JP6783797B2 - 抗がん融合ポリペプチド - Google Patents
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Description
HER2/neuはヒト上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーである。このがん遺伝子の増幅または過剰発現は、侵攻性が高い一定タイプの乳がんを含むさまざまな腫瘍の発生および進行に重要な役割を果たすことが示されている。HER2/neuは、腫瘍細胞上に、健常組織と比較してはるかに高い細胞表面密度で、著しく差次的に発現することが示されている。
(a)CD137に対する結合特異性、および
(b)HER2/neuに対する結合特異性
を有する融合ペプチドによってCD137と腫瘍抗原HER2/neuとに同時に会合する新規なアプローチを提供する。
以下の一覧では、本明細書の全体を通して使用される用語、語句、および略号を定義する。本明細書に列挙して定義する用語はいずれも、すべての文法形式を包含するものとする。
[本発明1001]
CD137にもHer2にも結合する能力を有する融合ポリペプチドであって、少なくとも2つのサブユニットを任意の順序で含み、第1サブユニットは完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含み、この第1結合ドメインはHER2に対する結合特異性を有し、かつ第2サブユニットはCD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含む、融合ポリペプチド。
[本発明1002]
融合ポリペプチドに含まれるCD137に特異的なリポカリンムテインと融合ポリペプチドとを本質的に実施例3に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、融合ポリペプチドに含まれるCD137に特異的なリポカリンムテインのEC50値と、少なくともほぼ同じかそれより優れたEC50値で、CD137に結合する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1003]
本質的に実施例3に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約1nMのEC50値でCD137に結合する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1004]
融合ポリペプチドに含まれるHER2/neuに特異的な免疫グロブリンと融合ポリペプチドとを本質的に実施例2に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、当該融合ポリペプチドに含まれるHER2/neuに特異的な免疫グロブリンのEC50値に匹敵するEC50値で、HER2/neuに結合する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1005]
本質的に実施例2に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約1nMのEC50値でHER2/neuに結合する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1006]
本質的に実施例4に記載するELISAアッセイにおいて測定した場合に、CD137およびHER2/neuに同時に結合する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1007]
本質的に実施例4に記載するELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約4nMのEC50値でCD137およびHER2/neuに同時に結合する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1008]
本質的に実施例5に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいてT細胞応答を共刺激する能力を有する、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1009]
本質的に実施例5に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、IL-2分泌およびT細胞増殖を誘発することができる、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1010]
本質的に実施例5に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞活性化の成功をもたらす、本発明1001の融合ポリペプチド。
[本発明1011]
前記ムテインが、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:18)の配列位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、本発明1001〜1010のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1012]
前記ムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:18)との比較において以下の変異アミノ酸残基:
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1011の融合ポリペプチド。
[本発明1013]
前記ムテインのアミノ酸配列が以下の組のアミノ酸置換:
のうちの1つを含む、本発明1011〜1012のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1014]
前記ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:32〜38からなる群またはそのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1011〜1013のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1015]
前記ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:32〜38からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有する、本発明1011〜1013のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1016]
前記ムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:17)の配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、本発明1001〜1010のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1017]
前記ムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:17)との比較において、以下の変異アミノ酸残基:
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1016の融合ポリペプチド。
[本発明1018]
前記ムテインのアミノ酸配列が、以下の組のアミノ酸置換:
のうちの1つを含む、本発明1016〜1017のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1019]
前記ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2および39〜46からなる群またはそのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1016〜1018のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1020]
前記ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2および39〜46からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有する、本発明1016〜1018のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1021]
1つのサブユニットが、本質的に図1に記載するように、ペプチド結合を介して別のサブユニットに連結されうる、本発明1001〜1020のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1022]
第1サブユニットと第2結合ドメインとが、第2サブユニットのリポカリンムテインのN末と第1サブユニットの免疫グロブリンの重鎖定常領域(CH)のC末との間のペプチド結合を介して連結されている、本発明1001〜1020のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1023]
第3サブユニットが、第3サブユニットのリポカリンムテインのN末と第1サブユニットの免疫グロブリンの軽鎖定常領域(CL)のC末との間でペプチド結合を介して第1サブユニットに連結されている、本発明1001〜1020のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1024]
ペプチド結合が、構造化されていない(G4S)3リンカーである、本発明1021〜1023のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1025]
SEQ ID NO:19に示すアミノ酸を含む、本発明1001〜1024のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1026]
リポカリンムテインがSEQ ID NO:2に示すアミノ酸を含む、本発明1001〜1025のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1027]
免疫グロブリンがモノクローナル抗体である、本発明1001〜1025のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1028]
モノクローナル抗体がトラスツズマブまたはペルツズマブである、本発明1001〜1025のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1029]
モノクローナル抗体がSEQ ID NO:3および4によって与えられる重鎖および軽鎖を有する、本発明1001〜1025のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1030]
モノクローナル抗体がIgG4バックボーンを有する、本発明1001〜1025のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1031]
IgG4バックボーンが、S228P、N297A、F234A、およびL235Aからなる群より選択される突然変異のうちのいずれか1つを有する、本発明1030の融合ポリペプチド。
[本発明1032]
SEQ ID NO:5および6に示すアミノ酸、SEQ ID NO:7および8に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:9および10に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:11および12に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:13および14に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:15および16に示すアミノ酸を含む、本発明1001〜1010のいずれかの融合ポリペプチド。
[本発明1033]
本発明1001〜1032のいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
[本発明1034]
核酸分子の発現を可能にする制御配列に機能的に連結されている、本発明1033の核酸分子。
[本発明1035]
ベクター中またはファージミドベクター中に含まれている、本発明1033または1034の核酸分子。
[本発明1036]
本発明1034〜1035のいずれかの核酸分子を含有する宿主細胞。
[本発明1037]
本発明1001〜1232のいずれかの融合ポリペプチドを生産する方法であって、融合ポリペプチドが、ムテインをコードする核酸から出発して、遺伝子工学的方法を使って生産される、方法。
[本発明1038]
融合ポリペプチドが細菌宿主細胞または真核宿主細胞中で生産され、かつ、この宿主生物またはその培養物から単離される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合(engage)するための、本発明1001〜1032のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
[本発明1040]
CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合するための、本発明1001〜1032のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
[本発明1041]
CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合する方法であって、本発明1001〜1032のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
[本発明1042]
T細胞を共刺激し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合する方法であって、本発明1001〜1032のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
[本発明1043]
Tリンパ球増殖を誘発し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合する方法であって、本発明1001〜1032のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
[本発明1044]
T細胞でのCD137クラスター化および活性化をHER2/neu陽性腫瘍細胞へ方向づける方法であって、本発明1001〜1032のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
[本発明1045]
HER2/neu陽性腫瘍細胞の近傍において局所的T細胞応答を誘発する方法であって、本発明1001〜1032のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
[本発明1046]
HER2/neu陽性腫瘍細胞の近傍において局所的NK細胞応答を誘発する方法であって、本発明1001〜1032のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
[本発明1047]
HER2/neu陽性腫瘍細胞の近傍においてT細胞によるIL-2および/またはIFNガンマの生産を誘発する方法であって、本発明1001〜1032のいずれかの融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、任意の順序で、少なくとも2つのサブユニット、すなわちHER2/neuに特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含む第1サブユニットと、CD137に特異的なリポカリンムテインを含む第2サブユニットとを含有する。
いくつかの態様では、融合ポリペプチドに関して、第1結合ドメインは、HER2/neuに特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含む。免疫グロブリンは、例えばIgG1またはIgG4でありうる。さらなる態様において、免疫グロブリンは、HER2/neuに対するモノクローナル抗体である。そのような免疫グロブリンの具体例をいくつか挙げると、トラスツズマブ(商品名Herclon、Herceptin)およびペルツズマブ(2C4とも呼ばれる、商品名Perjeta)がある。
本明細書にいう「リポカリン」は、複数(好ましくは4つ)のループにより一端においてペアワイズに接続されることで結合ポケットを規定している複数(好ましくは8つ)のβストランドを含む円柱状のβプリーツシート超二次構造領域を有する、重量が約18〜20kDAの単量体型タンパク質と定義される。サイズ、形状、および化学的特徴が異なる標的を収容する能力をそれぞれが有するリポカリンファミリーメンバー間に、さまざまな異なる結合様式を生じさせるのは、他の点では剛直なリポカリンスキャフォールドにおけるループの多様性である(例えばFlower, D.R.(1996),前掲; Flower, D.R. et al.(2000),前掲、またはSkerra, A.(2000)Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-3に概説されている)。事実、リポカリンタンパク質ファミリーは、広範なリガンドに結合するように、自然に進化しており、それらが共有する全体的配列保存のレベルは異常に低い(多くの場合、配列同一性は20%未満である)にもかかわらず、高度に保存された全体的フォールディングパターンを保っている。さまざまなリポカリンにおける位置間の対応は当業者には周知である。例えば米国特許第7,250,297号を参照されたい。
一局面において、本開示は、CD137結合性ヒト涙液リポカリンムテインを提供する。
のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、本開示によるTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンのこれらの配列位置における変異アミノ酸残基を、2つ以上、例えば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個、さらにはそれ以上、例えば13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26個、またはすべて含む。
のうちの1つまたは複数を含む。
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、CD137およびHER2の二重ターゲティングによる相乗効果をもたらしうる。例えば、エクスビボアッセイおよびマウスモデルにおいて証明されるとおり、NK細胞のCD137刺激は、NK細胞の機能および活性を強化することによって、トラスツズマブの活性を増進する(Kohrt, H. et al, J Clin Invest. 2012 Mar; 122(3):1066-75)。
実施例1:融合ポリペプチドの発現および分析
HER2およびCD137に同時に会合するために、本発明者らは、SEQ ID NO:3および4によって与えられる重鎖および軽鎖を有する抗体を、構造化されていない(G4S)3リンカー(SEQ ID NO:19)を介してSEQ ID NO:2のリポカリンムテインに融合することにより、いくつかの代表的な抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドを作製した。設計した複数の異なるフォーマットを図1に示す。そのような融合ポリペプチド(SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、SEQ ID NO:15および16)を、SEQ ID NO:2のリポカリンムテインを、インビトロおよびインビボでのIgG4半抗体交換を最小限に抑えるためのS228P突然変異(Silva 2015参照)ならびにFc-ガンマ受容体相互作用を低減するためのF234AおよびL235A突然変異(Alegre 1992)を含有する工学的に操作されたIgG4バックボーンを有する突然変異させた抗体の変異体の4つの末部のうちのいずれか1つに融合することによって作製した。さらにまた、本発明者らは、SEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチドとの比較において、天然のグリコシル化モチーフを除去するために抗体重鎖中に追加のN297A突然変異を有する(Bolt 1993参照)、SEQ ID NO:7および8の融合ポリペプチドを作製した。この除去は、潜在的に、Fc-ガンマ受容体との相互作用をさらに低減しうる。加えて、本発明者らは、IgG1バックグラウンドを持つSEQ ID NO:3および4の抗体の重鎖のC末へのSEQ ID NO:2のリポカリンムテインの直接融合物であり、それゆえにIgG1抗体の元来のFc-ガンマ相互作用を保っている、SEQ ID NO:5および6の融合ポリペプチドを作製した。
本発明者らは、ELISAアッセイを使って、組換えHER2(Sino Biological)に対する融合タンパク質の親和性を決定した。標的をPBS(5μg/mL)に溶解し、マイクロタイタープレートに4℃で終夜コーティングした。各インキュベーション工程後に、0.05%(v/v)Tween 20を補足したPBS(PBS-T)80μLで、プレートを5回洗浄した。プレートを、PBS中の2%BSA(w/v)により、室温で1時間ブロッキングした後、洗浄した。ベンチマーク抗体(SEQ ID NO:3および4、トラスツズマブ、すなわちHerceptin(登録商標)、Roche Diagnostics)または融合ポリペプチドをさまざまな濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。PBS-T中の1:5000希釈抗ヒトIgG Fc-HRP(#109-035-098、Jackson Laboratory)と共にインキュベーションした後、結合している試験対象の作用物質を検出した。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質(QuantaBlu、Thermo)を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
本発明者らは、ELISAアッセイを使って、組換えCD137-Fc融合物(#838-4B-100、R&D Systems)に対する融合ポリペプチドおよびSEQ ID NO:2の陽性対照リポカリンムテインの親和性を決定した。標的をPBS(5μg/mL)に溶解し、マイクロタイタープレートに4℃で終夜コーティングした。各インキュベーション工程後に、80μLのPBS-Tで、プレートを5回洗浄した。プレートを、PBS中の2%BSA(w/v)により、室温で1時間ブロッキングした後、洗浄した。単量体型のCD137特異的リポカリンムテイン(SEQ ID NO:2)または融合ポリペプチドをさまざまな濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。PBS-T中の1:1000希釈抗hNGAL抗体(HRPにコンジュゲートされているもの)と共に室温で1時間インキュベーションした後、結合している試験対象の作用物質を検出した。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質(QuantaBlu、Thermo)を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
HER2およびCD137への融合ポリペプチドの同時結合を証明するために、二重結合ELISAフォーマットを使用した。PBS中の組換えHER2(Sino Biological)(5μg/mL)をマイクロタイタープレートに4℃で終夜コーティングした。Biotek ELx405 select CW洗浄機を使って、各インキュベーション工程後に、0.05%(v/v)Tween 20を補足したPBS(PBS-T)80μLで、プレートを5回洗浄した。プレートを、PBS中の2%BSA(w/v)により、室温で1時間ブロッキングした後、再び洗浄した。融合ポリペプチドをさまざまな濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。次に、ビオチン化ヒトCD137-Fcを、PBS-T中1μg/mLの定濃度で1時間加えた。洗浄後にExtravidin-HRP(Sigma-Adrich、PBS-T中に1:5000)をウェルに1時間加えた。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質(QuantaBlu、Thermo)を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
本発明者らは、T細胞活性化アッセイを使って、T細胞応答を共刺激するSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドの能力を評価した。この目的のために、SEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドを、さまざまな濃度で、抗ヒトCD3抗体(OKT3、eBioscience)と一緒にプラスチック製ディッシュにコーティングし、次に精製T細胞をその被覆表面上でインキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、3日間のインキュベーション後のT細胞増殖の継続を、4時間BrdUパルスを使って評価し、上清のインターロイキン2(IL-2))レベルを測定した。以下にこの実験を詳細に説明する。
本発明者らは、標的細胞依存的T細胞活性化アッセイを使って、CD137およびHER2を同時に結合する能力を有するSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドの、HER2陽性細胞株上に固定化された場合のT細胞応答共刺激能力を評価した。本発明者らは、陰性対照として、SEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体を使用した。さらなる対照として、HER2陽性細胞に結合している二重特異性コンストラクトSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16を追い出すために、過剰量のSEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体の存在下で、実験を行った。この実験では、抗ヒトCD3抗体(OKT3、eBioscience)をプラスチック製培養ディッシュにコーティングした後、HER2陽性SKBR3細胞をそのディッシュ上で終夜培養した。翌日、精製T細胞を、さまざまな濃度の、SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチド、またはSEQ ID NO:3および4の対照抗体の存在下、被覆表面上でインキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、上清インターロイキン2(IL-2)およびインターフェロン-γ(IFN-γ)のレベルを測定した。以下にこの実験を詳述する。
Fc-ガンマ受容体hFcγRI/CD64(R&D Systems)およびhFcγRIIIA/CD16a(R&D Systems)に対する、工学的に操作されたIgG4に基づくバックボーンを持つポリペプチド融合物(SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16)の結合親和性を測定するために、表面プラズモン共鳴(SPR)に基づくアッセイを使用した。SEQ ID NO:3および4を、IgG1バックボーンを持つ単一特異性抗体の対照とした。SEQ ID NO:5および6を、IgG1に基づくポリペプチド融合物の対照とした。このSPR親和性アッセイでは、ポリペプチド融合物をビオチン化し、ビオチンCAPtureキット(Biotin CAPture Kit)(GE Healthcare)を使ってセンサーチップCAP上に捕捉した。センサーチップCAPをssDNAオリゴでプレ固定化処理(pre-immobilize)した。無希釈のビオチンCAPture試薬(相補的ssDNAオリゴとコンジュゲートされたストレプトアビジン)を、2μL/分の流速で300秒、適用した。次に10μg/mLのビオチン化ポリペプチド融合物を、5μL/分の流速で300秒、適用した。SEQ ID NO:3および4、ならびにポリペプチド融合物は、EZ-Link(登録商標)NHS-PEG4-ビオチン(Thermo Scientific)と共に室温で2時間インキュベートすることによってビオチン化した。反応混合物をZeba(商標)スピン脱塩プレート(Thermo Scientific)にローディングすることにより、反応しなかった過剰のビオチン試薬を除去した。リファレンスチャネルにはビオチンCAPture試薬だけをローディングした。
工学的に操作されたIgG4に基づくバックボーンを持つポリペプチド融合物(SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16)の、新生児型Fc受容体(FcRn、Sino Biologicals、#CT009-H08H)に対する結合親和性を測定するために、表面プラズモン共鳴(SPR)に基づくアッセイを使用した。SEQ ID NO:3および4を、IgG1バックボーンを持つ単一特異性抗体の対照とした。SEQ ID NO:5および6を、IgG1に基づくポリペプチド融合物の対照とした。このSPR親和性アッセイでは、FcRnをCM5センサーチップ(GE Healthcare)上に製造者の説明書に従って共有結合で固定化した。簡単に述べると、デキストランマトリックスのカルボキシル基を、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(EDC)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化した後、FcRnタンパク質の1級アミンを、シグナルが約200RUに達するまで表面上のNHSエステルと反応させた。最後に、表面を横切るように1Mエタノールアミンの溶液を通すことによって、未反応のNHSエステルをブロッキングした。固定化手順中の流速は常に10μl/分とした。
本発明者らは、標的細胞依存的T細胞活性化アッセイを使って、SEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチドの、T細胞応答を共刺激する能力を、標的細胞のHER2発現レベルの関数として評価した。この目的のために、本発明者らは、HER2高発現SKBR3細胞およびHER2高発現BT474細胞を、健常HER2発現細胞と類似するレベルでHER2を発現する細胞HepG2およびMCF7と共に使用した。比較のために、本発明者らは、SEQ ID NO:47および48、ならびにSEQ ID NO:49および50のリファレンス抗CD137モノクローナル抗体の挙動を調べた。陰性対照として、本発明者らはSEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体を使用した。さらにもう1つの陰性対照として、試験物の添加なしでこの実験を実行した(「媒体対照」)。この実験では、抗ヒトCD3抗体(OKT3、eBioscience)をプラスチック製培養ディッシュにコーティングしてから、そのディッシュ上でSKBR3、BT474、HepG2またはMCF7細胞を別々に終夜培養した。翌日、精製T細胞を、さまざまな濃度のSEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチド、リファレンス抗体SEQ ID NO:47および48ならびにSEQ ID NO:49および50、SEQ ID NO:3および4の対照抗体の存在下で、または試験物を添加することなく、被覆表面上でインキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、上清インターロイキン2(IL-2)レベルを測定した。以下にこの実験を詳述する。
SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16によって規定される融合ポリペプチドの安定性を調べるために、本発明者らは、試料を、およそ20mg/mL(21〜23mg/mLの範囲)の濃度において、pH7.4のPBS中、40℃で、4週間インキュベートする実験を使用した。比較のために、本発明者らは、SEQ ID NO:3および4によって規定されるポリペプチドの同一条件下での挙動を調べた。試料を5mg/mL前後の濃度から20mg/mL前後の濃度まで遠心分離フィルタ(Ultracel-3K、Amicon)を使って濃縮し、この濃縮試料の一部をリファレンス物質として-20℃で保存した。次に、0.5mLチューブ(PCR-PT、Sarstedt)中の濃縮試料0.1mLを、インキュベータ(Memmert)中、40℃で、4週間保存した。次に、試料の保全性および単量体含量を調べるために、0.150mL/分の流速で、Agilent 1200シリーズGPC2システムでのSuperdex200 Increaseカラム分析用サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に付した。20μgの試料をカラムに適用した。連続的フロースルー中の相対的タンパク質濃度を波長280nmにおける吸収によって検出した。
SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16によって規定される融合ポリペプチドの薬物動態と、参照用のSEQ ID NO:3および4の薬物動態との分析を、マウスにおいて行った。およそ5週齢の雄CD-1マウス(1時点あたり3匹; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH)の尾静脈に10mg/kgの用量で融合ポリペプチドを注射した。試験物は5mL/kgの体積を使ってボーラスとして投与した。5分、1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間、4日、8日、14日および20日の時点において、マウスから血漿試料を得た。各動物および各時点について少なくとも100μLのLi-ヘパリン血漿が得られるように、十分な全血(イソフルラン麻酔下で採血)を収集した。薬物レベルは、標的HER2およびCD137によって完全な二重特異性コンストラクトを検出するサンドイッチELISAを使って決定した。トラスツズマブの血漿中レベルは、標的HER2およびヒトFcによるサンドイッチELISAを使って決定した。Prism GraphPad 5ソフトウェアを使用し、2コンパートメントモデルを使って、データを当てはめた。
SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16によって規定される融合ポリペプチドの薬物動態と、参照用のSEQ ID NO:3および4の薬物動態との分析を、カニクイザルにおいて行った。雄カニクイザルに、用量3mg/kgの試験物を、60分かけて静脈内注入した。15分、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間、3日、4日、5日、6日、7日、9日、11日、14日、18日、および24日の時点において、カニクイザルから血漿試料を得た。薬物レベルは、標的HER2およびCD137によって完全な二重特異性コンストラクトを検出するサンドイッチELISAを使って決定した。トラスツズマブの血漿中レベルは、標的HER2およびヒトFcによるサンドイッチELISAを使って決定した。Prism GraphPad 5ソフトウェアを使用し、2コンパートメントモデルを使って、データを当てはめた。
人間における抗薬物抗体形成のリスクを調べるために、二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、SEQ ID NO:15および16、ならびに参照用のSEQ ID NO:3および4、SEQ ID NO:3および4の対照抗体、そして陽性対照キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)のインビトロT細胞免疫原性評価を行った。この実験を行うために、世界人口における分布を反映するHLAアロタイプをカバーするように選択された32人のドナーのPBMCを融解し、洗浄し、1ウェルあたり3×105細胞の密度で96ウェルプレート上に播種した。アッセイ培地に希釈した試験物を、30μg/mLの濃度で細胞に加えた。ブランクとしてはアッセイ培地のみを使用し、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)をナイーブ陽性対照として使用した。PBMCを、湿潤雰囲気中、37℃および5%CO2で、7日間インキュベートした。7日目に、PBMCを表面表現型CD3+およびCD4+マーカーについて標識すると共に、DNAに取り込まれたEdU(5-エチニル-2'デオキシウリジン)(細胞増殖マーカーとして使用)について標識した。Guava easyCyte 8HTフローサイトメーターを使ってCD3+CD4+EdU+増殖細胞のパーセンテージを測定し、GuavaSoft InCyteソフトウェアを使って分析した。
インビボマウスモデルにおけるSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:32および33の活性を調べるために、本発明者らは、ヒトSK-OV-3腫瘍およびヒトPBMCが移植された免疫不全NOGマウス(Taconic、NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)を使用した。
本発明者らは、標的細胞に基づくレポーターアッセイを使って、CD137およびHER2に同時に結合する能力を有するSEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチドの、標的細胞のHER2状態に依存してCD137経路を活性化する能力を評価した。この目的のために、本発明者らは、NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat細胞(Promega、CS196002)(これは、CD137を過剰発現するように工学的に操作されており、NF-κBルシフェラーゼレポーター遺伝子を保因している)と混合されたHER2高発現性NCI-N87胃がん細胞を使用した。比較のために本発明者らは、SEQ ID NO:32および33ならびにSEQ ID NO:34および35のリファレンス抗CD137モノクローナル抗体の挙動を調べた。本発明者らは、陰性対照として、SEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体を使用した。さらなる対照として、本発明者らは、SEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチド、SEQ ID NO:32および33ならびにSEQ ID NO:34および35の抗CD137モノクローナル抗体、そしてSEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体について、NCI-N87細胞非存在下でのCD137経路活性化も評価した。最後に、試験物の添加なしでも、この実験を実行した(「媒体対照」)。NCI-N87細胞のみの存在下で測定されるバックグラウンドシグナルを、NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat細胞が加えられていないウェルで評価した。この実験では、NCI-N87細胞をディッシュ上で終夜培養した。翌日、新たに融解したNF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat細胞(Promega、CS196002)を、被覆表面上、さまざまな濃度のSEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチド、リファレンス抗体SEQ ID NO:32および33ならびにSEQ ID NO:34および35、SEQ ID NO:3および4の対照抗体の存在下、または試験物の添加なしで、6時間インキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、Bio-Glo(商標)緩衝液(Promega、G7940)の添加によって誘発されるJurkatレポーター細胞上のルミネセンスを測定した。以下にこの実験を詳述する。
実施例14と類似するプロトコールで、HER2陽性腫瘍細胞(SKOV-3)を移植した免疫無防備状態のマウスにヒトPBMCを注射し、3週間にわたって、100μg/週または20μg/週のSEQ ID NO:9および10、抗CD137抗体SEQ ID NO:32および33、または媒体とPBMCである対照(「PBMCのみ」)、PBMCなしの媒体である対照(「PBMCなし」)、もしくはアイソタイプ対照とPBMCである対照で処置した。具体的には、NOGマウスにSK-OV-3細胞を皮下(s.c.)注射し、腫瘍を平均で120mm3まで成長させてから、処置群にランダムに割り当てた。1つの処置群につき10匹とした。マウスの尾静脈に新鮮ヒトPBMCを静脈内(i.v.)移植し、1時間後に処置を開始した。マウスには、SEQ ID NO:9および10またはSEQ ID NO:32および33または対照の処置(20μgまたは100μg)を、週3回、腹腔内(i.p.)に施行した。腫瘍成長を週に2回記録した。処置後20日目に2匹のマウスから腫瘍を収穫し、ヒトT細胞の浸潤を、ヒトリンパ球マーカーCD45に関する染色による免疫組織化学検査によって評価した。
SEQ ID NO:9および10の安全性を評価するために、実験16のマウスのマウス血液試料からPBMCを単離した。これらの試料を、PBMC移植後の19日目に採取し、ヒト表面マーカーCD45、CD3およびCD8に関するマルチカラーFACSによって分析した。末梢血を10mlの1×赤血球溶解緩衝液(0.15M NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM EDTA)に再懸濁し、15mlチューブ中、室温で1〜3分、溶解した。細胞を300×g、4℃で10分、遠心分離し、10mlのFC緩衝液(PBS中の2%ウシ胎児血清、pH7.4)で1回洗浄し、200μlのFC緩衝液に再懸濁した。細胞を5×105細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに移した。プレートを400×g、4℃で3分遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清を除去した。Fc-ブロック抗体(2.4G2抗体(0.5mg/ml、#553142-BD Bioscience)を緩衝液に1:100希釈したもの、10μl/ウェル)を各ウェルに加え、プレートを室温で15分インキュベートした。次に、ヒト標的hCD45(Life Technologies)、hCD3およびhCD8(どちらもBD Bioscience)に対する特異的抗体を加え(0.5〜1μg/試料)、プレートを遮光して4℃で30分インキュベートした。さらに1回の洗浄工程(プレートを400×g、4℃で3分、遠心分離)後、Attune Focusingサイトメーター(青色(488nm)/紫色(405nm)のレーザー構成)で分析するために、細胞を200μlのFC緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータはFlowJoデータ分析ソフトウェアで分析した。
インビボマウスモデルにおけるSEQ ID NO:9および10の活性を調べるために、本発明者らは、ヒトSK-OV-3腫瘍およびヒトPBMCが移植された免疫不全NOGマウス(Taconic、NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)を使用した。受容体HER2およびCD137の単一特異性ターゲティングの効果と二重特異性ターゲティングの効果とを対比して評価するために、単一特異性CD137ターゲティング抗体SEQ ID NO:32および33ならびに単一特異性HER2ターゲティングコンストラクト(IgG4バックボーン)SEQ ID NO:51および52を並行して調べた。
実施例18に記載のインビボ試験のフォローアップ分析において、9つの試験群のそれぞれのうち、5匹または6匹の腫瘍担持マウスから、試験終了時または倫理的屠殺時に腫瘍を切除し、ヒトリンパ球マーカーCD45に関する染色による免疫組織化学検査によって、ヒトT細胞の浸潤について評価した。この目的のために、腫瘍をホルマリン固定し、パラフィンに包埋し、抗ヒトCD45抗体を用いる免疫組織化学検査用に処理した。CD45陽性細胞は、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)染色によって同定した。グレースケール画像中のDAB陽性を明確に視覚化することができるように、画像のコントラストおよび輝度をデジタルに調整した。
SEQ ID NO:9および10の作用様式をさらに解明し、その安全性を評価するために、実験18のマウスの血液試料から、PBMCを単離した。これらの試料は、試験終了時のマウス屠殺後または倫理的屠殺後の最終採血によって採取し、ヒト表面マーカーCD45およびCD8についてマルチカラーFACSによって分析した。末梢血を10mlの1×赤血球溶解緩衝液(0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3、0.1mM EDTA)に再懸濁し、15mlチューブ中、室温で1〜3分、溶解した。細胞を300×g、4℃で10分、遠心分離し、10mlのFC緩衝液(PBS中の2%ウシ胎児血清、pH7.4)で1回洗浄し、200μlのFC緩衝液に再懸濁した。細胞を5×105細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに移した。プレートを400×g、4℃で3分遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清を除去した。Fc-ブロック抗体(2.4G2抗体(0.5mg/ml、#553142-BD Bioscience)を緩衝液に1:100希釈したもの、10μl/ウェル)を各ウェルに加え、プレートを室温で15分インキュベートした。次に、ヒト標的hCD45(Life Technologies)およびhCD8(BD Bioscience)に対する特異的抗体を加え(0.5〜1μg/試料)、プレートを遮光して4℃で30分インキュベートした。さらに1回の洗浄工程(プレートを400×g、4℃で3分、遠心分離)後、Attune Focusingサイトメーター(青色(488nm)/紫色(405nm)レーザー構成)で分析するために、細胞を200μlのFC緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータはFlowJoデータ分析ソフトウェアで分析した。
Claims (36)
- CD137にもHer2/neuにも結合する能力を有する融合ポリペプチドであって、少なくとも2つのサブユニットを任意の順序で含み、第1サブユニットは完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含み、この第1結合ドメインはHER2/neuに対する結合特異性を有し、かつ第2サブユニットはCD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含み、該リポカリンムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2、32〜38、および39〜46からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、融合ポリペプチド。
- 4nM以下のEC50値でCD137およびHER2/neuに同時に結合する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
- T細胞応答を共刺激する能力を有し、かつ/またはT細胞増殖を誘発する能力を有する、請求項1または2記載の融合ポリペプチド。
- 前記ムテインが、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:18)の配列位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 前記リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:18)との比較において以下の変異アミノ酸残基:
Ala 5 → ValまたはThr, Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Thr 42 → Ser, Gly 46 → Asp, Lys 52 → Glu, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Lys 65 → ArgまたはAsn, Thr 71 → Ala, Val 85 → Asp, Lys 94 → ArgまたはGlu, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Lys 121 → Glu, Ala 133 → Thr, Arg 148 → Ser, Ser 150 → IleおよびCys 153 → Ser
のうちの少なくとも1つを含む、請求項4記載の融合ポリペプチド。 - 前記ムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:18)との比較において、以下の変異アミノ酸残基の組:
(a)Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trpおよび Cys 153 → Ser;
(b)Ala 5 → Thr, Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Lys 65 → Arg, Val 85 → Asp, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Lys 121 → Glu, Ala 133 → ThrおよびCys 153 → Ser;
(c)Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Lys 65 → Asn, Lys 94 → Arg, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Lys 121 → Glu, Ala 133 → Thrおよび Cys 153 → Ser;
(d)Ala 5 → Val, Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Lys 65 → Arg, Lys 94 → Glu, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Lys 121 → Glu, Ala 133 → ThrおよびCys 153 → Ser;
(e)Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Thr 42 → Ser, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Ser 150 → IleおよびCys 153 → Ser;
(f)Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Lys 52 → Glu, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Thr 71 → Ala, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Ala 133 → Thr, Arg 148 → Ser, Ser 150 → IleおよびCys 153 → Ser; または
(g)Ala 5 → Thr, Arg 26 → Glu, Glu 27 → Gly, Phe 28 → Cys, Pro 29 → Arg, Glu 30 → Pro, Met 31 → Trp, Leu 33 → Ile, Glu 34 → Phe, Gly 46 → Asp, Leu 56 → Ala, Ser 58 → Asp, Arg 60 → Pro, Cys 61 → Ala, Thr 71 → Ala, Cys 101 → Ser, Glu 104 → Val, Leu 105 → Cys, His 106 → Asp, Lys 108 → Ser, Arg 111 → Pro, Lys 114 → Trp, Ser 150 → IleおよびCys 153 → Ser
のうちの1つを含む、請求項4または5記載の融合ポリペプチド。 - 前記リポカリンムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:32〜38からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するか、または
SEQ ID NO:32〜38からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含む、
請求項4〜6のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。 - 前記リポカリンムテインが、成熟ヒトリポカリン2(hNGAL)の直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:17)の配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 前記リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:17)との比較において、以下の変異アミノ酸残基:
Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → ArgまたはLys, Gln 49 → Val, Ile, His, SerまたはAsn, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Met, AlaまたはGly, Leu 70 → Ala, Lys, SerまたはThr, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Met, Arg, ThrまたはAsn, Trp 79 → AlaまたはAsp, Arg 81 → Met, TrpまたはSer, Phe 83 → Leu, Cys 87 → Ser, Leu 94 → Phe, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr
のうちの少なくとも1つを含む、請求項8記載の融合ポリペプチド。 - 前記リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO:17)との比較において、以下の変異アミノ酸残基の組:
(a)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Lys, Gln 49 → Asn, Tyr 52 → Met, Ser 68 → Gly, Leu 70 → Thr, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Thr, Trp 79 → Ala, Arg 81 → Ser, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr;
(b)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Arg, Gln 49 → Ile, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Met, Leu 70 → Lys, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Met, Trp 79 → Asp, Arg 81 → Trp, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr;
(c)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Arg, Gln 49 → Asn, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Ala, Leu 70 → Ala, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Thr, Trp 79 → Asp, Arg 81 → Trp, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr;
(d)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Lys, Gln 49 → Asn, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Ala, Leu 70 → Ala, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Thr, Trp 79 → Asp, Arg 81 → Trp, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr;
(e)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Lys, Gln 49 → Ser, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Gly, Leu 70 → Ser, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Thr, Trp 79 → Ala, Arg 81 → Met, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr;
(f)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Lys, Gln 49 → Val, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Gly, Leu 70 → Thr, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Arg, Trp 79 → Asp, Arg 81 → Ser, Cys 87 → Ser, Leu 94 → Phe, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr;
(g)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Arg, Gln 49 → His, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Gly, Leu 70 → Thr, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Thr, Trp 79 → Ala, Arg 81 → Ser, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr;
(h)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Lys, Gln 49 → Asn, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Gly, Leu 70 → Thr, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Thr, Trp 79 → Ala, Arg 81 → Ser, Phe 83 → Leu, Cys 87 → Ser, Leu 94 → Phe, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr;または
(i)Gln 28 → His, Leu 36 → Gln, Ala 40 → Ile, Ile 41 → Arg, Gln 49 → Ser, Tyr 52 → Met, Asn 65 → Asp, Ser 68 → Ala, Leu 70 → Thr, Arg 72 → Asp, Lys 73 → Asp, Asp 77 → Asn, Trp 79 → Ala, Arg 81 → Ser, Cys 87 → Ser, Asn 96 → Lys, Tyr 100 → Phe, Leu 103 → His, Tyr 106 → Ser, Lys 125 → Phe, Ser 127 → Phe, Tyr 132 → GluおよびLys 134 → Tyr
のうちの1つを含む、請求項8または9記載の融合ポリペプチド。 - 前記ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2および39〜46からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項8〜10のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 前記ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2および39〜46からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含む、請求項8〜10のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 第1サブユニットと第2サブユニットとが、第2サブユニットのリポカリンムテインのN末と第1サブユニットの免疫グロブリンの重鎖定常領域(CH)のC末との間のペプチドリンカーを介して連結されている、請求項1〜12のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 第3サブユニットが、第3サブユニットのリポカリンムテインのN末と第1サブユニットの免疫グロブリンの軽鎖定常領域(CL)のC末との間でペプチドリンカーを介して第1サブユニットに連結されている、請求項1〜13のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- SEQ ID NO:19に示すアミノ酸配列を含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- リポカリンムテインがSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 免疫グロブリンがトラスツズマブまたはペルツズマブである、請求項1〜15のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 免疫グロブリンがSEQ ID NO:3および4によって与えられる重鎖および軽鎖を有する、請求項1〜15のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 免疫グロブリンがIgG4バックボーンを有する、請求項1〜15のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- IgG4バックボーンが、S228P、N297A、F234A、およびL235Aからなる群より選択される突然変異のうちのいずれか1つを有する、請求項19記載の融合ポリペプチド。
- SEQ ID NO:5および6に示すアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- SEQ ID NO:7および8に示すアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- SEQ ID NO:9および10に示すアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- SEQ ID NO:11および12に示すアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- SEQ ID NO:13および14に示すアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- SEQ ID NO:15および16に示すアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 請求項1〜26のいずれか一項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
- 請求項1〜26のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを生産する方法であって、融合ポリペプチドが、ムテインをコードする核酸から出発して生産される、方法。
- CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合(engage)するのに使用するための、請求項1〜26のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物。
- T細胞を共刺激し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合するのに使用するための、請求項1〜26のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物。
- Tリンパ球増殖を誘発し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合するのに使用するための、請求項1〜26のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物。
- CD137クラスター化誘発性の活性化T細胞をHER2/neu陽性腫瘍細胞へ方向づけるのに使用するための、請求項1〜26のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物。
- HER2/neu陽性腫瘍細胞の近傍において局所的T細胞応答を誘発するのに使用するための、請求項1〜26のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物。
- HER2/neu陽性腫瘍細胞の近傍において局所的ナチュラルキラー細胞応答を誘発するのに使用するための、請求項1〜26のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物。
- HER2/neu陽性腫瘍細胞の近傍においてT細胞によるIL-2および/またはIFNガンマの生産を誘発するのに使用するための、請求項1〜26のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物。
- HER2/ner陽性がんの防止、回復、または治療に使用するための、請求項1〜26のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物。
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