JP5608368B2 - 涙リポカリンの突然変異タンパク質およびそれを得るための方法 - Google Patents

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Description

本出願は、２００６年８月１日に出願された米国仮出願第６０／８２１，０７３号および２００７年４月１６日に出願された米国仮出願第６０／９１２，０１３号の優先権の利益を主張し、それぞれの内容は、すべての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、所与の非天然リガンドに検出可能な親和性で結合する、ヒト涙リポカリンに由来する新規な突然変異タンパク質に関する。本発明はまた、そのような突然変異タンパク質をコードする対応する核酸分子およびそれらの生成方法にも関する。本発明は、そのような突然変異タンパク質を産生するための方法にさらに関する。最後に、本発明は、そのようなリポカリン突然変異タンパク質を含む医薬組成物および突然変異タンパク質の種々の使用を対象とする。
リポカリンタンパク質ファミリーのメンバー（Ｐｅｒｖａｉｚ，Ｓ．およびＢｒｅｗ，Ｋ．（１９８７）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１、２０９〜２１４）は、様々な異なる分子認識特性：種々の、主に疎水性分子（レチノイド、脂肪酸、コレステロール、プロスタグランジン、ビリベルジン、フェロモン、味覚物質、および臭気物質等）に結合するためのそれらの能力、特異的な細胞表面受容体へのそれらの結合、ならびに高分子複合体のそれらの形成によって特徴付けられる、典型的に小さな分泌タンパク質である。それらは過去に主に輸送タンパク質として分類されたが、リポカリンは種々様々な生理機能を果たすことが現在明らかとなっている。これらは、レチノール輸送、嗅覚、フェロモンシグナル伝達、およびプロスタグランジンの合成での役割を含む。リポカリンはまた、免疫応答の調節および細胞の恒常性の媒介にも関係した（例えば、Ｆｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１８、１〜１４およびＦｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４８２、９〜２４で考察される）。
リポカリンは、並外れて低レベルの全体的な配列保存を共有し、配列同一性が２０％未満であることが多い。非常に対照的に、それらの全体的なフォールディングパターンは高度に保存されている。リポカリン構造の中央部は、それ自体で閉じた単一の８本鎖逆平行β−シートから成り、連続的に水素結合したβ−バレルを形成する。バレルの一端は、その底面をわたるＮ末端ペプチドセグメントおよびβ−ストランドを結びつける３つのペプチドループによって立体的にブロックされている。β−バレルの他端は溶媒にさらされており、４つのペプチドループによって形成される標的（ｔａｒｇｅｔ）結合部位を包含する。異なるサイズ、形状、および化学的特徴の標的を収容することがそれぞれ可能な種々様々な異なる結合モードをもたらすのは、他の部分では不変のリポカリン骨格中のループのこの多様性である（例えば、Ｆｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．（１９９６）、前掲、Ｆｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（２０００）、前掲、またはＳｋｅｒｒａ，Ａ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４８２、３３７〜３５０で考察される）。
現在涙リポカリン（ＴＬＰＣまたはＴｌｃ）と呼ばれるヒト涙プレアルブミンは、ヒト涙液の主要なタンパク質（全タンパク質含有量の約３分の１）として最初は記載されたが、また、近年、前立腺、鼻粘膜、および気管粘膜を含む他のいくつかの分泌組織中でも同定された。相同タンパク質はラット、ブタ、イヌ、およびウマで見つかった。涙リポカリンは、関連する不溶性脂質に対するその高度な無差別性およびこのタンパク質ファミリーの他のメンバーと異なる結合の特徴のゆえに珍しいリポカリンメンバーである（Ｒｅｄｌ，Ｂ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４８２、２４１〜２４８で考察される）。脂肪酸、脂肪族アルコール、リン脂質、糖脂質、およびコレステロール等の異なる化学分類の著しい数の親油性化合物はこのタンパク質の内因性リガンドである。興味深いことには、他のリポカリンとは対照的に、リガンド（標的）結合の強度は、アルキルアミドおよび脂肪酸の両方についての炭化水素末部の長さと相互に関連する。したがって、涙リポカリンは最も可溶性でない脂質に最も強く結合する（Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｂ．Ｊ．ら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１４、３６３〜３７２、Ｇａｓｙｍｏｖ，Ｏ．Ｋ．ら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４３３、３０７〜３２０）。
ヒト涙リポカリンの正確な生物学的機能は今までのところ十分に解明されておらず、まだ論議事項である。涙液中で、ヒト涙リポカリンは、眼の粘膜表面から液相に脂質を移動させることによる涙液膜の完全性にとって最も重要であると思われる（Ｇａｓｙｍｏｖ，Ｏ．Ｋ．ら（１９９９）、前掲で考察される）。しかしながら、ヒト涙リポカリンは、リポカリンの間で非常に珍しいｉｎ ｖｉｔｒｏでのさらなる活性、すなわちシステインプロテイナーゼの阻害および非特異的エンドヌクレアーゼ活性を呈する（ｖａｎ’ｔ Ｈｏｆ，Ｗ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、１８３７〜１８４１、Ｙｕｓｉｆｏｖ，Ｔ．Ｎ．ら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４７、８１５〜８１９）。近年、涙リポカリンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでいくつかの脂質過酸化産物に結合することができることが実証され、涙リポカリンは、潜在的に有害な親油性分子の、生理学的酸化ストレス誘発性の捕捉剤として機能するかもしれないといった仮説をもたらした（Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｍ．ら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５６、１２９〜１３５）。
非共有結合的相互作用を介してそれらの対応する標的に選択的に結合するタンパク質は、一般に、バイオテクノロジー、医学、生物学的分析、ならびに生物科学および生命科学で試薬として重大な役割を果たす。抗体、つまり免疫グロブリンはこの種のタンパク質の顕著な例である。リガンド／標的の認識、結合、および／または分離に関連するそのようなタンパク質の多種多様の必要性にもかかわらず、ほとんど排他的に免疫グロブリンが現在使用されている。明確なリガンド結合の特徴を有する他のタンパク質、例えばレクチンの適用は、特別の場合に制限されたままである。
むしろ、近年、リポカリンファミリーのメンバーが、明確なリガンド結合特性を有するタンパク質に関する研究テーマになった。ＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／１６８７３号は、４つのペプチドループの領域に突然変異したアミノ酸位置を有するリポカリンファミリーのポリペプチドを開示し、これらのループは、結合ポケットを包含する円柱状のβ−バレル構造の端に配置され、またこれらのループは、オオモンシロチョウのビリン結合タンパク質のアミノ酸位置２８〜４５、５８〜６９、８６〜９９、および１１４〜１２９を含む線状ポリペプチド配列中のそれらのセグメントに対応する。
ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／７５３０８号は、ジゴキシゲニンに特異的に結合するビリン結合タンパク質の突然変異タンパク質を開示し、国際特許出願ＷＯ０３／０２９４６３号およびＷＯ０３／０２９４７１号は、それぞれヒト好中球ゼラチナーゼ関連性リポカリン（ｈＮＧＡＬ）およびアポリポタンパク質Ｄの突然変異タンパク質に関する。リポカリン変異体のリガンド親和性、特異性、およびフォールディング安定性をさらに改良し、うまく調整するために、さらなるアミノ酸残基の交換等の、リポカリンファミリーの異なるメンバーを使用する種々のアプローチが提唱された（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（２００１）Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４、２５７〜２７５、Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ，Ｓ．およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．（２００２）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９６、２１３〜２２８）。ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００６／５６４６４号は、低ナノモルの範囲でＣＴＬＡ−４に対する結合親和性を有するヒト好中球ゼラチナーゼ関連性リポカリンの突然変異タンパク質を開示する。
ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００５／１９２５６号は、異なるまたは同じ標的リガンドに対する少なくとも１つの結合部位を有する涙リポカリンの突然変異タンパク質を開示し、ヒト涙リポカリンのそのような突然変異タンパク質を生成するための方法を提供する。このＰＣＴ出願によれば、涙リポカリンの一次配列、特に、成熟ヒト涙リポカリンのアミノ酸７〜１４、２４〜３６、４１〜４９、５３〜６６、６９〜７７、７９〜８４、８７〜９８、および１０３〜１１０を含むループ領域内のあるアミノ酸ストレッチは、結合親和性を有する突然変異タンパク質を生成するために突然変異誘発にさらされる。結果として生じる突然変異タンパク質は、ナノモルの範囲で、ほとんどの場合＞１００ｎＭで、選択されたリガンドに対する結合親和性（ＫＤ）を有する。
この進歩にもかかわらず、単に、診断適用および治療適用でのヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質の適合性をさらに改良するための理由で、例えばピコモルの範囲で選択された標的分子に対する改良された結合特性を有するヒト涙リポカリン突然変異タンパク質を生成するための方法を有することはなお望ましいと思われる。
したがって、本発明の目的は、所与の標的に対する高度な結合親和性を有するヒト涙リポカリン突然変異タンパク質を提供することである。
この目的は、独立請求項の特徴を有するヒト涙リポカリン突然変異タンパク質を生成するための方法によって達成される。
第１の態様では、本発明は、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに検出可能な結合親和性で結合する、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質を生成するための方法であって、
（ａ）ヒト涙リポカリンをコードする核酸分子を、天然の成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置２６〜３４、５６〜５８、８０、８３、１０４〜１０６および１０８のうちのいずれかの少なくとも１つのコドンでの突然変異誘発にさらすことにより、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質をコードする複数の核酸を得るステップであって、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の配列位置６１および１５３でシステイン残基をコードするコドンの少なくとも１つが、任意の他のアミノ酸残基をコードするように突然変異されているステップ、
（ｂ）（ａ）で得られた１つまたは複数の突然変異タンパク質核酸分子を発現系において発現させることより、１つまたは複数の突然変異タンパク質を得るステップ、および
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに対する検出可能な結合親和性を有する１つまたは複数の突然変異タンパク質を選択および／または単離によって濃縮するステップ、
を含む方法を提供する。
これに関連して、本発明者らは、驚いたことに、システイン残基６１および１５３によって形成される野生型涙リポカリンの構造的ジスルフィド結合の除去（それぞれのナイーブ核酸ライブラリーのレベルで）（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔら（２００５）、Ｔｈｅ １．８−Å ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｅａｒ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃａｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｉｇａｎｄｓ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０、４８４〜４９３を参照されたい）が、安定してフォールドされているだけではなく、さらに、低ピコモルの範囲で、親和性を有する所与の非天然リガンドに結合することもできる涙リポカリン突然変異タンパク質を提供することを見つけたことに注目されたい。理論によって束縛されることを望まなければ、構造的ジスルフィド結合の排除は、本発明の突然変異タンパク質中への非天然人工ジスルフィド結合の（自発的）生成または意図的な導入を考慮し（実施例を参照されたい）、それによって、例えば、突然変異タンパク質の安定性を増加させるというさらなる利点を提供することも考えられる。
本明細書で使用される用語「突然変異誘発」は、実験条件が、ヒト涙リポカリン（Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータバンクエントリーＰ３１０２５）の所与の配列位置での自然発生のアミノ酸が、それぞれの天然のポリペプチド配列中のこの特異的な位置に存在しない少なくとも１つのアミノ酸によって置換され得るように選ばれることを意味する。用語「突然変異誘発」はまた、１つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入による配列セグメントの長さの（さらなる）改変をも含む。したがって、例えば、選ばれた配列位置の１つのアミノ酸が、３つのランダム突然変異のストレッチと交換され、野生型タンパク質のそれぞれのセグメントの長さと比較して２つのアミノ酸残基の挿入につながることは本発明の範囲内である。そのような挿入または欠失は、本発明で突然変異誘発にさらすことができるペプチドセグメントのうちのいずれかに互いに独立して導入されてもよい。本発明の例示的な一実施形態では、いくつかの突然変異の挿入は、選ばれたリポカリン骨格のループＡＢ中に導入されてもよい（本明細書にその全体が参照によって組み込まれる国際特許出願ＷＯ２００５／０１９２５６号を参照されたい）。用語「ランダム突然変異誘発」は、所定のただ１つのアミノ酸（突然変異）も、ある配列位置に存在しないが、少なくとも２つのアミノ酸が突然変異誘発の間に既定の配列位置に、ある確率で組み込まれ得ることを意味する。
ヒト涙リポカリンのコード配列（Ｒｅｄｌ，Ｂ．ら（１９９２）Ｔ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、２０２８２〜２０２８７）は、本発明で選択されたペプチドセグメントの突然変異誘発のための出発点として使用される。詳述されたアミノ酸位置の突然変異誘発については、当業者は、部位特異的突然変異誘発のための種々の確立された標準の方法を自由に使うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）、前掲）。通常使用される技術は、所望の配列位置に縮重塩基組成物を運ぶ、合成オリゴヌクレオチドの混合物を使用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による突然変異の導入である。例えば、コドンＮＮＫまたはＮＮＳ（Ｎ＝アデニン、グアニンもしくはシトシン、またはチミンであり、Ｋ＝グアニンまたはチミンであり、Ｓ＝アデニンまたはシトシンである。）の使用は、突然変異誘発の間に、アンバー停止コドンを加えた２０種のアミノ酸すべての組み込みを可能にするが、コドンＶＶＳは、アミノ酸Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌがポリペプチド配列の選択された位置に組み込まれないようにするので、組み込まれる可能性のあるアミノ酸の数を１２種に制限する。コドンＮＭＳ（Ｍ＝アデニンまたはシトシン）の使用は、例えば、アミノ酸Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＶａｌが選択された配列位置に組み込まれないようにするので、選択された配列位置での可能性のあるアミノ酸の数を１１種に制限する。この点で、セレノシステインまたはピロリジン等の他のアミノ酸（通常の２０種の自然発生アミノ酸以外）についてのコドンも突然変異タンパク質の核酸中に組み込むことができることに注目されたい。Ｗａｎｇ，Ｌ．ら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２、４９８〜５００またはＷａｎｇ，Ｌ．およびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１、１〜１１によって記載されるように、他の珍しいアミノ酸、例えばｏ−メチル−Ｌ−チロシンまたはｐ−アミノフェニルアラニンを挿入するために停止コドンとして普通認識されるＵＡＧ等の「人工」コドンを使用することも可能である。
塩基対特異性が低下したヌクレオチド基本単位、例えばイノシン、８−オキソ−２’デオキシグアノシン、または６（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３，４−ジヒドロ−８Ｈ−ピリミド−１，２−オキサジン−７−オンの使用（Ｚａｃｃｏｌｏら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５、５８９〜６０３）は、選ばれた配列セグメント中への突然変異の導入のための他の選択肢である。
さらなる可能性としていわゆるトリプレット突然変異誘発がある。この方法は、コード配列中への組み込みのための、それぞれが１つのアミノ酸をコードする異なるヌクレオチドトリプレットの混合物を使用する（Ｖｉｒｎｅｋａｓ Ｂ、Ｇｅ Ｌ、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＫＣ、Ｗｅｌｌｎｈｏｆｅｒ Ｇ、Ｍｏｒｏｎｅｙ ＳＥ．１９９４ Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ：ｉｄｅａｌ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｉｘｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２、５６００〜５６０７）。
それぞれのポリペプチドの選択された領域中に突然変異を導入するための１つの可能性のある戦略は、それぞれが、突然変異されることとなる対応する配列セグメントの１つに部分的に由来する４つのオリゴヌクレオチドの使用に基づく。これらのオリゴヌクレオチドを合成する場合、当業者は、天然のアミノ酸すべてをコードするコドンがランダムに生じるように、突然変異されることとなるアミノ酸位置に対応するそれらのヌクレオチドトリプレットの合成のための核酸基本単位の混合物を使用することができ、最後にリポカリンペプチドライブラリーの生成をもたらす。例えば、第１のオリゴヌクレオチドは、その配列中で、リポカリンポリペプチドの最もＮ末端の位置で、突然変異されることとなるペプチドセグメントについてのコーディング鎖に、突然変異される位置から離れて対応する。したがって、第２のオリゴヌクレオチドは、そのポリペプチド配列に続く第２の配列セグメントについての非コーディング鎖に対応する。順に、第３のオリゴヌクレオチドは、対応する第３の配列セグメントについてのコーディング鎖に対応する。最後に、第４のオリゴヌクレオチドは第４の配列セグメントの非コーディング鎖に対応する。ポリメラーゼ連鎖反応は、それぞれの第１および第２のオリゴヌクレオチドを用いてならびに必要であれば別々にそれぞれの第３および第４のオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。
これらの反応の両方の増幅産物は、種々の知られている方法によって、突然変異が選択された位置に導入された第１〜第４の配列セグメントの配列を含む単一の核酸中に組み合わせることができる。このために、両方の産物は、例えば、側方オリゴヌクレオチドならびに第２および第３の配列セグメントの間の配列をもたらす１つまたは複数の介在物質である核酸分子を使用して新しいポリメラーゼ連鎖反応にかけることができる。突然変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドの配列内の数および配置の選好では、当業者は自由に多数の代替物を使うことができる。
上記に定義される核酸分子は、リポカリンポリペプチドをコードする核酸の欠けている５’および３’配列ならびに／またはベクターとのライゲーションによって結びつけることができ、知られている宿主生物中でクローニングすることができる。多くの確立された手順はライゲーションおよびクローニングに利用可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）、前掲）。例えば、クローニングベクターの配列中にも存在する制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列は、合成オリゴヌクレオチドの配列中に設計することができる。したがって、それぞれのＰＣＲ産物の増幅および酵素的な開裂の後に、結果として生じる断片は対応する認識配列を使用して容易にクローニングすることができる。
突然変異誘発のために選択された、タンパク質をコードする遺伝子内のより長い配列セグメントも、例えばエラー率が増加した条件下でのポリメラーゼ連鎖反応の使用によって、化学的突然変異誘発によって、または細菌の突然変異誘発株の使用によって、知られている方法を介してランダム突然変異誘発にさらすことができる。そのような方法はまた、リポカリン突然変異タンパク質の標的親和性または特異性をさらに最適化するために使用することができる。実験突然変異誘発のセグメントの外側で起こる可能性のある突然変異は許容されることが多いまたはそれどころか、例えばそれらがリポカリン突然変異タンパク質のフォールディング能率またはフォールディング安定性の改善に寄与する場合、有利であると証明され得る。
本明細書で使用される用語「ヒト涙リポカリン」は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンク受入番号Ｐ３１０２５を有する成熟ヒト涙リポカリンを指す。
用語「非天然リガンド」は、生理学的条件下で天然の成熟ヒト涙リポカリンに結合しない化合物を指す。標的（リガンド）は、免疫学的ハプテン、ステロイドホルモン等のホルモン、または任意の生体高分子もしくはその断片、例えばタンパク質もしくはタンパク質ドメイン、ペプチド、オリゴデオキシヌクレオチド、核酸、オリゴ糖もしくは多糖またはそのコンジュゲート、脂質、または他の高分子の特徴を示す遊離形態またはコンジュゲート形態の任意の化合物であってもよい。
本発明の一実施形態では、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質を生成するための方法は、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置２６〜３４、５６〜５８、８０、８３、１０４〜１０６および１０８のうちのいずれかのコドンの少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１５、１６または１７個を突然変異させることを含む。他の実施形態では、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、５６、５７、５８、８０、８３、１０４、１０５、１０６および１０８のコドンの１８個すべてを突然変異させる。
他の態様では、本発明は、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに検出可能な結合親和性で結合する、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質を生成するための方法であって、
（ａ）ヒト涙リポカリンをコードする核酸分子を、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置３４、８０、および１０４のうちのいずれかの少なくとも１つのコドンでの突然変異誘発にさらすことにより、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質をコードする複数の核酸を得るステップ、
（ｂ）（ａ）で得られた１つまたは複数の突然変異タンパク質核酸分子を発現系において発現させることにより、１つまたは複数の突然変異タンパク質を得るステップ、および
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに対する検出可能な結合親和性を有する１つまたは複数の突然変異タンパク質を選択および／または単離によって濃縮するステップ、
を含む方法を提供する。
前に述べた方法の一実施形態では、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置２６〜３３、５６〜５８、８３、１０５〜１０６および１０８のうちのいずれかのコドンのさらに少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４または１５個が突然変異される。
本発明の別の実施形態では、本発明による方法は、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列中の位置６１および１５３のシステインをコードするコドンの両方の突然変異を含む。一実施形態では、位置６１は、ほんの少数の可能性を挙げると、アラニン、フェニルアラニン、リシン、アルギニン、トレオニン、アスパラギン、チロシン、メチオニン、セリン、プロリン、またはトリプトファン残基をコードするように突然変異される。位置１５３が突然変異される実施形態では、セリンまたはアラニン等のアミノ酸を位置１５３に導入することができる。
本明細書に記載される本発明の他の実施形態では、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置１１１および／または１１４をコードするコドンは、例えば位置１１１でアルギニンおよび位置１１４でトリプトファンをコードするように突然変異される。
本発明の方法の他の実施形態は、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の位置１０１でシステインをコードするコドンの突然変異誘発を、このコドンが任意の他のアミノ酸をコードするように含む。一実施形態では、位置１０１をコードする突然変異したコドンはセリンをコードする。したがって、いくつかの実施形態では、位置６１、１０１、および１５３の２つまたは３つすべてのシステインコドンは他のアミノ酸のコドンと交換される。
本発明の方法によれば、突然変異タンパク質はヒト涙リポカリンをコードする核酸から開始して得られる。そのような核酸は、突然変異誘発にさらされ、組換えＤＮＡ技術によって適切な細菌または真核生物の宿主生物中に導入される。涙リポカリンの核酸ライブラリーの獲得は、抗体のような特性を有するリポカリン突然変異タンパク質、つまり所与の標的に対して親和性を有する突然変異タンパク質を生成するための当技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して実行することができる。そのような組合せの方法の例は、例えば、国際特許出願ＷＯ９９／１６８７３号、ＷＯ００／７５３０８号、ＷＯ０３／０２９４７１号、ＷＯ０３／０２９４６２号、ＷＯ０３／０２９４６３号、ＷＯ２００５／０１９２５４号、ＷＯ２００５／０１９２５５号、ＷＯ２００５／０１９２５６号、またはＷＯ２００６／５６４６４号に詳細に記載される。これらの特許出願のそれぞれの内容は、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。適切な宿主中での、突然変異誘発にさらされた核酸配列の発現の後に、所与の標的に結合する複数のそれぞれのリポカリン突然変異タンパク質の遺伝情報を保有するクローンは、得られたライブラリーから選択することができる。ファージディスプレイ（Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ら（１９９６）前掲、Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９７）前掲、もしくはＲｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．およびＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９）前掲で考察される）、コロニースクリーニング（Ｐｉｎｉ，Ａ．ら（２００２）Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．５、５０３〜５１０で考察される）、リボソームディスプレイ（Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．ら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２、４００〜４０５で考察される）もしくはＷｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８、３７５０〜３７５５で報告されるｍＲＮＡディスプレイ、または、ＷＯ９９／１６８７３号、ＷＯ００／７５３０８号、ＷＯ０３／０２９４７１号、ＷＯ０３／０２９４６２号、ＷＯ０３／０２９４６３号、ＷＯ２００５／０１９２５４号、ＷＯ２００５／０１９２５５号、ＷＯ２００５／０１９２５６号、もしくはＷＯ２００６／５６４６４号に特に記載される方法等のよく知られている技術はこれらのクローンの選択のために利用することができる。
本開示に従って、ステップ（ｃ）は、上記の方法の他の実施形態で、
（ｉ）免疫学的ハプテン、ペプチド、タンパク質、または例えば多糖、核酸分子（例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ）、または完全ウイルス粒子もしくはウイロイド等の他の高分子の特徴を示す遊離形態またはコンジュゲート形態の化合物から成る群から選択される化合物を所与のリガンドとして提供すること、
（ｉｉ）複数の突然変異タンパク質を上述のリガンドと接触させて、上述のリガンドと、上述のリガンドに対する結合親和性を有する突然変異タンパク質との複合体の形成を可能にすること、および
（ｉｉｉ）結合親和性を有していないまたは実質的に有していない突然変異タンパク質を除去すること、
をさらに含む。
本発明の一部の実施形態では、リガンドはタンパク質またはその断片であってもよい。これらの実施形態のうちの１つでは、ヒトＴ細胞共受容体ＣＤ４に結合する突然変異タンパク質は除外される。
本発明の方法の一実施形態では、ステップ（ｃ）における選択は競合的条件下で実行する。本明細書で使用される競合的条件は、突然変異タンパク質の選択が、突然変異タンパク質およびヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンド（標的）が、その標的への突然変異タンパク質の結合に伴って競合するさらなるリガンドの存在下で接触させられる少なくとも１つのステップを包含することを意味する。このさらなるリガンドは、本発明の突然変異タンパク質によって認識されるエピトープに対する少なくとも１つの重複するエピトープに結合し、したがって突然変異タンパク質の標的結合に干渉する標的の生理学的リガンド、過剰な標的それ自体、または標的の任意の他の非生理学的リガンドであってもよい。あるいは、さらなるリガンドは、アロステリック効果によって、標的への突然変異タンパク質の結合部位と別個のエピトープを複雑にすることによって、突然変異タンパク質の結合と競合する。
テンペレート（溶原性）（ｔｅｍｐｅｒｅｎｔ）Ｍ１３ファージを使用するファージディスプレイ技術の実施形態（Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ら（１９９６），前掲、Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９７）前掲、またはＲｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．およびＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９）、前掲で考察される）は、本発明で利用することができる選択方法の例として与えられる。本発明の突然変異タンパク質の選択に使用することができるファージディスプレイ技術の他の実施形態は、Ｂｒｏｄｅｒｓらによって記載されるハイパーファージによるファージ技術である（Ｂｒｏｄｅｒｓら（２００３）「Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ．」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０５：２９５〜３０２）。ｆ１等の他のテンペレートファージまたはＴ７等の溶菌ファージも同様に利用されてもよい。例示的な選択方法については、Ｎ末端でのシグナル配列、好ましくはＯｍｐＡシグナル配列とのおよびＣ末端でのファージキャプシド中に組み込まれ得るファージＭ１３のキャプシドタンパク質ｐＩＩＩまたはその断片との融合タンパク質としての突然変異したリポカリン核酸配列の発現を可能にするＭ１３ファージミドが産生される。野生型配列のアミノ酸２１７〜４０６を含むファージキャプシドタンパク質のＣ末端断片ΔｐＩＩＩは融合タンパク質を産生するために好ましくは使用される。位置２０１のシステイン残基が欠けているまたは他のアミノ酸と交換されるｐＩＩＩのＣ末端断片は一実施形態でとりわけ好まれる。
したがって、本発明の方法の別の実施形態は、突然変異誘発によって得られる、ヒト涙リポカリンの複数の突然変異タンパク質をコードする核酸を、Ｍ１３ファミリーの糸状バクテリオファージのコートタンパク質ｐＩＩＩまたはこのコートタンパク質の断片をコードする遺伝子と３’端で作動可能に融合して、少なくとも１つの突然変異タンパク質を所与のリガンドの結合について選択することを含む。
融合タンパク質は、融合タンパク質またはその部分の固定化、検出、および／または精製を可能にするアフィニティータグ等のさらなる成分を含んでいてもよい。さらに、停止コドンは、リポカリンまたはその突然変異タンパク質をコードする配列領域およびファージキャプシド遺伝子またはその断片の間に位置させることができ、停止コドン、好ましくはアンバー停止コドンは、適切なサプレッサー株中での翻訳の間にアミノ酸に少なくとも部分的に翻訳される。
例えば、本明細書に記載される、現在ｐＴｌｃ２７とも呼ばれるファスミドベクターｐＴＬＰＣ２７は、ヒト涙リポカリン突然変異タンパク質をコードするファージミドライブラリーの調製に使用することができる。涙リポカリン突然変異タンパク質をコードする発明の核酸分子は２つのＢｓｔＸＩ制限部位を使用してベクター中に挿入される。ライゲーションの後に、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ等の適切な宿主株は、多くの独立したクローンを得るために結果として生じる核酸混合物を用いて形質転換される。それぞれのベクターは、所望の場合、ハイパーファージミドライブラリーの調製のために生成することができる。
結果として生じるライブラリーは、続いて、機能的ファージミドを産生するために、適切なＭ１３ヘルパーファージまたはハイパーファージを用いて液体培養中で重複感染させる。組換えファージミドは、コートタンパク質ｐＩＩＩまたはその断片との融合物としてその表面上にリポカリン突然変異タンパク質を表し、融合タンパク質のＮ末端シグナル配列は正常に切り離される。他方、それはまた、ヘルパーファージによって供給された天然のキャプシドタンパク質ｐＩＩＩの１つまたは複数のコピーをも運び、したがって、受容株、一般にＦプラスミドまたはＦ’プラスミドを保有する細菌株に感染することができる。ハイパーファージディスプレイの場合では、ハイパーファージミドは、それらの表面上に、感染性コートタンパク質ｐＩＩＩを有するが、天然のキャプシドタンパク質を有していない融合物としてリポカリン突然変異タンパク質を表す。ヘルパーファージまたはハイパーファージを用いた感染の間にまたはその後に、リポカリン突然変異タンパク質およびキャプシドタンパク質ｐＩＩＩの間の融合タンパク質の遺伝子発現は、例えばアンヒドロテトラサイクリンの添加によって誘発することができる。誘発条件は、得られたファージミドの実質的な画分がそれらの表面上に少なくとも１つのリポカリン突然変異タンパク質を表すように選ばれる。ハイパーファージディスプレイの場合では、誘発条件は、リポカリン突然変異タンパク質およびキャプシドタンパク質ｐＩＩＩから成る３つおよび５つの間の融合タンパク質を保有するハイパーファージミドの集団をもたらす。ポリエチレングリコールを用いた沈殿等の種々の方法がファージミドの単離で知られている。単離は、典型的に、６〜８時間のインキュベーション期間の後に起こる。
次いで、単離されたファスミドは、所望の標的を用いるインキュベーションによる選択にかけることができ、標的は、それらのコート中に融合タンパク質として所望の結合活性を有する突然変異タンパク質を運ぶそれらのファージミドの少なくとも一時的な固定化を可能にする形態で提示される。当業者に知られている種々の実施形態の中で、標的は、例えば、血清アルブミン等の担体タンパク質とコンジュゲートすることができ、この担体タンパク質を介してタンパク質結合表面、例えばポリスチレンに結合することができる。ＥＬＩＳＡ技術またはいわゆる「イムノスティック」に適したマイクロタイタープレートは、標的のそのような固定化に好ましくは使用することができる。あるいは、ビオチン等の他の結合基との標的のコンジュゲートを使用することができる。次いで、標的は、この基に選択的に結合する表面、例えばストレプトアビジン、ニュートラビジン、またはアビジンでコートされたマイクロタイタープレートまたは常磁性粒子の上に固定化することができる。標的が免疫グロブリンのＦｃ部分に融合される場合、固定化はまた、表面、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いてコートされたマイクロタイタープレートまたは常磁性粒子を用いて達成することができる。
表面上に存在する非特異的ファージミド結合部位は、ブロッキング溶液を用いて、それらがＥＬＩＳＡ法で知られているように飽和させることができる。次いで、ファージミドは、生理学的バッファーの存在下で表面上に固定化された標的と典型的に接触させられる。非結合ファージミドは複数回の洗浄によって除去される。次いで、表面上に残存するファージミド粒子を溶出させる。溶出については、いくつかの方法が可能である。例えば、ファージミドは、プロテアーゼの添加によってまたは酸、塩基、洗浄剤、もしくはカオトロピック塩の存在下でまたは適度な変性条件下で溶出させることができる。好ましい方法は、ｐＨ２．２のバッファーを使用する溶出であり、溶出液は続いて中和される。あるいは、遊離標的の溶液は、ファージミドへの結合について固定化標的と競合させるために添加することができるまたは標的特異的ファージミドは、対象とする標的に特異的に結合する免疫グロブリンもしくは天然のリガンドタンパク質（ｌｉｇａｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）との競合によって溶出させることができる。
その後、大腸菌細胞は溶出したファージミドを用いて感染させる。あるいは、核酸は、溶出したファージミドから抽出し、配列分析、増幅、または他の様式での細胞の形質転換に使用することができる。このように得られた大腸菌クローンから開始して、新鮮なファージミドまたはハイパーファージミドは、上記に記載される方法に従って、Ｍ１３ヘルパーファージまたはハイパーファージを用いた重複感染によって再び産生され、このように増幅されたファージミドは、固定化標的上での選択にもう一度かけられる。複数選択サイクルは、十分に濃縮された形態で本発明の突然変異タンパク質を有するファージミドを得るために必要であることが多い。選択サイクルの数は、好ましくは、続く機能分析で、研究されるクローンの少なくとも０．１％が、所与の標的に対して検出可能な親和性を有する突然変異タンパク質を産生するように選ばれる。サイズ、つまり利用されるライブラリーの複雑さに依存して、２〜８サイクルがこのために典型的に必要とされる。
選択された突然変異タンパク質の機能分析については、大腸菌株が選択サイクルから得られるファージミドを用いて感染され、対応する二重鎖ファスミドＤＮＡが単離される。このファスミドＤＮＡからまたは同様にファージミドから抽出された一重鎖ＤＮＡから開始して、本発明の選択された突然変異タンパク質の核酸配列を当技術分野で知られている方法によって決定することができ、アミノ酸配列をそれから推定することができる。突然変異した領域または全涙リポカリン突然変異タンパク質の配列は、他の発現ベクター上でサブクローニングすることができ、適切な宿主生物中で発現させることができる。例えば、現在ｐＴｌｃ２６とも呼ばれるベクターｐＴＬＰＣ２６は、大腸菌ＴＧ１等の大腸菌株中での発現に使用することができる。このように産生された涙リポカリンの突然変異タンパク質は種々の生化学的方法によって精製することができる。例えばｐＴｌｃ２６を用いて産生された涙リポカリン突然変異タンパク質は、それらのＣ末端に親和性ペプチドＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔら、前掲）を保有し、したがって、好ましくはストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
選択はまた、他の方法によっても実行することができる。多くの対応する実施形態は、当業者に知られているまたは文献に記載されている。さらに、方法の組合せを適用することができる。例えば、「ファージディスプレイ」によって選択されたまたは少なくとも濃縮されたクローンは、さらに、「コロニースクリーニング」にかけることができる。この手順は、標的に対して検出可能な結合親和性を有する涙リポカリン突然変異タンパク質の産生に関して個々クローンを直接単離することができるという利点を有する。
「ファージディスプレイ」技術または「コロニースクリーニング」法での宿主生物として大腸菌の使用に加えて、他の細菌株、酵母、または同様に昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞をこの目的のために使用することができる。さらに上記に記載されるランダムライブラリーからの涙リポカリン突然変異タンパク質の選択については、限定突然変異誘発を含む進化的方法も、繰り返しのスクリーニングサイクルの後の標的に対する親和性または特異性に関して、標的に対していくらかの結合活性を既に有する突然変異タンパク質を最適化するために適用することができる。
所与の標的に対する親和性を有する突然変異タンパク質は一度選択されると、さらに高度な親和性の変異体またはより高度な耐熱性、改善された血清安定性、熱力学的安定性、改善された溶解性、改善された単量体の挙動、熱変性、化学変性、タンパク質分解、もしくは洗浄剤に対する改善された抵抗性等のような改善された特性を有する変異体を続いて選択するために、そのような突然変異タンパク質を他の突然変異誘発にさらすことがさらに可能である。このさらなる突然変異誘発は、より高度な親和性を目標にする場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏ「親和性成熟」と見なすことができ、合理的な設計に基づいた部位特異的突然変異またはランダム突然変異によって達成することができる。より高度な親和性または改善された特性を得るための他の可能なアプローチは、エラープローンＰＣＲの使用であり、これは、リポカリン突然変異タンパク質の配列位置の選択された範囲にわたって点突然変異をもたらす。エラープローンＰＣＲは、Ｚａｃｃｏｌｏら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５、５８９〜６０３によって記載されるもの等の任意の知られているプロトコールに従って実行することができる。そのような目的のための適切なランダム突然変異誘発の他の方法は、Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｈら（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、７６〜８１によって記載されるランダム挿入／欠失（ＲＩＤ）突然変異誘発またはＢｉｔｔｋｅｒ，Ｊ．Ａら（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、１０２４〜１０２９によって記載される非相同的ランダム組換え（ＮＲＲ）を含む。所望の場合、親和性成熟はまた、ＷＯ００／７５３０８号またはＳｃｈｌｅｈｕｂｅｒ，Ｓ．ら、（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９７、１１０５〜１１２０に記載される手順に従って実行することができ、ここで、ジゴキシゲニンに対して高度な親和性を有するビリン結合タンパク質の突然変異タンパク質が得られる。
別の態様では、本発明は、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに対して検出可能な結合親和性を有するヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質を対象とし、これは本発明の上記の詳細な方法によって入手可能であるまたは得られる。
一実施形態では、上記の方法に従って得られたヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質は、他のアミノ酸による、配列位置６１および１５３のそれぞれに存在するシステイン残基の少なくとも一方または両方の置換ならびに成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の配列位置２６〜３４、５６〜５８、８０、８３、１０４〜１０６、および１０８のうちのいずれか１つの少なくとも１つのアミノ酸残基の突然変異を含む。涙リポカリンのβ−バレル構造の開放端の結合部位において、位置２４〜３６はＡＢループに含まれ、位置５３〜６６はＣＤループに含まれ、位置６９〜７７はＥＦループに含まれ、位置１０３〜１１０はＧＨループに含まれる。これらの４つのループの定義はＦｌｏｗｅｒに従って本明細書で使用される（Ｆｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．（１９９６）、前掲およびＦｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（２０００）、前掲）。普通、そのような突然変異タンパク質は、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の配列位置２６〜３４、５６〜５８、８０、８３、１０４〜１０６、および１０８に少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、または１８個の突然変異したアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、突然変異タンパク質は、アミノ酸置換Ｃｙｓ６１→Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、ＰｒｏまたはＴｒｐ、およびＣｙｓ１５３→ＳｅｒまたはＡｌａを含む。そのような置換は、Ｃｙｓ６１およびＣｙｓ１５３を連結する自然発生のジスルフィド架橋の形成を抑制し、したがって突然変異タンパク質の取扱いを容易にするのに有用であることがわかった。
他の実施形態では、突然変異タンパク質は、Ａｒｇ１１１→ＰｒｏおよびＬｙｓ１１４→Ｔｒｐから選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含む。本発明の突然変異タンパク質は、他のアミノ酸によって置換された、天然の成熟ヒト涙リポカリンの配列の位置１０１のシステインをさらに含んでいてもよい。この置換は、例えば、突然変異Ｃｙｓ１０１→ＳｅｒまたはＣｙｓ１０１→Ｔｈｒであってもよい。
突然変異タンパク質が結合している非天然リガンドはタンパク質またはその断片であってもよい、ただし、一部の実施形態では、ヒトＴ細胞共受容体ＣＤ４は非天然標的として除外されてもよいということを条件とする。
本発明のリポカリン突然変異タンパク質は、突然変異したアミノ酸配列位置の外側に野生型（天然）アミノ酸配列を含んでいてもよい。他方では、本明細書に開示されるリポカリン突然変異タンパク質はまた、アミノ酸突然変異が、突然変異タンパク質の結合活性およびフォールディングに干渉しない限り、突然変異誘発にさらされた配列位置の外側にそれらの突然変異を含有していてもよい。そのような突然変異は、確立された標準の方法を使用して、ＤＮＡレベルで非常に容易に達成することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。アミノ酸配列の可能な変更は、アミノ酸置換だけではなく挿入または欠失がある。そのような置換は保存的であってもよい、つまり、アミノ酸残基は化学的に類似するアミノ酸残基と交換される。保存的置換の例は次のグループのメンバーの中での交換とする：１）アラニン、セリン、およびトレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリシン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；ならびに６）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。他方では、アミノ酸配列中に非保存的変更を導入することも可能である。さらに、単一のアミノ酸残基を交換する代わりに、涙リポカリンの一次構造の１つまたは複数の連続的なアミノ酸を挿入するまたは欠失させることも、これらの欠失または挿入が安定したフォールドまたは機能的突然変異タンパク質をもたらす限り、可能である。（例えば、切断されたＮ末端およびＣ末端を有する突然変異タンパク質が生成される実験のセクションを参照されたい）。
アミノ酸配列のそのような改変は、ある制限酵素に対する開裂部位を組み込むことにより突然変異したリポカリン遺伝子またはその部分のサブクローニングを簡単にするための単一のアミノ酸位置の特異的突然変異誘発を含む。さらに、これらの突然変異はまた、所与の標的に対するリポカリン突然変異タンパク質の親和性をさらに改善するために組み込むこともできる。さらに、突然変異は、必要であれば、フォールディング安定性、血清安定性、タンパク質抵抗性、もしくは水溶解性を改善するまたは凝集傾向を低下させる等のために突然変異タンパク質のある特徴を調整するために導入することができる。例えば、自然発生のシステイン残基は、ジスルフィド架橋形成を予防するために他のアミノ酸に突然変異させてもよい。しかしながら、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ビオチン、ペプチド、もしくはタンパク質等の他の化合物へのコンジュゲートのためにまたは非自然発生ジスルフィド連結の形成のために新しい反応基を導入するために、他のアミノ酸配列位置をシステインに故意に突然変異させることも可能である。ヒト涙リポカリン突然変異タンパク質のアミノ酸配列中にシステイン残基を導入するためのそのような突然変異の例示的な可能性としては、置換Ｔｈｒ４０→Ｃｙｓ、Ｇｌｕ７３→Ｃｙｓ、Ａｒｇ９０→Ｃｙｓ、Ａｓｐ９５→Ｃｙｓ、およびＧｌｕ１３１→Ｃｙｓを含む。アミノ酸位置４０、７３、９０、９５、および／または１３１のうちのいずれかの側面に生成されたチオール成分は、例えば、それぞれの涙リポカリン突然変異タンパク質の血清半減期を増加させるために、突然変異タンパク質をＰＥＧ化するまたはＨＥＳ化するように使用されてもよい。システインが任意のこれらの配列位置に導入された突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（実施例４６を参照されたい）は、本発明のそのような突然変異タンパク質の例証となる例である。
本発明はまた、上記に定義される突然変異タンパク質も包含し、成熟ヒト涙リポカリンの配列の最初の４つのＮ末端アミノ酸残基（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ；位置１〜４）および／または成熟ヒト涙リポカリンの配列の最後の２つのＣ末端アミノ酸残基（Ｓｅｒ−Ａｓｐ；位置１５７〜１５８）は欠失している（実施例および添付の配列表リストも参照されたい）。
本発明のリポカリン突然変異タンパク質は、所望の標的に検出可能な親和性で、つまり、少なくとも２００ｎＭの解離定数で結合することができる。目下、一部の実施形態では、少なくとも１００、２０、１ｎＭ、またはそれ以下の、所与の標的に対する解離定数で所望の標的に結合するリポカリン突然変異タンパク質が好ましい。所望の標的に対する突然変異タンパク質の結合親和性は、蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡ、または表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）等の多くの方法によって測定することができる。
複合体形成が、結合パートナーの濃度、競合物の存在、バッファー系のイオン強度等のような多くの因子に依存的であることは当業者に容易に明白となる。選択および濃縮は、所望の標的との複合体で、少なくとも２００ｎＭの解離定数を有するリポカリン突然変異タンパク質の単離を可能にする条件下で一般に行われる。しかしながら、洗浄および溶出のステップは変動するストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）下で実行することができる。反応速度の特徴に関しての選択も同様に可能である。例えば、その選択は、標的からの遅い解離または言い換えれば、低ｋｏｆｆ速度を示す突然変異タンパク質との標的の複合体形成に有利である条件下で行うことができる。あるいは、選択は、突然変異タンパク質と標的との複合体の速い形成、言い換えれば高ｋｏｎ速度に有利である条件下で行うことができる。さらに例証となる代替物として、スクリーニングは、突然変異タンパク質の改善された耐熱性について選択する条件下で行うことができる（野生型涙リポカリンまたは事前に選択された標的に対する親和性を既に有する突然変異タンパク質と比較して）。
本発明の涙リポカリン突然変異タンパク質は典型的に単量体のタンパク質として存在する。しかしながら、発明のリポカリン突然変異タンパク質が自発的に二量体化するまたはオリゴマー形成することも可能である。安定した単量体を形成するリポカリン突然変異タンパク質の使用は、例えばより速い拡散およびより良好な組織浸透のゆえに、いくつかの適用にとって好ましいものとなり得るが、安定したホモ二量体または多量体を自発的に形成するリポカリン突然変異タンパク質の使用は、そのような多量体が所与の標的に対する（さらに）増加した親和性および／または結合力を提供することができるので、他の実例では有利となり得る。さらに、リポカリン突然変異タンパク質のオリゴマー形態は、より遅い解離速度または長期間の血清半減期を有することができる。安定した単量体を形成する突然変異タンパク質の二量体化または多量体化が所望される場合、これは、例えば、ｊｕｎ−ｆｏｓドメインもしくはロイシンジッパー等のそれぞれのオリゴマー化ドメインを本発明の突然変異タンパク質に融合することによってまたは「Ｄｕｏｃａｌｉｎ」の使用によって達成することができる（下記も参照されたい）。
本発明の涙リポカリン突然変異タンパク質は所与の標的との複合体形成のために使用されてもよい。標的は非天然標的／リガンドであってもよい。標的（リガンド）は、免疫学的ハプテン、ステロイドホルモン等のホルモン、または任意の生体高分子もしくはその断片、例えばタンパク質もしくはタンパク質ドメイン、ペプチド、オリゴデオキシヌクレオチド、核酸、オリゴ糖もしくは多糖またはそのコンジュゲートの特徴を示す遊離形態またはコンジュゲート形態の任意の化合物であってもよい。本発明の一実施形態では、標的はタンパク質である、ただしヒトＴ細胞共受容体ＣＤ４は除外されることを条件とする。タンパク質は、任意の球状可溶性タンパク質または受容体タンパク質、例えば細胞シグナル伝達に関連する膜貫通タンパク質、ＭＨＣ分子等の免疫系の成分、または特異的疾患を示す細胞表面受容体とすることができる。突然変異タンパク質はまたタンパク質の断片のみに結合することができてもよい。例えば、突然変異タンパク質は、細胞表面受容体のドメインが細胞膜中につなぎ留められた受容体の一部である場合、細胞表面受容体のドメインに結合することができ、ならびにこのドメインが可溶性タンパク質として同様に産生され得る場合、溶液中の同じドメインに結合することができる。しかしながら、本発明はそのような高分子標的に結合するのみの突然変異タンパク質に決して限定されない。しかし、突然変異誘発によって、ビオチン、フルオレセイン、またはジゴキシゲニン等の（より）低い分子量のリガンドへの特異的結合親和性を示す、涙リポカリンの突然変異タンパク質を得ることも可能である。
本発明の一実施形態では、涙リポカリン突然変異タンパク質が結合するリガンドは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）、およびインターロイキン４受容体アルファ鎖（ＩＬ−４受容体アルファ）もしくはその断片の群から選択されるタンパク質またはその断片である。リガンドとして、ＶＥＧＦ−Ｒ２またはＩＬ−４受容体アルファの細胞外領域またはドメインも含まれる。これらのリガンドは典型的に哺乳動物起源である。一実施形態では、これらのリガンドはヒト起源であるが、ほんの少数の例証となる例を挙げると、それらは、マウス、ラット、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、もしくはウシまたはカニクイザル起源であってもよい。
ヒトＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄから成る群から選択されてもよく、ＳＷＩＳＳ ＰＲＯＴデータバンク受入番号Ｐ１５６９２、Ｐ４９７６５、Ｐ４９７６７、およびＯ４３９１５（配列番号２２〜２５）に記載されるまたはその断片のアミノ酸配列を有していてもよい。そのような例示的な１つの断片はＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸８〜１０９から成る。ヒト血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）は、ＳＷＩＳＳ ＰＲＯＴデータバンク受入番号Ｐ３５９６８（配列番号２１）のアミノ酸配列またはその断片を有していてもよい。そのような断片の例証となる例は、それぞれアミノ酸４６〜１１０、１４１〜２０７、２２４〜３２０、３２８〜４１４、４２１〜５４８、５５１〜６６０、および６６７〜７５３を含む、ＶＥＧＦ−Ｒ２の細胞外Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン１〜７を含む。ヒトインターロイキン４受容体アルファ鎖は、ＳＷＩＳＳ ＰＲＯＴデータバンク受入番号Ｐ２４３９４（配列番号２０）のまたはその断片のアミノ酸配列を有していてもよい。ヒトインターロイキン４受容体アルファ鎖の断片の例証となる例は、ＩＬ−４受容体アルファのアミノ酸２６〜２３２を含む。
一般に、本発明の涙リポカリン突然変異タンパク質のタンパク質リガンドに関して本明細書で使用される用語「断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、Ｎ末端および／またはＣ末端が短縮されたタンパク質またはペプチドのリガンドに関し、これらは、本発明による突然変異タンパク質が認識するおよび／または結合することとなる完全長リガンドの性能を保持する。
したがって、本発明の他の態様は、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の配列位置２４〜３６、５３〜６６、７９〜８４、および１０３〜１１０のうちの任意の２つ以上の少なくとも１つの突然変異したアミノ酸残基を含み、ＩＬ−４受容体アルファ、ＶＥＧＦ−Ｒ２、またはＶＥＧＦに結合する、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質を対象とする。
ＩＬ−４受容体アルファに結合するヒト涙リポカリン突然変異タンパク質はＩＬ−４アンタゴニストおよび／またはＩＬ−１３アンタゴニストとして作用してもよい。一実施形態では、ヒト涙リポカリン突然変異タンパク質はヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−１３のアンタゴニストとして作用する。他の実施形態では、突然変異タンパク質は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３等のカニクイザルリガンドと交差反応し、それ自体としてカニクイザルＩＬ−４受容体アルファのアンタゴニストとして作用する。
ＩＬ−４受容体アルファに結合する本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質は、成熟ヒト涙リポカリンのアミノ酸配列に関して、天然の成熟ヒト涙リポカリンの位置２６〜３４、５６〜５８、８０、８３、１０４〜１０６、および１０８のうちのいずれかでのシステイン残基による天然のアミノ酸残基の少なくとも２つのアミノ酸置換を含んでいてもよい。一般に、そのような突然変異タンパク質は、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、もしくは１ｎＭのＫＤでまたはさらに低く、ピコモルの範囲のＫＤで、ＩＬ−４受容体アルファの細胞外領域またはドメインに結合する。したがって、本発明はまた、９００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、２５０ｐＭ、１００ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、または４０ｐＭ以下のＫＤでＩＬ−４受容体に結合する涙リポカリン突然変異タンパク質を包含する。突然変異タンパク質リガンド複合体のＫＤ値を決定するための適切な方法は当業者らに知られており、蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡ、等温の滴定熱量測定（ＩＴＣ）等の熱量測定法、および表面プラズモン共鳴を含む。そのような方法の例は下記に詳述される（例えば、実施例６、８、１４、１６、２２、２４、および２７を参照されたい）。
これに関連して、それぞれの突然変異タンパク質とそのリガンドとの複合体形成は、それぞれの結合パートナーの濃度、競合物の存在、ｐＨ、および使用されるバッファー系のイオン強度等の多くの異なる因子ならびに解離定数ＫＤの決定のために使用される実験方法（ほんの少数を挙げると、例えば蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡ、もしくは表面プラズモン共鳴）または実験データの評価のために使用される数学的なアルゴリズムさえによっても影響を及ぼされることも注目されたい。
したがって、本明細書に示されるＫＤ値（それぞれの突然変異タンパク質およびそのリガンドの間で形成された複合体の解離定数）は、所与のリガンドに対する特定のリポカリン突然変異タンパク質の親和性を決定するのに使用される方法および実験装備に依存して、ある実験の範囲内で変動してもよいことは当業者に明らかである。これは、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）または競合ＥＬＩＳＡによってＫＤ値が決定されたかどうかに依存して、測定されたＫＤ値にわずかな偏差または許容範囲があってもよいことを意味する。
本発明の特定の実施形態では、そのような突然変異タンパク質は、成熟ヒト涙リポカリンのアミノ酸配列に関して、Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ、Ｐｒｏ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ、Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；およびＬｙｓ１０８→Ｇｌｎから成る群から選択される少なくとも６、８、１０、１２、１４、または１６個のアミノ酸置換を含む。
さらに、そのような突然変異タンパク質は、Ｍｅｔ３９→Ｖａｌ；Ｔｈｒ４２→Ｍｅｔ、Ａｌａ；Ｔｈｒ４３→Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ａｌａ；Ｇｌｕ４５→Ｌｙｓ、Ｇｌｙ；Ａｓｎ４８→Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｖａｌ５３→Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ、Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５５→Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ；Ｇｌｕ６３→Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ；Ｖａｌ６４→Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ；Ａｌａ６６→Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ；Ｇｌｕ６９→Ｌｙｓ、Ｇｌｙ；Ｌｙｓ７０→Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ；Ｔｈｒ７８→Ａｌａ；Ｉｌｅ８９→Ｖａｌ；Ａｓｐ９５→Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ；およびＴｙｒ１００→Ｈｉｓから成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含んでいてもよい。
一実施形態では、ＩＬ−４受容体アルファに結合するヒト涙リポカリン突然変異タンパク質は、アミノ酸置換：Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；およびＬｙｓ１０８→Ｇｌｎを含む。
他の実施形態では、ＩＬ−４受容体アルファに結合するヒト涙リポカリン突然変異タンパク質は、アミノ酸置換の次のセット：
（１）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ；
（２）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｌｙｓ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ａｓｎ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ；
（３）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ；
（４）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ；
（５）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ａｌａ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ；
（６）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ；および
（７）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎのうちの１つを含む。
ＩＬ−４受容体アルファに結合するヒト涙リポカリン突然変異タンパク質は、配列番号２〜８またはその断片もしくは変異体に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含んでいてもよい、本質的にそれから成る、またはそれから成る。一実施形態では、本発明による突然変異タンパク質は、配列番号５もしくは６またはその断片もしくは変異体に記載されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。
本発明の突然変異タンパク質に関連して本発明で使用される用語「断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、Ｎ末端および／またはＣ末端が短縮された、つまり、Ｎ末端および／またはＣ末端のアミノ酸のうちの少なくとも１つを欠く、完全長成熟ヒト涙リポカリンに由来するタンパク質またはペプチドに関する。そのような断片は、成熟ヒト涙リポカリンの一次配列の好ましくは少なくとも１０、より好ましくは２０、最も好ましくは３０個以上の連続したアミノ酸を含み、成熟ヒト涙リポカリンのイムノアッセイで普通検出可能である。
本発明で使用される用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、例えば、置換、欠失、挿入、または化学的修飾によるアミノ酸配列の改変を含むタンパク質またはペプチドの誘導体に関する。好ましくは、そのような改変は、タンパク質またはペプチドの機能性を低下させない。そのような変異体はタンパク質を含み、１つまたは複数のアミノ酸は、それらのそれぞれのＤ−立体異性体とまたは例えばオルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリシン、ノルバリン等の、自然発生の２０種のアミノ酸以外のアミノ酸と交換される。しかしながら、そのような置換はまた保存的であってもよい、つまり、アミノ酸残基は化学的に類似するアミノ酸残基と交換される。保存的置換の例は次のグループのメンバーの中での交換とする：１）アラニン、セリン、およびトレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリシン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；ならびに６）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。
別の態様では、本発明は、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）またはその細胞外領域もしくはドメインに結合するヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質を対象とする。普通、そのような突然変異タンパク質はＶＥＧＦアンタゴニストとして作用し、ＶＥＧＦ−Ｒ２の細胞外領域またはドメインに、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、またはさらに１ｎＭ以下のＫＤで結合する。
そのような突然変異タンパク質は、成熟ヒト涙リポカリンのアミノ酸配列に関して、Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３０→Ｓｅｒ；Ｍｅｔ３１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ３２→Ａｒｇ；Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３４→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ５６→Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ；Ｉｌｅ５７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ、Ｐｒｏ；Ｌｙｓ８３→Ｇｌｕ、Ｇｌｙ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ａｌａ；Ｈｉｓ１０６→Ｖａｌ；およびＬｙｓ１０８→Ｔｈｒから成る群から選択される少なくとも６、８、１０、１２、１４、または１６個のアミノ酸置換を含んでいてもよく、Ｌｅｕ４１→Ｐｈｅ；Ｇｌｕ６３→Ｌｙｓ；Ｖａｌ６４→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ７６→Ａｒｇ、Ｇｌｕ；Ｉｌｅ８８→Ｖａｌ、Ｔｈｒ；Ｉｌｅ８９→Ｔｈｒ；Ａｒｇ９０→Ｌｙｓ；Ａｓｐ９５→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ９９→Ｌｅｕ；およびＧｌｙ１０７→Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕから成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含んでいてもよい。
ひとつの特有の実施形態では、そのような突然変異タンパク質はアミノ酸置換：Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３０→Ｓｅｒ；Ｍｅｔ３１→Ｇｌｙ，Ａｓｎ３２→Ａｒｇ；Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３４→Ｔｙｒ；Ｉｌｅ５７→Ｐｈｅ，Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ；Ｌｙｓ８３→Ｇｌｕ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ａｌａ；Ｈｉｓ１０６→Ｖａｌ；ａｎｄ Ｌｙｓ１０８→Ｔｈｒを含む。
ＶＥＧＦ−Ｒ２の細胞外領域またはドメインに検出可能な親和性で結合する本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質は、アミノ酸置換の次のセット：
（１）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ，Ｇｌｕ２７→Ｉｌｅ，Ｇｌｕ３０→Ｓｅｒ，Ｍｅｔ３１→Ｇｌｙ，Ａｓｎ３２→Ａｒｇ，Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ，Ｇｌｕ３４→Ｔｙｒ，Ｌｅｕ５６→Ｌｙｓ，Ｉｌｅ５７→Ｐｈｅ，Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ，Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ，Ｌｙｓ８３→Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ，Ｌｅｕ１０５→Ａｌａ，Ｈｉｓ１０６→Ｖａｌ，Ｌｙｓ１０８→Ｔｈｒ；
（２）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ，Ｇｌｕ２７→Ｉｌｅ，Ｇｌｕ３０→Ｓｅｒ，Ｍｅｔ３１→Ｇｌｙ，Ａｓｎ３２→Ａｒｇ，Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ，Ｇｌｕ３４→Ｔｙｒ，Ｌｅｕ５６→Ｇｌｕ，Ｉｌｅ５７→Ｐｈｅ，Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ，Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ，Ｌｙｓ８３→Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ，Ｌｅｕ１０５→Ａｌａ，Ｈｉｓ１０６→Ｖａｌ，Ｌｙｓ１０８→Ｔｈｒ；
（３）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ，Ｇｌｕ２７→Ｉｌｅ，Ｇｌｕ３０→Ｓｅｒ，Ｍｅｔ３１→Ｇｌｙ，Ａｓｎ３２→Ａｒｇ，Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ，Ｇｌｕ３４→Ｔｙｒ，Ｌｅｕ５６→Ａｌａ，Ｉｌｅ５７→Ｐｈｅ，Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ，Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ，Ｌｙｓ８３→Ｇｌｕ，Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ，Ｌｅｕ１０５→Ａｌａ，Ｈｉｓ１０６→Ｖａｌ，Ｌｙｓ１０８→Ｔｈｒ；および
（４）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３０→Ｓｅｒ；Ｍｅｔ３１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ３２→Ａｒｇ；Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３４→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ５７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ８３→Ｇｌｕ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ａｌａ；Ｈｉｓ１０６→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１０８→Ｔｈｒのうちの１つを含んでいてもよい。
本発明の一実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｒ２に結合する突然変異タンパク質は、配列番号３４〜３９に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。
さらに別の態様では、本発明は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合するヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質を対象とする。普通、そのような突然変異タンパク質は、ＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦの結合を阻害することによってＶＥＧＦアンタゴニストとして作用し、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、２０ｎＭ、５ｎＭ以下、またはさらに１ｎＭ以下のＫＤでＶＥＧＦに結合する。
本発明の方法によって入手可能なそのような突然変異タンパク質は、成熟ヒト涙リポカリンのアミノ酸配列に関して、Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ、Ｖａｌ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ；およびＬｙｓ１０８→Ａｌａ、Ｖａｌから成る群から選択される少なくとも６、８、１０、１２、１４、１６個のアミノ酸置換を含んでいてもよく、Ｖａｌ３６→Ｍｅｔ；Ｔｈｒ３７→Ａｌａ；Ｍｅｔ３９→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ４０→Ａｌａ、Ｓｅｒ；Ａｓｎ４８→Ａｓｐ；Ａｌａ５１→Ｖａｌ；Ｌｙｓ５２→Ａｒｇ；Ｔｈｒ５４→Ｖａｌ；Ｍｅｔ５５→Ｖａｌ；Ｓｅｒ６１→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ６５→Ａｒｇ；Ａｌａ６６→Ｖａｌ；Ｖａｌ６７→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ６９→Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ７６→Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ；Ｔｙｒ８７→Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ；Ｉｌｅ８９→Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ；Ａｒｇ９０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ９８→Ｖａｌ；およびＧｌｙ１０７→Ｇｌｕから成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含んでいてもよい。
一実施形態では、ＶＥＧＦに結合する、ヒト涙リポカリンのそのような突然変異タンパク質は、アミノ酸置換：Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ，Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ，Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；ａｎｄ Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌを含む。
他の特有の実施形態では、ＶＥＧＦに結合するヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質は、アミノ酸置換の次のセット：
（１）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
（２）Ａｒｇ２６→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｇｌｕ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
（３）Ａｒｇ２６→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
（４）Ａｒｇ２６→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
（５）Ａｒｇ２６→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
（６）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
（７）Ａｒｇ２６→Ｖａｌ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
（８）Ａｒｇ２６→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；および
（９）Ａｒｇ２６→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌのうちの１つを含んでいてもよい。
本発明の一実施形態では、ＶＥＧＦに結合する突然変異タンパク質は、配列番号２６〜３３または配列番号４４〜４７に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。
それらの潜在的な免疫原性に関して変更された上記の突然変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
細胞障害性Ｔ細胞は、主要組織適合複合体クラスＩ（ＭＨＣ）分子と連携して抗原提示細胞の細胞表面上でペプチド抗原を認識する。ペプチドがＭＨＣ分子に結合する能力は対立遺伝子特異的であり、それらの免疫原性と相互に関連する。所与のタンパク質の免疫原性を低下させるために、タンパク質中のどのペプチドが所与のＭＨＣ分子に結合する可能性を有するかを予測するための能力は非常に価値がある。潜在的なＴ細胞エピトープを同定するためにコンピュータによるスレッディングアプローチを利用するアプローチは、ＭＨＣクラスＩ分子への所与のペプチド配列の結合を予測するために以前に記載された（Ａｌｔｕｖｉａら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２４４〜２５０）。
そのようなアプローチはまた、本発明の突然変異タンパク質中の潜在的なＴ細胞エピトープを同定するためにかつその意図した使用に依存して、その予測される免疫原性に基づいて特異的な突然変異タンパク質を選択するために利用されてもよい。Ｔ細胞エピトープを含有すると予測されたペプチド領域をさらなる突然変異誘発にさらして、これらのＴ細胞エピトープを減らすまたは排除し、したがって免疫原性を最小限にすることはさらに可能であり得る。遺伝子的に操作された抗体からの両親媒性エピトープの除去は記載されており（Ｍａｔｅｏら（２０００）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９（６）：４６３〜４７１）、本発明の突然変異タンパク質に適応させてもよい。
したがって得られた突然変異タンパク質は、以下に記載されるもの等の、治療適用および診断適用でのそれらの使用に望ましい最小限の免疫原性を有していてもよい。
いくつかの適用については、標識形態の本発明の突然変異タンパク質を利用することも有用である。したがって、本発明はまた、酵素標識、放射性標識、有色標識、蛍光性標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、およびコロイド金から成る群から選択される標識にコンジュゲートされるリポカリン突然変異タンパク質をも対象とする。突然変異タンパク質はまた有機分子にコンジュゲートされてもよい。本明細書で使用される用語「有機分子」は、少なくとも２つの炭素原子を含むが、回転可能な炭素結合は好ましくは７または１２個以下であり、１００および２０００ダルトンの間の、好ましくは１００および１０００ダルトンの間の範囲の分子量を有し、１または２つの金属原子を任意選択で含む有機分子を好ましくは示す。
一般に、化学的、物理的、光学的、または酵素的な反応中で検出可能な化合物またはシグナルを直接または間接的に生成する任意の適切な化学物質または酵素でリポカリン突然変異タンパク質を標識することは可能である。物理的な反応および同時に光学的な反応／マーカーの例は、照射に際しての蛍光発光の放出または放射性標識を使用する場合のＸ線の放出である。アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼは、発色反応産物の形成を触媒する酵素標識（および同時に光学的な標識）の例である。一般に、抗体（免疫グロブリンのＦｃ部分中の糖成分のみで使用されるものを除く）に通常使用されるすべての標識も本発明の突然変異タンパク質へのコンジュゲートに使用することができる。本発明の突然変異タンパク質はまた、例えば所与の細胞、組織、もしくは器官へのそのような作用物質の標的送達のためにまたは周囲の正常細胞に影響を与えることなく細胞を、例えば腫瘍細胞を選択的に標的にするために任意の適切な治療的活性剤とコンジュゲートしてもよい。そのような治療的活性剤の例は、放射性核種、毒素、小さな有機分子、および治療ペプチド（細胞表面受容体のアゴニスト／アンタゴニストとして作用するペプチドまたは所与の細胞標的上のタンパク質結合部位に対して競合するペプチド等）を含む。しかしながら、本発明のリポカリン突然変異タンパク質はまた、アンチセンス核酸分子、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはリボザイム等の治療的に活性のある核酸とコンジュゲートされてもよい。そのようなコンジュゲートは当技術分野でよく知られている方法によって産生することができる。
一実施形態では、本発明の突然変異タンパク質はまた、身体内の所望の領域またはエリアに発明の突然変異タンパク質を送達するために、特定の身体領域を標的とする標的成分につながれてもよい。そのような改変が望ましいものであり得る１つの例は血液脳関門の横断である。血液脳関門を横断するために、本発明の突然変異タンパク質は、この関門を横切る能動輸送を容易にする成分につながれてもよい（Ｇａｉｌｌａｒｄ ＰＪら、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ−ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｒａｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ．２００５ １２７７：１８５〜１９８またはＧａｉｌｌａｒｄ ＰＪら、Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００５ ２（２）：２９９〜３０９を参照されたい。そのような成分は、例えば、商標名２Ｂ−Ｔｒａｎｓ（商標）（ｔｏ−ＢＢＢ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＢＶ、Ｌｅｉｄｅｎ、ＮＬ）で入手可能である。
上記に示されるように、本発明の突然変異タンパク質は一部の実施形態では突然変異タンパク質の血清半減期を延長する成分にコンジュゲートされてもよい（この点に関して、そのようなコンジュゲート戦略が、ＣＴＬＡ−４に対する結合親和性を有するヒト好中球ゼラチナーゼ関連性リポカリンの突然変異タンパク質への言及と共に記載されるＰＣＴ公開公報ＷＯ２００６／５６４６４号も参照されたい）。血清半減期を延長する成分は、ほんの少数を挙げると、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸等の脂肪酸分子（Ｖａｊｏ ＆ Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ ２０００、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５２、１〜９）、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合ペプチドもしくはアルブミン結合タンパク質、トランスフェリンであってもよい。アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、抗体、ドメイン抗体を含む抗体断片（例えば、米国特許第６，６９６，２４５号を参照されたい）、またはアルブミンに対する結合活性を有するリポカリン突然変異タンパク質であってもよい。したがって、本発明のリポカリン突然変異タンパク質の半減期の延長に適したコンジュゲートパートナーは、アルブミン（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｂ．Ｌ．ら（２００２）Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０３、５４０〜５４８）またはアルブミン結合タンパク質、例えば、連鎖球菌プロテインＧのうちの１つ等の細菌アルブミン結合ドメイン（Ｋｏｎｉｇ，Ｔ．およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８）Ｕｓｅ ｏｆ ａｎ ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｎ ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１８、７３〜８３）を含む。コンジュゲートパートナーとして使用することができるアルブミン結合ペプチドの他の例は、米国特許出願第２００３／００６９３９５号またはＤｅｎｎｉｓら（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｍ．Ｓ．、Ｚｈａｎｇ，Ｍ．、Ｍｅｎｇ，Ｙ．Ｇ．、Ｋａｄｋｈｏｄａｙａｎ，Ｍ．、Ｋｉｒｃｈｈｏｆｅｒ，Ｄ．、Ｃｏｍｂｓ，Ｄ．＆ Ｄａｍｉｃｏ，Ｌ．Ａ．（２００２）．「Ａｌｂｕｍｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７７、３５０３５〜３５０４３）に記載されるように、例えば、Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓコンセンサス配列を有するものであり、Ｘａａ１はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐであり、Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり、Ｘａａ３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり、Ｘａａ４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
他の実施形態では、アルブミンそれ自体またはアルブミンの生物学的活性断片は、本発明のリポカリン突然変異タンパク質のコンジュゲートパートナーとして使用することができる。用語「アルブミン」は、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンまたはラットアルブミン等のすべての哺乳動物アルブミンを含む。アルブミンまたはその断片は、米国特許第５，７２８，５５３号または欧州特許出願第０３３０４５１号および第０３６１９９１号に記載されるように組換えで産生することができる。組換えヒトアルブミン（Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標））Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｄｅｌｔａ Ｌｔｄ．（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）は、突然変異タンパク質の半減期を延長するためにリポカリン突然変異タンパク質にコンジュゲートするまたは融合することができる。
アルブミン結合タンパク質が抗体断片である場合、それはドメイン抗体であってもよい。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、最適な安全性および効力製品プロファイルを作り出すために生物物理的特性およびｉｎ ｖｉｖｏ半減期に対して正確な制御を可能にするように操作される。ドメイン抗体は、例えば、Ｄｏｍａｎｔｉｓ Ｌｔｄ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫおよびＭＡ、ＵＳＡ）から市販で入手可能である。
本発明の突然変異タンパク質の血清半減期を延長するために成分としてトランスフェリンを使用して、突然変異タンパク質は、非グリコシル化トランスフェリンのＮ末端もしくはＣ末端または両方に遺伝子的に融合することができる。非グリコシル化トランスフェリンは、１４〜１７日の半減期を有し、トランスフェリン融合タンパク質は、同様に、延長された半減期を有するであろう。トランスフェリン担体はまた、高度な生物学的利用率、体内分布、および循環安定性をも提供する。この技術は、ＢｉｏＲｅｘｉｓ（ＢｉｏＲｅｘｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）から市販で入手可能である。タンパク質安定剤／半減期延長パートナーとして使用される組換えヒトトランスフェリン（ＤｅｌｔａＦｅｒｒｉｎ（商標））も、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｄｅｌｔａ Ｌｔｄ．（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）から市販で入手可能である。
免疫グロブリンのＦｃ部分が本発明の突然変異タンパク質の血清半減期を延ばすための目的に使用される場合、Ｓｙｎｔｏｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ（ＭＡ、ＵＳＡ）から市販で入手可能なＳｙｎＦｕｓｉｏｎ（商標）技術が使用されてもよい。このＦｃ融合技術の使用は、長時間作用性の生物製剤の生成を可能にし、例えば、薬物動態、溶解性、および産生効率を改善するために抗体のＦｃ領域に連結された突然変異タンパク質の２つのコピーから成ってもよい。
さらに、本発明の突然変異タンパク質の半減期を延ばすための他の代替案は、本発明の突然変異タンパク質のＮ末端またはＣ末端に、長く、構造化されていない、柔軟性のグリシンリッチ配列を融合することである（例えば、約２０〜８０個の連続したグリシン残基を有するポリグリシン）。ＷＯ２００７／０３８６１９号に開示されるこのアプローチは、例えば、「ｒＰＥＧ」（組換えＰＥＧ）とも名付けられている。
ポリアルキレングリコールがコンジュゲートパートナーとして使用される場合、ポリアルキレングリコールは置換されたもの、非置換のもの、線状のもの、分岐したものであってもよい。それはまた活性化ポリアルキレン誘導体とすることもできる。適切な化合物の例は、インターフェロンに関してＷＯ９９／６４０１６号に、米国特許第６，１７７，０７４号に、もしくは米国特許第６，４０３，５６４号に記載されるようにまたはＰＥＧ修飾アスパラギナーゼ、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（ＰＥＧ−ＡＤＡ）、もしくはＰＥＧ−スーパーオキシドジスムターゼ等の他のタンパク質について記載されるようにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である（例えば、Ｆｕｅｒｔｇｅｓら（１９９０）Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １１、１３９〜１４８を参照されたい）。そのようなポリマー、好ましくはポリエチレングリコールの分子量は約３００〜約７０，０００ダルトンの範囲であってもよく、例えば、約１０，０００、約２０，０００、約３０，０００、または約４０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールを含む。さらに、例えば、米国特許第６，５００，９３０号または第６，６２０，４１３号に記載されるように、デンプンまたはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）等の炭水化物オリゴマーおよびポリマーは血清半減期延長の目的で本発明の突然変異タンパク質にコンジュゲートすることができる。
上記の成分のうちの１つが本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質にコンジュゲートされる場合、アミノ酸側鎖へのコンジュゲートは有利になり得る。適切なアミノ酸側鎖は、ヒト涙リポカリンのアミノ酸配列中の自然に存在していてもよくまたは突然変異誘発によって導入されてもよい。適切な結合部位が突然変異誘発を介して導入される場合、１つの可能性としては、システイン残基による、適切な位置でのアミノ酸の交換がある。一実施形態では、そのような突然変異は、Ｔｈｒ４０→Ｃｙｓ、Ｇｌｕ７３→Ｃｙｓ、Ａｒｇ９０→Ｃｙｓ、Ａｓｐ９５→Ｃｙｓ、またはＧｌｕ１３１→Ｃｙｓ置換の少なくとも１つを含む。これらの位置のうちのいずれかで新しく作り出されたシステイン残基は、ＰＥＧまたはその活性化誘導体等の、突然変異タンパク質の血清半減期を延ばす成分に突然変異タンパク質をコンジュゲートするために下記のもので利用することができる。
他の実施形態では、本発明の突然変異タンパク質に上記の成分のうちの１つをコンジュゲートするのに適したアミノ酸側鎖を提供するために、人工アミノ酸が突然変異誘発によって導入されてもよい。一般に、そのような人工アミノ酸は、より反応性であり、したがって、所望の成分へのコンジュゲートを容易にするように設計される。人工ｔＲＮＡを介して導入されてもよいそのような人工アミノ酸の１つの例は、パラ−アセチル−フェニルアラニンである。
本明細書に開示される突然変異タンパク質のいくつかの適用については、有利には、それらを融合タンパク質の形態で使用することができる。一部の実施形態では、発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質は、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはシグナル配列および／もしくはアフィニティータグ等のペプチドにそのＮ末端またはそのＣ末端で融合される。
医薬品適用については、本発明の突然変異タンパク質は、突然変異タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期を延長する融合パートナーに融合されてもよい（なおまた、適切な融合パートナーが、ＣＴＬＡ−４に対する結合親和性を有するヒト好中球ゼラチナーゼ関連性リポカリンの突然変異タンパク質への言及と共に記載されるＰＣＴ公開公報ＷＯ２００６／５６４６４号を参照されたい）。上記に記載されるコンジュゲートと同様に、融合パートナーは、ほんの少数を挙げると、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合タンパク質であってもよい。さらに、アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質またはアルブミンに対する結合活性を有するリポカリン突然変異タンパク質であってもよい。したがって、本発明のリポカリン突然変異タンパク質の半減期の延長に適した融合パートナーは、アルブミン（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｂ．Ｌ．ら（２００２）前掲、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０３、５４０〜５４８）またはアルブミン結合タンパク質、例えば連鎖球菌プロテインＧのうちの１つ等の細菌アルブミン結合ドメイン（Ｋｏｎｉｇ，Ｔ．およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８）前掲、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１８、７３〜８３）を含む。Ｘａａ１はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐであり、Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり、Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり、Ｘａａ４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであるＣｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓコンセンサス配列を有するＤｅｎｎｉｓら、前掲（２００２）または米国特許出願第２００３／００６９３９５号に記載されるアルブミン結合ペプチドも融合パートナーとして使用することができる。本発明のリポカリン突然変異タンパク質の融合パートナーとしてアルブミン自体またはアルブミンの生物学的活性断片を使用することも可能である。用語「アルブミン」は、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンまたはラット血清アルブミン等のすべての哺乳動物アルブミンを含む。アルブミンまたはその断片の組換え産生は当技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第５，７２８，５５３号、欧州特許出願第０３３０４５１号、または第０３６１９９１号に記載される。
融合パートナーは、他の分子に対する酵素活性または結合親和性等の新しい特徴を発明のリポカリン突然変異タンパク質に付与してもよい。適切な融合タンパク質の例は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ、プロテインＧのアルブミン結合ドメイン、プロテインＡ、抗体断片、オリゴマー化ドメイン、同じまたは異なる結合特異性のリポカリン突然変異タンパク質（「Ｄｕｏｃａｌｉｎ」の形成をもたらす。Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ，Ｓ．およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．（２００１）、Ｄｕｏｃａｌｉｎｓ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｆｏｌｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８２、１３３５〜１３４２を参照されたい）、または毒素である。
特に、結果として生じる融合タンパク質の両方の「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」が所与の治療標的に共に作用するように、本発明のリポカリン突然変異タンパク質を別々の酵素活性部位と融合することは可能であり得る。リポカリン突然変異タンパク質の結合ドメインは疾患の原因となる標的に付き、酵素ドメインが標的の生物学的機能を消滅させるのを可能にする。
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）もしくはＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ等のアフィニティータグ（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｇ．Ｍ．ら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５、７５３〜７６６）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓ６タグ、もしくはＨＡタグまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等のタンパク質も組換えタンパク質の容易な検出および／または精製を可能にし、さらに、好ましい融合パートナーの例となる。最後に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等の発色特性または蛍光特性を有するタンパク質は、同様に、本発明のリポカリン突然変異タンパク質に適した融合パートナーである。
本明細書で使用される用語「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）」はまた、シグナル配列を含有する本発明によるリポカリン突然変異タンパク質を含む。ポリペプチドのＮ末端のシグナル配列は、特定の細胞コンパートメント、例えば大腸菌の周辺質または真核細胞の小胞体にこのポリペプチドをターゲティングする。多くのシグナル配列は当技術分野で知られている。大腸菌の周辺質中へのポリペプチドの分泌のための好ましいシグナル配列はＯｍｐＡシグナル配列である。
本発明はまた、本明細書に記載される突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ＤＮＡおよびＲＮＡ）に関する。遺伝子コードの縮重は、同じアミノ酸を指定する他のコドンによるあるコドンの置換を可能にするので、本発明は、本発明の突然変異タンパク質をコードする特定の核酸分子に限定されることはなく、機能的突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むすべての核酸分子を含む。
したがって、本発明はまた、天然の成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置２６〜３４、５６〜５８、８０、８３、１０４〜１０６、および１０８のうちのいずれかの少なくとも１つのコドンに突然変異を含む本発明による突然変異タンパク質をコードする核酸配列をも含み、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の配列位置６１および１５３でシステイン残基の少なくとも１つをコードするコドンは任意の他のアミノ酸残基をコードするように突然変異させられる。
本明細書に開示される本発明はまた、実験的な突然変異誘発の示される配列位置の外側にさらなる突然変異を含む涙リポカリン突然変異タンパク質をコードする核酸分子をも含む。そのような突然変異は許容されることが多く、それどころか、例えばそれらが突然変異タンパク質のフォールディング能率、血清安定性、熱安定性、またはリガンド結合親和性の改善に寄与する場合、有利であると証明され得る。
本出願に開示される核酸分子は、この核酸分子の発現を可能にするために、調節配列（複数可）に「作動可能に連結され（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」てもよい。
ＤＮＡ等の核酸分子は、核酸分子が転写調節および／または翻訳調節に関係する情報を含有する配列エレメントを含み、そのような配列が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結される」場合、「核酸分子を発現することができる」または「ヌクレオチド配列の発現を可能にすること」ができるといわれる。作動可能な連結は、調節配列エレメントおよび発現されることとなる配列が遺伝子発現を有効にする方法で結びつけられる連結である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は、種の中で変動するかもしれないが、一般に、これらの領域は、原核生物で、プロモーターそれ自体、つまり転写の開始を指示するＤＮＡエレメントおよびＲＮＡに転写された場合に、翻訳の開始をシグナル伝達するであろうＤＮＡエレメントの両方を含有するプロモーターを含む。そのようなプロモーター領域は、原核生物の−３５／−１０ボックスおよびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏエレメントまたは真核生物のＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列、および５’キャッピングエレメント等の、転写および翻訳の開始に関連する５’非コーディング配列を通常含む。これらの領域はまた、エンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントならびに宿主細胞の特定のコンパートメントに天然のポリペプチドをターゲティングするための翻訳されたシグナル配列およびリーダー配列を含むこともできる。
さらに、３’非コーディング配列は、転写終結、ポリアデニル化、またはその他同種のものに関連する調節エレメントを含有していてもよい。しかしながら、これらの終結配列が特定の宿主細胞で十分機能的ではない場合、それらはその細胞で機能的なシグナルと置換されてもよい。
したがって、本発明の核酸分子は、調節配列、好ましくはプロモーター配列を含むことができる。他の好ましい実施形態では、本発明の核酸分子はプロモーター配列および転写終結配列を含む。適切な原核生物のプロモーターは、例えば、ｔｅｔプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、またはＴ７プロモーターである。真核細胞の発現に有用であるプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーターまたはＣＭＶプロモーターである。
本発明の核酸分子はまた、ベクターまたはプラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド、もしくは人工染色体等の任意の他の種類のクローニング媒体の一部とすることもできる。
一実施形態では、核酸分子はファスミド中に含まれる。ファスミドベクターは、対象とするｃＤＮＡに融合された、Ｍ１３またはｆ１等のテンペレートファージの遺伝子間領域またはその機能的部分をコードするベクターを示す。そのようなファージミドベクターおよび適切なヘルパーファージ（例えば、Ｍ１３Ｋ０７、ＶＣＳ−Ｍ１３、またはＲ４０８）を用いた細菌宿主細胞の重複感染の後で、完全なファージ粒子が産生され、それによって、ファージ表面上に示されたその対応するポリペプチドへの、コードされた異種のｃＤＮＡの物理的なつながりを可能にする（例えば、Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ら（１９９６）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第１版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６、４０１〜４２４、またはＲｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．およびＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０、８７〜９３で考察される）。
そのようなクローニング媒体は、上記に記載される調節配列および本発明のリポカリン突然変異タンパク質をコードする核酸配列とは別に、発現に使用される宿主細胞と適合性の種に由来する複製配列および制御配列ならびに形質転換された細胞または形質移入された細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーを含むことができる。多くの適切なクローニングベクターは当技術分野で知られており、市販で入手可能である。
本発明のリポカリン突然変異タンパク質をコードするＤＮＡ分子および特にそのようなリポカリン突然変異タンパク質のコード配列を含有するクローニングベクターは、遺伝子を発現することができる宿主細胞中に形質転換することができる。形質転換は標準の技術を使用して行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）、前掲）。したがって、本発明はまた、本明細書に開示される核酸分子を含有する宿主細胞をも対象とする。
形質転換された宿主細胞は、本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養される。適切な宿主細胞は、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ、大腸菌）やバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、枯草菌）等の原核生物またはサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、出芽酵母）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の真核生物、ＳＦ９またはＨｉｇｈ５昆虫細胞、不死化哺乳動物細胞系（例えば、ＨｅＬａ細胞やＣＨＯ細胞）または初代哺乳動物細胞とすることができる。
本発明はまた、本発明の突然変異タンパク質の産生のための方法にも関し、突然変異タンパク質、突然変異タンパク質の断片、または突然変異タンパク質および他のポリペプチドの融合タンパク質は、遺伝子操作法によって突然変異タンパク質をコードする核酸から開始して産生される。方法はｉｎ ｖｉｖｏで実行することができ、突然変異タンパク質は、例えば、細菌または真核生物の宿主生物中で産生し、次いで、この宿主生物またはその培養物から単離することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の使用によって、タンパク質を産生することも可能である。
突然変異タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで産生する場合、本発明の突然変異タンパク質をコードする核酸は、組換えＤＮＡ技術によって適切な細菌または真核生物の宿主生物中に導入される（既に上記に概説される）。この目的のために、宿主細胞は、確立された標準の方法を使用して、本発明の突然変異タンパク質をコードする核酸分子を含むクローニングベクターを用いて最初に形質転換される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）、前掲）。次いで、宿主細胞は、異種のＤＮＡの発現を可能にし、したがって対応するポリペプチドの合成を可能にする条件下で培養される。続いて、ポリペプチドは細胞または培養培地のいずれかから回収される。
本発明のいくつかの涙リポカリン突然変異タンパク質では、Ｃｙｓ６１およびＣｙｓ１５３の間の自然発生のジスルフィド結合が除去される。したがって、そのような突然変異タンパク質（または分子内ジスルフィド結合を含まない任意の他の涙リポカリン突然変異タンパク質）は、例えば、グラム陰性菌の細胞質中の還元性レドックス環境を有する細胞コンパートメント中で産生することができる。本発明のリポカリン突然変異タンパク質が分子内ジスルフィド結合を含む場合、好ましくは、適切なシグナル配列を使用して、酸化レドックス環境を有する細胞コンパートメントに新生ポリペプチドをターゲティングすることができる。そのような酸化環境は、大腸菌等のグラム陰性菌の周辺質によって、グラム陽性菌の細胞外環境中に、または真核細胞の小胞体の内腔中に提供されてもよく、普通、構造的ジスルフィド結合の形成に有利である。しかしながら、宿主細胞、好ましくは大腸菌の細胞質ゾルで本発明の突然変異タンパク質を産生することも可能である。この場合、ポリペプチドは、可溶性でフォールドされた状態で直接得ること、または、封入体の形態で回収することができ、その後にｉｎ ｖｉｔｒｏでの復元が続く。さらなる選択肢は、酸化細胞内環境を有する特異的な宿主株の使用であり、これは、したがって、細胞質ゾル中でのジスルフィド結合の形成を可能にし得る（Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｍ、Ｓｅｉｆｅｒｔ Ｃ、Ｈｕｎｔｅ Ｃ．（２００２）「Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｎ ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５、１〜８）。
しかしながら、本発明の突然変異タンパク質は、遺伝子操作の使用のみによって必ずしも生成または産生されなくてもよい。むしろ、リポカリン突然変異タンパク質は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ポリペプチド合成等の化学合成によって、または、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳によっても得ることができる。例えば、見込みのある突然変異を分子モデリングを使用して同定し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、望まれる（設計された）ポリペプチドを合成し、所与の標的に対する結合活性を調査することは可能である。タンパク質の固相および／または液相合成のための方法は当技術分野でよく知られている（例えばＬｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．ら（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．およびＣｏｌｏｗｉｃｋ，Ｓ．Ｐ．（１９９７）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、またはＢｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ，Ｔ．ら（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５、２９〜４３で考察される）。
他の実施形態では、本発明の突然変異タンパク質は、当業者らに知られている十分に確立された方法を利用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳によって産生されてもよい。
本発明はまた、ヒト涙リポカリンの少なくとも１つの発明の突然変異タンパク質またはその融合タンパク質もしくはコンジュゲートおよび薬学的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物にも関する。
本発明によるリポカリン突然変異タンパク質は、タンパク質性の薬剤にとって治療的に有効な任意の腸管外または非腸管外（経腸）経路を介して投与することができる。腸管外適用法は、例えば、注射液、注入液、またはチンキ剤の形態での例えば、皮内、皮下、筋肉内、気管内、鼻腔内、硝子体内、または静脈内の注射および注入技術、ならびに、例えばエアロゾル混合物、スプレー、または散剤の形態でのエアロゾルの導入および吸入を含む。肺薬剤送達、つまり、エアロゾル（また鼻腔内投与で使用することもできる）の吸入または気管内導入のいずれかを介した肺薬剤送達に関する概要は、例えばＪ．Ｓ．Ｐａｔｔｏｎら、Ｔｈｅ ｌｕｎｇｓ ａｓ ａ ｐｏｒｔａｌ ｏｆ ｅｎｔｒｙ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃ．２００４ 第１巻３３８〜３４４ページ）によって示される。非腸管外送達モードは、例えば、経口的、例えば丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤、もしくは懸濁剤の形態、または、直腸的、例えば坐薬の形態とする。本発明の突然変異タンパク質は、所望されるとおりに、従来の無毒な薬学的に許容し得る賦形剤または担体、添加剤、および媒体を含有する製剤で全身にまたは局所的に投与することができる。
本発明の一実施形態では、医薬品は、哺乳動物に、特にヒトに腸管外に投与される。対応する投与方法は、例えば、注射液、注入液、またはチンキ剤の形態での例えば皮内、皮下、筋肉内、気管内、または静脈内の注射および注入技術、ならびに、例えばエアロゾル混合物、スプレー、または散剤の形態のエアロゾルの導入および吸入を含むが、これらに限定されない。静脈内および皮下の注入および／または注射の組合せであれば、比較的短い血清半減期を有する化合物の場合に最も好都合である。医薬組成物は、水溶液、水中油型乳剤、または油中水型乳剤であってもよい。
この点に関して、Ｍｅｉｄａｎ ＶＭおよびＭｉｃｈｎｉａｋ ＢＢ ２００４ Ａｍ．Ｊ．Ｔｈｅｒ．１１（４）：３１２〜３１６に記載される、経皮送達技術、例えばイオン導入、超音波導入、またはマイクロニードルによって増強された送達は、また、本明細書に記載される突然変異タンパク質の経皮送達にも使用することができることに注目されたい。非腸管外送達モードは、例えば、経口的、例えば丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤、もしくは懸濁剤の形態、または、直腸投与、例えば坐薬の形態とする。本発明の突然変異タンパク質は、種々様々な従来の無毒な薬学的に許容し得る賦形剤または担体、添加剤、および媒体を含有する製剤で全身にまたは局所的に投与することができる。
適用される突然変異タンパク質の投薬量は、所望の予防効果または治療効果を達成するために広い範囲内で変動してもよい。それは、例えば、選ばれたリガンドに対する化合物の親和性ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの突然変異タンパク質とリガンドとの複合体の半減期に依存するであろう。さらに、最適な投薬量は、突然変異タンパク質またはその融合タンパク質もしくはそのコンジュゲートの体内分布、投与のモード、治療されている疾患／障害の重症度、および患者の医学的状態に依存するであろう。例えば、局所的な適用のために軟膏で使用される場合、高濃度の涙リポカリン突然変異タンパク質を使用することができる。しかしながら、望まれる場合、突然変異タンパク質はまた、徐放性製剤、例えばリポソーム分散液またはＰｏｌｙＡｃｔｉｖｅ（商標）またはＯｃｔｏＤＥＸ（商標）のようなヒドロゲルベースのポリマーミクロスフェアで与えられてもよい（Ｂｏｓら、Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｂｒｉｅｆｉｎｇ：Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ ２００３：１〜６を参照されたい）。入手可能な他の徐放性製剤は、例えばＰＬＧＡベースのポリマー（ＰＲ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＰＬＡ−ＰＥＧベースのヒドロゲル（Ｍｅｄｉｎｃｅｌｌ）、およびＰＥＡベースのポリマー（Ｍｅｄｉｖａｓ）である。
したがって、本発明の突然変異タンパク質は、薬学的に許容し得る成分および調製の確立された方法を使用して組成物に製剤することができる（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｌ．およびＧｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）。医薬組成物を調製するために、薬学的に不活性の無機または有機賦形剤を使用することができる。例えば丸剤、散剤、ゼラチンカプセル、または坐薬を調製するために、例えばラクトース、タルク、ステアリン酸およびその塩、脂肪、ろう、固体または液体ポリオール、天然油および硬化油を使用することができる。使用の前の、液剤またはエアロゾル混合物への再構成のための液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル混合物、または散剤の産生に適した賦形剤は、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、およびその適切な混合物ならびに植物油を含む。
医薬組成物はまた、例えば、増量剤、結合剤、湿潤剤、滑剤、安定剤、防腐剤、乳化剤、およびさらに溶剤もしくは可溶化剤または貯蔵効果を達成するための作用物質等の添加剤を含有していてもよい。最後のものは、リポソームおよびマイクロカプセル等の遅放性もしくは徐放性送達系または標的送達系に融合タンパク質が組み込まれてもよいということである。
製剤は、細菌保持フィルターを通しての濾過を含む多数によってまたは使用の直前に滅菌水もしくは他の滅菌培地中で溶解させるもしくは分散させることができる滅菌固形組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌することができる。
本発明の他の態様は、疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に上記に定義される突然変異タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
そのような治療を必要とする対象は、ほんの少数の例証となる例を挙げると、ヒト、イヌ、マウス、ラット、ブタ、サイモロガス（ｃｙｍｏｌｏｇｏｕｓ）等の類人猿等の哺乳動物であってもよい。
本発明の方法に従って治療されることとなる疾患および障害の正確な性質は、利用される突然変異タンパク質が結合しようとするリガンドに依存する。したがって、本発明の突然変異タンパク質は、疾患または障害の発達に関連することで知られている標的分子が、本発明の核酸ライブラリーの発現産物に対して提示され得るまたはそうでなければ、涙リポカリンの得られた突然変異タンパク質に対して提示され得る限り、任意の疾患を治療するために使用することができる。
高度な親和性を有するＩＬ−４受容体アルファに結合する上記の突然変異タンパク質またはそれらを含有する医薬組成物は、Ｔｈ２免疫応答の増加に関連する疾患または障害を治療する方法に利用されてもよい。そのような疾患または障害は、例えばアレルギー反応またはアレルギー性炎症であってもよい。アレルギー性炎症は、その結果として、アレルギー性喘息、鼻炎、結膜炎、または皮膚炎に関連していてもよい（Ｈａｇｅら、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｍｏｓａｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ、Ｃｅｌｌ、第９７巻、２７１〜２８１、１９９９年４月１６日またはＭｕｅｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ＩＬ−４／ＩＬ−１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（２００２）、２３７〜２５０を参照されたい）。
これに関連して、種々様々な腫瘍細胞が、正常細胞よりも多数の高度な親和性のＩＬ−４受容体を発現することに注目されたい。そのような細胞は、例えば黒色腫等の固形ヒト腫瘍、乳癌、卵巣癌、中皮腫、膠芽腫、星状細胞腫、腎細胞癌、頭頸部癌腫、ＡＩＤＳ関連性カポジ肉腫＝ＡＩＤＳ ＫＳ、ホルモン依存性および非依存性前立腺癌細胞、ならびに、前立腺腫瘍からの初代培養物を含む（Ｇａｒｌａｎｄ Ｌ、Ｇｉｔｌｉｔｚ Ｂら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．２８：３７６〜３８１、第４号、２００５年７月〜８月、Ｒａｎｄ ＲＷ、Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６：２１５７〜２１６５、２０００年６月、Ｈｕｓａｉｎ ＳＲ、Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．５：８１７〜８２２、１９９９年７月、Ｐｕｒｉ ＲＫ、Ｈｏｏｎ ＤＳら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５６：５６３１〜５６３７、１９９６年１２月１５日、１０．Ｄｅｂｉｎｓｋｉ Ｗ、Ｐｕｒｉ ＲらもしくはＨｕｓａｉｎ ＳＲ、Ｂｅｈａｒｉ Ｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５８：３６４９〜３６５３、１９９８年８月１５日、Ｋａｗａｋａｍｉ Ｋ、Ｌｅｌａｎｄ Ｐら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６０：２９８１〜２９８７、２０００年６月１日、またはＳｔｒｏｍｅ ＳＥ、Ｋａｗａｋａｍｉ Ｋら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．８：２８１〜２８６、２００２年１月を例として参照されたい。ＩＬ−４受容体の過剰発現の文書を伴う細胞の特定の例は、限定されるものではないが、バーキットリンパ腫細胞系Ｊｉｊｏｙｅ（Ｂ細胞リンパ腫）、前立腺癌（ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５）、頭頸部癌腫（ＳＣＣ、ＫＣＣＴ８７３）、膵癌（ＰＡＮＣ−１細胞系）、ＳＣＣ−２５：１３，０００（±５００）ｈ頭頸部癌細胞系（ＡＴＣＣ）を含む。ＩＬ４Ｒアルファ鎖はＩＬ４内部移行に主要な役割を果たす。したがって、毒素に融合されたまたはコンジュゲートされた場合、ＩＬ−４受容体アルファ鎖に結合する涙リポカリン突然変異タンパク質はまた、腫瘍（癌）の治療のために使用することもできる。適切な毒素の例は、シュードモナス外毒素、百日咳毒素、ジフテリア毒素、リシン、サポリン、シュードモナス外毒素、カリチアマイシンまたはその誘導体、タキソイド、マイタンシノイド、チュブリジン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、およびドラスタチン類似体を含む。ドラスタチン類似体の例は、オーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＥ、オーリスタチンＰＹＥ、およびオーリスタチンＰＨＥを含むが、これらに限定されない。
癌の治療については、ＩＬ−４受容体アルファ鎖に結合する突然変異タンパク質を細胞分裂阻害剤にコンジュゲートさせることも可能である。そのような細胞分裂阻害剤の例は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、タキソテール（ドセタキセル）、パクリタキセル、アントラサイクリン（ドキソルビシン）、メトトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ダカルバジン、シクロホスファミド、エトポシド、アドリアマイシン、カンプトテシン、コンブレタスタチンＡ−４関連化合物、スルホンアミド、オキサジアゾリン、ベンゾ［ｂ］チオフェン合成スピロケタールピラン、モノテトラヒドロフラン化合物、キュラシンおよびキュラシン誘導体、メトキシエストラジオール誘導体、ならびにロイコボリンを含む。
この関連で、毒素または細胞分裂阻害剤と本発明の涙リポカリン突然変異タンパク質との融合物またはコンジュゲートは、ＩＬ−４受容体アルファ鎖に対する親和性を有する突然変異タンパク質にもちろん限定されないことも示される。むしろ、当業者にとって直ちに明白となろうが、癌細胞の表面上に発現された受容体に結合する任意の涙リポカリン突然変異タンパク質は、癌の治療のために融合タンパク質またはコンジュゲートの形態で使用することができる。
高度な親和性でＶＥＧＦ−Ｒ２やＶＥＧＦに結合するヒト涙リポカリン突然変異タンパク質またはそれらを含有する医薬組成物は、癌、新生血管滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症もしくは糖尿病性黄斑浮腫、未熟児網膜症、または網膜静脈閉塞等の血管新生の増加に結びつけられる疾患または障害の治療のための方法に使用されてもよい。そのような癌は、ほんの少数の例証となる例を挙げると、胃腸管、直腸、結腸、前立腺、卵巣、膵臓、乳房、膀胱、腎臓、子宮内膜、および肺の癌腫、白血病、ならびに黒色腫から成る群から選択されてもよい。
上記の開示から明白なように、本発明の突然変異タンパク質またはその融合タンパク質もしくはコンジュゲートは、多くの用途で利用することができる。一般に、そのような突然変異タンパク質は、Ｆｃ部分のグリコシル化に特に頼る用途を除いて、抗体が使用されるすべての用途で使用することができる。
したがって、本発明の他の態様では、ヒト涙リポカリンの発明された突然変異タンパク質は、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドの検出のために使用される。そのような使用は、突然変異タンパク質を、所与のリガンドを含有していると思われる試料と適切な条件下で接触させることにより、突然変異タンパク質と所与のリガンドとの複合体の形成を可能にするステップ、および複合突然変異タンパク質を適切なシグナルによって検出するステップを含む。
検出可能なシグナルは、上記に説明されるように標識によってまたは結合、つまり複合体形成自体による物理的特性の変化によってもたらすことができる。１つの例は表面プラズモン共鳴であり、その値は、一方が金箔等の表面上に固定化される結合パートナーの結合の間に変化する。
本明細書に開示されるヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質はまた、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドの分離のために使用されてもよい。そのような使用は、突然変異タンパク質を、上述のリガンドを含有すると推測される試料と適切な条件下で接触させることにより、突然変異タンパク質と所与のリガンドとの複合体の形成を可能にするステップ、および突然変異タンパク質／リガンド複合体を試料から分離するステップを含んでいてもよい。
所与の非天然リガンドの検出および所与のリガンドの分離のための突然変異タンパク質の使用の両方で、突然変異タンパク質および／または標的は適切な固相上に固定化されてもよい。
本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質はまた、化合物を事前に選択された部位にターゲティングするために使用されてもよい。そのような目的のために、突然変異タンパク質は、対象とする化合物と接触させて、複合体形成を可能にする。次いで、突然変異タンパク質および対象とする化合物を含む複合体を、事前に選択された部位に送達する。この使用は、薬剤で治療されると推測される感染した身体部分、組織、または器官等の生物中の事前に選択された部位に（選択的に）薬剤を送達するのに特に適しているが、これに制限されない。突然変異タンパク質と対象とする化合物との複合体の形成の他に、突然変異タンパク質はまた、所与の化合物と反応させて、突然変異タンパク質および化合物のコンジュゲートを得ることができる。上記の複合体と同様に、そのようなコンジュゲートは、事前に選択された標的部位に化合物を送達するのに適し得る。突然変異タンパク質および化合物のそのようなコンジュゲートはまた、突然変異タンパク質および化合物を互いに共有結合させるリンカーを含んでいてもよい。任意選択で、そのようなリンカーは血流中で安定しているが、細胞環境中で開裂可能である。
したがって、本明細書に開示される突然変異タンパク質およびその誘導体は、抗体またはその断片と同様に、多くの分野で使用することができる。支持体に結合して、所与の突然変異タンパク質の標的またはこの標的のコンジュゲートもしくは融合タンパク質が固定化されるまたは分離されるのを可能にするためのそれらの使用に加えて、突然変異タンパク質は、酵素、抗体、放射性物質、または生物化学的活性もしくは定義された結合の特徴を有する任意の他の基を用いて標識するために使用することができる。そうすることによって、それらのそれぞれの標的またはそのコンジュゲートもしくは融合タンパク質を検出することができるまたはそれらに接触させることができる。例えば、本発明の突然変異タンパク質は、確立された分析法（例えば、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロット）または顕微鏡検査もしくは免疫センサーによって化学構造を検出するのに貢献することができる。ここで、検出シグナルは、適切な突然変異タンパク質コンジュゲートもしくは融合タンパク質の使用によって直接または抗体を介して結合した突然変異タンパク質の免疫化学的検出によって間接的に生成することができる。
発明の突然変異タンパク質についての多数の可能性のある用途はまた医学にも存在する。診断および薬剤送達（ドラッグデリバリー）でのそれらの使用に加えて、例えば、組織または腫瘍特異的細胞表面分子に結合する本発明の突然変異体ポリペプチドを生成することができる。そのような突然変異タンパク質は、例えば、コンジュゲート形態でまたは「腫瘍イメージング」のための融合タンパク質としてまたは癌療法のために直接使用してもよい。
したがって、本発明はまた、所与の非天然リガンドとの複合体形成のための本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質の使用をも含む。
本明細書に記載される突然変異タンパク質の他の関係する好ましい使用は、標的検証、つまり、疾患または障害の発達または進行に関連すると仮定されたポリペプチドが実際に何らかの形でその疾患または障害の原因となるかどうかの分析である。薬理学的薬剤標的としてタンパク質を検証するためのこの使用は、その天然のコンホメーションのタンパク質の表面エリアを特異的に認識する、つまり天然のエピトープに結合する本発明の突然変異タンパク質の能力を利用する。この点で、この能力は、限られた数の組換え抗体についてのみ報告されたことに注目されたい。しかしながら、薬剤標的の検証のための発明の突然変異タンパク質の使用は、標的としてのタンパク質の検出に限定されず、タンパク質ドメイン、ペプチド、核酸分子、有機分子、または金属錯体の検出も含む。
本発明は、次の非限定的な実施例および添付の図面によってさらに示される。
発現ベクターｐＴＬＰＣ１０（配列番号１）の地図（ｍａｐ）を示す図である。 Ｓ１４８．３ Ｊ１４、ＩＬ−４受容体アルファに対する結合親和性を有するヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質のポリペプチド配列を示す図である。 ＥＬＩＳＡを介しての親和性スクリーニングの方法およびＩＬ−４受容体アルファに対する親和性を有する突然変異タンパク質について得られた結果を示す図である。 ＩＬ−４受容体アルファに対する最も高度な親和性を有する突然変異タンパク質のポリペプチド配列を示す図である（配列番号３〜８）。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１４８．３ Ｊ１４；配列番号２）がＩＬ−４受容体アルファに結合するＢＩＡｃｏｒｅ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１９１．５ Ｋ１２；配列番号３）がＩＬ−４受容体アルファに結合するＢＩＡｃｏｒｅ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１４８．３ Ｊ１４ＡＭ２Ｃ２；配列番号４）がＩＬ−４受容体アルファに結合するＢＩＡｃｏｒｅ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１９１．４ Ｂ２４；配列番号５）がＩＬ−４受容体アルファに結合するＢＩＡｃｏｒｅ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１９１．４ Ｋ１９；配列番号６）がＩＬ−４受容体アルファに結合するＢＩＡｃｏｒｅ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１９１．５ Ｈ１６；配列番号７）がＩＬ−４受容体アルファに結合するＢＩＡｃｏｒｅ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１９７．８ Ｄ２２；配列番号８）がＩＬ−４受容体アルファに結合するＢＩＡｃｏｒｅ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１４８．３ Ｊ１４；配列番号２）がＩＬ−４受容体アルファに結合する競合ＥＬＩＳＡ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１９１．５ Ｋ１２；配列番号３）がＩＬ−４受容体アルファに結合する競合ＥＬＩＳＡ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１４８．３ Ｊ１４ＡＭ２Ｃ２；配列番号４）がＩＬ−４受容体アルファに結合する競合ＥＬＩＳＡ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１９１．４ Ｂ２４；配列番号５）がＩＬ−４受容体アルファに結合する競合ＥＬＩＳＡ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１９１．４ Ｋ１９；配列番号６）がＩＬ−４受容体アルファに結合する競合ＥＬＩＳＡ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１９１．５ Ｈ１６；配列番号７）がＩＬ−４受容体アルファに結合する競合ＥＬＩＳＡ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１９７．８ Ｄ２２；配列番号８）がＩＬ−４受容体アルファに結合する競合ＥＬＩＳＡ測定値を示す図である。 ＩＬ−４またはＩＬ−１３および本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１９１．５ Ｋ１２、Ｓ１４８．３ Ｊ１４ＡＭ２Ｃ２、Ｓ１９１．４ Ｂ２４、Ｓ１９１．４ Ｋ１９、Ｓ１９１．５ Ｈ１６、およびＳ１９７．８ Ｄ２２［配列番号３〜８］）の存在下でのＴＦ−１細胞増殖アッセイを示す図である。 発現ベクターｐＴＬＰＣ２７（配列番号９）の地図を示す図である。 ヒトＶＥＧＦ１６５および本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ２０９．２ Ｃ２３、Ｓ２０９．２ Ｄ１６、Ｓ２０９．２ Ｎ９、Ｓ２０９．６ Ｈ７、Ｓ２０９．６ Ｈ１０、Ｓ２０９．２ Ｍ１７、Ｓ２０９．２ Ｏ１０［配列番号２７〜３３］）、野生型涙リポカリン（ｐＴＬＰＣ１０の遺伝子産物；コントロール）、またはＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ；コントロール）の存在下での、ヒト臍静脈（ＨＵＶＥＣ）から培養した内皮細胞を用いた増殖アッセイを示す図である。 本発明のＰＥＧ化ヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１４８．３ Ｊ１４；配列番号２）がＩＬ−４受容体アルファに結合するＢＩＡｃｏｒｅ測定値を示す図である。 本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ２３６．１−Ａ２２、配列番号４４）が固定化されたＶＥＧＦ８〜１０９に結合するＢＩＡｃｏｒｅ測定値を示す図である。 ｈＶＥＧＦ８〜１０９、ｈＶＥＧＦ１２１、スプライス形態ｈＶＥＧＦ１６５、およびそれぞれのマウスオルソログｍＶＥＧＦ１６４がヒト涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）に結合するＢＩＡｃｏｒｅ測定値を示す図である。 ヒト血漿および硝子体液中の涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）の安定性試験の結果（図２５Ａ）およびアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）との突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２の融合タンパク質（配列番号５１）の安定性試験の結果（図２５Ｂ）を示す図である。 ＯｍｐＡシグナル配列（ＯｍｐＡ）、アルブミン結合ドメイン（ａｂｄ）に融合され、その後ＳｔｒｅｐタグＩＩが続く突然変異したヒト涙リポカリン（Ｔｌｃ）を含む融合タンパク質をコードする発現ベクターｐＴＬＰＣ５１を示す図である。 涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）およびＡＢＤとの突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２の融合タンパク質（配列番号５１）が組換えＶＥＧＦに結合するＢＩＡｃｏｒｅ測定値を示す図である。 ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下または非存在下でのＡＢＤを有するＳ２３６．１−Ａ２２（配列番号５１）によるＶＥＧＦ誘発性のＨＵＶＥＣ増殖の阻害を示す図である。 Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）および野生型涙リポカリンによって達成される阻害と比較した、リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）による、ヒト臍静脈（ＨＵＶＥＣ）から培養した内皮細胞のＶＥＧＦ誘発性の増殖の阻害を示す図である。 Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）によって達成される阻害と比較した、リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）による、ＨＵＶＥＣ中のＶＥＧＦ媒介性のＭＡＰキナーゼ活性化の阻害を示す図である。 Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）および野生型涙リポカリンと比較した、涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２０９．２＿Ｏ１０（配列番号３３）の局所投与を用いた血管透過性アッセイの結果を示す図である。 涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２０９．２＿Ｏ１０（配列番号３３）およびＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）および野生型涙リポカリンについての中央値の血管形成指数を比較するＣＡＭアッセイの結果を示す図である。 涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）およびＡＢＤとの突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２の融合タンパク質（配列番号５１）についてのＮＭＲＩマウスの血漿中のリポカリン突然変異タンパク質の濃度を示す図である。 野生型涙リポカリン、ＰＢＳバッファー、およびＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）と比較した、ＡＢＤとの涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２の融合タンパク質（配列番号５１）の全身投与の後の血管透過性アッセイの結果を示す図である。 野生型涙リポカリン、ＰＢＳバッファー、およびＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）と比較したＡＢＤとの涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２の融合タンパク質（配列番号５１）の腹腔内投与についての腫瘍異種移植モデル（スイスヌードマウス）の結果を示す図である。 増加性の濃度のＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（配列番号４）の存在下または非存在下での、ＩＬ−４またはＩＬ−１３を用いて刺激したＡ５４９細胞を用いたエオタキシン−３分泌アッセイの結果を示す図である。 増加性の濃度のＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（配列番号４）の存在下または非存在下での刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上でのＩＬ−４／ＩＬ−１３誘発性のＣＤ２３発現を示す図である。 ＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（配列番号４）のＳｃｈｉｌｄ分析の結果を示す図である。 ヒト初代Ｂ細胞に対する、ＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（配列番号４）の親和性判定の結果を示す図である。 静脈内、皮下、または気管内投与の後の、ＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４の生物学的利用率試験の結果を示す図である。 ＶＥＧＦ刺激ＨＵＶＥＣ増殖アッセイでの、ＰＥＧ２０、ＰＥＧ３０、またはＰＥＧ４０を用いたＰＥＧ化を有するおよび有していない突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）のｉｎ ｖｉｔｒｏ作用強度判定を示す図である。
図１は、ＯｍｐＡシグナル配列（ＯｍｐＡ）、Ｔ７アフィニティータグ、および突然変異したヒト涙リポカリン（Ｔｌｃ）を含み、その後にＳｔｒｅｐタグＩＩが続く融合タンパク質をコードする発現ベクターｐＴＬＰＣ１０を示す。突然変異した遺伝子カセットのクローニングのために使用されるＢｓｔＸＩ制限部位および構造遺伝子の側方に位置する制限部位の両方を標識する。遺伝子発現は、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）の制御下とする。転写はリポタンパク質転写ターミネーター（ｔｌｐｐ）で終結される。ベクターは、複製開始点（ｏｒｉ）、線状ファージｆ１の遺伝子間領域（ｆ１−ＩＧ）、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ）、およびテトラサイクリン抑制遺伝子（ｔｅｔＲ）をさらに含む。ｐＴＬＰＣ１０の核酸配列の関係のあるセグメントは、配列番号１として配列表リスト中のコードされたアミノ酸配列と共に再産生される。そのセグメントは、ＸｂａＩ制限部位で始まり、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で終わる。この領域の外側のベクターエレメントはベクターｐＡＳＫ７５と同一であり、その完全なヌクレオチド配列は、ドイツ特許公報ＤＥ４４１７５９８Ａ１号に示される。
図２は、ＩＬ−４受容体アルファに対する結合親和性を示す本発明のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１４８．３ Ｊ１４）の一次構造を示す。最初の２１残基（下線）はシグナル配列を構成し、これは周辺質の発現に際して開裂する。Ｎ末端Ｔ７タグ（イタリック体）およびＣ末端Ｓｔｒｅｐｔａｇ−ＩＩ（ボールド）は特徴付けられるタンパク質の一部である。図２は、また、４つのＮ末端アミノ酸残基（Ｈ１ Ｈ２ Ｌ３ Ａ４）ならびに２つの最後のＣ末端アミノ酸残基（Ｓ１５７およびＤ１５８）が本発明のこの例証となる突然変異タンパク質中で欠失していることも示す。
図３は、親和性スクリーニング実験からの結果を示す。モノクローナル抗ＳｔｒｅｐＴａｇ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）は、ヒト涙リポカリンの発現突然変異タンパク質を捕捉するためにＥＬＩＳＡプレート上にコートし、捕捉された突然変異タンパク質へのＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；３ｎＭおよび０．７５ｎＭ）の結合は、ＩＬ−４受容体アルファ−ＦｃのＦｃドメインに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートポリクローナル抗体を使用して検出した。親和性が改善されたクローンはより高度なシグナルを発する（左）。ＩＬ−４をＥＬＩＳＡプレート上にコートし、ＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃ（３ｎＭ）を発現突然変異タンパク質と共にインキュベートした。非占有ＩＬ−４結合部位を有するＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃの結合は、ＩＬ−４受容体アルファ−ＦｃのＦｃドメインに対するＨＲＰコンジュゲートポリクローナル抗体を使用して検出した。アンタゴニスト親和性が改善されたクローンはより低いシグナルを発する（右）。本発明の突然変異タンパク質Ｓ１４８．３ Ｊ１４（配列番号２）に対応するシグナルは、矢を用いて表し、個々のクローンからのシグナルは菱形によって表す。
図４は、配列番号２（Ｓ１４８．３ Ｊ１４）の親和性成熟によって得られたＩＬ−４受容体アルファに対する最も高度な結合親和性を有するヒト涙リポカリンの６つの突然変異タンパク質のポリペプチド配列（Ｓ１９１．５ Ｋ１２、Ｓ１４８．３ Ｊ１４ＡＭ２Ｃ２、Ｓ１９１．４ Ｂ２４、Ｓ１９１．４ Ｋ１９、Ｓ１９１．５ Ｈ１６、およびＳ１９７．８ Ｄ２２［配列番号３〜８］）を示す。表された一次構造の最初の２１残基（下線）はシグナル配列を構成し、これは周辺質の発現に際して開裂する。Ｃ末端ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＩＩ（ボールド）は特徴付けられたタンパク質の一部である。図４はまた、例えば、最初の４つのＮ末端アミノ酸残基（ＨＨＬＡ）および２つの最後のＣ末端アミノ酸残基（ＳＤ）は、タンパク質の生物学的機能に影響を与えることなく、本発明の涙リポカリン突然変異タンパク質中で欠失させることができることも示す。
図５〜１１は、ＩＬ−４受容体アルファに対する親和性を有するヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質（Ｓ１４８．３ Ｊ１４、Ｓ１９１．５ Ｋ１２、Ｓ１４８．３ Ｊ１４ＡＭ２Ｃ２、Ｓ１９１．４ Ｂ２４、Ｓ１９１．４ Ｋ１９、Ｓ１９１．５ Ｈ１６、およびＳ１９７．８ Ｄ２２［配列番号２〜８］）のＢｉａｃｏｒｅ測定値を示す。約４００ＲＵのＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃは、抗ヒトＦｃモノクローナル抗体を用いて事前にコートしたＣＭ−５チップ上で捕捉された。続いて、異なる濃度（図５：２０ｎＭ；４０ｎＭ；８０ｎＭ；１６０ｎＭ；３２０ｎＭ）または単一濃度の２５ｎＭ（図６〜１１）の突然変異タンパク質をフローセルに通過させ、共鳴ユニットの変化を記録した。ＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃをまったく有していないことを除いて等しく処理したフローセルからの基準シグナルを差し引き、結果として生じるデータをＢｌＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ（ラングミュア）モデルにあてはめた。図６〜１１に示される実験での相互作用の遅い解離反応速度のために、ＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃをまったく有していないことを除いて等しく処理したフローセルからのシグナルを差し引くことおよび試料バッファーのみを注入した実験からのシグナルを差し引くことによって、二重参照を使用した。結果として生じるデータは、ＢｌＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、物質輸送制限と共に１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルにあてはめた。図６〜１１では、５回の実験からの１つの代表的な結果を示す。
図１２は、ＩＬ−４受容体アルファに対する結合親和性を有するヒト涙リポカリン突然変異タンパク質（Ｓ１４８．３ Ｊ１４；配列番号２）の競合ＥＬＩＳＡ測定値を示す。ＩＬ−４（２０μｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡプレート上にコートし、ＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃ（１５ｎＭ）を、室温で１時間、種々の濃度のヒト涙リポカリン突然変異タンパク質またはＩＬ−４受容体特異的モノクローナル抗体（ＭＡＢ２３０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共にインキュベートした。ＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃおよび突然変異タンパク質の混合物を外界温度で３０分間、ＩＬ−４をコートしたプレートに与えた。結合したＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃをヤギ抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ−コンジュゲート抗体を用いて検出した。データを式：０．５＊（−ｍ０＋ｍ２−ｍ１＋ｓｑｒｔ（（−ｍ０＋ｍ２−ｍ１）＾２＋４＊ｍ１＊ｍ２））にあてはめた。Ｋｉは変数ｍ１によって示される。３回の実験からの１つの代表的な結果を示す。
図１３〜１８は、ＩＬ−４受容体アルファに対する結合親和性を有するヒト涙リポカリン突然変異タンパク質およびコントロールとしての野生型涙リポカリン（ＴＬＰＣ１０；ｐＴＬＰＣ１０の遺伝子産物）の競合ＥＬＩＳＡ測定値を示す。ＩＬ−４受容体に対するＩＬ−４受容体アルファ特異的モノクローナル抗体ＭＡＢ２３０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＥＬＩＳＡプレート上にコートし、ビオチン化ＩＬ−４受容体アルファ（ＩＬ−４Ｒアルファ−ｂｉｏ；０．５ｎＭ）を外界温度で１時間、種々の濃度の発明された突然変異タンパク質またはＴＬＰＣ１０と共にインキュベートした。ＩＬ−４Ｒアルファ−ｂｉｏおよび突然変異タンパク質の混合物を外界温度で３０分間、ＭＡＢ２３０でコートしたプレート中でインキュベートした。結合したＩＬ−４Ｒアルファ−ｂｉｏは、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを用いて検出した。データは式：０．５＊（−ｍ０＋ｍ２−ｍ１＋ｓｑｒｔ（（−ｍ０＋ｍ２−ｍ１）＾２＋４＊ｍ１＊ｍ２））にあてはめた。ＫＤは変数ｍ１によって示される。３回の実験からの１つの代表的な結果を示す。
図１９は、ＴＦ−１細胞増殖アッセイの結果を示す。ＴＦ−１細胞は、７２時間の０．８ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４（ａ、ｂ）または１２ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１３（ｃ、ｄ）の添加の前に、希釈系列の示された突然変異タンパク質、ＩＬ−４受容体アルファ特異的モノクローナル抗体、またはＩｇＧ２ａ抗体アイソタイプコントロールと共に３７℃で１時間インキュベートした。増殖は３Ｈチミジン取り込みによって測定した。
図２０は、ＯｍｐＡシグナル配列（ＯｍｐＡ）、ＳｔｒｅｐタグＩＩが後に続くＴｌｃ、およびアミノ酸２１７〜４０６を含むＭ１３コートタンパク質ｐＩＩＩの切断された形態（ｐＩＩＩ）を含む融合タンパク質をコードするファスミドベクターｐＴＬＰＣ２７を示す。ＳｕｐＥアンバーサプレッサー宿主株中でＧｌｎに部分的に翻訳されるアンバー停止コドンは、ＳｔｒｅｐタグＩＩを含むＴｌｃコード領域および切断されたファージコートタンパク質ｐＩＩＩのコード領域の間に位置し、非サプレッサー大腸菌株を利用する場合にＭ１３コートタンパク質ｐＩＩＩを伴わないでＴｌｃ突然変異タンパク質の可溶性発現を可能にする。突然変異した遺伝子カセットのクローニングのために使用されるＢｓｔＸＩ制限部位および構造遺伝子の側方に位置する制限部位の両方を標識する。遺伝子発現は、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）の制御下とする。転写はリポタンパク質転写ターミネーター（ｔｌｐｐ）で終結される。ベクターは、複製開始点（ｏｒｉ）、線状ファージｆ１の遺伝子間領域（ｆ１−ＩＧ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）、およびテトラサイクリン抑制遺伝子（ｔｅｔＲ）をさらに含む。ｐＴＬＰＣ２７の核酸配列の関係のあるセグメントは、配列番号９としての配列リスト中のコードされたアミノ酸配列と共に再産生される。
図２１は、ヒトＶＥＧＦに対する結合親和性を有するヒト涙リポカリン突然変異タンパク質、野生型涙リポカリン（ＴＬＰＣ１０）、またはＶＥＧＦ特異的治療抗体Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）を利用する増殖アッセイの結果を示す。約１，４００個のＨＵＶＥＣ細胞を完全培地中に接種し、３７℃での一晩のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、０．５％ＦＣＳ、ヒドロコルチゾン、およびゲンタマイシン／アンホテリシンを含有する基本培地を添加した。ＶＥＧＦ特異的突然変異タンパク質Ｓ２０９．２−Ｃ２３、Ｓ２０９．２−Ｄ１６、Ｓ２０９．２−Ｎ９、Ｓ２０９．６−Ｈ７、Ｓ２０９．６−Ｈ１０、Ｓ２０９．２−Ｍ１７、Ｓ２０９．２−Ｏ１０（配列番号２７〜３３）、野生型涙リポカリン（ｐＴＬＰＣ１０の遺伝子産物；コントロール）、または治療ＶＥＧＦ特異的モノクローナル抗体Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ；コントロール）を３通りのウェル中に示す濃度で添加した。３０分後、ＶＥＧＦによって誘発されない増殖のコントロールとしてのヒトＶＥＧＦ１６５またはヒトＦＧＦ−２（示さず）を添加し、細胞の生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ発色アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて６日後に判定した。
図２２は、ＩＬ−４受容体アルファに対する親和性を有するヒト涙リポカリンのＰＥＧ化突然変異タンパク質Ｓ１４８．３ Ｊ１４（配列番号２）のＢｉａｃｏｒｅ測定値を示す。約４００ＲＵのＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃは、抗ヒトＦｃモノクローナル抗体を用いて事前にコートしたＣＭ−５チップ上で捕捉された。続いて、異なる濃度（２００ｎＭ；６７ｎＭ；２２ｎＭの突然変異タンパク質をフローセルに通過させ、共鳴ユニットの変化を記録した。ＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃをまったく有していないことを除いて等しく処理したフローセルからの基準シグナルを差し引き、結果として生じるデータをＢｌＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルにあてはめた。
図２３は、ヒト涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）が固定化されたＶＥＧＦ８〜１０９に結合する例示的なＢｉａｃｏｒｅ測定値を示す。ＶＥＧＦ８〜１０９は標準のアミンの化学的性質を使用してＣＭ５チップ上に固定化した。リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２は、５００ｎＭ〜１６ｎＭの６つの濃度で３０μｌ／分の流速で加えた。センサーグラムの評価は、突然変異タンパク質のｋｏｎ、ｋｏｆｆ、およびＫＤを決定するためにＢＩＡ Ｔ１００ソフトウェアを用いて行った。
図２４は、異なる形態のＶＥＧＦとの、センサーチップ上に固定化された突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）の親和性測定値を示す。親和性測定値は、突然変異タンパク質が固定化され、異なるＶＥＧＦ変異体を含有する７０μｌの試料を２５０ｎＭの濃度で注入した改変を伴って、ＷＯ２００６／５６４６４号の実施例９に記載されるように本質的に行った。結果の定性的比較は、切断された形態ｈＶＥＧＦ８〜１０９およびｈＶＥＧＦ１２１が基本的に同一のセンサーグラムを示すことを示し、涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）に親和性が類似していることを示す。スプライス形態ｈＶＥＧＦ１６５もリポカリン突然変異タンパク質に対する強い結合を示すが、それぞれのマウスオルソログｍＶＥＧＦ１６４は親和性がわずかに低下している。
図２５は、利用した濃度を１ｍｇ／ｍｌとしたことを除いて国際特許出願ＷＯ２００６／０５６４６４号の実施例１５に記載されるように本質的に行った、ＰＢＳおよびヒト血清中での３７℃でのＶＥＧＦ結合突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２の安定性試験を示す。突然変異タンパク質の変化は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって判断されるようにＰＢＳ中での７日間のインキュベーション期間の間に検出することができなかった（データ示さず）。ヒト血清中でのリポカリン突然変異タンパク質のインキュベーションは、基準と比較しておよそ７０％まで７日後に親和性の低下をもたらした（図２５ａ）。ヒト血清中でのＳ２３６．１−Ａ２２のＡＢＤ融合物（配列番号５１）の安定性も上記に記載されるように試験した。活性の損失は７日間のインキュベーション期間の間に検出することができなかった（図２５ｂ）。
図２６は、ＯｍｐＡシグナル配列（ＯｍｐＡ）、アルブミン結合ドメイン（ａｂｄ）に融合され、その後ＳｔｒｅｐタグＩＩが続く突然変異したヒト涙リポカリン（Ｔｌｃ）を含む融合タンパク質をコードする発現ベクターｐＴＬＰＣ５１を示す。突然変異した遺伝子カセットのクローニングのために使用されるＢｓｔＸＩ制限部位および構造遺伝子の側方に位置する制限部位の両方を標識する。遺伝子発現は、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）の制御下とする。転写はリポタンパク質転写ターミネーター（ｔｌｐｐ）で終結される。ベクターは、複製開始点（ｏｒｉ）、線状ファージｆ１の遺伝子間領域（ｆ１−ＩＧ）、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ）、およびテトラサイクリン抑制遺伝子（ｔｅｔＲ）をさらに含む。ｐＴＬＰＣ５１の核酸配列の関係のあるセグメントは、配列番号４８および４９として配列表リスト中のコードされたアミノ酸配列と共に再産生される。そのセグメントは、ＸｂａＩ制限部位で始まり、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で終わる。この領域の外側のベクターエレメントはベクターｐＡＳＫ７５と同一であり、その完全なヌクレオチド配列は、ドイツ特許公報ＤＥ４４１７５９８Ａ１号に示される。
図２７は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用する、組換えＶＥＧＦ８〜１０９に対する涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２のＡＢＤ融合物（Ａ２２−ＡＢＤ）（配列番号５１）（２００ｐＭ）の親和性測定値を示す。親和性測定値は、約２５０ＲＵの組換えＶＥＧＦ８〜１０９が標準のアミンの化学的性質を使用してセンサーチップに直接つながれた改変を伴って、ＷＯ２００６／５６４６４号の実施例９に記載されるように本質的に行った。４０μｌの突然変異タンパク質を４００ｎＭの濃度で注入した。親和性は基本的に変化していないことがわかり、２６０ｐＭと測定された。
図２８は、ＶＥＧＦ誘発性のＨＵＶＥＣ増殖を阻害するためのその能力を判定することによる、ヒト血清アルブミンの存在下でのリポカリン突然変異タンパク質Ａ２２−ＡＢＤ（Ｓ２３６．１−Ａ２２のＡＢＤ融合物）の機能性の試験を示す。ＨＵＶＥＣ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）はゼラチンをコートした皿上で増し、継代Ｐ２およびＰ８の間に使用した。１日目、１４００個の細胞を、完全培地中の９６ウェルプレート中にウェル毎に接種した。２日目、細胞を洗浄し、０．５％ＦＣＳ、ヒドロコルチゾン、およびゲンタマイシン／アンホテリシンを含有する１００μｌの基本培地を添加した。増殖は、リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２−ＡＢＤ（配列番号５１）と混合し、３０分間インキュベートし、ウェルに添加した２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ１６５または１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２を用いて刺激した。生存率は６日目に決定し、結果は阻害％として表現した。示される場合に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、５μＭ）を添加した。５μＭ ＨＳＡで、＞９９．８％のＡ２２−ＡＢＤが任意の所与の時間にＨＳＡと結合する。
図２９は、本発明の突然変異タンパク質による、ＶＥＧＦ誘発性のＨＵＶＥＣ増殖の阻害を示す。ＨＵＶＥＣ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）はゼラチンをコートした皿（ｄｉｓｈ）上で増し、継代Ｐ２およびＰ８の間に使用した。１日目、１４００個の細胞を、完全培地中に９６ウェルプレート中にウェル毎に接種した。２日目、細胞を洗浄し、０．５％ＦＣＳ、ヒドロコルチゾン、およびゲンタマイシン／アンホテリシンを含有する１００μｌの基本培地を添加した。増殖は、リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）と混合し、３０分間インキュベートし、ウェルに添加した２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ１６５または１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２を用いて刺激した。生存率は６日目に決定し、結果は阻害％として表現した。
図３０は、本発明の突然変異タンパク質によるＨＵＶＥＣ中のＶＥＧＦ媒介性のＭＡＰキナーゼ活性化の阻害を示す。ＨＵＶＥＣは、標準の培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）中にウェル当たり１，４００個の細胞で９６ウェルプレート中に接種した。翌日、ＦＣＳを０．５％に低下させ、培養を１６時間継続した。次いで、細胞を５時間基本培地中０．５％ＢＳＡ中で飢餓状態にした。ＨＵＶＥＣは、用量応答曲線を得るために、増加性の濃度の涙リポカリン突然変異タンパク質Ａ２２またはＡｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）の存在下で１０分間ＶＥＧＦ１６５（Ｒｅｌｉａｔｅｃｈ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）を用いて刺激した。ＭＡＰキナーゼＥＲＫ１およびＥＲＫ２のリン酸化は、メーカーのマニュアル（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）に従ってＥＬＩＳＡを使用して定量化した。ＩＣ５０値は突然変異タンパク質Ａ２２（配列番号４４）について４．５ｎＭおよびＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）について１３ｎＭであると決定された。
図３１は、涙リポカリン突然変異タンパク質の局所投与を用いた血管透過性アッセイを示す。体重が３５０±５０ｇのＤｕｎｃａｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモットは、肩および背を剪毛した。動物は、１ｍｌの１％Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅ色素の耳静脈を介しての静脈内注射を受けた。３０分後、２０ｎｇ ＶＥＧＦ１６５（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を１０倍のモル過剰で試験物質またはコントロール物と混合し、３×４グリッド上に皮内に注射した。３０分後、動物はＣＯ２窒息によって安楽死させた。ＶＥＧＦ注射の１時間後に、グリッドパターンを含有する皮膚を摘出し、結合組織をきれいにした。色素血管外遊出のエリアは、画像解析器（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ １．３、Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）の使用によって定量化した。
図３２はヒヨコ漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイを示す。示されるようにＦＧＦ−２（５００ｎｇ）、ＶＥＧＦ（１５０ｎｇ）、および涙リポカリン突然変異タンパク質（１．３５μｇ）またはＡｖａｓｔｉｎ（１０μｇ）を含有するコラーゲンオンプラント（ｏｎｐｌａｎｔ）を１０日目のニワトリ胚（４つ／動物、１０匹の動物／グループ）のＣＡＭの上に置いた。２４時間目に、涙リポカリン突然変異タンパク質またはＡｖａｓｔｉｎを同じ用量でオンプラントに局所的に再び加えた。７２時間後に、オンプラントを収集し、画像を保存した。少なくとも１つの血管を含有するポジティブグリッドの百分率を盲検化した観察者によって決定した。中央値の血管形成指数は、ＶＥＧＦアンタゴニストであるＳ２０９．２−Ｏ１０（配列番号３３）およびＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）ならびにポジティブグリッドの画分としての野生型涙リポカリンコントロールについて報告する。
図３３は、マウス中のＡ２２およびＡ２２−ＡＢＤについての薬物動態（ＰＫ）パラメーターの決定を示す。ｉ．ｖ．の後の涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１ Ａ２２（配列番号４４）（４ｍｇ／ｋｇ）およびｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．単一ボーラス投与の後でのＡＢＤとの突然変異タンパク質Ｓ２３６．１ Ａ２２の融合タンパク質（配列番号５１）（５．４ｍｇ／ｋｇ）についての薬物動態（ＰＫ）パラメーター（半減期血漿濃度、生物学的利用率）をＮＭＲＩマウスで決定した。血漿は、事前に決めた時点で採取した末端血液試料から調製し、リポカリン突然変異タンパク質の濃度はＥＬＩＳＡによって決定した。結果は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＵＳＡ）を使用して分析した。Ｔ１／２ Ａ２２ ｉ．ｖ．：０．４２時間；Ｔ１／２ Ａ２２−ＡＢＤ ｉ．ｖ．：１８．３２時間；Ｔ１／２ Ａ２２−ＡＢＤ ｉ．ｐ．：２０．８２時間。融合タンパク質Ａ２２−ＡＢＤのｉ．ｐ．投与の後での生物学的利用率は８２．５％であった。
図３４は、涙リポカリン突然変異タンパク質の全身投与を用いた血管透過性アッセイを示す。実験の１２時間前に、試験物質またはコントロールをグループ当たり３匹の動物に静脈内に注射した。グループ１：ＰＢＳ媒体；グループ２：Ａｖａｓｔｉｎ、１０ｍｇ／ｋｇ；グループ３：突然変異タンパク質Ｓ２３６．１ Ａ２２−ＡＢＤ、６．１ｍｇ／ｋｇ；グループ４：ＴＬＰＣ５１：６．１ｍｇ／ｋｇ。時間＝０に、Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅを注射した。３０分後に、４つの用量のＶＥＧＦ（５、１０、２０、または４０ｎｇ）を３×４グリッド上に皮内に３通り注射した。ＶＥＧＦ注射の３０分後に、動物を犠牲死させ、色素血管外遊出を、画像解析器（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ １．３、Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）の使用によって定量化した。
図３５は、腫瘍異種移植モデルでの本発明の突然変異タンパク質の効果を示す。照射（２．５Ｇｙ、Ｃｏ６０）スイスヌードマウスは、右側腹部中に、マトリゲル中の１×１０７ Ａ６７３横紋筋肉腫細胞（ＡＴＴＣ）を皮下に接種した（グループ当たりｎ＝１２）。治療薬を腹腔内に投与し、同日に開始し、２１日間継続した。グループ１：ＰＢＳ媒体、毎日；グループ２：Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、５ｍｇ／ｋｇ、３日毎；グループ３：リポカリン突然変異タンパク質Ａ２２−ＡＢＤ（配列番号５１）、毎日、３．１ｍｇ／ｋｇ；グループ４：ＴＬＰＣ５１、毎日、３．１ｍｇ／ｋｇ。リポカリン突然変異タンパク質Ａ２２−ＡＢＤの用量は、マウスでのＡ２２−ＡＢＤ ＰＫデータおよび抗体の推算された血清半減期に基づいて突然変異タンパク質およびＡｖａｓｔｉｎのＶＥＧＦ結合部位の等モル数が一定に存在することを達成するように選んだ。腫瘍サイズはカリパスを用いて毎週２回測定し、腫瘍量は式（長さ×幅２）／２によって推算した。腫瘍量が２，０００ｍｍ３を超過した場合に、マウスを犠牲死させた。
図３６は、Ａ５４９細胞を用いたエオタキシン−３分泌アッセイの結果を示す。Ａ５４９細胞は、増加性の濃度のＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（配列番号４）の存在下または非存在下でそれぞれ０．７ｎＭ ＩＬ−４または０．８３ｎＭ ＩＬ−１３を用いて刺激した。エオタキシン−３分泌を、市販で入手可能なキットを使用して細胞培養上澄液中のエオタキシン３濃度を測定することによって７２時間後に判定した。
図３７は、増加性の濃度のＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（配列番号４）の存在下または非存在下での、４８時間後の、刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上でのＩＬ−４／ＩＬ−１３誘発性のＣＤ２３発現を示す。全ヒトＰＢＭＣをバッフィーコートから単離した。増加性の濃度のＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４を添加し、細胞は、それぞれ１．０ｎＭまたは２．５ｎＭの最終濃度でＩＬ−４またはＩＬ−１３を用いて刺激した。４８時間後、活性化されたＣＤ２３発現ＣＤ１４＋単球は、フローサイトメトリーによって定量化した。
図３８は、ＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（配列番号４）のＳｃｈｉｌｄ分析の結果を示す。ＴＦ−１細胞のＩＬ−４用量依存的増殖を、いくつかの固定濃度のＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４の存在下または非存在下で判定した（図３８Ａ）。得られた結果のＳｃｈｉｌｄ分析（図３８Ｂ）から、１９２ｐＭ（線形回帰）および１１６ｐＭ（非線形回帰）のＫｄを得た。
図３９は、ヒト初代Ｂ細胞に対する、ＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（配列番号４）の親和性判定の結果を示す。ＰＢＭＣをヒト血液から単離し、異なる濃度のＩＬ−４受容体アルファ結合ヒト涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４または野生型ヒト涙リポカリン（ＴＬＰＣ２６）と共にインキュベートした。次いで、細胞は、抗ＣＤ２０−ＦＩＴＣモノクローナル抗体およびビオチン化抗リポカリン抗血清、その後ストレプトアビジン−ＰＥを用いて染色した。野生型リポカリンおよびＩＬ−４受容体アルファ結合リポカリン突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４についての結果を図３９ＡおよびＢにそれぞれ示す。ＰＥポジティブＢ細胞について決定した百分率をリポカリンの濃度に対してあてはめ（図３９Ｃ）、ＥＣ５０を得られた曲線から算出した。ＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（配列番号４）のＥＣ５０は１０５ｐＭとして算出された。
図４０は、静脈内、皮下、または気管内投与の後の、ＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４の生物学的利用率試験の結果を示す。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、示された経路を介して４ｍｇ／ｋｇの、単一容量の突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４を受けた。気管内投与はマイクロスプレー投薬デバイス（ＰｅｎｎＣｅｎｔｕｒｙ、ＵＳＡ）を用いて行った。血漿試料を所定の時点で得て、機能的活性突然変異タンパク質の残存濃度を決定するためにサンドイッチＥＬＩＳＡ分析にかけた。濃度は非コンパートメントＰＫ分析によって分析した。生物学的利用率は皮下投与後に１００％、気管内送達の後で１３．８％であった。
図４１は、ヒト涙リポカリンｗｔと比較した、非ＰＥＧ化またはＰＥＧ２０、ＰＥＧ３０、もしくはＰＥＧ４０を用いてＰＥＧ化した突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）のｉｎ ｖｉｔｒｏ作用強度判定を示す。ＩＣ５０値は、ＶＥＧＦ刺激ＨＵＶＥＣ増殖アッセイでのそれぞれのヒト涙リポカリン突然変異タンパク質の滴定を介して決定し、増殖阻害を決定した。
他に示されない限り、組換え遺伝子技術の確立された方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に記載されるように使用した。
（実施例１：２×１０９個の独立したＴｌｃ突然変異タンパク質を用いたライブラリーの生成）
高度に複雑な、涙リポカリン（Ｔｌｃ）のランダムライブラリーは、成熟野生型ヒト涙リポカリンの１８個の選択されたアミノ酸位置２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、５６、５７、５８、８０、８３、１０４、１０５、１０６、および１０８の協奏的突然変異誘発によって調製した。このために、対応するコドンが標的様式でランダム化された遺伝子カセットを、先に記載された戦略に従って、２ステップで、縮重プライマーオリゴデオキシヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して構築した（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（２００１）「Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ」：ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ−ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４、２５７〜２７５）。このライブラリー設計では、涙リポカリンの野生型配列の最初の４つのＮ末端アミノ酸残基（ＨＨＬＡ）および最後の２つのＣ末端アミノ酸残基（ＳＤ）を欠失させた（この理由で、添付の配列リストに示されるすべての涙リポカリン突然変異タンパク質は、Ｎ末端残基として野生型配列のＡｌａ５およびＣ末端残基としてＧｌｙ１５６を有する（例えば、後者はアフィニティータグに任意選択で融合される））。
ランダムライブラリーの生成の第１のステップでは、Ｔｌｃの第１および第２の露出ループについての、ランダム化コドンを有するＰＣＲ断片は、プライマーＴＬ４６（配列番号１０）およびＴＬ４７（配列番号１１）を使用して調製し、一方、Ｔｌｃの第３および第４の露出ループについての、ランダム化コドンを有する他のＰＣＲ断片はプライマーＴＬ４８（配列番号１２）およびＴＬ４９（配列番号１３）を使用して並行して調製した。第２のステップでは、これらの２つのＰＣＲ断片は連結オリゴデオキシヌクレオチドを用いて組み合わせ、プライマーＡＮ−１４（配列番号１４）、ＴＬ５０ｂｉｏ（配列番号１５）、およびＴＬ５１ｂｉｏ（配列番号１６）を用いたＰＣＲ反応での鋳型として使用し、構築されたランダム化遺伝子カセットを得た。
第１のステップについての２つのＰＣＲ反応（１ａおよび１ｂ）は、従来のホスホラミダイト法によって合成された５０ｐｍｏｌの各ペアのプライマー（それぞれＴＬ４６およびＴＬ４７またはＴＬ４８およびＴＬ４９）と共に、鋳型として各反応につき１０ｎｇ ｐＴＬＰＣ１０プラスミドＤＮＡ（図１）を使用して１００μｌの容量でそれぞれ行った。さらに、反応混合物は１０μｌ １０×Ｔａｑ反応バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ９．０、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ｖ／ｖ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、および２μｌ ｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含有した。水で容量を増した後、５ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕ／μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、９４℃で１分間、５８℃で１分間、および７２℃で１．５分間の２０サイクルを加熱した蓋を有するプログラム可能なサーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で実行し、その後、完了させるために６０℃での５分間のインキュベーションを続けた。それぞれ１３５ｂｐおよび１３３ｂｐの所望のサイズを有する増幅産物は、ＧＴＱアガロース（Ｒｏｔｈ）およびＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、調製用アガロースゲル電気泳動によって単離した。
第２のＰＣＲステップについては、１０００μｌ混合物を調製し、ＰＣＲ反応１ａならびに１ｂからの約５００ｆｍｏｌの両方の断片を、５００ｐｍｏｌのそれぞれの側方プライマーＴＬ５０ｂｉｏ（配列番号１５）およびＴＬ５１ｂｉｏ（配列番号１６）ならびに媒介プライマーＡＮ−１４（配列番号１４）の１０ｐｍｏｌの存在下で鋳型として使用した。両方の側方プライマーはそれらの５’端にビオチン基を保有し、したがって、ストレプトアビジンをコートした常磁性ビーズを介しての、不完全に消化された産物からの、ＢｓｔＸＩ開裂の後のＰＣＲ産物の分離を可能にした。さらに、反応ミックスは、１００μｌ １０×Ｔａｑバッファー、２０μｌ ｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、５０ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕ／μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、および反応ミックスの最終容量を１０００μｌとするための水を含有した。混合物を１００μｌの一定分量に分け、ＰＣＲを、９４℃での１分間、５７℃での１分間、７２℃での１．５分間の２０サイクルを用いて行い、その後、６０℃での５分間の最終インキュベーションを続けた。ＰＣＲ産物はＥ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｃｙｃｌｅ−Ｐｕｒｅ Ｋｉｔ（ＰｅｑＬａｂ）を使用して精製した。
続くクローニングについては、核酸形態のＴｌｃ突然変異タンパク質のライブラリーの中央部を表すこの断片は、メーカーの指示に従って制限酵素ＢｓｔＸＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて最初にカットし、次いで、上記に記載されるように調製用アガロースゲル電気泳動によって精製し、サイズが３０１塩基対の二重鎖ＤＮＡ断片がもたらされた。
消化されていないまたは不完全に消化されたＤＮＡ断片は、ストレプトアビジンをコートした常磁性ビーズ（Ｍｅｒｃｋ）を使用して、それらの５’ビオチンタグを介して除去した。このために、ストレプトアビジンをコートした常磁性粒子の市販で入手可能な懸濁液の１５０μｌ（１０ｍｇ／ｍｌの濃度）は、１００μｌ ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて３回洗浄した。次いで、粒子は磁石の助けを借りて水気を切り、室温で１５分間１００μｌ ＴＥバッファー中で７０ｐｍｏｌの消化されたＤＮＡ断片と混合した。次いで、常磁性粒子は磁石を用いてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管の壁に収集し、精製され、十分に消化されたＤＮＡ断片を含有する上清を、次のライゲーション反応での使用のために回収した。
ベクターｐＴＬＰＣ２７（図２０）はメーカーの指示に従って制限酵素ＢｓｔＸＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてカットし、得られた大きなベクター断片を、上記に記載されるように調製用アガロースゲル電気泳動によって精製し、ベクターバックボーンを表す、サイズが３７７２塩基対の二重鎖ＤＮＡ断片がもたらされた。
ライゲーション反応については、４０ｐｍｏｌのＰＣＲ断片および４０ｐｍｏｌのベクター断片（ｐＴＬＰＣ２７）を、１６℃で、４８時間、１０．７６ｍｌの全容量（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中で１０７４ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下でインキュベートした。次いで、ライゲーション混合物中のＤＮＡは、２６７μｌ酵母ｔＲＮＡ（Ｈ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍｌの溶液（Ｒｏｃｈｅ））、１０．７６ｍｌ ５Ｍ酢酸アンモニウム、および４２．７ｍｌエタノールを添加することにより１．５時間沈殿させた。沈殿の後、ＤＮＡペレットは７０％ＥｔＯＨを用いて洗浄し、次いで乾燥させた。終わりに、ＤＮＡは、５３８μｌの水の全容量中２００μｇ／ｍｌの最終濃度まで溶解させた。
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅのエレクトロコンピテント細菌細胞の調製（Ｂｕｌｌｏｃｋら、前掲）は、ＴｕｎｇおよびＣｈｏｗ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１１（１９９５）、１２８〜１２９）によってならびにＨｅｎｇｅｎ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１（１９９６）、７５〜７６）によって記載される方法に従って実行した。１ｌ ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏトリプトン、５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を、ＸＬ１−Ｂｌｕｅの一晩の培養物の添加によって、６００ｎｍのＯＤ６００＝０．０８の光学密度に合わせ、２ｌ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ（アーレンマイヤー）フラスコ中で１４０ｒｐｍおよび２６℃でインキュベートした。ＯＤ６００＝０．６に達した後、培養物を氷上で３０分間冷却し、続いて、４０００ｇおよび４℃で１５分間遠心分離した。細胞を５００ｍｌ氷冷１０％ｗ／ｖグリセロールを用いて２回洗浄し、最後に、２ｍｌの氷冷ＧＹＴ培地（１０％ｗ／ｖグリセロール、０．１２５％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．２５％ｗ／ｖトリプトン）中に再度懸濁させた。次いで、細胞を等分し（２００μｌ）、液体窒素中でショック凍結させ、−８０℃で保存した。
エレクトロポレーションは、４℃で、Ｍｉｃｒｏ Ｐｕｌｓｅｒシステム（ＢｉｏＲａｄ）を同じベンダーからのキュベットと共に用いて行った（電極距離２ｍｍ）。ライゲーションしたＤＮＡ溶液（１μｇ ＤＮＡを含有する）の１０μｌの一定分量を、１００μｌの細胞懸濁液と混合し、最初に氷上で１分間インキュベートし、次いで、事前に冷やしたキュベットに移した。エレクトロポレーションは、５ｍｓおよび１２．５ｋＶ／ｃｍの電界強度のパラメーターを使用して行い、懸濁液を、そのすぐ後に２ｍｌ氷冷ＳＯＣ培地（オートクレーブした２０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏトリプトン、５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５、エレクトロポレーションの前に、２０ｍｌ／Ｌ ２０％グルコースを有する１０ｍｌ／Ｌ １Ｍ ＭｇＣｌ２および１Ｍ ＭｇＳＯ４を添加した）中で希釈し、その後３７℃および１４０ｒｐｍでの６０分間のインキュベーションを続けた。その後、培養物は、１００μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する２Ｌ ２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏトリプトン、１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）（２ＹＴ／Ｃａｍ）中に希釈し、０．２６のＯＤ５５０がもたらされた。培養物は、ＯＤ５５０が０．６ユニットさらに増すまで、３７℃でインキュベートした。
５４回のエレクトロポレーションの実行で、合計１０７．６μｇのライゲーションしたＤＮＡを利用することによって、合計約２．０×１０９個の形質転換体を得た。形質転換体は、融合タンパク質としてＴｌｃ突然変異タンパク質のライブラリーをコードするファージミドの調製のためにさらに使用した。
ファージミドライブラリーの調製については、上記からの４ｌの培養物を、１．３×１０１２ ｐｆｕ ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて感染させた。４５分間３７℃での撹拌の後、インキュベーション温度を２６℃に下げた。１０分間の温度平衡の後、２５μｇ／ｌアンヒドロテトラサイクリンを、Ｔｌｃ突然変異タンパク質およびファージコートタンパク質の間の融合タンパク質の遺伝子発現を誘発するために添加した。ファージミド産生を２６℃で１１時間可能にした。遠心分離による細菌の除去の後、ファージミドは、２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００（Ｆｌｕｋａ）、１５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを用いて培養上清から２回沈殿させ、最後に、ＰＢＳ（４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１１５ｍＭ ＮａＣｌ）中に溶解させた。
（実施例２：ＩＬ−４受容体アルファに対する親和性を有するＴｌｃ突然変異タンパク質のファージミド提示および選択）
ファージミドディスプレイおよび選択は、次の改変を有するＷＯ２００６／５６４６４号の実施例２に記載されるように本質的に、実施例１から得られたファージミドを利用して行った：標的タンパク質（ＩＬ−４受容体アルファ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）は２００ｎＭの濃度で利用し、ビオチン化タンパク質としてライブラリーに提示し、ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使用するファージ−標的複合体の捕捉を続けた。あるいは、標的タンパク質は、２００ｎＭの濃度でＦｃ融合タンパク質（ＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）として利用し、メーカーの指示に従って、プロテインＧビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使用するおよび抗ヒトＦｃ捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をコートしたイムノスティック（Ｎｕｎｃ）上でのＦｃ融合タンパク質の固定化によるファージ−標的複合体の捕捉を続けた。３または４回の選択を行った。
（実施例３：ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーニングを使用するＩＬ−４受容体アルファ特異的突然変異タンパク質の同定）
実施例２に従って選択された突然変異タンパク質のスクリーニングは、次の改変を有するＷＯ２００６／５６４６４号の実施例３に記載されるように本質的に行った：発現ベクターはｐＴＬＰＣ１０（図１）とした。使用した標的タンパク質は、共に２μｇ／ｍｌのＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩＬ−４受容体アルファ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とした。
実施例２に記載されるように選択された５６３２個のクローンのスクリーニングは、２２９４個のプライマリーヒットの同定につながり、ライブラリーからの突然変異タンパク質の単離がうまく行われたことを示す。このアプローチを使用して、クローンＳ１４８．３ Ｊ１４（配列番号２）を同定した。Ｓ１４８．３ Ｊ１４の配列はまた図２にも表す。
（実施例４：エラープローンＰＣＲを使用する突然変異タンパク質Ｓ１４８．３ Ｊ１４の親和性成熟）
突然変異タンパク質Ｓ１４８．３ Ｊ１４（配列番号２）に基づいた変異体のライブラリーの生成は、オリゴヌクレオチドＴＬ５０ｂｉｏ（配列番号１５）およびＴＬ５１ｂｉｏ（配列番号１６）を使用して、ＷＯ２００６／５６４６４号の実施例５に記載されるように本質的に行い、平均で構造遺伝子当たり３つの置換を有するライブラリーがもたらされた。
ファージミド選択は実施例２に記載されるように実行したが、限られた標的濃度（ＩＬ−４受容体アルファの２ｎＭ、０．５ｎＭ、および０．１ｎＭ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ）、ＩＬ−４受容体アルファに対するアンタゴニストモノクローナル抗体との、洗浄時間の延長（ＭＡＢ２３０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１時間の洗浄時間および２時間の洗浄時間）または短いインキュベーション時間（３０秒間、１分間、および５分間）を利用した。３または４回の選択を行った。
（実施例５：部位特異的ランダムアプローチを使用する突然変異タンパク質Ｓ１４８．３．Ｊ１４の親和性成熟）
突然変異タンパク質Ｓ１４８．３ Ｊ１４（配列番号２）に基づいた変異体のライブラリーは、位置３４、５３、５５、５８、６１、６４、および６６のランダム化によって設計し、これらの位置ですべての２０種のアミノ酸を考慮した。ライブラリーは、デオキシヌクレオチドＴＬ７０（配列番号１７）、ＴＬ７１（配列番号１８）、およびＴＬ７２（配列番号１９）をそれぞれＴＬ４６、ＴＬ４７、およびＡＮ−１４の代わりに使用した改変を伴って、実施例１に記載されるように本質的に構築した。
ファージミド選択は、それぞれＩＬ−４受容体アルファに対する競合的モノクローナル抗体との洗浄時間の延長（ＭＡＢ２３０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１時間の洗浄）または短いインキュベーション時間（１０分間）と組み合わせた限られた標的濃度（ＩＬ−４受容体アルファの０．５ｎＭおよび０．１ｎＭ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を使用して、実施例２に記載されるように実行した。３または４回の選択を行った。
（実施例６：ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーニングを使用するＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質の親和性スクリーニング）
スクリーニングは、３ｎＭ ＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の濃度を使用したといった改変ならびにｉ）モノクローナル抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）は産生された突然変異タンパク質を捕捉するためにＥＬＩＳＡプレート上にコートし、涙リポカリンの捕捉された突然変異タンパク質に対するＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３ｎＭおよび０．７５ｎＭ）の結合は、ＩＬ−４受容体アルファ−ＦｃのＦｃドメインに対するＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲートポリクローナル抗体を使用して検出したといった追加を伴って、実施例３に記載されるように行った。さらに、代替スクリーニング設定では、ｉｉ）ＩＬ−４はＥＬＩＳＡプレート上にコートし、ＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３ｎＭ）は発現突然変異タンパク質と共にインキュベートし、非占有ＩＬ−４結合部位を有するＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃの結合は、ＩＬ−４受容体アルファ−ＦｃのＦｃドメインに対するＨＲＰコンジュゲートポリクローナル抗体を使用して検出した。
そのようなスクリーンからの結果を図３に表す。実施例４および５に記載されるように選択された多くの突然変異タンパク質は、親和性成熟のためのベースとして貢献した突然変異タンパク質Ｓ１４８．３ Ｊ１４（配列番号２）と比較して、ＩＬ−４受容体アルファに対する改善された親和性を有するとして同定された。このアプローチを使用して、突然変異タンパク質Ｓ１９１．５ Ｋ１２、Ｓ１９１．４ Ｂ２４、Ｓ１９１．４ Ｋ１９、Ｓ１９１．５ Ｈ１６、Ｓ１９７．８ Ｄ２２、およびＳ１４８．３ Ｊ１４ＡＭ２Ｃ２（配列番号３〜８）を同定した。Ｓ１９１．５ Ｋ１２、Ｓ１９１．４ Ｂ２４、Ｓ１９１．４ Ｋ１９、Ｓ１９１．５ Ｈ１６、Ｓ１９７．８ Ｄ２２、およびＳ１４８．３ Ｊ１４ＡＭ２Ｃ２の配列も図４に表す。
（実施例７：ＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質の産生）
ＩＬ−４受容体アルファ特異的突然変異タンパク質の調製用の産生については、発現ベクターｐＴＬＰＣ１０（図１）上にコードされたそれぞれの突然変異タンパク質を収容している大腸菌Ｋ１２株ＪＭ８３を、Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ、Ｓ．ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）、２９７、１１０５〜１１２０）に記載されるプロトコールに従ってＬＢアンピシリン培地中で２Ｌ振盪フラスコ培養物中で増殖させた。大量のタンパク質を必要とする場合、それぞれの発現ベクターを収容している大腸菌株Ｗ３１１０を、Ｓｃｈｉｗｅｃｋ，Ｗ．およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９５）２３、５６１〜５６５）に記載されるプロトコールに基づいて、１ｌまたは１０ｌ管中でのベンチトップ発酵槽培養を介しての周辺質の産生のために使用した。
突然変異タンパク質は、Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．＆ Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｇ．Ｍ．（２０００）（Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６Ａ、２７１〜３０４）によって記載される手順に従って適切なベッド容量のカラムを使用してストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーを介して単一ステップで周辺質の画分から精製した。高純度を達成し、あらゆる凝集した組換えタンパク質を除去するために、突然変異タンパク質のゲル濾過を、ＰＢＳバッファーの存在下でＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０カラム（２４ｍｌベッド容量、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で最後に実行した。単量体のタンパク質画分をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を確認し、さらに生化学的キャラクタリゼーションに使用した。
（実施例８：Ｂｉａｃｏｒｅを使用する親和性測定）
親和性測定は、約４００ＲＵのＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を固定化し（ＷＯ２００６／５６４６４号で標的として使用される２０００ＲＵのヒトＣＴＬＡ−４またはネズミＣＴＬＡ−４−Ｆｃの代わりに）、１００μｌの突然変異タンパク質を２５ｎＭの濃度で注射した（ＷＯ２００６／５６４６４号で使用される、５〜０．３μＭの濃度の、４０μｌ試料精製リポカリン突然変異タンパク質の代わりに）といった改変を伴って、ＷＯ２００６／５６４６４号の実施例９に記載されるように本質的に行った。
Ｓ１４８．３ Ｊ１４、Ｓ１９１．５ Ｋ１２、Ｓ１９１．４ Ｂ２４、Ｓ１９１．４ Ｋ１９、Ｓ１９１．５ Ｈ１６、Ｓ１９７．８ Ｄ２２、およびＳ１４８．３ Ｊ１４ＡＭ２Ｃ２を利用する親和性測定からの結果を図５〜１１に表し、表１に要約する。表１は、Ｂｉａｃｏｒｅによって決定される、ＩＬ−４受容体アルファに対する本発明の選択された突然変異タンパク質の親和性を示し、５回の実験の平均（標準の偏差）を示す。
Figure 0005608368
（実施例９：阻害ＥＬＩＳＡを使用するＩＬ−４のアンタゴニストの同定）
選択された突然変異タンパク質による、ＩＬ−４およびＩＬ−４受容体アルファの間の相互作用の阻害を阻害ＥＬＩＳＡで評価した。したがって、一定濃度のＩＬ−４受容体アルファ（０．５ｎＭビオチン化ＩＬ−４受容体アルファ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈまたは１５ｎＭ ＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を希釈系列の涙リポカリン突然変異タンパク質とインキュベートし、非占有ＩＬ−４結合部位を有するＩＬ−４受容体アルファの量を、プレートをＩＬ−４またはアンタゴニスト抗ＩＬ−４受容体アルファモノクローナル抗体でコートしたＥＬＩＳＡで定量化した。結合したビオチン化ＩＬ−４受容体アルファはＨＲＰコンジュゲートＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を使用して検出し、ビオチン化ＩＬ−４受容体アルファの規定量の標準曲線と比較した。Ｓ１４８．３ Ｊ１４、Ｓ１９１．５ Ｋ１２、Ｓ１９１．４ Ｂ２４、Ｓ１９１．４ Ｋ１９、Ｓ１９１．５ Ｈ１６、Ｓ１９７．８ Ｄ２２、およびＳ１４８．３ Ｊ１４ＡＭ２Ｃ２の突然変異タンパク質を利用する測定からの結果を図１２〜１８に表し、表２に要約する。表２は、競合ＥＬＩＳＡによって決定される、本発明の選択された涙リポカリン突然変異タンパク質のアンタゴニスト能力およびＩＬ−４受容体アルファに対する親和性を示し、３回の実験の平均（標準の偏差）を示す。
Figure 0005608368
（実施例１０：ＴＦ−１増殖アッセイを使用するＩＬ−４およびＩＬ−１３のシグナル伝達のアンタゴニストの同定）
ＩＬ−４およびＩＬ−１３刺激ＴＦ−１細胞増殖アッセイを、Ｌｅｆｏｒｔらに記載されるように本質的に行った（Ｌｅｆｏｒｔ Ｓ．、Ｖｉｔａ Ｎ．、Ｒｅｅｂ Ｒ．、Ｃａｐｕｔ Ｄ．、Ｆｅｒｒａｒａ Ｐ．（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６６（２〜３）、１２２〜１２６）。ＴＦ−１増殖アッセイからの結果を図１９に表す、またその結果は、高度な親和性の変異体Ｓ１９１．５ Ｋ１２、Ｓ１９１．４ Ｂ２４、Ｓ１９１．４ Ｋ１９、Ｓ１９１．５ Ｈ１６、Ｓ１９７．８ Ｄ２２、およびＳ１４８．３ Ｊ１４ＡＭ２Ｃ２がＩＬ−４およびＩＬ−１３誘発性のシグナル伝達および増殖の強力なアンタゴニストであることを示す。
（実施例１１：ヒト涙リポカリンの抗ＩＬ−４受容体アルファ突然変異タンパク質はＳＴＡＴ６媒介性の経路を阻害する）
ＴＦ−１細胞は、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有し、２ｎｇ／ｍｌ組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を補足したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞は、直径１００ｍｍの組織培養皿中に２０ｍｌ培地の全容量で５×１０４細胞／ｍｌで接種し、分割し、２〜３日毎にこの濃度で再接種し、５％ＣＯ２の加湿大気中で３７℃で培養した。
ＴＦ−１細胞を５分間１２００ｒｐｍで遠心分離によって収集し、１％加熱不活性化ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＲＰＭＩ−１％ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中で５分間１２００ｒｐｍで遠心分離によって２回洗浄した。細胞を、ＲＰＭＩ−１％ＦＣＳ中に１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させ、２４ウェルプレート中に１ｍｌで配置し、一晩培養した。翌日、ＴＦ−１細胞を、２０μｇ／ｍｌのＩＬ−４受容体アルファ特異的突然変異タンパク質またはネガティブコントロール突然変異タンパク質と共に１時間培養した。さらに、細胞の一定分量を、空気中５％ＣＯ２の加湿大気中で３７℃で１時間培地のみで培養した。続いて、ヒト組換えＩＬ−４またはＩＬ−１３を、それぞれ０．８ｎｇ／ｍｌまたは１２ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、培養物を、空気中５％ＣＯ２の加湿大気中で３７℃で１０分間インキュベートした。
細胞は、４２μｌの３７％ホルムアルデヒド（１．５％の最終濃度）の添加によって室温（ＲＴ）で１０分間固定し、５ｍｌ丸底ポリスチレンチューブ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に移した。細胞を１％ＦＣＳを含有する２ｍｌＰＢＳ（ＰＢＳ−ＦＣＳ）を用いて洗浄し、５分間１２００ｒｐｍで遠心分離によってペレット化し、上清を捨てた。細胞は、勢いよくボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）する間に５００μｌ氷冷メタノールを添加することによって透過処理した。４℃での１０分間のインキュベーションの後、細胞を２ｍｌのＰＢＳ−ＦＣＳを用いて５分間１２００ｒｐｍで遠心分離によって２回洗浄した。細胞は、１００μｌのＰＢＳ−ＦＣＳ中に再懸濁させ、光から保護して、ＲＴで３０分間、２０μｌの抗リン酸化ＳＴＡＴ−６フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗体（クローンＹ６４１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色した。最後に、細胞は、５分間１２００ｒｐｍで遠心分離によって２ｍｌのＰＢＳ−ＦＣＳを用いて２回洗浄し、５００μｌのＰＢＳ−ＦＣＳ中で再懸濁させた。細胞は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ血球計算器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーによって分析した。データは、少なくとも１００００個のゲート細胞から収集した。
ＴＦ−１細胞中でのＩＬ−４およびＩＬ−１３媒介性のＳＴＡＴ−６リン酸化を阻害するためのＩＬ−４受容体アルファ特異的突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（配列番号５）およびＳ１９１．４ Ｋ１９（配列番号６）の能力をフローサイトメトリーによって測定した。ゲートは、細胞サイズ（前方散乱；ＦＳＣ）および細胞粒度（側方散乱；ＳＳＣ）に基づいて、コントロールＴＦ−１細胞（非刺激および非染色）を使用して、ＦＬ２値（チャネル２ 蛍光；ＰＥ強度）に基づいて９９％のコントロール非染色集団を除外するために無処置細胞に設定した。非刺激細胞のさらなる一定分量を抗リン酸化ＳＴＡＴ−６ ＰＥ標識抗体を用いて染色した。
ＳＴＡＴ−６リン酸化アッセイの結果は、ＩＬ−４受容体アルファ特異的突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４およびＳ１９１．４ Ｋ１９がＴＦ−１細胞中でＩＬ−４およびＩＬ−１３誘発性のＳＴＡＴ−６リン酸化を著しく阻害するといったことを明らかに示す（データを表３に要約）。表３では、ＩＬ−４およびＩＬ−１３によってＴＦ細胞中で誘発されたＳＴＡＴ−６−リン酸化を阻害するＳ１９１．４ Ｂ２４およびＳ１９１．４ Ｋ１９（配列番号５および６）の能力をフローサイトメトリーによって測定し、ＳＴＡＴ−６リン酸化についてポジティブに染まったゲート細胞の百分率およびすべてのゲート細胞の中央値の蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。
Figure 0005608368
（実施例１２：抗ヒトＩＬ−４受容体アルファ突然変異タンパク質はカニクイザル末梢血リンパ球に対して交差反応する）
健常なヒトボランティアからの全血を９ｍｌリチウムヘパリンチューブ中にＡｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ（Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ、ＵＫ）の臨床薬理部（ＣＰＵ）によって収集した。カニクイザル由来のヘパリン処理した全血の試料（最低２匹の動物からプール）は、Ｈａｒｌａｎ Ｓｅｒａ−Ｌａｂ（Ｂｉｃｅｓｔｅｒ、ＵＫ）またはＢ ａｎｄ Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｔｄ（Ｈｕｌｌ、ＵＫ）から得た。
ヒトおよびカニクイザルの全血は、赤血球溶解バッファー（０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１．０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．４）を用いて１：５に希釈し、反転した後で１０分間室温でインキュベートした。細胞を５分間１２００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去した。細胞を溶解バッファー中に再懸濁させ、上清がヘモグロビンを含有しなくなるまで手順を繰り返した。細胞は、血液の元の容量と同じ容量の凍結培地（１：１０、ジメチルスルホキシド：ウシ胎仔血清）中に再懸濁させ、低温バイアルに移した。各バイアルは１ｍｌの血液からの細胞を含有した。細胞を−８０℃で一晩凍結させ、保管のために液体窒素に移した。
凍結した末梢血細胞を、３７℃で急速解凍し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／１％ ＦＣＳ）を用いて洗浄した。細胞ペレットは、ＦＡＣＳバッファー（１ｍｌバッファー／バイアル）中に再懸濁させた。１００μｌの一定分量を９６ウェル丸底プレート中に置き、１００μｌのＦＡＣＳバッファーをウェル当たりに添加し、プレートを４℃で５分間１２００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨てた。続いて、細胞を低い速度でボルテックスすることにより再懸濁させ、１００μｌの希釈した一次抗体（抗ＣＤ１２４もしくはＩｇＧ１アイソタイプコントロール、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１０μｇ／ｍｌ）または抗ＩＬ−４受容体アルファ突然変異タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、細胞を３０分間氷上でインキュベートした。細胞を、１００μｌ ＦＡＣＳバッファーの添加および４℃での５分間の１２００ｒｐｍでの遠心分離によって一度洗浄し、上清を捨て、細胞を低い速度でボルテックスすることによって再懸濁させた。これは、細胞を洗浄するために２００μｌのＦＡＣＳバッファーを使用してもう２回繰り返した。最後の遠心分離の後、細胞ペレットを、５μｇ／ｍｌの適切な二次抗体の１００μｌ中に再懸濁させ（ビオチン化抗ヒトリポカリン−１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはビオチン化ラット抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ））、細胞を３０分間氷上でインキュベートした。細胞を、４℃での５分間の１２００ｒｐｍでの遠心分離によって１００μｌのＦＡＣＳバッファー中で一度洗浄し、上清を捨て、細胞を低い速度でボルテックスすることによって再懸濁させた。２回のさらなる洗浄を、２００μｌのＦＡＣＳバッファーおよび４℃での５分間の１２００ｒｐｍでの遠心分離を使用して行った。最後の遠心分離の後、細胞ペレットは、１００μｌの検出試薬（フィコエリトリン［ＰＥ］標識ストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；１．２５μｇ／ｍｌ）中に再懸濁させ、暗中で氷上で３０分間インキュベートした。先のような３回のさらなる洗浄ステップの後、細胞を、２００μｌ ＦＡＣＳバッファー中に採取し、４０×６ｍｍ試験管に移し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ血球計算器を使用してフローサイトメトリーによって分析した。コントロール細胞は非染色とした。非染色コントロール細胞を使用して、無処置リンパ球細胞のゲートを細胞サイズ（前方散乱；ＦＳＣ）および細胞粒度（側方散乱；ＳＳＣ）に設定した（Ｃｈｒｅｓｔ，Ｆ．Ｊ．ら（１９９３）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｎｔｉ−ＣＤ３ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ Ｇ０ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １４：８８３〜９０）。この領域は同日に分析した試料の間で変更しなかった。マーカーは、コントロール非染色集団でのＦＬ２（チャネル２ 蛍光；ＰＥ強度）値に基づいて、ＩＬ−４受容体アルファ＋およびＩＬ−４受容体アルファ−集団を区別するために設けた；マーカー１（Ｍ１）ＩＬ−４Ｒα＋細胞は非染色集団の９９％の排除に基づいて設定した。各試料について、少なくとも１×１０４個の細胞からのデータを取得した。
突然変異タンパク質Ｓ１９１．５ Ｋ１２、Ｓ．１４８．３ Ｊ１４−ＡＭ２Ｃ２、Ｓ．１９１．４ Ｂ２４、Ｓ．１９１．４ Ｋ１９、およびＳ．１９７．８ Ｄ２２（配列番号３〜６および８）は、カニクイザルリンパ球に対して高度なレベルで結合することを表し、ＩＬ−４受容体アルファ＋細胞は６１％および８０％の間で変動し、ＭＦＩ値は６．０および９．２の間で変動した（表２）。変異体Ｓ．１９１．５ Ｈ１６（配列番号７）もカニクイザルリンパ球に特異的に結合するが、残りの突然変異タンパク質と比較して親和性は低下する（４１％ＩＬ−４受容体アルファ＋細胞；ＭＦＩ値４．１）。
並行して、これらのＩＬ−４受容体アルファ特異的突然変異タンパク質が１人のヒトドナーからの末梢血リンパ球に結合する能力もフローサイトメトリーによって分析した。すべての抗ＩＬ−４受容体アルファ突然変異タンパク質は、ｐＴＬＰＣ１０ネガティブコントロールについて観察されたレベルよりもかなりより高度なレベルでヒト細胞に結合することを示した。ＩＬ−４受容体アルファ＋細胞は６０％および７６％の間で変動し、ＭＦＩ値は７．４および９．７の間で変動した。ｐＴＬＰＣ１０ネガティブコントロールを用いて染色した細胞は低レベルの非特異的結合を表し、９％の細胞がＩＬ−４受容体アルファ＋として記録され、ＭＦＩ値は３．２であった。突然変異タンパク質Ｓ１９１．５ Ｋ１２、Ｓ．１９１．４ Ｂ２４、およびＳ．１９１．４ Ｋ１９（配列番号 ３、５、および６）は、第２のヒトドナーの末梢血リンパ球に対して類似する結合親和性を表した（データ示さず）。表４は、フローサイトメトリーによって分析した、ＩＬ−４受容体アルファ特異的突然変異タンパク質がヒトおよびカニクイザルの末梢血リンパ球に結合する能力を示し、ＩＬ−４受容体アルファについてポジティブに染まったゲート細胞の百分率およびすべてのゲート細胞の中央値の蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
Figure 0005608368
（実施例１３：ヒトＶＥＧＦに対する親和性を有するＴｌｃ突然変異タンパク質のファージミド提示および選択）
実施例１から得られたファージミドを利用するファージミドディスプレイおよび選択は、次の改変を伴って、実施例２に記載されるように本質的に行った：標的タンパク質、つまりヒトＶＥＧＦ−Ａの組換え断片（ＶＥＧＦ８〜１０９、成熟ポリペプチド鎖のアミノ酸８〜１０９）を２００ｎＭの濃度で利用し、ビオチン化タンパク質としてファージミドライブラリーに提示し、メーカーの指示に従ってストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使用するファージ−標的複合体の捕捉を続けた。４回の選択を行った。
標的タンパク質は、発現ベクターｐＥＴ１１ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中へのヒトＶＥＧＦ Ａ（ＳＷＩＳＳ ＰＲＯＴデータバンク受入番号Ｐ１５６９２）の成熟ポリペプチド鎖のアミノ酸８〜１０９をコードする核酸を導入することによって得た。したがって、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩの制限部位を、ヒトＶＥＧＦ断片のｃＤＮＡの３’および５’端にそれぞれ導入し、ＶＥＧＦ遺伝子断片のサブクローニングに使用した。
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を結果として生じる発現プラスミドを用いて形質転換し、ＶＥＧＦ８〜１０９の細胞質内産生は、３７℃での３時間のＩＰＴＧを有するアンピシリン含有ＬＢ培地中での発現培養物の誘発の後で達成した。２０分間の５０００ｇでの遠心分離の後、細胞ペレットを培養ブロスの各２ｌについて２００ｍｌＰＢＳ中に再懸濁させ、一晩にわたる−２０℃でのインキュベーション前に１０分間５０００ｇでさらに遠心分離した。５００ｍｌ培養ブロスから得た各細胞ペレットを２０ｍｌ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁させ、１０秒間４回、氷上で超音波処理した。４℃での１００００ｇでの１０分間の遠心分離の後に、封入体は、１５ｍｌの事前に冷やしたＩＢバッファー（２Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ）を用いて可溶化し、超音波処理し、上記のように遠心分離した。その後、細胞ペレットは２０ｍｌ ＩＢバッファーを用いて可溶化し、２５ｍｌ可溶化バッファー（７．５Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＤＴＴ）中での可溶化前に上記のようにさらに遠心分離した。細胞懸濁液は外界温度で２時間撹拌し、４℃で１５分間４００００ｇで遠心分離し、組換えＶＥＧＦを含有する上清を濾過した（０．４５μｍ）。リフォールディングは、５ｌバッファー１（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭシステイン）に対して一晩にわたる外界温度での透析（３．５ｋＤａ分子量カットオフ）、その後に続く５ｌバッファー２（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１ｍＭシステイン）に対する透析および５ｌバッファー３（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４））を用いた２回の続く透析ステップによって達成された。遠心分離（４００００ｇ、２０分間、４℃）および濃縮の後、組換えＶＥＧＦ断片は、続くイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５）による標準の方法論に従って精製した。
（実施例１４：ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーンを使用する、ＶＥＧＦ結合突然変異タンパク質の同定）
実施例１３で得られたＴｌｃ突然変異タンパク質のスクリーニングは、実施例１１から得た組換え標的タンパク質ＶＥＧＦ８〜１０９を５μｇ／ｍｌで利用し、マイクロタイタープレートに直接コートしたといった改変を伴って、実施例３に記載されるように本質的に行った。合計して２１２４個のクローンのスクリーニングは、９７２個の初代ヒットの同定につながり、ライブラリーからの突然変異タンパク質の単離がうまく行われたことを示す。このアプローチを使用して、Ｔｌｃ突然変異タンパク質Ｓ１６８．４−Ｌ０１（配列番号２６）を同定した。
（実施例１５：エラープローンＰＣＲを使用するＴ１ｃ突然変異タンパク質Ｓ１６８．４−Ｌ０１の親和性成熟）
突然変異タンパク質Ｓ１６８．４−Ｌ０１に基づいた変異体のライブラリーの生成は、オリゴヌクレオチドＴＬ５０ｂｉｏ（配列番号１５）およびＴＬ５１ｂｉｏ（配列番号１６）を使用して、実施例４に記載されるように本質的に行い、平均で構造遺伝子当たり５つの置換を有するライブラリーがもたらされた。
ファージミド選択は、限られた標的濃度（１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．２ｎＭ ＶＥＧＦ８〜１０９）または標的濃度の制限を伴うもしくは伴わない（１０ｎＭ、１００ｎＭ）短いインキュベーション時間（１および５分間）を使用して、実施例１３に記載されるように実行した。４回の選択を行った。
（実施例１６：ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーンを使用するＶＥＧＦ結合突然変異タンパク質の親和性スクリーニング）
実施例１５で選択された突然変異タンパク質のスクリーニングは、モノクローナル抗Ｔ７タグ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）は産生された突然変異タンパク質を捕捉するためにＥＬＩＳＡプレート上にコートし、捕捉されたＴｌｃ突然変異タンパク質に対するビオチン化ＶＥＧＦ８〜１０９（５００ｎＭおよび５０ｎＭ）の結合はＨＲＰコンジュゲートＥｘｔｒａｖｉｄｉｎを使用して検出したといった改変を伴って、実施例１４に記載されるように行った。
多くのクローンは、親和性成熟のためのベースとして貢献した突然変異タンパク質Ｓ１６８．４−Ｌ０１と比較して、改善された親和性を有するとして同定された。このアプローチを使用して、クローンＳ２０９．２−Ｃ２３、Ｓ２０９．２−Ｄ１６、Ｓ２０９．２−Ｎ９、Ｓ２０９．６−Ｈ７、Ｓ２０９．６−Ｈ１０、Ｓ２０９．２−Ｍ１７、Ｓ２０９．２−Ｏ１０（配列番号２７〜３３）を同定した。
（実施例１７：ＶＥＧＦ結合突然変異タンパク質の産生）
産生は実施例７に記載されるように本質的に行った。
（実施例１８：Ｂｉａｃｏｒｅを利用するＶＥＧＦ特異的突然変異タンパク質の親和性決定）
親和性測定値は、約２５０ＲＵの組換えＶＥＧＦが標準のアミンの化学的性質を使用してセンサーチップに直接つながれた改変を伴って、実施例８に記載されるように本質的に行った。実施例１５から得た４０μｌのＴｌｃ突然変異タンパク質を４００ｎＭの濃度で注入した。
突然変異タンパク質Ｓ２０９．２−Ｃ２３、Ｓ２０９．２−Ｄ１６、Ｓ２０９．２−Ｎ９、Ｓ２０９．６−Ｈ７、Ｓ２０９．６Ｈ１０、Ｓ２０９．２−Ｍ１７、およびＳ２０９．２−Ｏ１０（配列番号２７〜３３）の親和性決定からの結果を表５に要約する。表５は、２５℃でのＢｉａｃｏｒｅ測定によって決定される、ＶＥＧＦに対する本発明の選択された突然変異タンパク質の親和性を示す。
Figure 0005608368
（実施例１９：阻害ＥＬＩＳＡを使用するＶＥＧＦのアンタゴニストの同定）
ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）の間の相互作用の阻害を阻害ＥＬＩＳＡで評価した。このために、一定濃度のビオチン化ＶＥＧＦ８〜１０９（１ｎＭ）を希釈系列のそれぞれのＴｌｃ突然変異タンパク質とインキュベートし、非占有ＶＥＧＦ−Ｒ２結合部位を有するＶＥＧＦの量を、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ−Ｒ２相互作用に干渉する抗ＶＥＧＦ抗体（ＭＡＢ２９３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をコートしたＥＬＩＳＡで定量化した。結合したＶＥＧＦはＨＲＰコンジュゲートＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を使用して検出し、ＶＥＧＦの規定量の標準曲線と比較した。突然変異タンパク質Ｓ２０９．２−Ｃ２３、Ｓ２０９．２−Ｄ１６、Ｓ２０９．２−Ｎ９、Ｓ２０９．６−Ｈ７、Ｓ２０９．６−Ｈ１０、Ｓ２０９．２−Ｍ１７、およびＳ２０９．２−Ｏ１０（配列番号２７〜３３）を利用する測定からの結果を表６に要約する。表６は、競合ＥＬＩＳＡによって決定される、本発明の選択された涙リポカリン突然変異タンパク質のアンタゴニスト能力およびＶＥＧＦに対する親和性を示す。
Figure 0005608368
（実施例２０：ＨＵＶＥＣ増殖アッセイを使用するＶＥＧＦアンタゴニストの同定）
ＶＥＧＦおよびＦＧＦ−２刺激ＨＵＶＥＣ細胞増殖の阻害は、次の改変を伴って、以前に記載されるように本質的に判定した（Ｋｏｒｈｅｒｒ Ｃ．、Ｇｉｌｌｅ Ｈ、Ｓｃｈａｆｅｒ Ｒ．、Ｋｏｅｎｉｇ−Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｋ．、Ｄｉｘｅｌｉｕｓ Ｊ．、Ｅｇｌａｎｄ Ｋ．Ａ．、Ｐａｓｔａｎ Ｉ．、およびＢｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）１０３（１１）４２４０〜４２４５）：ＨＵＶＥＣ細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）はメーカーの推奨に従って成長させ、継代２および６の間に使用した。１日目、１，４００個の細胞を完全培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）中に接種した。翌日、細胞を洗浄し、０．５％ＦＣＳ、ヒドロコルチゾン、およびゲンタマイシン／アンホテリシンを含有するが他の栄養剤を含有しない基本培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を添加した。ＶＥＧＦ特異的突然変異タンパク質Ｓ２０９．２−Ｃ２３、Ｓ２０９．２−Ｄ１６、Ｓ２０９．２−Ｎ９、Ｓ２０９．６−Ｈ７、Ｓ２０９．６−Ｈ１０、Ｓ２０９．２−Ｍ１７、Ｓ２０９．２−Ｏ１０（配列番号２７〜３３）、野生型涙リポカリン（ｐＴＬＰＣ１０の遺伝子産物；コントロール）、またはＶＥＧＦ特異的治療モノクローナル抗体Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ；コントロール）を３通りのウェル中に示す濃度で希釈系列で添加し、３０分後、ヒトＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはヒトＦＧＦ−２（Ｒｅｌｉａｔｅｃｈ）を添加した。細胞の生存率を、メーカーの指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて６日後に判定した。
突然変異タンパク質Ｓ２０９．２−Ｃ２３、Ｓ２０９．２−Ｄ１６、Ｓ２０９．２−Ｎ９、Ｓ２０９．６−Ｈ７、Ｓ２０９．６−Ｈ１０、Ｓ２０９．２−Ｍ１７、およびＳ２０９．２−Ｏ１０（配列番号２７〜３３）を利用する測定からの結果を図２１に示す。本発明のすべての突然変異タンパク質は、ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ誘発性の増殖の著しい阻害を示し、これはＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）誘発性の阻害に匹敵するまたはそれよりも優れているが、野生型涙リポカリンはＶＥＧＦ誘発性の細胞増殖を阻害しない。ＦＧＦ−２誘発性細胞増殖は、ＶＥＧＦ特異的突然変異タンパク質、ＴＬＰＣ１０、またはＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）のうちのいずれによっても影響を与えられない（示さず）。
（実施例２１：ＶＥＧＦ−Ｒ２に対するＴｌｃ突然変異タンパク質のファージミド提示および選択）
実施例１から得られたファージミドを利用するファージミドディスプレイおよび選択は、次の改変を伴って、実施例２に記載されるように本質的に行った：標的タンパク質ＶＥＧＦ−Ｒ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２００ｎＭの濃度で利用し、Ｆｃ融合タンパク質としてライブラリーに提示し、メーカーの指示に従ってプロテインＧビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使用するファージ−標的複合体の捕捉を続けた。４回の選択を行った。
（実施例２２：ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーンを使用するＶＥＧＦ−Ｒ２結合突然変異タンパク質の同定）
スクリーニングは、標的タンパク質ＶＥＧＦ−Ｒ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２．５μｇ／ｍｌの濃度で使用したといった改変を伴って実施例３に記載されるように本質的に行った。
実施例２１に記載される手順から得られた１４１６個のクローンのスクリーニングは、５９３個のプライマリーヒットの同定につながり、本発明のライブラリーからの突然変異タンパク質の単離がうまく行われたことを示す。このアプローチを使用して、突然変異タンパク質Ｓ１７５．４ Ｈ１１（配列番号３４）を同定した。
（実施例２３：エラープローンＰＣＲを使用するＶＥＧＦ−Ｒ２特異的突然変異タンパク質Ｓ１７５．４ Ｈ１１の親和性成熟）
突然変異タンパク質Ｓ１７５．４ Ｈ１１に基づいた変異体のライブラリーの生成は、オリゴデオキシヌクレオチドＴＬ５０ｂｉｏ（配列番号１５）およびＴＬ５１ｂｉｏ（配列番号１６）を使用して、実施例４に記載されるように本質的に行い、平均で構造遺伝子当たり２つの置換を有するライブラリーがもたらされた。
ファージミド選択は、限られた標的濃度（ＶＥＧＦ−Ｒ２−Ｆｃの５ｎＭ、１ｎＭ、および０．２ｎＭ）、競合組換えＶＥＧＦ８〜１０９（１００ｎＭ）の存在下での洗浄時間の延長（１時間）、または標的濃度の制限を伴うもしくは伴わない（１０ｎＭ、１００ｎＭ）短いインキュベーション時間（２および５分間）を使用して実施例２１に記載されるように実行した。４回の選択を行った。
（実施例２４：ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーンを使用するＶＥＧＦ−Ｒ２結合突然変異タンパク質の親和性スクリーニング）
スクリーニングは、モノクローナル抗Ｔ７タグ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）を産生されたＴｌｃ突然変異タンパク質を捕捉するためにＥＬＩＳＡプレート上にコートし、捕捉された突然変異タンパク質へのＶＥＧＦ−Ｒ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３ｎＭおよび１ｎＭ）の結合をＶＥＧＦ−Ｒ２−ＦｃのＦｃドメインに対するＨＲＰコンジュゲート抗体を使用して検出したといった改変を伴って、実施例３に記載されるように行った。
多くのクローンは、親和性成熟のためのベースとして貢献した突然変異タンパク質Ｓ１７５．４ Ｈ１１と比較して、改善された親和性を有するとして同定された。このアプローチを使用して、クローンＳ１９７．７−Ｎ１、Ｓ１９７．２−Ｉ１８、Ｓ１９７．２−Ｌ２２、Ｓ１９７．７−Ｂ６、およびＳ１９７．２−Ｎ２４（配列番号３５〜３９）を同定した。
（実施例２５：ＶＥＧＦ−Ｒ２結合突然変異タンパク質の産生）
産生は実施例７に記載されるように本質的に行った。
（実施例２６：Ｂｉａｃｏｒｅを使用するＶＥＧＦ−Ｒ２特異的突然変異タンパク質の親和性決定）
親和性測定は、約５００ＲＵのＶＥＧＦ−Ｒ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を捕捉したといった改変を伴って実施例８に記載されるように本質的に行い、８０μｌの突然変異タンパク質を１．５μＭの濃度で注入した。
Ｓ１７５．４−Ｈ１１、Ｓ１９７．７−Ｎ１、Ｓ１９７．２−Ｉ１８、Ｓ１９７．２−Ｌ２２、Ｓ１９７．７−Ｂ６、およびＳ１９７．２−Ｎ２４（配列番号３５〜３９）を利用する測定からの結果を表７に要約する。表７は、Ｂｉａｃｏｒｅ測定によって決定される、ＶＥＧＦ−Ｒ２に対する本発明の選択された突然変異タンパク質の親和性を示す。
Figure 0005608368
（実施例２７：阻害ＥＬＩＳＡを使用するＶＥＧＦのアンタゴニストの同定）
ＶＥＧＦ−Ｒ２特異的突然変異タンパク質による、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｒ２の間の相互作用の阻害を阻害ＥＬＩＳＡで評価した。したがって、一定濃度のＶＥＧＦ−Ｒ２（４ｎＭ ＶＥＧＦ−Ｒ２−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を希釈系列のそれぞれの突然変異タンパク質とインキュベートし、非占有ＶＥＧＦ結合部位を有するＶＥＧＦ−Ｒ２の量をＶＥＧＦ８〜１０９をコートしたＥＬＩＳＡで定量化した。結合したＶＥＧＦ−Ｒ２はＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＦｃ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を使用して検出し、ＶＥＧＦ−Ｒ２−Ｆｃの特定量の標準曲線と比較した。Ｓ１７５．４−Ｈ１１、Ｓ１９７．７−Ｎ１、Ｓ１９７．２−Ｉ１８、Ｓ１９７．２−Ｌ２２、Ｓ１９７．７−Ｂ６、およびＳ１９７．２−Ｎ２４（配列番号３５〜３９）の測定からの結果を表８に要約する。表８は、競合ＥＬＩＳＡによって決定される、本発明の選択された涙リポカリン突然変異タンパク質のアンタゴニスト能力およびＶＥＧＦ−Ｒ２に対する親和性を示す。
Figure 0005608368
（実施例２８：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた、ＩＬ−４受容体アルファ特異的突然変異タンパク質の部位特異的修飾）
不対システイン残基は、活性化ＰＥＧとつなぐための反応基を提供するために、ＩＬ−４受容体アルファ特異的突然変異タンパク質Ｓ１４８．３ Ｊ１４（配列番号２）の位置１３１のアミノ酸Ｇｌｕの代わりに点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）によって導入した。遊離Ｃｙｓ残基を保有する組換え突然変異タンパク質を、実施例７に記載されるように大腸菌中で続いて産生した。
ＰＥＧとの突然変異タンパク質Ｓ１４８．３ Ｊ１４のつながりについては、５．１ｍｇポリエチレングリコールマレイミド（平均分子量２０ｋＤａ、線状炭素鎖；ＮＯＦ）をＰＢＳ中で３ｍｇのタンパク質と混合し、外界温度で３時間撹拌した。反応は、８５μＭの最終濃度までのベータ−メルカプトエタノールの添加によって停止した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対する透析の後、反応混合物をＨｉＴｒａｐ Ｑ−ＸＬ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にかけ、通過した物を捨てた。ＰＥＧ化突然変異タンパク質は、０ｍＭ〜１００ｍＭのＮａＣｌの直線塩勾配にかけながら溶出し、未反応タンパク質から分離した。
（実施例２９：Ｂｉａｃｏｒｅを使用する、ＰＥＧ化突然変異タンパク質Ｓ１４８．３ Ｊ１４の親和性測定）
親和性測定は、約５００ＲＵのＩＬ−４受容体アルファ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を固定化し、８０μｌの精製されたＰＥＧ化突然変異タンパク質を２００ｎＭ、６７ｎＭ、および２２ｎＭの濃度で注入したといった改変を伴って、実施例８に記載されるように本質的に行った。測定の結果を図２２に表し、表９に要約する。そのＰＥＧ化形態（約３０ｎＭ）の突然変異タンパク質Ｓ１４８．３ Ｊ１４の親和性は、ＰＥＧ化されていない突然変異タンパク質（約３７ｎＭ、実施例８を参照されたい）と比較してほとんど不変である。表９は、Ｂｉａｃｏｒｅによって決定される、ＩＬ−４受容体アルファに対する本発明のＰＥＧ化突然変異タンパク質Ｓ１４８．３ Ｊ１４の親和性を示す。
Figure 0005608368
（実施例３０：部位特異的ランダムアプローチを使用する突然変異タンパク質Ｓ２０９．６−Ｈ１０の親和性成熟）
突然変異タンパク質Ｓ２０９．６−Ｈ１０（配列番号３０）に基づいた変異体のライブラリーは、位置２６、６９、７６、８７、８９、および１０６のランダム化によって設計し、これらの位置ですべての２０種のアミノ酸を考慮した。ライブラリーは、デオキシヌクレオチドＴＬ１０７（カバー位置２６）、ＴＬ１０９（カバー位置８７および８９）、ＴＬ１１０（カバー位置１０６）、ならびにＴＬ１１１（カバー位置６９および７６）を、ＴＬ４６、ＴＬ４７、ＴＬ４８、ならびにＴＬ４９の代わりにそれぞれ使用したといった改変を伴って、実施例１に記載されるように本質的に構築した。ファージミド選択は、限られた標的濃度（ＶＥＧＦ８〜１０９の１０ｐＭおよび２ｐＭおよび０．５ｐＭ）を使用してまたはＶＥＧＦに対する競合的モノクローナル抗体（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））と組み合わせて、実施例１３に記載されるように本質的に実行した。４回の選択を行った。
ＴＬ１０７（配列番号４０）：ＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＧＧＡＣＮＮＳＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＣＴＣ
ＴＬ１０９（配列番号４１）：ＧＧＣＣＡＴＣＧＧＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＧＣＡＮＮＳＡＴＣＮＮＳＡＧＧＴＣＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣ
ＴＬ１１０（配列番号４２）：ＣＡＣＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＣＣＣＣＳＮＮＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＧ
ＴＬ１１１（配列番号４３）：ＣＣＣＣＣＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＴＡＳＮＮＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＴＳＮＮＣＡＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＣ
（実施例３１：ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーニングを使用するＶＥＧＦ結合突然変異タンパク質の親和性スクリーニング）
スクリーニングは、１μｇ／ｍｌ ＶＥＧＦの濃度を使用したといった修飾ならびに
ｉ）モノクローナル抗Ｔ７タグ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）は産生された突然変異タンパク質を捕捉するためにＥＬＩＳＡプレート上にコートし、涙リポカリンの捕捉された突然変異タンパク質へのビオチン化ＶＥＧＦ（３ｎＭおよび１ｎＭ）の結合はＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲートｅｘｔｒａｖｉｄｉｎを使用して検出したといった追加を伴って、実施例１４に記載されるように行った。さらに、代替スクリーニング設定では、
ｉｉ）ヒトＶＥＧＦ８〜１０９の代わりに、マウスＶＥＧＦ１６４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をマイクロタイタープレート（１μｇ／ｍｌ）に直接コートした。
ｉｉｉ）ＶＥＧＦ結合突然変異タンパク質を含有する抽出物を１時間で６０℃に加熱した。
ｉｖ）ｍＡＢ２９３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、５μｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡプレート上にコートし、ビオチン化ＶＥＧＦ８〜１０９を発現突然変異タンパク質とプレインキュベートした。ｍＡＢ２９３へのＶＥＧＦ８〜１０９の結合は、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲートｅｘｔｒａｖｉｄｉｎを使用して検出した。
多くのクローンは、親和性成熟のためのベースとして貢献した突然変異タンパク質Ｓ２０９．６−Ｈ１０と比較して、改善された親和性を有するとして同定された。このアプローチを使用して、クローンＳ２３６．１−Ａ２２、Ｓ２３６．１−Ｊ２０、Ｓ２３６．１−Ｍ１１、およびＳ２３６．１−Ｌ０３（配列番号４４〜４７）を同定した。
これに関連して、本発明の突然変異タンパク質中の涙リポカリンの最初の４つのアミノ酸の欠失のために、アミノ酸配列は、涙リポカリンの委託された野生型涙リポカリン配列の配列位置５（アラニン）から開始して表され、このためＡｌａ５がＮ末端アミノ酸として表されることに注目されたい。さらに、野生型涙リポカリンのＣ末端アミノ酸Ａｓｐ１５８はアラニン残基と交換される（配列番号４４〜４７の残基１５４、配列番号２６〜４０等の本発明の他の突然変異タンパク質も参照されたい）。さらに実施例１のナイーブライブラリーの構築のために涙リポカリンのＣ末端に融合されるＳＴＲＥＰ−ＴＡＧ（登録商標）ＩＩを有する突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２、Ｓ２３６．１−Ｊ２０、Ｓ２３６．１−Ｍ１１、およびＳ２３６．１−Ｌ０３のアミノ酸配列を配列番号５２（Ｓ２３６．１−Ａ２２−ｓｔｒｅｐ）、配列番号５３（Ｓ２３６．１−Ｊ２０−ｓｔｒｅｐ）、配列番号５４（Ｓ２３６．１−Ｍ１１−ｓｔｒｅｐ）、および配列番号５５（Ｓ２３６．１−Ｌ０３−ｓｔｅｐ）に示す。これはまた、示された突然変異した位置／突然変異以外に、ＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦ−Ｒ２またはインターロイキン４受容体アルファ鎖（ＩＬ−４受容体アルファ）等の所与の標的に特異的に結合するための能力を有するそれぞれの突然変異タンパク質を提供するのに必要である、本発明の涙リポカリン突然変異タンパク質の配列の変異性を示す。
（実施例３２：ＶＥＧＦ結合突然変異タンパク質の産生）
産生は実施例７に記載されるように本質的に行った。
（実施例３３：Ｂｉａｃｏｒｅを利用するＶＥＧＦ特異的突然変異タンパク質の親和性決定）
親和性測定は実施例１８に記載されるように本質的に行った（固定化されたＶＥＧＦ８〜１０９へのヒト涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）の結合のＢｉａｃｏｒｅ測定を示す図２３も参照されたい）。手短かに言えば、ＶＥＧＦ８〜１０９は標準のアミンの化学的性質を使用してＣＭ５チップ上に固定化した。リポカリン突然変異タンパク質は、５００ｎＭ〜１６ｎＭの６つの濃度で３０μｌ／分の流速で加えた。センサーグラムの評価は、それぞれの突然変異タンパク質のＫｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを決定するためにＢＩＡ Ｔ１００ソフトウェアを用いて行った。表１０は、２５℃でのＢｉａｃｏｒｅ測定によって決定される、ＶＥＧＦに対する本発明の選択された突然変異タンパク質の親和性を示す。
Figure 0005608368
（実施例３４：阻害ＥＬＩＳＡを使用するＶＥＧＦのアンタゴニストの同定）
ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）の間の相互作用の阻害は、１時間のインキュベーション時間を１０分間に減らした改変を伴って、本質的に実施例１９に記載されるように阻害ＥＬＩＳＡで評価した。阻害定数を下表１１に要約する。表１１は、競合ＥＬＩＳＡによって決定される、本発明の選択された涙リポカリン突然変異タンパク質のアンタゴニスト能力およびＶＥＧＦに対する親和性を示す。
Figure 0005608368
（実施例３５：Ｂｉａｃｏｒｅを使用する、ＶＥＧＦ特異的突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２の交差反応性の決定）
親和性測定は、突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）をセンサーチップ上に固定化したといった改変を伴って実施例１８に記載されるように本質的に行った。７０μｌの試料を２５０ｎＭの濃度で注入した。
図２４に示される結果の定性的比較は、切断された形態ｈＶＥＧＦ８〜１０９およびｈＶＥＧＦ１２１が基本的に同一のセンサーグラムを示すことを示し、涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）に対する親和性が類似していることを示す。スプライス形態ｈＶＥＧＦ１６５もリポカリン突然変異タンパク質に対する強い結合を示すが、それぞれのマウスオルソログｍＶＥＧＦ１６４は親和性がわずかに低下している。アイソフォームＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄならびに関連するタンパク質ＰＩＧＦは、この実験で結合しないことを示す（データ示さず）。
（実施例３６：ＣＤ分光法の使用によるＶＥＧＦ結合突然変異タンパク質の熱変性の決定）
円二色性測定は、使用した波長を２２８ｎＭとする改変を伴って国際特許出願ＷＯ２００６／０５６４６４号の実施例１４に記載されるように本質的に行った。例えば、涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）の融解温度Ｔｍは、７５℃であると決定された。
（実施例３７：Ｓ２３６．１−Ａ２２の安定性試験）
ＰＢＳおよびヒト血清中での３７℃でのＶＥＧＦ結合突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２の安定性は、利用した濃度を１ｍｇ／ｍｌとしたことを除いて、国際特許出願ＷＯ２００６／０５６４６４の実施例１５に記載されるように本質的に試験した。突然変異タンパク質の変化は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって判断されるようにＰＢＳ中での７日間のインキュベーション期間の間に検出することができなかった（データ示さず）。ヒト血清中のリポカリン突然変異タンパク質のインキュベーションは、基準と比較しておよそ７０％まで７日後に親和性の低下をもたらした（図２５ａも参照されたい）。
（実施例３８：アルブミン結合ドメインとの抗ＶＥＧＦ突然変異タンパク質の融合）
血清半減期延長目的については、抗ＶＥＧＦ突然変異タンパク質をアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）とＣ末端で融合した。発現に使用した遺伝子構築物をｐＴＬＰＣ５１＿Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号５０）と名付けた。（図２６を参照されたい）
ＶＥＧＦ特異的突然変異タンパク質−ＡＢＤ融合物またはＴｌｃ−ＡＢＤ（コントロールとして）の調製用の産生は、実施例７に記載されるように本質的に行った。
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用する親和性測定は実施例１８に記載されるように本質的に行った。組換えＶＥＧＦに対する涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２のＡＢＤ融合物（Ａ２２−ＡＢＤ）（配列番号５１）（２００ｐＭ）の親和性は基本的に変化がないことがわかり、２６０ｐＭであると測定された（図２７を参照されたい）。
さらに、ＡＢＤドメインの完全性は、約８５０ＲＵのヒト血清アルブミンを標準のアミンの化学的性質を使用してセンサーチップに直接つないだ改変を伴って、実施例８に記載されるものと同じ方法によって試験した。６０μｌの突然変異タンパク質−ＡＢＤ融合物（Ａ２２−ＡＢＤ（配列番号５１）または野生型Ｔｌｃ−ＡＢＤ（配列番号４９））を５００ｎＭの濃度で注入した。それらの親和性はおよそ２０ｎＭであると測定された。
ヒト血清中のＳ２３６．１−Ａ２２のＡＢＤ融合物（配列番号５１）の安定性は実施例３７に記載されるように本質的に試験した。活性の損失は７日間のインキュベーション期間の間に検出することができなかった。（図２５ｂを参照されたい）。
ヒト血清アルブミンの存在下でのリポカリン突然変異タンパク質Ａ２２−ＡＢＤ（Ｓ２３６．１−Ａ２２のＡＢＤ融合物）の機能性は、ＶＥＧＦ誘発性のＨＵＶＥＣ増殖を阻害するためのその能力によって試験した。アッセイは、示される場合にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、５μＭ）を添加したことを除いて、実施例３９に記載されるように行った。５μＭ ＨＳＡで、＞９９．８％のＡ２２−ＡＢＤは、ＨＳＡに対するＡ２２−ＡＢＤのナノモルの親和性により、任意の所与の時間にＨＳＡと結合する（図２８を参照されたい）。ＩＣ５０値は以下のとおりに決定された：
Ｓ２３６．１−Ａ２２−ＡＢＤ ＩＣ５０：７６０ｐＭ
Ｓ２３６．１−Ａ２２−ＡＢＤ（＋ＨＳＡ）ＩＣ５０：４７０ｐＭ
（実施例３９：ＶＥＧＦ誘発性のＨＵＶＥＣ増殖の阻害）
ＨＵＶＥＣ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）はゼラチンをコートした皿上で増し、継代Ｐ２およびＰ８の間に使用した。１日目、１４００個の細胞を、完全培地中に９６ウェルプレート中にウェル毎に接種した。２日目、細胞を洗浄し、０．５％ＦＣＳ、ヒドロコルチゾン、およびゲンタマイシン／アンホテリシンを含有する１００μｌの基本培地を添加した。増殖は、リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）と混合し、３０分間インキュベートし、ウェルに添加した２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ１６５または１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２を用いて刺激した。生存率は６日目に決定し、結果は阻害％として表現する。ＩＣ５０値は以下のとおりに決定された（図２９も参照されたい）。ＦＧＦ−２媒介性の刺激はＶＥＧＦアンタゴニストによって影響を与えられなかった（データ示さず）。
Ｓ２３６．１−Ａ２２ ＩＣ５０：０．５１ｎＭ
Ａｖａｓｔｉｎ ＩＣ５０：０．５６ｎＭ
（実施例４０：ＨＵＶＥＣ中でのＶＥＧＦ媒介性のＭＡＰキナーゼ活性化の阻害）
ＨＵＶＥＣは、標準の培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）中にウェル当たり１，４００個の細胞で９６ウェルプレート中に接種した。翌日、ＦＣＳを０．５％に低下させ、培養を１６時間継続した。次いで、細胞を５時間基本培地中０．５％ＢＳＡ中で飢餓状態にした。ＨＵＶＥＣは、用量応答曲線を得るために、増加性の濃度の涙リポカリン突然変異タンパク質Ａ２２またはＡｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）の存在下で１０分間ＶＥＧＦ１６５（Ｒｅｌｉａｔｅｃｈ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）を用いて刺激した。ＭＡＰキナーゼＥＲＫ１およびＥＲＫ２のリン酸化は、メーカーのマニュアル（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）に従ってＥＬＩＳＡを使用して定量化した。ＩＣ５０値は突然変異タンパク質Ａ２２（配列番号４４）について４．５ｎＭおよびＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）について１３ｎＭであると決定された（図３０を参照されたい）。
（実施例４１：涙リポカリン突然変異タンパク質の局所投与を用いた血管透過性アッセイ）
体重が３５０±５０ｇのＤｕｎｃａｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモットは、肩および背を剪毛した。動物は、１ｍｌの１％Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅ色素の耳静脈を介しての静脈内注射を受けた。３０分後、２０ｎｇ ＶＥＧＦ１６５（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を１０倍のモル過剰で試験物質またはコントロール物と混合し、３×４グリッド上に皮内に注射した。３０分後、動物はＣＯ２窒息によって安楽死させた。ＶＥＧＦ注射の１時間後に、グリッドパターンを含有する皮膚を摘出し、結合組織をきれいにした。色素血管外遊出のエリアは、画像解析器（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ １．３、Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）の使用によって定量化した（図３１を参照されたい）。
（実施例４２：ＣＡＭ（ヒヨコ漿尿膜）アッセイ）
示されるようにＦＧＦ−２（５００ｎｇ）、ＶＥＧＦ（１５０ｎｇ）、および涙リポカリン突然変異タンパク質（１．３５μｇ）またはＡｖａｓｔｉｎ（１０μｇ）を含有するコラーゲンオンプラント（ｏｎｐｌａｎｔ）を１０日目のニワトリ胚（４つ／動物、１０匹の動物／グループ）のＣＡＭの上に置いた。２４時間目に、涙リポカリン突然変異タンパク質またはＡｖａｓｔｉｎを同じ用量でオンプラントに局所的に再び適用した。７２時間後に、オンプラントを収集し、画像を保存した。少なくとも１つの血管を含有するポジティブグリッドの百分率を盲検化した観察者によって決定した。中央値の血管形成指数は、ＶＥＧＦアンタゴニストであるＳ２０９．２−Ｏ１０（配列番号３３）およびＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）ならびに陽性グリッドの画分としての野生型涙リポカリンコントロールについて報告する（図３２を参照されたい）。
（実施例４３：マウス中のＡ２２およびＡ２２−ＡＢＤについての薬物動態（ＰＫ）パラメーターの決定）
ｉ．ｖ．の後の涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ２３６．１ Ａ２２（配列番号４４）（４ｍｇ／ｋｇ）およびｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．単一ボーラス投与の後でのＡＢＤとの突然変異タンパク質Ｓ２３６．１ Ａ２２の融合タンパク質（配列番号５１）（５．４ｍｇ／ｋｇ）についての薬物動態（ＰＫ）パラメーター（半減期血漿濃度、生物学的利用率）をＮＭＲＩマウスで決定した。血漿は、事前に決めた時点で採取した末端血液試料から調製し、リポカリン突然変異タンパク質の濃度はＥＬＩＳＡによって決定した。結果は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＵＳＡ）を使用して分析した。Ｔ１／２ Ａ２２ ｉ．ｖ．：０．４２時間；Ｔ１／２ Ａ２２−ＡＢＤ ｉ．ｖ．：１８．３２時間；Ｔ１／２ Ａ２２−ＡＢＤ ｉ．ｐ．：２０．８２時間。融合タンパク質Ａ２２−ＡＢＤのｉ．ｐ．投与の後での生物学的利用率は８２．５％であった（図３３を参照されたい）。
（実施例４４：涙リポカリン突然変異タンパク質の全身投与を用いた血管透過性アッセイ）
実験の１２時間前に、試験物質またはコントロールをグループ当たり３匹の動物に静脈内に注射した。グループ１：ＰＢＳ媒体；グループ２：Ａｖａｓｔｉｎ、１０ｍｇ／ｋｇ；グループ３：突然変異タンパク質Ｓ２３６．１ Ａ２２−ＡＢＤ、６．１ｍｇ／ｋｇ；グループ４：ＴＬＰＣ５１：６．１ｍｇ／ｋｇ。時間＝０に、Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅを注射した。３０分後に、４つの用量のＶＥＧＦ（５、１０、２０、または４０ｎｇ）を３×４グリッド上に皮内に３通り注射した。ＶＥＧＦ注射の３０分後に、動物を犠牲死させ、色素血管外遊出を上記のように定量化した（図３４を参照されたい）。
（実施例４５：腫瘍異種移植モデル）
照射（２．５Ｇｙ、Ｃｏ６０）スイスヌードマウスは、右側腹部中に、マトリゲル中の１×１０７ Ａ６７３横紋筋肉腫細胞（ＡＴＴＣ）を皮下に接種した（グループ当たりｎ＝１２）。治療薬を腹腔内に投与し、同日に開始し、２１日間継続した。グループ１：ＰＢＳ媒体、毎日；グループ２：Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、５ｍｇ／ｋｇ、３日毎；グループ３：突然変異タンパク質Ａ２２−ＡＢＤ（配列番号５１）、毎日、３．１ｍｇ／ｋｇ；グループ４：ＴＬＰＣ５１、毎日、３．１ｍｇ／ｋｇ。リポカリンＡ２２−ＡＢＤの用量は、マウスでのＡ２２−ＡＢＤ ＰＫデータおよび抗体の推算された血清半減期に基づいて突然変異タンパク質およびＡｖａｓｔｉｎのＶＥＧＦ結合部位の等モル数が一定に存在することを達成するように選んだ。腫瘍サイズはカリパスを用いて毎週２回測定し、腫瘍量は式（長さ×幅２）／２によって推算した。腫瘍量が２，０００ｍｍ３を超過した場合に、マウスを犠牲死させた（図３５を参照されたい）。
（実施例４６：リポカリン突然変異タンパク質−Ｃｙｓ変異体のスクリーニング）
例えば活性化ＰＥＧとつなぐための反応基を提供するために、不対システイン残基を部位特異的突然変異誘発によって導入した。遊離Ｃｙｓ残基を保有する組換え突然変異タンパク質を、実施例７に記載されるように大腸菌中で続いて産生し、発現収量を決定し、親和性を実施例１４に記載されるようにＥＬＩＳＡによって本質的に測定した。
例示的に、ＶＥＧＦ特異的突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）のＣｙｓスクリーニングからの結果を下表に示す。システインは、次のオリゴヌクレオチドを使用してアミノ酸Ｔｈｒ４０、Ｇｌｕ７３、Ａｓｐ９５、Ａｒｇ９０、およびＧｌｕ１３１の代わりに導入した。表１２は、ＥＬＩＳＡによって決定される、ＶＥＧＦに対する突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２およびそのＴｈｒ４０→Ｃｙｓ（配列番号６６）、Ｇｌｕ７３→Ｃｙｓ（配列番号６７）、Ａｓｐ９５→Ｃｙｓ（配列番号６８）、Ａｒｇ９０→Ｃｙｓ（配列番号６９）、およびＧｌｕ１３１→Ｃｙｓ（配列番号７０）突然変異体の親和性を示す。
Ａ２２＿Ｄ９５Ｃフォワード：ＧＡＧＧＴＣＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＧＧ（配列番号５６）、
Ａ２２＿Ｄ９５Ｃリバース：ＣＣＴＣＡＧＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＧＴＡＧＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＣＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣ（配列番号５７）、
Ａ２２＿Ｔ４０Ｃフォワード：ＧＧＧＴＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＴＣＡＣＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＧ（配列番号５８）、
Ａ２２＿Ｔ４０Ｃリバース：ＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＡＧＧＣＡＣＧＴＧＧＧＴＡＴＣＡＣＣＧＡＣＣＣ（配列番号５９）、
Ａ２２＿Ｅ７３Ｃフォワード：ＣＣＧＴＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＡＣＴＧＡＴＴＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＧ（配列番号６０）、
Ａ２２＿Ｅ７３Ｃリバース：ＣＣＧＴＧＴＡＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＣＧＧ（配列番号６１）、
Ａ２２＿Ｅ１３１Ｃフォワード：ＧＣＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＴＧＴＡＡＡＧＣＣＧＣＡＧＧＡＧ（配列番号６２）、
Ａ２２＿Ｅ１３１Ｃリバース：ＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＡＣＡＡＡＡＧＴＣＣＴＣＣＡＡＧＧＣ（配列番号６３）、
Ａ２２＿Ｒ９０Ｃフォワード：ＣＧＴＧＧＣＡＡＡＧＡＴＣＧＧＧＴＧＣＴＣＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＣ（配列番号６４）、および
Ａ２２＿Ｒ９０Ｃリバース：ＧＧＴＣＣＴＴＣＡＣＧＴＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＧＡＴＣＴＴＴＧＣＣＡＣＧ（配列番号６５）。
Figure 0005608368
（実施例４７：エオタキシン−３分泌アッセイ）
エオタキシン−３分泌アッセイを７２時間にわたってＡ５４９細胞上で行った。Ａ５４９細胞等の肺上皮細胞は、ＩＬ−４／ＩＬ−１３刺激に際してエオタキシン−３を分泌する。したがって、Ａ５４９細胞は、増加性の濃度のＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（配列番号４）を用いて処理し、それぞれ０．７ｎＭ ＩＬ−４または０．８３ｎＭ ＩＬ−１３を用いて刺激した。エオタキシン−３分泌は市販のサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して７２時間後に判定した。結果（図３６）は、ＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４が、それぞれ３２および５．１ｎＭのＩＣ５０値で、Ａ５４９細胞中でＩＬ−４およびＩＬ−１３媒介性のエオタキシン−３分泌を阻害することを実証する（表１３）。表１３は、Ａ５４９細胞中でのＩＬ−４およびＩＬ−１３媒介性のエオタキシン−３分泌に対するＳ１９１．４ Ｂ２４のＩＣ５０値を示す。
Figure 0005608368
（実施例４８：末梢血単核細胞上でのＩＬ−４／ＩＬ−１３媒介性のＣＤ２３誘発）
全ヒトＰＢＭＣをバッフィーコートから単離した。ＰＢＭＣを、増加性の濃度のＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４を用いて処理し、ＩＬ−４またはＩＬ−１３を、それぞれ、１．０ｎＭおよび２．５ｎＭの最終濃度まで添加した。ＰＢＭＣを１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地中で４８時間培養した。細胞を抗ＣＤ１４−ＦＩＴＣ抗体および抗ＣＤ２３−ＰＥ抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。各時点について、すべてのＣＤ１４ポジティブ単球の中からのダブルポジティブ細胞の百分率を決定し、突然変異タンパク質濃度の関数としてプロットした。
得られた結果から、単球上でのＩＬ−４およびＩＬ−１３媒介性のＣＤ２３発現を阻害するための突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４のＩＣ５０値を算出した（表１４）。表１４は、ＰＢＭＣ中でのＩＬ−４およびＩＬ−１３媒介性のＣＤ２３発現に対するＳ１９１．４ Ｂ２４のＩＣ５０値を示す。
Figure 0005608368
（実施例４９：ＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４の親和性についてのＳｃｈｉｌｄ分析）
Ｓｃｈｉｌｄ分析は、突然変異タンパク質の仮定された競合的結合モードを確かめ、かつ細胞上でのＫｄを決定するために実行した。ＴＦ−１細胞は、固定濃度のＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（０、４．１、１２．３、３７、１１１．１、３３３．３、または１０００ｎＭ）を用いて処理し、ＩＬ−４を用いて滴定し、細胞生存率を４日後に判定した（図３８Ａ）。ＥＣ５０値を非線形回帰によって決定した。得られた結果の従来のＳｃｈｉｌｄ分析（図３８Ｂ）から１９２ｐＭのＫｄを得（線形回帰）、より正確な非線形回帰から１１６ｐＭを得た。１．０８４のＳｃｈｉｌｄの傾きは拮抗的阻害を示す、つまり、突然変異タンパク質およびＩＬ−４はＩＬ−４受容体アルファ結合について競合する。
（実施例５０：初代Ｂ細胞への突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４のピコモルの結合）
ＰＢＭＣをヒト血液から単離し、異なる濃度のＩＬ−４受容体アルファ結合ヒト涙リポカリン突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４または野生型ヒト涙リポカリン（ＴＬＰＣ２６）と共にインキュベートした。次いで、細胞は、抗ＣＤ２０−ＦＩＴＣモノクローナル抗体およびビオチン化抗リポカリン抗血清、その後ストレプトアビジン−ＰＥを用いて染色した。野生型リポカリンおよびＩＬ−４受容体アルファ結合リポカリン突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４についての結果を図３９ＡおよびＢにそれぞれ示す。ＰＥポジティブＢ細胞について決定した百分率をリポカリン突然変異タンパク質の濃度に対してあてはめ（図３９Ｃ）、ＥＣ５０を得られた曲線から算出した。ＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４（配列番号４）の初代Ｂ細胞への結合についてのＥＣ５０は１０５ｐＭとして算出された。
（実施例５１：皮下および気管内投与の後の突然変異タンパク質の生物学的利用率）
ＩＬ−４受容体アルファ結合突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４の生物学的利用率は、ラットでの４ｍｇ／ｋｇのボーラス注射（ｂｏｌｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）の後に４時間、突然変異タンパク質Ｓ１９１．４ Ｂ２４の血漿濃度を監視することによって、静脈内、皮下、または気管内投与の後に決定した。気管内投与は、シリンジに付けられた長く薄いチューブの先端からのエアロゾルを生成する、市販で入手可能な気管内投薬デバイス（ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（登録商標）、Ｐｅｎｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｉｎｃ、Ｐｈｉｌｉａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使用して実行した。エアロゾルサイズは約２０μｍとした。非コンパートメント薬物動態（ＰＫ）分析の結果は、皮下注射に際しての１００％の生物学的利用率および抗体とは対照的に、ヒト涙リポカリン突然変異タンパク質の肺送達は実現可能なように思われることを実証する。得られた結果を表１５に示す。表１５は、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、および気管内（ｉ．ｔ．）投与の後のＳ１９１．４ Ｂ２４の半減期および生物学的利用率を示す。
Figure 0005608368
（実施例５２：ＨＵＶＥＣ増殖アッセイを使用する、ＰＥＧ化ＶＥＧＦアンタゴニストのｉｎ ｖｉｔｒｏ作用強度）
ＶＥＧＦ刺激ＨＵＶＥＣ細胞増殖の阻害は、次の改変を伴って実施例２０に記載されるように本質的に判定した：ＶＥＧＦ特異的突然変異タンパク質Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）は、上記実施例２８に記載されるように、位置９５ＣでＰＥＧ２０、ＰＥＧ３０、またはＰＥＧ４０につないだ。突然変異タンパク質、そのＰＥＧ化誘導体、および野生型涙リポカリン（ｐＴＬＰＣ２６の遺伝子産物；コントロールとして）をＶＥＧＦ１６５に希釈系列で添加し、室温で３０分間インキュベートした。混合物を３通りのウェル中のＨＵＶＥＣ細胞に添加して、示されるように２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦの最終濃度ならびに０．００３ｎＭおよび２，０００ｎＭの間の濃度を得た。細胞の生存率を、メーカーの指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて６日後に判定した。
前述の突然変異タンパク質を利用する測定からの結果を図４１に示す。Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）およびそのＰＥＧ化誘導体は、付けられたＰＥＧ成分の分子量が減少すると共にＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ誘発性の増殖の著しい阻害を示したが、野生型涙リポカリンはＶＥＧＦ誘発性の細胞増殖を阻害しない（表１６）。表１６は、ＨＵＶＥＣ細胞増殖阻害についての、Ｓ２３６．１−Ａ２２（配列番号４４）およびＰＥＧ２０、ＰＥＧ３０、またはＰＥＧ４０を用いてＰＥＧ化したその誘導体のＩＣ５０値を示す。
Figure 0005608368
本明細書に例証的に記載される本発明は、本明細書に特に開示されていない任意の１つまたは複数のエレメント、１つまたは複数の限定の非存在下で適切に実施されてもよい。したがって、例えば用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は、広範囲にかつ限定を伴うことなく解釈されるものとする。さらに、本明細書で利用される用語および表現は、説明の用語として使用され、限定するものではない。また、そのような用語および表現の使用に、示され、かつ記載される特徴のあらゆる等価物またはその部分を除外する意図はないが、種々の改変は主張される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態および任意の特徴によって特に開示されるが、本明細書に開示された、そこに具体化された本発明の改変および変形は当業者らによって採られてもよく、そのような改変および変形は本発明の範囲内であると考えられることを理解されたい。本発明は広く包括的に本明細書に記載されている。属の開示の範囲内であるそれぞれの下位の種および亜属のグループ分けも本発明の一部を形成する。これは、属から任意の主題を除去する条件のまたはその負の限定を有する本発明の属の説明を、削除された物質が本明細書に特に詳述されているかどうかにかかわらず含む。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループに関して記載される場合、当業者らは、本発明がまた、それによって、マーカッシュグループのあらゆる個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関して記載されることを認識するであろう。本発明のさらなる実施形態は次の請求項から明白になるであろう。

Claims (88)

  1. ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに検出可能な結合親和性で結合する、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質を生成するための方法であって、
    （ａ）ヒト涙リポカリンをコードする核酸分子を、天然の成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置２６〜３４、５６〜５８、８０、８３、１０４〜１０６および１０８のうちのいずれかの少なくとも１２個のコドンでの突然変異誘発にさらすことにより、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質をコードする複数の核酸を得るステップであって、前記成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の配列位置６１および１５３でシステイン残基をコードするコドンの少なくとも１つが、任意の他のアミノ酸残基をコードするように突然変異されているステップ、
    （ｂ）（ａ）で得られた１つまたは複数の突然変異タンパク質核酸分子を発現系において発現させることより、１つまたは複数の突然変異タンパク質を得るステップ、および
    （ｃ）（ｂ）で得られた、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに対する検出可能な結合親和性を有する前記１つまたは複数の突然変異タンパク質を選択するステップ、
    を含む方法。
  2. 成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、５６、５７、５８、８０、８３、１０４、１０５、１０６および１０８のコドンの１８個すべてが突然変異されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置６１および１５３をコードするコドンの少なくとも１つが、位置６１でアラニン、フェニルアラニン、リシン、アルギニン、トレオニン、アスパラギン、チロシン、メチオニン、セリン、プロリンもしくはトリプトファンおよび／または位置１５３でセリンもしくはアラニンをコードするように突然変異されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置１１１および１１４をコードするコドンが位置１１１でアルギニンおよび位置１１４でトリプトファンをコードするように突然変異されることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列の位置１０１でシステインをコードするコドンが任意の他のアミノ酸をコードするように突然変異されることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の位置１０１でシステインをコードするコドンがセリンをコードするように突然変異されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. ステップ（ｃ）が、
    （ａ）免疫学的ハプテン、ペプチド、タンパク質または他の高分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）の特徴を示す遊離形態またはコンジュゲート形態の化学化合物から成る群から選択される化合物を所与のリガンドとして提供し、
    （ｂ）前記リガンドと、前記リガンドに対する結合親和性を有する突然変異タンパク質との複合体の形成を可能にするために、前記複数の突然変異タンパク質を前記リガンドと接触させ、および
    （ｃ）結合親和性を有していないまたは実質的に有していない突然変異タンパク質を除去する、
    ことをさらに含むことを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記リガンドがタンパク質またはその断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）であることを特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の方法。
  9. ステップ（ｃ）における前記選択を競合的条件下で実行することを特徴とする請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
  10. 少なくとも１つの突然変異タンパク質を所与のリガンドの結合について選択するために、突然変異誘発によって得られ、ヒト涙リポカリンの前記複数の突然変異タンパク質をコードする核酸を、Ｍ１３ファミリーの糸状バクテリオファージのコートタンパク質ｐＩＩＩまたはこのコートタンパク質の断片をコードする遺伝子と３’端で作動可能に融合することを特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 請求項１ないし請求項１０のいずれか１項に記載の方法によって入手可能であり、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに対して検出可能な結合親和性を有するヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質。
  12. ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに対して検出可能な結合親和性を有するヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質において、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）涙リポカリンの配列位置６１および１５３に存在する少なくとも１つのシステイン残基が他のアミノ酸と交換され、少なくとも１２個の突然変異したアミノ酸残基が成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列の配列位置２６〜３４、５６〜５８、８０、８３、１０４〜１０６および１０８のうちのいずれかに存在することを特徴とする突然変異タンパク質。
  13. 配列位置２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、５６、５７、５８、８０、８３、１０４、１０５、１０６および１０８の１８個すべてで突然変異したアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項１１または請求項１２に記載の突然変異タンパク質。
  14. アミノ酸置換Ｃｙｓ６１→Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、ＰｒｏまたはＴｒｐ、およびＣｙｓ１５３→ＳｅｒまたはＡｌａの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１１ないし請求項１３のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  15. Ａｒｇ１１１→ＰｒｏおよびＬｙｓ１１４→Ｔｒｐから選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項１１ないし請求項１４のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  16. 成熟ヒト涙リポカリンの前記配列の位置１０１でシステイン残基のアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする請求項１１ないし請求項１５のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  17. 突然変異Ｃｙｓ１０１→Ｓｅｒを含むことを特徴とする請求項１６に記載の突然変異タンパク質。
  18. 酵素、タンパク質もしくはタンパク質ドメイン、ペプチド、シグナル配列、および／またはアフィニティータグにそのＮ末端またはそのＣ末端で作動可能に融合されることを特徴とする請求項１１ないし請求項１７のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  19. 突然変異タンパク質の血清半減期を延長する成分（ｍｏｉｅｔｙ）に融合されることを特徴とする請求項１１ないし請求項１８のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  20. 前記血清半減期を延長する成分が、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミンまたはアルブミン断片、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質およびトランスフェリンから成る群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の突然変異タンパク質。
  21. 前記アルブミン結合タンパク質が、細菌アルブミン結合タンパク質、アルブミンに対する抗体もしくは抗体断片、またはアルブミンに対する結合活性を有するリポカリン突然変異タンパク質であることを特徴とする請求項２０に記載の突然変異タンパク質。
  22. 前記細菌アルブミン結合タンパク質が連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインであることを特徴とする請求項２１に記載の突然変異タンパク質。
  23. 前記アルブミン結合ペプチドが式Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓを有し、Ｘａａ１がＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり；Ｘａａ２がＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；Ｘａａ３がＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；Ｘａａ４がＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒであることを特徴とする請求項２０に記載の突然変異タンパク質。
  24. 有機分子、酵素標識（ｌａｂｅｌ）、放射性標識、蛍光性標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、コロイド金および突然変異タンパク質の血清半減期を延長する成分から成る群から選択される標識にコンジュゲートされることを特徴とする請求項１１ないし請求項１７のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  25. 前記血清半減期を延長する成分が、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸または他の脂肪酸分子、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミンまたはアルブミン断片、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質およびトランスフェリンから成る群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の突然変異タンパク質。
  26. 前記アルブミン結合タンパク質が、細菌アルブミン結合タンパク質またはアルブミンに対する結合活性を有するリポカリン突然変異タンパク質であることを特徴とする請求項２５に記載の突然変異タンパク質。
  27. 前記細菌アルブミン結合タンパク質が連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインであることを特徴とする請求項２６に記載の突然変異タンパク質。
  28. 前記ポリアルキレングリコールがポリエチレン（ＰＥＧ）またはその活性化誘導体であることを特徴とする請求項２５に記載の突然変異タンパク質。
  29. 前記アルブミン結合ペプチドが式Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓを有し、Ｘａａ１がＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり；Ｘａａ２がＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；Ｘａａ３がＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；Ｘａａ４がＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒであることを特徴とする請求項２５に記載の突然変異タンパク質。
  30. 前記非天然リガンドがタンパク質またはその断片であることを特徴とする請求項１１ないし請求項２９のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  31. 前記タンパク質またはその断片が、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）およびインターロイキン４受容体アルファ鎖（ＩＬ−４受容体アルファ）の群から選択されることを特徴とする請求項３０に記載の突然変異タンパク質。
  32. 前記タンパク質がＩＬ−４受容体アルファであることを特徴とする請求項３１に記載の突然変異タンパク質。
  33. 前記タンパク質がヒトＩＬ−４受容体アルファであることを特徴とする請求項３２に記載の突然変異タンパク質。
  34. 前記タンパク質がＩＬ−４受容体アルファの細胞外領域またはドメインであることを特徴とする請求項３２または請求項３３に記載の突然変異タンパク質。
  35. ＩＬ−４アンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項３２ないし請求項３４のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  36. ヒトＩＬ−４のアンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項３５に記載の突然変異タンパク質。
  37. ＩＬ−１３アンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項３２ないし請求項３６のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  38. ヒトＩＬ−１３のアンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項３７に記載の突然変異タンパク質。
  39. カニクイザルＩＬ−４受容体アルファと交差反応することを特徴とする請求項３２ないし請求項３８のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
  40. 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して位置２６〜３４、５６〜５８、８０、８３、１０４〜１０６および１０８のうちのいずれかでのシステイン残基による天然のアミノ酸の少なくとも２つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項３２ないし請求項３９のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  41. ＩＬ−４受容体アルファの細胞外領域またはドメインに２００ｎＭ以下のＫＤで結合することを特徴とする請求項３２から４０のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
  42. ＩＬ−４受容体アルファの細胞外領域またはドメインに１００ｎＭ以下のＫＤで結合することを特徴とする請求項４１に記載の突然変異タンパク質。
  43. ＩＬ−４受容体アルファの細胞外領域またはドメインに２０ｎＭ以下のＫＤで結合することを特徴とする請求項４２に記載の突然変異タンパク質。
  44. ＩＬ−４受容体アルファの細胞外領域またはドメインに１ｎＭ以下のＫＤで結合することを特徴とする請求項４３に記載の突然変異タンパク質。
  45. 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して少なくとも１２個のアミノ酸置換を含み、そのアミノ酸置換が、Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ，Ｐｒｏ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ，Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ａｓｐ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｔｈｒ，Ａｒｇ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ，Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，Ｌｙｓ，Ｔｙｒ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；およびＬｙｓ１０８→Ｇｌｎから成る群から選択されることを特徴とする請求項３２ないし請求項４４のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  46. Ｍｅｔ３９→Ｖａｌ；Ｔｈｒ４２→Ｍｅｔ，Ａｌａ；Ｔｈｒ４３→Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，Ａｌａ；Ｇｌｕ４５→Ｌｙｓ，Ｇｌｙ；Ａｓｎ４８→Ａｓｐ，Ｈｉｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｖａｌ５３→Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｉｌｅ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ；Ｔｈｒ５４→Ａｌａ，Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５５→Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ；Ｇｌｕ６３→Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ａｒｇ；Ｖａｌ６４→Ｇｌｙ，Ｔｙｒ，Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｌｅｕ，Ａｓｎ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ，Ｉｌｅ；Ａｌａ６６→Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ；Ｇｌｕ６９→Ｌｙｓ，Ｇｌｙ；Ｌｙｓ７０→Ａｒｇ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ；Ｔｈｒ７８→Ａｌａ；Ｉｌｅ８９→Ｖａｌ；Ａｓｐ９５→Ａｓｎ，Ａｌａ，Ｇｌｙ；ａｎｄＴｙｒ１００→Ｈｉｓから成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする請求項４５に記載の突然変異タンパク質。
  47. アミノ酸置換：Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；ａｎｄＬｙｓ１０８→Ｇｌｎを含むことを特徴とする請求項４５または請求項４６に記載の突然変異タンパク質。
  48. アミノ酸置換の次のセット：
    （１）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ；
    （２）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｌｙｓ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ａｓｎ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ；
    （３）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ，Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ；
    （４）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ；
    （５）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｈｉｓ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ａｌａ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ；
    （６）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ；および
    （７）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ａｒｇ；Ｐｈｅ２８→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ａｌａ；Ａｓｎ３２→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｒｇ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｎ
    のうちの１つを含むことを特徴とする請求項４５ないし請求項４７のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  49. 配列番号２〜８またはその断片もしくは変異体のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３２ないし請求項４８のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  50. 配列番号５またはその断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項４９に記載の突然変異タンパク質。
  51. 配列番号６またはその断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項４９に記載の突然変異タンパク質。
  52. 前記リガンドがＶＥＧＦ−Ｒ２であることを特徴とする請求項３１に記載の突然変異タンパク質。
  53. 前記リガンドがＶＥＧＦ−Ｒ２の細胞外領域またはドメインであることを特徴とする請求項５２に記載の突然変異タンパク質。
  54. ＶＥＧＦアンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項５２または請求項５３に記載の突然変異タンパク質。
  55. ＶＥＧＦ−Ｒ２に２００ｎＭ以下のＫＤで結合することを特徴とする請求項５２ないし請求項５４のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  56. ＶＥＧＦ−Ｒ２に１００ｎＭ以下のＫＤで結合することを特徴とする請求項５５に記載の突然変異タンパク質。
  57. ＶＥＧＦ−Ｒ２に２０ｎＭ以下のＫＤで結合することを特徴とする請求項５６に記載の突然変異タンパク質。
  58. ＶＥＧＦ−Ｒ２に１ｎＭ以下のＫＤで結合することを特徴とする請求項５７に記載の突然変異タンパク質。
  59. 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して少なくとも１２個のアミノ酸置換を含み、そのアミノ酸置換が、Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３０→Ｓｅｒ；Ｍｅｔ３１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ３２→Ａｒｇ；Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３４→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ５６→Ｌｙｓ，Ｇｌｕ，Ａｌａ，Ｍｅｔ；Ｉｌｅ５７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ，Ｐｒｏ；Ｌｙｓ８３→Ｇｌｕ，Ｇｌｙ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ａｌａ；Ｈｉｓ１０６→Ｖａｌ；およびＬｙｓ１０８→Ｔｈｒから成る群から選択されることを特徴とする請求項５２ないし請求項５８のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  60. Ｌｅｕ４１→Ｐｈｅ；Ｇｌｕ６３→Ｌｙｓ，Ｖａｌ６４→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７２→Ｇｌｙ；Ｌｙｓ７６→Ａｒｇ，Ｇｌｕ；Ｉｌｅ８８→Ｖａｌ，Ｔｈｒ；Ｉｌｅ８９→Ｔｈｒ；Ａｒｇ９０→Ｌｙｓ；Ａｓｐ９５→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ９９→Ｌｅｕ；およびＧｌｙ１０７→Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｇｌｕから成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする請求項５９に記載の突然変異タンパク質。
  61. アミノ酸置換：Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３０→Ｓｅｒ；Ｍｅｔ３１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ３２→Ａｒｇ；Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３４→Ｔｙｒ；Ｉｌｅ５７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ；Ｌｙｓ８３→Ｇｌｕ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ａｌａ；Ｈｉｓ１０６→Ｖａｌ；およびＬｙｓ１０８→Ｔｈｒを含むことを特徴とする請求項５９または請求項６０に記載の突然変異タンパク質。
  62. アミノ酸置換の次のセット：
    （１）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３０→Ｓｅｒ；Ｍｅｔ３１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ３２→Ａｒｇ；Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３４→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ５６→Ｌｙｓ；Ｉｌｅ５７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ｇｌｕ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ａｌａ；Ｈｉｓ１０６→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１０８→Ｔｈｒ；
    （２）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３０→Ｓｅｒ；Ｍｅｔ３１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ３２→Ａｒｇ；Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３４→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ５７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ｇｌｕ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ａｌａ；Ｈｉｓ１０６→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１０８→Ｔｈｒ；
    （３）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３０→Ｓｅｒ；Ｍｅｔ３１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ３２→Ａｒｇ；Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３４→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ５６→Ａｌａ；Ｉｌｅ５７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ８３→Ｇｌｕ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ａｌａ；Ｈｉｓ１０６→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１０８→Ｔｈｒ；および
    （４）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３０→Ｓｅｒ；Ｍｅｔ３１→Ｇｌｙ；Ａｓｎ３２→Ａｒｇ；Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３４→Ｔｙｒ；Ｌｅｕ５６→Ｇｌｕ；Ｉｌｅ５７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ５８→Ａｒｇ；Ａｓｐ８０→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ８３→Ｇｌｕ；Ｇｌｕ１０４→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ１０５→Ａｌａ；Ｈｉｓ１０６→Ｖａｌ；Ｌｙｓ１０８→Ｔｈｒ．
    のうちの１つを含むことを特徴とする請求項５９ないし請求項６１のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  63. 配列番号３４〜３９のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項５２ないし請求項６２のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
  64. 前記リガンドがＶＥＧＦまたはその断片であることを特徴とする請求項３１に記載の突然変異タンパク質。
  65. ＶＥＧＦのその受容体への結合を阻害することによってＶＥＧＦアンタゴニストとして作用し、ＶＥＧＦに対する前記受容体はＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２およびニューロピリン−Ｉから成る群から選択されることを特徴とする請求項６４に記載の突然変異タンパク質。
  66. ＶＥＧＦに対する前記受容体がＶＥＧＦ−Ｒ２であることを特徴とする請求項６５に記載の突然変異タンパク質。
  67. ＶＥＧＦに２００ｎＭ以下のＫＤで結合することを特徴とする請求項６４ないし請求項６６のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  68. ＶＥＧＦに１００ｎＭ以下のＫＤで結合することを特徴とする請求項６７に記載の突然変異タンパク質。
  69. ＶＥＧＦに２０ｎＭ以下のＫＤで結合することを特徴とする請求項６８に記載の突然変異タンパク質。
  70. ＶＥＧＦに１ｎＭ以下のＫＤで結合することを特徴とする請求項６９に記載の突然変異タンパク質。
  71. 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して少なくとも１２個のアミノ酸置換を含み、そのアミノ酸置換が、Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ，Ｐｒｏ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５７→Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ａｓｎ，Ｓｅｒ；およびＬｙｓ１０８→Ａｌａ，Ｖａｌから成る群から選択されることを特徴とする請求項６４ないし請求項７０のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  72. Ｖａｌ３６→Ａｌａ；Ｔｈｒ３７→Ａｌａ，Ｉｌｅ；Ｍｅｔ３９→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ４０→Ａｌａ，Ｓｅｒ；Ａｓｎ４８→Ａｓｐ，Ａｌａ５１→Ｖａｌ；Ｌｙｓ５２→Ａｒｇ；Ｔｈｒ５４→Ｖａｌ；Ｍｅｔ５５→Ｖａｌ；Ｓｅｒ６１→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ６５→Ａｒｇ；Ａｌａ６６→Ｖａｌ；Ｖａｌ６７→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ６９→Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ７６→Ａｒｇ，Ｉｌｅ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ；Ｔｙｒ８７→Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ；Ｉｌｅ８９→Ｔｈｒ，Ｖａｌ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｍｅｔ，Ｌｙｓ；Ａｒｇ９０→Ｇｌｙ；Ｉｌｅ９８→Ｖａｌ；ａｎｄＧｌｙ１０７→Ｇｌｕから成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする請求項７１に記載の突然変異タンパク質。
  73. アミノ酸置換：Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；ａｎｄＬｙｓ１０８→Ｖａｌを含むことを特徴とする請求項７１または請求項７２に記載の突然変異タンパク質。
  74. アミノ酸置換の次のセット：
    （１）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
    （２）Ａｒｇ２６→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｇｌｕ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
    （３）Ａｒｇ２６→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ａｓｎ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
    （４）Ａｒｇ２６→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ａｒｇ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
    （５）Ａｒｇ２６→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
    （６）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
    （７）Ａｒｇ２６→Ｖａｌ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；
    （８）Ａｒｇ２６→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ；および
    （９）Ａｒｇ２６→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｌａ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ａｌａ；Ｇｌｕ３４→Ｇｌｙ；Ｌｅｕ５６→Ｈｉｓ；Ｓｅｒ５８→Ｌｙｓ；Ａｓｐ８０→Ｉｌｅ；Ｌｙｓ８３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ１０４→Ｃｙｓ；Ｈｉｓ１０６→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ１０８→Ｖａｌ
    のうちの１つを含むことを特徴とする請求項７１ないし請求項７３のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  75. 配列番号２６〜３３または４４〜４７のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項６４ないし請求項７４のいずれか１項に記載の突然変異タンパク質。
  76. 請求項１１ないし請求項７５のいずれかに記載の突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸分子。
  77. ベクター中に含まれることを特徴とする請求項７６に記載の核酸分子。
  78. ファージミドベクター中に含まれることを特徴とする請求項７７に記載の核酸分子。
  79. 請求項７６ないし請求項７８のいずれか１項に記載の核酸分子を含有することを特徴とする宿主細胞。
  80. 請求項１１ないし請求項３１のいずれか１項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
  81. 請求項３２ないし請求項５１のいずれか１項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
  82. 請求項５２ないし請求項７５のいずれか１項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
  83. 請求項１１ないし請求項７５のいずれかに記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質を産生するための方法であって、前記突然変異タンパク質を、細菌または真核生物の宿主生物中での遺伝子操作法によって該突然変異タンパク質をコードする核酸から開始して産生させ、この宿主生物またはその培養物から単離することを特徴とする方法。
  84. ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドを検出するための、請求項１１ないし請求項７５のいずれか１項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質の使用であって、
    （ａ）前記突然変異タンパク質を、前記所与のリガンドを含有していると思われる試料と適切な条件下で接触させることにより、前記突然変異タンパク質と前記所与のリガンドとの複合体の形成を可能にするステップ、および
    （ｂ）前記複合突然変異タンパク質を適切なシグナルによって検出するステップ、
    を含むことを特徴とする使用。
  85. ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドを分離するための、請求項１１ないし請求項７５のいずれか１項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質の使用であって、
    （ａ）前記突然変異タンパク質を、前記リガンドを含有すると推測される試料と適切な条件下で接触させることにより、前記突然変異タンパク質と前記所与のリガンドとの複合体の形成を可能にするステップ、および
    （ｂ）前記突然変異タンパク質／リガンド複合体を試料から分離するステップ、
    を含むことを特徴とする使用。
  86. 前記突然変異タンパク質／リガンド複合体が固形支持体上に結合されることを特徴とする請求項８４または請求項８５に記載の使用。
  87. 化合物をヒト以外の生物または組織中の事前に選択された部位にターゲティングするための、請求項１１ないし請求項７５のいずれか１項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質の使用であって、
    （ａ）前記突然変異タンパク質を前記化合物とコンジュゲートさせるステップ、および
    （ｂ）前記突然変異タンパク質／化合物複合体を事前に選択された部位に送達するステップ、
    を含むことを特徴とする使用。
  88. ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドとの複合体形成のための、請求項１１ないし請求項７５のいずれか１項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質の生体外での（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）使用。
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