KR20210146999A - 리포칼린 뮤테인의 흡입 투여 - Google Patents

리포칼린 뮤테인의 흡입 투여 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대상체로의 리포칼린 뮤테인의 흡입 투여에 관한 것으로, 여기서 투여는 호흡기의 리포칼린 뮤테인에 대한 국소 노출을 제공한다. 본 발명은 또한 대상체로의 리포칼린 뮤테인의 흡입 투여에 관한 것으로, 여기서 투여는 리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출을 제공한다.

Description

리포칼린 뮤테인의 흡입 투여
공기-혈액 장벽을 통과하는 에어로졸화된 약물의 치료적 필요 및 능력에 따라 흡입에 의한 기도의 약물 전달을 국소 및/또는 전신 작용에 사용할 수 있다. 흡입 약물은 폐로 전달되는데, 여기서 좋은 혈관 형성, 엄청난 용질 교환 능력 및 폐포 상피의 매우 얇은 두께는 펩타이드와 단백질의 폐 투여를 통한 전신 전달을 촉진할 수 있는 독특한 특징이다(Agu et al., Respir Res , 2001). 그러나, 다수의 분자 및 투여 경로 관련 문제가 당업계에 남아 있다.
리포칼린은 크기, 형상 및 화학적 특성 면에서 매우 다양한 표적을 수용할 수 있는 단백질 스캐폴드이다(Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000). 리포칼린은 안정적인 β-배럴 스캐폴드에 장착된 4개 루프 가변 영역으로 구성된 고도로 보존된 전체 접힘 구조를 공유한다(Skerra, FEBS J, 2008). 최근, 리포칼린 계열의 구성원은 일반적으로 생명과학에서 중요한 역할을 하는 표적-결합 단백질로서 연구의 대상이 되었으며, 이는 그 대부분이 항체(면역글로불린)에 의해 점유되어 왔다(WO 99/16873, WO03/029463, WO 03/ 029471, Schlehuber 및 Skerra, Biophys Chem, 2002, Skerra, J Biotechnol, 2001). 리포칼린 뮤테인은 리포칼린 구조를 기반으로 하는 분자 클래스이며 그들의 결합 부위의 돌연변이유발을 통해 생성되어 그들의 가소성을 추가로 증가시킴으로써 이러한 뮤테인이 선택된 표적에 결합할 수 있도록 한다.
현재, 항체의 흡입 전달 또는 승인된 흡입 항체 치료제에 대해 승인된 시스템이 없다. 흡입용으로 승인된 많은 저분자가 있지만 낮은 표적 친화도, 표적외 결합 및 다른 기관에 대한 부작용을 포함하여 많은 단점이 있다. 단백질(예: 항체 및 항체 유사 분자) 및 펩타이드를 포함한 흡입 생물학적 치료제는 증가된 표적 결합 능력 및 효능뿐만 아니라 감소된 표적외 효과를 제공하는 대안으로 제공할 수 있다. 그러나 단백질 및 펩타이드의 흡입 투여는 전달 장치에 대한 엄격한 요구 사항을 부과하고 특정 장벽, 특히 호흡기 상피는 흡입된 단백질 및 펩타이드의 흡수 및 전체 및 국소(예: 폐 원위) 침착을 손상시킨다. 따라서 흡입에 의한 항체 또는 항체-유사 치료제와 같은 단백질-기반 치료제의 효율적인 전달을 제공하는 것이 당업계의 요구로 남아 있다. 본 출원의 기초가 되는 기술적인 문제는 상기 요구를 충족시키는 것이다. 기술적인 문제는 청구범위에 반영된 구체예를 제공함으로써 해결되며, 설명에 기술되고 하기의 실시예 및 도면에 예시된다.
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정의
다음 목록은 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어, 문구 및 약어를 정의한다. 여기에 나열되고 정의된 모든 용어는 모든 문법적 형태를 포함하도록 의도되었다.
본원에 사용된 "검출가능한 친화도"는 약 10-5 M 이하(낮은 Kd 또는 EC50 값은 더 나은 결합 활성을 반영함)의 일반적으로 Kd 또는 EC50에 의해 측정된 친화도로 선택된 표적에 결합하는 능력을 의미한다. 낮은 친화도는 일반적으로 ELISA(enzyme-linked immunoorbent assay)와 같은 일반적인 방법으로 더 이상 측정할 수 없으므로 별로 중요하지 않다.
본원에 사용된 본 개시내용의 단백질(예를 들어, 리포칼린의 뮤테인) 또는 이의 융합 폴리펩타이드의 선택된 표적에 대한 "결합 친화도"는 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 측정될 수 있다(따라서 뮤테인-리간드 복합체의 Kd 값이 측정될 수 있음). 이러한 방법에는 형광 적정, 경쟁적 ELISA, 등온 적정 열량계(ITC)와 같은 열량계 방법 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이러한 방법은 당업계에 잘 확립되어 있으며 이의 실시예도 아래에 자세히 설명되어 있다.
또한 각 바인더와 이의 리간드 간의 복합체 형성은 각 결합 파트너의 농도, 경쟁자의 존재, 사용된 완충 시스템의 pH 및 이온 강도 및 해리 상수 Kd의 결정에 사용되는 실험 방법(예: 형광 적정, 경쟁 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명 등) 또는 실험 데이터의 평가에 사용되는 수학적 알고리즘과 같은 다양한 요인에 의해 영향을 받는다.
따라서, Kd 값(각 바인더와 이의 표적/리간드 사이에 형성된 복합체의 해리 상수)은 주어진 리간드에 대한 특정 리포칼린 뮤테인의 친화도를 결정하는데 사용되는 방법 및 실험 설정에 따라 특정 실험 범위 내에서 변할 수 있다는 것도 당업자에게 명백하다. 이는 예를 들어 Kd 값이 표면 플라즈몬 공명(SPR), 경쟁 ELISA 또는 직접 ELISA에 의해 결정되었는지 여부에 따라 측정된 Kd 값 또는 허용 오차 범위에 약간의 편차가 있을 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 "뮤테인", "돌연변이된 실체(단백질 또는 핵산)" 또는 "돌연변이체"는 자연적으로 발생하는 (야생형) 핵산 또는 단백질 "레퍼런스" 스캐폴드와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 교환, 결실 또는 삽입을 지칭한다. "레퍼런스 스캐폴드"는 바람직하게는 성숙한 인간 눈물 리포칼린 또는 성숙한 인간 호중구 젤라티나제-연관 리포칼린이다. 상기 "레퍼런스 스캐폴드"는 또한 본원에 기재된 바와 같은 뮤테인 및 변이체의 단편을 포함한다.
본원에 사용된 "눈물 리포칼린"은 인간 눈물 리포칼린(hTlc)을 지칭하며, 나아가 성숙한 인간 눈물 리포칼린을 지칭한다. 단백질을 특성화하기 위해 사용될 때 용어 "성숙한"은 신호 펩타이드가 본질적으로 없는 단백질을 의미한다. 본 개시내용의 "성숙한 hTlc"는 신호 펩타이드가 없는 성숙한 형태의 인간 눈물 리포칼린을 지칭한다. 성숙한 hTlc는 수탁 번호 P31025로 SWISS-PROT Data Bank에 기탁된 서열의 잔기 19-176에 의해 기술되며, 그 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 표시되어 있다.
본원에 사용된 "리포칼린-2" 또는 "호중구 젤라티나제-연관 리포칼린"은 인간 리포칼린-2(hLcn2) 또는 인간 호중구 젤라티나제-연관 리포칼린(hNGAL)을 지칭하고, 나아가 성숙한 hLcn2 또는 성숙한 hNGAL을 지칭한다. 단백질을 특성화하기 위해 사용될 때 용어 "성숙한"은 신호 펩타이드가 본질적으로 없는 단백질을 의미한다. 본 발명의 "성숙한 hNGAL"은 신호 펩타이드가 없는 성숙한 형태의 인간 호중구 젤라티나제-연관 리포칼린을 지칭한다. 성숙한 hNGAL은 수탁 번호 P80188로 SWISS-PROT Data Bank에 기탁된 서열의 잔기 21-198에 의해 기술되며, 그 아미노산은 SEQ ID NO: 2에 표시되어 있다.
본 개시내용의 뮤테인과 관련하여 본원에 사용된 용어 "단편"은 상기 뮤테인, 예컨대 전장의 성숙한 인간 눈물 리포칼린(hTlc 또는 hTLPC) 또는 전장의 성숙한 인간 호중구 젤라티나제-연관 리포칼린(hNGAL)에서 유래된, 즉 N-말단 및/또는 C-말단이 잘린, 즉 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 중 적어도 하나가 결여된 단백질 또는 펩타이드에 관한 것이다. 이러한 단편은 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산의 최대 2, 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 10, 최대 15, 최대 20, 최대 25 또는 최대 30(사이의 모든 숫자 포함)이 결여될 수 있다. 예시적인 예로서, 이러한 단편은 특히 뮤테인이 hTlc로부터 유래되는 경우 1, 2, 3 또는 4개의 N-말단 및/또는 1 또는 2개의 C-말단 아미노산이 결여될 수 있다. 단편은 바람직하게는 전장 리포칼린의 기능적 단편(뮤테인)이고, 이는 바람직하게는 그것이 유래하는 전장 리포칼린의 결합 포켓(뮤테인)을 포함하는 것으로 이해된다. 예시적인 예로서, 이러한 기능적 단편은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열에 상응하는 위치 5-158, 1-156, 5-156, 5-153, 5-150, 9-148, 12-140, 20-135, 또는 26-133에 있는 아미노산을 적어도 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 예로서, 이러한 기능적 단편은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열에 상응하는 위치 5-168, 8-160, 13-157, 15-150, 18-141, 20-134, 25-134, 또는 28-134에 있는 아미노산을 적어도 포함할 수 있다. 이러한 단편은 성숙한 리포칼린의 1차 서열의 10개 이상, 예를 들어 20개 또는 30개 이상의 연속적인 아미노산을 포함할 수 있고 일반적으로 성숙한 리포칼린의 면역분석에서 검출가능하다. 단편은 단백질 또는 폴리펩타이드의 천연 서열과 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95% 또는 적어도 약 98% 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인의 상응하는 단백질 표적과 관련하여 본원에 사용된 용어 "단편"은 N-말단 및/또는 C-말단이 단축된 단백질 또는 펩타이드 리간드에 관한 것으로, 이는 본 개시내용에 따른 뮤테인에 의해 인식 및/또는 결합되는 전장 리간드의 능력을 보유한다.
본원에 사용된 용어 "변이체"는 예를 들어 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 치환, 결실, 삽입 및/또는 화학적 변형에 의한 돌연변이를 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 유도체에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 이러한 돌연변이 및/또는 화학적 변형은 단백질 또는 펩타이드의 기능을 감소시키지 않는다. 이러한 치환은 보존적일 수 있으며, 즉 아미노산 잔기가 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 대체된다. 보존적 치환의 예는 다음 그룹의 구성원 간의 대체이다. 1) 알라닌, 세린, 트레오닌 및 발린; 2) 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘; 3) 아르기닌, 리신, 글루타민, 아스파라긴 및 히스티딘; 4) 이소루신, 루신, 메티오닌, 발린, 알라닌, 페닐알라닌, 트레오닌 및 프롤린; 및 5) 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판. 이러한 변이체는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하되, 하나 이상의 아미노산은 각각의 D-입체이성질체 또는 자연적으로 발생하는 20개 아미노산 이외의 아미노산, 예를 들어 오르니틴, 히드록시프롤린, 시트룰린, 호모세린, 히드록실리신, 노르발린에 의해 치환되었다. 이러한 변이체는 또한 예를 들어 N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가 또는 결실된 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 변이체는 천연 서열 단백질 또는 폴리펩타이드와 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95% 또는 적어도 약 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 변이체는 바람직하게는 생물학적 활성 예를 들어, 그것이 유래된 단백질 또는 폴리펩타이드의 동일한 표적에 결합하는 것을 유지한다.
본원에 사용된 용어 "돌연변이유발"은 성숙한 리포칼린의 주어진 서열 위치에서 자연적으로 발생하는 아미노산이 각각의 천연 폴리펩타이드 서열의 이 특정 위치에 존재하지 않는 적어도 하나의 아미노산으로 치환될 수 있도록 실험 조건이 선택된다는 것을 의미한다. 용어 "돌연변이유발"은 또한 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 삽입에 의한 서열 세그먼트의 길이 (추가) 변형을 포함한다. 따라서, 예를 들어 선택된 서열 위치에서 하나의 아미노산이 3개의 무작위 돌연변이의 스트레치로 대체되어 야생형 단백질의 각 세그먼트 길이와 비교하여 2개의 아미노산 잔기의 삽입이 초래되는 것은 본 개시내용의 범위 내에 있다. 이러한 삽입 또는 결실은 본 개시내용에서 돌연변이유발될 수 있는 임의의 펩타이드 단편에서 서로 독립적으로 도입될 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 일 구체예에서, 몇몇 돌연변이의 삽입은 선택된 리포칼린 스캐폴드의 루프 AB 내로 도입될 수 있다(참조: 국제 특허 공개 번호 WO 2005/019256, 본원에 전체가 참고로 포함됨).
본원에 사용된 용어 "무작위 돌연변이유발"는 특정 서열 위치에 소정의 돌연변이(아미노산의 변경)가 존재하지 않지만, 돌연변이유발 동안 소정의 서열 위치에 적어도 2개의 아미노산이 일정한 확률로 도입될 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 이들의 유사성 또는 관계를 측정하는 서열의 속성을 나타낸다. 본 개시내용에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 본 개시내용의 단백질 또는 폴리펩타이드의 서열을 문제의 서열(상동성)과 정렬한 후 이 두 서열 중 더 긴 잔기의 수에 대한 쌍별 동일한 잔기의 백분율을 의미한다. 서열 동일성은 동일한 아미노산 잔기의 수를 전체 잔기의 수로 나누고 생성물에 100을 곱하여 측정한다.
본원에 사용된 용어 "서열 상동성" 또는 "상동성"은 통상적인 의미를 가지며 상동 아미노산은 동일한 아미노산뿐만 아니라 본 개시내용의 단백질 또는 폴리펩타이드의 선형 아미노산 서열(예를 들어, 본 개시내용의 임의의 융합 단백질 또는 리포칼린 뮤테인)의 등가 위치에서 보존적 치환으로 간주되는 아미노산을 포함한다.
숙련된 기술자는 이용 가능한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 BLAST(Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997), BLAST2(Altschul et al., J Mol Biol, 1990), TBLASTN(Altschul et al., J Mol Biol, 1990), FASTA(Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 1988), Gap(Wisconsin GCG package, Accelerys Inc) 및 Smith-Waterman(Smith and Waterman, J Mol Biol, 1981), 서열 상동성 또는 서열 결정용 표준 매개변수를 사용하여 식별한다. 서열 상동성 또는 서열 동일성의 백분율은 예를 들어, 2002년 11월 16일자 프로그램 BLASTP, 버전 2.2.5(Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997)를 사용하여 본원에서 결정될 수 있다. 이 구체예에서, 상동성의 백분율은 바람직하게는 쌍별 비교에서 레퍼런스로서 야생형 단백질 스캐폴드를 사용하여 프로펩타이드 서열을 포함하는 전체 단백질 또는 폴리펩타이드 서열(matrix: BLOSUM 62; gap costs: 11.1; 컷오프 값은 10-3으로 설정됨)의 정렬을 기반으로 한다. 이는 BLASTP 프로그램 출력에서 결과로 표시된 "양성"(상동 아미노산)의 수를 정렬을 위해 프로그램에서 선택한 총 아미노산 수로 나눈 백분율로 계산된다.
구체적으로, 리포칼린(뮤테인)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 야생형 리포칼린의 아미노산 서열 중 특정 위치에 해당하는 야생형 리포칼린과 다른지 여부를 확인하기 위해, 숙련된 기술자는 수동으로 또는 기본 로컬 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool) 또는 ClustalW를 나타내는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 프로그램 또는 서열 정렬을 생성하기에 적합한 임의의 다른 적합한 프로그램을 사용하여 정렬과 같은 기술 분야에 잘 알려진 수단 및 방법을 사용할 수 있다. 따라서, 리포칼린의 야생형 서열은 "대상 서열" 또는 "레퍼런스 서열"로 제공할 수 있는 반면, 본원에 기재된 야생형 리포칼린과 상이한 리포칼린의 아미노산 서열은 "퀴어리 서열"로 제공할 수 있다. "야생형 서열" 및 "레퍼런스 서열" 및 "대상 서열"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 인간 눈물 리포칼린의 바람직한 야생형 서열은 SEQ ID NO: 1에 나타낸 바와 같은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 서열이다. hNGAL의 바람직한 야생형 서열은 SEQ ID NO: 2에 나타낸 바와 같은 성숙한 hNGAL의 서열이다.
"갭"은 아미노산의 추가 또는 결실의 결과인 정렬의 공백이다. 따라서, 정확히 동일한 서열의 두 카피는 100% 동일성을 갖지만 덜 보존되고 결실, 추가 또는 대체가 있는 서열은 서열 동일성의 정도가 더 낮을 수 있다. 당업자는 표준 매개변수를 사용하여 서열 동일성을 결정하기 위해 여러 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 BLAST(Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997), BLAST2(Altschul et al., J Mol Biol, 1990), TBLASTN(Altschul et al., J Mol Biol, 1990), FASTA(Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 1988), Gap(Wisconsin GCG 패키지, Accelerys Inc) 및 Smith-Waterman(Smith and Waterman, J Mol Biol, 1981)를 사용할 수 있음을 인식할 것이다.
본원에 사용된 용어 "위치"는 본원에 기재된 아미노산 서열 내의 아미노산의 위치 또는 본원에 기재된 핵산 서열 내의 뉴클레오티드의 위치를 의미한다. 하나 이상의 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열 위치와 관련하여 본원에 사용된 용어 "상응하다" 또는 "상응하는"은 상응하는 위치가 선행하는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수에 의해서만 결정되는 것이 아님을 이해해야 한다. 따라서, 본 개시내용에 따른 주어진 아미노산의 절대 위치는 (돌연변이 또는 야생형) 리포칼린의 다른 곳에서 아미노산의 결실 또는 추가로 인해 상응하는 위치와 다를 수 있다. 유사하게, 본 개시내용에 따른 주어진 뉴클레오티드의 절대 위치는 프로모터 및/또는 기타 조절 서열 또는 유전자(엑손 및 인트론 포함)를 포함하는 뮤테인 또는 야생형 리포칼린 5'-비번역 영역(UTR)의 다른 곳에서 결실 또는 추가 뉴클레오티드로 인해 상응하는 위치와 다를 수 있다.
본 개시내용에 따른 "상응하는 위치"는 본 개시내용에 따른 쌍별 또는 다중 서열 정렬에서 그것이 상응하는 서열 위치에 정렬되는 서열 위치일 수 있다. 본 개시내용에 따른 "상응하는 위치"에 대해, 뉴클레오티드 또는 아미노산의 절대 위치는 인접 뉴클레오티드 또는 아미노산과 다를 수 있지만 상기 인접 뉴클레오티드 또는 아미노산은 교환, 결실 또는 추가되거나, 또는 추가된 동일한 하나 이상의 "상응하는 위치"에 포함될 수 있음을 이해해야 한다.
더욱이, 비록 리포칼린 중에서 고도로 보존된 전체 폴딩 패턴에 비추어 당업자에 의해 인식되는 절대 위치 번호가 다를 수 있다 하더라도 본 개시내용에 따른 레퍼런스 서열에 기초한 리포칼린 뮤테인 내의 상응하는 위치에 대해, 바람직하게는 리포칼린 뮤테인의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 위치가 레퍼런스 리포칼린(야생형 리포칼린) 또는 다른 리포칼린 뮤테인 내의 다른 위치에 구조적으로 상응할 수 있음을 이해해야 한다.
본원에 사용된 "항체"는 전체 항체 또는 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합 부분" 또는 이의 단일쇄)을 포함한다. 전체 항체는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개 이상의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인(VH 또는 HCVR) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개 도메인으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL 또는 LCVR) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예: 효과기 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 임의로 매개할 수 있다.
본원에 사용된 항체의 "항원 결합 단편"은 항원(예를 들어, GPC3)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VH, VL, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 F(ab')2 단편; (iii) VH, VL, CL 및 CH1 도메인 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역으로 구성된 Fab' 단편; (iv) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (v) 항체의 단일 암의 VH 및 VL 도메인으로 구성된 단일쇄 Fv 단편; (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., Nature, 1989); 및 (vii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 둘 이상의 분리된 CDR의 조합; (viii) 짧은 링커를 사용하여 동일한 폴리펩타이드 사슬에 연결된 VH 및 VL을 포함하는 "디아바디"(예를 들어, 특허 문헌 EP 404,097; WO 93/11161; 및 Holliger et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1993 참조); (ix) VH 또는 VL만을 함유하되, 일부 경우에 둘 이상의 VH 영역이 공유 결합된 "도메인 항체 단편"을 포함한다.
항체는 다클론성 또는 단클론성일 수 있다; 이종, 동종 또는 동계; 또는 이의 변형된 형태(예: 인간화, 키메라 또는 다중특이적). 항체는 또한 완전한 인간일 수 있다.
"대상체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 용어 "포유동물"은 본원에서 인간, 가축 및 농장 동물, 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어, 양, 개, 말, 고양이, 소, 쥐, 돼지, 시노몰구스 원숭이와 같은 유인원 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭하는 데 사용된다. 바람직하게는, 본원에서 "포유동물"은 인간, 마우스, 또는 인간이 아닌 영장류이다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
"유효량"은 유익하거나 원하는 결과에 영향을 미치기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
"샘플"은 대상체로부터 채취한 생물학적 샘플로 정의된다. 생물학적 샘플에는 혈액, 혈청, 소변, 대변, 정액 또는 조직이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "흡입 투여" 또는 "흡입에 의한 투여"는 일반적으로 경구 흡입 또는 비강 흡입에 의해 호흡기(respiratory tract)를 통한 물질의 투여를 지칭한다. 물질은 기체, 액체 에어로졸, 미세 분말 또는 액체 스프레이 형태일 수 있다. 흡입 투여는 흡입기를 사용하여 수행될 수 있다.
"투여 용량"은 대상체에게 투여된 화합물의 용량에 해당한다. 미세분무기 장치를 사용한 물질의 기관내 투여와 관련하여 "투여 용량"은 "전달 용량"에 해당한다.
특히 흡입 장치와 관련하여 "계량된 용량" 또는 "장치 용량"은 장치에 장착된 물질의 용량과 관련이 있다.
"전달 용량"은 대상체에게 전달되는 물질의 용량, 즉 장치를 적용할 때 흡입 장치에서 나오는 용량을 지칭한다. 예를 들어, 분무기는 최종 총 부피가 분무되지 않기 때문에 의도적으로 과충전되는 경우가 있다. 분무기의 경우 전달 용량은 일반적으로 기기에 로드된 총 활성 물질인 명목 용량의 50% 미만이다. 명목 용량은 장치 용량 또는 계량된 용량으로도 알려져 있다. 건조 분말 흡입기의 경우 전달 용량은 일반적으로 계량된 용량의 약 85~90%이다. 숙련자는 흡입 장치에서 나오는 물질의 양을 결정하여 전달 용량을 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 실험적으로 "전달 용량"을 측정하는 데 사용되는 방법은 유럽 약전 9.0의 섹션 2.9.44에 제공된다.
본원에 사용된 "국소 노출" 또는 "국소 투여"는 국소적으로 투여되는 물질의 실질적인 부분이 순환계로 유입되지 않음을 의미한다. 바람직하게는 순환계에 들어가는 물질의 양은 정량화 한계 이하(BLQ)이다. 다른 경우에 순환계에 들어가는 물질의 양이 측정될 수 있지만 실질적인 것으로 간주되지는 않는다. 물질의 흡입 투여와 관련하여 "국소 노출" 또는 "국소 투여"는 물질이 본질적으로 호흡기 계통에 남아 있음을 의미할 수 있다. 경우에 따라, 특히 대상체가 사람인 경우 호흡기 계통에 잔류하는 물질의 양을 직접 측정하는 것이 어렵기 때문에 "국소 노출" 또는 "국소 투여"의 측정은 바람직하게는 순환계에 들어가는 물질의 양을 측정하여 간접적으로 수행된다.
본원에 사용된 "전신 노출"은 국소 투여된 물질의 실질적인 부분이 순환계에 들어가고 선택적으로 전신이 물질에 의해 영향을 받을 수 있음을 의미한다. 전신 노출은 순환계에 들어가는 물질의 양을 정량화할 수 있음을 의미할 수 있다. 전신 노출은 정량화할 수 있는 혈류에 들어가는 물질의 농도와 동일할 수 있다. 이 노출은 시간 경과에 따라 측정할 수 있는 물질의 혈액(혈청, 혈장 또는 전혈) 농도로 나타낼 수 있으며 혈중농도-시간 곡선하면적(AUC)을 포함한 다양한 매개변수로 기록할 수 있다. 물질에 대한 전신 노출은 또한 바이오마커에 영향을 미칠 수 있으며, 그 수준은 물질 농도 및 전신 노출과 직접적으로 관련될 수 있다. 전신 노출과 관련하여 사용되는 "정량할 수 있는" 또는 "검출가능한"이라는 용어는 당업계에 공지된 하나 이상의 분석 방법에 의해 측정가능한 물질의 혈액(혈청, 혈장 또는 전혈) 농도 또는 바이오마커의 수준으로 표시되는 노출을 지칭한다. 이러한 분석 방법에는 ELISA, 경쟁적 ELISA, 형광 적정, 열량계 방법, 질량 분석법(MS) 및 크로마토그래피 방법, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 또한 이러한 분석 방법을 사용하여 수행된 측정은 기기 검출 한계, 방법 검출 한계 및 정량화 한계와 같은 검출 한계와 관련되어 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 약물의 "시작" 또는 "작용의 시작"은 약물의 효과가 투여 동안 현저하게 되는 데 걸리는 시간을 지칭한다. 일부 구체예에서, 약물의 효과는 예를 들어, 최대 치료 효과의 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 도달 시 현저한 것으로 간주될 수 있다. 일부 구체예에서, 약물이 투여되는 대상체의 증상(들)이 완화될 때 약물의 효과가 현저한 것으로 간주될 수 있다. 약물의 시작은 그러한 약물의 임의의 투여 종료로부터 기준선과 비교하여 약물의 치료 효과 변화의 원하는 수준, 예를 들어 90% 또는 최대 수준에 도달하는 시간을 측정함으로써 정량화될 수 있다. 일부 특정 구체예에서, 약물의 시작은 실시예 4에 기재된 바와 같이 기준선에 비해 경동맥 저항의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그보다 더 높은 백분율 감소를 달성하는 시간의 지속 기간으로서 결정될 수 있다. 약물의 시작은 예를 들면 약 1 내지 5분, 약 1 내지 25분, 약 5 내지 25분, 또는 약 10 내지 20분일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소의 전부 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 그러나 이 용어는 구체적인 숫자도 포함한다. 예를 들어 "약 20"은 20을 포함한다.
도 1은 실시예 1에 기재된 바와 같이 SEQ ID NO: 3(hNGAL의 리포칼린 뮤테인, 도 1A) 및 SEQ ID NO: 4(hTlc의 리포칼린 뮤테인, 도 1B)의 마우스에서 약동학 분석 결과를 제공한다. 마우스에 100 ㎍/kg의 용량으로 시험 리포칼린 뮤테인을 기관내 투여하였다. 기관지폐포 세척액(BALF), 정규화된 폐 균질액 및 혈장의 약물 수준을 전기화학발광(ECL) 기반 분석을 사용하여 검출하였다. 리포칼린 뮤테인은 세 구획 각각에서 유사한 PK 프로파일을 갖는 상이한 농도를 나타낸다.
도 2는 실시예 2에 기술된 바와 같이 100 ㎍/mouse의 용량으로 SEQ ID NO: 3(hNGAL의 리포칼린 뮤테인, 도 2A) 또는 SEQ ID NO: 4(hTlc의 리포칼린 뮤테인, 도 2B)를 기관내 투여한 마우스의 약동학 분석 결과를 제공한다. ECL 기반 분석을 사용하여 BALF, 정규화된 폐 균질액 및 혈장의 약물 수준을 검출하였다. 리포칼린 뮤테인은 세 구획 각각에서 유사한 PK 프로파일을 나타낸다. 두 리포칼린 뮤테인은 세 구획 모두에서 농도의 시간 의존적 감소를 나타내지만 BALF의 AUCinf로 측정한 노출 수준이 혈장보다 큰 폐보다 더 높다.
도 3은 실시예 3에 기재된 바와 같이 2 mg/kg의 용량으로 SEQ ID NO: 3(hNGAL의 리포칼린 뮤테인) 또는 SEQ ID NO: 4(hTlc의 리포칼린 뮤테인)를 정맥내 주사한 마우스의 약동학 분석 결과를 제공한다. ECL 기반 분석을 사용하여 혈청 약물 수준을 검출하였다. 두 개의 리포칼린 뮤테인은 유사한 PK 프로파일을 나타낸다.
도 4는 1 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여, 5 mg/kg의 용량으로 피하 투여, 5 mg/kg의 용량으로 기관내 투여 또는 5 mg/kg의 용량으로 푸마릴 디케토피페라진(FDKP)을 기관내 투여한 후 예시적인 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 47)으로 처리된 랫트에서 감각 신경 매개 혈관 확장의 결과를 제공한다. 대조군으로서, 레퍼런스 항-CGRP 항체(SEQ ID NO: 204 및 205)도 실시예 4에 기재된 바와 같이 정맥내 투여를 통해 검사되었다. 리포칼린 뮤테인 처리된 동물에서 신경 자극 후 랫트 뒷발의 등쪽 피부의 진피 혈류는 처리되지 않은 동물에서 관찰된 것보다 유의하게 감소하였으며, 최대 변화는 레퍼런스 항-CGRP 항체에서 관찰된 것과 유사한 최대 변화를 나타내며, 이는 CGRP 차단을 통한 증가된 혈관수축을 가리킨다. 기관내 투여된 리포칼린 뮤테인은 피하 투여된 리포칼린 뮤테인보다 더 빠른 시작을 나타내고 정맥내 투여된 리포칼린 뮤테인 또는 레퍼런스 항체와 비교하여 동등하거나 훨씬 더 빠른 시작을 나타낸다.
도 5는 실시예 4에 기재된 바와 같이 2.5 mg/kg, 5 mg/kg 또는 10 mg/kg의 용량으로 기관내 투여(도 5A), 1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 또는 10 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여(도 5B) 후, 예시적인 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 47)으로 처리된 랫트에서 감각 신경 매개 혈관 확장의 결과를 제공한다. 대조군으로서, 레퍼런스 항-CGRP 항체(SEQ ID NO: 204 및 205)도 정맥내 투여를 통해 검사되었다. 리포칼린 뮤테인 처리 동물에서 신경 자극 후 랫트 뒷발의 등쪽 피부의 진피 혈류는 처리되지 않은 동물에서 관찰된 것보다 현저히 감소하며, 이는 CGRP 차단을 통한 증가된 혈관수축을 가리킨다. 기관내 투여된 리포칼린 뮤테인 SEQ ID NO: 47은 혈관 확장을 억제하는 데 2시간의 연구 기간에 걸쳐 신속한 시작(몇분 이내) 및 지속적인 효능을 보여준다.
도 6은 실시예 4에 기재된 바와 같이 2.5 mg/kg, 5 mg/kg 또는 10 mg/kg의 용량으로 기관내 투여(도 6A), 또는 1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 또는 10 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여(도 6B) 후, 예시적인 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 47)으로 처리된 랫트에서 혈장 리포칼린 뮤테인 농도를 제공한다.
본 발명은 흡입에 의해 투여되는 리포칼린 뮤테인이 호흡기, 특히 폐에서 국소 노출을 초래한다는 놀라운 발견에 기초한다. 흡입 약물은 일반적으로 전신 전달(경구 또는 주사)에 필요한 것보다 더 낮은 용량을 허용하므로 심각한 부작용의 가능성이 더 적고 더불어 더 낮은 위험 프로파일을 수행한다(Bodier-Montagutelli et al., Expert Opin Drug Deliv , 2018). 흡입 약물의 다른 장점으로는 자가 투여가 용이하고 환자의 순응도가 더 좋으며(주사에 비해) 더 빠른 작용 방식이 있다. 국소 전달 후 전신 확산도 일부 경우에 발생하며 치료 효과를 제공한다. 본 발명은 또한 흡입에 의해 투여되는 리포칼린 뮤테인이 전신 노출을 유발할 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 이론에 얽매이지 않고 리포칼린 뮤테인이 전신 순환계에 유입되는지 또는 전신 노출이 검출될 수 있는지 여부는 특히 폐에 투여되거나 전달되는 리포칼린 뮤테인의 용량에 의존하는 것으로 여겨진다.
본 발명은 또한 흡입에 의한 리포칼린 뮤테인의 전신 투여가 순환계로 리포칼린 뮤테인의 신속한 전달을 가능하게 한다는 놀라운 발견에 기초한다. 놀랍게도 혈장에서 리포칼린 뮤테인의 최대 농도는 리포칼린 뮤테인 투여 후 약 0.1 내지 약 10시간 후, 바람직하게는 투여 후 약 0.5시간 내지 약 5시간 후, 바람직하게는 투여 후 약 1시간 내지 약 2시간 후에 도달할 수 있다는 것이 발견되었다.
본 발명은 또한 리포칼린 뮤테인의 높은 수준의 전신 노출(전달 용량의 한 자리 또는 두 자리 백분율)이 이러한 리포칼린 뮤테인의 흡입 투여에 의해 달성될 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 이러한 높은 수준은 WO 2013/087660에서 마우스에 기관내 투여된 리포칼린 뮤테인의 0.2% 만이 투여 1시간 후에 혈액에서 검출된 실험이 개시되어 있기 때문에 놀라운 것이다.
본 발명은 또한 리포칼린 뮤테인의 검출가능한 전신 노출 없이 폐로의 국소 투여가 리포칼린 뮤테인의 용량에 따라 달성될 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 이는 리포칼린 뮤테인의 치료 효과가 폐에서 국소적으로 달성되고 리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출이 필요하지 않거나 심지어 바람직하지 않은 경우에 특히 유리하다.
따라서, 본 발명은 대상체에게 리포칼린 뮤테인을 투여하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 흡입에 의해 리포칼린 뮤테인을 투여하는 것을 포함하되, 투여는 호흡기의 리포칼린 뮤테인에 대한 국소 노출을 제공한다.
본 발명은 또한 대상체의 치료 용도를 위한 리포칼린 뮤테인에 관한 것으로, 이 용도는 흡입에 의해 리포칼린 뮤테인을 투여하는 것을 포함하되, 투여는 호흡기의 리포칼린 뮤테인에 대한 국소 노출을 제공한다.
본 발명은 또한 흡입 투여용 의약 제조를 위한 리포칼린 뮤테인의 용도에 관한 것으로, 흡입 투여는 호흡기의 리포칼린 뮤테인에 대한 국소 노출을 제공한다.
본 발명은 또한 대상체에게 리포칼린 뮤테인을 투여하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 흡입에 의해 리포칼린 뮤테인을 투여하는 것을 포함하되, 투여는 리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출을 제공한다.
본 발명은 또한 대상체의 치료 용도를 위한 리포칼린 뮤테인에 관한 것으로, 이 용도는 흡입에 의해 리포칼린 뮤테인을 투여하는 것을 포함하되, 투여는 리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출을 제공한다.
본 발명은 또한 흡입 투여를 위한 의약 제조를 위한 리포칼린 뮤테인의 용도에 관한 것으로, 흡입 투여는 리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출을 제공한다.
A. 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인
본원에 사용된 "리포칼린"은 한쪽 말단에서 복수(바람직하게는 4개)의 루프에 의해 쌍으로 연결된 복수(바람직하게는 8개)의 β-가닥을 포함하여 결합 포켓이라 정의되는 원통형의 β-주름 시트 초이차 구조 영역을 갖는 대략 18-20 kDa 중량의 단량체 단백질로 정의된다. 각각 상이한 크기, 모양 및 화학적 특성의 표적을 수용할 수 있는 리포칼린 패밀리 구성원 간에 다양한 상이한 결합 양식을 발생시키는 그밖의 견고한 리포칼린 스캐폴드에 있는 루프의 다양성이다(예를 들어, Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996에서 검토됨). 실제로, 단백질의 리포칼린 패밀리는 매우 낮은 수준의 전체 서열 보존(종종 20% 미만의 서열 동일성을 가짐)을 공유하면서도 고도로 보존된 전체 폴딩 패턴을 유지하면서 광범위한 리간드에 결합하도록 자연적으로 진화하였다. 다양한 리포칼린에서 위치 간의 일치는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 7,250,297 참조).
상기 언급된 바와 같이, 리포칼린은 그의 초이차 구조, 즉 결합 포켓을 정의하기 위해 한쪽 말단에서 4개의 루프에 의해 쌍으로 연결된 8개의 β-가닥을 포함하는 원통형의 β-주름 시트 초이차 구조 영역에 의해 정의된 폴리펩타이드이다. 본 개시내용은 본원에 구체적으로 개시된 리포칼린 뮤테인으로 제한되지 않는다. 이와 관련하여, 본 개시내용은 결합 포켓으로 정의되는 한쪽 말단에서 4개의 루프에 의해 쌍으로 연결된 8개의 β-가닥을 포함하는 원통형의 β-주름 시트 초이차 구조 영역을 갖는 리포칼린 뮤테인에 관한 것으로, 각각의 적어도 하나의 아미노산은 상기 4개의 루프 중 적어도 3개의 루프가 레퍼런스 서열과 비교하여 돌연변이되었고, 상기 리포칼린은 검출가능한 친화도로 그의 표적에 결합하는데 효과적이다.
본 개시내용에 따른 리포칼린 뮤테인은 임의의 리포칼린의 뮤테인일 수 있다. 뮤테인이 사용될 수 있는 적합한 리포칼린(때때로 "레퍼런스 리포칼린", "야생형 리포칼린", "레퍼런스 단백질 스캐폴드" 또는 단순히 "스캐폴드"로 지정되기도 함)의 예에는 눈물 리포칼린(리포칼린-1, Tlc 또는 폰 에브너선 단백질), 레티놀 결합 단백질, 호중구 리포칼린-유형 프로스타글란딘 D-합성효소, β-락토글로불린, 빌린-결합 단백질(BBP), 아포리포단백질 D(APOD), 호중구 젤라티나제-연관 리포칼린(NGAL), α2-마이크로글로불린-관련 단백질(A2m), 24p3/우테로칼린(24p3), 폰 에브너선 단백질 1(VEGP 1), 폰 에브너선 단백질 2(VEGP 2) 및 메이저 알레르겐 칸 f1(Major allergen Can f 1: ALL-1)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 관련 구현예에서, 리포칼린 뮤테인은 인간 눈물 리포칼린(hTlc), 인간 호중구 젤라티나제-연관 리포칼린(hNGAL), 인간 아포리포단백질 D(hAPOD) 및 피에리스 브라시캐(Pieris brasicae)의 빌린 결합 단백질에서 유래된다.
본 개시내용에 따른 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 다른 리포칼린과의 서열 동일성과 비교할 때(또한 상기 참조), 그것이 유래된 레퍼런스(또는 야생형) 리포칼린, 예를 들어, hTlc 또는 hNGAL과 비교하여 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 이러한 일반적인 맥락에서, 본 개시내용에 따른 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 상응하는 레퍼런스(야생형) 리포칼린의 아미노산 서열과 적어도 실질적으로 유사하며, 단, 아미노산의 추가 또는 결실의 결과인 정렬에서 갭(본원에 정의된 바와 같음)이 있을 수 있다. 상응하는 레퍼런스(야생형) 리포칼린의 서열과 실질적으로 유사한 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인의 각각의 서열은, 일부 구체예에서, 상응하는 리포칼린의 서열과 적어도 95% 동일성을 포함하여 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90% 동일성을 갖는다. 이와 관련하여, 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인은 물론 리포칼린 뮤테인이 선택된 표적에 결합할 수 있게 하는 본원에 기재된 바와 같은 치환을 함유할 수 있다.
일반적으로, 리포칼린 뮤테인은 야생형 또는 레퍼런스 리포칼린, 예를 들어 hTlc 및 hNGAL의 아미노산 서열에 비해 리간드 결합 포켓을 포함하고 리간드 결합 포켓의 입구를 정의하는 열린 말단의 4개의 루프(상기 참조)에서 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함한다. 상기에서 설명한 바와 같이, 이들 영역은 원하는 표적에 대한 리포칼린 뮤테인의 결합 특이성을 결정하는 데 필수적이다. 일부 구체예에서, 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인은 또한 4개의 루프 외부에 돌연변이된 아미노산 잔기 영역을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인은 리포칼린의 폐쇄 말단에서 β-가닥을 연결하는 3개의 펩타이드 루프(BC, DE 및 FG로 지정됨) 중 하나 이상에 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 눈물 리포칼린, NGAL 리포칼린 또는 그의 상동체로부터 유래된 뮤테인은 N-말단 영역 및/또는 3개의 펩타이드 루프 BC, DE, FG는 천연 리포칼린 결합 포켓 반대편에 위치한 β-배럴 구조의 끝에 배열된다. 일부 구체예에서, 눈물 리포칼린, NGAL 리포칼린 또는 이의 상동체로부터 유래된 뮤테인은 눈물 리포칼린의 야생형 서열과 비교하여 β-배럴 구조의 말단에 배열된 펩타이드 루프 DE에 돌연변이된 아미노산 잔기가 없을 수 있다.
제공된 리포칼린 뮤테인이 그것의 표적에 결합하는 능력을 유지하는 한 치환, 결실 및 삽입을 포함하여 돌연변이의 임의의 유형 및 수가 예상되며, 및/또는 그것은 레퍼런스(야생형) 리포칼린 예를 들어, 성숙 hTlc 또는 성숙 hNGAL의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예컨대 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진다. 일부 구체예에서, 치환은 보존적 치환이다. 일부 구체예에서, 치환은 비보존적 치환이다.
구체적으로, 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 레퍼런스(야생형) 리포칼린의 아미노산 서열의 특정 위치에 상응하는지 여부를 확인하기 위해 숙련된 기술자는 당업계에 잘 알려진 수단 및 방법, 예를 들어, 수동으로 또는 Basic Local Alignment Search Tool 또는 ClustalW를 나타내는 BLAST2.0과 같은 컴퓨터 프로그램, 또는 서열 정렬을 생성하기에 적합한 임의의 다른 적합한 프로그램을 사용한 정렬을 이용할 수 있다. 따라서 레퍼런스(야생형) 리포칼린의 아미노산 서열은 "대상 서열" 또는 "레퍼런스 서열"로 제공하는 한편, 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 "퀴어리 서열"로 제공할 수 있다(상기 참조).
보존적 치환은 일반적으로 돌연변이될 아미노산에 따라 나열된 다음의 치환이며, 각각은 보존적이라고 간주될 수 있는 하나 이상의 치환이 뒤따른다: Ala → Ser, Thr, 또는 Val; Arg → Lys, Gln, Asn, 또는 His; Asn → Gln, Glu, Asp, 또는 His; Asp → Glu, Gln, Asn, 또는 His; Gln → Asn, Asp, Glu, 또는 His; Glu → Asp, Asn, Gln, 또는 His; His → Arg, Lys, Asn, Gln, Asp, 또는 Glu; Ile → Thr, Leu, Met, Phe, Val, Trp, Tyr, Ala, 또는 Pro; Leu → Thr, Ile,Val, Met, Ala, Phe, Pro, Tyr, 또는 Trp; Lys → Arg, His, Gln, 또는 Asn; Met → Thr, Leu, Tyr, Ile, Phe, Val, Ala, Pro, 또는 Trp; Phe → Thr, Met, Leu, Tyr, Ile, Pro, Trp, Val, 또는 Ala; Ser → Thr, Ala, 또는 Val; Thr → Ser, Ala, Val, Ile, Met, Val, Phe, Pro, 또는 Leu; Trp → Tyr, Phe, Met, Ile, 또는 Leu; Tyr → Trp, Phe, Ile, Leu, 또는 Met; Val → Thr, Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Ser, 또는 Pro. 다른 치환도 허용되며 경험적으로 또는 알려진 다른 보존적 또는 비보존적 치환에 따라 결정할 수 있다. 추가적인 방향으로서, 다음의 그룹들은 일반적으로 서로에 대한 보존적 치환을 정의하는 데 사용할 수 있는 아미노산을 각각 포함한다: (a) 알라닌(Ala), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 발린(Val); (b) 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 글루타민(Gln), 아스파라긴(Asn), 히스티딘(His); (c) 아르기닌(Arg), 리신(Lys), 글루타민(Gln), 아스파라긴(Asn), 히스티딘(His); (d) 이소루신(Ile), 루신(Leu), 메티오닌(Met), 발린(Val), 알라닌(Ala), 페닐알라닌(Phe), 트레오닌(Thr), 프롤린(Pro); 및 (e) 이소루신(Ile), 루신(Leu), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 트립토판(Trp).
그러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하는 경우, 다음과 같은 더 실질적인 변화 또는 아미노산 클래스와 관련하여 하기에 추가로 설명되는 바와 같은 변화가 도입될 수 있고 원하는 특성에 대해 생성물이 스크리닝될 수 있다. 이러한 보다 실질적인 변화의 예는 다음과 같다: Ala → Leu 또는 Phe; Arg → Glu; Asn → Ile, Val, 또는 Trp; Asp → Met; Cys → Pro; Gln → Phe; Glu → Arg; His → Gly; Ile → Lys, Glu, 또는 Gln; Leu → Lys 또는 Ser; Lys → Tyr; Met → Glu; Phe → Glu, Gln, 또는 Asp; Trp → Cys; Tyr → Glu 또는 Asp; Val → Lys, Arg, His.
일부 구체예에서, 리포칼린(뮤테인)의 물리적 및 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형태와 같은 치환 영역에서 폴리펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 그들의 효과에서 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성된다.
자연적으로 발생하는 잔기는 공통 측쇄 특성에 따라 그룹으로 나뉜다: (1) 소수성: 메티오닌, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신; (2) 중성 친수성: 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민; (3) 산성: 아스파르트산, 글루탐산; (4) 염기성: 히스티딘, 리신, 아르기닌; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: 글리신, 프롤린; 및 (6) 방향족: 트립토판, 티로신, 페닐알라닌. 일부 구체예에서. 치환은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 수 있다.
비-보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반한다. 각각의 리포칼린의 적절한 형태를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 분자의 산화 안정성을 개선하고 비정상적인 가교를 방지하기 위해 일반적으로 세린으로 치환될 수도 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)은 안정성을 향상시키기 위해 리포칼린에 추가될 수 있다.
각각의 리포칼린의 적절한 형태를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 분자의 산화 안정성을 개선하고 비정상적인 가교를 방지하기 위해 일반적으로 세린으로 치환될 수도 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)은 안정성을 향상시키기 위해 리포칼린에 추가될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린(hTlc)의 뮤테인이거나 이를 포함할 수 있다. 성숙 hTlc의 뮤테인은 본원에서 "Tlc 뮤테인"으로 지정될 수 있다. 일부 다른 구체예에서, 본원에 개시된 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 호중구 젤라티나제-연관 리포칼린(hNGAL)의 뮤테인이다. 성숙 hNGAL의 뮤테인은 본원에서 "hNGAL 뮤테인"으로 지정될 수 있다.
상기에서 논의된 삽입을 포함한 모든 돌연변이는 핵산 예를 들어, 확립된 표준 방법을 사용하여 DNA 수준에서 매우 쉽게 달성될 수 있다. 아미노산 서열의 변경의 예시적인 예는 삽입 또는 결실 뿐만 아니라 아미노산 치환이다. 또한, 이러한 결실 또는 삽입이 안정한 접힘/기능적 뮤테인을 생성하는 한 단일 아미노산 잔기를 대체하는 대신 리포칼린(뮤테인)의 1차 구조의 하나 이상의 연속 아미노산을 삽입하거나 결실시키는 것도 가능하다.
아미노산 서열의 변형은 특정 제한 효소를 위한 절단 부위를 통합함으로써 돌연변이된 리포칼린 유전자 또는 그 부분의 서브클로닝을 단순화하기 위해 단일 아미노산 위치의 유도된 돌연변이유발을 포함한다. 게다가, 이러한 돌연변이는 또한 주어진 표적에 대한 리포칼린 뮤테인의 친화도를 추가로 개선하기 위해 통합될 수 있다. 또한, 돌연변이는 접힘 안정성, 혈청 안정성, 단백질 저항성 또는 수용성을 개선하거나 필요한 경우 응집 경향을 감소시키는 것과 같은 뮤테인의 특정 특성을 조절하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기는 이황화 브릿지 형성을 방지하기 위해 다른 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 새로운 반응기를 도입하기 위해 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 히드록시에틸 스타치(HES), 비오틴, 펩타이드 또는 단백질과 같은 다른 화합물에 대한 컨쥬게이션, 또는 비천연 이황화 결합의 형성을 위해 의도적으로 다른 아미노산 서열 위치를 시스테인으로 돌연변이시키는 것도 가능하다. 생성된 티올 모이어티는 예를 들어 각각의 리포칼린 뮤테인의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 뮤테인을 페길화 또는 헤실화하는 데 사용될 수 있다. hTlc 뮤테인의 아미노산 서열 내로 시스테인 잔기를 도입하기 위한 그러한 돌연변이의 예시적인 가능성은 치환 Thr 40→ Cys, Glu 73→ Cys, Arg 90→ Cys, Asp 95→ Cys, 및 Glu 131→ Cys를 포함한다. 유사하게, 인간 NGAL의 뮤테인과 관련하여, 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열 내로 시스테인 잔기를 도입하는 예시적인 가능성은 인간 NGAL의 야생형 서열의 서열 위치 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 또는 158에 상응하는 서열 위치 중 적어도 하나에서 시스테인(Cys) 잔기의 도입을 포함한다. 임의의 상기 언급된 아미노산 위치의 측면에서 생성된 티올 모이어티는 예를 들어, 각각의 리포칼린 뮤테인의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 뮤테인을 페길화 또는 헤실화할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 개시내용에 따라 상기 화합물 중 하나를 리포칼린 뮤테인에 컨쥬게이션하기 위한 적합한 아미노산 측쇄를 제공하기 위해, 인공 아미노산이 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 일반적으로, 이러한 인공 아미노산은 보다 반응성이 높아 원하는 화합물에 대한 컨쥬게이션을 용이하게 하도록 설계된다. 인공 tRNA를 통해 도입될 수 있는 이러한 인공 아미노산의 한 예는 파라-아세틸-페닐알라닌이다.
본원에 개시된 뮤테인의 여러 적용을 위해 융합 단백질의 형태로 사용하는 것이 유리할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인은 그의 N-말단 또는 그의 C-말단에서 단백질, 단백질 도메인 또는 펩타이드, 예를 들어 신호 서열 및/또는 친화성 태그에 융합된다.
Strep-tag 또는 Strep-tag II(Schmidt et al., J Mol Biol, 1996), c-myc-tag, FLAG-tag, His-tag 또는 HA-tag와 같은 친화성 태그 또는 단백질 재조합 단백질의 용이한 검출 및/또는 정제를 허용하는 글루타티온-S-트랜스퍼라제는 적합한 융합 파트너의 추가 예이다. 마지막으로, 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 황색 형광 단백질(YFP)과 같은 발색 또는 형광 특성을 갖는 단백질은 또한 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인에 대한 적합한 융합 파트너이다.
일반적으로, 화학적, 물리적, 광학적 또는 효소적 반응에서 검출가능한 화합물 또는 신호를 직간접적으로 생성하는 임의의 적절한 화학 물질 또는 효소로 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인을 표지하는 것이 가능하다. 물리적 반응과 동시에 광학적 반응/마커의 예는 방사선 조사 시 형광 방출 또는 방사성 표지를 사용할 때 X선 방출이다. 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제 및 β-갈락토시다제는 발색 반응 생성물의 형성을 촉매하는 효소 표지(동시에 광학 표지)의 예이다. 일반적으로, 항체에 일반적으로 사용되는 모든 표지(이뮤노글로불린의 Fc 부분에서 당 모이어티와 독점적으로 사용되는 표지 제외)는 또한 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인에 대한 컨쥬게이션에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인은 또한 예를 들어, 주어진 세포, 조직 또는 기관에 이러한 제제의 표적화된 전달을 위해, 또는 주변 정상 세포에 영향을 미치지 않으면서 세포(예: 종양 세포)를 선택적으로 표적화하기 위해 임의의 적합한 치료 활성제와 컨쥬게이션될 수 있다. 이러한 치료 활성제의 예는 방사성 핵종, 독소, 작은 유기 분자, 및 치료 펩타이드(예를 들어, 세포 표면 수용체의 작용제/길항제로 작용하는 펩타이드 또는 주어진 세포 표적 상의 단백질 결합 부위에 대해 경쟁하는 펩타이드)를 포함한다. 그러나, 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인은 또한 안티센스 핵산 분자, 작은 간섭 RNA, 마이크로 RNA 또는 리보자임과 같은 치료 활성 핵산과 컨쥬게이션될 수 있다. 이러한 컨쥬게이트는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 리포칼린 뮤테인의 생산 방법에 관한 것으로, 뮤테인, 뮤테인의 단편 또는 뮤테인과 다른 폴리펩타이드의 융합 단백질은 유전 공학 방법에 의해 뮤테인을 코딩하는 핵산으로부터 시작하여 생산된다. 상기 방법은 생체 내에서 수행될 수 있고, 리포칼린 뮤테인은 예를 들어 세균 또는 진핵 숙주 생물체에서 생산될 수 있으며, 그리고 나서 이 숙주 생물체 또는 그 배양물에서 분리된다. 예를 들어 시험관내 번역 시스템을 사용하여 시험관내에서 단백질을 생산하는 것도 가능하다.
생체내에서 리포칼린 뮤테인을 생산할 때, 이러한 뮤테인을 암호화하는 핵산은 재조합 DNA 기술(위에서 이미 요약된 바와 같음)에 의해 적합한 세균 또는 진핵 숙주 생물체 내로 도입된다. 이러한 목적을 위해, 숙주 세포는 먼저 확립된 표준 방법을 사용하여 본원에 기재된 리포칼린 뮤테인을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 클로닝 벡터로 형질전환된다. 그런 다음 숙주 세포는 이종 DNA의 발현을 허용하고 이에 따라 상응하는 폴리펩타이드의 합성을 허용하는 조건 하에 배양된다. 이어서, 폴리펩타이드는 세포 또는 배양 배지로부터 회수된다.
일부 구체예에서, 본 출원에 개시된 DNA와 같은 핵산 분자는 본 개시내용의 융합 단백질의 발현을 허용하기 위해 본 개시내용의 또 다른 핵산 분자에 "작동가능하게 연결"될 수 있다. 이와 관련하여, 작동가능한 연결은 제1 핵산 분자의 서열 요소와 제2 핵산 분자의 서열 요소가 융합 단백질을 단일 폴리펩타이드로 발현할 수 있는 방식으로 연결되는 연결이다.
또한, 본 개시내용의 hTlc 뮤테인에 대한 일부 구체예에서, Cys 61과 Cys 153 사이의 자연적으로 발생하는 이황화 결합이 제거될 수 있다. 따라서, 그러한 뮤테인은 환원 레독스 환경을 갖는 세포 구획, 예를 들어 그람-음성 세균의 세포질에서 생성될 수 있다.
본 개시내용의 리포칼린 뮤테인이 분자내 이황화 결합을 포함하는 경우, 적절한 신호 서열을 사용하여 초기 폴리펩타이드를 산화 레독스 환경을 갖는 세포 구획으로 유도하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 산화 환경은 대장균(E. coli)과 같은 그람-음성 세균의 주변 세포질, 그람-양성 세균의 세포외 환경 또는 진핵 세포의 소포체 내강에서 제공될 수 있으며 일반적으로 구조적 이황화 결합의 형성을 선호한다 .
그러나, 숙주 세포, 바람직하게는 대장균의 세포질에서 본 발명의 뮤테인을 생산하는 것도 가능하다. 이 경우, 폴리펩타이드는 가용성 및 접힌 상태로 직접 수득되거나 봉입체의 형태로 회수된 후 시험관내에서 재생될 수 있다. 추가 옵션은 산화성 세포내 환경을 갖는 특정 숙주 균주를 사용하는 것인데, 이는 세포질에서 이황화 결합의 형성을 허용할 수 있다(Venturi et al., J Mol Biol, 2002).
그러나, 본원에 기재된 리포칼린 뮤테인이 반드시 유전 공학의 사용에 의해서만 생성되거나 생성되는 것은 아닐 수 있다. 오히려, 그러한 뮤테인은 또한 메리필드(Merrifield) 고체상 폴리펩타이드 합성과 같은 화학적 합성 또는 시험관내 전사 및 번역에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어 분자 모델링을 사용하여 유망한 돌연변이를 확인하고, 이러한 돌연변이를 계속하는 폴리펩타이드는 시험관내에서 합성하고, 표적 및 기타 바람직한 특성(예: 안정성)에 대한 결합 활성을 조사하는 것이 가능하다. 폴리펩타이드/단백질의 고체상 및/또는 용액상 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Bruckdorfer et al., Curr Pharm Biotechnol, 2004 참조).
또 다른 구체예에서, 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인은 당업자에게 공지된 잘 확립된 방법을 사용하는 시험관내 전사/번역에 의해 생성될 수 있다.
숙련된 작업자는 본 개시내용에 의해 고려되지만 그의 단백질 또는 핵산 서열이 여기에 명시적으로 개시되어 있지 않은 리포칼린 뮤테인을 제조하는데 유용한 방법을 인식할 것이다. 개요로서, 아미노산 서열의 이러한 변형은 예를 들어 특정 제한 효소를 위한 절단 부위를 통합함으로써 돌연변이된 리포칼린 유전자 또는 이의 일부의 서브클로닝을 단순화하기 위한 단일 아미노산 위치의 유도된 돌연변이유발을 포함한다. 또한, 이러한 돌연변이는 표적에 대한 리포칼린 뮤테인의 친화도를 추가로 개선하기 위해 통합될 수도 있다. 또한, 돌연변이는 필요에 따라 접힘 안정성, 혈청 안정성, 단백질 저항성 또는 수용성을 개선하거나 응집 경향을 감소시키는 것과 같은 뮤테인의 특정 특성을 조절하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기는 이황화 브릿지 형성을 방지하기 위해 다른 아미노산으로 돌연변이될 수 있다.
본원에 개시된 리포칼린 뮤테인 및 이의 유도체는 항체 또는 이의 단편과 유사한 많은 분야에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 리포칼린 뮤테인은 효소, 항체, 방사성 물질 또는 생화학적 활성 또는 정의된 결합 특성을 갖는 임의의 다른 그룹으로 표지하는데 사용될 수 있다. 그렇게 함으로써, 그들의 각각의 표적 또는 이의 컨쥬게이트 또는 융합 단백질이 검출되거나 그들과 접촉될 수 있다. 또한, 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인은 확립된 분석 방법(예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯)에 의해 또는 현미경 또는 면역센서에 의해 화학 구조를 검출하는 역할을 할 수 있다. 이와 관련하여, 검출 신호는 적합한 뮤테인 컨쥬게이트 또는 융합 단백질의 사용에 의해 직접 생성되거나 항체를 통해 결합된 뮤테인의 면역화학적 검출에 의해 간접적으로 생성될 수 있다.
1. IL4-Rα에 특이적인 리포칼린 뮤테인
인터루킨-4 수용체 알파 사슬(IL-4Rα)은 인터루킨 4 및 인터루킨 13에 결합하여 B 세포에서 IgE 항체 생산을 조절할 수 있는 유형 I 막횡단 단백질이다. T 세포 중에서 코딩된 단백질 역시 인터루킨 4에 결합하여 Th2 세포의 분화를 촉진할 수 있다.
IL-4 수용체, 특히 인간 IL-4Rα에 특이적인 리포칼린 뮤테인은 국제 특허 공개 WO 2008/015239, WO 2011/154420, 및 WO 2013/087660에 개시되어 있다. 인간 IL-4Rα에 특이적인 리포칼린 뮤테인의 흡입 투여는 2019년 미국 흉부학회 연례 회의(American Thoracic Society Annual Congress, Dallas, TX, USA, 5월 17-22일)에서 발표된, 천식 치료에 대한 유망한 임상 프로파일을 보여주는 흡입형 IL-4R 길항제 AZD1402/PRS-060에 대한 최초의 인간 데이터에 대한 Bruns IB, Fitzgerald MF, Pardali K, Gardiner P, Keeling DJ, Axelsson LT, Jiang F, Lickliter J, Close DR에 의해 및 2019년 9월 28일부터 10월 2일까지 스페인 마드리드에서 개최된 유럽 호흡기 학회 국제 회의에서 발표된, IL-4Rα의 강력하고 선택적 차단제인 흡입형 IL-4Rβ 길항제 AZD1402/PRS-060의 1상 평가에 대한 Bruns IB, Fitzgerald MF, Pardali K, Gardiner P, Keeling DJ, Axelsson LT, Jiang F, Lickliter J, Close DR에 의해 보고되었으며, 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 IL-4Rα-특이적인 리포칼린 뮤테인은 인간 눈물 리포칼린의 뮤테인일 수 있다. 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)과 비교하여, 이러한 뮤테인은 돌연변이된 아미노산 잔기의 다음 세트 중 하나를 포함할 수 있다:
(a) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Tyr; Glu 34 → Gly; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Ser 58 → Ile; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln;
(b) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Tyr; Glu 34 → Lys; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Ser 58 → Asn; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln;
(c) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys, Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Tyr; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Ser 58 → Arg; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln;
(d) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Tyr; Glu 34 → Ser; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln;
(e) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → His; Leu 33 → Tyr; Glu 34 → Ser; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Ser 58 → Ala; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln;
(f) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Tyr; Glu 34 → Asp; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Ser 58 → Lys; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln;
(g) Arg 26 → Ser;Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Tyr; Glu 34 → Gly; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln;
(h) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Tyr; Glu 34 → Gly; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Ser 58 → Ile; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln;
(i) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Tyr; Glu 34 → Lys; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Ser 58 → Asn; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln;
(j) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys, Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Tyr; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Ser 58 → Arg; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln;
(k) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Tyr; Glu 34 → Ser; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln;
(l) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → His; Leu 33 → Tyr; Glu 34 → Ser; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Ser 58 → Ala; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln;
(m) Arg 26 → Ser; Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Tyr; Glu 34 → Asp; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Ser 58 → Lys; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln; 또는
(n) Arg 26 → Ser;Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Asn 32 → Tyr; Leu 33 → Tyr; Glu 34 → Gly; Leu 56 → Gln; Ile 57 → Arg; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln.
본 개시내용의 IL-4Rα-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 177-194, 또는 이의 단편 또는 변이체로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 IL-4Rα-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 177-194 중 어느 하나에 도시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.
2. CGRP에 대해 특이적인 리포칼린 뮤테인
칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)는 중추 및 말초 신경계의 신경에서 분비되는 혈관 활성 신경 펩타이드이며, 여기서 CGRP 함유 뉴런은 혈관과 밀접하게 연관된다. CGRP 매개 혈관 확장은 또한 혈장의 혈관외 유출 및 미세혈관의 혈관 확장을 초래하고 편두통에 존재하는 일련의 사건의 일부로서 신경성 염증과 관련이 있다.
CGRP에 특이적인 리포칼린 뮤테인은 국제 특허 공개 WO 2017/097946에 개시되어 있다.
본 개시내용의 CGRP-특이적인 리포칼린 뮤테인은 hNGAL의 뮤테인일 수 있다. 성숙 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)과 비교하여, 이러한 돌연변이체는 돌연변이된 아미노산 잔기의 다음 세트 중 하나를 포함할 수 있다:
(a) Gln 28 → His; Leu 36 → Glu; Ala 40 → Trp; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Lys; Tyr 52 → Ala; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gln; Arg 72 → Ile; Lys 73 → Glu; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Ala; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Gln; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Trp; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Trp;
(b) Gln 28 → His; Leu 36 → Phe; Ala 40 → Met; Ile 41 → Trp; Gln 49 → Phe; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Trp; Arg 72 → Glu; Lys 73 → Ala; Trp 79 → Gly; Arg 81 → Asn; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gly; Tyr 100 → Pro; Leu 103 → Met; Tyr 106 → His; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Trp;
(c) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Thr; Tyr 52 → Gln; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ser; Lys 73 → Glu; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu;
(d) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ile 41 → Glu; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Trp; Lys 73 → Gln; Asp 77 → Ile; Trp 79 → Val; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Leu 103 → Thr; Tyr 106 → Ala; Lys 125 → Val; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Glu;
(e) Gln 28 → His; Leu 36 → Ile; Ala 40 → Trp; Ile 41 → Trp; Gln 49 → Leu; Ser 68 → His; Leu 70 → Met; Arg 72 → Met; Lys 73 → Thr; Trp 79 → Thr; Cys 87 → Ser; Tyr 100 → Ile; Leu 103 → Met; Tyr 106 → Leu; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Trp; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → His;
(f) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ser; Lys 73 → Glu; Lys 75 → Arg; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Phe 83 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu;
(g) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Leu 42 → Arg; Asp 47 → Asn; Gln 49 → Thr; Tyr 52 → Gln; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ser; Lys 73 → Glu; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Phe 83 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu;
(h) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Ser; Lys 73 → Glu; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Phe 83 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Val 126 → Met; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 145 → Ala;
(i) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Asp 47 → Asn; Gln 49 → Thr; Tyr 52 → Gln; Val 66 → Ala; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Ser; Lys 73 → Glu; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Phe 83 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Ile 97 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu;
(j) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Ile; Lys 62 → Arg; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ser; Lys 73 → Glu; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Ile; Ser 146 → Asn;
(k) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Gln; Lys 62 → Arg; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ser; Lys 73 → Glu; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Phe 83 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Lys 98 → Gln; Tyr 100 → His; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Val 126 → Met; Ser 127 → Gly; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu;
(l) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Lys; Lys 62 → Arg; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Leu; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Ile; Ser 146 → Asn;
(m) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Lys; Lys 62 → Arg; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Glu; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Ile; Ser 146 → Asn;
(n) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Lys; Lys 62 → Arg; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Ile; Ser 146 → Asn;
(o) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Lys; Lys 62 → Arg; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Arg; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Tyr 100 → His; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Ile; Ser 146 → Asn;
(p) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Met; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Val; Ser 146 → Asn;
(q) Gln 28 → His; Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Ile; Lys 62 → Arg; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ser; Lys 73 → Glu; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Val 111 → Met; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Ile; Ser 146 → Asn;
(r) Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Met; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Cys 76 → Arg; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Val; Ser 146 → Asn; Cys 175 → Phe;
(s) Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Met; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Cys 76 → Met; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Val; Ser 146 → Asn; Cys 175 → Tyr;
(t) Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Met; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Cys 76 → Leu; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Val; Ser 146 → Asn; Cys 175 → Trp;
(u) Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Met; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Cys 76 → Ile; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Val; Ser 146 → Asn; Cys 175 → Glu;
(v) Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Met; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Cys 76 → Val; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Val; Ser 146 → Asn; Cys 175 → Tyr;
(w) Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Met; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Cys 76 → Arg; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Val; Ser 146 → Asn; Cys 175 → Trp;
(x) Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Met; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Cys 76 → Asn; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Val; Ser 146 → Asn; Cys 175 → Leu;
(y) Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Met; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Cys 76 → Arg; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Val; Ser 146 → Asn; Cys 175 → Val;
(z) Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Met; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Cys 76 → Lys; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Val; Ser 146 → Asn; Cys 175 → Asp;
(aa) Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Met; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Cys 76 → Phe; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Val; Ser 146 → Asn; Cys 175 → Asp;
(bb) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Glu; Ile 41 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Ser; Lys 73 → Glu; Asp 77 → Ile; Trp 79 → Val; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Lys 125 → Val; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu;
(cc) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Ala; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu;
(dd) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Gly 38 → Ala; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Ser; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Ile; Trp 79 → Val; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Leu 103 → Thr; Tyr 106 → Gly; Lys 125 → Val; Ser 127 → Gly; Tyr 132 → Ser; Lys 134 → Glu;
(ee) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Glu; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Gly; Lys 125 → Val; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu;
(ff) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Val; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Lys 75 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Ile 80 → Thr; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Lys 98 → Glu; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Asn 114 → Asp; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu;
(gg) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Gly 38 → Ala; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Val; Glu 44 → Asp; Lys 46 → Asn; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Ile 80 → Val; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu; Ile 135 → Val;
(hh) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Thr; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Asn 129 → Ser; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu;
(ii) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Thr; Glu 44 → Lys; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu;
(jj) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Ala; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Val 108 → Ile; Ser 112 → Asn; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu;
(kk) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Ala; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Arg 81 → His; Cys 87 → Gly; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu;
(ll) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Val; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Lys 75 → Arg; Cys 76 → Leu; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Ile 80 → Thr; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Lys 98 → Glu; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Asn 114 → Asp; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu; Cys 175 → Ile; Ile 176 → Asp; Asp 177 → Gly;
(mm) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Val; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Lys 75 → Arg; Cys 76 → Tyr; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Ile 80 → Thr; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Lys 98 → Glu; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Asn 114 → Asp; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu; Cys 175 → Ile; Ile 176 → Asp; Asp 177 → Gly;
(nn) Leu 36 → Trp; Ala 40 → Thr; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Gln; Thr 54 → Met; Ser 68 → Trp; Leu 70 → Tyr; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Asp; Cys 76 → Ile; Asp 77 → Asn; Trp 79 → His; Arg 81 → Glu; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Thr; Leu 103 → Glu; Ser 105 → Pro; Tyr 106 → Ile; Lys 125 → Gly; Ser 127 → Asn; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Glu; Thr 136 → Val; Ser 146 → Asn; Cys 175 → Glu; 및, 선택적으로 Gly 잔기는 N-말단에 추가된다;
(oo) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Val; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Lys 75 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Ile 80 → Thr; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Lys 98 → Glu; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Asn 114 → Asp; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu; 및, 선택적으로 Gly 잔기는 N-말단에 추가된다;
(pp) Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Val; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Asn 65 → Gln; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Lys 75 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Ile 80 → Thr; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Lys 98 → Glu; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Asn 114 → Asp; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu; Gly 178 → Asp; 및, 선택적으로 Gly 잔기는 N-말단에 추가된다;
(qq) Ile 8 → Lys; Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Val; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Lys 75 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Ile 80 → Thr; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Lys 98 → Glu; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Asn 114 → Asp; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu; 및, 선택적으로 Gly 잔기는 N-말단에 추가된다;
(rr) Pro 9 → His; Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Val; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Lys 75 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Ile 80 → Thr; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Lys 98 → Glu; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Asn 114 → Asp; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu; 및, 선택적으로 Gly 잔기는 N-말단에 추가된다;
(ss) Ile 8 → Lys; Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Val; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Asn 65 → Gln; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Lys 75 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Ile 80 → Thr; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Lys 98 → Glu; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Asn 114 → Asp; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu; Gly 178 → Asp; 및, 선택적으로 Gly 잔기는 N-말단에 추가된다; 또는
(tt) Pro 9 → His; Gln 28 → His; Leu 36 → Arg; Ala 40 → Asp; Ile 41 → Val; Gln 49 → Glu; Tyr 52 → Glu; Asn 65 → Gln; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Gly; Arg 72 → Val; Lys 73 → Gln; Lys 75 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Val; Ile 80 → Thr; Arg 81 → His; Cys 87 → Ser; Lys 98 → Glu; Leu 103 → Val; Tyr 106 → Ala; Asn 114 → Asp; Phe 123 → Val; Lys 125 → Leu; Ser 127 → Lys; Tyr 132 → Leu; Lys 134 → Glu; Gly 178 → Asp; 및, 선택적으로 Gly 잔기는 N-말단에 추가된다.
본 개시내용의 CGRP-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 6-51 및 206-212로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 CGRP-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 6-51 및 206-212 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.
3. 헵시딘(hepcidin)에 특이적인 리포칼린 뮤테인
일반적으로 20개 또는 25개의 아미노산으로 구성된 두 가지 형태로 존재하는 펩타이드 호르몬인 헵시딘은 철 부하 및 염증에 대한 반응으로 여러 세포에서 발현 및 분비된다. 헵시딘은 주로 간의 간세포에서 생산되고 철 항상성의 조절에 중심적인 역할을 하며 항균성 펩타이드로 작용하며 대부분의 철 결핍/과부하 증후군의 발병에 직간접적으로 관여한다. 헵시딘의 주요 작용은 철을 내보내는 모든 세포에서 발현되는 철을 내보내는 페로포틴(ferroportin)을 내재화하고 분해하는 것이다. 헵시딘은 페로포틴에 직접 결합한다. 따라서 높은 헵시딘 수준은 장내 철 흡수 및 대식세포 및 간세포로부터의 철 방출을 억제하는 반면, 낮은 농도의 헵시딘은 이들 세포로부터의 철 방출을 촉진한다.
헵시딘에 특이적인 리포칼린 뮤테인은 국제 특허 공개 WO 2012/022742 및 WO 2013/087654에 개시되어 있다.
본 개시내용의 헵시딘-특이적인 리포칼린 뮤테인은 hNGAL의 뮤테인일 수 있다. 성숙 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)과 비교하여, 이러한 뮤테인은 성숙 hNGAL의 상응하는 서열 위치에서 다음 세트의 아미노산 잔기 중 하나를 포함할 수 있다:
(a) Ala 36, Ser 40, Leu 41, Met 49, Asn 70, Gly 72, Gly 73, Ser 77, Leu 79, Leu 125, Val 132;
(b) Leu 36, Arg 40, Val 41, Gln 49, Asp 70, Arg 72, Thr 73, Leu 77, Ser 79, Thr 125, Val 132;
(c) Leu 36, Glu 40, Ile 41, Leu 49, Gln 70, Gly 72, Glu 73, Gly 77, Gly 79, Phe 125, Val 132;
(d) Leu 36, Glu 40, Ile 41, Met 49, Met 70, Leu 72, Ala 73, Glu 77, Leu 79, Val 125, Val 132;
(e) Leu 36, Glu 40, Val 41, Met 49, Met 70, Leu 72, Ala 73, Glu 77, Leu 79, Thr 125, Val 132;
(f) Leu 36, Glu 40, Val 41, Met 49, Met 70, Leu 72, Ala 73, Glu 77, Leu 79, Val 125, Val 132;
(g) Thr 36, Ser 40, Ile 41, Gln 49, Phe 70, Glu 72, Gly 73, Arg 77, Val 79, Val 125, Leu 132;
(h) Val 36, Glu 40, Met 41, Leu 49, Met 70, Glu 72, Tyr 73, Val 77, Leu 79, Arg 125, Val 132;
(i) Val 36, Gly 40, Leu 41, Leu 49, Leu 70, Val 72, Arg 73, Arg 77, Tyr 79, Met 125, Val 132;
(j) Leu 36, Glu 40, Val 41, Met 49, Trp 52, Ile 68, Met 70, Leu 72, Ala 73, Glu 77, Leu 79, Gln 81, Asp 96, Ser 100, Arg 103, Gly 106, Thr 125, Trp 127, Val 132, Trp 134;
(k) Leu 36, Glu 40, Val41, Met 49, Trp 52, Ile 68, Met 70, Leu 72, Ala 73, Glu 77, Leu 79, Gln 81, Gly 96, Gly 100, Arg 103, Gly 106, Val 125, Trp 127, Val 132, 및 Trp 134;
(l) Leu 36, Glu 40, Val41, Met 49, Trp 52, Ile 68, Met 70, Leu 72, Ala 73, Glu 77, Leu 79, Gln 81, Asp 96, Ser 100, Arg 103, Gly 106, Val 125, Trp 127, Val 132, Trp 134
(m) Leu 36, Glu 40, Ile41, Met 49, Trp 52, Ile 68, Met 70, Leu 72, Ala 73, Glu 77, Leu 79, Gln 81, Asp 96, Ser 100, Arg 103, Gly 106, Val 125, Trp 127, Val 132, Trp 134;
(n) Leu 36, Glu 40, Ile41, Met 49, Trp 52, Ile 68, Met 70, Leu 72, Ala 73, Glu 77, Leu 79, Gln 81, Asp 96, Ser 100, Arg 103, Gly 106, Val 125, Trp 127, Val 132, Trp 134;
(o) Leu 36, Glu 40, Val41, Met 49, Trp 52, Ile 68, Met 70, Leu 72, Ala 73, Glu 77, Leu 79, Gln 81, Asp 96, Ser 100, Arg 103, Gly 106, Val 125, Trp 127, Val 132, Trp 134;
(p) Leu 36, Glu 40, Val41, Met 49, Trp 52, Ile 68, Met 70, Leu 72, Ala 73, Glu 77, Leu 79, Gln 81, Gly 96, Gly 100, Arg 103, Gly 106, Val 125, Trp 127, Val 132, Trp 134;
(q) Leu 36, Glu 40, Val41, Met 49, Trp 52, Ile 68, Met 70, Leu 72, Ala 73, Glu 77, Leu 79, Gln 81, Asp 96, Ser 100, Arg 103, Gly 106, Thr 125, Trp 127, Val 132, Trp 134; 또는
(r) Leu 36, Glu 40, Val41, Met 49, Trp 52, Ile 68, Met 70, Leu 72, Ala 73, Glu 77, Leu 79, Gln 81, Asp 96, Ser 100, Arg 103, Gly 106, Val 125, Trp 127, Val 132, Trp 134.
본 개시내용의 헵시딘-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 52-65로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 헵시딘-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 52-65 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.
4. PCSK9에 특이적인 리포칼린 뮤테인
PCSK9(Human proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)은 주로 신장, 간 및 장에서 발현되는 분비 단백질이다. 그것은 3개의 도메인, 즉, 억제성 프로-도메인(아미노산 1-152; 아미노산 1-30의 신호 서열 포함), 세린 프로테아제 도메인(또는 촉매 도메인, 아미노산 153-448) 및 시스테인 잔기가 풍부한 210개 잔기 길이의 C-말단 도메인(또는 시스테인/히스티딘이 풍부한 도메인)(아미노산 449-692에서)를 갖는다. PCSK9는 소포체에서 프로-도메인과 촉매 도메인 사이에서 자가 촉매 절단을 겪는 자이모겐으로 합성된다. 프로-도메인은 절단 후 성숙한 단백질에 결합된 상태로 유지되고 복합체가 분비된다. 시스테인이 풍부한 도메인은 활성화된 프로테아제의 접힘 및 조절에 필수적인 것으로 보이는 다른 퓨린/켁신/서브틸린-유사(Furin/Kexin/Subtilisin-like) 세린 프로테아제의 P-(프로세싱) 도메인과 유사한 역할을 할 수 있다.
PCSK9는 세린 프로테아제의 프로테이나제 K 분비 서브틸리신 유사 서브패밀리의 구성원이며(Naureckiene et al., Arch Biochem Biophys, 2003), 간 저밀도 지단백질 수용체(LDL-R)의 강력한 음성 조절자로서 기능을 한다. PCSK9는 혈류를 순환하는 저밀도 지단백질(LDL) 입자의 수준을 조절하여 콜레스테롤 대사에 중요한 역할을 한다. PCSK9 수치의 상승은 간에서 LDL-R 수치를 감소시켜 혈장 내 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-c) 수치를 높이고 관상 동맥 질환에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 나타났다(Peterson et al., J Lipid Res, 2008).
PCSK9에 특이적인 리포칼린 뮤테인은 국제 특허 공개 WO 2014/140210에 개시되어 있다.
본 개시내용의 PCSK9-특이적인 리포칼린 뮤테인은 인간 눈물 리포칼린의 뮤테인일 수 있다. 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)과 비교하여, 이러한 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 상응하는 서열 위치에서 다음 세트의 잔기 중 하나를 포함할 수 있다:
(a) Glu 27 → Ser, Phe 28 → Arg, Pro 29 → Gly, Glu 30 → Asp, Met 31 → Ala, Leu 33 → Trp, Ile 57 → Tyr, Asp 80 → Met, Glu 104 → Pro, Leu 105 → Tyr, His 106 → Gln, Lys 108 → Ala;
(b) Glu 27 → Gln, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Asp, Glu 30 → Thr, Met 31 → Gly, Leu 33 → Trp, Ile 57 → Tyr, Leu 105 → Cys, His 106 → Gly, Lys 108 → Trp;
(c) Glu 27 → Glu, Phe 28 → Trp, Pro 29 → Asn, Glu 30 → Gly, Met 31 → His, Leu 33 → Tyr, Ile 57 → Tyr, Asp 80 → Pro, Glu 104 → Ser, Leu 105 → Trp, His 106 → Pro, Lys 108 → Tyr;
(d) Glu 27 → Thr, Phe 28 → Asp, Pro 29 → Asn, Glu 30 → Ser, Met 31 → Pro, Leu 33 → Phe, Ile 57 → Tyr, Asp 80 → Ile, Glu 104 → Ala, Leu 105 → Glu, His 106 → Arg, Lys 108 → Arg;
(e) Glu 27 → Phe, Phe 28 → Lys, Pro 29 → Ile, Glu 30 → Ala, Met 31 → Ser, Leu 33 → Pro, Ile 57 → Trp, Asp 80 → Gln, Glu 104 → Asn, Leu 105 → Arg, His 106 → Gln, Lys 108 → Asp;
(f) Glu 27 → Lys, Phe 28 → Gly, Pro 29 → Pro, Glu 30 → Thr, Met 31 → Pro, Leu 33 → Trp, Ile 57 → His, Asp 80 → Tyr, Glu 104 → Ala, Leu 105 → Ser, His 106 → Val, Lys 108 → Asn;
(g) Glu 27 → Glu, Phe 28 → His, Pro 29 → Leu, Glu 30 → Ala, Met 31 → Asp, Leu 33 → Ala, Ile 57 → Gln, Asp 80 → Ile, Glu 104 → Ala, Leu 105 → Tyr, His 106 → Pro, Lys 108 → Ser;
(h) Glu 27 → Ala, Phe 28 → Asp, Pro 29 → Met, Glu 30 → Gly, Met 31 → Asp, Leu 33 → Pro, Ile 57 → Thr, Asp 80 → Thr, Glu 104 → Thr, His 106 → Thr, Lys 108 → Arg;
(i) Glu 27 → Arg, Phe 28 → Leu, Pro 29 → Asp, Glu 30 → Asn, Met 31 → Glu, Leu 33 → Trp, Ile 57 → Tyr, Asp 80 → Gln, Glu 104 → Pro, Leu 105 → Arg, His 106 → Asn, Lys 108 → Ala;
(j) Glu 27 → Lys, Phe 28 → Asn, Pro 29 → Met, Glu 30 → Gly, Met 31 → Gln, Leu 33 → Pro, Ile 57 → Arg, Asp 80 → Ile, Glu 104 → Asp, Leu 105 → Arg, His 106 → Leu, Lys 108 → Thr;
(k) Glu 27 → Ser, Phe 28 → Arg, Pro 29 → Gly, Glu 30 → Asp, Met 31 → Ala, Leu 33 → Trp, Ile 57 → Tyr, Asp 80 → Met, Glu 104 → Pro, Leu 105 → Gly, His 106 → Gln, Lys 108 → Ala;
(l) Arg 26 → Phe, Glu 27 → Ser, Phe 28 → Arg, Pro 29 → Gly, Glu 30 → Asp, Met 31 → Ala, Asn 32 → Ile, Leu 33 → Trp, Glu 34 → Thr, Leu 56 → Met, Ile 57 → Tyr, Ser 58 → Ala, Lys 83 → Ser, Glu 104 → Pro 및 Lys 108 → Thr;
(m) Thr 43 → Ile 또는 Ala, Glu 45 → Gly, Asn 48 → Gly, Glu 63 → Gly, Ala 66 → Val, Glu 69 → Val, Lys 70 → Arg, Ala 79 → Thr, Met 또는 Val, Asp 80 → Met 또는 Ser, Gly 82 → Ser, His 84 → Gln, Val 85 → Gly, Tyr 87 → Ser, Ile 88 → Thr 또는 Leu, His 92 → Pro, Leu 105 → His, Gly 또는 Tyr 및 His 106 → Gln 또는 Arg;
(n) Glu 27 → Phe, Phe 28 → Lys, Pro 29 → Ile, Asn 32 → Trp, Leu 33 → Pro, Glu 34 → Arg, Leu 56 → Asn, Ile 57 → Trp, His 106 → Gln 및 Lys 108 → Glu; 또는
(o) Glu 43 → Gly 또는 Ala, Glu 45 → Gly, Ser 58 → Trp 또는 Arg, Glu 63 → Asp, Glu 69 → Gly, Lys 70 → Arg, Asp 80 → Gln, Val 또는 Thr, Gly 82 → Asp, Lys 83 → Ser 또는 Arg, Ala 86 → Glu 또는 Ser, Phe 99 → Leu, Glu 102 → Lys 또는 Val, Glu 104 → Asn 또는 Lys 및 Pro 106 → Thr.
본 개시내용의 PCSK9-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 66-91로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 PCSK9-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 66-91 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.
5. 피오베르딘(pyoverdine) 및 피오켈린(pyochelin)에 특이적인 리포칼린 뮤테인
피오베르딘(Pvd)은 펩타이드-연결된 히드록사메이트- 및 카테콜레이트-유형 리간드이고, 피오켈린(Pch)은 살리실레이트와 시스테인 2분자의 유도체화된 컨쥬게이트이며 페놀, 카르복실레이트 및 아민 리간드 기능을 가지고 있다. Pvd와 Pch 모두 일부 상승작용의 표시와 함께 녹농균(P. aeruginosa) 독성에서 역할을 입증하였다. 녹농균(P. aeruginosa)은 분비된 철 결합 사이드로포어, 피오켈린 및 피오베르딘을 사용하여 숙주 환경에서 철을 제거할 수 있다. 사이드로포어를 만들 수 없는 이중 결핍 돌연변이체는 두 사이드로포어 중 하나만 만들 수 없는 단일 결핍 돌연변이체보다 독성이 훨씬 더 약하다(Takase et al., Infect Immun, 2000). 또한, 피오베르딘은 피오베르딘 자체뿐만 아니라 여러 독성 인자의 생산을 제어하는 신호 분자로 작용한다. 피오켈린은 제2철(ferric iron) 외에 녹농균(P. aeruginosa)의 병원성을 위해 제2철 및 아연과 같은 2가 금속을 얻기 위한 시스템의 일부일 수 있다고 제안되었다(Visca et al., Appl Environ Microbiol, 1992).
세 가지 구조적으로 상이한 피오베르딘 유형 또는 그룹은 녹농균(P. aeruginosa) ATCC 15692(G. et al., Liebigs Ann Chem, 1989), 녹농균(P. aeruginosa) ATCC 27853(Tappe et al., J Prakt Chem, 1993) 및 천연 분리주, 녹농균(P. aeruginosa) R(Gipp) et al., Naturforsch, 1991)에서 유래된 여러 녹농균(P. aeruginosa) 균주에서 확인되었다. 더욱이, 88개의 임상 분리주와 위에서 언급한 2개의 수집 균주에 대한 비교 생물학적 조사에서 레퍼런스 균주, 녹농균(P. aeruginosa) ATCC 15692(Type I Pvd 또는 Pvd I), 녹농균(P. aeruginosa) ATCC 27853(유형 II Pvd 또는 Pvd II) 및 임상 분리주 녹농균(P. aeruginosa) R 및 pa6(유형 III Pvd 또는 Pvd III)에 따라 세 가지 상이한 균주-특이적인 피오베르딘 매개 철 흡수 시스템이 밝혀졌다(Meyer et al., Microbiology, 1997, Cornelis et al., Infect Immun, 1989).
Pvd 유형 I, Pvd 유형 II, Pvd 유형 III 및 Pch에 특이적인 리포칼린 뮤테인은 국제 특허 공개 WO 2016/131804에 개시되어 있다.
본 개시내용의 Pvd 유형 I-특이적인 리포칼린 뮤테인은 hNGAL의 뮤테인일 수 있다. 성숙 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)과 비교하여, 이러한 돌연변이체는 돌연변이된 아미노산 잔기의 다음 세트 중 하나를 포함할 수 있다:
(a) Gln 28→ His; Leu 36→ Asn; Ala 40→Gly; Ile 41→ Trp; Gln 49→ Ile; Tyr 52→ Met; Ser 68→ Val; Leu 70→ Gln; Arg 72→ Trp; Lys 73→ Asp; Asp 77→ Leu; Trp 79→ Gln; Arg 81→ Gln; Cys 87→ Ser; Asn 96→ His; Tyr 100→ Lys; Leu 103→ His; Tyr 106→ His; Lys 125→ Arg; Ser 127→ Trp; Tyr 132→ Trp; Lys 134→ Asp;
(b) Gln 28→ His; Leu 36→ Thr; Ala 40→Gly; Ile 41→ Phe; Gln 49→ Leu; Tyr 52→ Trp; Leu 70→ Trp; Arg 72→ Ala; Lys 73→ Leu; Asp 77→ Tyr; Trp 79→ Asp; Arg 81→ Gly; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Ile; Tyr 100→ Glu; Leu 103→ His; Tyr 106→ Gln; Lys 125→ Trp; Ser 127→ Asn; Tyr 132→ Asn; Lys 134→ Gln;
(c) Gln 28→ His; Leu 36→ Trp; Ala 40→Thr; Ile 41→ Thr; Gln 49→ Pro; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Gln; Arg 72→ Ser; Lys 73→ Glu; Asp 77→ Ser; Trp 79→ Ser; Arg 81→ Ile; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Gly; Tyr 100→ Asn; Leu 103→ Lys; Tyr 106→ His; Lys 125→ Tyr; Ser 127→ Ala; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Asn;
(d) Gln 28→ His; Leu 36→ Phe; Ala 40→ Asn; Ile 41→ Arg; Gln 49→ Pro; Tyr 52→ Met; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Thr; Arg 72→ Glu; Lys 73→ Ala; Asp 77→ Arg; Trp 79 → Arg; Arg 81→ Ile; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Tyr; Tyr 100→ Lys; Leu 103→ Pro; Tyr 106→ Phe; Lys 125→ Ser; Ser 127→ Thr; Tyr 132→ Trp; Lys 134→ Gly;
(e) Gln 28→ His; Ala 40→Gly; Ile 41→ Trp; Gln 49→ Val; Tyr 52→ Met; Ser 68→ Val; Leu 70→ Asp; Arg 72→ Glu; Lys 73→ Leu; Asp 77→ Arg; Trp 79→ Met; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Asp; Tyr 100→ Phe; Leu 103→ Trp; Tyr 106→ Gln; Lys 125→ Gly; Ser 127→ Tyr; Tyr 132→ Trp; Lys 134→ His;
(f) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Phe; Ile 41→ Phe; Gln 49→ Ala; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Trp; Arg 72→ Leu; Lys 73→ Asn; Asp 77→ Gln; Trp 79→ Glu; Arg 81→ His; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Tyr; Leu 103→ Tyr; Tyr 106→ His; Lys 125→ Val; Ser 127→ His; Tyr 132→ Lys; Lys 134→ Trp;
(g) Gln 28→ His; Leu 36→ Trp; Ala 40→Thr; Ile 41→ Thr; Gln 49→ Pro; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Gln; Arg 72→ Ser; Lys 73→ Glu; Asp 77→ Ser; Trp 79→ Ser; Ile 80→ Thr; Arg 81→ Ile; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Gly; Tyr 100→ Ser; Leu 103 → Gln; Tyr 106→ His; Lys 125→ Tyr; Ser 127→ Ile; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Asn;
(h) Gln 28→ His; Leu 36→ Trp; Ala 40→Thr; Ile 41→ Thr; Gln 49→ Pro; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Gln; Arg 72→ Ser; Lys 73→ Asp; Asp 77→ Ser; Trp 79→ Ser; Arg 81→ Ile; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Gly; Tyr 100→ Asn; Leu 103→ Asp; Tyr 106→ His; Lys 125→ Tyr; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Asn;
(i) Gln 28→ His; Leu 36→ Trp; Ala 40→Thr; Ile 41→ Thr; Gln 49→ Pro; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Gln; Arg 72→ Ser; Lys 73→ Glu; Asp 77→ Thr; Trp 79→ Ser; Arg 81→ Ile; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Asp; Tyr 100→ Asn; Leu 103→ Glu; Tyr 106→ His; Lys 125→ Tyr; Ser 127→ Asp; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Asn;
(j) Gln 28→ His; Leu 36→ Trp; Ala 40→Thr; Ile 41→ Thr; Gln 49→ Pro; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Gln; Arg 72→ Ser; Lys 73→ Asp; Asp 77→ Val; Trp 79→ Ser; Arg 81→ Ile; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Gly; Tyr 100→ Asn; Leu 103→ Asn; Tyr 106→ His; Lys 125→ Tyr; Ser 127→ Via; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Asn;
(k) Gln 28→ His; Ala 40→Gly; Ile 41→ Trp; Gln 49→ Leu; Tyr 52→ Met; Ser 68→ Val; Leu 70→ Asp; Arg 72→ Glu; Lys 73→ Leu; Asp 77→ Arg; Trp 79→ Met; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Asp; Tyr 100→ Ser; Leu 103→ Trp; Tyr 106→ Gln; Lys 125→ Gly; Ser 127→ Tyr; Tyr 132→ Trp; Lys 134→ His;
(l) Gln 28→ His; Leu 36→ Trp; Ala 40→Thr; Ile 41→ Thr; Gln 49→ Pro; Tyr 52→ Pro; Thr 54→ Val; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Gln; Arg 72→ Ser; Lys 73→ Glu; Lys 75→ Glu; Asp 77→ Ser; Trp 79→ Ser; Ile 80→ Thr; Arg 81→ Ile; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Gly; Tyr 100→ Ser; Leu 103→ Gln; Tyr 106→ His; Lys 125→ Tyr; Ser 127→ Thr; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Asn;
(m) Gln 28→ His; Ala 40→Gly; Ile 41→ Trp; Lys 46→ Glu; Gln 49→ Leu; Tyr 52→ Met; Thr 54→ Ala; Ile 55→ Via; Lys 59→ Arg; Ser 68→ Val; Leu 70→ Asp; Arg 72→ Glu; Lys 73→ Leu; Lys 74→ Glu; Lys 75→ Glu; Asp 77→ Arg; Trp 79→ Met; Ile 80→ Thr; Arg 81→ Glu; Ser 87→ Asn; Asn 96→ Asp; Tyr 100→ Ser; Leu 103→ Trp; Tyr 106→ Gln; Lys 125→ Gly; Ser 127→ Tyr; Tyr 132→ Trp; Lys 134→ His;
(n) Leu 36→ Trp; Asn 39→ Asp; Ala 40→Thr; Ile 41→ Thr; Gln 49→ Pro; Tyr 52→ Pro; Thr 54→ Val; Asn 65→ Asp; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Gln; Arg 72→ Ser; Lys 73→ Glu; Lys 75→ Glu; Asp 77→ Ser; Trp 79→ Ser; Ile 80→ Thr; Arg 81→ Ile; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Gly; Tyr 100→ Ser; Leu 103→ Gln; Tyr 106→ His; Lys 125→ Tyr; Ser 127→ Thr; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Asn; Thr 136→ Ala;
(o) Leu 36→ Trp; Ala 40→Thr; Ile 41→ Ala; Gln 49→ Pro; Tyr 52→ Pro; Thr 54→ Val; Asn 65→ Asp; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Gln; Arg 72→ Ser; Lys 73→ Glu; Lys 75→ Glu; Asp 77→ Ser; Trp 79→ Ser; Ile 80→ Thr; Arg 81→ Ile; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Gly; Tyr 100→ Ser; Leu 103→ Gln; Tyr 106→ His; Lys 125→ Tyr; Ser 127→ Thr; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Asn; Thr 136→ Ala;
(p) Gln 28→ His; Ala 40→Gly; Ile 41→ Trp; Lys 46→ Glu; Gln 49→ Leu; Tyr 52→ Met; Thr 54→ Ala; Ile 55→ Via; Lys 59→ Arg; Asn 65→ Asp; Ser 68→ Val; Leu 70→ Asp; Arg 72→ Glu; Lys 73→ Leu; Lys 74→ Glu; Lys 75→ Glu; Asp 77→ Arg; Trp 79→ Met; Ile 80→ Thr; Arg 81→ Glu; Ser 87→ Asn; Asn 96→ Asp; Tyr 100→ sER; Leu 103→ Trp; Tyr 106→ Gln; Lys 125→ Gly; Ser 127→ Tyr; Tyr 132→ Trp; Lys 134→ His; 또는
(q) Gln 28→ His; Ala 40→Gly; Ile 41→ Trp; Lys 46→ Glu; Gln 49→ Leu; Tyr 52→ Met; Thr 54→ Ala; Ile 55→ Val; Lys 59→ Arg; Asn 65→ Gln; Ser 68→ Val; Leu 70→ Asp; Arg 72→ Glu; Lys 73→ Leu; Lys 74→ Glu; Lys 75→ Glu; Asp 77→ Arg; Trp 79→ Met; Ile 80→ Thr; Arg 81→ Glu; Ser 87→ Asn; Asn 96→ Asp; Tyr 100→ Ser; Leu 103→ Trp; Tyr 106→ Gln; Lys 125→ Gly; Ser 127→ Tyr; Tyr 132→ Trp; Lys 134→ His.
본 개시내용의 Pvd 유형 II-특이적인 리포칼린 뮤테인은 hNGAL의 뮤테인일 수 있다. 성숙 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)과 비교하여, 이러한 돌연변이체는 돌연변이된 아미노산 잔기의 다음 세트 중 하나를 포함할 수 있다:
(a) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Glu; Ile 41→ Val; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Arg 72→ His; Lys 73→ Asn; Asp 77→ Asn; Trp 79→ Ser; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Tyr 100→ Asn; Leu 103→ Gln; Tyr 106→ Met; Ser 127→ Lys; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Trp;
(b) Gln 28→ His; Ala 40→ Thr; Ile 41→ Ile; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Asn; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Ile; Lys 73→ Met; Asp 77→ His; Trp 79→ Tyr; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Ile; Tyr 100→ Asn; Leu 103→ Thr; Tyr 106→ Gln; Lys 125 → Ile; Ser 127→ Arg; Tyr 132→ Met; Lys 134→ Trp;
(c) Gln 28→ His; Leu 36→ Ile; Ala 40→Thr; Ile 41→ Val; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Ala; Lys 73→ Pro; Asp 77→ Ile; Trp 79→ Ser; Arg 81→ Ser; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Met; Tyr 100→ Ser; Leu 103→ Gly; Tyr 106 → Ala; Lys 125→ Lys; Tyr 132→ Val; Lys 134→ Trp;
(d) Gln 28→ His; Ala 40→ Asn; Gln 49→ Ala; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Ser; Lys 73→ Gln; Asp 77→ Met; Trp 79→ Ala; Arg 81→ Tyr; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Arg; Tyr 100→ Pro; Leu 103→ Thr; Tyr 106→ Ile; Lys 125→ Lys; Ser 127→ Met; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp;
(e) Gln 28→ His; Ala 40→ His; Gln 49→ Ala; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Asp; Arg 72→ Gly; Lys 73→ Arg; Asp 77→ His; Trp 79→ Trp; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Arg; Tyr 100→ Asp; Leu 103→ Met; Tyr 106→ Phe; Lys 125→ Ala; Ser 127→ Asp; Tyr 132→ Asn; Lys 134→ Trp;
(f) Gln 28→ His; Leu 36→ Asn; Ala 40→ Gly; Ile 41→ Arg; Gln 49→ Pro; Tyr 52→ Trp; Ser 68→ Arg; Leu 70→ Trp; Arg 72→ Asn; Lys 73→ Gln; Asp 77→ Lys; Trp 79→ Asp; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Asp; Tyr 100→ Thr; Leu 103→ Trp; Tyr 106→ Asn; Lys 125→ Asn; Ser 127→ Met; Tyr 132→ Ile; Lys 134→ Tyr;
(g) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→Thr; Ile 41→ Thr; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Gly; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Gly; Lys 73→ Arg; Asp 77→ Gly; Trp 79→ Trp; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Ala; Tyr 100→ Trp; Leu 103→ Ile; Tyr 106 → Gly; Lys 125→ Lys; Ser 127→ Asn; Tyr 132→ Val; Lys 134→ Trp;
(h) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Glu; Ile 41→ Val; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Arg 72→ His; Lys 73→ Asn; Asp 77→ Asn; Trp 79→ Ser; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Lys; Tyr 100→ Asn; Leu 103→ Val; Tyr 106→ Met; Lys 125→ Asn; Ser 127→ Lys; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Trp;
(i) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Thr; Ile 41→ Val; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Arg 72→ His; Lys 73→ Asn; Asp 77→ Asn; Trp 79→ Ser; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Leu 103→ Gln; Tyr 106→ Met; Ser 127→ Lys; Tyr 132→ Val; Lys 134→ Trp;
(j) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Thr; Ile 41→ Val; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Arg 72→ His; Asp 77→ Asn; Trp 79→ Phe; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Lys; Tyr 100→ His; Leu 103→ Gln; Tyr 106→ Met; Ser 127→ Lys; Tyr 132→ Ala; Lys 134→ Trp;
(k) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Gly; Ile 41→ Val; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Arg 72→ His; Lys 73→ Asn; Asp 77→ Asn; Trp 79→ Trp; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Tyr 100→ Asn; Leu 103→ His; Tyr 106→ Met; Ser 127→ Lys; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Trp;
(l) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Thr; Ile 41→ Ile; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Asn; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Ile; Lys 73→ Phe; Asp 77→ His; Trp 79→ Tyr; Arg 81→ Asp; Cys 87→ Ser; Leu 103→ Met; Tyr 106→ Gln; Lys 125→ Ile; Ser 127 → Arg; Tyr 132→ Ile; Lys 134→ Trp;
(m) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Thr; Ile 41→ Ile; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Asn; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Ile; Lys 73→ Arg; Asp 77→ His; Trp 79→ Tyr; Arg 81→ Asp; Cys 87→ Ser; Leu 103→ Thr; Tyr 106→ Gln; Lys 125→ Ile; Ser 127 → Arg; Tyr 132→ Ile; Lys 134→ Trp;
(n) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Glu; Ile 41→ Val; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Pro; Asn 65→ Asp; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Arg 72→ His; Lys 73→ Asn; Asp 77→ Asn; Trp 79→ Phe; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Lys; Tyr 100→ Asn; Leu 103→ Val; Tyr 106→ Met; Lys 125→ Asn; Ser 127→ Lys; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Trp;
(o) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Glu; Ile 41→ Val; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Pro; Asn 65→ Gln; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Arg 72→ His; Lys 73→ Asn; Asp 77→ Asn; Trp 79→ Phe; Arg 81→ Glu; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Lys; Tyr 100→ Asn; Leu 103→ Val; Tyr 106→ Met; Lys 125→ Asn; Ser 127→ Lys; Tyr 132→ Gly; Lys 134→ Trp;
(p) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Thr; Ile 41→ Ile; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Asn; Thr 54→ Ala; Asn 65→ Asp; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Ile; Lys 73→ Arg; Asp 77→ His; Trp 79→ Tyr; Arg 81→ Asp; Cys 87→ Ser; Leu 103→ Thr; Tyr 106 → Gln; Lys 125→ Ile; Ser 127→ Arg; Tyr 132→ Ile; Lys 134→ Trp;
(q) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Thr; Ile 41→ Ile; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Asn; Thr 54→ Ala; Asn 65→ Gln; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Ile; Lys 73→ Arg; Asp 77→ His; Trp 79→ Tyr; Arg 81→ Asp; Cys 87→ Ser; Leu 103→ Thr; Tyr 106→ Gln; Lys 125→ Ile; Ser 127→ Arg; Tyr 132→ Ile; Lys 134→ Trp;
(r) Leu 36→ Val; Ala 40→ Thr; Ile 41→ Ile; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Asn; Thr 54→ Ala; Asn 65→ Asp; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Ile; Lys 73→ Arg; Asp 77→ His; Trp 79→ Tyr; Arg 81→ Asp; Cys 87→ Ser; Leu 103→ Thr; Tyr 106→ Gln; Lys 125→ Ile; Ser 127→ Arg; Tyr 132→ Ile; Lys 134→ Trp; 또는
(s) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Thr; Ile 41→ Ile; Gln 49→ Gly; Tyr 52→ Asn; Asn 65→ Gln; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Ile; Lys 73→ Arg; Asp 77→ His; Trp 79→ Tyr; Arg 81→ Asp; Cys 87→ Ser; Leu 103→ Thr; Tyr 106→ Gln; Lys 125→ Ile; Ser 127→ Arg; Tyr 132→ Ile; Lys 134→ Trp.
본 개시내용의 Pvd 유형 III-특이적인 리포칼린 뮤테인은 hNGAL의 뮤테인일 수 있다. 성숙 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)과 비교하여, 이러한 돌연변이체는 돌연변이된 아미노산 잔기의 다음 세트 중 하나를 포함할 수 있다:
(a) Gln 28→ His; Leu 36→ Phe; Ala 40→ Trp; Ile 41→ Met; Gln 49→ His; Tyr 52→ Asn; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Lys; Arg 72→ Gln; Lys 73→ Ala; Asp 77→ Ile; Trp 79→ Ser; Arg 81→ His; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Ile; Tyr 100→ Asn; Leu 103→ Gly; Tyr 106→ Glu; Lys 125→ Trp; Ser 127→ His; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Gln;
(b) Gln 28→ His; Leu 36→ Phe; Ala 40→ Arg; Ile 41→ Trp; Gln 49→ Ile; Tyr 52→ Tyr; Ser 68→ Gln; Leu 70→ Asn; Arg 72→ Trp; Lys 73→ Leu; Asp 77→ Ala; Trp 79→ Ser; Arg 81→ Ser; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Arg; Tyr 100→ Ile; Leu 103→ Pro; Tyr 106→ Glu; Lys 125→ Thr; Ser 127→ Ile; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Glu;
(c) Gln 28→ His; Leu 36→ Phe; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Leu; Gln 49→ Arg; Tyr 52→ Arg; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Leu; Lys 73→ Tyr; Asp 77→ Ile; Trp 79 → Ser; Arg 81→ Ala; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Gly; Tyr 100→ Ala; Leu 103→ Phe; Tyr 106→ Glu; Lys 125→ Trp; Ser 127→ Ala; Lys 134→ Glu;
(d) Gln 28→ His; Leu 36→ Phe; Ala 40→ Trp; Ile 41→ Arg; Gln 49→ Pro; Tyr 52→ Ser; Ser 68→ Asn; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Trp; Lys 73→ Pro; Asp 77→ Arg; Trp 79→ Ser; Arg 81→ Ser; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Met; Tyr 100→ Pro; Leu 103→ Gly; Tyr 106→ Glu; Lys 125→ Trp; Ser 127→ Phe; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Glu;
(e) Gln 28→ His; Leu 36→ Phe; Ala 40→ Trp; Ile 41→ Arg; Gln 49→ Pro; Tyr 52→ Ser; Ser 68→ Asn; Leu 70→ Arg; Arg 72→ Trp; Lys 73→ Pro; Asp 77→ Arg; Trp 79→ Ser; Arg 81→ Ser; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Met; Tyr 100→ Pro; Leu 103→ Gly; Tyr 106→ Glu; Lys 125→ Trp; Ser 127→ Phe; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Glu;
(f) Gln 28→ His; Leu 36→ Glu; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Ala; Gln 49→ Lys; Tyr 52→ Met; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Lys 73→ His; Asp 77→ Gln; Trp 79→ Asp; Arg 81→ Ala; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Leu; Tyr 100→ Asp; Leu 103→ Gln; Tyr 106→ Glu; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp;
(g) Gln 28→ His; Leu 36→ Glu; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Ala; Gln 49→ Met; Tyr 52→ Met; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Lys 73→ Gln; Asp 77→ Lys; Trp 79→ Asp; Arg 81→ Val; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Leu; Tyr 100→ Asp; Leu 103→ Gln; Tyr 106→ Glu; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp;
(h) Gln 28→ His; Leu 36→ Glu; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Thr; Gln 49→ Met; Tyr 52→ Met; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Lys 73→ Arg; Asp 77→ Lys; Trp 79→ Asp; Arg 81→ Val; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Val; Tyr 100→ Asp; Leu 103→ Gln; Tyr 106→ Glu; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp;
(i) Gln 28→ His; Leu 36→ Glu; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Ala; Gln 49→ Met; Tyr 52→ Met; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Lys 73→ His; Asp 77→ Lys; Trp 79→ Asp; Arg 81→ Val; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Leu; Tyr 100→ Asp; Leu 103→ Gln; Tyr 106→ Glu; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp;
(j) Gln 28→ His; Leu 36→ Glu; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Ala; Gln 49→ Lys; Tyr 52→ Met; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Lys 73→ Tyr; Asp 77→ Gln; Trp 79→ Asp; Arg 81→ Val; Cys 87→ Ser; Asn 96→ -; Tyr 100→ Glu; Leu 103→ Gln; Tyr 106→ Glu; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp;
(k) Gln 28→ His; Leu 36→ Glu; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Ala; Leu 42→ Arg; Gln 49→ Met; Tyr 52→ Met; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Lys 73→ His; Asp 77→ Lys; Trp 79 → Asp; Arg 81→ Val; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Leu; Tyr 100→ Asp; Leu 103→ Gln; Ser 105→ Pro; Tyr 106→ Glu; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp;
(l) Gln 28→ His; Leu 36→ Glu; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Ala; Asp 47→ Asn; Gln 49→ Met; Tyr 52→ Met; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Lys 73→ His; Asp 77→ Lys; Trp 79 → Asp; Arg 81→ Val; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Leu; Tyr 100→ Asp; Leu 103→ Gln; Ser 105→ Pro; Tyr 106→ Glu; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp; Thr 145→ Pro;
(m) Gln 28→ His; Leu 36→ Glu; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Ala; Asp 45→ Gly; Lys 46→ Arg; Gln 49→ Met; Tyr 52→ Met; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Lys 73→ His; Asp 77→ Lys; Trp 79→ Asp; Arg 81→ Val; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Leu; Tyr 100→ Asp; Leu 103→ Gln; Ser 105→ Pro; Tyr 106→ Glu; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp;
(n) Gln 28→ His; Leu 36→ Glu; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Ala; Leu 42→ Arg; Gln 49→ Met; Tyr 52→ Met; Asn 65→ Asp; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Lys 73→ His; Asp 77→ Lys; Trp 79→ Asp; Arg 81→ Val; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Leu; Tyr 100→ Asp; Leu 103→ Gln; Ser 105→ Pro; Tyr 106→ Glu; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp;
(o) Gln 28→ His; Leu 36→ Glu; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Ala; Asp 47→ Asn; Gln 49→ Met; Tyr 52→ Met; Asn 65→ Asp; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Lys 73→ His; Asp 77→ Lys; Trp 79→ Asp; Arg 81→ Val; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Leu; Tyr 100→ Asp; Leu 103→ Gln; Ser 105→ Pro; Tyr 106→ Glu; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp; Thr 145→ Pro;
(p) Gln 28→ His; Leu 36→ Glu; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Ala; Asp 45→ Gly; Lys 46→ Arg; Gln 49→ Met; Tyr 52→ Met; Asn 65→ Asp; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Lys 73→ His; Asp 77→ Lys; Trp 79→ Asp; Arg 81→ Val; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Leu; Tyr 100 → Asp; Leu 103→ Gln; Ser 105→ Pro; Tyr 106→ Glu; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp; 또는
(q) Leu 36→ Glu; Ala 40→ Leu; Ile 41→ Ala; Leu 42→ Arg; Gln 49→ Met; Tyr 52→ Met; Asn 65→ Asp; Ser 68→ Glu; Leu 70→ Arg; Lys 73→ His; Asp 77→ Lys; Trp 79 → Asp; Arg 81→ Val; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Leu; Tyr 100→ Asp; Leu 103→ Gln; Ser 105→ Pro; Tyr 106→ Glu; Ser 127→ Val; Tyr 132→ Phe; Lys 134→ Trp.
본 개시내용의 Pch-특이적인 리포칼린 뮤테인은 hNGAL의 뮤테인일 수 있다. 성숙 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)과 비교하여, 이러한 돌연변이체는 돌연변이된 아미노산 잔기의 다음 세트 중 하나를 포함할 수 있다:
(a) Gln 28→ His; Ala 40→ Ile; Ile 41→ Leu; Gln 49→ His; Tyr 52→ Leu; Ser 68→ His; Leu 70→ Thr; Arg 72→ Lys; Lys 73→ Trp; Asp 77→ Ile; Trp 79→ Ser; Arg 81→ His; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Met; Tyr 100→ Asn; Leu 103→ His; Tyr 106→ Met; Lys 125→ Trp; Ser 127→ Asp; Tyr 132→ Glu; Lys 134→ Leu;
(b) Gln 28→ His; Leu 36→ His; Ala 40→ Gln; Ile 41→ Trp; Gln 49→ Arg; Tyr 52→ Trp; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Asp; Arg 72→ Ala; Lys 73→ Ile; Asp 77→ His; Trp 79→ Arg; Arg 81→ Thr; Cys 87→ Ser; Tyr 100→ His; Leu 103→ Gly; Tyr 106→ Gly; Lys 125→ Phe; Ser 127→ Ile; Tyr 132→ Ala; Lys 134→ Phe;
(c) Gln 28→ His; Leu 36→ Met; Ala 40→ Phe; Ile 41→ His; Gln 49→ Ser; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ His; Leu 70→ Pro; Arg 72→ Trp; Lys 73→ Ala; Asp 77→ Ala; Trp 79→ Lys; Arg 81→ Ile; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Ala; Tyr 100→ Gly; Leu 103→ Met; Tyr 106→ Trp; Lys 125→ Gly; Ser 127→ Trp; Tyr 132→ Thru; Lys 134→ Val;
(d) Gln 28→ His; Leu 36→ Val; Ala 40→ Tyr; Ile 41→ Trp; Gln 49→ Ala; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Arg; Arg 72→Trp; Lys 73→ Arg; Asp 77→ Arg; Trp 79→ Asp; Arg 81→ Trp; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Pro; Tyr 100→ Glu; Leu 103→ Gln; Tyr 106→ Arg; Lys 125→ Leu; Ser 127→ Arg; Tyr 132→ Ala; Lys 134→ Asn;
(e) Gln 28→ His; Val 34→ Leu; Leu 36→ Met; Ala 40→ Phe; Ile 41→ His; Gln 49→ Ser; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ His; Leu 70→ Pro; Arg 72→ Trp; Lys 73→ Ala; Asp 77→ Ala; Trp 79→ Lys; Ile 80→ Thr; Arg 81→ Ile; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Ala; Tyr 100→ Gly; Leu 103→ Met; Tyr 106→ Trp; Phe 123→ Ser; Lys 125→ Gly; Ser 127→ Trp; Tyr 132→ Thru; Lys 134→ Val; Thr 141→ Ala;
(f) Gln 28→ His; Leu 36→ Met; Ala 40→ Phe; Ile 41→ His; Gln 49→ Ser; Tyr 52→ Pro; Ser 68→ His; Leu 70→ Pro; Arg 72→ Trp; Lys 73→ Ala; Asp 77→ Ala; Trp 79→ Lys; Ile 80→ Thr; Arg 81→ Ile; Cys 87→ Ser; Asn 96→ Ala; Tyr 100→ Gly; Leu 103→ Met; Tyr 106→ Trp; Phe 123→ Ser; Lys 125→ Gly; Ser 127→ Trp; Tyr 132→ Thru; Lys 134→ Val;
(g) Gln 28→ His; Leu 36→ His; Ala 40→ Gln; Ile 41→ Trp; Asp 45→ Gly; Lys 46→ Arg; Gln 49→ Arg; Tyr 52→ Trp; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Asp; Arg 72→ Ala; Lys 73→ Ile; Asp 77→ Leu; Trp 79→ Arg; Arg 81→ Thr; Cys 87→ Ser; Tyr 100→ His; Leu 103 → Gly; Tyr 106→ Gly; Lys 125→ Phe; Ser 127→ Ile; Tyr 132→ Ala; Lys 134→ Phe;
(h) Gln 28→ His; Leu 36→ His; Ala 40→ Gln; Ile 41→ Trp; Glu 44→ Gly; Lys 46→ Tyr; Gln 49→ Arg; Tyr 52→ Trp; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Asp; Arg 72→ Ala; Lys 73→ Ile; Lys 74→ Glu; Asp 77→ His; Trp 79→ Arg; Arg 81→ Thr; Cys 87→ Ser; Leu 94 → Phe; Tyr 100→ His; Leu 103→ Gly; Tyr 106→ Gly; Val 108→ Ala; Lys 125→ Phe; Ser 127→ Ile; Tyr 132→ Ala; Lys 134→ Phe; 또는
(i) Leu 36→ His; Ala 40→ Gln; Ile 41→ Trp; Asp 45→ Gly; Lys 46→ Arg; Gln 49→ Arg; Tyr 52→ Trp; Asn 65→ Asp; Ser 68→ Asp; Leu 70→ Asp; Arg 72→ Ala; Lys 73→ Ile; Asp 77→ Leu; Trp 79→ Arg; Arg 81→ Thr; Cys 87→ Ser; Tyr 100→ His; Leu 103 → Gly; Tyr 106→ Gly; Lys 125→ Phe; Ser 127→ Ile; Tyr 132→ Ala; Lys 134→ Phe
본 개시내용의 Pvd 유형 I-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 115-131로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 Pvd 유형 I-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 115-131 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 본 개시내용의 Pvd 유형 II-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 132-150으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 Pvd 유형 II-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 132-150 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 본 개시내용의 Pvd 유형 III-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 151-166으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 Pvd 유형 III-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 151-166 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 본 개시내용의 Pch-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 167-176으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 Pch-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 167-176 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.
6. 추가의 표적에 특이적인 리포칼린 뮤테인
치료 표적에 특이적인 추가의 리포칼린 뮤테인은 당업계에 기술되어 있다. WO 2011/069992는 피브로넥틴의 아밀로이드 베타 및 엑스트라-도메인 B에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 기재하고 있다. 아밀로이드 베타(Aβ)는 알츠하이머 환자의 뇌에서 발견되는 아밀로이드 플라크의 주성분으로 알츠하이머 질환에 결정적으로 관여하는 펩타이드이다. 펩타이드는 베타 세크레타제와 감마 세크레타제에 의해 절단되어 Aβ를 생성하는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에서 유래한다. 피브로넥틴(FN)은 유형 I, II 및 III의 다중 도메인을 포함하는 큰 모듈식 이량체 당단백질이다. FNIII7 및 FNIII8 도메인 사이에 통합된 추가 도메인 B(ED-B)를 포함하는 이소폼과 같은 FN의 대체 스플라이스 변이체는 조직 특이적 및 발달 단계 의존적 방식으로 발현된다(Zardi et al., EMBO J, 1987). ED-B는 상처 치유 및 신생 혈관형성 동안을 제외하고 정상적인 성인 조직에는 존재하지 않는다. 결과적으로, 피브로넥틴을 함유하는 ED-B는 신생혈관형성을 유인하고 비정상적인 혈관형성을 겪는 많은 상이한 종양 유형에서 풍부하게 발현된다. 본 개시내용의 아밀로이드 베타-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 195-199로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 아밀로이드 베타-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 195-199 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 본 개시내용의 피브로넥틴 ED-B에 특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 200-203으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 피브로넥틴 ED-B-특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 200-203 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.
WO 2014/076321 및 WO 2015/177175는 인터루킨-17A(IL-17A 또는 IL-17) 및 인터루킨-23(IL-23), 특히 인터루킨-2의 p19 서브유닛(IL-23p19)에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 기재하고 있다.
인간 IL-17A(CTLA-8, IL-17로 추가 명명, Swiss Prot Q16552)는 17,000 달톤의 Mr를 갖는 당단백질이다(Spriggs, J Clin Immunol, 1997). IL-17A는 동종이량체 IL-17 A/A 또는 동종이량체 IL-17A/F를 형성하기 위해 동종이량체 IL-17F와 복합된 이종이량체로 존재할 수 있다. IL-17F(IL-24, ML-1)는 IL-17A와 55% 아미노산 동일성을 공유한다. IL-17A와 IL-17F는 또한 동일한 수용체(IL-17RA)를 공유하며, 이는 혈관 내피 세포, 말초 T 세포, B 세포, 섬유아세포, 폐 세포, 골수 단핵구 세포 및 골수 기질 세포를 비롯한 다양한 세포에서 발현된다(Moseley et al., Cytokine Growth Factor Rev, 2003, Kawaguchi et al., J Allergy Clin Immunol, 2004, Kolls and Linden, Immunity, 2004). IL-17A는 주로 Th17 세포에 의해 발현되며 류마티스 관절염(RA) 환자의 활액에서 상승된 수준으로 존재하며 초기 RA 발달에 관여하는 것으로 나타났다. IL-17A는 또한 다발성 경화증(MS) 환자의 뇌척수액에서 과발현된다. 또한, IL-17은 TNF-α 및 IL-1의 유도제이며, 후자는 주로 골 침식 및 영향을 받는 환자에게 매우 고통스러운 결과를 초래한다(Lubberts, Cytokine, 2008). 또한, IL-17A의 부적절하거나 과도한 생산은 골관절염, 골 이식물의 이완, 급성 이식 거부(Van Kooten et al., J Am Soc Nephrol, 1998, Antonysamy et al., al., J Immunol, 1999), 패혈증, 패혈증 또는 내독성 쇼크, 알레르기, 천식(Molet et al., J Allergy Clin Immunol, 2001), 골 손실, 건선(Teunissen et al., J Invest Dermatol, 1998), 허혈, 전신 경화증(Kurasawa et al., Arthritis Rheum, 2000), 뇌졸중 및 기타 염증성 장애와 같은 다양한 기타 질환 및 장애의 병리와 관련이 있다. 본 개시내용의 IL-17A 특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 99 내지 104로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 IL-17A 특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 99-104 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.
인터루킨-23(IL-23으로도 알려짐)은 두 개의 서브유닛, 즉 p19 및 p40으로 구성된 이종이량체 사이토카인이다(Oppmann et al., Immunity, 2000). p19(Swiss Prot Q9NPF7, 본원에서 "IL-23p19"로 상호교환가능하게 지칭됨) 서브유닛은 IL-6, G-CSF(Granulocyte-colony stimulating factor) 및 IL-12의 p35 서브유닛과 구조적으로 관련되어 있다. IL-23은 IL-23R 및 IL-12beta1으로 구성된 이종이량체 수용체에 결합하여 신호전달을 매개한다. IL-12beta1 소단위는 IL-12beta1 및 IL-12beta2로 구성된 IL-12 수용체에 의해 공유된다. 트랜스제닉 p19 마우스는 최근 심각한 전신 염증 및 호중구 증가증을 나타내는 것으로 기술되었다(Wiekowski et al., J Immunol, 2001). 인간 IL-23은 T 세포, 특히 기억 T 세포의 증식을 촉진하는 것으로 보고되었으며 Th1 7 세포의 분화 및/또는 유지에 기여할 수 있다(Frucht, Sci STKE, 2002). 본 개시내용의 IL-23p19에 특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 105-114로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 IL-23p19 특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 105-114 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.
세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4)는 면역 체크포인트로 기능을 하고 면역 반응을 하향 조절하는 단백질 수용체이다. CTLA-4는 조절 T 세포에서 구성적으로 발현되지만 활성화 후에는 통상적인 T 세포에서만 상향조절된다. CTLA-4 차단은 종양에 대한 면역계 내성을 억제하여 암 환자에게 잠재적으로 유용한 면역요법 전략을 제공하는 수단으로 간주된다. CTLA-4에 특이적인 리포카인 뮤테인은 WO 2006/056464 및 WO 2012/072806에 개시되어 있다. 본 개시내용의 CTLA-4에 특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 92-98로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 CTLA-4 특이적인 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NOs: 92-98 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 더 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.
치료 표적에 대해 특이적인 추가의 리포칼린 뮤테인은 예를 들어 c-Met에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 개시하는 WO 2009/095447; 글리피칸-3에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 개시하는 WO 2012/065978, WO 2013/174783 및 WO 2016/184875; Lag-3에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 개시하는 WO 2017/009456 및 WO 2018/134274; CD137에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 개시하는 WO 2016/177762 및 WO 2018/087108; Ang-2에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 개시하는 WO 2016/120307; 및 VEGF에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 개시하는 WO 2008/015239에 개시되어 있다.
B. 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인의 투여
본 개시내용의 리포칼린 뮤테인은 흡입에 의해 투여될 수 있다. 물질의 흡입 투여를 위한 수단 및 장치는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 WO 94/017784A 및 Elphick et al. (2015)에 개시되어 있다. 이러한 수단 및 장치에는 분무기, 계량된 용량 흡입기, 분말 흡입기 및 비강 스프레이가 포함된다. 리포칼린 뮤테인의 흡입 투여를 지시하기에 적합한 다른 수단 및 장치가 또한 당업계에 공지되어 있다. 분무기는 용액에서 에어로졸을 생성하는 데 유용하며 계량된 용량 흡입기, 건조 분말 흡입기 등은 작은 입자의 에어로졸을 생성하는 데 효과적이다.
분무기는 폐로 흡입되는 미스트 형태로 의약품을 투여하는 데 사용되는 약물 전달 장치이다. 다양한 유형의 분무기가 당업자에게 알려져 있으며 제트 분무기, 초음파 분무기, 진동 메쉬 기술 및 연무 분무기를 포함한다. 일부 분무기는 분무된 용액의 지속적인 흐름을 제공한다. 즉, 그들은 대상체가 흡입하는지 여부에 관계없이 장기간에 걸쳐 연속 분무기를 제공하는 반면, 다른 분무기는 호흡 작동식이다. 즉, 대상체는 흡입할 때만 약간의 복용량을 얻는다.
계량된-용량 흡입기(MDI)는 액체 에어로졸화 의약의 짧은 분출 형태로 특정 양의 의약품을 폐에 전달하는 장치이다. 이러한 계량된-용량 흡입기는 일반적으로 세 가지 주요 구성 요소, 즉 투여될 제형을 포함하는 캐니스터, 각 작동과 함께 제형의 계량된 양이 분배되도록 하는 계량 밸브, 및 환자가 장치를 작동할 수 있게 하고 액체 에어로졸을 환자의 폐로 향하게 하는 액추에이터(또는 마우스피스)로 구성된다.
건조-분말 흡입기(DPI)는 건조 분말 형태로 폐에 의약품을 전달하는 장치이다. 건조 분말 흡입기는 정량된-용량 흡입기와 같은 에어로졸-기반 흡입기의 대안이다. 의약품은 일반적으로 수동 로딩을 위한 캡슐 또는 흡입기 내부에 위치한 전매 블리스터 팩에 보관된다.
비강 스프레이는 코를 통해 약물을 주입하는 비강 투여에 사용할 수 있다. 비강 스프레이는 의약품의 매우 빠른 흡수를 제공할 수 있다.
리포칼린 뮤테인은 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회, 주 5회, 주 6회, 1일 1회, 또는 1일 2회 투여될 수 있다.
리포칼린 뮤테인의 흡입 투여는 리포칼린 뮤테인에 대한 국소 노출, 전신 노출 또는 국소 및 전신 노출을 초래할 수 있다. 리포칼린 뮤테인의 용량은 투여가 국소 또는 전신 노출을 초래하는지 여부에 강한 영향을 미치는 것으로 믿어진다. 일반적으로 리포칼린 뮤테인의 저용량은 국소 노출을 초래하는 경향이 있는 반면 고용량은 전신 노출을 초래하는 경향이 있다고 믿어진다.
일부 구체예에서, 국소 노출은 리포칼린 뮤테인의 전달 용량의 약 0.15% 이하, 0.1% 이하, 0.05% 이하, 0.03% 이하, 0.02% 이하, 또는 0.01% 이하가 순환계로 들어가는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 국소 노출은 리포칼린 뮤테인의 전신 노출이 검출가능하지 않음을 의미한다. 리포칼린 뮤테인의 전신 노출은 바람직하게는 혈액, 바람직하게는 혈장 또는 혈청에서 측정된다.
일부 구체예에서, 국소 노출은 전달된 리포칼린 뮤테인의 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상이 기도 또는 폐, 예를 들어 폐 조직 또는 상피 내막에 남아 있다.
국소 노출을 달성하기 위해, 리포칼린 뮤테인의 전달 용량은 투여당 약 0.05 mg 내지 약 1000 mg, 바람직하게는 투여당 0.05 mg 내지 약 5 mg, 바람직하게는 투여당 약 0.1 mg 내지 약 5 mg, 바람직하게는 투여당 약 0.1 mg 내지 약 2 mg일 수 있다. 리포칼린 뮤테인의 전달 용량은 투여당 체중 kg 당 약 0.05 ㎍ 내지 약 15 mg, 바람직하게는 투여당 체중 kg 당 약 0.05 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 바람직하게는 투여당 체중 kg 당 약 0.05 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 바람직하게는 투여당 체중 kg 당 약 0.1 ㎍ 내지 약 50 ㎍일 수 있다. 일반적으로, 리포칼린 뮤테인의 전달 용량은 투여당 약 10 mg 이하, 약 9 mg 이하, 약 8 mg 이하, 약 7 mg 이하, 약 6 mg 이하, 또는 약 5 mg, 또는 약 2 mg 이하, 또는 약 1 mg, 또는 약 100 ㎍, 또는 약 50 ㎍ 이하, 또는 투여당 체중 kg 당 약 200 ㎍ 이하, 약 180 ㎍ 이하, 약 160 ㎍ 이하, 약 140 ㎍ 이하, 약 120 ㎍, 약 100㎍ 이하, 약 90㎍ 이하, 약 80㎍ 이하, 약 70㎍ 이하, 약 60㎍ 이하, 약 50㎍ 이하, 약 40㎍ 이하, 약 30㎍ 이하, 약 20㎍ 이하, 또는 약 10㎍ 이하일 수 있다. 리포칼린 뮤테인의 전달 용량은 투여당 약 0.05 mg 이상, 약 0.1 mg 이상, 또는 약 0.2 mg 이상, 또는 투여당 체중 kg 당 약 0.05 ㎍ 이상, 약 0.1 ㎍ 이상, 약 0.15 ㎍ 이상일 수 있다.
리포칼린 뮤테인이 호흡기 질환 또는 장애의 치료에 사용되는 경우 국소 노출이 필요할 수 있다. 국소 노출은 리포칼린 뮤테인이 효과가 나타나는 장소에 남아 있다는 이점이 있다. 또한, 호흡기에 남아 있는 리포칼린 뮤테인의 제거율은 전신 흡수 리포칼린 뮤테인보다 낮을 수 있다.
일부 구체예에서, 전신 노출은 리포칼린 뮤테인의 전달 용량의 약 0.3% 이상, 약 0.4% 이상, 약 0.5% 이상, 약 0.6% 이상, 약 0.7% 이상, 약 0.8% 이상, 약 0.9% 이상, 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 3% 이상, 약 4% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9 % 이상, 약 10% 이상, 약 11% 이상, 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 14% 이상, 또는 약 15% 이상이 순환계로 진입함을 의미한다.
전신 노출을 달성하기 위해, 리포칼린 뮤테인의 전달 용량은 투여당 약 0.05 mg 내지 약 1000 mg, 바람직하게는 투여당 5 mg 내지 약 1000 mg, 바람직하게는 투여당 약 6 mg 내지 약 500 mg, 바람직하게는 투여당 약 7 mg 내지 약 300 mg, 바람직하게는 투여당 약 7 mg 내지 약 280 mg일 수 있다. 리포칼린 뮤테인의 전달 용량은 투여당 체중 kg 당 약 0.1 ㎍ 내지 약 15 mg, 바람직하게는 투여당 체중 kg 당 약 0.05 mg 내지 약 8 mg, 바람직하게는 투여당 체중 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 4 mg일 수 있다. 일반적으로, 리포칼린 뮤테인의 전달 용량은 투여당 약 4 mg 이상, 약 5 mg 이상, 약 6 mg 이상, 약 7 mg 이상, 약 8 mg 이상, 약 9 mg 이상, 약 10 mg 이상, 약 15 mg 이상, 약 20 mg 이상, 약 25 mg 이상, 약 30 mg 이상, 약 50 mg 이상, 또는 약 100 mg 이상 또는 투여당 체중 kg 당 약 50 ㎍ 이상, 60 ㎍ 이상, 70 ㎍ 이상, 80 ㎍ 이상, 약 90 ㎍ 이상, 약 100 ㎍ 이상, 약 120 ㎍ 이상, 약 140 ㎍ 이상, 약 160 ㎍ 이상, 약 180 ㎍ 이상, 약 200 ㎍ 이상, 약 250 ㎍, 약 300 ㎍ 이상, 약 400 ㎍ 이상, 약 500 ㎍ 이상일 수 있다. 리포칼린 뮤테인의 전달 용량은 투여당 약 400 mg 이하, 약 300 mg 이하, 약 200 mg 이하, 약 150 mg 이하, 약 120 mg 이하, 또는 약 100 mg 이하, 또는 투여당 체중 kg당 약 5 mg 이하, 약 4 mg 이하, 약 3 mg 이하, 약 2.5 mg 이하, 또는 약 2 mg 이하일 수 있다.
흡입 투여 후 리포칼린 뮤테인의 전신 노출은 빠른 흡수를 특징으로 할 수 있다. 혈장 내 리포칼린 뮤테인의 최대 농도는 투여 후 약 0.1시간 내지 약 10시간, 바람직하게는 약 0.5시간 내지 약 5시간, 바람직하게는 약 1 내지 약 2시간 후에 도달할 수 있다. 혈장 내 리포칼린 뮤테인의 최대 농도(Cmax)는 mL당 약 1 ng 이상, mL당 약 3 ng 이상, mL당 약 8 ng 이상, mL당 약 10 ng 이상, mL당 약 50 ng 이상, mL당 약 100 ng 이상, mL당 약 600 ng 이상, mL당 약 1,000 ng 이상, mL당 약 1,500 ng 이상, 또는 mL당 약 2,000 ng, 예를 들어 mL당 약 1 ng 내지 mL당 약 2,000 ng, mL당 약 1 ng 내지 약 600 ng, 또는 mL당 약 1 ng 내지 약 100 ng이다. 리포칼린 뮤테인의 혈중농도-시간 곡선하면적(AUCinf)은 약 10 h*ng/mL 이상, 약 20 h*ng/mL 이상, 약 70 h*ng/mL 이상, 약 100 h*ng/mL 이상, 약 500 h*ng/mL 이상, 약 1,000 h*ng/mL 이상, 약 5,000 h*ng/mL 이상, 약 10,000 h*ng/mL 이상 또는 약 16,000 h*ng/mL 이상, 예를 들어 약 10 h*ng/mL 내지 약 16,000 h*ng/mL, 약 10 h*ng/mL 내지 약 5,000 h*ng/mL, 또는 20 h*ng/mL 내지 약 5,000 h*ng/mL일 수 있다. 리포칼린 뮤테인의 혈청 반감기(t1/2)는 약 2시간 내지 약 10시간, 예컨대 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 또는 약 10시간일 수 있다.
전신 노출은 이외에 호흡기에 남아 있는, 즉, 매우 낮은 수준(또는 정량화 한계 이하)으로 순환계에 들어가는 약물로 부가 및/또는 상승 효과를 달성하기에 바람직할 수 있다. 리포칼린 뮤테인이 전신 또는 호흡기 이외의 조직이나 기관에 영향을 미치는 질환 또는 장애의 치료에 사용되는 경우 전신 노출이 필요할 수도 있다. 전신 노출은 예를 들면 CGRP 특이적인 리포칼린 뮤테인의 투여를 위해 요구될 수 있다. 본원에 사용된 "전신 질환"은 다수의 기관 및 조직에 영향을 미치거나 신체 전체에 영향을 미치는 질환이다.
국소 노출은 리포칼린 뮤테인이 효과가 나타나는 장소에 남아 있다는 이점이 있다. 또한, 호흡기에 남아 있는 리포칼린 뮤테인의 제거율은 전신으로 흡수된 리포칼린 뮤테인보다 낮을 수 있다.
C. 제형화
본 발명에 사용하기 위한 리포칼린 뮤테인은 일반적으로 특정 결합 구성원에 추가하여 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 약학 조성물의 형태로 투여될 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 널리 공지된 기타 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 독성이 없어야 하며 유효성분의 효능을 방해해서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용하기 위한 리포칼린 뮤테인은 인산염 완충 식염수(PBS)의 수용액으로 제형화될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은 부형제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 부형제는 흡입 약물, 예를 들어 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인이 폐의 심부 및/또는 폐의 폐포 영역에 도달하는 것을 촉진할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 부형제는 흡입 약물, 예를 들어 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인의 전신 흡수를 향상시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 부형제는 흡입 약물, 예를 들어 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인의 보다 빠른 시작을 촉진할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 부형제는 흡입 약물, 예를 들어 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인의 강화된 치료 효과에 기여할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 부형제는 용액에서 미소구체를 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은 푸마릴 디케토피페라진(FDKP)을 포함할 수 있다.
리포칼린 뮤테인을 포함하는 약학 조성물은 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
분무기와 함께 사용하기에 적합한 제형은 일반적으로 물 또는 액체(보통 수성) 매질에 분산된 리포칼린 뮤테인을 포함한다. 제형은 또한 완충용액, 당(예를 들어, 단백질 안정화 및 삼투압 조절을 위한), 염(생리학적 양), 및/또는 기타 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 완충제의 예는 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트 및 글리신이다. 적합한 완충용액은 인산염 완충 식염수(예: 1.06 mM KH2PO4, 2.96 mM Na2HPO4, 154 mM NaCl, pH 7.4)이다.
계량된-용량 흡입기 장치와 함께 사용하기 위한 리포칼린 뮤테인 제형은 일반적으로 미분된 분말을 포함한다. 이 분말은 리포칼린 뮤테인 함유 제형을 동결건조하고 원하는 입자 크기로 밀링함으로써 생성될 수 있다. 제형은 또한 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은 안정화제를 함유할 수 있다. 하나 이상의 당 또는 당 알코올을 제제에 첨가할 수 있다. 예에는 락토스, 말토스, 만니톨, 소르비톨, 소르비토스, 트레할로스, 자일리톨 및 자일로스가 포함된다. 그런 다음 입자는 선택적으로 계면활성제의 도움으로 추진제에 현탁될 수 있다. 추진제는 클로로플루오로카본, 히드로클로로플루오로카본, 히드로플루오로카본, 또는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 또는 이들의 조합을 포함하는 탄화수소와 같이 이러한 목적을 위해 사용되는 임의의 통상적인 재료일 수 있다. 적합한 계면활성제에는 소르비탄 트리올리에이트 및 대두 레시틴이 포함된다. 올레산은 또한 계면활성제로서 유용할 수 있다.
D. 질환의 치료
1. 호흡기 질환 또는 장애
호흡기 질환 또는 장애는 호흡기와 관련된 모든 질환 또는 장애를 지칭한다. 이러한 질환 또는 장애는 흡입 투여를 통해 리포칼린 뮤테인을 사용하여 치료할 수 있다. 일부 구체예에서, 투여는 호흡기의 리포칼린 뮤테인에 대한 국소 노출을 제공할 수 있다. 국소 노출은 리포칼린 뮤테인이 호흡기, 즉 효과가 발생하는 장소에 남아 있도록 하는 데 도움이 될 수 있다. 일부 다른 구체예에서, 투여는 리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출을 제공할 수 있다. 이러한 전신 노출은 리포칼린 뮤테인이 호흡기에 실질적으로 남아 있을 때, 즉 전신 노출이 매우 낮은 경우(즉, 정량화 한계 이하)와 비교하여 부가적 및/또는 상승적 효과를 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 리포칼린 뮤테인의 흡입 투여는 잠재적으로 더 긴 작용 지속 기간과 같은 리포칼린 뮤테인의 동일하거나 필적하는 생체이용률을 전신적으로 투여하는 것과 비교하여 개선된 효과를 제공한다. 따라서, 일부 구체예에서, 흡입된 리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출이 바람직할 수 있다.
호흡기 질환 또는 장애는 알레르기성 염증, 알레르기성 천식, 비염, 결막염, 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐포 단백증, 성인 호흡 곤란 증후군, 또는 세균성 감염, 예를 들어 녹농균 감염을 포함한다. 호흡기 질환 또는 장애는 (알레르기성) 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD) 또는 낭포성 섬유증(CF)과 같은 폐 장애일 수 있다.
인터루킨(IL)-4 및 IL-13은 오랫동안 다양한 호흡기 질환 또는 장애와 연관되어 왔다. 이러한 질환 또는 장애는 IL-4Rα에 특이적인 리포칼린 뮤테인과 같은 IL-4Rα 길항제를 사용하여 치료할 수 있다.
예를 들어, 천식은 기도 염증과 관련된 기도 과민반응을 특징으로 하는 복잡하고 지속적인 염증성 질환이다. 연구에 따르면 고용량 흡입 코르티코스테로이드 및 지속성 기관지 확장제 또는 오말리주맙(면역글로불린 E에 결합하고 표준 치료 요법으로 조절되지 않는 환자에 대한 단계적 요법으로 종종 사용되는 인간화 단클론 항체)의 통상적인 사용은 모든 환자에서 천식 조절을 제공하기에 충부하지 않을 수 있으며, 중요한 미충족 요구를 강조한다. 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-13(IL-13), 전사 인자-6의 신호 변환기 및 활성화제는 천식에서 기도 염증, 점액 생성 및 기도 과민 반응의 발병의 핵심 구성요소이다. 일부 바람직한 구체예에서, 알레르기성 천식은 IL-4/IL-13 경로가 질환의 발병기전에 기여하는 기도 염증이다.
IL-4/IL-13 신호전달 경로와 관련된 추가 폐 장애에는 폐 장애가 포함된다. 이러한 폐 장애에는 만성 섬유성 폐 질환을 비롯한 폐 섬유증, 폐에서 IL-4-유도 섬유모세포 증식 또는 콜라겐 축적을 특징으로 하는 상태, Th2 면역 반응이 역할을 하는 폐 상태, 폐의 장벽 기능 감소(예: IL-4로 유발된 상피 손상으로 인해 발생), 또는 IL-4가 염증 반응에서 역할을 하는 상태에 의해 발생한다.
낭포성 섬유증(CF)은 점액의 과잉 생산과 만성 감염의 발병이 특징이다. IL-4Rα 및 Th2 반응을 억제하면 점액 생성이 감소하고 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증(ABPA)과 같은 감염을 통제하는 데 도움이 된다. 알레르기성 기관지폐 진균증은 주로 Th2 면역 반응이 우세한 낭포성 섬유증 또는 천식 환자에서 발생한다. IL-4Rα와 Th2 반응을 억제하면 이러한 감염을 제거하고 통제하는 데 도움이 된다.
만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)은 점액 과분비 및 섬유증과 관련이 있다. IL-4Rα 및 Th2 반응을 억제하면 점액 생성과 섬유질 발달이 감소하여 호흡 기능이 개선되고 질병 진행이 지연된다. 블레오마이신 유발성 폐렴 및 섬유증, 방사선 유발성 폐 섬유증은 IL-4 및 IL-13을 생성하는 Th2, CD4+ 세포 및 대식세포의 유입에 의해 나타나 차례로 섬유증의 발병을 매개하는 폐 섬유증을 특징으로 하는 장애이다. IL-4Rα 및 Th2 반응을 억제하면 이러한 장애의 발병을 줄이거나 예방할 수 있다.
또한, IL-4 및 IL-13은 폐 상피 세포를 점액 생성 술잔 세포로 분화하도록 유도한다. 따라서 IL-4 및 IL-13은 하위 집단 또는 일부 상황에서 점액 생성을 향상시키는 데 기여할 수 있다. 점액 생산 및 분비는 COPD 및 CF에서 질환 발병에 기여한다. 따라서, 점액 생성 또는 점액 분비(예를 들어, 과잉 생산 또는 과분비)와 관련된 장애는 바람직하게는 본원에 설명된 바와 같이 IL-4Rα에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 적용함으로써 본 개시내용의 방법에 의해 치료, 개선 또는 예방될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 점액 생성 또는 점액 분비와 관련된 장애는 바람직하게는 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD) 또는 낭포성 섬유증(CF)이다.
폐포 단백증은 계면활성제 제거의 붕괴를 특징으로 한다. IL-4는 계면활성제 생성물을 증가시킨다. 일부 추가 구체예에서, 계면활성제 생성을 감소시키고 전체 폐 세척의 필요성을 감소시키기 위해 본 개시내용의 IL-4Rα에 특이적인 리포칼린 뮤테인과 같은 IL-4Rα 길항제의 사용이 또한 본원에서 고려된다.
성인 호흡 곤란 증후군(ARDS)은 여러 요인에 기인할 수 있으며 그 중 하나는 독성 화학물질에 대한 노출이다. 따라서, 바람직하지만 비제한적인 예로서, ARDS가 그러한 환자에서 빈번한 합병증이기 때문에, ARDS에 민감한 환자 집단은 인공호흡기를 사용하는 중환자이다. 일부 추가 구체예에서, 본 개시내용의 IL-4Rα 특이적인 리포칼린 뮤테인과 같은 IL-4Rα 길항제는 염증 및 부착 분자를 감소시킴으로써 ARDS를 완화, 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.
유육종증은 육아종 병변이 특징이다. 일부 추가 구체예에서, 유육종증, 특히 폐 유육종증을 치료하기 위한 본 개시내용의 IL-4Rα 특이적인 리포칼린 뮤테인과 같은 IL-4Rα 길항제의 사용이 또한 본원에서 고려된다.
폐에서 IL-4로 유도된 장벽 파괴가 역할을 하는 상태는 IL-4Rα 길항제로 치료할 수 있다. 폐의 상피 장벽 손상은 IL-4 및/또는 IL-13에 의해 직접 또는 간접적으로 유도될 수 있다. 폐의 상피는 폐 내강의 내용물이 점막하층으로 들어가는 것을 방지하는 선택적 장벽으로 기능을 한다. 손상되거나 "새는" 장벽은 항원이 장벽을 통과하도록 하여 폐 조직에 추가 손상을 일으킬 수 있는 면역 반응을 유도한다. 이러한 면역 반응은 예를 들어 호산구 또는 비만 세포의 동원을 포함할 수 있다. IL-4Rα 길항제는 면역 반응의 이러한 바람직하지 않은 자극을 억제하기 위해 국소 투여될 수 있다.
이와 관련하여, 본 개시내용의 IL-4Rα 특이적인 리포칼린 뮤테인과 같은 IL-4Rα 길항제는 폐 상피의 치유를 촉진하기 위해, 예를 들어 천식 환자에서 사용되어 장벽 기능을 회복시키거나 대안으로 예방 목적으로 투여될 수 있다. 호흡기 계통에 국소 투여하여 폐 상피에 대한 IL-4 및/또는 IL-13 유발 손상을 방지한다.
호흡기 질환 또는 장애는 녹농균(P. aeruginosa) 세균에 의한 감염과 같은 세균성 감염일 수도 있다. 녹농균(P. aeruginosa)은 주로 조직 손상과 관련하여 급성 감염을 일으키는 기회감염 병원체이다. 놀랍게도, 동일한 병원체가 COPD, CF, 기관지 확장증 및 만성 파괴성 폐 질환에서 진행성 및 궁극적으로 만성 재발성 호흡기 감염과도 관련이 있다(Yum et al., Tuberc Respir Dis(Seoul), 2014). 녹농균(P. aeruginosa) 감염의 발병기전은 주로 생물막을 형성하는 능력, 점막 표면 또는 침습 장치를 덮을 수 있는 구조화된 세균 군집에 달려 있다. 생물막 감염은 기존의 항생제 요법으로 치료하기 어렵다. 피오베르딘과 피오켈린은 녹농균(P. aeruginosa)의 병원성에 중요한 표적이다. 따라서, 녹농균(P. aeruginosa)에 의해 유발된 것과 같은 세균성 감염은 흡입 투여 후 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인에 대한 국소 노출을 통해 치료될 수 있는 질환을 추가로 나타낸다. 따라서 피오베르딘 유형 I, II, III 또는 피오켈린에 특이적인 리포칼린 뮤테인은 이러한 감염의 치료에 사용될 수 있다.
암 치료는 리포칼린 뮤테인에 대한 국소 노출, 특히 폐암과 같은 호흡기의 암 치료를 위한 또 다른 출원이다. 일련의 암 표적에 특이적인 리포칼린 뮤테인이 본원에 개시되어 있고, 흡입 투여에 의한 암 치료에서 이들 모든 리포칼린 뮤테인의 사용이 본 개시내용에 의해 고려된다. 이러한 리포칼린 뮤테인은 ED-B 피브로넥틴, CTLA-4, c-Met, 글리피칸-3, LAG-3, CD137, Ang-2 또는 VEGF에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 포함한다.
2. 전신 질환 및 기타 기관 또는 조직의 질환
호흡기 계통 이외의 기관이나 조직에 영향을 미치는 전신 질환 또는 장애는 흡입 투여 후 전신에 흡수되는 리포칼린 뮤테인을 사용하여 치료할 수 있다. 이러한 질환 또는 장애는 편두통, 빈혈, 심혈관 질환과 같은 통증 장애, 알츠하이머 질환과 같은 신경퇴행성 질환, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 암, 및 세균성 감염, 예컨대 녹농균 감염을 포함한다.
호흡기 질환 또는 장애에 더하여, IL-4/IL-13 경로는 일련의 전신 질환 또는 호흡기 이외의 다른 기관 또는 조직에 영향을 미치는 질환에도 관여한다. 이러한 질환 또는 장애의 예로는 비염, 결막염, 피부염 또는 식품 알레르기와 같은 알레르기성 질환이 있다. 따라서 전신 노출을 초래하는 IL-4 Rα 특이적인 리포칼린 뮤테인의 흡입 투여를 위한 치료 응용 프로그램도 있다. 따라서 본 개시내용은 또한 IL-4Rα 특이적인 리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출을 통한 질환 및 장애의 치료 또는 예방을 고려한다. 이러한 질환 또는 장애에는 비염, 결막염, 피부염 또는 식품 알레르기와 같은 알레르기성 질환이 포함된다.
통증 장애는 편두통일 수 있으며, 이는 일반적으로 중등도에서 중증의 재발성 두통을 특징으로 하는 원발성 두통 장애이다. 일반적으로 두통은 머리의 절반에 영향을 미치고 본질적으로 맥동하며 2시간에서 72시간 동안 지속된다. 관련 증상에는 메스꺼움, 구토 및 빛, 소리 또는 냄새에 대한 과민증이 포함될 수 있다. CGRP는 감각 신경 자극 시 CGRP가 방출되고 강력한 혈관 확장 활성을 가지므로 편두통에서 역할을 하는 것으로 보고되었다(Arulmozhi et al., Vascul Pharmacol, 2005). 또한, CGRP의 방출은 삼차 신경 섬유의 자극 시 삼차 신경 섬유에 의해 신경지배되는 조직에서 혈관 투과성과 후속 혈장 단백질 누출(혈장 단백질 유출)을 증가시킨다(Arulmozhi et al., Vascul Pharmacol, 2005). 또한 편두통을 앓고 있는 환자에게 CGRP를 주입하면 편두통과 유사한 증상이 나타난다는 연구 결과가 보고되었다(Lassen et al., Cepharalgia, 2002). 본 개시내용의 CGRP 특이적인 리포칼린 뮤테인은 유리하는 CGRP의 탈조절된 수준과 관련된 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 리포칼린 뮤테인은 유리하는 CGRP의 순환 수준을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 개시내용의 CRGP 결합 리포칼린 뮤테인은 파린 장애, 특히 편두통의 치료, 예방 및/또는 개선에 유용할 수 있다. CGRP 특이적인 리포칼린 뮤테인의 흡입 투여는 주사를 피하고 자가 치료를 가능하게 하는 이점이 있다. 추가 이점은 흡입에 의해 CGRP 특이적인 리포칼린 뮤테인을 투여할 때 치료 효능 및 전신 흡수의 빠른 시작이다.
놀랍게도, 본원에 기재된 CGRP-특이적인 리포칼린 뮤테인과 같은 리포칼린 뮤테인의 흡입 투여는 피하 투여보다 우수한(즉, 보다 빠른) 시작(onset)을 가질 수 있다. 놀랍게도, 본원에 기술된 CGRP 특이적인 리포칼린 뮤테인과 같은 리포칼린 뮤테인의 흡입 투여는 정맥내 투여와 같은 직접 전신 투여에 필적할 만한(즉, 대략 빠른) 또는 심지어 더 빠른 시작을 가질 수 있다. 리포칼린 뮤테인의 증가된 전신 노출, 더 빠른 시작 및/또는 강화된 치료 효과는 푸마릴 디케토피페라진(FDKP)과 같은 특정 부형제를 사용한 제형을 통해 달성될 수 있다. 특히 본 개시내용의 CGRP-특이적인 리포칼린 뮤테인(예를 들어, SEQ ID NO: 47에 기재된 서열을 포함하는 리포칼린 뮤테인)과 관련하여, 시작은 레퍼런스 항-CGRP 항체(SEQ ID NO: 204 및 205)만큼 빠르거나 심지어 더 빠를 수 있다. FDKP와 함께 예를 들면 0.4 mg/kg으로 제형화하는 경우, 본 개시내용의 CGRP 특이적인 리포칼린 뮤테인은 더 빠른 시작, 예컨대 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 또는 약 30분의 시작을 나타낼 수 있다. CGRP 특이적인 리포칼린 뮤테인의 발병은 감각 신경 매개 혈관 확장 분석에서 결정될 수 있다. 이러한 분석은 실시예 4에 본질적으로 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
혈관 확장의 억제와 같은 본원에 기재된 CGRP-특이적인 리포칼린 뮤테인(예를 들어, SEQ ID NO: 47에 기재된 서열을 포함하는 리포칼린 뮤테인)의 치료 효과는 레퍼런스 항-CGRP 항체(SEQ ID NO: 204 및 205)에 필적하거나 더 우수하다. FDKP와 함께, 예를 들어 0.4 mg/kg으로 제형화되는 경우, 본 개시내용의 CGRP 특이적인 리포칼린 뮤테인의 시작이 추가로 향상될 수 있다.
빈혈은 적혈구(RBC) 수, 헤마토크릿(Ht), 헤모글로빈(Hb), 혈청 철 수준 및 트랜스페린(Tf) 포화와 같은 혈액학적 매개변수의 감소로 이어지는 혈청 철 고갈과 관련된 질환이다. 이로 인해 혈액 내 산소 수준이 감소하고 쇠약, 집중력 저하, 숨가쁨 및 호흡곤란으로 설명되는 삶의 질(QOL) 저하와 관련이 있다. 심한 빈혈은 빠른 심박수, 심장 비대 및 심부전으로 이어질 수 있다. 빈혈은 종종 만성 신장 질환/확립된 만성 신장 질환(CKD), 암 빈혈(AC), 화학요법 유도 빈혈(CIA) 및 만성 질환 빈혈(ACD)과 관련이 있다.
철 결핍성 빈혈은 염증성 질환과 관련된 빈혈과 달리 철 투여로 쉽게 치유되는 철 항상성의 장애이다. 헵시딘 수치는 염증과 함께 상향조절되기 때문에 이 두 질환을 구별할 수 있는 매개변수이다.
헵시딘은 철 항상성의 중추적인 음성 조절제이다. 헵시딘 생산은 철 부하 및 염증과 함께 증가하고 낮은 철 조건 및 저산소 상태에서 감소한다. 헵시딘은 유일하게 알려진 포유동물 세포 철 유출체인 페로포틴에 결합하여 작용하고 이의 내재화 및 분해를 유도한다. 페로포틴(ferroportin)은 십이지장 세포, 비장, 간에서 발현되기 때문에 헵시딘이 증가하고 페로포틴이 감소하면 십이지장 철 흡수가 억제되고 대식세포에서 재활용된 철이 방출되며 간에 저장된 철이 동원된다. 헵시딘은 염증성 질환과 관련된 빈혈의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 급성 또는 만성 염증 상태는 헵시딘 발현의 상향조절을 초래하여 철 결핍을 유발함으로써 ACD, AC, CIA 및 CKD의 빈혈과 관련된 빈혈을 유발할 수 있다.
본 개시내용의 헵시딘 결합 리포칼린 뮤테인은 상승된 수준의 헵시딘, 헵시딘 관련 장애, 철 항상성 장애, 빈혈 또는 상승된 수준의 헵시딘과 관련된 염증 상태를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 빈혈은 염증성 빈혈, 만성 염증성 빈혈, 철 결핍성 빈혈, 철부하성 빈혈, CKD, AC, CIA와 관련된 빈혈, 또는 적혈구 생성 촉진제(ESA) 내성과 관련된 빈혈일 수 있다.
허혈성 심장 질환(IHD)으로도 알려진 관상 동맥 질환(CAD)은 심장 동맥에 플라크가 축적되어 심장 근육으로 가는 혈류 감소를 수반한다. 심혈관 질환 중 가장 흔한 질환이다. 유형에는 안정형 협심증, 불안정형 협심증, 심근경색증, 심장 돌연사가 포함된다. 본 개시내용의 PCSK9 결합 리포칼린 뮤테인은 이러한 관상동맥 심장 질환을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
신경퇴행성 질환은 흡입 투여 후 리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출을 통해 치료될 수 있는 추가 질환 그룹이다. 알츠하이머 질환(AD)은 노인 인구에서 가장 흔한 형태의 치매이다. 알츠하이머 질환은 아밀로이드 베타 펩타이드를 포함하는 잠재적으로 신경독성의 40-42개의 잔기를 발생시키는 아밀로이드 전구체 단백질의 불완전한 프로세싱과 연관된다. Aβ의 올리고머 및 긴 섬유소로의 후속 응집은 질환의 진행 과정에서 중추적인 역할을 하여 노인성 플라크의 형성에서 절정에 이른다(Haass and Selkoe, Nat Rev Mol Cell Biol, 2007). 따라서 본 개시내용의 아밀로이드 베타 특이적인 리포칼린 뮤테인은 AD와 같은 신경퇴행성 질환을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.
녹농균(P. aeruginosa)에 의해 유발된 것과 같은 세균성 감염은 흡입 투여 후 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출을 통해 치료될 수 있는 추가의 질환을 나타낸다. 피오베르딘과 피오켈린은 녹농균(P. aeruginosa)의 병원성에 중요한 표적이다. 따라서 피오베르딘 유형 I, II, III 또는 피오켈린에 특이적인 리포칼린 뮤테인은 이러한 감염의 치료에 사용될 수 있다.
염증성 질환 및 자가면역 질환은 추가 질환 군이며, 이는 흡입 투여 후 본 개시내용의 리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출로 치료될 수 있다. IL-17A와 IL-23은 모두 염증과 자가면역 질환에 관여하는 사이토카인이다. 따라서, 본 개시내용의 IL-17A 특이적인 또는 IL-23 특이적인 리포칼린 뮤테인은 염증성 질환 또는 자가면역 질환, 예컨대 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 크론병 및 건선의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
암 치료는 리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출을 달성하기 위한 또 다른 응용 분야이다. 일련의 암 표적에 특이적인 리포칼린 뮤테인이 본원에 개시되어 있고, 흡입 투여에 의한 암 치료에서 이들 모든 리포칼린 뮤테인의 사용이 본 개시내용에 의해 고려된다. 이러한 리포칼린 뮤테인은 ED-B 피브로넥틴, CTLA-4, c-Met, 글리피칸-3, LAG-3, CD137, Ang-2 또는 VEGF에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 포함한다.
본 개시내용의 추가 목적, 이점 및 특징은 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 실시예 및 그의 첨부 도면의 조사시에 당업자에게 명백해질 것이다. 따라서, 본 개시내용은 예시적인 실시예 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 개시되지만, 여기에 개시된 본 개시내용의 변형 및 변이는 당업자에 의해 의존될 수 있고 그러한 변형 및 변이는 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주되는 것으로 이해되어야 한다.
[실시예]
실시예 1: 건강한 마우스에서 기관내 투여된 리포칼린 뮤테인의 약동학
건강한 마우스에서 예시적인 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NOs: 3 및 4)의 약동학(PK) 분석을 수행하였다.
대략 8주령의 암컷 마우스에 미세분무기(#1A-1C-M, Penn Century)를 사용하여 100 ㎍/kg 또는 100 ㎍/mouse의 용량으로 각각의 시험 리포칼린 뮤테인을 기관내 투여하였다. 혈장, 기관지폐포 세척액(BALF) 및 폐 균질액 샘플은 1시간, 4시간, 6시간, 12시간 및 24시간에 마우스를 희생시킨 후 얻었고, 해당 약물 수준이 결정되었다.
항응고제로서 리튬 헤파린이 있는 튜브에 약한 이소플루란 마취 하에서 심장 천자에 의해 실험 그룹의 모든 동물로부터 결정된 시점에서 혈액을 채취하였다. 그런 다음 샘플을 에펜도르프 튜브에서 4℃, 5000 x rpm으로 10분 동안 원심분리하고 혈장을 수집하고(100 ㎕/tube) 추가 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다. BALF 시료는 0.5 mL의 식염수로 3회(총 1.5 mL) 세척한 후 4℃, 400 x g으로 10분간 원심분리하여 얻었다. 상등액을 수집하고 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다. 세척 직후, 폐는 식염수로 우심실을 통해 관류되어 혈관 내용물을 내보내고 후속적으로 동결되고 -20℃에서 보관되었다. Ultra Turrax Homogenizer(IKA)를 사용하여 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 1 mL의 PBS에서 가중된 폐를 균질화하여 폐 균질액을 얻었다. 폐 균질액을 분취하고 추가 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다. 분석 전에 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 폐 균질액의 총 단백질 농도를 정량화하였다. 균질액 샘플을 PBS를 사용하여 5 mg/mL의 총 단백질 농도로 조정하였다(정규화된 폐 균질액).
BALF, 폐 균질액 및 혈장의 약물 수준을 다음 프로토콜을 사용하여 분석하였다: 항-NGAL 또는 항-Tlc 항체(Pieris)를 PBS(1 ㎍/mL)에 용해시키고 4℃에서 마이크로타이터 플레이트 상에서 밤새 코팅하였다. 플레이트는 5회 동안 80 ㎕의 PBS-0.05%T(0.05%(v/v) Tween 20이 보충된 PBS)로 각 인큐베이션 단계 후에 세척되었다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS-0.1%T(PBS-0.1%T-2%BSA) 중 2% BSA(w/v)로 차단하고 후속적으로 세척하였다. 샘플을 PBS-0.1%T-2%BSA에 희석하고(혈장 샘플은 50% 혈장 농도로, 폐 샘플은 20% 폐 균질액으로, BALF 샘플은 FACS 완충액 중 20% BALF로), 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 또 다른 세척 단계가 이어졌다. 연구 중인 결합 물질은 각각 PBS-0.1%T-2%BSA로 희석된 1 ㎍/mL의 항-NGAL-비오틴 또는 항-Tlc-비오틴 및 1 ㎍/mL의 SULFO-태그 스트렙타비딘(Meso Scale Discovery)과 함께 1시간 인큐베이션 후 검출되었다. 추가 세척 단계 후, 계면활성제가 포함된 MSD Read 완충액을 각 웰에 첨가하고 모든 웰의 전기화학발광(ECL) 신호를 Meso Scale Discovery 판독기를 사용하여 판독하였다. 데이터 분석 및 정량화를 위해 표준 단백질 희석액을 사용한 검정곡선도 작성하였다.
예시적인 실험에서 기관내 투여 후 시간 경과에 따른 시험 분자의 BALF, 정규화된 폐 균질액 및 혈장 농도를 도 1A 및 1B에 플롯팅하였다. Phoenix WinNonlin version 8.1을 사용하여 데이터에 비구획 분석을 적용했으며 계산된 반감기는 표 1에 요약되어 있다. 데이터는 기관내 단일 폐 투여에서 3개의 구획(BALF, 폐 및 혈장) 각각에서 SEQ ID NO: 3(hNGAL의 리포칼린 뮤테인) 및 SEQ ID NO: 4(hTlc의 리포칼린 뮤테인)에 대해 유사한 PK 프로파일이 관찰되었음을 보여준다.
리포칼린 뮤테인 기관내 투여 후 PK 매개변수
매개변수 BALF 정규화된 폐 균질액 혈장
SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
t1/2 [h] 5.9 4.3 6.2 4.6 5.52 5.59
Tmax [h] 1 1 1 1 1 1
Cmax [ng/mL] 1411.35 680.89 147.28 58.9 8.7 3.5
Tlast [h] 24 24 24 24 24 24
Clast [ng/mL] 105.78 15.81 11.26 1.98 0.53 0.2
AUClast [h*ng/mL] 10225.4 3953.24 1129.48 403.71 65 22.37
AUCinf [h*ng/mL] 11127.29 4051.3 1230.19 416.77 69.22 23.98
Vz/F [mL/kg] 76.62 153.09 726.97 1580.36 11513 33643.65
CL/F [mL/h/kg] 8.9869 24.6835 81.29 239.94 1444.74 4169.38
실시예 2: 건강한 마우스에서 기관내 투여된 리포칼린 뮤테인의 약동학
유사한 PK 분석이 또한 대략 8주령의 수컷 BALB/c 마우스로 수행되었으며, 여기서 동물은 미세분무기를 사용하여 84 ㎍/mouse 용량의 SEQ ID NO: 4(hTlc의 리포칼린 뮤테인) 및 100 ㎍/mouse 용량의 SEQ ID NO: 3(hNGAL의 리포칼린 뮤테인)의 리포칼린 뮤테인을 기관내 투여하였다. 동물은 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 24시간 및 48시간에 펜토바르비톤 나트륨(200 mg/kg 체중 또는 80 mg/mL의 스톡 용액의 200 ㎕)을 복강내 주사로 과량 투여하여 마우스를 희생시키고(시험 분자당 시점당 n=5마리), 혈장, BALF 및 폐 조직을 수집하여 PK 분석을 하였다. 1 내지 6시간 사이의 시점 동안, 마우스 기관내 주사는 20분 간격으로 이루어졌다; 24시간 및 48시간 시점 동안 마우스에 5분 간격으로 주사하였다.
기흉을 이용한 외과적 절제 후, 약 0.5 mL의 심장 혈액을 시린지로 심방 아래의 심장에 30G 바늘을 삽입하여 20 ㎕의 0.5 M EDTA를 포함하는 1.5 mL 튜브에 따랐다. 혈장 분리를 위해 혈액 샘플을 4℃, 3000 x g으로 10분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 혈장을 수집하고 분석 전까지 동결하였다.
BALF 수집을 위해 BALF 수확 팁을 마우스 기관에 삽입하여 PBS를 반복적으로 주입한 다음 BALF를 멸균 튜브에 250~300 ㎕까지 뽑아내고 "BALF Wash 1"이라고 표시하였다. 폐는 300 ㎕의 PBS로 매번 7회 더 세척되었고 BALF는 BALF 세척 2-8과 같이 별도의 튜브에 수집되었다. BALF 세척액은 추가 분석 전까지 -80℃에서 보관되었다.
폐 조직을 수확하기 위해 개별 엽(엽 1: 왼쪽 엽; 엽 2: 하엽; 엽 3: 상엽; 엽 4: 중간 엽)을 절단하고, 무게를 측정하고, 드라이 아이스에서 동결시켰다. 폐엽을 RIPA 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% Triton X-100, 0.2% 소듐 데옥시콜레이트, 0.2% 소듐 도데실설페이트와 완전 프로테아제 억제제 칵테일)에서 TissueLyser LT 장치(Qiagen)를 사용하여 균질화하고 4℃에서 10분 동안 10000 xg로 원심분리하였다. 상등액을 수집하고 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도에 대해 정량화하였다. 균질액 샘플을 RIPA 완충액으로 5 mg/mL의 단백질 농도로 조정하고 추가 사용을 위해 보관하였다(정규화된 폐 균질액).
상이한 구획에서의 약물 수준은 실시예 1에서 상기 기재된 바와 같이 ELISA를 사용하여 결정하였다. 시간 경과에 따른 BALF, 폐 또는 혈장에서 시험 분자의 평균 농도를 플롯팅하였다. 예시적인 실험의 결과는 도 2A 및 2B에 나와 있다. 해당 PK 매개변수는 표 2에 요약되어 있다.
데이터는 농도에서의 유사한 시간 의존적 감소가 BALF, 폐 조직 및 혈장의 세 구획 모두에서 SEQ ID NO: 4(hTlc의 리포칼린 뮤테인) 및 SEQ ID NO: 3(hNGAL의 리포칼린 뮤테인)에 대해 관찰되었음을 보여준다. 노출 수준은 두 리포칼린 모두에 대한 BALF에서 가장 높으며, SEQ ID NO: 3(hNGAL의 리포칼린 뮤테인) 또는 SEQ ID NO: 4(hTlc의 리포칼린 뮤테인)에 대한 혈장 노출과 비교하여 각각 ~4배 또는 ~12배 더 높은 수준을 나타낸다. Cmax에서도 같은 경향을 보였다.
리포칼린 뮤테인 기관내 투여 후 폐 및 말초의 PK 매개변수
매개변수 BALF 정규화된 폐 균질액 혈장
SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
t1/2 [h] 8.19 6.24 8.95 9.20 5.06 5.24
Tmax [h] 2.00 1.00 1.00 1.00 2.00 1.00
Cmax [ng/mL] 9740.12 7294.63 1261.08 1465.53 1859.23 616.3
Tlast [h] 48.00 48.00 48.00 48.00 48.00 48.00
Clast [ng/mL] 76.45 31.54 18.36 25.05 3.78 1.21
AUClast [h*ng/mL] 59799.58 53974.34 9544.88 11012.19 16164.97 4431.52
AUCinf [h*ng/mL] 60702.38 54258.4 9782.04 11344.75 16192.56 4440.66
Vz/F [mL/kg] 19.45 16.6 132.05 117.02 45.09 170.22
CL/F [mL/h/kg] 1.64738 1.84303 10.22282 8.81465 6.17568 22.51917
실시예 3: 건강한 마우스에서 정맥내 투여된 리포칼린 뮤테인의 약동학
추가 수컷 BALB/c 마우스에게 2 mg/kg의 시험 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 3)의 정맥내 용량을 투여하였다. 5분, 1시간, 6시간, 12시간 및 24시간에 마우스를 희생시키고 혈장에서 약물 수준을 평가하였다(n=시험 분자당 시점당 동물 2마리). 예시적인 예를 위해, 시간 경과에 따른 약물 농도는 도 3에 도시된 바와 같이 플롯팅되었고 상응하는 PK 매개변수는 표 3에 요약되어 있다. 따라서, 리포칼린 뮤테인의 생체이용률은 기관내 투여 및 흡입 후 AUCinf를 정맥내 그룹에 대한 AUCinf와 비교함으로써 결정할 수 있다.
리포칼린 뮤테인 정맥내 투여 후 혈청 PK 매개변수
매개변수 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
t1/2 [h] 2.57 3.52
Tmax [h] 0.08 0.08
Tlast [h] 24.00 24.00
Cmax [ng/mL] 33903.17 10825.97
AUClast [h*ng/mL] 28078.85 6600.38
AUCinf [h*ng/mL] 28079.82 6600.95
Vz/F [mL/kg] 263.88 1538.73
Cl/F [mL/h/kg] 71.22 302.98
실시예 4. 마취된 수컷 스프라규-달리(Sprague-Dawley) 랫트의 랫트 뒷발에서 항-CGRP 리포칼린 뮤테인 SEQ ID NO: 47 감각 신경 매개 피부 혈관 확장 효과의 평가
흡입된 리포칼린 뮤테인의 생체 내 효과를 조사하기 위해, 피부 혈관 확장 모델(Zeller et al., Br J Pharmacol, 2008)을 사용하여 랫트를 단일 용량의 예시적인 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 47)으로 처리하고 복재 신경 자극 후 피부 혈관 확장을 측정하였다.
수컷 스프라규-달리(Sprague Dawley) 랫트(체중 약 300 g)를 복강내(i.p.) 우레탄 주사로 마취하였다. 마취된 랫트를 체온을 유지하기 위해 항상성 담요 시스템에 놓고 pO2, pCO2 및 동맥혈 가스 분석(50 ㎕의 혈액 샘플)을 통해 유지된 pH로 기관절개술을 통해 환기시켰다. 필요한 경우 환풍기 조정을 수행하였다. 아트로핀은 기관지 분비를 억제하기 위해 피하(s.c.) 투여되었다.
초기 준비 후, 한쪽 뒷다리의 복재 신경을 작은 절개를 통해 노출시키고 복재 신경과 함께 달리는 감각 신경 섬유의 후속 역방향 전기 자극을 위해 양극성 백금 전극을 배치하였다(신경을 절단하고 브레틸륨을 사용하여 교감신경을 차단). 측정 기간 동안 일정한 주변 온도를 유지하기 위해 노출된 뒷다리와 동물 주위에 느슨한 덮개를 배치하였다. 피부 혈류는 뒷발에 위치한 레이저 도플러 프로브를 통해 측정되었다.
신경 자극 전 정의된 시점에서, 항-CGRP 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 47)을 1 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여하고, 5 mg/kg의 용량으로 피하 투여하고, 5 mg/kg의 용량으로 미세분무기를 통해 기관내 투여하고, 또는 5 mg/kg의 용량으로 폐 침투 촉진제 푸마릴 디케토피페라진과 함께 미세분무기 장치를 통해 기관내 투여하였다. 또한, 항-CGRP 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 47)을 1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg 또는 10 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여하거나, 또는 2.5 mg/kg, 5 mg/kg 또는 10 mg/kg의 용량으로 미세분무기 장치를 통해 기관내 투여하였다. 대조군으로서, 레퍼런스 항-CGRP 항체(SEQ ID NO: 204 및 205)도 정맥내 투여를 통해 검사하였다.
피부 혈류 이외에, 평균 동맥 혈압(MAP) 및 심박수(HR)는 경동맥 카테터를 통해 측정되었다. 대측 경동맥에 천음속 초음파 혈류 변환기(1 mm id, model #1PRB)를 배치하여 경동맥 저항(MAP/carotid flow)을 측정하였으며, 이는 기준선 혈역학에 대한 약물 치료의 영향을 나타낸다(즉, 리포칼린이 뮤테인은 내인성 CGRP 톤을 제거하여 혈관수축을 유발함). 투여 후 5분, 30분, 60분, 120분에 혈액을 채취하여 약물의 약동학을 분석하였다.
마지막 관찰 시점(2시간) 후에 랫트를 과량의 마취제로 안락사시켰다.
측정된 매개변수, HR, MAP, 경동맥 저항 및 레이저 도플러 뒷발 피부 혈류는 컴퓨터에 연결된 파워랩을 통해 기록되었다(Chart version 7, AD Instruments, Sydney, Australia). 데이터 수집 시스템, 코브 혈압 변환기 및 천음속 혈류 변환기는 각 실험일에 보정되었다.
결과는 도 4 및 5에 나타내었다. 항-CGRP 리포칼린 뮤테인 처리 동물에서 항-CGRP 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 47)의 혈장 농도는 도 6에 나타내었다. 항-CGRP 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 47)-처리된 동물에서 랫트 뒷발의 등쪽 피부의 진피 혈류는 처리되지 않은 동물에서 관찰된 것보다 유의하게 감소하고, 투여 후 약 5분에서 시작하여 적어도 2시간 동안 지속되며, 이는 CGRP 차단을 통한 증가된 혈관 수축을 나타낸다. 0.4 mg/kg의 푸마릴 디케토피페라진(FDKP)과 함께 제형화될 때, SEQ ID NO: 47-유도된 혈관 저항 감소가 향상된다. 신경 자극 후 SEQ ID NO: 47에 따른 경동맥 저항의 최대 변화는 레퍼런스 항-CGRP 항체(SEQ ID NO: 204 및 205)에서 관찰된 것과 유사하다. 항-CGRP 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 47)의 혈장 수준은 피부 혈관 확장 실험에서 보여지는 PD 효과와 상당히 연관된다. 기관내 투여된 리포칼린 뮤테인은 피하 투여된 리포칼린 뮤테인보다 더 빠른 시작을 나타내고 정맥내 투여된 리포칼린 뮤테인 또는 레퍼런스 항-CGRP 항체와 비교하여 동등하거나 훨씬 더 빠른 시작을 나타낸다.
여기에 예시적으로 설명된 실시예들은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한 없이 적절하게 실시될 수 있다. 따라서 예를 들어 "포함하는, comprising", "포함하는, including", "포함하는, containing" 등의 용어는 광범위하게 그리고 제한 없이 읽혀야 한다. 또한, 여기에 사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로 사용되었으나 제한되지 않으며, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 도시되고 설명된 특징의 등가물 또는 그 일부를 배제하려는 의도는 없지만 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인정된다. 따라서, 비록 본 구체예가 바람직한 실시예 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 이의 변형 및 변이가 당업자에 의해 의존될 수 있고 이러한 변형 및 변이는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되는 것으로 이해되어야 한다. 여기에 설명된 모든 특허, 특허 출원, 교과서 및 학계 검증된 간행물은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 또한, 본원에 참조로 포함된 참고문헌에서 용어의 정의 또는 사용이 일치하지 않거나 여기에 제공된 해당 용어의 정의와 반대되는 경우, 본원에 제공된 해당 용어의 정의가 적용되며 참고문헌에 있는 해당 용어의 정의는 적용되지 않는다. 일반 개시 내용에 속하는 보다 좁은 종 및 아속 그룹 각각은 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 본원에는 절단 물질이 여기에 구체적으로 인용되었는지 여부에 관계없이 속(genus)에서 임의의 요지를 제거하는 단서 또는 부정적인 제한이 있는 본 발명의 일반적인 설명이 포함된다. 또한, 특징이 마쿠시 그룹의 관점에서 설명되는 경우, 당업자는 본 개시가 마쿠시 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위 그룹의 관점에서도 설명된다는 것을 인식할 것이다. 추가 구체예는 다음 청구범위로부터 명백해질 것이다.
등가물: 당업자는 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 구체예에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 일상적인 실험만 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음 청구범위에 포함되도록 의도된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 여기에 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Pieris Pharmaceuticals GmbH <120> INHALED ADMINISTRATION OF LIPOCALIN MUTEINS <130> PIE16640PCT <150> US 62/826,767 <151> 2019-03-29 <150> EP 19166435.8 <151> 2019-04-01 <150> EP 19175818.4 <151> 2019-05-22 <150> EP 19177568.3 <151> 2019-05-31 <150> EP 19211404.9 <151> 2019-11-26 <160> 212 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 158 <212> PRT <213> human <400> 1 His His Leu Leu Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr 1 5 10 15 Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn 20 25 30 Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn 35 40 45 Leu Glu Ala Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val 50 55 60 Lys Ala Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp 65 70 75 80 Gly Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His 85 90 95 Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg Gly 100 105 110 Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu 115 120 125 Asp Phe Glu Lys 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Ala Met Val Phe Phe Lys Arg Val Tyr Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Leu Phe Glu Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Asn Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 201 <211> 178 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Lipocalin mutein <400> 201 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Glu Ala Gly Asn Ser Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Arg Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Ser Val Arg Phe Arg Ser Lys Lys Cys His Tyr Leu Ile 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Leu 85 90 95 Ile Lys Ser Lys Pro Gly His Thr Ser Phe Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Thr Val Ala Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Tyr Phe 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115 120 125 Asn Arg Glu Leu Phe Glu Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 208 <211> 178 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Lipocalin mutein <400> 208 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Asp Val Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Glu Lys Met Glu Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Gln Val Thr Asp Val Gly Phe Val Gln Lys Arg Cys Met Tyr Val Thr 65 70 75 80 His Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Glu Ser Tyr Pro Gly Val Thr Ser Ala Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Val Lys Leu Val Lys Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Leu Phe Glu Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Asp <210> 209 <211> 178 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Lipocalin mutein <400> 209 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Lys Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Asp Val Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Glu Lys Met Glu Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Asp Val Gly Phe Val Gln Lys Arg Cys Met Tyr Val Thr 65 70 75 80 His Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Glu Ser Tyr Pro Gly Val Thr Ser Ala Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Val Lys Leu Val Lys Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Leu Phe Glu Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser 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Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 211 <211> 178 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Lipocalin mutein <400> 211 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Lys Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Asp Val Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Glu Lys Met Glu Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Gln Val Thr Asp Val Gly Phe Val Gln Lys Arg Cys Met Tyr Val Thr 65 70 75 80 His Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Glu Ser Tyr Pro Gly Val Thr Ser Ala Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Val Lys Leu Val Lys Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Leu Phe Glu Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Asp <210> 212 <211> 178 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Lipocalin mutein <400> 212 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile His Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Asp Val Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Glu Lys Met Glu Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Gln Val Thr Asp Val Gly Phe Val Gln Lys Arg Cys Met Tyr Val Thr 65 70 75 80 His Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Glu Ser Tyr Pro Gly Val Thr Ser Ala Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Val Lys Leu Val Lys Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Leu Phe Glu Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Asp

Claims (33)

  1. 흡입에 의해 리포칼린 뮤테인을 투여하는 것을 포함하되, 투여는 호흡기(respiratory tract)의 리포칼린 뮤테인에 대한 국소 노출을 제공하는 것인 대상체에게 리포칼린 뮤테인을 투여하는 방법.
  2. 흡입에 의해 리포칼린 뮤테인을 투여하는 것을 포함하되, 투여는 호흡기(respiratory tract)의 리포칼린 뮤테인에 대한 국소 노출을 제공하는 것인 대상체의 치료 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인의 전달 용량의 약 0.15% 이하가 순환계로 들어가는 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  4. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인의 전신 노출은 검출가능하지 않은 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  5. 제4항에 있어서,
    전신 노출은 혈액으로의 흡수에 의해 정의되는 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  6. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인의 전달 용량은 투여당 약 0.1 mg 내지 약 1000 mg 또는 투여당 체중 kg 당 약 0.05 ㎍ 내지 약 15 mg인 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  7. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인의 전달 용량은 투여당 약 0.1 mg 내지 약 5 mg 또는 투여당 체중 kg 당 약 0.05 ㎍ 내지 약 50 ㎍인 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  8. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    방법 또는 용도는 호흡기 질환의 치료를 위한 것인 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  9. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    호흡기 질환은 알레르기성 염증, 알레르기성 천식, 비염, 결막염, 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐포 단백증, 성인 호흡 곤란 증후군 또는 세균성 감염인 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  10. 흡입에 의해 리포칼린 뮤테인을 투여하는 것을 포함하되, 투여는 리포칼린 뮤테인의 전신 노출을 제공하는 것인 대상체에게 리포칼린 뮤테인을 투여하는 방법.
  11. 흡입에 의해 리포칼린 뮤테인을 투여하는 것을 포함하되, 투여는 리포칼린 뮤테인의 전신 노출을 제공하는 것인 대상체의 치료 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인의 전달 용량의 약 0.3% 이상, 약 0.4% 이상, 약 0.5% 이상, 약 0.6% 이상, 약 0.7% 이상, 약 0.8% 이상, 약 0.9% 이상, 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 3% 이상, 약 4% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 11% 이상, 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 14% 이상, 또는 약 15% 이상이 순환계로 들어가는 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈장 중 리포칼린 뮤테인의 최대 농도는 투여 후 약 0.5시간 내지 약 10시간, 바람직하게는 투여 후 약 0.5시간 내지 약 4시간에 달성되는 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈장 중 리포칼린 뮤테인의 최대 농도는 약 1 ng/mL 이상, 바람직하게는 약 1 ng/mL 내지 약 2,000 ng/mL인 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인은 투여당 약 0.05 mg 내지 약 1000 mg 또는 투여당 체중 kg당 약 0.1 ㎍ 내지 약 15 mg의 전달 용량으로 투여되는 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인은 투여당 약 5 mg 내지 약 1000 mg 또는 투여당 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 약 15 mg의 전달 용량으로 투여되는 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리포칼린 뮤테인의 혈중농도-시간 곡선하면적(AUCinf)은 약 10 h*ng/mL 이상, 예를 들어 약 10 h*ng/mL 내지 약 16,000 h*ng/mL인 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인은 약 2시간 내지 약 10시간의 혈청 반감기(t1/2)를 갖는 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인에 대한 전신 노출은 동일하거나 필적하는 생체이용량의 리포칼린 뮤테인을 전신 투여하는 것과 비교하여 개선된 치료 효과를 제공하는 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법 또는 용도는 호흡기 질환의 치료를 위한 것인 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  21. 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    호흡기 질환은 알레르기성 염증, 알레르기성 천식, 비염, 결막염, 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐포 단백증, 성인 호흡 곤란 증후군 또는 세균성 감염인 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  22. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법 또는 용도는 전신 질환의 치료를 위한 것인 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  23. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법 또는 용도는 호흡기 질환 이외의 기관 또는 조직에 영향을 미치는 질환의 치료를 위한 것인 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  24. 제10항 내지 제19항, 제22항 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법 또는 용도는 암, 빈혈, 통증 장애, 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경퇴행성 질환, 비염, 결막염, 피부염 또는 식품 알레르기와 같은 알레르기 질환, 또는 녹농균 감염과 같은 세균성 감염의 치료를 위한 것인 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  25. 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인의 효과의 시작은 리포칼린 뮤테인이 피하로 투여되는 경우의 시작보다 더 빠른 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  26. 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인의 효과의 시작은 리포칼린 뮤테인이 전신으로 투여되는 경우의 시작보다 대략 빠르거나 더 빠른 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  27. 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    FDKP와 조합된 리포칼린 뮤테인의 효과의 시작은 리포칼린 뮤테인이 흡입 단독으로 투여되는 경우의 시작보다 대략 빠르거나 더 빠른 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  28. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    투여는 1회, 1주 1회, 1주 2회, 1주 3회, 1주 4회, 1주 5회, 1주 6회, 1일 1회, 1일 2회인 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  29. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인은 분무된 형태로 투여되는 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  30. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인은 건조 분말로 투여되는 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  31. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인은 액체 스프레이로 투여되는 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  32. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인은 인간 대상체에게 투여되는 방법 또는 용도를 위한 리포칼린 뮤테인.
  33. 전항들 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린 뮤테인은 인간 눈물 리포칼린(hTlc) 또는 인간 호중구 젤라티나제-연관 리포칼린(hNGAL)의 뮤테인인 방법 또는 용도를 위한 조성물.
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