CN103154023B - 铁调素的结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及针对铁调素的新的、特异性结合的治疗和/或诊断蛋白,所述蛋白优选地是脂质运载蛋白的突变蛋白。本发明还涉及编码这样的蛋白的核酸分子和生成方法以及这样的蛋白和核酸分子的用途。相应地,本发明还涉及包含这样的脂质运载蛋白的药物和/或诊断组合物,包括这些蛋白的用途。
Description
摘要
本发明涉及针对铁调素(Hepcidin)的新的、特异性结合的治疗和/或诊断蛋白,所述蛋白优选地是脂质运载蛋白的突变蛋白。本发明还涉及编码这样的蛋白的核酸分子和生成方法以及这样的蛋白和核酸分子的用途。相应地,本发明还涉及包含这样的脂质运载蛋白的药物和/或诊断组合物,包括这些蛋白的用途。
背景技术
铁调素,一种通常以由20或25个氨基酸形成的两种形式存在的肽激素,由大量细胞响应于铁加载和炎症而表达和分泌。铁调素主要在肝脏的肝细胞中产生,在铁动态平衡的调节中起到主要作用,作为一种抗菌肽以及直接或间接参与大多数铁缺乏/过载综合症的发展。铁调素的一个主要作用是内化和降解铁输出体膜铁转运蛋白(ferroportin),所述膜铁转运蛋白在所有输出铁的细胞上表达。铁调素直接结合至膜铁转运蛋白。因此,高水平的铁调素导致小肠铁吸收和从巨噬细胞和肝细胞的铁释放的抑制,然而低浓度的铁调素导致从这些细胞的铁释放的加速。
铁调素也可能在炎症性贫血和缺铁性贫血的发病机理中发挥作用。炎症性贫血,也称为慢性疾病贫血(ACD)或慢性障碍贫血,目前在住院患者中是最常见的贫血,并且是一种许多感染性、非感染性炎症和肿瘤障碍并发的常见综合症。ACD是一种正常红血球的、正常色素的贫血,以铁和铁结合能力(转铁蛋白)减少、铁蛋白增加和骨髓巨噬细胞中存在铁为特征,表明从其储存中调动铁的功能受损。然而在炎症性贫血中,铁调素水平增加,在缺铁性贫血中,发现铁调素水平较低。因此,铁调素可以用作区分这些疾病的标记物。铁调素也可以是用于筛选、预后和监控遗传性血色素沉着症及铁加载贫血的一个有用标记物。铁调素水平进一步可用于监测EPO治疗和预测对EPO的响应。
分离、分析和量化铁调素的方法以及用于治疗与铁调素相关的疾病和病症的制剂已经被描述于国际专利申请WO2008/011158、WO2008/097461、WO2009/094551A1、WO2009/139822、WO2009/058797和WO2010/017070中。然而,在以前的描述中没有具有本发明提供的蛋白所赋有的特征的铁调素结合蛋白。
发明概述
本发明的一个实施方案涉及一种能够以测定的KD为约10nM或更低的亲和力结合铁调素的脂质运载蛋白突变蛋白。更优选地,脂质运载蛋白可以具有测定的KD为约1nM或更低的亲和力。在另一个实施方案中,脂质运载蛋白突变蛋白能够中和人铁调素-25的生物活性,优选地具有约80nM或更低的IC50值,如通过用于铁调素诱导的膜铁转运蛋白的内化和降解的基于细胞的测定所测得。
在特定的实施方案中,根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白包含选自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列。在另一个实施方案中,突变蛋白与野生型人脂质运载蛋白(包括人脂质运载蛋白2)的序列具有至少75%的同一性。
在另一个实施方案中,本发明的突变蛋白与选自有机分子、酶标记、放射性标记、有色标记、荧光标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、细胞抑制剂、毒素、金属络合物、金属和胶体金的化合物缀合。所述突变蛋白可以在其N端和/或C端融合至融合配偶体,所述融合配偶体是蛋白、蛋白结构域或肽。
在另一个实施方案中,突变蛋白与延长突变蛋白的血清半衰期的化合物缀合。进一步优选地,突变蛋白与选自聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白的化合物缀合。
在另一个实施方案中,本发明的突变蛋白是铁调素的拮抗剂。所述铁调素可以是成熟人铁调素。
在另一个实施方案中,本发明涉及包含编码本发明突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子。
在另一个实施方案中,本发明的脂质运载蛋白突变蛋白选自以下蛋白的突变蛋白:视黄醇结合蛋白(RBP)、胆汁三烯结合蛋白(BBP)、载脂蛋白D(APO D)、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、泪脂质运载蛋白(TLPC)、α2-微球蛋白相关蛋白(A2m)、24p3/uterocalin(24p3)、von Ebners腺蛋白1(VEGP1)、von Ebners腺蛋白2(VEGP2)和主要变应原Can f1前体(ALL-1)。在相关的实施方案中,所述脂质运载蛋白突变蛋白选自人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)、人泪脂质运载蛋白(hTLPC)、人载脂蛋白D(APOD)和欧洲粉蝶(Pieris brassicae)的胆汁三烯结合蛋白。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种脂质运载蛋白突变蛋白,其阻止人铁调素-25诱导的受试者的血清铁水平降低。
本发明还涉及一种治疗与铁调素水平改变相关的疾病或障碍的方法,所述方法包括给有此需要的受试者施用含有本文所述的突变蛋白的药物组合物。在相关的实施方案中,所述疾病或障碍涉及铁动态平衡的障碍或与铁调素水平提高相关的炎性病症。
附图说明
图1示出了用于成熟Lcn2氨基酸序列中的20个氨基酸位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134(有下划线和编号的)的同时随机诱变的PCR组装策略。这20个位置被分为四个序列子集。对于每个子集中的氨基酸的随机化,合成了寡脱氧核苷酸(SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19),其中在突变的密码子处采用核苷酸的NNK混合物。N是指所有四个碱基A、C、G和T的混合物,而K是指仅有两个碱基G和T的混合物,因此这样一种三联体编码所有20个自然氨基酸以及琥珀终止密码子TAG,其在用于噬菌粒生成和基因表达的大肠杆菌supE菌株XL1-blue(Bullock等人.,BioTechniques5(1987),376-378)或TG1(Sambrook 等人.,Molecular Cloning.ALaboratory Manual(1989),Cold Spring Harbor Press)中被翻译成谷氨酰胺。在组装反应中还使用了四个额外的寡脱氧核苷酸(SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23),所述寡脱氧核苷酸具有对应于非编码链(以3'-5'方向写在DNA双链序列之下)并且填充上述寡脱氧核苷酸之间的间隔的固定核苷酸序列。两个较短的侧翼寡脱氧核苷酸(SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25),其被过量添加并携带生物素基团,用作该组装的完全合成的基因片段的PCR扩增引物。所述两个侧翼引物各包含BstXI限制性位点(CCANNNNNNTGG),从而经酶消化产生相互不兼容的突出。这种特殊的限制性位点的排列使其能够特别高效地连接和克隆该合成基因。相对于原始的Lcn2序列,用氨基酸Gln28替代His对于引进第一个BstXI位点是必要的,而第二个自然存在于Lcn2的cDNA中。此外,未配对的残基Cys87在基因组装期间被Ser替换。在一锅式PCR后,生成的基因片段被插入到提供Lcn2结构基因的缺失部分的载体中。此图示还分别描述了在被两个BstXI限制性位点侧翼的盒的上游和下游的两个短引物(SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33),其用于双链DNA测序。
图2示出了合成的Lcn2基因的库的核苷酸序列(只示出了被两个BstXI限制性位点侧翼的中央的盒,如图1所示)。这个基因片段由Sloning BioTechnology GmbH制得。相比于图1中描述的DNA库有两处不同。第一,只要有可能,对全部非突变氨基酸位置进行了针对大肠杆菌表达的密码子优化。第二,在20个随机化位置处采用了19个不同三联体(GAC、TTC、CTG、CAC、AAT、AGC、ACC、GCA、ATG、CCT、GTT、TGG、GAG、CAA、ATC、GGA、CGT、GCA、TAC)的混合物,每一个编码除Cys外的不同氨基酸,所述20个随机化位置与图1中描述的相同。这里的氨基酸编号与Sloning BioTechnology GmbH使用的内部方案相对应,由此Gly1号是直接跟随上游BstX1限制性位点的第一个氨基酸密码子。
图3A描述了人铁调素(hHepcidin)特异的基于NGAL的脂质运载蛋白突变蛋白的某些氨基酸序列与野生型NGAL脂质运载蛋白的多肽序列相比较的比对。所述NGAL衍生的铁调素结合突变蛋白包含残基1到178,这意味着它们具有成熟野生型蛋白的长度。残基179到186是链霉亲和素结合标签(Strep-tagTM)的序列,用于生成的突变蛋白的分离。
图3B描述了人铁调素(hHepcidin)特异的基于NGAL的脂质运载蛋白突变蛋白的某些氨基酸序列与野生型NGAL脂质运载蛋白的多肽序列相比较的比对。所述NGAL衍生的铁调素结合突变蛋白包含残基1到178,这意味着它们具有成熟野生型蛋白的长度。残基179到186是链霉亲和素结合标签(Strep-tagTM)的序列,用于生成的突变蛋白的分离。
图4A示出了经由接头(淡灰色的粗斜体)融合至ABD结构域(粗体)和链霉亲和素结合标签Strep-tagTM(斜体)的SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO:15)。
图4B示出了由载体phNGAL98编码、融合至链霉亲和素结合标签Strep-tagTM(斜体)和N端T7标签(粗斜体)的脂质运载蛋白hNGAL的氨基酸序列(SEQ ID NO:34)。此多肽由phNGAL101编码。
图5示出了选定的Lcn2突变蛋白的直接ELISA的结果。
图6示出了选定的Lcn2突变蛋白的竞争性结合测定的结果。
图7示出了通过表面等离子体共振(SPR)测定的人和猕猴(cynomolgus)铁调素-25的选定的突变蛋白的亲和力。
图8示出了抗铁调素-25脂质运载蛋白突变蛋白的体外中和活性。
图9示出了针对铁调素的脂质运载蛋白突变蛋白中和注入小鼠体内的人铁调素。
图10示出了SEQ ID NO:14-PEG和SEQ ID NO:1-ABD(等于SEQ ID NO:15)的药代动力学参数。
发明详述
一方面,本发明涉及针对或特异于铁调素的新的特异性结合蛋白。本发明的蛋白可以用于治疗和/或诊断目的。如本文使用地,如果能够区分靶标与一个或多个参照靶标,本发明的蛋白“特异性结合”靶标(这里为铁调素),因为结合特异性不是绝对的,而是相对的特性。例如,“特异性结合”可以例如根据蛋白质印迹法、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-试验、FACS、IHC和肽扫描测定。
针对或特异于铁调素的本发明的蛋白,包括任意数量的基于定义蛋白骨架的特异性结合蛋白突变蛋白。本文使用的“突变蛋白”、“突变的”实体(不管是蛋白质或核酸)或“突变体”,是指相对于天然存在的(野生型)核酸或蛋白“参照”骨架,分别地交换、缺失或插入一个或多个核苷酸或氨基酸。
本发明的蛋白可以为脂质运载蛋白的突变蛋白,优选地,脂质运载蛋白选自视黄醇结合蛋白(RBP)、胆汁三烯结合蛋白(BBP)、载脂蛋白D(APO D)、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、泪脂质运载蛋白(TLPC)、α2-微球蛋白相关蛋白(A2m)、24p3/uterocalin(24p3)、von Ebners腺蛋白1(VEGP1)、von Ebners腺蛋白2(VEGP2)和主要变应原Can f1前体(ALL-1)。如本文使用地,脂质运载蛋白被定义为重量为约18-20kDA的单体蛋白,其具有圆柱形β折叠片超二级结构区,所述结构区包含通过在一端的多个(优选为4个)环逐对连接的多个(优选为8个)β链,从而由此限定结合口袋。在脂质运载蛋白家族成员中,正是所述环在本应刚性的脂质运载蛋白骨架中的这种多样性产生多种不同的结合模式,每一种模式能容纳不同大小、形状和化学特征的靶标(例如上文的Flower,D.R.(1996);上文的Flower,D.R.等人(2000),或Skerra,A.(2000)Biochim.Biophys.Acta1482,337-350中的综述)。事实上,蛋白的脂质运载蛋白家族已经天然进化到结合范围广泛的配体,具有非常低水平的整体序列保守性(通常具有少于20%的序列同一性),但保留高保守性的整个折叠模式。不同脂质运载蛋白位置间的对应关系为本领域技术人员所公知。例如,见,美国专利No.7,25,0297。
在优选的实施方案中,本发明的蛋白是脂质运载蛋2(Lcn2;也被称为人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白,hNGAL或siderocalin)的突变蛋白。本文使用的术语“人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白”或“hNGAL”或“脂质运载蛋白2”或“Lcn2”是指具有SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P80188的成熟hNGAL或SEQ ID NO:35中所示的成熟hNGAL。这种蛋白的成熟形式具有全序列的氨基酸21至198,因为氨基酸1-20的信号肽被切掉。该蛋白质进一步在成熟蛋白的位置76至175处的氨基酸残基之间有二硫键形成。
在更优选的实施方案中,本发明涉及一种脂质运载蛋白突变蛋白,其具有圆柱形β折叠片超二级结构区,所述结构区包含通过在一端的4个环逐对连接的8个β链,从而由此定义结合口袋,其中所述4个环中至少三个中每一个的至少一个氨基酸被诱变,并且其中所述脂质运载蛋白以可检测的亲和力有效地结合作为给定非天然靶标的铁调素。优选地,所述脂质运载蛋白突变蛋白在对应于NGAL的线性多肽序列的位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132、和/或134的位置处具有一个或多个例如1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸替换。
在本文中,本发明人发现在特定位置处具有突变的脂质运载蛋白2突变蛋白的特定组,其显示了对铁调素的可检测亲和力以及特异性。适合突变的氨基酸位置包括人脂质运载蛋白2的线性多肽序列的序列位置96、100和106。本发明还涉及编码这些蛋白的核酸。
可以根据本发明设计以提供以可检测的亲和力结合铁调素的蛋白质突变蛋白的其它蛋白骨架包括:EGF样结构域,Kringle-结构域,纤连蛋白型I结构域,纤连蛋白II型结构域,纤连蛋白III型结构域,PAN结构域,G1a结构域,SRCR结构域,Kunitz/Bovine胰脏胰蛋白酶抑制剂结构域,淀粉酶抑肽(tendamistat),Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域,Trefoil(p型)结构域,血管性血友病因子C型结构域,过敏毒素样结构域,CUB结构域,甲状腺球蛋白I型重复序列,LDL受体A类结构域,Sushi结构域,链接结构域,血小板反应蛋白I型结构域,免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白样结构域(例如,结构域抗体或camel重链抗体),C型凝集素结构域,MAM结构域,血管性血友病因子A型结构域,生长调节素B结构域,WAP型四个二硫化物核心结构域,F5/8C型结构域,血液结合素结构域,SH2结构域,SH3结构域,层粘连蛋白型EGF样结构域,C2结构域,“Kappabodies”(III.等人“Design and constructionof a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and lightchain variable regions”Protein Eng10:949-57(1997)),“Minibodies”(Martin等人“The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of humaninterleukin-6”EMBO J13:5303-9(1994)),“双体”(Holliger等人“‘Diabodies’”:smallbivalent and bispecific antibody fragments”PNAS USA90:6444-6448(1993)),“Janusins”(Traunecker等人“Bispecific single chain molecules(Janusins)targetcytotoxic lymphocytes on HIV infected cells”EMBO J10:3655-3659(1991)和Traunecker等人“Janusin:new molecular design for bispecific reagents”Int JCancer Suppl7:51-52(1992),纳米抗体,adnectin,四连接素(tetranectin),微体,affiIin,affibody或锚蛋白,晶状体蛋白,knottin,泛素,锌指蛋白,自荧光蛋白,锚蛋白或锚蛋白重复序列蛋白或富亮氨酸重复序列蛋白,avimer(SIIverman,Lu Q,Bakker A,To W,Duguay A,Alba BM,Smith R,Rivas A,Li P,Le H,Whitehorn E,Moore KW,Swimmer C,Perlroth V,Vogt M,Kolkman J,Stemmer WP2005,Nat Biotech,Dec;23(12):1556-61,E-Publication in Nat Biotech.2005Nov20版);以及通过人受体结构域家族的外显子改组进化的多价avimer蛋白,其还描述于Silverman J,Lu Q,Bakker A,To W,Duguay A,AlbaBM,Smith R,Rivas A,Li P,Le H,Whitehorn E,Moore KW,Swimmer C,Perlroth V,VogtM,Kolkman J,Stemmer WP,Nat Biotech,Dec;23(12):1556-61,E-Publication inNat.Biotechnology.2005Nov20版)。
本发明的蛋白可包括突变氨基酸序列位置外的“亲本”蛋白骨架(例如脂质运载蛋白)的野生型(天然)的氨基酸序列;或者,脂质运载蛋白突变蛋白还可包括在进行诱变的序列位置外的氨基酸突变,所述氨基酸突变不干扰突变蛋白的结合活性和折叠。这种突变可以使用既定的标准方法(Sambrook,j.等人(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)在DNA水平实现。氨基酸序列可能的改变为插入或缺失以及氨基酸替换。
这样的替换可以是保守的,即一个氨基酸残基被一个化学相似的氨基酸残基替换。保守替换的例子有以下组成员间的替换:1)丙氨酸,丝氨酸和苏氨酸;2)天冬氨酸和谷氨酸;3)天冬酰胺和谷氨酰胺;4)精氨酸和赖氨酸;5)异亮氨酸,亮氨酸,蛋氨酸和缬氨酸;6)苯丙氨酸,络氨酸和色氨酸。另一方面,还可以在氨基酸序列中引入非保守性改变。此外,除了替换单个的氨基酸残基,也可以插入或缺失亲本蛋白骨架一级结构的一个或多个连续氨基酸,这些缺失或插入产生稳定的折叠/功能性突变蛋白,其可容易地被本领域技术人员检测。
本领域技术人员将会理解可用于制备本发明预期的、但其蛋白或核酸序列在本文中没有明确地披露的蛋白突变蛋白的方法。作为一个概述,这种氨基酸序列的修改包括,例如,通过引入某些限制性酶的切割位点对单个氨基酸位置进行定点诱变,以便简化突变的脂质运载蛋白基因或其部分的亚克隆。此外,也可以引入这些突变以进一步提高脂质运载蛋白突变蛋白对给定靶标的亲和力。并且,如果必要,可以引入突变来调节突变蛋白的某些特征,如提高折叠稳定性、血清稳定性、蛋白抗性或水溶性,或用来减少聚合趋势。例如,天然存在的半胱氨酸残基可突变为其它氨基酸以防止二硫键形成。
相应地,本发明还包括本文披露的蛋白的功能变体,其与参照蛋白有阈值序列同一性或序列同源性。“同一性”或“序列同一性”指的是衡量它们的相似性或关联的序列特性。本发明使用的术语“序列同一性”或“同一性”是指本发明多肽序列与有关序列(同源性)比对之后,形成配对的相同残基相对于这两个序列较长一个的残基数量的百分比。通过用相同残基的数量除以残基总数再使结果乘以100来测定百分同一性。本文使用的术语“同源性”为其通常含义,包括相同的氨基酸以及在两蛋白线性氨基酸序列的等效位置被认为保守替换的氨基酸(例如,用天冬氨酸残基交换谷氨酸残基)。最优选地,SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列优选地作为“参照序列”。SEQ ID NO:35示出了成熟hNGAL。本文中术语“参照序列”和(NGAL的)“野生型序列”互换使用。另外,具有SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P80188的氨基酸序列可以作为参照序列。
序列同源性或序列同一性,比如,可以使用程序BLASTP blastp2.2.5版(2002年11月16日;参见Altschul,S.F.等人(1997)Nucl.Acids Res.25,3389-3402)进行测定。在这个实施方案中,同源性百分比基于包括前肽序列的完整多肽序列比对(matrix:BLOSUM62;gapcosts:11.1;截距值设定为10-3),优选地在配对比较中使用野生型蛋白骨架作为参照。其计算为,以BLASTP程序输出的结果表示的“阳性氨基酸”(同源氨基酸)数除以程序选择用于比对的氨基酸总数的百分比。
还可以特意地将其它氨基酸序列位置突变为半胱氨酸以引入新的反应性基团,例如,用于缀合至其它化合物,如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白质,或用于形成非天然存在的二硫键。关于人脂质运载蛋白2的突变蛋白,将半胱氨酸残基引入到包括人脂质运载蛋白2突变蛋白的脂质运载蛋白的氨基酸序列这种突变的示例性可能性包括在对应于hNGAL野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的序列位置至少一个处引入半胱氨酸(Cys)。在一些实施方案中,本发明的人脂质运载蛋白2突变蛋白的序列相比于SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P80188的序列,半胱氨酸已被另一个氨基酸残基替换,所述相应的半胱氨酸可以被重新引入所述序列。作为一个说明性的例子,在这种情况下,通过恢复到最初存在于SWISS-PROT登录号P80188序列中的半胱氨酸,可以引入氨基酸位置87处的半胱氨酸残基。在氨基酸位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146和/或158任一处的一侧生成的硫醇部分可用于PEG化或HES化突变蛋白,例如,以增加相应人脂质运载蛋白2突变蛋白的血清半衰期。
当根据本发明使用时,术语“位置”是指本文描述的氨基酸序列中的氨基酸的位置或本文描述的核酸序列中的核苷酸的位置。本文使用的术语“相应的”还包括不仅由前面的核苷酸/氨基酸数量决定的位置。因此,可以被替换的根据本发明的给定氨基酸的位置可以由于缺失或添加(变体或野生型)脂质运载蛋白中别处的氨基酸而改变。类似地,可以被替换的根据本发明的给定核苷酸的位置可以由于缺失或添加突变蛋白中别处的核苷酸或包含启动子和/或任意其它调节序列或基因(包括外显子和内含子)的野生型脂质运载蛋白5’-非翻译区(UTR)而变化。
因此,根据本发明在“相应的位置”下,优选地理解为核苷酸/氨基酸在所示的数字方面可以不同,但仍可以有类似的邻近核苷酸/氨基酸。可以交换、缺失或添加的所述核苷酸/氨基酸也被术语“相应的位置”所包含。当本文使用“在对应于一个位置的位置处”时,在“查询”氨基酸(或核苷酸)序列中的位置是指对应于“主体”氨基酸(或核苷酸)序列中的位置。
特别地,为了确定不同于本发明NGAL脂质运载蛋白突变蛋白的脂质运载蛋白氨基酸序列的核苷酸残基或氨基酸残基是否对应于所述NGAL脂质运载蛋白突变蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列,尤其是SEQ ID NO:1-14中的任意一个或在NGAL线性多肽序列的位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和/或134具有一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸替换的序列,技术人员可以利用本领域熟知的手段和方法,如手动地或通过使用计算机程序如BLAST2.0比对,所述BLAST2.0代表基本局部比对搜索工具或ClustalW或任意其它适用于生成序列比对的合适程序。因此,具有SEQ ID NO:1-14中任一个或在NGAL线性多肽序列的位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和/或134处或本文所述任意其它位置处具有一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸替换的脂质运载蛋白突变蛋白可以用作“主体序列”,而不同于NGAL的脂质运载蛋白的氨基酸序列用作“查询序列”。
鉴于以上,本领域技术人员因此容易在一个位置来确定本文描述的Lcn2中突变的哪个氨基酸位置对应于除Lcn2以外骨架的氨基酸,优选如本文描述那些中的一个。具体地说,本领域技术人员将本文所述突变蛋白的氨基酸序列(特别是本发明的NGAL突变蛋白(或anticalin))与不同脂质运载蛋白的氨基酸序列进行比对,以确定所述突变蛋白的哪个(哪些)氨基酸对应于所述不同脂质运载蛋白的氨基酸序列的相应氨基酸。更具体地说,本领域技术人员能因此确定所述不同脂质运载蛋白的氨基酸序列的哪个氨基酸对应于在位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132、和/或134处的氨基酸或对应于NGAL线性多肽序列的本文所述的任意其它位置处的氨基酸。
针对或特异于铁调素的本发明的蛋白包括任意数量的基于所定义蛋白骨架的特异性结合蛋白突变蛋白。优选地,所述骨架为hNGAL。如本文使用地,“突变蛋白”、“突变的”实体(不管是蛋白质还是核酸)或“突变体”是指,相对于天然存在的(野生型)核酸或蛋白“参照”骨架,分别地交换、缺失或插入一个或多个核苷酸或氨基酸。优选地,分别地进行交换、缺失或插入的核苷酸或氨基酸的数量为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多如25、30、35、40、45或50。然而,优选地,本发明的突变蛋白仍然能够结合铁调素。
在一些实施方案中,根据本发明的蛋白以100μM或更少(包括5μM或更少,约500nM,约200nM或更少,100nM或更少,1nM或更少,或0.1nM或更少)的KD结合铁调素。本发明的蛋白可以特异地结合铁调素的成熟、折叠生物活性形式的一个或多个连续、不连续或构象表位。
本发明的蛋白能够以可测定的亲和力结合铁调素,即离解常数为至少200nM,即KD为约200nM或更少。在一些实施方案中,本发明的蛋白以至少约100nM、约50nM、约25nM、约15nM、约5nM、约2nM、约0.5nM、约0.25nM、约0.1nM、约0.05nM或更少的离解常数结合铁调素。本发明的蛋白优选地以KD为约10nM或更强的亲和力结合至成熟人铁调素分子。本发明人已经发现结合亲和力通常为KD低于约1nM,在一些情况下,为约0.1nM和更低。
本发明蛋白(例如脂质运载蛋白的突变蛋白)对选定靶标(在本发明中为铁调素)的结合亲和力,可以通过本领域技术人员已知的大量方法来测定(由此可以测定突变蛋白-配体复合物的KD值)。这些方法包括、但不限于,荧光滴定法、竞争ELISA、量热法如等温滴定量热法(ITC)、和表面等离子体共振(BIAcore)。本领域完备地创建了这些方法,并且下面详细介绍其实例。
本发明蛋白的氨基酸序列与成熟人脂质运载蛋白2或其它脂质运载蛋白可具有高序列同一性。在本文中,本发明的蛋白与选自SEQ ID NO:1-14的序列的蛋白可具有至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%同一性,包括至少95%同一性。优选地,结构性同系物在对应于NGAL线性多肽序列的位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和/或134的一个或多个位置处(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个位置处)仍然具有氨基酸替换。
本发明还包括选自SEQ ID NO:1-14的序列的蛋白的结构性同系物,其具有大于约60%的氨基酸序列同源性或序列同一性,优选地大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于92%以及最优选地大于95%。优选地,结构性同系物在对应于NGAL线性多肽序列的位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和/或134的一个或多个位置处(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个位置处)仍然具有氨基酸替换。
术语“铁调素”指也被称为肝表达抗菌肽1或假定的肝肿瘤抑制剂(regressor)的蛋白,其人类形式具有UniProtKB/Swiss-Prot登录号P81172。在一般基础上,术语“铁调素”指已知存在于脊椎动物物种(包括哺乳动物)中的铁调素蛋白的任意形式。人未加工蛋白具有84个氨基酸的长度,并且由基因“HAMP”编码,也被称为“HEPC”或“LEAP1”。其被切割成两条链,本文中也包括在术语“铁调素”中。这两条链为具有氨基酸60–84的铁调素-25(Hepc25)和具有氨基酸65–84的铁调素-20(Hepc20)。铁调素-25以弯曲的发夹形式排列,通过四个二硫键稳定。天然变体也包括在术语“铁调素”中,其具有例如氨基酸替换59R→G(VAR_0425129);氨基酸替换70C→R(VAR_042513);氨基酸替换71G→D(VAR_026648)或氨基酸替换78C→Y(VAR_042514)。另一天然变体为铁调素-22,是铁调素-25的另一N端截短的同种型(除了铁调素-20)。
本文使用的术语“成熟铁调素”指任意成熟的、生物活性形式的铁调素蛋白,其在脊椎动物如哺乳动物中表达。术语“铁调素”指存在于人体内的铁调素蛋白的任意形式。表达“人铁调素-25”指具有描述于SEQ ID NO:28中的氨基酸序列的人铁调素的成熟形式。在本发明中提供的脂质运载蛋白突变蛋白能够结合铁调素的每一个给定形式,包括其蛋白水解片段,而不管各自的铁调素分子是否显示生物/生理活动。因此,铁调素分子可能只存在于生物样品中,而没有任意可测量的生理相关性。例如,见,到目前为止铁调素-22只有在尿液中检测到,迄今为止被认为仅仅是铁调素-25的一种尿降解产物(综述于Kemna等人,Haematologica.2008Jan;93:(1)90-97)。本发明的突变蛋白当然也可以结合生理活性种类,如成熟的、生物活性的铁调素-25。因此,本发明的突变蛋白可被用作诊断性的和/或药物,这取决于选择的要识别的铁调素。
根据上文,本发明的蛋白优选地作为铁调素分子的拮抗剂。在一些实施方案中,本发明的蛋白(如,人脂质运载蛋白2突变蛋白)通过抑制铁调素分子结合至或者与膜铁转运蛋白相互作用的能力,可以作为铁调素分子的拮抗剂。铁调素可以为成熟人铁调素形式,如铁调素-25或铁调素-20。成熟铁调素与膜铁转运蛋白的结合导致膜铁转运蛋白的内化和降解,这是具有细胞表面/膜位置的蛋白质的标准过程。
另一方面,本发明包括各种脂质运载蛋白突变蛋白,包括特异地结合铁调素的人脂质运载蛋白2的突变蛋白。在这个意义上,铁调素可以看作野生型人脂质运载蛋白2的非天然配体,这里“非天然配体”指不结合至野生型脂质运载蛋白的化合物,包括生理条件下的人脂质运载蛋白2。通过工程化野生型脂质运载蛋白,如在某些位置诱变人脂质运载蛋白2,本发明人证明了对非天然配体的高亲和力和高特异性是可能的。一方面,至少在编码hLcn2线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和/或134的任意处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20个核苷酸三联体处,可以通过允许用核苷酸三联体的子集在这些位置处进行替换,进行随机突变。
本文描述的本发明的脂质运载蛋白突变蛋白中的氨基酸替换优选地在脂质运载蛋白(优选hNGAL)的一个、两个、三个或四个环区域内。所述环区域来自hNGAL的位置33至54(环1)、66至83(环2)、94至106(环3)和123至136(环4)。24-36、53-66、79-84和103-110。
进一步的,所述脂质运载蛋白可以用来生成具有突变的氨基酸残基的突变蛋白,所述突变的氨基酸残基在对应于成熟人脂质运载蛋白2线性多肽序列的序列位置96、100和106的序列位置的任一个或多个处,包括至少在任意两个或全部三个处。例如,在序列位置96处的替换可为替换Asn 96→Arg、Asp、Gln、Gly、Lys、Ser、Thr或Val。例如,在序列位置100处的替换可为替换Tyr100→Ala、Arg、Glu、Gln、Gly、Ser和Val。例如,在序列位置106处的替换可为替换Tyr106→Ile、Gly、Phe、Val或Arg。相对于成熟人脂质运载蛋白2线性多肽序列,在一些实施方案中的本发明突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Asn96→Val和Tyr100→Gln。在这样的实施方案中,在位置106处的酪氨酸可以不变。相对于成熟人脂质运载蛋白2线性多肽序列,在一些实施方案中的本发明突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Asn96→Arg、Tyr100→Glu和Tyr106→Phe。在一些实施方案中,本发明突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Asn96→Asp、Tyr100→Ser和Tyr106→Gly。在一些实施方案中,本发明突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Asn96→Gly、Tyr100→Gly和Tyr106→Gly。在一些实施方案中的本发明突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Asn96→Lys、Tyr100→Ala和Tyr106→Ile。在一些实施方案中,本发明突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Asn96→Ser、Tyr100→Arg和Tyr106→Val。在一些实施方案中的本发明突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Asn96→Ser、Tyr100→Val和Tyr106→Arg。在一些实施方案中,本发明突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Asn96→Thr、Tyr100→Val和Tyr106→Gly。在一些实施方案中,本发明的突变蛋白进一步包括在成熟人脂质运载蛋白2线性多肽序列中位置134处的突变的氨基酸残基。在一个实施方案中,所述替换为Lys134→Trp。
在一些实施方案中,典型地除了在序列位置96、100和106(上文)的一处或多处突变,本发明的突变蛋白在对应于成熟人脂质运载蛋白2线性多肽序列的序列位置52、68、81、127的序列位置中的任意一处或多处包括突变的氨基酸残基。例如,所述突变蛋白在成熟人脂质运载蛋白2线性多肽序列内包括替换Tyr52→His、Leu、Phe或Trp。所述突变蛋白还可在成熟人脂质运载蛋白2线性多肽序列内包括替换Ser68→Arg、Gly或Ile。所述突变蛋白还可包括替换Arg81→Glu、Gly或Gln。例如,所述突变蛋白可在成熟人脂质运载蛋白2线性多肽序列内包括替换Ser127→Thr或Trp。相对于成熟人脂质运载蛋白2线性多肽序列,在一些实施方案中的本发明的突变蛋白具有以下氨基酸替换集合:Tyr52→His、Ser68→Arg、Arg81→Ser和Ser127→Trp。在一些实施方案中,本发明的突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Tyr52→Leu、Ser68→Arg、Arg81→Glu和Ser127→Trp。在一些实施方案中的本发明的突变蛋白具有以下氨基酸替换集合:Tyr52→Phe、Ser68→Gly、Arg81→Gly和Ser127→Trp。在一些实施方案中的本发明的突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Tyr52→Trp、Ser68→Ile、Arg81→Gln和Ser127→Trp。在一些实施方案中,本发明的突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Tyr52→Trp、Ser68→Arg、Arg81→Glu和Ser127→Trp。关于成熟人脂质运载蛋白2的序列,在一些实施方案中的本发明的突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Tyr52→Trp、Ser68→Arg、Arg81→Glu和Ser127→Thr。在一些实施方案中,本发明的突变蛋白可具有以下氨基酸替换集合:Tyr52→Trp、Ser68→Arg、Arg81→Glu和Ser127→Trp。
在本发明的进一步的实施方案中,所述突变蛋白在对应于hNGAL线性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和138的序列位置的任意处或在其它脂质运载蛋白上的相应位点处包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个突变的氨基酸残基。在进一步的实施方案中,所述突变蛋白在对应于hNGAL线性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和138的任一处或在其它脂质运载蛋白上的相应位点处包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个突变的氨基酸残基。仍然在进一步的实施方案中,所述突变蛋白在人脂质运载蛋白2线性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和138的任一处或在其它脂质运载蛋白上的相应位点处包含18、19或20个突变的氨基酸残基。
例如,关于成熟hLcn2野生型氨基酸序列,本发明的突变蛋白可包括:Leu36→Ala,Cys,Thr,Val;Ala40→Arg,Glu,Gly和Ser;Ile41→Ile,Leu,Met或Val;Gln49→Leu或Met;Leu70→Asp,Asn,Gln,Met或Phe;Arg72→Glu,Gly,Leu或Val;Lys73→Ala,Arg,Glu,Gly,Leu,Thr或Tyr;Asp77→Arg,Glu,Gly,Leu,Ser或Val;Trp79→Gly,Leu,Ser,Tyr或Val;Leu103→Ala,Arg,Gly或Trp;Tyr106→Gly,Ile,Phe或Val;Lys125→Arg,Leu,Met,Phe,Thr,或Val;和Tyr132→Leu或Val中的一个或多个氨基酸替换,如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。例如,关于成熟人脂质运载蛋白2线性多肽序列,本发明的突变蛋白可具有Ala36、Ser40、Leu41、Met49、Asn70、Gly72、Gly73、Ser77、Leu79、Leu125和Val132的氨基酸组合集合。例如,关于成熟人脂质运载蛋白2序列,本发明的突变蛋白可具有Leu36、Arg40、Val41、Gln49、Asp70、Arg72、Thr73、Leu77、Ser79、Thr125和Val132的氨基酸组合集合。在一些实施方案中,本发明的突变蛋白可具有Leu36、Glu40、Ile41、Leu49、Gln70、Gly72、Glu73、Gly77、Gly79、Phe125和Val132的氨基酸组合集合。本发明的突变蛋白还可具有Leu36、Glu40、Ile41、Met49、Met70、Leu72、Ala73、Glu77、Leu79、Val125、Val132的氨基酸组合集合或Leu36、Glu40、Val41、Met49、Met70、Leu72、Ala73、Glu77、Leu79、Thr125和Val132的氨基酸组合集合。在一些实施方案中,本发明的突变蛋白可具有Leu36、Glu40、Val41、Met49、Met70、Leu72、Ala73、Glu77、Leu79、Val125和Val132的氨基酸组合集合或Thr36、Ser40、Ile41、Gln49、Phe70、Glu72、Gly73、Arg77、Val79、Val125和Leu132的氨基酸组合集合。作为进一步的例子,本发明的突变蛋白可具有Val36、Glu40、Met41、Leu49、Met70、Glu72、Tyr73、Val77、Leu79、Arg125和Val132的氨基酸组合集合。本发明的突变蛋白还可具有Val36、Gly40、Leu41、Leu49、Leu70、Val72、Arg73、Arg77、Tyr79、Met125和Val132的氨基酸组合集合。
在本发明的一个实施方案中,所述突变蛋白在以上所列序列位置的至少任意10、14、15、20、22、24、26、28、29、30、31、32、33、35或所有45处包括突变的氨基酸残基。
本发明结合至铁调素的突变蛋白可以相对于成熟人脂质运载蛋白2野生型氨基酸序列(Lcn2)包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸替换,其包括、但不限于,Leu36→Val或Cys、Ala40→Tyr或Lys或Val、Ile41→Thr或Ser或Leu、Gln49→Leu或Trp、Leu70→Gly、Arg72→Gly或Asp、Lys73→Leu或Thr或Asp、Asp77→Asn或His或Leu、Trp79→Lys、Asn96→Ile或Arg、Tyr100→Gln或Arg或Glu、Leu103→Met或Arg或Gly、Tyr106→Tyr或Ala或Trp、Lys125→Thr或Val或Glu、Ser127→Gly或Gln或Ala、Tyr132→Met或Ser或Thr、和Lys134→Asn。
在一个实施方案中,本发明结合至铁调素的突变蛋白包括以下氨基酸替换:Leu36→Val、Ala40→Tyr、Ile41→Thr、Gln49→Leu、Leu70→Gly、Lys73→Leu、Asp77→Asn、Trp79→Lys、Asn96→Ile、Tyr100→Gln、Leu103→Met、Lys125→Thr、Ser127→Gly、Tyr132→Met和Lys134→Asn。在进一步的实施方案中,本发明结合至铁调素的突变蛋白包括以下氨基酸替换:Leu36→Val、Ala40→Lys、Ile41→Ser、Gln49→Trp、Leu70→Gly、Arg72→Gly、Lys73→Thr、Asp77→His、Trp79→Lys、Asn96→Arg、Tyr100→Arg、Leu103→Arg、Tyr106→Ala、Lys125→Val、Ser127→Gln、Tyr132→Ser和Lys134→Asn。在另一个实施方案中,本发明结合至铁调素的突变蛋白包括以下氨基酸替换:Leu36→Cys、Ala40→Val、Ile41→Leu、Gln49→Leu、Leu70→Gly、Arg72→Asp、Lys73→Asp、Asp77→Leu、Trp79→Lys、Asn96→Arg、Tyr100→Glu、Leu103→Gly、Tyr106→Trp、Lys125→Glu、Ser127→Ala、Tyr132→Thr和Lys134→Asn。
相对于成熟hLcn2野生型氨基酸序列,根据本发明的突变蛋白可进一步包括氨基酸替换Gln28→His。相对于成熟hLcn2野生型氨基酸序列,根据本发明的突变蛋白可进一步包括氨基酸替换Lys62→Arg。此外,相对于成熟hLcn2野生型氨基酸序列,根据本发明的突变蛋白可包括氨基酸替换Phe71→Pro或Ser。相对于成熟hLcn2野生型氨基酸序列,可存在于本发明的突变蛋白中的其它氨基酸替换为替换Lys74→Glu。还可包括于本发明的突变蛋白中的其它氨基酸替换为替换Lys75→Glu。相对于成熟hLcn2野生型氨基酸序列,本发明的突变蛋白还可包括氨基酸替换Cys87→Ser。本发明的突变蛋白还可包括氨基酸替换Ser146→Pro。相对于成熟hLcn2野生型氨基酸序列,可存在于本发明突变蛋白中的其它氨基酸替换为替换Glu147→Gly。本发明的突变蛋白还可包括其它氨基酸替换。所述突变蛋白可以进一步包括氨基酸替换,例如Tyr52→Gln或Val;Ser68→Lys或Asn;或Arg81→Trp、Asn或His。
本发明的突变蛋白典型地以单体蛋白存在。然而,同样可行的是本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够自发地二聚化或低聚化。虽然形成稳定单体的脂质运载蛋白突变蛋白的使用可能优选地用于一些应用,例如由于更快的扩散和更好的组织穿透力,形成稳定的同型二聚体或多聚体的脂质运载蛋白突变蛋白的使用在其它情况下可能是有利的,因为这些多聚体可以为给定标靶提供(进一步)增强的吸引力和/或亲和力。此外,脂质运载蛋白突变蛋白的低聚物形式可具有更慢的离解速率或延长的血清半衰期。
本发明还指出,各突变蛋白和其配体间复合物的形成受许多不同因素影响,所述因素如各结合配偶体的浓度、竞争者的存在、pH和使用的缓冲系统的离子强度、以及用于离解常数KD测定的实验方法(例如荧光滴定法、竞争ELISA或表面等离子体共振,仅举几例)或甚至用于评价实验数据的数学算法。
因此,本领域技术人员也清楚KD值(在各突变蛋白和其靶标/配体间形成的复合物的离解常数)可能在某个实验范围内变化,这取决于用于测定特定脂质运载蛋白突变蛋白对给定配体的亲和力的方法和实验设置。这意味着所测得的KD值可能会有轻微的偏差或耐量范围,例如,取决于该KD值是通过表面等离子体共振(Biacore)、竞争ELISA、还是“直接ELISA”测定的。
在一个实施方案中,本文披露的突变蛋白可以从N或C端连接至亲和力标签如五组氨酸标签、六组氨酸标签或链霉亲和素标签(例如,)。因此,本申请还包括装备有这些标签的所有明确地和一般描述的突变蛋白。
本发明与特征脂质运载蛋白突变蛋白片段联合使用的术语“片段”涉及来源于N端和/或C端缩短的(例如,缺少N端和/或C端氨基酸的至少一个)全长成熟Lcn2的蛋白或肽。这种片段优选地包括成熟Lcn2一级序列的至少10个、更优选20个、最优选30个或更多个连续氨基酸,并且在成熟Lcn2的免疫测定中通常是可检测的。本文使用的词“检测”理解为在定量和定性水平上以及它们的组合。从而其包括目标分子的定量、半定量和定性测定。因此,可以测定例如在样品中的分子如铁调素的存在或不存在,以及其浓度或水平。
上述突变蛋白也包括于本发明的范围内,就其免疫原性已经对所述蛋白进行改变,以减少通过使用本领域技术人员已知的方法检测到的任何免疫原性。
细胞毒性T细胞识别与I类主要组织相容性复合体(MHC)分子相关合的抗原呈递细胞的细胞表面上的肽抗原。肽结合MHC分子的能力具有等位基因特异性并且和它们的免疫原性相关。为了减少给定蛋白的免疫原性,预测蛋白中的哪些肽具有结合至给定的MHC分子的潜力的能力具有很大的价值。之前已经描述了采用计算线程方法(computationalthreading approach)来识别潜在的T细胞表位的方法,以预测给定肽序列与MHC I类分子的结合(Altuvia等人(1995)J.Mol.Biol.249:244-250)。这种方法也可以用来识别在本发明突变蛋白中的潜在T细胞表位,以及取决于其预期用途,基于其预测的免疫原性进行特定突变蛋白的选择。进一步可能的是,使已经预测包含T细胞表位的肽区域进行另外的诱变,以减少或消除这些T细胞表位以及因此使免疫原性最小化。已经描述了从基因工程抗体中去除两性表位(Mateo等人(2000)Hybridoma19(6):463-471),并且可以适于本发明的突变蛋白。由此获得的突变蛋白可以拥有最小化的免疫原性,这对于它们在治疗和诊断应用中的使用是理想的,所述应用比如下面描述的那些。
对于某些应用,使用本发明突变蛋白的缀合形式同样是有用的。因此,本发明还涉及缀合至化合物的脂质运载蛋白突变蛋白,所述化合物包括、但不限于有机分子、酶标记、有色标记、细胞抑制剂、毒素、可光活化的标记(其适用于光动力治疗)、荧光标记、放射性标记、显色标记、发光标记、金属络合物、金属如胶体金、半抗原、地高辛、生物素、化学治疗剂金属或化学治疗剂金属,仅列举几个有代表性的例子。所述突变蛋白也可缀合至有机药物分子。所述缀合可以使用本领域已知的任意传统耦合方法进行。
本文使用于非天然靶标的术语“有机分子”或“有机小分子”表示一种有机分子,其包含至少两个碳原子,但优选地不多于7或12个可选转的碳键,具有范围在100至2000道尔顿的分子量,优选地在100至1000道尔顿间,并且可选择地包含一个或两个金属原子。
一般来说,可以用任何适当的化学物质或酶标记本文描述的脂质运载蛋白突变蛋白,所述化学物质或酶直接或间接地生成在化学、物理、光学、或酶反应中可检测的化合物或信号。物理反应(同时为光学反应/标记物)的实例是照射时荧光的发射。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶是酶标记(同时为光学标记)的实例,其催化显色反应产物的形成。一般来说,通常用于抗体的所有标记(除了只能和免疫球蛋白Fc部分中的糖部分一起使用的那些)也可以用于缀合到本发明的突变蛋白。本发明的突变蛋白也可以和任何合适的治疗活性剂缀合,例如,用于将这种制剂靶向递送到给定细胞、组织或器官或用于细胞(例如肿瘤细胞)的选择性靶向,而不影响周围的正常细胞。这种治疗活性剂的实例包括放射性核素、毒素、有机小分子和治疗肽(如用作细胞表面受体的激动剂/拮抗剂的肽或竞争给定细胞靶标上的蛋白结合位点的肽)。合适的毒素的例子包括、但不限于百日咳毒素、白喉毒素、蓖麻毒素、皂草素、假单胞菌外毒素、卡里奇霉素或其衍生物、紫杉烷、美登素、tubulysin或尾海兔素类似物。所述尾海兔素类似物可以为auristatin E、monomethylauristatin E、auristatin PYE和auristatin PHE。细胞抑制剂的例子包括、但不限于顺铂、卡铂、奥沙利铂、五氟脲嘧啶、泰索帝(紫杉萜)、紫杉醇、蒽环霉素(阿霉素)、甲氨蝶呤、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、达卡巴嗪、环磷酰胺、依托泊苷、阿霉素、Camptotecine、Combretatastin A-4相关化合物、磺酰胺类、噁二唑啉、苯并[b]噻吩合成螺缩酮吡喃、单四氢呋喃化合物、curacin和curacin衍生物、甲氧雌二醇衍生物和亚叶酸。本发明的脂质运载蛋白突变蛋白也可以和治疗活性核酸缀合,所述核酸如反义核酸分子、小干扰RNA、微RNA或核酶。这样的缀合物可以通过本领域熟知的方法产生。
在一个实施方案中,本发明的突变蛋白也可以耦合到靶向特定的人体区域的靶向部分,以便将本发明的突变蛋白递送到体内期望区域或范围。其中可能需要这种修饰的一个实例为血脑屏障的穿过。为了穿过血脑屏障,本发明的突变蛋白可以耦合到促进通过这种屏障的主动转运的部分(参见GaIIlard PJ等人(2005)International CongressSeries.1277,185-198或GaIIlard PJ等人(2005)Expert Opin Drug Deliv.2(2),299-309)。这种化合物例如可以以商标2B-TransTM获得(to-BBB technologies BV,Leiden,NL)。其它可耦合至本发明突变蛋白的示例性靶标分子包括抗体、抗体片段或对期望靶标分子有亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白。靶向部分的靶标分子例如可以是细胞表面抗原。细胞表面抗原例如可以特异于细胞或组织类型,如,癌症细胞。这种细胞表面蛋白的示例性例子为HER-2或蛋白聚糖如NEU-2。
正如上文所说,本发明的突变蛋白在一些实施方式中可以缀合至延长所述突变蛋白血清半衰期的化合物(这一点也参见PCT公开文件WO2006/56464,其中参考对CTLA-4有结合亲和力的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的突变蛋白描述了这种缀合策略)。延长血清半衰期的化合物可以是聚亚烷基二醇分子,例如聚乙二醇(PEG)或其活化衍生物;羟乙基淀粉,脂肪酸分子,如棕榈酸(Vajo&Duckworth(2000)Pharmacol.Rev.52,1-9),免疫球蛋白的Fc部分,免疫球蛋白的CH3结构域,免疫球蛋白的CH4结构域,白蛋白或其片段,白蛋白结合肽,白蛋白结合蛋白质,转铁蛋白,或标签Pro-Ala-Ser,仅列几个例子。白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白、抗体、抗体片段(包括结构域抗体,例如参见美国专利6,696,245)、或对白蛋白具有结合活性的脂质运载蛋白突变蛋白。相应地,用于延长本发明脂质运载蛋白突变蛋白的半衰期的适合的缀合化合物包括白蛋白(Osborn等人(2002)J.Pharmacol.Exp.Ther.303,540-548),或白蛋白结合蛋白,例如细菌白蛋白结合结构域,例如一种链球菌蛋白G(,T.和Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods218,73-83)。可以用作缀合配偶体的白蛋白结合肽的其它实例例如具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的那些,其中Xaa1是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp;Xaa2是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys;Xaa3是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr;Xaa4是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr,如美国专利申请2003/0069395或Dennis等人(Dennis等人(2002)J.Biol.Chem.277,35035-35043)中所述。
在其它实施方案中,可以将白蛋白自身或白蛋白的生物活性片段用作本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的化合物,以延长所述突变蛋白的血清半衰期。术语“白蛋白”包括所有的哺乳动物白蛋白,例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。可以以重组方式生成白蛋白或其片段,如美国专利5,728,553或欧洲专利申请EP0330451和EP0361991中所述。用作蛋白稳定剂的重组人白蛋白()例如可以购自Novozymes DeltaLtd.(Nottingham,UK)。
如果白蛋白结合蛋白是抗体片段,则其可以是结构域抗体。设计结构域抗体(dAb)以允许精确控制生物物理特性和体内半衰期,以获得最佳安全性和有效产品特征。结构域抗体例如可从Domantis Ltd.(Cambridge,UK和MA,USA)商购获得。
将转铁蛋白用作延长本发明突变蛋白的血清半衰期的部分,可以以基因工程方式将所述突变蛋白融合至非糖基化的转铁蛋白的N或C端或二者。非糖基化的转铁蛋白的半衰期为14-17天,而转铁蛋白融合蛋白将类似地具有延长的半衰期。转铁蛋白载体还提供高的生物利用度、生物学分布和循环稳定性。此技术可从BioRexis(BioRexis PharmaceuticalCorporation,PA,USA)商购获得。用作蛋白质稳定剂的重组人转铁蛋白(DeltaFerrinTM)也可从Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)商购获得。
如果将免疫球蛋白的Fc部分用于延长本发明突变蛋白的血清半衰期的目的,可以使用可从Syntonix Pharmaceuticals,Inc(MA,USA)商购获得的SynFusionTM技术。使用此Fc-融合技术允许产生更长效作用的生物药剂,并且可以例如包含连接至抗体的Fc区域的两个拷贝的突变蛋白,以改善药代动力学、溶解性和生产效率。
又一个延长本发明突变蛋白的半衰期的选择是将长的非结构化的柔性富甘氨酸序列(例如具有约20至80个连续甘氨酸残基的多甘氨酸)融合至本发明的突变蛋白的N或C端。此方法例如公开于WO2007/038619,还被称为“rPEG”(重组PEG)。
如果聚亚烷基二醇用作延长突变蛋白半衰期的化合物,则聚亚烷基二醇可以是取代的或未取代的。它还可以是活化的聚亚烷基衍生物。适合的化合物的实例为聚乙二醇(PEG)分子,如描述于WO99/64016、美国专利6,177,074或涉及干扰素的美国专利6,403,564中,或者已针对其它蛋白质例如PEG-修饰的天冬酰胺酶、PEG-腺苷脱氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶所描述的(例如参见Fuertges等人(1990)“The Clinical Efficacy ofPoly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins”J.Control.Release11,139-148)。这种聚合物(优选聚乙二醇)的分子量可以在从约300到约70.000道尔顿范围内变化,包括,例如,聚乙二醇分子量为约10.000、约20.000,约30.000或约40.000道尔顿。此外,例如在美国专利6,500,930或6,620,413中的描述,碳水化合物低聚物和聚合物如淀粉或羟乙基淀粉(HES)可以缀合至本发明的突变蛋白,以延长血清半衰期。
在另一个实施方案中,为了提供用于将上述化合物之一缀合至本发明的突变蛋白的适合的氨基酸侧链,可以通过诱变引入人工氨基酸。通常,可以将此类人工氨基酸设计成更有反应性,因此促进与期望部分的缀合。可以经由人工tRNA引入的这样的人工氨基酸的一个实例是对乙酰基-苯丙氨酸。
对于本文公开的突变蛋白的若干应用,使用它们的融合蛋白形式可能是有益的。在一些实施方案中,本发明的突变蛋白在其N端和/或其C端融合至蛋白、蛋白结构域或肽例如信号序列和/或亲和标签。
对于制药应用,本发明的突变蛋白可以融合至延长突变蛋白体内血清半衰期的融合配偶体(同样参见PCT申请WO2006/56464,其中参考对CTLA-4有结合亲和力的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的突变蛋白描述了合适的融合配偶体)。类似上面描述的缀合化合物,融合配偶体可以是免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白质,仅列几个例子。同样,白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白或对白蛋白有结合活性的脂质运载蛋白突变蛋白。因此,用于延长本发明脂质运载蛋白突变蛋白半衰期的合适的融合配偶体包括白蛋白(上文的Osborn,B.L.等人(2002)J.Pharmacol.Exp.Ther.303,540-548),或白蛋白结合蛋白质,例如,细菌白蛋白结合结构域,例如链球菌蛋白G(和Skerra,A.(1998)J.Immunol.Methods218,73-83)。描述于上文的Dennis等人(2002)或美国专利申请2003/0069395的白蛋白结合肽也可以用作融合配偶体,其具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列,其中Xaa1是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp;Xaa2是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys;Xaa3是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr;Xaa4是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr。还可以使用白蛋白本身或白蛋白的生物活性片段作为本发明脂质运载蛋白突变蛋白的融合配偶体。术语“白蛋白”包括所有的哺乳动物白蛋白,例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠血清白蛋白。白蛋白或其片段的重组产生是本领域熟知的,例如描述于美国专利5,728,553、欧洲专利申请EP0330451或EP0361991中。
融合配偶体可以给本发明的脂质运载蛋白突变蛋白带来新的特性,如酶活性或其它分子的结合亲和力。合适的融合蛋白的实例有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶、蛋白质G的白蛋白结合结构域、蛋白质A、抗体片段、寡聚结构域、结合特异性相同或不同的脂质运载蛋白突变蛋白(这造成“duocalin”的形成,参见Schlehuber,S.和Skerra,A.(2001),Duocalins,engineered ligand-binding proteins with dualspecificity derived from the lipocalin fold(Biol.Chem.382,1335-1342)或毒素。
特别地,可以将本发明的脂质运载蛋白突变蛋白与单独的酶活性位点融合,以使得产生的融合蛋白的两个“部分”一起作用于给定治疗靶标。脂质运载蛋白突变蛋白的结合结构域连接到致病靶标,从而允许酶结构域阻止所述靶标的生物功能。
亲和标签如或II(Schmidt,T.G.M.等人(1996)J.Mol.Biol.255,753-766)、myc-标签、FLAG-标签、His6-标签或HA-标签或蛋白质如也允许易于检测和/或纯化重组蛋白的谷胱甘肽-S-转移酶,是优选的融合配偶体的其它实例。最后,具有显色或荧光性质的蛋白质如绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白质(YFP)也是本发明脂质运载蛋白突变蛋白的合适的融合配偶体。
本文使用的术语“融合蛋白”还包括包含信号序列的根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白。多肽N端的信号序列将这种多肽导向到特定的细胞隔室,例如大肠杆菌的周质或真核细胞的内质网。大量的信号序列是本领域已知的。用于将多肽分泌到大肠杆菌的周质的优选信号序列为OmpA-信号序列。
本发明还涉及核酸分子(DNA和RNA),其包括编码本文所述突变蛋白的核苷酸序列。因为遗传密码的简并性允许指定相同氨基酸的其它密码子替换某些密码子,因此本发明并不局限于编码本发明突变蛋白的特定核酸分子,而是涵盖包括编码功能性突变蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。
本申请中公开的核酸分子可以“可操作地连接”调节序列以允许该核酸分子的表达。
核酸分子,如DNA,如果它包括包含关于转录和/或翻译调节的信息的序列元件,并且这样的序列“可操作地连接”编码多肽的核苷酸序列的话,其被称为“能够表达核酸分子”或能够“允许核苷酸序列的表达”。可操作的连接是这样的连接:在所述连接中,调节序列元件和要表达的序列以使基因能够表达的方式相连接。基因表达需要的调控区域的确切性质可能在种类间变化,但一般来说这些区域包括启动子,在原核生物中,所述启动子既包含启动子本身(即指导转录启动的DNA元件),又包括当转录成RNA时发出翻译启动信号的DNA元件。这种启动子区域通常包括参与转录和翻译启动的5'非编码序列,如-35/-10盒以及原核生物中的Shine-Dalgarno元件或TATA盒、CAAT序列和真核生物中的5'-加帽元件。这些区域还可以包括增强子或阻遏元件以及翻译信号和用于将天然多肽靶向宿主细胞特定隔室的前导序列。
此外,3'非编码序列可以包含参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而,如果这些终止序列在特定的宿主细胞内没有令人满意的功能,那么它们可能被该细胞中有功能的信号替换。
因此,本发明的核酸分子可以包括调节序列,优选地启动子序列。在另一个优选的实施方案中,本发明的核酸分子包括启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子,例如,tet启动子,lacUV5启动子或T7启动子。可用于在真核细胞中表达的启动子的实例有SV40启动子或CMV启动子。
本发明的核酸分子也可以是载体的一部分或任何其它类型的克隆载体,如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人工染色体。
编码本发明脂质运载蛋白突变蛋白的DNA分子,尤其包含这种脂质运载蛋白突变蛋白的编码序列的克隆载体可以转化进入能够表达该基因的宿主细胞。可以使用标准技术进行转化(上文的Sambrook,等人(1989))。
因此,本发明还涉及包含本文披露的核酸分子的宿主细胞。
本发明还涉及用于产生本发明突变蛋白的方法,其中所述突变蛋白、突变蛋白的片段或突变蛋白和另一多肽的融合蛋白通过基因工程方法的方式从编码所述突变蛋白的核酸开始而产生。所述方法可以在体内进行,例如,所述突变蛋白可以在细菌或真核宿主生物体内产生并且从此宿主生物体或其培养物中富集、纯化或分离。在体外产生蛋白也是可能的,例如通过使用体外翻译系统。术语“富集”表示,所述突变蛋白或其功能片段占目标样品或溶液中存在的总蛋白的部分显著高于在其所提取自的样品或溶液中。例如富集可包括从细胞提取物中分离某一部分。这可以通过标准技术获得,如离心。其它富集方式的例子为过滤或透析,例如其可以是针对去除低于某分子量的不期望分子,或使用有机溶剂或硫酸铵沉淀。例如,纯化可包括色谱技术,例如凝胶过滤、离子交换色谱、亲和纯化、疏水相互作用色谱法或疏水电荷感应色谱法。纯化的另一个例子为电泳技术,如制备毛细管电泳。分离可包括类似方法的组合。文中使用的“基本上纯的”或“基本上纯化的”表示为存在的主要物质的化合物或物质(即,基于摩尔,它比组合物中任何其它个体物质更丰富)。在一些实施方案中,基本上纯的组合物是这样的组合物:在该组合物中,所述物质包括存在的全部分子的或者全部大分子(如适用)的物质的至少约50%(基于摩尔)。在某些实施方案中,基本上纯的组合物将具有组合物中存在的全部分子的或者全部大分子(如适用)的物质的超过约80%、约85%、约90%、约95%或约99%。
当在体内产生所述突变蛋白时,通过重组DNA技术将编码本发明突变蛋白的核酸引入适合的细菌或真菌宿主生物体(如上文已经概括的)。为了这个目的,首先采用建立的标准方法(上文的Sambrook,J.等人(1989))用包含编码本发明突变蛋白的核酸分子的克隆载体转化宿主细胞。所述宿主细胞然后在允许表达异源DNA以及从而合成相应多肽的条件下培养。随后,所述多肽从细胞或从培养介质中回收。
一方面,本发明涉及用于生成结合铁调素的突变蛋白的方法,包括:
使编码脂质运载蛋白的核酸分子进行诱变,从而生成一个或多个突变蛋白核酸分子。
所述方法可以进一步包括:
在适合的表达系统中表达获得的一个或多个突变蛋白核酸分子,
使多个突变蛋白至少与铁调素的片段或成熟形式接触,和
通过选择和/或分离的方式,富集一个或多个对给定靶标具有可检测结合亲和力的突变蛋白。
本文使用的术语“诱变”系指,选择实验条件,以使得在脂质运载蛋白包括Lcn2(hNGAL;Swiss-Prot数据库条目P80188)给定序列位置处天然存在的氨基酸可以被至少一个不存在于各天然多肽序列中的此特定位置处的氨基酸替换。术语“诱变”还包括通过缺失或插入一个或多个氨基酸进行的序列区段长度的(额外的)修饰。因此,以下在本发明的范围内:例如,一个在选定序列位置处的氨基酸被三个随机突变区段替代,从而相比于野生型蛋白各区段的长度,导致两个氨基酸残基的插入。这样的缺失或插入可以彼此独立地引入到在本发明中可以进行诱变的任何肽区段中。在本发明的一个示例性实施方式中,几个突变的插入可以引入到选定的脂质运载蛋白支架的AB环中(参见以全文引用并入本文的国际专利申请WO2005/019256)。术语“随机诱变”指,无预定的单个氨基酸(突变)存在于某个序列位置处,而是至少两个氨基酸可以在诱变期间以某概率掺入在预限定的序列位置处。
在一个非限制性方法中,人脂质运载蛋白2的编码序列可以用作在本发明中选择的肽区段的诱变的起始点。对于列举的氨基酸位置的诱变,本领域技术人员具有多种建立的标准方法以进行定点诱变(上文的Sambrook,J.等人(1989))。一个常用的技术是通过使用合成寡核苷酸混合物进行PCR(聚合酶链反应)来引入突变,所述合成寡核苷酸在所需的序列位置处带有简并碱基组成。其它相似技术为本领域技术人员熟知。
上面定义的核酸分子可以通过与编码脂质运载蛋白多肽和/或载体的核酸的缺失5'-和3'-序列连接来进行连接,并且可以被克隆到已知宿主生物体中。众多的已建立实验程序可供连接和克隆(上文的Sambrook,J.等人(1989))。例如,同样存在于克隆载体序列中用于限制性内切酶的识别序列可以被工程化到合成寡核苷酸的序列中。因此,在扩增各自的PCR产物和酶切割之后,可以使用相应的识别序列容易地克隆所得片段。
在编码选定用于诱变的蛋白的基因内的较长序列区段还可以通过已知方法进行随机诱变,例如通过利用在增加错误率的条件下的聚合酶链反应、通过化学诱变或通过使用细菌突变菌株。这些方法还可以用于进一步优化靶标亲和力或脂质运载蛋白突变蛋白的特异性。可能发生于实验性诱变区段之外的突变通常是可以接受的或者甚至可以证明是有利的,例如如果它们有助于改进折叠效率或脂质运载蛋白突变蛋白的折叠稳定性。
在进一步的实施方案中,所述方法包括使核酸分子在编码对应于脂质运载蛋白(或例如,人脂质运载蛋白2)线性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和/或138的序列位置的至少任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个处的核苷酸三联体处进行诱变。这种核酸可进行诱突,并且通过使用重组DNA技术引入到合适的细菌或真菌宿主生物体中。获得脂质运载蛋白的核酸文库可以使用本领域已知的用于产生具有抗体样性质的突变蛋白(即与给定靶标有亲和力的突变蛋白)的任何适合的技术来进行。这种组合方法的实例在国际专利申请例如WO99/16873、WO00/75308、WO03/029471、WO03/029462、WO03/029463、WO2005/019254、WO2005/019255、WO2005/019256或WO2006/56464中有详细描述。这些专利申请中的每一个的内容均以全文引用的方式并入本文。在适当宿主中表达进行诱变的氨基酸序列后,可以从获得的文库中选择携带多个各脂质运载蛋白突变蛋白的遗传信息的克隆,所述脂质运载蛋白突变蛋白结合给定靶标。可以使用熟知的技术来筛选这些克隆,比如噬菌体展示(上文的Kay,B.K.等人(1996);上文的Lowman,H.B.(1997)或上文的Rodi,D.J.和Makowski,L.(1999)的综述)、菌落筛选(Pini,A.等人(2002)Comb.Chem.High ThroughputScreen.5,503-510中的综述)、核糖体展示(Amstutz,P.等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12,400-405中的综述)或如在WIIson,D.S.等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98,3750-3755中报道的mRNA展示,或在WO99/16873、WO00/75308、WO03/029471、WO03/029462、WO03/029463、WO2005/019254、WO2005/019255、WO2005/019256、或WO2006/56464中具体描述的方法。
根据此公开内容,上述方法的另一个实施方案包括:
(i)例如提供铁调素的至少一个片段作为给定靶标/配体,
使多个突变蛋白与所述靶标/配体接触以允许在所述配体和对所述靶标/配体有结合亲和力的突变蛋白之间形成复合物,和
去除没有结合亲和力或没有显著结合亲和力的突变蛋白。
在本发明方法的一个实施方案中,结合亲和力的筛选在竞争条件下进行。本文使用的竞争条件是指突变蛋白的筛选,其包含至少一个步骤,在该步骤中使所述突变蛋白和所述铁调素的片段或成熟铁调素如铁调素-25(靶标)在其它配体的存在下接触,所述其它配体与该突变蛋白竞争对靶标(铁调素)的结合。这种其它的靶标可以是铁调素的另一形式,例如铁调素-20(在被选定的突变蛋白选择性地结合铁调素-25或甚至铁调素-25的五个N端残基(正如前面指出的,目前认定铁调节的生物活性几乎完全归因于25个氨基酸形式的铁调素-25,这表明五个N端氨基酸对这种活性是至关重要的,上文的Kenma等人)的情况下),过量的靶标自身或铁调素的任意其它非生理配体将至少一个重叠表位结合至本发明突变蛋白识别的表位并且因此干扰突变蛋白的靶标(铁调素)结合。或者,其它的配体通过别构效应将不同于突变蛋白结合位点的表位络合至所述靶标,从而竞争该突变蛋白的结合。因此,任何片段、前体或铁调素的成熟形式可以用于本发明突变蛋白的产生中。
本发明方法的进一步实施方案涉及将编码多个本发明突变蛋白并且由在3’端处诱变得到的核酸与编码M13家族的纤维状噬菌体的衣壳蛋白pIII或这种衣壳蛋白的片段的基因可操作地融合,以便筛选至少一种用来结合给定配体的突变蛋白。
融合蛋白可以包括其它成分,比如亲和标签,它允许融合蛋白或其部分的固定、检测和/或纯化。此外,终止密码子可以位于编码脂质运载蛋白或其突变蛋白的序列区域和噬菌体衣壳基因或其片段之间,其中所述终止密码子,优选琥珀终止密码子,在合适的抑制菌株中在翻译过程中至少部分地翻译成氨基酸。
例如,这里描述的噬菌粒载体pTLPC27,现在也称为pTlc27,可用于制备编码本发明突变蛋白的噬菌粒文库。编码本发明突变蛋白的本发明的核酸分子可以用两个BstXI限制性位点插入到载体中。在连接后,用所得的核酸混合物转化合适的宿主菌株,如大肠杆菌XL1-Blue,以产生大量的独立克隆。如果需要,可以产生各自的载体以用于制备超级噬菌粒(hyperphagemid)文库。
一旦与给定靶标具有亲和力的突变蛋白被筛选出来,另外还可以使这种突变蛋白进行另一诱突,以便随后筛选具有甚至更高亲和力的变体或具有改善的特性的变体,如更高的热稳定性、改善的血清稳定性、热力学稳定性、改善的溶解度、改善的单体行为、对热变性、化学变性、蛋白质水解或洗涤剂的改善的抗性等等。此进一步诱变,在针对更高亲和力可视为体外“亲和力成熟”的条件下,可以通过基于合理设计或随机突变的位点特异性突变来获得。另一个可行的用于获得更高亲和力或改善的特性的方法是使用易错PCR,它导致在脂质运载蛋白突变蛋白序列位置的所选范围内的点突变。易错PCR可以根据任何已知操作程序进行,如一个由Zaccolo等人(1996)J.Mol.Biol.255,589-603描述的操作程序。适合于这种目的的其它随机诱变方法包括由Murakami等人(2002)Nat.Biotechnol.20,76-81描述的随机插入/缺失(RID)诱变,或由Bittker等人(2002)Nat.Biotechnol.20,1024-1029描述的非同源随机重组(NRR)。如果需要,也可以根据WO00/75308或Schlehuber 等人(2000)J.Mol.Biol.297,1105-1120中描述的过程进行亲和力成熟,在该文献中获得了对地高辛具有高亲和力的胆汁三烯结合蛋白的突变蛋白。提高亲和力的另一个方法为进行位置饱和诱变。在这种方法中可以产生“小”核酸库,其中仅仅在四个环区段中任一个内的单一位置处引入氨基酸交换/突变。这些库随后直接进行筛选步骤(亲和力筛选),不进行其它轮的淘选。这种方法允许有助于提高期望靶标结合的残基的识别以及允许对结合重要的“热点”的识别。
在一个实施方案中,用于修饰突变蛋白的上述方法进一步包括在对应于人脂质运载蛋白2野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的任何序列位置的至少一个处引入Cys残基以及经由在对应于hNGAL野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的任何序列位置的至少一个处引入的Cys残基的硫醇基团耦合能够改变所述突变蛋白血清半衰期的部分。所述能够改变所述突变蛋白血清半衰期的部分可以选自聚亚烷基二醇分子和羟乙基淀粉。
在本发明的蛋白为本发明的人脂质运载蛋白2突变蛋白的情况下,可以去除在Cys76和Cys175之间天然存在的二硫键。因此,这种突变蛋白(或任何其它的不包括分子内二硫键的人脂质运载蛋白2突变蛋白)可以在具有氧化还原环境的细胞隔室中产生,所述细胞隔室例如革兰氏阴性细菌的细胞质。
在本发明的脂质运载蛋白突变蛋白包括分子内二硫键的情况下,可优选地用适当的信号序列将原初多肽导向到具有氧化还原环境的细胞隔室。这种氧化环境可以由革兰氏阴性细菌如大肠杆菌的周质提供,在革兰氏阳性细菌的细胞外环境中或在真核细胞内质网的内腔中,并且通常有利于结构性二硫键的形成。
然而,也可以在宿主细胞优选大肠杆菌的胞溶胶中产生本发明的突变蛋白。在这种情况下,所述多肽可以以可溶性和折叠状态直接获得或以包涵体的形式回收,然后在体外复性。其它选择是使用具有氧化的细胞内环境的特定宿主菌株,其可以因此允许在胞溶胶中形成二硫键(Venturi等人(2002)J.Mol.Biol.315,1-8)。
然而,本发明的突变蛋白不一定仅通过使用基因工程生成或产生。相反,脂质运载蛋白突变蛋白也可以通过化学合成如梅利菲尔德固相多肽合成或通过体外转录和翻译获得。例如可行的是,使用分子建模鉴定有希望的突变,然后在体外合成想要的(设计的)多肽并且检测对给定靶标的结合活性。用于蛋白固相和/或液相合成的方法是本领域熟知的(例如,Lloyd-Williams等人(1997)Chemical Approaches to the Synthesis of Peptidesand Proteins.CRC Press,Boca Raton,Fields,GB和Colowick(1997)Solid-PhasePeptide Synthesis.Academic Press,San Diego或Bruckdorfer等人(2004)Curr.Pharm.Biotechnol.5,29-43中的综述)。
在另一个实施方式中,本发明的突变蛋白可以通过采用本领域技术人员已知的已建立方法的体外转录/翻译产生。
本发明还涉及到一种药物组合物,其包括至少一种在权利要求书中提及的本发明的突变蛋白或其融合蛋白或缀合物以及任选的药学上可接受的赋形剂。
可以经由对蛋白质性药物治疗上有效的肠胃外或非肠胃外(例如,肠)途径施用根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白。
因此,本发明的突变蛋白可以使用药学上可接受的成分以及已建立的制备方法配制成组合物(Gennaro和Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice ofPharmacy,20th Ed.,Lippincott WIIliams&WIIkins,PhIIadelphia,PA)。为了制备药学组合物,可以使用药学惰性的无机或有机赋形剂。
本发明的蛋白还可以用于将化合物靶向至预选位点。在一个这样的实施方案中,本发明的蛋白用于将药学活性化合物靶向至生物体或组织内的预选位点,包括:
a)将所述蛋白与所述化合物缀合,和
b)将所述蛋白/化合物复合物递送至所述预选位点。
对于这样的目的,使突变蛋白和目标化合物接触,以允许复合物形成。然后包括所述突变蛋白和目标化合物的复合物被递送到预选位点。例如,这可以通过将所述突变蛋白耦合至靶标部分实现,所述靶标部分如抗体、抗体片段或脂质运载蛋白突变蛋白或对选定靶标有结合亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白片段。
这种用途尤其适合、但不限于,将药物(选择性地)递送到生物体内的预选位点,例如认为要用所述药物治疗的被感染的身体部位、组织或器官。除了在突变蛋白和目标化合物之间形成复合物之外,所述突变蛋白还可以和给定的化合物反应,从而产生突变蛋白和化合物的缀合物。类似于上面的复合物,这种缀合物可以适合于将化合物递送到预选靶标位点。这种突变蛋白和化合物的缀合物还可以包括将突变蛋白和化合物彼此共价连接的连接物。任选地,这种连接物在血流中是稳定的,但在细胞环境中是可切割的。
本文公开的突变蛋白及其衍生物可以因此类似于抗体或其片段用在许多领域。除了它们结合至支持物(允许给定突变蛋白或缀合物的靶标或者这种靶标的融合蛋白固定或分离)的用途外,突变蛋白可以和酶、抗体、放射性物质或具有生化活性或确定的结合特性的任何其它基团一起用于标记。通过这样做,它们各自的靶标或其缀合物或融合蛋白可以被检测出或与它们接触。例如,本发明的突变蛋白可以通过已建立的分析方法(如ELISA或蛋白质印迹)或者通过显微镜或免疫感知(immunosensorics)用来检测化学结构。在这里,检测信号可以通过使用合适的突变蛋白缀合物或融合蛋白直接生成或通过免疫化学检测经由抗体的结合突变蛋白间接地生成。
本发明突变蛋白的众多可能的应用也存在于医药中。除了它们在诊断和药物递送中的用途,可以生成本发明的结合例如组织或肿瘤特异性细胞表面分子的突变多肽。这种突变蛋白可以,例如,以缀合形式使用或用作用于“肿瘤成像”的融合蛋白或直接用于癌症治疗。
在进一步的方面,本发明还包含根据本发明的突变蛋白用于制备药物组合物的用途。由此获得的药物组合物可以适于降低铁调素的水平。所述药物组合物可以用作单一疗法或联合疗法。因此,本发明还涉及上文定义的突变蛋白用于治疗与铁调素水平改变(例如增加或减少)相关的疾病或障碍。
铁调素相关疾病
贫血是一种与血清铁损耗相关的疾病,其导致血液参数如红细胞(RBC)计数、血细胞比容(Ht)、血红蛋白(Hb)、血清铁水平和转铁蛋白(Tf)饱和降低。这导致血液中氧含量减少,并且与描述为虚弱、精力不集中、气短、呼吸困难的生活质量下降相关。严重的贫血会导致心跳加快、心脏扩大和心力衰竭。贫血往往伴有慢性肾脏疾病/建立性慢性肾脏疾病(CKD)、癌症贫血(AC)、化疗所致贫血(CIA)和慢性疾病贫血(ACD)。
贫血的有效管理对生活质量产生重大影响,可影响患者的生存。生活质量的下降可以用虚弱、疲劳、精力不集中、气短乃至呼吸困难来描述。严重贫血伴随着心率加快,并可导致心脏扩大和心脏衰竭。
标准的治疗护理是输血以及施用ESA和铁。然而,因为标准治疗方法与以下缺点或潜在缺陷相关,需要新的治疗方法。输血具有溶血、感染和由于血型不相容导致的过敏反应的风险。铁疗法在长期治疗中会导致铁过载,不建议用于治疗炎症性贫血,原因为铁有助于炎症响应(如炎性关节疾病)。对于ESA而言,约40-50%的贫血患者为ESA非应答者,没有或仅在高剂量ESA治疗后具有延迟的Hb应答,这与安全问题如更难生存和癌症患者中缩短进程的自由生存时间相关。
缺铁性贫血是一种铁动态平衡障碍,其与炎症疾病相关贫血相比,容易通过铁施用治愈。铁调素是允许区分这两种障碍的参数,因为铁调素水平仅与炎症关联地上升。
伴随慢性炎性疾病如慢性感染、风湿病和系统性自身免疫障碍和炎性肠病的贫血称为炎症性贫血(AI)或慢性疾病贫血(ACD)。炎性细胞因子IL-6诱导铁调素表达,作为炎性反应的一部分,从而导致缺铁引起的贫血及对ESA的应答迟钝。
具有建立性慢性肾脏疾病(慢性肾功能衰竭(CRF))的患者发展为尿毒症贫血,一种最明显的疾病征兆。这种症状由促红细胞生成素(EPO)的肾脏产生受阻引起。EPO通过促进控制骨髓中红系祖细胞生存、增殖和分化来控制红细胞(RBC)的产生。慢性肾功能衰竭(CRF)中贫血的有效管理对生活质量有重大影响,并且可影响生存。补充重组人促红细胞生成素(rhEPO)是目前对于那些贫血患者的标准治疗。临床试验中已经观察到CRF患者对各种ESA(红细胞生成刺激剂)有70-90%的应答率。仅在具有另外的炎性疾病的患者中,铁调素在与CKD相关的贫血中发挥突出作用。
贫血常见于癌症患者中,并且具有多因素病因学。其可能与肿瘤本身及其程度以及类型、持续时间和骨髓抑制化学疗法的强度有关。此外,大多数癌症患者已显示具有对于他们的贫血程度不适当的低水平的循环EPO,反映了此动态平衡机制的改变。在某些癌症类型中,严重到足以导致输血的贫血发病率可高达60%。患有癌症的贫血患者可能经受如乏力、头晕、气短的症状和心血管症状如心悸和心脏衰竭。这种临床后遗症可能会降低这些患者的生活质量。此外,最近讨论了在贫血纠正和接受化疗的病人存活率上升之间潜在的联系。目前,癌症患者的贫血治疗选择为RBC输注或ESA’s。RBC输注可以与非溶血性和溶血性输血反应、大量输血患者铁过载、或传染病的传播相关。在输血治疗中安全及筛查需求增加了输血治疗的物流和成本,因此将输血限于严重和/或症状性贫血的病例。在以当前的政策仍未严重到足以接受输血的症状性贫血治疗中,ESA’s提供了输血的另一种选择。然而,已经建立对ESA’s明显的剂量反应关系,40%至50%的患者完全没有显示出Hb应答或延迟应答。在过去几年间,已经出现关于ESA影响癌症患者的生存以及他们的血栓栓塞风险可能性增加的重大关注(2007年3月,FDA创立了关于ESA与癌症诱发和血栓栓塞事件的可能关联性的黑盒预警)。有增加的文献证据表明,不仅通过ESA治疗4周内没有Hb应答增加,还通过铁调素水平提高(认为是炎性反应的一部分),预测到癌症患者的ESA抗性。
如上所述,铁调素是铁动态平衡的核心负调节器。铁调素的生成随铁过载和炎症而增加,在低铁条件和低氧下减少。铁调素通过与唯一已知的哺乳动物细胞铁输出物(膜铁转运蛋白)结合发挥作用,并且诱导其内化和降解。因为膜铁转运蛋白在十二指肠的肠细胞、脾脏和肝脏中表达,铁调素的增加,以及随后膜铁转运蛋白的减少,导致十二指肠铁吸收的抑制、循环铁从巨噬细胞的释放和肝脏中铁储存的动员。铁调素被认为在炎性疾病相关性贫血的形成中发挥关键作用。急性或慢性炎性病症导致铁调素表达上调,造成缺铁,其可以引起炎性疾病相关性贫血(ACD)、癌症(AC,CIA)和慢性肾脏疾病(CKD)(CKD贫血)。
根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可以用作铁调素的拮抗剂(上文)。在这方面,根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白,通常为分离的脂质运载蛋白突变蛋白,可以用于治疗,如人治疗。各自的突变蛋白能够通常以高亲和力与铁调素形成复合物,例如,人铁调素。因此脂质运载蛋白突变蛋白通常阻碍与铁调素受体膜铁转运蛋白相互作用。结果膜铁转运蛋白的内化和降解受到抑制。因此,所述脂质运载蛋白突变蛋白通过允许储存铁的动员和改善的肠铁吸收而支持红细胞生成。根据本发明的需要应用铁调素相应拮抗剂的受试者的示例性例子为对ESA治疗反应低的受试者(约40-50%的患者),其认为是由于铁调素上调导致用于血红蛋白合成的可用的铁减少引起的。术语“受试者”是指脊椎动物,包括哺乳动物,尤其是人(在这种情况下,也可以使用术语“患者”)。在一些实施方案中,受试者可发生障碍,其将受益于铁调素如铁调素-25水平的降低,铁调素生物活性(例如,铁调素-25的生物活性)的降低,和/或血清中铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的增加。
根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可以用于增加体液如血清中铁水平。其还可以用于增加受试者例如人的网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容。包含本发明脂质运载蛋白突变蛋白的药物组合物可以用于这方面。
本发明的另一方面涉及一种治疗受试者的方法,所述受试者患有与铁调素水平改变如铁调素水平增加或减少相关的疾病或障碍。相应疾病或障碍可包括引起铁缺乏或过载的遗传或非遗传疾病/障碍。疾病状态或障碍可包括感染性疾病,包括如细菌、真菌、酵母或病毒。如上面已经解释的,在一些实施方案中,所述疾病或障碍是贫血,包括、但不限于,感染、炎症、慢性疾病、和/或癌症造成的贫血。在一些实施方案中,其可包括炎性疾病如关节炎和某些癌症类型、肝脏疾病或血液疾病。在一些实施方案中,与铁调素水平增加相关的疾病为贫血或慢性肾脏疾病或与慢性肾脏疾病相关的贫血。如上面已经解释的,这种方法涉及给有此需要的受试者施用本发明的相应突变蛋白质或包含本发明突变蛋白的药物组合物。
例如,本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可以用于治疗具有提高水平的铁调素、铁调素相关障碍、铁动态平衡障碍、贫血或与提高水平铁调素相关的炎性病症的受试者。例如,所述受试者可为患有以下疾病的哺乳动物,如人:非洲铁过载,α地中海贫血,阿尔兹海默氏病,贫血,癌症性贫血,慢性疾病贫血,炎症性贫血,动脉硬化或动脉粥样硬化(包括冠状动脉疾病,脑血管疾病或外围闭塞性动脉疾病),共济失调,铁关联共济失调,转铁蛋白缺乏症,癌症,血浆铜蓝蛋白缺乏,化学治疗诱导贫血,慢性肾/肾脏疾病(尤其是与慢性肾脏疾病相关的贫血),包括晚期肾疾病或慢性肾/肾功能衰竭,肝硬化,血色沉着病,胶原诱导性关节炎(CIA),涉及铁调素过量(提高的铁调素)的病症,先天性异常红血球生成贫血,充血性心力衰竭,克罗恩氏病,糖尿病,铁生物分布障碍,铁动态平衡障碍,铁代谢障碍,膜铁转运蛋白疾病,膜铁转运蛋白突变血色素沉着症,叶酸缺乏,弗里德利希共济失调,缆索骨髓组织病,纤弱综合征,细菌感染如H.pyelori感染,Hallervordan Spatz疾病,血色沉着病,转铁蛋白受体2内突变造成的血色沉着病,血红蛋白病,肝炎,肝炎(Brock),丙型肝炎,肝细胞癌,遗传性血色沉着病,病毒性感染如HIV,亨廷顿氏舞蹈病,高铁蛋白血症,底色小红细胞性贫血,血铁过少,胰岛素耐受性,缺铁性贫血,缺铁性障碍,铁过载障碍,铁调素过量的铁缺乏病症,少年血色素沉着症(HFE2),多发性硬化,铁代谢中涉及的基因突变(所述基因例如表达本文涉及的蛋白,如转铁蛋白受体2、HFE、铁调素调节蛋白或膜铁转运蛋白),新生儿血色沉着病,铁相关的神经退行性疾病,骨质缺乏,骨质疏松胰腺炎,泛酸酯激酶相关神经退行性变,帕金森氏病,糙皮病,异食癖,卟啉症,迟发性皮肤卟啉病,假脑炎,肺含铁血黄素沉着症,血红细胞障碍,风湿性关节炎,败血症,继发性贫血,系统性红斑狼疮,地中海贫血,中间型地中海贫血,输血性铁过载,肿瘤,血管炎,维生素B6缺乏,维生素B12缺乏,威尔逊氏病,或与铁调素水平提高相关的炎性病症。
作为进一步的示例性例子,根据本发明的突变蛋白在一些实施方案中可以用于与促红细胞生成素结合。患有癌症(AC)和慢性疾病贫血(ACD)的贫血病患者与高浓度铁调素(约30nmol/L)相关,导致血清铁缺乏,从而降低红细胞生成。已报道血清中基线铁调素浓度低于13nmol/L的受试者比浓度大于13nmol/L的受试者对促红细胞生成素(EPO)治疗显示出更好的应答。因此,用铁调素拮抗剂治疗贫血癌症患者可以提高他们对促红细胞生成素的应答。
另外,贫血症受试者中的一个普遍的现象是抗重组促红细胞生成素(rhEPO),这是可以通过用根据本发明的突变蛋白的组合治疗克服的治疗问题。铁调素很可能在此rhEPO抗性中发挥重要作用。Sasu等人(Blood(2010)115,17,3616–3624)已经示出了在小鼠体内铁调素水平增加和促红细胞生成素刺激剂抗性之间显著的关联。他们还能够通过施用铁调素特异性抗体恢复ESA响应能力。
另一方面,本发明涉及根据本发明的突变蛋白在诊断中的用途。根据本发明的突变蛋白通常用于与铁调素水平改变相关的疾病或障碍的诊断以及各自的诊断方法。在一些实施方案中,所述用途涉及评价受试者体液中的铁调素水平。为了这个目的,从各受试者取得体液。铁调素水平可以与已知包括正常水平铁调素的对照样品相对比。因此可以确定是否有非生理学水平的铁调素存在于受试者体内。
因此,本发明还涉及上文定义的突变蛋白用于诊断与铁调素水平变化(如增加或减少)相关的疾病或障碍。在一些实施方案中,所述疾病为贫血症,包括、但不限于,由感染、炎症、慢性疾病和/或癌症造成的贫血。所述疾病或障碍可以例如与铁调素水平减少相关,例如遗传性血色沉着病、铁加载贫血或丙型肝炎。所述疾病或障碍还可以与铁调素水平增加相关,例如,炎症性贫血、铁缺乏性贫血(iron-refractory iron deficiency anemia)或慢性肾脏疾病。例如,丙型肝炎通常涉及肝铁过载,一般经由铁调素合成抑制导致。在诊断情况下,根据本发明的突变蛋白可以用于评估受试者体液中铁调素的水平。因为已经观察到具有低铁调素浓度(<13nmol/L)的贫血性癌症患者比具有高铁调素浓度(>13nmol/L)的患者对促红细胞生成素治疗显示出更好的响应,铁调素血清浓度例如可以用于预测对依泊艾汀治疗的响应(约50%的患者抗EPO)。
仍然在另一方面,本发明的特征为包含根据本发明突变蛋白的诊断或分析试剂盒。
有此治疗需要的受试者可以是哺乳动物,例如人、狗、小鼠、大鼠、猪、猿如猕猴(cynomolgous monkey),仅举出几个示例性例子。
仍然在另一方面,本发明的特征为一种用于受试者体内成像的方法,包括给所述受试者施用本发明的突变蛋白或包含本发明突变蛋白的药物组合物。所述受试者可以是如上文所定义的。
通过以下非限制性实施例和附图进一步阐明本发明。
除非另有说明,例如,按Sambrook等人(上文)描述使用的重组基因技术的已建立方法。
实施例1:突变体Lcn2噬菌体展示文库的构建
Lcn2变体的组合文库产生于克隆的cDNA基础上(Breustedt等人(2006)Biochim.Biophys.Acta1764,161-173),其携带氨基酸替换Cys87Ser,以移除单一不成对的硫醇侧链(Goetz等人(2000)Biochemistry39,1935-1941),以及Gln28His以引入第二个BstXI限制性位点。诱变和聚合酶链反应(PCR)组装此区域基本上按照出版的策略进行(Beste等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96,1898-1903;Skerra(2001)J.Biotechnol.74,257-275),这一次使用如图1描述的采用寡脱氧核苷酸(SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:25的序列)的一锅式扩增反应。设计寡脱氧核苷酸,以使得具有SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:19的序列的引物对应于编码链并且分别在氨基酸位置36、40、41、49、52或68、70、72、73、77、79、81或96、100、103、106或125、127、132、134处携带简并密码子,而具有SEQID NO:20至SEQ ID NO:23的序列的引物对应于非编码链并且不携带简并密码子或反密码子。具有SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的两个侧翼引物过量使用,并且用于组装的随机化基因片段的扩增。如(Schlehuber等人(2000)J.Mol.Biol.297,1105-1120)描述的,采用Go-Taq热启动DNA聚合酶(Promega,Mannheim,Germany)进行所有的PCR步骤。
不携带简并密码子的寡脱氧核苷酸以HPLC等级购自Metabion(Munich,Germany)。包含NNK的寡脱氧核苷酸以脱盐形式购自同一供应物并进一步提供尿素PAGE纯化。用BstXI(Promega,Mannheim,Germany)切割产生的DNA文库,并克隆于噬菌粒载体phNGAL102(SEQIDNO:26)上,该载体基于通用表达载体pASK111(Vogt和Skerra(2001)J.Mol.Recognit.14(1),79-86),并且编码由OmpA信号肽、修饰的成熟Lcn2、接下来的琥珀密码子以及丝状噬菌体M13的基因III衣壳蛋白的C端片段组成的融合蛋白,即类似于前面描述的胆汁三烯结合蛋白(上文的Beste等人;上文的Skerra)。施用8.4μg经消化的PCR产物和94μg经消化的质粒DNA的连接混合物电穿孔大肠杆菌XL1-Blue(Bullock等人(1987)Biotechniques5,376-378)后,得到1x1010个转化子。
或者,从Sloning BioTechnology GmbH(Puchheim,Germany)获得图2中描述的克隆的合成Lcn2随机文库。用合适的引物(SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25)经由PCR以20个循环扩增两侧有两个BstXI限制性位点的中央基因盒,然后亚克隆在phNGAL108(SEQ ID NO:27)上,该载体基于通用表达载体pASK75(Skerra(1994)Gene151,131-135)并且基本上携带与phNGAL102(SEQ ID NO:26)相同的组件,但介导氨苄青霉素抗性而不是氯霉素抗性,同样,产生复杂性对应于1,7x1010独立转化子的文库。
对于两个Lcn2文库,同样地进行以下产生文库的步骤。取100ml培养液,其包含用基于phNGAL102或phNGAL108的噬菌粒载体转化的细胞,所述噬菌粒载体分别编码脂质运载蛋白突变蛋白如噬菌体pIII融合蛋白的文库,将该100ml培养液转移至无菌锥形烧瓶,然后在37°C、160rpm下在没有抗生素选择压力的2YT培养基中孵育一小时。在用VCS-M13辅助噬菌体感染前,将培养液在2YT培养基中稀释至OD550为0.1,其中添加相应抗生素,并且进一步在相同条件下培养直至OD550达到0.6。在用VCS-M13辅助噬菌体(AglientTechnologies,La Jolla,USA)以约10的感染复数感染后,将培养液在37℃、100rpm下再振摇30分钟。然后,将孵育箱的温度降至26°C并且振摇速度又提高到160转/分,10分钟后添加卡那霉素(70μg/ml),再经由添加25μg/l(在每升培养物中加入125μl的在二甲基甲酰胺DMF中的200μg/ml母液)添加无水四环素(ACROS Organics,Geel,Belgium)诱导基因表达。在26℃、160rpm下继续孵化12-15h。
通过离心(30min,18000g,4°C)沉淀来自整个培养液的细胞。无菌过滤(0.45μm)包含噬菌粒的上清液,与1/4体积的20%w/v PEG8000、15%w/vNaCl混合,然后在冰上孵育至少2h。在离心(30min,18000g,4°C)后,将来自1升培养液的沉淀的噬菌粒溶解于30ml包含有50mM苯甲脒(Sigma)和Pefabloc1μg/ml(Roth,Karlsruhe,Germany)的冷BBS/E(200mM硼酸钠,160mM NaCl,1mM EDTA pH8.0)。将所述溶液在冰上孵育1h。在离心(10min,43000g,4°C)未溶解的组分之后,将各上清液转移到新的反应管中。
加入1/4体积的20%w/v PEG8000、15%w/v NaCl以及在冰上孵育60分钟使得再次沉淀噬菌粒,然后将噬菌粒等分并在-80℃下冷冻储存。为了进行第一个筛选循环,解冻噬菌粒并离心(30min,34000g,4°C),移除上清液,然后溶解沉淀的噬菌粒并合并在包含50mM苯甲脒的总计400μlPBS中。在冰上孵育30min后,离心(5min,18500g,4°C)该溶液,以移除残余的聚集体,并将上清液直接用于噬菌体展示筛选。
实施例2:可溶性铁调素-25肽的获得
合成的未修饰的铁调素-25(人DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT,SEQ ID NO:28,2789.4g/mol;小鼠DTNFPICIFCCKCCNNSQCGICCKT,SEQ ID NO:29,2754.2g/mol;大鼠DTNFPICLFCCKCCKNSSCGLCCIT,SEQ ID NO:30,2711.9g/mol)和C端生物素化大鼠铁调素-25(DTNFPICLFCCKCCKNSSCGLCCIT(SEQ ID NO:30)-Mini-PEG-连接物-K-生物素,3210.5g/mol)购自PeptaNova GmbH(Sandhausen,GE)。
人和小鼠C端生物素化铁调素-25购自Bachem AG(Bubendorf,CH)。类似于大鼠铁调素-25,这些靶标经由赖氨酸残基生物素化,该赖氨酸残基经由Minni-PEG连接物耦合至C端。
实施例3:具有100亿个独立NGAL突变蛋白的文库的产生
具有高度复杂性的NGAL脂质运载蛋白(Lcn2)的随机文库基本上如上述实施例1所描述制备。图1示出扩增反应,噬菌粒载体phNGAL102为SEQ ID NO:26。
实施例4:噬菌粒展示以及对人铁调素具有亲和力的NGAL突变蛋白的筛选
基本上如国际专利申请WO/2005/019256中描述的使用实施例1中获得的噬菌粒进行噬菌粒展示和筛选。针对可溶的C端生物素化的人铁调素-25靶标肽,所述文库经过三轮噬菌体展示筛选。
使用实施例1中获得的2x1012至1x1013个噬菌粒的文库。简而言之,将噬菌粒进行离心(21460xg,4℃,20min)并重悬浮于1ml含有50mM苯甲脒的PBS(4mM KH2PO4,16mMNa2BPO4,115mM NaCI,pH7.4)中。含有1%w/v酪蛋白(Sigma)和0.1%吐温的PBS用作封闭缓冲液。在与靶标蛋白一起孵育前,来自文库的噬菌粒与酪蛋白封闭的链霉亲和素珠子一起孵育30分钟,以耗竭呈递多反应性或错误折叠的脂质运载蛋白突变蛋白或链霉亲和素珠子特异性突变蛋白的噬菌粒。
在不同的淘选方法中,在与噬菌粒(溶液含固体的方法)孵育前,将1μM靶标溶液捕获到StreptavidinTM-涂覆的1%酪蛋白封闭的磁性珠子上或将500nM铁调素-25与来自NGAL文库的用1%酪蛋白封闭的3·1012噬菌粒在溶液中孵育(溶液方法)。在溶液方法中,结合肽的噬菌粒在20min内被StreptavidinTM-涂覆的磁性珠子捕获,接下来洗涤8次,用300μL70mM三乙胺(Triethylamin)洗脱10分钟,并用适量的pH7.4的1M Tris/HCl(碱性洗脱液)中和或用300μL pH2.2的0.1M甘氨酸/HCl洗脱10分钟并用适量的0.5M Tris-Base(酸性洗脱液)中和。
在溶液含固体的方法中,将封闭的噬菌粒与链霉亲和素珠子涂覆的靶标一起孵育,接下来洗涤8次,并且如上文描述洗脱。从第二个富集循环开始,只有一半的结合的噬菌粒溶液用于噬菌粒扩增。
在每一个淘选循环之间如Schlehuber,S.等人(J.Mol.Biol.(2000),297,1105-1120)中描述的进行噬菌粒扩增。
以这种方式进行针对铁调素-25的另两个筛选轮,其中使用来自各自前一富集循环的扩增的噬菌粒制备物,除了在第二个富集循环开始时使用仅约1×10l1个噬菌粒。
实施例5:使用高通量ELISA筛选鉴定人铁调素特异的突变蛋白
基本上按照国际专利申请WO2006/56464中实施例3描述的进行根据实施例4的选定的突变蛋白的筛选。
在HT-筛选ELISA中筛选脂质运载蛋白突变蛋白。其中,使用具有phNGAL101的大肠杆菌菌株TG1/F-在96孔微量滴定板中可溶表达装配有T7检测标签(Novagen)以及Strep-tag II亲和标签(IBA)的NGAL变体。这种载体对应于具有N端T7标签的phNGAL98(SEQ IDNO:31),该N端T7标签由11个氨基酸(MASMTGGQQMG)(SEQ ID NO:34,仍见图4B)组成。脂质运载蛋白突变蛋白表达在22°C、700rpm下用无水四环素(0,2μg/ml)以OD550为0.6诱导过夜。随后,细胞在搅拌下裂解(100mM硼酸钠,pH8.0,80mM NaCl,1mM EDTA,0.025%w/v溶菌酶)1h。为了使随后的ELISA筛选中的非特异性结合最小化,给粗细胞裂解物补充2%w/vBSA和0.1%v/v吐温20,并且在ELISA中检测与人铁调素-25的结合。因此,经由用中性亲和素(5μg/ml,Thermo Scientific)捕获,将可溶的C端生物素化的人铁调素-25以1μg/ml固定在黑色Fluotrac600ELISA板(Greiner;384孔)的孔上。每个5μg/ml的中性亲和素、链霉亲和素以及3%的牛奶用作阴性对照。板用含有2%w/v BSA的PBST/0.1封闭,随后与细菌细胞提取物在室温下孵育1h,板被洗涤5次并且结合的脂质运载蛋白突变蛋白经由抗T7的单克隆抗体HRP缀合物(Novagen)进行测定,该缀合物在PBST/0.1中以1:10.000稀释。因此,QuantaBluTM(Pierce;1:2稀释在PBS/T0.1%中)被用作荧光HRP底物。在室温下信号发展45分钟后,在波长320nm(±12.5nm)下激发荧光,在430nm(±17.5nm)下在GENiosPlus读板器中测量荧光。
在反向ELISA方法中,来自粗细胞裂解物的可溶性表达的突变蛋白在与不同量的C端生物素化的人铁调素孵育后经由它们的T7标签被捕获在ELISA板中,以达到靶标限制性条件,以便通过它们的亲和力来区分突变蛋白。经由Extravidin-HRP缀合物(Sigma)测定对靶标的结合。通过加入100nM非生物素化的人铁调素-25而能够竞争突变蛋白结合,表明所述突变蛋白也能结合未修饰的人铁调素-25。
对如实施例4中描述选定的2160个克隆进行筛选,鉴定了超过1000个的主要成功例(primary hit),这表明成功分离了靶标特异性突变蛋白。在靶标限制性条件下的反向ELISA方法以及竞争ELISA允许以其靶标亲和力区分铁调素特异的突变蛋白。使用这些ELISA方法,鉴定了具有SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的克隆。这些突变蛋白的序列描述于图3中。
实施例6:铁调素结合突变蛋白(NGAL)的产生
所述重组Lcn2和人铁调素特异的Lcn2变体通过周质分泌在大肠杆菌K12菌株JM83(Yanisch-Perron等人(1985)Gene33,103-11)、大肠杆菌supE菌株TG1-F-(大肠杆菌K12TG1的衍生物[Kim等人(2009)J.Am.Chem.Soc.131,3565-3576]其使用吖啶橙自它的附加体处理得到)、大肠杆菌BL21(Studier和Moffat(1986)J.Mol.Biol.189,113-130)、或大肠杆菌W3110(Bachmann(1990)Microbiol.Rev.54,130-197)中产生。
对于小规模的可溶性蛋白表达,使用质粒phNGAL98(SEQ ID NO:31),其编码OmpA信号肽与各自的突变蛋白以及C端Strep-tag II的融合蛋白,由此质粒携带所突变基因盒的单向亚克隆的两个不相容的BstXI限制性位点。根据描述于Schlehuber,S.等人(J.Mol.Biol.(2000),297,1105-1120)中的操作程序,在LB氨苄青霉素培养基存在下,在2L摇瓶培养液中进行培养。对于更大量的蛋白表达,基于Schiweck,W.和Skerra,A.Proteins(1995)23,561-565中描述的操作程序,在1升或10升容器中经由台式发酵器培养,用相同质粒在大肠杆菌菌株W3110中进行周质生产。
为了增加体内半衰期,选定的脂质运载蛋白突变蛋白通过以下过程示例性地被修饰。
构建ABD融合蛋白并周质表达SEQ ID NO:1的突变蛋白。来自链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域经由源自链球菌蛋白G的原始连接物融合至所述突变蛋白的C端,如SEQ IDNO:15中所述。
在定点聚乙二醇化的情况下,将在氨基酸位置87处具有自由的半胱氨酸残基的hNGAL突变蛋白(SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14)用于与分支的40k PEG-马来酰亚胺进行聚乙二醇化。为实现这个目的,位置87处的丝氨酸通过定点诱变(Quick-change诱变试剂盒,Stratagene)被突变回半胱氨酸,该半胱氨酸最初存在于野生型hNGAL中。在聚乙二醇化反应之前,在室温下,以摩尔比为1:1的Anticalin与TCEP还原所述自由的半胱氨酸残基3h。其后,通过用大于2摩尔的过量的PEG40-马来酰亚胺试剂与所述蛋白混合,在室温下进行聚乙二醇化1.5h。
经由链霉亲和素亲和色谱法(Strep-Tactin SuperflowTM,IBA),采用适当床体积的柱子,根据Skerra,A.&Schmidt,T.G.M.(2000)(Use of the Strep-tag andstreptavidin for detection and purification of recombinant proteins.MethodsEnzymol.326A,271-304)描述的操作程序,从周质级份中纯化Lcn2变体。为了达到更高的纯度并移除任何聚集的重组蛋白,最后在Superdex75HR10/30柱子(24-ml柱体积,AmershamPharmacia Biotech,Freiburg,Germany)上,在PBS缓冲液存在下,进行突变蛋白的凝胶过滤。汇集所述单体蛋白级分并通过SDS-PAGE(Fling and Gregerson (1986)Anal.Biochem.155,83-88)进行纯度分析,并且用于进一步的生化表征。
通过色谱法纯化hNGAL突变蛋白的聚乙二醇化形式,并在必要时,通过MustangE膜(Pall Corporation,US)过滤实现细菌内霉素的进一步减少。
实施例7:使用ELISA技术测量亲和力
进行“直接”ELISA以验证选定的Lcn2突变蛋白的结合亲和力和特异性。因此,将1μg/ml恒定浓度的C端生物素化的铁调素(Bachem AG,CH)通过中性亲和素(ThermoScientific,5μg/ml)捕获于聚苯乙烯板(Greiner,GE)的表面上。纯化的Lcn2突变蛋白的两步稀释系列与捕获的铁调素在室温下孵育1h,然后经由Strep-tag II使用兔抗strep-tagII多克隆抗体(GenScript,USA)或通过使用骨架特异性多克隆兔抗体进行测定。在这两种情况下,抗兔IgG-HRP缀合物(Abcam,UK)用作第二检测抗体。
在ELISA读取器(Tecan,GE)中测定320nm处的ΔA吸收,并且数据用GraphpadPrism软件(Statcom,USA)拟合。
使用SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12以及连接至PEG40的SEQ ID NO:14、连接至PEG40的SEQ ID NO:13和连接至白蛋白结合结构域(ABD)的SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:15)的序列的突变蛋白的测定结果概括于图5中。
选定的Lcn2突变蛋白的KD值从220pM至6.8nM变化。所有的突变蛋白以可比较的亲和力结合人和猕猴的铁调素-25。经由白蛋白结合结构域的C端融合的SEQ ID NO:1的脂质运载蛋白突变蛋白,其血清半衰期的延长对该突变蛋白的结合亲和力没有显著影响,然而在此ELISA实验中,聚乙二醇化显著降低了结合亲和力,其中对于SEQ ID NO:8,降低了5倍,对于SEQ ID NO:1的突变蛋白,降低了8倍。
在竞争ELISA方法中测定Lcn2突变蛋白对溶液中未修饰的铁调素-25的结合亲和力。因此,将1μg/ml恒定浓度的C端生物素化的人铁调素(Bachem AG,CH)经由中性亲和素(Thermo Scientific,5μg/ml,GE)捕获于聚苯乙烯板(Greiner,GE)的表面上。并行地,在无蛋白结合96孔聚丙烯板(Nunc,GE)中,在室温下,将1μM起始的非生物素化的人铁调素的两步稀释系列与恒定浓度的铁调素特异性突变蛋白孵育1h。所述脂质运载蛋白突变蛋白的恒定浓度对应于本实施例中如上描述的直接ELISA中测定的各突变蛋白的EC50。以下,将未修饰的人铁调素和脂质运载蛋白突变蛋白的混合物转移至捕获有铁调素的中性亲和素板上。使C端生物素化铁调素与未修饰的铁调素在室温下竞争Anticali结合20min。在这20min期间,游离的脂质运载蛋白突变蛋白被结合至捕获的铁调素并且经由兔抗strep-tag II多克隆抗体(GenScript,USA)进行测定。山羊抗兔IgG-HRP缀合物(Abcam,UK)用作第二检测抗体。平行于竞争实验,在“直接”ELISA中在相同的板上测定anticalin结合,以获得将RFU值与anticalin浓度相关的标准曲线。然后将该曲线用于将竞争数据标准化到结合至板上的anticalin的水平,然后用Graphpad软件拟合。IC50值对应于被结合至板上的脂质运载蛋白突变蛋白的半最大量。
使用SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12以及连接至PEG40的SEQ ID NO:14、连接至PEG40的SEQ ID NO:13和连接至ABD的SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:15)的序列的突变蛋白的测定结果概括于图6中。
选定的Lcn2突变蛋白的IC50值从100pM至10.8nM变化。经由白蛋白结合结构域的血清半衰期的延长对SEQ ID NO:1突变蛋白的结合亲和力没有影响,然而聚乙二醇化降低了结合亲和力,其中对于SEQ ID NO:13-PEG40降低了2倍,对于SEQ ID NO:14-PEG40降低了4倍。
实施例8:使用表面等离子体共振(SPR)测量亲和力
表面等离子体共振用于测量本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白的结合动力学和亲和力。
使用标准胺化学将脂质运载蛋白突变蛋白固定至CM5传感器芯片:使用EDC和NHS激活芯片的表面。随后,以5μL/min的流量施加在10mMpH4.5乙酸钠中的20μg/mL的脂质运载蛋白突变蛋白(对于聚乙二醇化脂质运载蛋白突变蛋白,施加在10mM pH4的乙酸钠中的60μg/mL),直到实现对于未修饰脂质运载蛋白突变蛋白的500-700谐振单元(RU)的表面密度和对于序列为SEQ ID NO:13的聚乙二醇化脂质运载蛋白的约1600RU的表面密度。用乙醇胺饱和残基活化基团。随后用EDC/NHS、然后用乙醇胺处理参考通道(空白固定化)。所有试剂和材料购自GE Healthcare。
将人和猕猴铁调素-25在流动缓冲液(HBS-EP+,GE Healthcare,BR-1006-68)中的系列稀释液施加于制备的表面。下面的参数用于结合测定:接触时间60s、解离时间180-360s、流量30μL/min。所有的测量都是在25℃下在Biacore T100仪器(GE Healthcare)上进行。其上固定有脂质运载蛋白的表面的再生通过以下方式获得:随后注射2M/4M盐酸胍(120-600s)以及10mM盐酸甘氨酸pH1.5/2.0(40-240s),接下来用流动的缓冲液额外冲洗以及120s的稳定时间段。
数据用Biacore T100评估软件(V2.0.1)进行评估。使用双重参考。1:1的结合模型(Langmuir)用于拟合原始数据。
重复实验可再现,并且没有检测到对参考通道的结合。具有SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:8以及连接至PEG40的SEQ ID NO:13的序列的脂质运载蛋白突变蛋白对人和猕猴铁调素-25的结合参数概括于图7中。
猕猴铁调素-25以约高于人靶标2倍的亲和力结合至固定的脂质运载蛋白突变蛋白。在具有SEQ ID NO:13序列的固定化的聚乙二醇化变体上的人铁调素-25的动力学分析显示出40pM的高亲和力。
实施例9:铁调素诱导的膜铁转运蛋白的内化和降解的基于细胞的测定
体外基于细胞的测定用于测量本发明的针对人铁调素的脂质运载蛋白突变蛋白的中和活性。这个测定基于铁调素诱导的其受体膜铁转运蛋白的内化和降解,基本上如(Nemeth等人,2004,2006)描述地实施。
简单地说,制备HEK-293稳定细胞系以允许羧基端融合有绿色荧光蛋白(GFP)的鼠膜铁转运蛋白(FPN)的诱导表达。FPN-GFP融合蛋白的诱导表达受多西环素控制,其中使用市场上可以买到的四环素调节的T-Rex表达系统(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)。将FPN-GFP编码序列克隆到pcDNA4/TO载体中,其包含诱导型启动子和Zeocin抗性标记物。将得到的构建体稳定地转染到T-REx-293细胞中,其表达多西环素诱导表达所需要的调节蛋白。
铁调素受体的铁调素诱导的内化的测定如下进行:将所述T-REx-293:FPN-GFP稳定系细胞以80%汇合度接种在T75细胞培养瓶中。在晚上,用4ng/ml多西环素诱导FPN-GFP的表达,并用10μM柠檬酸铁铵(III)在37℃下稳定16h。在第二天早晨,细胞被胰蛋白酶消化并以30万个细胞/孔、体积450μl接种于24孔板中。使细胞在37℃下附着1h,然后添加铁调素。将细胞在37℃下孵育24h,然后用流式细胞术分析分离的细胞悬液的GFP荧光。
将EC80(40nM)铁调素介导的Fpn-GFP融合蛋白降解用于中和测定中。为了这个目的,在加入细胞前,将Anticalin与铁调素在室温下孵育30min。24h孵育时间段之后,如上所述量化荧光。
具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11以及连接至PEG40的SEQ ID NO:14和连接至PEG40的SEQ ID NO:13和连接至ABD的SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:15)的序列的抗铁调素脂质运载蛋白突变蛋白中和人铁调素-25的生物活性,其IC50值在图8中示出。
实施例10:抗铁调素脂质运载蛋白突变蛋白中和小鼠体内的人铁调素
抗人铁调素脂质运载蛋白突变蛋白的活性在小鼠体内进行评估,所述小鼠被施用了足以产生如(Nemeth等人(2006)Blood,107:328-333)描述的缺铁反应(hypoferremicresponse)的量的人铁调素。
实验前两周,将C57BL/6小鼠转换为缺铁的饮食以抑制内源性铁调素。在实验前,使3倍摩尔过量的脂质运载蛋白突变蛋白与合成的人铁调素-25结合30min。平行地,将野生型脂质运载蛋白(NGAL98)与人铁调素-25以相同摩尔比预孵育,作为同型对照。小鼠获得单次腹膜内(i.p.)注射PBS(溶媒)或2mg/kg铁调素或2mg/kg与脂质运载蛋白突变蛋白或野生型脂质运载蛋白(阴性对照)预孵育的铁调素。两个小时后,在异氟醚麻醉下收集血液,在KoneLab XTi临床分析仪上使用比色法测定总血清铁水平。
以μM浓度计的总血清铁水平的结果描述于图9中。铁调素治疗诱导铁饥饿小鼠体内的血清铁水平显著下降。用野生型脂质运载蛋白预孵育的铁调素也显示血铁过少。人铁调素与脂质运载蛋白突变蛋白的预先复合保护动物免于缺铁反应。
实施例11:抗铁调素-25脂质运载蛋白突变蛋白的药代动力学(PK)参数的测定
在以图10所示剂量在NMRI小鼠和猕猴(Macacca fascicularis)中经静脉内单次团注给药之后,测定Lcn2突变蛋白的药代动力学(PK)参数(半衰期血药浓度),所述Lcn2突变蛋白具有连接至PEG40的SEQ ID NO:14和连接至ABD的SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:15)的序列。由在预先确定的时间点获取的终端血样制备血浆,并用ELISA测定脂质运载蛋白突变蛋白的浓度。用自然对数转换的血药浓度-时间曲线的终端部分的最小二乘线性回归计算消除速率常数。每一个单独曲线的最终消除阶段的开始处通过目测定义,其为血清浓度对数线性下降没有系统偏差的第一点。T1/2按以下公式计算:
T1/2SEQ ID NO:14-PEG(小鼠):27.9h;T1/2SEQ ID NO:1-ABD(小鼠):30h;T1/2SEQ ID NO:14-PEG(猕猴):88h。
本领域技术人员将会易于理解本发明能很好的适于进行主题并且获得提及的结果和优势,以及其中固有的那些。此外,可以对本文公开的发明进行不同的替换和修改,而不背离本发明的范围和精神,这对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文所描述的组合物、方法、过程、处理、分子和具体化合物是目前示例性的优选实施方式中具有代表性的,并且不意图作为对本发明范围的限制。其中包含在本发明精神内的对本领域技术人员可发生的变化和其它用途,由权利要求书的范围限定。在本说明书中先前出版的文件的列表或讨论不应一定理解为认可所述文件是本领域状态的一部分或者是公知常识。
必须注意如本文使用地,单数形式的“一个”和“这个”除非上下文另有明确表明,否则包括复数引用。因此,例如,关于“抗体”包括一个或多个这样的不同的抗体,关于“方法”包括关于本领域普通技术人员已知的可以修改或替代本文描述方法的等效步骤和方法。
在本文中引用的所有论文和专利通过全文引用的方式并入。在通过引用并入的材料与本说明书相矛盾或不一致的情况下,本说明书将优先于任何这样的材料。
除非另有表明,否则在系列元素之前的术语“至少”被理解为指该系列中的每一个元素。本领域技术技术人员将认识到,或仅仅用常规实验能够确定等同于本文描述的本发明的具体实施方式的许多等同方式。这些等同方式意在被本发明所包含。
本文在多个例举元素之间使用的连接术语“和/或”被理解为包含每一个和组合选择二者。例如,在两个元素用“和/或”连接时,第一选择指应用第一个元素而没有第二个。第二选择指应用第二个元素而没有第一个。第三选择指一起应用第一个和第二个元素。这些选择中的任一个被理解为落在所述含义内,因此满足本文使用的术语“和/或”的要求。多于一个选择的同时应用也被理解为落入所述含义内,因此满足本文使用的术语“和/或”的要求。
本文示例性描述的发明可以在任何未在本文具体公开的元素、限制不存在的情况下适当地进行实施。因此,例如,术语“包含”、“包括”、“含有”等应该广泛地理解而无限制。在本文的每一个例子中,术语“包含”、“基本上由…组成”和“组成”中的任一个可以被其它两个术语之一替代。
并且,本文采用的术语和表达方式用作描述性的而非限制性的术语,并且无意使用排除所示和所描述特征或其部分的的任何等同方式的此类术语和表达方式,但是应理解,在本发明要求保护的范围内,多种修改方式是可行的。因此,应该理解,尽管本发明已经通过示例性实施方式和任选特征予以具体公开,但是本领域技术人员可以寻求本文在此公开的实施发明的修改和改变,并且认为此类修改和改变在本发明的范围内。
本文已经广泛和通用地描述了本发明。落在通用公开内容之内的每个较窄种类和亚类集合也形成本发明的一部分。这包括具有从该通类去除任何主题的先决或负面限制的本发明的通用描述,无论该排除的物质是否在本文具体描述。
其它的实施方式在以下的权利要求书范围内。并且,在本发明的特征或方面以马库什基团的方式进行描述的情况下,本领域技术人员将认识到,本发明还由此以马库什基团的任何单独成员或成员子集的形式进行了描述。
Claims (45)
1.一种脂质运载蛋白突变蛋白,其能够以KD为10nM或低于10nM的亲和力结合铁调素:
(1)其中所述脂质运载蛋白突变蛋白由与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的序列编码,并且其中所述脂质运载蛋白突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO:35中所示的成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134的序列位置处的氨基酸残基Leu 36、Glu 40、Val 41、Met49、Trp 52、Ile 68、Met 70、Leu 72、Ala 73、Glu 77、Leu 79、Gln 81、Asp 96、Ser 100、Arg103、Gly 106、Thr 125、Trp 127、Val 132、Trp 134;或者
(ii)其中所述脂质运载蛋白突变蛋白由与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的序列编码,并且其中所述脂质运载蛋白突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO:35中所示的成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134的序列位置处的氨基酸残基Leu 36、Glu 40、Val41、Met49、Trp 52、Ile 68、Met 70、Leu 72、Ala 73、Glu 77、Leu 79、Gln 81、Gly 96、Gly 100、Arg103、Gly 106、Val 125、Trp 127、Val 132和Trp 134;或者
(iii)其中所述脂质运载蛋白突变蛋白由与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的序列编码,并且其中所述脂质运载蛋白突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO:35中所示的成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134的序列位置处的氨基酸残基Leu 36、Glu 40、Val 41、Met 49、Trp 52、Ile 68、Met 70、Leu 72、Ala 73、Glu 77、Leu 79、Gln 81、Asp 96、Ser100、Arg 103、Gly 106、Val 125、Trp 127、Val 132、Trp 134;或者
(iv)其中所述脂质运载蛋白突变蛋白由与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的序列编码,并且其中所述脂质运载蛋白突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO:35中所示的成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134的序列位置处的氨基酸残基Leu 36、Glu 40、Ile 41、Met 49、Trp 52、Ile 68、Met 70、Leu 72、Ala 73、Glu 77、Leu 79、Gln 81、Asp 96、Ser100、Arg 103、Gly 106、Val 125、Trp 127、Val 132、Trp 134;或者
(v)其中所述脂质运载蛋白突变蛋白由与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的序列编码,并且其中所述脂质运载蛋白突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO:35中所示的成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134的序列位置处的氨基酸残基Leu 36、Glu 40、Ile 41、Met49、Trp 52、Ile 68、Met 70、Leu 72、Ala 73、Glu 77、Leu 79、Gln 81、Asp 96、Ser 100、Arg103、Gly 106、Val 125、Trp 127、Val 132、Trp 134;或者
(vi)其中所述脂质运载蛋白突变蛋白由与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的序列编码,并且其中所述脂质运载蛋白突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO:35中所示的成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134的序列位置处的氨基酸残基Leu 36、Glu 40、Val 41、Met 49、Trp 52、Ile 68、Met 70、Leu 72、Ala 73、Glu 77、Leu 79、Gln 81、Asp 96、Ser100、Arg 103、Gly 106、Val 125、Trp 127、Val 132、Trp 134;或者
(vii)其中所述脂质运载蛋白突变蛋白由与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的序列编码,并且其中所述脂质运载蛋白突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO:35中所示的成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134的序列位置处的氨基酸残基Leu 36、Glu 40、Val 41、Met 49、Trp 52、Ile 68、Met 70、Leu 72、Ala 73、Glu 77、Leu 79、Gln 81、Gly 96、Gly100、Arg 103、Gly 106、Val 125、Trp 127、Val 132、Trp 134;或者
(viii)其中所述脂质运载蛋白突变蛋白由与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的序列编码,并且其中所述脂质运载蛋白突变蛋白包含在对应于SEQ IDNO:35中所示的成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134的序列位置处的氨基酸残基Leu 36、Glu 40、Val41、Met 49、Trp 52、Ile 68、Met 70、Leu 72、Ala 73、Glu 77、Leu 79、Gln 81、Asp 96、Ser100、Arg 103、Gly 106、Thr 125、Trp 127、Val 132、Trp 134;或者
(ix)其中所述脂质运载蛋白突变蛋白由与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的序列编码,并且其中所述脂质运载蛋白突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO:35中所示的成熟hNGAL线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132和134的序列位置处的氨基酸残基Leu 36、Glu 40、Val 41、Met 49、Trp 52、Ile 68、Met 70、Leu 72、Ala 73、Glu 77、Leu 79、Gln 81、Asp 96、Ser100、Arg 103、Gly 106、Val 125、Trp 127、Val 132、Trp 134。
2.根据权利要求1所述的脂质运载蛋白突变蛋白,其具有KD为1nM或低于1nM的亲和力。
3.根据权利要求1所述的脂质运载蛋白突变蛋白,其能够中和猕猴铁调素-25的生物活性。
4.根据权利要求1所述的脂质运载蛋白突变蛋白,其能够中和人铁调素-25的生物活性。
5.根据权利要求1所述的脂质运载蛋白突变蛋白,其IC50值为80nM或低于80nM,通过用于铁调素诱导的膜铁转运蛋白内化和降解的基于细胞的测定所测得。
6.根据权利要求5所述的脂质运载蛋白突变蛋白,其IC50值为50nM或低于50nM。
7.根据权利要求5所述的脂质运载蛋白突变蛋白,其IC50值为25nM或低于25nM。
8.根据权利要求1所述的突变蛋白,其中所述突变蛋白结合成熟人铁调素。
9.根据权利要求1所述的突变蛋白,其中所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1-15中任意一个所述。
10.根据权利要求1所述的突变蛋白,其中所述突变蛋白与成熟人铁调素的亲和力用KD定义,所述KD为10nM或低于10nM。
11.根据权利要求10所述的突变蛋白,其中所述突变蛋白与成熟人铁调素的亲和力用KD定义,所述KD为1nM或低于1nM。
12.根据权利要求1所述的突变蛋白,其中所述突变蛋白缀合至选自以下的化合物:有机分子、酶标记、放射性标记、有色标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、细胞抑制剂、毒素、金属络合物、金属和胶体金。
13.根据权利要求12所述的突变蛋白,其中所述发光标记为荧光标记。
14.根据权利要求1所述的突变蛋白,其中所述突变蛋白在其N端和/或其C端融合至融合配偶体,所述融合配偶体为蛋白、或蛋白结构域或肽。
15.根据权利要求1所述的突变蛋白,其中所述突变蛋白缀合至延长所述突变蛋白的血清半衰期的化合物。
16.根据权利要求15所述的突变蛋白,其中所述延长血清半衰期的化合物选自:聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白。
17.根据权利要求16所述的突变蛋白,其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)或其活化衍生物。
18.根据权利要求14所述的突变蛋白,其中所述突变蛋白的融合配偶体是延长所述突变蛋白的血清半衰期的蛋白结构域。
19.根据权利要求18所述的突变蛋白,其中所述蛋白结构域是免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽、或白蛋白结合蛋白。
20.根据权利要求1所述的突变蛋白,其用作铁调素的拮抗剂。
21.根据权利要求1所述的突变蛋白,其用作在膜铁转运蛋白处的成熟人铁调素的拮抗剂。
22.根据权利要求1所述的突变蛋白,其用于治疗或诊断。
23.根据权利要求1所述的突变蛋白,其用于治疗或诊断疾病或障碍,所述疾病或障碍涉及铁动态平衡的障碍或与提高水平的铁调素相关的炎性病症。
24.根据权利要求1所述的突变蛋白,其用于增加受试者的体液、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白或血细胞比容中的铁水平。
25.根据权利要求1所述的突变蛋白,其用于治疗或诊断贫血、败血症、遗传性血色沉着病、慢性肾脏疾病(CKD)相关贫血、癌症性贫血(AC)、化疗所致贫血(CIA)、抗ESA(红细胞生成刺激剂)相关贫血、膜铁转运蛋白疾病、血色沉着症、后阶段肾功能障碍、慢性肾脏疾病、炎症、糖尿病、风湿性关节炎、动脉硬化、系统性红斑狼疮和血红蛋白病。
26.根据权利要求25所述的突变蛋白,其中所述炎症为血管炎。
27.根据权利要求25所述的突变蛋白,其中所述贫血为炎症性贫血、慢性炎性贫血、缺铁性贫血或铁加载贫血。
28.根据权利要求1-21中任一项所述的突变蛋白,其用于监测促红细胞生成素(EPO)治疗或预测对促红细胞生成素(EPO)的响应或阻止人铁调素-25诱导的受试者的血清铁水平降低。
29.一种核酸分子,其编码根据权利要求1至28中任一项所述突变蛋白。
30.根据权利要求29所述的核酸分子,其中所述核酸分子可操作性地连接至调节序列以允许所述核酸分子的表达。
31.根据权利要求29所述的核酸分子,其中所述核酸分子包含于载体或噬菌粒载体中。
32.一种宿主细胞,其包含根据权利要求29所述的核酸分子。
33.一种产生根据权利要求1至28中任一项所述突变蛋白的方法,其中所述突变蛋白通过基因工程方法的方式从编码所述突变蛋白的核酸开始而产生。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述突变蛋白在细菌或真核宿主生物体中产生,并从该宿主生物体或其培养物中分离。
35.一种药物组合物,其包含根据权利要求1至28中任一项所述的突变蛋白和药学上可接受的赋形剂。
36.根据权利要求35所述的药物组合物,其还包含红细胞生成刺激物。
37.根据权利要求36所述的药物组合物,其中所述红细胞生成刺激物是促红细胞生成素、促红细胞生成素变体、结合促红细胞生成素的抗体和结合促红细胞生成素的脂质运载蛋白突变蛋白中的一种。
38.根据权利要求1至28中任一项所述的突变蛋白用于制备药物组合物的用途。
39.根据权利要求35所述的药物组合物,其用于减少铁调素水平的方法,所述方法包括给有此需要的受试者施用所述药物组合物。
40.一种诊断或分析试剂盒,其包含根据权利要求1至28中任一项所述的突变蛋白。
41.根据权利要求1至28中任一项所述的突变蛋白在制备用于检测生物样品中铁调素的存在的组合物中的用途。
42.根据权利要求41所述的用途,其中检测生物样品中铁调素的存在包括检测所述铁调素和所述突变蛋白的复合物。
43.根据权利要求41所述的用途,其中所述铁调素为成熟人铁调素。
44.根据权利要求41所述的用途,其中所述生物样品从人分离。
45.根据权利要求41所述的用途,其中所述生物样品包括体液。
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