JP6100694B2 - グリピカン−３（ｇｐｃ３）に対して親和性を有するヒトリポカリン２の突然変異タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、新奇で、グリピカン−３（ＧＰＣ３）を指向し特異的結合性を有する治療上および／または診断に役立つタンパク質に関し、タンパク質が好ましくはリポカリンタンパク質、より好ましくはリポカリン２（Ｌｃｎ２またはＮＧＡＬ）の突然変異タンパク質である。また、本発明は、そのようなタンパク質をコードする核酸分子、並びに、そのようなタンパク質および核酸分子の生成および使用のための方法に関する。従って、本発明は、そのようなリポカリンタンパク質を含む、これらタンパク質の使用を含めて、薬学的および／または診断に役立つ組成物を指向するものである。

グリピカン−３（ＧＰＣ３）は、グリコシル−ホスファチジルイノシトールが結合した（ａｎｃｈｏｒｅｄ）ヘパリン硫酸プロテオグリカンのグリピカンファミリに属する癌胎児性抗原である。グリピカンは、ヘパリン硫酸グリコサミノグリカンと称される複合多糖鎖に対する共有結合により特徴付けられる。グリピカンは、細胞−細胞外マトリックス界面での細胞シグナリングに含まれている（Sasisekharan et al., Nature Reviews I Cancer, Volume2 (2002)）。今日までに、ヒトグリピカンファミリの６つの異なるメンバが同定されている。細胞膜−結合グリピカン−３は、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合で結合した２つのサブユニットで構成されている。

グリピカン−３は、成長中の胎児肝および胎盤で現れ、正常成人組織では低下調節されるか沈黙している。グリピカン−３遺伝子における突然変異または減少は、ヒトのシンプソン−ゴラビ−ベヘメル（Simpson-Golabi-Behmel）またはシンプソン異形症症候群（Simpson dysmorphia syndrome）に応答性である。グリピカン−３は、種々の癌、特に、肝細胞癌（「ＨＣＣ」）、メラノーマ（melanoma）、ウィルムス腫（Wilm’s
tumor）および肝芽細胞腫（hepatoblastoma）で現れる（Jakubovic and Jothy; Ex.Mol.Path. 82: 184-189
(2007);Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2): 71-77 (2005)）。

ＨＣＣは、世界中の癌関連死の第３位の主要原因である。各年、約百万人の死亡原因となる（Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2): 71-77 (2005)）。肝硬変症を引き起こすＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよび慢性の重度の飲酒習慣は、ＨＣＣの最も一般的な原因のままである。その発生率は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の蔓延のために、合衆国において劇的に増加しており、今後２０年間で増加することが予測されている。ＨＣＣは、主として、肝臓移植または腫瘍切除により治療される。患者の予後は、基本的な肝機能および腫瘍が診断された時点でのステージの両者に依存している（Parikh
and Hyman, Am J Med. 120(3): 194-202 (2007)）。効果的なＨＣＣ治療方法（strategies）が求められている。このため、ＧＰＣ３、好ましくは腫瘍細胞上に現れるＧＰＣ３をターゲティングするための有効な手段および方法を有することが望まれている。

ＧＰＣ３を分離し分析する方法、同様に、ＧＰＣ３に関連した疾患や異常の治療用薬剤は、国際公開ＷＯ２００９／０１２３９４号、ＷＯ２００７／１３７１７０号やＷＯ２００７／０４７２９１号に記載されている。しかしながら、本発明で提供されるタンパク質に付随する特徴を有するグリピカン−３結合タンパク質は、以前には記載されていない。

本発明の一実施形態は、グリピカン−３（ＧＰＣ３）を約１０ｎＭまたはそれ未満のＫＤにより測定された親和性で結合することが可能なリポカリン突然変異タンパク質に関する。より好ましくは、そのリポカリンは、約１ｎＭまたは０．３ｎＭまたはそれ未満のＫＤにより測定された親和性を有するものである。他の実施形態では、リポカリン突然変異タンパク質は、競合アッセイにおいて、好ましくは約１ｎＭ、０．６ｎＭまたは０．２ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０値でＧＰＣ３に結合するために競合することが可能である。

他の実施形態では、本発明は、リポカリン突然変異タンパク質に関し、前記突然変異タンパク質がｈＬｃｎ２の直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および／または１３４に対応する１つまたはそれ以上の位置での置換、好ましくはここに記載されるような置換を含む。

特有の実施形態では、本発明の突然変異タンパク質は、ＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の配列位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および／または１３４に対応する配列位置で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、しばしばそれ以上の置換を含む。

同様に、本発明は、配列番号：２７に示されたＮＧＡＬを含むポリペプチドに関し、前記ＮＧＡＬが配列位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および／または１３４で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の突然変異したアミノ酸残基を含む。そのようなポリペプチドは、好ましくは、アンチカリンである。

他の特有の実施形態では、本発明に従うリポカリン突然変異タンパク質は、配列番号：１〜配列番号：８で構成する群から選択されたアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、その突然変異タンパク質がヒトリポカリン２（ｈＮＧＡＬ）を含む野生型ヒトリポカリンの配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有している。好ましくは、前記突然変異タンパク質は、ＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の配列位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および／または１３４で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、しばしばそれ以上の突然変異したアミノ酸残基を含む。

他の実施形態では、本発明の突然変異タンパク質は、有機分子、酵素ラベル（酵素標識）、放射性ラベル、有色ラベル、蛍光ラベル、発色ラベル、発光ラベル、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、細胞増殖抑制剤、毒素、金属複合体、金属およびコロイド金で構成する群から選択された１つの化合物と結合（conjugate）している。突然変異タンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端で、タンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチドである融合パートナに融合されていてもよい。

他の実施形態では、突然変異タンパク質は、その突然変異タンパク質の血清半減期を延長する化合物に結合されている。より好ましくは、突然変異タンパク質は、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロエチルでんぷん、免疫グロブリンのＦｃ部位、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン結合ペプチドおよびアルブミン結合タンパク質で構成する群から選択された化合物に結合されている。

他の実施形態では、本発明の突然変異タンパク質は、ＧＰＣ３のアンタゴニストである。

他の実施形態では、本発明は、本発明の突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。

さらに他の実施形態では、本発明は、その核酸分子を含むホスト（宿主）細胞を包含する。

他の実施形態では、本発明のリポカリン突然変異タンパク質は、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、ビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）、アポリポプロテインＤ（ＡＰＯ Ｄ）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、涙リポカリン（ＴＬＰＣ）、α２−ミクログロブリン関連タンパク質（Ａ２ｍ）、２４ｐ３／ユテロカリン（２４ｐ３）、ｖｏｎ Ｅｂｎｅｒｓ ｇｌａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＶＥＧＰ １）（エブネル腺タンパク質１）、ｖｏｎ Ｅｂｎｅｒｓ ｇｌａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＶＥＧＰ ２）および主要アレルゲンＣａｎ ｆ１前駆体（ＡＬＬ−１）（Major allergen Can f1 precursor）の突然変異タンパク質で構成する群から選択される。関連する実施形態では、リポカリン突然変異タンパク質は、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）、ヒト涙リポカリン（ｈＴＬＰＣ）、ヒトアポリポプロテインＤ（ＡＰＯ Ｄ）およびシロチョウ（Pieris
brassicae）のビリン結合タンパク質で構成する群から選択される。

また、本発明は、腫瘍、好ましくは肝臓腫瘍やメラノーマを治療する方法を含み、その方法がここに記載されるような突然変異タンパク質を含む薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。

成熟Ｌｃｎ２のアミノ酸配列における２０のアミノ酸位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および１３４（下線および番号を付した）の同時のランダム突然変異生成のためのＰＣＲアッセンブリストラテジィを示す。これら２０の位置は、４つの配列サブセットに分かれている。各サブセットにおけるアミノ酸のランダム化のために、オリゴデオキシヌクレオチド（配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９）を合成し、ヌクレオチドのＮＮＫ混合物を突然変異したコドンで使用した。Ｎは全４つの塩基Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物を意味しており、一方、Ｋは２つの塩基ＧおよびＴのみの混合物を意味しており；このため、そのようなトリプレットは、全２０の天然アミノ酸と同様にアンバー停止コドンのＴＡＧをコードしており、そのコドンは、ファージミド生成および遺伝子発現のために使用される、大腸菌（E.coli）ｓｕｐＥ−株（strains）のＸＬ１−ｂｌｕｅ（Bullock et al., BioTechniques5(1987), 376-378）やＴＧ１（Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989),Cold Spring Harbor Press）においてグルタミンとして翻訳される。非コードストランド（下記３’−５’方向におけるＤＮＡ二本鎖配列）に対応し、上述したオリゴデオキシヌクレオチド間のギャップを満たす確定したヌクレオチド配列を有する４つの追加のオリゴデオキシヌクレオチド（配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３）もアッセンブリ反応に使用した。過剰に添加されビオチングループを有する２つのより短いフランキング（flanking）オリゴデオキシヌクレオチド（配列番号：２４、配列番号：２５）は、アッセンブルされた完全合成の遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅用のプライマとして供給した。２つのフランキングプライマのそれぞれは、酵素消化で相互に非適合性オーバーハングを引き起こすＢｓｔＸＩ制限サイト（ＣＣＡＮＮＮＮＮＮＴＧＧ）を包含する。この制限サイトの特定の配列が合成遺伝子の特有の効率的なライゲーションおよびクローニングを可能とする。オリジナルＬｃｎ２配列についてのアミノ酸Ｇｌｎ２８のＨｉｓへの置換は、第１のＢｓｔＸＩサイトを導入するために必要であるが、第２のものではＬｃｎ２のｃＤＮＡにおいて自然に生じる。また、対になっていない残基Ｃｙｓ８７は、遺伝子アッセンブリの間にＳｅｒに置き換えられた。１ポットのＰＣＲの後、得られた遺伝子フラグメントを、Ｌｃｎ２構造遺伝子の欠損部を提供するベクタに挿入した。また、この図は、２つのＢｓｔＸＩ制限サイトに隣接された（flanked）カセットの上流側および下流側のそれぞれの２つの短鎖プライマ（配列番号：３２、配列番号：３３）を表しており、二本鎖ＤＮＡの配列決定用に供給した。 合成Ｌｃｎ２遺伝子のライブラリのヌクレオチド配列を示す（図１のように、２つのＢｓｔＸＩ制限サイトに隣接された中央のカセットのみを示す。）。この遺伝子フラグメントは、スローニング バイオテクノロジィ社（Sloning BioTechnology GmbH）により調製されたものである。図１に記載したＤＮＡライブラリと比較して、２つの相違点がある。第１に、可能であればいつでも、大腸菌発現用に最適化されたコドンが突然変異していないアミノ酸位置の全体で使用された。第２に、それぞれがシステイン以外の異なるアミノ酸をコードする１９の異なるトリプレット（ＧＡＣ、ＴＴＣ、ＣＴＧ、ＣＡＣ、ＡＡＴ、ＡＧＣ、ＡＣＣ、ＧＣＡ、ＡＴＧ、ＣＣＴ、ＧＴＴ、ＴＧＧ、ＧＡＧ、ＣＡＡ、ＡＴＣ、ＧＧＡ、ＣＧＴ、ＧＣＡ、ＴＡＣ）の混合物が、２０のランダム化された位置で用いられており、図１に表された１つと同一である。アミノ酸の番号付けは、スローニング バイオテクノロジィ社により用いられた内部スキームに対応しており、これにより、Ｇｌｙの１番は、上流側ＢｓｔＸＩ制限サイトに直接続く第１アミン酸コドンである。 野生型ＮＧＡＬリポカリンのポリペプチド配列と比較して、グリピカン−３特異的、ＮＧＡＬベースのリポカリン突然変異タンパク質の特定アミノ酸配列の並び（alignment）を示している。ＮＧＡＬに誘導されグリピカン−３に結合する突然変異タンパク質は、１から１７８までの残基を含み、それらが成熟した野生型タンパク質の長さを有することを意味している。残基１７９から１８８までは、生成した突然変異タンパク質の分離に用いたストレプトアビジン結合タグＳｔｒｅｐ−ｔａｇ^ＴＭの配列である。 ヒトグリピカン−３のための選択されたＬｃｎ２突然変異タンパク質のダイレクトＥＬＩＳＡのグラフである。Ｌｃｎ２野生型タンパク質は、グリピカン−３についてのこのアッセイで無視しうるシグナルを示し、ネガティブコントロールとして供給した。 選択されたＬｃｎ２突然変異タンパク質の競合結合アッセイの結果を示す。 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定されたヒトグリピカン−３に対する選択された突然変異タンパク質の親和性を示す。 ヒト、カニクイザルおよびマウスのＧＰＣ３を感染させたＳＫ−Ｈｅｐ１細胞に対する選択されたＬｃｎ２突然変異タンパク質の細胞ベースの結合アッセイの結果を示す。 配列番号：２７のアミノ酸配列を示す。

一態様では、本発明は、グリピカン−３（ＧＰＣ３）に対して指向し、または、グリピカン−３について特異的な、新奇で特異的結合性を有するタンパク質に関する。本発明のタンパク質は、治療的および／または診断的目的のために使用されてもよい。本発明のタンパク質は、特に、リポカリン突然変異タンパク質、同様にここに記載された「リポカリンの突然変異タンパク質」または「アンチカリン」を含む。より好ましくは、本発明のタンパク質は、ここに記載されたｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質である。ここで用いられるように、結合特異性が絶対的なものではなく、相対的な性質のため、ターゲット（標的）と、１またはそれ以上の参照ターゲットとの間を区別することができるのであれば、本発明のタンパク質がターゲット（ここでは、ＧＰＣ３）に「特異的に結合する」。「特異的結合性」は、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ−、ＲＩＡ−、ＥＣＬ−、ＩＲＭＡ−テスト、ＦＡＣＳ、ＩＨＣおよびペプチドスキャンに従い決定され得る。

同様に、他の態様では、本発明は、リポカリン突然変異タンパク質に関し、その突然変異タンパク質がｈＬｃｎ２の直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および／または１３４に対応する１またはそれ以上の位置での置換、好ましくはここに記載された置換を含む。

代わりの態様では、本発明は、リポカリン、好ましくは配列番号：２７に示されるｈＮＧＡＬを含み、そのｈＮＧＡＬがｈＬｃｎ２の直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および／または１３４に対応する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸位置での置換、好ましくはここに記載された置換を含むポリペプチドに関する。この代わりの態様のポリペプチドは、好ましくはアンチカリンである。

同様に、本発明は、４つのループにより一端でペアワイズに結合された８つのβ−ストランドを含み、それにより結合ポケットが定められる円筒状β−折りたたみシートの超二次構造領域を有するＮＧＡＬから誘導されたリポカリン突然変異タンパク質に関し、４つのループの少なくとも３つのそれぞれにおける少なくとも１つのアミノ酸が突然変異されており、そのリポカリンが、検出可能な親和性で、所与の非天然ターゲットとしてのＧＰＣ３と結合することに効果的である。有利なことに、リポカリン突然変異タンパク質は、ＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および／または１３４でのアミノ酸に対応する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸位置での置換、好ましくはここに記載された置換を含む。

本発明に関し用いられるときには用語「位置」は、ここに示されるアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸の位置、または、ここに示される核酸配列におけるヌクレオチドの位置を意味する。ここで用いられる用語「対応する」は、先行するヌクレオチド／アミノ酸の番号により決定されるのみではない位置も含んでいる。従って、本発明に関する所与のアミノ酸の位置は、置換されていてもよいが、（突然変異体または野生型）リポカリンにおけるどこかのアミノ酸の欠失または付加に起因して変えてもよい。同様に、本発明に関する所与のヌクレオチドは、置換されていてもよいが、プロモータおよび／または他のいずれかの制御配列（regulatory sequences）または遺伝子（エキソンおよびイントロンを含む）を含む突然変異タンパク質または野生型リポカリン５’−未翻訳領域（ＵＴＲ）におけるどこかの欠失または付加ヌクレオチドに起因して変わり得る。

このため、本発明に関する「対応する位置」では、ヌクレオチド／アミノ酸が示された番号が違っていてもよく、同様に隣接するヌクレオチド／アミノ酸を依然として有していてもよいと理解されるべきことが好ましい。そのヌクレオチド／アミノ酸は、交換、欠失または付加されていてもよいが、用語「対応する位置」により含まれるものでもある。

特に、本発明のＮＧＡＬリポカリン突然変異タンパク質と異なるリポカリンのヌクレオチド残基またはアミノ酸配列のアミノ酸残基が、記載されたように、ＮＧＡＬリポカリン突然変異タンパク質、特に配列番号：１〜８のいずれか、または、ＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および／または１３４での１またはそれ以上のアミノ酸置換を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における特定の位置に対応するかどうかを決定するために、当業者は、本技術分野においてよく知られた手法および方法、例えば、アライメントを使用することができ、手動でもよく、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ ＴｏｏｌやＣｌｕｓｔａｌＷまたは配列アライメントを生成するために適する他のいずれかの適切なプログラムの代わりとなる、ＢＬＡＳＴ２．０等のコンピュータプログラムを使用してもよい。従って、配列番号：１〜８のいずれか、または、ＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および／または１３４での１またはそれ以上のアミノ酸置換を有するリポカリン突然変異タンパク質は、「サブジェクト配列（subject sequence）」としての役割を果たし、一方、ＮＧＡＬと異なるリポカリンのアミノ酸配列は「クエリ配列（query
sequence）」としての役割を果たす。

上述のように、当業者は、ここに記載されたＬｃｎ２において突然変異したいずれのアミノ酸位置がＬｃｎ２以外のスカフォールド（scaffold）、好ましくはここに記載されたものの１つ等のアミノ酸に対応するかを位置において容易に決定する。特に、当業者は、その突然変異タンパク質のいずれのアミノ酸が異なるリポカリンのアミノ酸配列のそれぞれのアミノ酸に対応するかを決定するために、ここに記載された突然変異タンパク質、特に異なるリポカリンのアミノ酸配列を有する本発明のＮＧＡＬ突然変異タンパク質（またはアンチカリン）のアミノ酸配列を整列（align）することができる。このため、特に、当業者は、その異なるリポカリンのアミノ酸配列のいずれのアミノ酸が、ｈＬｃｎ２の直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および／または１３４でのアミノ酸に対応するかを決定することができる。

本発明のタンパク質は、ＧＰＣ３を指向するか、または、ＧＰＣ３について特異的であり、タンパク質スカフォールドを定める基礎となるいくつかの特異的結合性を有するタンパク質の突然変異タンパク質を包含している。ここで用いられる、「突然変異タンパク質」、「突然変異した」本体（タンパク質または核酸）、または、「突然変異体」は、それぞれ、自然に生じる（野生型）核酸またはタンパク質の「参照」スカフォールドと比較して、１またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換（exchange）、欠失（deletion）または挿入に関する。好ましくは、それぞれ、交換され、欠失され、または、挿入されるヌクレオチドまたはアミノ酸の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または、２５、３０、３５、４０、４５または５０等のそれ以上である。しかしながら、本発明の突然変異タンパク質がＧＰＣ３を結合することが可能なままであることが好ましい。

本発明のタンパク質は、リポカリン、好ましくは、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、ビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）、アポリポプロテインＤ（ＡＰＯ Ｄ）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、涙リポカリン（ＴＬＰＣ）、α２−ミクログロブリン関連タンパク質（Ａ２ｍ）、２４ｐ３／ユテロカリン（２４ｐ３）、ｖｏｎ Ｅｂｎｅｒｓ ｇｌａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＶＥＧＰ １）、ｖｏｎ Ｅｂｎｅｒｓ ｇｌａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＶＥＧＰ ２）および主要アレルゲンＣａｎ ｆ１前駆体（ＡＬＬ−１）で構成する群から選択されるリポカリンの突然変異タンパク質とすることができ、ＮＧＡＬが好適なリポカリンである。ここで用いられる「リポカリン」は、重量およそ１８〜２０ｋＤＡのモノマタンパク質（monomeric protein）であり、複数（好ましくは４つ）のループにより一端でペアワイズに結合された複数（好ましくは８つ）のｂ−ストランドを含み、それにより結合ポケットが定められる円筒状ｂ−折りたたみシートの超二次構造領域を有するものとして定義される。それは、リポカリンファミリのメンバ間の異なる結合モードの変化を引き起こし、それぞれが異なるサイズ、形状および化学的性質のターゲットに適応することが可能である、他の強固なリポカリンスカフォールドにおけるループの多様性である（例えば、Flower,
D.R. (1996)、前掲; Flower, D.R. et al. (2000)、前掲、または、Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys.
Acta 1482, 337-350に報告されている）。実際に、タンパク質のリポカリンファミリは、全体の折りたたみ（folding）形態を高度に保存しながら、通常、低レベルの全体の配列保存（しばしば、２０％より低い配列同一性）を共有し、広範囲のスペクトルのリガンドを結合するために自然に進化している。種々のリポカリンにおける位置間の対応は、当業者によく知られている。例えば、米国特許第７，２５０，２９７号を参照されたい。

好適な実施形態では、本発明のタンパク質は、リポカリン２（Ｌｃｎ２；ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ｈＮＧＡＬとして、またはシデロカリン（siderocalin）としても知られる）の突然変異タンパク質である。ここで用いられる用語「ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン」、「ｈＮＧＡＬ」、「リポカリン２」または「Ｌｃｎ２」は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＵｎｉＰｒｏｔデータバンクのアクセッション番号（Accession
Number）Ｐ８０１８８（Ｉｓｏｆｏｒｍ １）の成熟ｈＮＧＡＬに関する。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＵｎｉＰｒｏｔデータバンクのアクセッション番号Ｐ８０１８８に示されたアミノ酸配列は、「参照配列（reference
sequence）」として好適である。

最も好適には、配列番号：２７に示された（図８にも示されている）アミノ酸配列が「参照配列」として好適である。配列番号：２７は成熟ｈＮＧＡＬを示す。用語「参照配列」および（ＮＧＡＬの）「野生型配列」は、ここでは交換可能に用いられる。このタンパク質の成熟形態は、アミノ酸１〜２０のシグナルペプチド（ＭＰＬＧＬＬＷＬＧＬＡＬＬＧＡＬＨＡＱＡ）が切断されているため、アミノ酸２１から１９８までの全配列を有している。また、このタンパク質は、成熟タンパク質の位置７６および１７５でのアミノ酸残基間に形成されたジスルフィド結合を有している。

通常、ここで参照されるときは、「リポカリンの突然変異タンパク質」または「リポカリン突然変異タンパク質」、特に「リポカリン２の突然変異タンパク質」または「リポカリン２突然変異タンパク質」は、「アンチカリン」としても示されうるものである。従って、これらの用語は、ここでは等しく用いられる。好ましくは、アンチカリンは、自然に生じる対応（counterpart）のリポカリンと異なるものであり、少なくとも１つのアミノ酸が自然に生じる対応のリポカリンと異なる。相違点は、アミノ酸の置換、欠失および／または付加でもよいが、置換されていることが好ましい。好ましくは、本発明のアンチカリンは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、または、それ以上のアミノ酸位置、好ましくはここに記載されたアミノ酸位置で異なっている。

この状況において、本発明者らは、ＧＰＣ３について検出可能な親和性と同様に特異性を示し、特定の位置での突然変異を有するリポカリン２突然変異タンパク質の特定のグループを分離した。突然変異についての適切なアミノ酸位置は、ヒトリポカリン２の直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の配列位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および／または１３４を含む。本発明は、これらのタンパク質をコードする核酸にも関する。

検出可能な親和性でＧＰＣ３を結合するタンパク質の突然変異タンパク質を提供するために本発明に従い工学設計され得る他のタンパク質スカフォールドは、以下のものを含む：ＥＧＦ様ドメイン、クリングル−ドメイン（a Kringle-domain）、フィブロネクチンＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇ１ａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、クーニッツ（a
Kunitz）／ウシ膵臓トリプシンインヒビタドメイン、テンダミスタット（tendamistat）、カザール型セリンプロテアーゼインヒビタドメイン（a
Kazal-type serine protease inhibitor domain）、トレフォイル（Ｔｒｅｆｏｉｌ）（Ｐ型）ドメイン、フォンヴィレブランド因子（von
Willebrand factor）Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、チログロブリンＩ型反復、ＬＤＬ−レセプタクラスＡドメイン、スシドメイン（a
Sushi domain）、リンクドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリンドメインまたは免疫グロブリン様ドメイン（例えば、ドメイン抗体またはキャメル重鎖抗体）、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォンヴィレブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型４ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８Ｃ型ドメイン、ヘモペキシン（Hemopexin）ドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、Ｃ２ドメイン、「カッパボディ（Kappabodies）」（Ill.
et al. "Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with
properties of both heavy and light chain variable regions" Protein Eng 10:
949-57 (1997)）、「ミニボディ（Minibodies）」（Martin et al. "The affinity-selection
of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6" EMBO J 13: 5303-9
(1994)）、「ダイアボディ（Diabodies）」（Holliger et al. "‘Diabodies’: small bivalent
and bispecific antibody fragments" PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)）、「ジャヌシン（Janusins）」（Traunecker
et al. "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic
lymphocytes on HIV infected cells" EMBO J 10: 3655-3659 (1991) and
Traunecker et al. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents"
Int J Cancer Suppl 7: 51-52 (1992)）、ナノボディ、アドネクチン、テトラネクチン、ミクロボディ、アフィリン、アフィボディ（an
affibody）、アンキリン、クリスタリン、ノッティン（a knottin）、ユビキチン、ジンク−フィンガタンパク質、自己蛍光タンパク質、アンキリンまたはアンキリン反復タンパク質またはロイシンリッチ反復タンパク質、アビマ（an
avimer）（Silverman, Lu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li
P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer
WP 2005, Nat Biotech, Dec; 23(12): 1556-61, E-Publication in Nat Biotech. 2005
Nov 20 edition）；同様に、ヒトレセプタドメインのファミリのエキソンシャフリング（exon shuffling）により進化した多価アビマタンパク質（Silverman
J, Lu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn
E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer WP, Nat Biotech,
Dec; 23(12): 1556-61, E-Publication in Nat. Biotechnology. 2005 Nov 20 editionにも記載されている）。

本発明のタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列位置の外側で「ペアレンタル（parental）」タンパク質スカフォールド（リポカリン等）の野生型（天然）アミノ酸配列を含んでいてもよく；代わりに、リポカリン突然変異タンパク質は、突然変異タンパク質の結合活性および折りたたみを阻害しない突然変異生成を受けた配列位置の外側でアミノ酸突然変異を含んでいてもよい。そのような突然変異は、確立された標準的方法（Sambrook,
J. et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）を用いてＤＮＡレベルで行われ得る。アミノ酸配列の可能な変更は、挿入または欠失、同様にアミノ酸置換である。

そのような置換は、保存的、すなわち、アミノ酸残基が化学的に同類のアミノ酸残基と置換されてもよい。保存的な置換の例としては、以下のグループのメンバ間での入れ換えがある：１）アラニン、セリンおよびスレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン；並びに、６）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。一方、アミノ酸配列における非保存的な変更を導入することも可能である。さらに、単一のアミノ酸残基を置き換えることに代えて、ペアレンタルなタンパク質スカフォールドの一次構造における１またはそれ以上の連続したアミノ酸を挿入するかまたは欠失するかのいずれかでも可能であり、これらの欠失または挿入が、安定な折りたたみ／機能的な突然変異タンパク質の結果となり、当業者により容易にテストされ得る。

当業者は、本発明により意図されるタンパク質突然変異タンパク質を調製するために有効な方法を評価するだろうけれども、それらタンパク質や核酸配列がここに明確に示されていない。概略として、アミノ酸配列のそのような改変は、例えば、特定の制限酵素に対する切断部位を組み込むことにより、突然変異したリポカリン遺伝子またはその部分のサブクローニングを単純化するために単一のアミノ酸位置の指示された突然変異生成を含む。さらに、これらの突然変異は、所与のターゲットに対するリポカリン突然変異タンパク質の親和性をさらに向上させるために組み込まれてもよい。また、突然変異は、必要であれば、折りたたみ安定性、血清安定性、タンパク質抵抗性（protein resistance）や水溶解性を向上させる、または、凝集傾向を減少させる等の突然変異タンパク質の特定の性質を調整するために導入されてもよい。例えば、ジスルフィド結合形成を回避するために、自然に生じるシステイン残基が他のアミノ酸に突然変異されてもよい。

従って、本発明は、ここに開示されたタンパク質の機能的変異体も含み、その変異体が参照タンパク質に対する配列同一性や配列相同性の限界を有する。「同一性」や「配列同一性」では、それらの類似性や関連性を測定する配列の特性を意味するものである。本発明で用いられる用語「配列同一性」や「同一性」は、これら２つの配列の長い方における残基数について、−当の配列を有する本発明のポリペプチド配列の（同種の）アライメントに続く−ペアワイズで同一な残基のパーセンテージを意味している。パーセント同一性は、同一残基数を全残基数で除算し、結果に１００を乗算することにより決定される。用語「相同性」は、ここでは通常の意味で用いられ、同一のアミノ酸、同様に、２つのタンパク質の直鎖状アミノ酸配列における同じ（equivalent）位置での保存的な置換（例えば、グルタミン酸塩残基のアスパラギン酸塩残基との交換）であると考えられるアミノ酸を含むものである。

配列相同性や配列同一性のパーセンテージは、ここでは、例えば、プログラムＢＬＡＳＴＰ、バージョンｂｌａｓｔｐ２．２．５（２００２年１１月１６日；Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402参照）を使用して決定され得る。本実施形態では、相同性のパーセンテージは、プロペプチド配列を含み、好ましくはペアワイズ比較における参照として野生型タンパク質スカフォールドを用いて、全体のポリペプチド配列アライメント（マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：１１．１；カットオフ値を１０^−３までにセット）に基づいている。それは、ＢＬＡＳＴＰプログラム出力での結果として示される「ポジティブ」（同種のアミノ酸）の数がアライメントについてプログラムで選択されたアミノ酸の全数により除算されたパーセンテージとして算出される。

また、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルでんぷん（ＨＥＳ）、ビオチン、ペプチドやタンパク質等の他の化合物との結合（conjugation）、または、非天然に生じるジスルフィド結合の形成を目的として、新しい反応基を導入するために他のアミノ酸配列位置をシステインに慎重に突然変異することも可能である。ヒトリポカリン２の突然変異タンパク質に関し、ヒトリポカリン２突然変異タンパク質を含むリポカリンのアミノ酸配列にシステイン残基を導入するための突然変異の典型的な可能性は、ｈＮＧＡＬの野生型配列での配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６または１５８に対応する配列位置の少なくとも１つでのシステイン（Ｃｙｓ）残基の導入を含むことである。いくつかの実施形態では、本発明のヒトリポカリン２突然変異タンパク質は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＵｎｉＰｒｏｔデータバンクのアクセッション番号Ｐ８０１８８の配列と比較して、システインが他のアミノ酸残基で置き換えられた配列を有しており、対応するシステインがその配列に再導入されていてもよい。図面と共に示す実施例として、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴのアクセッション番号Ｐ８０１８８の配列にオリジナルに存在しているように、システインに戻すことによる場合に、アミノ酸位置８７でのシステイン残基が導入されてもよい。アミノ酸位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６および／または１５８のいずれかの側で生成したチオールのモイエティ（moiety）は、例えば、それぞれのヒトリポカリン２突然変異タンパク質の血清半減期を増大させることを目的として、突然変異タンパク質をＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅ）またはＨＥＳ化（ＨＥＳｙｌａｔｅ）するために用いられてもよい。

いくつかの実施形態では、本発明に従うタンパク質は、５μＭ以下、約５００ｎＭ、約２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下または０．２ｎＭ以下を含む１００μＭ以下のＫ_ＤでＧＰＣ３を結合する。本発明のタンパク質は、ＧＰＣ３の成熟し折りたたまれた生物活性な形態の連続、不連続のコンホメーションエピトープの１つまたはそれ以上を特異的に結合する。

本発明のタンパク質は、好ましくは、約１０ｎＭのＫ_Ｄによる親和性でＧＰＣ３に結合する。結合親和性は、本発明者らにより、しばしば約１ｎＭ、いくつかのケースでは約０．３または０．２ｎＭおよびそれ未満のＫ_Ｄであることが見出されている。

本発明のタンパク質（例えば、リポカリンの突然変異タンパク質）の選択されたターゲット（この場合は、ＧＰＣ３）に対する結合親和性は、当業者に知られた多くの方法により決定され得る（それにより突然変異タンパク質−リガンド複合体のＫ_Ｄ値が決定される）。そのような方法としては、制限されるものではないが、蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡ、等温滴定カロリメトリ（ＩＴＣ）等の熱量測定法および表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）を含む。そのような方法は、従来確立されたものであり、その実施例についても以下に詳述されている。

本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、成熟ヒトリポカリン２または他のリポカリンに対して高い配列同一性を有している。この状況では、本発明のタンパク質は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％の同一性を有しており、配列番号：１〜８および配列番号：２７の配列で構成する群から選択されるタンパク質に対して少なくとも９５％の同一性を含むものである。

本発明は、また、配列番号：１〜８の配列で構成する群から選択されたタンパク質の構造的相同性を含むものであり、それに関連して約６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、最も好ましくは９５％以上のアミノ酸配列相同性または配列同一性を有するものである。

用語「グリピカン−３」、「グリピカンプロテオグリカン３」、「ＧＰＣ３」、「ＯＴＴＨＵＭＰ００００００６２４９２」、「ＧＴＲ２−２」、「ＳＧＢ」、「ＤＧＳＸ」、「ＳＤＹＳ」、「ＳＧＢＳ」、「ＯＣＩ−５」および「ＳＧＢＳＩ」は、交換可能に用いられており、ヒトグリピカン−３の変異体、アイソフォームおよび種同族体を含む。典型的なヒトグリピカン−３の完全アミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＭ＿００４４８４である。

上述したものと一致して、本発明のタンパク質は、好ましくは、ＧＰＣ３のアンタゴニストとして作用する。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質（例えば、ヒトリポカリン２突然変異タンパク質）は、同族リガンドとの結合または別の相互作用に対するＧＰＣ３分子の能力を阻害することによりＧＰＣ３のアンタゴニストとして作用する。

さらに他の態様では、本発明は、ＧＰＣ３に特異的に結合するヒトリポカリン２の突然変異タンパク質を含めた種々のリポカリン突然変異タンパク質を含む。この意味では、ＧＰＣ３は、野生型ヒトリポカリン２の非天然リガンドに関連しており、「非天然リガンド」が生理学的条件下でヒトリポカリン２を含む野生型リポカリンに結合しない化合物に関する。特定位置での突然変異を有するヒトリポカリン２等の野生型リポカリンを工学設計することにより、本発明者らは、非天然リガンドに対する高親和性および高特異性が可能であることを立証した。一態様では、ｈＬｃｎ２の直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の配列位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および／または１３４のいずれかについてコードする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０のヌクレオチドトリプレット、または、リポカリン上の他のパラレルサイト（parralel sites）で、ランダム突然変異生成は、ヌクレオチドトリプレットのサブセットによるこの位置での置換を許容することで行われる。

また、リポカリンは、成熟ヒトリポカリン２の直鎖状ポリペプチド配列の配列位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および１３４に対応する配列位置の少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個のいずれかでの配列位置を含む、いずれか１つまたはそれ以上で突然変異したアミノ酸残基を有する突然変異タンパク質を生成するために使用されてもよい。

配列位置３６での置換は、例えば、Ｌｅｕ３６→Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、ＭｅｔまたはＳｅｒの置換としてもよい。配列位置４０での置換は、例えば、Ａｌａ４０→Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、ＧｌｙまたはＴｙｒの置換としてもよい。配列位置４１での置換は、例えば、Ｉｌｅ４１→Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＳｅｒの置換としてもよい。配列位置４９での置換は、例えば、Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＴｒｐの置換としてもよい。配列位置５２での置換は、例えば、Ｔｙｒ５２→Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＡｓｎの置換としてもよい。配列位置６８での置換は、例えば、Ｓｅｒ６８→Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＬｙｓの置換としてもよい。配列位置７０での置換は、例えば、Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＰｈｅの置換としてもよい。配列位置７２での置換は、例えば、Ａｒｇ７２→Ａｓｐ、Ｔｒｐ、ＡｌａまたはＳｅｒの置換としてもよい。配列位置７３での置換は、例えば、Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、ＬｅｕまたはＨｉｓの置換としてもよい。配列位置７７での置換は、例えば、Ａｓｐ７７→Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＴｙｒの置換としてもよい。配列位置７９での置換は、例えば、Ｔｒｐ７９→Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、ＳｅｒまたはＩｌｅの置換としてもよい。配列位置８１での置換は、例えば、Ａｒｇ８１→Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＴｒｐの置換としてもよい。配列位置９６での置換は、例えば、Ａｓｎ９６→Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＧｌｙまたはＰｈｅの置換としてもよい。配列位置１００での置換は、例えば、Ｔｙｒ１００→Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、ＩｌｅまたはＡｓｎの置換としてもよい。配列位置１０３での置換は、例えば、Ｌｅｕ１０３→Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、ＡｓｐまたはＴｒｐの置換としてもよい。配列位置１０６での置換は、例えば、Ｔｙｒ１０６→Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＡｓｎまたはＬｅｕの置換としてもよい。配列位置１２５での置換は、例えば、Ｌｙｓ１２５→Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、ＧｌｙまたはＴｒｐの置換としてもよい。配列位置１２７での置換は、例えば、Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＡｓｐの置換としてもよい。配列位置１３２での置換は、例えば、Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＶａｌの置換としてもよい。配列位置１３４での置換は、例えば、Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＩｌｅまたはＳｅｒの置換としてもよい。注目すべきは、参照配列における対応するアミノ酸を置換するアミノ酸は、いずれも、対応する保守的なアミノ酸により交換されうることである。特に、保守的な置換は、以下のグループのメンバ間の置き換えである：１）アラニン、セリンおよびスレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン；および６）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。

一実施形態では、ＧＰＣ３に結合する本発明の突然変異タンパク質は、以下のアミノ酸の置き換えを含む：
（ａ）Ｌｅｕ３６→Ｉｌｅ；Ａｌａ４０→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ａｒｇ；Ｓｅｒ６８→Ａｒｇ；Ｌｅｕ７０→；Ａｒｇ７２→Ａｓｐ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｙ；Ｔｒｐ７９→Ｇｌｙ；Ａｒｇ８１→Ａｌａ；Ａｓｎ９６→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１００→Ａｒｇ；Ｌｅｕ１０３→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１０６→Ａｓｐ；Ｌｙｓ１２５→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｙ；
（ｂ）Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ｉｌｅ４１→Ｍｅｔ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ａｒｇ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ７０→Ｓｅｒ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ａｌａ；
（ｃ）Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ａｌａ４０→Ｖａｌ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ａｒｇ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｎ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｍｅｔ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ１０３→Ａｓｎ；Ｔｙｒ１０６→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｐｈｅ；
（ｄ）Ｌｅｕ３６→Ｍｅｔ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｖａｌ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｎ；Ｔｒｐ７９→Ｇｌｙ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１２５→Ａｒｇ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｐ；
（ｅ）Ｌｅｕ３６→Ｓｅｒ；Ａｌａ４０→Ｈｉｓ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｎ；Ｌｅｕ７０→Ｔｈｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ９６→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１０６→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
（ｆ）Ｌｅｕ３６→Ｉｌｅ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｇｌｎ；Ｇｌｎ４９→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ５２→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｔｙｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１０６→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｉｌｅ；
（ｇ）Ｌｅｕ３６→Ｍｅｔ；Ｉｌｅ４１→Ｓｅｒ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｓｅｒ６８→Ｌｙｓ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｔｙｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；
（ｈ）Ｌｅｕ３６→Ｉｌｅ；Ａｌａ４０→Ｔｙｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ａｒｇ；Ｓｅｒ６８→Ａｒｇ；Ｌｅｕ７０→Ｐｈｅ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｉｌｅ；Ａｒｇ８１→Ｔｒｐ；Ａｓｎ９６→Ｐｈｅ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｙ．

番号付けは、好ましくはＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）に関するものである。従って、上述したように本発明の教示が与えられれば、当業者は、リポプロテインにおけるいずれのアミノ酸が、そのリポプロテインでのそのアミノ酸を突然変異させるために、ＮＧＡＬの好適な参照配列（配列番号：２７）における上述した（ａ）〜（ｈ）に記載されたアミノ酸に対応するかを容易に決定することができる。

また、それぞれの突然変異タンパク質およびそのリガンド間の複合体形成は、それぞれの結合パートナの濃度、競合相手の存在、用いるバッファ系のｐＨおよびイオン強度、並びに、解離定数Ｋ_Ｄの決定用に用いられる実験法（例えば、ほんの少しの例を挙げれば、蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡや表面プラズモン共鳴）や実験データの評価用に用いられる数学的アルゴリズム等の多くの因子により影響されることに注意する。

それゆえ、Ｋ_Ｄ値（それぞれの突然変異タンパク質およびそのターゲット／リガンド間に形成された複合体の解離定数）が、所与のリガンドに対する特有のリポカリン突然変異タンパク質の親和性を決定するために用いられる方法および実験的設定に依存して、特定の実験的範囲内で変化しうることも、当業者にとって明確である。このことは、例えば、Ｋ_Ｄ値が表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）、競合ＥＬＩＳＡまたは「直接ＥＬＩＳＡ」で決定されたかに依存して、測定されたＫ_Ｄ値や許容範囲にわずかな偏差のあり得ることを意味している。

一実施形態では、ここに開示された突然変異タンパク質は、Ｎ−末端またはＣ−末端のいずれかが融合パートナ、好ましくはタンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチドに結合されていてもよい。融合パートナの例としては、ペンタヒスチジンタグ、ヘキサヒスチジンタグやストレプトアビジンタグ（例えば、Streptag（登録商標））等のアフィニティタグがある。このため、本願は、そのようなタグの付けられた、明瞭におよび総称的に記載された突然変異タンパク質のすべてを包含する。

リポカリン突然変異タンパク質フラグメントの特徴に関連して本発明で用いられる用語「フラグメント」は、Ｎ−末端および／またはＣ−末端が短くされた、すなわち、Ｎ−末端および／またはＣ−末端アミノ酸の少なくとも１つが欠落した完全長の成熟Ｌｃｎ２から誘導されたタンパク質またはペプチドに関する。そのようなフラグメントは、好ましくは、成熟Ｌｃｎ２の一次配列における少なくとも１０、より好ましくは２０、最も好ましくは３０またはそれ以上の連続したアミノ酸を含み、通常、成熟Ｌｃｎ２のイムノアッセイにおいて検出可能である。ここで用いられる単語「検出する」または「検出している」は、定量的および定性的レベル、同様にそれらの組合せと理解される。このため、それは、重要な分子の定量的、半定量的および定性的な測定を含む。従って、例えば、サンプル中における、ＧＰＣ３等の分子の存在または不存在、同様にその濃度やレベルが決定されてもよい。

また、上述した突然変異タンパク質、そのタンパク質が当業者に知られた方法を用いることにより検出されたいずれの免疫原性も低減するために、その免疫原性に関して変化させられている突然変異タンパク質は、本発明の範囲に含まれる。

細胞障害性Ｔ細胞は、クラスＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に関連して、抗原存在細胞の細胞表面上でペプチド抗原を認識する。ペプチドのＭＨＣ分子に対して結合する能力は、対立遺伝子特異的であり、その免疫原性と相互に関連する。所与のタンパク質の免疫原性を低減するために、タンパク質におけるいずれのペプチドが所与のＭＨＣ分子に結合するポテンシャルを有しているかを予測する能力が重要な価値である。Ｔ細胞エピトープのポテンシャルを同定するためにコンピュータ的スレッディングアプローチ（a computational threading approach）を用いるアプローチは、所与のペプチド配列のＭＨＣクラスＩ分子に対する結合性を予測するために既に開示されている（Altuvia
et al. (1995) J. Mol. Biol. 249: 244-250）。そのようなアプローチは、本発明の突然変異タンパク質におけるＴ細胞エピトープのポテンシャルを同定し、その意図的な使用に依存して、予測される免疫原性に基づく特異的な突然変異タンパク質の選択を行うために利用されてもよい。さらに、Ｔ細胞エピトープを含むことが予測されたペプチド領域に、これらのＴ細胞エピトープを減少または消失させ、これにより免疫原性を最少化するために追加の突然変異原性を受けさせることも可能である。遺伝的に工学設計された抗体からの両側のエピトープの除去は、既に開示されており（Mateo
et al. (2000) Hybridoma 19(6): 463-471）、本発明の突然変異タンパク質に対して適応されてもよい。これにより得られた突然変異タンパク質は、最少化された免疫原性を有するものであり、以下に示すような、治療的、診断的応用におけるそれらの使用について魅力的である。

いくつかの応用について、本発明の突然変異タンパク質を結合された形態で用いることも有効である。結合は、本技術分野で知られた従来のいずれかのカップリング法を用いて行うことができる。

非天然のターゲットについてここで用いられる用語「有機分子」または「小有機分子」は、少なくとも２つの炭素原子を含み、好ましくは回転可能な炭素結合が７または１２を超えないものであり、１００および２０００ダルトンの間、好ましくは１００および１０００ダルトンの範囲の分子量を有しており、選択的に１または２の金属原子を含む有機分子を示している。

一般に、ここに記載されたリポカリン突然変異タンパク質を、化学的、物理的、光学的または酵素的反応において検出可能な化合物やシグナルを直接的または間接的に生成する適切な化学物質や酵素でラベルすることが可能である。物理的反応と同時に光学的反応／マーカについての例は、光照射に伴う蛍光の放出である。アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼやβ−ガラクトシダーゼは酵素ラベル（同時に光学的ラベル）の例であり、発色性反応生成物の形成を触媒する。一般に、抗体（免疫グロブリンのＦｃ部位における糖モイエティと排他的に用いられるものを除く）について通常用いられるすべてのラベルは、本発明の突然変異タンパク質との結合にも用いられ得る。本発明の突然変異タンパク質は、例えば、所与の細胞、組織または器官に対するその薬剤のターゲットデリバリ（targeted delivery）用、または、例えば、周囲の正常細胞に影響を及ぼさない腫瘍細胞等の細胞に対する選択的ターゲティング用として、適切な治療学的に活性ないずれかの薬剤と結合されてもよい。そのような治療学的に活性な薬剤の例は、放射性核種、毒素、小有機分子および治療上のペプチド（細胞表面レセプタのアゴニスト／アンタゴニストとして作用するペプチド、または、所与の細胞ターゲットでのタンパク質結合サイトに競合するペプチド等）を含む。適切な毒素の例は、制限されるものではないが、百日咳毒素、ジフテリア毒素、リシン、サポリン、緑膿菌外毒素、カリケアマイシン（calicheamicin）またはその誘導体、タキソイド類（a taxoid）、メイタンシノイド（a maytansinoid）、ツブリシン（a
tubulysin）、および、ドラスタチン類似物（a dolastatin analogue）を含む。ドラスタチン類似物は、オーリスタチンＥ（auristatin
E）、モノメチルオーリスタチンＥ、オーリスタチンＰＹＥおよびオーリスタチンＰＨＥとしてもよい。細胞増殖抑制剤の例は、制限されるものではないが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、タキソテレ（Taxotere）（ドセタキセル（Docetaxel））、パクリタキセル（Paclitaxel）、アントラサイクリン（ドキソルビシン（Doxorubicin））、メソトレキセート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ダカルバジン（Dacarbazine）、シクロホスファミド、エトポシド（Etoposide）、アドリアマイシン、カンプトテシン、コンブレタスタチン（Combretatastin）Ａ−４関連化合物，スルホンアミド、オキサジアゾリン、ベンゾ［ｂ］チオフェンシンセチック スピロケタール ピラン、モノテトラヒドロフラン化合物、クラシンおよびクラシン誘導体、メトキシエストラジオール誘導体、並びに、ロイコボリン（Leucovorin）を含む。本発明のリポカリン突然変異タンパク質は、アンチセンス核酸分子、小型妨害性ＲＮＡ（small
interfering RNAs）、マイクロＲＮＡやリボザイム等の治療学的に活性な核酸と結合されていてもよい。そのような結合体は、本技術分野でよく知られた方法により生成することができる。

一実施形態では、本発明の突然変異タンパク質は、本発明である突然変異タンパク質を生体内の望ましい領域または範囲に輸送するために、特異的な身体領域（body region）をターゲットとするターゲティングモイエティと結合していてもよい。そのような改変が望ましい一実施例は、脳血液関門の横断である。脳血液関門を横断するために、本発明の突然変異タンパク質は、この関門を横切る能動輸送を促進するモイエティと結合していてもよい（Gaillard PJ, et
al. (2005) International Congress Series. 1277, 185-198、または、Gaillard PJ, et al.
(2005) Expert Opin Drug Deliv. 2(2), 299-309参照）。そのような化合物は、例えば、商品名２Ｂ−Ｔｒａｎｓ^ＴＭとして入手可能である（to-BBB
technologies BV, Leiden, NL）。本発明の突然変異タンパク質が結合することができる他の典型的なターゲティング分子は、所望のターゲット分子に親和性を有する抗体、抗体フラグメントやリポカリン突然変異タンパク質を含む。ターゲティングモイエティのターゲット分子は、例えば、細胞表面抗原である。細胞表面抗原は、例えば、がん細胞等の細胞や組織タイプに特異的である。そのような細胞表面タンパク質の説明的な例は、ＨＥＲ−２、または、ＮＥＵ−２等のプロテオグリカンである。

上述したように、本発明の突然変異タンパク質は、いくつかの実施形態において、突然変異タンパク質の血清半減期を延長する化合物に結合していてもよい（この点について、そのような結合のストラテジィがＣＴＬＡ−４に対して結合親和性を有するヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンの突然変異タンパク質に関連して記載されているＰＣＴ公報ＷＯ２００６／５６４６４号も参照されたい）。血清半減期を延長する化合物は、ほんの少しの例を挙げれば、ポリエチレン（ＰＥＧ）等のポリアルキレングリコール分子若しくはその活性化された誘導体；ヒドロキシエチルでんぷん、パルミチン酸（Vajo & Duckworth
(2000) Pharmacol. Rev. 52, 1-9）等の脂肪酸分子、免疫グロブリンのＦｃ部位、免疫グロブリンのＣ_Ｈ３ドメイン、免疫グロブリンのＣ_Ｈ４ドメイン、アルブミン若しくはそのフラグメント、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質、トランスフェリン、または、タグＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒとしてもよい。アルブミン結合タンパク質は、細菌性アルブミン結合タンパク質、抗体、ドメイン抗体を含む抗体フラグメント（例えば、米国特許６，６９６，２４５号参照）、または、アルブミンに対して結合活性を有するリポカリン突然変異タンパク質としてもよい。従って、本発明のリポカリン突然変異タンパク質の半減期を延長するための適正な結合化合物は、アルブミン（Osborn et al.
(2002) J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548）、または、アルブミン結合タンパク質、例えば、連鎖球菌プロテインＧ（Konig,
T.
and Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83）等の細菌性アルブミン結合ドメインを含む。結合パートナとして用いられ得るアルブミン結合ペプチドの他の例は、例えば、Ｃｙｓ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｃｙｓのコンセンサス（共通）配列を有するものであり、米国特許出願２００３／００６９３９５号やデニスら（Dennis et al, (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043）により開示されたように、Ｘａａ_１がＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐ；Ｘａａ_２がＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；Ｘａａ_３がＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒ；およびＸａａ_４がＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。

他の実施形態では、アルブミンそれ自体やアルブミンの生物学的活性フラグメントは、突然変異タンパク質の血清半減期を延長する本発明のリポカリン突然変異タンパク質の化合物として用いられてもよい。用語「アルブミン」は、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミンやラットアルブミン等の全哺乳動物のアルブミンを含む。アルブミンやそのフラグメントは、米国特許５，７２８，５５３号や欧州特許出願ＥＰ ０３３０４５１号およびＥＰ ０３６１９９１号に記載されたように組み替えで生成される。タンパク質安定化剤としての使用のための組み換えヒトアルブミン（Recombumin（登録商標））は、例えば、ノボザイム デルタ社（Novozymes Delta Ltd., Nottingham, UK）から入手可能である。

アルブミン結合タンパク質が抗体フラグメントであれば、それはドメイン抗体としてもよい。ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）は、最適な安全性および有効性の生成物プロファイルを創り出すための生物物理学的な特性およびインビボ（in vivo）（生体内）半減期における正確なコントロールを許容するために工学設計されるものである。ドメイン抗体は、例えば、ドマンティス社（Domantis
Ltd., Cambridge, UK and MA, USA）から商業的に入手可能である。

本発明の突然変異タンパク質の血清半減期を延長するためのモイエティとしてトランスフェリンを用いることで、突然変異タンパク質は、非グリコシル化トランスフェリンのＮ末端若しくはＣ末端またはその両者と遺伝的に融合され得る。非グリコシル化トランスフェリンは１４〜１７日の半減期を有しており、トランスフェリン融合タンパク質は同様に延長された半減期を有すると考えられる。また、トランスフェリンキャリアは、高い生物学的利用能（bioavailability）、生体分布および循環安定性を備えている。この技術は、バイオレクシス社（BioRexis Pharmaceutical
Corporation, PA, USA）から商業的に入手可能である。また、タンパク質安定化剤としての使用のための組み換えヒトトランスフェリン（DeltaFerrin^TM）も、ノボザイム デルタ社（Nottingham, UK）から商業的に入手可能である。

本発明の突然変異タンパク質の血清半減期を延長することを目的として免疫グロブリンのＦｃ部位が用いられるとすれば、シントニックス ファーマシューティカルズ社（Syntonix Pharmaceuticals, Inc, MA, USA）から商業的に入手可能なＳｙｎＦｕｓｉｏｎ^ＴＭ技術が用いられてもよい。このＦｃ−融合技術の使用は、長期作用性の生物薬剤（longer-acting biopharmaceuticals）の創作を許容し、例えば、薬物動態学、溶解性および生成効率を向上させるために抗体のＦｃ部位に結合した突然変異タンパク質の２つの複製物を含んでもよい。

本発明の突然変異タンパク質の半減期を延長するための他の代替策は、本発明の突然変異タンパク質のＮ−末端またはＣ−末端を長い、組織化されていない、フレキシブルなグリシンリッチ配列（例えば、約２０から８０までの連続したグリシン残基を有するポリグリシン）に融合させることである。ＷＯ２００７／０３８６１９号に開示されたこのアプローチは、例えば、用語「ｒＰＥＧ」（組み換えＰＥＧ）でもある。

突然変異タンパク質の半減期を延長する化合物としてポリアルキレングリコールが用いられるとすれば、ポリアルキレングリコールが置換されてもよく、未置換とすることもできる。また、それは、活性化されたポリアルキレン誘導体としてもよい。適切な化合物の例は、ＷＯ９９／６４０１６号、米国特許６，１７７，０７４号、米国特許６，４０３，５６４号にインターフェロンと関連して記載されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、または、ＰＥＧ改変アスパラギナーゼ、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（ＰＥＧ−ＡＤＡ）やＰＥＧスーパーオキサイドディスムターゼ等の他のタンパク質用に記載されたポリエチレングリコール分子（例えば、Fuertges et
al. (1990) “The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene
Glycol)-Modified Proteins” J. Control. Release 11, 139-148を参照）である。そのようなポリマ、好適にはポリエチレングリコールの分子量は、例えば、約１０，０００、約２０，０００、約３０，０００、約４０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールを含む、約３００から約７０，０００ダルトンの範囲としてもよい。さらに、例えば、米国特許６，５００，９３０号や６，６２０，４１３号に記載されたように、でんぷんやヒドロキシエチルでんぷん（ＨＥＳ）等の炭水化物オリゴマやポリマは、血清半減期延長の目的のために、本発明の突然変異タンパク質に結合されてもよい。

他の実施形態では、上述した化合物の１つを本発明の突然変異タンパク質に結合するための適切なアミノ酸側鎖を提供するために、人工アミノ酸が突然変異生成により導入されてもよい。通常、そのような人工アミノ酸は、より反応性であり、これにより、所望のモイエティとの結合を促進するために設計される。人工的なｔＲＮＡを介して導入されるそのような人工アミノ酸の一実施例は、パラ−アセチル−フェニルアラニンである。

ここに開示された突然変異タンパク質のいくつかの応用について、それらを融合タンパク質の形態で使用することが有利である。いくつかの実施形態では、本発明である突然変異タンパク質は、そのＮ−末端および／またはＣ−末端で、シグナル配列および／またはアフィニティタグ等のタンパク質、タンパク質ドメインやペプチドに融合されている。

薬学的応用について、本発明の突然変異タンパク質は、その突然変異タンパク質のインビボ血清半減期を延長する融合パートナと融合していてもよい（ＣＴＬＡ−４に対して結合親和性を有するヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンの突然変異タンパク質に関連して、適切な融合パートナが記載されているＰＣＴ公報ＷＯ２００６／５６４６４号をもう一度参照されたい）。上述の結合した化合物と同様に、融合パートナは、ほんの少しの例を挙げれば、免疫グロブリンのＦｃ部位、免疫グロブリンのＣ_Ｈ３ドメイン、免疫グロブリンのＣ_Ｈ４ドメイン、アルブミン、アルブミン結合ペプチドまたはアルブミン結合タンパク質としてもよい。また、アルブミン結合タンパク質は、細菌性アルブミン結合タンパク質またはアルブミンに対して結合活性を有するリポカリン突然変異タンパク質としてもよい。従って、本発明のリポカリン突然変異タンパク質の半減期を延長するための適切な融合パートナは、アルブミン（Osborn, B.L.
et al. (2002) J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548、前掲）、または、アルブミン結合タンパク質、例えば、連鎖球菌プロテインＧ（Konig,
T.
and Skerra ,A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83、前掲）等の細菌性アルブミン結合ドメインを含む。デニスらの前掲の文献（２００２）または米国特許出願２００３／００６９３９５号に記載され、Ｃｙｓ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｃｙｓのコンセンサス配列を有し、Ｘａａ_１がＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐ；Ｘａａ_２がＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；Ｘａａ_３がＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒ；およびＸａａ_４がＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒであるアルブミン結合ペプチドは、融合パートナとしても用いられ得る。また、アルブミン自体またはアルブミンの生物学的活性フラグメントを本発明のリポカリン突然変異タンパク質の融合パートナとして用いることも可能である。用語「アルブミン」は、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミンやラット血清アルブミン等の全哺乳動物のアルブミンを含む。アルブミンの組み換え生成物またはそのフラグメントは、本技術分野においてよく知られており、例えば、米国特許５，７２８，５５３号、欧州特許出願ＥＰ ０３３０４５１号やＥＰ ０３６１９９１号に記載されている。

融合パートナは、本発明であるリポカリン突然変異タンパク質に対して、酵素的活性や他の分子に対する結合親和性等の新たな性質を授けることがある。適切な融合タンパク質の例は、アルカリンホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＧのアルブミン結合ドメイン、プロテインＡ、抗体フラグメント、オリゴマ化ドメイン、同じ若しくは異なる結合特異性のリポカリン突然変異タンパク質（「デュオカリン（duocalins）」の形成の結果となる、Schlehuber, S., and
Skerra, A. (2001), Duocalins, engineered ligand-binding proteins with dual
specificity derived from the lipocalin fold (Biol. Chem. 382, 1335-1342）、または、毒素である。

特に、本発明のリポカリン突然変異タンパク質を別の酵素活性サイトと融合させることが可能であり、得られた融合タンパク質の両「成分」は、所与の治療上のターゲットで共に作用する。リポカリン突然変異タンパク質の結合ドメインは、酵素ドメインにターゲットの生物学的機能を消失させることを許容する疾患原因（disease-causing）ターゲットに結合する。

組み換えタンパク質の容易な検出および／または精製をも許容する、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）やＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（Schmidt, T. G. M. et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 753-766）、ｍｙｃ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｈｉｓ_６−ｔａｇ若しくはＨＡ−ｔａｇ、または、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等のタンパク質、等のアフィニティタグは、好適な融合タンパク質のさらなる例である。そして、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）や黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等の発色性や蛍光性の特性を有するタンパク質は、同様に、本発明のリポカリン突然変異タンパク質に対する適切な融合パートナである。

また、ここで用いられる用語「融合タンパク質」は、シグナル配列を含む本発明によるリポカリン突然変異タンパク質も含む。ポリペプチドのＮ−末端でのシグナル配列は、特異的な細胞の区画、例えば、大腸菌のペリプラズマ（periplasm）（周辺質）や真核細胞の内質網状組織（the endoplasmatic reticulum）にこのポリペプチドを向けさせる。シグナル配列の多くは、本技術分野で知られている。大腸菌のペリプラズマにポリペプチドを分泌させるための好適なシグナル配列は、ＯｍｐＡ−シグナル配列である。

また、本発明は、ここに記載された突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ＤＮＡおよびＲＮＡ）に関する。遺伝コードの変質が同じアミノ酸を指定する他のコドンによる特定のコドンの置換を許可するため、本発明は、本発明の突然変異タンパク質をコードする特異的な核酸分子に制限されないが、機能的な突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むすべての核酸分子を含む。

本願において開示される核酸分子は、この核酸分子の発現を許容するために、制御配列（または複数の制御配列）に対して「作動可能に結合する（operably linked）」ようにすることができる。

ＤＮＡ等の核酸分子は、それが転写および／または翻訳の制御に関する情報を含む配列要素を含んでおり、その配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に結合している」とすれば、「核酸分子を発現する能力を有するもの」または「ヌクレオチド配列の発現を許容するための」能力を有するものに関する。作動可能な結合は、制御配列要素および発現されるべき配列が遺伝子発現を可能とするように結合された結合である。遺伝子発現に必要な制御部位の正確な特徴は、種の間で変わるが、一般には、これらの領域が、原核生物において、本来の両方のプロモータ、すなわち、転写の開始を示すＤＮＡ要素、同様に、ＲＮＡに転写されたときに翻訳の開始のシグナルとなるＤＮＡ要素を含むプロモータを含んでいる。そのプロモータ領域は、通常、転写および翻訳の開始に含まれる、原核生物における−３５／−１０ボックスおよびシャイン−ダルガルノ要素（Shine-Dalgarno element）、または、真核生物におけるＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列および５’−キャッピング要素等の５’非コード配列を含んでいる。これらの領域は、エンハンサまたはリプレッサ要素を含むこともでき、同様に、ホスト細胞の特異的な区画に天然のポリペプチドをターゲットするための翻訳されたシグナルおよびリーダ配列を含むこともできる。

さらに、３’非コード配列は、転写の停止、ポリアデニル化等に含まれる制御要素を含んでいてもよい。しかしながら、これらの停止配列が特定のホスト細胞において機能的に十分でなければ、それらがその細胞における機能的なシグナルで置換されていてもよい。

それゆえ、本発明の核酸分子は、制御配列、好ましくはプロモータ配列を含むことができる。他の好適な実施形態では、本発明の核酸分子は、プロモータ配列および転写停止配列を含む。適切な原核細胞のプロモータは、例えば、ｔｅｔプロモータ、ｌａｃＵＶ５プロモータやＴ７プロモータである。真核細胞における発現のために有効なプロモータの例は、ＳＶ４０プロモータやＣＭＶプロモータである。

本発明の核酸分子は、ベクタ、または、プラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウィルス、コスミド若しくはＹＡＣやＢＡＣ等の人工クロモソーム（artificial chromosome）等のいずれか他種のクローニングビークル（cloning vehicle）の部分とすることもできる。

本発明のリポカリン突然変異タンパク質をコードするＤＮＡ分子、特に、そのようなリポカリン突然変異タンパク質のコード配列を含むクローニングベクタは、遺伝子を発現する能力を有するホスト細胞に形質転換されてもよい。形質転換は、標準的な技術を用いて行うことができる（Sambrook, J. et al. (2001)、前掲）。

このため、本発明は、ここに開示された核酸分子を含むホスト細胞をも指向している。

また、本発明は、本発明の突然変異タンパク質の生成のための方法に関し、突然変異タンパク質、突然変異タンパク質のフラグメントや突然変異タンパク質および他のポリペプチドの融合タンパク質が突然変異タンパク質をコードする核酸から開始し、遺伝学的な工学設計法によって生成される。この方法はインビボで行われうるものであり、突然変異タンパク質は、例えば、細菌性または真核性ホスト生物で生成され、このホスト生物またはその培養から濃縮され、精製され、分離される。また、例えば、インビトロ（in vitro）（生体外）翻訳システムの使用により、インビトロでタンパク質を生成することも可能である。用語「濃縮（enriched）」は、突然変異タンパク質またはその機能的フラグメントが、それが得られたサンプルまたは溶液におけるものと比べて、対象のサンプルまたは溶液に存在する全タンパク質における著しく高い分画を構成することを意味する。濃縮は、例えば、細胞抽出物からの特定の分画の分離を含んでいてもよい。これは、遠心分離等の標準的な技術により得られるものである。濃縮の他の手法の例は、例えば、特定の分子量以下の望ましくない分子の除去で示される濾過や透析、または、有機溶媒や硫酸アンモニウムを用いる沈殿がある。精製は、例えば、クロマトグラフ技術、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティ精製、疎水性相互作用クロマトグラフィまたは疎水性電荷誘導クロマトグラフィを含む。精製のための他の例は、分取（preparative）キャピラリ電気泳動等の電気泳動技術である。分離は、同様の方法の組合せを含んでもよい。ここで用いられる「実質的に純粋」または「実質的に精製された」は、主な種が存在している（例えばモルベースで、組成物における他の個別の種と比べてより豊富である）化合物または種を意味する。いくつかの実施形態では、実質的に精製された組成物は、存在する全分子または適用可能な全高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を含む種の組成物である。特定の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在する全分子または適用可能な全高分子種の約８０％以上、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％を有している。

突然変異タンパク質をインビトロで生成するときは、本発明の突然変異タンパク質をコードする核酸が適切な細菌性または真核性ホスト生物に、組み換えＤＮＡ技術の手法により導入される（既に概要を上述したように）。この目的のために、ホスト細胞は、まず、確立された標準的な方法を用いて、本発明の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含むクローニングベクタで形質転換される（Sambrook, J. et al. (1989)、前掲）。そして、ホスト細胞は、異種起源のＤＮＡの発現、これにより対応するポリペプチドの合成を許容する条件下で培養される。続いて、ポリペプチドは、細胞または培養培地のいずれかから回収される。

一態様では、本発明は、ＧＰＣ３に結合する突然変異タンパク質の生成用の方法に関し、以下のステップを含む：
リポカリンをコードする核酸分子に突然変異生成を受けさせ、１またはそれ以上の突然変異核酸分子を生じさせる。

この方法は、さらに以下のステップを含んでもよい：
（ａ）で得られた１以上の突然変異タンパク質核酸分子を適切な発現系で発現させ、
複数の突然変異タンパク質を少なくともＧＰＣ３のフラグメントまたは成熟形態と接触させ、
所与のターゲットに対して検出可能な結合親和性を有する１またはそれ以上の突然変異タンパク質を選択および／または分離により濃縮する。

ここで用いられる用語「突然変異生成」は、Ｌｃｎ２（ｈＮＧＡＬ；Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータバンクのエントリＰ８０１８８）を含むリポカリンの所与の配列位置で天然に生じるアミノ酸がそれぞれの天然ポリペプチド配列におけるこの特異的な位置に存在しない少なくとも１つのアミノ酸で置換されるように、実験条件が選択されることを意味している。また、用語「突然変異生成」は、１またはそれ以上のアミノ酸の欠失または挿入により配列セグメントの長さの（追加の）改変を含む。このため、例えば、選択された配列位置での１つのアミノ酸が３つのランダム突然変異の長さで置き換えられ、野生型タンパク質のそれぞれのセグメントの長さと比べて２つのアミノ酸残基の挿入となることも本発明の範囲内である。そのような挿入や欠失は、本発明の突然変異生成を受け得るペプチドセグメントのいずれかにおいて互いに独立して導入されてもよい。本発明の典型的な一実施形態では、いくつかの突然変異の挿入が選択されたリポカリンスカフォールドのループＡＢに導入されてもよい（その全体の参照によりここに組み込まれる国際特許出願ＷＯ２００５／０１９２５６号参照）。用語「ランダム突然変異生成」は、所定の単一のアミノ酸（突然変異）が特定の配列位置に存在しないものの、突然変異生成の間に、少なくとも２つのアミノ酸が所定の配列位置で特定の確率で組み込まれ得ることを意味する。

制限されない１つのアプローチとして、ヒトリポカリン２のコード配列は、本発明で選択されたペプチドセグメントの突然変異生成のための開始ポイントとして用いられてもよい。列挙されたアミノ酸位置の突然変異生成について、当業者は、部位特異的突然変異生成のための種々の確立された標準的な方法を自由に用いることができる（Sambrook, J. et al. (2001)、前掲）。一般的に用いられる技術は、合成オリゴヌクレオチドの混合物を用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による突然変異の導入であり、所望の配列位置で変質した塩基組成を生み出す。他の同様な技術は当業者によく知られている。

上で定義された核酸分子は、リポカリンポリペプチドをコードする核酸および／またはベクタの５’−配列および３’−配列の欠損とライゲーションにより結合されてもよく、公知のホスト生物でクローン化されてもよい。多くの確立された手順がライゲーションおよびクローニングに有効である（Sambrook, J. et al. (2001)、前掲）。例えば、クローニングベクタの配列にも存在する制限エンドヌクレアーゼのための識別配列は、合成オリゴヌクレオチドの配列に工学設計されてもよい。このため、それぞれのＰＣＲ生成物の増幅および酵素切断の後、得られたフラグメントは、対応する識別配列を用いて容易にクローン化され得る。

突然変異生成用に選択されたタンパク質をコードする遺伝子におけるより長い配列セグメントは、公知の方法、例えば、エラー率を増加させた条件下でのポリメラーゼ連鎖反応の使用により、化学的突然変異生成により、または、細菌性ミューテータ株を用いることにより、ランダム突然変異生成を受けさせることもできる。そのような方法は、リポカリン突然変異タンパク質のターゲット親和性や特異性のさらなる最適化のために用いられてもよい。実験的突然変異生成のセグメントの外側で生じる可能性のある突然変異は、例えば、それらがリポカリン突然変異タンパク質の向上した折りたたみ効率や折りたたみ安定性の一因となるのであれば、しばしば容認され、有利であることを証明することができる。

他の実施形態では、この方法は、リポカリンの直鎖状ポリペプチド配列、特に、ＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の配列位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および１３４に対応する配列位置の少なくともいずれか１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０をコードするヌクレオチドトリプレットで核酸分子に突然変異生成を受けさせることを含む。そのような核酸は、組み換えＤＮＡ技術を用いることで突然変異生成を受け、適切な細菌性または真核性ホスト生物に導入されてもよい。得られるリポカリンの核酸ライブラリは、抗体様特性を有するリポカリン突然変異タンパク質、すなわち、所与のターゲットに対する親和性を有する突然変異タンパク質を生成するために、本技術分野で公知の適切な技術のいずれかを用いることで行われる。そのような組合せ法の例としては、例えば、国際特許出願ＷＯ９９／１６８７３号、ＷＯ００／７５３０８号、ＷＯ０３／０２９４７１号、ＷＯ０３／０２９４６２号、ＷＯ０３／０２９４６３号、ＷＯ２００５／０１９２５４号、ＷＯ２００５／０１９２５５号、ＷＯ２００５／０１９２５６号やＷＯ２００６／５６４６４号に詳細に記載されている。これら特許出願のそれぞれの内容は、その全体における参照によりここに組み込まれる。適切なホストで突然変異生成を受けた核酸配列の発現の後、所与のターゲットに結合する複数のそれぞれのリポカリン突然変異タンパク質についての遺伝情報を運ぶクローンは、得られたライブラリから選択され得る。ファージディスプレイ（Kay, B.K.et
al.(1996)、前掲；Lowman, H. B. (1997)、前掲やRodi, D. J. and Makowski, L. (1999)、前掲に報告されている）、コロニースクリーニング（Pini, A. et al. (2002) Comb.
Chem. High Throughput Screen. 5, 503-510に報告されている）、リボソームディスプレイ（Amstutz, P. et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12,
400-405に報告されている）、ウィルソン、Ｄ．Ｓ．ら（Wilson,
D. S. et al.）のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８、３７５０−３７５５（２００１）に報告されたｍＲＮＡディスプレイ、または、ＷＯ９９／１６８７３号、ＷＯ００／７５３０８号、ＷＯ０３／０２９４７１号、ＷＯ０３／０２９４６２号、ＷＯ０３／０２９４６３号、ＷＯ２００５／０１９２５４号、ＷＯ２００５／０１９２５５号、ＷＯ２００５／０１９２５６号やＷＯ２００６／５６４６４号に特に記載された方法等のよく知られた技術がこれらクローンの選択のために使用されてもよい。

この開示によれば、上述した方法の他の実施形態は、以下のステップを含む：
（ｉ）少なくともＧＰＣ３のフラグメントを例えば所与のターゲット／リガンドとして供給し、
前記リガンドおよび突然変異タンパク質間の前記ターゲット／リガンドに対する結合親和性を有する複合体の形成を許容するために、複数の突然変異タンパク質を前記ターゲット／リガンドと接触させ、および
結合親和性を有していない、または、結合親和性を実質的に有していない突然変異タンパク質を除去する。

本発明の方法の一実施形態では、結合親和性の選択は競合的条件下で行われる。ここで用いられる競合的条件は、突然変異タンパク質の選択が、ターゲット（ＧＰＣ３）に対する突然変異タンパク質の結合と競合する追加のリガンドの存在下で突然変異タンパク質およびＧＰＣ３のフラグメントを接触させる少なくとも１つのステップを包含することを意味する。代わりに、追加のリガンドは、アロステリック効果によりターゲットに対する突然変異タンパク質の結合サイトと異なるエピトープを複合化することにより、突然変異タンパク質の結合と競合する。従って、ＧＰＣ３のいずれかのフラグメント、前駆体または成熟形態は、本発明の突然変異タンパク質の生成に用いられてもよい。

本発明の方法の他の実施形態は、所与のリガンドの結合用の少なくとも１つの突然変異タンパク質を選択するために、本発明の複数の突然変異タンパク質をコードし３’端での突然変異生成から得られる核酸を、Ｍ１３ファミリの糸状バクテリオファージのコートプロテインｐＩＩＩまたはこのコートプロテインのフラグメントをコードする遺伝子と作動可能に融合させることを含む。

融合タンパク質は、その融合タンパク質またはその一部の固定化、検出および／または精製を許容するアフィニティタグ等の追加の成分を含んでいてもよい。さらに、停止コドンは、リポカリンまたはその突然変異タンパク質をコードする配列領域およびファージキャプシド遺伝子またはそのフラグメントの間に位置付けられるものであり、停止コドン、好ましくはアンバー停止コドンは、適切なサプレッサ種での翻訳の間に、少なくとも部分的にアミノ酸に翻訳される。

例えば、ここに記載され、またｐＴｌｃ２７とも称されるファズミドベクタ（phasmid vector）ｐＴＬＰＣ２７は、本発明の突然変異タンパク質をコードするファージミドライブラリの調製用に使用されてもよい。本発明の突然変異タンパク質をコードする本発明である核酸分子は、２つのＢｓｔＸＩ制限サイトを使用するベクタに挿入されてもよい。ライゲーションの後、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ等の適切なホスト株は、多くの独立したクローンを得るために得られた核酸混合物で形質転換される。それぞれのベクタは、望まれるなら、ハイパーファージミドライブラリの調製のために生成されてもよい。

所与のターゲットに対する親和性を有する突然変異タンパク質が選択されれば、一層高い親和性の変異体や、より高い熱安定性、向上した血清安定性、熱力学安定性、向上した溶解性、向上した単量体挙動（monomeric behavior）、熱変性、化学変性、タンパク質加水分解や界面活性剤等に対する向上した抵抗性、等の向上した特性を有する変異体を続いて選択するために、その突然変異タンパク質に他の突然変異生成をさらに受けさせることも可能である。この更なる突然変異生成は、インビトロの「アフィニティ成熟」と考えられるより高い親和性を目指す場合は、合理的設計またはランダム突然変異に基づくサイト特異的突然変異により達成されてもよい。より高い親和性または向上した特性を得るための他の可能なアプローチは、リポカリン突然変異タンパク質の配列位置の選択された範囲で点突然変異生成（point
mutagenesis）の結果となるエラープローンＰＣＲの使用である。エラープローンＰＣＲは、一例としてザッコロら（Zaccolo et
al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603）により開示されたような、いずれかの公知の手法により行われ得る。そのような目的に適したランダム突然変異生成の他の方法は、ムラカミら（Murakami et
al. (2002) Nat. Biotechnol. 20, 76-81）により開示されたランダム挿入／欠失（ＲＩＤ）突然変異生成、ビッカーら（Bittker et
al. (2002) Nat. Biotechnol. 20, 1024-1029）により開示された非相同的ランダム組み換え（ＮＲＲ）を含む。望むのであれば、アフィニティ成熟は、ＷＯ００／７５３０８号やシュレフーバーら（Schlehuber et
al. (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120）の手法により行われてもよく、ジゴキシゲニンに対して高い親和性を有するビリン結合タンパク質の突然変異タンパク質が得られている。親和性を向上させるための他のアプローチは、位置飽和突然変異生成（positional saturation mutagenesis）を行うことである。このアプローチでは、アミノ酸交換／突然変異が４つのループセグメントのいずれかにおける単一の位置に導入されただけである「小（small）」核酸ライブラリが創作される。そして、これらのライブラリは、更なるラウンドのパニング（panning）を行うことなく直接選択ステップ（親和性スクリーニング）を受けさせる。このアプローチは、所望のターゲットの向上した結合に貢献する残基の同定を許容し、結合に重要である「ホットスポット（hot
spots）」の同定を許容する。

一実施形態では、突然変異タンパク質を改変するための上述した方法は、ヒトリポカリン２の野生型配列の配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６または１５８に対応するいずれかの配列位置の少なくとも１つでＣｙｓを導入し、ｈＮＧＡＬの野生型配列の配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６または１５８に対応するいずれかの配列位置の少なくとも１つで導入されたＣｙｓ残基のチオール基を介してその突然変異タンパク質の血清半減期を改変することができるモイエティを結合することをさらに含む。その突然変異タンパク質の血清半減期を改変することができるモイエティは、ポリアルキレングリコール分子およびヒドロキシエチルでんぷんで構成するグループから選択されてもよい。

本発明のタンパク質が本発明のヒトリポカリン２突然変異タンパク質である場合、Ｃｙｓ７６およびＣｙｓ１７５間の自然に生じるジスルフィド結合は、除去されていてもよい。従って、そのような突然変異タンパク質（または、分子内ジスルフィド結合を含んでいないいずれか他のヒトリポカリン２突然変異タンパク質）は、減少した酸化還元環境（redox milieu）を有する細胞分画、例えば、グラム陰性細菌の細胞質で生成され得る。

本発明のリポカリン突然変異タンパク質が分子内ジスルフィド結合を含む場合は、新生（nascent）ポリペプチドを、適切なシグナル配列を用いて酸化還元環境を酸化する細胞分画に向けることが好適である。そのような酸化する環境は、大腸菌等のグラム陰性細菌の周辺質により、グラム陽性細菌の細胞内環境や真核細胞の内質網状組織の内腔（lumen）で提供され、通常、構造的ジスルフィド結合の形成を支持する。

しかしながら、ホスト細胞、好ましくは大腸菌のサイトソル（cytosol）で本発明の突然変異タンパク質を生成することも可能である。この場合、ポリペプチドは、可溶性で折りたたまれた状態で直接得られるか、封入体（inclusion
bodies）の形態で回収されるかのいずれかであり、インビトロで復元される。更なる選択肢は細胞内環境を酸化することを有する特異的なホスト種の使用であり、それによりサイトソルにおけるジスルフィド結合の形成を許容する（Venturi et
al. (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-8）。

しかしながら、本発明の突然変異タンパク質は、遺伝学的工学技術によってのみ必然的に生成され産生されるものではない。むしろ、リポカリン突然変異タンパク質は、メリフィールド固相ポリペプチド合成等の化学合成やインビトロの転写および翻訳により得られてもよい。例えば、有望な突然変異が分子モデル化により分離されることも可能であり、望まれる（設計される）ポリペプチドをインビトロで合成し、所与のターゲットに対する結合活性を調査することも可能である。タンパク質の固相および／または液相合成のための方法は、本技術分野でよく知られている（例えば、Lloyd-Williams
et al. (1997) Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins.
CRC Press, Boca Raton, Fields, GB, and, Colowick (1997) Solid-Phase Peptide
Synthesis. Academic Press, San Diego, or Bruckdorfer et al. (2004) Curr. Pharm.
Biotechnol. 5, 29-43に報告されている）。

他の実施形態では、本発明の突然変異タンパク質は、当業者に知られた十分に確立された方法を用いて、インビトロの転写／翻訳により生成されてもよい。

また、本発明は、特許請求の範囲に関する本発明である突然変異タンパク質、融合タンパク質またはそれらの結合体の少なくとも１つおよび選択的に薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物に関する。

本発明によるリポカリン突然変異タンパク質は、タンパク質性医薬について治療上効果的な非経口的または非−非経口的（non-parenteral）（例えば、経腸的）ルートのいずれかを介して投与され得る。非経口的適用法は、例えば、注射液、点滴液やチンキ剤の形態での皮内、皮下、筋肉内や静脈内の注射や点滴技術、同様に、例えば、エアロゾル混合物、スプレー剤や粉末剤の形態でのエアロゾルの導入（installation）や吸入（inhalation）、を含む。非−非経口的デリバリモードは、例えば、丸薬（pills）、錠剤（tablets）、カプセル剤、溶液や懸濁液の形態での経口的、座薬の形態での直腸的なものである。本発明の突然変異タンパク質は、従来の無毒性で薬学的に受容可能な賦形剤やキャリア、添加物および媒体（vehicles）を含む望みどおりの形態で、全身的または局所的に投与されてもよい。

本発明の一実施形態では、薬剤は、哺乳動物を含む脊椎動物、特に、ヒトに非経口的に投与される。対応する投与法は、制限されるものではないが、例えば、注射液、点滴液やチンキ剤の形態での皮内、皮下、筋肉内または静脈内への注射や点滴技術、同様に、例えば、エアロゾル混合物、スプレー剤や粉末剤の形態でのエアロゾルの導入や吸入を含む。静脈内および皮下の点滴および／または注射の組合せは、比較的に短い血清半減期を有する化合物の場合に、最も好都合である。薬学的組成物は、水溶液、水中油滴型（オイルインウォーター）エマルジョンまたは油中水滴型（ウォーターインオイル）エマルジョンとしてもよい。

この点に関し、メイダンおよびミクニアクに開示されたように（Meidan and
Michniak (2004) Am. J. Ther. 11(4), 312-316）、イオン導入法（iontophoresis）、超音波導入法（sonophoresis）やマイクロニードル増強デリバリ（microneedle-enhanced
delivery）等の経皮的デリバリ技術は、ここに記載された突然変異タンパク質の経皮的デリバリのために使用されてもよい。非−非経口的デリバリモードは、例えば、丸薬、錠剤、カプセル剤、溶液または懸濁液の形態での経口的、または、例えば、座薬の形態での直腸的投与である。本発明の突然変異タンパク質は、種々の従来の無毒性で薬学的に受容可能な賦形剤やキャリア、添加物および媒体を含む剤型で全身的または局所的に投与されてもよい。

適用された突然変異タンパク質の投与量は、所望の予防効果や治療上の応答を達成するために広範囲で適度に変えてもよい。例えば、それは、選択されたリガンドに対する化合物の親和性に依存し、同様に、インビボにおける突然変異タンパク質およびリガンド間の複合体の半減期に依存する。また、最適な投与量は、突然変異タンパク質、その融合タンパク質やその結合体の体内分布、投与モード、治療されるべき疾患／障害の重症度、同様に、患者の医療上の状態に依存する。例えば、局所的な適用について軟膏剤を用いるときは、高濃度の本発明のタンパク質を用いてもよい。しかしながら、望むのであれば、そのタンパク質が、徐放性の形態、例えば、リポソームの分散液、または、ＰｏｌｙＡｃｔｉｖｅ^ＴＭやＯｃｔｏＤＥＸ^ＴＭのようなハイドロゲルをベースとする高分子マイクロスフェア（Bos et al., Business
Briefing: Pharmatech 2003: 1-6）で投与されるようにしてもよい。

従って、本発明の突然変異タンパク質は、薬学的に受容可能な成分、同様に、確立された調製方法を用いて、組成物に組み合わされてもよい（Gennaro and Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of
Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA）。薬学的組成物を調製するために、薬学的に不活性な無機または有機の賦形剤を用いてもよい。例えば、丸薬、粉末剤、ゼラチンカプセル剤や座薬を調製するために、例えば、ラクトース、タルク、ステアリン酸およびその塩、脂質、ワックス、固体または液体ポリオール、天然油および硬化油を用いてもよい。溶液、懸濁液、エマルジョン、エアロゾル混合物、または、使用前に溶液やエアロゾル混合物への再構成用粉末の調製のための適切な賦形剤は、水、アルコール、グリセロール、ポリオールおよびこれらの適切な混合物、同様に、植物油脂を含む。

薬学的組成物は、例えば、充填剤、結合剤、湿潤剤、グリダント（glidants）、安定化剤、防腐剤、乳化剤、および、さらなる溶媒や可溶化剤、デポット（depot）効果を達成するための薬剤等の添加剤を含むようにしてもよい。後者は、融合タンパク質が緩効性や徐放性、リポソームやマイクロカプセル等のターゲットデリバリシステムに組み込まれてもよい。

剤型は、細菌保持性フィルタを通じた濾過を含む多くの手法、または、使用直前に滅菌水や他の滅菌媒体に溶解ないし分散される滅菌した固体組成物の形態に滅菌剤を組み込むことにより滅菌され得る。

本発明の突然変異タンパク質、それらの融合タンパク質や結合体は、多くの応用に使用されてもよい。一般に、そのような突然変異タンパク質は、Ｆｃ部位のグリコシル化に特異的に依存するものを除く抗体が用いられるすべての応用に使用されてもよい。

ここに記載されたリポカリン突然変異タンパク質は、ヒトの患者自体を含む生物に投与されてもよく、薬学的に活性な成分、適切なキャリアや賦形剤を含むかこれらと混合される薬学的組成物で投与されてもよい。それぞれのリポカリン突然変異タンパク質組成物の剤型および投与のための技術は、本技術分野においてよく確立された低分子量化合物のものと類似しているか、同一のものである。典型的なルートは、制限されるものではないが、経口、経皮および非経口デリバリを含む。リポカリン突然変異タンパク質やそれぞれの組成物は、カプセルやチューブを満たして用いられてもよく、顆粒剤（pellet）のような圧縮された形態で供給されてもよい。また、リポカリン突然変異タンパク質やそれぞれの組成物は、注入可能またはスプレー可能な形態、例えば、それぞれのリポカリン突然変異タンパク質の懸濁液として用いられてもよい。

本発明のリポカリン突然変異タンパク質を含む組成物は、例えば、皮膚上や創傷上に適用するようにしてもよい。また、投与の適切なルートは、例えば、デポット、経口、直腸、経粘膜、腸の投与を含んでもよく；筋肉内、皮下、静脈内、骨髄内の注射を含む非経口デリバリ、同様に、硬膜内、直接的な脳室内、腹腔内、鼻腔内や眼内の注入を含んでもよい。いくつかの実施形態では、リポカリン突然変異タンパク質やそれぞれの組成物を、例えば、注射を介する全身的な方法よりは局所的に投与してもよい。

本発明のリポカリン突然変異タンパク質を含む薬学的組成物は、それ自体が公知の方法、例えば、従来の混合する、溶解する、顆粒化する、糖剤化する、糊状化する、乳化する、カプセル化する、エントラップする、凍結乾燥するプロセスの手段により、製造されてもよい。このため、本発明による使用のための薬学的組成物は、薬学的に用いられ得る調製物におけるハイドロゲルおよび／またはペプチド／ペプトイドの処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む１またはそれ以上の生理学的に受容可能なキャリアを使用する従来の方法で剤型化されてもよい。適切な剤型は選択された投与のルートに依存する。

注射用として、リポカリン突然変異タンパク質またはそれぞれの組成物は、水溶液、例えば、ハンクス液、リンゲル液や生理的食塩水等の生理学的適合性のバッファで剤型化されてもよい。経粘膜投与用として、浸透すべきバリアに適する浸透剤が剤型に用いられる。そのような浸透剤は、本技術分野で一般に知られている。

経口投与用として、リポカリン突然変異タンパク質またはそれぞれの組成物は、本技術分野においてよく知られた薬学的に受容可能なキャリアとそれらを組み合わせることにより容易に剤型化され得る。そのようなキャリアは、リポカリン突然変異タンパク質またはそれぞれの組成物、同様に、存在すれば薬学的に活性な化合物を、治療されるべき患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、リキッド剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリ剤、懸濁液等として剤型化することができるようにする。経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤を添加し、選択的に得られた混合物を粉砕し、錠剤や糖剤の核を得るために、望むのであれば、適切な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工することにより得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールやソルビトールを含む糖等の充填剤；例えば、トウモロコシでんぷん、小麦でんぷん、ライスでんぷん、ポテトでんぷん、ゼラチン、トラガカントゴム（tragacanth）、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、および／または、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等のセルロース調製物である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、または、アルギン酸やアルギン酸ナトリウム塩のようなアルギン酸塩等の崩壊剤が添加されてもよい。

糖剤の核は適切なコーティングで供給される。この目的のために、濃縮された糖溶液が用いられるようにしてもよく、選択的に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、および／または、二酸化チタン、ラッカー溶液、および、適切な有機溶媒や溶媒混合物を含むようにしてもよい。染料や顔料は、活性化合物投与量の異なる組合せの同定用または特徴付けるために、錠剤や糖剤コーティングに添加されるようにしてもよい。

経口的に用いられうる薬学的調製物は、ゼラチン製のプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、同様に、ゼラチン製のソフトで密閉されたカプセルおよびグリセロールやソルビトール等の可塑剤を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース等の充填剤、でんぷん等の結合剤、および／または、タルクやステアリン酸マグネシウム塩等の潤滑剤および選択的に安定化剤との混合物に活性成分を含むことができる。ソフトカプセルには、ペプチド／ペプトイドが、脂肪油、流動パラフィンや液体ポリエチレングリコール等の適切な液体に分散されていてもよい。さらに、安定化剤が添加されてもよい。経口投与用の全ての剤型は、その投与に適する投与量とすべきである。バッカル錠（buccal）の投与では、組成物が従来の方法で形成された錠剤やロゼンジ（lozenges）（トローチ剤）の形態をとるようにしてもよい。

本発明のリポカリン突然変異タンパク質は、注射、例えば、筋肉内注射、ボーラス（bolus）注入（急速投与）または連続注入による非経口投与用として形成されるようにしてもよい。注入用の剤型は、単位投与量の形態、例えば、アンプル、または、防腐剤が添加されたマルチ投与量コンテナで存在していてもよい。それぞれの組成物は、懸濁液、溶液または油性や水性媒体でのエマルジョンの形態をとることもでき、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤等の製剤化剤を含むこともできる。

本発明のリポカリン突然変異タンパク質は、予め選択されたサイトに対する化合物をターゲットとするために使用されてもよい。そのような一実施形態では、本発明のリポカリン突然変異タンパク質は、生体や組織において予め選択されたサイトに対する薬学的に活性な化合物のターゲッティングのために使用され、ステップを含む：
ａ）リポカリン突然変異タンパク質をその化合物と結合させ、そして、
ｂ）リポカリン突然変異タンパク質／化合物複合体を予め選択されたサイトにデリバリする。

そのような目的のために、突然変異タンパク質は、複合体形成を許容するために対象の化合物と接触させられる。そして、突然変異タンパク質および対象の化合物を含む複合体は、あらかじめ選択されたサイトにデリバリされる。このことは、例えば、突然変異タンパク質を、選択されたターゲットに対して結合親和性を有する抗体、抗体フラグメントまたはリポカリン突然変異タンパク質やリポカリン突然変異タンパク質フラグメント等のターゲットとするモイエティと結合させる（coupling）ことにより達成される。

この使用は、制限されるものではないが、とりわけ、その薬品で治療されるべきことが要求されている感染した生体部分、組織または器官等の生体において予め選択されたサイトに薬品を（選択的に）デリバリするために好適である。突然変異タンパク質および対象のある化合物間の複合体形成の他に、突然変異タンパク質は、突然変異タンパク質および化合物の結合体を得るために所与の化合物と反応されるようにしてもよい。上述した複合体と同様に、そのような結合体は、予め選択されたターゲットサイトに化合物をデリバリするために好適である。そのような突然変異タンパク質および化合物の結合体は、突然変異タンパク質および化合物を互いに共有結合させるリンカーを含むようにしてもよい。選択的に、そのようなリンカーは、血流中で安定であるものの、細胞環境において切り離されるものである。

このように、ここに開示された突然変異タンパク質およびその誘導体は、それらの抗体やフラグメントと同様に、多くの分野で使用され得るものである。所与の突然変異タンパク質のターゲット、または、固定されるべき若しくは分離されるべきこのターゲットの結合体や融合タンパク質を許容する支持体に結合するためのこれらの使用に加えて、突然変異タンパク質は、酵素、抗体、放射性物質、または、生化学的活性や定義された結合特性を有する他のいずれかのグループでラベルするために使用されてもよい。そうすることにより、それらのそれぞれのターゲットまたはそれらの結合体や融合タンパク質は、検出されうるものであり、それらとの接触を導入されうるものである。例えば、本発明の突然変異タンパク質は、確立された分析法（例えば、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロット）により、または、顕微鏡検査法や免役検出法（immunosensorics）により化学構造を検出することに役立つ。ここで、検出シグナルは、適切な突然変異タンパク質結合体や融合タンパク質の使用により直接的に生成されるか、または、抗体を介して結合した突然変異タンパク質の免疫化学的検出により間接的に生成されるか、のいずれかである。

本発明である突然変異タンパク質についての多くの可能な応用は、医学に存在している。診断およびドラッグデリバリにおけるそれらの使用に加えて、例えば、組織特異的または腫瘍特異的な細胞表面分子を結合する本発明の突然変異ポリペプチドが生成される。そのような突然変異タンパク質は、例えば、結合された形態で、または、「腫瘍イメージング（tumor imaging）」用若しくは直接的な癌治療用の融合タンパク質として使用されてもよい。

他の態様では、本発明は、薬学的組成物の製造のために、本発明による突然変異タンパク質の使用も包含する。これにより得られた薬学的組成物は、貧血症（an anaemia）の治療に適している。薬学的組成物は、単独治療または複合治療として使用されてもよい。従って、本発明は、ＧＰＣ３の変化したレベル、例えば、増加したレベルまたは低減したレベルに関連する貧血症等の疾患や障害の治療のための、上述したように定義された突然変異タンパク質にも関する。

また他の態様では、本発明は、本発明による突然変異タンパク質の診断における使用に関する。本発明による突然変異タンパク質の使用は、一般的に、ＧＰＣ３の変化したレベルに関連する疾患や障害の診断、同様にそれぞれの診断法のためのものである。

従って、本発明は、ＧＰＣ３の変化したレベル、例えば、増加したレベルまたは低減したレベルに関連する疾患や障害の診断のための、上述したように定義された突然変異タンパク質にも関する。いくつかの実施形態では、疾患は、制限されるものではないが、肝臓癌やメラノーマを含む癌である。診断されるべき癌は、特に制限されるものではなく、特異的な例として、肝臓癌、膵臓癌、胆管癌、肺癌、腸癌、悪性結腸癌、神経線維肉腫、神経芽細胞腫、乳癌、胸部眼、卵巣癌、前立腺癌、白血病やリンパ腫、ウィルムス腫瘍を含んでもよく、好ましくは、肝臓癌または（原発性／初期）肝細胞癌である（Sinnett D. GPC3 (glypican3). Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. May 2002参照）。

また、本発明は、腫瘍や癌を治療するための方法に関し、その方法が、ここに記載され、本発明の突然変異タンパク質を含む薬学的組成物をそれらを必要とする対象に投与することを含む。同様に、本発明は、腫瘍や癌を治療することに使用するための本発明の突然変異タンパク質に関する。同様に、本発明は、腫瘍や癌を治療するための薬学的組成物の調製における本発明の突然変異タンパク質の使用に関与する。治療されるべき腫瘍や癌は、特に制限されるものではなく、特異的な例として、肝臓癌、膵臓癌、胆管癌、肺癌、腸癌、悪性結腸癌、神経線維肉腫、神経芽細胞腫、乳癌、胸部眼、卵巣癌、前立腺癌、白血病やリンパ腫、ウィルムス腫瘍を含んでもよく、好ましくは、肝臓癌または（原発性／初期）肝細胞癌である（Sinnett D.
GPC3 (glypican3). Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. May 2002参照）。

さらに他の態様では、本発明は、本発明による突然変異タンパク質を含む診断用キットまたは分析用キットを特徴とする。

そのような治療を必要とする対象は、ほんのわずかな例を挙げるとすれば、ヒト、イヌ、マウス、ラット、ブタ、カニクイザル等の類人猿である。

また他の態様では、本発明は、対象におけるインビボイメージングのための方法を特徴とし、本発明の突然変異タンパク質または本発明の突然変異タンパク質を含む薬学的組成物をその対象に投与することを含む。対象は、上述したように定義されたものである。

ここで用いられる、単数型「１つ（a）」、「１つ（an）」および「その（the）」は、前後関係が明確に他の状態であることを示していない限り、複数の参照を含むことに注意すべきである。このため、例えば、「１つの薬品（a
reagent）」については、１つまたはそれ以上の異なる薬品を含んでおり、「その方法（the method）」については、当業者に知られ、ここに記載された方法のために改変され、置換され得る同等のステップや方法に対する参照を含んでいる。
この開示に示された全ての刊行物および特許は、その全体における参照により取り込まれる。参照により取り込まれた物質が本明細書と矛盾するか、または、一致しない限りは、本明細書はそのようないずれの物質に変えてもよい。

他に示されていない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その一連の要素の全てを参照することを理解されるべきである。当業者は、慣例の実験法を越えるものを使用せず、ここに記載された本発明の特徴的な実施形態に対する多くの相当物を承認し、または、確認することができる。そのような相当物は、本発明に包含されるものであることが意図されるものである。

本明細書およびそれに続く請求の範囲を通じて、前後関係が他のことを要求しない限り、用語「含む（comprise）」および「含む（comprises）」や「含む（comprising）」等の変形は、示された整数（integer）やステップ、整数やステップのグループの包含を意味するものであり、他の整数やステップ、整数やステップのグループの排除を意味しないことが理解されるべきである。ここで用語「含む（comprising）」が用いられるときは、用語「包含する（containing）」に置換されてもよく、しばしば、ここで用いられる用語「有する（having）」に置換されてもよい。

ここで用語「構成する（cosisting of）」が用いられるときは、請求の範囲の要素に特定されていない要素、ステップまたは成分はいずれも排除される。ここで用いられるときは、「基本的に構成する（consisting
essentially of）」が、請求の範囲の基本的および新奇な特性に物質的に影響を及ぼさない物質やステップを排除するものではない。
ここでのそれぞれの事例では、用語「含む（comprising）」、「基本的に構成する（consisting
essentially of）」および「構成する（cosisting of）」は、いずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えてもよい。

本明細書のテキストを通じていくつかの文献が示されている。ここで示されたそれぞれの文献（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の規格、指図、等を含む。）は、前でも後でも、これによって、その全体における参照により取り込まれる。本発明が従来の発明によるそのような開示により既になされていたものと解釈することは妥当でない。

本発明は、以下の非制限的な実施例および添付した図面によりさらに例証される。しかしながら、これらの実施例は、本発明を制限するものとして解釈されるべきものではない。むしろ、単に代表的な実施形態にすぎないものである。

他の観点が示されていない限り、組み換え遺伝子技術の確立された方法は、例えば、サムブルックら（Sambrook
et al. (2001)、前掲）に開示されたものとして用いたものである。

実施例１：突然変異体Ｌｃｎ２ファージディスプレイライブラリの構造
単一の対になっていないチオール側鎖を除去するためのアミノ酸置換Ｃｙｓ８７Ｓｅｒ（Goetz et al. (2000)
Biochemistry 39, 1935-1941）、同様に、セカンドＢｓｔＸＩ制限サイトを導入するためのアミノ酸置換Ｇｌｎ２８Ｈｉｓを含むクローン化されたｃＤＮＡ（Breustedt et
al. (2006) Biochim. Biophys. Acta 1764, 161-173）に基づいて、Ｌｃｎ２変異体の組合せのライブラリを生成した。基本的に、報告されたストラテジィ（Beste et al. (1999)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96. 1898-1903; Skerra (2001) J. Biotechnol. 74, 257-275）により、この領域の突然変異生成およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アセンブリを行い、このとき、図１に示すように、オリゴデオキシヌクレオチド（配列番号：１６から配列番号：２５までの配列）での１ポット増幅反応を用いた。配列番号：１６から配列番号：１９までの配列を有するプライマがコードするストランドに対応し、アミノ酸位置３６、４０、４１、４９、５２または６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１または９６、１００、１０３、１０６または１２５、１２７、１３２、１３４のそれぞれでの縮重コドンを含むとともに、配列番号：２０から配列番号：２３までの配列を有するプライマがコードしないストランドに対応し、縮重コドンやアンチコドンを含まないように、オリゴデオキシヌクレオチドを設計した。配列番号：２４および配列番号：２５を有する２つのフランキングプライマを過剰に用い、アセンブルされランダム化された遺伝子フラグメントの増幅のために供給した。既に報告されたように（Schlehuber et
al. (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120）、Ｇｏ−Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega, Mannheim,
Germany）を用いて、すべてのＰＣＲステップを行った。

縮重コドンを含まないオリゴデオキシヌクレオチドをメタビオン社（Metabion,
Munich, Germany）からＨＰＬＣグレードのものを入手した。ＮＮＫ含有オリゴデオキシヌクレオチドを、同社から入手し、脱塩し、さらに、尿素ＰＡＧＥにより精製した。得られたＤＮＡライブラリをＢｓｔＸＩ（Promega, Mannheim,
Germany）で切断し、属性発現ベクタｐＡＳＫ１１１（Vogt and
Skerra (2001) J. Mol. Recognit. 14(1), 79-86）に基づくとともに、ＯｍｐＡシグナルペプチド、改変された成熟Ｌｃｎ２、続いてアンバーコドンおよび糸状バクテリオファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩコートタンパク質のＣ−末端フラグメントで構成される、つまり、ビリン結合タンパク質について以前開示されたもの（Beste et al.、前掲；Skerra、前掲）と同様の融合タンパク質をコードするファージミドベクタｐｈＮＧＡＬ１０２（配列番号：１０）でクローン化した。分解されたＰＣＲ生成物の８．４μｇおよび分解されたプラスミドＤＮＡの９４μｇのライゲーション混合物での大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅのエレクトロポレーションの後（Bullock et
al. (1987) Biotechniques 5, 376-378）、１×１０^１０の形質転換体を得た。

これに代えて、図２に示したクローン化された合成Ｌｃｎ２ランダムライブラリをスローニング バイオテクノロジィ社（Sloning
BioTechnology GmbH, Puchheim, Germany）から得た。２つのＢｓｔＸＩ制限サイトにより側面に位置される中央遺伝子カセットを、適切なプライマ（配列番号：１５および配列番号：２６）を用いて２０サイクルのＰＣＲを介して増幅し、属性発現ベクタｐＡＳＫ７５（Skerra (1994)
Gene 151, 131-135）に基づくとともに、ｐｈＮＧＡＬ１０２（配列番号：１０）と同じ特徴を基本的に含むものの、クロラムフェニコール抵抗性の代わりにアンピシリン抵抗性を媒介し、突然変異タンパク質およびファージｐＩＩＩプロテイン間のｓｔｒｅｐ−ｔａｇ Ｉを含み、同様に１．７×１０^１０の独立した形質転換体に対応する複雑性を有するライブラリをもたらすｐｈＮＧＡＬ１０８（配列番号：１１）でサブクローン化した。

ライブラリ生成において、以下のステップを、両方のＬｃｎ２ライブラリに対して同様に行った。ファージｐＩＩＩ融合タンパク質としてリポカリン突然変異タンパク質のライブラリをそれぞれコードするｐｈＮＧＡＬ１０２またはｐｈＮＧＡＬ１０８に基づきファズミドベクタで形質転換させた細胞を含む培養の１００ｍｌを、滅菌済エーレンマイヤフラスコに移し、抗生物質の選択圧を伴わない２ＹＴ培地中で、３７℃、１６０ｒｐｍで１時間インキュベートした。ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージでの感染前に、培養を、対応する抗生物質の添加された２ＹＴ培地でＯＤ５５０が０．１となるまで希釈し、さらに同じ条件下でＯＤ５５０が０．６に達するまで生長させた。約１０回の感染多重度でＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Agilent
Technologies, La Jolla, USA）での感染の後、培養をさらに３０分間、３７℃、１００ｒｐｍで振盪した。そして、インキュベータ温度を２６℃まで低下させ、振盪スピードを再び１６０ｒｐｍに上昇させ、１０分後、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を添加し、アンヒドロテトラサイクリン（ACROS
Organics, Geel, Belgium）の２５μｇ／ｌ（培養１リットルあたり、ジメチルホルムアミド、ＤＭＦ中２００μｇ／ｍｌのストック溶液の１２５μｌ）での添加を介して遺伝子発現を誘導した。インキュベーションを２６℃、１６０ｒｐｍでさらに１２−１５時間続けた。

全体の培養から細胞を遠心分離（３０分間、１８０００ｇ、４℃）により沈殿させた。ファージミド粒子を含む上清を滅菌濾過し（０．４５μｍ）、１／４容の２０％ｗ／ｖＰＥＧ８０００、１５％ｗ／ｖ塩化ナトリウムと混合し、氷上で少なくとも２時間インキュベートした。遠心分離（３０分間、１８０００ｇ、４℃）の後、培養の１リットルから沈殿したファージミド粒子を、５０ｍＭのベンズアミジン（Sigma）および１μｇ／ｍｌのＰｅｆａｂｌｏｃ（Roth, Karlsruhe, Germany）を含む冷却ＢＢＳ／Ｅ（２００ｍＭのホウ酸ナトリウム塩、１６０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）の３０ｍｌに溶解させた。溶液を氷上で１時間インキュベートした。未溶解成分を遠心分離（１０分間、４３０００ｇ、４℃）した後、それぞれの上清を新しい反応容器に移した。

ファージミド粒子を再沈殿させるために、１／４容の２０％ｗ／ｖＰＥＧ８０００、１５％ｗ／ｖ塩化ナトリウムの添加、氷上での６０分間のインキュベーションを行い、保存のためにファージミドを等分し、−８０℃で凍結させた。第１の選択サイクル用に、ファージミドを解凍し遠心分離（３０分間、３４０００ｇ、４℃）し、上清を除去し、沈殿したファージミド粒子を５０ｍＭのベンズアミジンを含む全体で４００μｌのＰＢＳに溶解させ組み合わせた。氷上で３０分間のインキュベーションの後、凝集残渣を除去するために溶液を遠心分離（５分間、１８５００ｇ、４℃）し、上清をファージディスプレイ選択に直接使用した。

実施例２：可溶性組み換えヒトグリピカン−３の獲得
ＮＳ０細胞で発現させた組み換えヒトグリピカン−３をＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから入手し、選択実験のために、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Pierce）を４倍モル過剰で用いることでリジン残基を介してランダムにビオチン化した。

実施例３：ファージミド発現およびヒトグリピカン−３（ＧＰＣ３）に対する親和性を有するＮＧＡＬ突然変異タンパク質の選択
国際特許出願ＷＯ／２００５／０１９２５６号に本質的に開示されたように、実施例１から得られたファージミドを用いて、ファージミドディスプレイおよび選択を行った。ライブラリには、組み換えビオチン化ヒトＧＰＣ３に対して４サイクルのファージディスプレイ選択を受けさせた。

実施例１で得られたライブラリの２×１０^１２から１×１０^１３のファージミドを用いた。要するに、ファージミドを遠心分離（２１４６０×ｇ、４℃、２０分間）し、５０ｍＭのベンズアミジンを含む１ｍｌのＰＢＳ（４ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、１６ｍＭのＮａ_２ＢＰＯ_４、１１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁させた。１％ｗ／ｖカゼイン（Sigma）および０．１％ツイン（Tween）２０（登録商標）を含むＰＢＳをブロッキングバッファとして用いた。ターゲットタンパク質とのインキュベーションの前に、ニュートラビジンに対して特異的な多重反応性若しくはミスフォールドされたリポカリン突然変異タンパク質、または、ストレプトアビジンビーズ特異的な突然変異タンパク質を発現するファージミドの減少のために、カゼインブロックしたニュートラビジンをコートしたマイクロタイタープレート上で、または、カゼインブロックしたストレプトアビジンビーズおよびニュートラビジンとともに、６０分間、ライブラリからのファージミドをインキュベートした。

異なるパニングアプローチ（Panning approaches）では、ニュートラビジンコートしたマイクロタイタープレート、１％カゼインブロックしたマイクロタイタープレートのいずれかでターゲットの１μｇ／ｍｌ溶液を獲得し（固相アプローチ）、または、１％カゼインでブロックされたＮＧＡＬライブラリからの１×１０^１３ファージミドを有する溶液中でビオチン化ＧＰＣ３の２００ｎＭ溶液をインキュベートした（溶液アプローチ）。溶液アプローチでは、ストレプトアビジン^ＴＭコートした磁気ビーズ（Invitrogen/Dynal）またはニュートラビジンコートした磁気ビーズ（Distrilab）を介し、続いて、８サイクルの洗浄、および、３００μＬの７０ｍＭトリエチルアミンで１０分間、１ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４の適切量での中性化（塩基性溶出）、続いて０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２で１０分間、０．５ＭＴｒｉｓ−Ｂａｓｅの適切量での中性化（酸性溶出）での溶出の２０分内の交互法、または、細菌性溶出でファージミド結合されたターゲットを獲得した。

固相アプローチでは、ブロックされたファージミドをビオチン化ターゲットとインキュベートし、続いて８サイクルの洗浄および上述した溶出を行った。第２濃縮サイクルでの始まりでは、結合したファージミド溶液の半分のみをファージミド増幅に用いた。

それぞれのパニングサイクルの間のファージミド増幅では、シュレフーバーらに開示された方法で行った（Schlehuber, S.
et al., J. Mol. Biol. (2000), 297, 1105-1120）。

グリピカン−３に対するさらに３回の選択ラウンドを、この方法で、第２濃縮サイクルでの始まりで約１×１０^１１ファージミドを用いたものを除いて、それぞれの前の濃縮サイクルからの増幅されたファージミドの調製物を用いて行った。

実施例４：ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーニングを用いたｈＧＰＣ−３特異的突然変異タンパク質の同定
実施例３に従い選択された突然変異タンパク質のスクリーニングを、国際特許出願ＷＯ２００６／５６４６４号の実施例３に本質的に記載されたように行った。

上述したパニングプロセスのラウンド３および４からのリポカリン突然変異タンパク質をＨＴスクリーニングＥＬＩＳＡで選択した。ここでは、大腸菌ＴＧ１／Ｆ−株をｐｈＮＧＡＬ１０１と共に用いた９６ウェルのマイクロタイタープレートで、Ｔ７検出タグ（Novagen）同様にＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩアフィニティタグ（IBA）を付けたＮＧＡＬ変異体を可溶化させた。このベクタは、１１アミノ酸（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）（配列番号：１２、図４Ｂも参照）で構成するＮ−末端Ｔ７タグを有するｐｈＮＧＡＬ９８（配列番号：９）に対応する。ＯＤ５５０が０．６でのアンヒドロテトラサイクリン（０．２μｇ／ｍｌ）とともに、２２℃、７００ｒｐｍで、一晩かけて、リポカリン突然変異タンパク質発現を誘導した。その後、振動下で１時間で細胞を溶解させた（１００ｍＭのホウ酸ナトリウム塩、ｐＨ８．０、８０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％ｗ／ｖリゾチーム）。続くＥＬＩＳＡスクリーンでの非特異的結合を最少化するために、クルードな細胞溶解物に２％ｗ／ｖＢＳＡおよび０．１％ｖ／ｖツイン２０を加え、ヒトグリピカン−３に対する結合をＥＬＩＳＡでテストした。これにより、ｂｌａｃｋ Ｆｌｕｏｔｒａｃ ６００ ＥＬＩＳＡプレート（Greiner、３８４ウェル）のウェルに固定化されたニュートラビジン（５μｇ／ｍｌ、Thermo Scientific）を介して１μｇ／ｍｌでのビオチン化ヒトＧＰＣ−３を獲得した。ニュートラビジン、ストレプトアビジンのそれぞれ５μｇ／ｍｌおよび３％ミルクをネガティブコントロールとして用いた。プレートを２％ｗ／ｖＢＳＡを含むＰＢＳＴ／０．１でブロックし、続いて、細菌性細胞抽出物とともに室温で１時間インキュベートし、プレートを５回洗浄し、結合したリポカリン突然変異タンパク質を、ＰＢＳＴ／０．１で１：１００００希釈した抗Ｔ７モノクローナル抗体−ＨＲＰ結合体を介して検出した。このため、ＱｕａｎｔａＢｌｕ^ＴＭ（Pierce；ＰＢＳ／Ｔ０．１％で１：２希釈）を蛍光発生ＨＲＰ基質として用いた。室温でシグナル発生の４５分後、ＧＥＮｉｏｓＰｌｕｓ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Tecan）で、波長３２０ｎｍ（±１２．５ｎｍ）で励起し、４３０ｎｍ（±１７．５ｎｍ）で蛍光測定した。

リバースＥＬＩＳＡアプローチでは、突然変異タンパク質をその親和性で区別するためにターゲットを限定する条件に達するまで、ビオチン化ヒトグリピカン−３の量を変えた（１０、５および１ｎＭ）インキュベーションにより、ラビットポリクローナルＮＧＡＬ特異的抗体を介してＥＬＩＳＡプレートで、クルードな細胞溶解物からの可溶化された突然変異タンパク質を獲得した。ニュートラビジン−ＨＲＰ結合体（Pierce）を介して、ターゲットの結合を検出した。非ビオチン化ヒトグリピカン−３の１００ｎＭの添加により結合する突然変異タンパク質と競合することができれば、その突然変異タンパク質は非改変ヒトグリピカン−３に同様に結合することを示す。ターゲット特異性を例証するために、１００ｎＭの非改変グリピカン−５（R&D
Systems）で競合することに対して、同一性アッセイアプローチを用いることもできる。

実施例３に記載されたように選択された１４４０クローンのスクリーニングは、ターゲット特異的突然変異タンパク質の十分な分離を示す７００以上の一時的ヒットの同定をもたらした。ターゲット制限条件下でのリバースＥＬＩＳＡアプローチおよび競合ＥＬＩＳＡは、それらのターゲット親和性や特異性の点から、ＧＰＣ３特異的突然変異タンパク質の区別を許容する。これらのＥＬＩＳＡアプローチを用いることで、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８を有するクローンを同定した。これらの突然変異タンパク質の配列を図３に示した。

実施例５：グリピカン３結合性突然変異タンパク質（ＮＧＡＬ）の生成
組み換えＬｃｎ２およびヒトグリピカン−３特異的Ｌｃｎ２変異体を、大腸菌Ｋ１２のＪＭ８３株（Yanisch-Perron
et al. (1985) Gene 33, 103-119）、大腸菌ｓｕｐＥのＴＧ１−Ｆ−株（アクリジニウムオレンジを用いてそのエピソームから保存処理された大腸菌Ｋ１２ ＴＧ１［Kim et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131, 3565-3576］の派生株）、または、大腸菌Ｗ３１１０（Bachmann (1990) Microbiol.
Rev. 54, 130-197）におけるペリプラズム分泌により生成した。

小スケールの可溶性タンパク質発現のために、ＯｍｐＡシグナルペプチドのそれぞれの突然変異タンパク質およびＣ−末端ストレプ−タグＩＩとの融合をコードし、それにより、プラスミドが突然変異した遺伝子カセットの一方向性のサブクローニングのための２つの非適合性ＢｓｔＸＩ制限サイトを運ぶプラスミドｐｈＮＧＡＬ９８（配列番号：９）を用いた。シュレフーバーら（Schlehuber, S.
et al., J. Mol. Biol. (2000), 297, 1105-1120）に開示されたプロトコルにより、ＬＢ−アンピシリン培地の存在下において２Ｌ振盪フラスコ培養で成長させた。より大量のタンパク質のために、シベックら（Schiweck, W.
and Skerra, A., Proteins (1995) 23, 561-565）に開示されたプロトコルに基づき、１つ（または１０）の培養器（vessel）でのベンチトップ発酵培養により大腸菌Ｗ３１１０株で発現させた同じベクタで、ペリプラズム生産を行った。

スケラら（Skerra, A. & Schmidt, T. G.
M. (2000) Use of the Strep-tag and streptavidin for detection and purification
of recombinant proteins. Methods Enzymol. 326A, 271-304）により開示された手法に従い、適切なベッドボリュームのカラムを用いたストレプトアビジンアフィニティクロマトグラフィ（Strep-Tactin^TM Superflow, IBA）によるシングルステップで、ペリプラズム分画からＬｃｎ２変異体を精製した。高純度を達成し、凝集した組み換えタンパク質を除去するために、ＰＢＳバッファの存在下において、スーパーデックス７５ＨＲ１０／３０カラム（Superdex 75 HR 10/30 column, 24-ml bed volume, Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Germany）で、最終的に突然変異タンパク質のゲル濾過を行った。単量体タンパク質分画をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Fling
and Gregerson (1986) Anal. Biochem. 155, 83-88）により純度を分析し、さらなる生化学的特徴付けに使用した。

実施例６：ＥＬＩＳＡ技術を用いたアフィニティ測定
選択されたＬｃｎ２突然変異タンパク質の結合親和性および特異性を確認するために、「直接」ＥＬＩＳＡを行った。これにより、ＢＳＡブロックしたニュートラビジン（Thermo
Scientific、５μｇ／ｍｌ）によるポリスチロールプレート（Greiner, GE）の表面で、１μｇ／ｍｌの一定濃度のビオチン化ヒトグリピカン３（R&D
Systems）を獲得した。精製したＬｃｎ２突然変異タンパク質の２段階希釈系を、獲得したＧＰＣ−３とともに室温で１時間インキュベートし、ラビット抗ストレプ−タグＩＩポリクローナル抗体を用いたＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩを介するか、または、スカフォールド特異的ポリクローナルラビット抗体を用いることのいずれかにより検出した。いずれの場合でも、抗ラビットＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を二次検出抗体として用いた。

３２０ｎｍでの吸光度ΔＡをＥＬＩＳＡリーダ（Tecan, GE）で測定し、グラフパッド プリズム ソフトウェア（Graphpad Prism software,
Statcom, USA）にデータを適合させた。

配列番号：１から配列番号：８までの配列の突然変異タンパク質を用いた測定からの結果、同様に、ネガティブコントロールとしての配列番号：９の結果を下表１にまとめた。

表１：突然変異タンパク質のターゲットであるヒトグリピカン−３に対する親和性定数

選択されたＬｃｎ２突然変異タンパク質のＫ_Ｄ値は２００ｐＭから７．６ｎＭまで変化しているのに、ネガティブコントロールは全く結合性を示さなかった。これらのデータを図４にグラフとして示す。

競合ＥＬＩＳＡアプローチで、溶液中での非改変グリピカン−３に対するＬｃｎ２突然変異タンパク質の結合親和性を評価した。これにより、ニュートラビジン（Thermo
Scientific、５μｇ／ｍｌ、GE）を介したポリスチロールプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ＧＥ）の表面で、１μｇ／ｍｌの一定濃度のビオチン化ヒトグリピカン−３（R&D Systems）を獲得した。同時に、１．５μＭから始まる非ビオチン化ヒトグリピカン−３の２段階希釈系を、タンパク質が結合していない９６ウェルのポリプロピレンプレート（Nunc,
GE）中で、一定濃度のＧＰＣ３特異的突然変異タンパク質とともに室温で１時間インキュベートした。リポカリン突然変異タンパク質の一定濃度は、本実施例で上述したように、直接ＥＬＩＳＡで決定されたそれぞれの突然変異タンパク質のＥＣ_５０に対応している。次に、非改変ヒトＧＰＣ３およびリポカリン突然変異タンパク質の混合物を、ＧＰＣ３を獲得したニュートラビジンプレート上に移した。ビオチン化ＧＰＣ３を、室温で１時間、アンチカリン結合用の非改変ＧＰＣ３と競合させた。この１時間の間に、フリーなリポカリン突然変異タンパク質を、獲得したＧＰＣ３に結合させ、ラビット抗ストレプ−タグＩＩポリクローナル抗体（GenScript,
USA）により検出した。ヤギ抗ラビットＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Abcam, UK）を、二次検出抗体として用いた。競合アッセイと同時に、ＲＦＵ値とアンチカリン濃度を関連させる標準曲線を得るために、「直接」ＥＬＩＳＡにおける同じプレートでアンチカリン結合性を決定した。そして、この曲線を、プレートに結合しグラフパッド ソフトウェア（Graphpad
software）に適合させたアンチカリンのレベルに対する競合データを正規化するために用いた。ＩＣ_５０値は、プレートに結合したリポカリン突然変異タンパク質の最大量の半分に対応する。

配列番号：１から配列番号：８までの配列の突然変異タンパク質を用いる測定からの結果を図５にまとめる。

選択されたＬｃｎ２突然変異タンパク質のＩＣ_５０値は、７０ｐＭから１ｎＭまで変化する。

実施例７：ＢｉａｃｏｒｅＴ１００装置での表面プラズモン共鳴によるグリピカン−３に対する結合親和性の測定
ここに開示されたリポカリン突然変異タンパク質の結合動力学および親和性を測定するために、表面プラズモン共鳴を用いた。

グリピカン−３に対するＬｃｎ２突然変異タンパク質の結合性のリアルタイム分析を、ランニングバッファとしてＨＢＳ−ＥＰ＋（BR-1006-69, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden）を用いるＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００システム（GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden）で行った。１０ｍＭ酢酸ナトリウム中のグリピカン−３の１０μｇ／ｍｌ溶液、ｐＨ４．５を、標準アミンの結合する化学的作用を用いてＣＭ５チップに固定し、４６７ＲＵのリガンド密度となった。精製したＬｃｎ２突然変異タンパク質を４０ｎＭおよび１２０ｎＭの濃度で３０μＬ／ｍｉｎの流速で供給した。希釈液を、ｋａおよびｋｄの情報を得るために、会合時間１２０秒、解離時間４２０秒で注入した。グアニジニウム−塩酸の６Ｍ（１２０秒／３００秒）か、塩化マグネシウムの３Ｍ（９００秒）のいずれかを流速１０μＬ／ｍｉｎで注入することにより、リガンドの再生を行った。再生溶液の注入に続いて、ランニングバッファでの特別な洗浄ステップおよび１８０秒間の安定化を行った。

エタノールアミンで活性化されブロックされたコントロールチャネルについて測定された対応するシグナルの減算により、および、結合する応答からのバッファ注入の削減によりデータを二重参照した。データ処理および動力学的適合のためのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ２．０．１を用いて、結合反応のｋａおよびｋｄを決定した。データを包括的に１：１結合モデルに適合させた。

配列番号：１から配列番号：８までの配列の突然変異タンパク質に対するｋａおよびｋｄの決定された数値を図６にまとめる。

実施例８：ＳＫ−Ｈｅｐ１感染体でのグリピカン３突然変異タンパク質の種−交差反応性
フローサイトメトリィにより評価されたときに検出可能なレベルの内因性ＧＰＣ３を発現しない、ＤＳＭＺセルバンクからのＳＫ−ＨＥＰ１を、ヒト、カニクイザルまたはマウスＧＰＣ３をコードする発現ベクタで安定的に感染させた。ベクタを欠くコントロールの細胞についても、同時に入手し分析した。マウス抗グリピカン３クローン１Ｇ１２モノクローナル抗体（DCS）を用いて、ＧＰＣ３の検出を行った。

細胞表面でのＧＰＣ３に対する突然変異タンパク質の結合性を評価するために、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中の２００，０００セルをそれぞれの結合反応に用いた。氷上で３０μｌにおいて２時間、反応を行った。続いてＰＢＳ／２％ＦＣＳでの２回の洗浄ステップを行い、二次ラビット抗ｈＮＧＡＬスカフォールド抗血清を３０分間用い、さらに２回の洗浄ステップを行った。抗ラビットＩｇＧ−ＰＥ（３０分間）で検出を行った。各サンプルについて１０，０００の結果を取得するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータで測定を行った。相乗平均値をＦｌｏｗＪｏ（Treestar
software）に集め、ＥＣ５０値を得るために、プリズム５プログラム（Prism5 program, GraphPad）でのシグモイダル投与量応答モデルに適合させた。

ヒト、カニクイザルおよびマウスＧＰＣ３を感染させたＳＫ−Ｈｅｐ１細胞に対する結合親和性を図７に示す。

Claims (15)

1. ｈＮＧＡＬの突然変異タンパク質において、前記突然変異タンパク質は、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列（配列番号：２７）の配列位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２および１３４に対応する配列位置のいずれかの９またはそれ以上のアミノ酸置換を含むことで特徴づけられるとともに、グリピカン−３（ＧＰＣ３）を、表面プラズモン共鳴により測定された親和性であって約１０ｎＭまたはそれ未満のＫ_Ｄによる親和性で結合することが可能であり、前記ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列に関し、Ｌｅｕ３６→Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、ＭｅｔまたはＳｅｒ；Ａｌａ４０→Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、ＧｌｙまたはＴｙｒ；Ｉｌｅ４１→Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＳｅｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＴｒｐ；Ｔｙｒ５２→Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＡｓｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＬｙｓ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＰｈｅ；Ａｒｇ７２→Ａｓｐ、Ｔｒｐ、ＡｌａまたはＳｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、ＬｅｕまたはＨｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＴｙｒ；Ｔｒｐ７９→Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、ＳｅｒまたはＩｌｅ；Ａｒｇ８１→Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＴｒｐ；Ａｓｎ９６→Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＧｌｙまたはＰｈｅ；Ｔｙｒ１００→Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、ＩｌｅまたはＡｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、ＡｓｐまたはＴｒｐ；Ｔｙｒ１０６→Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、ＰｈｅまたはＬｅｕ；Ｌｙｓ１２５→Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、ＧｌｙまたはＴｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＡｓｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＶａｌ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＩｌｅまたはＳｅｒ：で構成する群から選択された１またはそれ以上のアミノ酸置換を含むことを特徴とする突然変異タンパク質。
2. 前記突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、前記ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列に関し、
   （ａ）Ｌｅｕ３６→Ｉｌｅ；Ａｌａ４０→Ｔｒｐ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ａｒｇ；Ｓｅｒ６８→Ａｒｇ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ａｓｐ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｙ；Ｔｒｐ７９→Ｇｌｙ；Ａｒｇ８１→Ａｌａ；Ａｓｎ９６→Ｖａｌ；Ｔｙｒ１００→Ａｒｇ；Ｌｅｕ１０３→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１０６→Ａｓｐ；Ｌｙｓ１２５→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｌｙｓ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｙ；
   
   （ｂ）Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ；Ｉｌｅ４１→Ｍｅｔ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ａｒｇ；Ｓｅｒ６８→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ７０→Ｓｅｒ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ１０３→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１０６→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ａｌａ；
   
   （ｃ）Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ａｌａ４０→Ｖａｌ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ａｒｇ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｎ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ａｌａ；Ｌｙｓ７３→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｍｅｔ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｎ；Ｔｙｒ１００→Ｇｌｕ；Ｌｅｕ１０３→Ａｓｎ；Ｔｙｒ１０６→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｕ；Ｓｅｒ１２７→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ１３２→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ１３４→Ｐｈｅ；
   
   （ｄ）Ｌｅｕ３６→Ｍｅｔ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ｖａｌ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｎ；Ｔｒｐ７９→Ｇｌｙ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１００→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１０６→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１２５→Ａｒｇ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｐｈｅ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｐ；
   
   （ｅ）Ｌｅｕ３６→Ｓｅｒ；Ａｌａ４０→Ｈｉｓ；Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ６８→Ａｓｎ；Ｌｅｕ７０→Ｔｈｒ；Ｌｙｓ７３→Ｇｌｕ；Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ９６→Ｌｙｓ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ｍｅｔ；Ｔｙｒ１０６→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｈｉｓ；Ｔｙｒ１３２→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎ；
   
   （ｆ）Ｌｅｕ３６→Ｉｌｅ；Ａｌａ４０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ４１→Ｇｌｎ；Ｇｌｎ４９→Ｔｒｐ；Ｔｙｒ５２→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ；Ａｓｐ７７→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｔｙｒ；Ａｓｎ９６→Ｇｌｙ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０３→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１０６→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｙｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｉｌｅ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｉｌｅ；
   
   （ｇ）Ｌｅｕ３６→Ｍｅｔ；Ｉｌｅ４１→Ｓｅｒ；Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ；Ｔｙｒ５２→Ａｓｎ；Ｓｅｒ６８→Ｌｙｓ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｒｇ７２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ；Ａｓｐ７７→Ｔｙｒ；Ｔｒｐ７９→Ｓｅｒ；Ａｒｇ８１→Ｔｈｒ；Ａｓｎ９６→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０３→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｙ；Ｓｅｒ１２７→Ａｒｇ；Ｔｙｒ１３２→Ｔｒｐ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；
   
   （ｈ）Ｌｅｕ３６→Ｉｌｅ；Ａｌａ４０→Ｔｙｒ；Ｇｌｎ４９→Ｐｒｏ；Ｔｙｒ５２→Ａｒｇ；Ｓｅｒ６８→Ａｒｇ；Ｌｅｕ７０→Ｐｈｅ；Ａｒｇ７２→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｉｌｅ；Ａｒｇ８１→Ｔｒｐ；Ａｓｎ９６→Ｐｈｅ；Ｔｙｒ１００→Ａｓｎ；Ｔｙｒ１０６→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ１２５→Ｔｒｐ；Ｓｅｒ１２７→Ａｓｐ；Ｔｙｒ１３２→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｙ；
   
   で構成する群から選択されたアミノ酸置換の１セットを含むことを特徴とする請求項１に記載の突然変異タンパク質。
3. 配列番号：１〜配列番号：８で構成する群から選択されたアミノ酸配列を含む請求項１に記載の突然変異タンパク質。
4. 前記突然変異タンパク質は、有機分子、酵素ラベル、放射性ラベル、着色ラベル、蛍光ラベル、発色ラベル、発光ラベル、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、細胞増殖抑制剤、毒素、金属複合体、金属およびコロイド金で構成する群から選択された化合物と結合していることを特徴とする請求項１に記載の突然変異タンパク質。
5. 前記突然変異タンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端で、タンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチドである融合パートナと融合していることを特徴とする請求項１に記載の突然変異タンパク質。
6. 前記突然変異タンパク質は、該突然変異タンパク質の血清半減期を延長する化合物と結合していることを特徴とする請求項１に記載の突然変異タンパク質。
7. 前記血清半減期を延長する化合物は、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロエチルでんぷん、免疫グロブリンのＦｃ部位、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン結合ペプチドおよびアルブミン結合タンパク質で構成する群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の突然変異タンパク質。
8. 請求項１に記載の突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
9. 前記核酸分子は、前記核酸分子の発現を許容するために、制御配列と作動可能に結合されていることを特徴とする請求項８に記載の核酸分子。
10. 前記核酸分子は、ベクタまたはファージミドベクタに含まれることを特徴とする請求項８に記載の核酸分子。
11. 請求項８に記載の核酸分子を含むホスト細胞。
12. 請求項１に記載の突然変異タンパク質を生成する方法であって、前記突然変異タンパク質は、前記突然変異タンパク質をコードする核酸から開始し、遺伝子工学的手法を用いて生成されることを特徴とする方法。
13. 前記突然変異タンパク質は、細菌性または真核性のホスト有機体に生成され、前記ホスト有機体またはその培養から分離されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. ＧＰＣ３の存在を検出するための分析用キットにおいて、請求項１に記載の突然変異タンパク質を含むことを特徴とする分析用キット。
15. ＧＰＣ３の存在を検出する方法であって、
    （ａ）請求項１に記載の突然変異タンパク質を、ＧＰＣ３を含むと思われるテストサンプルと接触させ、それにより該突然変異タンパク質およびＧＰＣ３間の複合体の形成を許容し、
    （ｂ）前記突然変異タンパク質およびＧＰＣ３間の複合体を適切なシグナルにより検出する、
    ステップを含むことを特徴とする方法。