CN116249709A - 靶向4-1bb的多聚体免疫调节剂 - Google Patents
靶向4-1bb的多聚体免疫调节剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116249709A CN116249709A CN202180056934.5A CN202180056934A CN116249709A CN 116249709 A CN116249709 A CN 116249709A CN 202180056934 A CN202180056934 A CN 202180056934A CN 116249709 A CN116249709 A CN 116249709A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- multimeric protein
- targeting moiety
- seq
- multimeric
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims abstract description 189
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 title abstract description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 title abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 395
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 388
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 243
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 222
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 220
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 49
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 25
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 claims description 194
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 claims description 194
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 155
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 135
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 128
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 123
- 101001014668 Homo sapiens Glypican-3 Proteins 0.000 claims description 109
- 102100032530 Glypican-3 Human genes 0.000 claims description 103
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 89
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 89
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims description 61
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 61
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 50
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 49
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 49
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 claims description 19
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 claims description 18
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 17
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 17
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 claims description 15
- 230000003606 oligomerizing effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 claims description 14
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 12
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 5
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 abstract description 26
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 304
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 281
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 254
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 254
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 195
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 195
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 175
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 167
- 101001023833 Homo sapiens Neutrophil gelatinase-associated lipocalin Proteins 0.000 description 158
- 102000047202 human LCN2 Human genes 0.000 description 158
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 149
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 149
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 133
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 133
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 122
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 113
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 97
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 86
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 84
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 82
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 80
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 68
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 66
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 66
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 55
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 55
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 46
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 37
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 30
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 23
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 19
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 19
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 18
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 13
- -1 glycodulin Proteins 0.000 description 13
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 12
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 12
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 12
- 101000654403 Escherichia phage lambda Capsid assembly protease C Proteins 0.000 description 12
- 102100023849 Glycophorin-C Human genes 0.000 description 12
- 101000905336 Homo sapiens Glycophorin-C Proteins 0.000 description 12
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 12
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 11
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 10
- 102000013519 Lipocalin-2 Human genes 0.000 description 10
- 108010051335 Lipocalin-2 Proteins 0.000 description 10
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 9
- 102100034724 Lipocalin-1 Human genes 0.000 description 9
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 9
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010057281 Lipocalin 1 Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 7
- 101000946124 Homo sapiens Lipocalin-1 Proteins 0.000 description 6
- 101000679851 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 6
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 6
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 108091008034 costimulatory receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000050320 human TNFRSF4 Human genes 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 5
- 102000048373 human GPC3 Human genes 0.000 description 5
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 5
- 102100022954 Apolipoprotein D Human genes 0.000 description 4
- 108010025614 Apolipoproteins D Proteins 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 4
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 4
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000020385 T cell costimulation Effects 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 102000029752 retinol binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000053 retinol binding Proteins 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 101100274586 Anopheles gambiae CLIPB8 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000047200 Collagen Type XVIII Human genes 0.000 description 2
- 108010001463 Collagen Type XVIII Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000757556 Homo sapiens Apolipoprotein D Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004473 OX40 Ligand Human genes 0.000 description 2
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 description 2
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710094000 Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 2
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 239000003809 bile pigment Substances 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 229950007906 codrituzumab Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 2
- 102000056778 human APOD Human genes 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 2
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 108010000645 odorant-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 102000052563 odorant-binding protein Human genes 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 108091009565 pigment binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000012121 regulation of immune response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 108010078373 tisagenlecleucel Proteins 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000018623 Apolipoproteins M Human genes 0.000 description 1
- 108010027018 Apolipoproteins M Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102000000119 Beta-lactoglobulin Human genes 0.000 description 1
- GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N Biliverdin Natural products CC1=C(C=C)C(=C/C2=NC(=Cc3[nH]c(C=C/4NC(=O)C(=C4C)C=C)c(C)c3CCC(=O)O)C(=C2C)CCC(=O)O)NC1=O GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N Biliverdin IX Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(\C=C/2C(=C(C)C(=C/C=3C(=C(C=C)C(=O)N=3)C)/N\2)CCC(O)=O)N1 RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101710147132 Epididymal-specific lipocalin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102100034789 Epididymal-specific lipocalin-6 Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N Glu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000010956 Glypican Human genes 0.000 description 1
- 108050001154 Glypican Proteins 0.000 description 1
- 108050007237 Glypican-3 Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000899935 Homo sapiens Collagen alpha-1(XV) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000945886 Homo sapiens Epididymal-specific lipocalin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000605055 Homo sapiens Epididymal-specific lipocalin-8 Proteins 0.000 description 1
- 101000904196 Homo sapiens Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102100034721 Lipocalin-15 Human genes 0.000 description 1
- 101710155631 Lipocalin-15 Proteins 0.000 description 1
- YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N Lys-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 101710196975 Major allergen Can f 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000002030 Merkel cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101100337463 Mus musculus Gpc3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001117316 Mus musculus Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100153537 Mus musculus Tnfrsf4 gene Proteins 0.000 description 1
- CBQJSKKFNMDLON-JTQLQIEISA-N N-acetyl-L-phenylalanine Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 CBQJSKKFNMDLON-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029266 Neuroendocrine carcinoma of the skin Diseases 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102100024019 Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 102000048176 Prostaglandin-D synthases Human genes 0.000 description 1
- 108030003866 Prostaglandin-D synthases Proteins 0.000 description 1
- 102100033279 Prostaglandin-H2 D-isomerase Human genes 0.000 description 1
- 101710145576 Prostaglandin-H2 D-isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000000528 Pulmonary Surfactant-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010041520 Pulmonary Surfactant-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101000930457 Rattus norvegicus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700011201 Streptococcus IgG Fc-binding Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 108091008035 T cell costimulatory receptors Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 108010028230 Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys Proteins 0.000 description 1
- 101710165434 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 1
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- 108010001122 alpha(2)-microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940124425 anti-infective immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229960005475 antiinfective agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical class [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003852 atezolizumab Drugs 0.000 description 1
- 229950002916 avelumab Drugs 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N biliverdin-IXalpha Natural products N1C(=O)C(C)=C(C=C)C1=CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C=C)C(=O)N3)C)=N2)CCC(O)=O)N1 QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000023402 cell communication Effects 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 208000017763 cutaneous neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950009791 durvalumab Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 208000006359 hepatoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 102000057622 human COL15A1 Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 230000014925 multi-organism signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000002888 pairwise sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 108010094020 polyglycine Proteins 0.000 description 1
- 229920000232 polyglycine polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000004492 positive regulation of T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 229960003471 retinol Drugs 0.000 description 1
- 235000020944 retinol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011607 retinol Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000008786 sensory perception of smell Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 229940126625 tavolimab Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229950005972 urelumab Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/02—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution from inanimate materials
- A61K35/04—Tars; Bitumens; Mineral oils; Ammonium bituminosulfonate
- A61K35/06—Mineral oils, e.g. paraffinic oils or aromatic oils based on aromatic hydrocarbons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/303—Liver or Pancreas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/35—Valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/626—Diabody or triabody
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本公开提供了包含三个、四个或更多个单体多肽的多聚体蛋白，每个单体多肽包含第一4‑1BB靶向部分、寡聚化部分和任选的接头。所述单体多肽可以进一步包含一个或多个另外的靶向部分。所述寡聚化部分促进单体多肽的三聚化、四聚化或更高的寡聚状态。这样的多聚体蛋白可以用于许多药物应用，例如，作为抗癌剂和/或免疫调节剂。本公开还涉及制备本文所述的多聚体蛋白的方法以及包含这样的多聚体蛋白的组合物。本公开进一步涉及编码这样的多聚体蛋白的核酸分子和用于产生这样的多聚体蛋白和核酸分子的方法。此外，本申请公开了这样的多聚体蛋白以及包含一种或多种这样的多聚体蛋白的组合物的治疗和/或诊断用途。
Description
背景技术
分化簇137或CD137(也称为4-1BB或TNFRS9)是共刺激性免疫受体和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。它主要在活化的CD4+和CD8+T细胞、活化的B细胞和自然杀伤(NK)细胞上表达，但也可在静息单核细胞和树突细胞(Li和Liu，2013)或内皮细胞(Snell等人，2011)上发现。4-1BB在免疫应答的调节中起重要作用，因此是癌症免疫治疗的靶标。4-1BB配体(4-1BBL)是4-1BB唯一已知的天然配体，在几种类型的抗原呈递细胞诸如活化的B细胞、单核细胞和脾树突细胞上组成型表达，并且可以在T淋巴细胞上诱导。
在许多体内模型中已经证明了4-1BB共刺激对癌细胞消除的益处。例如，肿瘤上4-1BBL的强制表达导致肿瘤排斥(Melero等人，1998)。同样，抗4-1BB scFv在肿瘤上的强制表达导致肿瘤的CD4+T细胞和NK细胞依赖性消除(Yang等人，2007；Zhang等人，2006；Ye等人，2002)。全身性施用的抗4-1BB抗体也被证明导致肿瘤生长的延缓(Martinet等人，2002)。还显示4-1BB是人肿瘤中天然存在的肿瘤反应性T细胞的极好标志物(Ye等人，2014)，并且抗-4-1BB抗体可用于改善CD8+黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞的扩增和活性，以应用于过继性T细胞疗法(Chacon等人，2013)。4-1BB共刺激的潜在治疗益处的临床前证明刺激了靶向4-1BB的治疗性抗体的开发，包括BMS-663513(描述于美国专利No.7,288,638)和PF-05082566(Fisher等人，2012)。
4-1BBL是三聚体蛋白，其以膜结合形式存在，可以被蛋白水解切割成可溶性三聚体配体。然而，可溶性4-1BBL活化4-1BB的能力是有限的，例如，在表达4-1BB的淋巴细胞上，并且需要大浓度来引起效果(Wyzgol等，2009)，提供了证据表明诱导细胞内4-1BB需要4-1BB在细胞表面上更大规模聚集(Wyzgol等人，2009；Rabu等人，2005)。活化4-1BB的天然方式是通过4-1BB阳性细胞与4-1BBL阳性细胞的接合。然后认为4-1BB的活化是由通过4-1BBL在相对细胞上的聚集而诱导的，这导致通过TRAF1、2和3的信号传导(Snell等人，2011；Yao等人，2013)，并在4-1BB阳性T细胞中产生进一步的伴随的下游效应。在通过识别它们各自的同源靶而活化T细胞的情况下，由4-1BB的共刺激引起的效应是进一步增强的活化、增强的存活和增殖、促炎细胞因子的产生和提高的杀伤能力。
本公开尤其提供了通过一种或多种靶向4-1BB的多聚体蛋白刺激4-1BB的新方法，所述多聚体蛋白能够以FcγR非依赖性方式实现高水平的4-1BB聚簇。
II.定义
以下列表定义了本说明书中使用的术语、短语和缩写。本文列出和定义的所有术语旨在涵盖所有语法形式。
如本文所用，除非另有说明，“4-1BB”是指人4-1BB(hu4-1BB)。人4-1BB是指UniProt Q07011定义的全长蛋白质、其片段或其变体。人4-1BB由基因TNFRSF9编码。4-1BB也称为分化簇137(CD137)或肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)，它们可互换使用。食蟹猴4-1BB(cy4-1BB)是指食蟹猴的4-1BB。在一些具体实施方案中，使用非人物种的4-1BB，例如食蟹猴4-1BB和小鼠4-1BB。
如本文所用，除非另有说明，“磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3”或“GPC3”意指人GPC3(huGPC3)。人GPC3是指由UniProt P51654定义的全长蛋白、其片段或其变体。人GPC3由基因GPC3编码。在一些具体实施方案中，使用非人物种的GPC3，例如食蟹猴GPC3和小鼠GPC3。
如本文所用，除非另有说明，“OX40”是指人OX40(huOX40)。人OX40是指由UniProtP43489定义的全长蛋白、其片段或其变体。人OX40由基因TNFRSF4编码。OX40也称为分化簇134(CD134)或肿瘤坏死因子受体超家族成员4 (TNFRSF4)，它们可互换使用。食蟹猴OX40(cyOX40)是指食蟹猴的OX40。在一些具体实施方案中，使用非人物种的OX40，例如食蟹猴OX40和小鼠OX40。
如本文所用，除非另有说明，“程序性细胞死亡1配体1”或“PD-L1”是指人PD-L1(huPD-L1)。人PD-L1是指由UniProt Q9NZQ7定义的全长蛋白、其片段或其变体。人PD-L1由基因CD274编码。PD-L1也称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)。在一些具体实施方案中，使用非人物种的PD-L1，例如食蟹猴PD-L1和小鼠PD-L1。
如本文所用，“结合亲和力”描述本公开的生物分子(例如多肽或蛋白质)(例如脂质运载蛋白突变蛋白、抗体、融合蛋白、多聚体蛋白或任何其它肽或蛋白质)结合选定靶标并形成复合物的能力。结合亲和力通过本领域技术人员已知的许多方法测量，包括但不限于荧光滴定、基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的测定(包括直接和竞争性ELISA)、比色法，诸如等温滴定量热法(ITC)和表面等离子体共振(SPR)。这些方法在本领域中是公知的，并且本文进一步描述了这类方法的一些实例。结合亲和力由此报道为使用这类方法测量的解离常数值(KD)、半最大有效浓度(EC50)或半最大抑制浓度(IC50)。较低的KD、EC50或IC50值反映较好(较高)的结合能力(亲和力)。因此，可以测量和比较两种生物分子对所选靶标的结合亲和力。当比较两种生物分子对所选靶标的结合亲和力时，术语“大约相同”、“基本相同”或“基本相似”是指在结合亲和力测量的实验变异性内，一种生物分子具有报道为KD、EC50或IC50值的结合亲和力，其与另一种分子的结合亲和力相同或相似。结合亲和力测量的实验变异性取决于所使用的特定方法，并且是本领域技术人员已知的。
如本文所用，术语“基本(上)”也可指显示感兴趣的特征或性质的全部或接近全部范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象即使有也很少达到完全和/或进行到完成或者达到或避免绝对结果。因此，术语“基本(上)”在本文用于捕捉许多生物和化学现象中固有的潜在的完整性缺乏。
如本文所用，术语“检测”或“可检测的”应理解为定量和定性水平，以及它们的组合。因此，其包括对本公开的生物分子进行的定量、半定量和定性测量。
如本文所用，“可检测的亲和力”通常是指生物分子与其靶标之间的结合能力，由KD、EC50或IC50值报道，为至多约10-5M或更低。由KD、EC50或IC50值报道的高于10-5M的结合亲和力通常不再能用常规方法诸如ELISA和SPR测量，因此是次要的。
注意到本公开的生物分子与其靶标之间的复合物形成受许多不同因素影响，例如各自靶标的浓度、竞争剂的存在、所用缓冲体系的pH和离子强度、用于测定结合亲和力的实验方法(例如荧光滴定、竞争性ELISA(也称为竞争ELISA)和表面等离子体共振)，甚至用于评价实验数据的数学算法。因此，本领域技术人员清楚的是，由KD、EC50或IC50值报道的结合亲和力可在一定实验范围内变化，这取决于方法和实验设置。这意味着，测量的KD、EC50或IC50值或公差范围可能存在轻微偏差，这取决于例如这些值是通过ELISA(包括直接ELISA或竞争ELISA)、SPR还是通过其它方法测定的。
如本文所用，“对…特异(性)”、“特异性结合”或“特异性地结合”涉及生物分子区分期望靶标(例如4-1BB、OX40、PD-L1和GPC3)和一种或多种参照靶标(例如，嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的细胞受体)的能力。应理解，这种特异性不是绝对的，而是相对的性质，并且可以例如根据SPR、western印迹、ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)、放射免疫测定(RIA)、电化学发光(ECL)、免疫放射测定(IRMA)、免疫组织化学(IHC)和肽扫描来测定。
当在本公开的结合4-1BB、OX40、PD-L1和/或GPC3的多聚体蛋白的上下文中使用时，术语“对…特异(性)”、“特异性结合”或“特异性地结合”是指多聚体蛋白结合如本文所述的4-1BB、OX40、PD-L1和/或GPC3，与其反应或针对其，但基本上不结合另一种蛋白。术语“另一种蛋白质”包括不是4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3的任何蛋白质，或与4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3密切相关或同源的蛋白质。然而，术语“另一种蛋白质”不排除来自除人以外的物种的4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3和4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3的片段和/或变体。术语“基本上不结合”是指本公开的多聚体蛋白以比4-1BB、OX40、PD-L1和/或GPC3更低的结合亲和力结合另一种蛋白，即显示小于30％，优选小于20％，更优选小于10％、特别优选小于9、8、7、6或5％的交叉反应性。多聚体蛋白是否如上文定义的特异性反应可容易地测试，尤其是通过比较本公开的多聚体蛋白与4-1BB、OX40、PD-L1和/或GPC3的反应和所述多聚体蛋白与其它(另一种)蛋白的反应。
如本文所用，术语“脂质运载蛋白”是指重量约18-20kDa的单体蛋白，其具有圆柱形β折叠片超二级结构区，该结构区包含通过多个(优选四个)环在一端成对连接的多个β链(优选八个称为A至H的β链)，从而包含配体结合袋并限定该配体结合袋的入口。优选地，本发明中使用的包含配体结合袋的环是连接β链A和B、C和D、E和F、以及G和H的开放端的环，并被命名为环AB、CD、EF和GH。已充分确定的是，在本应刚性的脂质运载蛋白支架中所述环的多样性在脂质运载蛋白家族成员中产生多种不同的结合模式，每种结合模式能够适应不同大小、形状和化学特性的靶标(例如在Skerra，2000；Flower等人，2000；Flower，1996中综述)。应理解，脂质运载蛋白家族蛋白质天然进化为结合广谱配体，共有异常低水平的总体序列保守性(通常具有小于20％的序列同一性)，但仍保留高度保守的总体折叠模式。各种脂质运载蛋白中位置之间的对应性也是本领域技术人员公知的(参见例如美国专利No.7,250,297)。如本文所用，落入“脂质运载蛋白”定义中的蛋白质包括但不限于人脂质运载蛋白，包括泪脂质运载蛋白(Tlc，Lcn1)、脂质运载蛋白-2(Lcn2)或中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白(NGAL)、载脂蛋白D(ApoD)、载脂蛋白M、α1酸性糖蛋白1、α1酸性糖蛋白2、α1微球蛋白、补体成分8γ、视黄醇结合蛋白(RBP)、附睾视黄酸结合蛋白、glycodelin、气味结合蛋白IIa、气味结合蛋白IIb、脂质运载蛋白-15(Lcn15)和前列腺素D合酶。
如本文所用，除非另有说明，“泪脂质运载蛋白”是指人泪脂质运载蛋白(hTlc)，并且还指成熟的人泪脂质运载蛋白。术语“成熟(的)”当用于表征蛋白质时，是指基本上不含信号肽的蛋白质。本公开的“成熟hTlc”是指人泪脂质运载蛋白的成熟形式，其不含信号肽。成熟hTlc由SWISS-PROT数据库以登记号P31025保藏的序列的残基19-176描述，其氨基酸示于SEQ ID NO:1。
如本文所用，“脂质运载蛋白-2”或“嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白”是指人脂质运载蛋白-2(hLcn2)或人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)，并且还是指成熟的人脂质运载蛋白-2或成熟的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。术语“成熟(的)”当用于表征蛋白质时，是指基本上不含信号肽的蛋白质。本公开的“成熟hNGAL”是指人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的成熟形式，其不含信号肽。成熟hNGAL由SWISS-PROT数据库以登记号P80188保藏的序列的残基21-198描述，其氨基酸示于SEQ IDNO:2。
如本文所用，“天然序列”是指具有天然存在的序列或具有野生型序列的蛋白质或多肽，而不管其制备模式。这种天然序列蛋白质或多肽可以从自然界分离，或者可以通过其它方式产生，例如通过重组或合成方法。
“天然序列脂质运载蛋白”指与衍生自天然的相应多肽具有相同氨基酸序列的脂质运载蛋白。因此，天然序列脂质运载蛋白可具有来自任何生物体(特别是哺乳动物)的相应天然存在(野生型)脂质运载蛋白的氨基酸序列。术语“天然序列”当用于脂质运载蛋白的上下文时具体涵盖天然存在的截短或分泌形式的脂质运载蛋白、天然存在的变体形式诸如脂质运载蛋白的可变剪接形式和天然存在的等位基因变体。术语“天然序列脂质运载蛋白”和“野生型脂质运载蛋白”在本文可互换使用。
如本文所用，“突变蛋白”、“突变的”实体(无论是蛋白质或核酸)或“突变体”是指与天然存在的(野生型)蛋白质或核酸相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的交换、缺失或插入。所述术语还包括如本文所述突变蛋白的片段。本公开明确涵盖如本文所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其具有圆柱形β折叠片超二级结构区，该结构区包含通过四个环在一端成对连接的八个β链，从而包含配体结合袋并限定该配体结合袋的入口，其中所述四个环中至少三个的每一个的至少一个氨基酸与天然序列脂质运载蛋白相比已突变。本公开的脂质运载蛋白突变蛋白优选具有结合如本文所述的4-1BB、OX40或GPC3的功能。
如本文所用，与本公开的脂质运载蛋白突变蛋白有关的术语“片段”是指衍生自全长成熟hTlc或hNGAL或脂质运载蛋白突变蛋白的蛋白质或多肽，其N末端和/或C末端截短，即缺乏N末端和/或C末端氨基酸中的至少一个。此类片段可包括成熟hTlc或hNGAL或其来源的脂质运载蛋白突变蛋白的一级序列的至少10个或更多个，诸如20个或30个或更多个连续氨基酸，并且通常在成熟hTlc或hNGAL的免疫测定中可检测。这样的片段可以缺少N末端和/或C末端氨基酸的至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个或至多30个(包括其间的所有数字)。作为一个说明性实例，这样的片段可以缺少成熟hTlc的一个、两个、三个或四个N末端(His-His-Leu-Leu)和/或一个或两个C末端氨基酸(Ser-Asp)。应理解，所述片段优选是成熟hTlc或hNGAL或其来源的脂质运载蛋白突变蛋白的功能片段，这意味着其优选保留成熟hTlc/hNGAL或其来源的脂质运载蛋白突变蛋白的结合特异性，优选对于4-1BB、OX40或GPC3。作为一个说明性实例，这样的功能片段可以至少在对应于成熟hTlc的线性多肽序列的位置5-153、5-150、9-148、12-140、20-135或26-133处包含氨基酸。作为另一个说明性实例，这样的功能片段可以至少在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列的位置13-157、15-150、18-141、20-134、25-134或28-134处包含氨基酸。
关于本公开的多聚体蛋白的相应靶标诸如4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3的“片段”是指N末端和/或C末端截短的靶蛋白诸如4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3，或靶蛋白诸如4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3的蛋白结构域。如本文所述的4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3的片段保留全长4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3被本公开的多聚体蛋白识别和/或结合的能力。作为一个说明性实例，所述片段可以是4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3的胞外结构域。作为一个说明性实例，人4-1BB的这种胞外结构域可以包含UniProt Q07011的残基24-186或SEQ ID NO:4的残基1-163。这种胞外结构域可以包含4-1BB的胞外亚结构域的氨基酸，诸如结构域1(UniProtQ07011的残基24-45)、结构域2(UniProt Q07011的残基46-86)、结构域3(UniProt Q07011的87-118)和结构域4(UniProt Q07011的残基119-159)的单独的或组合的氨基酸序列。食蟹猴4-1BB的胞外结构域可包含SEQ ID NO:6的残基1-163。
如本文所用，术语“变体”涉及蛋白质或多肽的衍生物，其包括突变，例如通过氨基酸序列或核苷酸序列的取代、缺失、插入和/或化学修饰。在一些实施方案中，此类突变和/或化学修饰不降低蛋白质或肽的功能性。此类取代可以是保守的，即氨基酸残基被化学上相似的氨基酸残基替代。保守取代的实例是下列组的成员之间的替代：1)丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸；2)天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和组氨酸；3)精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和组氨酸；4)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和脯氨酸；和5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这些变体包括蛋白质或多肽，其中一个或多个氨基酸被它们各自的D-立体异构体或被除天然存在的20个氨基酸以外的氨基酸诸如例如鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、羟赖氨酸、正缬氨酸取代。这样的变体还包括例如其中在N-和/或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的蛋白质或多肽。通常，变体与天然序列蛋白或多肽具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或至少约99％的氨基酸序列同一性。变体优选地保留其来源的蛋白质或多肽的生物活性，例如结合相同的靶标。
如本文关于本公开的多聚体蛋白的相应蛋白靶标诸如4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3所用的术语“变体”涉及蛋白靶标诸如4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3或其片段，其与蛋白靶标的天然序列相比具有一个或多个诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80个或更多个氨基酸取代、缺失和/或插入，所述蛋白靶标诸如本文所述的如以UniProt Q07011保藏的4-1BB、以UniProt P43489保藏的OX40、以UniProt Q9NZQ7保藏的PD-L1或以UniProt P51654保藏的的GPC3。4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3变体分别优选与野生型4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。如本文所述的4-1BB、OX40、PD-L1或GPC3变体保留结合对本文公开的4-1BB、OX40、PD-L1和/或GPC3特异性的多聚体蛋白的能力。
如本文关于脂质运载蛋白突变蛋白所用的术语“变体”涉及本公开的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段，其中序列具有突变，包括取代、缺失和插入，和/或化学修饰。如本文所述的脂质运载蛋白突变蛋白变体保留了其来源的脂质运载蛋白突变蛋白的生物学活性，例如与4-1BB、OX40或GPC3的结合。通常，脂质运载蛋白突变蛋白变体与其来源的脂质运载蛋白突变蛋白具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
如本文所用，术语“诱变”是指将突变引入多核苷酸或氨基酸序列。优选在实验条件下引入突变，使得在蛋白质或多肽序列的给定位置处天然存在的氨基酸可以被改变，例如被至少一个氨基酸取代。术语“诱变”还包括通过缺失或插入一个或多个氨基酸对序列片段的长度进行(另外的)修饰。因此，例如，在选定序列位置处的一个氨基酸被三个氨基酸的区段取代，导致与天然蛋白质或多肽氨基酸序列的相应区段的长度相比添加两个氨基酸残基，这在本公开的范围内。这种插入或缺失可以彼此独立地引入本公开中可以进行诱变的任何序列区段中。在本公开的一个示例性实施方案中，可以将插入引入对应于天然序列脂质运载蛋白的环AB的氨基酸序列区段中(参见国际专利公开No.WO 2005/019256，其通过引用以其全文并入本文)。
如本文所用，术语“随机诱变”是指在某一序列位置处不存在预定的突变(氨基酸的改变)，但在诱变过程中，至少两个氨基酸可以以一定的概率掺入预定的序列位置。
如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”表示测量其相似性或关系的序列的性质。如本公开所用,术语“序列同一性”或“同一性”是指本公开的蛋白质或多肽的序列与所讨论的序列(同源)比对后，相对于这两个序列中较长序列中的残基数目，成对相同残基的百分比。序列同一性通过将相同氨基酸残基的数目除以残基的总数并将除数乘以100来测量。
如本文所用，术语“序列同源性”或“同源性”具有其通常含义，并且同源氨基酸包括相同氨基酸以及认为是本公开的蛋白质或多肽(例如本公开的任何抗体、抗体片段或衍生物、多聚体蛋白或脂质运载蛋白突变蛋白)的线性氨基酸序列中等同位置处的保守取代的氨基酸。
技术人员将认识到可用的计算机程序，例如BLAST(Altschul等人，1997)、BLAST2(Altschul等人，1990)和Smith-Waterman(Smith和Waterman，1981)，用于使用标准参数确定序列同源性或序列同一性。序列同源性或序列同一性的百分比可以例如使用程序BLASTP，版本2.2.5(2002年11月16日；Altschul等，1997)在本文测定。在该实施方案中，同源性百分比基于包括前肽序列的整个蛋白质或多肽序列(矩阵：BLOSUM 62；缺口成本：11.1；截断值设置为10-3)的比对，优选使用野生型蛋白质支架作为成对比较中的参照。它计算为BLASTP程序输出中显示为结果的“阳性”(同源氨基酸)数除以程序选择用于比对的氨基酸总数的百分比。
具体地，为了确定脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与参照(野生型)脂质运载蛋白在参照(野生型)脂质运载蛋白氨基酸序列中的某个位置是否不同，技术人员可使用本领域熟知的手段和方法，例如手动或通过使用计算机程序诸如BLAST 2.0(其代表基本局部比对搜索工具)或ClustalW或任何其它适于产生序列比对的合适程序进行比对。因此，参照(野生型)脂质运载蛋白的氨基酸序列可用作“主题序列”或“参照序列”，而脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列用作“查询序列”。术语“野生型序列”、“参照序列”和“主题序列”在本文可互换使用。优选的脂质运载蛋白野生型序列是示于SEQ ID NO:1的hTLC序列或示于SEQID NO:2的hNGAL序列。
“缺口”是比对中由于氨基酸的添加或缺失而产生的空间。因此，完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性，但是不那么高度保守并且具有缺失、添加或替代的序列可以具有较低程度的序列同一性。
如本文所用，术语“位置”是指本文公开的氨基酸序列内的氨基酸的位置或本文公开的核酸序列内的核苷酸的位置。应理解，当术语“对应”或“相应”在本文用于一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列位置的上下文中时，相应位置不仅由前面的核苷酸或氨基酸的数目确定。因此，由于(突变或野生型)脂质运载蛋白中别处氨基酸的缺失或添加，根据本公开的给定氨基酸的绝对位置可与相应位置不同。类似地，由于突变蛋白或野生型脂质运载蛋白5’-非翻译区(UTR)中别处的缺失或另外的核苷酸，包括启动子和/或任何其它调节序列或基因区(包括外显子和内含子)，根据本公开的给定核苷酸的绝对位置可与相应位置不同。
根据本公开的“相应位置”可以是在根据本公开的成对或多序列比对中与其对应的序列位置进行比对的序列位置。优选的是应当理解，对于根据本公开的“相应位置”，核苷酸或氨基酸的绝对位置可与相邻核苷酸或氨基酸不同，但是已经交换、缺失或添加的所述相邻核苷酸或氨基酸可以被包含在相同的一个或多个“相应位置”中。
此外，对于基于根据本公开的参照序列的脂质运载蛋白突变蛋白中的相应位置，优选的是应当理解，脂质运载蛋白突变蛋白的核苷酸或氨基酸的位置可在结构上对应于参照脂质运载蛋白(野生型脂质运载蛋白)或另一种脂质运载蛋白突变蛋白中别处的位置，即使它们的绝对位置数可能不同，如技术人员根据脂质运载蛋白之间高度保守的总体折叠模式所理解的。
如本文可互换使用的，术语“缀合物”、“缀合”、“融合”、“融合物”或“连接的”是指通过任何形式的共价或非共价连接，通过包括但不限于遗传融合、化学缀合、通过接头或交联剂偶联和非共价结合的方式将两个或更多个部分结合在一起。
如本文所用，术语“多聚体蛋白”或“多聚体”是指两个或更多个缔合的“单体多肽”的蛋白质复合物。多聚体蛋白中的单体多肽通过非共价键合连接。在一些实施方案中，如本文所述的多聚体蛋白包含两个、三个、四个、五个或更多个单体多肽。在一些实施方案中，多聚体蛋白可以是同源多聚体的，其中多聚体蛋白的单体多肽是相同的。在一些实施方案中，多聚体蛋白可以是异源多聚体的，其中多聚体蛋白的单体多肽是不同的。
在一些实施方案中，如本文所述的多聚体蛋白包含两个或更多个单体多肽，每个单体多肽包含4-1BB靶向部分和寡聚化部分以及任选的一个或多个另外的靶向部分。在一些实施方案中，如本文所述的多聚体蛋白包含三个或更多个单体多肽，每个单体多肽包含4-1BB靶向部分和寡聚化部分以及任选的一个或多个另外的靶向部分。在一些实施方案中，如本文所述的多聚体蛋白包含四个或更多个单体多肽，每个单体多肽包含4-1BB靶向部分和寡聚化部分和任选的一个或多个另外的靶向部分。在单体多肽中，这些部分可以通过共价或非共价连接而连接。优选地，所述单体多肽是两个或更多个部分之间的翻译融合多肽。翻译融合多肽可通过遗传工程改造阅读框中一个部分的编码序列与另一部分的编码序列来产生。两个部分可以由编码接头的核苷酸序列散布。然而，本公开的单体多肽的部分也可以通过化学缀合连接。形成单体多肽的部分通常如下彼此连接：一个部分的C末端至另一个部分的N末端，或一个部分的C末端至另一个部分的C末端，或一个部分的N末端至另一个部分的N末端，或一个部分的N末端至另一个部分的C末端。单体多肽的部分可以以任何顺序连接，并且可以包括多于一个的任何组成部分。
如本文公开的“寡聚化部分”或“多聚化部分”促进单体多肽组装成多聚体蛋白。在一些实施方案中，寡聚化部分促进单体多肽的三聚、四聚或更高的寡聚状态。在一些优选的实施方案中，寡聚化部分促进单体多肽的三聚。
如本文所用，本文公开的单体多肽的术语“部分”是指单个蛋白质、多肽或肽，其自身可形成稳定的结构并定义独特的功能。在一些实施方案中，本公开的优选部分是脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，本公开的优选部分是全长抗体或其抗原结合结构域或衍生物，诸如单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，本公开的优选部分是寡聚部分。
可由本公开的单体多肽包含的“接头”将如本文所述的单体多肽的两个或更多个部分连接在一起。该连接可以是共价的或非共价的。优选的共价连接是经由肽键，诸如氨基酸之间的肽键。优选的接头是肽接头。因此，在优选的实施方案中，所述接头包含一个或多个氨基酸，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸。优选的肽接头在本文描述，包括甘氨酸-丝氨酸(GS)接头、糖基化GS接头、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)接头、螺旋形成接头和刚性接头。示例性的肽接头示于SEQ ID NOs:12-28。其它优选的接头包括化学接头。
“样品”定义为取自任何受试者的生物样品。生物样品包括但不限于血液、血清、尿、粪便、精液或组织，包括肿瘤组织。
“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。如本文所用，术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括但不限于人、家畜和农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物动物，诸如绵羊、狗、马、猫、牛、大鼠、猪，猿诸如食蟹猴，仅举几个说明性实例。优选地，本文所用的“哺乳动物”是人。
“有效量”是足以产生有益或期望结果的量。有效量可以以一次或多次单独施用或剂量施用。
如本文所用，“抗体”包括全长抗体或其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或衍生物(例如单链抗体衍生物)。全长抗体是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(HC)和两条轻链(LC)的糖蛋白。每条重链由重链可变结构域(VH或HCVR)和重链恒定区(CH)组成。所述重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变结构域(VL或LCVR)和轻链恒定区(CL)组成。所述轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区域可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原(例如GPC3或PD-L1)相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可任选地介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本文所用，抗体的“抗原结合片段”是指保留特异性结合抗原(例如GPC3或PD-L1)的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括(i)由VH、VL、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)F(ab')2片段，其包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段；(iii)Fab'片段，其由VH、VL、CL和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的区域组成；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VH和VL结构域组成的单链Fv(scFv)片段，(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，1989)；和(vii)分离的互补决定区(CDR)或两个或更多个分离的CDR的组合，其可以任选地通过合成接头连接；(viii)“双抗体”，其包含使用短接头连接在同一多肽链中的VH和VL(参见例如专利文件EP 404,097；WO 93/11161；和Holliger等人，1993)；(ix)“结构域抗体片段”，其仅含有VH或VL，其中在一些情况下两个或更多个VH区共价连接。
如本文所用，“T细胞活化增强靶向”部分，诸如脂质运载蛋白突变蛋白，是靶向T细胞、抗原呈递细胞和/或肿瘤细胞上的受体或其配体的部分。此外，靶向部分能够刺激、特别是共刺激T细胞活化，或能够拮抗T细胞抑制。这种T细胞活化增强靶向部分可以是T细胞上的共刺激受体的激动剂，在本文也称为“T细胞共刺激受体靶向”部分。示例性的T细胞共刺激受体是4-1BB，另一个例子是OX40。或者，这种T细胞活化增强靶向部分可以是T细胞上的抑制性受体的拮抗剂。拮抗可以通过结合抑制性受体或其配体来进行。T细胞上的共刺激受体和T细胞上的抑制性受体以及它们的配体是本领域熟知的，并且例如由Bakdash G等人(2013)Front.Immunol.4:53和Catakovic等人Cell Communication and Signaling(2017)15:1综述。T细胞活化增强靶向脂质运载蛋白突变蛋白公开于例如WO 2006/056464、WO2012/072806、WO 2016/177762、WO 2018/087108、WO 2017/009456和WO 2018/134274，将其通过引入并入本文。
如本文所用，术语“肿瘤相关抗原(TAA)”是指由肿瘤细胞表达的蛋白质或多肽抗原。例如，TAA可以是肿瘤细胞的一种或多种表面蛋白或多肽、核蛋白或糖蛋白、或其片段。或者，TAA可以是指与肿瘤基质相关的蛋白质或多肽抗原。TAA靶向脂质运载蛋白突变蛋白公开于例如WO 2009/095447、WO 2012/065978、WO 2013/174783、WO 2016/184875、WO2012/136685、WO 2005/019256和WO 2016/120307，将其通过引入并入本文。本文公开的具体TAA是GPC3和PD-L1。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指工程化受体，其通常将抗原特异性移植到细胞毒性细胞的受体上，所述细胞毒性细胞例如T细胞、NK细胞和巨噬细胞，其中T细胞是优选的。CAR是多个部分的人工融合物：它通常包含至少一个抗原特异性靶向区(胞外结构域)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(胞内结构域)，所述胞内信号传导结构域通常含有一种或多种(共)刺激性免疫受体的信号传导结构域。胞外结构域的一个实例是scFv片段或CD19配体。跨膜结构域的一个实例是CD28跨膜结构域。胞内结构域的一个实例是CD3-ζ。例如，在CTL019的情况下，识别结构域是对CD19特异性的抗体单链片段(scFv)，接头和跨膜区从膜蛋白CD8移植，并且胞内信号传导部分由串联融合的4-1BB和CD3ζ的完整胞内结构域组成。当用该构建体转导的T细胞遇到CD19阳性靶细胞时，嵌合抗原受体成簇，这导致CD3ζ和共刺激受体4-1BB下游的信号传导途径的活化，继而导致T细胞增殖、细胞因子分泌、存活和杀伤能力的活化。通过这种设计，CTL019是“第二代”CAR的实例，其通过存在两个免疫刺激结构域而鉴定。相反，“第一代”CAR仅含有单个免疫刺激结构域——通常是CD3ζ的免疫刺激结构域——而在“第三代”CAR中，总共三个细胞内免疫刺激结构域串联融合，例如CD3ζ、CD28和4-1BB的那些。
附图说明
图1：提供了本申请中描述的代表性单体多肽及其组装的多聚体蛋白的设计的概述。通过将一个或多个本公开的4-1BB靶向部分(例如SEQ ID NOs:56-71)经由接头诸如示于SEQ ID NOs:12-28中任一个的接头融合至本公开的寡聚化部分(例如SEQ ID NOs:35-37)的N末端、C末端或N末端和C末端两者，产生了代表性单体多肽。产生的不同形式描述于图1A和1B，并且还包括4-1BB靶向部分之一被OX40靶向部分替换的双特异性形式(图1B)。通过将本公开的4-1BB靶向部分(例如SEQ ID NOs:56-71)和(1)本公开的GPC3靶向部分(例如SEQ ID NOs:74-98)、(2)本公开的OX40靶向部分(例如SEQ ID NOs:174-202)或(3)本公开的PD-L1靶向部分(例如SEQ ID NO:172)经由接头诸如示于SEQ ID NOs:12-28中任一个的接头融合至寡聚化部分(例如SEQ ID NOs:35-37)的N末端、C末端或N末端和C末端两者，产生了另外的示例性双特异性单体多肽。产生的不同形式描述于图1C。
图2：显示了ELISA实验的结果，其中如实施例3中所述测定示例性多聚体蛋白与人4-1BB(图2A)或人GPC3(图2B)的结合。C末端His-标记的4-1BB或GPC3包被在微量滴定板上，测试的试剂从100nM的最高浓度开始滴定。通过抗NGAL-HRP检测研究的结合的试剂。数据用1:1结合模型拟合，EC50值和最大信号作为自由参数，斜率固定为一。所得的EC50值提供在表3中。
图3：显示了示例性ELISA实验的结果，其中如实施例4中所述测定代表性多聚体蛋白同时结合GPC3和4-1BB的能力。重组huGPC3-His包被在微量滴定板上，然后滴定多聚体蛋白。随后，加入恒定浓度的生物素化hu4-1BB，其通过Extravidin-过氧化物酶检测。数据用1:1结合模型拟合，EC50值和最大信号作为自由参数，斜率固定为一。所得的EC50值提供在表4中。
图4：如实施例5中所述使用表达人4-1BB的CHO细胞(图4A)、表达食蟹猴4-1BB的CHO细胞(图4B)和表达人GPC3的HepG2细胞(图4C)通过流式细胞术进行示例性多聚体蛋白的靶标结合评价的结果。当使用模拟转染的细胞时没有观察到结合(数据未显示)。荧光强度的几何平均值用于计算EC50值，其提供于表5中。
图5：证明了示例性多聚体蛋白共刺激T细胞活化的潜力。将模拟转染的Flp-In-CHO细胞接种到抗CD3抗体包被的平板中。加入Pan T细胞、各种浓度的测试分子和抗CD28抗体并孵育三天。如实施例6中所述通过基于电化学发光的测定来测定上清液中分泌的IL-2的水平。三价多聚体蛋白(SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:43)不增加IL-2分泌。与hIgG4同种型对照相比，与三价相比具有更高价的多聚体蛋白(SEQ ID NOs:46-48和50-53)导致IL-2分泌的明显增加，其效力与参照4-1BB抗体(SEQ ID NOs:72和73)相当。此外，具有三价4-1BB靶向和另一三价T细胞共刺激受体靶向部分的双特异性六价蛋白甚至比参照4-1BB抗体(SEQ ID NOs:72和73)更有效。
图6：显示了代表性多聚体蛋白共刺激T细胞活化的能力。将GPC3表达肿瘤细胞HepG2接种到抗人CD3包被的平板中。加入Pan T细胞、各种浓度的测试分子和抗CD28并孵育三天。如实施例7中所述测定分泌的IL-2的水平。与参照4-1BB抗体SEQ ID NOs:72和73相比，双特异性多聚体蛋白SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55以及具有三价4-1BB靶向和另一三价T细胞共刺激受体靶向部分的双特异性六价蛋白导致IL-2分泌的强烈增加。对于参照GPC3抗体SEQ ID NOs:108和109、GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:90或如多聚体蛋白中包含的4-1BB特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:64)，没有观察到超过背景的IL-2分泌增加。
图7：显示了使用如实施例8中所述4-1BB生物测定评价的代表性多聚体蛋白活化4-1BB下游信号传导途径和共刺激T细胞的能力。在存在和不存在GPC3表达肿瘤细胞HepG2的情况下，将NFκB-luc2/CD137 Jurkat细胞与各种浓度的多聚体蛋白或对照共培养。4小时后，加入荧光素酶测定试剂并测量发光信号。进行四参数逻辑曲线分析以计算EC50值(参见表6)。三价多聚体蛋白SEQ ID NOs:38-42和44在存在和不存在GPC3的情况下不诱导4-1BB介导的T细胞共刺激。六价多聚体蛋白SEQ ID NOs:48-53在存在和不存在GPC3的情况下显示了相当的活化。双特异性多聚体蛋白SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55诱导GPC3依赖性4-1BB介导的T细胞共刺激。
图8：证明了示例性多聚体蛋白共刺激分离的CD8+(图8A)和分离的CD4+(图8B)T细胞活化的能力。将模拟转染的Flp-In-CHO细胞接种到抗CD3抗体包被的平板中。加入CD8+或CD4+T细胞和各种浓度的测试分子并孵育两天。如实施例6中所述通过基于电化学发光的测定来测定上清液中分泌的IL-2的水平。与hIgG4同种型对照(SEQ ID NOs:29和30)相比，多聚体蛋白(SEQ ID NO:52)或参照4-1BB抗体(SEQ ID NOs:72和73)导致CD8+T细胞的IL-2分泌明显增加。与hIgG4同种型对照(SEQ ID NOs:29和30)相比，多聚体蛋白(SEQ ID NO:52)导致CD4+T细胞的IL-2分泌明显增加，其效力与参照4-1BB抗体(SEQ ID NOs:72和73)相当。
图9：显示了如实施例10中所述通过使用表达人4-1BB的CHO细胞(图9A)、表达人OX40的CHO细胞(图9B)和表达人PD-L1的CHO细胞(图9C)的流式细胞术进行示例性多聚体蛋白的靶标结合评估的结果。当使用模拟转染的细胞时没有观察到结合(数据未显示)。荧光强度的几何平均值用于计算EC50值，其提供于表7中。
图10：显示了示例性多聚体蛋白共刺激T细胞活化的潜力。将Flp-In-CHO::huPD-L1细胞接种到抗CD3抗体包被的平板中。加入Pan T细胞和各种浓度的测试分子并孵育三天。如实施例11中所述通过基于电化学发光的测定来测定上清液中分泌的IL-2的水平。与hIgG4同种型对照相比，所有测试的多聚体蛋白导致IL-2分泌的明显增加。
图11：显示了示例性多聚体蛋白共刺激分离的CD4+T细胞活化的能力。将Flp-In-CHO::huPD-L1细胞接种到抗CD3抗体包被的平板中。加入CD4+T细胞和各种浓度的测试分子并孵育三天。如实施例12中所述通过基于电化学发光的测定来测定上清液中分泌的IL-2的水平。与hIgG4同种型对照相比，所有测试的多聚体蛋白导致IL-2分泌的明显增加。
图12：显示了示例性多聚体蛋白共刺激分离的CD8+T细胞活化的能力。将Flp-In-CHO::huPD-L1细胞接种到抗CD3抗体包被的平板中。加入CD8+T细胞和各种浓度的测试分子并孵育三天。如实施例13中所述通过基于电化学发光的测定来测定上清液中分泌的IL-2的水平。与hIgG4同种型对照相比，所有测试的多聚体蛋白导致IL-2分泌的明显增加。
图13：显示了使用如实施例14中所述4-1BB生物测定评价的代表性六价三聚体蛋白活化4-1BB下游信号传导途径和共刺激T细胞的潜力。在存在和不存在Flp-In-CHO::huOX40细胞的情况下与不同浓度的多聚体蛋白或对照共培养NFκB-luc2/CD137 Jurkat细胞。4小时后，加入荧光素酶测定试剂并测量发光信号。在存在Flp-In-CHO::huOX40细胞的情况下，与同种型对照相比，所有测试的多聚体蛋白导致4-1BB介导的T细胞共刺激的强烈增加，但在不存在Flp-In-CHO::huOX40细胞的情况下则不是这样。
图14：显示了使用如实施例15中所述OX40生物测定评价的代表性六价三聚体蛋白活化OX40下游信号传导途径和共刺激T细胞的能力。在存在和不存在Flp-In-CHO::hu4-1BB细胞的情况下与不同浓度的多聚体蛋白或对照共培养NFκB-luc2/OX40 Jurkat细胞。5小时后，加入荧光素酶测定试剂并测量发光信号。在存在Flp-In-CHO::hu4-1BB细胞的情况下，与同种型对照相比，所有测试的多聚体蛋白导致OX40介导的T细胞共刺激的强烈增加，但在不存在Flp-In-CHO::hu4-1BB细胞的情况下则不是这样。
具体实施方式
如本文所述，本发明涵盖这样的认识，即三价可溶性4-1BBL可能不会导致有效的4-1BB活化，这需要由抗原呈递细胞的细胞表面表达介导的更大尺寸的4-1BB聚簇(Wyzgol等人，2009；Rabu等人，2005)。类似地，二价4-1BB靶向分子诸如抗体可能本身不足以诱导由4-1BB聚簇介导的有效活化。因此，对于诱导T细胞和NK细胞上高水平的4-1BB聚簇的治疗剂存在未满足的需求。因此，本申请尤其提供了新的多聚体蛋白，其不含有Fc区，用于使4-1BB能够以FcγR-非依赖性方式聚簇，并用于以细胞表面上高水平的4-1BB聚簇来诱导4-1BB活化。本申请还提供了通过多聚体蛋白使4-1BB在细胞表面上聚簇并刺激4-1BB活化和免疫应答的新方法。
另外，可能需要靶向4-1BB的治疗剂，其不需要表达4-1BB的细胞与其它细胞例如肿瘤细胞交联。在这方面，本公开的多聚体蛋白能够活化4-1BB并共刺激T细胞，而不依赖于另外的靶蛋白的表达。
此外，本公开的多聚体蛋白的尺寸小于抗体，能够用作短期作用的4-1BB激动剂以降低外周毒性的风险和与慢性4-1BB激动有关的限制。因此，提供的多聚体蛋白可以满足未满足的需要，以提供用于疾病领域的治疗剂，包括恶性肿瘤，其中当前的4-1BB激动剂诸如单克隆抗体尚不能显示令人信服的风险-益处谱。
A.本公开的示例性多聚体蛋白
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白含有至少两个单体多肽，每个单体多肽包含(1)第一4-1BB靶向部分(T1)，诸如4-1BB靶向脂质运载蛋白突变蛋白，和(2)寡聚化部分(O)，诸如示于SEQ ID NOs:35-37中任一个的寡聚化部分。在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白含有至少三个单体多肽，每个单体多肽包含(1)第一4-1BB靶向部分(T1)，诸如4-1BB靶向脂质运载蛋白突变蛋白，和(2)寡聚化部分(O)，诸如示于SEQ ID NOs:35-37中任一个的寡聚化部分。在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白含有至少四个单体多肽，每个单体多肽包含(1)第一4-1BB靶向部分(T1)，诸如4-1BB靶向脂质运载蛋白突变蛋白，和(2)寡聚化部分(O)，诸如示于SEQ ID NOs:35-37中任一个的寡聚化部分。在一些实施方案中，提供的多聚体多肽包含三个这样的单体多肽。在一些实施方案中，本公开的提供的多聚体多肽包含四个这样的单体多肽。
在一些实施方案中，提供的单体多肽的第一4-1BB靶向部分(T1)在其N末端和/或其C末端融合至寡聚化部分(O)。在一些实施方案中，提供的单体多肽的第一4-1BB靶向部分(T1)经由接头(L)融合至寡聚化部分(O)(图1A)。如本文所述的接头可以是肽接头，例如，如示于SEQ ID NOs:12-28中任一个。
在一些实施方案中，提供的单体多肽的第一4-1BB靶向部分(T1)在其N末端和/或其C末端连接至寡聚化部分(O)。在一些实施方案中，提供的单体多肽的第一4-1BB靶向部分(T1)经由接头(L)连接至寡聚化部分(O)(图1A)。如本文所述的接头可以是肽接头，例如，如示于SEQ ID NOs:12-28中任一个。
在一些实施方案中，提供的单体多肽的第一4-1BB靶向部分(T1)经由接头(L)、优选肽接头在其C末端连接至寡聚化部分(O)的N末端(图1A)。
在一些实施方案中，本公开的单体多肽包含至少一个另外的靶向部分(T2)。在一些实施方案中，单体多肽包含另外的靶向部分(T2)，所述另外的靶向部分(T2)是第二4-1BB靶向部分。在一些实施方案中，单体多肽包含另外的部分(T2)，所述另外的部分(T2)是靶向另一靶标(即除4-1BB外)的部分，例如靶向肿瘤相关抗原的部分，诸如GPC3或PD-L1靶向部分，或T细胞活化增强靶向部分(除4-1BB靶向部分外)，诸如OX40靶向部分。这种另外的靶向部分(T2)通常可以是任何靶标特异性结合分子。优选地，这种另外的靶向部分(T2)是脂质运载蛋白突变蛋白、抗体或抗体的抗原结合片段或衍生物，诸如单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，本公开的单体多肽包含与第一4-1BB靶向部分(T1)串联放置的另外的靶向部分(T2)。另外的靶向部分(T2)和第一4-1BB靶向部分(T1)可以经由接头、诸如肽接头连接。在一些具体实施方案中，单体多肽包含作为第二4-1BB靶向部分的另外的靶向部分(T2)。作为第二4-1BB靶向部分的另外的靶向部分(T2)可以与第一4-1BB靶向部分(T1)串联放置。两个4-1BB靶向部分(T1和T2)可以经由肽接头(L)连接至寡聚化部分(O)的N末端或C末端(图1B)。在一些实施方案中，当所述另外的靶向部分(T2)是第二4-1BB靶向部分时，所述第二4-1BB靶向部分可以是脂质运载蛋白突变蛋白。另外的靶向部分(T2)可以是与第一4-1BB靶向部分相同的脂质运载蛋白突变蛋白。另外的靶向部分(T2)和第一4-1BB靶向部分可单独选自本公开的4-1BB特异性脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，另外的靶向部分(T2)是靶向另一靶标(即除4-1BB外)的部分，例如靶向肿瘤相关抗原的部分，诸如GPC3或PD-L1靶向部分，或T细胞活化增强靶向部分(除4-1BB靶向部分外)，诸如OX40靶向部分。在一些具体实施方案中，T1是4-1BB靶向脂质运载蛋白突变蛋白，T2是OX40靶向脂质运载蛋白突变蛋白。
在一些实施方案中，本公开的单体多肽具有以下构型(从N至C末端)中的一者(L’是与L相同或不同的接头)：
a.T1-L’-T2-L-O；
b.T2-L’-T1-L-O；
c.O-L-T1-L’-T2；
d.O-L-T2-L’-T1；
e.T1-L-T2-O；
f.T2-L-T1-O；
g.O-L-T1-T2；
h.O-L-T2-T1；
i.T1-T2-L-O；
j.T2-T1-L-O；
k.O-T1-L-T2；
l.O-T2-L-T1；
m.T1-T2-O；
n.T2-T1-O；
o.O-T1-T2；或
p.O-T2-T1。
在一些实施方案中，本公开的单体多肽包含另外的靶向部分(T2)，其中所述另外的靶向部分与所述第一4-1BB靶向部分(T1)相比连接至寡聚化部分(O)的不同末端。在一些具体实施方案中，单体多肽包含另外的靶向部分(T2)，所述另外的靶向部分(T2)是靶向肿瘤相关抗原的部分。在一些具体实施方案中，单体多肽包含另外的靶向部分(T2)，所述另外的靶向部分(T2)是GPC3或PD-L1靶向部分。在一些具体实施方案中，单体多肽包含另外的靶向部分(T2)，所述另外的靶向部分(T2)是T细胞活化增强靶向部分，诸如OX40靶向部分。优选是靶向肿瘤相关抗原的部分或T细胞活化增强靶向部分的另外的靶向部分(T2)可连接至寡聚化部分(O)的C末端或N末端，而第一4-1BB靶向部分(T1)分别连接至寡聚化部分(O)的N末端或C末端(图1C)。在一些具体实施方案中，T1是4-1BB靶向脂质运载蛋白突变蛋白，T2是OX40靶向脂质运载蛋白突变蛋白。
在一些实施方案中，本公开的单体多肽具有以下构型(从N至C末端)中的一者(L’是与L相同或不同的接头)：
a.T1-L-O-L’-T2；
b.T2-L’-O-L-T1；
c.T1-L-O-T2；
d.T2-L-O-T1；
e.T1-O-L-T2；
f.T2-O-L-T1；
g.T1-O-T2；或
h.T2-O-T1。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可以包含至少四个靶向部分(T1或T2)。这样的多聚体蛋白可以包含至少三个第一4-1BB靶向部分(T1)。作为一个说明性实例，所述多聚体蛋白可以包含四个第一4-1BB靶向部分(T1)。这种示例性多聚体蛋白可以包含四个单体多肽，每个单体多肽包含第一4-1BB靶向部分(T1)、和寡聚化部分(O)以及任选的接头(L)，其中所述寡聚化结构域能够促进四聚化。在另一个说明性实例中，所述多聚体蛋白可以包含六个第一4-1BB靶向部分(T1)。这种示例性多聚体蛋白可以包含本文公开的三个单体多肽，每个单体多肽包含能够促进三聚化的寡聚化结构域(O)和两个第一4-1BB靶向部分(T1)。在另一个说明性实例中，所述多聚体蛋白可以包含三个第一4-1BB靶向部分(T1)和至少一个另外的靶向部分(T2)。这样的多聚体蛋白可以具有三个单体多肽，每个单体多肽包含能够促进三聚化的寡聚化结构域(O)，并且其中所述单体多肽中的至少一个、优选所有单体多肽包含另外的靶向部分(T2)。另外的靶向部分(T2)可以是本文公开的任何另外的靶向部分(T2)。单体多肽中的任一个可以包含一个或多个连接T1、T2和/或O部分的接头(L)。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以约1nM或更低诸如0.94nM或更低、约0.68nM或更低、约0.5nM或更低、约0.3nM或更低或约0.2nM或更低的KD值结合4-1BB。在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以比如这样的多聚体蛋白中包含的4-1BB靶向部分诸如示于SEQ IDNO:64的脂质运载蛋白突变蛋白的KD值低的KD值结合4-1BB。提供的多聚体蛋白的KD值可以是表观KD值，例如如实施例2中所述。提供的多聚体蛋白的KD值可以例如在表面等离子体共振(SPR)测定中测量，诸如基本上如实施例2中所述的SPR测定。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以约1.5nM或更低诸如约0.7nM或更低、约0.3nM或更低、约0.2nM或更低、约0.15nM或更低或约0.1nM或更低的EC50值结合4-1BB。在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以比如这样的多聚体蛋白中包含的4-1BB靶向部分诸如示于SEQ ID NO:64的脂质运载蛋白突变蛋白的EC50值低的EC50值结合4-1BB。提供的多聚体蛋白的EC50值可以例如在酶联免疫吸附测定(ELISA)测定诸如基本上如实施例3中所述的ELISA测定中测量。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以约11nM或更低诸如约9nM或更低、约7nM或更低、约5nM或更低、约4nM或更低、约3nM或更低或约2nM或更低的EC50值结合4-1BB表达细胞。在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以比如这样的多聚体蛋白中包含的4-1BB靶向部分诸如示于SEQ ID NO:64的脂质运载蛋白突变蛋白的EC50值低的EC50值结合4-1BB。在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以与抗4-1BB抗体诸如具有由SEQ ID NOs:72和73提供的重链和轻链的抗体的EC50值相当或比其低的EC50值结合4-1BB。提供的多聚体蛋白的EC50值可以例如在流式细胞术分析诸如基本上如实施例5中所述流式细胞术分析中测量。所述4-1BB表达细胞可以例如是用人4-1BB转染的CHO细胞。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可与食蟹猴4-1BB交叉反应。在一些实施方案中，提供的多聚体蛋白可能够以至多约7nM或更低诸如约6nM或更低、约5nM或更低、约4nM或更低、约3nM或更低或约2nM或更低的EC50值结合食蟹猴4-1BB。在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以与抗4-1BB抗体诸如具有由SEQ ID NOs:72和73提供的重链和轻链的抗体的EC50值相当或比其低的EC50值结合食蟹猴4-1BB。多聚体蛋白的EC50值可以例如在流式细胞术分析诸如基本上如实施例5中所述流式细胞术分析中测量。所述4-1BB表达细胞可以例如是用食蟹猴4-1BB转染的CHO细胞。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以至多约3nM或更低诸如约2nM或更低、约1nM或更低或约0.5nM或更低的EC50值结合GPC3表达细胞。在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以与GPC3靶向部分来源的抗GPC3抗体诸如具有由SEQ ID NOs:108和109提供的重链和轻链的抗体的EC50值相当或比其低的EC50值结合GPC3。提供的多聚体蛋白的EC50值可以例如在流式细胞术分析诸如基本上如实施例5中所述流式细胞术分析中测量。所述GPC3表达细胞可以例如是HepG2细胞。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够同时结合4-1BB和GPC3。在一些实施方案中，提供的多聚体蛋白可能够以至多约0.2nM或更低诸如约0.1nM或更低的EC50值同时结合4-1BB和GPC3。在一些其他实施方案中，提供的多聚体蛋白可能够以至多约1.5nM或甚至更低诸如约1.4nM或更低、约1.3nM或更低、约0.7nM或更低或约0.6nM或更低的EC50值同时结合4-1BB和GPC3。所述同时结合可以例如在ELISA测定诸如基本上如实施例4中所述ELISA测定中测量。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以至多约10nM或更低诸如约9nM或更低、约7nM或更低、约5nM或更低、约4nM或更低、约3nM或更低、约2nM或更低或约1.5nM或更低的EC50值结合PD-L1表达细胞。提供的多聚体蛋白的EC50值可以例如在流式细胞术分析诸如基本上如实施例10中所述流式细胞术分析中测量。所述PD-L1表达细胞可以例如是用人PD-L1转染的CHO细胞。在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够同时结合4-1BB和PD-L1。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以至多约10nM或更低诸如约9nM或更低、约7nM或更低、约5nM或更低、约4nM或更低、约3nM或更低、约2nM或更低、约1.5nM或更低、约1nM或更低或约0.5nM或更低的EC50值结合OX40表达细胞。提供的多聚体蛋白的EC50值可以例如在流式细胞术分析诸如基本上如实施例10中所述流式细胞术分析中测量。所述OX40表达细胞可以例如是用人OX40转染的CHO细胞。在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够同时结合4-1BB和OX40。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够诱导增加的IL-2分泌。在一些优选的实施方案中，提供的多聚体蛋白可能够诱导浓度依赖性IL-2分泌和/或显示诱导以更高浓度的增强的IL-2分泌的趋势。IL-2分泌可以例如在功能性T细胞活化测定诸如基本上如实施例6、7和/或9中所述测定中测量。在一些实施方案中，所述T细胞是CD4+T细胞、是CD8+T细胞或包含CD4+T细胞和CD8+T细胞两者。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够共刺激T细胞应答。在一些实施方案中，所述T细胞是CD4+T细胞、是CD8+T细胞或包含两者。在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可能够以GPC3、OX40、4-1BB或PD-L1依赖性方式共刺激T细胞应答。在一些实施方案中，提供的多聚体蛋白在不存在GPC3、OX40、4-1BB或PD-L1的情况下不能共刺激T细胞应答。刺激的T细胞应答或T细胞活化可以例如在4-1BB生物测定诸如基本上如实施例8中所述测定中或在OX40生物测定诸如基本上如实施例15中所述测定中测量。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白含有至少两个、优选三个或四个单体多肽，每个单体多肽包含示于SEQ ID NOs:38-55和164-167中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白含有至少两个、优选三个或四个单体多肽，每个单体多肽包含与示于SEQ ID NOs:38-55和164-167中任一个的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高序列同一性的氨基酸序列。
B.如多聚体蛋白中包含的示例性寡聚化部分。
在一些实施方案中，本公开的单体多肽中包含的寡聚化部分可以将两个或更多个单体多肽转化为本公开的多聚体蛋白。
在一些实施方案中，本公开的寡聚化部分可以是二聚化结构域，诸如GCN4亮氨酸拉链。
在一些实施方案中，本公开的寡聚化部分可以是三聚化结构域，诸如T4纤维蛋白(foldon)的C末端结构域，胶原的三聚化结构域诸如人胶原XVIII三聚化结构域和人胶原XV三聚化结构域，GCN4亮氨酸拉链，和来自肺表面活性蛋白的三聚基序。胶原的三聚化结构域在本领域中已有描述，包括胶原XV、胶原XVIII和/或胶原XXII的三聚化结构域，如例如WO2006/048252、WO 2012/022811、WO 2012/049328和EP 2065402中所述)。在一些实施方案中，本公开的三聚化结构域包含与示于SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供的三聚化结构域包含示于SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的寡聚化部分可以是四聚化结构域，诸如p53四聚化结构域、GCN4亮氨酸拉链和TRP样结构域。在一些实施方案中，本公开的四聚化结构域包含与示于SEQ ID NOs:36-37中任一个的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供的四聚化结构域包含示于SEQ ID NOs:36-37中任一个的氨基酸序列。
C.本公开的示例性脂质运载蛋白突变蛋白。
脂质运载蛋白是天然进化为结合配体的蛋白质结合分子。脂质运载蛋白存在于许多生物体中，包括脊椎动物、昆虫、植物和细菌。脂质运载蛋白家族的成员(Pervaiz和Brew，1987)通常是小的分泌蛋白，并具有单一多肽链。它们的特征在于一系列不同的分子识别性质：它们与各种主要是疏水性的小分子(诸如类视色素、脂肪酸、胆固醇、前列腺素、胆绿素、信息素、促味剂和添味剂)结合，以及它们与特异性细胞表面受体结合和它们形成大分子复合物。尽管过去主要将它们分类为转运蛋白，但现在清楚的是脂质运载蛋白实现多种生理功能。这些包括在视黄醇转运、嗅觉、信息素信号传导和前列腺素合成中的作用。脂质运载蛋白也参与免疫应答的调节和细胞稳态的介导(例如在Flower等人，2000；Flower，1996中综述)。
脂质运载蛋白具有异常低水平的总体序列保守性，通常具有小于20％的序列同一性。相反，它们的整体折叠模式是高度保守的。脂质运载蛋白结构的中心部分由单个八链反平行β折叠组成，其自身闭合形成连续氢键合β桶。该β桶形成中心腔。该桶的一端被穿过其底部的N末端肽区段以及连接β链的三个肽环空间阻断。β桶的另一端对溶剂开放，并涵盖靶标结合位点，该位点由四个柔性肽环(AB、CD、EF和GH)形成。正是在本应刚性的脂质运载蛋白支架中所述环的多样性产生多种不同的结合模式，每种结合模式能够适应不同大小、形状和化学特性的靶标(例如在Skerra，2000；Flower等人，2000；Flower，1996中综述)。
根据本公开的脂质运载蛋白突变蛋白可以是任何脂质运载蛋白的突变蛋白。可以使用突变蛋白的合适的脂质运载蛋白(有时也称为“参照脂质运载蛋白”、“野生型脂质运载蛋白”、“参照蛋白质支架”或简称为“支架”)的实例包括但不限于泪脂质运载蛋白(脂质运载蛋白-1、Tlc或von Ebner’腺蛋白)、视黄醇结合蛋白、嗜中性粒细胞脂质运载蛋白型前列腺素D合酶、β-乳球蛋白、后胆色素结合蛋白(BBP)、载脂蛋白D(APOD)、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、α2-微球蛋白相关蛋白(A2m)、24p3/子宫运载蛋白(24p3)、vonEbner’腺蛋白1(VEGP 1)、von Ebner’腺蛋白2(VEGP 2)和主要变应原Can f 1(ALL-1)。在相关实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白来自由人泪脂质运载蛋白(hTlc)、人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)、人载脂蛋白D(hApoD)和大菜粉蝶后胆色素结合蛋白组成的脂质运载蛋白组。
当与另一种脂质运载蛋白(也参见上文)的序列同一性相比时，如与其来源的参照(或野生型)脂质运载蛋白(例如hTlc或hNGAL)相比，根据本公开的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列可具有高序列同一性。在该一般上下文中，根据本公开的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列至少基本上类似于相应的参照(野生型)脂质运载蛋白的氨基酸序列，条件是在比对中可能存在由于氨基酸添加或缺失而产生的缺口(如本文定义)。在一些实施方案中，与相应的参照(野生型)脂质运载蛋白的序列基本上相似的本公开的脂质运载蛋白突变蛋白的相应序列与相应的脂质运载蛋白的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％同一性，包括至少95％同一性。在这方面，本公开的脂质运载蛋白突变蛋白当然可以含有如本文所述的取代，其使得所述脂质运载蛋白突变蛋白能够结合所需的靶标，诸如T细胞活化增强靶向部分或靶向肿瘤相关抗原诸如4-1BB或GPC3的部分。
通常，脂质运载蛋白突变蛋白——相对于野生型或参照脂质运载蛋白例如hTlc和hNGAL的氨基酸序列——在包含配体结合口袋并限定配体结合口袋入口(参见上文)的开放端处的四个环中包含一个或多个突变的氨基酸残基。如上文所述，这些区域在确定脂质运载蛋白突变蛋白对所需靶标的结合特异性中是必需的。在一些实施方案中，本公开的脂质运载蛋白突变蛋白还可包含四个环之外的突变的氨基酸残基区域。在一些实施方案中，本公开的脂质运载蛋白突变蛋白可在连接脂质运载蛋白封闭端处的β链的三个肽环(命名为BC、DE和FG)中的一个或多个中含有一个或多个突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，源自泪脂质运载蛋白、NGAL脂质运载蛋白或其同源物的突变蛋白可以在N末端区中和/或在β桶结构的位于天然脂质运载蛋白结合口袋对面的一端处排列的三个肽环BC、DE和FG中的任何序列位置处具有1、2、3、4或更多个突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，与野生型泪脂质运载蛋白序列相比，源自泪脂质运载蛋白、NGAL脂质运载蛋白或其同源物的突变蛋白可以在β桶结构的端部处排列的肽环DE中没有突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，与相应的参照(野生型)脂质运载蛋白的氨基酸序列相比，根据本公开的脂质运载蛋白突变蛋白可包括一个或多个诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或甚至更多个突变的氨基酸残基，条件是这样的脂质运载蛋白突变蛋白应当能够结合给定靶标，诸如4-1BB或GPC3。在一些实施方案中，本公开的脂质运载蛋白突变蛋白包括至少两个包括2、3、4、5或甚至更多个突变的氨基酸残基，其中相应的参照(野生型)脂质运载蛋白的天然氨基酸残基被精氨酸残基取代。
设想了任何类型和数量的突变，包括取代、缺失和插入，只要提供的脂质运载蛋白突变蛋白保留其结合其给定靶标诸如4-1BB或GPC3的能力，和/或其与参照(野生型)脂质运载蛋白例如成熟hTlc或成熟hNGAL的氨基酸序列具有其为至少60％诸如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高同一性的序列同一性。
具体地，为了确定脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列的氨基酸残基对应于参照(野生型)脂质运载蛋白的氨基酸序列中的某个位置是否与参照(野生型)脂质运载蛋白不同，技术人员可使用本领域熟知的手段和方法，例如手动或通过使用计算机程序诸如BLAST2.0(其代表基本局部比对搜索工具)或ClustalW或任何其它适于产生序列比对的合适程序进行比对。因此，参照(野生型)脂质运载蛋白的氨基酸序列可用作“主题序列”或“参照序列”，而脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列用作“查询序列”(也参见上文)。
在一些实施方案中，取代是保守取代。保守取代通常是根据待突变的氨基酸列出的以下取代，每个取代后跟随一个或多个可以认为是保守性的取代：Ala→Ser、Thr或Val；Arg→Lys、Gln、Asn或His；Asn→Gln、Glu、Asp或His；Asp→Glu、Gln、Asn或His；Gln→Asn、Asp、Glu或His；Glu→Asp、Asn、Gln或His；His→Arg、Lys、Asn、Gln、Asp或Glu；Ile→Thr、Leu、Met、Phe、Val、Trp、Tyr、Ala或Pro；Leu→Thr、Ile、Val、Met、Ala、Phe、Pro、Tyr或Trp；Lys→Arg、His、Gln或Asn；Met→Thr、Leu、Tyr、Ile、Phe、Val、Ala、Pro或Trp；Phe→Thr、Met、Leu、Tyr、Ile、Pro、Trp、Val或Ala；Ser→Thr、Ala或Val；Thr→Ser、Ala、Val、Ile、Met、Val、Phe、Pro或Leu；Trp→Tyr、Phe、Met、Ile或Leu；Tyr→Trp、Phe、Ile、Leu或Met；Val→Thr、Ile、Leu、Met、Phe、Ala、Ser或Pro。其它取代也是允许的，并且可以凭经验或根据其它已知的保守或非保守取代来确定。作为进一步的方向，以下组各自含有通常可用于定义彼此是保守取代的氨基酸：
(a)丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)
(b)天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、组氨酸(His)
(c)精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、组氨酸(His)
(d)异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、脯氨酸(Pro)
(e)异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)
如果这种保守取代导致生物活性的变化，则可以引入更实质的变化，诸如以下的，或如下文关于氨基酸类别进一步描述的，并且筛选具有所需特征的产物。这种更实质的变化的实例是：Ala→Leu或Phe；Arg→Glu；Asn→Ile、Val或Trp；Asp→Met；Cys→Pro；Gln→Phe；Glu→Arg；His→Gly；Ile→Lys、Glu或Gln；Leu→Lys或Ser；Lys→Tyr；Met→Glu；Phe→Glu、Gln或Asp；Trp→Cys；Tyr→Glu或Asp；Val→Lys、Arg、His。
在一些实施方案中，通过选择它们在维持以下方面的作用显著不同的取代来实现脂质运载蛋白(突变蛋白)的物理和生物性质的实质的修饰：(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如作为片状或螺旋状构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。
天然存在的残基基于共同的侧链性质被分成以下的各组：(1)疏水性的：甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；(2)中性亲水性的：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；(3)酸性的：天冬氨酸、谷氨酸；(4)碱性的：组氨酸、赖氨酸、精氨酸；(5)影响链取向的残基：甘氨酸、脯氨酸；和(6)芳香族的：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。在一些实施方案中，取代可能需要将这些类别之一的成员与另一类别交换。
任何不参与维持相应脂质运载蛋白的正确构象的半胱氨酸残基也可以通常用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以将半胱氨酸键加入脂质运载蛋白以改善其稳定性。
D.如多聚体蛋白中包含的示例性4-1BB靶向部分。
在一些实施方案中，对于提供的多聚体蛋白，4-1BB靶向部分可以是或包含4-1BB靶向脂质运载蛋白突变蛋白。
如上文所述，脂质运载蛋白是由其超二级结构定义的多肽，所述超二级结构即圆柱形β折叠片超二级结构区，该结构区包含通过四个环在一端成对连接的八个β链，从而限定结合袋。本公开不限于本文具体公开的脂质运载蛋白突变蛋白。在这点上，本公开涉及脂质运载蛋白突变蛋白，其具有圆柱形β折叠片超二级结构区，该结构区包含通过四个环在一端成对连接的八个β链，从而限定结合袋，其中所述四个环中至少三个的每一个的至少一个氨基酸已被突变，并且其中所述脂质运载蛋白以可检测的亲和力有效结合给定靶标，诸如4-1BB。
在一些实施方案中，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白可以是或包含成熟人泪脂质运载蛋白(hTlc)的突变蛋白。成熟hTlc的突变蛋白在本文可命名为“hTlc突变蛋白”。在一些其它实施方案中，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白是成熟人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)的突变蛋白。成熟hNGAL的突变蛋白在本文可命名为“hNGAL突变蛋白”。
在一个方面，本公开包括以可检测的亲和力结合4-1BB的源自参照(野生型)脂质运载蛋白、优选源自成熟hTlc或成熟hNGAL的任何数量的脂质运载蛋白突变蛋白。在相关方面，本公开包括能够通过结合4-1BB活化4-1BB的下游信号传导途径的各种脂质运载蛋白突变蛋白。在这种意义上，4-1BB可被认为是参照(野生型)脂质运载蛋白、优选hTLc或hNGAL的非天然靶标，其中“非天然靶标”是指在生理条件下不结合参照(野生型)脂质运载蛋白的物质。通过在某些序列位置处用一个或多个突变工程改造参照(野生型)脂质运载蛋白，本发明人已证明对非天然靶标4-1BB的高亲和力和高特异性是可能的。在一些实施方案中，在编码野生型脂质运载蛋白上某些序列位置的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多个核苷酸三联体处，可以通过在这些位置处用核苷酸三联体的亚组进行取代来进行随机诱变，目的是产生能够结合4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白。
在一些实施方案中，本公开的脂质运载蛋白突变蛋白可在对应于参照脂质运载蛋白(优选hTlc或hNGAL)的线性多肽序列的一个或多个序列位置处具有突变(包括取代、缺失和插入)的氨基酸残基。在一些实施方案中，与参照脂质运载蛋白、优选hTlc或hNGAL的氨基酸序列相比，突变的本公开的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸残基数目是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个，诸如25、30、35、40、45或50个，其中优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个，甚至更优选9、10或11个。然而，优选的是本公开的脂质运载蛋白突变蛋白仍能够结合4-1BB。
在一些实施方案中，与相应的参照(野生型)脂质运载蛋白相比，本公开的脂质运载蛋白突变蛋白可在其N末端缺少1、2、3、4或更多个氨基酸和/或在其C末端缺少1、2或更多个氨基酸；例如，SEQ ID NOs:56-62。在一些实施方案中，本公开涵盖如上文定义的hTlc突变蛋白，其中成熟hTlc序列的前四个、两个、三个或N末端氨基酸残基(His-His-Leu-Leu；1-4位)和/或成熟hTlc线性多肽序列的最后一个或两个C末端氨基酸残基(Ser-Asp；157-158位)已缺失(例如SEQ ID NOs:56-62)。在一些实施方案中，本公开涵盖如上文定义的hNGAL突变蛋白，其中成熟hNGAL线性多肽序列的氨基酸残基(Lys-Asp-Pro，46-48位)已缺失(SEQID NO:67)。此外，本公开的脂质运载蛋白突变蛋白可在突变的氨基酸序列位置之外包括参照(野生型)脂质运载蛋白、优选hTlc或hNGAL的野生型(天然)氨基酸序列。
在一些实施方案中，掺入本公开的脂质运载蛋白突变蛋白中的一个或多个突变的氨基酸残基基本上不阻碍或不干扰与指定靶标的结合活性和突变蛋白的折叠。这些突变，包括取代、缺失和插入，可以使用已建立的标准方法(Sambrook和Russell，2001，Molecularcloning:a laboratory manual)在DNA水平上完成。在一些实施方案中，通过用核苷酸三联体亚组取代编码参照脂质运载蛋白相应序列位置的核苷酸三联体，通过随机诱变引入在对应于参照(野生型)脂质运载蛋白(优选hTlc或hNGAL)线性多肽序列的一个或多个序列位置处的突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的以可检测的亲和力结合4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白可以包括至少一个用另一个氨基酸例如丝氨酸残基取代天然半胱氨酸残基的氨基酸取代。在一些实施方案中，以可检测的亲和力结合4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白可以包括一个或多个非天然半胱氨酸残基，其取代参照(野生型)脂质运载蛋白、优选hTlc或hNGAL的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，根据本公开的脂质运载蛋白突变蛋白包括至少两个用半胱氨酸残基取代天然氨基酸的氨基酸取代，由此形成一个或多个半胱氨酸桥。在一些实施方案中，所述半胱氨酸桥可以连接至少两个环区。这些区的定义在本文根据(2000)，Flower(1996)和Breustedt等人(2005)使用。
通常，本公开的脂质运载蛋白突变蛋白可与成熟hTlc(SEQ ID NO:1)或成熟hNGAL(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列具有约至少70％、包括至少约80％、诸如至少约85％氨基酸序列同一性。
在一些方面，本公开提供了4-1BB结合hTlc突变蛋白。在这方面，本公开提供了一种或多种hTlc突变蛋白，其能够以约300nM、200nM、150nM、100nM或更低的KD测量的亲和力结合4-1BB。在一些实施方案中，提供的hTlc突变蛋白能够以约250nM、150nM、100nM、50nM、20nM或甚至更低的EC50值结合4-1BB。在一些其它实施方案中，所述4-1BB结合hTlc突变蛋白可与食蟹猴4-1BB(cy4-1BB)交叉反应。
在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白可干扰4-1BBL与4-1BB的结合。
在一些实施方案中，提供的hTlc突变蛋白可以在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的hTlc突变蛋白可以在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置26-34、55-58、60-61、65、104-106和108的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的hTlc突变蛋白可以进一步在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置101、111、114和153的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的hTlc突变蛋白可以在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或甚至更多个位置处包含突变氨基酸残基。在一些优选实施方案中，提供的hTlc突变蛋白能够结合4-1BB、特别是人4-1BB。
在一些实施方案中，提供的hTlc突变蛋白可以在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置26-34、55-58、60-61、65、104、106和108的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多个位置处包含突变的氨基酸残基。在一些优选的实施方案中，提供的hTlc突变蛋白能够结合4-1BB、特别是人4-1BB。
在一些实施方案中，根据本公开的脂质运载蛋白突变蛋白可以包括至少一个用例如丝氨酸残基取代天然半胱氨酸残基的氨基酸取代。在一些实施方案中，根据本公开的hTlc突变蛋白包括用另一个氨基酸诸如丝氨酸残基取代在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置61和/或153的位置处的天然半胱氨酸残基的氨基酸取代。在这种情况下，注意到已经发现，去除由半胱氨酸残基61和153形成的野生型hTlc的结构二硫键(在各自的原初核酸文库的水平上)(参见Breustedt等人，2005)可以提供不仅稳定折叠而且还能够以高亲和力结合给定非天然靶标的hTlc突变蛋白。在一些实施方案中，结构二硫键的消除可提供允许产生或故意引入非天然二硫键至本公开的突变蛋白中从而增加突变蛋白的稳定性的进一步优点。然而，结合4-1BB并具有在Cys 61和Cys 153之间形成的二硫键的hTlc突变蛋白也是本公开的一部分。
在一些具体实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白可以在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置61和/或153的位置处包括以下氨基酸取代中的一个或多个：Cys61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Gly、Gln、Asp、Asn、Leu、Tyr、Met、Ser、Pro或Trp，和/或Cys153→Ser或Ala。
在一些实施方案中，在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置61、101和153的位置处的半胱氨酸密码子中的两个或所有三个被另一个氨基酸的密码子替代。此外，在一些实施方案中，根据本公开的hTlc突变蛋白包括用丝氨酸残基或组氨酸残基取代在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置101的位置处的天然半胱氨酸残基的氨基酸取代。
在一些实施方案中，根据本公开的突变蛋白在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQID NO:1)的位置28或105的位置处包含用半胱氨酸残基取代天然氨基酸的氨基酸取代。此外，在一些实施方案中，根据本公开的突变蛋白包含用脯氨酸残基取代在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置111的位置处的天然精氨酸残基的氨基酸取代。此外，在一些实施方案中，根据本公开的突变蛋白包含用色氨酸残基或谷氨酸取代在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置114的位置处的天然半胱氨酸残基的氨基酸取代。
在一些实施方案中，提供的4-1BB结合hTlc突变蛋白可以在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Ala 5→Val或Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Thr 42→Ser；Gly46→Asp；Lys 52→Glu；Leu 56→Ala；Ser58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg或Asn；Thr 71→Ala；Val 85→Asp；Lys 94→Arg或Glu；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；Arg 148→Ser；Ser 150→Ile；和Cys 153→Ser。在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或更多个或甚至全部突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的4-1BB结合hTlc突变蛋白与成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)相比可包含以下突变的氨基酸残基组之一：
(a)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(b)Ala 5→Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg；Val 85→Asp；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；和Cys 153→Ser；
(c)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Asn；Lys 94→Arg；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；和Cys153→Ser；
(d)Ala 5→Val；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg；Lys 94→Glu；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；和Cys 153→Ser；
(e)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Thr 42→Ser；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Ile；和Cys 153→Ser；
(f)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Lys 52→Glu；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Thr 71→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ala 133→Thr；Arg 148→Ser；Ser 150→Ile；和Cys 153→Ser；和
(g)Ala 5→Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Gly 46→Asp；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Thr 71→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Ile；和Cys153→Ser。
在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白的剩余区域，即不同于对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的位置的区域，可以包含突变的氨基酸序列位置之外的成熟hTlc线性多肽序列的野生型(天然)氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白与成熟hTlc序列(SEQ ID NO:1)具有至少70％序列同一性或至少70％序列同源性。作为一个说明性实例，SEQ ID NO:56的突变蛋白与成熟hTlc的氨基酸序列具有大约84％的氨基酸序列同一性或序列同源性。
在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白包含如示于SEQ ID NOs:56-62中任一个的氨基酸序列或其片段或变体。
在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白与选自SEQ ID NOs:56-62的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性。
本公开还包括具有选自SEQ ID NOs:56-62的氨基酸序列的hTlc突变蛋白的结构同源物，所述结构同源物相对于所述hTlc突变蛋白具有大于约60％、优选大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于92％和最优选大于95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。
在一些方面，本公开提供了4-1BB结合hNGAL突变蛋白。在这方面，本公开提供了一种或多种hNGAL突变蛋白，其能够以约800nM、700nM、200nM、140nM、100nM或更低、优选约70nM、50nM、30nM、10nM、5nM、2nM或甚至更低的KD测量的亲和力结合4-1BB。在一些实施方案中，提供的hNGAL突变蛋白能够以约1000nM、500nM、100nM、80nM、50nM、25nM、18nM、15nM、10nM、5nM或更低的EC50值结合4-1BB。
在一些实施方案中，提供的4-1BB结合hNGAL突变蛋白可以与食蟹猴4-1BB交叉反应。在一些实施方案中，提供的hNGAL突变蛋白能够以约50nM、20nM、10nM、5nM、2nM或甚至更低的KD测量的亲和力结合食蟹猴4-1BB。在一些实施方案中，提供的hNGAL突变蛋白能够以约100nM、80nM、50nM、30nM或甚至更低的EC50值结合食蟹猴4-1BB。
在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白可以干扰或竞争4-1BBL与4-1BB的结合。在一些其他实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白可能够在存在4-1BBL的情况下结合4-1BB和/或结合4-1BB/4-1BBL复合物。
在一些实施方案中，提供的hNGAL突变蛋白可以在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的hNGAL突变蛋白可以在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个位置处包含突变的氨基酸残基。在一些优选实施方案中，提供的hNGAL突变蛋白能够结合4-1BB、特别是人4-1BB。
在一些实施方案中，提供的hNGAL突变蛋白可以在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。在一些优选实施方案中，提供的hNGAL突变蛋白能够结合4-1BB、特别是人4-1BB。
在一些实施方案中，提供的hNGAL突变蛋白可以在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置36、87和96的一个或多个位置处以及在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置28、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、94、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。
在其它一些实施方案中，提供的hNGAL突变蛋白可以在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132和134的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。
在其它实施方案中，提供的hNGAL突变蛋白可以在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、125、127、132和134的一个或多个位置处以及在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置20、25、33、44、59、71、78、80、82、87、92、98、101和122的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，根据本公开的脂质运载蛋白突变蛋白可以包含至少一个用例如丝氨酸残基取代天然半胱氨酸残基的氨基酸取代。在一些实施方案中，根据本公开的hNGAL突变蛋白可以包含用另一个氨基酸诸如丝氨酸残基取代在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置76和/或175的位置处的天然半胱氨酸残基的氨基酸取代。在此背景下，注意到已经发现，去除由半胱氨酸残基76和175形成的野生型hNGAL的结构二硫键(在各自的原初核酸文库水平上)(参见Breustedt等人，2005)可以提供不仅稳定折叠而且还能够以高亲和力结合给定非天然靶标的hNGAL突变蛋白。在一些实施方案中，结构二硫键的消除可提供允许产生或故意引入非天然二硫键至本公开的突变蛋白中从而增加突变蛋白的稳定性的进一步优点。然而，结合4-1BB并具有在Cys 76和Cys 175之间形成的二硫键的hNGAL突变蛋白也是本公开的一部分。
在一些实施方案中，提供的4-1BB结合hNGAL突变蛋白可以在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg或Lys；Gln 49→Val、Ile、His、Ser或Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Met、Ala或Gly；Leu 70→Ala、Lys、Ser或Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Met、Arg、Thr或Asn；Trp 79→Ala或Asp；Arg81→Met、Trp或Ser；Phe 83→Leu；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn96→Lys；Tyr100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu和Lys 134→Tyr。在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL(SEQ ID NO:2)的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个、甚至更多个诸如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个或全部突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的4-1BB结合hNGAL突变蛋白可以在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132和134的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Gln 20→Arg；Asn 25→Tyr或Asp；Gln 28→His；Val 33→Ile；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Glu 44→Val或Asp；Gln 49→His；Tyr 52→Ser或Gly；Lys 59→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Phe 71→Leu；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln或His；Tyr 78→His；Trp 79→Ile；Ile 80→Asn；Arg 81→Trp或Gln；Thr82→Pro；Cys 87→Ser；Phe 92→Leu或Ser；Asn 96→Phe；Lys 98→Arg；Tyr 100→Asp；Pro101→Leu；Leu 103→His或Pro；Phe 122→Tyr；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly。在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL(SEQ IDNO:2)的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的4-1BB结合hNGAL突变蛋白可以在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、125、127、132和134的一个或多个诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Ser或Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln或His；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp或Gln；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His或Pro；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly。在一些实施方案中，提供的4-1BB结合hNGAL突变蛋白可以进一步在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置20、25、33、44、59、71、78、80、82、87、92、98、101和122的一个或多个诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Gln 20→Arg；Asn 25→Tyr或Asp；Val 33→Ile；Glu 44→Val或Asp；Lys 59→Asn；Phe 71→Leu；Tyr 78→His；Ile 80→Asn；Thr 82→Pro；Phe 92→Leu或Ser；Lys 98→Arg；Pro 101→Leu；和Phe 122→Tyr。
在一些实施方案中，提供的4-1BB结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)相比可包含以下突变的氨基酸残基组之一：
(a)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(b)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Ile；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Met；Leu 70→Lys；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Met；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(c)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Ala；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(d)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Ala；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(e)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Ser；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Ser；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Met；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(f)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Val；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Arg；Trp 79→Asp；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(g)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→His；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(h)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Phe 83→Leu；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr132→Glu；和Lys 134→Tyr；或
(i)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Ser；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Asn；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr。
在一些进一步实施方案中，在剩余区域，即不同于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQID NO:2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的区域，本公开的hNGAL突变蛋白可以包括突变的氨基酸序列位置之外的成熟hNGAL的野生型(天然)氨基酸序列。
在一些其它实施方案中，提供的4-1BB结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)相比可包含以下突变的氨基酸残基组之一：
(a)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(b)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Lys 98→Arg；Tyr 100→Asp；Pro 101→Leu；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(c)Asn 25→Tyr；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Phe 71→Leu；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Gln；Phe 92→Ser；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(d)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Tyr 78→His；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(e)Asn 25→Asp；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(f)Val 33→Ile；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(g)Gln 20→Arg；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Glu 44→Val；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Phe 122→Tyr；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(h)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Ile 80→Asn；Arg 81→Trp；Thr 82→Pro；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Pro 101→Leu；Leu 103→Pro；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(i)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Lys 59→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；和
(j)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Glu 44→Asp；Gln 49→His；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Phe 71→Leu；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→His；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly。
在一些实施方案中，提供的4-1BB结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)相比可包含以下突变的氨基酸残基组：Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Ile；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Met；Leu 70→Lys；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Met；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr，和/或提供的突变蛋白可与SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性。
在一些实施方案中，在剩余区域，即不同于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132和134的区域，本公开的hNGAL突变蛋白可以包括突变的氨基酸序列位置之外成熟hNGAL的野生型(天然)氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL序列(SEQ ID NO:2)具有至少70％序列同一性或至少70％序列同源性。作为一个说明性实例，SEQ ID NO:64的突变蛋白与成熟hNGAL的氨基酸序列具有大约87％的氨基酸序列同一性或序列同源性。
在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白包含如示于SEQ ID NOs:63-71中任一个的氨基酸序列或其片段或变体。
在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白与选自SEQ ID NOs:63-71的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性。
本公开还包括具有选自SEQ ID NOs:63-71的氨基酸序列的hNGAL突变蛋白的结构同源物，所述结构同源物相对于所述hNGAL突变蛋白具有大于约60％、优选大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于92％和最优选大于95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。
在一些实施方案中，本发明提供了一种脂质运载蛋白突变蛋白，其以约5nM或更低的KD测量的亲和力结合4-1BB，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性。
在一些实施方案中，本公开的脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白可在其N-或C末端、优选C末端包含异源氨基酸序列，诸如Strep II标签(SEQ ID NO:12)或某些限制性酶的切割位点序列，而不影响脂质运载蛋白突变蛋白的生物学活性(与其靶标例如4-1BB的结合)。
在一些实施方案中，可以引入脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白的进一步修饰以调节所述突变蛋白的某些特征，诸如以改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白质抗性或水溶性，或降低聚集趋势，或向所述突变蛋白引入新的特征。在一些实施方案中，修饰可导致提供的突变蛋白的两种或更多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种)特征被调节。
例如，可以突变脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白的一个或多个氨基酸序列位置以引入新的反应基团，例如用于缀合至其它化合物，诸如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白，或用于形成非天然存在的二硫键。缀合的化合物，例如PEG和HES，在一些情况下可增加相应脂质运载蛋白突变蛋白的血清半衰期。
在一些实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白的反应基团可天然存在于其氨基酸序列中，诸如所述氨基酸序列中天然存在于的半胱氨酸残基。在一些其它实施方案中，这样的反应基团可以通过诱变引入。在通过诱变引入反应基团的情况下，一种可能性是通过半胱氨酸残基使在适当位置处的氨基酸突变。将半胱氨酸残基引入hTlc突变蛋白的氨基酸序列中的这种突变的示例性可能性包括hTlc野生型序列(SEQ IDNO:1)的Thr 40→Cys、Glu 73→Cys、Arg 90→Cys、Asp 95→Cys和Glu 131→Cys的取代。将半胱氨酸残基引入hNGAL突变蛋白的氨基酸序列中的这种突变的示例性可能性包括在对应于hNGAL野生型序列(SEQ ID NO:2)的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的序列位置中的一个或多个处引入半胱氨酸残基。产生的巯基部分可用于对突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白进行聚乙二醇化(PEGylate)或HESylate，例如，以便增加相应脂质运载蛋白突变蛋白的血清半衰期。
在一些实施方案中，为了提供合适的氨基酸侧链作为用于将上述化合物之一缀合至脂质运载蛋白突变蛋白的新的反应基团，可将人工氨基酸引入脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白的氨基酸序列。通常，将这些人工氨基酸设计成更具反应性，从而促进与所需化合物的缀合。此类人工氨基酸可通过诱变引入，例如，使用人工tRNA对乙酰基苯丙氨酸。
在一些实施方案中，本公开的脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白在其N末端或其C末端(至少一个)处融合至蛋白质、蛋白质结构域或肽(例如抗体、信号序列和/或亲和标签)。在一些其他实施方案中，本公开的脂质运载蛋白突变蛋白在其N末端或其C末端缀合至配偶体，所述配偶体是蛋白质、蛋白质结构域或肽；例如抗体、信号序列和/或亲和标签。
亲和标签诸如Strep-标签或Strep-标签II(Schmidt等人，1996)、c-myc-标签、FLAG-标签、His-标签或HA-标签或蛋白质诸如谷胱甘肽-S-转移酶或其组合，其允许容易地检测和/或纯化重组蛋白，是合适的融合配偶体的实例。作为一个说明性实例，可将myc-His-标签，例如如示于SEQ ID NO:131，融合至脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽(例如如示于SEQ ID NO:38-55的一个)或多聚体蛋白，例如在C末端。具有生色或荧光性质的蛋白质诸如绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)也是本公开的脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白的合适融合配偶体。通常，可以用任何合适的化学物质或酶标记本公开的脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白，其在化学、物理、光学或酶促反应中直接或间接产生可检测的化合物或信号。例如，荧光或放射性标记可缀合至脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白以产生荧光或X射线作为可检测信号。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶是催化生色反应产物形成的酶标记(以及同时是光学标记)的实例。通常，常用于抗体的所有标记(除了那些仅与免疫球蛋白Fc部分中的糖部分一起使用的标记)也可用于缀合至本公开的脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白。
在一些实施方案中，本公开的脂质运载蛋白突变蛋白可以融合或缀合至延长突变蛋白血清半衰期的部分(在这方面也参见国际专利公开No.WO 2006/056464，其中这样的策略参考对CTLA-4具有结合亲和力的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)的突变蛋白描述)。延长血清半衰期的部分可以是PEG分子、HES分子、脂肪酸分子，诸如棕榈酸(Vajo和Duckworth，2000)、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽、白蛋白结合蛋白或转铁蛋白，仅举几个例子。
在一些实施方案中，如果PEG用作缀合配偶体，则PEG分子可以是取代的、未取代的、线性的或分支的。它还可以是活化的聚乙烯衍生物。合适的化合物的实例是PEG分子，如国际专利公开No.WO 1999/64016、美国专利No.6,177,074或美国专利No.6,403,564中关于干扰素所述，或如关于其它蛋白质所述，诸如PEG修饰的天冬酰胺酶、PEG-腺苷脱氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶(Fuertges和Abuchowski，1990)。这种聚合物诸如聚乙二醇的分子量的范围可以为约300至约70,000道尔顿，包括例如分子量为约10,000、约20,000、约30,000或约40,000道尔顿的聚乙二醇。此外，例如，如美国专利No.6,500,930或6,620,413中所述，可以将碳水化合物寡聚物和聚合物诸如HES缀合至本公开的突变蛋白以延长血清半衰期。
在一些实施方案中，如果免疫球蛋白的Fc部分用于延长本公开的脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白的血清半衰期，可使用可从Syntonix PharmaceuticalsInc.(MA，USA)商购获得的SynfusionTM技术。使用这种Fc融合技术允许产生更长作用的生物药物，并且可以例如由连接至抗体Fc区的突变蛋白的两个拷贝组成，以改善药物动力学、溶解性和生产效率。
可用于延长脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白的血清半衰期的白蛋白结合肽的实例是，例如，具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的那些，其中Xaa1是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa2是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa3是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；Xaa4是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr，如美国专利公开No.20030069395或Dennis等人(2002)中所述。融合或缀合至脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白以延长血清半衰期的白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白、抗体、包括结构域抗体的抗体片段(例如参见美国专利6,696,245)或具有白蛋白结合活性的脂质运载蛋白突变蛋白。细菌白蛋白结合蛋白的实例包括链球菌蛋白G(Konig和Skerra，1998)。
在一些实施方案中，如果白蛋白结合蛋白是抗体片段，则其可以是结构域抗体。结构域抗体(dAb)被工程化以允许精确控制生物物理性质和体内半衰期，从而产生最佳的安全性和功效产物谱。结构域抗体例如可从Domantis Ltd(Cambridge,UK和MA,USA)商购获得。
在一些实施方案中，白蛋白本身(Osborn等人，2002)或白蛋白的生物活性片段可用作本公开的脂质运载蛋白突变蛋白的配偶体以延长血清半衰期。术语“白蛋白”包括所有哺乳动物白蛋白，诸如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。白蛋白或其片段可以如美国专利No.5,728,553或欧洲专利公开Nos.EP0330451和EP0361991中所述重组产生。因此，重组人白蛋白(例如来自Novozymes Delta Ltd.,Nottingham,UK的
)可缀合或融合至本公开的脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白。
在一些实施方案中，如果转铁蛋白用作延长本公开的脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白的血清半衰期的配偶体，则突变蛋白可遗传融合至非糖基化转铁蛋白的N或C末端或两者。非糖基化转铁蛋白的半衰期为14-17天，转铁蛋白融合蛋白类似地具有延长的半衰期。转铁蛋白载体还提供了高生物利用度、生物分布和循环稳定性。该技术可从BioRexis(BioRexis Pharmaceutical Corporation,PA,USA)商购获得。用作蛋白稳定剂/半衰期延长配偶体的重组人转铁蛋白(DeltaFerrinTM)也可从Novozymes Delta Ltd.(Nottingham,UK)商购获得。
延长本公开的脂质运载蛋白突变蛋白的半衰期的又一种备选方案是将长的、非结构化的、柔性的富含甘氨酸的序列(例如具有约20至80个连续甘氨酸残基的聚甘氨酸)融合至脂质运载蛋白突变蛋白、单体多肽或多聚体蛋白的N或C末端。例如，国际专利公开No.WO2007/038619中公开的这种方法也称为“rPEG”(重组PEG)。
E.如多聚体蛋白中包含的示例性GPC3靶向部分。
在一些实施方案中，对于提供的多聚体蛋白，GPC3靶向部分可以是或包含对GPC3特异性的全长抗体或其抗原结合结构域或衍生物。在一些实施方案中，GPC3靶向部分可以是或包含对GPC3特异性的单链可变片段(scFv)。
本公开的GPC3结合抗体的说明性实例可以包含抗原结合区，其交叉阻断或结合与GPC3结合抗体相同的表位，所述GPC3结合抗体包含已知抗体诸如codrituzumab(也称为GC33或RO5137382)、YP7(包括人源化YP7)、HN3和HS20的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)区。在一些实施方案中，本公开的GPC3结合抗体可包含抗原结合区，诸如来自选自codrituzumab、YP7、HN3和HS20的抗体的三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)中的任一个。
在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域或衍生物可具有选自SEQ ID NOs:104、105、115、120和126的重链可变区(HCVR)和/或选自SEQ ID NOs:106、116、127和128的轻链可变区(LCVR)。
在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域或衍生物的重链和轻链对是或包含分别如以下的HCVR和LCVR：SEQ ID NOs:104和106，SEQ ID NOs:106和106，SEQID NOs:115和116，SEQ ID NOs:126和127或SEQ ID NOs:126和128。
在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域或衍生物的重链和轻链对分别是或包含分别具有以下序列的HCVR和LCVR：所述序列与示于SEQ ID NOs:104和106、SEQ ID NOs:106和106、SEQ ID NOs:115和116、SEQ ID NOs:126和127或SEQ ID NOs:126和128的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性。
在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域或衍生物可具有是SEQID NOs:104和105中任一个的重链，和/或是SEQ ID NO:106的轻链。
在一些实施方案中，提供的GPC3抗体的重链和轻链对是或包含如示于SEQ IDNOs:104和106或SEQ ID NOs:105和106的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供的GPC3抗体的重链和轻链对是或包含具有以下序列的重链和轻链：所述序列与如示于SEQ ID NOs:104和106或SEQ ID NOs:105和106的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性。
在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域可具有与选自SEQ IDNOs:104、105、115、120和126的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高序列同一性的HCVR，和/或与选自SEQ ID NOs:106、116、127和128的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高序列同一性的LCVR。在其它实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域可具有与选自SEQ ID NOs:104和105的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:106的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至更高序列同一性的轻链。
在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域的重链可变区可具有三个CDR，所述CDR具有以下序列：GYTFTDYE(HCDR1，SEQ ID NO:99)、LDPKTGDT(HCDR2，SEQ IDNO:100)、TRFYSYTY(HCDR3；SEQ ID NO:101)。在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域的重链可变区可具有三个CDR，所述CDR具有以下序列：GFTFNKNA(HCDR1，SEQ IDNO:110)、IRNKTNNYAT(HCDR2，SEQ ID NO:111)、VAGNSFAY(HCDR3；SEQ ID NO:112)。在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域的重链可变区可具有三个CDR，所述CDR具有以下序列：YFDFDSYE(HCDR1，SEQ ID NO:117)、IYHSGST(HCDR2，SEQ ID NO:118)、ARVNMDRFDY(HCDR3；SEQ ID NO:119)。在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域的重链可变区可具有三个CDR，所述CDR具有以下序列：GFTFSSYA (HCDR1，SEQ ID NO:122)、IQKQGLPT(HCDR2，SEQ ID NO:122)、AKNRAKFDY(HCDR3；SEQ ID NO:123)。
在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域的轻链可变区可具有三个CDR，所述CDR具有以下序列：QSLVHSNRNTY(LCDR1，SEQ ID NO:102)、KVS(LCDR2)、SQNTHVPPT(LCDR3；SEQ ID NO:103)。在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域的轻链可变区可具有三个CDR，所述CDR具有以下序列：QSLLYSSNQKNY(LCDR1，SEQ IDNO:113)、WAS(LCDR2)、QQYYNYPLT(LCDR3；SEQ ID NO:114)。在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域的轻链可变区可具有三个CDR，所述CDR具有以下序列：QSISSY(LCDR1，SEQ ID NO:124)、NAS(LCDR2)、QQNRGFPLT(LCDR3；SEQ ID NO:125)。
在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域包括具有三个CDR的重链可变区，所述CDR具有以下序列：GYTFTDYE(HCDR1，SEQ ID NO:99)、LDPKTGDT(HCDR2，SEQID NO:100)、TRFYSYTY(HCDR3；SEQ ID NO:101)；和具有三个CDR的轻链可变区，所述CDR具有以下序列：QSLVHSNRNTY(LCDR1，SEQ ID NO:102)、KVS(LCDR2)、SQNTHVPPT(LCDR3；SEQ IDNO:103)。在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域包括具有三个CDR的重链可变区，所述CDR具有以下序列：GFTFNKNA(HCDR1，SEQ ID NO:110)、IRNKTNNYAT(HCDR2，SEQ ID NO:111)、VAGNSFAY(HCDR3；SEQ ID NO:112)；和具有三个CDR的轻链可变区，所述CDR具有以下序列：QSLLYSSNQKNY(LCDR1，SEQ ID NO:113)、WAS(LCDR2)、QQYYNYPLT(LCDR3；SEQ ID NO:114)。在一些实施方案中，提供的GPC3抗体或其抗原结合结构域包括具有三个CDR的重链可变区，所述CDR具有以下序列：GFTFSSYA(HCDR1，SEQ ID NO:121)、IQKQGLPT(HCDR2，SEQ ID NO:122)、AKNRAKFDY(HCDR3；SEQ ID NO:123)；和具有三个CDR的轻链可变区，所述CDR具有以下序列：QSISSY(LCDR1，SEQ ID NO:124)、NAS(LCDR2)、QQNRGFPLT(LCDR3；SEQ ID NO:125)。
在一些实施方案中，本文公开的对GPC3特异性的单链可变片段(scFv)可以源自具有如示于SEQ ID NOs:104和106或SEQ ID NOs:105和106的氨基酸序列的GPC3抗体。在一些实施方案中，提供的对GPC3特异性的scFv可以与示于SEQ ID NO:98的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高序列同一性。在一些实施方案中，提供的对GPC3特异性的scFv可以示于SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
除非另有说明，本文公开的所有CDR序列根据如Lefranc,M.-P.,TheImmunologist,7,132-136(1999)所述的IMGT方法进行定义。CDR1由27-38位组成，CDR2由56-65位组成，种系V基因的CDR3由105-116位组成，重排的V-J基因或V-D-J基因的CDR3由105-117位(J-PHE或J-TRP 118之前的位置)组成，其中对于具有少于13个氨基酸的重排的CDR3-IMGT，在环顶部具有缺口，或者对于具有多于13个氨基酸的重排的CDR3-IMGT，具有额外的112.1、111.1、112.2、111.2等位置。在这段中给出的位置是根据Lefranc,M.-P.,TheImmunologist,7,132-136(1999)中所述的IMGT编号方案。
用于产生抗体或其抗原结合结构域或衍生物的各种技术是本领域熟知的，并且描述于例如Altshuler等人(2010)中。因此，例如，多克隆抗体可以在用抗原与添加剂和佐剂的混合物免疫后从动物血液获得，并且单克隆抗体可以通过提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术来产生。这些技术的例子描述于例如Harlow和Lane(1999)，(1988)，包括最初由
和Milstein，1975描述的杂交瘤技术，trioma技术，人B细胞杂交瘤技术(参见例如Li等人，2006；Kozbor和Roder,1983)和EBV-杂交瘤技术，以产生人单克隆抗体(Cole等人，1984)。此外，重组抗体可从单克隆抗体获得，或者可使用各种展示方法诸如噬菌体、核糖体、mRNA或细胞展示从头制备。在一些实施方案中，用于表达重组(人源化)抗体或其片段的合适系统可以选自例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞系或转基因动物或植物(参见例如美国专利No.6,080,560；Holliger和Hudson，2005)。此外，可以改造用于产生单链抗体的所述技术(参见尤其是，美国专利No.4,946,778)以产生对本发明的靶标特异性的单链抗体。如BIAcore系统中所用的表面等离子体共振可用于提高噬菌体抗体的效率。
在一些其他实施方案中，对于提供的多聚体蛋白，GPC3靶向部分可以是或包含GPC3靶向脂质运载蛋白突变蛋白。
在一些方面，本公开提供GPC3结合hNGAL突变蛋白。在这方面，本公开提供了一种或多种hNGAL突变蛋白，其能够以通过约1nM、0.5nM、0.3nM、0.2nM或更低的KD测量的亲和力结合GPC3。
在一些实施方案中，提供的GPC3结合hNGAL突变蛋白可在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和175的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的GPC3结合hNGAL突变蛋白可在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和175的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Leu 36→Val或Arg；Ala 40→Leu、Val或Gly；Ile 41→Leu、Arg、Met、Gly或Ala；Gln 49→Pro或Leu；Tyr 52→Arg或Trp；Asn 65→Asp；Ser 68→Val、Gly、Asn或Ala；Leu 70→Arg、Ser、Ala或Val；Arg 72→Asp、Trp、Ala或Gly；Lys 73→Gly、Arg、Asn、Glu或Ser；Cys 76→Val或Ile；Asp 77→His、Met、Val、Leu、Thr或Lys；Trp 79→Lys、Ser或Thr；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg、Asp、Gln或Pro；Tyr 100→Gly、Glu、Pro或Gln；Leu 103→Glu、Gln、Asn、Gly、Ser、Asp或Tyr；Ser 105→Ala；Tyr 106→Asn、Ser或Thr；Lys125→Glu；Ser 127→Arg或Tyr；Tyr 132→Trp或Ile；Lys 134→Ala或Phe；Thr 136→Ile；和Cys 175→Ala。在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL(SEQ ID NO:2)的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个、甚至更多个诸如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个或全部突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的GPC3结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)相比可包含以下突变的氨基酸残基组之一：
(a)Leu 36→Val；Ile 41→Leu；Gln 49→Leu；Tyr 52→Arg；Asn 65→Asp；Ser 68→Val；Leu 70→Ser；Arg 72→Trp；Lys 73→Arg；Asp 77→His；Trp 79→Lys；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Gly；Leu 103→Gln；Tyr 106→Asn；Lys 125→Glu；Ser 127→Arg；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Ala；
(b)Leu 36→Val；Ala 40→Val；Ile 41→Arg；Gln 49→Pro；Tyr 52→Arg；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Ser；Lys 73→Gly；Asp 77→His；Trp 79→Lys；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Asp；Tyr 100→Gly；Leu 103→Glu；Tyr 106→Asn；Lys 125→Glu；Ser 127→Arg；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Phe；
(c)Leu 36→Val；Ala 40→Gly；Ile 41→Met；Gln 49→Leu；Tyr 52→Arg；Asn 65→Asp；Leu 70→Ala；Lys 73→Asn；Asp 77→His；Trp 79→Lys；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Gln；Tyr 100→Gly；Leu 103→Glu；Tyr 106→Asn；Lys 125→Glu；Ser 127→Arg；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Phe；
(d)Leu 36→Arg；Ala 40→Val；Ile 41→Gly；Gln 49→Pro；Tyr 52→Trp；Asn 65→Asp；Ser 68→Asn；Leu 70→Arg；Arg 72→Ala；Lys 73→Arg；Asp 77→Leu；Trp 79→Ser；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Gln；Tyr 100→Glu；Leu 103→Asn；Ser 105→Ala；Tyr 106→Asn；Lys 125→Glu；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Ile；Lys 134→Phe；和Thr136→Ile；
(e)Leu 36→Arg；Ala 40→Val；Ile 41→Gly；Gln 49→Pro；Tyr 52→Trp；Asn 65→Asp；Ser 68→Asn；Leu 70→Arg；Arg 72→Ala；Lys 73→Arg；Asp 77→Thr；Trp 79→Ser；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Gln；Tyr 100→Glu；Leu 103→Gly；Ser 105→Ala；Tyr 106→Asn；Lys 125→Glu；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Ile；Lys 134→Phe；和Thr136→Ile；
(f)Leu 36→Arg；Ala 40→Gly；Ile 41→Ala；Gln 49→Pro；Tyr 52→Trp；Asn 65→Asp；Ser 68→Asn；Leu 70→Arg；Arg 72→Ala；Lys 73→Arg；Asp 77→Val；Trp 79→Ser；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Pro；Tyr 100→Glu；Leu 103→Asn；Ser 105→Ala；Tyr 106→Ser；Lys 125→Glu；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Ile；Lys 134→Phe；和Thr136→Ile；
(g)Leu 36→Arg；Ala 40→Val；Ile 41→Ala；Gln 49→Pro；Tyr 52→Arg；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Arg；Arg 72→Ala；Lys 73→Arg；Asp 77→Leu；Trp 79→Ser；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Glu；Leu 103→Tyr；Ser 105→Ala；Tyr 106→Asn；Lys 125→Glu；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Ile；Lys 134→Phe；和Thr136→Ile；
(h)Leu 36→Arg；Ala 40→Val；Ile 41→Ala；Gln 49→Pro；Tyr 52→Arg；Asn 65→Asp；Ser 68→Asn；Leu 70→Val；Arg 72→Ala；Lys 73→Gly；Asp 77→Lys；Trp 79→Ser；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Arg；Tyr 100→Pro；Leu 103→Asn；Ser 105→Ala；Tyr 106→Asn；Lys 125→Glu；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Ile；Lys 134→Phe；和Thr136→Ile；
(i)Leu 36→Arg；Ala 40→Leu；Ile 41→Gly；Gln 49→Pro；Tyr 52→Trp；Asn 65→Asp；Ser 68→Asn；Leu 70→Arg；Arg 72→Ala；Lys 73→Arg；Asp 77→Met；Trp 79→Ser；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Gln；Tyr 100→Glu；Leu 103→Ser；Ser 105→Ala；Tyr 106→Asn；Lys 125→Glu；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Ile；和Lys 134→Phe；
(j)Leu 36→Arg；Ala 40→Val；Ile 41→Gly；Gln 49→Pro；Tyr 52→Trp；Asn 65→Asp；Ser 68→Asn；Leu 70→Arg；Arg 72→Ala；Lys 73→Gly；Cys 76→Val；Asp 77→Lys；Trp 79→Thr；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Gln；Tyr 100→Glu；Leu 103→Asn；Ser 105→Ala；Tyr 106→Thr；Lys 125→Glu；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Ile；Lys 134→Phe；和Cys 175→Ala；
(k)Leu 36→Arg；Ala 40→Val；Ile 41→Gly；Gln 49→Pro；Tyr 52→Arg；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Arg；Arg 72→Gly；Lys 73→Glu；Cys 76→Ile；Asp 77→Lys；Trp 79→Ser；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Gln；Tyr 100→Gln；Leu 103→Asp；Ser 105→Ala；Tyr 106→Thr；Lys 125→Glu；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Ile；Lys134→Phe；Thr 136→Ile；和Cys 175→Ala；和
(l)Leu 36→Arg；Ala 40→Val；Ile 41→Gly；Gln 49→Pro；Tyr 52→Arg；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Arg；Arg 72→Asp；Lys 73→Ser；Cys 76→Val；Asp 77→Thr；Trp 79→Ser；Arg 81→Gly；Cys 87→Ser；Asn 96→Gln；Tyr 100→Glu；Leu 103→Asn；Ser 105→Ala；Tyr 106→Thr；Lys 125→Glu；Ser 127→Tyr；Tyr 132→Ile；Lys 134→Phe；Thr 136→Ile；Cys 175→Ala。
在一些实施方案中，在剩余区域，即不同于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和175的区域，本公开的GPC3结合hNGAL突变蛋白可以包括突变的氨基酸序列位置之外的成熟hNGAL的野生型(天然)氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的GPC3结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL序列(SEQ IDNO:2)具有至少70％序列同一性或至少70％序列同源性。作为一个说明性实例，SEQ ID NO:90的突变蛋白与成熟hNGAL的氨基酸序列具有大约87％的氨基酸序列同一性或序列同源性。
在一些实施方案中，本公开的GPC3结合hNGAL突变蛋白包含如示于SEQ ID NOs:74-97中任一个的氨基酸序列或其片段或变体。
在一些实施方案中，本公开的GPC3结合hNGAL突变蛋白与选自SEQ ID NOs:74-97的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性。
本公开还包括具有选自SEQ ID NOs:74-97的氨基酸序列的GPC3结合hNGAL突变蛋白的结构同源物，所述结构同源物相对于所述hNGAL突变蛋白具有大于约60％、优选大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于92％和最优选大于95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。
F.如多聚体蛋白中包含的示例性PD-L1靶向部分。
在一些实施方案中，对于提供的多聚体蛋白，PD-L1靶向部分可以是或包含对PD-L1特异性的单链可变片段(scFv)。例如，对PD-L1特异性的scFv可源自PD-L1特异性抗体，所述抗体选自atezolizumab(也称为MPDL3280A或RG7446，商品名
)、avelumab(也称为MSB0010718C，商品名/>
)、durvalumab(以前称为MEDI4736，商品名/>
)和BMS-936559(也称为MDX-1105)。这些和其它合适的PD-L1特异性抗体进一步描述于例如WO 2020/02565 9A1中，其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，提供的对PD-L1特异性的scFv可以与示于SEQ ID NO:172的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至更高序列同一性。在一些实施方案中，提供的对PD-L1特异性的scFv包含重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，它们具有与SEQ ID NO:172的重链CDR和轻链CDR相同的序列。在一些实施方案中，提供的对PD-L1特异性的scFv可以包含示于SEQ ID NO:172的氨基酸序列。
G.如多聚体蛋白中包含的示例性OX40靶向部分。
在一些实施方案中，对于提供的多聚体蛋白，OX40靶向部分可以是或包含OX40靶向脂质运载蛋白突变蛋白。
在一些实施方案中，OX40靶向脂质运载蛋白突变蛋白是hTlc突变蛋白。在一些其它实施方案中，OX40靶向脂质运载蛋白突变蛋白是hNGAL突变蛋白。在一些实施方案中，所述突变蛋白能够以约500nM或更低、约400nM或更低、约300nM或更低、约200nM或更低、约150nM或更低、约100nM或更低、约70nM或更低、约50nM或更低、约30nM或更低、约20nM或更低、约15nM或更低、约10nM或更低、约5nM或更低、约3nM或更低、约2nM或更低、约1nM或更低、约0.5nM或甚至更低的KD测量的亲和力结合OX40，如例如在表面等离子体共振(SPR)测定中测定的。在一些实施方案中，所述突变蛋白以约250nM或更低、约200nM或更低、约150nM或更低、约100nM或更低、约70nM或更低、约50nM或更低、约30nM或更低、约20nM或更低、约15nM或更低、约10nM或更低、约7nM或更低、约5nM或更低、约3nM或更低、约2nM或更低、约1nM或甚至更低的EC50值结合OX40，如例如在荧光活化细胞分选(FACS)测定中测定的。在一些实施方案中，所述突变蛋白与人OX40和猕猴OX40都交叉反应。在一些实施方案中，所述突变蛋白干扰OX40配体(OX40L)与OX40的结合。在一些实施方案中，所述突变蛋白与OX40L竞争结合OX40。
在一些实施方案中，提供的OX40结合hTlc突变蛋白可在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置5、6、8、11、19、23、26-34、36、37、40、52、55-56、58、60-61、65、79、86、101、104-106、108、111、113-114、116、121、124、137、140、148和153的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或更多个)位置处包含突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白在成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的上述位置中一个或多个处包含10个或更多个突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白在成熟hTlc线性多肽序列(SEQ IDNO:1)的上述位置中一个或多个处包含15个或更多个突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白在成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的上述位置中一个或多个处包含20个或更多个突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的OX40结合hTlc突变蛋白可在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置5、6、8、11、19、23、26-34、36、37、40、52、55-56、58、60-61、65、79、86、101、104-106、108、111、113-114、116、121、124、137、140、148和153的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Ala 5→Thr；Ser 6→Thr；Glu 8→Lys；Gln11→Arg；Leu 19→Met or Gln；Thr 23→Lys；Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Val36→Asp；Thr 37→Ala；Thr 40→Ile；Lys 52→Glu；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Ser 58→Asp；Arg 60→Lys；Cys 61→Tyr；Lys 65→Ile；Ala 79→Thr；Ala 86→Thr；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；Val 113→Metor Leu；Lys 114→Trp；Val 116→Ala；Lys 121→Met；Leu 124→Lys；Arg 137→His；Ser140→Arg；Arg 148→Ser or Trp；和Cys 153→Ser。在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或更多个或甚至全部上述突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的这些序列位置处包含10个或更多个上述突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白在成熟hTlc的这些序列位置(SEQ ID NO:1)包含15个或更多个上述突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白在成熟hTlc的这些序列位置(SEQ ID NO:1)包含20个或更多个上述突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的OX40结合hTlc突变蛋白可在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置26-34、55-56、60、101、104-105、108、111和114的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Arg 60→Lys；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；和Lys 114→Trp。在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个上述突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的这些序列位置处包含10个或更多个上述突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的这些序列位置处包含15个或更多个上述突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的OX40结合hTlc突变蛋白可在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置23、26-34、55-56、58、60-61、101、104-106、108、111、114和153的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Thr 23→Lys；Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Ser 58→Asp；Arg 60→Lys；Cys61→Tyr；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108→Ile；Arg111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser。在一些实施方案中，本公开的hTlc突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO:1)的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个上述突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的OX40结合hTlc突变蛋白可在对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置5、6、8、11、19、36、37、40、52、65、79、86、113、116、121、124、137、140和148的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Ala 5→Thr；Ser 6→Thr；Glu 8→Lys；Gln 11→Arg；Leu 19→Met or Gln；Val 36→Asp；Thr 37→Ala；Thr 40→Ile；Lys 52→Glu；Lys 65→Ile；Ala 79→Thr；Ala 86→Thr；Val 113→Met orLeu；Val 116→Ala；Lys 121→Met；Leu 124→Lys；Arg 137→His；Ser 140→Arg；和Arg148→Ser或Trp。
在一些实施方案中，提供的OX40结合hTlc突变蛋白与成熟hTlc线性多肽序列(SEQID NO:1)相比可包含以下突变的氨基酸残基组之一：
(a)Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Ser 58→Asp；Arg 60→Lys；Cys 61→Tyr；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(b)Leu 19→Gln；Thr 23→Lys；Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Val 36→Asp；Thr 40→Ile；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Ser 58→Asp；Arg 60→Lys；Cys 61→Tyr；Ala 86→Thr；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；Val 113→Met；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(c)Leu 19→Met；Thr 23→Lys；Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Ser 58→Asp；Arg 60→Lys；Cys 61→Tyr；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；Val 113→Met；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(d)Ala 5→Thr；Thr 23→Lys；Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Lys 52→Glu；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Ser 58→Asp；Arg 60→Lys；Cys 61→Tyr；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；Val 113→Met；Lys 114→Trp；Arg 137→His；和Cys 153→Ser；
(e)Ser 6→Thr；Thr 23→Lys；Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Thr 37→Ala；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Ser 58→Asp；Arg 60→Lys；Cys 61→Tyr；Lys 65→Ile；Ala 79→Thr；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Val 116→Ala；和Cys 153→Ser；
(f)Ala 5→Thr；Thr 23→Lys；Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Val 36→Asp；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Ser 58→Asp；Arg 60→Lys；Cys 61→Tyr；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Arg 148→Ser；和Cys 153→Ser；
(g)Glu 8→Lys；Thr 23→Lys；Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Val 36→Asp；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Ser 58→Asp；Arg 60→Lys；Cys 61→Tyr；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；Val 113→Leu；Lys 114→Trp；Lys 121→Met；和Cys 153→Ser；
(h)Gln 11→Arg；Thr 23→Lys；Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Val 36→Asp；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Ser 58→Asp；Arg 60→Lys；Cys 61→Tyr；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 140→Arg；Arg 148→Trp；和Cys 153→Ser；
(i)Thr 23→Lys；Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Val 36→Asp；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Ser 58→Asp；Arg 60→Lys；Cys 61→Tyr；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys153→Ser；
(j)Thr 23→Lys；Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Val 36→Asp；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Arg 60→Lys；Cys 61→Tyr；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Leu 124→Lys；和Cys 153→Ser；或
(k)Thr 23→Lys；Arg 26→Trp；Glu 27→Asp；Phe 28→Cys；Pro 29→Asn；Glu 30→Gln；Met 31→Pro；Asn 32→Ile；Leu 33→Phe；Glu 34→Asp；Val 36→Asp；Met 55→Ile；Leu 56→Phe；Ser 58→Asp；Arg 60→Lys；Cys 101→Ser；Glu 104→Gln；Leu 105→Cys；His 106→Pro；Lys 108→Ile；Arg 111→Pro；和Lys 114→Trp。
在一些实施方案中，OX40结合hTlc突变蛋白与成熟hTlc线性多肽序列(SEQ IDNO:1)相比包括上述突变的氨基酸残基组之一的除三个以外的全部、除两个以外的全部或除一个以外的全部突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，本公开的OX40结合hTlc突变蛋白的剩余区域，即不同于对应于成熟hTlc线性多肽序列(SEQ ID NO:1)的位置5、6、8、11、19、23、26-34、36、37、40、52、55-56、58、60-61、65、79、86、101、104-106、108、111、113、114、116、121、124、137、140、148和153的位置的区域，可以包含突变的氨基酸序列位置之外的成熟hTlc线性多肽序列的野生型(天然)氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的OX40结合hTlc突变蛋白与成熟hTlc序列(SEQ IDNO:1)具有至少70％序列同一性或至少70％序列同源性。作为一个说明性实例，SEQ ID NO:182的突变蛋白与成熟hTlc的氨基酸序列具有大约84％的氨基酸序列同一性或序列同源性。
在一些实施方案中，本公开的OX40结合hTlc突变蛋白包含如示于SEQ ID NOs:174-184中任一个的氨基酸序列或其片段或变体。
在一些实施方案中，本公开的OX40结合hTlc突变蛋白与选自SEQ ID NOs:174-184的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性。
本公开还包括具有选自SEQ ID NOs:173-183的氨基酸序列的OX40结合hTlc突变蛋白的结构同源物，所述结构同源物相对于所述hTlc突变蛋白具有大于约60％、优选大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于92％和最优选大于95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。
在一些实施方案中，提供的OX40结合hNGAL突变蛋白可以在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置3、21、25-26、28、36、40-41、44、49-50、52、55、59、60、62-63、65、68、70、72-73、75、77-83、87、93、96、98、100、103、106、108、114、118、125、127、129、132、134、143、150、164和170的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或甚至更多个)位置处包含突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的上述位置中一个或多个处包含10个或更多个突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的上述位置中一个或多个处包含15个或更多个突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的上述位置中一个或多个处包含20个或更多个突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的OX40结合hNGAL突变蛋白可以在对应成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置3、21、25-26、28、36、40-41、44、49-50、52、55、59、60、62-63、65、68、70、72-73、75、77-83、87、93、96、98、100、103、106、108、114、118、125、127、129、132、134、143、150、164和170的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Ser 3→Phe或Pro；Asn 21→Asp；Asn 25→Ser；Gln 26→Arg；Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp或Arg；Glu 44→Gly；Gln 49→Gly；Lys 50→Glu或Thr；Tyr 52→Gln；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Glu 60→Lys；Tyr 62→Arg；Ser 63→Thr或Ala；Asn 65→Gln或Arg；Ser 68→Gly；Leu 70→Pro或Arg；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Lys 75→Glu；Asp 77→His；Tyr 78→Asp或His；Trp 79→Asp；Ile 80→Thr；Arg 81→Val；Thr 82→Ile或Val；Phe 83→Leu；Cys 87→Ile、Ser或Arg；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Lys 98→Arg；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Val 108→Ala；Asn 114→Asp；His 118→Tyr；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Asn 129→Asp；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Tyr；Glu143→Ala；Glu 150→Gly；Gln 164→Asp；和Val 170→Ala。在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL(SEQ ID NO:2)的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33个或全部突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL(SEQ ID NO:2)的这些序列位置处包含10个或更多个上述突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL(SEQ ID NO:2)的这些序列位置处包含15个或更多个上述突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL(SEQ ID NO:2)的这些序列位置处包含20个或更多个上述突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的OX40结合hNGAL突变蛋白可在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置36、40-41、49、52、68、72-73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Leu36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp或Arg；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Ser 68→Gly；Arg72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ile、Ser或Arg；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Tyr。在一些实施方案中，本公开的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL(SEQ ID NO:2)的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，提供的OX40结合hNGAL突变蛋白可以在对应于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)的位置3、21、25-26、28、44、50、55、59-60、62-63、65、70、75、78、80、82-83、93、98、108、114、118、129、143、150、164和170的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Ser 3→Phe或Pro；Asn 21→Asp；Asn 25→Ser；Gln 26→Arg；Gln 28→His；Glu 44→Gly；Lys 50→Glu或Thr；Ile 55→Val；Lys 59→Arg；Glu 60→Lys；Tyr 62→Arg；Ser 63→Thr或Ala；Asn 65→Gln或Arg；Leu 70→Pro或Arg；Lys 75→Glu；Tyr 78→Asp或His；Ile 80→Thr；Thr 82→Ile或Val；Phe 83→Leu；Thr 93→Ile；Lys 98→Arg；Val 108→Ala；Asn 114→Asp；His 118→Tyr；Asn 129→Asp；Glu 143→Ala；Glu150→Gly；Gln 164→Asp；和Val 170→Ala。
在一些实施方案中，提供的OX40结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)相比可包含以下突变的氨基酸残基组之一：
(a)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Ser 68→Gly；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Tyr；
(b)Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Glu 60→Lys；Ser 68→Gly；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Lys 75→Glu；Asp 77→His；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Phe 83→Leu；Cys 87→Ile；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Asn 114→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr132→Trp；和Lys 134→Tyr；
(c)Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Ser 63→Thr；Ser 68→Gly；Leu 70→Pro；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Tyr；
(d)Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp；Gln 49→Gly；Lys 50→Glu；Tyr 52→Gln；Ser 68→Gly；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Trp 79→Asp；Ile 80→Thr；Arg 81→Val；Cys 87→Arg；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Lys 98→Arg；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Asn 114→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Tyr；
(e)Ser 3→Phe；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Ile 55→Val；Ser 68→Gly；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Phe 83→Leu；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Lys 98→Arg；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；His 118→Tyr；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；Lys 134→Tyr；和Glu 150→Gly；
(f)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp；Glu 44→Gly；Gln 49→Gly；Lys 50→Thr；Tyr 52→Gln；Tyr 62→Arg；Asn 65→Gln；Ser 68→Gly；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Lys 75→Glu；Asp 77→His；Trp 79→Asp；Ile 80→Thr；Arg 81→Val；Thr 82→Ile；Phe 83→Leu；Cys 87→Ser；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr106→Asp；Asn 114→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr132→Trp；和Lys 134→Tyr；
(g)Gln 28→His；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Trp；Gln 49→Gly；Lys 50→Glu；Tyr 52→Gln；Asn 65→Gln；Ser 68→Gly；Leu 70→Arg；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Lys 75→Glu；Asp 77→His；Trp 79→Asp；Ile 80→Thr；Arg 81→Val；Thr 82→Ile；Cys 87→Ser；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Asn 114→Asp；His 118→Tyr；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Asn 129→Asp；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Tyr；
(h)Asn 25→Ser；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Arg；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Lys 59→Arg；Ser 63→Ala；Ser 68→Gly；Leu 70→Pro；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Tyr；
(i)Asn 25→Ser；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Arg；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Lys 59→Arg；Ser 63→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Gly；Leu 70→Pro；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Tyr 78→Asp；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Thr 82→Ile；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Asn 114→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；Lys 134→Tyr；Glu 143→Ala；和Gln 164→Asp；
(j)Asn 25→Ser；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Arg；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Lys 59→Arg；Ser 63→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Gly；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Tyr 78→Asp；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Thr 82→Ile；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Asn 114→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；Lys 134→Tyr；Glu 143→Ala；和Gln 164→Asp；
(k)Ser 3→Pro；Asn 25→Ser；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Arg；Gln 49→Gly；Lys 50→Glu；Tyr 52→Gln；Lys 59→Arg；Ser 63→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Gly；Leu 70→Pro；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Trp 79→Asp；Ile 80→Thr；Arg 81→Val；Thr 82→Ile；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu103→Ile；Tyr 106→Asp；Asn 114→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Tyr；
(l)Asn 25→Ser；Gln 26→Arg；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Arg；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Lys 59→Arg；Ser 63→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Gly；Leu 70→Pro；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Tyr 78→His；Trp 79→Asp；Ile 80→Thr；Arg 81→Val；Thr 82→Ile；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu103→Ile；Tyr 106→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；Lys 134→Tyr；和Gln 164→Asp；
(m)Asn 21→Asp；Asn 25→Ser；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Arg；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Lys 59→Arg；Ser 63→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Gly；Leu 70→Pro；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Tyr 78→Asp；Trp 79→Asp；Ile 80→Thr；Arg 81→Val；Thr 82→Ile；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu103→Ile；Tyr 106→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；Lys 134→Tyr；和Gln 164→Asp；
(n)Asn 25→Ser；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Arg；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Lys 59→Arg；Ser 63→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Gly；Leu 70→Pro；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Lys 75→Glu；Asp 77→His；Trp 79→Asp；Ile 80→Thr；Arg 81→Val；Thr 82→Ile；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr106→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Asn 129→Asp；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Tyr；
(o)Asn 25→Ser；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Arg；Gln 49→Gly；Lys 50→Glu；Tyr 52→Gln；Lys 59→Arg；Ser 63→Ala；Asn 65→Arg；Ser 68→Gly；Leu 70→Pro；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Lys 75→Glu；Asp 77→His；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Thr 82→Val；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr106→Asp；Val 108→Ala；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Asn 129→Asp；Tyr 132→Trp；Lys134→Tyr；Gln 164→Asp；和Val 170→Ala；
(p)Asn 25→Ser；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Arg；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Lys 59→Arg；Ser 63→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Gly；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Tyr 78→Asp；Trp 79→Asp；Arg 81→Val；Thr 82→Ile；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Asn 114→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；Lys 134→Tyr；和Gln 164→Asp；
(q)Asn 25→Ser；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Arg；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Lys 59→Arg；Ser 63→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Gly；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Tyr 78→Asp；Trp 79→Asp；Ile 80→Thr；Arg 81→Val；Thr 82→Ile；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Asn 114→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；Lys 134→Tyr；和Gln 164→Asp；或
(r)Asn 25→Ser；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Arg；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Lys 59→Arg；Ser 63→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Gly；Leu 70→Pro；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Tyr 78→Asp；Trp 79→Asp；Ile 80→Thr；Arg 81→Val；Thr 82→Ile；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr106→Asp；Asn 114→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；Lys 134→Tyr；和Gln 164→Asp。
在一些实施方案中，本公开的OX40结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ ID NO:2)相比包含以下突变的氨基酸残基组：Asn 25→Ser；Leu 36→Phe；Ala 40→Tyr；Ile 41→Arg；Gln 49→Gly；Tyr 52→Gln；Lys 59→Arg；Ser 63→Ala；Asn 65→Gln；Ser 68→Gly；Arg 72→Pro；Lys 73→His；Asp 77→His；Tyr 78→Asp；Trp 79→Asp；Arg81→Val；Thr 82→Ile；Cys 87→Ser；Thr 93→Ile；Asn 96→Trp；Tyr 100→Asp；Leu 103→Ile；Tyr 106→Asp；Asn 114→Asp；Lys 125→Trp；Ser 127→Phe；Tyr 132→Trp；Lys134→Tyr；Glu 143→Ala；和Gln 164→Asp，和/或与SEQ ID NO:194的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性。
在一些实施方案中，OX40结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL线性多肽序列(SEQ IDNO:2)相比包括上述突变的氨基酸残基组之一的除三个以外的全部、除两个以外的全部或除一个以外的全部突变的氨基酸残基。
在一些进一步实施方案中，在剩余区域，即不同于成熟hNGAL线性多肽序列(SEQID NO:2)的位置3、21、25-26、28、36、40-41、44、49-50、52、55、59、60、62-63、65、68、70、72-73、75、77-83、87、93、96、98、100、103、106、108、114、118、125、127、129、132、134、143、150、164和170的区域，本公开的hNGAL突变蛋白可以包括突变的氨基酸序列位置之外的成熟hNGAL的野生型(天然)氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的OX40结合hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL序列(SEQ IDNO:2)具有至少70％序列同一性或至少70％序列同源性。作为一个说明性实例，SEQ ID NO:194的突变蛋白与成熟hNGAL的氨基酸序列具有大约83％的氨基酸序列同一性或序列同源性。
在一些实施方案中，本公开的OX40结合hNGAL突变蛋白包含如示于SEQ ID NOs:185-202中任一个的氨基酸序列或其片段或变体。
在一些实施方案中，本公开的OX40结合hNGAL突变蛋白与选自SEQ ID NOs:185-202的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性。
本公开还包括具有选自SEQ ID NOs:185-202的氨基酸序列的OX40结合hNGAL突变蛋白的结构同源物，所述结构同源物相对于所述hNGAL突变蛋白具有至少60％、优选至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同源性或序列同一性。
在一些实施方案中，用于本公开的多聚体蛋白的OX40靶向部分可以是或包含OX40靶向scFv。这样的scFv可以例如源自已知的OX40靶向抗体，诸如MEDI0562、BMS-986178或PF-04518600。
H.多聚体蛋白的示例性用途和应用。
在一些实施方案中，本公开涵盖本公开的多聚体蛋白、本公开的核酸分子、包含这样的多聚体蛋白和/或这样的核酸分子的组合物和/或本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)用于治疗的用途。
在一些实施方案中，本公开涵盖药物组合物，其包含本公开的多聚体蛋白、本公开的核酸分子和/或本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)。
在一些实施方案中，本公开涵盖本公开的多聚体蛋白、本公开的核酸分子、包含这样的多聚体蛋白和/或核酸分子的组合物和/或本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)用于制备药物的用途。
在一些实施方案中，本公开涵盖本公开的多聚体蛋白、本公开的核酸分子、包含这样的多聚体蛋白和/或这样的核酸分子的组合物、本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)、本公开的药物组合物和/或本公开的药物，其用于治疗癌症，例如GPC3或PD-L1阳性癌症。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。
在一些实施方案中，本公开涵盖本公开的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)用于共刺激T细胞和/或活化4-1BB(和/或任选地OX40)下游信号传导途径的用途。在一些实施方案中，所述T细胞是CD4+T细胞、是CD8+T细胞或包含两者。共刺激的T细胞和/或其4-1BB(和/或任选地OX40)下游信号传导途径已被活化的T细胞可以是表达和/或分泌多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的T细胞。共刺激的T细胞和/或其4-1BB(和/或任选地OX40)下游信号传导途径已被活化的T细胞还可以是旁观者免疫细胞，诸如T细胞，即不表达和/或分泌多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的免疫细胞或T细胞。然而，所述旁观者免疫细胞可以接近表达和/或分泌多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的细胞。所述旁观者免疫细胞可以是另一种肿瘤浸润T细胞。本公开提供了通过施用本公开的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)共刺激T细胞和/或活化4-1BB(和/或任选地OX40)下游信号传导途径的方法。
在一些实施方案中，本公开涵盖本公开的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)用于诱导T细胞上的4-1BB(和/或任选地OX40)聚簇和/或活化的用途。在一些实施方案中，所述T细胞是CD4+T细胞、是CD8+T细胞或包含两者。其4-1BB(和/或任选地OX40)聚簇已被诱导和/或其已被活化的T细胞可以是表达和/或分泌多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的T细胞。其4-1BB(和/或任选地OX40)聚簇已被诱导和/或其已被活化的T细胞也可以是旁观者免疫细胞，诸如旁观者T细胞，即不表达和/或分泌多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的免疫细胞或T细胞。然而，所述旁观者免疫细胞可以接近表达和/或分泌多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的细胞。所述旁观者免疫细胞可以是另一种肿瘤浸润T细胞。本公开提供了通过施用本公开的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)诱导T细胞上的4-1BB(和/或任选地OX40)聚簇和活化的方法。
在一些实施方案中，本公开涵盖一种或多种本文公开的多聚体蛋白或一种或多种包含这样的多聚体蛋白的组合物用于同时结合4-1BB和GPC3或4-1BB和PD-L1的用途。在一些实施方案中，本公开涵盖本公开的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)用于在接合表达GPC3或PD-L1的肿瘤细胞时共刺激T细胞和/或活化4-1BB下游信号传导途径的用途。在一些实施方案中，所述T细胞是CD4+T细胞、是CD8+T细胞或包含两者。共刺激的T细胞和/或其4-1BB下游信号传导途径已被活化的T细胞可以是表达和/或分泌多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的T细胞。共刺激的T细胞和/或其4-1BB下游信号传导途径已被活化的T细胞还可以是旁观者免疫细胞，诸如T细胞，即不表达和/或分泌多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的免疫细胞或T细胞。然而，所述旁观者免疫细胞可以接近表达和/或分泌多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的细胞。所述旁观者免疫细胞可以是另一种肿瘤浸润T细胞。本公开提供了一种当接合表达GPC3或PD-L1的肿瘤细胞时，通过施用本公开的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)诱导T细胞上的4-1BB聚簇和活化的方法。
在一些实施方案中，本公开涵盖一种或多种本文公开的多聚体蛋白或一种或多种包含这样的多聚体蛋白的组合物或本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)用于同时结合4-1BB和肿瘤相关抗原的用途。在一些实施方案中，本公开涵盖本公开的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)在接合表达TAA的肿瘤细胞或肿瘤时用于共刺激T细胞和/或活化4-1BB下游信号传导途径的用途。共刺激的T细胞和/或其4-1BB下游信号传导途径已被活化的T细胞可以是表达和/或分泌多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的T细胞。共刺激的T细胞和/或其4-1BB下游信号传导途径已被活化的T细胞还可以是旁观者免疫细胞，诸如T细胞，即不表达和/或分泌多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的免疫细胞或T细胞。然而，所述旁观者免疫细胞可以接近表达和/或分泌多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的细胞。所述旁观者免疫细胞可以是另一种肿瘤浸润T细胞。本公开提供了一种当接合表达GPC3或PD-L1的肿瘤细胞时，通过施用本公开的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或本公开的细胞(特别是免疫细胞，诸如T细胞，诸如CAR-T细胞)诱导T细胞上的4-1BB聚簇和活化的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了同时结合4-1BB和GPC3或PD-L1的多聚体蛋白，或表达和/或分泌所述多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的细胞，其用于诸如抗肿瘤和/或抗感染剂和免疫调节剂的用途。在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可同时靶向表达GPC3的肿瘤细胞(诸如HCC、黑色素瘤、Merkel细胞癌、WiIm’s肿瘤和肝胚细胞瘤细胞)或表达PD-L1的肿瘤细胞，并活化邻近这样的肿瘤细胞的宿主免疫系统的淋巴细胞。
在研究了以下实施例及其附图后，本公开的其他目的、优点和特征对于本领域技术人员将变得显而易见，所述实施例及其附图不旨在限制。因此，应当理解，尽管本公开通过示例性实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的本文中实施的公开的修改和变化，并且此类修改和变化被认为在本公开的范围内。
I.多聚体蛋白的产生。
在一些实施方案中，本公开提供了核酸分子(DNA和RNA)，其包括编码提供的多聚体蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了核酸分子(DNA和RNA)，其包括编码提供的单体多肽的核苷酸序列，所述单体多肽包含在多聚体蛋白中。在一些实施方案中，本公开涵盖含有提供的核酸分子的细胞。由于遗传密码的简并性允许某些密码子被指定相同氨基酸的其他密码子取代，本公开不限于编码如本文所述的多聚体蛋白或包含在该多聚体蛋白中的单体多肽的特定核酸分子，而是涵盖包括编码功能性多聚体蛋白或包含在该多聚体蛋白中的单体多肽的核苷酸序列的所有核酸分子。在这方面，本公开还涉及编码提供的多聚体蛋白或包含在该多聚体蛋白中的单体多肽的核苷酸序列。本公开提供的编码SEQ IDNOs:38-55和164-167的单体多肽的示例性核苷酸序列示于SEQ ID NOs:144-161和168-171。本文还提供了这些核苷酸序列的变体，其与选自SEQ ID NOs:144-161和168-171的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，并且编码本公开内容的单体多肽。
如果核酸分子(诸如DNA)包括含有关于转录和/或翻译调节的信息的序列元件，并且这样的序列“可操作地连接”至编码蛋白的核苷酸序列，则其被称为“能够表达核酸分子”或“能够允许核苷酸序列的表达”。可操作地连接是其中调节序列元件和待表达的序列以能够使基因表达的方式连接的连接。基因表达所必需的调节区的精确性质在物种之间可以变化，但是通常这些区域包括启动子，在原核生物中，该启动子包含启动子本身，即指导转录起始的DNA元件，以及当转录成RNA时将发出翻译起始信号的DNA元件。这种启动子区通常包括参与转录和翻译起始的5’非编码序列，诸如原核生物中的-35/-10框和Shine-Dalgarno元件，或真核生物中的TATA框、CAAT序列和5’-加帽元件。这些区域也可以包括增强子或阻遏子元件以及翻译的信号和前导序列，用于将天然蛋白靶向宿主细胞的特定区室。
此外，3’非编码序列可以含有参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定宿主细胞中的功能不令人满意，那么它们可以被在该细胞中有功能的信号所取代。
因此，本公开的核酸分子可以“可操作地连接”至一个或多个调控序列，诸如启动子序列，以允许该核酸分子的表达。在一些实施方案中，本公开的核酸分子包括启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子是例如tet启动子、lacUV5启动子或T7启动子。用于在真核细胞中表达的启动子的实例是SV40启动子或CMV启动子。
在一些实施方案中，编码包含在本申请中公开的多聚体蛋白中的提供的单体多肽的部分或结构域的核酸分子可以“可操作地连接”至编码本公开的部分或结构域的另一个核酸分子，以允许表达本文公开的多聚体蛋白。
在一些实施方案中，提供的核酸分子还可以是载体或任何其它种类的克隆载体的一部分，诸如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人工染色体。在一些实施方案中，提供的核酸分子也可包含在宿主细胞的基因组DNA中。在一些实施方案中，提供的核酸分子可以包含在表达载体中。这样的表达载体可以是病毒载体。用于在动物细胞诸如哺乳动物细胞中表达的病毒载体是本领域已知的。用于在免疫细胞中表达的病毒载体例如公开于WO2016/113203 A1，Chmielewski等人2011Cancer Res 71(17):5697-706；Zhang等人2011MolTher 19(4):751-9；Pegram等人2012Blood 119(18):4133-41；和Pegram等人2014Leukemia29(2):415-22，这些通过引用并入本文。在一些实施方案中，所述核酸分子可以包含在纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述核酸分子可以包含在脂质体中。例如，编码本公开的多聚体蛋白或其单体多肽的mRNA可包含在纳米颗粒或脂质体中。
在一些实施方案中，提供的核酸分子可以包括在噬菌粒中。如本上下文所用，噬菌粒载体表示编码温和噬菌体诸如M13或f1的基因间区域或其与目的cDNA融合的功能部分的载体。例如，在一些实施方案中，在用这样的提供的噬菌粒载体和适当的辅助噬菌体(例如M13K07、VCS-M13或R408)超感染细菌宿主细胞后，产生完整的噬菌体颗粒，从而能够将编码的异源cDNA物理偶联至其展示在噬菌体表面上的相应多肽(Lowman,1997,Rodi andMakowski,1999)。
根据各种实施方案，除了上文所述调节序列和编码如本文所述的多聚体蛋白的核酸序列之外，克隆载体可以包括来源于与用于表达的宿主细胞相容的物种的复制和控制序列，以及赋予转化或转染的细胞以可选择表型的选择标记。大量合适的克隆载体是本领域已知的，并且是商业上可获得的。
在一些实施方案中，本公开还涉及用于从编码多聚体蛋白或其中的任何单体多肽的核酸开始产生本公开的多聚体蛋白的方法。在一些实施方案中，提供的方法可以在体内进行，其中提供的多聚体蛋白可以例如在细菌或真核宿主生物体中产生。所述多聚体蛋白可进一步从宿主生物体或其培养物分离。也可能在体外产生本公开的多聚体蛋白，例如，使用体外翻译系统。
当在体内产生多聚体蛋白时，可以使用本领域熟知的重组DNA技术将编码多聚体蛋白的核酸引入合适的细菌或真核宿主生物体中。在一些实施方案中，编码如本文所述多聚体蛋白的DNA分子，特别是含有这样的多聚体蛋白的编码序列的克隆载体，可以转化到能够表达该基因的宿主细胞中。可以使用标准技术进行转化。因此，本公开还涉及含有如本文公开的核酸分子的宿主细胞。
在一些实施方案中，可以在适合于表达编码本公开的多聚体蛋白的核苷酸序列的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以是原核的，诸如大肠杆菌(Escherichia coli；E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，或真核的，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、SF9或High5昆虫细胞，永生化哺乳动物细胞系(例如HeLa细胞或CHO细胞)或原代哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，当本公开的脂质运载蛋白突变蛋白，包括如包含在本文公开的多聚体蛋白中的脂质运载蛋白突变蛋白，包括分子内二硫键时，可优选使用合适的信号序列将新生蛋白引导至具有氧化还原环境的细胞区室。这种氧化环境可以由革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌的周质、革兰氏阳性细菌的细胞外环境或真核细胞内质网腔提供，并且通常有利于结构二硫键的形成。
在一些实施方案中，还可以在宿主细胞、优选大肠杆菌的胞质溶胶中产生本公开的多聚体蛋白。在这种情况下，提供的多聚体蛋白可以直接以可溶和折叠状态获得，或以包涵体形式回收，随后在体外复性。另一选择是使用具有氧化胞内环境的特定宿主菌株，其因此可以允许在胞质溶胶中形成二硫键(Venturi等人，2002)。
在一些实施方案中，如本文所述的本公开的多聚体蛋白可以不必通过使用遗传工程全部或部分地产生或生产。相反，这样的蛋白质也可通过许多常规和熟知的技术中的任何一种获得，诸如简单有机合成策略、固相辅助合成技术、市售自动化合成仪，或通过体外转录和翻译。例如可能的是，使用分子建模鉴定、体外合成并研究对目的靶标的结合活性来鉴定有希望的多聚体蛋白或包含在这样的多聚体蛋白中的脂质运载蛋白突变蛋白。蛋白质的固相和/或液相合成方法是本领域熟知的(参见例如Bruckdorfer等人，2004)。
在一些实施方案中，本公开的多聚体蛋白可以采用本领域技术人员已知的充分建立的方法通过体外转录/翻译产生。
在一些另外的实施方案中，如本文所述的多聚体蛋白也可通过常规重组技术单独制备或与常规合成技术组合制备。
此外，在一些实施方案中，根据本公开的多聚体蛋白可以通过将单独的亚基、例如如包括在多聚体蛋白中的单链可变片段和脂质运载蛋白突变蛋白缀合在一起而获得。例如，可以使用常规方法通过所有形式的共价或非共价连接来实现这种缀合。
本发明的一个优选应用是装甲(armored)细胞治疗。重组T细胞，诸如CAR-T细胞可以被工程化以具有分泌促炎细胞因子的能力。在这种情况下，工程化的CAR-T可以导致促炎细胞因子在CAR-T运输的肿瘤微环境中积累。可能需要促炎细胞因子以便于以局部限制的方式募集第二波免疫细胞，以启动对肿瘤的细胞的更完全和潜在的靶标非依赖性攻击。这种方法已经被描述，特别是利用了工程化的单链白细胞介素12变体，此后称为scIL-12。
工程化T细胞以分泌其它类型的治疗性蛋白质的能力将是期望的，进一步将所有组成成分扩展到肿瘤微环境中可用的治疗形式。分泌本发明的多聚体蛋白的T细胞满足这种需要。
这样的构建体可以基于具有确定特异性的T细胞(不经遗传操作或通过用CAR或重组TCR转导)，其具有分泌本发明的多聚体蛋白或各自的单体多肽的能力，所述单体多肽然后可以自组装成多聚体蛋白。本领域技术人员将理解该方法也可以基于其它细胞类型，诸如NK细胞或B细胞。
在一些实施方案中，根据本公开的多聚体蛋白可由细胞表达和分泌。在一些实施方案中，所述细胞表达和分泌多聚体蛋白。在一些实施方案中，所述细胞表达和分泌一种或多种单体多肽。所述单体多肽然后可以自组装成多聚体蛋白。单体多肽和/或多聚体蛋白的表达和分泌可以在体外或体内发生。
对于体内应用，当单体多肽和/或多聚体蛋白的表达和/或分泌在期望的组织或位点处是有利的。例如，可能期望表达和/或分泌在肿瘤中、在肿瘤基质中、在肿瘤微环境中或在肿瘤附近。
在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞。如本文所用，“免疫细胞”是指作为免疫系统的一部分并帮助身体对抗感染和其它疾病的细胞。免疫细胞包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴细胞，诸如B细胞和/或T细胞。所述免疫细胞可以是重组的。优选的免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞可以是CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞可以是CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞可以是CAR-T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞、特别是T细胞可以包含重组抗原受体。这样的重组抗原受体可以是嵌合抗原受体(CAR)。这样的重组抗原受体可以是T细胞受体。所述免疫细胞、特别是T细胞可以表达4-1BB。应当理解，所述细胞、特别是免疫细胞可以是人细胞，诸如人T细胞。
技术人员将理解可用于制备本公开考虑的多聚体蛋白的方法，但其蛋白质或核酸序列未在本文中明确公开。总的来说，氨基酸序列的这种修饰包括例如单个氨基酸位置的定向诱变，以通过掺入某些限制性酶的切割位点来简化蛋白质基因或其部分的亚克隆。而且，可以掺入这些突变以进一步提高多聚体蛋白对其靶标(例如4-1BB、OX40、PD-L1和GPC3)的亲和力。此外，如果需要，可以引入突变以调节蛋白质的一种或多种特征，诸如改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白质抗性或水溶性，或降低聚集趋势。
本发明的特征还可以在于以下项目。
项目1.一种多聚体蛋白，其包含至少三个单体多肽，其中每个单体多肽包含(1)第一4-1BB靶向部分(T1)，和(2)寡聚化部分(O)。
项目2.根据项目1所述的多聚体蛋白，其中所述第一4-1BB靶向部分(T1)在其N末端或C末端经由接头(L)分别融合至所述寡聚化部分(O)的C末端或N末端。
项目3.根据项目1或2所述的多聚体蛋白，其中所述单体多肽包含至少一个另外的靶向部分(T2)。
项目4.根据项目1至3中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述单体多肽包含另外的靶向部分(T2)，其中所述另外的靶向部分(T2)与所述第一4-1BB靶向部分(T1)串联放置。
项目5.根据项目4所述的多聚体蛋白，其中所述单体多肽具有以下构型中的一者：
a.T1-L’-T2-L-O；
b.T2-L’-T1-L-O；
c.O-L-T1-L’-T2；或
d.O-L-T2-L’-T1
其中L’是与L相同或不同的接头。
项目6.根据项目1至3中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述单体多肽包含另外的靶向部分(T2)，其中所述另外的靶向部分(T2)与所述第一4-1BB靶向部分(T1)相比连接至所述寡聚化部分(O)的不同末端。
项目7.根据项目6所述的多聚体蛋白，其中所述单体多肽具有以下构型中的一者：
a.T1-L-O-L’-T2；或
b.T2-L’-O-L-T1
其中L'是与L相同或不同的接头。
项目8.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是第二4-1BB靶向部分。
项目9.根据项目8所述的多聚体蛋白，其中所述第二4-1BB靶向部分与所述第一4-1BB靶向部分(T1)相同。
项目10.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是靶向肿瘤相关抗原的部分。
项目11.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是靶向肿瘤相关抗原的部分并且是脂质运载蛋白突变蛋白。
项目12.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是靶向肿瘤相关抗原的部分并且是抗体或其抗原结合结构域或衍生物。
项目13.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是靶向肿瘤相关抗原的部分并且是单链可变片段(scFv)。
项目14.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是GPC3靶向部分。
项目15.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是GPC3靶向部分，所述GPC3靶向部分是脂质运载蛋白突变蛋白。
项目16.根据项目15所述的多聚体蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与选自SEQ ID NOs:74-97的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
项目17.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是GPC3靶向部分，所述GPC3靶向部分是抗体或其抗原结合结构域或衍生物。
项目18.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是GPC3靶向部分，所述GPC3靶向部分是单链可变片段(scFv)。
项目19.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是PD-L1靶向部分。
项目20.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是PD-L1靶向部分，所述PD-L1靶向部分是单链可变片段(scFv)。
项目21.根据项目20所述的多聚体蛋白，其中所述scFv与示于SEQ ID NO:172的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
项目22.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是T细胞活化增强靶向部分。
项目23.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是T细胞活化增强靶向部分，所述T细胞活化增强靶向部分是脂质运载蛋白突变蛋白。
项目24.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是T细胞活化增强靶向部分，所述T细胞活化增强靶向部分是抗体或其抗原结合结构域或衍生物。
项目25.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是T细胞活化增强靶向部分，所述T细胞活化增强靶向部分是单链可变片段(scFv)。
项目26.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是OX40靶向部分。
项目27.根据项目3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是OX40靶向部分，所述OX40靶向部分是脂质运载蛋白突变蛋白。
项目28.根据项目27所述的多聚体蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与选自SEQ ID NOs:174-202的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
项目29.根据项目1至28中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述第一4-1BB靶向部分(T1)是脂质运载蛋白突变蛋白。
项目30.根据项目1至29中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述第一4-1BB靶向部分(T1)是脂质运载蛋白突变蛋白，所述脂质运载蛋白突变蛋白与选自SEQ ID NOs:56-71的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
项目31.根据项目1至30中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述寡聚化部分(O)能够促进三聚化。
项目32.根据项目1至31中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述寡聚化部分(O)是胶原的三聚化结构域。
项目33.根据项目1至32中任一项所述的多聚蛋白质，其中所述寡聚化部分(O)与选自SEQ ID NOs:35-37的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
项目34.根据项目1至33中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白是三聚体蛋白。
项目35.根据项目1至30和33中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白是四聚体蛋白。
项目36.根据项目2至35中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述接头(L)与选自SEQID NOs:12-28的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
项目37.根据项目1至36中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白与选自SEQ ID NOs:38-55和164-167的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
项目38.根据项目1至37中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白包含选自SEQ ID NOs:38-55和164-167的氨基酸序列。
项目39.根据项目1至38中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白能够以约0.68nM或更低的表观KD值结合4-1BB。
项目40.根据项目1至39中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白能够以比所述单体多肽中包含的靶向4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白的KD值低的表观KD值结合4-1BB。
项目41.根据项目39或40所述的多聚体蛋白，其中通过表面等离子体共振(SPR)来测定所述表观KD值。
项目42.根据项目1至41中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白与食蟹猴4-1BB交叉反应。
项目43.一种核酸分子，其包含编码根据项目1至42中任一项所述的多聚体蛋白中包含的单体多肽的核苷酸序列。
项目44.根据项目43所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接至调节序列以允许所述核酸分子的表达。
项目45.根据项目43或44所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含在载体或噬菌粒载体中。
项目46.根据项目43或44中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含在病毒载体、纳米颗粒或脂质体中。
项目47.根据项目43至46中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含在宿主细胞的基因组DNA中。
项目48.一种细胞，其含有根据项目43至47中任一项所述的核酸分子和/或表达根据项目1至42中任一项所述的多聚体蛋白和/或表达如项目1至42中任一项中定义的单体多肽。
项目49.根据项目48所述的细胞，其中所述细胞分泌所述多聚体蛋白和/或所述单体多肽。
项目50.根据项目48所述的细胞，其中所述细胞分泌所述单体多肽。
项目51.根据项目50所述的细胞，其中所述单体多肽在分泌后自组装成多聚体蛋白。
项目52.根据项目48至51中任一项所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
项目53.根据项目52所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
项目54.根据项目53所述的细胞，其中所述细胞是CD8+T细胞。
项目55.根据项目53所述的细胞，其中所述细胞是CD4+T细胞。
项目56.根据项目52至55中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含重组抗原受体。
项目57.根据项目56所述的细胞，其中所述重组抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。
项目58.根据项目56所述的细胞，其中所述重组抗原受体是T细胞受体(TCR)。
项目59.根据项目52至57中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CAR-T细胞。
项目60.根据项目52至59中任一项所述的细胞，其中所述细胞表达4-1BB。
项目61.根据项目52至60中任一项所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
项目62.一种产生根据项目1至42中任一项所述的多聚体蛋白的方法，其中从编码所述多聚体蛋白中包含的单体多肽的核酸开始产生所述多聚体蛋白。
项目63.根据项目62所述的方法，其中所述多聚体蛋白在细菌或真核宿主生物体中产生。
项目64.根据项目1至42中任一项所述的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或根据项目48至61中任一项所述的细胞用于诱导T细胞上的4-1BB(和/或任选地OX40)聚簇和活化的用途。
项目65.根据项目1至42中任一项所述的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或根据项目48至61中任一项所述的细胞用于共刺激T细胞和/或活化4-1BB(和/或任选地OX40)下游信号传导途径的用途。
项目66.根据项目1至42中任一项所述的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或根据项目48至61中任一项所述的细胞用于在接合表达GPC3或PD-L1的肿瘤细胞时共刺激T细胞的用途。
项目67.根据项目64至66中任一项所述的用途，其中所述T细胞是表达所述多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的T细胞。
项目68.根据项目64至66中任一项所述的用途，其中所述T细胞是不表达所述多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的T细胞。
项目69.一种药物组合物，其包含一种或多种根据项目1至42中任一项所述的多聚体蛋白和/或一种或多种根据项目48至61中任一项所述的细胞。
项目70.根据项目1至42中任一项所述的多聚体蛋白和/或根据项目48至61中任一项所述的细胞，其用于疗法中。
项目71.根据项目70所述用途的多聚体蛋白和/或细胞，其中所述用途是在癌症的治疗中。
项目72.根据项目1至42中任一项所述的多聚体蛋白和/或根据项目48至61中任一项所述的细胞，其用于药物的制备中。
项目73.根据项目72所述的用途，其中所述药物用于治疗癌症。
V.实施例
实施例1：代表性多聚体蛋白的表达和分析
在本实施例中，通过构成单体多肽的自组装产生多聚体蛋白。通过将4-1BB靶向部分、寡聚化部分和任选的一个或多个另外的靶向部分融合在一起产生单体多肽。
通过将一个或多个本公开的4-1BB靶向脂质运载蛋白突变蛋白诸如SEQ ID NO:64经由接头诸如示于SEQ ID NOs:12-28中任一个的接头融合至人胶原XVIII三聚化结构域(SEQ ID NO:35)的N末端、C末端或N和C末端两者，产生了代表性单体多肽。图1A和1B中描述了产生的不同形式。此外，通过将本公开的4-1BB靶向脂质运载蛋白突变蛋白诸如SEQ IDNO:64和(1)本公开的GPC3靶向部分诸如SEQ ID NO:90或SEQ ID NO:98、(2)本公开的OX40靶向部分诸如SEQ ID NO:194或(3)本公开的PD-L1靶向部分诸如SEQ ID NO:172经由接头诸如示于SEQ ID NOs:12-28中任一个的接头融合至人胶原XVIII三聚化结构域(SEQ IDNO:35)的N末端、C末端或N和C末端两者，产生了示例性双特异性单体多肽。图1C中描述了产生的不同形式。
通过用靶向另一个靶标(即除4-1BB外)的部分代替示于图1B的单体多肽的4-1BB靶向部分之一，可以产生另外的双特异性形式。通过经由接头将(1)本公开的4-1BB靶向脂质运载蛋白突变蛋白诸如SEQ ID NO:64的C末端融合至本公开的OX40靶向脂质运载蛋白突变蛋白诸如SEQ ID NO:194的N末端和将该OX40靶向脂质运载蛋白突变蛋白的C末端融合至人胶原XVIII三聚化结构域(SEQ ID NO:35)的N末端，得到例如SEQ ID NO:165的单体多肽，或将(2)本公开的OX40靶向脂质运载蛋白突变蛋白诸如SEQ ID NO:194的C末端融合至本公开的4-1BB靶向脂质运载蛋白突变蛋白诸如SEQ ID NO:64的N末端和将该4-1BB靶向脂质运载蛋白突变蛋白的C末端靶向至人胶原XVIII三聚化结构域(SEQ ID NO:35)的N末端，得到例如SEQ ID NO:166的单体多肽，产生了示例性双特异性单体多肽。
单体多肽的构建体在C末端融合至myc-His-标签(SEQ ID NO:131)，并通过基因合成产生，并且克隆到哺乳动物表达载体中。然后将它们在Expi293F或ExpiCHO-S细胞(LifeTechnologies)中瞬时表达，并使其自组装。在His-标签纯化、随后在磷酸缓冲盐水(PBS)中进行尺寸排阻层析后，示例性多聚体蛋白的产量总结于表1中。在SEC纯化后，合并含有处于所需寡聚化状态的多聚体蛋白的级分，并使用分析型SEC再次分析(参见表1)。
表1：瞬时表达
实施例2：通过表面等离子体共振(SPR)测定的多聚体蛋白对4-1BB的结合
示例性多聚体蛋白对人4-1BB(hu4-1BB)的表观结合动力学和亲和力通过表面等离子体共振(SPR)使用Biacore 8K仪器(GE Healthcare)测定。
使用标准胺化学将抗人IgG Fc抗体(GE Healthcare)固定在CM5传感器芯片上：使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化芯片上的羧基。随后，以5μL/分钟的流速施加10mM乙酸钠(pH 5.0)中的浓度为25μg/mL的抗人IgGFc抗体溶液(GE Healthcare)，直至达到4000-10000共振单元(RU)的固定水平。通过使1M乙醇胺溶液通过表面来封闭残留的未反应的NHS-酯。以类似的方式处理参照通道。随后，芯片表面的抗人IgG-Fc抗体以10μL/min的流速捕获0.3μg/mL的hu4-1BB-Fc(R&DSystems)180秒。
为了亲和力测定，在HBS-EP+缓冲液中制备8-2000nM的各种浓度的各测试多聚体多肽的稀释物，并将其施加到制备的芯片表面上用于对人4-1BB的亲和力测量。结合测定以180秒的接触时间、1200秒或3000秒的解离时间和30μL/min的流速进行。所有测量均在25℃下进行，还测试了如多聚体蛋白中包含的脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:64作为阴性对照。通过以10μL/min的流速注射3M MgCl 120秒、随后用流动缓冲液(HBS-EP+缓冲液)再洗涤来实现芯片表面的再生。在蛋白质测量之前，为了调节目的进行三个启动循环。数据用Biacore评价软件评价。使用双重参照，并且使用1:1结合模型来拟合原始数据。
所有值的确定是在多价相互作用测定中进行，并且所得数据显示所分析的多聚体蛋白的清楚的多价相互作用，并且不遵循1:1结合行为。然而，使用1:1结合模型分析了数据以允许近似比较。在这方面，测定的Kon、Koff和平衡解离常数(KD)(表2)是对该所述测定特异性的表观值。
与如多聚体蛋白中包含的单体脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:64相比，测试的多聚体蛋白(SEQ ID NOs:38-54)以更高的亲和力(更低的KD值)结合hu4-1BB，表明亲合力作用。
表2：通过SPR测定确定的多聚体蛋白对人4-1BB的表观动力学常数和表观亲和力
实施例3.在酶联免疫吸附测定(ELISA)中多聚体蛋白对4-1BB或GPC3的结合
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定示例性多聚体蛋白对人4-1BB或人GPC3的结合效力。
在4℃下将PBS中浓度为1μg/mL的重组hu4-1BB-His(具有C末端聚组氨酸标签的人4-1BB，R&D Systems)包被在微量滴定板上过夜。用PBS-0.05％T(PBS补充有0.05％(v/v)Tween 20)洗涤后，用PBS-0.1％T(PBS补充有0.1％(v/v)Tween 20)中的2％BSA(w/v)在室温下封闭平板1小时。用100μLPBS-0.05％T洗涤五次后，将示例性多聚体蛋白(SEQ ID NOs:38-44和46-53)或如多聚体蛋白中包含的4-1BB特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:64)以100-0.002nM的不同浓度加入到孔中，并在室温下孵育1小时，然后进行另一洗涤步骤。通过与在PBS-0.1％T-2％BSA中1:1000稀释的抗NGAL-HRP一起孵育来检测研究的结合的分子。在另外的洗涤步骤之后，将荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)加入每个孔中，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。
还使用相同的ELISA设置来测定示例性双特异性多聚体蛋白(SEQ ID NO:54和SEQID NO:55)对GPC3的结合效力，其中改为将huGPC3-His(具有C末端聚组氨酸标签的人GPC3，R&D Systems)包被在微量滴定板上。类似地滴定测试试剂并检测结合的试剂。
示例性实验的结果与由1:1结合S形拟合得到的拟合曲线一起描绘在图2中，其中EC50值和最大信号是自由参数，并且斜率固定为一。表3提供了所得的EC50值。所有测试多聚体蛋白对hu4-1BB观察到的EC50值在亚纳摩尔范围内。
表3. 4-1BB或GPC3结合的ELISA数据
实施例4.双特异性多聚体蛋白与GPC3和4-1BB的同时结合
为了证明示例性双特异性多聚体蛋白与GPC3和4-1BB的同时结合，使用了双结合ELISA形式。
在4℃下将PBS中1μg/mL浓度的重组huGPC3-His(具有C末端聚组氨酸标签的人GPC3，R&D Systems)包被在微量滴定板上过夜。用PBS-0.05％T(PBS补充有0.05％(v/v)Tween 20)洗涤后，用PBS-0.1％T(PBS补充有0.1％(v/v)Tween 20)中的2％BSA(w/v)在室温下封闭平板1小时。用100μL PBS-0.05％T洗涤五次后，将100-0.002nM的不同浓度的示例性多聚体蛋白(SEQ ID NOs:54和55)加入到孔中，并在室温下孵育1小时，然后进行另一洗涤步骤。通过与1μg/mL重组hu4-1BB-His(具有C末端聚组氨酸标签的生物素化人4-1BB，Sino Biological)在PBS-0.1％T-2％BSA中孵育1小时来检测研究的结合的分子。该步骤之后是另一洗涤步骤和与在PBS-0.1％T-2％BSA中的1:5000稀释的Extravidin-HRP孵育。在另外的洗涤步骤之后，将荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)加入每个孔中，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。
示例性实验的结果与由1:1结合S形拟合得到的拟合曲线一起描绘在图3中，其中EC50值和最大信号是自由参数，并且斜率固定为一。表4提供了所得的EC50值。双特异性多聚体蛋白(SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55)显示清楚的结合信号，证明它们可以同时结合GPC3和4-1BB。
表4.GPC3和4-1BB的同时靶标结合的ELISA数据
实施例5.多聚体蛋白与表达4-1BB和GPC 3的细胞结合的流式细胞术分析
通过流式细胞术评估多聚体蛋白与表达4-1BB和GPC3的细胞的靶标特异性结合。
根据制造商的说明，使用Flp-In系统(Life Technologies)，用人4-1BB、食蟹猴4-1BB或模拟对照稳定转染CHO细胞。转染的CHO细胞维持在补充有10％胎牛血清(Biochrom)和500μg/ml潮霉素B(Roth)的Ham’s F12培养基(Life Technologies)中。根据制造商的说明(37℃，5％CO2大气压)在细胞培养瓶中培养细胞。
根据制造商的说明(37℃，5％CO2大气压)在补充有10％胎牛血清(Sigma-Aldrich)的杜氏改良伊格尔培养基(DMSO，Pan Biotech)和细胞培养瓶中培养GPC3阳性肿瘤细胞系HepG2。
对于流式细胞术分析，将各个细胞系与测试多聚体蛋白一起孵育，并在FACS分析中使用荧光标记的兔抗NGAL骨架抗体(或抗人IgG抗体作为参照抗体)进行检测，如下所述：
将5×104个/孔细胞在含有5％胎牛血清的冰冷PBS(PBS-FCS)中孵育1小时。将一系列稀释的测试多聚体蛋白(SEQ ID NOs:38-44和46-55)、如该多聚体蛋白中包含的4-1BB靶向脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:64)或GPC3靶向脂质运载蛋白SEQ ID NO:90加入细胞中并在冰上孵育1小时。用PBS洗涤细胞两次，然后将细胞与用荧光染料Alexa 488标记的兔抗NGAL或山羊抗人IgG在冰上孵育30分钟。测试人IgG4同种型(SEQ ID NOs:29和30)和脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:8作为阴性对照。随后洗涤细胞并使用iQue流式细胞仪(Intellicyte Screener)分析。绘制平均几何荧光信号，并使用非线性回归(共用底部，四个参数，可变斜率)用Graphpad软件拟合。
多聚体蛋白结合人4-1BB、食蟹猴4-1BB和GPC3的能力描述于图4中，所有测试的多聚体蛋白与人和食蟹猴4-1BB表达细胞的结合亲和力(EC50，描述于表5中)在个位数纳摩尔范围内。结果证明多聚体蛋白的亲和力效应，因为如该多聚体蛋白中包含的单体4-1BB特异性脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:64不是食蟹猴交叉反应性的。没有观察到与模拟转染细胞的结合(数据未显示)。
表5.多聚体蛋白与表达4-1BB或GPC3的细胞的结合亲和力
实施例6.T细胞活化的评估
使用T细胞活化测定分析多聚体蛋白的T细胞共刺激。将多聚体蛋白以不同浓度应用于与模拟转染的Flp-In-CHO细胞共培养的抗CD3和抗CD28刺激的T细胞。在上清液中测量IL-2分泌水平。
通过聚蔗糖密度梯度(Biocoll，1.077g/mL，Biochrom)离心，遵循Biochrom的方案，从血沉棕黄层分离来自健康志愿者供体的PBMC。使用Pan T细胞纯化试剂盒(MiltenyiBiotec GmbH)按照制造商的说明通过磁性细胞分选从PBMC进一步纯化T淋巴细胞。将纯化的Pan T细胞重悬于由90％FCS和10％DMSO组成的缓冲液中，立即冷冻并储存在液氮中直至进一步使用。对于该测定，将T细胞解冻并在37℃下在潮湿的5％CO2气氛中在补充有10％FCS和1％青霉素-链霉素(Life Technologies)的培养基(RPMI 1640，Life Technologies)中静置过夜。
对于每个实验条件使用一式三份进行以下程序：在37℃下用0.25μg/mL抗CD3抗体预包被平底组织培养板2小时，然后将其用PBS洗涤两次。用30μg/ml丝裂霉素C(SigmaAldrich)处理模拟转染的Flp-In-CHO细胞30分钟以便阻断增殖。然后用PBS洗涤丝裂霉素处理的细胞两次，并以8.3×103细胞/孔铺板于培养基中，以使之在37℃下在湿润的5％CO2气氛中贴壁过夜。CHO细胞之前已在标准条件下生长，使用Accutase(PAA Laboratories)分离，并重新悬浮于培养基中。
在接下来的几天中，将2.5×104个T细胞/孔加入该CHO细胞中。将一系列稀释的测试多聚体蛋白(SEQ ID NOs:38、43、46-48和50-53)、参照4-1BB抗体(SEQ ID NOs:72和73)、具有三价4-1BB靶向和另一三价T细胞共刺激受体靶向部分的双特异性六价蛋白、阴性脂质运载蛋白突变蛋白对照(SEQ ID NO:8)或人IgG4同种型对照(SEQ ID NOs:29和30)(通常范围为0.008nM至500nM)加入相应孔中，随后加入0.05μg/mL抗CD28抗体。双特异性六价蛋白N末端包含融合至如示于SEQ ID NO:38的三聚化结构域的4-1BB靶向脂质运载蛋白部分，所述三聚化结构域经由SEQ ID NO:12的接头(L1)C末端融合至靶向T细胞共刺激受体的脂质运载蛋白突变蛋白，并且所述脂质运载蛋白突变蛋白进一步C末端融合至如示于SEQ IDNO:131的接头和Myc-His标签(L19-Myc-His)。该双特异性六价蛋白的一般结构如示于图1c中。板用可透气的密封物覆盖，并在37℃下在潮湿的5％CO2气氛中孵育3天。
共培养3天后，如以下程序所述使用人IL-2DuoSet试剂盒(R&D Systems)评价上清液中的IL-2水平。
将384孔板使用PBS中的1μg/mL“人IL-2捕获抗体”在室温下包被2小时。随后，用80μl PBS-0.05％T洗涤孔5次。在含有1％酪蛋白(w/w)的PBS-0.05％T中封闭1小时后，将测定上清液和在培养基中稀释的一系列浓度的IL-2标准品转移到各个孔中，在4℃下孵育过夜。第二天，加入100ng/mL山羊抗hIL-2-Bio检测抗体(R&D Systems)和1μg/mL Sulfotag标记的链霉抗生物素蛋白(Mesoscale Discovery)在含有0.5％酪蛋白的PBS-0.05％T中的混合物，并在室温下孵育1小时。洗涤后，向每个孔中加入25μL读取缓冲液(MesoscaleDiscovery)，通过Mesoscale Discovery读板仪检测所得电化学发光(ECL)信号。使用Mesoscale Discovery软件进行分析和定量。
示例性数据示于图5中。在存在三价多聚体蛋白(SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:43)的情况下Pan T细胞与CHO细胞的共培养并未使IL-2分泌增加超过背景。与hIgG4同种型对照相比，与三价相比具有更高价的多聚体蛋白(SEQ ID NO:46-48和50-53)导致IL-2分泌明显增加，其效力与参照4-1BB抗体(SEQ ID NOs:72和73)相当。此外，进一步测试的具有三价4-1BB靶向和另一三价T细胞共刺激受体靶向部分的双特异性六价蛋白甚至比参照4-1BB抗体(SEQ ID NOs:72和73)更有效。
实施例7.在存在表达GPC3的肿瘤细胞的情况下T细胞活化的评价
采用T细胞测定来评价示例性4-1BB-和GPC3-双特异性多聚体蛋白以GPC3靶标依赖性方式共刺激T细胞活化的能力。在存在GPC3阳性肿瘤细胞系HepG2的情况下，将多聚体蛋白以不同浓度应用于抗CD3和抗CD28刺激的T细胞。在上清液中测量IL-2分泌水平。
对于该测定，使用与实施例5中所述相同的方案，除了用丝裂霉素C处理GPC3阳性肿瘤细胞系HepG2并将该细胞用于与T细胞共培养以评估4-1BB在T细胞上的GPC3靶标依赖性聚簇。
一系列稀释的测试多聚体蛋白(SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:55)、如实施例6中所述具有三价4-1BB靶向和另一三价T细胞共刺激受体靶向部分的双特异性六价蛋白、如多聚体蛋白中包含的4-1BB特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:64)、GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:90、GPC3抗体SEQ ID NOs:108和109、参照4-1BB抗体(SEQ IDNOs:72和73)、人IgG4同种型对照(SEQ ID NOs:29和30)或阴性对照脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:8)，通常为0.01nM-200nM，加入相应的孔中。在37℃下在潮湿的5％CO2气氛中孵育3天后进行读出。如实施例6所述，使用人IL-2DuoSet试剂盒(R&D Systems)评价上清液中的IL-2水平。
示例性数据显示在图6中。4-1BB-和GPC3-双特异性多聚体蛋白SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55以及具有三价4-1BB靶向和另一三价T细胞共刺激受体靶向部分的双特异性六价蛋白导致IL-2分泌的强烈增加，其与参照4-1BB抗体SEQ ID NOs:72和73相比更强。对于参照GPC3抗体SEQ ID NOs:108和109、GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO:90或如多聚体蛋白中包含的4-1BB特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:64)，没有观察到超过背景的IL-2分泌增加。
实施例8.使用4-1BB生物测定的多聚体蛋白的GPC3依赖性T细胞共刺激
使用表达4-1BB和luc2基因(萤火虫荧光素酶的人源化形式)的商业上可获得的双稳定转染的Jurkat细胞系，评价所选多聚体蛋白以GPC3依赖性方式诱导4-1BB信号传导途径活化的潜力，在该细胞系中luc2表达由NFκB应答元件驱动。在这一生物测定中，4-1BB接合导致4-1BB的胞内信号传导，实现NFκB介导的发光。
将GPC3阳性肿瘤细胞系HepG2在补充有10％胎牛血清(Sigma-Aldrich)的杜氏改良伊格尔培养基(DMSO，Pan Biotech)中培养。在测定前一天，将HepG2细胞以6.25×103个细胞/孔铺板，并使之在37℃下在湿润的5％CO2气氛中贴壁过夜。为了测试构建体是否能够在不存在GPC3表达肿瘤细胞HEPG2的情况下活化报告细胞，一些孔仅用培养基孵育过夜。
第二天，向每个孔中加入3.75×104个NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat细胞，随后加入各种浓度、通常为0.01nM至100nM的测试多聚体蛋白(38-42、44和48-55)、如多聚体蛋白中包含的4-1BB特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:64)、GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:90)、参照GPC3抗体(SEQ ID NOs:108和109)、人IgG4同种型对照(SEQID NOs:29和30)或阴性对照脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO:8)。另外，在不存在HepG2细胞的情况下，将最高浓度的每种构建体加入NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat细胞中。用可透气的密封物覆盖平板，并在37℃下在潮湿的5％CO2气氛中孵育。4小时后，将Bio-GloTM试剂加入每个孔中，并使用发光计(PHERAstar)定量生物发光信号。用GraphPad
进行四参数逻辑曲线分析，以计算EC50值(共有底部，四个参数，可变斜率)，其总结于表6中，在不存在HepG2细胞的情况下平行进行相同的实验。该测定一式三份进行。/>
代表性实验的结果描述于图6中。三价多聚体蛋白SEQ ID NOs:38-42和44在存在和不存在GPC3的情况下不诱导4-1BB介导的T细胞共刺激。在存在和不存在GPC3的情况下，六价多聚体蛋白SEQ ID NOs:48-53显示了相当的活化。双特异性多聚体蛋白SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55仅在存在GPC3阳性HepG2细胞的情况下诱导4-1BB介导的T细胞共刺激，证明GPC3依赖性的作用模式。
表6.使用4-1BB生物测定的T细胞活化评价
实施例9.评估CD8和CD4T细胞活化
为了解释构建体对CD4+和CD8+T细胞的影响，使用改进的T细胞活化测定分析多聚体蛋白的共刺激。将多聚体蛋白以不同浓度应用于与模拟转染的Flp-In-CHO细胞共培养的抗CD3刺激的分离的CD4+或CD8+T细胞。在上清液中测量IL-2分泌水平。
对于该测定，使用与实施例5中所述相同的方案，除了使用分离的CD4+或CD8+T细胞代替Pan T细胞。因此，从健康志愿者供体分离PBMC。使用CD4+T细胞分离试剂盒或CD8微珠(Miltenyi Biotec GmbH)通过磁性细胞分选，按照制造商的方案，从PBMC进一步纯化CD4或CD8 T淋巴细胞。
将一系列稀释的所选多聚体蛋白(SEQ ID NO:52)、如实施例6中所述具有三价4-1BB靶向和另一三价T细胞共刺激受体靶向部分的双特异性六价蛋白、参照4-1BB抗体(SEQID NOs:72和73)或人IgG4同种型对照(SEQ ID NOs:29和30)，通常范围为0.05nM-500nM，加入相应孔中，随后加入0.05μg/mL抗CD28抗体。板用可透气的密封物覆盖，并在37℃下在潮湿的5％CO2气氛中孵育2天。
共培养3天后，如实施例5所述使用人IL-2DuoSet试剂盒(R&D Systems)评价上清液中的IL-2水平。
示例性数据示于图8。与hIgG4同种型对照(SEQ ID NOs:29和30)相比，在存在多聚体蛋白(SEQ ID NO:52)或参照4-1BB抗体(SEQ ID NOs:72和73)的情况下共培养分离的CD8+T细胞与CHO细胞导致IL-2分泌明显增加。具有三价4-1BB靶向和另一三价T细胞共刺激受体靶向部分的双特异性六价蛋白不导致IL-2分泌的增加(图8A)。与hIgG4同种型对照(SEQID NOs:29和30)相比，在存在多聚体蛋白(SEQ ID NO:52)的情况下共培养分离的CD4+T细胞与CHO细胞导致IL-2分泌明显增加，效力与参照4-1BB抗体(SEQ ID NOs:72和73)相当。当使用具有三价4-1BB靶向和另一三价共刺激受体靶向部分的双特异性六价蛋白质时，CD4+T细胞的IL-2分泌的增加甚至更强(图8B)。
实施例10.多聚体蛋白与表达人4-1BB、OX40或PD-L1的细胞结合的流式细胞术分析
通过如实施例5所述的流式细胞术，使用稳定转染有人4-1BB、人OX40或人PD-L1(Flp-In系统；Life Technologies)的CHO细胞，评估六价三聚体蛋白与人4-1BB、OX40或PD-L1表达细胞的靶标特异性结合。
结果示于图9，显示多聚体蛋白分别结合人4-1BB(图9A)、人OX40(图9B)和/或人PD-L1(图9C)的能力。所有测试的多聚体蛋白与靶标表达细胞的结合亲和力(EC50，表7中描述)在个位数纳摩尔范围内或甚至更低。没有观察到与模拟转染细胞的结合(数据未显示)。
表7.多聚体蛋白与表达4-1BB、OX40或PD-L1的细胞的结合亲和力
实施例11.T细胞活化的评价
使用如实施例6中所述的T细胞活化测定分析本公开的六价三聚体蛋白质的T细胞共刺激，除了使用Flp-In-CHO::huPD-L1细胞代替模拟转染的Flp-In-CHO细胞。
示例性数据示于图10。与hIgG4同种型对照(SEQ ID NOs:29和30)相比，在存在单特异性(SEQ ID NO:52)和双特异性(SEQ ID NOs:164-167)六价三聚体蛋白的情况下共培养Pan T细胞与CHO细胞导致IL-2分泌的明显增加。靶向4-1BB和OX40两者的多聚体蛋白(SEQ ID NOs:164-166)或靶向4-1BB和PD-L1两者的多聚体蛋白(SEQ ID NO:167)的增加比仅靶向4-1BB的多聚体蛋白(SEQ ID NO:52)的增加要显著更强。
实施例12.CD4 T细胞活化的评价
使用如实施例9中所述改进的T细胞活化测定分析本公开的六价三聚体蛋白的CD4+T细胞共刺激，除了使用Flp-In-CHO::huPD-L1细胞代替模拟转染的Flp-In-CHO细胞。
示例性数据示于图11。与hIgG4同种型对照(SEQ ID NOs:29和30)相比，在存在单特异性(SEQ ID NO:52)和双特异性(SEQ ID NOs:164-167)六价三聚体蛋白的情况下，共培养分离的CD4+T细胞与CHO细胞导致IL-2分泌的明显增加。靶向4-1BB和OX40两者的多聚体蛋白(SEQ ID NOs:164-166)或靶向4-1BB和PD-L1两者的多聚体蛋白(SEQ ID NO:167)的增加比仅靶向4-1BB的多聚体蛋白(SEQ ID NO:52)的增加要显著更强。
实施例13.CD8 T细胞活化的评价
使用如实施例9中所述改进的T细胞活化测定分析本公开的六价三聚体蛋白的CD8+T细胞共刺激，除了使用Flp-In-CHO::huPD-L1细胞代替模拟转染的Flp-In-CHO细胞。
示例性数据示于图12。与hIgG4同种型对照(SEQ ID NOS:29和30)相比，在存在单特异性(SEQ ID NO:52)和双特异性(SEQ ID NOs:164-167)六价三聚体蛋白的情况下，共培养分离的CD8+T细胞与CHO细胞导致IL-2分泌的明显增加。仅靶向4-1BB的多聚体蛋白(SEQID NO:52)或靶向4-1BB和PD-L1两者的多聚体蛋白(SEQ ID NO:167)的增加比靶向4-1BB和OX40两者的多聚体蛋白(SEQ ID NOs:164-166)的增加要显著更强。
实施例14.使用4-1BB生物测定的双特异性六价蛋白的T细胞共刺激
使用如实施例8中所述商业可得的4-1BB生物测定评价所选多聚体蛋白诱导4-1BB信号传导途径活化的潜力，除了使用Flp-In-CHO::huOX40细胞代替HepG2细胞。在不存在Flp-In-CHO::huOX40细胞的情况下也测试了最高浓度的构建体。
示例性数据示于图13。在存在Flp-In-CHO::huOX40细胞的情况下，与(同种型)对照(SEQ ID NOs:8、29和30)和作为另外的阴性对照的OX40L蛋白质(SEQ ID NO:204)相比，靶向4-1BB和OX40的双特异性六价三聚体蛋白(SEQ ID NOs:164-166)导致4-1BB信号传导途径的显著活化。活化水平显著高于用仅靶向4-1BB的多聚体蛋白(SEQ ID NO:52)、用参照4-1BB抗体(SEQ ID NOs:72和73)或用4-1BB靶向三聚体蛋白(SEQ ID NO:38)和OX40靶向三聚体蛋白(SEQ ID NO:203)的组合可获得的活化水平。在不存在Flp-In-CHO::huOX40细胞的情况下，双特异性六价三聚体蛋白(SEQ ID NOs:164-166)中无一诱导4-1BB介导的T细胞共刺激。
实施例15.使用OX40生物测定的双特异性六价蛋白的T细胞共刺激
使用表达OX40和luc2基因(萤火虫荧光素酶的人源化形式)的商业上可获得的双稳定转染的Jurkat细胞系，评价所选多聚体蛋白诱导OX40信号传导途径活化的潜力，在该细胞系中luc2表达由NFκB应答元件驱动。在这一生物测定中，OX40接合导致OX40胞内信号传导，实现NFκB介导的发光。
将Flp-In-CHO::hu4-1BB细胞系在补充有10％胎牛血清(Sigma-Aldrich)和500μg/ml潮霉素B(Carl Roth)的Ham’s F12(Gibco，Thermo Fisher)中培养。在测定前一天，将Flp-In-CHO::hu4-1BB细胞以8×103个细胞/孔铺板，并使之在37℃下在湿润的5％CO2气氛中贴壁过夜。为了测试构建体是否能够在不存在4-1BB表达细胞的情况下活化报告细胞，一些孔仅用培养基孵育过夜。
第二天，向每个孔中加入1×104个NF-kB-Luc2/OX40 Jurkat细胞，随后加入各种浓度、通常为0.004nM至100nM的测试的4-1BB/OX40靶向多聚体蛋白(SEQ ID NOs:164-166)、人IgG4同种型对照(SEQ ID NOs:29和30)、阴性对照脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ IDNO:8)、OX40L蛋白(SEQ ID NO:204)、仅靶向4-1BB的多聚体蛋白(SEQ ID NO:52)、参照4-1BB抗体(SEQ ID NOs:72和73)以及4-1BB靶向三聚体蛋白(SEQ ID NO:38)和OX40靶向三聚体蛋白(SEQ ID NO:203)的组合。另外，在不存在Flp-In-CHO::hu4-1BB细胞的情况下，将最高浓度的每种构建体加入NF-kB-Luc2/OX40 Jurkat细胞中。用可透气的密封物覆盖平板，并在37℃下在潮湿的5％CO2气氛中孵育。5小时后，将Bio-GloTM试剂加入每个孔中，并使用发光计(PHERAstar)定量生物发光信号。用GraphPad
进行四参数逻辑曲线分析。该测定一式三份进行。
代表性实验的结果描述于图14中。在存在Flp-In-CHO::hu4-1BB细胞的情况下，与(同种型)对照(SEQ ID NOs:8、29和30)相比，靶向4-1BB和OX40的双特异性六价三聚体蛋白(SEQ ID NOs:164-166)导致OX40信号传导途径的显著活化。活化水平显著高于用仅靶向4-1BB的多聚体蛋白(SEQ ID NO:52)、用参照4-1BB抗体(SEQ ID NOs:72和73)、用OX40L蛋白(SEQ ID NO:204)或用4-1BB靶向三聚体蛋白(SEQ ID NO:38)和OX40靶向三聚体蛋白(SEQID NO:203)的组合可获得的活化水平。在不存在Flp-In-CHO::hu4-1BB细胞的情况下，双特异性六价三聚体蛋白(SEQ ID NOs:164-166)中无一诱导4-1BB介导的T细胞共刺激。
在缺少在此没有具体公开的任何一个或多个元件、一个或多个限制的情况下，可以适当地实践在此说明性描述的实施例。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广义地而非限制性地理解。另外，本文所采用的术语和表达方式已经用作描述性术语而非限制性术语，并且在使用这些术语和表达方式时，无意排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，但是应认识到，在所要求保护的本发明的范围内，各种修改是可能的。因此，应当理解，尽管通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明的实施方案，但本领域技术人员可以采用其修改和变化，并且认为这些修改和变化在本发明的范围内。本文所述的所有专利、专利申请、教科书和同行综述的出版物均以引用方式全文并入本文。此外，当通过引用并入本文的参考文献中的术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用参考文献中的该术语的定义。落入一般公开内容的每个较窄的种类和亚属分组也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，附带条件或负面限制从该属中除去任何主题，而不管所去除的材料是否在本文中具体叙述。另外，在特征是按照马库什组描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此按照马库什组的任何单独成员或成员的子组来描述。进一步的实施例将从以下根据权利要求书中变得显而易见。
等价物：本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这些等同物旨在被以下权利要求涵盖。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用并入本说明书，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入本说明书。
VI.非专利参考文献
1.ALTSCHUL,S.F.,GISH,W.,MILLER,W.,MYERS,E.W.&LIPMAN,D.J.1990.Basiclocal alignment search tool.J Mol Biol,215,403-10.
2.ALTSCHUL,S.F.,MADDEN,T.L.,SCHAFFER,A.A.,ZHANG,J.,ZHANG,Z.,MILLER,W.&LIPMAN,D.J.1997.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs.Nucleic Acids Res,25,3389-402.
3.ALTSHULER,E.P.,SEREBRYANAYA,D.V.&KATRUKHA,A.G.2010.Generation ofrecombinant antibodies and means for increasing their affinity.Biochemistry(Mosc),75,1584-605.
4.BREUSTEDT,D.A.,KORNDORFER,I.P.,REDL,B.&SKERRA,A.2005.The 1.8-Acrystal structure of human tear lipocalin reveals an extended branched cavitywith capacity for multiple ligands.J Biol Chem,280,484-93.
5.BRUCKDORFER,T.,MARDER,O.&ALBERICIO,F.2004.From production ofpeptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugsof the future.Curr Pharm Biotechnol,5,29-43.
6.CHACON,J.A.,WU,R.C.,SUKHUMALCHANDRA,P.,MOLLDREM,J.J.,SARNAIK,A.,PILON-THOMAS,S.,WEBER,J.,HWU,P.&RADVANYI,L.2013.Co-stimulation through 4-1BB/CD137 improves the expansion and function of CD8(+)melanoma tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive T-cell therapy.PLoS One,8,e60031.
7.COLE,S.P.,CAMPLING,B.G.,LOUWMAN,I.H.,KOZBOR,D.&RODER,J.C.1984.Astrategy for the production of human monoclonal antibodies reactive with lungtumor cell lines.Cancer Res,44,2750-3.
8.DENNIS,M.S.,ZHANG,M.,MENG,Y.G.,KADKHODAYAN,M.,KIRCHHOFER,D.,COMBS,D.&DAMICO,L.A.2002.Albumin binding as a general strategy for improving thepharmacokinetics of proteins.J Biol Chem,277,35035-43.
9.FISHER,T.S.,KAMPERSCHROER,C.,OLIPHANT,T.,LOVE,V.A.,LIRA,P.D.,DOYONNAS,R.,BERGQVIST,S.,BAXI,S.M.,ROHNER,A.,SHEN,A.C.,HUANG,C.,SOKOLOWSKI,S.A.&SHARP,L.L.2012.Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity.CancerImmunol Immunother,61,1721-33.
10.FLOWER,D.R.1996.The lipocalin protein family:structure andfunction.Biochem J,318(Pt 1),1-14.
11.FLOWER,D.R.2000.Beyond the superfamily:the lipocalinreceptors.Biochim Biophys Acta,1482,327-36.
12.FLOWER,D.R.,NORTH,A.C.&SANSOM,C.E.2000.The lipocalin proteinfamily:structural and sequence overview.Biochim Biophys Acta,1482,9-24.
13.FUERTGES,F.&ABUCHOWSKI,A.1990.The clinical efficacy of poly(ethylene glycol)-modified proteins.Journal of Controlled Release,11,139-148.
14.HARLOW,E.&LANE,D.1988.Antibodies:a laboratory manual,Cold SpringHarbor,NY,Cold Spring Harbor Laboratory.
15.HARLOW,E.&LANE,D.1999.Using antibodies:a laboratory manual,ColdSpring Harbor,N.Y.,Cold Spring Harbor Laboratory Press.
16.HOLLIGER,P.&HUDSON,P.J.2005.Engineered antibody fragments and therise of single domains.Nat Biotechnol,23,1126-36.
17.HOLLIGER,P.,PROSPERO,T.&WINTER,G.1993."Diabodies":small bivalentand bispecific antibody fragments.Proc Natl Acad Sci U S A,90,6444-8.
18.KONIG,T.&SKERRA,A.1998.Use of an albumin-binding domain for theselective immobilisation of recombinant capture antibody fragments on ELISAplates.J Immunol Methods,218,73-83.
19.KOZBOR,D.&RODER,J.C.1983.The production of monoclonal antibodiesfrom human lymphocytes.Immunol Today,4,72-9.
20.LI,J.,SAI,T.,BERGER,M.,CHAO,Q.,DAVIDSON,D.,DESHMUKH,G.,DROZDOWSKI,B.,EBEL,W.,HARLEY,S.,HENRY,M.,JACOB,S.,KLINE,B.,LAZO,E.,ROTELLA,F.,ROUTHIER,E.,RUDOLPH,K.,SAGE,J.,SIMON,P.,YAO,J.,ZHOU,Y.,KAVURU,M.,BONFIELD,T.,THOMASSEN,M.J.,SASS,P.M.,NICOLAIDES,N.C.&GRASSO,L.2006.Human antibodies forimmunotherapy development generated via a human B cell hybridomatechnology.Proc Natl Acad Sci U S A,103,3557-62.
21.LI,S.Y.&LIU,Y.2013.Immunotherapy of melanoma with the immunecostimulatory monoclonal antibodies targeting CD137.Clin Pharmacol,5,47-53.
22.LOWMAN,H.B.1997.Bacteriophage display and discovery of peptideleads for drug development.Annu Rev Biophys Biomol Struct,26,401-24.
23.MARTINET,O.,DIVINO,C.M.,ZANG,Y.,GAN,Y.,MANDELI,J.,THUNG,S.,PAN,P.Y.&CHEN,S.H.2002.T cell activation with systemic agonistic antibody versuslocal 4-1BB ligand gene delivery combined with interleukin-12 eradicate livermetastases of breast cancer.Gene Ther,9,786-92.
24.MELERO,I.,BACH,N.,HELLSTROM,K.E.,ARUFFO,A.,MITTLER,R.S.&CHEN,L.1998.Amplification of tumor immunity by gene transfer of the co-stimulatory4-1BB ligand:synergy with the CD28 co-stimulatory pathway.Eur J Immunol,28,1116-21.
25.OSBORN,B.L.,OLSEN,H.S.,NARDELLI,B.,MURRAY,J.H.,ZHOU,J.X.,GARCIA,A.,MOODY,G.,ZARITSKAYA,L.S.&SUNG,C.2002.Pharmacokinetic and pharmacodynamicstudies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein incynomolgus monkeys.J Pharmacol Exp Ther,303,540-8.
26.PERVAIZ,S.&BREW,K.1987.Homology and structure-functioncorrelations between alpha 1-acid glycoprotein and serum retinol-bindingprotein and its relatives.FASEB J,1,209-14.
27.RABU,C.,
A.,JACQUES,Y.,ECHASSERIEAU,K.,VUSIO,P.&LANG,F.2005.Production of Recombinant Human Trimeric CD137L(4-1BBL):CROSS-LINKINGIS ESSENTIAL TO ITS T CELL CO-STIMULATION ACTIVITY.Journal of BiologicalChemistry,280,41472-41481.
28.RODI,D.J.&MAKOWSKI,L.1999.Phage-display technology--finding aneedle in a vast molecular haystack.Curr Opin Biotechnol,10,87-93.
29.SAMBROOK,J.&RUSSELL,D.W.2001.Molecular cloning:a laboratorymanual,Cold Spring Harbor,N.Y.,Cold Spring Harbor Laboratory Press.
30.SCHMIDT,T.G.,KOEPKE,J.,FRANK,R.&SKERRA,A.1996.Molecularinteraction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target,streptavidin.J Mol Biol,255,753-66.
31.SKERRA,A.2000.Lipocalins as a scaffold.Biochim Biophys Acta,1482,337-50.
32.SMITH,T.F.&WATERMAN,M.S.1981.Identification of common molecularsubsequences.J Mol Biol,147,195-7.
33.SNELL,L.M.,LIN,G.H.,MCPHERSON,A.J.,MORAES,T.J.&WATTS,T.H.2011.T-cell intrinsic effects of GITR and 4-1BB during viral infection and cancerimmunotherapy.Immunol Rev,244,197-217.
34.VAJO,Z.&DUCKWORTH,W.C.2000.Genetically engineered insulin analogs:diabetes in the new millenium.Pharmacol Rev,52,1-9.
35.VENTURI,M.,SEIFERT,C.&HUNTE,C.2002.High level production offunctional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm.J MolBiol,315,1-8.
36.WARD,E.S.,GUSSOW,D.,GRIFFITHS,A.D.,JONES,P.T.&WINTER,G.1989.Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variabledomains secreted from Escherichia coli.Nature,341,544-6.
37.WYZGOL,A.,MULLER,N.,FICK,A.,MUNKEL,S.,GRIGOLEIT,G.U.,PFIZENMAIER,K.&WAJANT,H.2009.Trimer stabilization,oligomerization,and antibody-mediatedcell surface immobilization improve the activity of soluble trimers of CD27L,CD40L,41BBL,and glucocorticoid-induced TNF receptor ligand.J Immunol,183,1851-61.
38.YANG,Y.,YANG,S.,YE,Z.,JAFFAR,J.,ZHOU,Y.,CUTTER,E.,LIEBER,A.,HELLSTROM,I.&HELLSTROM,K.E.2007.Tumor cells expressing anti-CD137 scFv inducea tumor-destructive environment.Cancer Res,67,2339-44.
39.YAO,S.,ZHU,Y.&CHEN,L.2013.Advances in targeting cell surfacesignalling molecules for immune modulation.Nat Rev Drug Discov,12,130-46.
40.YE,Q.,SONG,D.G.,POUSSIN,M.,YAMAMOTO,T.,BEST,A.,LI,C.,COUKOS,G.&POWELL,D.J.,JR.2014.CD137 accurately identifies and enriches for naturallyoccurring tumor-reactive T cells in tumor.Clin Cancer Res,20,44-55.
41.YE,Z.,HELLSTROM,I.,HAYDEN-LEDBETTER,M.,DAHLIN,A.,LEDBETTER,J.A.&HELLSTROM,K.E.2002.Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragmentsspecific for 4-1BB.Nat Med,8,343-8.
42.ZHANG,H.,KNUTSON,K.L.,HELLSTROM,K.E.,DISIS,M.L.&HELLSTROM,I.2006.Antitumor efficacy of CD137 ligation is maximized by the use of aCD137 single-chain Fv-expressing whole-cell tumor vaccine compared withCD137-specific monoclonal antibody infusion.Mol Cancer Ther,5,149-55.
序列表
<110> 皮里斯制药有限公司
<120> 靶向4-1BB的多聚体免疫调节剂
<130> LC22310023P
<150> EP 20178414.7
<151> 2020-06-05
<150> EP 20178721.5
<151> 2020-06-08
<160> 204
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 158
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
His His Leu Leu Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr
1 5 10 15
Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn
20 25 30
Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn
35 40 45
Leu Glu Ala Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val
50 55 60
Lys Ala Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp
65 70 75 80
Gly Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His
85 90 95
Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg Gly
100 105 110
Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu
115 120 125
Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile
130 135 140
Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly Ser Asp
145 150 155
<210> 2
<211> 178
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile
65 70 75 80
Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn
85 90 95
Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 3
<211> 535
<212> PRT
<213> 人
<400> 3
Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser
1 5 10 15
Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro
20 25 30
Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys
35 40 45
Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn
50 55 60
Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile
65 70 75 80
Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg
85 90 95
His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser
100 105 110
Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val
115 120 125
Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn
130 135 140
Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn
145 150 155 160
Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly
165 170 175
Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met
180 185 190
Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala
195 200 205
Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe
210 215 220
Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr
225 230 235 240
Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val
245 250 255
Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp
260 265 270
Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg
275 280 285
Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His
290 295 300
Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr
305 310 315 320
Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala
325 330 335
Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala
340 345 350
His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile
355 360 365
Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr
370 375 380
Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn
385 390 395 400
Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly
405 410 415
Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu
420 425 430
Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu
435 440 445
Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu
450 455 460
Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu
465 470 475 480
Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu
485 490 495
Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro
500 505 510
Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe
515 520 525
His Asn Leu Gly Asn Val His
530 535
<210> 4
<211> 232
<212> PRT
<213> 人
<400> 4
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu
165 170 175
Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg
180 185 190
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
195 200 205
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
210 215 220
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
225 230
<210> 5
<211> 535
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 5
Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser
1 5 10 15
Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro
20 25 30
Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys
35 40 45
Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn
50 55 60
Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile
65 70 75 80
Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg
85 90 95
His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser
100 105 110
Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val
115 120 125
Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn
130 135 140
Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn
145 150 155 160
Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly
165 170 175
Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met
180 185 190
Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala
195 200 205
Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe
210 215 220
Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr
225 230 235 240
Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val
245 250 255
Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp
260 265 270
Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg
275 280 285
Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His
290 295 300
Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr
305 310 315 320
Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala
325 330 335
Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala
340 345 350
His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile
355 360 365
Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr
370 375 380
Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn
385 390 395 400
Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly
405 410 415
Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu
420 425 430
Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu
435 440 445
Leu Arg Thr Met Ser Val Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu
450 455 460
Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu
465 470 475 480
Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Met Lys Val Lys Asn Gln Leu
485 490 495
Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Val Pro
500 505 510
Gly Asn Asn Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe
515 520 525
His Asn Leu Gly Asn Val His
530 535
<210> 6
<211> 231
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 6
Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Ile Ile Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Val Val Leu
165 170 175
Phe Leu Leu Phe Phe Leu Val Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Ser
180 185 190
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
195 200 205
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
210 215 220
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
225 230
<210> 7
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 7
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Cys Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Glu Cys His Gly Lys Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 8
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 8
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile
65 70 75 80
Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn
85 90 95
Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和标签
<400> 9
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和标签
<400> 10
His His His His His His His His His His
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和标签
<400> 11
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 12
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 13
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 13
Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser
1 5 10 15
Pro Ser
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 14
Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val
1 5 10
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 15
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala
20
<210> 16
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 16
Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser
1 5 10 15
Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser
35 40 45
Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser
50 55 60
Ala Ser
65
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 17
Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser
1 5 10 15
Pro Ser Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val
20 25 30
<210> 18
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 18
Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser
1 5 10 15
Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser
20 25 30
Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr
35 40 45
Pro Ser Pro Ser Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser
50 55 60
Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ala Ser
65 70
<210> 19
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 19
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
35 40
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 20
Val Asp Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Glu
1 5 10
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 21
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Arg Met Asp Glu
1 5 10
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 25
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 26
Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro
1 5
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 27
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr
1 5 10 15
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 28
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ala
<210> 29
<211> 327
<212> PRT
<213> 人
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人
<400> 30
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Fc区
<400> 31
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 32
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Fc区
<400> 32
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 33
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Fc区
<400> 33
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 34
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Fc区
<400> 34
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 35
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多聚化结构域
<400> 35
Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val His
1 5 10 15
Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu
20 25 30
Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala Arg
35 40 45
Thr Pro Leu
50
<210> 36
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多聚化结构域
<400> 36
Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu
1 5 10 15
Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp
20 25 30
Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro
35
<210> 37
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多聚化结构域
<400> 37
Arg Leu Lys Gln Ile Glu Asp Lys Leu Glu Glu Ile Leu Ser Lys Leu
1 5 10 15
Tyr His Ile Glu Asn Glu Leu Ala Arg Ile Lys Lys Leu Leu Gly Glu
20 25 30
Arg
<210> 38
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 38
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val
195 200 205
His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu
210 215 220
Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala
225 230 235 240
Arg Thr Pro Leu
<210> 39
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 39
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln
180 185 190
Ala Met Leu Gly Gln Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe
195 200 205
Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg
210 215 220
Lys Val Gln Leu Glu Ala Arg Thr Pro Leu
225 230
<210> 40
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 40
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Arg Leu Trp
195 200 205
Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val His Glu Val Pro Glu Gly
210 215 220
Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln
225 230 235 240
Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala Arg Thr Pro Leu
245 250
<210> 41
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 41
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro
180 185 190
Thr Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val
195 200 205
His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu
210 215 220
Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala
225 230 235 240
Arg Thr Pro Leu
<210> 42
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 42
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
180 185 190
Ala Lys Ala Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly
195 200 205
Gln Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln
210 215 220
Glu Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu
225 230 235 240
Glu Ala Arg Thr Pro Leu
245
<210> 43
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 43
Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val His
1 5 10 15
Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu
20 25 30
Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala Arg
35 40 45
Thr Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser
65 70 75 80
Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys
85 90 95
Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys
100 105 110
Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
115 120 125
Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr
130 135 140
Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu
145 150 155 160
Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val
165 170 175
Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val
180 185 190
Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys
195 200 205
Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser
210 215 220
Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln
225 230 235 240
Cys Ile Asp Gly
<210> 44
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 44
Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val His
1 5 10 15
Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu
20 25 30
Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala Arg
35 40 45
Thr Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile
50 55 60
Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp
65 70 75 80
Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile
85 90 95
Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr
100 105 110
Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp
115 120 125
Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln
130 135 140
Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr
145 150 155 160
Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
165 170 175
Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr
180 185 190
Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe
195 200 205
Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe
210 215 220
Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
225 230
<210> 45
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 45
Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val His
1 5 10 15
Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu
20 25 30
Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala Arg
35 40 45
Thr Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr
65 70 75 80
Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln
85 90 95
Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln
100 105 110
Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met
115 120 125
Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met
130 135 140
Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val
145 150 155 160
Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe
165 170 175
Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn
180 185 190
Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu
195 200 205
Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu
210 215 220
Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn
225 230 235 240
His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
245 250
<210> 46
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 46
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Arg Leu Lys Gln Ile Glu Asp Lys Leu Glu Glu Ile Leu Ser Lys
195 200 205
Leu Tyr His Ile Glu Asn Glu Leu Ala Arg Ile Lys Lys Leu Leu Gly
210 215 220
Glu Arg
225
<210> 47
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 47
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg
195 200 205
Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys
210 215 220
Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro
225 230
<210> 48
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 48
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val
195 200 205
His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu
210 215 220
Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala
225 230 235 240
Arg Thr Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu
260 265 270
Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly
275 280 285
Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp
290 295 300
Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp
305 310 315 320
Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met
325 330 335
Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr
340 345 350
Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg
355 360 365
Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe
370 375 380
Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr
385 390 395 400
Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys
405 410 415
Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp
420 425 430
Gln Cys Ile Asp Gly
435
<210> 49
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 49
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln
180 185 190
Ala Met Leu Gly Gln Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe
195 200 205
Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg
210 215 220
Lys Val Gln Leu Glu Ala Arg Thr Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu
245 250 255
Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln
260 265 270
Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn
275 280 285
Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile
290 295 300
Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe
305 310 315 320
Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser
325 330 335
Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His
340 345 350
Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala
355 360 365
Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile
370 375 380
Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn
385 390 395 400
Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val
405 410 415
Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
420 425
<210> 50
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 50
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Arg Leu Trp
195 200 205
Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val His Glu Val Pro Glu Gly
210 215 220
Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln
225 230 235 240
Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala Arg Thr Pro Leu Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser
260 265 270
Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln
275 280 285
Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly
290 295 300
Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met
305 310 315 320
Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr
325 330 335
Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe
340 345 350
Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser
355 360 365
Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr
370 375 380
Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu
385 390 395 400
Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu
405 410 415
Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu
420 425 430
Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
435 440 445
<210> 51
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 51
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
180 185 190
Ala Lys Ala Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly
195 200 205
Gln Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln
210 215 220
Glu Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu
225 230 235 240
Glu Ala Arg Thr Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro
260 265 270
Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe
275 280 285
His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg
290 295 300
Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys
305 310 315 320
Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys
325 330 335
Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu
340 345 350
Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu
355 360 365
Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe
370 375 380
Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly
385 390 395 400
Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe
405 410 415
Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro
420 425 430
Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
435
<210> 52
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 52
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
195 200 205
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp
210 215 220
Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp
225 230 235 240
Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser
245 250 255
Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp
260 265 270
Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly
275 280 285
Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val
290 295 300
Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe
305 310 315 320
Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu
325 330 335
Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu
340 345 350
Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys
355 360 365
Ile Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
370 375 380
Gly Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln
385 390 395 400
Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu
405 410 415
Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu
420 425 430
Ala Arg Thr Pro Leu
435
<210> 53
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 53
Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val His
1 5 10 15
Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu
20 25 30
Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala Arg
35 40 45
Thr Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser
65 70 75 80
Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys
85 90 95
Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys
100 105 110
Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
115 120 125
Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr
130 135 140
Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu
145 150 155 160
Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val
165 170 175
Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val
180 185 190
Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys
195 200 205
Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser
210 215 220
Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln
225 230 235 240
Cys Ile Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu
260 265 270
Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly
275 280 285
Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp
290 295 300
Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp
305 310 315 320
Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met
325 330 335
Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr
340 345 350
Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg
355 360 365
Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe
370 375 380
Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr
385 390 395 400
Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys
405 410 415
Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp
420 425 430
Gln Cys Ile Asp Gly
435
<210> 54
<211> 507
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Leu Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp
165 170 175
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val
180 185 190
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val
210 215 220
Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln
260 265 270
Ala Met Leu Gly Gln Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe
275 280 285
Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg
290 295 300
Lys Val Gln Leu Glu Ala Arg Thr Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu
325 330 335
Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln
340 345 350
Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn
355 360 365
Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile
370 375 380
Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe
385 390 395 400
Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser
405 410 415
Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His
420 425 430
Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala
435 440 445
Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile
450 455 460
Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn
465 470 475 480
Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val
485 490 495
Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
500 505
<210> 55
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 55
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Pro Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Arg Lys Lys Cys Thr Tyr Ser Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln
85 90 95
Ile Lys Ser Glu Pro Gly Gly Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val
195 200 205
His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu
210 215 220
Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala
225 230 235 240
Arg Thr Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu
260 265 270
Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly
275 280 285
Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp
290 295 300
Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp
305 310 315 320
Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met
325 330 335
Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr
340 345 350
Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg
355 360 365
Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe
370 375 380
Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr
385 390 395 400
Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys
405 410 415
Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp
420 425 430
Gln Cys Ile Asp Gly
435
<210> 56
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 56
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 57
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 57
Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Arg Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Asp Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 58
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 58
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Asn Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Arg Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 59
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 59
Val Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Arg Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Glu Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 60
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 60
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Ser Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 61
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 61
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Glu
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Ala Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Ser
130 135 140
Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 62
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 62
Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Asp Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Ala Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 63
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 63
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 64
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 64
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 65
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 65
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Ala Val Ala Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 66
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 66
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Ala Val Ala Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 67
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 67
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Ser Lys Met
35 40 45
Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr
50 55 60
Gly Val Ser Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile Met Thr Phe
65 70 75 80
Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser
85 90 95
Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr
100 105 110
Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu
115 120 125
Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu
130 135 140
Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu
145 150 155 160
Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
165 170 175
<210> 68
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 68
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Val Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Arg Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 69
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 69
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 70
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 70
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Ser Thr Leu Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 71
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 71
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ser Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Ala Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Asn Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 72
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链
<400> 72
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 73
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链
<400> 73
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 74
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 74
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 75
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 75
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Arg Ser Asp Leu Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 76
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 76
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Tyr Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Leu Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80
Gln Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Ser Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 77
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 77
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln His Ile Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 78
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 78
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asp Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 79
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 79
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Ile Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 80
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 80
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Arg Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Val Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Tyr Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 81
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 81
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Asn
65 70 75 80
Trp Pro Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Leu Gly Pro Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 82
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 82
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Asn Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 83
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 83
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Asp Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Leu Leu Asp Lys Lys Cys His Tyr Ile Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 84
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 84
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Val Ala Gly Asn Ala Met Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Leu Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Gly Val Ser Phe Trp Arg Lys Lys Cys His Tyr Lys Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asp
85 90 95
Ile Lys Ser Gly Pro Gly Gln Thr Ser Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Arg Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Ala Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 85
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 85
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Pro Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Met Lys Lys Cys Met Tyr Ser Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln
85 90 95
Ile Lys Ser Glu Pro Gly Asn Thr Ser Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 86
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 86
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Val Ala Gly Asn Ala Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Leu Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Val Val Ser Phe Trp Arg Lys Lys Cys His Tyr Lys Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asp
85 90 95
Ile Lys Ser Gly Pro Gly Gln Thr Ser Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Arg Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Ala Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 87
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 87
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Val Ala Gly Asn Val Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Pro Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Ser Phe Arg Gly Lys Lys Cys His Tyr Lys Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asp
85 90 95
Ile Lys Ser Gly Pro Gly Glu Thr Ser Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Arg Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 88
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 88
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Val Ala Gly Asn Gly Met Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Leu Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Ser Val Ala Phe Arg Asn Lys Lys Cys His Tyr Lys Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln
85 90 95
Ile Lys Ser Gly Pro Gly Glu Thr Ser Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Arg Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 89
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 89
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Pro Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Arg Lys Lys Cys Leu Tyr Ser Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln
85 90 95
Ile Lys Ser Glu Pro Gly Asn Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 90
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 90
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Pro Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Arg Lys Lys Cys Thr Tyr Ser Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln
85 90 95
Ile Lys Ser Glu Pro Gly Gly Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 91
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 91
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Gly Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Pro Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Arg Lys Lys Cys Val Tyr Ser Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Pro
85 90 95
Ile Lys Ser Glu Pro Gly Asn Thr Ala Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 92
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 92
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Pro Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Ala Val Arg Phe Ala Arg Lys Lys Cys Leu Tyr Ser Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Arg
85 90 95
Ile Lys Ser Glu Pro Gly Tyr Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 93
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 93
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Pro Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Asn Val Val Phe Ala Gly Lys Lys Cys Lys Tyr Ser Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Arg
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Pro Gly Asn Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 94
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 94
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Leu Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Pro Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Arg Lys Lys Cys Met Tyr Ser Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln
85 90 95
Ile Lys Ser Glu Pro Gly Ser Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 95
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 95
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Pro Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Gly Lys Lys Val Lys Tyr Thr Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln
85 90 95
Ile Lys Ser Glu Pro Gly Asn Thr Ala Thr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Ala Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 96
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 96
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Pro Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Arg Phe Gly Glu Lys Lys Ile Lys Tyr Ser Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln
85 90 95
Ile Lys Ser Gln Pro Gly Asp Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Ala Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 97
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 97
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Pro Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Arg Phe Asp Ser Lys Lys Val Thr Tyr Ser Ile
65 70 75 80
Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln
85 90 95
Ile Lys Ser Glu Pro Gly Asn Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Ala Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 98
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体单链Fv片段
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Leu Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg
145 150 155 160
Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp
165 170 175
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val
180 185 190
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val
210 215 220
Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 99
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链CDR1
<400> 99
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu
1 5
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链CDR2
<400> 100
Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr
1 5
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链CDR3
<400> 101
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链CDR1
<400> 102
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链CDR3
<400> 103
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 104
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链可变区
<400> 104
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 105
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链可变区
<400> 105
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Leu Val Ser Ser
115
<210> 106
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链可变区
<400> 106
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 107
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 108
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链
<400> 108
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Leu Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 109
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链
<400> 109
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链CDR1
<400> 110
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Asn Ala
1 5
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链CDR2
<400> 111
Ile Arg Asn Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链CDR3
<400> 112
Val Ala Gly Asn Ser Phe Ala Tyr
1 5
<210> 113
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链CDR1
<400> 113
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链CDR3
<400> 114
Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 115
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链可变区
<400> 115
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Asn
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Asn Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Ala Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser
115
<210> 116
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链可变区
<400> 116
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 117
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链CDR1
<400> 117
Tyr Phe Asp Phe Asp Ser Tyr Glu
1 5
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链CDR2
<400> 118
Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链CDR3
<400> 119
Ala Arg Val Asn Met Asp Arg Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 120
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链可变区
<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Phe Asp Phe Asp Ser Tyr
20 25 30
Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Asn Met Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ser
115
<210> 121
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链CDR1
<400> 121
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链CDR2
<400> 122
Ile Gln Lys Gln Gly Leu Pro Thr
1 5
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链CDR3
<400> 123
Ala Lys Asn Arg Ala Lys Phe Asp Tyr
1 5
<210> 124
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链CDR1
<400> 124
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链CDR3
<400> 125
Gln Gln Asn Arg Gly Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 126
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链可变区
<400> 126
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Gln Lys Gln Gly Leu Pro Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Arg Ala Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 127
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链可变区
<400> 127
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Ser Met Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Arg Gly Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 128
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链可变区
<400> 128
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Met Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Arg Gly Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 129
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点
<400> 129
Ile Glu Gly Arg
1
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合肽
<400> 130
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 131
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合肽
<400> 131
Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
1 5 10 15
Leu Gly Ser His His His His His His His His His His
20 25
<210> 132
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和标签
<400> 132
caccaccatc atcaccacca tcaccatcac 30
<210> 133
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和标签
<400> 133
gagcagaagc tgatctctga ggaagatctg 30
<210> 134
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 134
ggaggcggag gatctggtgg tggtggatct ggcggcggag gtagc 45
<210> 135
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 135
ggaggcggag gatct 15
<210> 136
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 136
ggaggcggag gatctggtgg tggtggatct ggcggcggag gtagcggagg cggaggatct 60
<210> 137
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 137
ggaggcggag gatctggtgg tggtggatct ggcggcggag gtagcggagg cggaggatct 60
ggtggtggtg gatct 75
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 138
ggaggttctg gcggtgctcc t 21
<210> 139
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 139
ggctctccta cacctactcc taccacacct acaccaacac ctaca 45
<210> 140
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 140
gccgaggccg ctgccaagga ggccgctgca aaggaggccg ctgcaaaggc c 51
<210> 141
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多聚化结构域
<400> 141
ggagttagac tgtgggctac cagacaggct atgctcggac aggtgcacga agtgcctgaa 60
ggctggctga tcttcgtggc cgagcaagag gaactgtacg tgcgggtgca gaacggcttc 120
agaaaggtgc agctggaagc tagaacccct ctc 153
<210> 142
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多聚化结构域
<400> 142
aaacctctgg atggcgagta cttcacactg cagatccggg gcagagaacg cttcgagatg 60
ttcagagagc tgaacgaggc cctggaactg aaggatgccc aggccggaaa agaaccc 117
<210> 143
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多聚化结构域
<400> 143
agactgaagc agatcgagga caagctggaa gagatcctgt ccaagctgta ccacatcgag 60
aacgagctgg cccggatcaa gaagctgctg ggcgaacga 99
<210> 144
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 144
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggtagcg gagttagact gtgggctacc 600
agacaggcta tgctcggaca ggtgcacgaa gtgcctgaag gctggctgat cttcgtggcc 660
gagcaagagg aactgtacgt gcgggtgcag aacggcttca gaaaggtgca gctggaagct 720
agaacccctc tc 732
<210> 145
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 145
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gagttagact gtgggctacc agacaggcta tgctcggaca ggtgcacgaa 600
gtgcctgaag gctggctgat cttcgtggcc gagcaagagg aactgtacgt gcgggtgcag 660
aacggcttca gaaaggtgca gctggaagct agaacccctc tc 702
<210> 146
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 146
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggtagcg gaggcggagg atctggtggt 600
ggtggatctg gagttagact gtgggctacc agacaggcta tgctcggaca ggtgcacgaa 660
gtgcctgaag gctggctgat cttcgtggcc gagcaagagg aactgtacgt gcgggtgcag 720
aacggcttca gaaaggtgca gctggaagct agaacccctc tc 762
<210> 147
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 147
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggctct 540
cctacaccta ctcctaccac acctacacca acacctacag gagttagact gtgggctacc 600
agacaggcta tgctcggaca ggtgcacgaa gtgcctgaag gctggctgat cttcgtggcc 660
gagcaagagg aactgtacgt gcgggtgcag aacggcttca gaaaggtgca gctggaagct 720
agaacccctc tc 732
<210> 148
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 148
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcgccgag 540
gccgctgcca aggaggccgc tgcaaaggag gccgctgcaa aggccggagt tagactgtgg 600
gctaccagac aggctatgct cggacaggtg cacgaagtgc ctgaaggctg gctgatcttc 660
gtggccgagc aagaggaact gtacgtgcgg gtgcagaacg gcttcagaaa ggtgcagctg 720
gaagctagaa cccctctc 738
<210> 149
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 149
ggagttagac tgtgggctac cagacaggct atgctcggac aggtgcacga agtgcctgaa 60
ggctggctga tcttcgtggc cgagcaagag gaactgtacg tgcgggtgca gaacggcttc 120
agaaaggtgc agctggaagc tagaacccct ctcggaggcg gaggatctgg tggtggtgga 180
tctggcggcg gaggtagcca ggactccacc tctgatctga tccctgctcc tccactgtcc 240
aaggtgccac tgcagcagaa cttccaggac aaccagttcc acggcaagtg gtacgtcgtc 300
ggccaggccg gaaacatcag actgagagag gacaaggacc ccatcaagat gatggctacc 360
atctacgagc tgaaagagga taagtcctac gacgtcacca tggtcaagtt cgacgacaaa 420
aagtgtatgt acgacatctg gaccttcgtg cccggctctc agcctggcga gtttaccctg 480
ggcaagatca agagcttccc cggccacacc tcttctctcg tgcgtgtggt gtccaccaac 540
tacaaccagc acgccatggt gttcttcaag ttcgtgttcc agaaccggga agagttctac 600
atcaccctgt acggccggac caaagagctg acctccgaac tgaaagagaa cttcatccgg 660
ttctccaaga gcctgggcct gcctgagaac cacatcgtgt tccctgtgcc tatcgaccag 720
tgcatcgatg gc 732
<210> 150
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 150
ggagttagac tgtgggctac cagacaggct atgctcggac aggtgcacga agtgcctgaa 60
ggctggctga tcttcgtggc cgagcaagag gaactgtacg tgcgggtgca gaacggcttc 120
agaaaggtgc agctggaagc tagaacccct ctcggaggcg gaggatctca ggactccacc 180
tctgatctga tccctgctcc tccactgtcc aaggtgccac tgcagcagaa cttccaggac 240
aaccagttcc acggcaagtg gtacgtcgtc ggccaggccg gaaacatcag actgagagag 300
gacaaggacc ccatcaagat gatggctacc atctacgagc tgaaagagga taagtcctac 360
gacgtcacca tggtcaagtt cgacgacaaa aagtgtatgt acgacatctg gaccttcgtg 420
cccggctctc agcctggcga gtttaccctg ggcaagatca agagcttccc cggccacacc 480
tcttctctcg tgcgtgtggt gtccaccaac tacaaccagc acgccatggt gttcttcaag 540
ttcgtgttcc agaaccggga agagttctac atcaccctgt acggccggac caaagagctg 600
acctccgaac tgaaagagaa cttcatccgg ttctccaaga gcctgggcct gcctgagaac 660
cacatcgtgt tccctgtgcc tatcgaccag tgcatcgatg gc 702
<210> 151
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 151
ggagttagac tgtgggctac cagacaggct atgctcggac aggtgcacga agtgcctgaa 60
ggctggctga tcttcgtggc cgagcaagag gaactgtacg tgcgggtgca gaacggcttc 120
agaaaggtgc agctggaagc tagaacccct ctcggaggcg gaggatctgg tggtggtgga 180
tctggcggcg gaggtagcgg aggcggagga tctggtggtg gtggatctca ggactccacc 240
tctgatctga tccctgctcc tccactgtcc aaggtgccac tgcagcagaa cttccaggac 300
aaccagttcc acggcaagtg gtacgtcgtc ggccaggccg gaaacatcag actgagagag 360
gacaaggacc ccatcaagat gatggctacc atctacgagc tgaaagagga taagtcctac 420
gacgtcacca tggtcaagtt cgacgacaaa aagtgtatgt acgacatctg gaccttcgtg 480
cccggctctc agcctggcga gtttaccctg ggcaagatca agagcttccc cggccacacc 540
tcttctctcg tgcgtgtggt gtccaccaac tacaaccagc acgccatggt gttcttcaag 600
ttcgtgttcc agaaccggga agagttctac atcaccctgt acggccggac caaagagctg 660
acctccgaac tgaaagagaa cttcatccgg ttctccaaga gcctgggcct gcctgagaac 720
cacatcgtgt tccctgtgcc tatcgaccag tgcatcgatg gc 762
<210> 152
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 152
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggtagca gactgaagca gatcgaggac 600
aagctggaag agatcctgtc caagctgtac cacatcgaga acgagctggc ccggatcaag 660
aagctgctgg gcgaacga 678
<210> 153
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 153
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggtagca aacctctgga tggcgagtac 600
ttcacactgc agatccgggg cagagaacgc ttcgagatgt tcagagagct gaacgaggcc 660
ctggaactga aggatgccca ggccggaaaa gaaccc 696
<210> 154
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 154
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggtagcg gagttagact gtgggctacc 600
agacaggcta tgctcggaca ggtgcacgaa gtgcctgaag gctggctgat cttcgtggcc 660
gagcaagagg aactgtacgt gcgggtgcag aacggcttca gaaaggtgca gctggaagct 720
agaacccctc tcggaggcgg aggatctggt ggtggtggat ctggcggcgg aggtagccag 780
gactccacct ctgatctgat ccctgctcct ccactgtcca aggtgccact gcagcagaac 840
ttccaggaca accagttcca cggcaagtgg tacgtcgtcg gccaggccgg aaacatcaga 900
ctgagagagg acaaggaccc catcaagatg atggctacca tctacgagct gaaagaggat 960
aagtcctacg acgtcaccat ggtcaagttc gacgacaaaa agtgtatgta cgacatctgg 1020
accttcgtgc ccggctctca gcctggcgag tttaccctgg gcaagatcaa gagcttcccc 1080
ggccacacct cttctctcgt gcgtgtggtg tccaccaact acaaccagca cgccatggtg 1140
ttcttcaagt tcgtgttcca gaaccgggaa gagttctaca tcaccctgta cggccggacc 1200
aaagagctga cctccgaact gaaagagaac ttcatccggt tctccaagag cctgggcctg 1260
cctgagaacc acatcgtgtt ccctgtgcct atcgaccagt gcatcgatgg c 1311
<210> 155
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 155
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gagttagact gtgggctacc agacaggcta tgctcggaca ggtgcacgaa 600
gtgcctgaag gctggctgat cttcgtggcc gagcaagagg aactgtacgt gcgggtgcag 660
aacggcttca gaaaggtgca gctggaagct agaacccctc tcggaggcgg aggatctggt 720
ggtggtggat ctggcggcgg aggtagccag gactccacct ctgatctgat ccctgctcct 780
ccactgtcca aggtgccact gcagcagaac ttccaggaca accagttcca cggcaagtgg 840
tacgtcgtcg gccaggccgg aaacatcaga ctgagagagg acaaggaccc catcaagatg 900
atggctacca tctacgagct gaaagaggat aagtcctacg acgtcaccat ggtcaagttc 960
gacgacaaaa agtgtatgta cgacatctgg accttcgtgc ccggctctca gcctggcgag 1020
tttaccctgg gcaagatcaa gagcttcccc ggccacacct cttctctcgt gcgtgtggtg 1080
tccaccaact acaaccagca cgccatggtg ttcttcaagt tcgtgttcca gaaccgggaa 1140
gagttctaca tcaccctgta cggccggacc aaagagctga cctccgaact gaaagagaac 1200
ttcatccggt tctccaagag cctgggcctg cctgagaacc acatcgtgtt ccctgtgcct 1260
atcgaccagt gcatcgatgg c 1281
<210> 156
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 156
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggtagcg gaggcggagg atctggtggt 600
ggtggatctg gagttagact gtgggctacc agacaggcta tgctcggaca ggtgcacgaa 660
gtgcctgaag gctggctgat cttcgtggcc gagcaagagg aactgtacgt gcgggtgcag 720
aacggcttca gaaaggtgca gctggaagct agaacccctc tcggaggcgg aggatctggt 780
ggtggtggat ctggcggcgg aggtagccag gactccacct ctgatctgat ccctgctcct 840
ccactgtcca aggtgccact gcagcagaac ttccaggaca accagttcca cggcaagtgg 900
tacgtcgtcg gccaggccgg aaacatcaga ctgagagagg acaaggaccc catcaagatg 960
atggctacca tctacgagct gaaagaggat aagtcctacg acgtcaccat ggtcaagttc 1020
gacgacaaaa agtgtatgta cgacatctgg accttcgtgc ccggctctca gcctggcgag 1080
tttaccctgg gcaagatcaa gagcttcccc ggccacacct cttctctcgt gcgtgtggtg 1140
tccaccaact acaaccagca cgccatggtg ttcttcaagt tcgtgttcca gaaccgggaa 1200
gagttctaca tcaccctgta cggccggacc aaagagctga cctccgaact gaaagagaac 1260
ttcatccggt tctccaagag cctgggcctg cctgagaacc acatcgtgtt ccctgtgcct 1320
atcgaccagt gcatcgatgg c 1341
<210> 157
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 157
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcgccgag 540
gccgctgcca aggaggccgc tgcaaaggag gccgctgcaa aggccggagt tagactgtgg 600
gctaccagac aggctatgct cggacaggtg cacgaagtgc ctgaaggctg gctgatcttc 660
gtggccgagc aagaggaact gtacgtgcgg gtgcagaacg gcttcagaaa ggtgcagctg 720
gaagctagaa cccctctcgg aggcggagga tctggtggtg gtggatctgg cggcggaggt 780
agccaggact ccacctctga tctgatccct gctcctccac tgtccaaggt gccactgcag 840
cagaacttcc aggacaacca gttccacggc aagtggtacg tcgtcggcca ggccggaaac 900
atcagactga gagaggacaa ggaccccatc aagatgatgg ctaccatcta cgagctgaaa 960
gaggataagt cctacgacgt caccatggtc aagttcgacg acaaaaagtg tatgtacgac 1020
atctggacct tcgtgcccgg ctctcagcct ggcgagttta ccctgggcaa gatcaagagc 1080
ttccccggcc acacctcttc tctcgtgcgt gtggtgtcca ccaactacaa ccagcacgcc 1140
atggtgttct tcaagttcgt gttccagaac cgggaagagt tctacatcac cctgtacggc 1200
cggaccaaag agctgacctc cgaactgaaa gagaacttca tccggttctc caagagcctg 1260
ggcctgcctg agaaccacat cgtgttccct gtgcctatcg accagtgcat cgatggc 1317
<210> 158
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 158
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggtagcc aggactccac ctctgatctg 600
atccctgctc ctccactgtc caaggtgcca ctgcagcaga acttccagga caaccagttc 660
cacggcaagt ggtacgtcgt cggccaggcc ggaaacatca gactgagaga ggacaaggac 720
cccatcaaga tgatggctac catctacgag ctgaaagagg ataagtccta cgacgtcacc 780
atggtcaagt tcgacgacaa aaagtgtatg tacgacatct ggaccttcgt gcccggctct 840
cagcctggcg agtttaccct gggcaagatc aagagcttcc ccggccacac ctcttctctc 900
gtgcgtgtgg tgtccaccaa ctacaaccag cacgccatgg tgttcttcaa gttcgtgttc 960
cagaaccggg aagagttcta catcaccctg tacggccgga ccaaagagct gacctccgaa 1020
ctgaaagaga acttcatccg gttctccaag agcctgggcc tgcctgagaa ccacatcgtg 1080
ttccctgtgc ctatcgacca gtgcatcgat ggcggaggcg gaggatctgg tggtggtgga 1140
tctggcggcg gaggtagcgg agttagactg tgggctacca gacaggctat gctcggacag 1200
gtgcacgaag tgcctgaagg ctggctgatc ttcgtggccg agcaagagga actgtacgtg 1260
cgggtgcaga acggcttcag aaaggtgcag ctggaagcta gaacccctct c 1311
<210> 159
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 159
ggagttagac tgtgggctac cagacaggct atgctcggac aggtgcacga agtgcctgaa 60
ggctggctga tcttcgtggc cgagcaagag gaactgtacg tgcgggtgca gaacggcttc 120
agaaaggtgc agctggaagc tagaacccct ctcggaggcg gaggatctgg tggtggtgga 180
tctggcggcg gaggtagcca ggactccacc tctgatctga tccctgctcc tccactgtcc 240
aaggtgccac tgcagcagaa cttccaggac aaccagttcc acggcaagtg gtacgtcgtc 300
ggccaggccg gaaacatcag actgagagag gacaaggacc ccatcaagat gatggctacc 360
atctacgagc tgaaagagga taagtcctac gacgtcacca tggtcaagtt cgacgacaaa 420
aagtgtatgt acgacatctg gaccttcgtg cccggctctc agcctggcga gtttaccctg 480
ggcaagatca agagcttccc cggccacacc tcttctctcg tgcgtgtggt gtccaccaac 540
tacaaccagc acgccatggt gttcttcaag ttcgtgttcc agaaccggga agagttctac 600
atcaccctgt acggccggac caaagagctg acctccgaac tgaaagagaa cttcatccgg 660
ttctccaaga gcctgggcct gcctgagaac cacatcgtgt tccctgtgcc tatcgaccag 720
tgcatcgatg gcggaggcgg aggatctggt ggtggtggat ctggcggcgg aggtagccag 780
gactccacct ctgatctgat ccctgctcct ccactgtcca aggtgccact gcagcagaac 840
ttccaggaca accagttcca cggcaagtgg tacgtcgtcg gccaggccgg aaacatcaga 900
ctgagagagg acaaggaccc catcaagatg atggctacca tctacgagct gaaagaggat 960
aagtcctacg acgtcaccat ggtcaagttc gacgacaaaa agtgtatgta cgacatctgg 1020
accttcgtgc ccggctctca gcctggcgag tttaccctgg gcaagatcaa gagcttcccc 1080
ggccacacct cttctctcgt gcgtgtggtg tccaccaact acaaccagca cgccatggtg 1140
ttcttcaagt tcgtgttcca gaaccgggaa gagttctaca tcaccctgta cggccggacc 1200
aaagagctga cctccgaact gaaagagaac ttcatccggt tctccaagag cctgggcctg 1260
cctgagaacc acatcgtgtt ccctgtgcct atcgaccagt gcatcgatgg c 1311
<210> 160
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 160
caggttcagc tggtacagtc tggcgctgaa gtgaagaaac ctggggctag tgtgaaagtc 60
agctgtaagg ctagcgggta cacctttacc gactacgaga tgcactgggt taggcaagca 120
cctggacaag gcctggaatg gatgggtgct cttgacccca aaaccggaga tacagcctat 180
tcccagaagt tcaagggcag agtcactctg acagccgaca agtccacatc taccgcctat 240
atggagctca gctcactgac gtcagaggat acagccgtgt actactgcac tcggttctat 300
tcctacacct attggggaca gggcactctc gtgactctcg tgtctagtgg aggcggagga 360
tctggtggtg gtggatctgg cggcggaggt agcggaggcg gaggatctga tgtcgtgatg 420
acacagagtc ctctctctct gccagtgaca cctggagaac ctgccagcat tagctgcaga 480
agttcccagt cccttgtgca ctctaaccgc aatacctatc tgcactggta tctgcagaaa 540
cccggacagt caccccaact gctgatctac aaggtgtcta accggttttc cggagttccc 600
gatcgattca gcggttcagg ctctggtaca gacttcaccc tcaagatctc cagggtcgaa 660
gctgaggacg taggcgtgta ctactgtagc cagaatacgc atgtcccacc cacttttggg 720
caaggcacca aactggagat aaagggaggc ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc 780
ggaggtagcg gagttagact gtgggctacc agacaggcta tgctcggaca ggtgcacgaa 840
gtgcctgaag gctggctgat cttcgtggcc gagcaagagg aactgtacgt gcgggtgcag 900
aacggcttca gaaaggtgca gctggaagct agaacccctc tcggaggcgg aggatctggt 960
ggtggtggat ctggcggcgg aggtagccag gactccacct ctgatctgat ccctgctcct 1020
ccactgtcca aggtgccact gcagcagaac ttccaggaca accagttcca cggcaagtgg 1080
tacgtcgtcg gccaggccgg aaacatcaga ctgagagagg acaaggaccc catcaagatg 1140
atggctacca tctacgagct gaaagaggat aagtcctacg acgtcaccat ggtcaagttc 1200
gacgacaaaa agtgtatgta cgacatctgg accttcgtgc ccggctctca gcctggcgag 1260
tttaccctgg gcaagatcaa gagcttcccc ggccacacct cttctctcgt gcgtgtggtg 1320
tccaccaact acaaccagca cgccatggtg ttcttcaagt tcgtgttcca gaaccgggaa 1380
gagttctaca tcaccctgta cggccggacc aaagagctga cctccgaact gaaagagaac 1440
ttcatccggt tctccaagag cctgggcctg cctgagaacc acatcgtgtt ccctgtgcct 1500
atcgaccagt gcatcgatgg c 1521
<210> 161
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 161
caggactcca cctccgatct gattccagct cctccactgt ccaaggtgcc cctgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccaaggcaag tggtacgtcg tgggcagagc tggcaatgtg 120
ggcctgagag aggacaagga ccctcctaag atgtgggcca ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtgac caacgttcgc ttcgcccgga agaagtgcac ctactccatc 240
ggcaccttcg tgcctggatc tcagcctggc gagtttaccc tgggccagat caagtctgag 300
cctggcggca cagccaacct cgtcagagtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca aagaggtgta ccagaaccgc gagatcttct tcatcatcct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggtagcg gagttagact gtgggctacc 600
agacaggcta tgctcggaca ggtgcacgaa gtgcctgaag gctggctgat cttcgtggcc 660
gagcaagagg aactgtacgt gcgggtgcag aacggcttca gaaaggtgca gctggaagct 720
agaacccctc tcggaggcgg aggatctggt ggtggtggat ctggcggcgg aggtagccag 780
gactccacct ctgatctgat ccctgctcct ccactgtcca aggtgccact gcagcagaac 840
ttccaggaca accagttcca cggcaagtgg tacgtcgtcg gccaggccgg aaacatcaga 900
ctgagagagg acaaggaccc catcaagatg atggctacca tctacgagct gaaagaggat 960
aagtcctacg acgtcaccat ggtcaagttc gacgacaaaa agtgtatgta cgacatctgg 1020
accttcgtgc ccggctctca gcctggcgag tttaccctgg gcaagatcaa gagcttcccc 1080
ggccacacct cttctctcgt gcgtgtggtg tccaccaact acaaccagca cgccatggtg 1140
ttcttcaagt tcgtgttcca gaaccgggaa gagttctaca tcaccctgta cggccggacc 1200
aaagagctga cctccgaact gaaagagaac ttcatccggt tctccaagag cctgggcctg 1260
cctgagaacc acatcgtgtt ccctgtgcct atcgaccagt gcatcgatgg c 1311
<210> 162
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体单链Fv片段
<400> 162
caggttcagc tggtacagtc tggcgctgaa gtgaagaaac ctggggctag tgtgaaagtc 60
agctgtaagg ctagcgggta cacctttacc gactacgaga tgcactgggt taggcaagca 120
cctggacaag gcctggaatg gatgggtgct cttgacccca aaaccggaga tacagcctat 180
tcccagaagt tcaagggcag agtcactctg acagccgaca agtccacatc taccgcctat 240
atggagctca gctcactgac gtcagaggat acagccgtgt actactgcac tcggttctat 300
tcctacacct attggggaca gggcactctc gtgactctcg tgtctagtgg aggcggagga 360
tctggtggtg gtggatctgg cggcggaggt agcggaggcg gaggatctga tgtcgtgatg 420
acacagagtc ctctctctct gccagtgaca cctggagaac ctgccagcat tagctgcaga 480
agttcccagt cccttgtgca ctctaaccgc aatacctatc tgcactggta tctgcagaaa 540
cccggacagt caccccaact gctgatctac aaggtgtcta accggttttc cggagttccc 600
gatcgattca gcggttcagg ctctggtaca gacttcaccc tcaagatctc cagggtcgaa 660
gctgaggacg taggcgtgta ctactgtagc cagaatacgc atgtcccacc cacttttggg 720
caaggcacca aactggagat aaag 744
<210> 163
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合肽
<400> 163
ggaggttctg gcggtgctcc tgagcagaag ctgatctctg aggaagatct gggctcccac 60
caccatcatc accaccatca ccatcac 87
<210> 164
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 164
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val
195 200 205
His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu
210 215 220
Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala
225 230 235 240
Arg Thr Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu
260 265 270
Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly
275 280 285
Lys Trp Tyr Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp
290 295 300
Lys Asp Pro Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp
305 310 315 320
Lys Ala Tyr Gln Val Thr Gly Val Leu Phe Pro His Lys Lys Cys His
325 330 335
Asp Asp Ile Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile
340 345 350
Leu Gly Trp Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg
355 360 365
Val Val Ser Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp
370 375 380
Val Phe Gln Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr
385 390 395 400
Lys Ala Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys
405 410 415
Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asp His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp
420 425 430
Gln Cys Ile Asp Gly
435
<210> 165
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 165
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
195 200 205
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp
210 215 220
Tyr Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp
225 230 235 240
Pro Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala
245 250 255
Tyr Gln Val Thr Gly Val Leu Phe Pro His Lys Lys Cys His Asp Asp
260 265 270
Ile Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly
275 280 285
Trp Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val
290 295 300
Ser Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe
305 310 315 320
Gln Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Ala
325 330 335
Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu
340 345 350
Gly Leu Pro Glu Asp His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys
355 360 365
Ile Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
370 375 380
Gly Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln
385 390 395 400
Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu
405 410 415
Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu
420 425 430
Ala Arg Thr Pro Leu
435
<210> 166
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 166
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Leu Phe Pro His Lys Lys Cys His Asp Asp Ile
65 70 75 80
Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Ala Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asp His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
195 200 205
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp
210 215 220
Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp
225 230 235 240
Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser
245 250 255
Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp
260 265 270
Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly
275 280 285
Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val
290 295 300
Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe
305 310 315 320
Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu
325 330 335
Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu
340 345 350
Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys
355 360 365
Ile Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
370 375 380
Gly Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln
385 390 395 400
Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu
405 410 415
Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu
420 425 430
Ala Arg Thr Pro Leu
435
<210> 167
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 167
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr
145 150 155 160
Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Phe
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser
180 185 190
Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala
260 265 270
Met Leu Gly Gln Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val
275 280 285
Ala Glu Gln Glu Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys
290 295 300
Val Gln Leu Glu Ala Arg Thr Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
305 310 315 320
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile
325 330 335
Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp
340 345 350
Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile
355 360 365
Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr
370 375 380
Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp
385 390 395 400
Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln
405 410 415
Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr
420 425 430
Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
435 440 445
Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr
450 455 460
Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe
465 470 475 480
Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe
485 490 495
Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
500 505
<210> 168
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 168
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggtagcg gagttagact gtgggctacc 600
agacaggcta tgctcggaca ggtgcacgaa gtgcctgaag gctggctgat cttcgtggcc 660
gagcaagagg aactgtacgt gcgggtgcag aacggcttca gaaaggtgca gctggaagct 720
agaacccctc tcggaggcgg aggatctggt ggtggtggat ctggcggcgg aggtagccag 780
gattctacct ccgatctgat ccccgctcct ccactgtcta aggtgccact gcagcagaac 840
ttccaggact cccagttcca aggcaagtgg tacgtcgtgg gcttcgccgg caactacaga 900
ctgagagagg acaaggaccc cggcaagatg caggccacca tctacgagct gcgcgaggat 960
aaggcctacc aagtgaccgg cgtgctgttc cctcacaaga agtgccacga cgacatcgtg 1020
atcttcgtgc ccggatctca gcccggcgag tttatcctcg gctggatcaa gtctgaccct 1080
ggcatcacct ccgacctcgt cagagtggtg tccaccgact acaaccagca cgccatggtg 1140
ttcttcaaat gggtgttcca gaaccgcgag tggttctaca tcaccctgta cggcaggacc 1200
aaggctctga cctccgagct gaaagagaac ttcatccggt tctccaagag cctgggcctg 1260
cctgaggatc acatcgtgtt ccctgtgcct atcgaccagt gcatcgatgg c 1311
<210> 169
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 169
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggctctc aggattctac ctccgacctg 600
attccagcac ctcctctgag caaagtccct ctgcagcaaa attttcagga ctctcagttt 660
caaggcaagt ggtatgttgt gggcttcgcc ggcaactacc ggctgaggga agataaggat 720
cccggcaaga tgcaggccac aatctacgaa ctccgcgagg ataaggctta ccaagtgacc 780
ggcgtgctgt tccctcacaa gaagtgccac gacgacatcg tgatctttgt gcctggaagc 840
cagccaggcg aattcatcct cggctggatc aagtctgacc ccggcatcac atccgacctc 900
gtcagagtgg tgtctaccga ttacaatcaa catgctatgg tctttttcaa atgggttttc 960
cagaacagag agtggtttta catcacactc tatggccgca caaaggccct gacatccgag 1020
ttgaaagaaa atttcattcg cttcagcaag tccctgggac tgcccgagga tcatattgtg 1080
tttcccgtgc caattgatca gtgtattgat ggcggtggtg gcggtagcgg tggcggtggt 1140
tcaggtggcg gcggttctgg cgttagactg tgggctacaa gacaggccat gctcggacag 1200
gtgcacgaag tgcctgaagg ctggctgatc ttcgtggccg agcaagagga actgtacgtg 1260
cgggtgcaga acggcttcag aaaggtgcag ctggaagcta gaacccctct c 1311
<210> 170
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 170
caggactcca cctctgatct gatccctgct cctccactgt ccaaggtgcc actgcagcag 60
aacttccagg actcccagtt ccaaggcaag tggtacgtcg tgggcttcgc cggcaactac 120
agactgagag aggacaagga ccccggcaag atgcaggcca ccatctacga gctgcgcgag 180
gataaggcct accaagtgac cggcgtgctg ttccctcaca agaagtgcca cgacgacatc 240
gtgatcttcg tgcccggatc tcagcccggc gagtttatcc tcggctggat caagtctgac 300
cctggcatca cctccgacct cgtcagagtg gtgtccaccg actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca aatgggtgtt ccagaaccgc gagtggttct acatcaccct gtacggcagg 420
accaaggctc tgacctccga gctgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgagg atcacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggttctc aggattctac cagcgacctg 600
attcctgcac ctcctctgag caaagtccct ctgcagcaaa attttcagga taaccagttt 660
cacggaaagt ggtatgttgt cggccaggcc ggcaatatcc ggctgaggga agataaggac 720
cctatcaaga tgatggctac aatctacgaa ctgaaagagg ataagagcta cgacgtcacc 780
atggtcaagt tcgacgacaa aaagtgtatg tacgacatct ggacctttgt gcctggcagc 840
cagcctggcg aattcaccct gggaaagatc aagagcttcc ccggccacac ctccagtctt 900
gtgcgtgtgg tgtctaccaa ttacaatcaa catgctatgg tctttttcaa gttcgtgttt 960
cagaacaggg aagagtttta catcacactc tatggccgca ccaaagagct gaccagcgaa 1020
ctcaaagaaa actttatccg cttcagcaag tccctgggac tgcccgagaa ccatattgtg 1080
tttcccgtgc caattgatca gtgtattgat ggcggtggtg gcggtagcgg tggcggtgga 1140
agcggcggtg gcggctctgg tgttagattg tgggctacca gacaggccat gctcggacag 1200
gttcacgaag tgcctgaagg atggctgatc tttgtggccg agcaagagga actgtacgtg 1260
cgggtgcaga acggcttcag aaaggtgcag ctggaagcta gaacccctct c 1311
<210> 171
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 171
caggtccagc tgcaagaatc tggacctggc ctggtcaagc cctccgagac actgtctatc 60
acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120
cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180
cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240
aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300
tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac agtttctagc 360
ggaggcggag gatctggtgg tggtggatct ggcggcggag gtagtggtgg cggaggttct 420
gaaatcgtgc tgacccagtc tcctgacaca ctgagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 480
ctgacctgcc gggccagcca gtctatcggc accaacatcc actggttcca gcagaagcct 540
ggccagtctc caaagctgct gattaagtac gcctccgagt ccatctccgg cgtgccctct 600
agattttctg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaactc cgtggaagcc 660
gaggatgccg ctacctacta ctgccagcag tccaactcct ggccttacac ctttggccag 720
ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggtggt ggtagtggcg gtggcggatc aggtggcggt 780
ggaagcggag ttagactgtg ggctaccaga caggctatgc tcggacaggt gcacgaagtg 840
cctgaaggct ggctgatctt cgtggccgag caagaggaac tgtacgtgcg ggtgcagaac 900
ggcttcagaa aggtgcagct ggaagctaga acccctctcg gaggcggagg atctggtggt 960
ggtggatctg gcggcggagg tagccaggac tccacctctg atctgatccc tgctcctcca 1020
ctgtccaagg tgccactgca gcagaacttc caggacaacc agttccacgg caagtggtac 1080
gtcgtcggcc aggccggaaa catcagactg agagaggaca aggaccccat caagatgatg 1140
gctaccatct acgagctgaa agaggataag tcctacgacg tcaccatggt caagttcgac 1200
gacaaaaagt gtatgtacga catctggacc ttcgtgcccg gctctcagcc tggcgagttt 1260
accctgggca agatcaagag cttccccggc cacacctctt ctctcgtgcg tgtggtgtcc 1320
accaactaca accagcacgc catggtgttc ttcaagttcg tgttccagaa ccgggaagag 1380
ttctacatca ccctgtacgg ccggaccaaa gagctgacct ccgaactgaa agagaacttc 1440
atccggttct ccaagagcct gggcctgcct gagaaccaca tcgtgttccc tgtgcctatc 1500
gaccagtgca tcgatggc 1518
<210> 172
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体片段
<400> 172
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr
145 150 155 160
Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Phe
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser
180 185 190
Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 173
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体片段
<400> 173
caggtccagc tgcaagaatc tggacctggc ctggtcaagc cctccgagac actgtctatc 60
acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120
cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180
cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240
aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300
tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac agtttctagc 360
ggaggcggag gatctggtgg tggtggatct ggcggcggag gtagtggtgg cggaggttct 420
gaaatcgtgc tgacccagtc tcctgacaca ctgagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 480
ctgacctgcc gggccagcca gtctatcggc accaacatcc actggttcca gcagaagcct 540
ggccagtctc caaagctgct gattaagtac gcctccgagt ccatctccgg cgtgccctct 600
agattttctg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaactc cgtggaagcc 660
gaggatgccg ctacctacta ctgccagcag tccaactcct ggccttacac ctttggccag 720
ggcaccaagc tggaaatcaa a 741
<210> 174
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 174
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Trp Asp Cys Asn Gln Pro Ile Phe Asp Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Ile Phe Ile Asp Gly Lys Tyr Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Gln Cys Pro Gly Ile Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 175
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 175
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Gln Lys
1 5 10 15
Ala Met Lys Val Asp Trp Asp Cys Asn Gln Pro Ile Phe Asp Ser Asp
20 25 30
Thr Pro Met Ile Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Ile Phe Ile Asp Gly Lys Tyr Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Thr Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Gln Cys Pro Gly Ile Pro Val Pro Gly Met Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 176
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 176
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Met Lys
1 5 10 15
Ala Met Lys Val Asp Trp Asp Cys Asn Gln Pro Ile Phe Asp Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Ile Phe Ile Asp Gly Lys Tyr Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Gln Cys Pro Gly Ile Pro Val Pro Gly Met Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 177
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 177
Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Lys Val Asp Trp Asp Cys Asn Gln Pro Ile Phe Asp Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Glu
35 40 45
Val Thr Ile Phe Ile Asp Gly Lys Tyr Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Gln Cys Pro Gly Ile Pro Val Pro Gly Met Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala His Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 178
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 178
Ala Thr Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Lys Val Asp Trp Asp Cys Asn Gln Pro Ile Phe Asp Ser Val
20 25 30
Ala Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Ile Phe Ile Asp Gly Lys Tyr Gln Glu Val Ile Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Thr Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Gln Cys Pro Gly Ile Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Ala
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 179
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 179
Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Lys Val Asp Trp Asp Cys Asn Gln Pro Ile Phe Asp Ser Asp
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Ile Phe Ile Asp Gly Lys Tyr Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Gln Cys Pro Gly Ile Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Ser
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 180
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 180
Ala Ser Asp Lys Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Lys Val Asp Trp Asp Cys Asn Gln Pro Ile Phe Asp Ser Asp
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Ile Phe Ile Asp Gly Lys Tyr Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Gln Cys Pro Gly Ile Pro Val Pro Gly Leu Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Met Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 181
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 181
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Arg Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Lys Val Asp Trp Asp Cys Asn Gln Pro Ile Phe Asp Ser Asp
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Ile Phe Ile Asp Gly Lys Tyr Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Gln Cys Pro Gly Ile Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Arg Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Trp
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 182
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 182
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Lys Val Asp Trp Asp Cys Asn Gln Pro Ile Phe Asp Ser Asp
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Ile Phe Ile Asp Gly Lys Tyr Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Gln Cys Pro Gly Ile Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 183
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 183
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Lys Val Asp Trp Asp Cys Asn Gln Pro Ile Phe Asp Ser Asp
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Ile Phe Ile Ser Gly Lys Tyr Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Gln Cys His Gly Ile Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Lys Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 184
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 184
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Lys Val Asp Trp Asp Cys Asn Gln Pro Ile Phe Asp Ser Asp
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Ile Phe Ile Asp Gly Lys Cys Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Gln Cys Pro Gly Ile Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly
145 150
<210> 185
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 185
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Trp Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Gly Val Leu Phe Pro His Lys Lys Cys His Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Val Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 186
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 186
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Trp Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Lys Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Gly Val Leu Phe Pro His Lys Glu Cys His Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Val Thr Leu Val Pro Gly Ile Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 187
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 187
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Trp Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Thr Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Gly Val Pro Phe Pro His Lys Lys Cys His Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Val Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 188
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 188
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Trp Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Glu Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Gly Val Leu Phe Pro His Lys Lys Cys His Tyr Asp Thr
65 70 75 80
Val Thr Phe Val Pro Gly Arg Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Arg Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 189
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 189
Gln Asp Phe Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Trp Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Val Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Gly Val Leu Phe Pro His Lys Lys Cys His Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Val Thr Leu Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Arg Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln Tyr Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Gly Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 190
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 190
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Trp Leu Arg Gly Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Thr Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Arg Ser Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Leu Phe Pro His Lys Glu Cys His Tyr Asp Thr
65 70 75 80
Val Ile Leu Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 191
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 191
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Trp Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Glu Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Arg Phe Pro His Lys Glu Cys His Tyr Asp Thr
65 70 75 80
Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln Tyr Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asp Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 192
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 192
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Gly Val Pro Phe Pro His Lys Lys Cys His Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Val Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 193
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 193
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Pro Phe Pro His Lys Lys Cys His Asp Asp Ile
65 70 75 80
Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Ala Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asp His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 194
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 194
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Leu Phe Pro His Lys Lys Cys His Asp Asp Ile
65 70 75 80
Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Ala Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asp His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 195
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 195
Gln Asp Pro Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Glu Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Pro Phe Pro His Lys Lys Cys His Tyr Asp Thr
65 70 75 80
Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 196
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 196
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Arg Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Pro Phe Pro His Lys Lys Cys His His Asp Thr
65 70 75 80
Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asp His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 197
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 197
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asp Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Pro Phe Pro His Lys Lys Cys His Asp Asp Thr
65 70 75 80
Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asp His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 198
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 198
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Pro Phe Pro His Lys Glu Cys His Tyr Asp Thr
65 70 75 80
Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asp Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 199
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 199
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Glu Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Arg Val Thr Gly Val Pro Phe Pro His Lys Glu Cys His Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Val Val Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Ala Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asp Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asp His Ile Val Phe Pro Ala Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 200
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 200
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Leu Phe Pro His Lys Lys Cys His Asp Asp Ile
65 70 75 80
Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asp His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 201
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 201
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Leu Phe Pro His Lys Lys Cys His Asp Asp Thr
65 70 75 80
Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asp His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 202
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 202
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Pro Phe Pro His Lys Lys Cys His Asp Asp Thr
65 70 75 80
Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asp His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 203
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 203
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Ser Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Phe Ala Gly Asn Tyr Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gly Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Arg Glu Asp Lys Ala Tyr
50 55 60
Gln Val Thr Gly Val Leu Phe Pro His Lys Lys Cys His Asp Asp Ile
65 70 75 80
Val Ile Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Ile Leu Gly Trp
85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ile Thr Ser Asp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asp Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Trp Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Ala Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asp His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val
195 200 205
His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala Glu Gln Glu Glu
210 215 220
Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu Glu Ala
225 230 235 240
Arg Thr Pro Leu
<210> 204
<211> 133
<212> PRT
<213> 人
<400> 204
Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
1 5 10 15
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
20 25 30
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
35 40 45
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn
50 55 60
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
65 70 75 80
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
85 90 95
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
100 105 110
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
115 120 125
Glu Phe Cys Val Leu
130
Claims (73)
1.一种多聚体蛋白，其包含至少三个单体多肽，其中每个单体多肽包含(1)第一4-1BB靶向部分(T1)，和(2)寡聚化部分(O)。
2.根据权利要求1所述的多聚体蛋白，其中所述第一4-1BB靶向部分(T1)在其N末端或C末端经由接头(L)分别融合至所述寡聚化部分(O)的C末端或N末端。
3.根据权利要求1或2所述的多聚体蛋白，其中所述单体多肽包含至少一个另外的靶向部分(T2)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述单体多肽包含另外的靶向部分(T2)，其中所述另外的靶向部分(T2)与所述第一4-1BB靶向部分(T1)串联放置。
5.根据权利要求4所述的多聚体蛋白，其中所述单体多肽具有以下构型中的一者：
a.T1-L’-T2-L-O；
b.T2-L’-T1-L-O；
c.O-L-T1-L’-T2；或
d.O-L-T2-L’-T1
其中L’是与L相同或不同的接头。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述单体多肽包含另外的靶向部分(T2)，其中所述另外的靶向部分(T2)与所述第一4-1BB靶向部分(T1)相比连接至所述寡聚化部分(O)的不同末端。
7.根据权利要求6所述的多聚体蛋白，其中所述单体多肽具有以下构型中的一者：
a.T1-L-O-L’-T2；或
b.T2-L’-O-L-T1
其中L'是与L相同或不同的接头。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是第二4-1BB靶向部分。
9.根据权利要求8所述的多聚体蛋白，其中所述第二4-1BB靶向部分与所述第一4-1BB靶向部分(T1)相同。
10.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是靶向肿瘤相关抗原的部分。
11.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是靶向肿瘤相关抗原的部分并且是脂质运载蛋白突变蛋白。
12.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是靶向肿瘤相关抗原的部分并且是抗体或其抗原结合结构域或衍生物。
13.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是靶向肿瘤相关抗原的部分并且是单链可变片段(scFv)。
14.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是GPC3靶向部分。
15.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是GPC3靶向部分，所述GPC3靶向部分是脂质运载蛋白突变蛋白。
16.根据权利要求15所述的多聚体蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与选自SEQID NOs:74-97的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
17.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是GPC3靶向部分，所述GPC3靶向部分是抗体或其抗原结合结构域或衍生物。
18.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是GPC3靶向部分，所述GPC3靶向部分是单链可变片段(scFv)。
19.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是PD-L1靶向部分。
20.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是PD-L1靶向部分，所述PD-L1靶向部分是单链可变片段(scFv)。
21.根据权利要求20所述的多聚体蛋白，其中所述scFv与示于SEQ IDNO:172的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
22.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是T细胞活化增强靶向部分。
23.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是T细胞活化增强靶向部分，所述T细胞活化增强靶向部分是脂质运载蛋白突变蛋白。
24.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是T细胞活化增强靶向部分，所述T细胞活化增强靶向部分是抗体或其抗原结合结构域或衍生物。
25.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是T细胞活化增强靶向部分，所述T细胞活化增强靶向部分是单链可变片段(scFv)。
26.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是OX40靶向部分。
27.根据权利要求3至7中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述另外的靶向部分(T2)是OX40靶向部分，所述OX40靶向部分是脂质运载蛋白突变蛋白。
28.根据权利要求27所述的多聚体蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与选自SEQID NOs:174-202的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述第一4-1BB靶向部分(T1)是脂质运载蛋白突变蛋白。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述第一4-1BB靶向部分(T1)是脂质运载蛋白突变蛋白，所述脂质运载蛋白突变蛋白与选自SEQ ID NOs:56-71的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述寡聚化部分(O)能够促进三聚化。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述寡聚化部分(O)是胶原的三聚化结构域。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的多聚蛋白质，其中所述寡聚化部分(O)与选自SEQ ID NOs:35-37的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白是三聚体蛋白。
35.根据权利要求1至30和33中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白是四聚体蛋白。
36.根据权利要求2至35中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述接头(L)与选自SEQ IDNOs:12-28的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白与选自SEQID NOs:38-55和164-167的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白包含选自SEQ ID NOs:38-55和164-167的氨基酸序列。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白能够以约0.68nM或更低的表观KD值结合4-1BB。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白能够以比所述单体多肽中包含的靶向4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白的KD值低的表观KD值结合4-1BB。
41.根据权利要求39或40所述的多聚体蛋白，其中通过表面等离子体共振(SPR)来测定所述表观KD值。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白与食蟹猴4-1BB交叉反应。
43.一种核酸分子，其包含编码根据权利要求1至42中任一项所述的多聚体蛋白中包含的单体多肽的核苷酸序列。
44.根据权利要求43所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接至调节序列以允许所述核酸分子的表达。
45.根据权利要求43或44所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含在载体或噬菌粒载体中。
46.根据权利要求43或44中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含在病毒载体、纳米颗粒或脂质体中。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含在宿主细胞的基因组DNA中。
48.一种细胞，其含有根据权利要求43至47中任一项所述的核酸分子和/或表达根据权利要求1至42中任一项所述的多聚体蛋白和/或表达如权利要求1至42中任一项中定义的单体多肽。
49.根据权利要求48所述的细胞，其中所述细胞分泌所述多聚体蛋白和/或所述单体多肽。
50.根据权利要求48所述的细胞，其中所述细胞分泌所述单体多肽。
51.根据权利要求50所述的细胞，其中所述单体多肽在分泌后自组装成多聚体蛋白。
52.根据权利要求48至51中任一项所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。
53.根据权利要求52所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
54.根据权利要求53所述的细胞，其中所述细胞是CD8+T细胞。
55.根据权利要求53所述的细胞，其中所述细胞是CD4+T细胞。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含重组抗原受体。
57.根据权利要求56所述的细胞，其中所述重组抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。
58.根据权利要求56所述的细胞，其中所述重组抗原受体是T细胞受体(TCR)。
59.根据权利要求52至57中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CAR-T细胞。
60.根据权利要求52至59中任一项所述的细胞，其中所述细胞表达4-1BB。
61.根据权利要求52至60中任一项所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
62.一种产生根据权利要求1至42中任一项所述的多聚体蛋白的方法，其中从编码所述多聚体蛋白中包含的单体多肽的核酸开始产生所述多聚体蛋白。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述多聚体蛋白在细菌或真核宿主生物体中产生。
64.根据权利要求1至42中任一项所述的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或根据权利要求48至61中任一项所述的细胞用于诱导T细胞上的4-1BB(和/或任选地OX40)聚簇和活化的用途。
65.根据权利要求1至42中任一项所述的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或根据权利要求48至61中任一项所述的细胞用于共刺激T细胞和/或活化4-1BB(和/或任选地OX40)下游信号传导途径的用途。
66.根据权利要求1至42中任一项所述的多聚体蛋白或包含这样的多聚体蛋白的组合物或根据权利要求48至61中任一项所述的细胞用于在接合表达GPC3或PD-L1的肿瘤细胞时共刺激T细胞的用途。
67.根据权利要求64至66中任一项所述的用途，其中所述T细胞是表达所述多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的T细胞。
68.根据权利要求64至66中任一项所述的用途，其中所述T细胞是不表达所述多聚体蛋白和/或其单体多肽之一的T细胞。
69.一种药物组合物，其包含一种或多种根据权利要求1至42中任一项所述的多聚体蛋白和/或一种或多种根据权利要求48至61中任一项所述的细胞。
70.根据权利要求1至42中任一项所述的多聚体蛋白和/或根据权利要求48至61中任一项所述的细胞，其用于疗法中。
71.根据权利要求70所述用途的多聚体蛋白和/或细胞，其中所述用途是在癌症的治疗中。
72.根据权利要求1至42中任一项所述的多聚体蛋白和/或根据权利要求48至61中任一项所述的细胞，其用于药物的制备中。
73.根据权利要求72所述的用途，其中所述药物用于治疗癌症。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20178414.7 | 2020-06-05 | ||
| EP20178414 | 2020-06-05 | ||
| EP20178721 | 2020-06-08 | ||
| EP20178721.5 | 2020-06-08 | ||
| PCT/EP2021/065020 WO2021245240A1 (en) | 2020-06-05 | 2021-06-04 | Multimeric immunomodulator targeting 4-1bb |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116249709A true CN116249709A (zh) | 2023-06-09 |
Family
ID=76624002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202180056934.5A Pending CN116249709A (zh) | 2020-06-05 | 2021-06-04 | 靶向4-1bb的多聚体免疫调节剂 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230227568A1 (zh) |
| EP (1) | EP4161957A1 (zh) |
| JP (1) | JP2023527908A (zh) |
| KR (1) | KR20230020443A (zh) |
| CN (1) | CN116249709A (zh) |
| AU (1) | AU2021285201A1 (zh) |
| CA (1) | CA3177098A1 (zh) |
| WO (1) | WO2021245240A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2020253034A1 (en) * | 2019-03-29 | 2021-08-19 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Inhaled administration of lipocalin muteins |
Family Cites Families (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| JPH01215289A (ja) | 1988-02-22 | 1989-08-29 | Toa Nenryo Kogyo Kk | 遺伝子組換えによる正常ヒト血清アルブミンａの製造方法 |
| FR2649991B2 (fr) | 1988-08-05 | 1994-03-04 | Rhone Poulenc Sante | Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces |
| DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
| ATE207080T1 (de) | 1991-11-25 | 2001-11-15 | Enzon Inc | Multivalente antigen-bindende proteine |
| US5728553A (en) | 1992-09-23 | 1998-03-17 | Delta Biotechnology Limited | High purity albumin and method of producing |
| US6080560A (en) | 1994-07-25 | 2000-06-27 | Monsanto Company | Method for producing antibodies in plant cells |
| US5908621A (en) | 1995-11-02 | 1999-06-01 | Schering Corporation | Polyethylene glycol modified interferon therapy |
| US6620413B1 (en) | 1995-12-27 | 2003-09-16 | Genentech, Inc. | OB protein-polymer chimeras |
| DE19742706B4 (de) | 1997-09-26 | 2013-07-25 | Pieris Proteolab Ag | Lipocalinmuteine |
| GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
| CA2233725A1 (en) | 1998-03-31 | 1999-09-30 | Hemosol Inc. | Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes |
| IL139786A0 (en) | 1998-06-08 | 2002-02-10 | Hoffmann La Roche | Use of peg-ifn-alpha and ribavirin for the treatment of chronic hepatitis c |
| US6403564B1 (en) | 1998-10-16 | 2002-06-11 | Schering Corporation | Ribavirin-interferon alfa combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic hepatitis C infection |
| US7211395B2 (en) | 2001-03-09 | 2007-05-01 | Dyax Corp. | Serum albumin binding moieties |
| AU2003275958A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-03-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of tear lipocalin |
| US7288638B2 (en) | 2003-10-10 | 2007-10-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Fully human antibodies against human 4-1BB |
| ES2325344B1 (es) | 2004-11-02 | 2010-06-09 | Univ Madrid Autonoma | Inhibidores de angiogenesis multifuncionales y multivalentes. |
| WO2006056464A2 (en) | 2004-11-26 | 2006-06-01 | Pieris Ag | Compound with affinity for the cytotoxic t lymphocyte-associated antigen (ctla-4) |
| AU2006294644A1 (en) | 2005-09-27 | 2007-04-05 | Amunix, Inc. | Proteinaceous pharmaceuticals and uses thereof |
| US10183986B2 (en) | 2005-12-15 | 2019-01-22 | Industrial Technology Research Institute | Trimeric collagen scaffold antibodies |
| CA2713557C (en) | 2008-01-30 | 2016-06-07 | Pieris Ag | Muteins of tear lipocalin having affinity to human c-met receptor tyrosine kinase and methods for obtaining the same |
| EP2420253A1 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-22 | Leadartis, S.L. | Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain |
| ES2701445T3 (es) | 2010-10-15 | 2019-02-22 | Leadartis S L | Generación de complejos polipeptídicos multifuncionales y multivalentes mediante el dominio de trimerización del colágeno XVIII |
| US9260492B2 (en) | 2010-11-15 | 2016-02-16 | Pieris Ag | Muteins of human lipocalin 2 with affinity for glypican-3 (GPC-3) |
| DK2646552T3 (en) | 2010-12-02 | 2017-10-23 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | MUTEINES OF HUMAN LIPOCALIN 2 WITH AFFINITY FOR CTLA-4 |
| WO2012136685A1 (en) | 2011-04-04 | 2012-10-11 | Pieris Ag | Methods and compositions for anti-vegf and anti-c-met therapy |
| US9522940B2 (en) | 2012-05-23 | 2016-12-20 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Lipocalin muteins with binding-affinity for glypican-3 (GPC-3) and use of lipocalin muteins for target-specific delivery to cells expressing GPC-3 |
| US11382963B2 (en) | 2015-01-12 | 2022-07-12 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Engineered T cells and uses therefor |
| WO2016120307A1 (en) | 2015-01-28 | 2016-08-04 | Pieris Ag | Novel proteins specific for angiogenesis |
| KR20170142200A (ko) | 2015-05-04 | 2017-12-27 | 피어이스 파마슈티컬즈 게엠베하 | Cd137에 특이적인 신규한 단백질 |
| MX2017014730A (es) | 2015-05-18 | 2018-06-28 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Muteinas de lipocalina 2 humana con afinidad por glipicano-3 (gpc3). |
| MX2018000447A (es) | 2015-07-15 | 2018-08-15 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Novedosas proteinas especificas para lag-3. |
| EP3487298A4 (en) * | 2016-07-20 | 2020-03-11 | IGM Biosciences, Inc. | MOLECULES FIXING PDK137 / 4 AND USES THEREOF |
| WO2018087108A1 (en) | 2016-11-09 | 2018-05-17 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Proteins specific for cd137 |
| US11168119B2 (en) | 2017-01-18 | 2021-11-09 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Lipocalin muteins with binding affinity for LAG-3 |
| SI3830120T1 (sl) | 2018-07-31 | 2023-10-30 | Pieris Pharmaceuticals GbmH | Novi fuzijski protein, specifičen za CD137 in PD-L1 |
-
2021
- 2021-06-04 EP EP21734764.0A patent/EP4161957A1/en active Pending
- 2021-06-04 CA CA3177098A patent/CA3177098A1/en active Pending
- 2021-06-04 KR KR1020227046125A patent/KR20230020443A/ko unknown
- 2021-06-04 US US18/000,651 patent/US20230227568A1/en active Pending
- 2021-06-04 CN CN202180056934.5A patent/CN116249709A/zh active Pending
- 2021-06-04 JP JP2022574395A patent/JP2023527908A/ja active Pending
- 2021-06-04 WO PCT/EP2021/065020 patent/WO2021245240A1/en active Application Filing
- 2021-06-04 AU AU2021285201A patent/AU2021285201A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2023527908A (ja) | 2023-06-30 |
| AU2021285201A1 (en) | 2022-11-24 |
| WO2021245240A1 (en) | 2021-12-09 |
| KR20230020443A (ko) | 2023-02-10 |
| CA3177098A1 (en) | 2021-12-09 |
| US20230227568A1 (en) | 2023-07-20 |
| EP4161957A1 (en) | 2023-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210198380A1 (en) | Anti-cancer fusion polypeptide | |
| JP6947642B2 (ja) | 抗がん性融合ポリペプチド | |
| JP6884708B2 (ja) | Ｃｄ１３７に特異的なタンパク質 | |
| JP7482488B2 (ja) | Ｃｄ１３７とｐｄ－ｌ１に特異的な新規融合タンパク質 | |
| JP7476219B2 (ja) | Ｃｄ１３７およびｇｐｃ３に特異的な新規融合タンパク質 | |
| RU2628699C2 (ru) | Trail r2-специфические мультимерные скаффолды | |
| WO2018087108A1 (en) | Proteins specific for cd137 | |
| CN116249709A (zh) | 靶向4-1bb的多聚体免疫调节剂 | |
| TWI837156B (zh) | 新穎的cd137及pd-l1特異性融合蛋白 | |
| RU2814653C2 (ru) | Новые слитые белки, специфические в отношении cd137 и gpc3 | |
| RU2818349C2 (ru) | Новый слитый белок, специфичный для cd137 и pd-l1 | |
| WO2024064713A1 (en) | Novel fusion protein specific for cd137 and cd228 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |