体形式的脂质运载蛋白突变蛋白可具有更慢的解离速率或延长的血清半衰期。如果期望使形成稳定单体的突变蛋白二聚化或多聚化,这可通过例如将各自寡聚化结构域(如jun-fos结构域或亮氨酸拉链)与本发明突变蛋白融合或通过使用“双运载蛋白(Duocalin)”(见下文)来实现。
本发明的泪液脂质运载蛋白突变蛋白可用于与给定靶标形成复合体。所述靶标可以是非天然靶标/配体。所述靶标(配体)可以是任何显示免疫半抗原特征的游离或缀合形式的化合物、激素例如甾类激素或其生物聚合体或片段,例如蛋白质或蛋白质结构域、肽、寡聚脱氧核糖核苷酸、核酸、寡糖或多糖或其缀合物。在本发明的一个实施方案中,靶标是蛋白质,其前提为排除人T细胞共同受体CD4。该蛋白质可以是任何球形可溶性蛋白质或受体蛋白,例如参与细胞信号转导的跨膜蛋白、免疫系统的组分如MHC分子或指示特定疾病的细胞表面受体。所述突变蛋白还可以仅与蛋白质片段结合。例如,突变蛋白可与细胞表面受体的结构域结合(当它是锚着在细胞膜上的受体部分时)以及与溶液中的相同结构域结合(如果该结构域可产生为可溶性蛋白)。然而,本发明决不仅限于仅结合这些大分子靶标的突变蛋白。而是也可以通过诱变获得泪液脂质运载蛋白突变蛋白,其对(较)低分子量配体(如生物素、荧光素或洋地黄毒苷)显示特异性结合亲和力。
在本发明的一个实施方案中,被泪液脂质运载蛋白突变蛋白结合的配体是蛋白质或其片段,其选自血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)和白介素4受体α链(IL-4受体α),或其片段。配体还包括VEGF-R2或IL-4受体α的胞外区域或结构域。这些配体一般为哺乳动物来源。在一些实施方案中,这些配体为人来源,但它们也可以为小鼠、大鼠、猪、马、狗、猫或牛或猕猴来源,以上仅为少数示例性实例。
人VEGF可选自VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D,并可具 有SWISS PROT数据库登记号P15692、P49765、P49767和O43915(SEQID No.:22-25)所示氨基酸序列或其片段。一个这样的示例性片段由VEGF-A的氨基酸8至109组成。人血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)可具有SWISS PROT数据库登记号P35968(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列或其片段。这些片段的示例性实例包括VEGF-R2的胞外Ig样C2型结构域1至7,分别包含氨基酸46至110、141至207、224至320、328至414、421至548、551至660以及667至753。人白介素4受体α可具有SWISS PROT数据库登记号P24394(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列或其片段。人白介素4受体α链的片段的示例性实例包括IL-4受体α的氨基酸26至232。
一般而言,就本发明泪液脂质运载蛋白突变蛋白的蛋白质配体而言,本文使用的术语“片段”涉及N端和/或C端缩短的蛋白质或肽配体,其保持全长配体被本发明突变蛋白识别和/或结合的能力。
因此,本发明的另一个方面涉及人泪液脂质运载蛋白突变蛋白,其在成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的序列位置24-36、53-66、79-84和103-110中两个或更多个位置处包含至少一个突变氨基酸残基,并结合IL-4受体α、VEGF-R2或VEGF。
结合IL-4受体α的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白可作为IL-4拮抗剂和/或IL-13拮抗剂。在一个实施方案中,所述人泪液脂质运载蛋白突变蛋白作为人IL-4和/或IL-13的拮抗剂。在另一实施方案中,所述突变蛋白与猕猴配体如IL-4和/或IL-13交叉反应,并因此作为猕猴IL-4受体α的拮抗剂。
相对于成熟人泪液脂质运载蛋白氨基酸序列而言,结合IL-4受体α的本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白可包含天然成熟人泪液脂质运载蛋白的26-34、56-58、80、83、104-106和108中任何位置上用半胱氨酸残基替换天然氨基酸残基的至少两个氨基酸替换。一般而言,这样的突变蛋白以200nM或更低、100nM或更低、20nM或更低或者1nM的KD或甚至在皮摩尔范围内的KD与IL-4受体α的胞外区或结构域结合。因此, 本发明还涵盖以900pM或更低、600pM或更低、500pM或更低、250pM、100pM或更低、60pM或更低或者40pM或更低的KD与IL-4受体结合的泪液脂质运载蛋白突变蛋白。测定突变蛋白-配体复合体的KD值的合适方法为本领域技术人员已知,并且包括荧光滴定、竞争ELISA、量热法如等温滴定量热法(ITC)以及表面等离振子共振。这些方法的实例在下文中详细描述(参见如实施例6、8、14、16、22、24和27)。
在这种情况下,还应注意,各个突变蛋白与其配体之间复合体的形成受到多种不同因素的影响,例如各结合配偶体的浓度、竞争剂的存在、所用缓冲体系的pH和离子强度,以及用于测定解离常数KD的实验方法(例如荧光滴定、竞争ELISA或表面等离振子共振,以上仅为几个实例)或甚至用于评价实验数据的数学算法。
因此,本领域技术人员也十分清楚,本文给出的KD值(各个突变蛋白与其配体形成的复合体的解离常数)可在一定实验范围内变化,这取决于用于测定特定脂质运载蛋白突变蛋白对给定配体的亲和力的方法和实验设置。这意味着,取决于例如是通过表面等离振子共振(Biacore)还是通过竞争ELISA测定KD值,所测得的KD值可能稍有变化或者是可接受的范围。
在本发明一个具体的实施方案中,这样的突变蛋白相对于成熟人泪液脂质运载蛋白的氨基酸序列而言包含选自以下的至少6、8、10、12、14或16个氨基酸替换:Arg 26→Ser、Pro;Glu 27→Arg;Phe 28→Cys;Glu30→Arg;Met 31→Ala;Asn 32→Tyr、His;Leu 33→Tyr;Glu 34→Gly、Ser、Ala、Asp、Lys、Asn、Thr、Arg;Leu 56→Gln;Ile 57→Arg;Ser 58→Ile、Ala、Arg、Val、Thr、Asn、Lys、Tyr、Leu、Met;Asp 80→Ser;Lys 83→Arg;Glu 104→Leu;Leu 105→Cys;His 106→Pro;以及Lys 108→Gln。
此外,这样的突变蛋白还可包含选自以下的至少一个氨基酸替换:Met 39→Val;Thr 42→Met、Ala;Thr 43→Ile、Pro、Ala;Glu 45→Lys、Gly;Asn 48→Asp、His、Ser、Thr;Val 53→Leu、Phe、Ile、Ala、Gly、 Ser;Thr 54→Ala、Leu;Met 55→Leu、Ala、Ile、Val、Phe、Gly、Thr、Tyr;Glu 63→Lys、Gln、Ala、Gly、Arg;Val 64→Gly、Tyr、Met、Ser、Ala、Lys、Arg、Leu、Asn、His、Thr、Ile;Ala 66→Ile、Leu、Val、Thr、Met;Glu 69→Lys、Gly;Lys 70→Arg、Gln、Glu;Thr 78→Ala;Ile 89→Val;Asp 95→Asn、Ala、Gly;以及Tyr 100→His。
在一个实施方案中,与IL-4受体α结合的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白包含以下氨基酸替换:Arg 26→Ser、Glu 27→Arg、Phe 28→Cys、Glu 30→Arg;Met 31→Ala、Leu 33→Tyr、Leu 56→Gln、Ile 57→Arg、Asp 80→Ser、Lys 83→Arg、Glu 104→Leu、Leu 105→Cys、His 106→Pro和Lys 108→Gln。
在另一实施方案中,与IL-4受体α结合的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白包含以下氨基酸替换组之一:
(1)Arg 26→Ser;Glu 27→Arg;Phe 28→Cys;Glu 30→Arg;Met 31→Ala;Asn 32→Tyr;Leu 33→Tyr;Glu 34→Gly;Leu 56→Gln;Ile 57→Arg;Ser 58→Ile;Asp 80→Ser;Lys 83→Arg;Glu 104→Leu;Leu 105→Cys;His 106→Pro;Lys 108→Gln;
(2)Arg 26→Ser;Glu 27→Arg;Phe 28→Cys;Glu 30→Arg;Met 31→Ala;Asn 32→Tyr;Leu 33→Tyr;Glu 34→Lys;Leu 56→Gln;Ile 57→Arg;Ser 58→Asn;Asp 80→Ser;Lys83→Arg;Glu 104→Leu;Leu 105→Cys;His 106→Pro;Lys108→Gln;
(3)Arg 26→Ser;Glu 27→Arg;Phe 28→Cys,Glu 30→Arg;Met31→Ala;Asn 32→Tyr;Leu 33→Tyr;Leu 56→Gln;Ile 57→Arg;Ser 58→Arg;Asp 80→Ser;Lys 83→Arg;Glu 104→Leu;Leu 105→Cys;His 106→Pro;Lys 108→Gln;
(4)Arg 26→Ser;Glu 27→Arg;Phe 28→Cys;Glu 30→Arg;Met 31→Ala;Asn 32→Tyr;Leu 33→Tyr;Glu 34→Ser;Leu 56→Gln;Ile 57→Arg;Asp 80→Ser;Lys 83→Arg;Glu 104→Leu;Leu 105→Cys;His 106→Pro;Lys 108→Gln;
(5)Arg 26→Ser;Glu 27→Arg;Phe 28→Cys;Glu 30→Arg;Met 31→Ala;Ash 32→His;Leu 33→Tyr;Glu 34→Ser;Leu56→Gln;Ile 57→Arg;Ser 58→Ala;Asp 80→Ser;Lys 83→Arg;Glu 104→Leu;Leu 105→Cys;His 106→Pro;Lys 108→Gln;
(6)Arg 26→Ser;Glu 27→Arg;Phe 28→Cys;Glu 30→Arg;Met 31→Ala;Asn 32→Tyr;Leu 33→Tyr;Glu 34→Asp;Leu 56→Gln;Ile 57→Arg;Ser 58→Lys;Asp 80→Ser;Lys83→Arg;Glu 104→Leu;Leu 105→Cys;His 106→Pro;Lys108→Gln;and
(7)Arg 26→Ser;Glu 27→Arg;Phe 28→Cys;Glu 30→Arg;Met31→Ala;Asn 32→Tyr;Leu 33→Tyr;Glu 34→Gly;Leu 56→Gln;Ile 57→Arg;Asp 80→Ser;Lys 83→Arg;Glu 104→Leu;Leu 105→Cys;His 106→Pro;Lys 108→Gln。
与IL-4受体α结合的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白可包含、基本组成为或组成为:SEQ ID NO:2-8所示氨基酸序列任一个或其片段或变体。在一个实施方案中,本发明的突变蛋白包含、基本组成为或组成为:SEQ IDNO:5或6所示氨基酸序列或其片段或变体。
涉及本发明的突变蛋白时,本发明使用的术语“片段”指的来自全长成熟人泪液脂质运载蛋白的N端和/或C端缩短(即缺少至少一个N端和/或C端氨基酸)的蛋白质或肽。这样的片段优选地包含成熟人泪液脂质运载蛋白一级序列的至少10个、更优选20个、最优选30个或更多连续氨基酸,并且通常可在成熟人泪液脂质运载蛋白的免疫测定中检测到。
本发明所使用的术语“变体”指蛋白质或肽的衍生物,其包含氨基酸序列的修饰,例如替换、缺失、插入或化学修饰。优选地,这样的修饰不降低该蛋白质或肽的功能性。这样的变体包括蛋白质,其中一个或多个氨基 酸被其相应的D-立体异构体取代或20种天然氨基酸以外的氨基酸(例如鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、羟赖氨酸、正缬氨酸)取代。然而,这样的替换也可以是保守性的,即氨基酸残基被化学性质相似的氨基酸残基取代。保守性替换的实例是以下组的成员之间的替换:1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸;2)天冬氨酸和谷氨酸;3)天冬酰胺和谷氨酰胺;4)精氨酸和赖氨酸;5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸;以及6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
在另一个方面中,本发明涉及与血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)或其胞外区或结构域结合的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白。通常,这样的突变蛋白作为VEGF拮抗剂,并以200nM或更低、100nM或更低、20nM或更低、15nM或更低、10nM或更低或甚至1nM或更低的KD与VEGF-R2的胞外区或结构域结合。
相对于成熟人泪液脂质运载蛋白而言,这样的突变蛋白可包含选自以下的至少6、8、10、12、14或16个氨基酸替换:Arg 26→Ser;Glu 27→Ile;Glu 30→Ser;Met 31→Gly;Asn 32→Arg;Leu 33→Ile;Glu 34→Tyr;Leu 56→Lys、Glu、Ala、Met;Ile 57→Phe;Ser 58→Arg;Asp 80→Ser、Pro;Lys 83→Glu、Gly;Glu 104→Leu;Leu 105→Ala;His 106→Val;以及Lys 108→Thr,并且还可包含选自以下的至少一个氨基酸替换:Leu 41→Phe;Glu 63→Lys;Val 64→Met;Asp 72→Gly;Lys 76→Arg、Glu;Ile 88→Val、Thr;Ile 89→Thr;Arg 90→Lys;Asp 95→Gly;Phe 99→Leu;以及Gly 107→Arg、Lys、Glu。
在一个具体的实施方案中,这样的突变蛋白包含以下氨基酸替换:Arg26→Ser,Glu 27→Ile,Glu 30→Ser,Met 31→Gly,Asn 32→Arg,Leu33→Ile,Glu 34→Tyr,Ile 57→Phe,Ser 58→Arg,Lys 83→Glu,Glu104→Leu,Leu 105→Ala,His 106→Val,和Lys 108→Thr。
以可检测的亲和力与VEGF-R2胞外区或结构域结合的本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白可包含以下氨基酸替换组之一:
(1)Arg 26→Ser,Glu 27→Ile,Glu 30→Ser,Met 31→Gly,Asn 32→Arg,Leu 33→Ile,Glu 34→Tyr,Leu 56→Lys,Ile 57→Phe,Ser 58→Arg,Asp 80→Ser,Lys 83→Glu,Glu 104→Leu,Leu 105→Ala,His 106→Val,Lys 108→Thr;
(2)Arg 26→Ser,Glu 27→Ile,Glu 30→Ser,Met 31→Gly,Asn32→Arg,Leu 33→Ile,Glu 34→Tyr,Leu 56→Glu,Ile 57→Phe,Ser 58→Arg,Asp 80→Ser,Lys 83→Glu,Glu 104→Leu,Leu 105→Ala,His 106→Val,Lys 108→Thr;
(3)Arg 26→Ser,Glu 27→Ile,Glu 30→Ser,Met 31→Gly,Asn32→Arg,Leu 33→Ile,Glu 34→Tyr,Leu 56→Ala,Ile 57→Phe,Ser 58→Arg,Asp 80→Ser,Lys 83→Glu,Glu 104→Leu,Leu 105→Ala,His 106→Val,Lys 108→Thr;和
(4)Arg 26→Ser,Glu 27→Ile,Glu 30→Ser,Met 31→Gly,Asn32→Arg,Leu 33→Ile,Glu 34→Tyr,Leu 56→Glu,Ile 57→Phe,Ser 58→Arg,Asp 80→Pro,Lys 83→Glu,Glu 104→Leu,Leu 105→Ala,His 106→Val,Lys 108→Thr。
在本发明的一个实施方案中,与VEGF-R2结合的突变蛋白包含、基本组成为或组成为:SEQ ID No:34-39所示任一氨基酸序列。
在另一实施方案中,本发明涉及与血管内皮生长因子(VEGF)结合的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白。通常,这样的突变蛋白通过抑制VEGF与VEGF受体结合而作为VEGF拮抗剂,并以200nM或更低、100nM或更低、20nM、5nM或更低或甚至1nM或更低的KD与VEGF结合。
相对于成熟人泪液脂质运载蛋白而言,可通过本发明方法获得的这样的突变蛋白可包含选自以下的至少6、8、10、12、14或16个氨基酸替换:Arg 26→Ser、Pro、Val、Leu、Ile;Glu 27→Gly;Phe 28→Ala;Pro 29→Leu;Glu 30→Arg;Met 31→Cys;Asn 32→Leu;Leu 33→Ala;Glu 34→Gly;Leu 56→His、Arg、Tyr、Gln;Ile 57→Val、Thr、Leu;Ser 58→Lys;Asp 80→Ile;Lys 83→Ile、Val;Glu 104→Cys;His 106→Asn、Ser、Asp;以及Lys 108→Ala、Val,并且还可包含选自以下的至少一个氨基 酸替换:Val 36→Met;Thr 37→Ala;Met 39→Thr;Thr 40→Ala、Ser;Asn 48→Asp;Ala 51→Val;Lys 52→Arg;Thr 54→Val;Met 55→Val;Ser 61→Pro;Lys 65→Arg;Ala 66→Val;Val 67→Ile;Glu 69→Gly、Ser、Thr;Lys 76→Arg、Ile、Ala、Met、Pro;Tyr 87→Arg、His、Lys、Gln;Ile 89→Thr、Val、Gly、His、Met、Lys;Arg 90→Gly;Ile 98→Val和Gly 107→Glu。
在一个实施方案中,这样的与VEGF结合的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白包含以下氨基酸替换:Glu 27→Gly,Phe 28→Ala,Pro 29→Leu,Glu 30→Arg,Met 31→Cys,Asn 32→Leu,Leu 33→Ala,Glu 34→Gly,Asp 80→Ile,Lys 83→Ile,Glu 104→Cys,和Lys 108→Val。
在另一具体的实施方案中,与VEGF结合的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白可包含选自以下的氨基酸替换组之一:
(1)Arg 26→Ser;Glu 27→Gly;Phe 28→Ala;Pro 29→Leu;Glu30→Arg;Met 31→Cys;Asn 32→Leu;Leu 33→Ala;Glu 34→Gly;Leu 56→His;Ser 58→Lys;Asp 80→Ile;Lys 83→Ile;Glu 104→Cys;His 106→Asn;Lys 108→Val;
(2)Arg 26→Pro;Glu 27→Gly;Phe 28→Ala;Pro 29→Leu;Glu 30→Arg;Met 31→Cys;Asn 32→Leu;Leu 33→Ala;Glu 34→Gly;Leu 56→His;Ser 58→Glu;Asp 80→Ile;Lys83→Ile;Glu 104→Cys;His 106→Ser;Lys 108→Val;
(3)Arg 26→Pro;Glu 27→Gly;Phe 28→Ala;Pro 29→Leu;Glu 30→Arg;Met 31→Cys;Asn 32→Leu;Leu 33→Ala;Glu 34→Gly;Leu 56→His;Ser 58→Lys;Asp 80→Ile;Lys83→Ile;Glu 104→Cys;His 106→Asn;Lys 108→Val;
(4)Arg 26→Pro;Glu 27→Gly;Phe 28→Ala;Pro 29→Leu;Glu 30→Arg;Met 31→Cys;Asn 32→Leu;Leu 33→Ala;Glu 34→Gly;Leu 56→Arg;Ser 58→Lys;Asp 80→Ile;Lys83→Ile;Glu 104→Cys;His 106→Ser;Lys 108→Val;
(5)Arg 26→Pro;Glu 27→Gly;Phe 28→Ala;Pro 29→Leu;Glu 30→Arg;Met 31→Cys;Asn 32→Leu;Leu 33→Ala;Glu 34→Gly;Leu 56→His;Ser 58→Lys;Asp 80→Ile;Lys83→Ile;Glu 104→Cys;His 106→Ser;Lys 108→Val;
(6)Arg 26→Ser;Glu 27→Gly;Phe 28→Ala;Pro 29→Leu;Glu30→Arg;Met 31→Cys;Asn 32→Leu;Leu 33→Ala;Glu 34→Gly;Leu 56→His;Ser 58→Lys;Asp 80→Ile;Lys 83→Ile;Glu 104→Cys;His 106→Ser;Lys 108→Val;
(7)Arg 26→Val;Glu 27→Gly;Phe 28→Ala;Pro 29→Leu;Glu 30→Arg;Met 31→Cys;Asn 32→Leu;Leu 33→Ala;Glu 34→Gly;Leu 56→His;Ser 58→Lys;Asp 80→Ile;Lys83→Ile;Glu 104→Cys;His 106→Ser;Lys 108→Val;
(8)Arg 26→Leu;Glu 27→Gly;Phe 28→Ala;Pro 29→Leu;Glu 30→Arg;Met 31→Cys;Asn 32→Leu;Leu 33→Ala;Glu 34→Gly;Leu 56→His;Ser 58→Lys;Asp 80→Ile;Lys83→Ile;Glu 104→Cys;His 106→Ser;Lys 108→Val;和
(9)Arg 26→Ile;Glu 27→Gly;Phe 28→Ala;Pro 29→Leu;Glu30→Arg;Met 31→Cys;Asn 32→Leu;Leu 33→Ala;Glu 34→Gly;Leu 56→His;Ser 58→Lys;Asp 80→Ile;Lys 83→Ile;Glu 104→Cys;His 106→Ser;Lys 108→Val。
在本发明的一个实施方案中,与VEGF结合的突变蛋白包含、基本组成为或组成为SEQ ID No:26-33或SEQ ID No:44-47中任一氨基酸序列。
本发明范围内还包括在潜在免疫原性方面发生了改变的上述突变蛋白。
细胞毒性T细胞识别与I类主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原呈递细胞表面上的肽抗原。肽与MHC分子结合的能力是等位基因特异性的,并与其免疫原性相关。为了降低给定蛋白质的免疫原性,预测蛋白质中哪些肽具有与给定MHC分子结合的能力是十分有价值的。先前 已经描述了利用计算机线程法(computational threading approach)鉴定潜在T细胞表位来预测给定肽序列与I类MHC分子的结合的方法(Altuvia等(1995)J.Mol.Biol.249:244-250).
这样的方法还可用于鉴定本发明突变蛋白中的潜在T细胞表位,并用于根据其预期用途而基于其预计免疫原性选择特定的突变蛋白。它还可以对预计含有T细胞表位的肽区域进行额外的诱变,以减少或消除这些T细胞表位,从而使免疫原性最小化。从遗传改造的抗体中除去两性表位已有描述(Mateo等(2000)Hybridoma 19(6):463-471),并可适用于本发明的突变蛋白。
这样获得的突变蛋白可具有尽可能小的免疫原性,这在其治疗或诊断应用中是期望的,如下文所述。
对于一些应用,使用标记形式的本发明突变蛋白也可能是有用的。因此,本发明涉及与选自以下的标记缀合的脂质运载蛋白突变蛋白:酶标记、放射性标记、有色标记、荧光标记、生色标记、发光标记、半抗原、洋地黄毒苷、生物素、金属络合物、金属以及胶体金。突变蛋白也可以缀合到有机分子。本文使用的术语“有机分子”优选指这样的有机分子:其包含至少两个碳原子,但优选不超过7或12个可旋转的碳键,分子量为100至2000道尔顿,优选100至1000道尔顿,并任选地包含一个或两个金属原子。
一般而言,可以以任何合适的化学物质或酶来标记脂质运载蛋白突变蛋白,所述化学物质或酶在化学、物理、光学或酶促反应中直接或间接产生可检测的化合物或信号。物理反应并且同时是光学反应/标记物的实例是在照射后发出荧光或在使用放射性标记时发射X射线。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶是催化形成生色反应产物的酶标记(也是光学标记)实例。一般而言,通常用于抗体的所有标记(除了仅用于免疫球蛋白Fc部分的糖部分的标记以外)均可用于与本发明突变蛋白缀合。本发明的突变蛋白还可缀合任何合适的治疗活性剂,例如用于将这样的活性剂定向递送至给定细胞、组织或器官或者用于选择性靶定细胞(如肿瘤细胞) 而不影响周围的正常细胞。这些治疗活性剂的实例包括放射性核素、毒素、小有机分子和治疗肽(例如作为细胞表面受体激动剂/拮抗剂的肽或者竞争给定细胞靶标上蛋白质结合位点的肽)。然而,本发明的脂质运载蛋白突变蛋白还可缀合治疗活性核酸,如反义核酸分子、小干扰RNA、小RNA或核酶。这些缀合物可通过本领域熟知的方法产生。
在一个实施方案中,本发明的突变蛋白还可与靶向特定机体部位的靶向部分偶联,以将本发明突变蛋白递送至体内期望的部位或区域。可能期望这样的修饰的一个实例是穿过血脑屏障。为了穿过血脑屏障,本发明的突变蛋白可与有利于主动转运穿过该屏障的部分偶联(参阅Gaillard PJ等.Diphtheria-toxin receptor-targeted brain drug delivery.InternationalCongress Series.2005 1277:185-198或者Gaillard PJ等Targeted deliveryacross the blood-brain barrier.Expert Opin Drug Deliv.2005 2(2):299-309)。这样的部分可以例如商品名2B-TransTM(BBB technologies BV,Leiden,NL)购得。
如上述,在一些实施方案中,本发明的突变蛋白可与延长该突变蛋白的血清半衰期的部分缀合(这方面可参阅PCT公开WO 2006/56464,其中参考对CTLA-4具有结合亲和力的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的突变蛋白描述了这样的缀合策略)。延长血清半衰期的部分可以是聚(亚烷基)二醇分子、羟乙基淀粉、脂肪酸分子如棕榈酸(Vajo &Duckworth 2000,Pharmacol.Rev.52,1-9)、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白或其片段、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白、转铁蛋白,以上仅为少数实例。白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白、抗体、抗体片段,包括结构域抗体(参阅如美国专利6,696,245)或者对白蛋白有结合亲和力的脂质运载蛋白。相应地,延长本发明脂质运载蛋白突变蛋白半衰期的合适的缀合配偶体包括白蛋白(Osborn,B.L.等(2002)Pharmacokinetic and pharmacodynamicstudies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein incynomolgus monkeys J.Pharmacol.Exp.Ther.303,540-548)或者白蛋白结 合蛋白,例如细菌白蛋白结合结构域,例如链球菌G蛋白之一 T.和Skerra,A.(1998)Use of an albumin-binding domain for the selectiveimmobilisation of recombinant capture antibody fragments on ELISAplates.J.Immunol.Methods 218,73-83)。可用作缀合配偶体的白蛋白结合肽的其他实例为例如具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的那些,其中Xaa1是Asp,Asn,Ser,Thr或Trp;Xaa2是Asn,Gln,His,Ile,Leu或Lys;Xaa3是Ala,Asp,Phe,Trp或Tyr;Xaa4是Asp,Gly,Leu,Phe,Ser或Thr,如美国专利申请2003/0069395或Dennis等(Dennis,M.S.,Zhang,M.,Meng,Y.G.,Kadkhodayan,M.,Kirchhofer,D.,Combs,D.& Damico,L.A.(2002).,Albumin binding as a general strategy for improving thepharmacokinetics of proteins.”J Biol Chem 277,35035-35043)所述。
在其他实施方案中,白蛋白本身或白蛋白的生物活性片段可用作本发明脂质运载蛋白突变蛋白的缀合配偶体。术语“白蛋白”包括所有哺乳动物白蛋白,例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。白蛋白或其片段可如美国专利5,728,553或欧洲专利申请EP 0 330 451和EP 0 361 991所述重组产生。重组人白蛋白( )Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)可与脂质运载蛋白突变蛋白缀合或融合,以延长该突变蛋白的半衰期。
如果所述白蛋白结合蛋白是抗体片段,则它可以是结构域抗体。结构域抗体(dAb)被改造成允许精确控制生理特性和体内半衰期,以产生最佳的安全性及效力产品特性。结构域抗体例如可购自Domantis Ltd.(Cambridge,UK and MA,USA)。
使用转铁蛋白作为延长本发明突变蛋白血清半衰期的部分,该突变蛋白可遗传融合至非糖基化转铁蛋白的N段或C端,或者这两个末端。非糖基化的转铁蛋白具有14-17天的半衰期,转铁蛋白融合蛋白将相似地具有延长的半衰期。转铁蛋白载体还提供高生物利用率、生物分布和循环稳定性。该技术可购自BioRexis(BioRexis Pharmaceutical Corporation,PA,USA)。用作蛋白稳定剂/半衰期延长配偶体的重组人转铁蛋白 (DeltaFerrinTM)也可购自Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)。
如果使用免疫球蛋白的Fc部分来延长本发明突变蛋白的血清半衰期,则可使用可购自Syntonix Pharmaceuticals,Inc(MA,USA)的SynFusionTM技术。使用该Fc融合技术允许产生作用更长久的生物药物,并可由例如两拷贝的突变蛋白与抗体Fc区连接组成,以改进药代动力学、溶解度和生产效率。
延长本发明突变蛋白半衰期的另一替代方案是向本发明突变蛋白的N端或C端融合富含甘氨酸的长的非结构化的柔性序列(例如具有约20至80个连续甘氨酸残基的聚甘氨酸)。公开于例如WO2007/038619的这种方法也称为“rPEG”(重组PEG)。
如果使用聚(亚烷基)二醇作为缀合配偶体,则所述聚(亚烷基)二醇可以是被取代的、未取代的,直链的或分支的。还可以是活化的聚亚烷基衍生物。合适的化合物的实例为聚乙二醇(PEG)分子,如WO 99/64016、美国专利6,177,074或美国专利6,403,564中涉及干扰素的描述,或者如针对其他蛋白质的描述,如PEG修饰的天冬酰胺酶、PEG-腺苷脱氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶(参阅如Fuertges等(1990)TheClinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J.Control.Release 11,139-148)。这样的聚合物(优选聚乙二醇)的分子量为约300至约70000道尔顿,包括如分子量约10000、约20000、约30000或约40000道尔顿的聚乙二醇。此外,如美国专利6,500,930或6,620,413所述,可将碳水化合物的寡聚物和多聚体(如淀粉或羟乙基淀粉(HES))与本发明的突变蛋白缀合,以用于延长血清半衰期的目的。
如果将上述部分之一与本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白缀合,则缀合至氨基酸侧链可能是有利的。合适的氨基酸侧链可天然存在于人泪液脂质运载蛋白的氨基酸序列中,或者可通过诱变引入。对于通过诱变引入适当的结合位点的情况,一种可能性是用半胱氨酸残基替换适当位置的氨基酸。在一个实施方案中,这样的突变包括Thr 40→Cys、Glu 73→Cys、Arg 90→Cys、Asp 95→Cys或Glu 131→Cys替换中至少一个。任何这些 位置处新产生的半胱氨酸残基其后均可用于将该突变蛋白与延长该突变蛋白血清半衰期的部分(如PEG或其活化衍生物)缀合。
在另一实施方案中,为了提供用于将本发明突变蛋白与上述部分之一缀合的合适的氨基酸侧链,可通过诱变引入人工氨基酸。一般而言,这样的人工氨基酸设计成更具反应性,因此有利于缀合期望的部分。这些可通过人工tRNA引入的人工氨基酸的一个实例是对乙酰苯丙氨酸。
对于本文公开的突变蛋白的一些应用而言,以融合蛋白的形式使用它们可能是有利的。在一些实施方案中,本发明的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白在其N端或其C端与蛋白质、蛋白质结构域或肽(如信号序列和/或亲和标记)融合。
对于药物应用而言,本发明突变蛋白可与延长该突变蛋白体内血清半衰期的融合配偶体融合(也参阅PCT公开WO 2006/56464,其中参考对CTLA-4具有结合亲和力的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的突变蛋白描述了合适的融合配偶体)。与上述缀合相似,融合配偶体可以是免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白,以上仅为少数实例。再次,白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白或者对白蛋白具有结合活性的脂质运载蛋白突变蛋白。相应地,用于延长本发明脂质运载蛋白突变蛋白半衰期的合适的融合配偶体包括白蛋白(Osborn,B.L.等(2002)同上J.Pharmacol.Exp.Ther.303,540-548)或白蛋白结合蛋白,例如细菌白蛋白结合结构域,如链球菌G蛋白之一( T.和Skerra,A.(1998)同上J.Immunol.Methods 218,73-83)。Dennis等,同上(2002)或美国专利申请2003/0069395中描述的具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的白蛋白结合肽也可用作融合配偶体,其中Xaa1是Asp,Asn,Ser,Thr或Trp;Xaa2是Asn,Gln,His,Ile,Leu或Lys;Xaa3是Ala,Asp,Phe,Trp或Tyr;Xaa4是Asp,Gly,Leu,Phe,Ser或Thr。还可以使用白蛋白本身或白蛋白的生物活性片段作为本发明脂质运载蛋白突变蛋白的融合配偶体。术语“白蛋白”包括所有的哺乳动物白蛋白,例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大 鼠血清白蛋白。重组产生白蛋白或其片段为本领域所熟知,并描述于例如美国专利5,728,553、欧洲专利申请EP 0 330 451或EP 0 361 991。
融合配偶体可赋予本发明脂质运载蛋白突变蛋白新的特征,例如酶活性或对其他分子的结合亲和力。合适的融合蛋白的实例为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶、G蛋白的白蛋白结合结构域、A蛋白、抗体片段、寡聚化结构域、具有相同或不同结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(导致形成“双运载蛋白”,参阅Schlehuber,S.和Skerra,A.(2001),Duocalins,engineered ligand-binding proteins with dual specificity derivedfrom the lipocalin fold.Biol.Chem.382,1335-1342)或毒素。
特别地,可以将本发明的脂质运载蛋白突变蛋白与独立的酶活性位点融合,使得所得融合蛋白的两个“组分”都作用于给定的治疗性靶标。上述脂质运载蛋白突变蛋白的结合结构域附着至致病靶标,使得酶结构域能够消除靶标的生物功能。
亲和标记如Strep- 或Strep- II(Schmidt,T.G.M.等(1996)J.Mol.Biol.255,753-766)、myc-标记、FLAG-标记、His6-标记或HA-标记或者蛋白质如谷胱甘肽-S-转移酶也允许对重组蛋白容易地进行检测和/或纯化,并且也是优选的融合配偶体实例。最后,具有生色或发光特性的蛋白质如绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)也是用于本发明脂质运载蛋白突变蛋白的合适的融合配偶体。
本文使用的术语“融合蛋白”还包括含有信号序列的本发明脂质运载蛋白突变蛋白。多肽N端的信号序列将该多肽引导至特定的细胞区室,例如大肠杆菌的周质或真核细胞的内质网。大量的信号序列为本领域已知。用于将多肽分泌进大肠杆菌周质的一种优选信号序列是OmpA-信号序列。
本发明还涉及包含编码本文所述突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子(DNA和RNA)。由于遗传密码的简并性将某些密码子替换成代表同一氨基酸的其他密码子,因此本发明不局限于编码本发明突变蛋白的特定核酸分子,而是包括包含编码功能性突变蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。
因此,本发明还包括编码本发明突变蛋白的核酸序列,其包含天然成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中任何位置上的至少一个密码子突变,其中编码成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列中序列位置61和153的半胱氨酸残基中至少一个的密码子被突变成编码任一其他氨基酸残基。
如本文公开的本发明还包括编码泪液脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子,其包含实验诱变所指出序列位置以外的其他突变。这样的突变经常是可以容忍的,或者甚至证明可提供优点,例如如果它们有助于提高该突变蛋白的折叠效率、血清稳定性、热稳定性或配体结合亲和力的话。
本申请所述核酸分子可以与调节序列“有效连接”,以允许表达该核酸分子。
如果核酸分子(如DNA)包含含有转录和/或翻译调节相关信息的序列元件,并且这些序列与编码多肽的核苷酸序列“有效连接”,则称其“能够表达核酸分子”或能“允许表达核苷酸序列”。有效连接是其中调节性序列元件与待表达序列以允许基因表达的方式相连的连接。基因表达所需调节区的确切性质在物种之间可能有所不同,但一般而言,这些区域包含启动子,其在原核生物中包含启动子本身(即指导转录起始的DNA元件)以及在转录成RNA后发出翻译起始信号的DNA元件。这样的启动子区通常包括参与转录及翻译起始的5’非编码序列(如-35/-10盒),以及原核生物中的Shine-Dalgarno元件或真核生物中的TATA盒、CAAT序列和5’加帽元件。这些区域还可包括增强子或阻抑基因元件以及用于将天然多肽靶向至宿主细胞特定区室的翻译的信号和前导序列。
此外,3’非编码序列可包含参与转录终止、多腺苷酸化等的调节元件。然而,如果这些终止序列在特定宿主细胞中的功能不令人满意,则可将其替换成在该细胞中有功能的信号。
因此,本发明的核酸分子可包含调节序列,优选为启动子序列。在另一优选的实施方案中,本发明的核酸分子包含启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子为例如tet启动子、lacUV5启动子或T7启动子。 可用于真核细胞表达的启动子实例为SV40启动子或CMV启动子。
本发明的核酸分子还可以是载体或其他类型克隆运载体(如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人工染色体)的一部分。
在一个实施方案中,所述核酸分子包含在质粒中。噬粒载体指编码与目的cDNA融合的温和噬菌体(如M13或f1)基因间区域或其功能部分的载体。用这样的噬菌粒和合适的辅助噬菌体(如M13K07、VCS-M13或R408)超感染细菌宿主细胞后,产生完整的噬菌体颗粒,从而使得可以将所编码的异源cDNA与噬菌体表面所展示的其相应多肽物理偶联(综述于例如Kay,B.K.等(1996)Phage Display of Peptides and Proteins-ALaboratory Manual,第一版,Academic Press,New York NY;Lowman,H.B.(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26,401-424,或者Rodi,D.J.和Makowski,L.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10,87-93)。
除了上述调节序列和编码本发明脂质运载蛋白突变蛋白的核酸序列以外,这些克隆载体可包括来自与表达所使用的宿主细胞相容的物种的复制及控制序列,以及赋予转化或转染细胞可选择表型的选择标记。大量合适的克隆载体为本领域已知,并可购得。
编码本发明脂质运载蛋白突变蛋白的DNA分子(特别是含有此类脂质运载蛋白突变蛋白的编码序列的克隆载体)可转化进能表达该基因的宿主细胞中。转化可使用标准技术进行(Sambrook,J.等(1989),同上),因此,本发明还涉及含有本文所述核酸分子的宿主细胞。
在适于表达编码本发明融合蛋白的核酸序列的条件下培养转化的宿主细胞。合适的宿主细胞可以是原核细胞,如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),或者是真核的,例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、SF9或High5昆虫细胞、永生化哺乳动物细胞系(如HeLa细胞或CHO细胞)或原代哺乳动物细胞。
本发明还涉及用于产生本发明突变蛋白的方法,其中通过遗传工程方法,从编码该突变蛋白的核酸开始产生该突变蛋白、该突变蛋白的片段或该突变蛋白与另一多肽的融合蛋白。该方法还可在体内进行,上述突变蛋 白可以在例如细菌或真核宿主生物中产生,接着从该宿主生物或其培养物中分离。还可以在体外产生蛋白质,例如使用体外翻译系统。
在体内产生突变蛋白时,通过重组DNA技术(上文已概述)将编码本发明突变蛋白的核酸引入合适的细菌或真核宿主生物中。为此,首先使用成熟的标准方法(Sambrook,J.等(1989),同上)用克隆载体转化该宿主细胞,所述克隆载体包含编码本发明突变蛋白的核酸分子。接着在允许表达该异源DNA并因此允许合成相应多肽的条件下培养该宿主细胞。其后,从细胞或培养基中回收该多肽。
在本发明的一些泪液脂质运载蛋白突变蛋白中,Cys 61与Cys 153之间天然存在的二硫键被除去。因此,这样的突变蛋白(或不包含分子内二硫键的任何其他泪液脂质运载蛋白突变蛋白)可在具有还原性氧还环境的细胞区室(例如革兰氏阴性菌的胞质)中产生。对于本发明脂质运载蛋白突变蛋白包含分子内二硫键的情况,使用适当的信号序列将新生多肽引导至具有氧化性氧还环境的细胞区室中可能是优选的。这样的氧化性环境可由革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)的周质、革兰氏阳性菌的胞外环境或真核细胞的内质网腔来提供,并通常有利于形成结构性二硫键。然而,也可以在宿主细胞(优选大肠杆菌)的胞质溶胶中产生本发明的突变蛋白。在这种情况下,该多肽可以可溶并已折叠的状态直接获得,或者以包含体形式回收,其后体外复性。另一种选择是使用具有氧化性胞内环境并因此允许在胞质溶胶中形成二硫键的特定宿主菌株(Venturi M,Seifert C,Hunte C.(2002)“High level production of functional antibody Fab fragments in anoxidizing bacterial cytoplasm.”J.Mol.Biol.315,1-8.)。
然而,本发明的突变蛋白不一定仅使用遗传工程产生或生产。相反,脂质运载蛋白突变蛋白也可通过化学合成(如Merrifield固相多肽合成)或者体外转录和翻译获得。例如,可以使用分子建模鉴定有希望的突变,接着在体外合成需要(设计)的多肽并研究对给定靶标的结合活性。固相和/或溶液相合成蛋白质的方法为本领域所熟知(综述于例如Lloyd-Williams,P.等(1997)Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins.CRC Press,Boca Raton,Fields,G.B.,以及Colowick,S.P.(1997)Solid-Phase Peptide Synthesis.Academic Press,SanDiego,或者Bruckdorfer,T.等(2004)Curr.Pharm.Biotechnol.5,29-43)。
在另一实施方案中,本发明的突变蛋白可使用本领域技术人员已知的成熟方法通过体外转录/翻译产生。
本发明还涉及包含至少一种本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白或其融合蛋白或缀合物以及可药用赋形剂的药物组合物。
本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可通过对蛋白质药物而言有疗效的任何肠胃外或非肠胃外(肠内)途径给药。肠胃外施用法包括如皮内、皮下、肌内、气管内、鼻内、玻璃体内或静脉内的注射及输注技术,例如注射液、输注液或酊剂以及气雾剂装置和吸入(例如气雾剂混合物)、喷雾剂或粉剂的形式。肺部药物递送(即通过吸入气雾剂(也可用于鼻内给药)或气管内滴注)的概述由例如J.S.Patton等The lungs as a portal of entryfor systemic drug delivery.Proc.Amer.Thoracic Soc.2004 Vol.1338-344页给出。非肠胃外递送模式为例如经口(例如丸剂、片剂、胶囊剂、溶液剂或混悬剂形式)或直肠(如栓剂形式)。根据需要,本发明的突变蛋白可在含有常规无毒可药用赋形剂或载体、添加剂和运载体的制剂中全身或局部给药。
在本发明的一个实施方案中,所述药物肠胃外施用至哺乳动物(特别是人)。相应的给药方法包括但不仅限于例如皮内、皮下、肌内、气管内或静脉内的注射及输注技术,例如注射液、输注液或酊剂以及气雾剂装置和吸入(例如气雾剂混合物)、喷雾剂或粉剂的形式。静脉内及皮下输注和/或注射的组合对于血清半衰期相对短的化合物可能是最方便的。所述药物组合物可以是水溶液、水包油乳剂或油包水乳剂。
就这一点而言,应该注意,如Meidan VM和Michniak BB 2004 Am.J.Ther.11(4):312-316所述的经皮递送技术(如离子电渗、超声促渗或纤维针增强递送)也可用于经皮递送本文所述突变蛋白。非肠胃外递送模式为例如经口(例如丸剂、片剂、胶囊剂、溶液剂或混悬剂形式)或直肠施用 (如栓剂形式)。本发明的突变蛋白可在含有常规无毒可药用赋形剂或载体、添加剂和运载体的制剂中全身或局部给药。
所施用的突变蛋白剂量可在宽范围内变化,以实现期望的预防效果或治疗应答。例如,这将取决于该化合物对选定配体的亲和力以及该突变蛋白与该配体的复合体在体内的半衰期。此外,最佳剂量将取决于该突变蛋白或其融合蛋白或其缀合物的生物分布、给药模式、受治疾病/病症的严重程度以及患者的医学状况。例如,当在软膏剂中用于局部施用时,可以使用高浓度的泪液脂质运载蛋白突变蛋白。然而,如果需要的话,也可在持续释放制剂中给予该突变蛋白,例如脂质体分散体或基于水凝胶的聚合物微球体,如PolyActiveTM或OctoDEXTM(参阅Bos等,Business Briefing:Pharmatech 2003:1-6)。其他可用的持续释放制剂为例如基于PLGA的聚合物(PR pharmaceuticals)、基于PLA-PEG的水凝胶(Medincell)以及基于PEA的聚合物(Medivas)。
因此,可使用可药用成分和成熟的制备法将本发明的突变蛋白配制成组合物(Gennaro,A.L和Gennaro,A.R.(2000)Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第二十版,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA)。为了制备药物组合物,可以使用药学惰性的无机或有机赋形剂。为了制备如丸剂、粉剂、明胶胶囊剂或栓剂,可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然及硬化的油。用于产生溶液剂、混悬剂、乳剂、气雾剂混合物或粉剂(在使用前将粉剂重建成溶液剂或气雾剂混合物)的合适赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其合适的混合物以及植物油。
所述药物组合物还可包含添加剂,例如填充剂、粘合剂、湿润剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂,以及溶剂或增溶剂或用于实现贮存效应的试剂。后者是融合蛋白可掺入缓慢或持续释放或靶向递送系统(如脂质体和微囊剂)。
可通过多种方法对制剂进行灭菌,包括通过截留细菌的滤器过滤,或通过以无菌固体组合物的形式掺入消毒剂,所述消毒剂可在临用前溶于或 分散于无菌水或其他无菌介质中。
本发明的另一方面涉及治疗疾病或病症的方法,包括对有此需要的受试者施用包含上述突变蛋白的药物组合物。
需要这些治疗的受试者可以是哺乳动物,例如人、狗、小鼠、大鼠、猪、猿(如猕猴),以上仅为几个示例性实例。
待根据本发明治疗的疾病和病症的确切性质取决于所使用突变蛋白预期结合的配体。因此,本发明的突变蛋白可用于治疗任何疾病,只要已知参与该疾病或病症的发生的靶分子可展示为本发明核酸文库的表达产物或展示为以其他方式获得的泪液脂质运载蛋白突变蛋白即可。
上述以高亲和力结合IL-4受体α的突变蛋白或含有它们的药物组合物可用于治疗与Th2免疫应答提高相关的疾病或病症的方法。例如,这样的疾病或病症可以是变态反应或变应性炎症。上述变应性炎症又可与变应性哮喘、鼻炎、结膜炎或皮炎相关(参阅Hage等,Crystal Structure of theInterleukin-4 Receptor alpha chain complex reveals a mosaic bindinginterface,Cell,Vol.97,271-281,April 16,1999或者Mueller等,Structure,binding and antagonists in the IL-4/IL-13receptor system,Biochemica etBiophysica Acta(2002),237-250)。
在这种情况下,应该注意,多种肿瘤细胞表达比正常细胞更多数量的高亲和力IL-4受体。这些细胞包括例如人实体瘤如黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、间皮瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、肾细胞癌、头颈癌、AIDS相关的卡波西肉瘤=AIDS KS、激素依赖性及非依赖性前列腺癌细胞以及来自前列腺瘤的原代培养物(参阅Garland L,Gitlitz B,等,Journal ofImmunotherapy.28:376-381,No.4,Jul-Aug 2005;Rand RW,KreitmanRJ,等Clinical Cancer Research.6:2157-2165,Jun 2000;Husain SR,Kreitman RJ,等Nature Medicine.5:817-822,Jul 1999;Puri RK,HoonDS,等Cancer Research.56:5631-5637,15Dec 1996,10.Debinski W,PuriR等,或Husain SR,Behari N,等Cancer Research.58:3649-3653,15 Aug1998,Kawakami K,Leland P,等Cancer Research.60:2981-2987,1 Jun 2000;或者Strome SE,Kawakami K,等Clinical Cancer Research.8:281-286,Jan 2002)。例如,已证实过表达IL-4受体的细胞的具体实例包括但不仅限于Burkitt淋巴瘤细胞系Jijoye(B细胞淋巴瘤)、前列腺癌(LNCaP、DU145)、头颈癌(SCC、KCCT873)、胰腺癌(PANC-1细胞系)、SCC-25:13.000(+/-500)h头颈癌细胞系(ATCC)。IL4Rα链在IL4内化中发挥重要作用。因此,当与毒素融合或缀合时,与IL-4受体α链结合的泪液脂质运载蛋白突变蛋白还可用于治疗肿瘤(癌症)。合适的毒素的实例包括假单胞菌外毒素、百日咳毒素、白喉毒素、蓖麻毒蛋白、肥皂草毒蛋白、假单胞菌外毒素、刺孢霉素或其衍生物、紫杉烷、maytansinoid、tubulysin和多拉司他汀类似物。多拉司他汀类似物的实例包括但不仅限于auristatin E、monomethylauristatin E、auristatin PYE和auristatin PHE。
就癌症治疗而言,还可以将结合IL-4受体α链的突变蛋白与细胞抑制剂缀合。这些细胞抑制剂的实例包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、泰索帝(多西他赛)、紫杉醇、蒽环类抗生素(多柔比星)、氨甲喋呤、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春烯碱、达卡巴嗪、环磷酰胺、依托泊苷、阿霉素、喜树碱、考布他汀A-4相关化合物、氨磺酰类、噁二唑啉类、苯并[b]噻吩合成螺酮缩醇吡喃、单四氢呋喃化合物、curacin和curacin衍生物、甲氧基雌二醇衍生物和亚叶酸。
就这方面而言,还应该指出,本发明泪液脂质运载蛋白突变蛋白与毒素或细胞抑制剂的融合物或缀合物当然不仅限于对IL-4受体α链有亲和力的突变蛋白。相反,对于本领域技术人员显而易见的是,与癌细胞表面表达的受体结合的任何泪液脂质运载蛋白突变蛋白都可以融合蛋白或缀合物的形式用于治疗癌症。
以高亲和力与VEGF-R2或VEGF结合的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白或包含它们的药物组合物可用于治疗与血管化作用提高的疾病或病症,例如癌症、新血管湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变或黄斑水肿、早产儿视网膜病变或视网膜静脉闭塞。这样的癌症可选自胃肠道、直肠、结肠、前列腺、卵巢、胰腺、乳腺、膀胱、肾、子宫内膜 和肺的癌症、白血病和黑素瘤,以上仅为少数实例。
从上文的公开内容中很明显的是,本发明的突变蛋白或其融合蛋白或缀合物可用于许多应用中。一般而言,这样的突变蛋白可用于所有使用抗体的应用,除了特别依赖于Fc部分的糖基化的以外。
因此,在本发明的另一个方面中,本发明的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白用于检测人泪液脂质运载蛋白的给定的非天然配体。这一用途可包括以下步骤:在适当条件下使该突变蛋白接触怀疑含有给定配体的样品,以允许该突变蛋白与该给定配体形成复合体,并通过适当的信号检测复合的突变蛋白。
可检测信号可通过如上述的标记产生,或通过由于结合(即复合物形成)本身而导致的物理特性的变化而产生。一个实例是等离振子表面共振,其数值在结合配偶体结合时发生改变,所述配偶体之一固定在表面上,例如金箔上。
本文所述人泪液脂质运载蛋白突变蛋白还可用于分离人泪液脂质运载蛋白的给定非天然配体。这样的用途可包括以下步骤:在适当条件下使该突变蛋白接触推测含有给定配体的样品,以允许该突变蛋白与该给定配体形成复合体,并从样品中分离突变蛋白/配体复合体。
在突变蛋白用于检测给定非天然配体和分离给定配体的用途中,突变蛋白和/或靶标均可固定在合适的固相上。
本发明的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白还可用于将化合物靶向至预选的部位。就这样的目的而言,将突变蛋白与目的化合物接触,以允许形成复合体。接着将该突变蛋白与目的化合物的复合体递送至预选部位。该用途特别适用于(但不仅限于)将药物(选择性)递送至生物体中的预选部位,例如旨在用该药物进行治疗的受到感染的机体部分、组织或器官。除了在突变蛋白与目的化合物之间形成复合体以外,突变蛋白还可以与给定的化合物反应,以得到突变蛋白与化合物的缀合物。与上述复合体相似,这样的缀合物可适用于将化合物递送至预定的靶部位。这样的突变蛋白与化合物的缀合物还可包括将突变蛋白和化合物彼此共价连接的接头。任选 地,这样的接头在血流中稳定,但在细胞环境中可被切割。
因此,本文所述突变蛋白及其衍生物可以与抗体或其片段相似地用于许多领域。除了与支持物结合以允许固定或分离给定突变蛋白的靶标或该靶标的缀合物或融合蛋白以外,该突变蛋白还可用于以酶、抗体、放射性物质或任何其他具有生物化学活性或确定的结合特征的基团进行标记。这样,它们各自的靶标或其缀合物或融合蛋白可以被检测或者与它们接触。例如,本发明的突变蛋白可用于通过成熟的分析法(如ELISA或Western印迹)或通过显微术或免疫传感器来检测化学结构。这里,检测信号可使用合适的突变蛋白缀合物或融合蛋白直接产生,或者通过以抗体对结合的突变蛋白进行免疫化学检测而间接产生。
医学领域中还存在本发明突变蛋白的众多可能的应用。除了在诊断和药物递送中的用途以外,可以产生与例如组织或肿瘤特异性细胞表面分子结合的本发明突变多肽。这样的突变蛋白例如可以缀合形式或作为融合蛋白用于“肿瘤成像”或直接用于癌症治疗。
因此,本发明还涉及本发明的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白用于与给定非天然配体形成复合体的用途。
本文所述突变蛋白的另一相关并优选的用途是靶标确认,即分析推测参与疾病或病症的发生或发展的多肽是否确实以某种方式导致该疾病或病症。这种确认蛋白质作为药理学药物靶标的用途利用本发明突变蛋白特异性识别天然构象蛋白质的表面区(即结合天然表位)的能力。在这方面,应该注意,该能力仅在少数重组抗体中有过报道。然而,本发明突变蛋白用于确认药物靶标的用途不仅限于检测蛋白质作为靶标,而且还包括检测蛋白质结构域、肽、核酸分子、有机分子或金属络合物。
通过以下非限制性实例和附图进一步说明本发明,其中:
图1显示表达载体pTLPC10(SEQ ID NO:1)的图。
图2显示S148.3J14的多肽序列,S148.3J14是一种对IL-4受体α具有结合亲和力的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白。
图3显示通过ELISA进行的亲和力筛选方法,以及对IL-4受体α具 有亲和力的突变蛋白得到的结果。
图4显示对IL-4受体α具有最高亲和力的突变蛋白的多肽序列(SEQID No:3-8)。
图5显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S148.3 J14;SEQ IDNO:2)与IL-4受体α的结合的BIAcore测量。
图6显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S191.5 K12;SEQ IDNO:3)与IL-4受体α的结合的BIAcore测量。
图7显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S148.3 J14AM2C2;SEQ ID NO:4)与IL-4受体α的结合的BIAcore测量。
图8显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S191.4B24;SEQ IDNO:5)与IL-4受体α的结合的BIAcore测量。
图9显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S191.4 K19;SEQ IDNO:6)与IL-4受体α的结合的BIAcore测量。
图10显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S191.5 H16;SEQ IDNO:7)与IL-4受体α的结合的BIAcore测量。
图11显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S197.8 D22;SEQ IDNO:8)与IL-4受体α的结合的BIAcore测量。
图12显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S148.3 J14;SEQ IDNO:2)与IL-4受体α的结合的竞争性ELISA测量。
图13显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S191.5 K12;SEQ IDNO:3)与IL-4受体α的结合的竞争性ELISA测量。
图14显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S148.3 J14AM2C2;SEQ ID NO:4)与IL-4受体α的结合的竞争性ELISA测量。
图15显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S191.4 B24;SEQ IDNO:5)与IL-4受体α的结合的竞争性ELISA测量。
图16显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S191.4 K19;SEQ IDNO:6)与IL-4受体α的结合的竞争性ELISA测量。
图17显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白竞争性(S191.5 H16; SEQ ID NO:7)与IL-4受体α的结合的竞争性ELISA测量。
图18显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S197.8D22;SEQ IDNO:8)与IL-4受体α的结合的竞争性ELISA测量。
图19显示IL-4或IL-13及本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S191.5K12、S148.3J14AM2C2、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16和S197.8D22[SEQ ID No:3-8])存在下的TF-1细胞增殖测定。
图20显示表达载体pTLPC27(SEQ ID NO:9)的图。
图21显示在人VEGF165及本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S209.2C23、S209.2D16、S209.2N9、S209.6H7、S209.6H10、S209.2M17、S209.2O10[SEQ ID NOs:27-33])、野生型泪液脂质运载蛋白(pTLPC10的基因产物,对照)或 (Roche;对照)存在下由人脐静脉(HUVEC)培养的内皮细胞的增殖测定。
图22显示PEG化的本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S148.3J14;SEQ ID NO:2)与IL-4受体α的结合的BIAcore测量。
图23显示本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S236.1-A22、SEQ IDNO:44)与固定的VEGF8-109的结合的BIAcore测量。
图24显示hVEGF8-109、hVEGF121、剪接形式hVEGF165及相应小鼠直向同源物mVEGF164与人泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22(SEQ IDNO:44)结合的BIAcore测量。
图25显示人泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)在人血浆和玻璃体液中稳定性测试的结果(图25A),以及突变蛋白S236.1-A22与白蛋白结合结构域(ABD)的融合蛋白(SEQ ID NO:51)的稳定性测试结果(图25B)。
图26显示表达载体pTLPC51,其编码包含以下的融合蛋白:OmpA信号序列(OmpA)、与白蛋白结合结构域(abd)融合的突变人泪液脂质运载蛋白(Tlc),其后为Strep-tag II。
图27显示泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)和突变蛋白S236.1-A22与ABD的融合蛋白(SEQ ID NO:51)与重组VEGF 结合的BIAcore测量。
图28显示在人血清白蛋白(HAS)不存在或存在下用S236.1-A22与ABD的融合蛋白(SEQ ID NO:51)抑制VEGF诱导的HUVEC增殖。
图29显示与 和野生型泪液脂质运载蛋白所实现的抑制相比,脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)对培养自人脐静脉(HUVEC)的内皮细胞的VEGF诱导的增殖的抑制。
图30显示与 所实现的抑制相比,脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)对HUVEC中VEGF介导的MAP激酶激活的抑制。
图31显示与 和野生型泪液脂质运载蛋白相比,局部施用泪液脂质运载蛋白突变蛋白S209.2_O10(SEQ ID NO:33)的血管通透性测定的结果。
图32显示比较泪液脂质运载蛋白突变蛋白S209.2_O10(SEQ IDNO:33)与 和野生型泪液脂质运载蛋白的中值血管发生指数的CAM测定结果。
图33显示泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)和突变蛋白S236.1-A22与ABD的融合蛋白(SEQ ID NO:51)的NMRI小鼠血浆中的脂质运载蛋白浓度。
图34显示与野生型泪液脂质运载蛋白、PBS缓冲液和 相比,全身施用泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22与ABD的融合蛋白(SEQID NO:51)后血管通透性测定的结果。
图35显示与野生型泪液脂质运载蛋白、PBS缓冲液和 相比,腹膜内施用泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22与ABD的融合蛋白(SEQ ID NO:51)的肿瘤异种移植物模型(Swiss裸鼠)的结果。
图36显示在存在和不存在浓度逐渐提高的IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24(SEQ ID NO:4)的情况下用IL-4或IL-13刺激的A549细胞进行的嗜酸性粒细胞活化趋化因子(Eotaxin)-3分泌测定的结果。
图37显示在存在和不存在浓度逐渐提高的IL-4受体α结合突变蛋白 S191.4B24(SEQ ID NO:4)时,经刺激的外周血单核细胞(PBMC)中IL-4/IL-13诱导的CD23表达。
图38显示IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24(SEQ ID NO:4)的Schild分析结果。
图39显示IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24(SEQ ID NO:4)对人原代B细胞的亲和力评估的结果。
图40显示IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24在静脉内、皮下或气管内给药后的生物利用率测试的结果。
图41显示VEGF刺激的HUVEC增殖测定中以PEG20、PEG30或PEG40PEG化或未PEG化的突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)的体外功效评估。
图1显示了表达载体pTLPC10,其编码包含OmpA信号序列(OmpA)、T7亲和标记和突变人泪液脂质运载蛋白(Tlc)、其后为Strep-tagII的融合蛋白。用于克隆突变基因表达盒的BstXI限制性位点和结构基因侧翼的限制性位点均已标记。基因表达在四环素启动子/操纵基因(tetp/o)控制之下。转录在脂蛋白转录终止子(tlpp)处终止。该载体还包含复制起点(ori)、丝状噬菌体f1的基因间区域(f1-IG)、氨苄青霉素抗性基因(amp)和四环素抑制基因(tetR)。将pTLPC10核酸序列的相关区段与序列表中SEQ ID NO:1所编码氨基酸序列一起复制。该区段从XbaI限制性位点开始,以HindIII限制性位点结束。该区域以外的载体元件与载体pASK75相同,其完整核苷酸序列在德国专利公开DE 44 17 598 A1中给出。
图2显示对IL-4受体α显示结合亲和力的本发明人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S148.3J14)的一级结构。前21个残基(下划线)构成在周质表达后被切割的信号序列。N端T7-标记(斜体)和C端Streptag-II(粗体)是所表征蛋白质的一部分。图2还显示在这一本发明的示例性突变蛋白中4个N端氨基酸残基(H1 H2 L3 A4)和最后两个C端氨基酸残基(S157和D158)已缺失。
图3显示亲和力筛选实验的结果。将单克隆抗StrepTag抗体(Qiagen)包被至ELISA平板上,以捕获所表达的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白,使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗IL-4受体α-Fc的Fc结构域的多克隆抗体来检测IL-4受体α-Fc(R&D Systems;3nM和0.75nM)与所捕获突变蛋白的结合。亲和力提高的克隆给出更高的信号(左)。将IL-4包被至ELISA平板上,并将IL-4受体α-Fc(3nM)与所表达的突变蛋白一起孵育。使用针对IL-4受体α-Fc的Fc结构域的辣根过氧化物酶(HRP)缀合多克隆抗体来检测具有未占据的IL-4结合位点的IL-4受体α-Fc的结合。拮抗性亲和力提高的克隆给出更低的信号(右)。用箭头标出了对应于本发明突变蛋白S148.3J14(SEQ ID NO:2)的信号,并用菱形标出了来自各个克隆的信号。
图4显示通过SEQ ID NO:2(S148.3J14)的亲和力成熟获得的对IL-4受体α具有最高结合亲和力的六种人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S191.5K12、S148.3J14AM2C2、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16和S197.8D22[SEQ ID No:3-8])的多肽序列。所示一级结构的前21个残基(下划线)构成在周质表达后被切割的信号序列。C端Streptag-II(粗体)是所表征蛋白质的一部分。图4还显示在本发明泪液脂质运载蛋白突变蛋白中,例如可缺失前4个N端氨基酸残基(HHLA)以及最后两个C端氨基酸残基(SD)而不影响该蛋白质的生物功能。
图5-11显示显示对IL-4受体α具有亲和力的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S148.3J14、S191.5K12、S148.3J14AM2C2、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16和S197.8D22[SEQ ID No:2-8])的Biacore测量。约400RU的IL-4受体α-Fc被捕获在之前以抗人Fc单克隆抗体包被的CM-5芯片上。其后,使不同浓度(图5:20nM;40nM;80nM;160nM;320nM)或单个浓度25nM(图6-11)的突变蛋白经过流动池,记录共振单位的变化。减去来自经同样处理但无任何IL-4受体α-Fc的流动池的参比信号,使用BIAevaluatoin软件将所得数据以1∶1Langmuir模型进行拟合。由于图6-11所示实验中相互作用的慢解离动力学情况,通过减去来自同样处理但无任 何IL-4受体α-Fc并减去来自仅注射样品缓冲液的实验的信号来使用双参照。使用BIAevaluation软件用质量转运限制模式将所得数据以1∶1Langmuir模型进行拟合。在图6-11中,显示了五个实验中的一个代表的结果。
图12显示对IL-4受体α具有结合亲和力的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白(S148.3J14;SEQ ID NO:2)的竞争ELISA测量。将IL-4(20μg/ml)包被至ELISA平板上,并将IL-4受体α-Fc(15nM)与多种浓度的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白或IL-4受体特异性单克隆抗体(MAB230,R&DSystems)在室温下一起孵育1小时。对IL-4包被的平板在室温下给予IL-4受体α-Fc和突变蛋白混合物30分钟。用山羊抗人Fc-HRP缀合抗体检测结合的IL-4受体α-Fc。将数据对以下表达式进行拟合:0.5*(-m0+m2-m1+sqrt((-m0+m2-m1)^2+4*m1*m2))。通过变量m1给出Ki。显示了三个实验中一个代表的结果。
图13-18显示对IL-4受体α具有结合亲和力的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白及作为对照的野生型泪液脂质运载蛋白(TLPC10;pTLPC10的基因产物)的竞争ELISA测量。将针对IL-4受体的IL-4受体α特异性单克隆抗体MAB230(R&D Systems)包被至ELISA平板上,并将生物素化的IL-4受体α(IL-4R alpha-bio;0.5nM)与多种浓度的本发明突变蛋白或TLPC10在室温下一起孵育1小时。将IL-4R alpha-bio和突变蛋白混合物在室温下在MAB230包被的平板中孵育30分钟。用Extravidin-HRP检测结合的IL-4R alpha-bio。将数据以以下表达式进行拟合:0.5*(-m0+m2-m1+sqrt((-m0+m2-m1)^2+4*m1*m2))。通过变量m1给出KD。显示了三个实验中的一个代表的结果。
图19显示了TF-1细胞增殖测定的结果。将TF-1细胞与连续稀释的所示突变蛋白、IL-4受体α特异性单克隆抗体或IgG2a抗体同种型对照在37℃下孵育1小时,之后加入0.8ng/ml IL-4(a,b)或12ng/ml IL-13(c,d)72小时。通过3H-胸苷掺入来测量增殖。
图20显示噬粒载体pTLPC27,其编码包含OmpA信号序列(OmpA)、 Tlc、其后为Strep-tag II的融合蛋白以及包含氨基酸217至406的截短形式的M13衣壳蛋白pIII(pIII)的融合蛋白。在SupE琥珀抑制基因宿主菌种中部分翻译成Gln的琥珀型终止密码子位于Tlc编码区(包括Strep-tag II)与截短的噬菌体衣壳蛋白pIII的编码区之间,从而允许在使用非阻抑基因大肠杆菌菌种时可以可溶性表达无M13衣壳蛋白pIII的Tlc突变蛋白。用于克隆突变基因表达盒的BstXI限制性位点和结构基因侧翼的限制性位点均已标记。基因表达在四环素启动子/操纵基因(tetp/o)控制之下。转录在脂蛋白转录终止子(tlpp)处终止。该载体还包含复制起点(ori)、丝状噬菌体f1的基因间区域(f1-IG)、编码氯霉素乙酰转移酶的氨苄青霉素抗性基因(amp)和四环素抑制基因(tetR)。将pTLPC27核酸序列的相关区段与序列表中SEQ ID NO:9所编码氨基酸序列一起复制。
图21显示利用对人VEGF具有结合亲和力的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白、野生型泪液脂质运载蛋白(TLPC10)或VEGF特异性治疗性抗体 进行的增殖测定的结果。将约1400个HUVEC细胞接种到完全培养基中并以37℃过夜孵育,洗涤细胞并加入含有0.5%FCS、氢化可的松和庆大霉素/两性霉素的基本培养基。以标明的浓度一式三份向孔中加入VEGF特异性突变蛋白S209.2-C23,S209.2-D16,S209.2-N9,S209.6-H7,S209.6-H10,S209.2-M17,S209.2-O10(SEQ ID NO:27-33)、野生型泪液脂质运载蛋白(pTLPC10的基因产物,作为对照)或治疗性VEGF特异性单克隆抗体 (Roche;作为对照)。30分钟后,加入人VEGF165或人FGF-2(作为未受VEGF诱导增殖的对照(未显示)),6天后以CellTiter 96 Aqueous One生色测定(chromogenic assay)(Promega)评估细胞生存力。
图22显示对IL-4受体α具有亲和力的人泪液脂质运载蛋白的PEG化突变蛋白S148.3J14(SEQ ID NO:2)的Biacore测量。将约400RU IL-4受体α-Fc捕获在之前以抗人Fc单克隆抗体包被的CM-5芯片上。其后,使不同浓度(200nM;67nM;22nM)的突变蛋白通过流动池并记录共振单位的改变。减去来自同样处理但无任何IL-4受体α-Fc的流动池的参照信 号,并使用BIAevaluation软件将所得数据以1∶1Langmuir模型进行拟合。
图23显示人泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)与固定的VEGF8-109的结合的示例性Biacore测量。使用标准胺化学反应将VEGF8-109固定在CM5芯片上。在500nM至16nM的六种不同浓度下以30μl/分钟的流速应用脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22。用BIA T100软件进行传感图评估,以测定该突变蛋白的kon、koff和KD。
图24显示固定在传感芯片上的突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)与不同形式VEGF的亲和力测量。基本如WO 2006/56464的实施例9所述进行亲和力测量,改动是突变蛋白被固定,并以250nM的浓度注入含有不同VEGF变体的70μl样品。结果的定性比较显示,截短形式hVEGF8-109和hVEGF121显示基本相同的传感图,表明对泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)相似的亲和力。剪接形式hVEGF165也显示与泪液脂质运载蛋白突变蛋白的强烈结合,而相应的小鼠直向同源物mVEGF164的亲和力稍低。
图25显示VEGF-结合突变蛋白S236.1-A22在37℃下在PBS和人血清中的稳定性测试,该测试基本如国际专利申请WO2006/056464的实施例15所述进行,只是所使用的浓度为1mg/ml。通过HPLC-SEC判断,在7天的温育期间未检测到该突变蛋白的改变(数据未显示)。在人血清中孵育该泪液脂质运载蛋白突变蛋白导致亲和力在7天后下降至参照的约70%(图25a)。还如上述在人血清中测试了S236.1-A22的ABD融合蛋白(SEQ ID NO:51)的稳定性。在7天的孵育期中未检测到活性的损失(图25b)。
图26显示表达载体pTLPC51,其编码包含OmpA信号序列(OmpA)、与白蛋白结合结构域(abd)融合的突变人泪液脂质运载蛋白(Tlc)、其后为Strep-tag II的融合蛋白。用于克隆突变基因表达盒的BstXI限制性位点和结构基因侧翼的限制性位点均已标记。基因表达在四环素启动子/操纵基因(tetp/o)控制之下。转录在脂蛋白转录终止子(tlpp)处终止。该载体还包含复制起点(ori)、丝状噬菌体f1的基因间区域(f1-IG)、氨苄青霉素抗 性基因(amp)和四环素抑制基因(terR)。将pTLPC51核酸序列的相关区段与序列表中SEQ ID NO:48和49所编码氨基酸序列一起复制。该区段从XbaI限制性位点开始,以HindIII限制性位点结束。该区域以外的载体元件与载体pASK75相同,其完整核苷酸序列在德国专利公开DE 44 17 598A1中给出。
图27显示使用表面等离振子共振(Biacore)对泪液脂质运载蛋白突变蛋白的ABD融合物S236.1-A22(A22-ABD)(SEQ ID NO:51)(200pM)与重组VEGF8-109的亲和力测量。亲和力测量基本如WO 2006/56464的实施例9所述进行,改动为使用标准胺化学反应将约250RU的重组VEGF8-109与传感芯片直接偶联。以400nM的浓度注入40μl突变蛋白。发现亲和力基本无改变,测得为260pM。
图28显示泪液脂质运载蛋白突变蛋白A22-ABD(ABD-S236.1-A22融合物)在人血清白蛋白存在下的功能性测试,这通过评估其抑制VEGF所诱导的HUVEC增殖来进行。在明胶包被的平皿中培养HUVEC(Promocell),并在P2至P8代之间使用。在第1天,以1400个细胞/孔接种到96孔板的完全培养基中。第2天,洗涤细胞并加入含有0.5%FCS、氢化可的松和庆大霉素/两性霉素的100μl基本培养基。用20ng/mlVEGF165或10ng/ml FGF-2刺激增殖,将它们与脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22-ABD(SEQ ID NO:51)混合,孵育30分钟并加入孔中。在第6天测定生存力,将结果表示为抑制百分比。在标明的情况下加入了人血清白蛋白(HSA,5μM)。在5μM HAS下,>99.8%的A22-ABD在任何给定时间均与HAS相关联。
图29显示本发明突变蛋白对VEGF诱导的HUVEC增殖的抑制。在明胶包被的平皿中增殖HUVEC(Promocell),并在P2到P8代之间使用。在第1天,以1400个细胞/孔接种到96孔板的完全培养基中。第2天,洗涤细胞并加入含有0.5%FCS、氢化可的松和庆大霉素/两性霉素的100μI基本培养基。用20ng/ml VEGF165或10ng/ml FGF-2刺激增殖,将它们与脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)混合,孵育30分钟并 加入孔中。在第6天测定生存力,将结果表示为抑制百分比。
图30显示本发明突变蛋白对HUVEC中VEGF介导的MAP激酶活化的抑制。以1400个细胞/孔将HUVEC接种到96孔板的标准培养基(Promocell,Heidelberg)中。第2天,将FCS减少至0.5%,并继续培养16小时。在基本培养基中的0.5%BSA中使细胞饥饿5小时。在浓度逐渐提高的泪液脂质运载蛋白突变蛋白A22或Avastin(贝伐单抗,Genentech/Roche)存在下用VEGF165(Reliatech,Braunschweig)刺激HUVEC 10分钟,以获得剂量应答曲线。根据生产商的说明书(Active Motif,Rixensart,Belgium),使用ELISA定量MAP激酶ERK1和ERK2的磷酸化。IC50值测定为:突变蛋白A22(SEQ ID NO:44)为4.5nM, 为13nM。
图31显示局部施用泪液脂质运载蛋白突变蛋白的血管通透性测定。将体重350±50g的Duncan-Hartley豚鼠在肩和背部剃毛。该动物通过耳静脉接受静脉注射1ml 1%Evan’s蓝色染料。30分钟后,将20ng VEGF165(Calbiochem)以10倍摩尔过量与测试物质或对照物混合,并在3×4的方格中皮内注射。30分钟后,通过CO2窒息对动物实施安乐死。注射VEGF后1小时,取下含有方格图案的皮肤并清除结缔组织。使用图像分析仪(Image Pro Plus 1.3,Media Cybernetics)对染料外渗面积进行定量。
图32显示鸡尿囊绒膜(CAM)测定。将含有FGF-2(500ng)、VEGF(150ng)以及泪液脂质运载蛋白突变蛋白(1.35μg)或Avastin(10μg)的胶原种植体(onplant)置于10日鸡胚的CAM上(4个/动物,10只动物/组)。在24小时时以相同剂量对该种植体再次应用泪液脂质运载蛋白突变蛋白或Avastin。72小时后,收集种植体并捕捉图像。通过不知情观察者确定含有至少一个血管的阳性方格的百分比。对VEGF拮抗剂S209.2-O10(SEQID NO:33)和 以及野生型泪液脂质运载蛋白对照将中值血管发生指数报告为阳性方格的分数。
图33显示测定A22和A22-ABD在小鼠中的药代动力学(PK)参数。在NMRI小鼠中测定静脉内注射泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1A22 (SEQ ID NO:44)(4mg/kg)后及静脉或腹膜内快速输注突变蛋白S236.1A22与ABD的融合蛋白(SEQ ID NO:51)(5.4mg/kg)后的药代动力学(PK)参数(半衰期血浆浓度、生物利用率)。从在预定时间点收集的末端血样中制备血浆,并通过ELISA测定脂质运载蛋白突变蛋白的浓度。使用WinNonlin软件(Pharsight Corp.,Mountain View,USA)分析结果。T1/2 A22静脉内注射:0.42小时;T1/2 A22-ABD静脉内注射:18.32小时;T1/2 A22-ABD腹膜内注射:20.82小时。腹膜内注射施用A22-ABD融合蛋白后的生物利用率为82.5%。
图34显示全身施用泪液脂质运载蛋白突变蛋白的血管通透性测定。实验前12小时,将测试物质或对照静脉内注射到每组三只动物中。第1组:PBS载体;第2组:Avastin,10mg/kg;第3组:突变蛋白S236.1A22-ABD,6.1mg/kg;第4组:TLPC51:6.1mg/kg。在时间=0时注射Evan’s Blue。30分钟后,在3×4方格中一式三份皮内注射4种剂量的VEGF(5、10、20或40ng)。注射VEGF后30分钟,处死动物并使用图像分析仪(Image ProPlus 1.3,Media Cybernetics)对染料外渗进行定量。
图35显示本发明突变蛋白在肿瘤异种移植物模型中的作用。将基质胶中的1×107个A673横纹肌肉瘤细胞(ATTC)皮下接种至经照射(2.5Gy,Co60)的Swiss裸鼠的右侧腹(n=12只/组)。腹膜内施用处理,在照射开始的同一天开始并持续21天。第1组:PBS载体,每天一次;第2组:Avastin(贝伐单抗,Genentech/Roche),5mg/kg,每3天一次;第3组:脂质运载蛋白突变蛋白A22-ABD(SEQ ID NO:51),每天一次,3.1mg/kg;第4组:TLPC51,每天一次,3.1mg/kg。将脂质运载蛋白突变蛋白A22-ABD的剂量选择成实现恒定存在等摩尔数的突变蛋白及Avastin的VEGF结合位点,这是基于A22-ABD PK数据和抗体在小鼠中的估计血清半衰期。用测径器每周两次测量肿瘤大小,并根据式(长度×宽度2)/2来估计肿瘤体积。当肿瘤体积超过2,000mm3时处死小鼠。
图36显示用A549细胞进行的嗜酸性粒细胞活化趋化因子分泌测定的结果。在存在和不存在浓度逐渐提高的IL-4受体α结合突变蛋白S191.4 B24(SEQ ID NO:4)的情况下分别用0.7nM IL-4或0.83nM IL-13刺激A549细胞。在72小时后通过使用市售试剂盒测量细胞培养上清液中的嗜酸性粒细胞活化趋化因子3浓度来评估嗜酸性粒细胞活化趋化因子3的分泌。
图37显示在不存在和存在浓度逐渐提高的IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24(SEQ ID NO:4)的情况下经刺激的外周血单核细胞(PBMC)中IL-4/IL-13诱导的CD23表达。从暗黄覆盖区中分离总人PBMC。加入浓度逐渐提高的IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24,并分别以终浓度1.0nM或2.5nM的IL-4或IL-13刺激细胞。48小时后,通过流式细胞术对表达CD23的CD14+单核细胞进行定量。
图38显示IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24(SEQ ID NO:4)的Schild分析的结果。在不存在或存在若干固定浓度IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24的情况下评估TF-1细胞的IL-4剂量依赖性增殖(图38A)。所得结果的Schild分析(图38B)获得的Kd为192pM(线性回归)和116pM(非线性回归)。
图39显示结合IL-4受体α的突变蛋白S191.4B24(SEQ ID NO:4)对人原代B细胞的亲和力评估的结果。从人血液中分离PBMC,并与不同浓度的结合IL-4受体α的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白S191.4B24或野生型人泪液脂质运载蛋白(TLPC26)一起孵育。接着用抗CD20-FITC单克隆抗体和生物素化的抗脂质运载蛋白抗血清、其后用链霉亲合素-PE染色细胞。野生型脂质运载蛋白和结合IL-4受体α的脂质运载蛋白突变蛋白S191.4B24的结果分别示于图39A和B。将所测定的PE阳性B细胞百分比对脂质运载蛋白浓度进行拟合(图39C),并从所得曲线中计算EC50。IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24(SEQ ID NO:4)的EC50计算为105pM。
图40显示静脉内、皮下或气管内施用后结合IL-4受体α的突变蛋白S191.4B24的生物利用率测试的结果。通过所示途径,以4mg/kg对Sprague-Dawley大鼠给予单剂量的突变蛋白S191.4B24。使用微型喷雾给 药装置(PennCentury,USA)进行气管内施用。在预定时间点获得血浆样品并进行夹层ELISA分析,以测定具有功能活性的突变蛋白的剩余浓度。通过非房室PK分析来分析浓度。生物利用率在皮下给药后为100%,在气管内递送后为13.8%。
图41显示与人泪液脂质运载蛋白野生型相比,未PEG化或以PEG20、PEG30或PEG40PEG化的突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)的体外效力评估。通过在VEGF刺激的HUVEC增殖测定中滴定各自的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白并测定增殖抑制来测定IC50。
实施例
除非另外指明,否则均使用成熟的重组基因技术方法,例如Sambrook等(同上)所述。
实施例1:产生具有2×10
9
种独立的Tlc突变蛋白的文库
通过协同诱变成熟野生型人泪液脂质运载蛋白中18个选定的氨基酸位置26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106和108来制备高复杂性的泪液脂质运载蛋白(Tlc)随机文库。为此,在根据前述策略的两个步骤中,使用简并性引物寡脱氧核苷酸通过聚合酶链式反应(PCR)装配以靶向方式将相应密码子随机化的基因盒,(Skerra,A.(2001)″Anticalins″:a new class of engineered-ligand-bindingproteins with antibody-like properties.J.Biotechnol.74,257-275)。在该文库设计中,泪液脂质运载蛋白野生型序列中的前4个N端氨基酸残基(HHLA)和最后两个C端氨基酸残基(SD)被缺失(为此,所附序列表中所有的泪液脂质运载蛋白突变蛋白均含有野生型序列的Ala5作为N末端残基,Gly156作为C末端残基(后者任选地与例如亲和标记融合)。
在产生随机文库的第一个步骤中,使用引物TL46(SEQ ID NO:10)和TL47(SEQ ID NO:11)为Tlc第一个和第二个暴露环制备带有随机化密码子的PCR片段,使用引物TL48(SEQ ID NO:12)和TL49(SEQ ID NO:13)平行地为Tlc第三个和第四个暴露环制备带有随机化密码子的另一PCR片 段。在第二个步骤中,使用连接寡脱氧核苷酸将这两个PCR片段合并,并在使用引物AN-14(SEQ ID NO:14)、TL50bio(SEQ ID NO:15)和TL51bio(SEQ ID NO:16)的PCR反应中作为模板,以获得装配好的随机化基因盒。
第一步中的两个PCR反应(1a和1b)各在100μl体积中进行,每个反应分别使用作为模板的10ng pTLPC10质粒DNA(图1)以及50pmol的每对引物(分别为TL46和TL47,或者TL48和TL49),它们根据常规的亚磷酰胺法合成。此外,反应混合物含有10μl10×Taq反应缓冲液(100mMTris/HCl pH 9.0,500mM KCl,15mM MgCl2,1%v/v Triton X-100)和2μldNTP-Mix(10mM dATP,dCTP,dGTP,dTTP)。用水补足体积后,加入5u Taq DNA聚合酶(5u/l,Promega),在带热盖的可编程热循环仪(Eppendorf)中进行94℃1分钟、58℃1分钟和72℃1.5分钟的20个循环,其后60℃孵育5分钟完成反应。使用GTQ琼脂糖(Roth)和WizardDNA提取试剂盒(Promega),通过制备型琼脂糖凝胶电泳分离具有分别为135bp和133bp的期望大小的扩增产物。
在第二个PCR步骤中,制备1000μl混合物,其中在500pmol每种侧翼引物TL50bio(SEQ ID NO:15)和TL51bio(SEQ ID NO:16)以及10pmol中介体引物AN-14(SEQ ID NO:14)存在下,使用约500fmol来自PCR反应1a和1b的片段作为模板。两种侧翼引物均在其5’末端带有生物素基团,因此允许在BstXI切割后通过包被有链霉亲合素的顺磁性珠从不完全消化的产物中分离PCR产物。此外,该反应混合物含有100μl10×Taq缓冲液、20μl dNTP混合物(10mM dATP,dCTP,dGTP,dTTP)、50u TaqDNA聚合酶(5u/l,Promega),并用水将终体积补足至1000μl终体积。将混合物分成100μl等分试样并以94℃1分钟、57℃1分钟、72℃1.5分钟的20个循环进行PCR,随后最终以60℃孵育5分钟。使用E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit(PeqLab)纯化PCR产物。
就后续的克隆而言,首先根据生产商的说明,用限制性酶BstXI(Promega)切下代表核酸形式Tlc突变蛋白文库中心部分的这一片段,接着 如上述通过制备型琼脂糖凝胶电泳进行纯化,产生大小为301个碱基对的双链DNA片段。
使用以链霉亲合素包被的顺磁性珠(Merck),通过其5’-生物素标签除去未消化或未完全消化的DNA片段。为此,用100μl TE缓冲液(10mMTris/HCl pH 8.0,1mM EDTA)将150μl市售的链霉亲合素包被的顺磁性颗粒的悬浮液(10mg/ml的浓度)洗涤三次。接着借助磁体将颗粒排干水分并与100μl TE缓冲液中的70pmol经消化DNA片段在室温下混合15分钟。接着借助磁体收集Eppendor容器壁上的顺磁性颗粒,回收完全消化的DNA片段用于后续的连接反应中。
根据生产商的说明,用限制性酶BstXI(Promega)切割载体pTLPC27(图20),如上述通过制备型琼脂糖凝胶电泳纯化获得的大载体片段,产生代表载体骨架的大小为3772个碱基对的双链DNA片段。
就连接反应而言,在总体积10.76ml(50mM Tris/HCl pH7.8,10mMMgCl2,10mM DTT,1mM ATP,50μg/ml BSA)中,在1074Weiss单位T4DNA连接酶(Promega)存在下将40pmol PCR片段和40pmol载体片段(pTLPC27)以16℃孵育48小时。接着通过加入267μl酵母tRNA(水中10mg/ml溶液(Roche))、10.76ml 5M乙酸铵和42.7ml乙醇将连接混合物中的DNA沉淀1.5小时。沉淀后,用70%EtOH洗涤DNA沉淀并干燥。最后,将DNA在总体积538μl水中溶解至终浓度200μg/ml。
根据Tung和Chow(Trends Genet.11(1995),128-129)以及Hengen(Trends Biochem.Sci.21(1996),75-76)所述方法进行细胞大肠杆菌菌株XL1-Blue的电感受态细菌(Bullock等,同上)的制备。通过加入XL1-Blue的过夜培养物并在2升锥形瓶中以140rpm和26℃孵育而将1升LB培养基(10g/L Bacto Tryptone,5g/L细菌用酵母提取物,5g/L NaCl,pH 7.5)调整成600nm处的吸光度OD600=0.08。达到OD600=0.6后,将培养物在冰上冷却30分钟,其后以4000g和4℃离心15分钟。将细胞用500ml冰预冷的10%w/v甘油洗涤两次,最后重悬于2ml冰预冷的GYT培养基(10%w/v甘油、0.125%w/v酵母提取物、0.25%w/v胰蛋白胨)中。接着将细胞 分成等分试样(200μl),在液氮中速冻并保存于-80℃。
在4℃下使用Micro Pulser系统(BioRad)结合来自同一销售商的穿孔杯(电极距离2mm)进行电穿孔。将10μl等分试样的连接后的DNA溶液(含有1μg DNA)与100μl细胞悬液混合,首先在冰上孵育1分钟,接着转移到预冷的穿孔杯中。使用5ms和12.5kV/cm场强的参数进行电穿孔,其后立即将悬液在2ml冰预冷的SOC培养基(20g/L Bacto Tryptone,5g/L细菌用酵母提取物,10mM NaCl,2.5mM KCl,pH 7.5,高压灭菌,在电穿孔前加入10ml/L 1M MgCl2和1M MgSO4以及20ml/L 20%葡萄糖)中稀释,随后以37℃和140rpm孵育60分钟。其后,将培养物在含有100μg/ml氯霉素(2YT/Cam)的2L 2×YT培养基(16g/L Bacto Tryptone,10g/L细菌用酵母提取物,5g/L NaCl,pH 7.5)中稀释,得到0.26的OD550。将培养物在37℃下孵育,直至OD550再提高0.6单位。
通过在54次电穿孔中使用总计107.6μg已连接的DNA,获得了总计约2.0×109个转化体。将转化体进一步用于制备编码作为融合蛋白的Tlc突变蛋白文库的噬菌粒。
就噬菌粒文库的制备而言,用1.3×1012pfu VCS-M13辅助噬菌体(Stratagene)感染4l上述培养物。37℃搅拌45分钟后,将孵育温度降至26℃。温度平衡10分钟后,加入25μg/l无水四环素,以诱导基因表达Tlc突变蛋白与噬菌体衣壳蛋白之间的融合蛋白。允许在26℃产生噬菌粒11小时。通过离心除去细菌后,用20%(w/v)聚乙二醇8000(Fluka)、15%(w/v)NaCl从培养物上清液沉淀噬菌粒两次,最后溶于PBS(4mMKH2PO4,16mM Na2HPO4,115mM NaCl)中。
实施例2:噬菌粒呈递以及选择对IL-4受体α具有亲和力的Tlc突变蛋白
利用实施例1所得的噬菌粒进行噬菌粒展示和选择,基本如WO2006/56464的实施例2所述的进行,有以下修改:以200nM的浓度使用靶蛋白(IL-4受体α,Peprotech),并作为生物素化蛋白呈递给文库,随后使 用链霉亲合素珠(Dynal)捕获噬菌体-靶标复合体。或者,以200nM浓度Fc-融合蛋白(IL-4受体α-Fc,R&D System)的形式使用靶蛋白,其后根据生产商的说明,使用G蛋白珠(Dynal)并通过将Fc-融合蛋白固定在以抗人Fc捕获抗体(Jackson Immuno Research)包被的免疫棒(Nunc)上来捕获噬菌体-靶标复合体。进行三轮或四轮选择。
实施例3:使用高通量ELISA筛选来鉴定IL-4受体α特异性突变蛋白
基本如WO 2006/56464的实施例3所述对根据实施例2选择的突变蛋白进行筛选,有以下修改:表达载体为pTLPC10(图1)。所使用的靶蛋白为IL-4受体α-Fc(R&D Systems)和IL-4受体α(Peprotech),均为2μg/ml。
筛选了如实施例2所述选择的5632个克隆,鉴定了指示从文库中成功分离突变蛋白的2294个原始命中。使用该方法鉴定了克隆S148.3J14(SEQID NO:2)。S148.3J14的序列也示于图2。
实施例4:使用易错PCR对突变蛋白S148.3J14进行亲和力成熟
使用寡核苷酸TL50 bio(SEQ ID NO:15)和TL51bio(SEQ IDNO:16),基本如WO 2006/56464实施例5所述产生基于突变蛋白S148.3J14(SEQ ID NO:2)的变体文库,得到每个结构基因平均带有3个替换的文库。
如实施例2所述进行噬菌粒选择,但使用有限的靶标浓度(2nM、0.5nM和0.1nM的IL-4受体α,Peprotech Ltd)、延长的洗涤时间以及针对IL-4受体α的拮抗性单克隆抗体(MAB230,R&D Systems;1小时洗涤时间和2小时洗涤时间)或短孵育时间(30秒、1分钟和5分钟)。进行三轮或四轮选择。
实施例5:使用定点随机法对突变蛋白S148.3J14进行亲和力成熟
通过将位置34、53、55、58、61、64和66随机化成在这些位置上允许全部20种氨基酸来设计基于突变蛋白S148.3J14(SEQ ID NO:2)的变体文库。基本如实施例1所述构建文库,改动为分别使用脱氧核苷酸TL70(SEQ ID NO:17)、TL71(SEQ ID NO:18)和TL72(SEQ ID NO:19)代替TL46、TL47和AN-14。
分别使用有限的靶标浓度(0.5nM和0.1nM IL-4受体α,Peprotech)与延长的洗涤时间及针对IL-4受体α的竞争性单克隆抗体(MAB230,R&DSystems;1小时洗涤)或短孵育时间(10分钟)组合,如实施例2所述进行噬菌粒选择。进行三轮或四轮选择。
实施例6:使用高通量ELISA筛选对IL-4受体α结合突变蛋白进行亲和力筛选
如实施例3所述进行筛选,改动为使用3nM浓度的IL-4受体α-Fc(R&D Systems),并加入了i)将单克隆抗-Strep标签抗体(Qiagen)包被在ELISA平板上,以捕获产生的突变蛋白,并使用针对IL-4受体α-Fc的Fc结构域的HRP(辣根过氧化物酶)缀合的多克隆抗体检测IL-4受体α-Fc(R&D Systems,3nM和0.75nM)与所捕获的泪液脂质运载蛋白突变蛋白的结合。另外,在备选的筛选设置中ii)将IL-4包被在ELISA平板上,将IL-4受体α-Fc(R&D Systems,3nM)与所表达的突变蛋白一起孵育,使用针对IL-4受体α-Fc的Fc结构域的HRP(辣根过氧化物酶)缀合的多克隆抗体检测IL-4受体α-Fc与未占据的IL-4结合位点的结合。
这样的筛选的结果示于图3。与作为亲和力成熟基础的突变蛋白S148.3J14(SEQ ID NO:2)相比,如实施例4和5所述选择的大量突变蛋白被鉴定为对IL-4受体α具有提高的亲和力。使用该方法鉴定了突变蛋白S191.5K12、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16、S197.8D22和S148.3J14AM2C2(SEQ ID NO:3-8)。S191.5K12、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16、S197.8D22和S148.3J14AM2C2的序列也示于图4。
实施例7:产生IL-4受体α结合突变蛋白
为制备性产生IL-4受体α特异性突变蛋白,根据Schlehuber,S.等(J.Mol.Biol.(2000),297,1105-1120)所述方案,将带有表达载体pTLPC10(图1)上所编码各个突变蛋白的大肠杆菌K12菌株JM83以2L摇瓶培养在LB-氨苄青霉素培养基中培养。在需要大量蛋白质时,基于Schiweck,W.和Skerra,A.Proteins(1995)23,561-565)所述方案,在1l或10l容器中,使用带有各自表达载体的大肠杆菌W3110通过台式发酵罐培养进行周质生产。
根据Skerra,A.& Schmidt,T.G.M.(2000)(Use of the Strep-tag andstreptavidin for detection and purification of recombinant proteins.Methods Enzymol.326A,271-304)所述方法,使用适当柱床体积的柱通过链霉亲合素亲和层析在单个步骤中从周质级分中纯化突变蛋白。为了获得更高的纯度以及除去任何聚集的重组蛋白,最后在PBS缓冲液存在下在Superdex 75HR 10/30柱(24-ml柱床体积,Amersham Pharmacia Biotech)上最后进行突变蛋白的凝胶过滤。合并单体蛋白级分,通过SDS-PAGE检查纯度,并用于进一步生化表征。
实施例8:使用Biacore进行亲和力测量
基本如WO 2006/56464实施例9所述进行亲和力测量,改动是固定约400RU IL-4受体α-Fc(R&D Systems)(而不是WO 2006/56464中用作靶标的2000RU人CTLA-4或小鼠CTLA-4-Fc),并注射25mM浓度的100μl突变蛋白(而不是WO 2006/56464中使用浓度5-0.3μM的纯化脂质运载蛋白突变蛋白的40μl样品)。
使用S148.3J14、S191.5K12、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16、S197.8D22和S148.3J14AM2C2进行的亲和力测量的结果示于图5-11,并总结于表I
表I.通过Biacore测定的本发明选定的突变蛋白对IL-4受体α的亲和力。显示了五个实验的平均值(标准差)。
实施例9:使用抑制ELISA鉴定IL-4的拮抗剂
在抑制ELISA中评估所选突变蛋白对IL-4与IL-4受体α之间相互作用的抑制。因此,将恒定浓度的IL-4受体α(0.5nM生物素化的IL-4受体α,Peprotech,或15nM IL-4受体α-Fc,R&D Systems)与泪液脂质运载蛋白突变蛋白的连续稀释液一起孵育,在ELISA中定量具有未占据的IL-4结合位点的IL-4受体α的量,在所述ELISA中用IL-4或拮抗性抗IL-4受体α单克隆抗体包被平板。使用HRP缀合的Extravidin(Sigma)检测已结合的生物素化IL-4受体α,并与确定量生物素化IL-4受体α的标准曲线进行比较。使用突变蛋白S148.3J14、S191.5K12、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16、S197.8D22和S148.3J14AM2C2测量的结果示于图12-18,并总结于表II。
表II.通过竞争ELISA测定的所选本发明泪液脂质运载蛋白突变蛋白对IL-4受体α的拮抗能力和亲和力。显示了三个实验的平均值(标准差)。
实施例10:使用TF-1增殖测定签定IL-4及IL-13信号转导的拮抗剂
基本如Lefort等(Lefort S.,Vita N.,Reeb R.,Caput D.,Ferrara P.(1995)FEBS Lett.366(2-3),122-126)所述进行以IL-4和IL-13刺激的TF-1细胞增殖测定。来自TF-1增殖测定的结果示于图19,其显示高亲和力变体S191.5K12、S191.4B24、S191.4K19、S191.5H16、S197.8D22和S148.3J14AM2C2是IL-4和IL-13所诱导信号转导及增殖的强力拮抗剂。
实施例11:抗IL-4受体α人泪液脂质运载蛋白突变蛋白抑制STAT6介导的途径
在含有10%热灭活胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100g/ml氯霉素的RPMI1640中培养TF-1细胞,并补充2ng/ml重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。将细胞以5×104个细胞/ml接种至100mm直径组织培养皿中的总体积20ml培养基中,每2至3天将其分开并以此浓度再接种,在5%CO2的加湿气氛中在37℃下培养。
通过1200rpm离心5分钟来收获TF-1细胞,并通过在含有1%热灭活胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100g/ml链霉素的RPMI1640(RPMI-1%FCS)中1200rpm离心5分钟来洗涤两次。以1×106个细胞/ml将细胞重悬于RPMI-1%FCS中,以1ml接种到24孔板中并培养过夜。第二天,将TF-1细胞与20g/ml IL-4受体α特异性突变蛋白或阴性对照突变蛋白一起培养。将细胞的其他等分试样在空气中5%CO2的加湿气氛中在37℃下仅用培养基培养1小时。其后,分别以终浓度0.8ng/ml或12ng/ml加入人重组IL-4或IL-13,在空气中5%CO2的加湿气氛中在37℃下将培养物孵育10分钟。
通过加入42μl 37%甲醛(1.5%终浓度)在室温(RT)下将细胞固定10分钟,并转移至5ml圆底聚苯乙烯管(BD Falcon)中。用含有1%FCS的2ml PBS(PBS-FCS)洗涤细胞,1200rpm离心5分钟进行沉淀,弃去上清液。通过加入500μl冰预冷的甲醇并剧烈涡旋来透化细胞。4℃孵育10分钟后,通过以2ml PBS-FCS以1200rpm离心5分钟洗涤两次。将细胞重悬于100μl PBS-FCS中,并用20μl抗磷酸化STAT-6藻红蛋白(PE)-标记的抗体(克隆Y641;BD Biosciences)在室温下避光染色30分钟。最后,通过1200rpm离心5分钟而用2ml PBS-FCS洗涤细胞两次并重悬浮在500μl PBS-FCS中。使用FACScalibur流式细胞仪(BD Biosciences),通过流式细胞术分析细胞。从至少10000个门控细胞收集数据。
通过流式细胞术测量IL-4受体α特异性突变蛋白S191.4B24(SEQ IDNO:5)和S191.4K19(SEQ ID NO:6)抑制TF-1细胞中IL-4和IL-13介导的STAT-6磷酸化的能力。基于细胞大小(前向散射,FSC)和细胞粒度(侧向散射,SSC)使用对照TF-1细胞(未刺激的和未染色的),对完整细胞设置门控,以基于FL2值(通道2荧光;PE强度)排除99%的对照未染色群体。用抗磷酸化STAT-6PE标记抗体对未刺激细胞的其他等分试样进行染色。
STAT-6磷酸化测定的结果清楚地显示,IL-4受体α特异性突变蛋白S191.4B24和S191.4K19显著抑制TF-1细胞中IL-4和IL-13诱导的STAT-6磷酸化(数据总结于表III)。
处理 | %阳性 | MFI |
未染色 | 1 | 3.8 |
染色的未刺激的 | 6 | 5.8 |
IL-4 | 75 | 15.8 |
IL-13 | 77 | 16.4 |
pTLPC10+IL-4(阴性对照) | 72 | 13.1 |
pTLPC10+IL-13(阴性对照) | 84 | 18.6 |
S191.4K19+IL-4 | 6 | 4.9 |
S191.4K19+IL-13 | 8 | 5.0 |
S191.4B24+IL-4 | 6 | 4.8 |
S191.4B24+IL-13 | 11 | 5.5 |
表III.通过流式细胞术测量S191.4B24和S191.4K19(SEQ ID NO:5和6)抑制TF细胞中IL-4和IL-13诱导的STAT-6磷酸化的能力。显示了STAT-6磷酸化阳性染色的门控细胞百分比以及所有门控细胞的中值荧光强度(MFI)。
实施例12:抗人IL-4受体α突变蛋白与猕猴外周血淋巴细胞交叉反应
由Astra Zeneca(Macclesfield,UK)的临床药理学单位(CPU)将健康人志愿者的全血收集到9ml肝素锂管中。从Harlan Sera-Lab(Bieester,UK)或者B and K Universal Ltd(Hull,UK)获得来自猕猴的肝素化全血样品(合并自至少两只动物)。
将人和猕猴全血以红细胞裂解缓冲液(0.15M NH4Cl,1.0mM KHCO3,0.1mM EDTA,pH 7.2-7.4)以1∶5稀释,接着在室温下倒置孵育10分钟。将细胞以1200rpm离心5分钟,除去上清液。将细胞重悬于裂解缓冲液中并重复操作,直至上清液中不再含有血红蛋白。将细胞重悬于与血液原始体积相同体积的冷冻介质(1∶10,二甲亚砜∶胎牛血清)中并转移至冻存管。每管含有来自1ml血的细胞。将细胞在-80℃下冷冻过夜,并转移至液氮中保存。
将冷冻的外周血细胞在37℃下迅速解冻并用FACS缓冲液(FBS/1%FCS)洗涤。将细胞沉淀重悬于FACS缓冲液中(1ml缓冲液/管)。将100μl等分试样置于96孔圆底平板中,每孔加入100μl FACS缓冲液,将平板在4℃下以1200rpm离心5分钟,弃去上清液。其后,通过低速涡旋而重悬细胞,加入100μl稀释的第一抗体(抗CD124或IgG1同种型对照,eBioscience,10μg/ml)或抗IL-受体α突变蛋白(10μg/ml),并将细胞在冰上 孵育30分钟。通过加入100μl FACS缓冲液并在4℃下1200rpm离心5分钟而将细胞洗涤一次,弃去上清液,低速涡旋使细胞重悬。使用200μlFACS缓冲液重复两次以洗涤细胞。最后一次离心后,将细胞沉淀重悬于5μg/ml的100μl适当的第二抗体(生物素化的抗人脂质运载蛋白-1抗体(R&D Systems)或生物素化的大鼠抗小鼠IgG(Insight Biotechnology Ltd))中并将细胞在冰上孵育30分钟。通过在4℃下1200rpm离心5分钟而在100μl FACS缓冲液中洗涤细胞,弃去上清液并通过低速涡旋而重悬细胞。使用200μl FACS缓冲液和4℃1200rpm离心5分钟再洗涤两次。最后一次离心后,将细胞沉淀重悬于100μl检测试剂(藻红蛋白[PE]标记的链霉亲合素(eBioscience);1.25μg/ml)中并在冰上避光孵育30分钟。如前述再进行三次洗涤后,将细胞置于200μl FACS缓冲液中,转移至40×6mm试管中并使用FACScalibur流式细胞仪通过流式细胞术进行分析。对照细胞未染色。使用未染色的对照细胞,并对细胞大小(前向散射,FSC)和细胞粒度(侧向散射,SSC)设置完整淋巴细胞门控(Chrest,F.J.等(1993).Identification and quantification of apoptotic cells following anti-CD3activation of murine G0 T cells.Cytometry 14:883-90)。该区域在同一天分析的样品之间没有改变。基于对照未染色群体的FL2(通道2荧光,PE强度)值做出标记以区分IL-4受体α+和IL-4受体α-的群体,基于排除99%的未染色群体而设置标记1(M1)IL-4Rα+细胞。对每个样品,获得来自至少1×104个细胞的数据。
突变蛋白S191.5K12、S.148.3J14-AM2C2、S.191.4B24、S.191.4K19和S.197.8D22(SEQ ID NO:3-6和8)对猕猴淋巴细胞显示高水平结合,IL-4受体α+细胞为61%至80%不等,MFI值为6.0至9.2不等(表2)。变体S.191.5H16(SEQ ID NO:7)也特异性结合猕猴淋巴细胞,但与剩余突变蛋白相比亲和力降低(41%IL-4受体α+细胞;MFI值4.1)。
平行地,还通过流式细胞术分析了这些IL-4受体α特异性突变蛋白与来自一名人供体的外周血淋巴细胞结合的能力。所有的抗IL-4受体α突变蛋白均显示出与pTLPC10阴性对照所观察到的相比对人细胞显著更高水 平的结合。IL-4受体α+细胞为60%至76%不等,MFI值为7.4至9.7不等。用pTLPC10阴性对照染色的细胞显示低水平的非特异性结合,9%的细胞记录为IL-4受体α+,MFI值为3.2。突变蛋白S191.5K12、S.191.4B24和S.191.4K19(SEQ ID NO:3、5和6)对第二名人供体的外周血淋巴细胞显示相似的结合亲和力(数据未显示)。
表IV.通过流式细胞术分析了IL-4受体α特异性突变蛋白结合人及猕猴外周血淋巴细胞的能力。显示了IL-4受体α阳性染色的门控细胞百分比以及所有门控细胞的中值荧光强度(MFI)。
实施例13:噬菌粒呈递和以对人VEGF的亲和力选择Tlc突变蛋白
基本如实施例2所述利用得自实施例1的噬菌粒进行噬菌粒展示和选择,进行了以下改动:靶蛋白(即重组人VEGF-A片段(VEGF8-109,成熟多肽链的氨基酸8-109)以200nM浓度使用,并作为生物素化蛋白呈递于噬菌粒文库,其后根据生产商的说明使用链霉亲合素珠(Dynal)捕获噬菌体-靶标复合体。进行四轮选择。
通过将编码人VEGF A(SWISS PROT数据库登记号P15692)的成熟多肽链的氨基酸8至109的核酸引入表达载体pET11c(Novagen)中而获得靶 蛋白。因此,BamHI和NdeI限制性位点分别引入了人VEGF片段cDNA的3’和5’末端,并用于亚克隆VEGF基因片段。
用所得表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃下在含有氨苄青霉素的LB培养基中以IPTG诱导表达培养3小时后实现VEGF8-109的胞质产生。5000g离心20分钟后,将细胞沉淀重悬于每2l培养液200ml的PBS中,5000g再离心10分钟,然后-20℃孵育过夜。将得自500ml培养液的每份细胞沉淀重悬于20ml 20mM Tris-HCl(pH7.5),5mM EDTA中并在冰上超声处理,4次,10秒钟。4℃下10000g离心10分钟后,将包含体溶于15ml预冷的IB缓冲液(2M尿素、20mM Tris-HCl(pH7.5)、0.5MNaCl)中,如上述进行超声处理和离心。其后,将细胞沉淀溶于20ml IB缓冲液并如上述再次离心,之后溶于25ml溶解缓冲液中(7.5M尿素、20mM Tris-HCl(pH7.5)、4mM DTT)。将细胞悬液在室温下搅拌2小时,4℃下40000g离心15分钟,过滤含有重组VEGF的上清液(0.45μm)。如下进行重折叠:室温下对5l缓冲液1(20mM Tris-HCl(pH8.4),400mMNaCl,1mM半胱氨酸)透析过夜,其后再对5l缓冲液2(20mM Tris-HCl(pH8.4),1mM半胱氨酸)透析,并以5l缓冲液3(20mM Tris-HCl(pH8.4))透析两次。离心(40000g,20min,4℃)和浓缩后,根据标准方法通过离子交换层析(Q-Sepharose)和大小排阻层析(Superdex 75)纯化重组的VEGF片段。
实施例14:使用高通量ELISA筛选来鉴定VEGF结合突变蛋白
基本如实施例3所述对实施例13所得Tlc突变蛋白进行筛选,进行了以下改动:得自实施例11的重组靶蛋白VEGF8-109以5μg/ml使用,并直接包被至微量滴定板。筛选了共2124个克隆,鉴定了972个指示从文库中成功分离了突变蛋白的初步命中。使用该方法鉴定出了Tlc突变蛋白S168.4-L01(SEQ ID NO:26)。
实施例15:使用易错PCR对Tlc突变蛋白S168.4-L01进行亲和力成熟
基本如实施例4所述使用寡核苷酸TL50bio(SEQ ID NO:15)和TL51bio(SEQ ID NO:16)产生基于突变蛋白S168.4-L01的变体文库,得到平均每个结构基因含有5个替换的文库。
如实施例13所述进行噬菌粒选择,使用有限的靶标浓度(10nM、1nM和0.2nM VEGF8-109)或短孵育时间(1和5分钟)并使用或不使用有限的靶标浓度(10nM、100nM)。进行四轮选择。
实施例16:使用高通量ELISA筛选对VEGF结合突变蛋白的亲和力筛选
如实施例14所述对实施例15中选择的突变蛋白进行筛选,改动为将单克隆抗T7标签抗体(Novagen)包被至ELISA平板上以捕获产生的突变蛋白,并使用HRP缀合的Extravidin检测生物素化VEGF8-109(500nM和50nM)与所捕获Tlc突变蛋白的结合。
鉴定了与作为亲和力成熟基础的突变蛋白S168.4-L01相比具有提高的亲和力的大量克隆。使用该方法鉴定出了克隆S209.2-C23、S209.2-D16、S209.2-N9、S209.6-H7、S209.6-H10、S209.2-M17、S209.2-O10(SEQ IDNO:27-33)。
实施例17:产生VEGF结合突变蛋白
基本如实施例7所述进行产生。
实施例18:使用Biacore进行VEGF特异性突变蛋白的亲和力测定
基本如实施例8所述进行亲和力测量,改动是使用标准胺化学反应将约250RU的重组VEGF与传感器芯片直接偶联。以400nM浓度注入40μl得自实施例15的Tlc突变蛋白。
突变蛋白S209.2-C23、S209.2-D16、S209.2-N9、S209.6-H7、S209.6H10、S209.2-M17和S209.2-O10(SEQ ID NO:27-33)的亲和力测定结果总结于表 V。
克隆 | kon | koff | 亲和力 |
[1041/Ms] | [10-51/s] | [nM] | |
S209.2-C23 | 3.6 | 1.3 | 0.37 |
S209.2-D16 | 3.8 | 3 | 0.79 |
S209.2-N9 | 5.9 | 7.1 | 1.2 |
S209.6-H7 | 6.4 | 4.4 | 0.68 |
S209.6-H10 | 4.6 | 4.4 | 0.97 |
S209.2-M17 | 2.8 | 2.0 | 0.72 |
S209.2-O10 | 3.2 | 0.67 | 0.21 |
表V.在25℃下通过Biacore测量测定了选定的本发明突变蛋白对VEGF的亲和力。
实施例19:使用抑制ELISA鉴定VEGF的拮抗剂
在抑制ELISA中评估对VEGF与VEGF受体2(VEGF-R2)之间相互作用的抑制。为此,将恒定浓度的生物素化VEGF8-109(1nM)与连续稀释的各个Tlc突变蛋白一起孵育,并在ELISA中测定带有未占据的VEGF-R2结合位点的VEGF的量,所述ELISA中包被了干扰VEG F/VEGF-R2相互作用的抗VEGF抗体(MAB293,R&D Systems)。使用HRP缀合的Extravidin(Sigma)检测结合的VEGF并与确定量VEGF的标准曲线进行比较。使用突变蛋白S209.2-C23、S209.2-D16、S209.2-N9、S209.6-H7、S209.6-H10、S209.2-M17和S209.2-O10(SEQ ID NO:27-33)的测定结果总结于表VI。
克隆 | 亲和力竞争ELISA |
Ki [nM] | |
S209.2-C23 | 2.3 |
S209.2-D16 | 3.9 |
S209.2-N9 | 2.8 |
S209.6-H7 | 2.4 |
S209.6-H10 | 1.3 |
S209.2-M17 | 2.0 |
S209.2-O10 | 0.83 |
表VI.通过竞争ELISA测定的选定的本发明泪液脂质运载蛋白突变蛋白的拮抗能力以及对VEGF的亲和力。
实施例20:使用HUVEC增殖测定来鉴定VEGF拮抗剂
基本如前述(Korherr C.,Gille H,Schafer R.,Koenig-Hoffmann K.,Dixelius J.,Egland K.A.,Pastan I.& Brinkmann U.(2006)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)103(11)4240-4245)评估对VEGF和FGF-2刺激的HUVEC细胞增殖的抑制,进行了以下改动:根据生产商的推荐培养HUVEC细胞(Promocell)并在第2代至第6代之间使用。第1天,将1400个细胞接种至完全培养基(Promocell)。第二天,洗涤细胞并加入含0.5%FCS、氢化可的松和庆大霉素/两性霉素但无其他补充剂的基本培养基(Promocell)。向一式三份的孔中加入以标明的浓度连续稀释的VEGF特异性突变蛋白S209.2-C23、S209.2-D16、S209.2-N9、S209.6-H7、S209.6-H10、S209.2-M17、S209.2-O10(SEQ ID NO:27-33)、野生型泪液脂质运载蛋白(pTLPC10的基因产物;作为对照)或VEGF特异性治疗性单克隆抗体 (Roche;作为对照),30分钟后加入人VEGF165(R&DSystems)或人FGF-2(Reliatech)。6天后,根据生产商的说明,使用CellTiter96 Aqueous One(Promega)评估细胞生存力。
使用突变蛋白S209.2-C23、S209.2-D16、S209.2-N9、S209.6-H7、S209.6-H10、S209.2-M17和S209.2-O10(SEQ ID NO:27-33)的测量结果示于图21。所有本发明突变蛋白均显示显著抑制VEGF诱导的HUVEC细 胞增殖,与 诱导的抑制相当或更好,而野生型泪液脂质运载蛋白不抑制VEGF诱导的细胞增殖。FGF-2诱导的细胞增殖不受VEGF特异性突变蛋白、TLPC10或 中任何一种的影响(未显示)。
实施例21:针对VEGF-R2的Tlc突变蛋白的噬菌粒呈递和选择
基本如实施例2所述用得自实施例1的噬菌粒进行噬菌粒展示和选择,进行了以下修改:靶蛋白VEGF-R2-Fc(R&D Systems)以200nM浓度使用,并作为Fc融合蛋白呈递至文库,其后根据生产商的说明使用G蛋白珠(Dynal)捕获噬菌体-靶标复合体。进行四轮选择。
实施例22:使用高通量ELISA筛选来鉴定VEGF-R2结合突变蛋白
基本如实施例3所述进行筛选,改动为靶蛋白VEGF-R2-Fc(R&DSystems)以2.5μg/ml的浓度使用。
筛选了得自实施例21所述方法的1416个克隆,鉴定出指示从本发明文库中成功分离了突变蛋白的593个原始命中。使用该方法鉴定出了突变蛋白S175.4H11(SEQ ID NO:34)。
实施例23:使用易错PCR对VEGF-R2特异性突变蛋白S175.4H11进行亲和力成熟
基本如实施例4所述使用寡聚脱氧核苷酸TL50bio(SEQ ID NO:15)和TL51bio(SEQ ID NO:16)产生基于突变蛋白S175.4H11的变体文库,产生了平均每个结构基因含有2个替换的文库。
如实施例21所述进行噬菌粒选择,使用有限的靶标浓度(5nM、1nM和0.2nM的VEGF-R2-Fc)、在竞争重组VEGF8-109(100nM)存在下延长的洗涤时间(1小时)或短孵育时间(2和5分钟)并使用或不使用有限的靶标浓度(10nM、100nM)。进行四轮选择。
实施例24:使用高通量ELISA筛选对VEGF-R2结合突变蛋白进行亲和力筛选
如实施例3所述进行筛选,改动为将单克隆抗T7标记抗体(Novagen)包被至ELISA平板以捕获产生的Tlc突变蛋白,并使用针对VEGF-R2-Fc中Fc结构域的HRP缀合抗体检测VEGF-R2-Fc(R&D Systems,3nM和1nM)与所捕获突变蛋白的结合。
鉴定了与作为亲和力成熟基础的突变蛋白S175.4H11相比具有提高的亲和力的大量克隆。使用该方法鉴定出了克隆S197.7-N1、S197.2-I18、S197.2-L22、S197.7-B6和S197.2-N24(SEQ ID NO:35-39)。
实施例25:产生VEGF-R2结合突变蛋白
如实施例7所述进行产生。
实施例26:使用Biacore对VEGF-R2特异性突变蛋白进行亲和力测定
基本如实施例8所述进行亲和力测量,改动为捕获了约500RU的VEGF-R2-Fc(R&D Systems)并以1.5μM浓度注入80μl突变蛋白。
使用S175.4-H11、S197.7-N1、S197.2-I18、S197.2-L22、S197.7-B6和S197.2-N24(SEQ ID NOs:35-39)的测定结果总结于表VII。
克隆 | kon | koff | 亲和力 |
[1041/Ms] | [10-51/s] | [nM] | |
S175.4-H11 | 0.9 | 36 | 35 |
S197.7-N1 | 2.1 | 11 | 5.5 |
S197.2-I18 | 2.7 | 8.3 | 3.1 |
S197.2-L22 | 1.2 | 2.4 | 3.3 |
S197.7-B6 | 2.3 | 13 | 6 |
S197.2-N24 | 2.4 | 6.4 | 2.7 |
表VII.通过Biacore测量测定了选定的本发明突变蛋白对VEGF-R2 的亲和力。
实施例27:使用抑制ELISA鉴定VEGF拮抗剂
在抑制ELISA中评估VEGF-R2特异性突变蛋白对VEGF与VEGF受体2(VEGF-R2)之间相互作用的抑制。为此,将恒定浓度的VEGF-R2(4nM VEGF-R2-Fc,R&D Systems)与连续稀释的各个突变蛋白一起孵育,并在ELISA中测定带有未占据的VEGF结合位点的VEGF-R2的量,所述ELISA中包被了VEGF8-109。使用HRP缀合的抗人Fc抗体(Dianova)检测结合的VEGF-R2并与确定量VEGF-R2-Fc的标准曲线进行比较。使用突变蛋白S175.4-H11、S197.7-N1、S197.2-I18、S197.2-L22、S197.7-B6和S197.2-N24(SEQ ID NO:35-39)的测定结果总结于表VIII。
克隆 | 亲和力竞争ELISA |
Ki[nM] | |
S175.4-H11 | 12.9 |
S197.7-N1 | 12 |
S197.2-I18 | 5.5 |
S197.2-L22 | 3.5 |
S197.7-B6 | 3.8 |
S197.2-N24 | 2.3 |
表VIII.通过竞争ELISA测定了选定的本发明泪液脂质运载蛋白突变蛋白的拮抗能力和对VEGF-R2的亲和力。
实施例28:用聚乙二醇(PEG)对IL-4受体α特异性突变蛋白进行位点特异性修饰
通过点突变在IL-4受体α特异性突变蛋白S148.3J14(SEQ ID NO:2)中引入未配对的半胱氨酸残基来代替131位氨基酸Glu,以便提供用于与活化PEG的偶联的反应基。其后如实施例7所述在大肠杆菌中产生带有 该游离Cys残基的重组突变蛋白。
就突变蛋白S148.3J14与PEG的偶联而言,将5.1mg聚乙二醇马来酰亚胺(平均分子量20kDa,线性碳链,NOF)与3mg蛋白质在PBS中混合,并室温搅拌3小时。加入β-巯基乙醇至85μN终浓度以终止反应。对10mM Tris HCl(pH 7.4)透析后,将反应混合物应用至HiTrap Q-XL琼脂糖柱(Amersham),弃去流出液。应用0mM至100mM NaCl梯度洗脱并从未反应的蛋白质中分离PEG化的突变蛋白。
实施例29:使用Biacore对PEG化突变蛋白S148.3J14进行亲和力测量
基本如实施例8所述进行亲和力测量,改动为固定约500RU的IL-4受体α-Fc(R&D Systems),并以200nM、67nM和22nM浓度注入80μl纯化的PEG化突变蛋白。该测定的结果示于图22并总结于表IX。与未PEG化突变蛋白(约37nM,见实施例8)相比,PEG化形式的突变蛋白S148.3J14的亲和力(约30nM)几乎没有变化。
克隆 | kon | koff | 亲和力 |
[1051/Ms] | [10-31/s] | [nM] | |
S148.3J14-PEG | 1.64 | 4.93 | 30 |
表IX.通过Biacore测定的PEG化的本发明突变蛋白S148.3J14对IL-4受体α的亲和力。
实施例30:使用定点随机方法对突变蛋白S209.6-H10进行亲和力成熟
通过将残基位置26、69、76、87、89和106随机化成在这些位置上允许全部20种氨基酸来设计基于突变蛋白S209.6-H10(SEQ ID NO:30)的变体文库。基本如实施例1所述构建文库,改动为分别使用脱氧核苷酸TL107 (覆盖位置26)、TL109(覆盖位置87和89)、TL110(覆盖位置106)和TL111(覆盖位置69和76)来代替TL46、TL47、TL48和TL49。基本如实施例13所述进行噬菌粒选择,使用有限的靶标浓度(10pM和2pM以及0.5pM的VEGF8-109)或与针对VEGF的竞争性单克隆抗体 组合。进行四轮选择。
TL107(SEQ ID NO:40)
GAAGGCCATGACGGTGGACNNSGGCGCGCTGAGGTGCCTC
TL109(SEQ ID NO:41)
GGCCATCGGGGGCATCCACGTGGCANNSATCNNSAGGTCGCACGTGAAGGAC
TL110(SEQ ID NO:42)
CACCCCTGGGACCGGGACCCCSNNCAAGCAGCCCTCAGAG
TL111(SEQ ID NO:43)
CCCCCGATGGCCGTGTASNNCCCCGGCTCATCAGTTTTSNNCAGGACGGCCCTCAC
CTC
实施例31:使用高通量ELISA筛选对VEGF结合突变蛋白进行亲和力筛选
如实施例14所述进行筛选,改动为使用1μg/ml浓度的VEGF,并且此外
i)将单克隆抗T7标签抗体(Novagen)包被到ELISA平板上以捕获产生的突变蛋白,并使用HRP(辣根过氧化物酶)缀合的extravidin检测生物素化VEGF(3nM和1nM)与所捕获的泪液脂质运载蛋白突变蛋白的结合。此外,在备选筛选设置中
ii)不使用人VEGF8-109,而是将小鼠VEGF164(R&D Systems)直接包被到微量滴定板上(1μg/ml)。
iii)将含有VEGF结合突变蛋白的提取物在60℃加热1小时。
iv)将mAB293(R&D Systems,5μg/ml)包被到ELISA平板上,并用生物素化VEGF8-109与所表达的突变蛋白预孵育。使用HRP(辣根过氧化物酶)缀合的extravidin检测VEGF8-109与mAB293的结合。
鉴定到了与作为亲和力成熟基础的突变蛋白S209.6-H10相比具有提高的亲和力的大量克隆。使用该方法鉴定出了克隆S236.1-A22、S236.1-J20、S236.1-M11和S236.1-L03(SEQ ID NO:44-47)。
在这种情况下,应该注意,由于本发明突变蛋白中缺失了泪液脂质运载蛋白的前4个氨基酸,因此氨基酸序列从所保藏的野生型泪液脂质运载蛋白序列的序列位置5(丙氨酸)开始显示,从而Ala5显示为N端氨基酸。此外,用于构建实施例1天然文库的突变蛋白S236.1-A22、S236.1-J20、S236.1-M11和S236.1-L03以及与泪液脂质运载蛋白C端融合的 II的氨基酸序列示于SEQ ID NO:52(S236.1-A22-strep)、SEQ ID NO:53(S236.1-J20-strep)、SEQ ID NO:54(S236.1-M11-strep)和SEQ ID NO:55(S236.1-L03-step)。还显示了本发明泪液脂质运载蛋白突变蛋白偏离所标明的突变位置/突变的变异性,这些突变位置/突变是为各自突变蛋白提供特异性结合给定靶标(如VEGF或VEGF-R2或白介素4受体α链(IL-4受体α))的能力所必需的。
实施例32:产生VEGF结合突变蛋白
基本如实施例7所述进行产生。
实施例33:使用Biacore对VEGF特异性突变蛋白进行亲和力测定
基本如实施例18所述进行亲和力测量。(含参阅图23,其中展示了人泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)与固定的VEGF8-109的Biacore测量)。简言之,使用标准胺化学反应将VEGF8-109固定在CM5芯片上。在500nM至16nM的六种浓度下以30μl/分钟的流速应用脂质运载蛋白突变蛋白。用BIA T100软件评估传感器图,以测定各个突变蛋白的Kon、Koff和KD。
突变蛋白 | kon | koff | 亲和力 |
[1041/Ms] | [10-51/s] | [nM] | |
S236.1-A22 | 8.8 | 2.2 | 0.25 |
S236.1-J20 | 7.9 | 2.2 | 0.28 |
S236.1-L03 | 6.8 | 4.4 | 0.64 |
S236.1-M11 | 7.3 | 2.3 | 0.31 |
表X.在25℃下通过Biacore测定的选定的本发明突变蛋白对VEGF的亲和力。
实施例34:使用抑制ELISA鉴定VEGF的拮抗剂
基本如实施例19所述在抑制ELISA中评估对VEGF与VEGF受体2(VEGF-R2)之间相互作用的抑制,改动为将1小时的孵育时间缩短至10分钟。抑制常数总结于下表中:
突变蛋白 | 亲和力竞争ELISA |
Ki[nM] | |
S236.1-A22 | 5.8 |
S236.1-J20 | 6.3 |
S236.1-L03 | 9.4 |
S236.1-M11 | 6.4 |
表XI.通过竞争ELISA测定的选定的本发明泪液脂质运载蛋白突变蛋白的拮抗能力和对VEGF的亲和力。
实施例35:使用Biacore测定VEGF特异性突变蛋白S236.1-A22的交叉反应性
基本如实施例18所述进行亲和力测量,改动是将突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)固定在传感器芯片上。以250nM浓度注入70μl样品。
图24所示的结果的定性比较显示,截短形式的hVEGF8-109和hVEGF121显示基本相同的传感器图,表明与泪液脂质运载蛋白突变蛋白 S236.1-A22(SEQ ID NO:44)相似的亲和力。剪接形式hVEGF165也显示与脂质运载蛋白突变蛋白强结合,而各自小鼠直向同源物mVEGF164具有稍低的亲和力。同种型VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D及相关蛋白PlGF在该实验中不显示结合(数据未显示)。
实施例36:使用CD光谱术测定VEGF结合突变蛋白的热变性
基本如国际专利申请WO2006/056464的实施例14所述进行圆二色性测量,改动是使用的波长为228nM。例如,泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)的解链温度Tm测定为75℃。
实施例37:S236.1-A22的稳定性测试
基本如国际专利申请WO2006/056464的实施例15所述测试VEGF结合突变蛋白在37℃下在PBS和人血清中的稳定性,只是使用的浓度为1mg/ml。通过HPLC-SEC判断,在PBS中孵育的7天中未检测到突变蛋白的改变(数据未显示)。将脂质运载蛋白突变蛋白在人血清中孵育导致亲和力与参考相比在7天后下降约70%(还参见图25a)。
实施例38:将抗VEGF突变蛋白与白蛋白结合结构域融合
为了延长血清半衰期,将抗VEGF突变蛋白在C端与白蛋白结合结构域(ABD)融合。用于表达的遗传构建体称为pTLPC51_S236.1-A22(SEQID NO:50)(见图26)。
基本如实施例7所述进行VEGF特异性突变蛋白-ABD融合物或Tlc-ABD(作为对照)的制备性产生。
基本如实施例18所述使用表面等离振子共振(Biacore)进行亲和力测量。发现泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22的ABD融合物(A22-ABD)(SEQ ID NO:51)(200pM)对重组VEGF的亲和力基本未改变,测定为260pM(见图27)。
此外,通过如实施例8所述的相同方法测试ABD结构域的完整性, 改动是使用标准胺化学反应将约850RU的人血清白蛋白直接与传感器芯片偶联。以500nM浓度注入60μl突变蛋白-ABD融合物(A22-ABD(SEQID NO:51)或野生型Tlc-ABD(SEQ ID NO:49))。测得其亲和力为约20nM。
基本如实施例37所述测试S236.1-A22的ABD融合物(SEQ ID NO:51)在人血清中的稳定性。在7天的孵育期中未检测到活性丧失(见图25b)。
通过其抑制VEGF诱导的HUVEC增殖的能力测试脂质运载蛋白突变蛋白A22-ABD(S236.1-A22的ABD融合物)在人血清白蛋白存在下的功能性。该测定基本如实施例39所述进行,只是在标明处加入了人血清白蛋白(HSA,5μM)。在5μM HAS下,由于A22-ABD对HAS的纳摩尔亲和力,>99.8%的A22-ABD在任何给定时间均与HAS结合(见图28)。测得IC50值如下:
S236.1-A22-ABD IC50:760pM
S236.1-A22-ABD(+HSA) IC50:470pM。
实施例39:抑制VEGF诱导的HUVEC增殖
在明胶包被的平皿上增殖HUVEC(Promocell),并在P2代到P8代之间使用。第一天,在96孔平板中每孔的完全培养基中接种1400个细胞。第二天,洗涤细胞并加入含有0.5%FCS、氢化可的松和庆大霉素/两性霉素的100μl基本培养基。用20ng/ml VEGF165或10ng/ml FGF-2刺激增殖,将它们与脂质运载蛋白突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)混合,孵育30分钟并加入孔中。在第6天测定生存力,结果表示为%抑制。测得IC50值如下(还参见图29)。
S236.1-A22 IC50:0.51nM
Avastin IC50:0.56nM
FGF-2介导的刺激不受VEGF拮抗剂影响(数据未显示)。
实施例40:抑制HUVEC中VEGF介导的MAP激酶活化
以1400个细胞/孔将HUVEC细胞接种至96孔板的标准培养基(Promocell,Heidelberg)中。第二天,将FCS减少到0.5%并继续培养16小时。接着在基本培养基中的0.5%BSA中使细胞饥饿5小时。在浓度逐渐提高的泪液脂质运载蛋白突变蛋白A22或Avastin(贝伐单抗,Genentech/Roche)存在下用VEGF165(Reliatech,Braunschweig)刺激HUVEC 10分钟,以获得剂量反应曲线。根据生产商的手册(Active Motif,Rixensart,Belgium)使用ELISA定量MAP激酶ERK1和ERK2的磷酸化。IC50值测得为:突变蛋白A22(SEQ ID NO:44)为4.5nM, (参见图30)为13nM。
实施例41:使用局部施用泪液脂质运载蛋白突变蛋白的血管通透性测定
将体重350±50g的Duncan-Hartley豚鼠在肩和背部剃毛。该动物通过耳静脉接受静脉内注射1ml 1%Evan’s蓝染料。30分钟后,将20ngVEGF165(Calbiochem)与10倍摩尔过量的测试物质或对照物混合,并在3×4的方格上皮内注射。30分钟后,通过CO2窒息处死动物。注射VEGF后1小时,取下含有方格图案的皮肤并清除结缔组织。使用图像分析仪(Image Pro Plus 1.3,Media Cybernetics)对染料外渗面积进行定量(见图31)。
实施例42:CAM(鸡尿囊绒膜)测定
如标示将含有FGF-2(500ng)、VEGF(150ng)和泪液脂质运载蛋白突变蛋白(1.35μg)或Avastin(10μg)的胶原种植体置于10日鸡胚的CAM上(4个/动物,10只动物/组)。在24小时时以相同剂量对该种植体再次局部应用泪液脂质运载蛋白突变蛋白或Avastin。72小时后,收集种植体并捕捉图像。通过不知情观察者确定含有至少一个血管的阳性方格的百分比。对VEGF拮抗剂S209.2-O10(SEQ ID NO:33)和 以及野生型泪液脂质运载蛋白对照将中值血管发生指数报告为阳性方格的分数(见图 32)。
实施例43:测定A22和A22-ABD在小鼠中的药代动力学(PK)参数
在NMRI小鼠中测定静脉内注射泪液脂质运载蛋白突变蛋白S236.1A22(SEQ ID NO:44)(4mg/kg)后及静脉内或腹膜内单次快速浓注施用突变蛋白S236.1A22与ABD的融合蛋白(SEQ ID NO:51)(5.4mg/kg)后的药代动力学(PK)参数(半衰期血浆浓度、生物利用率)。从在预定时间点收集的末端血样制备血浆,并通过ELISA测定脂质运载蛋白突变蛋白的浓度。使用WinNonlin软件(Pharsight Corp.,Mountain View,USA)分析结果。T1/2A22静脉内注射:0.42小时;T1/2A22-ABD静脉内注射:18.32小时;T1/2A22-ABD腹膜内注射:20.82小时。腹膜内注射施用融合蛋白A22-ABD后的生物利用率为82.5%(见图33)。
实施例44:全身施用泪液脂质运载蛋白突变蛋白的血管通透性测定
实验前12小时,将测试物质或对照静脉内注射到每组三只动物中。第1组:PBS载体;第2组:Avastin,10mg/kg;第3组:突变蛋白S236.1A22-ABD,6.1mg/kg;第4组:TLPC51:6.1mg/kg。在时间=0时注射Evan’sBlue。30分钟后,在3×4方格中一式三份皮内注射4种剂量的VEGF(5、10、20或40ng)。注射VEGF后30分钟,处死动物并如上对染料外渗进行定量(见图34)。
实施例45:肿瘤异种移植物模型
将基质胶中的1×107个A673横纹肌肉瘤细胞(ATTC)接种至经照射(2.5Gy,Co60)的Swiss裸鼠的右侧腹(n=12只/组)。腹膜内施用处理,在照射开始的同一天开始并持续21天。第1组:PBS载体,每天一次;第2组:Avastin(贝伐单抗,Genentech/Roche),5mg/kg,每3天一次;第3组:突变蛋白A22-ABD(SEQ ID NO:51),每天一次,3.1mg/kg;第4组:TLPC51,每天一次,3.1mg/kg。将脂质运载蛋白A22-ABD的剂量选择成 实现恒定存在等摩尔数的突变蛋白及Avastin的VEGF结合位点,这是基于A22-ABD PK数据和抗体在小鼠中的估计的血清半衰期。用测径器每周两次测量肿瘤大小,并根据式(长度×宽度2)/2来估计肿瘤体积。当肿瘤体积超过2,000mm3时处死小鼠(见图35)。
实施例46:筛选脂质运载蛋白突变蛋白-Cys变体
为了提供用于偶联例如活化的PEG的反应基,通过定点诱变引入未配对的半胱氨酸残基。其后如实施例7所述在大肠杆菌中产生带有游离Cys残基的重组突变蛋白,如实施例14所述测定表达产物并通过ELISA测量亲和力。
下表中给出了VEGF特异性突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)的Cys筛选的示例性结果。使用以下寡核苷酸引入半胱氨酸来代替氨基酸Thr 40、Glu 73、Asp 95、Arg 90和Glu 131:
A22_D95C正向:GAGGTCGCACGTGAAGTGCCACTACATCTTTTACTCTGAGG(SEQ ID NO:56),
A22_D95C反向:CCTCAGAGTAAAAGATGTAGTGGCACTTCACGTGCGACCTC(SEQ ID NO:57),
A22_T40C正向:GGGTCGGTGATACCCACGTGCCTCACGACCCTGGAAGGG(SEQID NO:58),
A22_T40C反向:CCCTTCCAGGGTCGTGAGGCACGTGGGTATCACCGACCC,(SEQID NO:59),
A22_E73C正向:CCGTCCTGAGCAAAACTGATTGCCCGGGGATCTACACGG(SEQID NO:60),
A22_E73C反向:CCGTGTAGATCCCCGGGCAATCAGTTTTGCTCAGGACGG(SEQID NO:61),
A22_E131C正向:GCCTTGGAGGACTTTTGTAAAGCCGCAGGAG(SEQ ID NO:62),
A22_E131C反向:CTCCTGCGGCTTTACAAAAGTCCTCCAAGGC(SEQ ID NO:63),
A22_R9OC正向:CGTGGCAAAGATCGGGTGCTCGCACGTGAAGGACC(SEQ IDNO:64),和
A22_R90C反向:GGTCCTTCACGTGCGAGCACCCGATCTTTGCCACG(SEQ ID NO:65).
克隆 | 产率 | 亲和力 |
[μg/L] | [nM] | |
S236.1-A22 | 1000 | 10 |
S236.1-A22T40C | 420 | 14 |
S236.1-A22E73C | 300 | 13 |
S236.1-A22D95C | 750 | 10 |
S236.1-A22R90C | 470 | 10 |
S236.1-A22E131C | 150 | >100 |
表XII.通过ELISA测定的突变蛋白S236.1-A22及其Thr 40→Cys(SEQ ID NO:66)、Glu 73→Cys(SEQ ID NO:67)、Asp 95→Cys(SEQ IDNO:68)、Arg 90→Cys(SEQ ID NO:69)和Glu 131→Cys(SEQ ID NO:70)突变体对VEGF的亲和力。
实施例47:嗜酸性粒细胞活化趋化因子3分泌测定
在72小时中对A549细胞进行嗜酸性粒细胞活化趋化因子3分泌测定。肺上皮细胞(如A549细胞)在IL-4/IL-13刺激后分泌嗜酸性粒细胞活化趋化因子3。因此,用浓度逐渐提高的结合IL-4受体α的突变蛋白S191.4B24(SEQ ID NO:4)处理细胞,并分别用0.7nM IL-4或0.83nM IL-13进行刺激。在72小时后通过使用市售的夹层ELISA(R&D Systerms)评估嗜酸性粒细胞活化趋化因子3的分泌。结果(图36)证明,结合IL-4受体α的突变蛋白S191.4B24分别以32和5.1nM的IC50值抑制A549细胞中IL-4和IL-13介导的嗜酸性粒细胞活化趋化因子3分泌(表XIII)。
IC50(nM) | |
IL-4 | 32 |
IL-13 | 5.1 |
表XIII.S191.4B24对A549细胞中IL-4和IL-13所介导的嗜酸性粒细胞活化趋化因子3分泌的IC50值。
实施例48:IL-4/IL-13介导的外周血单核细胞上CD23的诱导
从暗黄覆盖区中分离总人PBMC。用浓度逐渐提高的IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24处理PBMC,并分别加入终浓度1.0nM和2.5nM的IL-4或IL-13。将PBMC在含有10%FCS的RPMI培养基中培养48小时。用抗CD14-FITC和抗CD23-PE抗体染色细胞并通过流式细胞术分析。对于每个点,测定双阳性细胞在全部CD14阳性单核细胞中的百分比,并作为突变蛋白浓度的函数作图。
从获得的结果中计算突变蛋白S191.4B24抑制IL-4和IL-13介导的单核细胞上CD23表达的IC50值(表XIV)。
IC50(nM) | |
IL-4 | 905 |
IL-13 | 72 |
表XIV.S191.4B24对IL-4和IL-13介导的PBMC中CD23表达的IC50值。
实施例49:IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24的Schild分析
进行了Schild分析来证实假想的突变蛋白竞争性结合机制并测定对细胞的Kd。用固定浓度的IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24(0、4.1、12.3、37、111.1、333.3或1000nM)处理TF-1细胞并用IL-4滴定,在4天后评估细胞生存力(图38A)。通过非线性回归测定EC50值。所得结果的常规Schild分析(图38B)得到Kd为192pM(线性回归),更准确的非线性回归得到116pM。1.084的Schild斜率表明竞争性抑制,即突变蛋白与IL-4竞争IL-4受体α结合。
实施例50:突变蛋白S191.4B24与原代B细胞的皮摩尔结合
从人血液中分离PBMC,并与不同浓度的IL-4受体α结合人泪液脂质运载蛋白突变蛋白S191.4B24或野生型人泪液脂质运载蛋白(TLPC26)一起孵育。接着用抗CD20-FITC单克隆抗体和生物素化的抗脂质运载蛋白抗血清、其后用链霉亲合素-PE染色细胞。野生型脂质运载蛋白和IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24的结果分别示于图39A和B。将所测定的PE阳性B细胞百分比对脂质运载蛋白浓度进行拟合(图39C),并从所得曲线中计算EC50。IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24(SEQ ID NO:4)结合原代B细胞的EC50计算为105pM。
实施例51:突变蛋白在皮下及气管内给药后的生物利用率
测定了静脉内、皮下或气管内给药后IL-4受体α结合突变蛋白S191.4B24的生物利用率,这通过在大鼠中4mg/kg快速推注突变蛋白S191.4B24后监测血浆浓度4小时来进行。气管内给药使用市售的气管内给药装置 Penn-Century Inc,Philiadelphia,PA,USA)来进行,该装置从连接在注射器上的细长管的尖端产生气溶胶。气溶胶大小约为20μm。非房室药代动力学(PK)分析的结果证实了皮下注射后100%的生物利用率,并且与抗体相反,人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的经肺递送看来是可行的。所得结果示于表XV。
静脉内 | 皮下 | 气管内 | |
t1/2[h] | 0.78 | 1.6 | 2.36 |
生物利用率(AUClast) | n/a | 97.2% | 10% |
生物利用率(AUCinf) | n/a | 119% | 13.8% |
表XV.静脉内、皮下和气管内给药后S191.4B24的半衰期和生物利用率。
实施例52:使用HUVEC增殖测定PEG化VEGF拮抗剂的体外效力
基本如实施例20所述评估对VEGF刺激的HUVEC细胞增殖的抑制,进行以下修改:如实施例28所述将VEGF特异性突变蛋白S236.1-A22(SEQ ID NO:44)在95C位置与PEG20、PEG30或PEG40偶联。向VEGF165中加入突变蛋白、其PEG化衍生物和野生型脂质运载蛋白(pTLPC26的基因产物,作为对照)的连续稀释液,并在室温下孵育30分钟。将混合物加入一式三份孔中的HUVEC细胞中,获得20ng/ml VEGF的终浓度以及标出的0.003nM至2.000nM的浓度。6天后根据生产商的说明用CellTiter-Glo(Promega)评估细胞生存力。
使用上述突变蛋白的测量结果示于图41。S236.1-A22(SEQ ID NO:44)及其PEG化衍生物显示随着附着的PEG部分分子量的下降而显著抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖,而野生型泪液脂质运载蛋白不抑制VEGF诱导的细胞增殖(表XVI)。
IC50(nM) | |
S236.1-A22 | 0.4 |
S236.1-A22-PEG20 | 0.53 |
S236.1-A22-PEG30 | 2.13 |
S236.1-A22-PEG40 | 3.27 |
表XVI.S236.1-A22(SEQ ID NO:44)及其用PEG20、PEG30或PEG40PEG化的衍生物对HUVEC细胞增殖抑制的IC50值。
本文所述发明适于在缺少本文具体公开的任何要素、限制的情况下实施。因此,例如术语“包含”、“包括”、“含有”等应理解为开放性的并且没有限制。此外,本文使用的术语和表述处于描述和表达目的使用,这些术语和表述的使用不排除所显示及描述特征或其部分的任何等同方式,而是应该理解,在要求保护的发明范围内可以有多种改变。因此,应该理解, 尽管本发明通过优选实施方案和任选特征进行了描述,但本领域技术人员可进行本文所述发明的修改和改变,并且这样的修改和改变被认为是在本发明范围内。本文广义和一般性地描述了本发明。落入一般公开内容之内的每种更窄的种类和亚类也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述,而不限制从类中除去任何主题,无论是否所除去的材料是否在本文中具体指出。此外,当本发明的特征或方面以马库什组方式描述时,本领域技术人员会理解,本发明也就该马库什组的任何个体成员或成员亚组进行了描述。本发明的其他实施方案根据以下权利要求将是显而易见的。
Claims (19)
1.产生如SEQ ID No:2-8、SEQ ID No:34-39、SEQ ID No:26-33或44-47中任一项所示的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的方法,其中所述突变蛋白以可检测的亲和力与人泪液脂质运载蛋白的给定非天然配体结合,该方法包括:
(a)将人泪液脂质运载蛋白的核酸分子在天然成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列SEQ ID NO:71中氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中任何位置的至少12、14或16个密码子处进行诱变,其中编码成熟人泪液脂质运载蛋白线性多肽序列SEQ ID NO:71的序列位置61和153处半胱氨酸残基的至少一个密码子已经被突变成编码任何其他氨基酸残基,从而获得编码人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的多种核酸,
(b)在表达系统中表达(a)中获得的一种或多种突变蛋白核酸分子,从而获得一种或多种突变蛋白,和
(c)通过选择和/或分离来富集对人泪液脂质运载蛋白的给定非天然配体具有可检测亲和力的(b)中所得一种或多种突变蛋白。
2.人泪液脂质运载蛋白突变蛋白,其对人泪液脂质运载蛋白的给定的非天然配体具有可检测的结合亲和力,其中所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-8、SEQ ID No:34-39、SEQ ID No:26-33或44-47中任一项所示。
3.核酸分子,其编码权利要求2的突变蛋白。
4.权利要求3的核酸分子,其包含在载体中。
5.权利要求4的核酸分子,其包含在噬菌粒载体中。
6.宿主细胞,其包含权利要求3至5中任一项的核酸分子。
7.药物组合物,其包含权利要求2所定义的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白以及可药用赋形剂。
8.产生权利要求2所定义的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白的方法,其中所述突变蛋白通过遗传工程方法在细菌或真核宿主生物中从编码该突变蛋白的核酸开始产生,并从该宿主生物或其培养物中分离。
9.权利要求2所定义突变蛋白,其用作药物。
10.权利要求2所定义突变蛋白用于生产治疗疾病或病症的药物组合物的用途,其中所述非天然配体为白介素4受体α链(IL-4受体α)或其片段,并且其中所述疾病或病症与Th2免疫应答的提高相关,或者其中所述疾病是癌症。
11.权利要求10的用途,其中所述疾病或病症是变态反应或变应性炎症。
12.权利要求11的用途,其中所述变应性炎症与变应性哮喘、鼻炎、结膜炎或皮炎相关。
13.权利要求2所定义突变蛋白用于生产治疗疾病或病症的药物组合物的用途,其中所述非天然配体为选自血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)或其片段的蛋白,并且其中所述疾病或病症选自血管化作用的提高导致或促进的疾病或病症。
14.权利要求13的用途,其中所述疾病或病症选自癌症、新血管湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、黄斑水肿、早产儿视网膜病变或视网膜静脉闭塞。
15.权利要求14的用途,其中所述癌症选自胃肠道、直肠、结肠、前列腺、卵巢、胰腺、乳腺、膀胱、肾、子宫内膜和肺的癌症、白血病和黑素瘤。
16.权利要求2的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白用于检测样品中人泪液脂质运载蛋白的给定非天然配体的用途,包括以下步骤:
(a)将该突变蛋白在适当的条件下与怀疑含有所述给定配体的样品接触,从而允许该突变蛋白与该给定配体之间形成复合体,和
(b)通过适当的信号检测复合的突变蛋白。
17.权利要求2的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白用于分离人泪液脂质运载蛋白的给定非天然配体的用途,包括以下步骤:
(a)将该突变蛋白在适当的条件下与怀疑含有所述配体的样品接触,从而允许该突变蛋白与该给定配体之间形成复合体,和
(b)从样品中分离突变蛋白/配体复合体。
18.权利要求16或17的用途,其中所述突变蛋白/配体复合体结合在固相支持体上。
19.权利要求2的人泪液脂质运载蛋白突变蛋白用于与人泪液脂质运载蛋白的给定非天然配体在体外形成复合体的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510431417.8A CN105112477A (zh) | 2006-08-01 | 2007-08-01 | 泪液脂质运载蛋白的突变蛋白及其获得方法 |
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US82107306P | 2006-08-01 | 2006-08-01 | |
US60/821,073 | 2006-08-01 | ||
US91201307P | 2007-04-16 | 2007-04-16 | |
US60/912,013 | 2007-04-16 | ||
PCT/EP2007/057971 WO2008015239A2 (en) | 2006-08-01 | 2007-08-01 | Muteins of tear lipocalin and methods for obtaining the same |
Related Child Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510431417.8A Division CN105112477A (zh) | 2006-08-01 | 2007-08-01 | 泪液脂质运载蛋白的突变蛋白及其获得方法 |
CN201510013379.4A Division CN104650213A (zh) | 2006-08-01 | 2007-08-01 | 泪液脂质运载蛋白的突变蛋白及其获得方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101516907A CN101516907A (zh) | 2009-08-26 |
CN101516907B true CN101516907B (zh) | 2015-08-26 |
Family
ID=41040484
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200780035208.5A Active CN101516907B (zh) | 2006-08-01 | 2007-08-01 | 泪液脂质运载蛋白的突变蛋白及其获得方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101516907B (zh) |
ES (1) | ES2354653T3 (zh) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG10201408073XA (en) * | 2009-12-07 | 2015-01-29 | Pieris Ag | Muteins of human lipocalin 2 (lcn2, hngal) with affinity for a given target |
PL2580236T3 (pl) * | 2010-06-08 | 2019-09-30 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Muteiny lipokaliny łez wiążące IL-4 R alfa |
EP2606061B8 (en) * | 2010-08-16 | 2017-09-27 | Pieris Pharmaceuticals GmbH | Binding proteins for hepcidin |
CN106573964B (zh) * | 2014-05-22 | 2021-07-16 | 皮里斯制药有限公司 | 新型特异性结合多肽及其用途 |
US10899805B2 (en) | 2014-10-02 | 2021-01-26 | Paul Scherrer Institut | Human G protein alpha subunit gail with at least one mutated amino acid residue |
CN114573680A (zh) * | 2015-05-04 | 2022-06-03 | 皮里斯制药有限公司 | Cd137特异性的蛋白 |
MX2017014716A (es) | 2015-05-18 | 2018-06-28 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Polipeptido de fusion anti-cancer. |
SI3665192T1 (sl) * | 2017-08-10 | 2023-11-30 | Denali Therapeutics Inc. | Inženiring polipeptidov, ki se vežejo na receptorje za transferine |
CN111542535A (zh) * | 2017-12-20 | 2020-08-14 | 圣安娜儿童癌症研究中心 | 配体调控的蛋白-蛋白相互作用系统 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999016873A1 (de) * | 1997-09-26 | 1999-04-08 | Arne Skerra | Anticaline |
WO2005019256A2 (en) * | 2003-08-25 | 2005-03-03 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of tear lipocalin |
WO2006056464A2 (en) * | 2004-11-26 | 2006-06-01 | Pieris Ag | Compound with affinity for the cytotoxic t lymphocyte-associated antigen (ctla-4) |
-
2007
- 2007-08-01 CN CN200780035208.5A patent/CN101516907B/zh active Active
- 2007-08-01 ES ES07788139T patent/ES2354653T3/es active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999016873A1 (de) * | 1997-09-26 | 1999-04-08 | Arne Skerra | Anticaline |
EP1270725A1 (de) * | 1997-09-26 | 2003-01-02 | Pieris ProteoLab AG | Anticaline |
WO2005019256A2 (en) * | 2003-08-25 | 2005-03-03 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of tear lipocalin |
WO2006056464A2 (en) * | 2004-11-26 | 2006-06-01 | Pieris Ag | Compound with affinity for the cytotoxic t lymphocyte-associated antigen (ctla-4) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2354653T3 (es) | 2011-03-16 |
CN101516907A (zh) | 2009-08-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104650213A (zh) | 泪液脂质运载蛋白的突变蛋白及其获得方法 | |
CN101516907B (zh) | 泪液脂质运载蛋白的突变蛋白及其获得方法 | |
JP5562257B2 (ja) | ヒトc−met受容体のチロシンキナーゼに対し親和性を有する涙液リポカリンの変異タンパク質、及びそれを得るための方法 | |
JP6884708B2 (ja) | Cd137に特異的なタンパク質 | |
JP4856543B2 (ja) | 涙リポカリンの突然変異タンパク質 | |
CN102770764B (zh) | 对给定靶标具有亲和力的人脂质运载蛋白2(Lcn2,hNGAL)的突变蛋白 | |
JP2019115342A (ja) | IL−4Rαに結合する涙液リポカリンムテイン | |
JP6100694B2 (ja) | グリピカン−3(gpc3)に対して親和性を有するヒトリポカリン2の突然変異タンパク質 | |
AU2011203057B2 (en) | Muteins of tear lipocalin and methods for obtaining the same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1131167 Country of ref document: HK |
|
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1131167 Country of ref document: HK |