KR20210052468A - Cd137/her2 이중특이적 제제 및 pd-1 축 억제제를 포함하는 조합물 치료요법 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 개시는 이전에 치료된 특이적 HER2-양성 진행성 또는 전이성 고형 종양을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시는 HER2-양성 진행성 또는 전이성 고형 종양을 갖는 개체에서 면역 반응을 향상시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 방법은 CD137 및 HER2를 표적화하는 PD-1 축 억제제 및 이중특이적 제제를 투여하는 것을 포함한다.

Description

CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물 치료요법 및 이의 용도

본 개시는, 무엇보다도, CD137/HER2 이중특이적 제제 및PD-1 축 억제제를 포함하는 신규한 치료적 조합물 및 상기 조합물을 사용하여 HER2-양성 진행성 또한 전이성 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다.

4-1BB로도 알려진, CD137은 공동자극 면역 수용체이며 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 수퍼-패밀리의 구성원이다. CD137는 면역 반응 조절에 중요한 역할을 하므로 암 면역치료요법의 타겟이 된다. CD137 리간드 (CD137L)는 CD137의 유일한 천연 리간드이며 활성화된 B 세포, 단핵구, 및 맹장 수지상 세포와 같은 몇 가지 유형의 항원 제시 세포 (APCs)에서 구성적으로 발현되며, T 림프구에서 유도될 수 있다.

암 치료요법에서 CD137 공동자극의 잠재력은 많은 전임상 연구들에서 입증되었다 - 작용제 항-CD137 항체들의 투여는 종양 퇴행을 달성하고 (Vinay and Kwon, Mol Cancer Ther, 2012, Bartkowiak and Curran, Front Oncol, 2015) 결과적인 CD137 신호는 독성 T 림프구의 아네르기를 중단하고 역전시키는 것으로 나타났다 (Williams et al., J Exp Med, 2017, Wilcox et al., Blood, 2004). 두 가지 작용제 항체인, 우렐루맙(urelumab) 및 유토밀루맙(utomilumab)의 임상시험이 진행 중이지만, 우렐루맙은 1 mg/kg 이상의 용량에서 상당한 독성을 갖는 반면, 유토밀루맙은 덜 강력하고 잠재적인 효능 문제가 있기 때문에 두 가지 모두 심각한 문제를 나타낸다 (Tolcher et al., Clin Cancer Res, 2017, Segal et al., Clin Cancer Res, 2018, Sznol et al., Journal of Clinical Oncology, 2008).　또한, CD137의 발현은 종양 침윤 림프구에 국한되지 않기 때문에, 우렐루맙 또는 유토밀루맙 단일치료요법은 CD137 작용성(agonism)을 종양 미세환경으로 제한하지 못할 수 있으므로 CD137 클러스터링 및 비-국지적 방식으로 활성화될 수 있다 (Makkouk et al., Eur J Cancer, 2016, Alizadeh et al., Blood, 2011). 따라서, 안전하면서도 효과적인 항-CD137 치료요법이 필요하다. 또한, 다른 체크포인트 면역요법 또는 종양-표적 치료요법과 조합하여 CD137를 타겟으로 하는 것이 평가되고 있지만, 이러한 치료요법을 조합하면 증가된 전신 면역 활성화를 포함하여, 원하지 않는 부작용의 위험이 증가할 수 있다. 따라서, CD137을 타겟으로 하고 안전하면서도 효과적인 조합 면역치료요법이 필요하다.

세포예정사 단백질 1(Programmed cell death protein 1), 또는 PD-1 (또한 분화 클러스터 279 또는 CD279로 알려짐)는 분화 클러스터 28 (CD28) 유전자 패밀리의 구성원이며 활성화된 T, B, 및 골수 계통 세포에서 발현된다 (Sharpe et al., Nat Immunol, 2007, Greenwald et al., Annu Rev Immunol, 2005). PD-1은 세포예정사 1 리간드1 (PD-L1) 및 세포예정사 1 리간드 2 (PD-L2)의 두 리간드와 상호작용한다. 이러한 리간드와 PD-1의 상호작용은 과도하게-활동적인 T 세포를 국소적으로 제한함으로써 면역 시스템을 하향조절하는 데 중요한 역할을 하며, 이는 차례로 자가면역을 방지하고 정상 조직에서 감염 또는 염증 중의 말초 내성을 유지한다 (Sharpe et al., Nat Immunol, 2007, Greenwald et al., Annu Rev Immunol, 2005).

많은 암에서, PD-1은 종양-침윤 림프구 (TILs)에 의해 발현되며 숙주 항-종양 면역과 관련이 있다 (Galon et al., Science, 2006). 다중 라인의 증거는 TIL이 PD-1 억제 조절 대상이고 관찰되는 항-종양 면역이 PD-1/PD-L1 신호에 의해 조절된다는 것을 나타낸다. 첫째, PD-L1 발현은 여러 인간 및 마우스 종양 라인에서 발현된다 (Dong et al., Nat Med, 2002). 둘째, 종양 세포에 의한 PD-L1의 발현은 시험관내(in vitro) 항-종양 T 세포에 의한 용해 저항성과 직접적인 관련이 있다 (Blank et al., Cancer Res, 2004, Dong et al., Nat Med, 2002). 셋째, PD-1 녹아웃(knockout) 마우스는 종양 공격에 내성이 있고 (Iwai et al., Int Immunol, 2005) PD-1 녹아웃 마우스 유래 T 세포는 종양-보유 마우스로 채택되어 전달될 때 종양 거부에 매우 효과적이다 (Blank et al., Cancer Res, 2004). 넷째, PD-1 단일클론 항체에 의한 PD-1 억제 신호 차단은 마우스에서 숙주 항-종양 면역을 강화할 수 있다 (Hirano et al., Cancer Res, 2005, Iwai et al., Int Immunol, 2005). 다섯째, 종양에서 높은 PD-L1 발현 수치 (면역조직화학적 염색에 의해 검출됨)는 많은 인간 암 유형의 나쁜 예후와 관련이 있다 (Hamanishi et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2007). 따라서, PD-1및 PD-L1을 타겟하는 단일클론 항체는 다양한 암 유형에서 임상적 이점을 입증했으며, 니볼루맙, 펨브로리주맙, 및 아테졸리주맙을 포함한 일부는 미국 식품의약국 (FDA)의 승인을 받았다 (Topalian et al., Cancer Cell, 2015). 그러나, 소수의 암 환자만이 항-PD-1/PD-L1 치료요법에 반응하고 1차 및 후천적 내성 모두 항-PD-1/PD-L1 치료요법의 주요 장애물이 되어, 장기간-지속되는 효과 및 광범위한 적용을 제한한다 (Bu et al., Trends Mol Med, 2016, Bai et al., Oncotarget, 2017).

면역치료요법에 반응하는 환자의 비율을 높이고 치료 저항성을 극복하기 위해, 예컨대, 다른 면역 치료요법 또는 타겟된 치료요법과 조합하여 면역 체크포인트 치료의 임상적 이점의 극대화가 필요하다. 그러나, 수많은 전임상 연구들이 수행되고 면역치료요법 조합의 잠재력이 입증되었지만, 이러한 조합은 예들 들어, 항-PD-1/PD-L1 치료요법 및 항-CTLA-4 치료요법의 조합으로 알 수 있듯이, 실질적인 증분의 독성을 초래할 수 있으며, 직면한 독성을 극복하기에 충분한 임상 반응을 산출하지 않는다 (Shoushtari et al., JAMA Oncol, 2018, Haanen et al., Ann Oncol, 2017). 또한, 특이적 면역치료요법 조합의 경우, 약물 투여 시기와 순서를 최적화하여 효능과 안전성을 획득하고 다양한 환자의 반응을 고려할 때 개체가 특정 조합에 어떻게 반응할지 예측하기 위해 더 나은 생물학적 마커 (바이오마커)를 식별해야 한다.

HER2, 또는 HER2/neu는, 인간 상피 성장 인자 수용체 패밀리의 구성원이다. 이 종양 유전자의 증폭 또는 과발현은 특정 공격적 유형의 유방암을 비롯한 다양한 종양의 발생 및 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. HER2는 건강한 조직에 비해 세포-표면 밀도가 훨씬 높은 종양세포에서, 매우 차별적으로 발현되는 것으로 나타났다. 항-HER2 타겟 치료요법은 초기 단계 또는 전이성 HER2(+) 유방암 환자 집단 일부에서는 효과적이지만, 난치성이거나 진행성 암 환자 사이에서의 반응율은 차선책이다. 예를 들어, 화학치료요법과 항-HER2 치료요법을 함께 사용하여 임상 시험한 경우 객관적인 반응율이 50　%에 불과하다 (Slamon et al., N Engl J Med, 2001). 따라서, HER2 양성 암 환자를 위한 더 나은 타겟 치료요법이 필요하다.

본 개시는, 무엇보다도, CD137/HER2 이중특이적 제제 및PD-1 축 억제제를 포함하는 신규한 치료적 조합물 및 상기 조합물을 사용하여 HER2-양성 진행성 또한 전이성 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다.

정의

다음의 목록은 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어, 어구, 및 약어를 정의한다. 본 명세서에서 열거되고 정의된 모든 용어는 모든 문법적 형태를 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, "CD137"은 인간 CD137 (huCD137)을 의미한다. 인간 CD137은 UniProt Q07011에 의해 정의된 전장 단백질(full-length protein), 이의 단편, 또는 이의 변이체를 의미한다. CD137는 또한 4-1BB, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리의 구성원 9 (TNFRSF9), 및 림프구 활성화에 의한 유도 (ILA)라고도 한다. 일 구체예에서, 비-인간 종의 CD137, 예컨대, 게먹원숭이 CD137 및 마우스 CD137가 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, “HER2”는 인간 HER2 (huHER2)를 의미한다. 인간 Her 2는 UniProt P04626에 의해 정의된 전장 단백질, 이의 단편, 또는 이의 변이체를 의미한다. HER2는 또한 인간 표피 성장 인자 수용체 2, HER2/neu, 수용체 티로신-단백질 키나아제 erbB-2, 분화 클러스터 340 (CD340), 원-종양유전자 Neu, ERBB2 (인간), Erbb2 (설치류), c-neu, 또는 p185라고도 한다. 인간 HER2는 ERBB2 유전자에 의해 암호화된다. 일 구체예에서, 비-인간 종의 HER2, 예컨대, 게먹원숭이 HER2 및 마우스 HER2가 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, “세포예정사 단백질 1” 또는 “PD-1”은 인간 PD-1 (huPD-1)을 의미한다. 인간 PD-1은 UniProt Q15116에 의해 정의된 전장 단백질, 이의 단편, 또는 이의 변이체를 의미한다. 인간 PD-1은 PDCD1 유전자에 의해 암호화된다. PD-1은 또한 분화 클러스터 279 또는 CD279라고도 한다. 일 구체예에서, 비-인간 종의 PD-1, 예컨대, 게먹원숭이 PD-1 및 마우스 PD-1이 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, “세포예정사 1 리간드” 또는 “PD-L1”는 인간 PD-L1 (huPD-L1)을 의미한다. 인간 PD-L1은 UniProt Q9NZQ7에 의해 정의된 전장 단백질, 이의 단편, 또는 이의 변이체를 의미한다. 인간 PD-L1은 CD274 유전자에 의해 암호화된다. PD-L1은 또한 분화 클러스터 274 (CD274) 또는 B7 동족체(homolog) 1 (B7-H1)라고도 한다. 일 구체예에서, 비-인간 종의 PD-L1, 예컨대, 게먹원숭이 PD-L1 및 마우스 PD-L1이 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “PD-1 축 억제제” 또는 “축 길항제(antagonist)”는 PD-1-매개 신호를 감소, 차단, 억제, 또는 방해하여 PD-1 축의 활성화로 인한 T 세포 기능장애(dysfunction) 및 면역 억제를 완화하고 T 세포 기능을 회복하거나 또는 향상시키는 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “PD-1/PD-L1 축 억제제” 또는 “축 억제제”는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용 및 그에 따른 신호 경로를 감소, 차단, 억제, 또는 방해하여, PD-1 축의 활성화로 인한 T 세포 기능장애 및 면역 억제를 완화하고 T 세포 기능을 회복하거나 또는 향상시키는 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “억제제” 또는 “길항제”는 PD-L1, PD-L2와 같은, PD-1의 하나 이상의 결합 파트너와의 상호작용 및 그에 따른 신호 경로를 감소, 차단, 억제, 방해하는 분자를 지칭한다. 일 구체예에서, PD-1 억제제는 하나 이상의 PD-1 결합 파트너, 바람직하게는 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합과 경쟁할 수 있다. 다른 실시예에서, PD-1 억제제는 하나 이상의 PD-1 결합 파트너, 바람직하게는 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합과 경쟁하지 않을 수 있다. 일 실시예에서, PD-1 억제제는, PD-1과 같은 T 림프구에서 발현되는 세포 표면 단백질에 의해서 또는 통해서 매개되는 음성 공동자극 신호를 감소시킬 수 있다. PD-1 억제제는, PD-L1 및 PD-L2와 같은, 하나 이상의 PD-1 결합 파트너와의 상호작용 및 그에 따른 신호 경로를 감소, 차단, 억제, 또는 방해하는 항-PD-1 항체 및 이의 항원 결합 단편, 면역접합체(immunoadhesin), 융합 단백질, 올리고펩타이드, 및 다른 분자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 실시예에서, PD-1 억제제는 펨브로리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, MK-3475, MEDI-0680, PDR001, REGN2810, BGB-108과 같은, 항-PD-1 항체이거나 이를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “억제제” 또는 “길항제”는 PD-1 및 B7.1과 같은, PD-L1의 하나 이상의 결합 파트너와의 상호작용 및 그에 따른 신호 경로를 감소, 차단, 억제, 방해하는 분자를 지칭한다. 일 실시예에서, PD-L1 억제제는 하나 이상의 PD-L1 결합 파트너, 예컨대 PD-1 및 B7.1의 결합과 경쟁할 수 있다. 다른 실시예에서, PD-L1 억제제는 하나 이상의 PD-L1 결합 파트너, 예컨대 PD-1 및/또는 B7.1의 결합과 경쟁하지 않을 수 있다. 일 실시예에서, PD-L1 억제제는 PD-L1과 하나 이상의 PD-L1 결합 파트너의 결합에 의해 매개되는 억제 신호를 감소시킬 수 있다. 일 실시예에서, PD-L1 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 및 BMS-936559와 같은, 항-PD-L1 항체이거나 이를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “PD-L2 억제제” 또는 “길항제”는 PD-1과 같은, PD-L2의 하나 이상의 결합 파트너와의 상호작용 및 그에 따른 신호 경로를 감소, 차단, 억제, 방해하는 분자를 지칭한다. 일 실시예에 있어서, PD-L2 억제제는 하나 이상의 PD-L2 결합 파트너, 예컨대 PD-1의 결합과 경쟁할 수 있다. 다른 실시예에서, PD-L2 억제제는 하나 이상의 PD-L2 결합 파트너, 예컨대 PD-1의 결합과 경쟁하지 않을 수 있다. 일 실시예에서, PD-L2 억제제는 PD-L1과 하나 이상의 PD-L1 결합 파트너의 결합에 의해 매개되는 억제 신호를 감소시킬 수 있다. 일 실시예에서, PD-L2 억제제는 항-PD-L2 항체이거나 이를 포함할 수 있다.

용어 “항-”은, 단백질 타겟에 결합할 수 있거나 및/또는 단백질 타겟의 하나 이상의 생물학적 기능을 조절할 수 있는 분자를 의미하는, 관심 단백질 타겟 (예컨대, CD137, PD-1, PD-L1, 또는 HER2)과 연관된 분자를 설명할 때 사용된다. 예를 들어, 본원에 기재된 “항-CD137” 분자는, CD137에 결합할 수 있거나 및/또는 CD137의 하나 이상의 생물학적 기능을 조절할 수 있다. 단백질 타겟의 “생물학적 기능”은 예컨대, 결합 파트너(들)과 결합하고 신호 경로(들)을 조절하는, 생물학적 미션(들)을 수행하는 단백질 타겟의 능력을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, T 세포와 관련하여 사용될 때 “기능장애(dysfunction)” 또는 “기능장애적인”은, 변경된 활성화 및 분화 과정의 결과로서 T 세포의 기능장애적인 상태를 지칭한다. 고갈(exhaustion), 내성(tolerance), 및 아네르기를 포함하는 용어를 사용하여 기능장애적인 상태를 설명할 수 있다. 면역 시스템과 관련하여 사용될 때, “기능장애”는 면역 시스템 구성요소의 이상(abnormality) 및/또는 과도하거나 또는 불충분한 면역 반응에 의해 특징화되는 면역 시스템의 상태를 지칭한다. 면역 시스템의 기능장애적인 상태는 항원 인식에 대해 무반응이거나 또는 불응성이고 항원 인식을 다운스트림 T-세포 이펙터 기능, 예컨대 증식, 사이토카인 (예컨대, IL-2) 생성, 및 타겟 세포 사멸로 변환하는 것에 대한 손상된 능력을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “아네르기(anergy)” 또는 “아네르기의”는 면역 시스템이 항원에 대해 정상적인 면역 반응을 일으킬 수 없는 상태를 지칭한다. T 세포 아네르기는 T 세포 수용체 (TCRs)를 통해 전달되는 불완전하거나 또는 불충분한 신호로 인해 유발될 수 있다. 공동자극의 부재에서 T 세포가 TCR 신호를 수신할 때 T 세포 아네르기가 유발될 수 있으며, 그 결과 공동자극의 맥락에서도 세포가 항원에 의한 차후 활성화에 대해 불응성이 된다. 일 실시예에서, 아네르기 T 세포는 클론 확장을 거치지 않고 및/또는 이펙터 기능을 획득하지 않는다. 일 실시예에서, 본원에 기술된 바와 같이 아네르기 상태는 IL-2의 존재에 의해 무시될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “고갈(exhaustion)” 또는 “T 세포 고갈”은 지속적인 TCR 신호로부터 발생하는 T 세포 기능장애 상태를 지칭한다. 고갈은 외적 음성 조절 경로(extrinsic negative regulatory pathways) (예컨대, 면역조절 사이토카인)뿐만 아니라, 세포 내적 음성 조절 모두에서 발생할 수 있다. 이는 불량한 이펙터 기능, 억제 수용체의 지속적인 발현, 및/또는 기능적 이펙터 또는 기억 T 세포와 구별되는 전사 상태에 의해 특징화될 수 있다. 일 실시예에서, 아네르기는 불완전하거나 또는 결함이 있는 신호에 의해 발생하지만, 고갈은 지속적인 TCR 자극에 의해 발생한다는 점에서 아네르기와 다르다. 일 실시예에서, 고갈은 많은 만성 감염 및 암에서 발생할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “내성”은 “중추 내성” 및 “말초 내성”을 포함한다. “중추 내성”은 발달중인 T 또는 B 림프구를 제거하는 과정을 지칭한다. 일 실시예에서, 상기 과정은 면역 시스템이 자가 펩타이드를 공격하지 않도록 보장할 수 있다. “말초 내성”은 면역 말초에서 발생하는 중심 내성 이후의 면역학적 내성의 두 번째 분지를 지칭한다. 일 실시예에서, 말초 내성은 중추 내성을 벗어난 자가-반응성 T 및 B 세포가 자가면역을 유발하지 않도록 보장할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “억제 신호”는 T 세포 사이토카인 생성 및/또는 이펙터 기능의 억제를 유도하는, 공동-억제 분자에 의해 T 세포로 형질도입된 신호를 지칭한다. "자극 신호"는 TCR 관여 후 공동자극 분자에 의해 T ?로 형질도입된 신호를 지칭하며, 이는 활성화된 T 세포를 아네르기로부터 구하고 및/또는 완전한 활성화가 발생하도록 허용한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “T-세포 기능 회복”, “T-세포 활성 향상”, “T 세포 활성화”, 또는 “T-세포 반응 자극”은 T 세포가 지속되거나 또는 증폭된 생물학적 기능을 갖도록 유도, 유발, 또는 자극하거나, 또는 고갈되거나 또는 비활성화된 T 세포를 재개하거나 또는 재활성화하는 것을 지칭한다. 향상된 T-세포 활성의 예시적인 징후는: CD8⁺　T 세포로부터 증가된 INF-감마 분비, 증가된 증식, 및/또는 이러한 중재 전 수준에 비해 증가된 항원 반응성 (예컨대, 바이러스, 병원균, 및 종양 제거)을 포함할 수 있다. 이러한 향상을 측정하는 방법은 당업자에게 알려져 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “상승효과(synergy)” 또는 “상승적인”은 두 가지 이상의 물질, 약, 또는 다른 제제의 상호작용 또는 협력을 통해 개별 효과의 합보다 더 큰 결합된 효과를 생성하는 것을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “암” 및 “암성(cancerous)”은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장에 의해 특징화되는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭한다. “종양”은 하나 이상의 암에 걸린 세포를 포함할 수 있다.

용어 “전이성”은 암 세포가 처음 형성된 곳에서 떨어져 나와 혈액 또는 림프 시스템을 통해 이동하고, 및/또는 신체의 다른 부분에 새로운 종양 (전이성 종양)을 형성하는 암 상태를 지칭한다. "진행성" 암은 국소 침범 또는 전이에 의해, 기원 부위 또는 기관 외부로 퍼진 암이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “항-종양 제제“는 종양, 특히 악성 종양 (암성)에 작용할 수 있으며, 바람직하게는 항-종양 효과 또는 항-종양 활성을 갖는다. “항-종양 효과” 또는 “항-종양 활성”은 종양, 특히 악성 종양에 대한 항-종양 제제의 작용을 지칭하며, 상기 작용은 종양-특이적 면역 반응의 자극, 종양 크기의 감소, 종양 세포 성장의 억제, 전이의 억제, 완전 완화, 부분 완화, 질병의 안정화, 재발 전 기간의 연장, 환자 생존 시간의 연장, 또는 환자의 삶의 질 개선을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “치료하다” 또는 “치료”는 생리학적 상태 또는 장애 또는 임상 병리의 과정 동안 치료되는 개체 또는 세포의 자연 과정을 변경하도록 설계된 임상 개입을 지칭한다. “치료”는 치료적 처우 및 예방적(prophylactic) 또는 예방적(preventative) 조치 모두를 지칭하며, 치료의 목적은 암과 같은 다증식성 상태의 성장, 발달 또는 확산과 같은 원하지 않는 생리적 변화 또는 장애를 예방하거나 또는 늦추는 것 (감소)하는 것이다. 바람직한 치료 효과는 질병 진행 속도, 질병 상태 개선 또는 완화, 증상 온화, 질병 상태 안정화 또는 악화 방지, 검출 가능 여부에 관계없이 개선된 예후의 완화를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한 바람직한 치료의 효과는 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 연장시키는 것을 포함한다. 치료가 필요한 대상체는 이미 상태 또는 장애가 있거나 또는 상태 또는 장애를 갖기 쉽거나 또는 상태 또는 장애가 예방되어야 하는 대상체를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "조합물(combination)", "와 조합하여(in combination with)", 또는 "와 함께(in conjunction with)"는 다른 물질, 약물, 또는 다른 제제 이외에 또다른 물질, 약물, 또는 다른 제제를 투여하는 것과 관련된다. 물질, 약물, 또는 다른 제제의 투여는 다른 것의 투여 전, 투여 중, 또는 투여 후일 수 있다.

"유효량"은 유익하거나 원하는 결과를 얻기에 충분한 양이다. 예를 들어, 유효량은 원하는 수준의 치료요법에 대한 면역 반응을 향상시키거나 또는 감소시키기에 충분한 양이다. 치료요법의 결과 (예컨대, 억제되거나 결핍된 면역 반응의 활성화, 증가된 T 세포의 세포용해 활성, 증가된 T 세포 이펙터 기능, 또는 종양 성장의 감소)는 당업계에 공지된 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 유효량은 하나 이상의 개별 투여 또는 용량으로 투여될 수 있다. 유효량은 다른 제제와 함께 단독으로 또는 하나 이상의 추가 제제와 함께 조합되어 투여될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “항체”는 전체 항체 또는 임의의 항원 결합 단편 (즉, “항원-결합 부분”) 또는 이의 단일 사슬을 포함한다. 전체 항체는 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 중쇄 (HCs) 및 2개의 경쇄 (LCs)를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 도메인 (V_H 또는 HCVR) 및 중쇄 불변 영역 (C_H)으로 구성된다. 상기 중쇄 불변 영역은 C_H1, C_H2 및 C_H3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 도메인 (V_L 또는 LCVR) 및 경쇄 불변 영역 (C_L)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 C_L로 구성된다. V_H 및 V_L 영역은 프레임 워크 영역 (FRs)이라 불리는, 보다 보존된 영역이 배치된 상보성 결정 영역 (CDRs)이라 하는, 초가변(hypervariability) 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각 V_H 및 V_L은 3개의 CDRs 및 4개의 FRs로 구성되며, 아미노-말단에서 카복시-말단까지의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항원 (예를 들어, PD-L1)과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포 (예컨대, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 첫 번째 성분 (C1q)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린(immunoglobulin)의 결합을 임의대로 매개할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 항체의 “항원-결합 도메인” 또는 “항원-결합 단편”은 항원 (예컨대, PD-1 또는 PD-L1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다고 밝혀졌다. 항체의 “항원-결합 단편”이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) V_H, V_L, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성되는 Fab 단편; (ii) 힌지 영역(hinge region)에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 F(ab')2; (iii) V_H, V_L, C_L 및 C_H1 도메인 및 C_H1과 C_H2 도메인 사이의 영역으로 구성된 Fab' 단편; (iv) V_H 및 C_H1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (v) 항체의 단일 팔(single arm)의 V_H 및 V_L 도메인으로 구성된 단일-사슬 Fv 단편; (vi) V_H 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., Nature, 1989); (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 둘 이상의 단리된 CDRs의 조합; (viii) 짧은 링커를 사용하여 동일한 폴리펩타이드 사슬에 연결된 V_H 및 V_L을 포함하는 “디아바디(diabody)” (예컨대, 특허 문헌 EP 404,097; WO 93/11161; 및 Holliger et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1993 참조); (ix) 일부의 경우 둘 이상의 V_H 영역이 공유 결합된, V_H 또는 V_L 만을 함유하는 “도메인 항체 단편”이 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 항체의 “항원 결합 단편”은 항원 (예컨대, PD-L1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다고 밝혀졌다. 항체의 “항원-결합 단편”이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) V_H, V_L, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성되는 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 F(ab')2; (iii) V_H, V_L, C_L 및 C_H1 도메인 및 C_H1과 C_H2 도메인 사이의 영역으로 구성된 Fab' 단편; (iv) V_H 및 C_H1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (v) 항체의 단일 팔(single arm)의 V_H 및 V_L 도메인으로 구성된 단일-사슬 Fv 단편; (vi) V_H 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., Nature, 1989); (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 둘 이상의 단리된 CDRs의 조합; (viii) 짧은 링커를 사용하여 동일한 폴리펩타이드 사슬에 연결된 V_H 및 V_L을 포함하는 “디아바디(diabody)” (예컨대, 특허 문헌 EP 404,097; WO 93/11161; 및 Holliger et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1993 참조); (ix) 일부의 경우 둘 이상의 V_H 영역이 공유 결합된, V_H 또는 V_L 만을 함유하는 “도메인 항체 단편”이 포함된다.

항체는 다중클론 또는 단일클론; 이종(xenogeneic), 동종(allogeneic), 또는 동계(syngeneic); 또는 이의 변형된 형태 (예컨대, 인간화, 키메라, 또는 다중특이)일 수 있다. 또한 항체는 완전한 인간 항체일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “프레임워크” 또는 “FR”은 초가변영역 (CDR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다.

“단편 결정화 영역(Fragment crystallizable region) 또는 “영역”은 고유-서열(native-sequence) Fc 영역 및 변이 Fc 영역을 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다를 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226, 또는 Pro230의 아미노산 잔기로부터 Kabat의 EU 색인 (Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000)에 따라 번호매김된 카복실-말단까지 확장된 것으로 정의된다. 예를 들어, 항체의 생산 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 Fc 영역의 C-말단 라이신 (Kabat의 EU 색인에 따른 447 잔기)이 제거될 수 있다. 따라서, 온전한 항체 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 있는 항체와 없는 항체의 혼합물은 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체에 사용하기 적합한 고유-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3, 및 IgG4를 포함한다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된 항체"는 자연 환경이 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 단리된 항체는 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 및 다른 단백질이 실질적으로 없는 것이다. "단리된 항체"는 또한 다른 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체는 지칭한다. 본 발명의 경우, PD-L1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 PD-L1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다. 그러나, PD-L1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종의 PD-L1 분자와 같은, 다른 항원과 교차-반응성을 가질 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “단일클론 항체”는 단일 분자 조성의 항체 분자 제제를 지칭한다. 단일클론 항체 조성은 특정 에피토프(epitope)에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성(affinity)을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “인간화 항체”는 이간 이외의 포유류로부터 유래된 항체의 CDR, 및 인간 항체 또는 인간 항체로부터 유래된 FR 영역 및 불변 영역으로 구성된 항체를 지칭한다. 일 실시예에서 인간화 항체는 Ehrenmann et al. (2010)에 기술된 바와 같이, 전체로서 분석되는, 가변영역 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하며, 이는 Immunogenetics Information System (IMGT) DomainGapAlign tool를 사용하여 평가된 바와 같이 다른 종보다 인간에 더 가깝다. 일 실시예에서, 인간화 항체는 감소된 항원성(antigenicity)으로 인해 치료제의 유효 성분으로서 유용할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “치료제(therapeutic agent)” 또는 “치료적 활성제”는 치료적으로 유용한 제제를 지칭한다. 치료제는 질병, 생리적 상태, 증상의 예방, 개선, 또는 치료를 위하거나, 또는 이의 평가 또는 진단을 위한 임의의 제제일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “인간 항체”는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 인간 생식세포계열(germline) 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변영역을 갖는 항체를 포함한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유한다면, 불변 영역 또한 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 것이다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 가질 수 있다 (예컨대, 시험관내 무작위 또는 위치-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같이, “인간 항체”는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열이 있는 항체가 인간 프레임워크 서열에 이식된 것임을 포함하려는 의도가 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이 항체와 관련된 용어 “이펙터 기능”은 항체 아이소타입(isotype)에 따라 변하는 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예로는: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포 식균작용 (ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체의 하향 조절 (예컨대, B 세포 수용체), 및 B 세포 활성화가 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리포칼린(lipocalin)"은 한쪽 말단에서 리간드-결합 포켓을 포함하고 리간드-결합 포켓의 입구를 정의하는 다수의 루프 (바람직하게는 4개)에 의해 쌍으로 연결된 다수의 β 가닥 (바람직하게는 A 내지 H로 지정된 8개의 β 가닥)을 포함하는 실린더형 β-병풍구조의 초2차 구조 영역(cylindrical β-pleated sheet supersecondary structural region)을 갖는 약 18-20 kDa 중량의 단량체 단백질을 지칭한다. 바람직하게는 본 발명에서 사용되는 리간드-결합 포켓을 포함하는 상기 루프는 β-가닥 A 및 B, C 및 D, E 및 F, G 및 H의 오픈 말단(open ends)을 연결하는 루프이며, 지정된 루프 AB CD EF 및 GH이다. 단단한 리포칼린 스캐폴드와는 다른 상기 루프의 다양성은 리포칼린 패밀리 구성원들 사이의 다양한 다른 결합 모드를 야기하며, 각각은 다른 크기, 모양, 및 화학적 특성의 타겟을 수용할 수 있다는 것이 잘 알려져 있다 (예컨대 Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996에서 검토되었다). 단백질의 리포칼린 패밀리는 자연적으로 진화하여 광범위한 리간드에 결합하며, 비정상적으로 낮은 수준의 전반적인 서열 보존 (종종 20% 미만의 서열 동일성을 가짐)을 공유하면서도 고도로 보존된 폴딩 패턴을 유지하는 것으로 이해된다. 다양한 리포칼린에서 위치 사이의 관련성 역시 당업자에게 잘 알려져 있다 (예컨대, U.S. Patent No. 7,250,297 참조). 본원에서 사용되는 바와 같이 “리포칼린”의 정의에 속하는 단백질은, 눈물 리포칼린(tear lipocalin) (Tlc, Lcn1), 리포칼린-2 (Lcn2) 또는 호중구 젤라티나아제-연관 리포칼린 (NGAL), 아포리포단백질 D (ApoD), 아포리포단백질 M, α₁-산 글리코단백질 1, α₁-산 글리코단백질 2, α₁-마이크로글로불린, 보체 성분 8γ, 레티놀-결합 단백질 (RBP), 부고환 레티노산-결합 단백질, 글리코델린(glycodelin), 후각(odorant)-결합 단백질 IIa, 후각-결합 단백질 IIb, 리포칼린-15 (Lcn15), 및 프로스타글란딘 D 합성효소를 포함하는 인간 리포칼린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "리포칼린-2" 또는 "호중성 젤라티나아제-연관 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)"은 인간 리포칼린-2 (hLcn2) 또는 인간 호중구 젤라티나아제-연관 리포칼린 (hNGAL)을 지칭하며 또한 성숙한 인간 리포칼린-2 또는 성숙한 인간 호중구 젤라티나아제-연관 리포칼린을 지칭한다. 단백질을 특정화하기 위해 사용될 때 용어 "성숙한(mature)"은 신호 펩타이드가 근본적으로 없는 단백질을 의미한다. 본 개시 내용의 "성숙한 hNGAL"은 신호 펩타이드가 없는, 인간 호중구 젤라티나아제-연관 리포칼린의 성숙한 형태를 지칭한다. 성숙한 hNGAL은 수탁번호(Accession Number) P80188로 SWISS-PROT Data Bank에 기탁된 서열의 21-198 잔기에 의해 설명되며, 이의 아미노산은 서열번호: 1로 표시된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "고유 서열(native sequence)"은 제조 방식에 관계없이, 자연적으로 발생하거나 또는 야생-형 서열을 갖는 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 고유 서열 단백질 또는 폴리펩타이드는 자연으로부터 단리될 수 있거나 또는 재조합 또는 합성 방법과 같은, 다른 수단에 의해 생산될 수 있다.

"고유 서열 리포칼린(native sequence lipocalin)"은 자연에서 유래된 해당 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 리포칼린을 지칭한다. 따라서, 고유 서열 리포칼린은 임의의 유기체, 특히, 포유동물로부터 각각의 자연-발생 (야생형) 리포칼린의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 리포칼린과 관련하여 사용될 때 용어 “고유 서열”은 구체적으로 리포칼린의 자연-발생 절단 또는 분비된 형태, 대안적으로 리포칼린의 슬라이싱 형태 및 자연-발생 대립유전자 변이체와 같은 자연-발생 변이체 형태를 포함한다. 본원에서 용어 “고유 서열 리포칼린” 및 “야생형 리포칼린(wild-type lipocalin)”은 상호교환적으로 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "뮤테인", "돌연변이된" 개체(entity) (단백질 또는 핵산), 또는 "돌연변이"는 자연-발생 (야생형) 단백질 또는 핵산과 비교하여, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 교환, 결실, 또는 삽입을 지칭한다. 또한 상기 용어는 본원에 기재된 바와 같이 뮤테인 단편을 함유한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 개시는 한쪽 말단에서 리간드-결합 포켓을 포함하고 리간드-결합 포켓의 입구를 정의하는 4개의 루프에 의해 쌍으로 연결된 8개의 β 가닥을 포함하는 실린더형 β 병풍구조의 초2차 구조 영역을 갖는 리포칼린 뮤테인을 명시적으로 포함하며, 상기 4개의 루프 중 각각의 적어도 3개 중 적어도 하나의 아미노산은 고유 서열 리포칼린과 비교하여 돌연변이된 것이다. 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 본원에 기재된 바와 같이 바람직하게는 CD137에 결합하는 기능을 갖는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 본 개시에서 리포칼린 뮤테인과 관련된 용어 "단편"은, N-말단 및/또는 C-말단이 절단된 즉, N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 중 적어도 하나가 부족한 전장 성숙 hNGAL 또는 리포칼린 뮤테인 유래의 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 단편은 성숙 hNGAL의 1차 서열 또는 유래된 리포칼린 뮤테인의 20개 또는 30개 이상의 연속된 아미노산과 같은 적어도 10개 이상을 포함할 수 있으며 일반적으로 성숙 hNGAL의 면역분석(immunoassay)에서 검출가능하다. 이러한 단편은 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산이 최대 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 또는 30개 (사이의 모든 숫자 포함)가 부족할 수 있다. 단편은 바람직하게는 성숙 hNGAL 또는 유래된 리포칼린 뮤테인의 기능적 단편이며, 이는 바람직하게는 성숙 hNGAL 또는 유래된 리포칼린 뮤테인이 바람직하게는 CD137에 대한 결합 특이성을 보유하는 것을 의미한다. 일례로, 이러한 기능적 단편은 성숙 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열에 상응하는 위치 13-157, 15-150, 18-141, 20-134, 25-134, 또는 28-134에 적어도 아미노산을 포함할 수 있다.

CD137, HER2, PD-1, 또는 PD-L1에 대한 "단편"은, N-말단 및/또는 C-말단이 절단된 CD137, HER2, PD-1, 또는 PD-L1은 CD137, HER2, PD-1, 또는 PD-L1의 단백질 도메인을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이 CD137, HER2, PD-1, 또는 PD-L1의 단편은 리포칼린 뮤테인, 항체, 융합 단백질, 및/또는 이들의 조합에 의해 인식 및/또는 결합되는 전장 CD137, HER2, PD-1, 또는 PD-L1의 능력을 보유한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "이중특이적(bispecific)"이란 분자가 적어도 2개의 별개의 표적에 특이적으로 결합할 수 있음을 지칭한다. 일반적으로, 이중특이적 분자는 2개의 표적-결합 부위를 포함하며, 이들 각각은 상이한 표적에 대해 특이적이다. 일 실시예에서, 이중특이적 분자는 두 개의 표적에 동시에 결합할 수 있다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는, 용어 "컨쥬게이트(conjugate)", "컨쥬게이션(conjugation)", "융합되다(fuse)", "융합(fusion)", 또는 "연결된(linked)"은, 이에 제한되는 것은 아니나, 유전자 융합, 화학적 컨쥬게이션, 링커 또는 가교제(cross-linking agent)를 통한 커플링, 및 비-공유 연관(association)을 포함하는 수단에 의한 모든 형태의 공유 또는 비-공유 연결(linkage)을 통해, 두 개 이상의 서브유닛(subunit)을 함께 연결하는 것을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "융합 폴리펩타이드" 또는 "융합 단백질"은 두 개 이상의 서브유닛을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 일 실시예에서, 본원에 기재된 바와 같이 융합 단백질은 두 개 이상의 서브유닛을 포함하고, 이러한 서브유닛 중 적어도 하나는 CD137에 특이적으로 결합할 수 있고, 추가의 서브유닛은 HER2에 특이적으로 결합할 수 있다. 융합 단백질 내에서, 이러한 서브유닛들은 공유 또는 비-공유 연결에 의해 결합될 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질은 두 개 이상의 서브유닛 사이의 단백질 융합(translational fusion)이다. 단백질 융합은 추가의 서브유닛의 코딩 서열로 리딩 프레임(reading frame)에서 하나의 서브유닛에 대한 코딩 서열을 유전적으로 조작함으로써 생성될 수 있다. 두 서브유닛은 링커를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 산재될 수 있다. 그러나, 본 개시에서 융합 단백질의 서브유닛은 또한 화학적 컨쥬게이션을 통해 연결될 수 있다. 융합 단백질을 형성하는 서브유닛은 일반적으로 한 서브유닛의 C-말단과 다른 서브유닛의 N-말단, 또는 한 서브유닛의 C-말단과 다른 서브유닛의 C-말단, 또는 한 서브유닛의 N-말단과 다른 서브유닛의 N-말단, 또는 한 서브유닛의 N-말단과 다른 서브유닛의 C-말단이 각각 연결되어 있다. 융합 단백질의 서브유닛은 임의의 순서대로 연결될 수 있으며 구성성분(constituent) 서브유닛 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 하나 이상의 서브유닛이 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 단백질 (복합체)의 일부인 경우, 용어 "융합 단백질"은 또한 단백질 (복합체)의 융합된 서열 및 다른 모든 폴리펩타이드 사슬(들)을 포함하는 단백질을 지칭할 수 있다. 일례로, 전장 면역글로불린이 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄를 통해 리포칼린 뮤테인에 융합되는 경우, 용어 "융합 단백질"은 리포칼린 뮤테인 및 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 지칭할 수 있다. 용어 "융합 단백질"은 또한 전체 면역글로불린 (경쇄 및 중쇄 모두) 및 이의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나 또는 둘 모두에 융합된 리포칼린 뮤테인을 지칭할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에 개시된 융합 단백질의 용어 "서브유닛"은 단일 단백질 또는 개별 폴리펩타이드 사슬을 지칭하며, 이는 그 자체로 안정한 접힌 구조를 형성하고 표적에 대한 결합 모티프(motif)를 제공하는 독특한 기능을 나타낼 수 있다. 일 실시예에서, 본 개시의 바람직한 서브유닛은 리포칼린 뮤테인이다. 다른 일 실시예에서, 본 개시의 바람직한 서브유닛은 전장 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인이다.

본 개시의 융합 단백질에 포함될 수 있는 "링커"는 본원에 기재된 바와 같이 융합 단백질의 두 개 이상의 서브유닛을 함께 연결한다. 상기 연결은 공유 또는 비-공유일 수 있다. 바람직한 공유 연결은 아미노산 사이의 펩타이드 결합과 같은, 펩타이드 결합을 통한 것이다. 바람직한 링커는 펩타이드 링커이다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 상기 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산과 같은, 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 본원에 기재된 바람직한 펩타이드 링커는 글리신-세린 (GS) 링커, 글리코실화 GS 링커, 및 프롤린-알라닌-세린 폴리머 (PAS) 링커를 포함한다. 다른 바람직한 링커는 화학적 링커를 포함한다.

"시료(sample)"는 임의의 대상체로부터 채취한 생물학적 시료로 정의된다. 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 소변, 대변, 정액, 또는 종양 조직을 포함하는, 조직을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

“대상체(subject)”는 척추동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간이다. 본원에 사용된 용어 "포유류(mammal)"는, 몇 가지 일례로 언급되는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 양, 개, 말, 고양이, 소, 쥐, 돼지, 게먹원숭이와 같은 유인원과 같은 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물을 포함하되 이에 제한되지 않는 포유류로 분류된 모든 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에 사용된 "포유류"는 인간이다.

본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 15% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 및 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 또한 구체적인 숫자를 포함하는데, 즉 "약 20"은 20개를 포함한다.

도 1: T-세포 활성화를 공동자극하는 서열번호: 72 및 73에 제시된 PD-1 항체와 조합된 서열번호: 81 및 80에 제시된 CD137/HER2 이중특이적 제제의 능력을 보여준다. 실험에서, 종양 세포주 NCI-N87를 플레이트에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 인간 말초혈액단핵세포 (PBMCs)를 플레이트에 첨가하고 0.05 ng/mL의 포도상구균 엔테로톡신 B (SEB)의 존재하에 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 단독, PD-1 항체 (서열번호: 72 및 73) 단독, 또는 상기 두 개의 조합물을 1:10 몰비로 함께 배양하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, T-세포 활성화 마커로서, 분비된 인터루킨 2 (IL-2)의 수준은 전기화학발광-기반 분석(electrochemiluminescence-based assay)에 의해 결정되고 상응하는 IgG4 아이소타입 대조군 항체 (서열번호: 15 및 16)로 표준화되었다. 두 명의 테스트된 기증자(donor)의 결과는 각각 도 1A 및 1B에 표시되었다. CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 및 PD-1 항체 (서열번호: 72 및 73)의 조합물은 개선된 (더 낮은) EC₅₀으로 CD137/HER2 이중특이적 제제 또는 PD-1 항체 단독과 비교하여 용량-의존적 IL-2 분비를 유도할 수 있었다.
도 2: 서열번호: 72 및 73 (도 2A) 또는 서열번호: 74 및 75 (도 2B)에 제시된 PD-1 항체와 서열번호: 81 및 80에 제시된 CD137/HER2 이중특이적 제제의 조합물이 T-세포 활성화를 공동자극하는 능력을 보여준다. 실험에서, 종양 세포주 NCI-N87을 플레이트에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 인간 PBMCs를 플레이트에 첨가하고 1 ng/mL SEB의 존재하에, 고정 농도 10 nM 또는 100 nM에서 다양한 농도의 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80)와 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75에 제시된 PD-1 항체와 조합하여 함께 인큐베이션 하였다. 또한 비교를 위하여 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 및 PD-1 항체 (서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75)는 단독으로 테스트되었다. 분비된 IL-2의 수준은 실시예 2에 기재된 바와 같이, T-세포 활성화에 대한 판독값으로서 전기화학발광-기반 분석에 의해 결정되고 상응하는 IgG4 아이소타입 대조군 항체 (서열번호: 15 및 16)의 수준으로 정규화되었다. 10 nM 및 3.33 nM에서 테스트된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80)의 대표적인 결과가 도시되어 있다. CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 및 서열번호: 72 및 73에 제시된 PD-1 항체의 조합물 및 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 및 서열번호: 74 및 75에 제시된 PD-1 항체의 조합물 모두 더 높은 IL-2 분비를 유도하고 상승적으로 또는 부가적으로 작용한다. 서열번호: 72 및 73과 조합될 때, 10 nM 항체를 사용할 때보다 100 nM 항체를 사용할 때 유도된 IL-2 분비 수준이 더 높았다. 한편, 서열번호: 74 및 75의 농도 (100 nM 또는 10 nM에서)는 CD137/HER2 이중특이적 제제와 함께 사용될 때 IL-2 분비에 영향을 미치지 않았다.
도 3: 서열번호: 81 및 80에 제시된 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-L1 항체 (서열번호: 76 및 77)의 조합물이 조사된 T-세포 활성화를 유도하는 능력의 대표적인 실험 결과를 보여준다. 실험에서, 종양 세포주 NCI-N87 (HER2 높음, PD-L1 낮음), JIMT-1 (HER2 보통, PD-L1 보통) 또는 MDA-MB-231 (HER2 낮음, PD-L1 보통)를 플레이트에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 인간 PBMCs를 플레이트에 첨가하고 0.05 ng/mL SEB의 존재하에, 100 nM에서 다양한 농도의 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 단독 또는 PD-L1 항체 (서열번호: 76 및 77) 또는 IgG4 아이소타입 대조군 항체 (서열번호: 15 및 16)와 조합하여 함께 인큐베이션 하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 분비된 IL-2의 수준이 결정되었다. 2.5 nM 및 0.16 nM의 농도에서 테스트된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80)의 예시적인 데이터는 도 3에 제시되어 있다. T 세포를 활성화하거나 또는 IL-2 분비를 증가시키는 능력에 의해 측정되는 PD-L1 항체와 조합된 CD137/HER2 이중특이적 제제의 기능적 활성은 높거나 보통(moderate) 수준의 HER2 (NCI-N87 및 JIMT-1)를 발현하는 종양 세포의 존재에서 상승적/부가적이다.
도 4: 특정 진행성 또는 전이성 HER-2 양성 고형 종양 (예컨대, 방광, 유방 및 위장)에서 최대 허용 용량 (maximum tolerated dose, MTD) 및 권장 2상 용량 (recommended Phase 2 dose, RP2D)을 결정하고 서열번호: 76 및 77에 제시된 PD-L1 항체와 조합되어 투여된 서열번호: 81 및 80에 제시된 CD137/HER2 이중특이적 제제의 안정성, 효능, 및 PK를 평가하기 위한 1b 상 연구의 전반적인 연구 설계를 설명한다. 이 연구에는 용량 증가 기간과 확장 기간이 포함된다.
도 5: 본원에 기술된 대표적인 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질 설계에 대한 개요를 제공한다. 대표적인 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질은 HER2에 특이적인 항체 (예컨대, 서열번호: 79 및 80에 제시된 항체) 및 CD137에 특이적인 하나 이상의 리포칼린 뮤테인 (예컨대, 서열번호: 21-39의 서열 중 어느 하나로 제시된 리포칼린)을 기반으로 만들어졌다. 하나 이상의 리포칼린 뮤테인은 도 1A-1D에 도시된 바와 같이 HER2 특이적 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 및/또는 N-말단에 유전적으로 융합되어, 융합 단백질, 예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 83 및 80, 및 서열번호: 79 및 84를 생성한다. 돌연변이 S228P, F234A, 및 L235A로 조작된 IgG4 백본(backbone)이 융합 단백질에 포함된 HER2 특이적 항체에 사용되었다.

CD137은 공동자극 면역 체크포인트이며 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 패밀리의 구성원이다. 주로 활성화된 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포, 활성화된 B 세포, 및 자연 살해 (NK) 세포에서 발현되며, 면역 반응 조절에 중요한 역할을 한다. CD137 클러스터링은 수용체의 활성화와 다운스트림 신호를 유도한다 (Yao et al., Nat Rev Drug Discov, 2013, Snell et al., Immunol Rev, 2011). 동족(cognate) 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 표적에 결합하는 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 전-자극된(pre-stimulated) T 세포에서, CD137를 통한 공동자극은 활성화, 생존, 및 증식을 향상시킬뿐만 아니라 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 생성을 유도하고 살해 능력을 향상시킨다.

수용체 클러스터링을 필요로 하는, CD137 활성화 방식에 따라, 항-CD137 항체와 같은 단일특이적 CD137-표적화 제제는 그 자체로 CD137를 클러스터링하는 데 효율적이지 않고 효율적인 활성화를 이끌 수 있다. 또한, TNFR 패밀리 구성원에 대한 최근 연구는 항체가 Fc 영역을 통해 Fc-감마 수용체와 상호작용하고, Fc-감마 수용체-발현 면역 세포를 활성화하고, 후속 항-종양 활성을 촉진하는 항-TNFR 항체의 메커니즘을 설명한다 (Bulliard et al., Immunol Cell Biol, 2014, Bulliard et al., J Exp Med, 2013). 따라서, 이것은 항- CD137 항체가 선택적으로 종양-국소적이지 않고 신체 전체에 분포하는 Fc-감마 수용체-양성 세포의 풍부함에 따라 CD137 클러스터링을 유발할 수 있음을 시사한다. 따라서, 항- CD137 단일치료요법의 효능 및 표적-특이성이 우려될 수 있다. 사실, 임상 연구에서 우렐루맙 및 유토밀루맙과 같은 일부 항-CD137 치료법은, 저-용량에서 실망스러운 효능 결과를 보이거나 및/또는 고-용량 또는 유효-용량에서 독성을 나타낸다 (Bulliard et al., Immunol Cell Biol, 2014, Bulliard et al., J Exp Med, 2013).

따라서, 효과적이면서 안전한 CD137-표적화 치료법에 대한 충족되지 않은 요구가 있다. 이상적인 CD137-표적화 제제는 CD137의 클러스터링으로 이어져야 하며, 종양-침윤 림프구에서 종양 국소화 방식으로 해야한다. 본원에 기재된 바와 같이, CD137-표적화 제제를 얻기 위해, 이중특이적 제제는 한쪽 말단에서 CD137을 표적화하고 다른 쪽 말단에서 차별적으로 발현된 종양 표적을 표적화하도록 설계될 수 있다.

이러한 관점에서 HER2는 광범위한 종양 유형에 걸쳐 임상적으로-검증된 표적이다. HER2 유전자의 증폭과 그 제품의 과발현은 유방암, 방광암, 위암, 위식도(gastroesophageal)암, 결장암, 및 담도암을 포함한 다양한 유형의 암 발생 및 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 본원에 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제는 T 세포를 HER2-양성 종양 세포와 가교(bridging)시키고 공동자극 신호를 종양 항원-특이적 T 세포에 전달하여, 국소 면역 활성화를 제공하고 종양 파괴를 유도함으로써 CD137 클러스터링을 촉진하도록 구상된다.

또한, 체크포인트 면역요법 및 면역요법 및 종양-표적 요법의 조합은 일부의 경우에서 단일요법보다 우월함을 보여주는 것이 입증되었다 (Karachaliou et al., Ann Transl Med, 2017, Ott et al., J Immunother Cancer, 2017). CD137-표적화 제제는 다른 치료법과 함께 연구되고 있다. 마우스 이종이식 모델을 이용한 전임상 연구에서 항-CD137 치료법이 항-PD-1/PD-L1 항체와 같은 체크포인트 억제제와 조합되어 이점이 있을 수 있음이 밝혀졌지만 (Dai et al., Clin Cancer Res, 2015, Wei et al., Oncoimmunology, 2014, Chen et al., Cancer Immunol Res, 2015, Kohrt et al., J Clin Invest, 2014, Kohrt et al., J Clin Invest, 2012, Morales-Kastresana et al., J Immunother Cancer, 2013), CD137-표적화 조합 요법의 실제 적용을 위한 비-표적화 면역 활성화 및 독성을 포함하여 효능의 개선과 관련 위험의 균형을 맞출 필요가 남아있다. 임상적으로, 작용제(agonist) 항-CD137 항체 우렐루맙이 니볼루맙 (항-PD-1 mAb)과 함께 연구되어 실망스러운 효능 결과와 제한된 임상 활성을 보였다 (Massarelli, 31st Annual Meeting and Associated Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer, 2016). 또한 우렐루맙은 세툭시맙 (항-EGFR mAb)의 신보조제(neoadjuvant) 시험에서 조사되었으며 세툭시맙에 의해 이미 활성화된 NK 세포가 있을 때만 항-종양 면역을 강화할 수 있는 잠재력을 나타냈다 (Srivastava et al., Clin Cancer Res, 2017). 또다른 항-CD137 항체인, 유토밀루맙은 또다른 PD-1 억제제인, 펨브로리주맙과 함께 연구되고 있다. Ib 상 데이터는 임상적 이점을 보여주고 바이오마커의 특정 경향을 보여주었지만, 상기 조합은 유토밀루맙의 이점과 펨브로리주맙 단독 요법의 효과를 구별하기에 충분하지 않았다 (Tolcher et al., Clin Cancer Res, 2017).

진행중인 개발에도 불구하고, CD137-표적화 치료법에 대한 임상적 이점과 적합한 작용 방식을 가진 최적의 조합 요법과 관련된 바이오마커를 식별해야할 필요성이 여전히 남아있다.

일 실시예에 있어서, 따라서 본 개시는 CD137-표적화 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물을 제공한다. 제공된 CD137-표적화 제제는 바람직하게는 CD137/HER2 이중특이적 제제이며 따라서 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함할 것이다.

또한 본 개시는 PD-1 축 억제제와 CD137/HER2 이중특이적 제제를 포함하는 하나 이상의 조합물을 제조하는 방법 및 이러한 조합물(들)을 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시예에서, 본 개시는 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라 약학적 키트를 포함한다. 제공된 약학적 조성물은 경피, 비강, 또는 데포(depot) 용량 단위와 같은 고체, 액체 서방형일 수 있으며 적합한 약학적 담체를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 본 개시는 특이적 HER2-양성 진행성 또는 전이성 고형 종양의 치료를 위해, CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물을 사용하는 방법을 제공한다. 또한 본 개시는 HER2-양성 진행성 또는 전이성 고형 종양을 갖는 개체에서 면역 반응을 향상시키기 위해, CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물을 사용하는 방법을 제공한다.

A. 본 개시의 예시적인 조합물 및 이의 용도 및 적용.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 적어도 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함한다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 적어도 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-L1 억제제를 포함한다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 적어도 서열번호: 81 및 80으로 표시되는 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질인 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체인 PD-L1 억제제를 포함한다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 적어도 서열번호: 81 및 80으로 표시되는 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질인 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체인 PD-1 억제제를 포함한다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제의 조합물이다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-L1 억제제의 조합물이다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 억제제의 조합물이다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 서열번호: 81 및 80으로 표시되는 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질 및 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체의 조합물이다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 서열번호: 81 및 80으로 표시되는 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질 및 서열번호: 72 및 73으로 표시되는 PD-1 항체의 조합물이다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 서열번호: 81 및 80으로 표시되는 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질 및 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체의 조합물이다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, T 세포를 활성화하거나 또는 T-세포 반응을 자극할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, T 세포를 상승적이거나 부가적으로 활성화하거나 또는 T-세포 반응을 자극할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 특정 조합물에 포함된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 및 서열번호: 79 및 84) 및/또는 PD-1 축 억제제 (예컨대 서열번호: 72 및 73, 서열번호: 74 및 75, 및 서열번호: 76 및 77)와 비교하여 필적하거나 더 나은 효능 및/또는 효과로 T-세포 활성화를 유도한다. 예를 들어, 자극된 T-세포 반응 또는 T-세포 활성화는 본질적으로 실시예 1-3에 기재된 바와 같은 기능적 T-세포 활성화 분석에서 측정될 수있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 이중특이적 제제 또는 억제제 단독과 관련된 증가된 IL-2 분비를 유도할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 증가된 IL-2 분비를 상승적으로 또는 부가적으로 유도할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 제공된 조합물은 농도-의존적 IL-2 분비를 유도할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 및 서열번호: 79 및 84) 및/또는 PD-1 축 억제제 (예컨대 서열번호: 72 및 73, 서열번호: 74 및 75, 및 서열번호: 76 및 77) 단독과 비교하여 필적하거나 더 나은 효능으로 증가된 IL-2 분비를 이끌 수 있다. 예를 들어, IL-2 분비는 본질적으로 실시예 1-3에 기재된 바와 같은 기능적 T-세포 활성화 분석에서 측정될 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 종양 세포의 존재 및/또는 종양 미세환경에서 T-세포 반응을 자극할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 융합 단백질은 HER2-양성 종양 세포의 존재에서 T-세포 반응을 자극할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포 및/또는 종양 미세환경에서 제공된 조합물에 의한 T-세포 활성화는, 본질적으로 실시예 1-3에 기재된 바와 같은 기능적 T-세포 활성화 분석에서 평가될 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 HER2 의존적 방식으로 T-세포를 활성화하거나 T-세포 반응을 자극할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 HER2-양성 암의 미세환경에서 T-세포에 의한 IL-2 생성의 국소 유도를 유발할 수 있다. 예를 들어, 조합물에 의한 T-세포의 HER2 의존적 활성화는, 본질적으로 상이한 수준의 HER2를 발현하는 종양 세포의 존재하에서 시험되고 HER2 발현 수준에 따라 T 세포를 다르게 활성화하는 능력이 입증된 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제의 조합으로 실시예 3에 기재된 바와 같은 T-세포 활성화 분석에서 결정될 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 부가적인 항-종양 효과를 발휘할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 상승적인 항-종양 효과를 발휘할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 이들의 조합물은, 투여될 때, CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 83 및 80, 서열번호: 79 및 84) 단독 및/또는 PD-1 축 억제제 (예컨대 서열번호: 72 및 73, 서열번호: 74 및 75, 서열번호: 76 및 77) 단독과 비교하여 개선된 효능 및 더 넓은 안정성으로 더 낮은 용량을 허용한다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 증가된 IL-2 분비를 유도할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 증가된 IFN-감마 분비를 유도할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 바람직하게는 종양 미세환경에서, CD4⁺ T 세포 증식 및/또는 활성화를 자극할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 바람직하게는 종양 미세환경에서, CD8⁺ T 세포 증식 및/또는 활성화를 자극할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 종양-침윤 림프구의 확장을 유도할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 바람직하게는 종양 미세환경에서 NK 세포를 활성화시키고 ADCC를 증가시킬 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 대상체에서 바이오마커 수준의 변화를 유도할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 대상체에서 바이오마커의 수준을 감소시킬 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 대상체에서 바이오마커의 수준을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 바이오마커는, CD4, CD8, PD-L1, Ki67, CD137, HER2, IL-8, 및 FoxP3일 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 대상체에서 종양 크기를 감소시킬 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 대상체에서 종양 성장을 막을 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 대상체에서 종양 전이를 막을 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 대상체에서 종양 재발을 지연시킬 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합하여, 대상체의 전반적인 생존율을 개선시킬 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 예컨대 인간과 같은 포유류 대상체에게 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물이 투여된 대상체는 이전에 치료된 진행성 및/또는 전이성 HER2-양성 종양의 진단을 확인할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물의 성분은 조합물의 임의의 다른 성분에 대해 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제는 서로 동시에 또는 서로에 대해 순차적으로 투여될 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물의 성분은 조합물의 임의의 다른 성분의 보조제(adjuvant)로서 투여될 수 있으며, 즉, 제공된 조합물의 한 성분은 대상체가 다른 성분으로 치료를 받은 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, CD137/HER2 이중특이적 제제는 대상체가 PD-1 축 억제제로 치료를 받은 후에 투여될 수 있거나 또는 PD-1 축 억제제는 대상체가 CD137/HER2 이중특이적 제제로 치료를 받은 후에 투여될 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물의 성분이 동시에 투여될 때, 단일 제제(formulation) 또는 별개의 제제로 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물의 성분이 별개의 제제로 동시에 또는 순차적으로 투여될 때, 상기 성분은 단일 부위 또는 별도의 분위에서 동일한 경로 또는 다른 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물의 성분이 순차적으로 투여될 때, 성분의 투여 사이의 시간은 특정 성분이 전신적으로 또는 투여 부위에서 지속되는 시간; 또는 성분의 세포 효곽 전신적으로 또는 투여 부위에서 지속되는 시간과 같은 특정 인자를 사용하여 결정될 수 있다.

일 실시예에서, 본 개시의 조합물, 또는 제공된 조합물을 포함하는 조성물은 항-종양제, 항-감염제, 및/또는 면역 조절제로서 사용되는 것이 예상된다. 예를 들어, 일 실시예에서, 제공된 조합물은 IL-2 분비를 증가시키는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 INF-감마 분비를 증가시키는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 종양-침윤 림프구를 증가시키는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 NK 세포를 활성화시키고 ADCC를 증가시키는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 림프구 활성화를 유도 및/또는 증식하는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 면역 기능을 향상시키는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 T 세포에서 CD137 클러스터링 및 활성화를 유도하고 이러한 T 세포를 종양 세포, 바람직하게는 HER2-양성 종양 세포로 유도하는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 종양 미세환경에서 림프구 반응을 유도하는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 항-종양 효과를 제공하는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD4, CD8, PD-L1, Ki67, CD137, HER2, IL-8, 및 FoxP3과 같은, 바이오마커 수준의 변화를 유도하는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 암의 진행을 치료 및/또는 지연하는 것에 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 HER2-발현 종양을 치료하는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 HER2-양성 종양을 치료하는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 HER2-불분명 종양을 치료하는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 HER2-음성 종양을 치료하는 것에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 HER2-발현 종양을 치료하는 것에 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양의 HER2 발현 상태는 면역조직화학 (immunohistochemistry, IHC) 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 단백질 수준에서 분석될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 HER2-양성 진행성 또는 전이성 고형 종양을 치료하는 것에 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 PD-L1-양성 종양을 치료하는 것에 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물의 각 성분은, 그 자체로, 항-종양, 항-감염, 및/또는 면역자극 활성을 가질 수 있다. 일 실시예에서, CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제의 조합물과 같은 성분의 조합물은, 임의의 한 성분이 제공할 수 있는 더 큰 항-종양, 항-감염, 및/또는 면역자극 활성을 제공할 수 있다. 일 실시예에서, 성분의 조합물은, 부가적이거나 또는 상승적인 항-종양, 항-감염, 및/또는 면역자극 활성을 제공할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 약 주2회, 약 주1회, 약 10일에 1회, 약2주에 1회, 약 3주에 1회, 약 4주에 1회, 약 5주에 1회, 약 1개월에 1회, 약 6주에 1회, 약 7주에 1회, 약 8주에 1회, 또는 약 2개월에 1회의 투여 일정을 허용하는 적절한 약동학적(pharmacokinetic) 특성을 가질 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 조합물의 한 성분은, 그 자체로, 적절한 약동학적 특성을 가질 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 조합물의 하나 이상의 성분은 약 주 2회, 약 주 1회, 약 10일에 1회, 약 2주에 1회, 약 3주에 1회, 약4주에 1회, 약 5주에 1회, 약 1개월에 1히, 약 6주에 1회, 약 7주에 1회, 약 8주에 1회, 또는 약 2개월에 1회의 빈도로 투여된다.

일 실시예에서, 조합물은 부품 키트의 형태로 제공된다. 일 실시예에서, 부품 키트는 CD137/HER2 이중특이적 제제를 포함하는 약학적 조성물 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 일 실시예에서, CD137/HER2 이중특이적 제제를 포함하는 약학적 조성물 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 적어도 2개의 분리된 단위 용량 형태로 제공된다. 일 실시예에서, 부품 키트에 포함되는 약학적 조성물은 단일 투여 당 대상체에 투여되는 용량에 사응하는 단위 용량으로 제공된다. 예시적인 실시예에서, CD137/HER2 이중특이적 제제는 약 0.05 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 또는 8.0 mg/kg의 단위 용량으로 투여되고 PD-L1 축 억제제는 약 1200 mg의 단위 용량으로 투여된다.

B. 예시적인 CD137/HER2 이중특이적 제제.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제를 포함한다. 일 실시예에서, 본 개시의 CD137/HER2 이중특이적 제제는 적어도 2개의 서브유닛: (1) HER에 특이적인 전장 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인을 포함하는 첫 번째 서브유닛, 및 (2) CD137에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 포함하는 두 번째 서브유닛을 임의의 순서로 함유하는 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질일 수 있다 (도 5). 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제는 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질은 또한 적어도 하나의 추가적인 서브유닛, 예를 들어, 세 번째 서브유닛을 함유할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 CD137에 특이적인 세 번째 서브유닛을 함유할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질은 하나 이상의 추가적인 서브유닛 (예컨대, 네 번째, 다섯 번째, 또는 여섯 번째 서브유닛)을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 적어도 하나의 서브유닛은 N-말단 및/또는 C-말단에서 다른 서브유닛에 융합될 수 있다.

일 실시예에서, 적어도 하나의 서브유닛은 링커를 통해 다른 서브유닛에 융합될 수 있다. 일 실시예에서, 링커는 펩타이드 링커, 예를 들어, 구조화되지 않은 글리신-세린 (GS) 링커, 글리코실화 GS 링커, 또는 프롤린-알라닌-세린 폴리머 (PAS) 링커이다. 일 실시예에서, GS 링커는 서열번호: 4에 제시된 (Gly₄Ser)₃ 링커 ((G₄S)₃)이다. 다른 예시적인 링커들은 서열번호: 5-14에 제시되어 있다. 일 실시예에서, 펩타이드 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 아미노산과 같이 1 내지 50 아미노산을 가질 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 첫 번째 서브유닛이 전장 면역글로불린을 포함할 때, 두 번째 서브유닛은 두 번째 서브유닛의 N-말단과 상기 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 (CH)의 C-말단 사이의 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다. 일 실시예에서, 세 번째 서브유닛은 세 번째 서브유닛의 N-말단과 상기 면역글로불린의 경쇄 불변 영역 (CL)의 C-말단 사이의 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다.

일 실시예에서, 리포칼린 뮤테인 서브유닛은 제공된 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질의 면역글로불린 서브유닛에 융합될 수 있다. 일 실시예에서, 리포칼린 뮤테인 서브유닛은 N-말단 및/또는 C-말단에서 면역글로불린 중쇄 도메인 (HC)의 C-말단, HC의 N-말단, 면역글로불린 경쇄 (LC)의 C-말단, 및/또는 LC의 N-말단에 있는 면역글로불린 서브유닛에 융합될 수 있다 (도 5). 예를 들어, 일 실시예에서, 리포칼린 뮤테인은, 펩타이드 링커를 통해서, N-말단에서 면역글로불린의 각각의 HC에 연결될 수 있다 (도 5D).

일 실시예에서, 본 개시의 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질과 관련하여, 적어도 하나의 서브유닛은 전장 면역글로불린이거나 또는 이를 포함할 수 있으며, 동시에 Fc 수용체-양성 세포에 대한 전장 면역글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능은 보존될 수 있고 융합 단백질은 CD137 및 HER2와 동시에 결합한다.

일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질의 적어도 하나의 서브유닛은 전장 면역글로불린이거나 또는 이를 포함할 수 있으며, Fc 수용체-양성 세포에 대한 전장 면역글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능은 융합 단백질이 CD137 및 PD-L1에 동시에 결합하는 동안 단백질 공학에 의해 감소되거나 완전히 억제될 수 있다. 일 실시예에서, 이는 예를 들어, IgG1 백본에서 IgG4로 전환함으로써 달성될 수 있는데, IgG4가 IgG1에 비해 감소된 Fc-감마 수용체 상호작용을 나타내는 것으로 알려져 있기 ?문이다. 일 실시예에서, 돌연변이가 F234A 및 L235A와 같은 IgG4 백본에 도입되어 Fc-감마 수용체에 대한 잔기 결합을 감소시킬 수 있다. 일 실시예에서, 또한 S228P 돌연변이를 IgG4 백본으로 도입하여 IgG4 반(half)-항체의 교환을 최소화할 수 있다 (Silva et al., J Biol Chem, 2015). 일 실시예에서, F234A 및 L235A 돌연변이는 감소된 ADCC 및 ADCP (Glaesner et al., Diabetes Metab Res Rev, 2010) 및/또는 연장된 혈청 반감기(half-life)에 대한 M428L 및 N434S 돌연변이 또는 M252Y, S254T, 및 T256E 돌연변이를 위해 도입될 수 있다 (Dall'Acqua et al., J Biol Chem, 2006, Zalevsky et al., Nat Biotechnol, 2010). 일 실시예에서, 추가적인 N297A 돌연변이는 글리코실화 모티프를 제거하기 위해 제공된 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질의 면역글로불린 중쇄에 존재할 수 있다.

본 개시의 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질에 포함된 면역글로불린의 Fc 부분은 융합 단백질의 혈청 수준 유지에 기여할 수 있다. 예를 들어, Fc 부분이 내피세포 및 식세포의 Fc 수용체에 결합하면, 융합 단백질이 내재화되어 혈류로 재순환되어 체내 반감기가 향상될 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질과 관련하여, 첫 번째 서브유닛은 전장 면역글로불린이거나 또는 이를 포함할 수 있고 또는 이의 항원-결합 도메인은 HER2에 대해 특이적일 수 있다. 일 실시예에서, 면역글로불린은 HER2에 대한 단일클론항체이다.

일 실시예에서, 제공된 HER2 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 40, 서열번호: 41, 및 서열번호: 42의 세 가지 중쇄 CDRs, 및/또는 서열번호: 43, 서열번호: 44, 서열번호: 45의 세 가지 경쇄 CDRs을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 HER2 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 64에 제시된 중쇄 가변영역 (HCVR), 및/또는 서열번호: 65에 제시된 경쇄 가변영역 (LCVR)을 가질 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 HER2 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 78 또는 79 중 어느 하나인 중쇄, 및/또는 서열번호: 80에 제시된 경쇄를 가질 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 HER2 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 64에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 HCVR, 및/또는 서열번호: 65에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 LCVR을 가질 수 있다. 다른 실시예에서, 제공된 HER2 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 78-79로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및/또는 서열번호: 80의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 경쇄를 가질 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 HER2 항체는 트라스투주맙(trastuzumab)이다. 일 실시예에서, 제공된 HER2 항체는 IgG4 백본을 갖는 트라스투주맙이다.

일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질에 대하여, 두 번째 서브유닛은 CD137에 대해 특이적인 리포칼린 뮤테인이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 호중구 젤라티나아제-연관 리포칼린 (hNGAL)이거나 이를 포함할 수 있다. 성숙한 hNGAL의 뮤테인은 본원에서 “hNGAL 뮤테인”으로 지칭될 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 CD137-결합 hNGAL 뮤테인은 인간 CD137에 높은 친화도로 결합할 수 있으며 항-CD3 항체아 함께 플라스틱 디쉬에 고정될 때 인간 T 세포를 공동자극할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 CD137-결합 hNGAL 뮤테인은 서열번호: 21-39로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 CD137-결합 hNGAL 뮤테인은 서열번호: 22의 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 CD137-결합 hNGAL 뮤테인의 아미노산 서열은 서열번호: 21-39로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 동일성과 같은, 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 CD137-결합 hNGAL 뮤테인의 아미노산 서열은 서열번호: 22의 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 동일성과 같은, 높은 서열 동일성을 가질 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질은 유연한(flexible) 비-면역성 링커에 의해 연결된, CD137-특이적 hNGAL 뮤테인과 트라스투주맙 IgG4 변이체의 유전적 융합에 의해 생성된다.

일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 융합 HER2 및 CD137을 동시에 결합할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 융합 단백질은 HER2-의존 방식에서 CD137 신호를 활성화할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 융합 단백질은 HER2-양성 종양 미세환경에서 CD137 신호를 활성화할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 융합 단백질은 T 세포 반응을 공동자극하고 및/또는 HER2-양성 종양 미세환경에서 T 세포 기능을 향상시키는 것을 활성화할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질은 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 83 및 80, 서열번호: 79 및 84로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 융합 단백질은 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 83 및 80, 서열번호: 79 및 84에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 이중특이적 융합 단백질이 하나 이상의 아미노산 사슬을 포함하는 경우, 서열 동일성에 대해 주어진 값은 두 아미노산 사슬의 아미노산 잔기 수에 의해 정규화된 평균 서열 동일성과 관련있다. 예를 들어, 이중특이적 융합 단백질이 100개의 아미노산을 갖는 아미노산 사슬 A 및 50개의 아미노산을 갖는 아미노산 사슬 B로 이루어지고, 또다른 이중특이적 융합 단백질이 아미노산 사슬 A에 대해 80 % 서열 동일성인 100 개의 아미노산을 갖는 아미노산 사슬 A' 및 아미노산 사슬 B에 대해 95 % 서열 동일성인 50개의 아미노산을 갖는 아미노산 사슬 B'로 이루어질 때, 두 융합 단백질 사이의 평균 서열 동일성은 (100/(100+50)) x 80 % + (50/(100+50)) x 95 % = 85 % 서열 동일성일 것이다. 바람직한 실시예에서, 이중특이적 융합 단백질이 하나 이상의 아미노산 사슬을 포함하는 경우, 서열 동일성에 대해 주어진 값은 관심 단백질이 이중특이적 융합 단백질의 하나의 사슬에 대해 적어도 주어진 서열 동일성 값을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 이중특이적 융합 단백질의 다른 사슬에 대해 적어도 주어진 서열 동일성 값을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다.

C. 예시적인 PD-1 축 억제제.

일 실시예에서, 제공된 조합물은 PD-1 축 억제제의 성분을 포함한다. 일 실시예에서, 본 개시의 PD-1 축 억제제는 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, 또는 PD-L2 길항제일 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 PD-1 축 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 항-PD-L2 항체이다. 일 실시예에서, 제공된 PD-1 축 억제제는 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있다.

다양한 PD-1 축 억제제는 당업계에 알려져 있다. MK-3475, Merck 3475, 램브롤리주맙(lambrolizumab), SCH-900475, 및 KEYTRUDA^®으로도 알려진, 펨브로리주맙은 PD-1에 결합하고 차단하는 인간화 IgG4 단일클론 항체이다. 플래티튬-기반 화학요법(platinum-based chemotherapy) 후 두경부 편평 세포 암종(neck squamous cell carcinoma)에 대한 2차-라인 치료로, 특정 상황에서 수술로 치료할 수 없거나 전이성 흑생종, 전이성 비-소세포 폐암 (NSCLC)을 치료하고 난치의 전형적인 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma)을 가진 성인 및 소아 환자의 치료를 위해 정맥 주입을 통해 사용된다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, 및 OPDIVO^®으로도 알려진 PD-1에 결합하여 PD-L1를 막는 인간화 IgG4 항-PD-1 단일클론 항체이다. 암이 BRAF에 돌연변이가 없다면 이필리루맙(ipilimumab)과 함께 수술할 수 없거나 전이성 흑색종에 대한 1차 라인 치료로서 사용되며 이필리루맙 치료 후에 2차-라인 치료로서 사용되고 암이 BRAF에 돌연변이가 있다면 신장 세포 암종에 대한 2차-라인 치료 및 편평 비-소세포폐암에 대한 2차-라인 치료로서 BRAF 억제제와 함께 사용된다. MPDL3280A 또는 Tecentriq^®으로도 알려진 아테졸리주맙은 Fc-이펙터 기능이 제거되록 조작된 인간 IgG1 단일클론 항체이다. 그것은 인간 PD-L1을 표적화하고 PD-1과의 상호작용을 억제한다. 요로상피세포암종(urothelial carcinoma), 일반적 유형의 방광암의 치료에 사용되며, 다른 종양 유형에서도 조사중이다.

C-1. PD-1 축 억제제로서 예시적인 항-PD-L1 항체

일 실시예에서, 제공된 PD-1 축 억제제는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인이다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인을 포함한다.

본 개시의 항-PD-L1 항체의 예시적인 예로는, 아테졸리주맙 (MPDL3280A 또는 RG7446 으로도 알려짐, 상표명 Tecentriq^®), 아벨루맙 (MSB0010718C으로도 알려짐, 상표명　Bavencio^®), 더발루맙 (이전에 MEDI4736으로도 알려짐, 상표명 Imfinzi^®), BMS-936559 (MDX-1105으로도 알려짐), 및 PCT 국제 출원 공개 번호 WO 2010/077634, WO 2007/005874, WO 2010/089411, WO 2011/066389, WO 2013/079174, WO 2015/048520, WO 2016/061142, WO 2016/111645, WO 2015/061668, WO 2016/007235, 및 WO 2017/148424에 개시된 항-PD-L1 항체들과 같이 이전에 공지된 항체의 VH 및 VL 영역을 포함하는 항-PD-L1 항체와 동일한 에피토프를 교차-차단하거나 이에 결합하는 항원-결합 영역이 포함될 수 있다. 제공된 항-PD-L1 항체는 또한 항원-결합 영역 또는 VH 및 VL 영역 또는 상기-언급된 항-PD-L1 항체들 중 어느 하나이거나 이를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 WO2017148424에 개시된 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙(durvalumab), 및 항-PD-L1 항체들로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 세 가지 중쇄 상보성-결정 영역 (CDRs) (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 세 가지 경쇄 CDRs (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3) 중 어느 하나와 같은, 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 58, 서열번호: 59, 및 서열번호: 60의 세 가지 중쇄 CDRs, 및/또는 서열번호: 61, 서열번호: 62, 서열번호: 63의 세 가지 경쇄 CDRs를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 70에 제시된 중쇄 가변영역 (HCVR), 및/또는 서열번호: 71에 제시된 경쇄 가변영역 (LCVR)을 가질 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 PD-L1 항체또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 76에 제시된 중쇄, 및/또는 서열번호: 77에 제시된 경쇄를 가질 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 70에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 HCVR, 및/또는 서열번호: 71에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 LCVR을 가질 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 76의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및/또는 서열번호: 77의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 경쇄를 가질 수 있다.

일 실시예에서, 본 개시의 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다. 일 실시예에서, 본 개시의 항-PD-L1 항체는 더발루맙 또는 아벨루맙이다.

C-2. PD-1 축 억제제 로서 예시적인 항-PD-1 항체

일 실시예에서, 제공된 PD-1 축 억제제는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인이다. 일 실시예에서, 제공된 조합물은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인을 포함한다.

본 개시의 항-PD-1 항체의 예시적인 예로는 니볼루맙 (ONO-4538, BMS-936558, 또는 MDX1106으로도 알려짐, Opdivo®로 판매), 펨브로리주맙 (램브롤리주맙 또는 MK03475로도 알려짐, 상표명 Keytruda®PDR001, 티스렐리주맙 (BGB-A317), 세미플리맙 (REGN281), MEDI0680 (이전 AMP-514), 피딜리주맙 (CT-011), ENUM-388D4 (D4-1, D4-2 및 D4-3 변이체 포함), ENUM-244C8 (이의 각 변이체 역시 포함), 및 U.S. 특허 출원 공개 번호 US 2003/0039653, US 2004/0213795, US 2006/0110383, US 2007/0065427, US 2007/0122378, US 2009/0217401, US 2011/0008369, 및 US2015/0203579 및 PCT 국제 출원 공개 번호 WO 2003/099196, WO 2006/121168, WO 2007/005874, WO 2008/156712, WO 2009114335, WO 2010/027423, WO2 011/110604, WO 2012/145493, WO 2013/014668, WO 2014/194302, WO 2015/035606, 및 WO 2016/106159에 개시된 항-PD-1 항체들과 같이, 이전에 알려진 항체의 VH 및 VL 영역을 포함하는 항-PD-1 항체와 동일한 에피토프를 교차-차단하거나 이에 결합하는 항원-결합 영역이 포함될 수 있다. 제공된 항-PD-1 항체는 또한 항원-결합 영역 또는 VH 및 VL 영역 또는 상기-언급된 항-PD-1 항체들 중 어느 하나이거나 또는 이를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 니볼루맙, 펨브로리주맙, PDR001, MEDI0680, 피딜리주맙, ENUM-388D4, 및 ENUM-244C8으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 세 개의 중쇄 CDRs (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 중 어느 하나 및 세 개의 경쇄 CDRs (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3) 중 어느 하나와 같은 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 46, 서열번호: 47, 및 서열번호: 48의 세 개의 중쇄 CDRs, 및/또는 서열번호: 49, 서열번호: 50, 서열번호: 51의 세 개의 경쇄 CDRs을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 52, 서열번호: 53, 및 서열번호: 54의 세 개의 중쇄 CDRs, 및/또는 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57의 세 개의 경쇄 CDRs을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 66 및 68 중 어느 하나의 HCVR, 및/또는 서열번호: 67 및 69 중 어느 하나의 경쇄 가변 LCVR을 가질 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 서열번호: 72 및 74 중 어느 하나의 중쇄, 및/또는 서열번호: 73 및 75 중 어느 하나의 경쇄를 가질 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인의 중쇄 및 경쇄 쌍은 각각 다음과 같이 HCVR 및 LCVR을 포함한다: 서열번호: 66 및 67 또는 서열번호: 68 및 69.

일 실시예에서, 제공된 PD-1 항체의 중쇄 및 경쇄 쌍은 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75에 제시된 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 66 및 68 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 HCVR, 및/또는 서열번호: 67 및 69 중 어느 하나로 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 LCVR을 가질 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 서열번호: 72 및 74 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및/또는 서열번호: 73 및 75 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 경쇄를 가질 수 있다.

일 실시예에서, 본 개시의 항-PD-1 항체는 니볼루맙 또는 펨브로리주맙이다. 일 실시예에서, 본 개시의 항-PD-1 항체는 티스렐리주맙 또는 세미플리맙일 수 있다.

D. 본 개시의 예시적인 방법

일 실시예에서, 본 개시는, CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

일 실시예에서, 본 개시는, 바람직하게는 종양 미세환경에서 IL-2 분비를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합되어, 이중특이적 제제 또는 억제제 단독에 비해서 바람직하게는 종양 미세환경에서IL-2 분비를 증가시키기에 효과적이다. 일 실시예에서, 제공된 방법은 IL-2 분비의 상승적인 증가를 유도할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 방법은 IL-2 분비의 부가적인 증가를 유도할 수 있다.

일 실시예에서, 본 개시는 바람직하게는 종양 미세환경에서, IFN-감마 분비를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 각각의 양은, 다른 것과 조합될 때, 이중특이적 제제 또는 억제제 단독에 비해 바람직하게는 종양 미세환경에서 IFN-감마 분비를 증가시키는 데 효과적이다. 일 실시예에서, 제공된 방법은 IFN-감마 분비의 상승적인 증가를 유도할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 방법은 IFN-감마 분비의 부가적인 증가를 유도할 수 있다.

일 실시예에서, 본 개시는 T 림프구 활성화 및/또는 증식을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 각각의 양은, 다른 것과 조합될 때, T 림프구 활성화 및/또는 증식을 유도하는 것에 효과적이다. 일 실시예에서, 제공된 방법은 상승적인 T 림프구 활성화 및/또는 증식을 유도할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 방법은 부가적인 T 림프구 활성화 및/또는 증식을 유도할 수 있다.

일 실시예에서, 본 개시는 면역 기능을 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 각각의 양은, 다른 것과 조합될 때, 향상된 면역 기능을 유도하는 것에 효과적이다. 일 실시예에서, 제공된 방법은 상승적인 면역 기능의 증대를 유도할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 방법은 면역 기능의 부가적인 증대를 유도할 수 있다.

일 실시예에서, 본 개시는 바람직하게는 종양 미세환경에서, CD4⁺ T 세포를 증가하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 본 개시는 바람직하게는 종양 미세환경에서, CD8⁺ T 세포를 증가하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 본 개시는 바람직하게는 종양 미세환경에서, NK 세포를 활성화 및 ADCC를 증가하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 본 CD4, CD8, PD-L1, Ki67, CD137, HER2, 및 IL-8 수준과 같은 종양 바이오마커 수준을 모니터링하고 변경하는 방법을 제공한다. 제공된 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 각각의 양은, 다른 것과 조합될 때, 바람직하게는 종양 미세환경에서 CD4⁺ T 세포의 확장, 바람직하게는 종양 미세환경에서 CD8⁺ T 세포의 확장, 바람직하게는 종양 미세환경에서 NK 세포의 활성화 및 증가된 ADCC, 및/또는 종양 바이오마커 수준의 변화를 유도하는 것에 효과적이다.

일 실시예에서, 본 개시는 T 세포에서 CD137 클러스터링 및 활성화를 유도하고 이러한 T 세포를 종양 세포, 바람직하게는 HER2-양성 종양 세포로 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합될 때, T 세포에서 CD137 클러스터링 및 활성화를 유도하고 이러한 T 세포를 종양 세포, 바람직하게는 HER2-양성 종양 세포로 유도하는 것에 효과적이다.

일 실시예에서, 본 개시는 종양 세포, 바람직하게는 HER2-양성 종양 세포 부근에서 국소 림프구 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 각각의 양은, 다른 것과 조합될 때, 종양 세포, 바람직하게는 HER2-양성 종양 세포 부근에서 국소 림프구 반응을 유도하는 것에 효과적이다.

일 실시예에서, 본 개시는 암 진행을 치료 또는 지연하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 본 개시는 종양 크기 감소, 종양 성장 억제, 전이 억제, 재발 지연, 및 개선된 전반적인 생존율과 같은, 항-종양 효과를 제공하는 방법을 제공한다. 제공된 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 각각의 양은, 다른 것과 조합될 때, 항-종양 효과를 한다.

일 실시예에서, 본 개시는 HER2-양성 진행성 또는 전이성 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 본 개시는 PD-L1-양성 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 제공된 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 각각의 양은, 다른 것과 조합될 때, 항-종양 효과를 발휘하는 것에 효과적이다. 일 실시예에서, 제공된 방법은 상승적인 항-종양 효과를 유도할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 방법은 부가적인 항-종양 효과를 유도할 수 있다.

일 실시예에서, CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 제공된 방법과 관련하여, 상기 CD137/HER2 이중특이적 제제는 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 83 및 80, 및 서열번호: 79 및 84로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및/또는 PD-1 축 억제제는 서열번호: 72 및 73, 서열번호: 74 및 75, 및 서열번호: 76 및 77으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 니볼루맙, 펨브로리주맙, 또는 아테졸리주맙일 수 있다.

일 실시예에서, CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 제공된 방법과 관련하여, 상기 CD137/HER2 이중특이적 제제는 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 83 및 80, 및 서열번호: 79 및 84에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및/또는 상기 PD-1 축 억제제는 서열번호: 72 및 73, 서열번호: 74 및 75, 및 서열번호: 76 및 77에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 니볼루맙, 펨브로리주맙, 또는 아테졸리주맙을 포함할 수 있다. 상기 정의된 바와 같은 2 개의 아미노산 사슬을 포함하는 이중특이적 융합 단백질에 대한 서열 동일성의 의미는 필요한 변경(mutatis mutandis)으로 항체에 준용된다.

일 실시예에서, CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 제공된 방법과 관련하여, 상기 조합물은 서열번호: 81 및 80 및 서열번호: 72 및 73, 서열번호: 81 및 80 및 서열번호: 74 및 75, 서열번호: 81 및 80 및 서열번호: 76 및 77로 이루어진 군으로부터 선택되는 조합물이다.

일 실시예에서, 제공된 방법은 대상체에 대한 반응으로 이어진다. 일 실시예에서, 반응은 부분 반응이다. 일 실시예에서, 반응은 완전 반응이다. 일 실시예에서, 반응은 치료 중단 후 대상체에서 지속적인 반응 (예컨대, 지속적인 부분 반응 또는 완전 반응)이다.

일 실시예에서, 본 개시의 대상체는 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물의 치료 전에 암 치료요법으로 치료되었을 수 있다. 일 실시예에서, 본 개시의 대상체는 하나 이상의 암 치료요법에 내성이 있는 암을 가질 수 있으며, 여기서 암은 치료 초기에 내성일 수 있거나 치료 동안 내성이 될 수 있다. 일 실시예에서, 본 개시의 대상체는 트라스투주맙에 내성이 있는 암을 가질 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 암은 초기 단계 또는 후기 단계에 있을 수있다.

일 실시예에서, 본 개시의 대상체는 진행성 또는 전이성 유방암을 앓고 있을 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)는 약 0.05 mg/kg 내지 약 8 mg/kg 체중(bodyweight), 약 0.15 mg/kg 내지 약 8 mg/kg 체중, 약 0.5 mg/kg 내지 약 8 mg/kg 체중, 약 1 mg/kg 내지 약 8 mg/kg 체중, 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중, 약 0.15 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중, 약 0.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중의 용량으로 개체에게 투여된다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)는 약 0.5 mg/kg 내지 약 8 mg/kg 체중, 약 1 mg/kg 내지 약 8 mg/kg 체중, 약 0.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중의 용량으로 개체에게 투여된다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)는 약 1 mg/kg 내지 약 8 mg/kg 체중의 용량으로 개체에게 투여된다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중의 용량으로 개체에게 투여된다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)는 약 0.05 mg/kg 체중, 약 0.15 mg/kg 체중, 약 0.5 mg/kg 체중, 약 1.0 mg/kg 체중, 약 2.5 mg/kg 체중, 약 5.0 mg/kg 체중, 또는 약 8.0 mg/kg 체중의 용량으로 투여된다. 일반적인 제의(proposition)로서, CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)의 치료적 유효량은 약 0.01 내지 약 50 mg/kg의 범위에서, 1회 이상의 투여에 의해 인간에게 투여된다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)는 약 매주에서 약 4주마다, 약 매주에서 약 3주마다, 또는 약 매주에서 약 2주마다 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)는 약 매주, 약 2주마다, 약 3주마다, 또는 약 4주마다 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)는 각 주기의 첫째 날, 각 7-일 주기의 첫째 날, 각 14-일 주기의 첫째 날 및 여덟째 날, 각 21-일 주기의 첫째 날, 여덟째 날 및 열다섯째 날, 또는 각 28-일 주기의 첫째 날, 여덟째 날, 및 열다섯째 날에 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)는 약 2주마다, 각 주기의 첫째날에 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 더 많은 주기와 같은, 적어도 하나의 주기로 투여된다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제는 서열번호: 81 및 80로 표시되는 서열을 갖는다.

일 실시예에서, 본 개시의 제공된 방법은 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, 및 PD-L2 길항제로 이루어진 군으로부터 선택되는 PD-1 축 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

일 실시예에서, PD-L1 길항제는 PD-1 및 B7.1과 같은, 결합 파트너(들)에 PD-L1이 결합하는 것을 억제할 수 있는 항체와 같은, 항체이다. 일 실시예에서, PD-L1 길항제는 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체이며, 약 매주, 약 2주마자, 약 3주마다, 또는 약 4주마다와 같이, 약 4 주마다, 약 매주에서 약 3 주마다, 약 매주에서 약 2주마다 약 800 mg 내지 약 1500 mg의 용량으로 투여될 수 있다 (예컨대, 약 1000 mg 내지 약 1300 mg, 예컨대, 약 1100 mg 내지 약 1200 mg). 일 실시예에서, PD-L1 길항제는 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체이며, 약 3주마다 약 800 mg 내지 약 1500 mg의 용량으로 투여될 수 있다 (예컨대, 약 3주마다 약 1000 mg 내지 약 1300 mg, 예컨대, 약 3주마다 약 1100 mg 내지 약 1200 mg). 일 실시예에서, 서열번호: 76 및 77으로 표시되는 PD-L1 항체는 약 3주마다 약 1200 mg의 용량으로 투여될 수 있다.

일 실시예에서, PD-1 길항제는 PD-L1 및 PD-L2와 같은, 결합 파트너에 PD-1가 결합하는 것을 억제할 수 있는 항체와 같은, 항체이다. 일 실시예에서, PD-1 길항제는 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체이며, 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주마다 약 100 mg 내지 약 600 mg의 용량으로 투여될 수 있다 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주 마다 약 100 mg, 120 mg, 140 mg, 160 mg, 180 mg, 200 mg, 220 mg, 240 mg, 260 mg, 280 mg, 300 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 또는 600 mg). 일 실시예에서, 서열번호: 72 및 73으로 표시되는 PD-1 항체는 약 2주마다 약 240 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 서열번호: 72 및 73으로 표시되는 PD-1 항체는 약 2주마다 약 480 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체는 약 3주마다 약 200 mg의 용량으로 투여될 수 있다.

일반적인 제의로서, PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체와 같은 PD-1 길항제, 또는 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체와 같은, PD-L1 길항제)의 치료적 유효량은 환자 체중의 약 0.01 내지 약 50 mg/kg의 범위에서 1회 이상의 투여에 의해 인간에게 투여된다. 일 실시예에서, 예를 들어, 제공된 PD-1 축 억제제(예컨대, 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체와 같은, PD-1 길항제, 또는 PD-L1 항체 표시되는 서열번호: 76 및 77으로 표시되는 PD-L1 항체와 같은, PD-L1 길항제)는 약 0.01 내지 약 45 mg/kg, 약 0.01 내지 약 40 mg/kg, 약 0.01 내지 약 35 mg/kg, 약 0.01 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 내지 약 25 mg/kg, 약 0.01 내지 약 20 mg/kg, 약 0.01 내지 약 15 mg/kg, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 약 1 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체와 같은, PD-L1 항체)는 약 15 mg/kg으로 투여된다. 일 실시예에서, 서열번호: 72 및 73로 표시되는 PD-1 축 억제제는 약 2주마다 약 3 mg/kg으로 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 축 억제제는 약 3주마다 약 2 mg/kg으로 투여될 수 있다. 다른 용량 요법(regimens)도 유용할 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체와 같은 PD-1 길항제, 또는 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체와 같은 PD-L1 길항제)는 약 100 mg, 약 200 mg, 약 300 mg, 약 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg, 약 1000 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 또는 약 1500 mg의 플랫 용량(flat dose)으로 사람에게 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체와 같은, PD-L1 길항제)는 약 3주마다 약 1150 mg 내지 약 1250 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 76 및 77으로 표시되는 PD-L1 항체와 같은, PD-L1 길항제)는 약 3주마다 약 1200 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 72 및 73으로 표시되는 PD-1 항체와 같은, PD-1 길항제)는 약 240 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체와 같은, PD-1 길항제)는 약 200 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 본 개시의 제공된 PD-1 축 억제제의 용량은 단일 용량 또는 다양한(multiple) 용량 (예컨대, 2 또는 3 용량)으로서 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 PD-1 축 억제제는 단일 치료와 비교하여 조합 치료로 투여될 때, 감소된 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 대상체에서 암의 진행을 치료 또는 지연시키는 제공된 방법은 치료 주기를 포함하는 투여 요법을 포함하며, 대상체는 각 주기의 첫째 날에 인간 PD-1 축 결합 길항제 (예컨대, 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1와 같은, PD-L1 길항제)가 약 1200 mg의 용량으로 투여되며, 각 주기는 약 21 일 (즉, 각 주기는 약 21 일마다 반복된다)이다. 예를 들어, 일 실시예에서, 대상체에서 암의 진행을 치료 또는 지연시키는 제공된 방법은 치료 주기를 포함하는 투여 요법을 포함하며, 대상체는 각 주기의 첫째 날에, 인간 PD-1 축 결합 길항제 (서열번호: 72 및 73으로 표시되는 PD-1 항체와 같은, PD-1 길항제)가 각 주기는 약 14일이며 약 240 mg의 용량으로 또는 각 주기는 약 28일이며 약 480 mg의 용량으로 투여된다. 예를 들어, 일 실시예에서, 대상체에서 암의 진행을 치료 또는 지연시키는 제공된 방법은 치료 주기를 포함하는 투여 요법을 포함하며, 대상체는 인간 PD-1 축 결합 길항제 (예컨대, 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체와 같은, PD-1 길항제)가 각 주기의 첫째 날에 약 240 mg의 용량으로 투여되며, 각 주기는 약 21 일이다. 일 실시예에서, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 그 이상의 주기와 같은 적어도 하나의 주기가, 투여된다.

일 실시예에서, 본 개시의 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84) 및 PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체와 같은 PD-L1 길항제)는 단일 치료 주기로 투여된다. 이러한 성분들의 투여는 투여 요법의 맥락에서 순차적으로 (다른 시간에) 또는 동시 (동일한 시간에)일 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 본 개시의 방법은 치료 주기를 포함하는 투여 요법을 포함하며, 대상체는 각 주기의 첫째 날에, 약 0.05 mg/kg 체중, 0.15 mg/kg 체중, 0.5 mg/kg 체중, 1.0 mg/kg 체중, 2.5 mg/kg 체중, 5.0 mg/kg 체중, 또는 8.0 mg/kg 체중의 용량으로 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)가 투여되고, 그리고 즉시, PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체와 같은, PD-L1 길항제)가 약 1200 mg 용량으로 투여된다. 일 실시예에서, 각 주기는 약 21 일이다. 일 실시예에서, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 그 이상의 주기와 같은, 적어도 하나의 주기가 투여된다.

일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)는 제공된 PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체와 같은, PD-1 길항제, 또는 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1과 같은, PD-L1 길항제)와 별도의 조성물로 투여된다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)는 제공된 PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체와 같은 PD-1 길항제, 또는 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체와 같은, PD-L1 길항제)와 동일한 조성물로 투여된다.

일 실시예에서, 본 개시의 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84) 및 PD-1 축 억제제 (예컨대, PD-1 항체 표시되는 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체와 같은, PD-1 길항제, 또는 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체와 같은, PD-L1 길항제)는 동일한 투여 경로에 의해 투여된다. 일 실시예에서, 본 개시의 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84) 및 PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체와 같은, PD-1 길항제, 또는 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체와 같은, PD-L1 길항제)는 동일한 투여 경로에 의해 또는 다른 투여 경로에 의해 투여된다. 일 실시예에서, 제공된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84)는 정맥내(intravenously), 근육내(intramuscularly), 피하(subcutaneously), 국소(topically), 경구(orally), 경피(transdermally), 복강내(intraperitoneally), 안와내(intraorbitally), 이식(implantation)에 의해, 흡입(inhalation)에 의해, 척수강내(intrathecally), 심실내(intraventricularly), 또는 비강내(intranasally)로 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 제공된 PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체와 같은, PD-1 길항제, 또는 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체와 같은, PD-L1 길항제)는 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 안와내, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척수강내, 심실내, 또는 비강내로 투여될 수 있다.

일 실시예에서, 제공된 방법은 추가적인 치료요법을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 추가적인 치료요법은 방사능(radiation) 치료요법, 수술 (예컨대, 종괴절제술(lumpectomy) 및 유방절제술(mastectomy)), 화학치료요법, 유전자 치료요법, DNA 치료요법, 바이러스 치료요법, RNA 치료요법, 면역치료요법, 골수이식, 나노치료요법, 단일클론 항체 치료요법, 또는 앞서 말한 조합물일 수 있다. 이러한 추가적인 치료요법은 보조제 또는 신보조제 치료요법의 형태일 수 있다. 일 실시예에서, 추가적인 치료요법은 작은 분자 효소 억제제의 투여 또는 항-전이성 제제이다. 일 실시예에서, 추가적인 치료요법은 부작용(side-effect) 억제제 (예컨대, 항-메스꺼움제(anti-nausea agents), 등과 같은, 치료의 부작용 발생 및/또는 중증도를 줄이기 위한 제제)의 투여이다.

E. 약학적 제제(Pharmaceutical Formulations)

일 실시예에서, CD137/HER2 이중특이적 제제 (예컨대, 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 82 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84) 및 PD-1 축 억제제 (예컨대, 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75로 표시되는 PD-1 항체와 같은, PD-1 길항제, 또는 서열번호: 76 및 77로 표시되는 PD-L1 항체와 같은, PD-L1 길항제)와 같은, 제공된 조합물 및 조합물의 성분을 포함하는 본 개시의 분자는, 치료적 조성물의 “활성 성분(active ingredients)”으로 사용하기 위한 표준 약학적 관행에 따라 제형화될 수 있다. 이러한 분자를 포함하는 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 활택제(glidant), 희석제, 또는 부형제를 함유할 수 있으며, 이는 조성물의 투여를 용이하게 하고 및/또는 작용 부위로의 조성물의 전달을 용이하게 한다. 적합한 담체, 희석제 및 부형제는 당업계에 잘 알려져 있으며 탄수화물(carbohydrates), 왁스(waxes), 수용성 및/또는 팽윤성 중합체, 친수성 또는 소수성 물질, 젤라틴, 오일, 용매, 물 등과 같은 물질을 포함한다. 본 개시의 조성물은 임의의 적합한 형태, 예를 들어 정제(tablets), 환약(pills), 파우더, 로렌지(lozenges), 봉지(sachets), 캐슈(cachets), 엘릭시르제(elixirs), 현탁액(suspensions), 에멀젼(emulsions), 용액(solutions), 시럽, 에어로졸 (고체 또는 액체 매질(medium)로서), 몇 가지 비-제한적 대안을 언급하는 것으로서 예를 들어, 최대 10 중량%의 활성 화합물, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 좌약, 멸균 주사 용액, 및 멸균 포장 파우더를 함유하는 연고일 수 있다. 이러한 조성물 (또는 제제)은 통상적인 용해 및 혼합 절차와 같은, 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 제조 될 수있다.

일 실시예에서, 본 개시의 제형은 동결건조된 제형, 분쇄된 파우더, 또는 수용액의 형태로 다양한 경로 및 투여 유형으로 제조될 수있다.

일 실시예에서, CD137/HER2 이중특이적 제제는 표적 단백질 농도가 약 25 mg/mL 인 수용액으로 제형화된다. 일 실시예에서, 서열번호: 76 및 77의 상업적 제형은 정맥내 주입을 위해 방부제가 없는 용액의 형태로 약 1200mg/20mL (60mg/mL)의 서열번호: 76 및 77을 함유하는 데 사용될 수 있다.

본 개시의 추가적인 목적, 이점, 및 특징은 제한하려는 의도가 아니며 하기 실시예 및 그의 첨부된 도면을 검토하면 당업자에게 명백해질 것이다. 따라서, 본 개시는 예시적인 실시예들 및 선택적 특징들에 의해 구체적으로 개시되지만, 본원에 개시된 본 개시에 구현된 개시 내용의 수정 및 변형은 당업자에 의해 의지될 수 있으며, 이러한 수정 및 변형은 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

실시예

실시예 1: CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 항체의 조합물에 의해 유도된 T-세포 활성화의 평가

T-세포 반응을 공동자극하기 위해, 고정 몰비로 항-PD-1 항체와 조합하여 사용될 때, 서열번호: 81 및 80에 제시된 CD137/HER2 이중특이적 제제의 능력을 평가하기 위해 T 세포 분석을 사용하였다. 이를 위해, CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 및 서열번호: 72 및 73에 제시된 PD-1 항체의 조합물을 포도상구균 장독소 B (enterotoxin B, SEB) 자극 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 첨가했으며, 종양 세포주 NCI-N87의 존재하에 37℃에서 3 일 동안 배양하였다. T-세포 활성화의 증명으로서, IL-2 분비 수준은 상청액에서 측정되었다.

건강한 지원자 기증자로부터의 PBMC는 Biochrom의 프로토콜에 따라 폴리수크로스(polysucrose) 밀도 경사 (Biocoll, 1.077 g/mL, Biochrom)를 통한 원심분리에 의해 버피 코트에서 단리되었다. 정제된 PBMC를 90% FCS 및 10% DMSO로 구성된 완충액에 재현탁하고, 즉시 동결시키고 추가 사용까지 액체 질소에 보관하였다. 분석을 위해, PBMC를 해동하고 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Life Technologies)이 보충된 배양 배지 (RPMI 1640, Life Technologies)에 가습된 5% CO₂ 대기에서 37℃로 16 시간 동안 나두었다.

다음 절차는 각 실험 조건을 삼중으로 사용하여 수행되었다: 증식을 차단하기 위해 종양 세포주 NCI-N87을 37℃에서 30 ㎍/ml 미토마이신 C (Sigma Aldrich)로 30 분 동안 처리하였다. 그런 다음 미토마이신 처리된 세포를 배양 배지에서 2 회 세척하고 384 웰 플랫-바닥 조직 배양 플레이트에 웰당 2.5x10⁴ 세포로 플레이팅하여 가습된 5% CO₂ 대기에서 37℃ 밤새 접착할 수 있도록 하였다. 표적 세포는 이전에 표준 조건에서 성장하고 Accutase (PAA Laboratories)를 사용하여 분리되고, 배양 배지에 재현탁되었다.

다음 날, PBS로 2회 세척한 후 웰당 2.5x10⁴ PBMC를 종양 세포에 첨가하였다. 전형적으로 0.001 nM 내지 100 nM 범위를 갖는, CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 및 PD-1 항체 (서열번호: 72 및 73) (1:10 몰비)의 조합물, CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 단독, 또는 PD-1 항체 (서열번호: 72 및 73) 단독의 희석 시리즈는, 0.05 ng/mL SEB와 함께, 각각의 웰에 첨가하되었다. 플레이트를 가스 투과성 씰 (4도)로 덮고 가습된 5% CO₂ 대기에서 37℃로 3일 동안 배양하였다. 이어서, 다음 절차에 설명된대로 인간 IL-2 DuoSet 키트 (R&D Systems)를 사용하여 상청액의 IL-2 수준을 평가하였다.

384 웰 플레이트를 PBS에서 1 μg/mL "인간 IL-2 포획 항체(Human IL-2 Capture Antibody)"로 실온에서 2 시간 동안 코팅하였다. 이어서, 0.05% Tween (PBS-T)이 보충된 80 μl PBS로 웰을 5 회 세척하였다. 1% 카제인(casein) (w/w)을 포함하는 PBS-T에서 1 시간 차단 후, 분석 상청액 및 배양 배지에 희석된 IL-2 표준의 농도 시리즈를 각가의 웰로 옮기고 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 0.5% 카제인을 함유한 PBS-T에 100 ng/mL 염소 항-hIL-2-Bio 검출 항체 (R&D Systems)와 1μg/mL 설포태크(Sulfotag)-표지 스트렙타비딘 (Mesoscale Discovery)의 혼합물을 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후, 25 μL 판독 완충액 (Mesoscale Discovery)을 각 웰에 추가하고 결과적인 전기화학발광 (ECL) 신호를 Mesoscale Discovery 판독기를 사용하여 검출하였다. Mesoscale Discovery 소프트웨어를 사용하여 분석 및 정량화를 수행하였다.

대표적인 실험의 결과는 도 1에 묘사되어 있으며 유도된 IL-2 분비에 맞는 EC₅₀은 표 1에 요약되어 있다. hIgG4 아이소타입 대조군 항체를 테스트하여 기저 활성을 설정하였다. CD137/HER2 이중 특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 및 PD-1 항체 (서열번호: 72 및 73)의 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 또는 PD-1 항체 단독과 비교하여 개선된 (낮은) EC₅₀ 값으로, IL-2의 용량-의존적 분비를 유도할 수 있었다. 한편, 조합물에 의해 유도된 IL-2 수준은 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 또는 PD-1 항체 (서열번호: 72 및 73)의 등몰(equimolar) 농도에 비해 더 높았으며, 상승적인 또는 부가적인 효과를 보였다.

표 1: IL-2 분비 유도의 효과

실시예 2: PD-1 항체와 조합된 CD137/HER2 이중특이적 제제에 의해 유도된 T-세포 활성화 평가

고정된 농도의 PD-1 항체와 조합하여 사용하는 경우, T-세포 반응을 공동자극하는 서열번호: 81 및 80에 나타낸 CD137/HER2 이중특이적 제제의 능력을 평가하기 위해, 또다른 T 세포 분석을 사용하였다. 이를 위해, 다양한 농도의 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 및 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75에 제시된 PD-1 항체의 조합물을 종양 세포주 NCI-N87의 존재하에 SEB 자극된 인간 PBMC에 고정된 농도로 첨가하고 37℃에서 3 일 동안 배양하였다. T-세포 활성화의 증명으로서 IL-2 분비 수준은 상청액에서 측정되었다.

건강한 지원 기증자로부터의 PBMC를 단리하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 처리하였다. 종양 세포주 NCI-N87을 처리하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 분석 전날 웰당 2.5x10⁴ 세포로 플레이팅하였다.

다음 절차는 각 실험 조건을 삼중으로 사용하여 수행되었다: NCI-N87 코팅된 플레이트를 PBS로 2 회 세척하고 웰당 2.5x10⁴ PBMC를 종양 세포에 첨가하였다. 0.0002 nM 내지 10 nM 범위의 다양한 농도의 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80), 단독으로 또는 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75의 10 nM 또는 100 nM을 조합하여 1 ng / mL SEB와 함께 각 웰에 첨가하였다. 동일한 실험에서, PD-1 항체 (서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75)도 비교를 위해 단독으로 적정되었다. 그런 다음 플레이트를 가스 투과성 씰 (4도)로 덮고 가습된 5% CO₂ 대기에서 37℃로 3 일 동안 배양하였다. 그 후, 상청액의 IL-2 수준을 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가하였다.

대표적인 실험의 결과는 도 2에 나와있다 (10 nM 및 3.33 nM에서 테스트된 CD137/HER2 이중특이적 제제; 다른 농도의 데이터는 표시되지 않음). 테스트된 PD-1 항체 (서열번호: 72 및 73 및 서열번호: 74 및 75)와 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80)의 조합물은 더 높은 IL-2 분비를 유도했고, 상승적으로 또는 부가적으로 행동했다. CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80)를 서열번호: 72 및 73과 조합했을 때, 유도된 IL-2 분비 수준은 10nM 항체를 사용할 때 보다 100nM 항체를 사용할 때 더 높았다. 한편, 서열번호: 74 및 75의 농도 (100nM 또는 10nM)는 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80)와 조합하여 사용될 때 IL-2 분비에 영향을 미치지 않았다.

실시예 3: 상이한 수준의 HER2 및/또는 PD-L1을 발현하는 종양 세포의 존재하에 PD-L1 항체와 조합된 CD137/HER2 이중특이적 제제에 의해 유도된 T-세포 활성화의 평가

서열번호: 81 및 80에 제시된 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제의 조합물이 HER2 표적 의존적 방식으로 T-세포 활성화를 공동자극하는 능력을 평가하기 위해, 추가적 T 세포 분석을 사용하였다. 상이한 농도의 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80)와 서열번호: 76 및 77로 제시된 고정된 농도의 PD-L1 항체의 조합물은 상이한 HER2 및/또는 PD-L1 발현 수준을 갖는 종양 세포주의 존재하에서, T 세포를 자극하기 위해 SEB에 적용되었다. 테스트된 종양 세포주는 NCI-N87 (HER2 높음, PD-L1 낮음), JIMT-1 (HER2 보통, PD-L1 보통) 및 MDA-MB-231 (HER2 낮음, PD-L1 보통)을 포함한다.

건강한 지원 기증자로부터의 PBMC가 단리되었고 실시예 1에 기재된 바와 같이 처리되었다.

다음 절차는 각 실험 조건을 삼중으로 사용하여 수행되었다: 종양 세포주 NCI-N87, JIMT-1 및 MDA-MB-231을 실시예 1에 기재된 대로 미토마이신 C로 성장 또는 처리하고 가습된 5% CO₂ 대기에서 37℃로 접착되도록 밤새 배양 배지에서 웰당 8.3 x10³ 세포로 플레이팅하였다. 다음 날, 종양 세포가 코팅된 플레이트를 PBS로 2 회 세척한 후, 웰당 2.5 x 10⁴ PBMC를 각 웰에 첨가하였다. 0.0002 nM 내지 10 nM 범위의 다양한 농도의 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80), 단독 또는 100 nM의 PD-L1 항체 (서열번호: 76 및 77) 또는 hIgG4 아이소타입 대조군 항체와 조합하여 0.05 ng/mL SEB와 함께, 각각의 웰에 첨가하였다. 동일한 실험에서, PD-L1 항체도 비교를 위해 단독으로 적정되었다. 그런 다음 플레이트를 가스 투과성 씰 (4도)로 덮고 가습된 5% CO₂ 대기에서 37℃로 3 일 동안 배양하였다. 그 후, 상청액의 IL-2 수준을 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가하였다.

2.5 nM 및 0.16 nM의 농도에서 테스트된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80)의 예시적인 데이터는 도 3 (다른 농도에서의 이중특이적 제제의 데이터는 도시되지 않음)에 제시되어 있다. CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 및 PD-L1 항체 (서열번호: 76 및 77) 조합물의 존재 하에서 NCI-N87 (HER2 높음, PD-L1 낮음) 또는 JIMT-1 (HER2 보통, PD-L1 보통)과 T 세포의 공동-배양은 이중특이적 제제 또는 항체 단독 또는 이중특이적 제제 및 hIgG4 아이소타입 대조군 항체의 조합물과 비교하여 통계적으로 유의하게 증가된 IL-2 분비를 유도했다 (도 3A 및 3B). 추가적으로, CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80) 및 PD-L1 항체 (서열번호: 76 및 77)의 조합물과 MDA-MB-231 (HER2 낮음, PD-L1 보통)의 공동-배양이 더 높은 IL-2 분비를 유도하였으나, 항체가 단독으로 사용되었을 때와 동일한 정도로만 증가되었다. 이것은 MDA-MB-231에 대한 Her2 발현이 CD137/HER2 이중특이적 제제가 어떠한 효과를 갖기에 충분하지 않기 때문일 수도 있다.

전반적으로, 데이터는 T 세포를 활성화 또는 IL-2 분비를 증가시키는 능력에 의해 측정된, PD-L1 항체 (서열번호: 76 및 77)와 조합된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80)의 기능적 활성이 상승적이거나 부가적이며, 종양 세포에 대한 Her2 및 PD-L1 발현 프로파일에 의존한다는 것을 나타낸다.

실시예 4: 인간 PBMC가 접목된 이종이식 마우스 모델에서 기능적 생체 내 활성 평가

서열번호: 81 및 80에 제시된 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 제공된 조합물의 생체 내(in vivo) 활성을 조사하기 위해, 세포주-유래 이종이식 마우스 모델이 사용되었다. 따라서, 인간 암 세포주는 적어도 1 주 격리되어 4-6주령에 전달된 면역 결핍 NOG 마우스 피하로 이식된다. 종양이 약 80-100 mm³의 부피에 도달한 후 마우스는 인간 PBMC로 대체된다. 테스트 분자(들)은 적어도 3회 주입되고 종양 성장 및 활성이 지속적으로 측정되었다. 연구 종료에 도달한 후, 마우스는 희생되었다. CD3-, CD4- 및 CD8-양성 세포의 종양내 침윤은 면역조직화학을 통해 평가되었다. IFN-감마 RNA범위는 추가 판독으로 수행되었다.

실시예 5: CD137 인간화 마우스 모델에서 기능적 생체내 활성 평가

서열번호: 81 및 80에 제시된 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 제공된 조합물의 생체 내 활성을 조사하기 위해, 인간 Her2를 과-발현하는 마우스 세포주-유래 이종이식 마우스 모델이 사용되었다. 따라서, 마우스 암 세포주는 적어도 1주 격리되어 8-10주령에 전달된 인간화 CD137 C57b 마우스 피하로 이식되었다. 종양이 약 50-80 mm³의 부피에 도달한 후, 마우스는 균질한(homogeneous) 군에 무작위화되었다. 테스트 분자(들)은 적어도 3회 주입되고 종양 성장 및 활성이 지속적으로 측정되었다. 연구 종료에 도달한 후, 마우스는 희생되었다. CD3-, CD4- 및 CD8-양성 세포의 종양내 침윤은 면역조직화학을 통해 평가되었다. IFN-감마 RNA범위는 추가 판독으로 수행되었다.

실시예 6: PD-1 축 억제제와 조합된 CD137/HER2 이중특이적 제제의 임상 연구

상기 논의된 데이터는 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물이 종양 미세환경에서 T 세포 활성화를 자극하기 위해 부가적 또는 상승적으로 작용할 수 있음을 나타낸다. 따라서 이러한 조합물은 암 환자에게 임상적 이점을 제공할 수 있다.

특정 HER2 양성 진행성 또는 전이성 고형 종양을 갖는 환자에서 서열번호: 76 및 77에 제시된 PD-L1 항체와 조합된 서열번호: 81 및 80에 제시된 CD137/HER2 이중특이적 제제의 개방-표지의, lb 상 용량 증량 연구는 최대 허용 용량 (MTD) 및 2 상 용량 (RP2D)을 결정하기 위해 설계되었다. 2 차 목표에는 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-L1 항체 조합물의 효능, 안전성, 약동학, 및 면역원성을 평가하는 것이 포함된다. 탐색적 목표는 조합물, CD137/HER2 이중특이적 제제 노출-반응 관계, 및 바이오마커의 예비 항종양 활성을 평가하는 것을 포함한다. 본 연구는 용량 증량 기간과 확장 기간이 포함된다 (도 4A).

하나의 치료 주기는 21 일로 정의되며 Q3W가 제공된 PD-L1 항체 (서열번호: 76 및 77)와 조합된 3 주마다 (Q3W) 제공되는 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 89)의 정맥내 주입으로 구성된다 (도 4B). 환자는 CD137/HER2 이중특이적 제제를 각 주기의 첫째 날에 2-시간 정맥내 주입으로 투여한 후 즉시 60 (± 15) 분에 걸쳐 PD-L1 항체 (1200mg 고정 용량)가 투여된다. PD-L1 항체의 후속 용량은 첫 번째 용량이 잘 견디는 경우 30 (±　10) 분에 걸쳐 투여될 수 있다.

주어진 용량 수준에서 초기 2 명의 환자에게 투여하는 것은 최소 7 일만큼 시차를 둔다. 첫 번째 환자가 8 일째 방문을 완료한 후 안전성 검토가 수행된다. 첫 번째 환자에 대해 용량-제한 독성 (DLT)이 관찰되지 않으면, 두 번째 환자에 대해 시차를 72 시간으로 줄일 수 있다. 처음 두 환자에서 DLT가 관찰되지 않으면 후속 환자에 대해 시차(staggering)가 필요하지 않다. 본원에서 사용되는 바와 같이, DLT는 주기 1에서 발생하는 역효과 (adverse effect, AE)로 정의되며, 다른 원인을 식별할 수 없고 (따라서 연구 치료와 관련이 있을 가능성이 있다) 사전-설정된 기준 중 적어도 하나를 충족한다. 독성은 NCI CTCAE, 버전 4.03 지침에 따라 등급이 지정되고 문서화된다. 주기 1이 완료되기 전에 중단한 환자는 교체되었다.

용량 증량은 수정된 독성 확률 간격 (modified toxicity probability interval, mTPI) 적응 설계를 사용하여 진행하여 용량을 권장하고 1200 mg의 PD-L1 항체 (서열번호: 76 및 77)의 승인된 용량과 조합된 CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80)의 최대 허용 용량 (MTD)을 추정한다. mTPI 설계는 평가중인 용량 수준에서 관찰된 DLT 수를 기반으로, 동일한 용량을 상승, 감소 또는 유지하거나 또는 용량 증량을 중지하도록 권장하는 사전-지정된 결정 매트릭스를 갖는 모델-기반 접근방식이다. 용량 수준으로 정의된 MTD는 추정된 독성 확률이 0.3에 가까웠다. 3 내지 6 명의 대상체가 각 용량 증량 코호트에 등록될 것으로 예상되었다. 환자-내 용량 증량은 허용되지 않았다.

용량 증량은 PD-L1 항체 Q3W 1200mg의 고정 용량과 함께 3 주마다 (Q3W) 0.05mg/kg의 용량 수준에서 시작한다. 이 용량 내에서 최소 3 명의 대상체가 표적 용량 수준으로 처리되고 DLT 평가 기간을 통해 평가된 후, mTPI 모델이 확대를 권장하면 다음 용량 수준에 대한 등록을 시작할 수 있다. mTPI 모델의 권장사항은 DLT 만을 기반으로 한다. 그러나, 테스트될 후속 용량을 결정할 때 사용가능한 모든 안전성 데이터와 새로운 PK, 지속성 및 약력학(pharmacodynamics) 데이터, 및 DLT 모델링 권장사항이 고려된다. 용량 증량은 MTD에 도달할 때까지, 최대 시료 크기 (30 명의 대상체)에 도달할 때까지, 또는 안전 또는 과소 투여 효과에 대한 중지 규칙이 먼저 발생하는 시점까지 계속된다. CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-L1의 용량 수준은 표 2에 따라 용량 증량 기간 동안 테스트되었다. CD137/HER2 이중특이적 제제의 용량은 치료 변형에 기초하여 적절하게 조정되거나 중단된다.

표 2: 용량 증량 기간에서 평가된 D137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-L1 항체의 용량

일단 MTD가 확립되면, 연구의 확장 기간은 용량-증량 기간으로부터 확립된 RP2D의 안전성 및 관용성 외에도 예비 효능 및 PD 효과를 조사한다.

투여는 연구 치료 중단 기준이 충족될 때까지 (질병 진행 또는 연구에서 철회) 또는 최대 30주기까지 계속된다. 환자는 투여 초기 24 주 (처음 8주기) 동안 6 주마다 및 24 주 스캔 후 12 주마다 종양 반응/진행에 대해 평가된다.

용량-측정 코호트의 경우, 주어진 코호트의 마지막 환자가 적어도 1주기의 연구 치료를 완료한 후, 모든 안전성 데이터를 검토하여 용량 증량을 계속할지 또는 중지할지 여부를 결정하고, 개별 용량 수준을 확장하여 추가 안전성 데이터를 얻고, MTD 및/또는 RP2D를 결정하거나, 또는 다른 용량 수준/일정을 탐색한다.

제형 - CD137/HER2 이중특이적 제제 (서열번호: 81 및 80)는 주입을 위해 16의 공칭(nominal) 충전물이 있는 20-mL 유형 I USP/유럽 약전 유리 바이알에 수용액으로 제공되었다. CD137/HER2 이중특이적 제제는 20mM 히스티딘, 250mM 솔비톨, pH 6.3, 0.01 % PS80에서 25mg/mL의 표적 단백질 농도로 제형화되었다. PD-L1 항체 (서열번호: 76 및 77)는 일회용(single-use), 20-cc 유형 1 USP/유럽 약전 유리 바이알에 수용액으로 제공되었다. 바이알은 20mM 히스티딘 아세테이트, 120mM 수크로스, 0.04% 폴리소르 베이트 20, pH 5.8에서 60mg/mL로 제형화된 PD-L1 항체 20mL (1200mg)를 전달하도록 설계되었다.

안전성 평가 - CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-L1 항체의 안전성 및 관용성(tolerability)은 AE (발생률 및 중증도), 수행 상태, 신체 검사, 12-리드 휴식 심전도 (electrocardiograms, ECG), LVEF 평가 및 실험실 안전성 평가를 기반으로 평가된다. 실험실 이상 및 AE는 NCI CTCAE v4.03에 따라 등급이 매겨진다. 면역-연관 (immune-related, ir) AE의 관리는 면역-연관 (ir) AE의 취급에 대한 자세한 지침을 제공한다. AE, ECG, LVEF 평가 및 실험실 데이터는 연구 중에 지속적으로 검토 및 요약된다. 적어도 연구의 1회 용량을 치료받은 모든 환자는 안전성 분석에 포함된다.

약동학적 평가 - CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-L1 항체의 단일 및 다중 용량 약동학적 프로파일은 다음 매개 변수를 사용하여 연구 과정 동안 조사된다: (1) 농도-시간 곡선의 적분 (농도-시간 곡선 아래 영역, AUC); (2) 최대 혈장, 혈액, 혈청, 또는 기타 체액 약물 농도 (C_max); (3) Cmax에 도달하는 시간 (T_max); (4) 말단 반감기 (t_1/2); (5) 단위 시간 클리어런스(clearance) 당 약물이 제거된 혈장의 부피 (클리어런스, CL); (6) 최종 상(terminal phase) 동안의 외관 분포 부피 (Vz); 및 (7) 축적 비율 (AR; AR = C_max (다중 용량)/C_max (단일 용량)).

CD137/HER2 이중특이적 제제의 약동학 평가를 위해, 전-이중특이적 제제 주입에서 플러시를 포함한 이중 특이성 약제 주입 종료 후 주기 1 및 3 동안 및 5 분, 4, 8, 24, 48, 72, 168, 및 336 시간 동안 모든 환자로부터 말초 정맥혈 (4mL)이 수집된다. 또한 시료는 이중특이적 제제의 정량화를 위해 주기 2, 4-6, 8, 12 및 16의 첫째 날에 전-이중특이적 제제 주입을 수집한다.

PD-L1 항체의 약동학 평가를 위해, 플러시를 포함한 PD-L1 항체 주입 종료 후 40분에, 전-항체 주입에서 주기 1 동안 모든 환자로부터 말초 정맥혈 (4 mL)이 수집된다. 또한 시료는 PD-L1 항체의 정량화를 위해 주기 2, 4, 8, 12, 16의 첫째 날에 전-항체 주입을 수집한다.

약력학적 평가 - CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-L1 항체의 약력학적 반응은 종양 생검에서 림프구 아형(subtype) 또는 마커 또는 혈장에서 말초 혈액 및 사이토카인 수준을 정량화함으로써 평가된다. 분석을 위해 계획된 선택된 약력학적 마커 (시료는 미리 특정된 시점에 투여 전 및 투여 후 채취됨)가 표 3에 나와 있다.

표 3: 평가된 약력학적 마커

바이오마커 평가 - 말초 혈액 및 신선한 종양 조직은 치료 전 및 치료시 선택된 시점 (종양 생검)에서 수집된다. 지정된 분석 완료 후 사용할 수있는 잔여 시료 재료는 현지 법률 또는 규정에서 금지하지 않는 한 추가 약력학적 또는 예측 마커를 식별하거나 질병 생물학에 대한 이해를 높이는 데 사용된다. 환자의 프라이버시를 보장하기 위해 시료는 익명화된다.

효능 평가 - CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-L1 항체의 효능은 RECIST 버전 1.1에 따라 종양 반응 및 진행을 평가하여 평가된다. 환자는 투여 초기 24 주 (처음 8 주기) 동안 6 주마다 평가된다. 24 주 스캔 후, 12 주마다 종양 평가가 수행된다. 종양 평가는 임상 검사 및 적절한 영상 기법, 예컨대, RECIST에 따라 적절한 슬라이스 두께로 가슴, 복부, 및 골반의 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔으로 구성된다. 자기 공명 영상 (MRI), X-레이, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 스캔, 및 초음파와 같은 다른 연구는 필요에 따라 수행된다. 기준선에서 병변을 감지하는 데 사용되는 것과 동일한 방법을 사용하여 임상 연구 전체에서 동일한 병변을 추적한다.

면역원성 평가 - CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-L1 항체의 면역원성은 정맥혈 시료의 항약물 항체 수준을 기준으로 평가된다. 또한 농도/부작용 반응 - 면역원성 관계를 그래픽으로 조사하고, 스크리닝 면역원성 존재의 변화와 CD137/HER2 이중특이적 제제의 혈청 농도 간의 관계를 특성화하기 위해 표로 작성했다. 면역원성과 다른 종점 (주요 안전성, 효능 및 바이오마커 매개변수) 간의 잠재적 상관관계도 평가된다.

통계적 방법 - 데이터의 표형식 요약은 본질적으로 서술적이다 (즉, 환자 수 [n], 평균, 표준 편차, 연속 변수의 경우 중앙값, 계량형 변수의 경우 최소값 및 최대값, 범주형 변수의 경우 n 및 백분율). 분석 방법에 대한 자세한 설명은 임상 데이터베이스 잠금 이전에 완료되는 통계 분석 계획 (SAP)에 제공된다.

본 명세서에 예시적으로 설명된 실시예들은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재에도 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, "포함하는", "함유하는", "담고 있는" 등의 용어는 제한없이 확대되어 해석될 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로서 사용되었지만 제한이 아니며, 도시되고 설명된 특징 또는 그 일부의 등가물을 배제하는 용어 및 표현의 사용에 대한 의도는 없지만, 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 인식해야 한다. 따라서, 본 실시예가 바람직한 실시예 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 통상의 기술자라면 이들의 수정 및 변형이 가능할 수 있으며, 이러한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다. 본원에 기술된 모든 특허, 특허 출원, 참고서 및 상호-심사 간행물은 그 전체가 본원에 참고로 인용되어 있다. 또한, 본 명세서에 레퍼런스로 포함된 레퍼런스 문헌의 용어의 정의 또는 사용이 일관성이 없거나 본 명세서에 제공된 그 용어의 정의와 상반되는 경우, 본 명세서에 제공된 용어의 정의 및 레퍼런스 문헌에서의 해당 용어의 정의가 적용되지 않는다. 일반적인 개시 내용에 속하는 더 좁은 종 및 하위 전제 군도 각각이 본 발명의 일부를 형성한다. 제거된 물질이 본 명세서에서 구체적으로 인용되는지의 여부에 상관없이 속으로부터 임의의 구성을 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 갖는 본 발명의 포괄적인 설명을 포함된다. 또한, 특징이 마쿠쉬 그룹으로 기술되는 경우, 본 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 또한 마쿠쉬 그룹의 구성원의 개별 구성원 또는 서브 그룹의 점에서 기술됨을 인식할 것이다. 추가 실시예는 다음의 청구항으로부터 명백해질 것이다.

균등물(equivalents): 통상의 기술자는 일상적인 실험만을 사용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시예에 대한 다수의 균등물을 인식할 수 있거나 또는 확인할 수 있다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 본 명세서에 참고로 인용된 것처럼 동등한 정도로 본 명세서에 레퍼런스로 포함된다.

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SEQUENCE LISTING <110> Pieris Pharmaceuticals GmbH <120> Combination therapies comprising CD137/HER2 bispecific agents and PD-1 axis inhibitors and uses thereof <130> PIE16492PCT <150> EP18191041.5 <151> 2018-08-27 <160> 112 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu 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cgtgttcccc ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 420 tctaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcctgt gaccgtgagc 480 tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcaatcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgaca gtgccctcct ccagcctggg caccaagacc 600 tacacctgta acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660 aaatacggcc ctccctgccc cccctgccct gcccctgaag cggcgggcgg accttccgtg 720 tttctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 780 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaagat ccagaggtgc agttcaactg gtatgttgac 840 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960 tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccctcc agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1020 ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gccaggaaga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttctacc cctccgacat tgccgtggaa 1140 tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg acagtggata agtcccggtg gcaggaaggc 1260 aatgtgttct cctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagtcc 1320 ctgtccctga gcctgggcaa g 1341 <210> 108 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Trastuzumab LC <400> 108 gacatccaga tgacacagtc tccctcttcc ctgtccgctt ctgtgggcga tcgagtgaca 60 atcacctgta gggctagtca ggatgtgaat actgctgttg cttggtacca gcagaaacca 120 ggaaaagccc ctaaactgct gatctactct gcctcattcc tgtactctgg ggtgccttct 180 cgattcagtg gttctagatc tggcaccgat ttcacactga ccatttcttc actgcaacct 240 gaggattttg ccacctacta ctgtcagcag cactacacaa cacctcccac atttggccag 300 ggcacaaaag tggagatcaa acggaccgtg gcggcgcctt ctgtgttcat tttcccccca 360 tctgatgaac agctgaaatc tggcactgct tctgtggtct gtctgctgaa caacttctac 420 cctagagagg ccaaagtcca gtggaaagtg gacaatgctc tgcagagtgg gaattcccag 480 gaatctgtca ctgagcagga ctctaaggat agcacatact ccctgtcctc tactctgaca 540 ctgagcaagg ctgattacga gaaacacaaa gtgtacgcct gtgaagtcac acatcagggg 600 ctgtctagtc ctgtgaccaa atccttcaat aggggagagt gc 642 <210> 109 <211> 1920 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion protein <400> 109 gaagtccagc tggtcgaatc tggtggtggc ctggtccagc ctggtggatc actgagactg 60 tcctgtgctg cttctggttt caacatcaag gacacctaca tccattgggt cagacaggca 120 cctggcaagg gactggaatg ggtcgcccga atctacccta caaacggcta cactcgctac 180 gccgactccg tcaagggacg ctttaccatc tccgccgaca cctctaaaaa caccgcctac 240 ctgcaaatga atagtctgag ggccgaggat actgctgtgt actactgctc acgatgggga 300 ggcgacggct tttacgctat ggattactgg ggacagggaa ctctggtcac tgtctcgagc 360 gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 420 tctaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcctgt gaccgtgagc 480 tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcaatcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgaca gtgccctcct ccagcctggg caccaagacc 600 tacacctgta acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660 aaatacggcc ctccctgccc cccctgccct gcccctgaag cggcgggcgg accttccgtg 720 tttctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 780 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaagat ccagaggtgc agttcaactg gtatgttgac 840 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960 tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccctcc agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1020 ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gccaggaaga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttctacc cctccgacat tgccgtggaa 1140 tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg acagtggata agtcccggtg gcaggaaggc 1260 aatgtgttct cctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagtcc 1320 ctgtccctga gcctgggcaa gggcggtgga ggatccgggg gtgggggaag cggcggagga 1380 ggtagccagg actctactag tgatctgatc ccggcaccgc cactgtcaaa agtccctctg 1440 caacaaaact ttcaagacaa tcagtttcac ggcaaatggt atgtggtcgg ccaggccgga 1500 aacattaggc tgcgggagga caaggacccc atcaaaatga tggctaccat ctacgagctg 1560 aaggaagaca aatcttatga tgtgacaatg gtcaagttcg acgataagaa atgcatgtac 1620 gacatctgga ccttcgtgcc cggctcccag ccgggagagt tcaccctggg caagatcaag 1680 tccttccccg gccacacttc cagcctggtc cgcgtggtct cgaccaacta taatcagcat 1740 gctatggtgt tcttcaagtt cgtctttcag aatagagagg agttctacat cacactgtat 1800 ggacgcacca aggagctgac aagcgagctg aaagaaaact tcatcaggtt ttcaaagtcc 1860 ctggggctgc ccgaaaatca tatcgtgttc ccagtcccca tcgaccagtg tattgatggt 1920 <210> 110 <211> 1221 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion protein <400> 110 gacatccaga tgacacagtc tccctcttcc ctgtccgctt ctgtgggcga tcgagtgaca 60 atcacctgta gggctagtca ggatgtgaat actgctgttg cttggtacca gcagaaacca 120 ggaaaagccc ctaaactgct gatctactct gcctcattcc tgtactctgg ggtgccttct 180 cgattcagtg gttctagatc tggcaccgat ttcacactga ccatttcttc actgcaacct 240 gaggattttg ccacctacta ctgtcagcag cactacacaa cacctcccac atttggccag 300 ggcacaaaag tggagatcaa acggaccgtg gcggcgcctt ctgtgttcat tttcccccca 360 tctgatgaac agctgaaatc tggcactgct tctgtggtct gtctgctgaa caacttctac 420 cctagagagg ccaaagtcca gtggaaagtg gacaatgctc tgcagagtgg gaattcccag 480 gaatctgtca ctgagcagga ctctaaggat agcacatact ccctgtcctc tactctgaca 540 ctgagcaagg ctgattacga gaaacacaaa gtgtacgcct gtgaagtcac acatcagggg 600 ctgtctagtc ctgtgaccaa atccttcaat aggggagagt gcggcggcgg aggatccggg 660 ggtgggggaa gcggcggagg aggtagccag gactctacta gtgatctgat cccggcaccg 720 ccactgtcaa aagtccctct gcaacaaaac tttcaagaca atcagtttca cggcaaatgg 780 tatgtggtcg gccaggccgg aaacattagg ctgcgggagg acaaggaccc catcaaaatg 840 atggctacca tctacgagct gaaggaagac aaatcttatg atgtgacaat ggtcaagttc 900 gacgataaga aatgcatgta cgacatctgg accttcgtgc ccggctccca gccgggagag 960 ttcaccctgg gcaagatcaa gtccttcccc ggccacactt ccagcctggt ccgcgtggtc 1020 tcgaccaact ataatcagca tgctatggtg ttcttcaagt tcgtctttca gaatagagag 1080 gagttctaca tcacactgta tggacgcacc aaggagctga caagcgagct gaaagaaaac 1140 ttcatcaggt tttcaaagtc cctggggctg cccgaaaatc atatcgtgtt cccagtcccc 1200 atcgaccagt gtattgatgg t 1221 <210> 111 <211> 1920 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion protein <400> 111 caggactcta ctagtgatct gatcccggca ccgccactgt caaaagtccc tctgcaacaa 60 aactttcaag acaatcagtt tcacggcaaa tggtatgtgg tcggccaggc cggaaacatt 120 aggctgcggg aggacaagga ccccatcaaa atgatggcta ccatctacga gctgaaggaa 180 gacaaatctt atgatgtgac aatggtcaag ttcgacgata agaaatgcat gtacgacatc 240 tggaccttcg tgcccggctc ccagccggga gagttcaccc tgggcaagat caagtccttc 300 cccggccaca cttccagcct ggtccgcgtg gtctcgacca actataatca gcatgctatg 360 gtgttcttca agttcgtctt tcagaataga gaggagttct acatcacact gtatggacgc 420 accaaggagc tgacaagcga gctgaaagaa aacttcatca ggttttcaaa gtccctgggg 480 ctgcccgaaa atcatatcgt gttcccagtc cccatcgacc agtgtattga tggaggaggc 540 ggaggatccg gcggaggagg aagtggcgga ggaggaagtg aagtccagct ggtcgaatct 600 ggtggtggcc tggtccagcc tggtggatca ctgagactgt cctgtgctgc ttctggtttc 660 aacatcaagg acacctacat ccattgggtc agacaggcac ctggcaaggg actggaatgg 720 gtcgcccgaa tctaccctac aaacggctac actcgctacg ccgactccgt caagggacgc 780 tttaccatct ccgccgacac ctctaaaaac accgcctacc tgcagatgaa tagtctgagg 840 gccgaggata ctgctgtgta ctactgctca cgatggggag gcgacggctt ttacgctatg 900 gattactggg gacagggaac tctggtcact gtgtctagcg ctagcaccaa gggcccctcc 960 gtgttccccc tggccccttg ctcccggtcc acctccgagt ctaccgccgc tctgggctgc 1020 ctggtgaaag actacttccc cgagcctgtg accgtgagct ggaactctgg cgccctgacc 1080 tccggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg caatcctccg gcctgtactc cctgtcctcc 1140 gtggtgacag tgccctcctc cagcctgggc accaagacct acacctgtaa cgtggaccac 1200 aagccctcca acaccaaggt ggacaagcgg gtggaatcta aatacggccc tccctgcccc 1260 ccctgccctg cccctgaagc ggcgggcgga ccttccgtgt ttctgttccc cccaaagccc 1320 aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc 1380 caggaagatc cagaggtgca gttcaactgg tatgttgacg gcgtggaagt gcacaacgcc 1440 aagaccaagc ccagagagga acagttcaac tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc 1500 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1560 ctgccctcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggccaagg gccagccccg cgagccccag 1620 gtgtacaccc tgccccctag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt 1680 ctggtgaaag gcttctaccc ctccgacatt gccgtggaat gggagtccaa cggccagccc 1740 gagaacaact acaagaccac cccccctgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac 1800 tctcggctga cagtggataa gtcccggtgg caggaaggca atgtgttctc ctgcagcgtg 1860 atgcacgagg ccctgcacaa ccactatacc cagaagtccc tgtccctgag cctgggcaag 1920 <210> 112 <211> 1221 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion protein <400> 112 caggactcta ctagtgatct gatcccggca ccgccactgt caaaagtccc tctgcaacaa 60 aactttcaag acaatcagtt tcacggcaaa tggtatgtgg tcggccaggc cggaaacatt 120 aggctgcggg aggacaagga ccccatcaaa atgatggcta ccatctacga gctgaaggaa 180 gacaaatctt atgatgtgac aatggtcaag ttcgacgata agaaatgcat gtacgacatc 240 tggaccttcg tgcccggctc ccagccggga gagttcaccc tgggcaagat caagtccttc 300 cccggccaca cttccagcct ggtccgcgtg gtctcgacca actataatca gcatgctatg 360 gtgttcttca agttcgtctt tcagaataga gaggagttct acatcacact gtatggacgc 420 accaaggagc tgacaagcga gctgaaagaa aacttcatca ggttttcaaa gtccctgggg 480 ctgcccgaaa atcatatcgt gttcccagtc cccatcgacc agtgtattga tggaggaggc 540 ggaggatccg gcggaggagg aagtggcgga ggaggaagtg acatccagat gacacagtct 600 ccctcttccc tgtccgcttc tgtgggcgat cgagtgacaa tcacctgtag ggctagtcag 660 gatgtgaata ctgctgttgc ttggtaccag cagaaaccag gaaaagcccc taaactgctg 720 atctactctg cctcattcct gtactctggg gtgccttctc gattcagtgg ttctagatct 780 ggcaccgatt tcacactgac catttcttca ctgcaacctg aggattttgc cacctactac 840 tgtcagcagc actacacaac acctcccaca tttggccagg gcacaaaagt ggagatcaaa 900 cggaccgtgg cggcgccttc tgtgttcatt ttccccccat ctgatgaaca gctgaaatct 960 ggcactgctt ctgtggtctg tctgctgaac aacttctacc ctagagaggc caaagtccag 1020 tggaaagtgg acaatgctct gcagagtggg aattcccagg aatctgtcac tgagcaggac 1080 tctaaggata gcacatactc cctgtcctct actctgacac tgagcaaggc tgattacgag 1140 aaacacaaag tgtacgcctg tgaagtcaca catcaggggc tgtctagtcc tgtgaccaaa 1200 tccttcaata ggggagagtg c 1221

Claims (38)

1. 대상체에
   (a) (i) 서열번호: 64로 표시되는 서열을 갖는 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3 도메인, (ii) 서열번호: 65로 표시되는 서열을 갖는 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3 도메인, 및 (iii) 서열번호: 21 내지 39 중 어느 하나로 표시되는 서열을 갖는 리포칼린 뮤테인을 포함하는 CD137/HER2 이중특이적 제제, 및
   (a) PD-1 축 억제제를 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
2. (a) 대상체에게 CD137/HER2 이중특이적 제제를 투여하되, 상기 대상체는 또한 PD-1 축 억제제를 투여받아, 대상체가 두 가지 모두를 치료요법으로 받는 단계, 또는
   (b) 대상체에게 PD-1 축 억제제를 투여하되, 상기 대상체는 또한 CD137/HER2 이중특이적 제제를 투여받아, 대상체가 두 가지 모두를 치료요법으로 받는 단계를 포함하되,
   상기 CD137/HER2 이중특이적 제제는 (i) 서열번호: 64로 표시되는 서열을 갖는 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR 도메인, (ii) 서열번호: 65로 표시되는 서열을 갖는 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3 도메인, 및 (iii) 서열번호: 21 내지 39 중 어느 하나로 표시되는 서열을 갖는 리포칼린 뮤테인을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암은 HER-2 양성 및/또는 PD-L1 양성인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 향상된 항-종양 효과를 제공할 수 있는 것인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제 또는 PD-1 축 억제제 단독과 비교하여 부가적인 항-종양 효과를 제공할 수 있는 것인 방법.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제 또는 PD-1 축 억제제 단독과 비교하여 상승적인(synergistic) 항-종양 효과를 제공할 수 있는 것인 방법.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-종양 효과는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법:
   (a) 종양-연관 면역 반응의 자극;
   (b) 증가된 IL-2 분비;
   (c) 종양 미세환경에서 증가된 IL-2 분비;
   (d) 증가된 IFN-감마 분비;
   (e) 종양 미세환경에서 증가된 IFN-감마 분비;
   (f) CD4+ T 세포의 확장;
   (g) 종양 미세환경에서 CD4+ T 세포의 확장;
   (h) CD8+ T 세포의 확장;
   (i) 종양 미세환경에서 CD8+ T 세포의 확장;
   (j) 종양-침윤 림프구의 확장;
   (k) NK 세포의 활성화 및 증가된 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC);
   (l) NK 세포의 활성화 및 종양 미세환경에서 증가된 ADCC;
   (m) 종양 미세환경에서 증가된 CD4의 수준;
   (n) 종양 미세환경에서 감소된 CD4의 수준;
   (o) 종양 미세환경에서 증가된 CD8의 수준;
   (p) 종양 미세환경에서 감소된 CD8의 수준;
   (q) 종양 미세환경에서 증가된 PD-L1의 수준;
   (r) 종양 미세환경에서 감소된 PD-L1의 수준;
   (s) 종양 미세환경에서 증가된 Ki67의 수준;
   (t) 종양 미세환경에서 감소된 Ki67의 수준;
   (u) 종양 미세환경에서 증가된 CD137의 수준;
   (v) 종양 미세환경에서 감소된 CD137의 수준;
   (w) 종양 미세환경에서 증가된 HER2의 수준;
   (x) 종양 미세환경에서 감소된 HER2의 수준;
   (y) 종양 미세환경에서 증가된 IL-8의 수준;
   (z) 종양 미세환경에서 감소된 IL-8의 수준;
   (aa) 종양 미세환경에서 증가된 FoxP3의 수준;
   (ab) 종양 미세환경에서 감소된 FoxP3의 수준;
   (ac) 종양 크기의 감소;
   (ad) 종양 성장의 억제;
   (ae) 종양 전이의 억제;
   (af) 재발의 지연; 또는
   (ag) 개선된 전반적인 생존율.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 적어도 하나의 투여 주기를 포함하되, 상기 주기는 약 3주의 기간이고, 상기 적어도 하나의 주기 각각에 대해 적어도 1회의 용량으로 CD137/HER2 이중특이적 제제가 투여되며 적어도 1회의 용량으로 PD-1 축 억제제가 투여되는 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제는 순차적으로 또는 동시에 투여되는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD137/HER2 이중특이적 제제는 약 0.05 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 또는 8.0 mg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 축 억제제는 항-PD-L1 항체인 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 서열번호: 76 및 77로 표시되는 서열을 갖는 것인 방법.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 약 1200 mg의 용량으로 투여되는 방법.
14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 축 억제제는 항-PD-1 항체인 방법.
15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 축 억제제는 서열번호: 72 및 73 또는 서열번호: 74 및 75로 표시되는 서열을 갖는 항체인 방법.
16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 축 억제제는 아테졸리주맙(atezolizumab), 더발루맙(durvalulmab), 아벨루맙(avelumab), 니볼루맙(nivolumab), 펨브로리주맙(pembrolizumab), 티스렐리주맙(tislelizumab), 또는 세미플리맙(cemiplimab)인 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 PD-1 축 억제제는 하기 용량으로 투여되는 방법:
    (a) 약 0.05 mg/kg CD137/HER2 이중특이적 제제 및 약 1200mg PD-1 축 억제제,
    (b) 약 0.15 mg/kg CD137/HR2 이중특이적 제제 및 약 1200mg PD-1 축 억제제,
    (c) 약 0.5 mg/kg CD137/HER2 이중특이적 제제 및 약 1200mg PD-1 축 억제제,
    (d) 약 1.0 mg/kg CD137/HER2 이중특이적 제제 및 약 1200mg PD-1 축 억제제,
    (e) 약 2.5 mg/kg CD137/HER2 이중특이적 제제 및 약 1200mg PD-1 축 억제제,
    (f) 약 5.0 mg/kg CD137/HER2 이중특이적 제제 및 약 1200mg PD-1 축 억제제, 또는
    (g) 약 8.0 mg/kg CD137/HER2 이중특이적 제제 및 약 1200mg PD-1 축 억제제.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 및 30 주기와 같은, 적어도 하나의 투여 주기를 포함하되, 상기 주기는 약 3주의 기간인 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제의 1회 용량 및 PD-1 축 억제제 1회 용량을, 3-주 주기 마다 첫째 날에, 서로에 대해 순차적으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 CD137/HER2 이중특이적 제제의 1회 용량 및 PD-1 축 억제제의 1회 용량을, 30개의 3-주 주기 동안 각 주기의 첫째 날에, 서로에 대해 순차적으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD137/HER2 이중특이적 제제는 항-HER2 항체의 각 중쇄 C-말단에 대한 링커를 통해 N-말단에서 융합된 CD137에 대해 특이적인 리포칼린 뮤테인을 포함하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 CD137에 대해 특이적인 리포칼린 뮤테인은 서열번호: 22로 표시되는 서열을 갖는 것인 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 항-HER2 항체는 서열번호: 79 및 80으로 표시되는 서열은 갖는 것인 방법.
24. 제1항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD137/HER2 이중특이적 제제는 서열번호: 81 및 80, 서열번호: 79 및 82, 서열번호: 83 및 80, 또는 서열번호: 79 및 84로 표시되는 서열을 갖는 것인 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 HER-2 양성 진행성 또는 전이성 고형 종양인 방법.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 이전에 치료받은 것인 방법.
27. 제1항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 항-HER2 치료요법으로 이전에 치료받은 것인 방법.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 PD-1 축 억제제 치료요법으로 이전에 치료받은 것인 방법.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 종양-특이적 면역 반응, 종양 크기의 감소, 종양 세포 성장의 억제, 전이의 억제, 완전 완화(complete remission), 부분 완화(partial remission), 질병의 안정화, 재발 전 기간의 연장, 생존 시간의 연장, 완전 반응, 및 부분 반응으로부터 선택되는 적어도 하나의 효과를 생성하는 방법.
30. (i) 서열번호: 64로 표시되는 서열을 갖는 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3 도메인, (ii) 서열번호: 65로 표시되는 서열을 갖는 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3 도메인, 및 (iii) 서열번호: 21 내지 39 중 어느 하나로 표시되는 서열을 갖는 리포칼린 뮤테인을 포함하는 CD137/HER2 이중특이적 제제 항체, 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 조합물로서,
    상기 조합물은 적어도 하나의 주기로 대상체에게 투여하는 것이 적합하고,
    각 주기에 대해 상기 CD137/HER2 이중특이적 제제는 약 0.05 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 또는 8.0 mg/kg의 용량으로 투여되며 상기 항-PD-L1 축 억제제는 약 1200 mg의 용량으로 투여되는 조합물.
31. 제30항에 있어서, 상기 CD137/HER2 이중특이적 제제 및 항-PD-L1 항체는 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것인 조합물.
32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 조합물은 HER2-양성 및/또는 PD-L1 양성 종양을 치료하기 위한 용도일 수 있는 것인 조합물.
33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합물은 향상된 항-종양 효과를 생성할 수 있는 것인 조합물.
34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 또는 PD-1 축 억제제 단독과 비교하여 부가적인 항-종양 효과를 생성할 수 있는 것인 조합물.
35. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합물은 CD137/HER2 이중특이적 제제 또는 PD-1 축 억제제 단독과 비교하여 상승적인 항-종양 효과를 생성할 수 있는 것인 조합물.
36. (a) (i) 서열번호: 64로 표시되는 서열을 갖는 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3 도메인, (ii) 서열번호: 65로 표시되는 서열을 갖는 경쇄 가변영역의 CDR1, CD2, CDR3 도메인, 및 (iii) 서열번호: 21 내지 39 중 어느 하나로 표시되는 서열을 갖는 리포칼린 뮤테인을 포함하는 CD137/HER2 이중특이적 제제 항체를 포함하는 약학적 조성물; 및
    (b) PD-1 축 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 부품 키트(kit of parts).
37. 제36항에 있어서, 상기 CD137/HER2 이중특이적 제제는 약 0.05 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 또는 8.0 mg/kg 단위 용량이고 상기 항-PD-L1 축 억제제는 1200 mg 단위 용량인 부품 키트.
38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 CD137/HER2 이중특이적 제제를 포함하는 약학적 조성물 및 PD-1 축 억제제를 포함하는 약학적 제제는 부가적인 또는 상승적인 항-종양 효과를 생성할 수 있는 부품 키트.
    

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