CN112955221A - 包含cd137/her2双特异性试剂和pd-1轴抑制剂的组合疗法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于治疗先前经治疗的特定的HER2‑阳性晚期或转移性实体瘤的组合物和方法。本发明提供用于在患有HER2‑阳性晚期或转移性实体瘤的个体中增强免疫应答的组合物和方法。所述方法包括施用PD‑1轴抑制剂和靶向CD137和HER2的双特异性试剂。

Description

包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合疗法及 其用途
I.背景技术
CD137，也称为4-1BB，为一种共刺激性免疫受体及肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。CD137在调节免疫应答中起重要作用，因此是癌症免疫疗法的靶标。CD137配体(CD137L)是CD137的唯一已知天然配体，并在一些诸如活化的B细胞、单核细胞和脾脏树突状细胞的抗原呈递细胞(APC)种类上组成型表达，也可在T淋巴细胞上诱导。
在许多临床前研究中已经证明了CD137共刺激在癌症疗法中的潜力——已表明激动剂抗-CD137抗体的施用实现肿瘤消退(Vinay和Kwon,Mol Cancer Ther,2012,Bartkowiak and Curran,Front Oncol,2015)并且所产生的CD137信号传导破坏并逆转细胞毒性T淋巴细胞的无反应性(Williams等，J Exp Med,2017；Wilcox等，Blood,2004)。正在进行两种激动剂乌瑞芦单抗(urelumab)和乌托鲁单抗(utomilumab)的临床实验，但是由于当剂量在1mg/kg以上时乌瑞芦单抗具有实质性毒性，而乌托鲁单抗的效力较弱且具有潜在功效挑战，因此二者均面临重大挑战(Tolcher等，Clin Cancer Res,2017；Segal等，ClinCancer Res,2018；Sznol等，Journal of Clinical Oncology,2008)。此外，由于CD137的表达不限于肿瘤浸润淋巴细胞，因此乌瑞芦单抗或乌托鲁单抗单一疗法可能无法将CD137激动作用限制在肿瘤微环境中，因此可能导致CD137聚集和以非局部方式活化(Makkouk等，Eur J Cancer,2016；Alizadeh等，Blood,2011)。因此，仍然需要既安全又有效的抗-CD137疗法。另外，正在评估靶向CD137与其它检查点免疫疗法或肿瘤靶向疗法的组合，但是将此类疗法组合可增加不希望的不良反应的风险，包括全身免疫活化增加。因此，仍然需要靶向CD137并且既安全又有效的组合免疫疗法。
程序性细胞死亡蛋白1，或PD-1(也称为分化簇279或CD279)是分化簇28(CD28)基因家族的成员并在活化的T、B和髓系细胞上表达(Sharpe等，Nat Immunol,2007；Greenwald等，Annu Rev Immunol,2005)。PD-1与两个配体，程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)和程序性细胞死亡1配体2(PD-L2)，相互作用。这些配体与PD-1的相互作用在通过限制局部过度活化的T细胞而下调免疫系统中起重要作用，这继而防止了自身免疫且维持了正常组织中感染或炎症期间的外周耐受(Sharpe等，Nat Immunol,2007；Greenwald等，Annu Rev Immunol,2005)。
在许多癌症中，PD-1由肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)表达并与宿主抗肿瘤免疫性相关(Galon等，Science,2006)。多种证据表明，TIL经受PD-1抑制性调节，并且观察到的抗肿瘤免疫性由PD-1/PD-L1信号传导调节。第一，在若干人和小鼠肿瘤系中证实了PD-L1的表达(Dong等，Nat Med,2002)。第二，肿瘤细胞PD-L1的表达与其对抗肿瘤T细胞体外溶解的抗性直接相关(Blank等，Cancer Res,2004；Dong等，Nat Med,2002)。第三，PD-1敲除小鼠对肿瘤攻击具有抗性(Iwai等，Int Immunol,2005)且当过继转移至荷瘤小鼠时，来自PD-1敲除小鼠的T细胞在肿瘤排异中高度有效(Blank等，Cancer Res,2004)。第四，通过PD-1单克隆抗体阻断PD-1抑制信号可以增强小鼠的宿主抗肿瘤免疫性(Hirano等，Cancer Res,2005；Iwai等，Int Immunol,2005)。第五，肿瘤中PD-L1的高度表达(通过免疫组织化学染色检测)与许多人类癌症类型的不良预后相关(Hamanishi等，Proc Natl Acad Sci U S A,2007)。因此，已经在多种癌症类型中证明了靶向PD-1和PD-L1的单克隆抗体的临床益处，其中的少数包括纳武单抗(nivolumab)、帕博丽珠单抗(pembrolizumab)和阿妥珠单抗(atezolizumab)已经获得美国食品药品监督管理局(FDA)的批准(Topalian等，CancerCell,2015)。然而，只有少数癌症患者对抗-PD-1/PD-L1疗法有应答，并且原发性和获得性抗性成为抗-PD-1/PD-L1疗法的主要障碍，从而限制了其长期疗效和广泛应用((Bu等，Trends Mol Med,2016；Bai等，Oncotarget,2017)。
为了增加对免疫疗法有应答并克服治疗耐药性的患者比例，仍然需要通过与例如其他免疫疗法或靶向疗法的组合来使免疫检查点治疗的临床益处最大化。然而，尽管进行了大量的临床前研究并证明了免疫疗法组合的潜力，但此类组合可能会导致实质性的增量毒性，例如，如在抗-PD-1/PD-L1疗法和抗-CTLA-4疗法的组合中所见，并且不一定产生足够的临床应答来克服所遭遇的毒性(Shoushtari等，JAMA Oncol,2018；Haanen等，Ann Oncol,2017)。此外，对于特定的免疫疗法组合，还需要优化药物施用的时间和顺序以达到疗效和安全性，并且鉴于患者应答的多样性，需要识别更好的生物的标志物(生物标志物)，用于预测个体对特定组合的反应如何。
HER2或HER2/neu是人表皮生长因子受体家族的成员。已经证明该致癌基因的扩增或过表达在多种肿瘤的发展和进展中起重要作用，包括某些侵袭类型的乳腺癌。与健康组织相比，已经证明HER2在某些肿瘤细胞上高度差异表达，在这些细胞上具有更高的细胞表面密度。虽然在部分早期或转移性HER2(+)乳腺癌患者中抗-HER2靶向疗法是有效的，但是在难治的或晚期癌症患者中的应答率并不理想。例如，在采用抗-HER2疗法与化学疗法的临床试验中，客观应答率仅为50％(Slamon等，N Engl J Med,2001)。因此，仍然需要针对HER2阳性癌症患者的更好的靶向疗法。
除其它之外，本发明提供了包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的新的治疗组合，和采用此类组合治疗HER2阳性晚期或转移性实体瘤的方法。
II.定义
以下所列定义了在本说明书中使用的术语、短语和缩写。本文列出和定义的所有术语旨在涵盖所有语法形式。
如本文所使用，除另有规定外，“CD137”意指人CD137(huCD137)。人CD137意指由UniProt Q07011定义的全长蛋白、其片段或其变体。CD137也称为4-1BB或肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)和淋巴细胞活化诱导的(ILA)。在一些特定的实施方案中，采用非人物种的CD137，如猕猴(cynomolgus)CD137和小鼠CD137。
如本文所使用，除非另有规定，“HER2”意指人HER2(huHER2)。人Her 2意指由UniProt P04626定义的全长蛋白、其片段或其变体。HER2也称为人表皮生长因子受体2、HER2/neu、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2、分化簇340(CD340)、原癌基因Neu、ERBB2(人)、Erbb2(啮齿动物)、c-neu或p185。人HER2由ERBB2基因编码。在一些特定的实施方案中，采用非人物种的HER2，如猕猴HER2和小鼠HER2。
如本文所使用，除另有规定外，“程序性细胞死亡蛋白1”或“PD-1”意指人PD-1(hPD-1)。人PD-1意指由UniProt Q15116定义的全长蛋白、其片段或其变体。人PD-1由PDCD1基因编码。PD-1也称为分化簇279或CD279。在一些特定的实施方案中，采用非人物种的PD-1，如猕猴PD-1和小鼠PD-1。
如本文所使用，除另有规定外，“程序性细胞死亡1配体1”或“PD-L1”意指人PD-L1(huPD-L1)。人PD-L1意指由UniProt Q9NZQ7定义的全长蛋白、其片段或其变体。人PD-L1由CD274基因编码。PD-L1也称为分化簇274(CD274)或B7同系物1(B7-H1)。在一些特定的实施方案中，采用非人物种的PD-L1，如猕猴PD-L1和小鼠PD-L1。
如本文所使用，“PD-1轴抑制剂”或“PD-1轴拮抗剂”是指这样一种分子，其降低、阻断、抑制或干扰PD-1介导的信号传导，使得减轻由PD-1轴的活化导致的T细胞功能障碍和免疫抑制并恢复或增强T细胞功能。如本文所使用，PD-1轴抑制剂包括PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和PD-L2抑制剂。
如本文所使用，“PD-1/PD-L1轴抑制剂”或“PD-1/PD-L1轴抑制剂”是指这样一种分子，其降低、阻断、抑制或干扰PD-1与PD-L1的相互作用及所产生的信号传导通路，使得减轻由PD-1轴的活化导致的T细胞功能障碍和免疫抑制并恢复或增强T细胞功能。
如本文所使用，“PD-1抑制剂”或“PD-1拮抗剂”是指这样一种分子，其降低、阻断、抑制、干扰PD-1与其结合配偶体(比如PD-L1、PD-L2)中的一种或多种的相互作用以及由此产生的信号传导通路。在一些实施方案中，PD-1抑制剂可以与一种或多种PD-1结合配偶体(优选PD-L1和/或PD-L2)的结合竞争。在一些其他实施方案中，PD-1抑制剂可以不与一种或多种PD-1结合配偶体(优选PD-L1和/或PD-L2)的结合竞争。在一些实施方案中，PD-1抑制剂可以减少由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白(比如PD-1)介导的负共刺激信号。PD-1抑制剂可包括、但不限于抗-PD-1抗体及其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和其他分子，所述其他分子降低、阻断、抑制或干扰PD-1与其结合配偶体(比如PD-L1和PD-L2)中的一种或多种的相互作用以及由此产生的信号传导通路。在一些实施方案中，PD-1抑制剂可以是或包含抗-PD-1抗体，比如帕博丽珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、pidilizumab、MK-3475、MEDI-0680、PDR001、REGN2810、BGB-108。
如本文所使用，“PD-L1抑制剂”或“PD-L1拮抗剂”是指这样一种分子，其降低、阻断、抑制、干扰PD-L1与其结合配偶体(比如PD-1和B7.1)中的一种或多种的相互作用以及由此产生的信号传导通路。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂可以与一种或多种PD-L1结合配偶体(比如PD-1和B7.1)的结合竞争。在一些其他实施方案中，PD-L1抑制剂可以不与一种或多种PD-L1结合配偶体(比如PD-1和/或B7.1)的结合竞争。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂可以减少由PD-L1与其结合配偶体中的一种或多种结合介导的抑制信号。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂可以是或包含抗-PD-L1抗体，比如阿妥珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)和BMS-936559。
如本文所使用，“PD-L2抑制剂”或“PD-L2拮抗剂”是指这样一种分子，其降低、阻断、抑制、干扰PD-L2与其结合配偶体(比如PD-1)中的一种或多种的相互作用以及由此产生的信号传导通路。在一些实施方案中，PD-L2抑制剂可以与一种或多种PD-L2结合配偶体(比如PD-1)的结合竞争。在一些其他实施方案中，PD-L2抑制剂可以不与一种或多种PD-L2结合配偶体(比如PD-1)的结合竞争。在一些实施方案中，PD-L2抑制剂可以减少由PD-L2与其结合配偶体中的一种或多种结合介导的抑制信号。在一些实施方案中，PD-L2抑制剂可以是或包含抗-PD-L2抗体。
当用于描述与目标蛋白质靶标(如CD137、PD-1、PD-L1或HER2)相关的分子时，术语“抗-”意指能够结合蛋白质靶标和/或调节蛋白质靶标的一种或多种生物功能的分子。例如，如本文所使用的“抗-CD137”分子能够结合CD137和/或调节CD137的一种或多种生物功能。蛋白质靶标的“生物功能”是指蛋白质靶标执行其生物学任务的能力，所述生物学任务如与其结合配偶体结合和介导信号传导通路。
如本文所使用，当与T细胞结合使用时“功能障碍”或“功能障碍的”是指由于活化和分化过程改变而导致的T细胞的功能障碍状态。可将包括耗尽、耐受和无反应性的术语用于描述功能障碍状态。当与免疫系统结合使用时，“功能障碍”是指免疫系统的状态，其特征在于免疫系统的组分异常和/或免疫应答过度或不足。免疫系统的功能障碍状态可以包括难治的或对抗原识别无应答，以及将抗原识别转化为下游T细胞效应功能(比如增殖、细胞因子(如IL-2)产生和靶细胞杀伤)的能力受损。
如本文所使用，“无反应性”或“无反应的”是指免疫系统不能针对抗原发起正常免疫应答的状态。通过T细胞受体(TCR)传递的不完全或不充分信号可能会诱导T细胞无反应性。当T细胞在没有共同刺激的情况下接收到TCR信号时，也可能会诱导T细胞无反应性，导致即使在共同刺激的情况下，该细胞也变得难以随后被抗原激活。在一些实施方案中，无反应的T细胞不经历克隆扩增和/或获得效应功能。在一些实施方案中，IL-2的存在可以使如本文所述的无反应状态失效。
如本文所使用，“耗尽”或“T细胞耗尽”是指产生自持续TCR信号传导的T细胞功能障碍的状态。耗尽可以由外在负调节通路(如免疫调节细胞因子)以及细胞内在负调节二者引起。其特征可以是不良的效应功能、抑制性受体的持续表达和/或与功能效应或记忆T细胞不同的转录状态。在一些实施方案中，耗尽与无反应性的不同之处在于耗尽是由连续的TCR刺激引起的，而无反应性是由于信号传导不完整或不足而引入的。在一些实施方案中，耗尽可以在许多慢性感染和癌症期间发生。
如本文所使用，“耐受”包括“中心耐受”和“外周耐受”。“中心耐受”是指消除任何正在发育的T或B淋巴细胞的过程。在一些实施方案中，这一过程可以确保免疫系统不攻击自身肽。“外周耐受”是指中心耐受后的免疫耐受的第二分支，其发生在免疫外周中。在一些实施方案中，外周耐受可以确保逃脱中心耐受的自身反应性T细胞和B细胞不会引起自身免疫。
如本文所使用，“抑制信号”是指通过共抑制分子转导至T细胞的信号，其导致T细胞因子产生和/或效应功能的抑制。“刺激信号”是指在TCR接合后通过共刺激分子转导至T细胞的信号，从而将活化的T细胞自无反应性中解救出来和/或允许发生完全活化。
如本文所使用，“恢复T细胞功能”、“增强T细胞活性”、“活化T细胞”或“刺激T细胞应答”是指诱导、导致或刺激T细胞以具有持续的或放大的生物功能，或更新或重新活化耗尽的或不活跃的T细胞。T细胞活性增强的示例性迹象可包括：相对于干预前的此类水平，从CD8+T细胞的INF-γ的分泌增加、增殖增加和/或抗原反应性(如，病毒、病原体和肿瘤清除率)增加。测量此类增强的方法是本领域技术人员已知的。
如本文所使用，“协同”或“协同的”是指两种或更多种物质、药物或其他试剂的相互作用或合作作用，以产生大于其单独作用之和的组合作用。
如本文所使用，“癌症”和“癌性的”是指哺乳动物中通常以不受控制的细胞生长为特征的生理状况。“肿瘤”可包含一种或多种癌性细胞。
术语“转移性”是指癌细胞从其最初形成的地方脱离，穿过血液或淋巴系统，和/或在身体其他部位形成新的肿瘤(转移性肿瘤)的癌症状态。“晚期”癌症是一种通过局部浸润或转移而扩散到原发部位或器官之外的癌症。
如本文所使用，“抗肿瘤试剂”可作用于肿瘤，特别是恶性肿瘤(癌性)，并且优选具有抗肿瘤效应或抗肿瘤活性。“抗肿瘤效应”或“抗肿瘤活性”是指抗肿瘤试剂对肿瘤，特别是对恶性肿瘤的作用，包括肿瘤特异性免疫应答的刺激、肿瘤尺寸的减小、肿瘤细胞生长的抑制、转移的抑制、完全缓解、部分缓解、疾病的稳定、复发前期限延长、患者生存时间延长或患者生活质量的改善。
如本文所使用，“治疗(teat/treatment)”是指设计为在生理状况或障碍或临床病理过程中改变所治疗个体或细胞的天然过程的临床干预。“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或障碍，比如过度增殖性状态(比如癌症)的生长、进展或扩散。治疗的期望效果包括但不限于降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态、减轻症状、稳定疾病状态或使疾病状态不恶化、以及可检测或不可检测的改善预后的缓解。治疗的期望效果还包括与未接受治疗的期望生存相比延长的生存。需要治疗的受试者包括已经患有该病症或障碍或易于患有该病症或障碍的受试者，或其中待预防该病症或障碍的受试者。
如本文所使用，“组合”、“与……组合”或“与……结合”涉及除另一种物质、药物或其它试剂外还施用一种物质、药物或其它试剂。这种物质、药物或其它试剂的施用可以在另一种施用之前、之中或之后进行。
“有效量”是足够产生有益或者所希望的结果的量。例如，有效量为足以将免疫应答增强或减少至所希望的治疗水平的量。通过本领域已知的合适方法可以确定治疗的结果(如抑制的或不足的免疫应答的活化、T细胞的细胞溶解活性增强、增强的T细胞效应功能或肿瘤生长减少)。可以在一次或多次单独施用或剂量中施用有效量。可以以一种试剂单独地或与一种或多种其他试剂组合施用有效量。
如本文所使用，“抗体”包括整个抗体或其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。整个抗体是指包含通过二硫键互相连接的至少两个重链(HC)和两个轻链(LC)的糖蛋白。每个重链由重链可变结构域(VH或HCVR)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变结构域(VL或LCVR)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH与VL区可进一步细分成高可变区，称作互补决定区(CDR)，其间散布更保守的区域，称作框架区(FR)。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原(例如，PD-L1)相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可任意地介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(如，效应细胞)及典型补体系统的第一组分(C1q)。
如本文所使用，抗体的“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是指抗体的保留了特异性结合抗原(如PD-1或PD-L1)的能力的一个或多个片段。已表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括(i)由VH、VL、CL及CH1结构域组成的Fab片段；(ii)包含由在铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的F(ab’)2片段；(iii)由VH、VL、CL及CH1结构域和CH1与CH2结构域之间的区域组成的Fab’片段；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VH和VL结构域组成的单链Fv片段；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，Nature,1989)；和(vii)分离的互补决定区(CDR)或两个或更多个分离的CDR的组合，其可任选地通过合成连接子连接；(viii)包含在同一多肽链中采用短连接子连接的VH和VL的“双抗体”(参见如专利文件EP404,097；WO 93/11161；和Holliger等，Proc Natl Acad Sci U S A,1993)；(ix)仅含有VH或VL的“结构域抗体片段”，其中在一些情况下，两个或更多个VH区为共价连接的。
如本文所使用，抗体的“抗原结合片段”是指抗体的保留了特异性结合抗原(如PD-L1)的能力的一个或多个片段。已表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括(i)由VH、VL、CL及CH1结构域组成的Fab片段；(ii)包含由在铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的F(ab’)2片段；(iii)由VH、VL、CL及CH1结构域和CH1与CH2结构域之间的区域组成的Fab’片段；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VH和VL结构域组成的单链Fv片段；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，Nature,1989)；和(vii)分离的互补决定区(CDR)或两个或更多个分离的CDR的组合，其可任选地通过合成连接子连接；(viii)包含在同一多肽链中采用短连接子连接的VH和VL的“双抗体”(参见如专利文件EP 404,097；WO 93/11161；和Holliger等，Proc NatlAcad Sci U S A,1993)；(ix)仅含有VH或VL的“结构域抗体片段”，其中在一些情况下，两个或更多个VH区为共价连接的。
抗体可以是多克隆的或单克隆的；异种的、同种异体的或同系的；或它们的修饰形式(如，人源化的、嵌合的或多特异性的)。抗体也可能是完全人类的。
如本文所使用，“框架”或“FR”是指可变结构域残基而非高可变区(CDR)残基。
“片段可结晶区”或“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C-末端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能改变，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230位置的氨基酸残基(根据Kabat的EU索引编号)延伸到其羧基末端(Johnson和Wu,Nucleic Acids Res,2000)。可以，例如，在抗体的生产或纯化过程中或通过重组工程化编码抗体重链的核酸，移除Fc区的C-末端赖氨酸(根据Kabat的EU索引编号，残基447)。因此，完整抗体的组合物可包含移除了所有K447残基的抗体群、无K447残基移除的抗体群及具有有和无K447残基的抗体混合物的抗体群。在本发明抗体中使用的合适的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc”受体或“FcR”是指结合抗体Fc区的受体。
如本文所使用，“分离的抗体”是指实质上脱离其自然环境的抗体。举例而言，分离的抗体实质上不含来自其所源自的细胞或组织来源的细胞材料和其它蛋白。“分离的抗体”进一步是指实质上不含其它具有不同抗原特异性的抗体的抗体。在本文中，特异性结合PD-L1的分离的抗体实质上不含特异性结合除PD-L1以外的抗原的抗体。然而，特异性结合PD-L1的分离的抗体可具有与其它抗原的交叉反应性，所述其它抗原比如来自其它物种的PD-L1分子。
如本文所使用，“单克隆抗体”是指具有单一分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物对特定表位展现出单一的结合特异性和亲和力。
如本文所使用，“人源化抗体”是指由源自除人以外的哺乳动物的抗体CDR与人抗体或源自人抗体的FR区和恒定区组成的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体包括具有可变区氨基酸序列的可变结构域，采用如Ehrenmann等，(2010)所述的ImmunogeneticsInformation System(IMGT)DomainGapAlign工具评估，从整体上分析，所述可变区氨基酸序列更接近于人而非其它物种。在一些实施方案中，由于降低的抗原性，人源化抗体可用作治疗剂中的有效组分。如本文所使用的术语“治疗剂”或“治疗活性剂”是指治疗有用的试剂。治疗剂可以是任何用于预防、改善或治疗疾病、生理状态、症状或用于疾病、生理状态、症状的评估或诊断的试剂。
如本文所使用，“人抗体”包括这样的抗体，该种抗体具有其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。此外，若抗体包含恒定区，则该恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，如本文所使用，术语“人抗体”不旨在包括这种抗体，该种抗体中源自另一哺乳动物物种种系(比如小鼠)的CDR序列被移植至人的框架序列。
本文关于抗体所用的术语“效应功能”是指由抗体的Fc区引起的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的通过抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体的下调(如B细胞受体)和B细胞活化。
如本文所使用，术语“脂质运载蛋白”是指重量为约18-20kDa的单体蛋白，其具有圆柱形β折叠片超二级结构区，所述结构区包含通过在一端的多个(优选为4个)环逐对连接的多个β-链(优选为8个β-链，标记为A至H)以由此包含配体结合口袋和限定配体结合口袋的入口。优选地，本发明中所用的包含配体结合口袋的环是连接β-链A和B、C和D、E和F、和G和H的开口端的环，并被标记为AB、CD、EF和GH环。得到公认的是，在脂质运载蛋白家族成员中，正是所述环在本应刚性的脂质运载蛋白骨架中的这种多样性产生多种不同的结合模式，每一种模式能够容纳不同大小、形状和化学特征的靶标(如Skerra,Biochim BiophysActa,2000；Flower等，Biochim Biophys Acta,2000；Flower,Biochem J,1996中的综述)。应当理解，蛋白的脂质运载蛋白家族已经天然进化为结合范围广泛的配体，具有非常低水平的整体序列保守性(通常具有小于20％的序列同一性)，但保留高度保守的整体折叠模式。不同脂质运载蛋白中位置之间的对应关系也为本领域技术人员所熟知(参见如美国专利No.7,250,297)。落入本文所使用的“脂质运载蛋白”的定义中的蛋白质包括但不限于包括泪液脂质运载蛋白(Tlc,Lcn1)、脂质运载蛋白-2(Lcn2)或中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的人脂质运载蛋白，载脂蛋白D(ApoD)，载脂蛋白M，α1-酸性糖蛋白1，α1-酸性糖蛋白2，α1-微球蛋白，补体成份8γ，视黄醇结合蛋白(RBP)，附睾视黄酸结合蛋白，glycodelin，气味结合蛋白IIa，气味结合蛋白IIb，脂质运载蛋白-15(Lcn15)和前列腺素D合酶。
如本文所使用，“脂质运载蛋白-2”或“中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白”是指人脂质运载蛋白-2(hLcn2)或人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)，并进一步是指成熟人脂质运载蛋白-2或成熟人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。当将术语“成熟”用于表征蛋白时意指蛋白基本上不含信号肽。本发明的“成熟hNGAL”是指人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的成熟形式，其不具有信号肽。将成熟hNGAL描述为具有SWISS-PROT数据库登录号P80188的序列的残基21-198，其氨基酸示于SEQ ID NO:1。
如本文所使用，“天然序列”是指具有存在于自然界中的序列或具有野生型序列的蛋白或多肽，而不考虑该种蛋白或多肽的制备方式。此类天然序列蛋白或多肽可以从自然界中分离或者可以通过诸如重组或合成方法的其它手段产生。
“天然序列脂质运载蛋白”是指与源自自然界的相应多肽具有相同氨基酸序列的脂质运载蛋白。因此，天然序列脂质运载蛋白可以具有来自任何生物体、特别是哺乳动物的相应天然存在的(野生型)脂质运载蛋白的氨基酸序列。当在脂质运载蛋白的上下文中使用时，术语“天然序列”具体涵盖脂质运载蛋白的天然存在的截短的或分泌的形式、天然存在的变体形式(例如脂质运载蛋白的可变剪接形式和天然存在的等位基因变体)。在本文中术语“天然序列脂质运载蛋白”与“野生型脂质运载蛋白”可互换使用。
如本文所使用，“突变蛋白”、“突变的”实体(蛋白质或核酸)或“突变体”是指与天然存在(野生型)的蛋白或核酸相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的交换、缺失或插入。所述术语还包括如本文所述的突变蛋白的片段。本发明明确涵盖如本文所述的这样的脂质运载蛋白突变蛋白，该种突变蛋白具有圆柱形β折叠片超二级结构区，所述结构区包含通过在一端的4个环逐对连接的8个β-链以由此包含配体结合口袋和限定配体结合口袋的入口，其中与天然序列脂质运载蛋白相比，所述4个环中的至少三个中的每一个的至少一个氨基酸已被突变。优选地，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白具有如本文所述的结合CD137的功能。
如本文所使用，与本发明的脂质运载蛋白突变蛋白有关的术语“片段”是指N-末端和/或C-末端截短的(即缺少N-末端和/或C-末端氨基酸中的至少一个)源自全长成熟hNGAL或脂质运载蛋白突变蛋白的蛋白质或多肽。这种片段可包括其所源自的成熟hNGAL或脂质运载蛋白突变蛋白一级序列的至少10个或更多，比如20或30个或者更多个连续氨基酸，并且通常在成熟hNGAL的免疫测定中可检测到。这种片段可缺少N-末端和/或C-末端氨基酸中的多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达10个、多达15个、多达20个、多达25个或多达30个(包括之间的所有数字)。应理解，所述片段优选为其所源自的成熟hNGAL或脂质运载蛋白突变蛋白的功能片段，这意味着该片段优选地保留了其所源自的成熟hNGAL或脂质运载蛋白突变蛋白的优选对CD137的结合特异性。作为示例性实例，此类功能片段可至少包含在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列的位置13-157、15-150、18-141、20-134、25-134或28-134处的氨基酸。
关于CD137、HER2、PD-1或PD-L1的“片段”是指N-末端和/或C-末端截短的CD137、HER2、PD-1或PD-L1，或者CD137、HER2、PD-1或PD-L1的蛋白结构域。本文所述的CD137、HER2、PD-1或PD-L1的片段保留了全长CD137、HER2、PD-1或PD-L1被所提供的脂质运载蛋白突变蛋白、抗体、融合蛋白和/或它们的组合识别和/或结合的能力。
如本文所使用，“双特异性”是指能够特异性地结合至至少两种不同靶标的分子。典型地，双特异性分子包含两种靶标结合位点，其中每种位点对不同靶标具有特异性。在一些实施方案中，双特异性分子能够同时结合两种靶标。
如本文可互换使用的，术语“缀合(conjugate/conjugation)”、“融合(fuse/fusion)”或“连接”是指通过包括但不限于基因融合、化学缀合、通过连接子或交联试剂偶联和非共价联合的手段，经由全部形式的共价或非共价键(linkage)将两个或更多个亚基连接在一起。
如本文所使用的“融合多肽”或“融合蛋白”是指包含两个或更多个亚基的多肽或蛋白。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含两个或更多个亚基，这些亚基中至少一个能够特异性结合CD137，和另一个亚基能够特异性结合HER2。在该融合蛋白中，这些亚基可通过共价或非共价键连接。优选地，所述融合蛋白是两个或更多个亚基之间的翻译融合物。该翻译融合物可以通过使一个亚基的编码序列在与另一个亚基的编码序列的阅读框内基因工程化产生。两个亚基可以被编码连接子的核苷酸序列散布(interspersed)。然而，本发明的融合蛋白的亚基也可通过化学缀合连接。典型地，形成融合蛋白的亚基彼此之间连接，一个亚基的C-末端与另一个亚基的N-末端，或一个亚基的C-末端与另一个亚基的C-末端，或一个亚基的N-末端与另一个亚基的N-末端，或一个亚基的N-末端与另一个亚基的C-末端连接。融合蛋白的亚基可以以任何顺序连接，并可包括任何组成亚基中的一个以上。如果一个或多个亚基是由一条以上多肽链组成的蛋白(复合物)的一部分，那么术语“融合蛋白”还可指包含融合的序列以及该蛋白(复合物)的全部其它多肽链的蛋白。作为一个示例性实例，在全长免疫球蛋白经由该免疫球蛋白的重链或轻链与脂质运载蛋白突变蛋白融合的情况下，术语“融合蛋白”可以指包含给脂质运载蛋白突变蛋白和该免疫球蛋白的重链或轻链的单一多肽链。术语“融合蛋白”也可以指完整的免疫球蛋白(轻链和重链二者)和融合至其重链和/或轻链中的一个或两个的脂质运载蛋白突变蛋白。
如本文所使用，术语本文公开的融合蛋白的“亚基”是指单一蛋白或独立的多肽链，其自身可形成稳定的折叠结构并定义一种向靶标提供结合基序的独特功能。在一些实施方案中，本发明优选的亚基是脂质运载蛋白突变蛋白。在一些其它实施方案中，本发明优选的亚基是全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域。
可由本发明的融合蛋白包含的“连接子”连接两个或更多个如本文所述融合蛋白的亚基。所述键(linkage)可以是共价或非共价的。一种优选的共价键(linkage)是通过肽键，比如氨基酸之间的肽键。一种优选的连接子是肽连接子。因此，在优选的实施方案中，所述连接子包含一个或多个氨基酸，比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸。本文描述了优选的肽连接子，包括甘氨酸-丝氨酸(GS)连接子、糖基化的GS连接子和脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)连接子。其它优选的连接子包括化学连接子。
将“样品”定义为从任何受试者采集的生物样品。生物样品包括但不限于血液、血清、尿液、粪便、精液或组织，包括肿瘤组织。
“受试者”是脊椎动物，优选是哺乳动物，更优选是人。如本文所使用的术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括但不限于人、家畜和农用动物以及动物园、运动或宠物动物，比如绵羊、狗、马、猫、牛、大鼠、猪、如猕猴(cynomolgous monkey)的猿，仅举几个示例性实例。优选地，本文所使用的“哺乳动物”是人。
如本文所使用，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的20％，优选地15％，优选地10％和更优选地5％内。其还包括具体的数字，即“约20”包括数字20。
III.附图说明
图1：示出了与SEQ ID NOs:72和73所示的PD-1抗体组合的SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性试剂共刺激T细胞活化的能力。在该实验中，将肿瘤细胞系NCI-N87在板上培养过夜。第二天，将人外周血单核细胞(PBMC)添加至板中并在0.05ng/mL葡萄球菌肠毒素B(SEB)存在下用单独的CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)、单独的PD-1抗体(SEQ ID NOs:72和73)或二者的组合(以1:10的摩尔比)温育。如实施例1中所述，通过基于电化学发光的分析测定分泌的白细胞介素2(IL-2)(作为T细胞活化的标志物)的水平，并将其对于相应IgG4同种型对照抗体(SEQ ID NOs:15和16)的水平标准化。将来自两个测试供体的结果分别描绘在图1A和1B。与单独的CD137/HER2双特异性试剂或PD-1抗体相比，CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)和PD-1抗体(SEQ ID NOs:72和73)的组合能够诱导剂量依赖性IL-2分泌，具有改善的(更低的)EC50。
图2：示出了SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性试剂与SEQ ID NOs:72和73(图2A)或SEQ ID NOs:74和75(图2B)所示的PD-1抗体的组合共刺激T细胞活化的能力。在该实验中，将肿瘤细胞系NCI-N87在板上培养过夜。第二天，将人PBMC添加至板中并在1ng/mL SEB存在下用不同浓度的CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)与10nM或100nM固定浓度的SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体组合温育。还单独测试了CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)和PD-1抗体(SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75)以用于比较。如实施例2中所述，将通过基于电化学发光的分析测定的分泌的IL-2的水平作为T细胞活化的读数，并将其对于相应IgG4同种型对照抗体(SEQID NOs:15和16)的水平标准化。描绘了在10nM和3.33nM下测定的CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)的代表性结果。CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)与SEQ ID NOs:72和73所示的PD-1抗体的组合和CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)与SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体的组合均诱导了更高的IL-2分泌并协同地或累加地作用。当与SEQ ID NOs:72和73组合时，相比于采用10nM抗体，采用100nM抗体时，诱导的IL-2分泌水平更高。另一方面，当与CD137/HER2双特异性试剂组合使用时，SEQ ID NOs:74和75的浓度(100nM或10nM)不影响IL-2分泌。
图3：示出了代表性实验的结果，在该实验中研究了SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性试剂与PD-1抗体(SEQ ID NOs:76和77)的组合诱导T细胞活化的能力。在该实验中，将肿瘤细胞系NCI-N87(HER2高，PD-L1低)、JIMT-1(HER2中，PD-L1中)或MDA-MB-231(HER2低，PD-L1中)在板上培养过夜。第二天，将人PBMC添加至板中并在0.05ng/mLSEB存在下用不同浓度的CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)单独地或与100nMPD-1抗体(SEQ ID NOs:76和77)或IgG4同种型对照抗体(SEQ ID NOs:15和16)组合温育。如实施例3中所述测定分泌的IL-2的水平。图3中示出了2.5nM和0.16nM的浓度下测定的CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)的示例性数据。在表达高或中水平的HER2(NCI-N87和JIMT-1)的肿瘤细胞存在下，与PD-L1抗体组合的CD137/HER2双特异性试剂的功能活性(通过活化T细胞或增加IL-2分泌的能力度量)是协同的或累加的。
图4：描述了1b期研究的整体研究设计以确定最大耐受剂量(MTD)和推荐的2期剂量(RP2D)，并评估与SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体组合的SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性试剂在具体的晚期或转移性HER-2阳性实体肿瘤(如膀胱、乳腺和胃肠)中的安全性、有效性和PK。该研究包括一个剂量递增期，随后是一个扩展期。
图5：提供了如本文所述的代表性CD137/HER2双特异性融合蛋白的设计概述。代表性CD137/HER2双特异性融合蛋白是基于对HER2特异性的抗体(如SEQ ID NOs:79和80所示的抗体)和一种或多种对CD137特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(如SEQ ID NOs:21-39中任一序列所示的脂质运载蛋白)而制备的。如图1A-1D所描绘的，使一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白遗传地融合至HER2特异性抗体的重链或轻链的C-和/或N-末端，得到融合蛋白，如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:83和80和SEQ ID NOs:79和84。将具有突变S228P、F234A和L235A的工程化IgG4骨架用于包含在融合蛋白中的HER2特异性抗体。
IV.发明详述
CD137是一种共刺激免疫检查点和肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的成员。CD137主要在活化的CD4+和CD8+T细胞、活化的B细胞和天然杀伤(NK)细胞上表达，并在免疫应答的调节中起重要作用。CD137的聚集导致了受体和下游信号传导的活化(Yao等，Nat Rev DrugDiscov,2013；Snell等，Immunol Rev,2011)。在由与同源主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex,MHC)靶标结合的T细胞受体(TCR)预刺激的T细胞中，经由CD137的共刺激导致增强的活化、存活和增殖、以及促炎细胞因子的产生和改善的杀伤能力。
根据CD137活化的模式，即需要受体聚集，单特异性CD137靶向试剂(比如抗-CD137抗体)自身可能不能有效地使CD137聚集并导致有效的活化。此外，围绕TNFR家族成员的最新研究证明抗-TNFR抗体的机制，其中抗体经由其Fc区与Fc-γ受体相互作用以接合表达活化的Fc-γ受体的免疫细胞并促进随后的抗肿瘤活性(Bulliard等，Immunol Cell Biol,2014；Bulliard等，J Exp Med,2013)。因此表明抗-CD137抗体可触发依赖于并非择性地局限于肿瘤而是分布在全身的Fc-γ受体阳性细胞的丰度的CD137聚集。因此，抗-CD137单一疗法的疗效和靶标特异性可能是令人担忧的。事实上，在临床研究中的一些抗-CD137治疗剂(比如乌瑞芦单抗和乌托鲁单抗)在低剂量下显示出令人失望的疗效结果和/或在高剂量或有效剂量下显露毒性(Bulliard等，Immunol Cell Biol,2014；Bulliard等，J Exp Med,2013)。
因此，对于既有效又安全的CD137靶向治疗剂的需求还未满足。理想的CD137靶向试剂应导致CD137聚集并在肿瘤浸润淋巴细胞上以肿瘤局部的方式进行实现。如本文所述，为了获得此类CD137靶向试剂，可以将双特异性试剂设计为一端靶向CD137和另一端靶向差异化表达的肿瘤靶标。
对此，HER2是临床验证的广泛肿瘤类型的靶点。已经表明HER2基因的扩增和其产物的过表达在多种类型癌症的发展和进展中起重要作用，所述多种类型癌症包括乳腺、膀胱、胃、胃食管、结直肠和胆道癌症。因此设想本文提供的CD137/HER2双特异性试剂通过用HER2阳性肿瘤细胞桥接T细胞来促进CD137聚集，并向肿瘤抗原特异性T细胞递送共刺激信号，从而提供局部的免疫活化并导致肿瘤破坏。
此外，已经证明了检查点免疫疗法和免疫疗法及肿瘤靶向疗法的组合在某些情况下比单一疗法更显优势((Karachaliou等，Ann Transl Med,2017；Ott等，J ImmunotherCancer,2017)。正在探索与其它疗法组合的CD137靶向试剂。尽管对小鼠异种移植模型的临床前研究表明，抗-CD137疗法可能会从与检查点抑制剂(比如抗-PD-1/PD-L1抗体)的组合中受益(Dai等，Clin Cancer Res,2015；Wei等，Oncoimmunology,2014；Chen等，CancerImmunol Res,2015；Kohrt等，J Clin Invest,2014；Kohrt等，J Clin Invest,2012；Morales-Kastresana等，J Immunother Cancer,2013)，但是仍然需要在疗效改善与相关风险之间平衡，所述相关风险包括CD137靶向组合疗法的实际应用中的非靶向免疫活化和毒性。临床上，已经研究了与纳武单抗(抗-PD-1mAb)组合的激动剂抗-CD137抗体乌瑞芦单抗，其表现出令人沮丧的疗效结果和有限的临床活性(Massarelli,31st Annual Meeting andAssociated Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer,2016)。还在西妥昔单抗(抗-EGFR mAb)的新辅助试验中检验了乌瑞芦单抗，并揭示了其增强抗肿瘤免疫的潜力，尽管仅在已经被西妥昔单抗活化的NK细胞存在的情况下(Srivastava等，ClinCancer Res,2017)。正在研究另一抗-CD137抗体乌托鲁单抗与另一PD-1抑制剂帕博丽珠单抗。虽然Ib期数据表明了临床益处并揭示了生物标志物的一些趋势，但这种组合不足以将乌托鲁单抗的益处与帕博丽珠单抗单一疗法的效果加以区分(Tolcher等，Clin CancerRes,2017)。
尽管正在进行研究，但仍需要识别与CD137靶向治疗剂的临床益处相关的生物标志物，以及具有合适作用模式的最佳组合疗法。
因此，在一些实施方案中，本发明提供包含CD137靶向试剂和PD-1轴抑制剂的组合。优选地，所提供的CD137靶向试剂为CD137/HER2双特异性试剂并因此所提供的组合将包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂。
本发明还提供制备一种或多种包含CD137/HER2双特异性试剂与PD-1轴抑制剂的组合的方法以及包含此类组合的组合物。在一些实施方案中，本发明包括药物组合物以及药物试剂盒，其包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂。所提供的药物组合物可以为固体、液体、诸如透皮地、经鼻地或储存剂量单位(depot dosage unit)的缓释，并可进一步包括合适的药学载体。在一些实施方案中，本发明提供采用包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合治疗具体的HER2-阳性晚期或转移性实体瘤的方法。本发明还提供采用包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合增强患有HER2-阳性晚期或转移性实体瘤的个体中免疫应答的方法。
A.本发明的示例性组合及其用途和应用
在一些实施方案中，提供的组合至少包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂。在一些实施方案中，提供的组合至少包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-L1抑制剂。在一些实施方案中，提供的组合至少包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-L1抑制剂，所述CD137/HER2双特异性试剂为SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性融合蛋白，所述PD-L1抑制剂为SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体。在一些实施方案中，提供的组合至少包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1抑制剂，所述CD137/HER2双特异性试剂为SEQ IDNOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性融合蛋白，所述PD-1抑制剂为SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体。
在一些实施方案中，提供的组合为CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合。在一些实施方案中，提供的组合为CD137/HER2双特异性试剂和PD-L1抑制剂的组合。在一些实施方案中，提供的组合为CD137/HER2双特异性试剂和PD-1抑制剂的组合。在一些实施方案中，提供的组合为SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性融合蛋白和SEQID NOs:76和77所示的PD-L1抗体的组合。在一些实施方案中，提供的组合为SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性融合蛋白和SEQ ID NOs:72和73所示的PD-1抗体的组合。在一些实施方案中，提供的组合为SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性融合蛋白和SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体的组合。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够活化T细胞或刺激T-细胞应答。在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够协同地或累加地活化T细胞或刺激T-细胞应答。在一些实施方案中，与包含在特定组合中的CD137/HER2双特异性试剂(如，SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ IDNOs:82和80、和SEQ ID NOs:79和84)和/或PD-1轴抑制剂(如SEQ ID NOs:72和73、SEQ IDNOs:74和75、和SEQ ID NOs:76和77)相比，提供的组合以相当的或更好的效力和/或功效导致T细胞活化。可以在例如基本上如实施例1-3中所述的功能T-细胞活化分析中测量刺激的T-细胞应答或T-细胞活化。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，相对于单独的双特异性试剂或抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够诱导IL-2分泌增加。在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够协同地或累加地诱导IL-2分泌增加。在一些实施方案中，提供的组合物可能够诱导浓度依赖性IL-2分泌。在一些实施方案中，与单独的CD137/HER2双特异性试剂(如，SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80、和SEQ ID NOs:79和84)和/或PD-1轴抑制剂(如SEQ ID NOs:72和73、SEQ ID NOs:74和75、和SEQ ID NOs:76和77)相比，提供的组合可以相当的或更好的功效导致IL-2分泌增加。可以在例如基本上如实施例1-3中所述的功能T-细胞活化分析中测量IL-2分泌。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够在肿瘤细胞存在下和/或在肿瘤微环境中刺激T-细胞应答。在一些特定的实施方案中，提供的融合蛋白可能够在HER2-阳性肿瘤细胞存在下刺激T-细胞应答。可以在例如基本上如实施例1-3中所述的功能T-细胞活化分析中评估在肿瘤细胞存在下和/或在肿瘤微环境中提供的组合的T-细胞活化。
在一些实施方案中，提供的组合可能够以HER2依赖性方式活化T细胞或刺激T-细胞应答。在一些实施方案中，提供的组合物可导致HER2-阳性癌症的微环境中的T细胞局部诱导IL-2产生。可以在例如基本上如实施例3中所述的功能T-细胞活化分析中确定提供的组合的T-细胞的HER2依赖性活化，其中，在表达不同水平的HER2的肿瘤细胞存在下测试了CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合并证明了活化T细胞的能力因HER2表达水平而不同。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量发挥累加的抗肿瘤作用。在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量施加协同的抗肿瘤作用。在一些实施方案中，当施用时，与单独的CD137/HER2双特异性试剂(如，SEQ IDNOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80、SEQ ID NOs:79和84)和/或单独的PD-1轴抑制剂(如SEQ ID NOs:72和73、SEQ ID NOs:74和75、SEQ ID NOs:76和77)相比，提供的组合允许具有改善功效的更低剂量和更宽的安全窗。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够诱导IL-2分泌增加。在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够诱导IFN-γ分泌增加。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够优选地在肿瘤微环境中刺激CD4+T细胞增殖和/或活化。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够优选地在肿瘤微环境中刺激CD8+T细胞增殖和/或活化。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够诱导肿瘤浸润淋巴细胞的扩增。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够优选地在肿瘤微环境中活化NK细胞并增加ADCC。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够诱导受试者中生物标志物的改变。在一些实施方案中，提供的组合物可降低受试者中生物标志物的水平。在一些实施方案中，提供的组合物可增加受试者中生物标志物的水平。生物标志物可以是，例如CD4、CD8、PD-L1、Ki67、CD137、HER2、IL-8和FoxP3。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够减小受试者中的肿瘤尺寸。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够抑制受试者中的肿瘤生长。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够抑制受试者中的肿瘤转移。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够延迟受试者中的肿瘤复发。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量可能够改善受试者的总生存期。
在一些实施方案中，可以将提供的组合施用于受试者，如诸如人的哺乳动物。在一些实施方案中，施用提供的组合的受试者可被确诊为先前经治疗的晚期和/或转移性HER2-阳性肿瘤。
在一些实施方案中，可以关于提供的组合中的任何其它组分，同时或顺序地施用所述组合中的组分。例如，CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂可以彼此同时或关于彼此顺序地施用。
在一些实施方案中，提供的组合的组分可以作为组合的任何其他组分的佐剂施用，即，可以在受试者接受一种组分的治疗后施用提供的组合的另一种组分。例如，可以在受试者接受PD-1轴抑制剂的治疗之后施用CD137/HER2双特异性试剂，或者可以在受试者接受CD137/HER2双特异性试剂的治疗之后施用PD-1轴抑制剂。
在一些实施方案中，当同时施用提供的组合的组分时，这些组分可以以单一制剂或不同制剂施用。在一些实施方案中，当将提供的组合的组分作为不同制剂施用时，无论同时还是顺序地，所述组分可以在单一部位或不同的部位并采用相同途径或不同途径施用。在一些实施方案中，当顺序地施用提供的组合的组分时，可以使用某些因素来确定各组分施用之间的时间，所述因素比如特定组分在全身或在施用部位处持续存在的时间长度；或组分的细胞效应在全身或给药部位处持续存在的时间长度。
在一些实施方案中，设想将本发明的组合，或包含提供的组合的组合物用作抗肿瘤试剂、抗感染剂和/或免疫调节剂。例如，在一些实施方案中，可以将提供的组合用于使IL-2分泌增加。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于使IFN-γ分泌增加。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于使肿瘤浸润淋巴细胞增加。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于使NK细胞活化和使ADCC增加。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于诱导淋巴细胞活化和/或增殖。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于使免疫功能增强。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于诱导T细胞上CD137聚集和活化并使此类T细胞靶向肿瘤细胞，优选地HER2-阳性肿瘤细胞。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于诱导肿瘤微环境中的淋巴细胞应答。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于提供抗肿瘤效应。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于诱导生物标志物(比如CD4、CD8、PD-L1、Ki67、CD137、HER2、IL-8和FoxP3)的水平的改变。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于治疗和/或延缓癌症进展。
在一些实施方案中，可以将提供的组合用于治疗表达HER2的肿瘤。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于治疗HER2阳性肿瘤。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于治疗HER2-疑似(equivocal)肿瘤。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于治疗HER2-阴性肿瘤。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于治疗表达HER2的肿瘤。肿瘤的HER2表达状态可以例如通过免疫组织化学(IHC)或本领域已知的其他方法在蛋白质水平上进行分析。在一些实施方案中，可以将提供的组合用于治疗HER2阳性晚期或转移性实体瘤。
在一些实施方案中，可以将提供的组合用于治疗PD-L1-阳性肿瘤。
在一些实施方案中，提供的组合的每一组分其本身可具有抗肿瘤、抗感染和/或免疫刺激活性。在一些实施方案中，组分的组合，比如CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合可以提供比任一单一的组分可以提供的更高的抗肿瘤、抗感染和/或免疫刺激活性。在一些实施方案中，组分的组合可提供累加的或协同的抗肿瘤、抗感染和/或免疫刺激活性。
在一些实施方案中，提供的组合可具有有利的药代动力学性质以允许约每周两次、约每周一次、约每十天一次、约每两周一次、约每三周一次、约每四周一次、约每五周一次、约每月一次、约每六周一次、约每七周一次、约每八周一次或约每两个月一次的给药方案。在一些实施方案中，提供的组合的一种组分本身可具有有利的药代动力学性质。
在一些实施方案中，以约每周两次、约每周一次、约每十天一次、约每两周一次、约每三周一次、约每四周一次、约每五周一次、约每月一次、约每六周一次、约每七周一次、约每八周一次或约每两个月一次的频率施用提供的组合的一种或多种组分。
在一些实施方案中，以成套试剂盒的形式提供组合。在一些实施方案中，成套试剂盒包含一种包含CD137/HER2双特异性试剂的药物组合物和一种包含PD-1轴抑制剂的药物组合物。在一些实施方案中，以至少两个独立的单位剂量形式提供包含CD137/HER2双特异性试剂的药物组合物和包含PD-1轴抑制剂的药物组合物。在一些实施方案中，以单位剂量提供包含在成套试剂盒中的药物组合物，所述单位剂量对应于每次单次施用于受试者的剂量。作为示例性的实例，以约0.05mg/kg、0.15mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg或8.0mg/kg的单位剂量施用CD137/HER2双特异性试剂，和以约1200mg的单位剂量施用PD-L1轴抑制剂。
B.示例性CD137/HER2双特异性试剂。
在一些实施方案中，提供的组合包含CD137/HER2双特异性试剂。在一些实施方案中，本发明的CD137/HER2双特异性试剂可以是含有至少两个任何顺序的亚基的CD137/HER2双特异性融合蛋白：(1)包含对HER2特异性的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域的第一亚基，和(2)包含对CD137特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(图5)的第二亚基。在一些实施方案中，提供的CD137/HER2双特异性试剂可以用在本文提供的方法中。
在一些实施方案中，提供的CD137/HER2双特异性融合蛋白还包含至少一个另外的亚基，例如，第三亚基。例如，融合蛋白可含有对CD137特异性的第三亚基。在一些实施方案中，提供的CD137/HER2双特异性融合蛋白可包含一种或多种另外的亚基(如第四、第五或第六亚基)。
在一些实施方案中，至少一个亚基可在其N-末端和/或C-末端融合至另一个亚基。
在一些实施方案中，至少一个亚基可以经由连接子与另一个亚基融合。在一些另外的实施方案中，连接子为肽连接子，例如，非结构性的甘氨酸-丝氨酸(GS)连接子，糖基化的GS连接子或脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)连接子。在一些实施方案中，GS连接子为如SEQ ID NO:4所示的(Gly4Ser)3连接子((G4S)3)。其它示例性连接子示于SEQ ID NOs:5-14。在一些实施方案中，肽连接子可具有1至50个氨基酸，比如1、2、3、4、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。例如，在一些实施方案中，当第一亚基包含全长免疫球蛋白时，第二亚基可经由所述第二亚基的N-末端与所述免疫球蛋白的重链恒定区(CH)的C-末端之间的肽连接子连接。在一些另外的实施方案中，第三亚基可经由第三亚基的N-末端与所述免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)的C-末端之间的肽连接子连接。
在一些实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白亚基可以融合至提供的CD137/HER2双特异性融合蛋白的免疫球蛋白亚基。在一些实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白亚基可以在其N-末端和/或其C-末端在免疫球蛋白重链结构域(HC)的C-末端、HC的N-末端、免疫球蛋白轻链(LC)的C-末端和/或LC的N-末端融合至免疫球蛋白亚基(图5)。例如，在一些实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白可以在其N-末端经由肽连接子连接至免疫球蛋白的每个HC(图5D)。
在一些实施方案中，关于本发明的CD137/HER2双特异性融合蛋白，其中至少一个亚基可为或包含全长免疫球蛋白，当融合蛋白同时接合CD137和HER2时，可同时保留全长免疫球蛋白Fc区对Fc受体阳性细胞的Fc功能。
在一些实施方案中，其中所提供的CD137/HER2双特异性融合蛋白的至少一个亚基可为或包含全长免疫球蛋白，可通过蛋白工程化降低或完全抑制全长免疫球蛋白Fc区对Fc受体阳性细胞的Fc功能，而融合蛋白同时接合CD137和PD-L1。在一些实施方案中，可以通过例如将IgG1骨架转换为IgG4而实现上述情况，因为已知相比于IgG1，IgG4显示降低的Fc-γ受体相互作用。在一些实施方案中，为了进一步降低与Fc-γ受体的残留结合，可向IgG4骨架中引入诸如F234A和L235A的突变。在一些实施方案中，还可将S228P突变引入IgG4骨架，以使IgG4半抗体的交换最小化(Silva等，J Biol Chem,2015)。在一些实施方案中，可引入F234A和L235A突变以降低ADCC和ADCP(Glaesner等，Diabetes Metab Res Rev,2010)和/或引入M428L和N434S突变或M252Y、S254T和T256E突变以延长血清半衰期(Dall'Acqua等，JBiol Chem,2006；Zalevsky等，Nat Biotechnol,2010)。在一些实施方案中，所提供的CD137/HER2双特异性融合蛋白的免疫球蛋白重链中可存在另外的N297A突变以便移除天然糖基化基序。
在一些实施方案中，本发明的CD137/HER2双特异性融合蛋白中包括的免疫球蛋白的Fc部分可有助于维持该融合蛋白的血清水平。例如，当Fc部分结合至内皮细胞和吞噬细胞上的Fc受体时，该融合蛋白可变得内化并循环回到血流中，从而提高其在体内的半衰期。
在一些实施方案中，关于所提供的CD137/HER2双特异性融合蛋白，第一亚基可以为或包含对HER2特异性的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白是针对HER2的单克隆抗体。
在一些实施方案中，提供的HER2抗体或其抗原结合结构域可包含SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42三个重链CDR和/或SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45三个轻链CDR。
在一些实施方案中，提供的HER2抗体或其抗原结合结构域可包含SEQ ID NO:64所示的重链可变区(HCVR)和/或SEQ ID NO:65所示的轻链可变区(LCVR)。
在一些实施方案中，提供的HER2抗体或其抗原结合结构域可具有为SEQ ID NO:78或79中任一个的重链，和/或SEQ ID NO:80所示的轻链。
在一些实施方案中，提供的HER2抗体或其抗原结合结构域可具有与SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高的序列同一性的HCVR，和/或与SEQ IDNO:65所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高的序列同一性的LCVR。在其它实施方案中，提供的HER2抗体或其抗原结合结构域可具有与选自SEQ ID NOs:78-79的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高的序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高的序列同一性的轻链。
在一些实施方案中，提供的HER2抗体为曲妥珠单抗(trastuzumab)。在一些实施方案中，提供的HER2抗体为具有IgG4骨架的曲妥珠单抗。
在一些实施方案中，关于所提供的CD137/HER2双特异性融合蛋白，第二亚基可以为或包含CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，提供的脂质运载蛋白突变蛋白可以为或包含成熟人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)的突变蛋白。在本文中可以将成熟hNGAL的突变蛋白称为“hNGAL突变蛋白”。
在一些实施方案中，提供的CD137-结合hNGAL突变蛋白可以高亲和力结合人CD137并当与抗-CD3抗体一起固定在塑料皿上时能够共刺激人T细胞。在一些实施方案中，提供的CD137-结合hNGAL突变蛋白可包含选自SEQ ID NOs:21-39的氨基酸序列或其片段或变体。在一些实施方案中，提供的CD137-结合hNGAL突变蛋白可包含SEQ ID NOs:22的氨基酸序列或其片段或变体。在一些实施方案中，提供的CD137-结合hNGAL突变蛋白的氨基酸序列可与选自SEQ ID NOs:21-39的序列具有高序列同一性，比如至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高的同一性。在一些实施方案中，提供的CD137-结合hNGAL突变蛋白的氨基酸序列可与SEQ ID NOs:22的序列具有高序列同一性，比如至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高的同一性。
在一些实施方案中，通过CD137特异性hNGAL突变蛋白与曲妥珠单抗IgG4变体的遗传融合产生提供的CD137/HER2双特异性融合蛋白，二者通过柔性的非免疫原性连接子连接。
在一些实施方案中，提供的CD137/HER2双特异性融合蛋白能够同时接合HER2和CD137。在一些实施方案中，提供的融合蛋白可能够以HER2-依赖性方式活化CD137信号传导。在一些实施方案中，提供的融合蛋白可能够在HER-阳性肿瘤微环境中活化CD137信号传导。在一些实施方案中，提供的融合蛋白可能够在HER-阳性肿瘤微环境中活化共刺激T细胞应答和/或增强T细胞功能。
在一些实施方案中，提供的CD137/HER2双特异性融合蛋白可包含选自SEQ IDNOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:83和80、SEQ ID NOs:79和84的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供的CD137/HER2双特异性融合蛋白可包含与SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:83和80、SEQ ID NOs:79和84所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，当双特异性融合蛋白包含大于一条氨基酸链时，给定值的序列同一性涉及通过两条氨基酸链中的氨基酸残基数目归一化的平均序列同一性。例如，如果双特异性融合蛋白由具有100个氨基酸的氨基酸链A以及具有50个氨基酸的氨基酸链B组成，和另一双特异性融合蛋白由具有100个氨基酸和与氨基酸链A 80％序列同一性的氨基酸链A’以及具有50个氨基酸和与氨基酸链B’95％序列同一性的氨基酸链B’组成，则两种融合蛋白之间的平均序列同一性将为(100/(100+50))x 80％+(50/(100+50))x 95％＝85％序列同一性。在一些优选的实施方案中，如果所述双特异性融合蛋白包含大于一条氨基酸链，给定值的序列同一性意指目标蛋白包含与双特异性融合蛋白的一条链具有至少给定值的序列同一性的氨基酸序列并包含与双特异性融合蛋白的另一条链具有至少给定值的序列同一性的氨基酸序列。
C.示例性PD-1轴抑制剂。
在一些实施方案中，提供的组合包含PD-1轴抑制剂组分。在一些实施方案中，本发明的PD-1轴抑制剂可以是PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂或PD-L2拮抗剂。在一些实施方案中，提供的PD-1轴抑制剂是抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体或抗-PD-L2抗体。在一些实施方案中，提供的PD-1轴抑制剂可用于本文提供的方法中。
本领域已知各种PD-1轴抑制剂。帕博丽珠单抗，也称为MK-3475、Merck3475、派姆单抗(lambrolizumab)、SCH-900475和
Figure BDA0003039058420000281
是一种结合并阻断PD-1的人源化IgG4单克隆抗体。通过静脉输注将其用于治疗无法手术或转移性黑色素瘤、在某些情况下的转移性非小细胞肺癌(NSCLC)、作为基于铂类的化学疗法后的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的二线治疗以及用于治疗难治性经典霍奇金淋巴瘤(cHL)的成人和儿童患者。纳武单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0003039058420000291
为阻断PD-L1与PD-1结合的人源化IgG4抗PD-1单克隆抗体。如果癌症在BRAF中不具有突变，则将其与伊匹单抗联合用作无法手术或转移性黑色素瘤的一线治疗；作为在使用伊匹单抗治疗后的二线治疗，和如果癌症在BRAF中具有突变，则与BRAF抑制剂一起作为鳞状非小细胞肺癌的二线治疗以及作为肾细胞癌的二线治疗。阿妥珠单抗，也称为MPDL3280A或
Figure BDA0003039058420000292
为被工程化为消除Fc-效应功能的人IgG1单克隆抗体。其靶向人PD-L1，并抑制其与PD-1的相互作用。将阿妥珠单抗指定用于治疗尿路上皮癌(一种膀胱癌的常见类型)，并且正在其他肿瘤类型中进行阿妥珠单抗的研究。
C-1.作为PD-1轴抑制剂的示例性抗-PD-L1抗体
在一些实施方案中，提供的PD-1轴抑制剂为抗-PD-L1抗体或其抗原结合结构域。在一些实施方案中，提供的组合包含抗-PD-L1抗体或其抗原结合结构域。
本发明的抗-PD-L1抗体的示例性实例可包含抗原结合区，其交叉阻断或结合与抗-PD-L1抗体相同的表位，所述抗-PD-L1抗体包含先前已知抗体的VH和VL区，所述先前已知抗体比如阿妥珠单抗(atezolizumab)(也称为MPDL3280A或RG7446，商品名
Figure BDA0003039058420000293
)、阿维单抗(avelumab)(也称为MSB0010718C，商品名
Figure BDA0003039058420000294
)、度伐利尤单抗(durvalumab)(先前称为MEDI4736，商品名
Figure BDA0003039058420000295
)、BMS-936559(也称为MDX-1105)，以及PCT国际申请公开文本Nos.WO 2010/077634、WO 2007/005874、WO 2010/089411、WO2011/066389、WO 2013/079174、WO 2015/048520、WO 2016/061142、WO 2016/111645、WO2015/061668、WO 2016/007235和WO 2017/148424中公开的抗-PD-L1抗体。提供的抗-PD-L1抗体还可以为或包含上述抗-PD-L1抗体的抗原结合区或VH和VL区或任意之一。
在一些实施方案中，提供的抗-PD-L1抗体或其抗原结合结构域可包含来自选自阿妥珠单抗、阿维单抗、度伐利尤单抗和WO2017148424中公开的抗-PD-L1抗体的抗体的抗原结合区，比如三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)中的任一个。
在一些实施方案中，提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域可包含SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60三个重链CDR，和/或SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63三个轻链CDR。
在一些实施方案中，提供的抗-PD-L1抗体或其抗原结合结构域可具有SEQ ID NO:70所示的重链可变区(HCVR)和/或SEQ ID NO:71所示的轻链可变区(LCVR)。
在一些实施方案中，提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域可具有SEQ ID NO:76所示的重链和/或SEQ ID NO:77所示的轻链。
在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域可具有与SEQ IDNO:70所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高的序列同一性的HCVR，和/或与SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高的序列同一性的LCVR。在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域可具有与SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高的序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高的序列同一性的轻链。
在一些实施方案中，本发明的抗-PD-L1抗体为阿妥珠单抗。在一些实施方案中，本发明的抗-PD-L1抗体为度伐利尤单抗或阿维单抗。
C-2.作为PD-1轴抑制剂的示例性抗-PD-1抗体
在一些实施方案中，提供的PD-1轴抑制剂为抗-PD-1抗体或其抗原结合结构域。在一些实施方案中，提供的组合包含抗-PD-1抗体或其抗原结合结构域。
本发明的抗-PD-1抗体的示例性实例可包含抗原结合区，其交叉阻断或结合与抗-PD-1抗体相同的表位，所述抗-PD-1抗体包含先前已知抗体的VH和VL区，所述先前已知抗体比如纳武单抗(也称为ONO-4538、BMS-936558或MDX1106，商品名
Figure BDA0003039058420000311
)、帕博丽珠单抗(也称为派姆单抗或MK03475，商品名
Figure BDA0003039058420000312
)、PDR001、替雷利珠单抗(BGB-A317)、西米普利单抗(REGN281)、MEDI0680(以前为AMP-514)、pidilizumab(CT-011)、ENUM-388D4(包括D4-1、D4-2和D4-3变体)、ENUM-244C8(也包括其每个变体)，以及美国专利申请公开文本Nos.US 2003/0039653、US 2004/0213795、US 2006/0110383、US 2007/0065427、US 2007/0122378、US 2009/0217401、US 2011/0008369和US2015/0203579和PCT国际申请公开文本Nos.WO 2003/099196、WO 2006/121168、WO 2007/005874、WO 2008/156712、WO2009114335、WO 2010/027423、WO 2011/110604、WO 2012/145493、WO 2013/014668、WO2014/194302、WO 2015/035606和WO 2016/106159中公开的抗-PD-1抗体。提供的抗-PD-1抗体还可以为或包含上述抗-PD-1抗体的抗原结合区或VH和VL区或任意之一。
在一些实施方案中，提供的抗-PD-1抗体或其抗原结合结构域可包含来自选自纳武单抗、帕博丽珠单抗、PDR001、MEDI0680、pidilizumab、ENUM-388D4和ENUM-244C8的抗体的抗原结合区，比如三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)中的任一个。
在一些实施方案中，提供的PD-1抗体或其抗原结合结构域可包含SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48三个重链CDR，和/或SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51三个轻链CDR。在一些实施方案中，提供的PD-1抗体或其抗原结合结构域可包含SEQID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54三个重链CDR，和/或SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57三个轻链CDR。
在一些实施方案中，提供的抗-PD-1抗体或其抗原结合结构域可具有SEQ ID NOs:66和68中任一个的HCVR和/或SEQ ID NOs:67和69中任一个的轻链可变LCVR。
在一些实施方案中，提供的抗-PD-1抗体或其抗原结合结构域可具有SEQ ID NOs:72和74中任一个的重链和/或SEQ ID NOs:73和75中任一个的轻链。
在一些实施方案中，提供的PD-1抗体或其抗原结合结构域的重链和轻链对包含分别如下的HCVR和LCVR：SEQ ID NOs:66和67或SEQ ID NOs:68和69。
在一些实施方案中，提供的PD-1抗体的重链和轻链对为或包含SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供的PD-1抗体或其抗原结合结构域可具有与SEQ ID NOs:66和68中任一个所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高的序列同一性的HCVR，和/或与SEQ ID NOs:67和69中任一个所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高的序列同一性的LCVR。在一些实施方案中，提供的PD-1抗体或其抗原结合结构域可具有与SEQ ID NOs:72和74中任一个的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高的序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NOs:73和75中任一个的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高的序列同一性的轻链。
在一些实施方案中，本发明的抗-PD-1抗体为纳武单抗或帕博丽珠单抗。在一些实施方案中，本发明的抗-PD-1抗体可以为替雷利珠单抗或西米普利单抗。
D.本发明的示例性方法
在一些实施方案中，本发明提供预防性和/或治疗性方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合。
在一些实施方案中，本发明提供了用于使(优选地在肿瘤微环境中的)IL-2分泌增加的方法。所述方法可以包括向受试者施用包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合，相对于单独的双特异性试剂或抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量有效使(优选地在肿瘤微环境中的)IL-2分泌增加。在一些实施方案中，提供的方法可以引起IL-2分泌的协同增加。在一些实施方案中，提供的方法可以引起IL-2分泌的累加增加。
在一些实施方案中，本发明提供用于使(优选地在肿瘤微环境中的)IFN-γ分泌增加的方法。所述方法可包括向受试者施用包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合，相对于单独的双特异性试剂或抑制剂，当与另一种组合时，其各自的量有效使(优选地在肿瘤微环境中的)IFN-γ分泌增加。在一些实施方案中，提供的方法可以引起IFN-γ分泌的协同增加。在一些实施方案中，提供的方法可以引起IFN-γ分泌的累加增加。
在一些实施方案中，本发明提供用于诱导T淋巴细胞活化和/或增殖的方法。所述方法可包括向受试者施用包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合，当与另一种组合时，其各自的量有效诱导T淋巴细胞活化和/或增殖。在一些实施方案中，提供的方法可以引起协同的T淋巴细胞活化和/或增殖。在一些实施方案中，提供的方法可以引起累加的T淋巴细胞活化和/或增殖。
在一些实施方案中，本发明提供用于增强免疫功能的方法。所述方法可包括向受试者施用包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合，当与另一种组合时，其各自的量有效诱导增强的免疫功能。在一些实施方案中，提供的方法可以引起协同的免疫功能增强。在一些实施方案中，提供的方法可以引起累加的免疫功能增强。
在一些实施方案中，本发明提供用于使(优选地在肿瘤微环境中的)CD4+T细胞增加的方法。在一些实施方案中，本发明提供用于使(优选地在肿瘤微环境中的)CD8+T细胞增加的方法。在一些实施方案中，本发明提供用于使(优选地在肿瘤微环境中的)NK细胞活化且使ADCC增加的方法。在一些实施方案中，本发明提供用于监测和改变肿瘤生物标志物水平比如CD4、CD8、PD-L1、Ki67、CD137、HER2和IL-8水平的方法。提供的方法可包括向受试者施用包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合，当与另一种组合时，其各自的量有效诱导(优选地在肿瘤微环境中的)CD4+T细胞的扩增，(优选地在肿瘤微环境中的)CD8+T细胞的扩增，(优选地在肿瘤微环境中的)NK细胞的活化和ADCC增加，和/或肿瘤生物标志物水平的改变。
在一些实施方案中，本发明提供用于诱导T细胞上CD137聚集和活化并使此类T细胞靶向肿瘤细胞(优选HER2阳性肿瘤细胞)的方法。所述方法可包括向受试者施用包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合，当与另一种组合时，其各自的量有效诱导T细胞上CD137聚集和活化并使此类T细胞靶向肿瘤细胞(优选HER2阳性肿瘤细胞)。
在一些实施方案中，本发明提供用于在肿瘤细胞、优选HER2阳性肿瘤细胞附近诱导局部淋巴细胞应答的方法。所述方法可包括向受试者施用包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合，当与另一种组合时，其各自的量在肿瘤细胞、优选HER2-阳性肿瘤细胞附近有效诱导局部淋巴细胞应答。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗或延缓癌症进展的方法。在一些实施方案中，本发明提供用于提供抗肿瘤效应的方法，所述抗肿瘤效应比如肿瘤尺寸的减小、肿瘤生长的抑制、转移的抑制、复发的延迟和总生存期改善。提供的方法可包括向受试者施用包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合，当与另一种组合时，其各自的量引发抗肿瘤效应。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗HER2阳性晚期或转移性实体瘤的方法。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗PD-L1阳性肿瘤的方法。提供的方法可包括向受试者施用包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合，当与另一种组合时，其各自的量有效引发抗肿瘤效应。在一些实施方案中，提供的方法可以引起协同的抗肿瘤效应。在一些实施方案中，提供的方法可以引起累加的抗肿瘤效应。
在一些实施方案中，就提供的包括向受试者施用有效量的包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合的方法而言，所述CD137/HER2双特异性试剂可包含选自SEQID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:83和80、和SEQ ID NOs:79和84的氨基酸序列，和/或所述PD-1轴抑制剂可包含选自SEQ ID NOs:72和73、SEQ ID NOs:74和75、和SEQID NOs:76和77的氨基酸序列或可以为纳武单抗、帕博丽珠单抗或阿妥珠单抗。
在一些实施方案中，就提供的包括向受试者施用有效量的包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合的方法而言，所述CD137/HER2双特异性试剂可包含与SEQ IDNOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:83和80、和SEQ ID NOs:79和84所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，和/或所述PD-1轴抑制剂可包含与SEQ ID NOs:72和73、SEQ ID NOs:74和75、和SEQ ID NOs:76和77所示的氨基酸序列或纳武单抗、帕博丽珠单抗或阿妥珠单抗的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。针对包含如上定义的两条氨基酸链的双特异性融合蛋白的序列同一性的含义经必要修改适用于抗体。
在一些实施方案中，就提供的包括向受试者施用有效量的包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合的方法而言，所述组合为SEQ ID NOs:81和80及SEQ ID NOs:72和73、SEQ ID NOs:81和80及SEQ ID NOs:74和75、SEQ ID NOs:81和80及SEQ ID NOs:76和77的组合。
在一些实施方案中，提供的方法导致受试者的应答。在一些实施方案中，应答为部分应答。在一些实施例中，应答为完全应答。在一些实施方案中，应答为受试者在停止治疗后的持续应答(例如，持续的部分应答或完全应答)。
在一些实施方案中，在包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合治疗之前，本发明的受试者可已经采用癌症疗法进行了治疗。在一些实施方案中，本发明的受试者可以具有对一种或多种癌症疗法具有抗性的癌症，其中所述癌症在治疗开始时可以是抗性的，或者在治疗期间所述癌症可变为抗性的。在一些实施方案中，本发明的受试者可具有对曲妥珠单抗具有抗性的癌症。如本文所述，所述癌症可能处于早期或晚期。
在一些实施方案中，本发明的受试者可患有晚期或转移性乳腺癌。
在一些实施方案中，提供的方法包括有效量的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)的施用。在一些实施方案中，将提供的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ IDNOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)以约0.05mg/kg至约8mg/kg体重、约0.15mg/kg至约8mg/kg体重、约0.5mg/kg至约8mg/kg体重、约1mg/kg至约8mg/kg体重、约0.05mg/kg至约5mg/kg体重、约0.15mg/kg至约5mg/kg体重、约0.5mg/kg至约5mg/kg体重或约1mg/kg至约5mg/kg体重的剂量施用于个体。在一些实施方案中，将提供的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ IDNOs:79和84)以约0.5mg/kg至约8mg/kg体重、约1mg/kg至约8mg/kg体重、约0.5mg/kg至约5mg/kg体重或约1mg/kg至约5mg/kg体重的剂量施用于个体。在一些实施方案中，将提供的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)以约1mg/kg至约8mg/kg体重的剂量施用于个体。在一些实施方案中，将提供的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)以约1mg/kg至约5mg/kg体重的剂量施用于个体。在一些实施方案中，将提供的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)以约0.05mg/kg体重、约0.15mg/kg体重、约0.5mg/kg体重、约1.0mg/kg体重、约2.5mg/kg体重、约5.0mg/kg体重或约8.0mg/kg体重的剂量施用。作为一般提议，无论是通过一次还是通过多次施用，施用于人的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ IDNOs:79和84)的治疗有效量将处于约0.01至约50mg/kg的范围。在一些实施方案中，可以从约每周至每约4周、从约每周至每约3周或从约每周至每约2周施用提供的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)。在一些实施方案中，可以约每周、每约2周、每约3周或每约4周施用提供的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQID NOs:79和84)。在一些实施方案中，可以在每个周期的第1天，每个7天周期的第1天，每个14天周期的第1天和第8天，每个21天周期的第1、8和15天，或每个28天周期的第1、8和15天施用提供的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ IDNOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)。在一些实施方案中，可以在每个周期的第1天，每约3周施用提供的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ IDNOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)。在一些实施方案中，施用至少1个周期，比如2、3、4、5、10、15、20、25、30或更多个周期。在一些实施方案中，提供的CD137/HER2双特异性试剂具有SEQ ID NO:81和80所示的序列。
在一些实施方案中，本发明提供的方法包括施用有效量的选自PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂和PD-L2拮抗剂的PD-1轴抑制剂。
在一些实施方案中，PD-L1拮抗剂为抗体，比如能够抑制PD-L1与其结合配偶体(比如PD-1和B7.1)结合的抗体。在一些实施方案中，PD-L1拮抗剂为SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体，可以从每周至每约4周、从约每周至每约3周、从约每周至每约2周，比如约每周、每约2周、每约3周或每约4周以约800mg至约1500mg(如约1000mg至约1300mg，如约1100mg至约1200mg)的剂量施用所述PD-L1拮抗剂。在一些实施方案中，PD-L1拮抗剂为SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体，可以每约3周以约800mg至约1500mg(如每约3周以约1000mg至约1300mg，如每约3周以约1100mg至约1200mg)的剂量施用所述PD-L1拮抗剂。在一些实施方案中，可以每约3周以约1200mg的剂量施用SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体。
在一些实施方案中，PD-1拮抗剂为抗体，比如能够抑制PD-1与其结合配偶体(比如PD-L1和PD-L2)结合的抗体。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂为SEQ ID NOs:72和73或SEQID NOs:74和75所示的PD-1抗体，可以每约1、2、3、4、5或6周以约100mg至约600mg(如每约1、2、3、4、5或6周以约100mg、120mg、140mg、160mg、180mg、200mg、220mg、240mg、260mg、280mg、300mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg或600 1300mg)的剂量施用所述PD-1拮抗剂。在一些实施方案中，可以每约2周以约240mg的剂量施用SEQ IDNOs:72和73所示的PD-1抗体。在一些实施方案中，可以每约4周以约480mg的剂量施用SEQID NOs:72和73所示的PD-1抗体。在一些实施方案中，可以每约3周以约200mg的剂量施用SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体。
作为一般提议，无论是通过一次还是通过多次施用，施用于人的PD-1轴抑制剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体，或PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)的治疗有效量将处于约0.01至约50mg/kg患者体重的范围。在一些实施方案中，例如，可以以约0.01至约45mg/kg、约0.01至约40mg/kg、约0.01至约35mg/kg、约0.01至约30mg/kg、约0.01至约25mg/kg、约0.01至约20mg/kg、约0.01至约15mg/kg、约0.01至约10mg/kg、约0.01至约5mg/kg或约0.01至约1mg/kg的剂量施用提供的PD-1轴抑制剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体，或PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)。在一些实施方案中，可以以约15mg/kg施用提供的PD-1轴抑制剂(如PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)。在一些实施方案中，可以每约2周以约3mg/kg施用SEQ ID NOs:72和73所示的PD-1轴抑制剂。在一些实施方案中，可以每约3周以约2mg/kg施用SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1轴抑制剂。其他剂量方案也可能是有用的。在一个实施方案中，可以将提供的PD-1轴抑制剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体，或PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)以约100mg、约200mg、约300
mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg或约1500mg的统一剂量(flat dose)施用于人。在一些实施方案中，可以每约3周以约1150mg至约1250mg的剂量施用提供的PD-1轴抑制剂(如PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)。在一些实施方案中，可以每约3周以约1200mg的剂量施用提供的PD-1轴抑制剂(如PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)。在一些实施方案中，可以以约240mg的剂量施用提供的PD-1轴抑制剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体)。在一些实施方案中，可以以约200mg的剂量施用提供的PD-1轴抑制剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体)。在一些实施方案中，本发明所提供的PD-1轴抑制剂的剂量可以单剂量或多剂量(如2或3个剂量)施用。在一些实施方案中，当与单一治疗相比在联合治疗中施用时，可以以减少的剂量施用所提供的PD-1轴抑制剂。在一些实施方案中，例如，提供的用于治疗或延缓受试者中癌症进展的方法包括一种包含治疗周期的给药方案，其中在每个周期的第1天以约1200mg的剂量向受试者施用人PD-1轴结合拮抗剂(如PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)，其中每个周期为约21天(即每个周期每约21天重复一次)。在一些实施方案中，例如，提供的用于治疗或延缓受试者中癌症进展的方法包括一种包含治疗周期的给药方案，其中在每个周期的第1天以约240mg的剂量向受试者施用人PD-1轴结合拮抗剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:72和73所示的PD-1抗体)，其中每个周期为约14天，或在每个周期的第1天以约480mg的剂量向受试者施用所述人PD-1轴结合拮抗剂，其中每个周期为约28天。在一些实施方案中，例如，提供的用于治疗或延缓受试者中癌症进展的方法包括一种包含治疗周期的给药方案，其中在每个周期的第1天以约240mg的剂量向受试者施用人PD-1轴结合拮抗剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体)，其中每个周期为约21天。在一些实施方案中，施用至少1个周期，比如2、3、4、5、10、15、20、25、30或更多个周期。
在一些实施方案中，以单一给药方案施用本发明的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)和PD-1轴抑制剂(如PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)。在所述给药方案的上下文中，这些组分的施用可以是顺序地(在不同时间)或同时地(在相同时间)。例如，在一些实施方案中，本发明的方法包括一种包含治疗周期的给药方案，其中在每个周期的第1天以约0.05mg/kg体重、0.15mg/kg体重、0.5mg/kg体重、1.0mg/kg体重、2.5mg/kg体重、5.0mg/kg体重或8.0mg/kg体重的剂量向受试者施用CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ IDNOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)，并在之后立即以约1200mg的剂量施用PD-1轴抑制剂(如PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)。在一些实施方案中，每个周期为约21天。在一些实施方案中，施用至少1个周期，比如2、3、4、5、10、15、20、25、30或更多个周期。
在一些实施方案中，在与提供的PD-1轴抑制剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体，或PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)独立的组合物中施用提供的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)。在一些实施方案中，在与提供的PD-1轴抑制剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体，或PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)相同的组合物中施用提供的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)。
在一些实施方案中，通过相同的施用途径施用本发明的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)和PD-1轴抑制剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体，或PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)。在一些实施方案中，通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用本发明的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)和PD-1轴抑制剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体，或PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)。在一些实施方案中，可以静脉内地、肌内地、皮下地、局部地、口服地、经皮地、腹膜内地、眶内地，通过植入、通过吸入、鞘内地，脑室内地或鼻内地施用提供的CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)。在一些实施方案中，可以静脉内地、肌内地、皮下地、局部地、口服地、经皮地、腹膜内地、眶内地，通过植入、通过吸入、鞘内地，脑室内地或鼻内地施用提供的PD-1轴抑制剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体，或PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)。
在一些实施方案中，提供的方法可进一步包括另外的疗法。在一些实施方案中，另外的疗法可以是放射疗法、手术(如，肿块切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述疗法的组合。此类另外的疗法可以是辅助或新辅助疗法的形式。在一些实施方案中，另外的疗法为施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的疗法为施用限制副反应的试剂(如旨在减轻治疗副反应的发生和/或严重程度的试剂，例如抗恶心试剂等)。
E.药物制剂
在一些实施方案中，可以根据标准药学实践将本发明的分子配制为用作治疗组合物的“活性成分”，所述分子包括提供的组合和组合的组分，比如CD137/HER2双特异性试剂(如SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:82和80或SEQ ID NOs:79和84)和PD-1轴抑制剂(如PD-1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体，或PD-L1拮抗剂，比如SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体)。包含此类分子的组合物可含有一种或多种药学上可接受的载体、助流剂、稀释剂或赋形剂，其促进组合物的施用和/或促进组合物向作用部位的递送。合适的载体、稀释剂和赋形剂是本领域技术人员已知的并包括诸如碳水化合物、蜡、水溶性和/或可溶胀聚合物、亲水或疏水材料、明胶、油、溶剂、水等的材料。本发明的组合物可以为任何合适的形式，例如片剂、丸剂、粉剂、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或液体介质)、含有例如高达10％重量的活性化合物的软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射液和无菌包装粉末，仅列举一些非限制性选择。可以采用本领域已知的方法，比如常规溶解和混合程序制备此类组合物(或制剂)。
在一些实施方案中，本发明的制剂可以冻干制剂、研磨粉或水性溶液的形式制备以用于各种施用途径和类型。
在一些实施方案中，将CD137/HER2双特异性试剂配制为具有约25mg/mL的靶标蛋白浓度的水性溶液。在一些实施方案中，可以使用SEQ ID NOs:76和77的市售制剂，该制剂以用于静脉输注的无防腐剂溶液的形式含有约1200mg/20mL(60mg/mL)的SEQ ID NOs:76和77。
对本领域技术人员而言，经审查以下的实施例及其附图(其并非意图是限制性的)，本发明的另外的目的、优点和特征将变得显而易见。因此，应当理解的是，虽然本发明通过示例性实施方案以及任选的特征进行特定的公开，但本领域技术人员可以采取本文所公开且于其中实施的公开内容的修饰及变化，且认为这样的修饰及变化在本发明的范围内。
V.实施例
实施例1：由CD137/HER2双特异性试剂和PD-1抗体的组合诱导的T细胞活化的评估
采用T细胞测定来评估，当以固定的摩尔比与抗-PD-1抗体组合使用时，SEQ IDNOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性试剂共刺激T细胞应答的能力。基于此目的，在肿瘤细胞系NCI-N87存在下，将CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)和SEQ ID NOs:72和73所示的PD-1抗体的组合添加至经葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的人外周血单核细胞(PBMC)，并在37℃下温育3天。测量上清液中IL-2分泌水平，作为T细胞活化的证明。
根据Biochrom的方案，通过经由聚蔗糖密度梯度(Biocoll 1.077g/mL，Biochrom)的离心自血沉棕黄色层中分离健康志愿者供体的PBMC。将纯化的PBMC重悬浮于由90％FCS和10％DMSO组成的缓冲液中，立即冷冻并储存在液氮中直至进一步使用。对于测定，将PBMC解冻并置于在37℃下于湿润的5％CO2氛围中的补充有10％FCS和1％青霉素-链霉素(LifeTechnologies)的培养基(RPMI 1640，Life Technologies)中达16h。
对于每个实验条件，采用一式三份实施以下程序：为了阻断增殖，在37℃下将肿瘤细胞系NCI-N87用30μg/ml丝裂霉素C(Sigma Aldrich)处理30min。然后在培养基中将丝裂霉素处理的细胞洗涤两次并以每孔2.5x104个细胞铺板在384孔平底组织培养板以允许在37℃下于湿润的5％CO2氛围中粘附过夜。靶细胞之前已在标准条件下生长，使用Accutase(PAA Laboratories)分离，并重悬在培养基中。
在接下来的几天中，在用PBS洗涤板两次之后，将每孔2.5x104个PBMC添加至肿瘤细胞。CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)和PD-1抗体(SEQ ID NOs:72和73)(1:10摩尔比)的组合、单独的CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)或单独的PD-1抗体(SEQ ID NOs:72和73)的稀释系列(通常范围为0.001nM至100nM)和0.05ng/ml SEB添加至相应的孔。将板用透气密封膜(4titude)覆盖，并在37℃下在湿润的5％CO2气氛中温育3天。随后，按照如下程序所述采用人IL-2DuoSet试剂盒(R&D Systems)评估上清液中的IL-2水平。
在室温下用PBS中的1μg/mL“人IL-2捕获抗体”涂覆384孔板达2h。随后，用80μL补充有0.05％吐温的PBS(PBS-T)洗涤孔5次。在含有1％酪蛋白(w/w)的PBS-T中阻断1h后，将测定上清液和在培养基中稀释的浓度系列的IL-2标准品转移至相应的孔中并在4℃下温育过夜。第二天，加入在含有0.5％酪蛋白的PBS-T中的100ng/mL山羊抗-hIL-2-Bio检测抗体(R&DSystems)和1μg/mL Sulfotag-标记的链霉亲和素(Mesoscale Discovery)的混合物并在室温下温育1h。洗涤后，向每个孔中加入25μL读数缓冲液(Mesoscale Discovery)，并采用Mesoscale Discovery读数器检测得到的电化学发光(ECL)信号。使用MesoscaleDiscovery软件进行分析和定量。
相应实验的结果描绘在图1中且诱导的IL-2分泌的拟合EC50汇总于表1中。测试了hIgG4同种型对照抗体以设定基础活性。与单独的CD137/HER2双特异性试剂或PD-1抗体相比，CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)和PD-1抗体(SEQ ID NOs:72和73)的组合能够以改善的EC50值(更低)诱导IL-2的剂量依赖性分泌。同时，与等摩尔浓度的CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NO:81和80)或PD-1抗体(SEQ ID NO:72和73)相比，该组合诱导的IL-2水平更高并呈现协同或累加效应。
表1：诱导IL-2分泌的功效
分子 EC<sub>50</sub>(供体A) EC<sub>50</sub>(供体B)
SEQ ID NOs:81和80 0.1494nM 0.1165nM
SEQ ID NOs:72和73 0.4198nM 0.8538nM
SEQ ID NOs:81和80+SEQ ID NOs:72和73 0.05462nM 0.05817nM
实施例2：由与PD-1抗体组合的CD137/HER2双特异性试剂诱导的T细胞活化的评估
采用另一T细胞测定来评估，当与固定浓度的PD-1抗体组合使用时，SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性试剂共刺激T细胞应答的能力。基于此目的，在肿瘤细胞系NCI-N87存在下，将不同浓度的CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)与固定浓度的SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的PD-1抗体的组合添加至经SEB刺激的人PBMC，并在37℃下温育3天。测量上清液中IL-2分泌水平，作为T细胞活化的证明。
按照实施例1所述分离并处理来自健康志愿者供体的PBMC。如实施例1所述，在测定前一天处理肿瘤细胞系NCI-N87并以每孔2.5x104个细胞铺板。
对于每个实验条件，采用一式三份实施以下程序：将NCI-N87涂覆的板用PBS洗涤两次，并将每孔2.5x104个PBMC添加至肿瘤细胞。将单独的或与10nM或100nM的SEQ ID NOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75组合的不同浓度(范围为0.0002nM至10nM)的CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)以及1ng/mL SEB添加至相应的孔中。在同一实验中，还单独滴定了PD-1抗体(SEQ ID NO:72和73或SEQ ID NO:74和75)以用于比较。然后将板用透气密封膜(4titude)覆盖，并在37℃下在湿润的5％CO2气氛中温育3天。随后，按照实施例1中所述评估上清液中的IL-2水平。
相应实验的结果描绘在图2中(以10nM和3.33nM测试了CD137/HER2双特异性试剂；其它浓度下的数据未示出)。CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)与任何一种测试的PD-1抗体(SEQ ID NOs:72和73以及SEQ ID NOs:74和75)的组合均诱导更高的IL-2分泌并协同地或累加地作用。当将CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)与SEQ IDNOs:72和73组合时，采用100nM抗体比采用10nM抗体诱导的IL-2分泌水平更高。另一方面，当与CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)组合使用时，SEQ ID NOs:74和75的浓度(100nM或10nM)不影响IL-2分泌。
实施例3：在表达不同水平HER2和/或PD-L1的肿瘤细胞存在下，由与PD-L1抗体组合的CD137/HER2双特异性试剂诱导的T细胞活化的评估
采用另外的T细胞测定来评估，SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合以HER2靶依赖性方式共刺激T细胞活化的能力。在具有不同HER2和/或PD-L1表达水平的肿瘤细胞系存在下，将不同浓度的CD137/HER2双特异性试剂(SEQID NOs:81和80)与固定浓度的SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体的组合施加至经SEB刺激的T细胞。测试的肿瘤细胞系包括NCI-N87(HER2高，PD-L1低)、JIMT-1(HER2中，PD-L1中)和MDA-MB-231(HER2低，PD-L1中)。
按照实施例1所述分离并处理来自健康志愿者供体的PBMC。
对于每个实验条件，采用一式三份实施以下程序：如实施例1所述，使肿瘤细胞系NCI-N87、JIMT-1和MDA-MB-231生长或用丝裂霉素C处理，并以每孔8.3x103个细胞铺在培养基中，以允许在37℃下于湿润的5％CO2氛围中粘附过夜。在接下来的几天中，在将用肿瘤细胞涂覆的板用PBS洗涤两次之后，将每孔2.5x104个PBMC添加至各孔中。将单独的或与100nMPD-L1抗体(SEQ ID NOs:76和77)或hIgG4同种型对照抗体组合的不同浓度(范围为0.0002nM至10nM)的CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)以及0.05ng/mL SEB添加至相应的孔中。在同一实验中，还单独滴定了PD-L1抗体以用于比较。然后将板用透气密封膜(4titude)覆盖，并在37℃下在湿润的5％CO2气氛中温育3天。随后，按照实施例1中所述评估上清液中的IL-2水平。
在图3中示出了在2.5nM和0.16nM的浓度下测试的CD137/HER2双特异性试剂(SEQID NOs:81和80)的示例性数据(其它浓度的双特异性试剂的数据未示出)。与单独的双特异性试剂或抗体或双特异性试剂与hIgG4同种型对照抗体的组合相比，在CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)和PD-L1抗体(SEQ ID NOs:76和77)的组合存在下，T细胞与NCI-N87(HER2高，PD-L1低)或JIMT-1(HER2中，PD-L1中)的共培养导致统计学上显著增加的IL-2分泌(图3A和3B)。此外，与MDA-MB-231(HER2低，PD-L1中)的共培养在采用CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)和PD-L1抗体(SEQ ID NOs:76和77)的组合时诱导更高的IL-2分泌，但是仅为与单独使用抗体时相同的程度。这可能是由于MDA-MB-231上的Her2表达不足以使CD137/HER2双特异性试剂产生任何作用。
总体而言，数据表明与PD-L1抗体(SEQ ID NOs:76和77)组合的CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)的功能活性是协同的或累加的，且依赖于肿瘤细胞上Her2和PD-L1的表达情况，所述功能活性由其活化T细胞或增加IL-2分泌的能力度量。
实施例4：在植入人PBMC的异种移植小鼠模型中功能性体内活性的评估
为了研究所提供的包含SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合的体内活性，采用细胞系衍生的异种移植小鼠模型。由此，将人癌细胞系皮下植入免疫缺陷的NOG小鼠中，该小鼠在4-6周龄移交(deliver)并具有至少1周检疫隔离期。当肿瘤达到约80-100mm3的体积后，小鼠成为人PBMC的代用品。将测试分子注射至少3次，并不断测量肿瘤的生长和活性。研究结束后，处死小鼠。通过免疫组织化学评估CD3-、CD4-和CD8-阳性细胞的肿瘤内浸润。进行IFN-γRNAscope作为进一步的读出。
实施例5：在CD137人源化小鼠模型中功能性体内活性的评估
为了研究所提供的包含SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合的体内活性，采用过表达人Her2的小鼠细胞系衍生的异种移植小鼠模型。由此，将小鼠癌细胞系皮下植入人源化的CD137 C57b小鼠中，该小鼠在8-10周龄移交(deliver)并具有至少1周检疫隔离期。当肿瘤达到约50-80mm3的体积后，将小鼠随机分成同类组。将测试分子注射至少3次，并不断测量肿瘤的生长和活性。研究结束后，处死小鼠。通过免疫组织化学评估CD3-、CD4-和CD8-阳性细胞的肿瘤内浸润。进行IFN-γRNAscope作为进一步的读出。
实施例6：与PD-1轴抑制剂组合的CD137/HER2双特异性试剂的临床研究
以上讨论的数据表明包含CD137/HER2双特异性试剂和PD-1轴抑制剂的组合可累加地或协同地作用以在肿瘤微环境中刺激T细胞活化。因此，此类组合可在具有癌症的患者中提供临床益处。
设计在具有特定的HER2阳性晚期或转移性实体瘤的患者中与SEQ ID NOs:76和77所示的PD-L1抗体组合的SEQ ID NOs:81和80所示的CD137/HER2双特异性试剂的Ib期开放性剂量递增研究，以确定最大耐受剂量(MTD)和2期剂量(RP2D)。次要目的包括评估CD137/HER2双特异性试剂和PD-L1抗体的组合的功效、安全性，药代动力学和免疫原性。探索性目的包括评估该组合的初步抗肿瘤活性、CD137/HER2双特异性试剂的暴露-应答关系以及生物标志物。该研究包括一个剂量递增期，然后是一个扩展期(图4A)。
将一个治疗周期定义为21天并包括静脉输注的与每3周(Q3W)给予PD-L1抗体(SEQID NOs:76和77)组合的Q3W给予CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和89)(图4B)。在每个周期的第1天，患者接受2小时静脉输注CD137/HER2双特异性试剂，然后在60(±15)分钟内立即施用PD-L1抗体(1200mg固定剂量)。如果第一剂量耐受性良好，则可以在30(±10)分钟内施用后续剂量的PD-L1抗体。
以给定剂量水平的最初两位患者的给药错开(stagger)最少7天。在首位患者完成第8天的问诊后进行安全复查。如果对第一位患者未观察到剂量限制性毒性(DLT)，则第二位患者的错开时间可减少至72小时。如果在前两名患者中未观察到DLT，则后续患者无需错开。如本文中所使用的，将DLT定义为在第1周期中发生的不良反应(AE)，对于所述不良反应无法识别其他原因(并因此可能与研究治疗有关)并且满足至少一个预设标准。根据NCICTCAE 4.03版指南对毒性进行分级并记录。将在完成第1周期之前中断治疗的患者替换掉。
使用改良毒性概率区间(mTPI)自适应设计进行剂量递增，以提出剂量建议并估算与PD-L1抗体(SEQ ID NO:76和77)的批准剂量1200mg组合的CD137/HER2双特异性试剂(SEQID NO:81和80)的最大耐受剂量(MTD)。mTPI设计是一种基于模型的方法，其具有预先确定的决策矩阵，该矩阵根据在所评估的剂量水平中观察到的DLT数量，给出建议逐步增加、减小或维持相同剂量或停止剂量增加。将MTD定义为具有最接近0.3的估算毒性概率的剂量水平。预期每个剂量递增群组(cohort)中将招募3至6名受试者。患者中(intra-patient)剂量递增是不允许的。
以每3周(Q3W)0.05mg/kg的剂量水平组合Q3W 1200mg的固定剂量的PD-L1抗体开始剂量递增。在此剂量内的最少3名受试者已经以目标剂量水平治疗并在DLT评估期内进行评估后，如果mTPI模型建议增加，则可以开始为下一个剂量水平进行招募。mTPI模型的建议仅基于DLT。然后，在确定随后待测试的剂量时，应考虑所有可获得的安全性数据以及新出现的PK、持久性和药效学数据以及DLT建模建议。剂量递增将持续直至达到MTD，直至达到最大样本量(30名受试者)，或者直至安全性停止规则或不足剂时生效，以先到者为准。在根据表2的剂量递增期内测试CD137/HER2双特异性试剂和PD-L1的剂量水平。根据治疗修改情况，适当调整或中断CD137/HER2双特异性试剂的剂量。
表2：在剂量递增期内评估的CD137/HER2双特异性试剂和PD-L1抗体的剂量
Figure BDA0003039058420000481
一旦建立了MTD，研究的扩展期将探索从剂量递增期建立的RP2D的初步疗效和PD效果，以及安全性和耐受性。
持续给药直至达到研究治疗中止的标准(疾病进展或退出研究)或直至达到30个周期。在给药的最初24周(前8个周期)中的每6周以及所述24周观察(scan)后每12周，评估患者的肿瘤应答/进展。
对于剂量探索(dose-finding)群组，在给定群组中的最后一名患者完成至少1个研究治疗周期后，将审核所有安全性数据，以确定是继续还是停止剂量递增，扩展个体剂量水平以获得另外的安全性数据，确定MTD和/或RP2D，或探索其它剂量水平/方案。
制剂——在用于输注的标准灌装量为16的20-mL Type I USP/欧洲药典玻璃小瓶中，以水性溶液的形式提供CD137/HER2双特异性试剂(SEQ ID NOs:81和80)。将CD137/HER2双特异性试剂配制为在20mM组氨酸、250mM山梨醇、pH 6.3、0.01％PS80中25mg/mL的靶标蛋白浓度。在一次性使用的20-cc 1型USP/欧洲药典玻璃瓶中以水性溶液的形式提供PD-L1抗体(SEQ ID NOs:76和77)。将所述小瓶设计为递送20mL(1200mg)的PD-L1抗体，所述PD-L1抗体配制为在20mM组氨酸乙酸盐、120mM蔗糖、0.04％聚山梨酯20、pH 5.8中60mg/mL。
安全性评价——根据AE(发病率和严重程度)、体力状态、体格检查、12导联静息心电图(ECG)、LVEF评估和实验室安全性评估来评价CD137/HER2双特异性试剂和PD-L1抗体的安全性和耐受性。根据NCI CTCAE v4.03对实验室异常和AE分级。免疫相关(ir)AE的管理为免疫相关(ir)AE的处理提供了详细的指导。在研究过程中，对AE、ECG、LVEF评估和实验室数据进行回顾和总结。所有接受了至少1个研究治疗剂量的患者均涵盖在安全性分析中。
药代动力学评价——在研究过程中，采用以下参数研究了CD137/HER2双特异性试剂和PD-L1抗体的单剂量和多剂量药代动力学特征：(1)浓度-时间曲线的积分(浓度-时间曲线下面积，AUC)；(2)最大血浆、血液、血清或其它体液药物浓度(Cmax)；(3)达到Cmax(Tmax)的时间；(4)终末半衰期(t1/2)；(5)单位时间内清除药物的清除血浆体积(clearance,CL)；(6)终末期表观分布容积(Vz)；和(7)累积率(AR；AR＝Cmax(多剂量)/Cmax(单剂量))。
为了评估CD137/HER2双特异性试剂的药代动力学，在第1至第3周期，在双特异性试剂输注前，以及在双特异性试剂输注结束(包括冲洗(flush))后的第5分钟、4、8、24、48、72、168和336小时时，从所有患者收集外周静脉血(4mL)。还在第2、4-6、8、12和16周期的第1天，在双特异性试剂输注前收集样品，用于双特异性试剂的定量。
为了评估PD-L1抗体的药代动力学，在第1周期，在抗体输注前，以及在PD-L1抗体输注结束(包括冲洗(flush))后的第30分钟时，从所有患者收集外周静脉血(4mL)。还在第2、4、8、12和16周期的第1天，在抗体输注前收集样品，用于PD-L1抗体的定量。
药效学评价——通过定量肿瘤活检或外周血中的淋巴细胞亚型或标志物和血浆中的细胞因子水平来评估CD137/HER2双特异性试剂和PD-L1抗体的药效学应答。表3列出了计划进行分析的选定的药效学标志物(在给药前和给药后的预先指定的时间点取样)。
表3：评估的药效学标志物
Figure BDA0003039058420000501
生物标志物评价——在治疗之前和在治疗的选定时间点收集外周血和新鲜肿瘤组织(肿瘤活检)。除非当地法律或法规禁止，否则将在完成指定分析后可用的残留样品材料用于识别其它药效或预测标志物或用于增进对疾病生物学的了解。将样品除去标识以确保患者的隐私。
疗效评价——通过根据RECIST版本1.1评估肿瘤应答和进展来评估CD137/HER2双特异性试剂和PD-L1抗体的疗效。在给药的最初24周(前8个周期)中，每6周评估一次患者。在24周观察后，每12周进行一次肿瘤评估。肿瘤评估将包括临床检查和适当的成像技术，如，根据RECIST以合适的切片厚度对胸部、腹部和骨盆进行计算机断层(CT)扫描。根据需要进行其它研究，比如磁共振成像(MRI)、X-射线、正电子发射断层(PET)扫描和超声。在整个临床研究中，将用于检测基线病变的相同方法用于跟踪相同的病变。
免疫原性评价——基于静脉血样品中的抗药物抗体水平来评估CD137/HER2双特异性试剂和PD-L1抗体的免疫原性。此外，以图形方式探索了浓度/不良反应-免疫原性的关系，并制成表格以表征筛选免疫原性存在的变化与CD137/HER2双特异性试剂的血清浓度之间的关系。还评估了免疫原性和其它终点(主要的安全性、功效和生物标志物参数)之间的潜在相关性。
统计方法——表格的数据摘要本质上是描述性的(即，患者数[n]、平均值、标准差、中位数、连续变量的最小值和最大值，以及类别变量的n和百分比)。统计分析计划(SAP)中提供了要在临床数据库锁定之前完成的分析方法的更详细说明。
本文示例性所描述的实施方式可以适当地在本文中未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制不存在的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被宽泛地解读且无限制。另外，本文所采用的术语和表达被用作描述的术语而非限制的术语，并且无意图在使用这些术语和表达时，排除显示和描述的特征的任何等同物或其部分，而是认可各种修饰可以在本发明请求保护的范围内。因此，应当理解的是，虽然本发明实施方式已通过优选的实施方式和任选的特征而被具体公开，本领域技术人员可以寻求其修饰和变化，并且这样的修饰和变化被认为是在本发明的范围内。本文所述的所有专利、专利申请、教科书和同行评审的出版物均通过引用全文并入本文。此外，当在通过引用并入本文的参考文献中的定义或使用的术语与本文所提供该术语的定义不一致或相反时，适用本文所提供的该术语的定义，而不适用该参考文献中该术语的定义。每个较窄种类和亚属分组落入类属的公开范围内，也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述，且具有从该种类中去除任何主题的条件或负面限制，而不管该去除的材料是否在本文中具体陈述。此外，当特征是以马库什组的形式描述时，本领域技术人员将认识到，本发明还由此以该马库什组中任何单独成员或成员亚组的形式描述。进一步的实施方式将由以下的权利要求书中变得显而易见。
等同物：本领域的技术人员使用不超过常规实验就会认识到或者能够确定许多与此处描述的本发明的具体实施方式的等同物。以下的权利要求意欲涵盖这些等同物。在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此引入本说明书中作为参考，就像每个单独的出版物、专利或专利申请具体地且分别指出引入本文作为参考一样。
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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
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<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> NGAL98wt
<400> 2
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile
65 70 75 80
Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn
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Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
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115 120 125
Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
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<213> 人工
<220>
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1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
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Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser
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Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
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Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<220>
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<213> 人工
<220>
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
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225
<210> 19
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<213> 人工
<220>
<223> Fc, IgG4
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 20
<211> 228
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<213> 人工
<220>
<223> Fc, IgG4
<400> 20
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Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
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225
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<213> 人工
<220>
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<400> 21
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Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
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<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 22
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Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
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Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
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165 170 175
Asp Gly
<210> 23
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 23
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165 170 175
Asp Gly
<210> 24
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 24
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Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
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165 170 175
Asp Gly
<210> 25
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工
<220>
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<400> 25
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165 170 175
<210> 26
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 26
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
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Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
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Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
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165 170 175
Asp Gly
<210> 27
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 27
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
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<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 28
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Ser Thr Leu Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
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<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 29
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
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Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ser Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
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Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
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<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 30
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
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Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
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65 70 75 80
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Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
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<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 31
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
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Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
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65 70 75 80
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Ile Arg Ser Asp Leu Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 32
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 32
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Tyr Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
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Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
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His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
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Gln Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Ser Thr Leu Gly Phe
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Asp Gly
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<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 33
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1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
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Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
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<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 34
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asp Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
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165 170 175
Asp Gly
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<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 35
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
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Ile Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 36
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 36
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Arg Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
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Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Val Asp Lys Asp Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
Asp Gly
<210> 37
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 37
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Asn
65 70 75 80
Trp Pro Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Leu Gly Pro Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 38
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 38
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Asn Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 39
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 39
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Asp Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Leu Leu Asp Lys Lys Cys His Tyr Ile Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗HCDR1
<400> 40
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗HCDR2
<400> 41
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗HCDR3
<400> 42
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗LCDR1
<400> 43
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp
1 5 10
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗LCDR2
<400> 44
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗LCDR3
<400> 45
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Nivo HCDR1
<400> 46
Asn Ser Gly Met His
1 5
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Nivo HCDR2
<400> 47
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 48
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Nivo HCDR3
<400> 48
Asn Asp Asp Tyr
1
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Nivo LCDR1
<400> 49
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Nivo LCDR2
<400> 50
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Nivo LCDR3
<400> 51
Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr
1 5
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Pembro HCDR1
<400> 52
Asn Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Pembro HCDR2
<400> 53
Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Pembro HCDR3
<400> 54
Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Pembro LCDR1
<400> 55
Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Pembro LCDR2
<400> 56
Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Pembro LCDR3
<400> 57
Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Atezo HCDR1
<400> 58
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Atezo HCDR2
<400> 59
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Atez HCDR3
<400> 60
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Atezo LCDR1
<400> 61
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Atezo LCDR2
<400> 62
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Atezo LCDR3
<400> 63
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 64
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗VL
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 66
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Nivo VH
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Ser
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<213> 人工
<220>
<223> Nivo VL
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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<220>
<223> Pembro VL
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
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<220>
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20 25 30
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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<223> 阿妥珠单抗HC
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
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435 440 445
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<213> 人工
<220>
<223> 阿妥珠单抗LC
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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<210> 78
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<220>
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<400> 78
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
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<210> 79
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗-IgG4 HC
<400> 79
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
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435 440 445
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<211> 214
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<213> 人工
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<223> 曲妥珠单抗LC
<400> 80
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tctacccttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt ttggcaagat taaaagtttt 300
ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 95
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 95
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120
aggctgcgtg aggataagga tccgtctaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat atgacgtcac cgctgtgacg tttgatgata agaaatgcaa ttacgctatt 240
tctacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300
ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 96
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 96
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 97
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 97
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat tagaagtgac 300
ctgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 98
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 98
caggactcca cctcagacct gatccctgcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg actaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg cttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
cagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtctactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
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ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 99
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 99
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
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ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 100
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 100
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acgaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgttgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagttgactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 101
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 101
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatatcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
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ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 102
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 102
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcgg 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaag tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg tggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagttaactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgtacttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 103
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 103
caggactcca cctcagatct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcaat 240
tggccctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcttcat taaaagtgac 300
ctgggcccca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 104
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 104
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggtgcga ccatttacga gttgaatgaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 105
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 105
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg atgataagga tccgcacaaa atgagcgcta ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg ttactggaca agaaatgcca ttacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca aaagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 106
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗-IgG1 HC
<400> 106
gaagtccagc tggtcgaatc tggtggtggc ctggtccagc ctggtggatc actgagactg 60
tcctgtgctg cttctggttt caacatcaag gacacctaca tccattgggt cagacaggca 120
cctggcaagg gactggaatg ggtcgcccga atctacccta caaacggcta cactcgctac 180
gccgactccg tcaagggacg ctttaccatc tccgccgaca cctctaaaaa caccgcctac 240
ctgcagatga atagtctgag ggccgaggat actgctgtgt actactgctc acgatgggga 300
ggcgacggct tttacgctat ggattactgg ggacagggaa ctctggtcac tgtgtctagc 360
gctagcacaa agggccctag tgtgtttcct ctggctccct cttccaaatc cacttctggt 420
ggcactgctg ctctgggatg cctggtgaag gattactttc ctgaacctgt gactgtctca 480
tggaactctg gtgctctgac ttctggtgtc cacactttcc ctgctgtgct gcagtctagt 540
ggactgtact ctctgtcatc tgtggtcact gtgccctctt catctctggg aacccagacc 600
tacatttgta atgtgaacca caaaccatcc aacactaaag tggacaaaaa agtggaaccc 660
aaatcctgtg acaaaaccca cacctgccca ccttgtcctg cccctgaact gctgggagga 720
ccttctgtgt ttctgttccc accaaaacca aaagataccc tgatgatctc tagaacccct 780
gaggtgacat gtgtggtggt ggatgtgtct catgaggacc ctgaggtcaa attcaactgg 840
tacgtggatg gagtggaagt ccacaatgcc aaaaccaagc ctagagagga acagtacaat 900
tcaacctaca gagtggtcag tgtgctgact gtgctgcatc aggattggct gaatggcaag 960
gaatacaagt gtaaagtctc aaacaaggcc ctgcctgctc caattgagaa aacaatctca 1020
aaggccaagg gacagcctag ggaaccccag gtctacaccc tgccaccttc aagagaggaa 1080
atgaccaaaa accaggtgtc cctgacatgc ctggtcaaag gcttctaccc ttctgacatt 1140
gctgtggagt gggagtcaaa tggacagcct gagaacaact acaaaacaac cccccctgtg 1200
ctggattctg atggctcttt ctttctgtac tccaaactga ctgtggacaa gtctagatgg 1260
cagcagggga atgtcttttc ttgctctgtc atgcatgagg ctctgcataa ccactacact 1320
cagaaatccc tgtctctgtc tcctggcaaa 1350
<210> 107
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗-IgG4 HC
<400> 107
gaagtccagc tggtcgaatc tggtggtggc ctggtccagc ctggtggatc actgagactg 60
tcctgtgctg cttctggttt caacatcaag gacacctaca tccattgggt cagacaggca 120
cctggcaagg gactggaatg ggtcgcccga atctacccta caaacggcta cactcgctac 180
gccgactccg tcaagggacg ctttaccatc tccgccgaca cctctaaaaa caccgcctac 240
ctgcaaatga atagtctgag ggccgaggat actgctgtgt actactgctc acgatgggga 300
ggcgacggct tttacgctat ggattactgg ggacagggaa ctctggtcac tgtctcgagc 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 420
tctaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcctgt gaccgtgagc 480
tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcaatcctcc 540
ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgaca gtgccctcct ccagcctggg caccaagacc 600
tacacctgta acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660
aaatacggcc ctccctgccc cccctgccct gcccctgaag cggcgggcgg accttccgtg 720
tttctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 780
tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaagat ccagaggtgc agttcaactg gtatgttgac 840
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 900
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccctcc agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1020
ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gccaggaaga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttctacc cctccgacat tgccgtggaa 1140
tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg acagtggata agtcccggtg gcaggaaggc 1260
aatgtgttct cctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagtcc 1320
ctgtccctga gcctgggcaa g 1341
<210> 108
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗LC
<400> 108
gacatccaga tgacacagtc tccctcttcc ctgtccgctt ctgtgggcga tcgagtgaca 60
atcacctgta gggctagtca ggatgtgaat actgctgttg cttggtacca gcagaaacca 120
ggaaaagccc ctaaactgct gatctactct gcctcattcc tgtactctgg ggtgccttct 180
cgattcagtg gttctagatc tggcaccgat ttcacactga ccatttcttc actgcaacct 240
gaggattttg ccacctacta ctgtcagcag cactacacaa cacctcccac atttggccag 300
ggcacaaaag tggagatcaa acggaccgtg gcggcgcctt ctgtgttcat tttcccccca 360
tctgatgaac agctgaaatc tggcactgct tctgtggtct gtctgctgaa caacttctac 420
cctagagagg ccaaagtcca gtggaaagtg gacaatgctc tgcagagtgg gaattcccag 480
gaatctgtca ctgagcagga ctctaaggat agcacatact ccctgtcctc tactctgaca 540
ctgagcaagg ctgattacga gaaacacaaa gtgtacgcct gtgaagtcac acatcagggg 600
ctgtctagtc ctgtgaccaa atccttcaat aggggagagt gc 642
<210> 109
<211> 1920
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 109
gaagtccagc tggtcgaatc tggtggtggc ctggtccagc ctggtggatc actgagactg 60
tcctgtgctg cttctggttt caacatcaag gacacctaca tccattgggt cagacaggca 120
cctggcaagg gactggaatg ggtcgcccga atctacccta caaacggcta cactcgctac 180
gccgactccg tcaagggacg ctttaccatc tccgccgaca cctctaaaaa caccgcctac 240
ctgcaaatga atagtctgag ggccgaggat actgctgtgt actactgctc acgatgggga 300
ggcgacggct tttacgctat ggattactgg ggacagggaa ctctggtcac tgtctcgagc 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 420
tctaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcctgt gaccgtgagc 480
tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcaatcctcc 540
ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgaca gtgccctcct ccagcctggg caccaagacc 600
tacacctgta acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660
aaatacggcc ctccctgccc cccctgccct gcccctgaag cggcgggcgg accttccgtg 720
tttctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 780
tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaagat ccagaggtgc agttcaactg gtatgttgac 840
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 900
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccctcc agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1020
ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gccaggaaga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttctacc cctccgacat tgccgtggaa 1140
tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg acagtggata agtcccggtg gcaggaaggc 1260
aatgtgttct cctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagtcc 1320
ctgtccctga gcctgggcaa gggcggtgga ggatccgggg gtgggggaag cggcggagga 1380
ggtagccagg actctactag tgatctgatc ccggcaccgc cactgtcaaa agtccctctg 1440
caacaaaact ttcaagacaa tcagtttcac ggcaaatggt atgtggtcgg ccaggccgga 1500
aacattaggc tgcgggagga caaggacccc atcaaaatga tggctaccat ctacgagctg 1560
aaggaagaca aatcttatga tgtgacaatg gtcaagttcg acgataagaa atgcatgtac 1620
gacatctgga ccttcgtgcc cggctcccag ccgggagagt tcaccctggg caagatcaag 1680
tccttccccg gccacacttc cagcctggtc cgcgtggtct cgaccaacta taatcagcat 1740
gctatggtgt tcttcaagtt cgtctttcag aatagagagg agttctacat cacactgtat 1800
ggacgcacca aggagctgac aagcgagctg aaagaaaact tcatcaggtt ttcaaagtcc 1860
ctggggctgc ccgaaaatca tatcgtgttc ccagtcccca tcgaccagtg tattgatggt 1920
<210> 110
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 110
gacatccaga tgacacagtc tccctcttcc ctgtccgctt ctgtgggcga tcgagtgaca 60
atcacctgta gggctagtca ggatgtgaat actgctgttg cttggtacca gcagaaacca 120
ggaaaagccc ctaaactgct gatctactct gcctcattcc tgtactctgg ggtgccttct 180
cgattcagtg gttctagatc tggcaccgat ttcacactga ccatttcttc actgcaacct 240
gaggattttg ccacctacta ctgtcagcag cactacacaa cacctcccac atttggccag 300
ggcacaaaag tggagatcaa acggaccgtg gcggcgcctt ctgtgttcat tttcccccca 360
tctgatgaac agctgaaatc tggcactgct tctgtggtct gtctgctgaa caacttctac 420
cctagagagg ccaaagtcca gtggaaagtg gacaatgctc tgcagagtgg gaattcccag 480
gaatctgtca ctgagcagga ctctaaggat agcacatact ccctgtcctc tactctgaca 540
ctgagcaagg ctgattacga gaaacacaaa gtgtacgcct gtgaagtcac acatcagggg 600
ctgtctagtc ctgtgaccaa atccttcaat aggggagagt gcggcggcgg aggatccggg 660
ggtgggggaa gcggcggagg aggtagccag gactctacta gtgatctgat cccggcaccg 720
ccactgtcaa aagtccctct gcaacaaaac tttcaagaca atcagtttca cggcaaatgg 780
tatgtggtcg gccaggccgg aaacattagg ctgcgggagg acaaggaccc catcaaaatg 840
atggctacca tctacgagct gaaggaagac aaatcttatg atgtgacaat ggtcaagttc 900
gacgataaga aatgcatgta cgacatctgg accttcgtgc ccggctccca gccgggagag 960
ttcaccctgg gcaagatcaa gtccttcccc ggccacactt ccagcctggt ccgcgtggtc 1020
tcgaccaact ataatcagca tgctatggtg ttcttcaagt tcgtctttca gaatagagag 1080
gagttctaca tcacactgta tggacgcacc aaggagctga caagcgagct gaaagaaaac 1140
ttcatcaggt tttcaaagtc cctggggctg cccgaaaatc atatcgtgtt cccagtcccc 1200
atcgaccagt gtattgatgg t 1221
<210> 111
<211> 1920
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 111
caggactcta ctagtgatct gatcccggca ccgccactgt caaaagtccc tctgcaacaa 60
aactttcaag acaatcagtt tcacggcaaa tggtatgtgg tcggccaggc cggaaacatt 120
aggctgcggg aggacaagga ccccatcaaa atgatggcta ccatctacga gctgaaggaa 180
gacaaatctt atgatgtgac aatggtcaag ttcgacgata agaaatgcat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc ccagccggga gagttcaccc tgggcaagat caagtccttc 300
cccggccaca cttccagcct ggtccgcgtg gtctcgacca actataatca gcatgctatg 360
gtgttcttca agttcgtctt tcagaataga gaggagttct acatcacact gtatggacgc 420
accaaggagc tgacaagcga gctgaaagaa aacttcatca ggttttcaaa gtccctgggg 480
ctgcccgaaa atcatatcgt gttcccagtc cccatcgacc agtgtattga tggaggaggc 540
ggaggatccg gcggaggagg aagtggcgga ggaggaagtg aagtccagct ggtcgaatct 600
ggtggtggcc tggtccagcc tggtggatca ctgagactgt cctgtgctgc ttctggtttc 660
aacatcaagg acacctacat ccattgggtc agacaggcac ctggcaaggg actggaatgg 720
gtcgcccgaa tctaccctac aaacggctac actcgctacg ccgactccgt caagggacgc 780
tttaccatct ccgccgacac ctctaaaaac accgcctacc tgcagatgaa tagtctgagg 840
gccgaggata ctgctgtgta ctactgctca cgatggggag gcgacggctt ttacgctatg 900
gattactggg gacagggaac tctggtcact gtgtctagcg ctagcaccaa gggcccctcc 960
gtgttccccc tggccccttg ctcccggtcc acctccgagt ctaccgccgc tctgggctgc 1020
ctggtgaaag actacttccc cgagcctgtg accgtgagct ggaactctgg cgccctgacc 1080
tccggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg caatcctccg gcctgtactc cctgtcctcc 1140
gtggtgacag tgccctcctc cagcctgggc accaagacct acacctgtaa cgtggaccac 1200
aagccctcca acaccaaggt ggacaagcgg gtggaatcta aatacggccc tccctgcccc 1260
ccctgccctg cccctgaagc ggcgggcgga ccttccgtgt ttctgttccc cccaaagccc 1320
aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc 1380
caggaagatc cagaggtgca gttcaactgg tatgttgacg gcgtggaagt gcacaacgcc 1440
aagaccaagc ccagagagga acagttcaac tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc 1500
gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1560
ctgccctcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggccaagg gccagccccg cgagccccag 1620
gtgtacaccc tgccccctag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt 1680
ctggtgaaag gcttctaccc ctccgacatt gccgtggaat gggagtccaa cggccagccc 1740
gagaacaact acaagaccac cccccctgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac 1800
tctcggctga cagtggataa gtcccggtgg caggaaggca atgtgttctc ctgcagcgtg 1860
atgcacgagg ccctgcacaa ccactatacc cagaagtccc tgtccctgag cctgggcaag 1920
<210> 112
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 112
caggactcta ctagtgatct gatcccggca ccgccactgt caaaagtccc tctgcaacaa 60
aactttcaag acaatcagtt tcacggcaaa tggtatgtgg tcggccaggc cggaaacatt 120
aggctgcggg aggacaagga ccccatcaaa atgatggcta ccatctacga gctgaaggaa 180
gacaaatctt atgatgtgac aatggtcaag ttcgacgata agaaatgcat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc ccagccggga gagttcaccc tgggcaagat caagtccttc 300
cccggccaca cttccagcct ggtccgcgtg gtctcgacca actataatca gcatgctatg 360
gtgttcttca agttcgtctt tcagaataga gaggagttct acatcacact gtatggacgc 420
accaaggagc tgacaagcga gctgaaagaa aacttcatca ggttttcaaa gtccctgggg 480
ctgcccgaaa atcatatcgt gttcccagtc cccatcgacc agtgtattga tggaggaggc 540
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gatgtgaata ctgctgttgc ttggtaccag cagaaaccag gaaaagcccc taaactgctg 720
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aaacacaaag tgtacgcctg tgaagtcaca catcaggggc tgtctagtcc tgtgaccaaa 1200
tccttcaata ggggagagtg c 1221

Claims (38)

1.一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)CD137/HER2双特异性试剂，其包含(i)具有SEQ ID NO:64所示的序列的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3结构域，(ii)具有SEQ ID NO:65所示的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3结构域，和(iii)具有SEQ ID NOs:21-39中任一个所示的序列的脂质运载蛋白突变蛋白，和
(b)PD-1轴抑制剂。
2.一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括：
(a)向所述受试者施用CD137/HER2双特异性试剂，其中所述受试者还接受PD-1轴抑制剂，使得所述受试者接受两种疗法，或
(b)向所述受试者施用PD-1轴抑制剂，其中所述受试者还接受CD137/HER2双特异性试剂，使得所述受试者接受两种疗法，
其中所述CD137/HER2双特异性试剂包含(i)具有SEQ ID NO:64所示的序列的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3结构域，(ii)具有SEQ ID NO:65所示的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3结构域，和(iii)具有SEQ ID NOs:21-39中任一个所示的序列的脂质运载蛋白突变蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为HER-2阳性和/或PD-L1阳性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法能够提供增强的抗肿瘤效应。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中与单独的所述CD137/HER2双特异性试剂或所述PD-1轴抑制剂相比，所述方法能够提供累加的抗肿瘤效应。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中与单独的所述CD137/HER2双特异性试剂或所述PD-1轴抑制剂相比，所述方法能够提供协同的抗肿瘤效应。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述抗肿瘤效应选自：
(a)肿瘤相关的免疫应答的刺激；
(b)IL-2分泌增加；
(c)在肿瘤微环境中IL-2分泌增加；
(d)IFN-γ分泌增加；
(e)在肿瘤微环境中IFN-γ分泌增加；
(f)CD4+T细胞的扩增；
(g)在肿瘤微环境中CD4+T细胞的扩增；
(h)CD8+T细胞的扩增；
(i)在肿瘤微环境中CD8+T细胞的扩增；
(j)肿瘤浸润淋巴细胞的扩增；
(k)NK细胞的活化和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增加；
(l)在肿瘤微环境中NK细胞的活化和ADCC增加；
(m)在肿瘤微环境中CD4水平升高；
(n)在肿瘤微环境中CD4水平降低；
(o)在肿瘤微环境中CD8水平升高；
(p)在肿瘤微环境中CD8水平降低；
(q)在肿瘤微环境中PD-L1水平升高；
(r)在肿瘤微环境中PD-L1水平降低；
(s)在肿瘤微环境中Ki67水平升高；
(t)在肿瘤微环境中Ki67水平降低；
(u)在肿瘤微环境中CD137水平升高；
(v)在肿瘤微环境中CD137水平降低；
(w)在肿瘤微环境中HER2水平升高；
(x)在肿瘤微环境中HER2水平降低；
(y)在肿瘤微环境中IL-8水平升高；
(z)在肿瘤微环境中IL-8水平降低；
(aa)在肿瘤微环境中FoxP3水平升高；
(ab)在肿瘤微环境中FoxP3水平降低；
(ac)肿瘤尺寸的减小；
(ad)肿瘤生长的抑制；
(ae)肿瘤转移的抑制；
(af)复发的延迟；或
(ag)总生存期改善。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述方法包括至少一个施用周期，其中所述周期为约3周的时间段，其中对于所述至少一个周期中的每一个周期，施用至少一剂量的所述CD137/HER2双特异性试剂并施用至少一剂量的所述PD-1轴抑制剂。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中顺序地或同时施用所述CD137/HER2双特异性试剂和所述PD-1轴抑制剂。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中以约0.05mg/kg、0.15mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg或8.0mg/kg的剂量施用所述CD137/HER2双特异性试剂。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述PD-1轴抑制剂为抗-PD-L1抗体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗-PD-L1抗体具有SEQ ID NOs:76和77所示的序列。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中以约1200mg的剂量施用所述抗-PD-L1抗体。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述PD-1轴抑制剂为抗-PD-1抗体。
15.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述PD-1轴抑制剂为具有SEQ IDNOs:72和73或SEQ ID NOs:74和75所示的序列的抗体。
16.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述PD-1轴抑制剂为阿妥珠单抗、度伐利尤单抗、阿维单抗、纳武单抗、帕博丽珠单抗、替雷利珠单抗或西米普利单抗。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中以以下剂量施用所述CD137/HER2双特异性试剂和所述PD-1轴抑制剂：
(a)约0.05mg/kg CD137/HER2双特异性试剂和约1200mg PD-1轴抑制剂，
(b)约0.15mg/kg CD137/HER2双特异性试剂和约1200mg PD-1轴抑制剂，
(c)约0.5mg/kg CD137/HER2双特异性试剂和约1200mg PD-1轴抑制剂，
(d)约1.0mg/kg CD137/HER2双特异性试剂和约1200mg PD-1轴抑制剂，
(e)约2.5mg/kg CD137/HER2双特异性试剂和约1200mg PD-1轴抑制剂，
(f)约5.0mg/kg CD137/HER2双特异性试剂和约1200mg PD-1轴抑制剂，或
(g)约8.0mg/kg CD137/HER2双特异性试剂和约1200mg PD-1轴抑制剂。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述方法包括至少一个施用周期，比如2、3、4、5、10、15、20、25和30个周期，其中所述周期为约3周的时间段。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述方法包括在每个三周周期的第一天就彼此而言顺序地施用一剂量的所述CD137/HER2双特异性试剂和一剂量的所述PD-1轴抑制剂。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述方法包括在每个周期的第1天就彼此而言顺序地施用一剂量的所述CD137/HER2双特异性试剂和一剂量的所述PD-1轴抑制剂达30个三周周期。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述CD137/HER2双特异性试剂包含经由连接子在N-末端与抗-HER2抗体的每条重链的C-末端融合的CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白。
22.根据权利要求21中任一项所述的方法，其中所述CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白具有SEQ ID NO:22所示的序列。
23.根据权利要求22中任一项所述的方法，其中所述抗-HER2抗体具有SEQ ID NOs:79和80所示的序列。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述CD137/HER2双特异性试剂具有SEQ ID NOs:81和80、SEQ ID NOs:79和82、SEQ ID NOs:83和80或SEQ ID NOs:79和84所示的序列。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述癌症为HER-2阳性晚期或转移性实体瘤。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述受试者为先前经治疗的。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述受试者为先前采用抗-HER2疗法治疗的。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述受试者为先前采用PD-1轴抑制剂疗法治疗的。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述治疗产生至少一种选自以下的效应：肿瘤特异性免疫应答的刺激、肿瘤尺寸的减小、肿瘤细胞生长的抑制、转移的抑制、完全缓解、部分缓解、疾病的稳定、复发前期限延长、生存时间延长、完全应答和部分应答。
30.一种包含CD137/HER2双特异性试剂抗体和PD-1轴抑制剂的组合，所述CD137/HER2双特异性试剂抗体包含(i)具有SEQ ID NO:64所示的序列的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3结构域，(ii)具有SEQ ID NO:65所示的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3结构域，和(iii)具有SEQ ID NOs:21-39中任一个所示的序列的脂质运载蛋白突变蛋白，
其中所述组合适合在至少一个周期中施用于受试者，
其中对于每个周期，以约0.05mg/kg、0.15mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg或8.0mg/kg的剂量施用所述CD137/HER2双特异性试剂，和以约1200mg的剂量施用所述抗-PD-L1轴抑制剂。
31.根据权利要求30所述的组合，其中顺序地或同时施用所述CD137/HER2双特异性试剂和所述抗-PD-L1抗体。
32.根据权利要求30或31所述的组合，其中所述组合可用于治疗HER2阳性和/或PD-L1阳性肿瘤。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的组合，其中所述组合可产生增强的抗肿瘤效应。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的组合，其中与单独的所述CD137/HER2双特异性试剂或所述PD-1轴抑制剂相比，所述组合可产生累加的抗肿瘤效应。
35.根据权利要求30-33中任一项所述的组合，其中与单独的所述CD137/HER2双特异性试剂或所述PD-1轴抑制剂相比，所述组合可产生协同的抗肿瘤效应。
36.一种成套试剂盒，包含：
(a)一种包含CD137/HER2双特异性试剂抗体的药物组合物，所述CD137/HER2双特异性试剂抗体包含(i)具有SEQ ID NO:64所示的序列的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3结构域，(ii)具有SEQ ID NO:65所示的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3结构域，和(iii)具有SEQ ID NOs:21-39中任一项所示的序列的脂质运载蛋白突变蛋白；和
(b)一种包含PD-1轴抑制剂的药物组合物。
37.根据权利要求36所述的成套试剂盒，其中所述CD137/HER2双特异性试剂为约0.05mg/kg、0.15mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg或8.0mg/kg的单位剂量，和所述抗-PD-L1轴抑制剂为约1200mg的单位剂量。
38.根据权利要求36或37所述的成套试剂盒，其中所述包含CD137/HER2双特异性试剂的药物组合物和所述包含PD-1轴抑制剂的药物组合物能够产生累加的或协同的抗肿瘤效应。
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