JP7217783B2 - グリピカン-3(gpc3)に対する親和性を有するヒトリポカリン2のムテイン - Google Patents
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Description
グリピカン-3(GPC3)は、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型ヘパリン硫酸プロテオグリカンのグリピカンファミリーに属するがん胎児性抗原である。グリピカンは、ヘパリン硫酸グリコサミノグリカンと呼ばれる複合多糖鎖への共有結合を特徴とする。グリピカンは、細胞-細胞外マトリックス界面で、細胞シグナリングに関与する(Sasisekharan et al., Nat. Rev. Cancer 2:521-528(2002)(非特許文献1))。現在までに、ヒトグリピカンファミリーには、6つの相異なるメンバーが同定されている。細胞膜結合型GPC3は、1つまたは複数のジスルフィド結合で連結された2つのサブユニットで構成されている。
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:1)との比較において、配列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136および/または175に少なくとも20個の変異アミノ酸残基を含む、KDが約1nM以下である親和性でグリピカン-3(GPC3)に結合する能力を有するリポカリンムテイン。
[本発明1002]
ムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:1)との比較において以下の変異アミノ酸残基
Leu 36→ValまたはArg; Ala 40→Leu、ValまたはGly; Ile 41→Leu、Arg、Met、GlyまたはAla; Gln 49→ProまたはLeu; Tyr 52→ArgまたはTrp; Asn 65→Asp; Ser 68→Val、Gly、AsnまたはAla; Leu 70→Arg、Ser、AlaまたはVal; Arg 72→Asp、Trp、Ala、またはGly; Lys 73→Gly、Arg、Asn、GluまたはSer; Cys 76→ValまたはIle; Asp 77→His、Met、Val、Leu、ThrまたはLys; Trp 79→Lys、SerまたはThr; Arg 81→Gly; Cys 87→Ser; Asn 96→Arg、Asp、GlnまたはPro; Tyr 100→Gly、Glu、ProまたはGln; Leu 103→Glu、Gln、Asn、Gly、SerまたはTyr; Ser 105→Ala; Tyr 106→Asn、SerまたはThr; Lys 125→Glu; Ser 127→ArgまたはTyr; Tyr 132→TrpまたはIle; Lys 134→AlaまたはPhe; Thr 136→Ile; およびCys 175→Ala
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1001のムテイン。
[本発明1003]
本質的に実施例4に記載するように表面プラズモン共鳴(SPR)分析によって測定した場合に、SEQ ID NO:3のムテインより強い結合親和性でGPC3に結合する、本発明1001または1002のいずれかのムテイン。
[本発明1004]
本質的に実施例5に記載するように、ヒト、マウスまたはカニクイザルGPC3がトランスフェクトされたSK-HEP-1細胞に基づくアッセイで測定した場合に、SEQ ID NO:4のムテインと比較して改善されたEC50値を呈する、本発明1001または1002のいずれかのムテイン。
[本発明1005]
本質的に実施例6に記載するように蛍光に基づく熱変性アッセイによって測定した場合に、SEQ ID NO:3のムテインより生物物理学的安定性が高い、本発明1001または1002のいずれかのムテイン。
[本発明1006]
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:1)の配列位置28に対応する配列位置に突然変異を含まない、本発明1001または1002のいずれかのムテイン。
[本発明1007]
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:1)の位置65にある天然N-グリコシル化部位Asnが、ムテインの対応する配列位置では除去されている、本発明1001または1002のいずれかのムテイン。
[本発明1008]
ムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:1)との比較において、以下の組のアミノ酸置換
のうちの1つを含む、本発明1001~1007のいずれかのムテイン。
[本発明1009]
N-グリコシル化部位を有しない、本発明1001~1008のいずれかのムテイン。
[本発明1010]
SEQ ID NO:5~16からなる群またはそのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該フラグメントもしくは変異体は本発明1006~1028のいずれかに規定したアミノ酸残基を含む、リポカリンムテイン。
[本発明1011]
SEQ ID NO:5~16からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有する、本発明1001~1010のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1012]
本発明1001~1011のいずれかのムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
[本発明1013]
本発明1012の核酸分子を含有する宿主細胞。
[本発明1014]
本発明1001~1011のいずれかのムテインを生産する方法であって、該ムテインをコードする核酸から出発して、遺伝子工学的方法によってムテインが生産される、方法。
[本発明1015]
有効量の本発明1001~1010のいずれかのリポカリンムテインの1つもしくは複数または該ムテインを含む組成物の1つもしくは複数を対象に投与する工程を含む、対象中のGPC3に結合する方法。
本開示の一態様は、KDで測って約1nM以下の親和性でGPC3に結合する能力を有するリポカリンムテインに関する。より好ましくは、ムテインは、KDで測って約1nM以下または約0.2nM以下の親和性を有しうる。別の一態様において、ムテインは、本質的に実施例5に記載するアッセイなどの細胞結合アッセイにおいて、好ましくは約25nM、10nMもしくは3nMまたはそれよりも低いEC50値で、ヒトGPC3への結合について競合する能力を有する。
が切り離されて、アミノ酸21~198の完全配列を有する。このタンパク質は、成熟タンパク質の位置76および175にあるアミノ酸残基間に形成されるジスルフィド結合をさらに有する。
(a)において得られた前記1つまたは複数のムテイン核酸分子を適切な発現系で発現させる工程、
前記複数のムテインを、少なくとも1つのGPC3のフラグメントまたは成熟型と接触させる工程、および
所与の標的に対して検出可能な結合親和性を有する前記1つまたは複数のムテインを選択および/または単離によって濃縮する工程
を含むことができる。
例えば所与の標的/リガンドとして、少なくとも1つのGPC3フラグメントを用意する工程、
該リガンドと該標的/リガンドに対する結合親和性を有するムテインとの間で複合体の形成が可能になるように、前記複数のムテインを該標的/リガンドと接触させる工程、および
結合親和性を有しないか実質的な結合親和性を有しないムテインを除去する工程、
を含む。
a)リポカリンムテインを化合物とコンジュゲートする工程、および
b)リポカリンムテイン/化合物複合体を予め選択された部位に送達する工程
を含む、ある生物または組織中の予め選択された部位への薬学的活性化合物のターゲティングに使用される。
(a)ムテインを、GPC3を含有すると疑われる試験試料と接触させることによって、ムテインとGPC3との間に複合体を形成させる工程、および
(b)ムテインとGPC3との間の複合体を適切なシグナルによって検出する工程
を含むGPC3の結合/検出のための、本開示のムテインの使用を例示する。
実施例1:成熟ライブラリーの作製およびGPC3に特異的に結合する最適化ムテインの選択
GPC3特異的ムテインを最適化するために、ムテインSEQ ID NO:3および4に基づき、選択された位置のバイアス付きランダム化(biased randomization)またはエラープローンポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく方法のどちらかを使って、ライブラリーを作製した。バイアス付きの設計は、選択された位置のそれぞれについて、コードされるアミノ酸が、50~70%の確率で、それぞれの母クローン中に見いだされるアミノ酸に対応すると同時に、50~30%の確率で異なるアミノ酸となりうるように行った。標的となる位置の数をN、バイアスをBとして、1クローンあたりの交換の最確数はN×(1-B)である。真核細胞における発現を容易にするために、突然変異N65DによってhNGAL由来の天然N-グリコシル化部位N65を除去し、他の潜在的Nグリコシル化部位(Asn-X-Ser/Thr)については、これらのライブラリー位置にバイアスを設定することにより、出現する可能性を低減した。選択されたライブラリーにおけるSS架橋の除去は、バリンを位置C76における主要アミノ酸とする50%バイアスを設定すること、およびC175Aの突然変異によって実現した。
個々のクローンを使って2×YT/Amp培地に接種し、定常期まで終夜(14~18時間)培養した。次に、定常期培養物から50μlの2×YT/Ampに接種し、37℃で3時間インキュベートした後、OD595が0.6~0.8に達するまで22℃に移行した。1.2μg/mlアンヒドロテトラサイクリンを補足した2×YT/Ampを10μL添加することによって、ムテインの生産を誘発した。培養物を翌日まで22℃でインキュベートした。PBS/T中の5%(w/v)BSA 40μLを添加し、25℃で1時間インキュベートした時点で、培養物はスクリーニングアッセイに使用する準備が整った。20μlの培養物をスクリーニングELISAプレートにそのまま適用すると共に、残りの体積は65℃で1時間インキュベートした。
発現後にStreptactinアフィニティークロマトグラフィーおよび分取用サイズ排除クロマトグラフィーを使ってムテインを精製するために、SAリンカーとStrep-tag(登録商標)II(WSHPQFEK(SEQ ID NO:18))とを含むC末配列SAWSHPQFEK(SEQ ID NO:17)を持つユニークムテインを、2YT-Amp培地中、大腸菌で発現させた。
表面プラズモン共鳴(SPR)を使って、本明細書において開示する最適化リポカリンムテインの結合速度および親和性を測定した。
フローサイトメトリーによる評価で検出可能なレベルの内在性GPC3を発現しないDSMZ細胞バンクからのSK-HEP-1細胞に、ヒトGPC3、カニクイザルGPC3またはマウスGPC3をコードする発現ベクターを安定にトランスフェクトした。空ベクター対照細胞も得て、並行して分析した。
蛍光に基づく熱変性アッセイ(一般に示差走査蛍光測定の熱シフトアッセイと呼ばれる)を使用して、GPC3特異的Lcn2ムテインの熱安定性を、Mx3005P qPCRシステム(Agilent Technologies)を使って測定した。
非最適化製剤(PBS pH7.4)ならびにヒト血漿およびマウス血漿における選択された例示的ムテイン(SEQ ID NO:7、9および10)の貯蔵安定性を評価するために、以下の安定性試験を行った。
Claims (13)
- KDで測って約0.3nM以下の親和性でグリピカン-3(GPC3)に結合する能力を有するリポカリンムテインであって、
ムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:1)との比較において、以下の組の変異アミノ酸残基
(a) Leu 36 → Val; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Leu; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Val; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Trp; Lys 73 → Arg; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Asp; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Gln; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; および Lys 134 → Ala;
(b) Leu 36 → Val; Ala 40 → Val; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Lys 73 → Gly; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Asp; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; および Lys 134 → Phe;
(c) Leu 36 → Val; Ala 40 → Gly; Ile 41 → Met; Gln 49 → Leu; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Leu 70 → Ala; Lys 73 → Asn; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; および Lys 134 → Phe;
(d) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Leu; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; および Thr 136 → Ile;
(e) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Gly; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; および Thr 136 → Ile;
(f) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Gly; Ile 41→ Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Val; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Pro; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; および Thr 136 → Ile;
(g) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Leu; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Tyr; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; および Thr 136 → Ile;
(h) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Val; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Gly; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg; Tyr 100 → Pro; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; および Thr 136 → Ile;
(i) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Leu; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Ser; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; および Lys 134 → Phe;
(j) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Gly; Lys 73 → Glu; Cys 76 → Ile; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Gln; Leu 103 → Asp; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile; および Cys 175 → Ala; または
(k) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Ser; Cys 76 → Val; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile; Cys 175 → Ala
のうちの1つを含み、
ムテインが、SEQ ID NO:5~13および15~16からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、
リポカリンムテイン。 - 成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:1)の配列位置28に対応する配列位置に変異を含まない、請求項1記載のムテイン。
- N-グリコシル化部位を有しない、請求項1または2記載のムテイン。
- SEQ ID NO:5~13および15~16からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1~3のいずれか一項記載のリポカリンムテイン。
- SEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列を含むリポカリンムテイン。
- 請求項1~5のいずれか一項記載のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
- SEQ ID NO:5~13および15~16からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むムテインをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項6記載の核酸分子。
- SEQ ID NO:29に示すヌクレオチド配列を含む、請求項6記載の核酸分子。
- 請求項6~8のいずれか一項記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
- 請求項1~5のいずれか一項記載のムテインを生産する方法であって、該ムテインをコードする核酸から出発して、遺伝子工学的方法によってムテインが生産される、方法。
- 請求項1~5のいずれか一項記載のリポカリンムテインまたは請求項6~8のいずれか一項記載の核酸分子を含む、グリピカン-3の検出剤、対象中のグリピカン-3結合剤、またはグリピカン-3レベルの変化と関連する疾患もしくは障害の治療剤。
- 請求項1~5のいずれか一項記載の1種もしくは複数種のリポカリンムテインまたは請求項6~8のいずれか一項記載の核酸分子を含む、薬学的組成物。
- (a)請求項1~5のいずれか一項記載のムテインを、グリピカン-3を含有すると疑われる試験試料と接触させることによって、ムテインとグリピカン-3との複合体を形成させる工程、および
(b)ムテインとグリピカン-3との複合体を適切なシグナルによって検出する工程
を含む、グリピカン-3の結合または検出のためのインビトロ方法。
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