KR20130054953A - 간질성 폐 질환을 치료하기 위한 인자 ｘｉｉ 억제제 - Google Patents

간질성 폐 질환을 치료하기 위한 인자 ｘｉｉ 억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 유효량의 응고 인자 XII의 억제제를 개체에 투여함을 포함하는, 간질성 폐 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 상기 치료를 위한 용도 및 약제학적 키트를 제공한다.

Description

간질성 폐 질환을 치료하기 위한 인자 ＸＩＩ 억제제{FACTOR XII INHIBITORS FOR TREATING INTERSTITIAL LUNG DISEASE}
본 발명은 특발성 폐 섬유증과 같은 섬유증식성 간질성 폐 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한 인자 XII 및/또는 인자 XIIa의 세포 활성의 비-내인성 억제제의 용도에 관한 것이다.
산재성 실질 폐 질환(diffuse parenchymal lung disease)(DPLD)으로서도 공지되어 있는 간질성 폐 질환(ILD)은 간질(폐의 기낭 주변의 조직 및 공간)에 영향을 미치는 폐 질환 그룹을 나타낸다. 이것은 폐포 상피, 폐 모세혈관 내피, 기저막, 혈관주위 및 림프주위 조직과 관련된다. 특발성 폐 섬유증(IPF)은 폐에 제한되고, 통상적인 간질성 폐렴(UIP)의 조직학적 패턴과 관련된 원인불명의 독특한 유형의 만성 섬유화 간질성 폐렴으로서 정의된다. IPF 폐는 구조적 파괴, 즉, 봉와상 및 산재된 섬유아세포 병소(집중적인 섬유아세포 증식 영역)를 갖는 밀집된 반흔을 특징으로 한다. IPF는 진단 후 평균 생존율이 2 내지 3년인 진행성이고 통상 치명적인 과정을 갖는다. IPF를 앓는 환자는 통상 50세 내지 70세이고, 발병률은 연간 여성의 경우 100,000명당 7.4건이고 남성의 경우 100,000명당 10.7건이다. 상기 발병률, 유병률 및 사망은 연령과 함께 증가한다. 지금까지, 대부분의 치료 전략은 염증성 성분을 제거하거나 억제하는데 근거하고 있다. 어떠한 약리학적 치료요법도 IPF 치료에 효과적인 것으로 입증되지 않았다. IPF에서 현재 가용한 모든 치료학적 시도는 질환 병인에 대한 명백한 이해가 부족하여 매우 제한되어 있다. IPF의 발병과정의 본래의 가설은 미지의 병인학적 제제(특발성)에 응답하는 만성 염증이 조직 파괴, 상처 치유 반응의 개시 및 확산을 유발하고, 이어서 진행성 섬유증을 유도한다는 것이다. 최근 보고는 염증이 섬유화 과정의 개시를 유발하는데 필수적이지만 질환의 질행에서는 최소의 역할을 수행함을 나타낸다.
유육종증 및 과민성 폐렴과 같은 다른 형태의 만성 간질성 폐 질환과는 반대로, IPF는 단지 제한된 염증을 특징으로 한다.
최근에, IPF가 주로 폐포 상피 손상, 비정상적 폐포 상처 복구 및 리모델링의 장애인 것으로 제안되었다.
형질전환 성장 인자-β1(TGF-β1)은 고도의 다면발현성 사이토킨이고, 이는 상처 치유, 배아 발육, 및 염증 및 증식과 관련된 질환 상태, 예를 들어, 조직 섬유증에서 기본적인 역할을 수행한다. 성숙한 마우스에서, 폐에서 TGF-β 과발현은 진행성 폐 섬유증을 유도한다. TGF-β는 주로 폐포 상피 세포 증식의 억제, 섬유아세포 증식의 자극, 콜라겐-생산 근섬유아세포로 분화하는 상피 세포를 포함하는 잔류 폐 세포의 활성화로 인해 폐에서 섬유화 반응을 촉진시키는 것으로 사료된다. TGF-β1은 세포외 매트릭스 성분의 합성을 증진시키고 이의 분해를 억제한다. 더욱이, 최근 연구는 TGF-β1이 응고 촉진 및 피브린 용해 활성을 조절함에 의해 섬유화 조건에 기여할 수 있음을 시사한다. 특히, TGF-β1은, 외인성 응고 경로의 주요 개시제인 조직 인자의 발현 및 섬유아세포를 포함하는 상이한 세포 집단에서 플라스미노겐 활성인자 억제제(PAI)-1의 발현을 상향조절하는 것으로 나타났다.
TGF-β1에 대한 세포 반응은 TGF-β 수용체 I형(TβR-I)을 인산화하는 TGF-β 수용체 II형(TβR-II)에 결합하는 리간드를 포함한다. 활성화된 TβR-I은 수용체 연합된 Smad(Smad 1, 2, 3, 5, 및 8)를 인산화하여 이들의 통상적인 매개체 Smad(Smad 4)와의 이종이량체화 및 세포질로부터 핵으로의 이동을 촉진시킨다. 핵내에서, Smad 이종-복합체는 표적 유전자의 표준 smad-결합 요소(SBE)와 상호작용하여 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다. 사람 Smad 3 및 Smad 4는 CAGA 박스를 포함하는 SBE에 결합하는 것으로 나타났다.
폐포 지혈 균형의 변화 및 폐포내 피브린의 과도한 침착이 IPF 환자의 폐에서 관찰되었다. 이들 조건하에 관찰된 폐포내 피브린 축적은 혈장 단백질(피브리노겐 포함)의 폐포 공간으로의 누출과 연계하여 국소적으로 생성된 응고 촉진 및 억제 인자간의 불균형으로부터 발생한다. IPF를 앓는 환자의 기관지폐포 세척(BAL) 유체내 증가된 응고 촉진 활성은 감소된 피브린 용해 활성을 수반한다. 폐포 공간내 동일한 지혈 균형의 변화는 폐 섬유증의 블레오마이신 동물 모델에서 관찰되었다. 임상적 및 실험적 폐 섬유증에서, 응고 촉진 반응은 주로 인자 VIIa와 관련된 조직 인자(TF) 때문일 수 있는 반면, 감소된 피브린 용해 활성은 α2-플라스민 억제제에 의한 플라스민의 차단뿐만 아니라 플라스미노겐 활성인자 억제제(PAI)-1에 의한 우로키나제형(u-PA) 및 조직형(t-PA) 플라스미노겐 활성인자의 억제에 기인한다. 피브린이 복구 과정 및 정상적인 상처 치유에 요구되지만, 혈관외 피브린의 지속적이고 과도한 침착은 여러 방식으로 섬유화 폐 질환의 병리기작에 기여하는 것으로 사료된다. 피브린은 섬유화 촉진 성장 인자의 저장소로서 작용할 수 있다. 이것은 폐포 표면 장력을 낮게 유지하기 위해 중요한 폐 지단백질 복합체인 폐 계면활성제를 통합시키고 불활성화시킨다. 계면활성제의 기능부전은 무기 폐 및 폐 탄성 소실을 유발한다. 더욱이, 피브린에 의한 인접 폐포 벽의 "접착(glueing)"과 연계된 계면활성제 시스템의 불활성화는 섬유아세포가 증식하고 콜라겐을 생성시키는 임시의 매트릭스를 제공하는 것으로 사료된다.
추가로, u-PA/PAI-1 시스템은 세포 이동, 세포 접착 및 세포 증식을 조절함에 의해 폐 섬유증의 발병에 기여할 수 있다. 추가로, 다양한 응고 프로테아제, 예를 들어, 트롬빈, 인자 Xa 및 TF/인자-VIIa 복합체는 폐에서의 섬유화 과정에 또한 기여할 수 있는 세포 활성을 나타낸다. 이들 기능의 대부분은 프로테아제 활성화된 수용체(PAR)의 단백질용해 활성화를 통해 매개된다. 예를 들어, 트롬빈 및 인자 Xa는 PAR-1-의존성 방식으로 섬유아세포 증식 및 프로콜라겐 생산을 자극한다. 추가로, 트롬빈은 PAR-1 활성화를 통해, 정상적인 폐 섬유아세포의 근섬유아세포로의 분화를 유도한다. 추가로, 트롬빈, 인자 Xa 및 TF/인자 VIIa 복합체에 의한 PAR-1 의 활성화는 섬유화촉진 및 염증촉진 사이토킨의 발현을 증가시킬 수 있다. 폐 섬유증에서의 PAR-1의 잠재적인 역할은, PAR-1-결핍 마우스가 블레오마이신-유도된 폐 섬유증으로부터 보호됨을 입증하는 최근 발견으로 인해 강조되고 있다. 폐 섬유증의 발병에서 지혈 인자에 의해 매개되는 세포 효과의 중요성을 강조하는 추가의 증거는 피브리노겐 효과가 없는 마우스에서 블레오마이신-유도된 폐 섬유증으로부터 보호되지 않음을 나타내는 최근 관찰로부터 비롯된다.
발명의 요약
본 발명자들은 놀랍게도, 인자 XII(FXII)가 실험적으로 유도된 폐 손상의 섬유화 단계 동안에 역할을 수행함을 밝혔다. 추가로, 폐 섬유아세포 증식의 FXII-의존성 유도가 ERK1/2 경로의 약리학적 차단 및 FXIIa-특이적 억제에 의해 약화되는 것으로 관찰되었다.
이들 결과는 폐 섬유증의 병리학에서 FXII/FXIIa를 중요한 위치에 자리잡게 했다. 따라서, FXII 활성화 또는 FXIIa 활성을 방해할 수 있고 차단할 수 있는 물질은 폐에서 섬유화 과정 및 이의 임상적 결과를 차단시키는데 적합한데, 즉 상기 물질은 FXII/FXIIa의 세포 활성을 특이적으로 억제함에 의해 폐 섬유아세포 증식을 제한하는데 적합할 수 있다.
제1 양상에서, 본 발명은 특발성 폐 섬유증과 같은 섬유증식성 간질성 폐 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한, 인자 XII 및/또는 인자 XIIa(FXII/FXIIa)의 세포 활성의 비-내인성 억제제에 관한 것이다.
본 발명의 제2 양상은 특발성 폐 섬유증과 같은 섬유증식성 간질성 폐 질환을 치료하고/하거나 예방하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 FXII 및/또는 FXIIa의 세포 활성의 비-내인성 억제제의 약제학적 유효량을 개체에 투여함을 포함한다.
본 발명의 특정 양상에서, 상기 치료법은 간질성 폐 질환을 치료하기 위한 제2 치료제 또는 치료학적 원칙과의 병용 치료를 포함한다. 상기 제2 치료학적 원칙은 산소요법일 수 있다. 간질성 폐 질환의 치료를 위한 상기 제2 치료제는 코르티코스테로이드 약물, 아자티오프린, 피르페니돈, 사이클로포스파미드, 아세틸시스테인 및/또는 항-섬유화제일 수 있다.
본 발명의 추가의 양상은 섬유증식성 간질성 폐 질환을 앓는 환자의 생존 시간을 연장하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 FXII 및/또는 FXIIa의 세포 활성의 비-내인성 억제제의 약제학적 유효량을 상기 환자에게 투여함을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 특발성 폐 섬유증과 같은 섬유증식성 간질성 폐 질환과 관련된 증상을 감소시키는 방법이고, 상기 방법은 FXII 및/또는 FXIIa의 세포 활성의 비-내인성 억제제의 약제학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 특발성 폐 섬유증과 같은 섬유증식성 간질성 폐 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한 약제학적 키트에 관한 것이고, 상기 키트는 (1) FXII 및/또는 FXIIa의 세포 활성의 비-내인성 억제제 및 (2) 간질성 폐 질환을 치료하기 위한 추가의 약물을 포함한다. 상기 추가의 약물은 코르티코스테로이드 약물, 아자티오프린, 피르페니돈, 사이클로포스파미드, 아세틸시스테인 및 항-섬유화제로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
도 1 : FXII , FXI 및 HMWK 의 mRNA 수준은 IPF 환자의 폐에서 상승한다. (도 1a) FXII, FXI 및 HMWK mRNA의 발현을, 공여체(n=10) 및 IPF(n=10) 폐로부터 분리된 폐 섬유아세포 및 폐포 상피 II형 세포(AT II)에서뿐만 아니라 공여체 및 IPF 폐 조직 균질물(LH)에서 RT-PCR로 평가하였다. IPF 표본(β-액틴 발현에 대해 정규화됨)에서 mRNA 발현은 공여체 샘플에 대해 수득된 값에 비해 배수-증가한다. (도 1b) 건강한(H) 영역 및 IPF 폐의 섬유화(F) 영역에서 FXII, FXI 및 HMWK의 발현. IPF 표본(β-액틴 발현에 대해 정규화됨)에서 mRNA 발현은 공여체 샘플(C)에 대해 수득된 값에 비해 배수-증가한다. 결과는 평균 ± s.e.m.으로서 나타낸다. * p<0.05; 스튜던트 t-시험. ND; 검출되지 않음.
도 2: FXII , FXI 및 HMWK 의 단백질 수준은 IPF 환자의 폐 균질물에서 증가한다. (도 2a) 공여체 및 IPF 환자의 폐 균질물에서 FXII, FXI 및 HMWK의 발현을 보여주는 대표적인 면역 블롯. β-액틴은 로딩 대조군으로서 작용함. (도 2b) 발색 기질(B)을 사용하는 FXII 활성 검사. 옥수수 트립신 억제제를 사용하여 FXII 활성을 특이적으로 차단하였다. 상기 결과는 10명의 공여체 및 10명의 IPF 환자로부터 유래한 것이다. 데이터는 박스 및 휘스커 플롯으로서 제공하고, 여기서, 각 박스내 수평선은 중간값을 나타내고, 각 박스의 한계선은 사분위 범위를 나타내고 휘스커는 최대 및 최소값을 나타낸다. 맨-휘트니 시험에 의한 통계학적 유의성에 대해 시험함. 유의성 수준을 나타낸다.
도 3: 공여체 및 IPF 환자의 폐 조직에서 FXII , FXI 및 HMWK 의 발현 및 국소 화. 면역조직화학적 염색을 공여체 및 IPF 환자로부터 수득된 파라핀 폐 조직 절편에 대해 수행하였다. 그룹 당 5명 중 1명의 대표적인 IPF 환자 및 1명의 대조군을 나타낸다. 막대 크기를 나타낸다.
도 4: FXII, FXI 및 HMWK의 mRNA 수준은 블레오마이신 처리된 마우스의 폐에서 평가한다. 대조군(n=10) 및 블레오마이신 투여된(n=10) 마우스의 폐로부터 분리된 폐 섬유아세포 및 폐포 상피 II형 세포(AT II)에서뿐만 아니라 대조군 및 블레오마이신 폐 균질물에서의 FXII, FXI 및 HMWK 발현의 정량적 RT-PCR 분석. 블레오마이신 폐(β-액틴 발현에 대해 정규화됨)에서 mRNA 발현은 대조군 폐에 대해서 수득된 값에 비해 배수-증가한다. 결과는 평균 ± s.e.m.으로 나타낸다. *** p<0.0005, ** p<0.005, * p<0.05; 스튜던트 t-시험.
도 5: 대조군 및 블레오마이신 투여된 마우스의 폐 균질물에서 FXII, FXI 및 HMWK의 증가된 단백질 수준. 염수 대조군 및 블레오마이신 폐의 폐 균질물에서 FXII, FXI 및 HMWK의 발현을 보여주는 대표적인 면역블롯. β-액틴은 로딩 대조군으로서 작용함.
도 6: 대조군 및 블레오마이신 치료된 마우스의 폐에서 FXII , FXI 및 HMWK 의 발현 및 국소화 . 염수 또는 블레오마이신 치료된 마우스 기원의 폐에서 FXII, FXI 및 HMWK 면역국소화를 보여주는 대표적인 조직학적 절편. 그룹 당 10마리 중 하나의 대표적인 블레오마이신 마우스 및 하나의 대조군을 나타낸다. 막대 크기를 나타낸다.
도 7: FXII -/- 마우스는 블레오마이신 -유도된 폐 섬유증으로부터 보호된다. 블레오마이신 투여 후 21일째에 (A) 야생형 및 (C) FXII-/- 마우스의 폐의 헤마톡실린 및 에오신 염색. 블레오마이신 투여 후 21일째에 (B) 야생형 및 (D) FXII-/- 마우스의 트리크롬 염색. 녹색은 콜라겐 염색을 나타낸다. 막대 크기를 나타낸다. (E) 블레오마이신 투여 후 WT 및 FXII-/- 마우스의 치사율을 입증하는 생존 곡선, n=20 마우스/그룹. 로그-랭크 시험에 의한 유의적인 차이, P=0.007 FXII-/- 대 WT 생존.
도 8: FXII-/- 마우스의 폐에서 피브린 침착은 블레오마이신 적용 후 손상되지 않는다. 블레오마이신 치료된 WT 및 블레오마이신 주입 후 3주째에 FXII-/- 마우스 기원의 폐 조직에서의 피브린 면역염색. 적색은 피브린을 나타낸다. 현미경 사진은 각각의 실험 그룹에 대한 폐의 비정상적 영역 및 정상적 영역에서 피브린 침착의 패턴 및 정도를 설명하기 위해 선별되었다. 막대 크기를 나타낸다.
도 9: FXIIa 억제제는 블레오마이신 유도된 폐 섬유증을 약화시킨다. (C,G) 블레오마이신 또는 (A,E) 염수 적용 후 21일째에 폐의 헤마톡실린 및 에오신 염색. 블레오마이신(D,H) 또는 염수(B,F) 주입 후 21일째에 폐의 트리크롬 염색. 녹색은 콜라겐 염색을 나타낸다. 막대 크기를 나타낸다. (I) 블레오마이신 투여 후 WT 및 FXII-/- 마우스의 치사율을 입증하는 생존 곡선, n=20 마우스/그룹. 로그-랭크 시험에 의한 유의적인 차이, P=0.007. (J) 블레오마이신 또는 염수 투여 후 21일째 탄성 측정. 데이터는 박스 및 휘스커 플롯으로 나타내고, 이때, 각각의 박스내 수평선은 중간값을 나타내고, 각 박스의 한계선은 사분위 범위를 나타내고, 휘스커는 최대 및 최소 값을 나타낸다. n=5 마우스/그룹; *** P<0.05; ANOVA, 터키 후 시험(Tukey's post test).
도 10: B1B2-/- 마우스는 블레오마이신 유도된 폐 섬유증으로부터 보호되지 않는다. (도 10a) 블레오마이신 주입 후 21일째에 WT 및 B1B2-/- 치료된 마우스의 폐의 H&E 및 마손-트리크롬 염색. 녹색은 콜라겐 염색을 나타낸다. 막대 크기를 나타낸다. (도 10b) 블레오마이신 투여 후 WT 및 B1B2-/- 마우스의 치사율을 입증하는 생존 곡선, n=20 마우스/그룹. 로그-랭크 시험에 의한 유의적인 차이, p=0.86. (도 10c) 블레오마이신 투여 후 21일째에 탄성 측정. 데이터는 박스 및 휘스커 플롯으로 나타내고 여기서 각각의 박스내 수평선은 중간값을 나타내고 각 박스의 한계선은 사분위 범위를 나타내고 휘스커는 최대 및 최소 값을 나타낸다. n=20 마우스/그룹; 차이는 유의적이지 않음; 맨-휘트니 시험(Mann-Whitney test).
도 11: FXIIa 는 뮤린 폐 섬유아세포의 증식을 자극한다. (도 11a) FXIIa에 노출된 뮤린 폐 섬유아세포내 [3H]-티미딘 혼입. 상기 값은 적어도 3회의 하나의 실험내에 수행된 4개의 측정값의 평균 ± SEM으로 나타낸다. **P<0.0005; * P<0.05; ANOVA, 터키 후 시험. (도 11b) 6 μg/ml의 FXIIa 자극 6시간 후 뮤린 폐 섬유아세포에서 사이클린 D1 발현을 보여주는 대표적인 면역블롯, β-액틴은 로딩 대조군으로서 작용함.
도 12: p44 /42 키나제는 뮤린 폐 섬유아세포의 FXII -유도된 증식을 조절한다. (도 12a) 뮤린 폐 섬유아세포는 지적된 시점에 대해 FXIIa로 처리하였고 p44/42, JNK, c-jun, p38 및 Akt 키나제의 활성 및 발현은 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 인단백질은 지적된 바와 같이 인-특이적 항체를 통해 검출하였다. 동일한 로딩은 범-특이적 항체를 통해 확인하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. (도 12b) FXIIa 자극 전에 JNK, PI3K, MEK 및 p38 키나제(각각 SP600125, Wortmannin, PD98059, 및 SB203580)의 특이적 억제제로 전처리된 뮤린 폐 섬유아세포내에 [3H]-티미딘 혼입. 상기 값은 적어도 3회 중 하나의 실험내에 4개의 측정값의 평균 ± SEM으로서 나타낸다;* P<0.05; ANOVA, 터키 후 시험.
도 13: uPAR 은 FXIIa 유도된 뮤린 폐 섬유아세포 증식을 매개한다. (도 13a) FXIIa 자극 전에 uPAR 차단 항체 또는 IgG 이소형 대조군 항체로 전처리된 뮤린 폐 섬유아세포내에 [3H]-티미딘 혼입. (도 13b) uPAR의 도메인 2 (LRG 또는 TCK) 또는 무작위 펩타이드 기원의 펩타이드의 존재하에 FXIIa에 대한 노출 후 뮤린 폐 섬유아세포내에 [3H]-티미딘 혼입. 상기 값은 적어도 3회 중 하나의 실험내에서 수행된 4개의 측정값의 평균 ± SEM으로 나타낸다. **P<0.0005; * P<0.05; ANOVA, 터키 후 시험.
도 14: uPAR 은 FXIIa 유사분열 활성을 위해 요구된다. (도 14a) FXIIa 자극 후 야생형(WT) 또는 uPAR 결핍(uPAR-/-) 마우스로부터 분리된 뮤린 폐 섬유아세포내에 [3H]-티미딘 혼입. TGFβ 노출은 양성 대조군으로서 작용함. CTI, 옥수수 트립신 억제제. 상기 값은 적어도 3회중 하나의 실험내에 수행된 4개의 측정값의 평균 ± SEM으로 나타낸다. **P<0.0005; ANOVA, 터키 후 시험. (도 14b) FXII의 면역침전. uPAR에 특이적인 항체는 30분 동안 FXIIa로 자극되거나 자극되지 않은 세포 기원의 용해물로 항온처리하였다. 면역복합체는 단백질 A-아가로스 비드를 사용하여 침전시키고 FXII에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. uPAR은 로딩 대조군으로서 작용한다. IgG LCh, IgG 경쇄; IgGHCh, IgG 중쇄.
도 15: α5β1 인테그린은 FXIIa 매개된 뮤린 폐 섬유아세포 증식을 조절한다. (도 15a) FXIIa 자극 전에 (a) β1 또는 (b) α5 인테그린 차단 항체 또는 IgG 이소형 대조군으로 전처리된 마우스 폐 섬유아세포에서 [3H]-티미딘 혼입. 상기 값은 적어도 3회 중 하나의 실험에서 수행된 4개의 측정값의 평균 ± SEM으로서 나타낸다. ***p<0.0005; **p<0.005; *p<0.05; ANOVA, 터키 후 시험.
도 16: TGF -β1은 HLF 에서 FXII 발현을 상향조절한다. (a, b) (도 16a) 실시간 PCR 및 (도 16b) 웨스턴 블롯팅에 의해 평가된 바와 같은, TGF-β1 자극 후 HLF에서 FXII 발현의 시간 경과 과정. 실시간 PCR 결과는 비자극된 세포에 대해 수득된 값에 대한 FXII 발현(β-액틴 발현에 대해 정화화된)에서의 배수 증가로 표현하고 평균 ± SD이다; n = 3; ** p < 0.01. 3회 중 대표적인 블롯을 나타낸다. (도 16c) (b)에 제공된 블롯의 밀도측정 분석; ** p < 0.01.
도 17: TGF -β1은 MAPK , Akt 및 Smad3 의 인산화를 유도한다. (도 17a) HLF는 지적된 시점에 대해 TGF-β1으로 처리하고 p44/42, JNK, p38 및 Akt 키나제의 활성 및 발현은 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 인단백질은 지적된 바와 같인 인-특이적 항체를 통해 검출하였다. 동등한 로딩은 범-특이적 항체를 통해 확인하였다. 데이터는 4개의 독립적인 실험을 대표한다. (도 17b) 인-Smad 3의 핵으로의 TGF-β1 의존성 이동. HLF를 1시간 동안 TGF-β1과 항온처리하고, 이어서 세척하고, 고정시키고, 인-Smad 3 항체로 염색하였다. 화살표는 Smad 3의 핵 국소화를 나타낸다. 본래의 변형 40'/1.25-0.75 오일-객관적. 막대 크기 10㎛. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. (도 17c) 인-Smad 3의 핵으로의 TGF-β1 구동된 이동에 대한 웨스턴 블롯 분석. HLF는 1시간 동안 TGF-β1로 처리하였고, 핵 추출물을 제조하고 인-Smad 3, 라민 B 및 튜불린에 대해 항체로 면역블롯팅하였다. 라민 B는 로딩 대조군으로서 사용하고 튜불린을 사용하여 핵 분획의 순도를 평가하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다.
도 18: Smad 3 및 JNK 키나제는 HLF 에서 TGF -β1-유도된 FXII 발현을 조절한다. (a) HLF에서 TGF-β1 유도된 FXII 발현의 웨스턴 블롯 분석. HLF는 48시간 동안 TGF-β1과 항온처리하기 전에 1시간 동안 SB431542, SP600125, 워트마닌 (Wort), PD98059, 또는 SB203580으로 처리하였다. 세포 용해물을 제조하고 FXII 발현을 조사하고, β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용하였다. 3회 중 대표적인 블롯을 나타낸다. (b) (a)에서 제공된 블롯의 밀도측정 분석; ** p < 0.01 ; *** p < 0.001. (c, f) (c) JNK1 또는 (f) Smad 3에 대한 siRNA 형질감염에 의한 HLF에서 녹다운 효능을 웨스턴 블로팅으로 측정. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. (d, g) HLF에서 TGF-β1 유도된 FXII 발현에 대한 (d) JNK1 또는 (g) Smad 3 녹다운의 효과. (e, h) 각각 (d) 및 (g)에서 제공된 블롯의 밀도측정 분석; * p < 0.05; ** p < 0.01, *** p < 0.001. siR, 스크럼블 siRNA; wort, 워트마닌.
도 19: JNK1 키나제는 Smad3 인산화 및 핵으로의 이동을 조절하지 않는다. (a, b) HLF는 지적된 바와 같은 (a) JNK 억제제(SP600125) 또는 (b) TβRI 억제제(SB431542)의 존재 또는 부재하에 TGF-β1로 처리하였고 Smad 3 및 JNK의 활성 및 발현은 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 데이터는 4개의 독립적인 실험을 대표한다. (c) 인-Smad 3의 핵으로의 TGF-β1 구동된 이동에 대한 웨스턴 블롯 분석. HLF는 SB431542 또는 SP600125로 전처리하였고 이어서 비자극시키거나 TGF-β1로 1시간 동안 자극하였고, 핵 추출물을 제조하였고 인-Smad 3, 라민 B, 및 튜불린에 대한 항체로 면역블롯팅하였다. 라민 B는 로딩 대조군으로서 사용하였고 튜불린을 사용하여 핵 분획의 순도를 평가하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다.
도 20: TGF-β1은 위치-272번에 위치한 SBE를 통해 FXII 프로모터 활성을 유도한다. (a) FXII 프로모터 결실 루시퍼라제 리포터 작제물에 대한 도식. 각을 이루는 화살표는 전사 개시 부위를 나타낸다. (b) NIH3T3 세포는 지적된 FXII 프로모터 결실 작제물로 형질감염시키고 이어서 비자극시키거나(백색 막대) TGF-β1로 자극시켰다(흑색 막대). 루시퍼라제 활성은 "실험 과정"에 기재된 바와 같이 측정하였다. 데이터는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 값 ± SD를 나타내고, 각각은 3회 수행하였다; ** p < 0.01. (c) 위치-272번에서 추정 smad 결합 부위(SBE)를 함유하는 FXII 프로모터 영역의 도식. pGL3-299 C/T는 위치-273번에서 C가 T로 대체되어 돌연변이된 작제물을 나타낸다. (d) NIH3T3 세포는 pGL3-299 또는 pGL3-299 C/T 작제물로 형질감염시켰다. 루시퍼라제 활성은 비처리된(백색 막대) 및 TGF-β1 처리된(흑색 막대) 세포에서 측정하였다. 데이터는 4개의 독립적인 실험으로부터 평균 값 ± SD를 나타내고, 실험 각각은 3회 수행하였다; ** p < 0.01.
도 21: TGF-β1은 위치-272번에 위치한 SBE를 통해 FXII 프로모터 활성을 유도한다. (a) pGL3-299 작제물 및 SBE-272가 결핍된 작제물(pGL3-183DSBE-272)의 도식. (b) NIH3T3 세포는 pGL3-299 또는 pGL3-183DSBE-272로 형질감염시키고 상기 루시퍼라제 활성은 비자극된(백색 막대) 및 TGF-β1 자극된(흑색 막대) 세포에서 측정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 평균 값 ± SD를 나타내고 실험 각각은 3회 수행하였다; ** p < 0.01. (c) pGL3-399 작제물로 형질감염된 NIH3T3 세포는 TGF-β1과 항온처리하기 전에 1시간 동안 SB431542, SP600125, 워트마닌 (Wort), PD98059, 또는 SB203580으로 전처리하였다. 루시퍼라제 활성은 비처리된(백색 막대) 및 TGF-β1 처리된(흑색 막대) 세포에서 측정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 평균 값 ± SD를 나타내고, 각각의 실험은 3회 수행하였다; * p < 0.05; ** p < 0.01 ; *** p < 0.001. wort, 워트마닌.
도 22: Smad 3 - SBE -272 상호작용은 JNK 억제제의 존재하에 억제된다. (a) HLF는 비자극시키거나 TGF-β1로 자극시키고 ChIP 분석은 Smad 3 항체 또는 이소형 IgG 대조군을 사용하여 수행하였다. PCR은 "실험 과정"에 기재된 바와 같은 면역침전된 DNA로 수행하였다. PCR 작제물은 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고 에티디움 브로마이드와 염색시켜 검출하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. (b) 비처리되거나 TGF-β1 처리된 세포 기원의 핵 추출물은 비오티닐화된 주형(SBE-283/-258 또는 SBE-283/-258 C/T)과 항온처리하였고 Smad 3은 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. (c) HLF는 TGF-β1과 항온처리하기 전에 1시간 동안 SB431542 또는 SP600125로 전처리하였다. ChIP 분석은 Smad 3 항체 또는 이소형 IgG 대조군을 사용하여 수행하였다. PCR은 "실험 과정"에 기재된 바와 같은 면역침전된 염색질로 수행하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. (d) HLF는 TGF-β1의 첨가 전에 1시간 동안 SB431542 또는 SP600125로 전처리하였다. 핵 추출물을 제조하고, 이어서 비오티닐화된 주형(SBE- 283/-258)과 항온처리하였다. Smad 3은 웨스턴 블롯팅으로 검출하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다.
도 23: 마우스의 실험 폐 섬유증에서 FXII 의 발현 및 분포. (a) 블레오마이신을 적용하여 마우스에서 특발성 폐 섬유증(IPF)형 질환을 유도하고, 처리된 동물의 기관지폐포 세척 유체중 FXII의 농도를 정량하였다. (b) 블레오마이신으로 처리 후 14일 및 21일째 마우스에 대한 마우스 폐에서 FXII의 발현(웨스턴 블롯 분석)을 나타낸다. (c) 블레오마이신-처리된 마우스에서 β-액틴 mRNA과 관련된 FXII mRNA의 발현을 나타내고, 또한 블레오마이신 적용후 14일째 및 21일째에 배수 증가를 나타낸다. (d,e) 블레오마이신-처리된 마우스에서 FXII의 조직 구조 및 분포(적색)가 입증된다.
도 24: 마우스에서 블레오마이신 -유도된 IPF 에 대한 FXII 결핍의 영향. (a) 야생형(WT) 및 FXII-결핍 동물에서 인자 XII(적색)의 분포를 나타낸다. 또한, 콜라겐 침착의 분포를 기록한다. 주지사항: FXII-결핍 마우스에서, 폐 조직 구조는 거의 영향받지 않고 생리학적 상황과 유사하고 어떠한 주요 콜라겐 침착이 가시화되지 않는다. (b) FXII 결핍 마우스와 비교되는 야생형 마우스의 생존 곡선(카플란-마이어 플롯(Kaplan-Meier plot))은 블레오마이신-처리된 그룹에 대해 기록한다. (c) 블레오마이신-처리된 야생형 또는 FXII-결핍 마우스의 폐 기능의 탄성을 기록하고, IPF 상황에 대해 FXII 결핍 마우스가 거의 완전히 보호됨을 나타낸다. (d,e) 콜라겐 함량뿐만 아니라 격막 두께는 야생형 그룹과 비교하여 블레오마이신-처리된 FXII-결핍 마우스에서 비대해지지 않는다.
도 25: FXIIa 억제제 "옥수수-트립신-억제제"( CTI )의 투여는 마우스에서 블레오마이신 -유도된 IPF 상황으로부터 보호한다. (a) 블레오마이신 투여 시, 비처리된 야생형 마우스는 콜라겐 침착 뿐만 아니라 현저히 증가된 FXII 발현을 나타내고, CTI-표적화된 마우스는 폐 리모델링 및 콜라겐 침착으로부터 크게 보호된다. (b) 생존 곡선(카플란-마이어 플롯)은, FXII 억제제 CTI를 투여받은 블레오마이신- 처리된 마우스가 IPF-형 폐 섬유증으로부터 상당히 보호됨을 나타낸다. (c) CTI 투여받은 처리 그룹에서, 폐 탄성은 상당히 개선된다. (d,e) 블레오마이신 적용을 통해 유발된 격막 두께 및 콜라겐 함량 둘다의 증가는 마우스의 치료학적 CTI-그룹에서 상당히 예방된다.
본 발명은 FXII/FXIIa의 세포 활성의 비-내인성 억제제를 약제학적 유효량으로 대상체에 투여함을 포함하는, 간질성 폐 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한 방법에 관한 것이고, 즉, 상기 억제제의 투여는 폐 섬유아세포의 증식을 예방하고/하거나 제한한다. 또한, 본 발명은 간질성 폐 질환의 치료 및/또는 예방용 의약을 제조하기 위한 비-내인성 세포 FXII 억제제의 용도에 관한 것이다.
인자 XII
FXII는 단일쇄 78kD 자이모겐으로서 간에서 생성되는 폴리펩타이드이다. 활성화시, FXII는 중쇄 및 경쇄로 이루어진 2개의 쇄 형태로 전환된다. 상기 중쇄는 하기의 도메인을 함유한다: 리더 펩타이드, 피브로넥틴 II형 도메인, 상피 성장 인자(EGF) 도메인, 피브로넥틴 I형 도메인, 크링글(kringle) 도메인 및 FXII에 특유한 프롤린-풍부 도메인. 상기 경쇄는 세린 프로테아제에 대해 전형적인 촉매 도메인을 함유하고, 이로써 FXII는 조직형 플라스미노겐 활성인자(t-PA), 우로키나제형 플라스미노겐 활성인자(u-PA), 또는 인자 VII-활성화 프로테아제와 같은 세린 프로테아제 계열의 다른 구성원과 유사한 도메인 구성을 갖는다. 상기 중쇄는 피브로넥틴 I형 영역을 따라 아미노 말단에 국소화되고 능히 제2 EGF-유사 도메인 또는 크링글 도메인에 국소화된 음전하 표면에 대한 결합 영역을 함유한다. 상기 경쇄에서 FXII의 활성 부위는 His40, Asp89 및 Ser191 잔기들을 포함하는 표준 촉매 트리아드(triad)로 이루어진다. 상기 부위는 또한 주요 고유 응고 경로 억제제인, C1 억제제에 대한 표적이다. 칼리크레인 또는 이의 자가활성화에 의한 FXII의 절단은 FXII 자이모겐에 결합되어 있는 Arg353-Val354를 분열시켜 디설파이드 결합에 의해 연결되어 있는 중쇄 및 경쇄를 함유하는 활성 알파 XIIa 형태를 생성시킨다. 알파 XIIa 형태에서 2개의 추가의 펩타이드 결합의 가수분해는 경쇄, 및 중쇄의 절단된 단편을 함유하는 30kD 베타 XIIa를 생성시킨다. 알파 XIIa는 음전하 표면에 결합하여 FXI 및 프리칼리크레인(PK)을 활성화시킬 수 있다. 베타 XIIa는 어떠한 표면-결합 능력도 갖지 않지만, PK를 활성화시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인자 XII" 또는 "FXII"는 상기된 형태의 인자 XII 중 어느 것을 언급한다. 특히, 상기 용어는 활성화된 형태의 인자 XIIa(FXIIa)를 포함한다.
간질성 폐 질환
산재성 실질 폐 질환(diffuse parenchymal lung disease)(DPLD)으로서도 공지되어 있는 간질성 폐 질환(ILD)은 간질(폐의 기낭 주변의 조직 및 공간)에 영향을 미치는 폐 질환 그룹을 나타낸다. 이것은 폐포 상피, 폐 모세혈관 내피, 기저막, 혈관주위 및 림프주위 조직과 관련된다. 본 발명의 측면에서 ILD는 특히 폐 섬유아세포 증식에 관한 것이고, 따라서 용어 "섬유증식성 ILD"가 사용된다. 상기 폐 섬유아세포 증식은 본 발명에 의해 치료되고/되거나 예방되어야만 한다.
바람직하게, 본 발명에 따라 치료될 ILD는 폐 섬유증이다. 가장 바람직하게, 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증이다. 특발성 폐 섬유증(IPF)은 폐에 제한되고, 통상적인 간질성 폐렴(UIP)의 조직학적 패턴과 관련된 원인불명의 독특한 유형의 만성 섬유화 간질성 폐렴으로서 정의된다. IPF 폐는 구조적 파괴, 즉, 봉와상 및 산재된 섬유아세포 병소(집중적인 섬유아세포 증식 영역)를 갖는 밀집된 반흔을 특징으로 한다.
FXII 의 세포 활성의 비-내인성 억제제
용어 "FXII의 세포 활성의 비-내인성 억제제" 또는 "비-내인성 세포 FXII 억제제"는 FXII 및/또는 FXIIa의 세포 활성 또는 이의 양을 감소시킬 수 있는 임의의 비-내인성 화합물을 나타낸다. 본 발명의 측면에서 FXII 억제제는 FXIIa의 촉매 활성을 방해하는 화합물을 포함한다. 추가로 생체내 FXII 또는 FXIIa의 양을 감소시킬 수 있는 화합물이 포함된다. 상기 억제제는 FXII의 발현을 감소시킬 수 있는 화합물을 포함한다. 추가로, FXII의 FXIIa로의 전환을 방해하는 억제제가 포함된다.
상기 억제제는 FXII 및/또는 FXIIa의 생물학적 기능을 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 예를 들어, 98% 이상 또는 99% 이상 감소시킨다. 생물학적 기능은 FXII/FXIIa의 임의의 공지된 세포 효과를 나타낸다. 상기 세포 기능의 예는 세포, 특히 폐 섬유아세포 또는 평활근 세포에 대한 증식성 및/또는 미토겐 효과이다.
본 발명의 측면에서 "비-내인성" 억제제는 FXII/FXIIa가 억제되어야만 하는 종에서는 천연적으로 발생하지 않는 FXII/FXIIa 억제제이다. FXII/FXIIa의 내인성 억제제는 예를 들어, 항트롬빈, C1 억제제, 알파-1 프로테아제 억제제이다. 본 발명의 비-내인성 FXII/FXIIa 억제제는 내인성 FXII/FXIIa 억제제보다 더 특이적이고, 즉, 본 발명에 따른 억제제는 FXII/FXIIa에 대해 매우 특이적이다. 상기 특이성은 예를 들어, FXII/FXIIa의 활성을 50% 감소시키는데 요구되는, FXII/FXIIa에 대한 특이적 억제제의 몰 비로서 표현될 수 있다. 이것은 본 발명의 측면에서 몰 억제 비로서 언급된다. 0.5의 몰 억제 비는 1pmol의 FXII/FXIIa에의 억제제 0.5pmol의 첨가가 FXII/FXIIa의 활성을 50% 감소시킴을 의미한다. 본 발명의 특이적, 즉 비-내인성 억제제는 10 이하, 또는 바람직하게는 5 이하, 또는 보다 바람직하게는 2 이하 또는 0.5 이하와 같은 1 이하의 몰 억제 비를 갖는 억제제이다.
FXIIa의 촉매 활성을 결정하기 위한 시험은 문헌[참조: Kannemeier C, Shibamiya A, Nakazawa F, Trusheim H, Ruppert C, Markart P, Song Y, Tzima E, Kennerknecht E, Niepmann M, Bruehl ML, Sedding D, Massberg S, Gunther A, Engelmann B, Preissner KT]에 기재되어 있다. 세포외 RNA는 혈액 응고에서 천연 응고 촉진 조인자를 구성한다[문헌참조: Proc Natl Acad Sci USA. 104:6388-6393, 2007]. 간략하게, FXIIa-샘플 및 발색 기질 펩타이드가 혼합되고, 405nm에서, 광도계에서의 시간 경과에 따라 p-니트로아닐린이 방출된다. 화합물은 이것이 유의적인 방식으로 상기 검사에서 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 25% 이상, 가장 바람직하게는 50% 이상, 예를 들어, 75% 이상 또는 90% 이상 촉매 활성을 감소시킬 수 있는 경우, FXIIa의 촉매, 특히 효소적 활성의 억제제로서 적합하다.
FXII의 FXIIa로의 전환 정도를 측정하기 위한 시험은 발색 펩타이드 검사에서 FXIIa의 증가에 따른 상기된 바와 유사한 방식으로 기재된다. 화합물이 상기 검사에 따라 유의적인 정도로 상기 전환을 억제할 수 있는 경우, 화합물은 FXII의 FXIIa로의 전환을 방해하는 억제제로서 적합하고; 바람직하게, 상기 억제제에 의해 영향받은 전환 감소는 10% 이상, 보다 바람직하게는 25% 이상, 가장 바람직하게는 50 % 이상이다.
FXII-특이적 항체를 사용한 효소-결합 면역흡착 검사(ELISA)에 의해 FXII/FXIIa의 총량을 정량하고, 활성화된 FXII 부분은 상기 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분석하고 이어서 웨스턴-블롯팅시킴으로써 측정하여 단백질 밴딩 패턴을 정량하는, FXII 및/또는 FXIIa의 양을 측정하기 위한 방법이 기재된다. 상기 방법은 ELISA 및 다른 면역학적 기술과 같은, 공지된 단백질 검출 방법을 포함한다.
항- FXII 항체
FXII 및/또는 FXIIa에 대해 지시된 항체를 사용하여 FXIIa의 기능을 억제할 수 있다. 상기 항체는 예를 들어, 항-FXII 항체를 포함하고, 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함한다.
상기 항체는 또한 억제 활성을 보유하는, 동일체 또는 모사체, 예를 들어, 미국 특허 제6,613,890호에서 특히 칼럼 4 내지 8에 기재된 바와 같은 아밀로이드 전구체 단백질의 쿤니츠 프로테아제 억제제 도메인의 유사체의 단편일 수 있다.
프로테아제 억제제
FXIIa 활성을 억제하기 위한 효율적인 방법은 세린 프로테아제 억제제와 같은 특이적 비-내인성 프로테아제 억제제를 사용하는 것이다. 이의 예는 아프로티닌, Z-Pro-Pro-알데하이드-디메틸 아세테이트, DX88(Dyax Inc., 300 Technology Square, Cambridge, MA 02139, USA; Williams A. and Baird LG., Transfus Apheresis Sci. 2003 Dec: 29 (3):255-8에 인용됨), Fmoc-Ala-Pyr-CN과 같은 프롤릴 올리고펩티다제의 억제제, 옥수수-트립신 억제제(CTI), 소 췌장 트립신 억제제의 돌연변이체 및 Pro-Phe-Arg-클로로메틸-케톤(PCK)을 포함한다.
다른 적합한 억제제는 문헌[참조: H. Isawa et al. (J Biol Chem 277:27651 -27658, 2002)]에 기재된 바와 같은 하마다린일 수 있다. 적합한 옥수수 트립신 억제제 및 이의 제조 방법은 문헌[참조: Z.Y. Chen et al. (Appl Environm Microbiol 65:1320-1324, 1999 및 상기 문헌에 인용된 참조문헌 19)]에 기재되어 있다. 모든 인용 문헌은 본원에서 이들의 전체 내용을 포함하여 참조로서 인용된다. 그렇지만, 예를 들어, 선별 기본이 되는 검사로서 FXII 각각의 FXIIa 억제를 사용하여 분리된 소분자 및 상기 또는 하기에 기재된 이들의 각각의 용도는 본 발명의 일부이다. 이들 소분자 FXIIa 억제제는 FXII의 결정 구조를 기준으로 디자인할 수 있다. 따라서, 여러 FXII 도메인 또는 경쇄는 이. 콜라이, 효모 또는 포유동물 세포와 같은 발현 시스템에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 이어서, 상기 단백질은 FXII 기질 FXI에 대해 기재된 바와 같은 표준 과정을 사용하여 정제되고 결정화된다(문헌참조: Jin L et al. J Biol Chem. 280:4704-4712, 2005). 에코틴 돌연변이체와 복합된 FXIa 촉매 도메인의 결정 구조는 기질-유사 상호작용을 밝힌다. 또는, 소분자 세린 프로테아제 억제제는 FXII 구조를 안정화시키기 위해 포함될 수 있다.
최근에, FXII/FXIIa의 신규 억제제는 곤충에서 발견되었다: 흡혈성 곤충인 트리아토마 인페스탄스(Triatoma infestans)의 중장(midgut)으로부터 기원하는 인페스틴 도메인(Infestin domain) 3-4(인페스틴 3-4) 및 인페스틴 도메인 4(인페스틴-4)[문헌참조: Campos ITN et al. 2002. Infestin, a thrombin inhibitor present in Triatoma infestans midgut, a Chagas' disease vector: gene cloning, expression and characterization of the inhibitor. Insect Biochem. Mol. Biol. 32:991-997; Campos ITN et al. 2004. Identification and characterization of a novel factor Xlla inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae). FEBS Lett. 577:512-516]. 이들 단백질은 Kazal형 세린 프로테아제 억제제의 강력한 FXIIa 억제제로서 공지되어 있고, 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간을 대략 3배 지연시킨다.
국제 특허원 WO 2008/098720에는 FXIIa의 강력한 억제제로서, 인페스틴 4(rHA-인페스틴-4)의 알부민 융합 단백질뿐만 아니라 인페스틴 3-4 및 인페스틴-4, 및 이들 분자 자체가 기재되어 있다. 추가로, 인페스틴-4와 매우 높은 유사성을 갖는 사람 단백질은 췌장에서 발현되는 Kazal형 세린 프로테아제 억제제(췌장 분비 트립신 억제제, PSTI로서도 공지됨)인 SPINK-1인 것으로 기재되었다. 야생형 SPINK-1 서열을 기준으로, 인페스틴-4에 대한 SPINK-1 서열의 증가된 상동성을 갖는 3개의 상이한 돌연변이체가 기재되어 있다. 성숙한 SPINK-1 야생형 단백질, 3개의 돌연변이체 및 인페스틴-4의 아미노산 서열은 서열번호 29 내지 33으로 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 FXII 억제제는 SPINK-1로부터 유도된 돌연변이 Kazal 억제제를 포함하고, 여기서 상기 억제제는 인페스틴-4에 대해 증가된 상동성을 갖는다. 상기 용어 "각각 증가된 상동성을 갖는 SPINK-1 돌연변이체"는 인페스틴-4와 함께 20개 이상의 동일한 아미노산, 또는 동일한 아미노산 대신 보존성 치환을 의미하는 동일성 대신 보존성 치환을 함유하는 돌연변이체를 나타낸다. 바람직하게, 상기 돌연변이 Kazal 억제제와 억제된 FXIIa의 접촉 부위는 Kazal형 억제제 인페스틴의 도메인 4로부터 유도된다. WO 2008/098720의 전문은 본원에 참조로서 인용된다.
따라서, 인페스틴 또는 이의 단편, 또는 인페스틴 3-4 또는 인페스틴-4, 또는 SPINK-1로부터 유도된 상기 돌연변이 Kazal 억제제(여기서, 상기 억제제는 인페스틴-4에 대해 증가된 상동성을 갖는다), 및 하기된 바와 같은 융합 단백질 rHA-인페스틴-4가 본 발명에 따른 FXII/FXIIa의 세포 활성의 적합한 비-내인성 억제제이다.
다른 말로, 하나의 실시형태에서, 본원은 인페스틴 도메인 4, 인페스틴-4를 포함하는 FXII 억제제를 제공한다. 하나의 실시형태에서, FXII 억제제는 인페스틴-4의 변이체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, FXII 억제제는 인페스틴 도메인 4 및 임의로 인페스틴 도메인 1, 2, 및/또는 3을 포함하고; 이들 단백질은 FXII의 강력한 억제제인 것으로 공지되어 있다. 인페스틴-4의 야생형 폴리펩타이드 서열(서열번호 33)이 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 아미노산 돌연변이를 갖는 폴리펩타이드를 나타내고, 여기서 "돌연변이"는 야생형 인페스틴-4 서열에 대한 치환, 결실, 또는 첨가로서 정의되고, 상기 변화는 FXII를 억제하는 폴리펩타이드의 기능적 능력을 변형시키지 않는다. 용어 "변이체"는 야생형 또는 돌연변이된 인페스틴-4 서열의 단편을 포함한다. 추가로, 상기 변이체의 예는 하기에 제공된다.
하나의 실시형태에서, 인페스틴-4 변이체는 야생형 인페스틴-4 서열의 N-말단 아미노산 2 내지 13, 및 야생형 인페스틴-4 서열과의 차이 또는 6개의 보존된 시스테인 잔기 및 야생형 인페스틴-4 서열과 70% 이상의 상동성을 유발하는, N-말단 아미노산 외부의 1개 이상 내지 5개 이하의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 인페스틴-4 서열의 N-말단 아미노산 2개 내지 13개는 트롬빈에 결합하는 관련 억제제인 로드니우스 프롤릭서스(Rhodnius prolixus)(PDB: 1 TSO)에 대한 구조적 데이터의 분석 및 키모트립신에 결합하는 SPINK-1의 분석을 기초로, FXII에 대한 결합에 중요한 것일 수 있고, 이 모두는 N-말단 영역에 접촉 부위가 축적되어 있다는 공통된 특징을 공유한다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 인페스틴-4의 변이체는 야생형 인페스틴-4 서열의 아미노산 2 내지 13의 보존된 N-말단 영역, 및 야생형 인페스틴-4 서열과의 차이를 유발하는, 이들 보존된 N-말단 아미노산 외부에 1개 이상 내지 5개 이하의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 치환, 결실, 또는 첨가일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상기 N-말단 아미노산의 외부"는 서열 VRNPCACFRNYV, 즉 야생형 인페스틴-4 서열 기원의 아미노산 2 내지 13을 포함하는 연속적인 범위의 아미노산 이외에 변이체의 폴리펩타이드 쇄를 따라 존재하는 임의의 아미노산을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 인페스틴-4 변이체는 6개의 보존된 시스테인 잔기를 포함하고, 야생형 인페스틴-4 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는다. 하나의 실시형태에서, 6개의 보존된 시스테인 잔기는 야생형 인페스틴-4 서열의 6, 8, 16, 27, 31 및 48 위치에서의 아미노산이다. 하나의 실시형태에서, 상기 변이체는 최종 보존된 시스테인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 시스테인 잔기의 정확한 위치, 및 서로 상대적인 위치는 인페스틴-4 변이체내 삽입 또는 결실로 인해 야생형 인페스틴-4 서열의 6, 8, 16, 27, 31, 및 48 위치로부터 변화할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 실시형태에서, 인페스틴-4 변이체는 모든 6개의 시스테인을 포함하고 야생형 인페스틴-4 서열과 70%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 공유할 수 있다.
실시형태들에서, 인페스틴-4의 변이체는 이것이 FXII를 억제함을 특징으로 한다. FXII를 억제하는 기능적 활성은 예를 들어, FXII 효소 활성의 억제, 지연된 응고 시간, 즉 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간(aPTT)을 시험하기 위한 직접적인 검사를 포함하는, 시험관내 및/또는 생체내 특징 분석, 또는 응고를 평가하는 생체내 방법을 통해 평가할 수 있다. 인페스틴-4 변이체의 추가의 예는 하기에 기재된 SPINK-1 돌연변이체이다.
하나의 실시형태는 사람에서 치료학적 용도를 위한 FXII 억제제를 포함한다. 인페스틴-4와 높은 유사성을 갖는 사람 단백질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 인페스틴-4와 가장 높은 유사성을 갖는 사람 단백질은 췌장에서 발현되는 Kazal형 세린 프로테아제 억제제(췌장 분비 트립신 억제제, PSTI로서도 공지됨)인 SPINK-1이다. Kazal형 세린 프로테아제 억제제 계열은 세린 프로테아제 억제제의 수많은 계열들 중 하나이다. 상이한 종 기원의 많은 단백질들은 문헌[참조: Laskowski M and Kato I, 49 Ann. Rev. Biochem. 593-626, 1980]에 기재되어 있다. 인페스틴-4와 SPINK-1 간의 아미노산 서열 유사성은 도 12에 명시되어 있다.
야생형 SPINK-1 서열(서열번호 29)을 기초로, 상이한 변이체가 인페스틴-4와 SPINK-1 서열의 상동성을 증가시키기 위해 제조될 수 있다. 어구 "인페스틴-4에 대해 증가된 유사성"은 아미노산 돌연변이가 SPINK-1에 적용되어 SPINK-1 서열이 인페스틴-4 서열과 보다 유사해지도록 하는 과정을 나타낸다.
하나의 실시형태에서, SPINK-1은 야생형 인페스틴-4 서열의 N-말단 아미노산 2 내지 13을 포함하도록 돌연변이시키고; 상기 폴리펩타이드 서열은 K1(서열번호 30)으로 나타낸다. 상기된 바와 같이, 인페스틴-4 서열의 N-말단 부분은 FXII 억제 기능을 위해 중요한 것으로 사료된다.
따라서, 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 SPINK-1의 변이체는 또한 야생형 인페스틴-4 서열의 N-말단 아미노산 2 내지 13, 및 야생형 SPINK-1 서열과의 차이를 유발하고 야생형 인페스틴-4 서열과 변이체의 상동성을 증가시키는, 상기 N-말단 아미노산 외부의 1개 이상 및 5개 이하의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 돌연변이된 SPINK-1의 변이체는 6개의 보존된 시스테인 잔기를 포함하고 야생형 SPINK-1 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는다. 돌연변이는 치환, 결실 또는 첨가일 수 있다. 상기 정의된 바와 같이, 용어 "상기 N-말단 아미노산 외부"는 서열 VRNPCACFRNYV, 즉, 야생형 인페스틴-4 서열 기원의 아미노산 2 내지 13으로 구성된 연속 범위의 아미노산 이외에 변이체의 폴리펩타이드 쇄를 따라 존재하는 임의의 아미노산을 나타낸다. 용어 "변이체"는 상기 돌연변이된 SPINK-1 서열의 단편을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 6개의 보존된 시스테인 잔기는 야생형 SPINK-1 서열의 9, 16, 24, 35, 38, 및 56 위치의 아미노산일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 변이체는 최종 보존된 시스테인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 시스테인의 정확한 위치, 및 서로에 대한 상대적 위치는 SPINK-1 변이체내의 삽입 또는 결실로 인해 야생형 SPINK-1 서열의 9, 16, 24, 35, 38 및 56 위치로부터 변화할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 실시형태에서, SPINK-1 변이체는 모든 6개의 시스테인을 포함한다. 실시형태들에서, SPINK-1 변이체는 또한 이것이 FXII를 억제함을 특징으로 한다.
상기 SPINK-1 변이체의 예가 주어지고, K2 및 K3(각각 서열번호 31 및 32)으로 명명한다. SPINK-1 변이체 K2 및 K3에서, N-말단의 외부의 추가의 아미노산 치환은 인페스틴-4와의 상동성을 증가시키기 위해 수행되고, 여기서 변이체는 또한 이들의 FXII 활성을 억제함을 특징으로 한다. 문헌[WO 2008/098720]을 참조한다. SPINK-1 변이체 K3의 경우에, 5개의 아미노산 치환이 이루어져 인페스틴-4와의 상동성을 증가시킨다. 따라서, 실시형태들에서, SPINK-1 변이체는 야생형 SPINK-1 서열과 70%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 공유할 수 있다.
연장된 반감기를 갖는 억제제
본 발명의 바람직한 양태는 FXII/FXIIa 억제제, 특히 연장된 반감기를 갖는 인페스틴 상동체 또는 이의 단편을 기초로 하는 인페스틴-4 및 변형된 포유동물 Kazal형 세린 프로테아제 억제제의 용도이다. Kazal형 세린 프로테아제 억제제는 다소 소형 단백질이기 때문에, 다른 소형 단백질에 대해 공개된 바와 같이 급속한 신장 제거가 예상될 수 있다[문헌참조: Werle M. and Bernkop-Schnurch A. 2006. Strategies to improve plasma half-life time of peptide and protein drugs. Amino Acids 30:351-367]. 폴리펩타이드 화합물의 짧은 혈장 반감기를 극복하기 위한 한가지 방법은 이것을 반복적으로 또는 연속 주입을 통해 주사하는 것이다. 바람직하게, 폴리펩타이드 자체의 특유 혈장 반감기는 증가된다. 따라서, FXII 억제제, 특히 반감기 연장 단백질(HLEP)에 융합된 세린 프로테아제 억제제를 사용하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 HLEP는 알부민, 알부민 계열의 구성원, 면역글로불린 G의 불변 영역 및 이의 단편 및 생리학적 조건하에서 알부민, 알부민 계열의 구성원 및 면역글로불린 불변 영역 부분에 결합할 수 있는 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 예로서, 알부민 및 면역글로불린 및 이들의 단편 또는 유도체는 HLEP로서 기재되었다.
문헌[참조: Ballance et al. (WO 01/79271)]에는 사람 혈청 알부민과 융합되는 경우 증가된 기능적 생체내 반감기 및 연장된 저장 수명을 가질 것으로 예측되는, 다수의 상이한 치료학적 폴리펩타이드의 융합 폴리펩타이드를 기재되어 있다. 상기 치료학적 단백질은 직접 또는 펩타이드 링커를 통해 알부민 모이어티에 융합될 수 있고, C- 및 N-말단 융합이 기재된다.
용어 사람 혈청 알부민(HSA) 및 사람 알부민(HA)은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "알부민" 및 "혈청 알부민"은 광범위하고, 기타 종 기원의 알부민 (및 이의 단편 및 변이체)뿐만 아니라 사람 혈청 알부민(및 이의 단편 및 변이체)도 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "알부민"은 알부민의 하나 이상의 기능적 활성(예를 들어, 생물학적 활성)을 갖는, 알부민 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 단편 또는 변이체를 총칭한다. 특히, "알부민"은 사람 알부민 또는 이의 단편, 특히 본원에서 서열번호 34로 나타낸 바와 같은 성숙한 형태의 사람 알부민 또는 기타 척추동물 기원의 알부민 또는 이의 단편, 또는 상기 분자 또는 이의 단편의 유사체 또는 변이체를 나타낸다.
알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 상기된 바와 같은 전장 HA 서열을 포함할 수 있거나, 치료학적 활성을 안정화시키거나 연장시킬 수 있는 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 10개 이상의 아미노산 길이일 수 있거나, HA 서열 기원의 약 15개, 20개, 25개, 30개, 50개 이상의 연속 아미노산들을 포함할 수 있거나, HA의 특이적 도메인의 일부 또는 모두를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 정상적인 HA의 변이체일 수 있다. 본 발명의 융합 단백질의 치료학적 폴리펩타이드 부분은 또한 본원에 기재된 바와 같은 상응하는 치료학적 폴리펩타이드의 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 삽입, 결실 및 치환을 포함하고, 이들은 보존성이거나 비보존성이고, 여기서 상기 변화는 치료학적 폴리펩타이드의 치료학적 활성을 부여하는 활성 부위 또는 활성 도메인을 실질적으로 변형시키지 않는다.
특히, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 알부민 융합 단백질은 사람 알부민의 천연 발생 다형태 변이체 및 사람 알부민의 단편을 포함할 수 있다. 상기 알부민은 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유동물, 예를 들어, 사람, 원숭이, 소, 양 또는 돼지로부터 유도된 것일 수 있다. 비-포유동물 알부민은 닭 및 연어로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 치료학적 폴리펩타이드 부분 이외에 알부민-연결된 폴리펩타이드의 알부민 부분은 상이한 동물 기원일 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 HA 또는 이의 보존적 변형체의 하나 이상의 서브도메인 또는 도메인을 포함할 수 있다.
일반적으로 말해서, 알부민 단편 또는 변이체는 20개 이상, 바람직하게는 40개 이상, 가장 바람직하게는 70개 이상의 아미노산 길이이다. 상기 알부민 변이체는 우선적으로 알부민의 하나 이상의 전체 도메인 또는 상기 도메인의 단편, 예를 들어, 도메인 1(서열번호 34의 아미노산 1 내지 194), 2(서열번호 34의 아미노산 195 내지 387), 3(서열번호 34의 아미노산 388 내지 585), 1 + 2(서열번호 34의 1 내지 387), 2 + 3(서열번호 34의 195 내지 585) 또는 1 + 3(서열번호 34의 아미노산 1 내지 194 + 서열번호 34의 아미노산 388 내지 585)으로 이루어지거나, 또는 이들을 포함한다. 각각의 도메인 자체는 잔기 Lys106 내지 Glu119, Glu292 내지 Val315 및 Glu492 내지 Ala511을 포함하는 유연한 서브도메인 링커 영역과 함께 2개의 상동성 서브도메인, 즉, 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 및 512-585로 이루어진다.
알부민 이외에, 알부민 계열의 다른 구성원인 알파-페토단백질은 생체내에서 접착된 치료학적 폴리펩타이드의 반감기를 연장시키는 것으로 주장되었다(WO 2005/024044). 알부민 계열의 단백질인, 진화적으로 관련된 혈청 수송 단백질은 알부민, 알파-페토단백질(AFP)[문헌참조: Beattie & Dugaiczyk 1982. Structure and evolution of human alpha-fetoprotein deduced from partial sequence of cloned cDNA. Gene 20:415-422], 아파민(AFM)[문헌참조: Lichenstein et al. 1994. Afamin is a new member of the albumin, alpha-fetoprotein, and vitamin D-binding protein gene family. J. Biol. Chem. 269:18149-18154] 및 비타민 D 결합 단백질(DBP)[문헌참조: Cooke & David 1985. Serum vitamin D-binding protein is a third member of the albumin and alpha fetoprotein gene family. J. Clin. Invest. 76:2420-2424]로 이루어진다. 이들의 유전자는 사람, 마우스 및 래트에서의 동일한 염색체 영역에 맵핑하는 구조적 및 기능적 유사성을 갖는 다중 유전자 클러스터를 나타낸다. 알부민 계열 구성원의 구조적 유사성은 HLEP로서의 이들의 용도를 제안한다. 따라서, 상기 알부민 계열 구성원, 이의 단편 및 변이체를 HLEP로서 사용하는 본 발명의 다른 실시형태가 존재한다. 용어 "변이체"는 삽입, 결실 및 치환을 포함하고, 이는 보존성 또는 비보존성이고, 여기서 상기 변화는 치료학적 폴리펩타이드의 치료학적 활성을 부여하는 활성 부위, 또는 활성 도메인을 실질적으로 변형시키지 않는다.
알부민 계열 구성원은 전장의 각각의 단백질 AFP, AFM 및 DBP를 포함할 수 있거나, 치료학적 활성을 안정화시키거나 연장시킬 수 있는 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 10개 이상의 아미노산 길이일 수 있거나, 각각의 단백질 서열의 약 15개, 20개, 25개, 30개, 50개 이상의 연속 아미노산을 포함할 수 있거나, 각각의 단백질의 특이적 도메인의 일부 또는 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 알부민 계열 구성원 융합 단백질은 AFP, AFM 및 DBP의 천연 발생 다형태의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 단백질은 임의의 척추 동물, 특히, 임의의 포유동물, 예를 들어, 사람, 원숭이, 소, 양 또는 돼지로부터 유도될 수 있다. 비-포유동물 알부민 계열 구성원은 닭 및 연어로부터 유도된 것들을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
항원-결합 도메인이 없는 IgG 및 IgG-단편은 또한 HLEP로서 사용될 수 있다. 상기 치료학적 폴리펩타이드 부분은 바람직하게, 절단될 수도 있는, 항체의 힌지 영역 또는 펩타이드 링커를 통해, IgG 또는 IgG 단편에 연결된다. 다수의 특허 및 특허원은 치료학적 단백질의 생체내 반감기를 연장시키기 위한 치료학적 단백질의 면역글로불린 불변 영역으로의 융합을 기재하고 있다. 미국 특허원 제 2004/0087778호 및 WO 2005/001025는 펩타이드의 반감기를 증가시키고, 그렇지 않으면 생체내에서 신속하게 분해되는 Fc 도메인 또는 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부와 생물학적 활성 펩타이드의 융합 단백질을 기재하고 있다. 생물학적 활성이 증진되고 순환 반감기가 지연되고 보다 큰 용해도를 갖는 Fc-IFN-β 융합 단백질이 문헌[참조: WO 2006/000448]에 기재되어 있다. 지연된 혈청 반감기 및 증가된 생체내 효능을 갖는 Fc-EPO 단백질 및 G-CSF는 G-CSF(WO 2003/076567), 글루카곤-유사 펩타이드-1(WO 2005/000892), 응고 인자(WO 2004/101740) 및 인터류킨-10(US 6,403,077)(상기 모두는 반감기 연장 성질을 갖는다)과의 Fc 융합체가 기재되어 있다(WO 2005/063808).
따라서, 상기 면역글로불린 서열, 바람직하게는 Fc 단편 및 이의 변이체는 HLEP로서 사용될 수 있다. 인페스틴-4와 같은 Kazal형 세린 프로테아제 억제제 및 SPINK-1 돌연변이체와 같이 FXIIa에 대해 증진된 억제 특이성을 갖는 변형된 Kazal형 세린 프로테아제 억제제는 HLEP로서, Fc 도메인 또는 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부와 융합시키고 이. 콜라이, 효모, 곤충, 식물 또는 척추동물 세포 또는 형질전환 동물에서 발현시킬 수 있다. SPINK-K2-Fc 융합 단백질은 서열번호 53으로 예시적으로 나타낸다.
본 발명에 따라, 바람직한 FXII 억제제는 인페스틴-4와 같은 Kazal형 세린 프로테아제 억제제 및 SPINK-1 돌연변이체 또는 이의 단편 또는 변이체와 같이 변형된 Kazal형 세린 프로테아제 억제제를 HLEP 또는 이의 단편 또는 변이체의 N- 또는 C-말단이 연결시켜, 형성된 융합 단백질이, HLEP에 연결되지 않은 상응하는 Kazal형 세린 프로테아제 억제제와 비교하여, 증가된 생체내 반감기를 갖도록 하는 융합 단백질이다. 삽입 펩타이드 링커는 치료학적 펩타이드와 HLEP 사이에 도입될 수 있다. HLEP가 예를 들어, 입체 장해에 의해 치료학적 폴리펩타이드의 특이적 활성을 방해하는 경우, 절단가능한 링커가 도입될 수 있다. 링커 절단을 위해 바람직한 효소는 내인성 응고 경로의 응고 프로테아제, FXIIa, FXIa, FIXa, FVIIIa 또는 FXa이고, 여기서 가장 바람직한 절단 효소는 FXIIa이다.
상기 Kazal형 세린 프로테아제 억제제 계열은 세린 프로테아제 억제제의 수많은 계열 중 하나이다. 상이한 종 기원의 많은 단백질이 기재되어 있다[문헌참조: Laskowski M and Kato I. 1980. Protein inhibitors of proteinases. Ann. Rev. Biochem. 49: 593-626].
상기 정의내에 "인페스틴-4 및 변형된 Kazal형 세린 프로테아제 억제제"는 천연 아미노산 서열 또는 서열번호 30 내지 33 또는 49 내지 52의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 그러나, 상기 정의는 또한 약간 변형된 아미노산 서열, 예를 들어, 폴리펩타이드가 각각의 Kazal형 세린 프로테아제 억제제의 활성을 실질적으로 보유하는 한, 말단 아미노산 결실 또는 첨가를 포함하는 변형된 N-말단 또는 C-말단을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 정의내 "Kazal형 세린 프로테아제 억제제"는 또한 개체마다 존재하고 발생할 수 있는 천연 대립형질 변형을 포함한다. 상기 정의내 "Kazal형 세린 프로테아제 억제제"는 Kazal형 세린 프로테아제 억제제의 변이체를 추가로 포함한다. 상기 변이체는 야생형 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이하다. 상기 차이의 예는 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들어, 1 내지 10개의 아미노산 잔기)의 N- 및/또는 C-말단의 절단, 또는 N- 및/또는 C-말단에서의 하나 이상의 추가 잔기의 첨가, 및 보존적 아미노산 치환, 즉, 유사한 특징, 예를 들어, (1) 소형 아미노산, (2) 산성 아미노산, (3) 극성 아미노산, (4) 염기성 아미노산, (5) 소수성 아미노산, 및 (6) 방향족 아미노산을 갖는 아미노산 그룹 내에서 수행된 치환들을 포함할 수 있다. 상기 보존성 치환의 예는 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
본 발명의 Kazal형 세린 프로테아제 억제제 및 변형된 Kazal형 세린 프로테아제 억제제는 세균, 효모, 식물, 동물(곤충 포함) 또는 사람 세포주와 같은 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서, 또는 WO 2008/098720에 따른 형질전환 동물에서 재조합 분자로서 제조될 수 있다. 임의로, 상기 폴리펩타이드는 숙주 세포로부터 분비된다.
투여의 용량, 제형 및 경로
FXII 억제제, 특히 본 발명의 세린 프로테아제 억제제를 80% 초과의 순도, 보다 바람직하게는 95% 초과의 순도로 정제하는 것이 바람직하고, 오염성 거대 분자, 특히 기타 단백질 및 핵산에 대해 순도 99.9% 초과이고, 감염성 제제 및 발열성 제제가 없는 약제학적으로 순수한 상태인 것이 특히 바람직하다. 바람직하게, 본 발명의 분리되거나 정제된 세린 프로테아제 억제제는 다른 폴리펩타이드가 실질적으로 없다.
본원에 기재된 치료학적 FXII 억제제는 치료학적 용도를 위해 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 상기 정제된 단백질 또는 항체는 약제학적 제제를 제공하기 위해 임의로 약제학적 부형제 및 담체가 첨가될 수 있는 통상적인 생리학적 혼화성 완충 수용액 중에 용해시킬 수 있다.
광범위한 약제학적으로 허용되는 부형제 및 담체는 당업계에 공지되어 있다. 상기 약제학적 담체 및 부형제, 및 적합한 약제학적 제형은 다양한 공보에 상세히 기재되어 있다(예를 들어, 문헌("Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) 또는 "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000) A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc)을 참조한다). 특히, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 동결건조되거나 안정한 가용성 형태로 제형화할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 다양한 과정에 의해 동결건조시킬 수 있다. 동결건조된 제형은 사용 전에 주사용 멸균수 또는 멸균 생리학적 염수 용액과 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제를 첨가하여 재구성된다.
본원의 방법에서, 상기 억제제(들)는 목적하는 치료학적 효과를 유도할 수 있는 임의의 통상적인 수단을 사용하여 개체에 투여될 수 있다. 따라서, 상기 제제는 치료학적 투여를 위해 다양한 제형에 혼입될 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 제제는 적당한, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 약제학적 조성물로 제형화될 수 있고, 정제, 캅셀제, 산제, 입제, 연고, 용제, 좌제, 주사제, 흡입제 및 에어로졸과 같은, 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있다.
이와 같이, 제제의 투여는 경구, 협측, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 경피, 기관내 등의 투여를 포함하는 다양한 방식으로 성취될 수 있고, 즉, 상기 조성물의 제형은 임의의 약제학적으로 적합한 투여 수단에 의해 개체에 전달된다. 다양한 전달 시스템은 공지되어 있고 임의의 통상적인 경로에 의해 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물은 전신 투여된다. 전신 용도를 위해, 본 발명의 치료학적 단백질은 통상적인 방법에 따른 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하내, 근육내, 복강내, 대뇌내, 폐내, 비강내 또는 경피) 또는 장(예를 들어, 경구, 질 또는 직장) 전달용으로 제형화된다. 가장 바람직한 투여 경로는 정맥내 또는 폐내 투여이다. 상기 제형은 주입 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 일부 제형은 서방출 시스템을 포함한다.
경구 투여를 위한 정제 및 캅셀제는 결합제, 충전제, 윤활제 및 습윤제 등과 같은 통상적인 부형제를 함유할 수 있다. 경구 액체 제제는 수성 또는 유성 현탁제, 용액, 에멀젼, 시럽제, 엘릭시르제 등의 형태일 수 있거나, 사용을 위해 물 또는 다른 적합한 비히클과 재구성하기 위한 무수 생성물로서 제공될 수 있다. 상기 액체 제제는 현탁제, 유화제, 비-수성 비히클 및 방부제와 같은 통상적인 첨가제를 함유할 수 있다.
일반적으로, 경구 제제를 위한 제제는 단독으로 사용되거나 정제, 산제, 입제 또는 캅셀제를 제조하기 위해 적당한 첨가제와 조합하여, 예를 들어, 통상적인 첨가제, 예를 들어, 락토스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 조합하거나; 결합제, 예를 들어, 결정성 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 조합하거나; 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분, 감자 전분 또는 나트륨 카복시메틸셀룰로스와 조합하거나; 윤활제, 예를 들어, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 조합하거나; 경우에 따라, 희석제, 완충제, 습윤제, 방부제 및 향미제와 조합하여 사용될 수 있다.
국소 적용에 적합한 제형은 수성 또는 유성 현탁제, 용액, 에멀젼, 겔, 또는 바람직하게는 에멀젼 연고의 형태일 수 있다. 분무 적용에 유용한 제형은 분무가능한 액체 또는 무수 분말 형태일 수 있다.
상기 제제는 이들을 수성 또는 비-수성 용매, 예를 들어, 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세라이드, 고급 지방족 산의 에스테르 또는 프로필렌 글리콜 중에, 그리고 경우에 따라 가용화제, 등장성 제제, 현탁제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 통상적인 첨가제와 함께, 용해시키거나, 현탁시키거나, 유화시킴에 의해 제제로 제형화될 수 있다.
추가로, 상기 제제는 유화 염기 또는 수용성 염기와 같은 다양한 염기와 혼합하여 좌제로 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물은 좌제를 통해 직장으로 투여될 수 있다. 상기 좌제는 체온에서 용융되지만 실온에서는 고형화되어 있는 코코아 버터, 카보왁스 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비히클을 포함할 수 있다.
약제학적 용량 형태에서, 상기 제제는 이들의 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 투여될 수 있거나, 이들은 또한 단독으로 사용되거나, 다른 약제학적 활성 화합물과의 조합뿐만 아니라 적당히 연합하여 사용될 수 있다. 하기의 방법 및 부형제는 단순히 예시적인 것이고, 어떠한 방식으로든지 제한되지 않는다.
본 발명의 FXII 억제제는 치료학적 유효 용량으로 환자에게 투여되고, 상기 유효 용량은 목적하는 효과를 나타내는데 충분하고, 허용되지 않는 역효과를 나타내는 용량에 도달하지 않고, 병태 또는 징후의 중증도 또는 확산을 예방하거나 감소시키는 용량을 의미한다. 상기 정확한 용량은 예를 들어, 징후, 제형 및 투여 경로와 같은 많은 인자에 의존하고 각각의 징후에 대한 임상전 및 임상 시험에서 결정되어야만 한다.
시럽제, 엘릭시르제 및 좌제와 같은 경구 또는 직장 투여용의 단위 용량 형태가 제공될 수 있고, 여기서 각각의 용량 단위, 예를 들어, 티 스푼, 테이블 스푼의 정제 또는 좌제는 하나 이상의 억제제를 함유하는 미리 결정된 양의 조성물을 함유한다. 유사하게, 주사 또는 정맥내 투여용의 단위 용량 형태는 조성물 내에 멸균수, 정상 염수 또는 다른 약제학적으로 허용되는 담체 중의 용액으로서 억제제(들)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단위 용량 형태"는 사람 및 동물 피검체용의 단일 용량으로 적합한 물리적으로 별개인 단위를 나타내고, 각각의 단위는 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 비히클과 회합하여 목적하는 효과를 나타내기에 충분한 양으로 계산되는 미리 결정된 양의 본 발명의 화합물을 함유한다. 본 발명의 신규 단위 용량 형태에 대한 세부 항목은 사용되는 특정 화합물 및 성취될 효과 및 숙주에서 각각의 화합물과 관련된 약동학에 의존한다.
당업자는 용량 수준이 특이적 화합물, 증상의 중증도 및 피검체의 부작용에 대한 민감성의 함수로서 다양할 수 있음을 인지할 것이다. 소정의 화합물에 대해 바람직한 용량은 다양한 수단에 의해 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 바람직한 수단은 소정의 화합물의 생리학적 효능을 측정하는 것이다.
적용 방식에 의존하여, 상당히 낮은 용량이 iv 주사에 의한 전신 투여와 비교하여 흡입 또는 분무용으로 실행가능할 것이다.
약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료학적 제제와 연계하여 투여될 수 있다. 이들 제제는 동일한 약제의 일부로서 혼입될 수 있다.
본 발명의 다양한 생성물은 섬유증식성 간질성 폐 질환의 치료요법을 위한 의약으로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 FXII 억제제, 특히 본원에 기재된 바와 같은 Kazal형 세린 프로테아제 억제제 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 언급된 치료요법, 즉, 현저한 폐 섬유증, 바람직하게는 특발성 폐 섬유증을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 변형된 DNA는 또한 사람 유전자 치료요법에 사용하기 위한 전달 벡터에 통합될 수 있다.
FXII에 대한 특이적 siRNA는 FXII 발현의 하향-조절 또는 녹-다운을 위해 사용될 수 있다.
상기된 실시형태들 중 어느 하나는 본 발명의 억제제, 본 발명의 방법, 본 발명의 용도 및 본 발명의 키트에 적용될 수 있고, 이들이 이들 카테고리 중 하나와 조합한 경우에 대해서만 기재된 것과는 상관없이 적용될 수 있다.
실시예
방법
마우스에서의 간질성 블레오마이신의 투여
무게가 20 내지 22g인 수컷 마우스를 모든 실험에 사용하였다. 동물은 NIH 지침에 따라 유지하였고, 실험은 지역 행정관의 허가하에 착수하였다. 상기 동물은 케타민 하이드로클로라이드와 크실라진 하이드로클로라이드의 혼합물을 복강내 주사하여 마취시켰다. 체중 kg 당 5U 용량의 블레오마이신을 에어로졸로서 투여하였다. 블레오마이신 전달을 위해, 동물에 경구 기관 삽관하고 기계적으로 통기시켰다. 미세분무기(Penn-Century Inc, Philadelphia, PA)에 블레오마이신을 함유하는 100㎕의 염 용액을 충전시키고, 기관 캐뉼라에 도입하고, 카리나 약간 위에 위치시키고, 시린지를 신속하게 비워서 호기-종말(end-expiratory) 호흡 정지하에 에어로졸 생성을 성취하였다. 대조군 마우스에 단지 비히클(0.9% 염수)를 투여하였다. 둘 다 0.9% 염수에 희석된 5mg/kg의 CTI 및 8mg/kg의 PCK를 각각 마우스 체중당 용량으로 9일, 12일, 15일 및 18일째 기관내 투여하였다. 상기 마우스는 치사 용량의 케타민 및 크실라진으로 적용한지 21일 후(달리 지적되지 않는 경우)에 희생시켰다.
폐 탄성 측정
마우스를 기관절개하고 0 kPa의 양성 호기-종말 압력에서 용량 구동된 방식으로 통기시켰다. 호흡 속도는 분당 20 호흡으로 설정하였고, 통기압은 200㎕의 호흡량에서 폐를 팽창시키는 동안 기록하였다.
폐 제조
동물을 희생시킨 후, 흉부를 개방하고, 폐를 폐 동맥에 위치된 카테터를 통해 PBS 완충액으로 세척하였다. 용출액에 혈액이 나타나지 않으면, 폐를 제거하고 추가의 실험을 위해 파라포름알데하이드 또는 질소하에 위치시켰다. 세포 분리를 위해, 폐를 PBS 완충액 중에 위치시켰다.
뮤린 및 사람 폐 섬유아세포의 분리 및 세포 배양
폐 실질조직의 사람 폐 표본 및 마우스 폐를 1mm3 미만의 조각으로 토막내었다. 상기 토막낸 조각을 PBS로 2회 세척하고, 이어서 100-mm 접시(Greiner-bio-one, Frickenhausen, Germany)에 분주하였다. 상기 표본을 37℃에서 5% CO2의 습윤화된 대기에서, 10% 태아 소 혈청(FCS; HyClone, South Logan, UT) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)이 보충된 듈베코 변형된 이글 배지(DMEM; Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에서 배양하였다. 분리된 섬유아세포의 순도는 비멘틴, 피브로넥틴 및 콜라겐 IV에 대한 양성 염색으로 입증하였다. 모든 실험은 3회 내지 4회 계대된 폐 섬유아세포로 수행하였다. 상기 마우스 NIH3T3 섬유아세포는 37℃에서 5% CO2의 습윤화된 대기에서, 10% FCS, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하였다.
폐 조직 및 폐포 상피 II 형 세포의 미세절개
폐의 동결된 표본을 저온 유지장치에서 10㎛로 절개하고, 피복되지 않은 얇은 유리 슬라이드상에 탑재하고 45초 동안 해말라운(Roth)으로 염색시켰다. 이어서, 사용할 때까지 상기 절편을 70% 및 96%의 에탄올 중에 침지시켰다. 10개 이하의 절편은 저장 시간을 제한하기 위해 즉시 제조하였다. 폐 표본의 선택된 영역은 가시적 제어하에 레이저-미세절개하였다(PALM, Bernried, Germany). 조직은 시린지 바늘로 수거하고 10㎕의 제1 스트랜드 완충액(52 mM Tris pH 8.3, 78 mM KCl, 3.1 mM MgCl2)을 함유하는 반응 튜브로 전달하였다. 샘플은 액체 질소에서 동결시키고 추가의 제조를 위해 저장하였다. 폐포 II형 세포 미세절개를 위해, 저온 유지장치 절편(10㎛ 두께)을 폴리-L-라이신(0.01 %; Sigma, Deisenhofen, Germany)-커버된 슬라이드상에 탑재하고 5분 동안 아세톤 중에서 보관하였다. proSP-C 염색을 위해, 폴리클로날 토끼 항 pro-SP-C 항체를 적용하고(PBS 중 1:100; Chemicon, Temecula, CA), 이어서 FITC-표지된 염소 항-토끼 IgG(PBS 중 1:40, Santa Cruz Biotechnology, CA)로 항온처리하였다. 2개 이하의 절편은 보관 시간을 제한하기 위해 즉시 제조하였다. 폐포 II형 세포는 이들의 염색 패턴에 따라 선별하고, 가시적 조절하에 레이저-미세절개하였다. 각각 50개 세포 프로필을 갖는 샘플을 액체 질소 중에서 순간 동결시키고 추가의 제조를 위해 보관하였다.
RNA 분리 및 역전사효소 반응
총 RNA를 제조업자의 지침에 따라 PeqGOLD 총 RNA 키트(PeqLab, Erlangen, Germany)를 사용하여 추출하였다. 폐 균질물, 미세절개된 폐 표본, 분리된 섬유아세포 또는 미세절개된 ATII 세포로부터 각각 수득된 1μg의 RNA를 Rnase 비함유수(최종 용적 20㎕) 중에 4㎕ 5x 제1 스트랜드 완충액(FSB, 52mM TRIS pH 8.3, 78 mM KCl, 3.1 mM MgCl2), 2㎕ dNTP(각각 10mM, Fermentas, St. Leon-Rot, Germany), 1㎕의 무작위 헥사머(50 μM), 1㎕ DDT(0.1 M), 1㎕ Rnase 억제제(40U/㎕) 및 1㎕ MuLV 역전사효소(200U/㎕, 모두 (제조원: Applied Biosystems, Foster City, CA)으로부터 구입됨)를 함유하는 반응에 사용하였다. 상기 반응물을 1시간 동안 43℃에서 항온처리하고, 이어서 2분 동안 94℃에서 항온처리하였다(TGradient Thermocycler, Biometra, Goettingen, Germany).
실시간 PCR
실시간 PCR은 서열 검출 시스템 7700(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)에 의해 수행하였다. 반응은 2ml의 cDNA를 사용하는 백금 SYBR 그린 qPCR 슈퍼 믹스-UDG(Invitrogen Karlsruhe, Germany)로 설정하였다. β-액틴 유전자를 표준 유전자로서 사용하였다. 사이클링 조건은 6분동안 95℃이었고, 20초 동안 95℃, 30초 동안 55℃ 및 30초 동안 73℃에서의 45 사이클이 이어졌다. 용융 곡선 분석 및 겔 전기영동을 수행하여 예상된 PCR 생성물의 배타적 증폭을 확인하였다. 유전자 발현은 이미 기재된 바와 같은 2-△△CT 방법을 사용하여 평가하였다. 내인성 대조군 β-액틴에 상대적인 표적 유전자의 배수 변화는 방정식 배수 변화 =2-△△CT(여기서, -△△CT=(Ct 표적 - Ct액틴)처리된-(Ct 표적-Ct액틴)대조군이다)을 사용하여 결정하였다. 프라이머 서열은 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
단백질 분리 및 정량
수거된 세포 및 동결된 폐 표본은 프로테아제 억제제 칵테일(Roche, Mannheim, Germany)을 함유하는 RIPA 완충액(50mM TRIS-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton-X-100, 1% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS) 중에서 용해시켰다. 용해물을 빙상에서 30분 동안 항온처리하고, 이어서 원심분리(4℃에서 10분동안 10000rpm)하였다. 상청액을 새로운 튜브에 위치시키고, -80℃에 보관하였다. 단백질 정량은 제조업자의 지침에 따라 BCA™ 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 수행하였다. 상이한 소 혈청 알부민 (BSA) 농축물을 표준물로서 사용하였다.
SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
단백질 샘플을 5x SDS-로딩 완충액(0.25 mol/l Tris-HCl pH 6.8, 10%(w/v) SDS, 50% 글리세롤, 10% β-머캅토에탄올)과 혼합하고, 10분동안 비등시키고, SDS 아크릴아미드 겔(스택킹 겔: 4% 아크릴아미드:비스아크릴아미드, 125mM Tris-HCl pH 6.8, 0.1 %(w/v) SDS, 0.1 %(w/v) APS, 0.1 %(v/v) TEMED; 분리 겔(10%): 10% 아크릴아미드:비스아크릴아미드, 375mM Tris-HCl pH 8.8, 0.1 %(w/v) SDS, 0.1 % (w/v) APS, 0.1 %(v/v) TEMED)에 로딩하고, 100V에서 SDS-전개 완충액(25mM Tris, 250mM 글라이신, 0.1 %(w/v) SDS) 중에서 전개하였다.
면역블롯팅
SDS 폴리아크릴아미드 겔상에 분리된 단백질은 100V에서 1시간 동안 전달 완충액(25mM Tris, 192mM 글라이신, 20%(v/v) 메탄올) 중에서 습윤 전달 기술을 사용하여 PVDF 막(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)으로 전달하였다. 0.1% (v/v) Tween 20(TBS-T)을 함유하는 트리스-완충 염수(TBS; 25 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, pH 7.5) 중에서 5% 탈지 분유로 블록킹한 후, 상기 막을 TBS-T 중의 1% BSA로 희석된 적당한 1차 항체와 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 퍼옥시다제-표지된 2차 항체(모두 Dako, Gostrup, Denmark로부터 시판됨)와 1시간 항온처리한 후, 단백질을 ECL 플러스 키트(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)를 사용하여 검출하였다. 겔상에 로딩된 단백질의 양을 결정하기 위해, 블롯을 1시간 내에 생성시키고(스트립핑 완충액: 100mM 글라이신, 1 % HCl), 항-β-액틴 또는 적당한 항-pan 항체를 사용하여 재탐침하였다.
면역세포화학
면역세포화학 분석을 위해, HLF를 10분 동안 4% 파라포름알데하이드로 고정화시키고, 인산-완충 염수(PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HP04, 2mM KH2P04, pH 7.4) 중의 0.2 % 트리톤 X-100으로 10분동안 침투시키고, 1시간 동안 실온에서 PBS 중의 3% BSA로 블록킹하고, 하기의 항체 중 하나와 4℃에서 밤새 항온처리하였다: 마우스 항-FXII, 토끼-항-콜라겐 IV, 마우스 항-피브로넥틴(모두 Abeam으로부터 시판됨), 염소 항-비멘틴(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 및 토끼 항-인-Smad 3(세포 시그날 전달). 슬라이드를 로다민-접합된 2차 항체(Dianova, Hamburg, Germany)와 항온처리하고, 벡타쉴드 탑재 매질(Vector, Burlingame, CA)과 함께 탑재하였다. 핵을, 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; Sigma) 염색을 사용하여 가시화하였다. 대조군은 1차 항체를 비-특이적 항체로 치환함에 의해 수행하였다. 이미지를 실온에서 40'/1.25-0.75 오일-대물렌즈를 사용하는 Leica DMR 현미경(Leica, Heidelberg, Germany)으로 캡쳐하고 MetaMorph 7.0(Molecular Devices, Downingtown, PA)을 사용하여 사진촬영하였다. 도시된 모든 이미지는 적어도 3개의 독립적인 절편 상에 나타나는, 절편당 적어도 4개의 다른 영역을 대표한다.
면역조직화학
파라핀-매립된, 포르말린-고정화된 폐 조직을 5 마이크론으로 절개하고 제조업자의 지침에 따라 적당한 1차 항체 및 ZytoChem 플러스 AP-패스트 레드 키트를 사용하는 면역조직화학적 염색을 위해 가공하였다(Zytomed Systems, Berlin, Germany). 음성 대조군은 1차 항체를 제거함에 의해 모든 경우에서 수득되었다.
증식 검사
원발성 뮤린 폐 섬유아세포를 48웰 플레이트에 씨딩하고, FXIIa(American Diagnostica, Stamford, CT) 자극 전에 24시간 동안 무혈청 DMEM(둘베코 변형 이글 배지)에서 영양물이 공급되지 않도록 하였다. 몇몇 실험에서, 세포는 FXIIa에 노출되기 1 내지 2시간 전에 5μg/ml의 항-uPAR(R&D Systems, Wiesbaden, Germany), 항-β1-인테그린 또는 항-α5-인테그린(모두 Millipore, Billerica, MA로부터 구입함) 블록킹 항체와 예비 항온처리하였다. 추가로, 몇몇 실험에서, 10.0 μM PD98059, 5 μM SP600125, 0.7 μM Wortmannin, 3 μM SB203580(모두 Calbiochem, Darmstadt, Germany로부터 구입함)을 FXIIa를 첨가하기 1 내지 2시간 전에 세포 배양 배지에 첨가하였다. 세포는 단독으로 또는 이의 특이적 억제제: 옥수수 트립신 억제제(CTI, Calbiochem), H-D-Pro-Phe-Arg-클로로메틸케톤(PCK, Bachem, Weil am Rhein, Germany) 또는 uPAR 합성 펩타이드의 존재하에 3 내지 9μg/ml의 FXIIa로 처리하였다. 24 내지 36시간 후, 상기 세포는 6 내지 12시간 동안 [3H]티미딘(웰당 0.2μCi)에 노출시키고, PBS로 3회 세정하고, 0.2ml의 0.5M 수산화나트륨으로 가용화시켰다. 0.1ml의 가용화된 물질을 액체 섬광 계수(TRI-CARB® 1500, A Canbera Company, Meriden, CT)에 의해 정량하였다. [3H]티미딘 혼입은 절대 방사능활성(웰당 분당 계수)으로 나타내었다.
면역침전
1차 뮤린 섬유아세포는 비자극하거나 30분 동안 6μg/ml의 FXIIa로 자극하고, 20mM HEPES pH=7.5, 10mM EGTA, 40mM β-글리세로포스페이트, 1% Triton X-100, 2.5mM MgCl2, 1mM DTT, 2mM PMSF, 20μg/ml 아프로티닌, 20μg/ml의 류펩틴, 2mM의 나트륨 바나데이트를 함유하는 완충액 중에서 용해시켰다. 37℃에서 30분 항온처리한 후, 불용성 물질을 4℃에서 10분 동안 1000rpm으로 원심분리하여 펠렛을 형성하도록 하였다. 100㎕의 세포 용해물은 추가로 5μg의 염소 항-uPAR 항체(Santa Cruz) 또는 염소 IgG 대조군 항체(R&D Systems)로 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이어서, 100㎕의 G-세파로스(Amersham Biosciences)를 첨가하고, 면역 복합체는 1시간 동안 4℃에서 결합하도록 방치하였다. 이어서, 상기 비드는 용해 완충액으로 4회 세척하고, 흡수된 물질은 2x SDS 로딩 완충액 중에서 용출시켰다. 비등시킨 후, uPAR 결합 단백질은 마우스 항-FXII 항체(Abcam)를 사용하는 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.
FXII 프로모터 작제물의 제조 및 부위-지시된 돌연변이유발
사람 FXII 프로모터 단편들은 제조업자의 지침에 따라 긴 PCR 효소 믹스(Mix)(Fermantas, St. Leon-Rot, Germany)를 사용하여 사람 폐 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 사이클링 조건은 다음과 같다: 5분 동안 95℃에 이어서, 30초 동안 95℃, 30초 동안 55℃ 및 3분 동안 72℃에서 35 사이클. 하기의 프라이머를 사용하였다: 사람 FXII-1630 정배향 5'-CCGCTCGAGTGCTCTGTGCTTAGTAACC-3' (서열번호 17); 사람 FXII-907 정배향 5'-CCGCTCGAGCAGCTACCCAGGAGGCT-3' (서열번호 18); 사람 FXII-577 정배향 5'-CCGCTCGAGGCGTGGTGGTGGGCTCCT-3' (서열번호 19); 사람 FXII-299 정배향 5'-CCGCTCGAGCTTAACCTCCTGATCTCC-3' (서열번호 20); 사람 FXII-183DSBE-272 정배향 5'-CCGCTCGAGAAACTCCCAAACTTTCC-3' (서열번호 21); 사람 FXII 역배향 5'-CCCAAGCTTC-GTTGGTCCAGCTGCCTATC-3 (서열번호 22)'. PCR 단편을 XhoI 및 HindIII 제한 부위(굵게 표시)를 사용하여 pGL3 인핸서 벡터(Promega, Mannheim, Germany)에 클로닝하였다. 점 돌연변이는 제조업자의 지침에 따라 퀵 체인지 부위 지시된 돌연변이유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 pGL3-299 작제물중의 CAGA 박스에 도입하였다. 하기의 프라이머를 사용하였다: 사람 FXII-299C/T 정배향 5'-CCACAGGACCTAGAGCATAAGAATG-3' (서열번호 23), 사람 FXII-299C/T 역배향 5'-CATTCTTATGCTCTAGGTCCTGTGG-3' (서열번호 24). CAGA 박스로의 성공적인 클로닝 및 돌연변이의 삽입은 서열분석에 의해 확인하였다.
일시적 형질감염 및 루시퍼라제 분석
NIH3T3 세포는 제조업자의 지침에 따라 FuGene6 (Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여 지적된 플라스미드로 형질감염시켰다. 48시간 후 세포는 비자극되거나 10 ng/ml TGF-β1(R&D Systems)로 추가의 24시간 동안 자극되었다. 이어서, 상기 세포를 수거하고 제조업자의 지침에 따라 프로메가 루시퍼라제 검사 키트를 사용하여 루시퍼라제 리포터 활성에 대해 검사하였다. pEGF-N1(Clontech, Mountain View, CA) 대조군 벡터와 동시형질감염을 사용하여 형질감염 효율에 대해 정규화하였다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드
사람 Samd 3(Dharmacon, Chicago, IL), 사람 JNK1(Abnova, Heidelberg, Germany), 및 범용 음성 대조군 siRNA(Ambion, Austin, TX)에 대해 지시된, 예비 디자인된 시판되는 siRNA 서열을 사용하였다. 세포를 X-treme 유전자 siRNA 형질감염 시약(Roche)을 사용하여 siRNA(각각 250nM)로 처리하였다. 표적 유전자의 siRNA-매개된 하향조절은 웨스턴 블롯팅에 의한 형질감염 72시간 후에 평가하였다. 이러한 시점에서, 세포는 비자극하거나 24시간 동안 10 ng/ml TGF-β1로 자극하고 FXII에 대한 웨스턴 블롯을 상기된 바와 같이 제조하였다.
염색질 면역침전( ChIP )
ChIP는 제조업자의 지침에 따라 염색질 면역침전 검사 키트(제조원: Millipore(Schwalbach, Germany))를 사용하여 수행하였다. 간략하게, 비자극되거나 10 ng/ml TGF-β1 (R&D Systems)로 자극시킨 NIH3T3 세포를 10분 동안 1% 포름알데하이드로 처리하였다. 이어서, 교차-연결된 염색질을 제조하고, 평균 크기가 500 내지 800bp가 되도록 초음파 처리하였다. DNA 단편은 토끼 항-Smad 3 항체(세포 시그날 전달) 또는 IgG 이소형 대조군과 4℃에서 밤새 면역침전시켰다. 교차 연결의 전환 후, 면역침전된 염색질을 하기의 프라이머를 사용한 PCR로 증폭시켰다: 사람 FXII-299 bp 정배향: 5'-CTTAACCTCCTGATCTCC-3' (서열번호 25); 사람 FXII-299 bp 역배향: 5'-CGTTGGTCCAGCTGCCTATC-3' (서열번호 26). PCR 생성물은 2% 아가로스 겔상에서 분리하고 에티디움 브로마이드 염색으로 가시화하였다.
스트렙트아비딘 풀-다운 검사
SBE를 가로지르는 이중-가닥 비오티닐화된 DNA 단편(SBE-283/-258: 5'-비오틴-CTTAACCTCCTGATCTCCACAGGACCCAGAGCATAAGAATGTCCC-3' (서열번호 27) 또는 SBE-283/-258 C/T: 5'-비오틴-CTTAACCTCCTGATCTCCACAGGACCTAGAGCATAAGAATGTCCC-3') (서열번호 28)을 20μg의 핵 추출물, 20 pmol/㎕의 비오티틸화된 주형, 및 1㎍의 폴리(dl-dC)를 함유하는 100ml의 결합 반응물에서 단백질 상호작용에 대해 검사하였다. 1시간 동안 30℃에서 항온처리한 후, 결합 완충액(20 mM Hepes(pH 7.9), 80 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 %(v/v) 글리세롤, 2 mM DTT, 500 ㎍/ml의 BSA 및 0.05 %(v/v) Nonidet P-40) 중에서 예비-평형화된 스트렙트아비딘 MagneSphere 상자성 입자(Promega)를 반응물에 첨가하고, 30℃에서 추가로 1시간 동안 항온처리하였다. DNA-단백질 복합체는 자기 장치(Dynal MPC®-E, Magnetic Particle Concentrator)를 사용하여 세척 완충액(20 mM HEPES(pH 7.9), 50 mM KCl, 6.25 mM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 2 mM DTT, 및 8.5 %(v/v) 글리세롤)으로 3회 세척하였다. 비등시킨 후, DNA-결합된 단백질은 토끼 항-인 Smad 3 항체(세포 시그날 전달)을 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 핵 추출물은 제조업자의 지침에 따라 NE-PERN 핵 및 세포질 추출 시약(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 제조하였다.
통계
데이터는 달리 언급되지 않는 경우, 평균 ± SD로 나타낸다. 정상적인 분포는 샤피로-윌크 시험으로 분석하였다. 2개의 집단간에 통계학적 비교는 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-시험에 의해 수행하였다. 다수의 그룹간의 차이는 원-웨이 ANOVA에 이어서 터키 포스트 시험 또는 크러스컬-월리스에 이어서 듄의 포스트 시험으로 비교하였다. p<0.05의 수준은 통계학적으로 유의적인 것으로 고려되었다. 생존 곡선 간의 통계학적 유의성은 로그-랭크 시험에 의해 평가하였다.
결과
FXII , FXI 및 HMWK 의 발현은 특발성 폐 섬유증 폐에서 변화한다.
특발성 폐 섬유증(IPF)의 병리학에서 고유 응고 경로 성분의 잠재적인 역할을 밝히기 위해, IPF 환자 및 공여체 기원의 폐 조직내 FXII, FXI 및 HMWK의 발현을 정량적 실시간 (q)RT-PCR을 사용하여 분석하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, FXII 및 HMWK mRNA 수준은 IPF 폐 표본에서 현저히 상향조절되었다. 고유 응고 경로 성분의 세포-특이적 발현은 원발성 사람 폐포 상피 세포 II형(ATII) 및 IPF 환자 및 공여체의 폐로부터 유도된 섬유아세포에서 정량하였다. IPF 폐 조직으로부터 분리된 폐 섬유아세포는 공여체 폐 기원의 세포보다 높은 수준으로 FXII mRNA를 발현하였다. FXII mRNA는 ATII 세포에서 검출되지 않았다. IPF 환자의 폐로부터 유도된 ATII 세포 및 폐 섬유아세포내 FXI 및 HMWK 발현은 공여체 샘플과 비교하여 변화하지 않았다. 추가로, IPF 조직의 섬유증(도 1f) 및 건강한(도 1h) 영역으로부터 미세절개된 폐포 격막에서의 FXII, FXI 및 HMWK의 발현을 분석하였다(도 1b). IPF 폐 기원의 건강한 영역에서 FXII, FXI 및 HMWK의 mRNA 수준은 공여체 조직과 비교하여 변화하지 않았다(도 1c). 대조적으로, IPF 폐의 섬유증 영역에서는 FXII, FXI 및 HMWK 유전자가 상당히 상향조절되었다.
mRNA 발현과 일치하여, FXII 및 HMWK의 단백질 수준은 IPF 폐에서 상향조절되었다. IPF 폐에서 FXI 단백질의 발현은 변화하지 않았다(도 2a). FXII 발색 기질을 사용한 활성 검사는 IPF 환자 기원의 기관지폐포 세척 유액(BALF)에서 증가된 효소 활성 FXII를 입증하였다(도 2b). 수행된 검사의 특이성은 이의 억제제인 옥수수 트립신 억제제(CTI)에 의한 FXII 활성의 차단에 의해 입증되었다.
FXII, FXI 및 HMWK의 면역조직화학 염색을 수행하여 공여체 및 IPF 폐에서 이들 인자의 국소화의 특징을 분석하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 모든 고유 응고 인자의 발현은 공여체 조직과 비교하여 IPF 절개부에서 현저히 증가하였다. FXII의 가장 강한 면역반응성은 섬유아세포, 및 ATII 세포의 표면상에서 관찰되었다. FXI는 주로 ATII 세포 및 섬유아세포에서 발현되는 반면, HMWK는 주로 단핵구에 존재하였다.
FXII , FXI 및 HMWK 의 발현은 블레오마이신 폐에서 상승한다.
IPF 폐에서의 발견이 폐 섬유증의 동물 모델로까지 해당되는지의 여부를 결정하기 위해, FXII, FXI 및 HMWK의 발현을 블레오마이신 투여된 마우스의 폐에서 정량하였다. RT-PCR은 블레오마이신 주입 후 4일 및 20일째에 블레오마이신 처리된 마우스 기원의 폐 균질물 중에서 FXII, FXI 및 HMWK가 상향조절됨을 밝혔다(도 4). 흥미롭게도, FXII mRNA는 원발성 뮤린 폐 섬유아세포 및 ATII 세포에서 검출되지 않았다. 블레오마이신 폐로부터 유도되는 ATII 세포에서의 FXI 발현은 변화하지 않았고, 폐 섬유아세포에서의 이의 발현은 블레오마이신 투여한 후 12일 째에 상향조절되었다. 블레오마이신 적용 후 20일째에 폐 섬유아세포에서 HMWK mRNA는 상당히 상향조절된 반면, ATII 세포에서의 HMWK 발현에서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
IPF 조직 표본으로부터의 발견과 비교하여, 면역블롯팅은 블레오마이신 적용 후 4일 및 20일째에 폐 균질물에서 FXII, FXI 및 HMWK 단백질 수준이 유사하게 상향조절됨을 보여주었다(도 5).
면역국소화 연구는 염수 처리된 마우스의 폐에서 관찰된 약한 시그날과 비교하여 블레오마이신-손상된 폐(적용후 20일째)에서 FXII, FXI 및 HMWK가 강하게 발현됨을 확인시켜주었다(도 6). 정상적인 대조군 폐에서 약한 FXII, FXI 및 HMWK 염색은 주로 폐포 마크로파아지에서 관찰되었다. 블레오마이신 적용 후, 강한 FXII, FXI 및 HMWK 면역반응성은 섬유증 영역 및 폐포 마크로파아지에서 가시적이었다.
FXII 녹아웃 또는 억제는 블레오마이신 유도된 폐 섬유증으로부터 보호한다.
폐 섬유증에서 FXII의 역할을 결정하기 위해, FXII가 결핍된 마우스에 블레오마이신을 투여하였다. 21일째에 헤마톡실린 및 에오신 염색에 의해 밝혀진 바와 같이, 블레오마이신 처리된 야생형(WT) 동물은 정상적인 폐 구조의 붕괴, 증가된 간질성 벽 두께 및 증가된 수의 섬유아세포를 특징으로 하는 명확한 폐 섬유증을 보여주었다(도 7a). 반대로, FXII-결핍(FXII-/-) 마우스는 폐내 섬유증 변화를 상당히 감소시켰다(도 7c).
메이슨 트리크롬 염색(Masson trichrome staining)을 수행하여 블레오마이신 투여 후 폐 콜라겐 침착에서의 비정상을 평가하였다. 콜라겐의 축적은 FXII-/- 마우스(도 7d)와 비교하여 WT 동물(도 7b)에서 보다 현저하였다. 최종적으로, FXII-/-마우스의 치사율은 WT 마우스와 비교하여 상당히 저하되었다(도 7e). 블레오마이신 투여 후 21일째에, WT 마우스의 치사율은 40%인 반면, FXII-/-의 치사율은 5%였다. 블레오마이신 적용 후 피브린 침착에서의 임의의 변화가 WT 및 FXII -/- 마우스에서 발생하는지를 결정하기 위해, 폐 절개부를 항-피브린 항체로 염색하였다(도 8). 블레오마이신을 투여받은 WT 동물은 섬유증 영역에서 광범위한 피브린 침착을 나타내었다. 피브린 염색은 섬유증 영역 및 이의 근접한 영역의 폐포 공간에서 관찰되었다. 블레오마이신 투여 받은 FXII-/- 마우스의 폐에서 유사한 패턴이 나타났다.
블레오마이신 유도된 폐 손상에 대한 FXII 억제의 가능한 치료학적 효과를 평가하기 위해, 염수 대조군 마우스 및 블레오마이신 투여된 마우스에, 특이적 FXII 활성 억제제인 옥수수 트립신 억제제를 투여하였다. 염수 또는 CTI는 9일, 12일, 15일 및 18일째에 체중 kg당 5mg의 용량으로 기관내 투여하였다. 21일째에 상기 마우스를 희생시키고, 폐 탄성을 측정하고 폐 조직 표본을 수거하였다. 염수를 투여받은 블레오마이신-처리된 마우스는 정상적인 구조의 상실 및 광범위한 콜라겐 축적을 갖는 중증 섬유증 변화를 보여주었다(도 9c, 도 9d). 광범위한 섬유증 발병은 탄성에서의 상당한 감소에 의해 반영되었다(도 9j). 반대로, 블레오마이신 처리된 마우스의 폐에서의 조직학적 발견에서 수득된 CTI는 약한 섬유증 병변을 입증하였다(도 9g). 메이슨-트리크롬 염색에 의해 평가된 바와 같은 콜라겐 축적은 FXII 억제제 처리된 동물에서 상당히 감소하였다(도 9h). 더욱이, CTI 처리된 동물의 탄성은 상당히 개선되었다(도 9j). 블레오마이신 투여 후 21일째에, 염수 처리된 마우스의 치사율은 80%인 반면, CTI 투여된 동물의 치사율은 20%였다(도 9i). CTI 투여받은 대조군 동물은 폐에서 어떠한 조직학적 변화도 나타내지 않았지만, 이들은 경미한 정도의 염증 세포의 기낭으로의 침윤을 보여주었다(도 9e). CTI의 상기 부작용은 이의 치료학적 적용을 제한할 수 있다.
브라디키닌 수용체 1/2 녹아웃 마우스는 블레오마이신 유도된 폐 섬유증으로부터 보호되지 않는다.
FXIIa는 혈장 프레칼리크레인의 강력한 활성인자이다. 활성화된 칼리크레인은 HMWK를 HKa 및 브라디키닌(BK)으로 추가로 절단하고, 이것은 2개의 G-단백질-커플링된 수용체들: B1 및 B2를 통해 혈관확장제 및 염증 촉진성 펩타이드로서 작용한다. FXII 유도된 브라디키닌 전달이 폐 섬유증의 발병에 기여하는지의 여부를 결정하기 위해, 브라디키닌 1 및 브라디키닌 2 수용체 결핍 마우스(B1B2-/-)에 블레오마이신을 투여하였다. 블레오마이신 적용 21일 후에, WT 및 B1B2-/- 동물 둘 다는 각각 H&E 염색 및 메이슨-트리크롬 염색에 의해 입증된 바와 같이 폐에서 강한 섬유증 변화 및 콜라겐 축적을 나타내었다(도 10a). 블레오마이신 투여 후 WT 마우스와 비교하여 폐 탄성(도 10c) 및 생존(도 10b)에서의 어떠한 개선도 B1B2-/-에서 관찰되지 않았다.
FXII 는 폐 섬유아세포의 증식을 자극한다.
FXII는 사람 간암(Hep2) 세포, 평활근 세포, 폐포 II형 세포 및 내피 세포에 대해 미토겐으로서 작용하는 것으로 보고되었다. 강한 섬유아세포 증식이 폐 섬유증의 특징임을 고려할 때, FXII가 또한 폐 섬유아세포 증식을 제어할 수 있는지를 조사하는 것이 흥미로웠다. 이러한 의문에 답하기 위해, 뮤린 폐 섬유아세포를 증가하는 농도의 FXIIa로 자극하였고 [3H]-티미딘 혼입을 측정하였다. DNA 합성에서 용량-의존성 증가는 FXIIa 처리 후 관찰되었다(도 11a). FXII-유도된 증식은 FXIIa 특이적 억제제인 CTI에 의해 차단되었다. 추가로, FXIIa에 대한 노출 후 증가된 사이클린 D 발현은 뮤린 폐 섬유아세포에 대한 FXIIa 유사분열 활성을 확인시켜 주었다(도 11B).
상이한 시그날 전달 경로의 뮤린 폐 섬유아세포의 FXIIa 유도된 증식에 대한 기여도를 조사하기 위해, FXIIa 자극에 응답하는 MAPK 및 Akt 인산화 역학을 분석하였다. p38, p44/42 및 Akt 활성의 현저한 증가는 15분 후 나타나는 반면, JNK 및 c-jun의 인산화는 관찰되지 않았다. CTI는 FXIIa 노출 30분 후 p44/42 및 Akt 인산화를 약화시켰다. 인산화 역학의 측정 후, 이어서 이들 경로의 간섭이 뮤린 폐 섬유아세포의 FXIIa-유도된 증식에 영향을 미치는지를 분석하였다. 상기 의문을 평가하기 위해, JNK, PI3K, MEK 및 p38 키나제의 특이적 억제제(각각 SP600125, 워트마닌(Wortmannin), PD98059, 및 SB203580)를 사용하였고 FXIIa 미토겐성 활성에 대한 이들의 효과를 평가하였다. 도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, PD98059에 의한 MEK 활성의 억제는 FXIIa에 응답하는 뮤린 폐 섬유아세포 증식을 감소시킨다. 세포가 PI3K, JNK 및 p38 키나제의 억제제로 전처리되는 경우 DNA 합성에서 어떠한 변화도 나타나지 않았다.
FXII는 gC1qR, 우로키나제 플라스미노겐 활성인자 수용체(uPAR) 및 사이토케라틴 1(CK1)과 복합적으로 내피 세포 표면에 결합하는 것으로 보고되었다. 추가로, uPAR이 FXII-유도된 내피 세포 증식에 관여함을 지적하는 연구가 있다. uPAR이 뮤린 폐 섬유아세포에 대한 FXIIa 미토겐성 활성을 매개하는지를 조사하기 위해, 세포를 FXIIa 자극 전에 항-uPAR 차단 항체로 처리하였다. [3H]-티미딘 혼입에 의해 측정되는 바와 같은 세포 증식은 항-uPAR 항체에 의해 차단되었다(도 13a). 더욱이, uPAR 도메인 2에 상응하는 펩타이드를 사용하는 실험은 FXIIa 미토겐성 활성에 대한 상기 수용체의 중요성을 확인시켜 주었고, uPAR에 대한 잠재적인 FXII 결합 부위를 밝혔다. uPAR 도메인 2로부터 기원하는 펩타이드 LRG20(위치 166 내지 185)은 FXIIa 자극 후 DNA 합성의 증가를 차단하였다(도 13b). 대조적으로, 도메인 2(위치 196 내지 214) 및 무작위 펩타이드 기원의 펩타이드 TCK는 FXIIa 유도된 증식에 대해 어떠한 영향도 미치지 않았다.
조기의 발견을 확인하기 위해, 본 발명자들은 uPAR 결핍 마우스(uPAR-/-)로부터 뮤린 폐 섬유아세포를 분리하고, 이들을 FXIIa에 노출시켰다. 야생형 세포와는 반대로, uPAR 결핍 폐 섬유아세포는 FXIIa에 응답하지 않았다(도 14a). 이들 데이터는 uPAR이 FXIIa 미토겐성 활성에 요구됨을 나타낸다. 이러한 관찰은 uPAR이 FXIIa 단백질과 상호작용하는지의 의문점을 제기하였다. 상기 의문점을 조사하기 위해, 면역침전검사를 수행하였다. 면역침전을 위해, 용해물을, 30분 동안 FXIIa로 자극되거나 비자극된 세포로부터 제조하였다. 항-uPAR 항체를 사용하여, FXII를, FXIIa에 노출된 세포의 용해물로부터 면역침전시켰다. uPAR은 이소형 대조군 항체와는 면역침전되지 않았다. 이를 종합해보면, 이들 결과는 uPAR 의존적 방식으로 FXII가 뮤린 폐 섬유아세포 증식을 유도하였음을 입증하였다. uPAR이 어떠한 키나제 활성을 갖지 않고 직접적으로 세포내 경로와는 상호작용하지 않는다는 상기 사실에 근거하여, 다른 단백질이 상기 기작에 관여하는지의 의문점이 제기되었다. 막관통 구조가 결여된 글리코실 포스파티딜이노시톨-부착된 uPAR이 어떻게 시그날 전달을 매개하는지는 불명확하다. uPAR이 연합된 단백질로서의 인테그린과 시스-상호작용하여 이의 리간드인 우로키나제의 결합시 증식 또는 이동 시그날을 세포에 전달하는 것으로 제안되었다. 공명 에너지 전달 현미경 및 정제된 재조합 단백질과의 동시-면역침전을 사용한 연구는 uPAR이 β1- 및 β2-인테그린의 서브세트와 복합체를 형성하고 이들 분자의 시그날 전달 능력을 조절함을 나타낸다. FXIIa 자극 후 섬유아세포의 피브로넥틴에 대한 증가된 접착을 보여주는, 이들 보고 및 본 발명자들의 연구에 근거하여, 피브로넥틴 수용체 α5β1 인테그린이 FXII 미토겐성 활성에 영향을 미치는지가 조사되었다. 폐 섬유아세포의 α5 또는 β1 인테그린 차단 항체로의 전처리가, FXII에 대한 노출 후 [3H]-티미딘 혼입을 폐지시키는 반면, IgG 대조군 항체는 어떠한 영향도 미치지 않았다(도 15). 이러한 관찰은 α5β1 인테그린이 FXIIa- 유도된 뮤린 폐 섬유아세포 증식에 관여함을 시사한다.
TGF -β1은 사람 폐 섬유아세포의 FXII 발현을 조절한다.
TGF-β1은 HLF에서 FXII mRNA 및 단백질 수준을 상향조절한다.
HLF의 10ng/ml의 TGF-β1로의 노출은 시간 의존적 방식으로 FXII의 합성을 자극하였다. 실시간 RT-PCR 분석은 처리 4시간 후 가장 강한 FXII mRNA 발현의유도를 입증하였다(도 16a). 최대 FXII 단백질 수준은 48시간 자극 기간내에 성취되었고 72시간 넘어서는 약간 감소한다(도 16b, 도 16c). 면역형광 염색은 TGF-β1에 응답하여 FXII의 현저한 발현을 밝혔다. FXII는 HLF의 세포질 부분에서 뿐만 아니라 세포 표면상에서도 검출되었다. 분리된 HLF의 순도는 피브로넥틴, 비멘틴 및 콜라겐 IV에 대한 양성 염색에 의해 입증되었다.
TGF -β1은 MAPK , Akt 및 Smad3 의 인산화를 유도한다.
HLF에서 TGF-β1 유도된 FXII 생성에 대한 상이한 시그날 전달 경로의 기여도를 해부하기 위해, TGF-β1 자극에 응답하는 MAPK, Akt, 및 Smad 인산화 역학을 분석하였다. p42/44 및 p38 키나제의 인산화는 60분에 피크에 도달하였고, 이어서 점차적으로 감소하였다. JNK 활성의 현저한 증가는 60분 후 나타난 반면, Akt의 증진된 인산화는 120분 후 나타났다(도 17a). 예상된 바와 같이, TGF-β1은 30 내지 60분 이내에 최대 반응과 함께 Smad 3의 신속한 인산화를 유도하였다(도 17b). c-jun의 어떠한 활성화도 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 면역형광 분석은 TGF-β1이 인-Smad 3의 핵으로의 이동을 유도함을 입증하였다. 따라서, 증가된 수준의 인-Samd 3은 TGF-β1 처리 후 핵 추출물에서 관찰되었다(도 17c). 라민 B는 핵 분획의 순도를 평가하기 위해 로딩 대조군 및 튜불린으로서 사용하였다.
Smad 3 및 JNK 키나제는 HLF 에서 TGF -β1 유도된 FXII 발현을 조절한다.
인산화 역학의 측정 후, 이어서 본 발명자들은 이들 경로의 간섭이 HLF에서 TGF-β1-유도된 FXII 발현에 영향을 미치는지를 분석하고자 하였다. 이러한 특징 분석을 위해, TβRI, JNK, PI3K, MEK 및 p38 키나제의 특이적 억제제(각각 SB431542, SP600125, Wortmannin, PD98059, 및 SB203580)를 사용하였고, FXII의 TGF-β1 자극된 발현에 대한 이들 효과를 평가하였다. 도 18a, 도 18b에 도시된 바와 같이, 각각 SB431542 및 SP600125에 의한 TβRI 및 JNK 활성의 억제는 TGF-β1에 응답하는 FXII 발현을 감소시켰다. HLF가 Akt, p44/42, 및 p38 키나제의 억제제로 전처리되는 경우 FXII 발현에서의 어떠한 변화도 나타나지 않았다. 이들 결과를 추가로 확인하기 위해, HLF를 JNK1- 또는 Smad 3-특이적 siRNA로 형질감염시켰고, 이것은 웨스턴 블로팅에 의해 입증된 바와 같이 이들 단백질의 상당한 녹다운을 유발하였다(도 18c, 도 18f). 도 18d 및 도 18e에 나타낸 바와 같이, JNK1의 녹다운은 TGF-β1 자극 후 FXII 발현을 억제하였다. Smad 3이 결실된 경우 유사한 결과가 수득되었다(도 18g, 도 18h).
JNK 키나제는 Smad3 인산화 및 핵으로의 이동을 조절하지 않는다.
다음 실험에서, Smad3 인산화 및 핵으로의 이동에서의 JNK 키나제의 역할이 조사되었다. HLF의 JNK 억제제(SP600125)와의 항온처리는 Smad 3 인산화를 감소시키지 않았지만, JNK 활성을 완전히 폐지시켰다(도 19a). TβRI 억제제(SB431542)는TGF-β1에 응답하는 Smad 3 및 JNK1의 인산화를 약화시켰고, 이는 Smad 3 및 JNK의 인산화가, TGF-β1 시그날 전달 경로에서 최인접 분자인 TβRI으로부터 기원함을 나타낸다(도 19b). 추가로, HLF의 SP600125로의 노출은 TGF-β1-유도된 Smad 3의 핵으로의 이동에 대해 어떠한 효과를 나타내지 않는 반면, SB431542는 상기 과정을 완전히 차단한다(도 19c). 유사한 결과는 면역형광 분석에 의해 수득되었다. SB431542 및 SP600125는 단독으로 핵에서 Smad 3의 축적에 영향을 미치지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 이들 결과는 JNK 키나제가 Smad 3의 인산화 및 이의 핵으로의 이동에 대한 어떠한 효과 부재하에 TGF-β1 유도된 FXII 발현을 조절할 수 있음을 나타낸다.
TGF -β1은 위치 272에 위치한 SBE 를 통해 FXII 프로모터 활성을 유도한다.
TGF-β1 유도된 FXII 제조를 위해 요구되는 DNA 요소를 동정하기 위해, NIH3T3 세포를 일련의 사람 FXII 프로모터 결실 작제물(-1630 bp; -907 bp; -577 bp; -299 bp; 도 20a)로 순간적으로 형질감염시키고, 이어서 비처리되고 TGF-β1 처리된 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정하였다. NIH3T3 세포는 이들의 높은 형질감염 효율 때문에 본 연구에 사용하였다. pGL3-1630; pGL3-907; 및 pGL3-577 작제물로 형질감염된 세포는 TGF-β1에 응답하는 루시퍼라제 활성의 증가를 나타내지 않은 반면, FXII 프로모터 활성의 강한 유도가 pGL3-299 형질감염된 세포에서 관찰되었다(도 20b). 이들 결과는 사람 FXII 프로모터에서 -299/+1 bp 내에 TGF-β1 반응 요소의 존재를 나타낸다. 추가로, 상기 데이터는 -299 bp의 업스트림 영역에 위치한 리프레서 요소(들)가 TGF-β1의 자극 효과를 감소시킬 수 있음을 시사한다.
-299/+1 bp 사이에 존재하는 FXII 프로모터의 TGF-β1-반응성 요소를 동정하기 위해, 상기 DNA 영역을 컨센서스 smad 결합 요소(SBE)에 대해 조사하였다. 상기 분석으로 -272 bp(SBE-272, 도 20c) 위치에서의 추정 SBE를 동정하였다. 예상된 바와 같이, SBE-272의 점 돌연변이는 TGF-β1에 응답하는 FXII 프로모터 활성을 완전히 폐지시켰다(도 20d). 이들 결과를 확인하기 위해, SBE-272가 결여된 작제물을 제조하였다(도 21a). -299과 -183 사이의 서열 결실은 TGF-β1에 대한 응답을 부여하는 FXII 프로모터의 능력을 차단하였다(도 21b). 유사한 결과는 원발성 HLF가 사용되는 경우 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 이어서, FXII 발현의 조절에서 JNK/Smad 3 시그날 전달 경로의 역할은 유전자 루시퍼라제 활성 검사로 시험하였다. 상기 세포는 pGL3-299 작제물로 형질감염시키고, 지적된 억제제로 전처리하고 이어서 비자극되거나 10 ng/ml TGF-β1로 자극하였다. 도 21c에 나타낸 바와 같이, TGF-β1 구동된 루시퍼라제 활성은 SB431542 및 SP600125 억제제의 존재하에서만 강하게 감소하였다.
Smad 3은 FXII 프로모터 내에서 SBE -272와 상호작용한다.
Smad3과 SBE-272 ChIP 및 스트렙트아비딘과의 상호작용을 조사하기 위해, 풀-다운 검사를 수행하였다. 상기 ChIP 검사는 명백하게 Smad 3이 SBE-272를 플랭킹하는 FXII 프로모터 영역(-299/+1 bp)과 TGF-β1-유도된 상호작용을 수행함을 입증하였다(도 22a). Smad 3의 SBE-272로의 결합을 추가로 분석하기 위해, FXII 프로모터의 -283 및 -258 bp 영역에 걸쳐 있는 비오티닐화된 주형을 사용하는 스트렙트아비딘 풀-다운을 수행하였다. 예상된 바와 같이, Smad 3은 상기 주형으로부터 용출된 반면, SBE-272가 돌연변이된 경우 어떠한 상호작용도 발생하지 않았다(도 22b). 이들 발견은 Smad 3-SBE-272가 HLF의 TGF-β1로의 자극 후 복합체를 형성함을 나타낸다.
JNK 키나제는 Smad 3의 SBE -272로의 결합에 영향을 미친다.
JNK 키나제의 억제는 Smad 3의 인산화 및 핵으로의 이동에 대해 어떠한 영향도 미치지 않았고, Smad 3 - SBE-272 복합체의 형성에 상기 키나제가 관여하는지를 ChIP 및 스트렙트아비딘 풀-다운 검사로 조사하였다. TβRI 또는 JNK1 억제제(각각 SB431542 또는 SP600125)로 전처리된 HLF는 비자극되거나 TGF-β1로 자극하고, 용해시키고, ChIP 검사는 항-Smad3 항체 및 IgG 이소형 대조군을 사용하여 수행하였다. TGF-β1은 Smad 3-DNA 복합체 형성을 유도하였다. 상기 상호작용은 SB431542가 사용되는 경우 완전히 폐지되었고, SP600125의 존재하에 급격히 감소되었다(도 22c). SB431542 및 SP600125 단독은 Samd 3의 DNA와의 상호작용에 어떠한 영향도 미치지 않는다(데이터는 나타내지 않음). 유사한 결과가 스트렙트아비딘 풀-다운 검사가 수행되는 경우 수득되었다(도 22d).
SEQUENCE LISTING <110> JUSTUS-LIEBIG-UNIVERSITAET GIESSEN <120> FACTOR XII INHIBITORS FOR TREATING INTERSTITIAL LUNG DISEASE <130> A162 <160> 53 <150> US 61/282,801 <151> 2010-04-01 <150> EP 10003652.4 <151> 2010-04-01 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta-actin forward primer <400> 1 attgccgaca ggatgcagga a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta-actin reverse primer <400> 2 gctgatccac atctgctgga a 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human FXII forward primer <400> 3 acgacctggc tctgttgc 18 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human FXII reverse primer <400> 4 cttggcaggc acaccgg 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human FXI forward primer <400> 5 tctggcttgt attagggac 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human FXI reverse primer <400> 6 tctttgggcc attcctgg 18 <210> 7 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cccgtgtgcg gtacc 75 <210> 38 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SPINK fragment S3wt <400> 38 ggtaccgacg gcaacaccta ccccaacgag tgcgtgctgt gcttcgagaa ccgcaagcgc 60 cagacctcca tcctgatcca gaagtccggc ccctgctgag gatcc 105 <210> 39 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SPINK fragment S3K3 <400> 39 ggtaccgacg gcaacaccta cggcaacgag tgcatgctga actgcgccga gaaccgcaag 60 cgccagacct ccatcctgat ccagaaggag ggcccctgct gaggatcc 108 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We2450 <400> 40 cgagtgcatg ctgtgcgccg agaac 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We2451 <400> 41 gttctcggcg cacagcatgc actcg 25 <210> 42 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Infestin-4 fragment I4C <400> 42 agatctgacg gaaagaccta cggcaacccc tgcatgctga actgtgccgc ccagaccaag 60 gtgcccgggc tcaagctggt gcacgagggc cgctgctagg cggccgc 107 <210> 43 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We2467 <400> 43 gctgccttag gcttaggagg atccagcgct gtgaagg 37 <210> 44 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis oligonucleotide We2468 <400> 44 ccttcacagc gctggatcct cctaagccta aggcagc 37 <210> 45 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer We2470 <400> 45 cgcgcggccg cgatcctcag caggggccg 29 <210> 46 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer We2473 <400> 46 gcgggatccg gggggagcgg cggctccgac tccctgggcc gc 42 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer We2623 <400> 47 ctgctggcgg ccgcctag 18 <210> 48 <211> 650 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 580 585 590 Gly Ser Asp Ser Leu Gly Arg Glu Ala Lys Cys Tyr Asn Glu Leu Asn 595 600 605 Gly Cys Thr Lys Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly Thr Asp Gly Asn Thr 610 615 620 Tyr Pro Asn Glu Cys Val Leu Cys Phe Glu Asn Arg Lys Arg Gln Thr 625 630 635 640 Ser Ile Leu Ile Gln Lys Ser Gly Pro Cys 645 650 <210> 49 <211> 647 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 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Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 580 585 590 Gly Ser Asp Ser Leu Gly Arg Glu Val Arg Asn Pro Cys Ala Cys Phe 595 600 605 Arg Asn Tyr Val Pro Val Cys Gly Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Gly Asn 610 615 620 Glu Cys Met Leu Cys Ala Glu Asn Arg Lys Arg Gln Thr Ser Ile Leu 625 630 635 640 Ile Gln Lys Glu Gly Pro Cys 645 <210> 51 <211> 648 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 580 585 590 Gly Ser Asp Ser Leu Gly Arg Glu Val Arg Asn Pro Cys Ala Cys Phe 595 600 605 Arg Asn Tyr Val Pro Val Cys Gly Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Gly Asn 610 615 620 Glu Cys Met Leu Asn Cys Ala Glu Asn Arg Lys Arg Gln Thr Ser Ile 625 630 635 640 Leu Ile Gln Lys Glu Gly Pro Cys 645 <210> 52 <211> 647 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 580 585 590 Gly Ser Asp Ser Leu Gly Arg Glu Val Arg Asn Pro Cys Ala Cys Phe 595 600 605 Arg Asn Tyr Val Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Gly Asn 610 615 620 Pro Cys Met Leu Asn Cys Ala Ala Gln Thr Lys Val Pro Gly Leu Lys 625 630 635 640 Leu Val His Glu Gly Arg Cys 645 <210> 53 <211> 294 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Asp Ser Leu Gly Arg Glu Val Arg Asn Pro Cys Ala Cys Phe Arg Asn 1 5 10 15 Tyr Val Pro Val Cys Gly Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Gly Asn Glu Cys 20 25 30 Met Leu Cys Ala Glu Asn Arg Lys Arg Gln Thr Ser Ile Leu Ile Gln 35 40 45 Lys Glu Gly Pro Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Pro 50 55 60 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 65 70 75 80 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 85 90 95 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 100 105 110 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 115 120 125 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 130 135 140 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 145 150 155 160 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 165 170 175 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 180 185 190 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 195 200 205 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 210 215 220 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 225 230 235 240 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 245 250 255 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 260 265 270 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 275 280 285 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 290

Claims (17)

  1. 섬유증식성 간질성 폐 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한, 인자 XII 및/또는 인자 XIIa(FXII/FXIIa)의 세포 활성의 비-내인성 억제제.
  2. 제1항에 있어서, 인자 XIIa의 촉매 활성을 억제할 수 있는 화합물인, 억제제.
  3. 제1항에 있어서, 세포내 인자 XII의 발현을 감소시키거나 폐지시킬 수 있는 화합물인, 억제제.
  4. 제1항에 있어서, 인자 XII의 인자 XIIa로의 전환을 억제할 수 있는 화합물인, 억제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세린 프로테아제 억제제인, 억제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 야생형 인페스틴-4 폴리펩타이드 서열(서열번호 33) 또는 이의 변이체(여기서, 상기 변이체는
    (a) 상기 야생형 인페스틴-4 서열의 N 말단 아미노산 2 내지 13 및 상기 야생형 인페스틴-4 서열과의 차이를 유발하는, 상기 N-말단 아미노산 외부의 적어도 1개 내지 5개의 아미노산 돌연변이;
    및/또는
    (b) 상기 야생형 인페스틴-4 서열로부터의 6개의 보존된 시스테인 잔기 및 상기 야생형 인페스틴-4 서열과의 70% 이상의 상동성을 포함한다);
    (ii) 상기 야생형 인페스틴-4 서열의 N 말단 아미노산 2 내지 13을 포함하도록 돌연변이된 SPINK-1(서열번호 29), 또는 상기 돌연변이된 SPINK-1의 변이체(여기서, 상기 변이체는
    a) 상기 야생형 인페스틴-4 서열의 N 말단 아미노산 2 내지 13; 및 상기 야생형 SPINK-1 서열과의 차이를 유발하고 상기 야생형 인페스틴-4 서열에 대한 상기 변이체의 상동성을 증가시키는, 상기 N-말단 아미노산 외부의 적어도 1개 내지 5개의 아미노산 돌연변이; 및/또는
    b) 상기 야생형 SPINK-1 서열로부터의 6개의 보존된 시스테인 잔기 및 상기 야생형 SPINK-1 서열과의 70% 이상의 상동성을 포함한다);
    (iii) SPINK K1, K2, 또는 K3(서열번호 30, 31 또는 32);
    (iv) 아프로티닌, 옥수수-트립신 억제제(CTI), 소 췌장 트립신 억제제의 돌연변이체 및 Pro-Phe-Arg-클로로메틸-케톤(PCK); 및
    (v) 상기 FXII/FXIIa에 결합할 수 있는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 억제제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 억제제가 반감기 증진 폴리펩타이드에 연결되고, 여기서 상기 반감기 증진 폴리펩타이드가 임의로 알부민, 아파민, 알파-페토단백질 또는 비타민 D 결합 단백질, 사람 알부민, 또는 이의 변이체, 면역글로불린 또는 이의 변이체, IgG의 Fc인, 억제제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 반감기 증진 폴리펩타이드가 링커를 통해 상기 FXII 억제제에 연결된, 억제제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 링커가,
    (i) 절단가능하거나;
    (ii) 내인성, 외인성 또는 통상적인 응고 경로의 응고 프로테아제에 의해 절단가능하거나;
    (iii) FXIIa에 의해 절단가능한, 억제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유증식성 간질성 폐 질환이 폐 섬유증인, 억제제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 폐 섬유증이 특발성 폐 섬유증인, 억제제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 코르티코스테로이드 약물, 피르페니돈, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 아세틸시스테인, 항-섬유화제 및/또는 산소요법의 투여를 포함하는 제2 요법과의 병용 치료를 포함하는, 억제제.
  13. FXII/FXIIa의 세포 활성의 비-내인성 억제제의 약제학적 유효량을 개체에 투여함을 포함하는, 섬유증식성 간질성 폐 질환을 치료하고/하거나 예방하는 방법.
  14. FXII/FXIIa의 세포 활성의 비-내인성 억제제의 약제학적 유효량을 섬유증식성 간질성 폐 질환을 앓는 환자에게 투여함을 포함하는, 섬유증식성 간질성 폐 질환을 앓는 환자의 생존 시간을 연장시키는 방법.
  15. 상기 섬유증식성 간질성 폐 질환이 특발성 폐 섬유증인, 제13항 또는 제14항 중 어느 한 항의 억제제의 사용 방법.
  16. FXII/FXIIa의 세포 활성의 비-내인성 억제제, 및 섬유증식성 간질성 폐 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한 추가의 약물을 포함하는, 간질성 폐 질환을 치료하기 위한 약제학적 키트.
  17. 제16항에 있어서, 섬유증식성 간질성 폐 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한 상기 추가의 약물이 코르티코스테로이드 약물, 아자티오프린, 피르페니돈, 사이클로포스파미드, 아세틸시스테인 및 항-섬유화제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 키트.
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