JP5800458B2 - 血液凝固因子を有するタンパク質分解によって切断可能な融合タンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、それらの改変されていない元の治療用ポリペプチドと比較して高い半減期を有する改変された治療用融合タンパク質の分野に関する。本発明は、具体的には、タンパク質分解によって切断可能なリンカーペプチドによって連結された、半減期を延長したポリペプチド(HLEP)に融合した凝固因子に関する。このようなリンカーが切断されると、HLEPによって引き起こされるあらゆる活性を弱める立体障害から治療用ポリペプチドが放出され、それによって、凝固因子の高いモル比活性度を保持する融合タンパク質の生成が可能になる。治療用融合タンパク質が酵素原である場合、対応するプロテアーゼに晒された際に、インビボでのそれらの活性化と実質的に同時に治療用ポリペプチドを放出するようなリンカーが特に好ましい。本発明のその他の形態は、凝固因子が活性化されて、ペプチドリンカーが、凝固に関連する様式でタンパク質分解によって切断されると、それに対応する切断可能なリンカーを有さない融合タンパク質と比較してより速い所定の凝固因子の不活性化速度を示すこと、および/または、凝固因子が活性化されて、ペプチドリンカーが、凝固に関連する様式でタンパク質分解によって切断されると、それに対応する切断可能なリンカーを有さない融合タンパク質と比較してより速い所定の凝固因子の除去速度を示すことである。
a)凝固因子、その変異体または誘導体、
b)アルブミン(それらの変異体および誘導体を含む)、アルブミンファミリーのポリペプチド(それらの変異体および誘導体を含む)、および、免疫グロブリン(それらの変異体および誘導体を含む)からなる群より選択された半減期を延長したポリペプチド、および、
c)凝固因子と半減期を延長したポリペプチドとを連結するペプチドリンカー、
含む治療用融合タンパク質に関し;
ここにおいて該ペプチドリンカーは、凝固に関与するプロテアーゼによって切断することができるか、または、凝固酵素によって活性化することができ、および、該治療用融合タンパク質は、アミノ酸配列GGGGGGVを有する切断不可能なリンカーで連結された各治療用融合タンパク質と比較して:
i)少なくとも1種の凝固関連の分析において、高いモル比活性度、および/または
ii)凝固に関連する様式で該ペプチドリンカーがタンパク質分解によって切断された後の、活性化された凝固因子の高い不活性化速度、および/または
iii)凝固に関連する様式で該ペプチドリンカーがタンパク質分解によって切断された後の、活性化された凝固因子の高い除去速度、
を示す。
a)凝固因子、その変異体または誘導体、
b)アルブミン(それらの変異体および誘導体を含む)、アルブミンファミリーのポリペプチド(それらの変異体および誘導体を含む)、および、免疫グロブリン(それらの変異体および誘導体を含む)からなる群より選択された半減期を延長したポリペプチド、および、
c)凝固因子と半減期を延長したポリペプチドとを連結するペプチドリンカー、
含む治療用融合タンパク質を提供することであり;
ここにおいて該ペプチドリンカーは、凝固に関与するプロテアーゼによって切断することができるか、または、凝固酵素によって活性化することができ、および、該治療用融合タンパク質は、アミノ酸配列GGGGGGVを有する切断不可能なリンカーで連結された各治療用融合タンパク質と比較して:
i)少なくとも1種の凝固関連の分析において、高いモル比活性度、および/または
ii)凝固に関連する様式で該ペプチドリンカーがタンパク質分解によって切断された後の、活性化された凝固因子の高い不活性化速度、および/または
iii)凝固に関連する様式で該ペプチドリンカーがタンパク質分解によって切断された後の、活性化された凝固因子の高い除去速度、
を有し、さらに、未改変の凝固因子のインビボでの回復と比較して強化されたインビボでの回復、
を示す。
ビタミンK依存性ポリペプチド
ビタミンK依存性ポリペプチドは、治療用ポリペプチドの1つの群として、肝臓で補因子としてビタミンKを用いて酵素的にγ−カルボキシル化されるポリペプチドである。このようなビタミンK依存性ポリペプチドは、例えば、第II因子、第VII因子、第IX因子、第X因子、プロテインC、プロテインS、GAS6、および、プロテインZである。
ヒトFIXは、ビタミンK依存性ポリペプチド群の1メンバーとして、57kDaの分子量を有する単鎖糖タンパク質であり、これは、肝細胞によって、415個のアミノ酸からなる不活性な酵素原として血流に分泌される。これは、ポリペプチドのN末端のGla−ドメインに局在している12個のγ−カルボキシ−グルタミン酸残基を含む。Gla残基は、それらの生合成のためにビタミンKを必要とする。Glaドメインに続いて、2種の上皮増殖因子ドメイン、活性化ペプチド、および、トリプシン型セリンプロテアーゼドメインがある。FIXのさらなる翻訳後修飾としては、水酸化(Asp64)、N−(Asn157およびAsn167)、加えてO型の糖付加(Ser53、Ser61、Thr159、Thr169、および、Thr172)、硫酸化(Tyr155)、および、リン酸化(Ser158)が挙げられる。
FVIIは、50kDaの分子量を有する単鎖糖タンパク質であり、これは、肝細胞によって、406個のアミノ酸からなる不活性な酵素原として血流に分泌される。FVIIは、Arg152〜Ile153における単一のペプチド結合のタンパク質分解によってその活性型である第VIIa因子に変換され、それにより、2種のポリペプチド鎖、N末端軽鎖(24kDa)、および、C末端重鎖(28kDa)の形成が起こるが、これらは、1個のジスルフィド架橋によって結合される。その他のビタミンK依存性凝固因子とは異なり、活性化ペプチドは、活性化中に切断されない。第VII因子の活性化による切断は、インビトロにおいて、例えば、第Xa因子、第IXa因子、第VIIa因子、第XIIa因子、第7因子活性化プロテアーゼ(FSAP)、および、トロンビンによって達成できる。Mollerup等.(Biotechnol.Bioeng.(1995)48:501〜505)は、いくつかの切断は、Arg290および/またはArg315で重鎖でも起こることを報告している。
「治療用融合タンパク質」とは、本発明の意味において、ヒトまたは動物に投与されると、予防または治療効果を引き起こすことができる、半減期を延長したポリペプチドに融合した凝固因子のことである。これらの治療用融合タンパク質は、静脈内、筋肉内、経口、外用、非経口またはその他の経路によってヒトまたは動物に投与することができる。包含される治療用融合タンパク質の特定のクラス、すなわち本発明の実施例に記載されているタンパク質のクラスは、例えばアルブミンおよび免疫グロブリン、ならびにそれらのフラグメントまたは誘導体のような半減期を延長したポリペプチドに連結した、例えばビタミンK依存性ポリペプチドのような凝固因子である。「治療用融合タンパク質」という表現は、「融合タンパク質」と交換可能に用いられる。
半減期を延長したポリペプチド(HLEP)の例として、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、および、免疫グロブリン、並びに、それらのフラグメントまたは誘導体が上述されている。用語「ヒト血清アルブミン」(HSA)および「ヒトアルブミン」(HA)は、本願において交換可能に用いられる。用語「アルブミン」および「血清アルブミン」は広範であり、ヒト血清アルブミン(およびそれらのフラグメントおよび変異体)、加えてその他の種由来のアルブミン(およびそれらのフラグメントおよび変異体)を包含する。
想される。これは、凝固に関連する様式で不活性化を強化すること、または、凝固因子を除去することのいずれかによって達成することができる。
a)治療用ポリペプチドの活性化中にタンパク質分解によって切断されるタンパク質分解的切断部位を含む場合、それ自身が投与される治療用ポリペプチド、
b)この治療用ポリペプチドの基質ポリペプチド、または、
c)治療用ポリペプチドの直接的または間接的な関与によって活性化または形成された、プロテアーゼによって切断される基質ポリペプチド。
図2:活性化されていない融合タンパク質と比較した、切断可能なリンカーを有する、および、それらを有さない、活性化されたrecFIXおよびFIX−アルブミン融合タンパク質の薬物動態である。
図3:活性化されたrecFIXまたはFIX−アルブミン融合タンパク質のATによる不活性化である。120分後に、非活性化部分のトロンボプラスチン時間の分析を用いて残留したFIX活性を決定した。
第IX因子のコード配列を、PCRで、ヒト肝臓cDNAライブラリー(ProQuest,インビトロジェン(Invitrogen))から、プライマーWe1403およびWe1404(配列番号5および6)を用いて増幅した。プライマーWe1405およびWe1406(配列番号7および8)を用いた2回目のPCRサイクルの後に、得られたフラグメントを、pCR4TOPO(インビトロジェン)にクローニングした。続いて、FIXのcDNAを、EcoRIフラグメントとして、予め内部のXhoI部位を除去したpIRESpuro3(BDバイオサイエンス(BD Biosciences))のEcoRI部位に移した。得られたプラスミドをpFIX−496と名付け、これを第IX因子野生型用の発現ベクターとした。
プラスミドをE.coliのTOP10(インビトロジェン)中で増殖させ、標準的なプロトコール(キアゲン(Qiagen))を用いて精製した。HEK−293細胞をリポフェクトアミン2000試薬(インビトロジェン)を用いてトランスフェクションし、無血清培地(インビトロジェン293エキスプレス(Express))中で、50ng/mlのビタミンK、および、4μg/mlのピューロマイシンの存在下で増殖させた。トランスフェクションした細胞群をT−フラスコを介してローラーボトルまたは小規模の発酵槽に散布し、そこから上清を精製するために回収した。
FIXまたはFIXアルブミン融合タンパク質を含む細胞培養の回収物を、50mMのトリス×HCl/100mMのNaCl緩衝液(pH8.0)で予め平衡化したQ−セファロースFFカラムに適用した。その後、カラムを200mMのNaClを含む平衡緩衝液で洗浄した。結合したFIXまたはFIX融合タンパク質の溶出を、基剤として50mMのトリス×HCl/200mMのNaCl緩衝液(pH8.0)を用いた塩の濃度勾配によって達成した。溶出液を、ヒドロキシルアパタイト樹脂でのカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。この目的のために、Q−セファロースFFカラムの溶出液を、50mMのトリス×HCl/100mMのNaCl緩衝液(pH7.2)で平衡化したヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーカラムにローディングした。カラムを同じ緩衝液で洗浄し、pH7.2でのリン酸カリウムの濃度勾配を用いてFIXまたはFIX−HSAを溶出させた。溶出液を透析して塩濃度を低くし、生化学解析、加えて薬物動態学的なパラメーターの決定に用いた。実施例5で説明されているようにしてFIX抗原および活性を決定した。
実施例3で説明されているように、FIXまたはFIXアルブミン融合タンパク質を含む細胞培養の回収物を、Q−セファロースFFでのクロマトグラフィーで精製した。Q−セファロースの溶出液を、ヘパリン−フラクトゲル(Fractogel)カラムでのクロマトグラフィーによってさらに精製した。この目的のために、50mMのトリス×HCl、50mMのNaCl(pH8.0)緩衝液(EP)を用いてヘパリン−フラクトゲルカラムを平衡化し、Q−セファロースFF溶出液を適用して、このカラムを75mMのNaClを含む平衡緩衝液で洗浄した。FIXまたはFIXアルブミン融合タンパク質をそれぞれ、300mMのNaClに調節したEPを用いて溶出させた。
FIX活性を、市販のaPTT試薬(パトロムチンSLおよびFIX欠乏血漿,デイド・ベーリング)を用いて凝固(clotting)または凝固(coagulation)活性(FIX:C)として決定した。世界保健機構の国際的なFIX濃縮物標準(WHO International FIXconcentrate Standard)(96/854)を較正した内部二次標準(substandard)を参照として用いた。
異なるリンカーペプチドを含むFIX−アルブミン融合タンパク質をコードするDNAコンストラクトでトランスフェクションされたHEK細胞の細胞培養上清を、上述のようなFIX活性および抗原試験で処理した(実施例5を参照)。FIX:CのFIX:Agに対する比率を計算したところ、異なるコンストラクトのモル比活性度に正比例する尺度が示された。
精製した組換え野生型FIX(rFIX496/797)、および、FIX−アルブミン融合タンパク質(rFIX980/797、rFIX986/797、rFIX−1088/797、および、rFIX1089/797)を上述のような凝固分析でFIX活性に関して試験した。平行して、タンパク質濃度の尺度として、280および320nmでの光学密度の差を決定した(OD280〜320)。OD280〜320での活性の比率を計算し、モル光学密度に基づいてモル比活性度を計算した。以下の表5に結果を要約する。
FIX−アルブミン融合タンパク質およびrecFIXを、市販の第XIa因子(コルディア(Kordia))を用いてインビトロで活性化した。簡単に言えば、同一なモル量のFIXまたはFIX−アルブミン融合タンパク質(3.0×10-6mol/L)を、pH6.8に緩衝化したFXIa(1.9×10-8mol/L)、および、CaCl2(1,5mmol/L)を含む溶液中で、37℃で活性化した。SDS−PAGEにより示された通り完全に活性化させた後に、FXIaの量に基づいて5倍の過剰なモル量のC1−阻害剤(ベリナートP(Berinert P))を添加することによって反応を止めた。薬物動態学的な調査を開始するまでサンプルを−70℃より低温で凍結保存した。
切断可能なリンカーを含む(1088/797)、および、含まない(980/797)FIX融合タンパク質を、実施例8で説明されているようにFXIaとインキュベートすることによって活性化した。活性化された因子を、ATと120分間インキュベートし、残留したFIXa活性を、SchnitgerおよびGrossに従って、手動式のFIX凝固分析方法を用いて活性化せずに(naPTT、以下を参照)決定した。コントロールサンプルとして、同量のATの存在下で活性化されたFIX−アルブミン融合タンパク質を用いた(ただしインキュベートせず)。
Claims (24)
- 治療用融合タンパク質であって
a)凝固第IX因子、
b)アルブミン、アルブミンファミリーのポリペプチド、および、抗原結合ドメインを有さない免疫グロブリンからなる群より選択された半減期を延長するポリペプチド、および、
c)凝固第IX因子と半減期を延長するポリペプチドとを連結するペプチドリンカー、を含み、
ここにおいて該ペプチドリンカーは、FXIaおよび/又はFVIIa/TFによって切断することができ、且つ、SKLTR、RVVGG及びRIVGGからなる群より選択される配列を含み、
さらに、少なくとも1種の凝固関連の分析において、該治療用融合タンパク質は、アミノ酸配列GGGGGGVを有する切断不可能なリンカーで連結された治療用融合タンパク質と比較して、高いモル比活性度を有する、上記タンパク質。 - 治療用融合タンパク質であって、
a)凝固第IX因子、
b)アルブミン、アルブミンファミリーのポリペプチド、および、抗原結合ドメインを有さない免疫グロブリンからなる群より選択された半減期を延長するポリペプチド、および、
c)凝固第IX因子と半減期を延長するポリペプチドとを連結するペプチドリンカー、を含み、
ここにおいて該ペプチドリンカーは、FXIaおよび/又はFVIIa/TFによって切断することができ、且つ、SKLTR、RVVGG及びRIVGGからなる群より選択される配列を含み、
さらに、該治療用融合タンパク質は、アミノ酸配列GGGGGGVを有する切断不可能なリンカーで連結された治療用融合タンパク質と比較して、凝固に関連する様式で該ペプチドリンカーがタンパク質分解によって切断された後に、活性化された凝固因子の高い不活性化速度を示す、上記タンパク質。 - 治療用融合タンパク質であって、
a)凝固第IX因子、
b)アルブミン、アルブミンファミリーのポリペプチド、および、抗原結合ドメインを有さない免疫グロブリンからなる群より選択された半減期を延長するポリペプチド、および、
c)凝固第IX因子と半減期を延長するポリペプチドとを連結するペプチドリンカー、を含み、
ここにおいて該ペプチドリンカーは、FXIaおよび/又はFVIIa/TFによって切断することができ、且つ、SKLTR、RVVGG及びRIVGGからなる群より選択される配列を含み、
さらに、該治療用融合タンパク質は、アミノ酸配列GGGGGGVを有する切断不可能なリンカーで連結された治療用融合タンパク質と比較して、凝固に関連する様式で該ペプチドリンカーがタンパク質分解によって切断された後に、活性化された凝固因子の高い除去速度を示す、上記タンパク質。 - 融合タンパク質は、半減期を延長するポリペプチドに融合していない凝固第IX因子のインビボでの回復と比較して、より高いインビボでの回復を示す、請求項1〜3のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質。
- 融合タンパク質は、半減期を延長するポリペプチドに融合していない凝固第IX因子の血漿半減期と比較して、長い血漿半減期を示す、請求項1〜4のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質。
- 半減期を延長するポリペプチドは、抗原結合ドメインを含まない免疫グロブリン、または、それらのフラグメントである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質。
- 利用可能な様々な凝固関連の分析のうち少なくとも1種において、治療用融合タンパク質の凝固に関連するモル比活性度は、アミノ酸配列GGGGGGVを有する切断不可能なリンカーで連結された治療用融合タンパク質の場合の活性と比較して少なくとも25%高い、請求項1〜6のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質。
- 凝固第IX因子と半減期を延長するポリペプチドとを連結するペプチドリンカーを切断した後の該凝固第IX因子の不活性化速度は、それに相当するアミノ酸配列GGGGGGVを有する切断不可能なリンカーで連結された治療用融合タンパク質における凝固第IX因子の不活性化速度と比較して少なくとも10%高い、請求項1〜7のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質。
- 凝固第IX因子と半減期を延長するポリペプチドとを連結するペプチドリンカーを切断した後の該凝固第IX因子の除去速度は、それに相当するアミノ酸配列GGGGGGVを有する切断不可能なリンカーで連結された治療用融合タンパク質における凝固第IX因子の除去速度と比較して少なくとも10%高い、請求項1〜8のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質。
- プロテアーゼまたはプロテアーゼ群によるリンカー切断の速度は、凝固第IX因子の活性化の速度の3倍を超えて遅延しない、請求項1〜9のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質。
- リンカーは、配列番号36〜49、53〜54、61〜65、79〜92及び95〜112からなる群より選択された配列を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の治療
用融合タンパク質。 - 医薬物質として使用するための、請求項1〜11のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項13に記載の核酸を含むプラスミドまたはベクター。
- 発現ベクターである、請求項14に記載のプラスミドまたはベクター。
- ベクターは、ヒトの遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターである、請求項15に記載のプラスミドまたはベクター。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチド、または、請求項14〜16のいずれか一項に記載のプラスミドまたはベクターを含む宿主細胞。
- 請求項17に記載の宿主細胞を、治療用融合タンパク質が発現されるような条件下で培養することを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質の製造方法。
- 宿主細胞または培地から治療用融合タンパク質を回収することをさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質、請求項13に記載のポリヌクレオチド、または、請求項14〜16のいずれか一項に記載のプラスミドまたはベクターを含む医薬組成物。
- 血液凝固障害を治療または予防するための医薬品を製造するための、請求項1〜11のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質、請求項13に記載のポリヌクレオチド、請求項14〜16のいずれか一項に記載のプラスミドまたはベクター、または、請求項17に記載の宿主細胞の使用。
- 血液凝固障害は、血友病Bである、請求項21に記載の使用。
- 治療は、ヒトの遺伝子治療を含む、請求項21または22に記載の使用。
- 凝血促進性の特性を有する医薬品を製造するための、請求項1〜11のいずれか一項に記載の治療用融合タンパク質、請求項13に記載のポリヌクレオチド、請求項14〜16のいずれか一項に記載のプラスミドまたはベクター、または、請求項17に記載の宿主細胞の使用。
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