JP2018515085A - 抗がん融合ポリペプチド - Google Patents
抗がん融合ポリペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018515085A JP2018515085A JP2017557310A JP2017557310A JP2018515085A JP 2018515085 A JP2018515085 A JP 2018515085A JP 2017557310 A JP2017557310 A JP 2017557310A JP 2017557310 A JP2017557310 A JP 2017557310A JP 2018515085 A JP2018515085 A JP 2018515085A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fusion polypeptide
- seq
- her2
- amino acid
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 335
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 326
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 323
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 262
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 title 1
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims abstract description 200
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims abstract description 193
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims abstract description 169
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims abstract description 165
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 44
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 136
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 claims description 109
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 claims description 109
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 81
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 74
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 74
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 43
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 43
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 42
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 33
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 33
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 30
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 26
- 101000946124 Homo sapiens Lipocalin-1 Proteins 0.000 claims description 24
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 claims description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 14
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 13
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 claims description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 claims description 12
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 claims description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 5
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 5
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 claims description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 claims 1
- 229920000831 ionic polymer Polymers 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 79
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 72
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 39
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 abstract description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 58
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 53
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 49
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 108010057281 Lipocalin 1 Proteins 0.000 description 37
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 37
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 32
- 102100034724 Lipocalin-1 Human genes 0.000 description 29
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 28
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 28
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 27
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 26
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 23
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 22
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 16
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 16
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 15
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 230000034994 death Effects 0.000 description 11
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 11
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 102000002627 4-1BB Ligand Human genes 0.000 description 10
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 10
- 101001023833 Homo sapiens Neutrophil gelatinase-associated lipocalin Proteins 0.000 description 10
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 10
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 102000047202 human LCN2 Human genes 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 10
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 10
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 9
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 9
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 9
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 9
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 102000003752 Lipocalin 1 Human genes 0.000 description 8
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 8
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 102000050327 human TNFRSF9 Human genes 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 6
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 5
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 239000003287 lymphocyte surface marker Substances 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 102000051957 human ERBB2 Human genes 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- -1 Jun Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 3
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDEURGJCGCHYFH-DJLDLDEBSA-N 5-ethynyl-2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C#C)=C1 CDEURGJCGCHYFH-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101150055061 LCN2 gene Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 2
- 101710138747 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 101710165434 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006786 activation induced cell death Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 2
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- DTLVBHCSSNJCMJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-[2-[2-[2-[2-[5-(2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoylamino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate Chemical compound S1CC2NC(=O)NC2C1CCCCC(=O)NCCOCCOCCOCCOCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O DTLVBHCSSNJCMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001316595 Acris Species 0.000 description 1
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100026251 Caenorhabditis elegans atf-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100421200 Caenorhabditis elegans sep-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 101100077740 Cyprinus carpio map2k2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N Endothion Chemical compound COC1=COC(CSP(=O)(OC)OC)=CC1=O YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034789 Epididymal-specific lipocalin-6 Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100032558 Glypican-2 Human genes 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000012766 Growth delay Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000945886 Homo sapiens Epididymal-specific lipocalin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000605055 Homo sapiens Epididymal-specific lipocalin-8 Proteins 0.000 description 1
- 101001014664 Homo sapiens Glypican-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001052490 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001052477 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000950669 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000763579 Homo sapiens Toll-like receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000019145 JUN kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical group CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 102000013519 Lipocalin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010051335 Lipocalin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N Lys-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- 102100024192 Mitogen-activated protein kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100024189 Mitogen-activated protein kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100037809 Mitogen-activated protein kinase 9 Human genes 0.000 description 1
- 102100033127 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710164337 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010070308 Refractory cancer Diseases 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000004398 TNF receptor-associated factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000920 TNF receptor-associated factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 238000010228 ex vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 208000016691 refractory malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229950005972 urelumab Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
- C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
本開示は、CD137クラスター化および活性化をHER2/neu陽性腫瘍細胞へ方向づけるために役立ちうる、CD137とHER2/neuとの両方に特異的な融合ポリペプチドを提供する。そのような融合ポリペプチドは、多くの薬学的応用、例えば抗がん作用物質および/または免疫調節物質として、さまざまな腫瘍などのヒト疾患の処置または防止のために使用することができる。本開示は、本明細書に記載の融合ポリペプチドを作製する方法ならびにそのような融合ポリペプチドを含む組成物に関する。本開示はさらに、そのような融合ポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにそのような融合ポリペプチドおよび核酸分子の作製方法に関する。加えて本願は、そのような融合ポリペプチド、およびそのような融合ポリペプチドの1つまたは複数を含む組成物の、治療的および/または診断的使用を開示する。
Description
I.背景
HER2/neuはヒト上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーである。このがん遺伝子の増幅または過剰発現は、侵攻性が高い一定タイプの乳がんを含むさまざまな腫瘍の発生および進行に重要な役割を果たすことが示されている。HER2/neuは、腫瘍細胞上に、健常組織と比較してはるかに高い細胞表面密度で、著しく差次的に発現することが示されている。
HER2/neuはヒト上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーである。このがん遺伝子の増幅または過剰発現は、侵攻性が高い一定タイプの乳がんを含むさまざまな腫瘍の発生および進行に重要な役割を果たすことが示されている。HER2/neuは、腫瘍細胞上に、健常組織と比較してはるかに高い細胞表面密度で、著しく差次的に発現することが示されている。
HER2/neuを標的とするモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（Herceptin（登録商標））は、初期または転移性のHER2（＋）乳がんを持つ女性の処置に適応を持つ。この状況ではトラスツズマブなどのモノクローナル抗体の活性が有望であるにもかかわらず、難治性がんまたは進行がんを持つ患者における奏功率は最適とはいえない。例えば、単独化学治療を化学治療＋トラスツズマブと比較する臨床治験において、客観的奏功率は32％から50％へと有意に上昇したが、それでもなお治験に参加した患者の半数では応答がなかった（Slamon D.J. et al., N Engl J Med. 2001 Mar 15;344（11）:783-92（非特許文献1））。それゆえに、奏功率が改良された、より良いHER2/neuターゲティング治療が求められている。
CD137は、共刺激免疫受容体であり、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）スーパーファミリーのメンバーである。これは主に、活性化CD4＋およびCD8＋ T細胞上、活性化B細胞上、ならびにナチュラルキラー（NK）細胞上に発現するが、休止単球および休止樹状細胞上（Li, S. Y. et al., Clin Pharmacol 2013 5（Suppl 1）:47-53（非特許文献2））または内皮細胞上（Snell, L. M. et al., Immunol Rev 2011 Nov; 244（1）:197-217（非特許文献3））にも見いだすことができる。CD137は免疫応答の制御に重要な役割を果たすので、がん免疫治療の標的である。CD137リガンド（CD137L）はCD137の唯一公知の天然リガンドであって、活性化B細胞、単球、および脾臓樹状細胞などの数タイプのAPC上に構成的に発現しており、Tリンパ球上に誘導されうる。
CD137Lは、膜結合型および可溶性変異体として存在する三量体型タンパク質である。しかし、可溶性CD137Lが持つ、CD137（例えばCD137発現リンパ球上のCD137）を活性化する能力は限られており、効果を引き出すには高い濃度が要求される（Wyzgol, A. et al., J Immunol 2009 Aug 1183（3）:1851-1861（非特許文献4））。CD137の天然の活性化は、CD137陽性細胞がCD137L陽性細胞と会合（engage）することによって起こる。次に、相対する細胞上のCD137Lによるクラスター化によってCD137活性化が誘発され、それがTRAF1、2および3を介したシグナリング（Snell, L. M. et al., Immunol Rev 2011 Nov; 244（1）:197-217（非特許文献3）、Yao, S. et al., Nat Rev Drug Disc 2013 Feb; 12（2）:130-146（非特許文献5））およびCD137陽性T細胞におけるさらなる付随下流効果につながると考えられている。各々のコグネイトターゲットを認識することによって活性化されたT細胞の場合、CD137の共刺激によって引き出される効果は、活性化のさらなる強化、生存および増殖の強化、炎症誘発性サイトカインの生産、ならびに殺能力の向上である。
がん細胞の排除にとってのCD137共刺激の利益は、いくつかの前臨床インビボモデルで証明されている。例えば腫瘍上にCD137Lを強制的に発現させると、腫瘍拒絶が起こる（Melero, I. et al., Eur J Immunol 1998 Mar; 28（3）:1116-1121（非特許文献6））。同様に、腫瘍上に抗CD137 scFvを強制的に発現させると、腫瘍のCD4＋T細胞およびNK細胞依存的排除が起こる（Ye, Z. et al., Nat Med 2002 Apr; 8（4）:343-348（非特許文献7）、Zhang, H. et al., Mol Canc Ther 2006 Jan; 5（1）:149-155（非特許文献8）、Yang, Y. et al., Canc Res 2007 Mar 1; 67（5）:2339-2344（非特許文献9））。抗CD137抗体を全身性に投与すると、腫瘍成長の遅延が起こることも証明されている（Martinet, O. et al., Gene Ther 2002 Jun; 9（12）:786-792（非特許文献10））。
CD137はヒト腫瘍における天然の腫瘍反応性T細胞の優れたマーカーであること（Ye, Q. et al., Clin Canc Res: 2014 Jan 1; 20（1）:44-55（非特許文献11））、そして養子T細胞治療に応用する目的でCD8＋黒色腫腫瘍浸潤性リンパ球の拡大および活性を改良するために、抗CD137抗体を使用できること（Chacon, J. A. et al., PloS One 2013 8（4）:e60031（非特許文献12））が示されている。
CD137共刺激の潜在的治療利益が前臨床的に証明されたことで、CD137を標的とする治療抗体BMS-663513（Jure-Kunkel, M.らの米国特許第7288638号（特許文献1））およびPF-05082566（Fisher, T.S. et al., Canc Immunol Immunother 2012 Oct; 61（10）:1721-1733（非特許文献13））の開発に拍車がかかった。これらはどちらも、現在、初期臨床治験中である。
しかし、三価の可溶性CD137Lが活性を欠くのと同様に、抗体のような二価CD137結合物質も、それだけでは、T細胞上またはNK細胞上のCD137をクラスター化して効率的な活性化をもたらすには十分でない可能性が理解されたのは、最近になってからである。前臨床マウスモデルを利用した最近の刊行物には、実際のところ、他の抗TNFR抗体の作用様式は、抗体がそのFc部分を介してFc-ガンマ受容体発現細胞上のFc-ガンマ受容体と相互作用することを必要とするという、インビボでの証拠が提示されている（Bulliard, Y. et al., J Exp Med 2013 Aug 26; 210（9）:1685-1693（非特許文献14）、Bulliard, Y. et al., Immunol Cell Biol 2014 Jul; 92（6）:475-480（非特許文献15））。それゆえに、現在臨床開発中の抗体の作用様式は、Fc-ガンマ受容体による非標的型（non-targeted）のクラスター化に支配される可能性があり、それは、腫瘍の近傍におけるFc-γ発現細胞の存在に、ほぼランダムに依存しうる。
したがって、腫瘍標的型（tumor-targeted）の特異的作用様式でCD137をクラスター化し活性化する治療薬の創製には、未充足のニーズがある。
Slamon D.J. et al., N Engl J Med. 2001 Mar 15;344（11）:783-92
Li, S. Y. et al., Clin Pharmacol 2013 5（Suppl 1）:47-53
Snell, L. M. et al., Immunol Rev 2011 Nov; 244（1）:197-217
Wyzgol, A. et al., J Immunol 2009 Aug 1183（3）:1851-1861
Yao, S. et al., Nat Rev Drug Disc 2013 Feb; 12（2）:130-146
Melero, I. et al., Eur J Immunol 1998 Mar; 28（3）:1116-1121
Ye, Z. et al., Nat Med 2002 Apr; 8（4）:343-348
Zhang, H. et al., Mol Canc Ther 2006 Jan; 5（1）:149-155
Yang, Y. et al., Canc Res 2007 Mar 1; 67（5）:2339-2344
Martinet, O. et al., Gene Ther 2002 Jun; 9（12）:786-792
Ye, Q. et al., Clin Canc Res: 2014 Jan 1; 20（1）:44-55
Chacon, J. A. et al., PloS One 2013 8（4）:e60031
Fisher, T.S. et al., Canc Immunol Immunother 2012 Oct; 61（10）:1721-1733
Bulliard, Y. et al., J Exp Med 2013 Aug 26; 210（9）:1685-1693
Bulliard, Y. et al., Immunol Cell Biol 2014 Jul; 92（6）:475-480
この未充足ニーズを満たすために、本願は、以下の特性、すなわち
（a）CD137に対する結合特異性、および
（b）HER2/neuに対する結合特異性
を有する融合ペプチドによってCD137と腫瘍抗原HER2/neuとに同時に会合する新規なアプローチを提供する。
（a）CD137に対する結合特異性、および
（b）HER2/neuに対する結合特異性
を有する融合ペプチドによってCD137と腫瘍抗原HER2/neuとに同時に会合する新規なアプローチを提供する。
この融合ポリペプチドは、腫瘍細胞上に過剰発現しているHER2を介して、腫瘍標的依存的な、リンパ球上のCD137の活性化をもたらすように設計される。そのような分子は、HER2陽性腫瘍の近傍に位置するT細胞および/またはNK細胞を、さらに活性化すると予想される。そのような二重特異性物質は、抗HER2抗体または抗CD137抗体よりも改良された治療効果を呈しうる。
II.定義
以下の一覧では、本明細書の全体を通して使用される用語、語句、および略号を定義する。本明細書に列挙して定義する用語はいずれも、すべての文法形式を包含するものとする。
以下の一覧では、本明細書の全体を通して使用される用語、語句、および略号を定義する。本明細書に列挙して定義する用語はいずれも、すべての文法形式を包含するものとする。
本明細書において使用する場合、別段の指定がある場合を除き、「CD137」はヒトCD137を意味する。CD137は、「4-1BB」または「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（TNFRSF9）」または「ILA（induced by lymphocyte activation）」としても公知である。ヒトCD137とは、UniProt Q07011によって規定される完全長タンパク質、そのフラグメント、またはその変異体を意味する。
本明細書において使用する場合、別段の指定がある場合を除き、「HER2」または「HER2/neu」は、ヒトHER2を意味する。Her-2またはHER2/neuは、「erbB-2」、「c-neu」、または「p185」としても公知である。ヒトHer2とは、UniProt P04626によって規定される完全長タンパク質、そのフラグメント、またはその変異体を意味する。
本明細書にいう「検出可能な親和性」とは、一般に少なくとも約10-5M以下の親和性定数で、選択された標的に結合する能力を意味する。これより低い親和性は、一般に、ELISAなどの一般的方法ではもはや測定することができず、それゆえに、あまり重要ではない。
本明細書において、選択された標的（この場合はCD137および/またはHER2/neu）に対する、本開示のタンパク質（例えばリポカリンのムテイン）またはその融合ポリペプチドの「結合親和性」は、当業者に公知の数多くの方法によって測定することができる（そしてそれによってムテイン-リガンド複合体のKD値が決定される）。そのような方法には、蛍光滴定、競合ELISA、等温滴定熱量測定（ITC）などの熱量測定法、および表面プラズモン共鳴（BIAcore）などがあるが、それらに限定されるわけではない。そのような方法は当技術分野において確立されており、その例を以下にも詳述する。
また、それぞれの結合物質とそのリガンドとの間の複合体形成は、それぞれの結合パートナーの濃度、競合物質の存在、使用する緩衝系のpHおよびイオン強度、ならびに解離定数KDの決定に使用される実験方法（例えば蛍光滴定、競合ELISAまたは表面プラズモン共鳴であるが、これらはほんの一例に過ぎない）、さらには実験データの評価に使用される数学的アルゴリズムなどといった、多種多様な因子の影響を受けることに注意されたい。
それゆえに、所与のリガンドに対する特定リポカリンムテインの親和性を決定するために使用される方法および実験装置に依存して、KD値（それぞれの結合物質とその標的/リガンドとの間に形成される複合体の解離定数）が一定の実験範囲内で変動しうることは、当業者にとっては明らかである。これは、例えばそのKD値が表面プラズモン共鳴（Biacore）で決定されたか、競合ELISAで決定されたか、または「直接ELISA」で決定されたかなどに依存して、測定されるKD値にはわずかな偏差、または許容誤差範囲が存在しうることを意味する。
本明細書にいう「ムテイン」、「変異（mutated）」実体（entity）（タンパク質であるか核酸であるかを問わない）、または「突然変異体（mutant）」とは、天然（野生型）の核酸またはタンパク質「リファレンス」スキャフォールドと比較した、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換、欠失、または挿入を指す。この用語は、本明細書に記載するムテインおよび変異体（variant）のフラグメントも包含する。本発明のリポカリンムテイン、そのフラグメントまたは変異体は、好ましくは、本明細書に記載するようにCD137に結合する機能を保っている。
本開示のムテインに関連して本明細書において使用する用語「フラグメント」は、N末および/またはC末が短縮された、すなわち少なくとも1つのN末および/またはC末アミノ酸を欠く、完全長成熟ヒト涙液リポカリンから誘導されるタンパク質またはペプチドに関する。そのようなフラグメントは、成熟リポカリンの一次配列のうちの少なくとも10個またはそれ以上、例えば20個もしくは30個またはそれ以上の連続アミノ酸を含むことができ、通常は、成熟リポカリンのイムノアッセイで検出可能である。一般に、本開示のリポカリンムテインの、または本開示による組み合わせの、または本明細書に記載する融合タンパク質の、対応タンパク質リガンドであるCD137に関連して本明細書において使用する用語「フラグメント」は、N末および/またはC末が短縮されたタンパク質またはペプチドリガンドであって、本開示のムテインによって認識されかつ/または結合されるという完全長リガンドの能力を保っているものに関する。
本明細書において使用する用語「突然変異誘発」は、成熟リポカリンの所与の配列位置に本来存在するアミノ酸を、それぞれの天然ポリペプチド配列中のその特定位置には存在しない少なくとも1つのアミノ酸で置換することができるように、実験条件が選ばれることを意味する。「突然変異誘発」という用語は、1つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入による配列セグメントの長さの（付加的）修飾も包含する。したがって、例えば、選ばれた配列位置にある1つのアミノ酸が、一続きになった3つのランダム突然変異で置き換えられて、野生型タンパク質のそれぞれのセグメントの長さと比較して2つのアミノ酸残基が挿入されたことになるのは、本開示の範囲内である。そのような挿入または欠失は、本開示において突然変異誘発の対象となりうるペプチドセグメントのいずれにおいても、互いに独立して導入されうる。本開示の例示的一態様では、数個の突然変異の挿入が、選ばれたリポカリンスキャフォールドのループAB中に導入されうる（国際特許出願WO 2005/019256参照。この特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
「ランダム突然変異誘発」という用語は、前もって決定された単一アミノ酸（突然変異）が一定の配列位置に存在するのではなくて、突然変異誘発中に所定の配列位置に少なくとも2種類のアミノ酸が一定の確率で組み込まれうることを意味する。
「同一性」とは、配列間の類似性または関係性を測る配列の一特性である。本開示において使用する「配列同一性」または「同一性」という用語は、本開示のポリペプチドの配列を問題の配列と（相同）アラインメントした後の、それら2つの配列のうちの長い方の残基数を基準とした、ペアごとの同一残基のパーセンテージを意味する。配列同一性は、同一アミノ酸残基の数を残基の総数で割り、その結果に100を掛けることによって測られる。
「相同性」という用語は、本明細書では、その通常の意味で使用され、本開示のポリペプチド（例えば本開示の任意のリポカリンムテイン）の直鎖アミノ酸配列において等価な位置にある同一アミノ酸ならびに保存的置換とみなされるアミノ酸（例えばアスパラギン酸残基によるグルタミン酸残基の交換）を包含する。
配列相同性または配列同一性のパーセンテージは、ここでは、例えばプログラムBLASTP、バージョンblastp 2.2.5（2002年11月16日; Altschul, S. F. et al.（1997）Nucl. Acids Res. 25, 3389-3参照）を使って決定することができる。この態様において、相同性のパーセンテージは、プロペプチド配列を含む全ポリペプチド配列のアラインメントに基づき（行列: BLOSUM 62; ギャップコスト: 11.1; カットオフ値は10-3に設定）、好ましくは野生型タンパク質スキャフォールドを、ペアワイズ比較におけるリファレンスとして使用する。これは、アラインメントのためにプログラムが選択したアミノ酸の総数で割った、BLASTPプログラム出力に結果として示される「ポジティブ（positive）」（相同アミノ酸）の数のパーセンテージとして計算される。
具体的には、野生型リポカリンとは異なるリポカリン（ムテイン）のアミノ酸配列のアミノ酸残基が、野生型リポカリンのアミノ酸中の一定の位置に対応するかどうかを決定するために、当業者は、例えば手作業によるアラインメント、またはBLAST2.0（Basic Local Alignment Search Toolの略）もしくはClustalWなどのコンピュータプログラム、または配列アラインメントを作成するのに適した他の任意の適切なプログラムを使ったアラインメントなど、当技術分野において周知の手段および方法を使用することができる。したがって、野生型リポカリンが「対象配列」または「リファレンス配列」として役立ちうるのに対して、本明細書に記載する野生型リポカリンとは異なるリポカリンのアミノ酸配列は「クエリー配列」になる。「リファレンス配列」および「野生型配列」という用語は、本明細書では相互可換的に使用される。好ましい野生型リポカリンをSEQ ID NO:18（Tlc）またはSEQ ID NO:17（NGAL）にそれぞれ示す。本発明のリポカリンムテインがそれぞれTlcに基づくかNGALに基づくかに応じて、対応野生型リポカリンをリファレンス配列または野生型配列として使用しうる。
「ギャップ」とは、アミノ酸の付加または欠失の結果であるアラインメント中の空白をいう。したがって、厳密に同じ配列である2つのコピーは100％の同一性を有するが、それほど高度には保存されていなくて、欠失、付加、または置き換えを有する配列は、それより程度の低い配列同一性を有しうる。標準的なパラメータを使って配列同一性を決定するために、例えばBlast（Altschul, et al.（1997）Nucleic Acids Res. 25, 3389-3）、Blast2（Altschul, et al.（1990）J. Mol. Biol. 215, 403-3）、およびSmith-Waterman（Smith, et al.（1981）J. Mol. Biol. 147, 195-3）など、いくつかのコンピュータプログラムが利用可能であることは、当業者にはわかるであろう。
本開示において使用する用語「変異体」は、置換、欠失、挿入または化学修飾などによるアミノ酸配列の修飾を含む、タンパク質またはペプチドの誘導体に関する。そのような修飾は、いくつかの態様では、タンパク質またはペプチドの機能性を低減しない。そのような変異体には、1つまたは複数のアミノ酸が各々のD-立体異性体で置き換えられているか、20種類の天然アミノ酸以外のアミノ酸、例えばオルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、ノルバリンなどで置き換えられている、タンパク質が包含される。しかし、そのような置換は保存的であってもよく、すなわちアミノ酸残基は、化学的に類似するアミノ酸残基で置き換えられる。保存的置換の例は、以下のグループのメンバー間での置き換えである:1）アラニン、セリン、およびスレオニン; 2）アスパラギン酸およびグルタミン酸; 3）アスパラギンおよびグルタミン; 4）アルギニンおよびリジン; 5）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン;ならびに6）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。本開示のリポカリンムテインの、または本開示による組み合わせの、または本明細書に記載する融合タンパク質の、対応タンパク質リガンドであるCD137に関連して本明細書において使用する用語「変異体」は、それぞれ野生型CD137タンパク質、例えば本明細書に記載するとおりUniProtに登録されたCD137リファレンスタンパク質と比較して、1つまたは複数の、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80個またはそれ以上の、アミノ酸の置換、欠失および/または挿入を有する、それぞれ、CD137またはそのフラグメントに関する。CD137変異体は、それぞれ、好ましくは、野生型ヒトCD137、例えば本明細書に記載するとおりUniProtに登録されたCD137リファレンスタンパク質に対して、少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％または95％のアミノ酸同一性を有する。
「ネイティブ配列」リポカリンとは、自然から得られる対応ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するリポカリンを意味する。したがってネイティブ配列リポカリンは、任意の生物からの、特に哺乳動物からの、それぞれの天然リポカリンのアミノ酸配列を有することができる。そのようなネイティブ配列ポリペプチドは、自然から単離するか、組換え手段または合成手段によって生産することができる。「ネイティブ配列」ポリペプチドという用語は、リポカリンの天然切断型または天然分泌型、リポカリンの天然変異体型、例えば選択的スプライス型または天然対立遺伝子変異体を、特に包含する。ポリペプチド「変異体」とは、ネイティブ配列ポリペプチドに対して少なくとも約50％、60％、70％、80％または少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有する、生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、ポリペプチドのN末またはC末において1つまたは複数のアミノ酸残基が付加されまたは欠失しているポリペプチドが含まれる。一般に変異体は、ネイティブ配列ポリペプチドに対して、少なくとも約70％の、例えば少なくとも約80％、例えば少なくとも約85％の、アミノ酸配列同一性、例えば少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有する。具体例として、本開示の涙液リポカリン（Tlc）ムテインでは、タンパク質の生物学的機能に影響を及ぼすことなく、N末の最初の4アミノ酸残基（His-His-Leu-Leu）およびC末の最後の2アミノ酸残基（Ser-Asp）を欠失させることができる。例えばSEQ ID NO:32〜38。加えて、別の具体例として、本開示のリポカリン2（NGAL）ムテインでは、タンパク質の生物学的機能に影響を及ぼすことなく、一定のアミノ酸残基を、例えばSEQ ID NO:42については（Lys-Asp-Pro、位置46〜48）を、欠失させることができる。
本開示において使用する場合、「位置」という用語は、本明細書に示すアミノ酸配列内でのアミノ酸の位置、または本明細書に示す核酸配列内でのヌクレオチドの位置を意味する。1つまたは複数のリポカリンムテインのアミノ酸配列位置との関連で本明細書において使用される「対応する」または「対応」という用語を理解するために、対応位置は、先行するヌクレオチド/アミノ酸の数だけでは決定されない。したがって、本開示によれば、置換されうる所与のアミノ酸の位置は、（突然変異体または野生型）リポカリン中の他のどこかにあるアミノ酸の欠失または付加ゆえに、変動しうる。同様に、本開示によれば、置換されうる所与のヌクレオチドの位置も、ムテインまたは野生型リポカリン5'-非翻訳領域（UTR）、例えばプロモーターおよび/または他の任意の制御配列もしくは制御遺伝子（エクソンおよびイントロンを含む）中の他のどこかにある欠失または追加ヌクレオチドゆえに、変動しうる。
このように、本開示による対応位置に関して、ヌクレオチド/アミノ酸の位置は、類似の隣接ヌクレオチド/アミノ酸とは、表示される数字の点で異なりうるが、交換、欠失または付加されうる該隣接ヌクレオチド/アミノ酸も、当該1つまたは複数の対応位置によって含まれると理解されることが好ましい。
加えて、本開示によるリファレンススキャフォールドに基づくリポカリンムテイン中の対応位置については、リポカリン間の高度に保存された全体的フォールディングパターンに照らして当業者には理解されるとおり、ヌクレオチド/アミノ酸の位置は、たとえそれらが表示される数字の点で異なっていたとしても、（突然変異体または野生型）リポカリン中の他のどこかにある位置と、構造的に対応していると理解されることが好ましい。
本明細書において使用する「検出する」、「検出」、「検出可能な」または「検出すること」という単語は、定量的レベルおよび定性的レベルの両方で、ならびにそれらの組み合わせで、理解される。したがってこれは、関心対象の分子の定量的、半定量的および定性的測定を包含する。
「対象」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。「哺乳動物」という用語は、本明細書では、哺乳動物に分類される任意の動物を指すために使用され、ヒト、家畜および農用動物、ならびに動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、ブタ、サル、例えばカニクイザルなどを含むが、ここでは具体例をいくつか挙げただけで、これらに限定されるわけではない。好ましくは、本明細書における哺乳動物はヒトである。
「有効量」とは、有益な結果または所望の結果を達成するのに十分な量である。有効量は1回または複数回の投与で投与することができる。
「試料」は、任意の対象から採取された生物学的試料と定義される。生物学的試料には、血液、血清、尿、糞便、精液、または組織が包含されるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において開示する融合ポリペプチドの「サブユニット」は、当該ポリペプチドのうちの一続きのアミノ酸であって、その一続きが、該ポリペプチドのユニークな機能単位を規定しているもの、例えば標的に対する結合モチーフを与えるものと定義される。
III.図面の説明
標的HER2およびCD137に関して二重特異性である本願に記載の代表的融合ポリペプチドの設計を概観した図である。代表的融合ポリペプチドは、HER2に特異的な抗体（SEQ ID NO:3および4）とCD137に特異的なリポカリンムテイン（SEQ ID NO:2）とに基づいて作製された。抗体をリポカリンムテインと直接融合した結果、SEQ ID NO:5および6の融合ポリペプチドを得た。突然変異S228P、F234AおよびL235Aを持つ工学的に操作されたIgG4バックボーンを使って、抗体の4つの末部のいずれか1つに、リポカリンムテインを融合した（SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、SEQ ID NO:15および16）。加えて、融合ポリペプチドSEQ ID NO:7および8）内には、グリコシル化モチーフを除去するために、N297A突然変異を施した。
HER2に対する代表的融合ポリペプチドおよびベンチマーク抗体の親和性を決定したELISA実験の結果を示す図である。組換えHER2をマイクロタイタープレートにコーティングし、被験作用物質を100nMの濃度から出発してタイトレートした。結合した試験対象の作用物質は、実施例2に記載するように、抗ヒトIgG Fc抗体によって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。その結果得られたEC50値を表2に掲載する。
CD137に対する代表的融合ポリペプチドおよび陽性対照リポカリンムテインの親和性を決定したELISA実験の結果を示す図である。ヒトCD137のFc融合物をマイクロタイタープレートにコーティングし、被験作用物質を100nMの濃度から出発してタイトレートした。結合した試験対象の作用物質は、実施例3に記載するように、抗ヒトIgG-Fc抗体によって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。その結果得られたEC50値を表3に掲載する。
HER2およびCD137の両標的に同時に結合する代表的融合ポリペプチドの能力を決定したELISA実験の結果を図解している。組換えHER2をマイクロタイタープレートにコーティングした後、融合ポリペプチドのタイトレーションを100nMの濃度から出発して行った。次に、定濃度のビオチン化ヒトCD137-Fcを加え、それを実施例4に記載するように、エクストラビジン（extravidin）によって検出した。
T細胞応答を共刺激するSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドの能力を評価したT細胞活性化アッセイの結果を示す図である。SEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドを、複数の異なる濃度で、抗ヒトCD3抗体と一緒にプラスチック製ディッシュにコーティングし、次にその被覆表面上で精製T細胞をインキュベートした。上清インターロイキン2（IL-2）レベルを実施例5に記載するように測定した。
HER2標的依存的にT細胞活性化を共刺激するSEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチドの能力を調べた代表的実験を掲載する図である。本発明者らは、対照として、SEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体を使用した。この実験では、抗ヒトCD3抗体をプラスチック製培養ディッシュにコーティングし、次に、そのディッシュ上でHER2陽性SKBR3細胞を終夜培養した。翌日、その被覆表面上、さまざまな濃度の二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:9および10（黒丸）またはSEQ ID NO:3および4の対照抗体の存在下で、精製T細胞をインキュベートした。複数の異なる濃度でSEQ ID NO:3および4について決定された値を平均として掲載する（点線）。上清インターロイキン2（IL-2）（A）およびIFN-γ（B）を、電気化学ルミネセンスに基づくアッセイによって決定した。この実験を過剰量のSEQ ID NO:3および4の存在下でも行い、IL-2（C）およびIFN-γ（D）の上清レベルを測定した。データの当てはめは1:1結合モデルで行った。
HER2標的依存的にT細胞活性化を共刺激するSEQ ID NO:11および12の融合ポリペプチドの能力を調べた代表的実験を掲載する図である。詳しくは図6の説明文を参照されたい。
HER2標的依存的にT細胞活性化を共刺激するSEQ ID NO:13および14の融合ポリペプチドの能力を調べた代表的実験を掲載する図である。詳しくは図6の説明文を参照されたい。
HER2標的依存的にT細胞活性化を共刺激するSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドの能力を調べた代表的実験を掲載する図である。詳しくは図6の説明文を参照されたい。
実施例7および8に記載するFcgRI、FcgRIIIおよびFcRnに対するポリペプチドの親和性に関する代表的実験を掲載する図である。
複数の異なる細胞株を使って、図に表示した融合ポリペプチドの、T細胞活性化を共刺激する能力を調べた、代表的実験を掲載する図である。利用した細胞株は、高HER2陽性細胞（SKBR3、BT474）および健常細胞と類似するレベルでHER2を発現する細胞株（HepG2、MCF7）であった。この実験では、抗ヒトCD3抗体をプラスチック製培養ディッシュにコーティングし、次に、試験対象の細胞株をそのディッシュ上で終夜培養した。翌日、その被覆表面上、さまざまな濃度の、次に挙げる二重特異性融合ポリペプチドの存在下で、精製T細胞を3日間インキュベートした:（A）SEQ ID NO:9および10（実線）またはSEQ ID NO:3および4の対照抗体（破線）、（B）抗CD137抗体SEQ ID NO:32および33、（C）抗CD137抗体SEQ ID NO:34および35。上清インターロイキン2レベルは、電気化学ルミネセンスに基づくアッセイによって決定した。プロットした相対的IL-2応答は、試験物の存在下で得られる応答と試験物の非存在下で得られる応答（「バックグラウンド」）の比に相当する。
pH7.4のPBS中、40℃で4週間のインキュベーション前（下側の曲線）およびインキュベーション後（上側の曲線）の、二重特異性融合ポリペプチドならびにSEQ ID NO:3および4の対照抗体の代表的なサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）トレースを掲載する図である。試料濃度はいずれの場合も20mg/mlとし、融合ポリペプチドの実体は図中に示したとおりである。SEC曲線は視認しやすいようにy軸方向にずらしてプロットされている。
マウスにおける二重特異性融合ポリペプチドならびにSEQ ID NO:3および4の対照抗体の薬物動態分析の結果を掲載する図である。雄CD-1マウス（各時点3匹）に融合ポリペプチドを10mg/kgの用量で静脈内注射した。薬物レベルは、標的HER2およびCD137によって完全な二重特異性コンストラクトを検出するサンドイッチELISAを使って検出した。トラスツズマブの血漿中レベルは、標的HER2およびヒトFcによるサンドイッチELISAを使って決定した。データの当てはめは2コンパートメントモデルを使って行った。
マウスにおける二重特異性融合ポリペプチドならびにSEQ ID NO:3および4の対照抗体の薬物動態分析の結果を掲載する図である。雄トラスツズマブ-ナイーブ・カニクイザルに、試験物を、継続時間60分の静脈内注入として3mg/kgの用量で与えた。薬物レベルは、標的HER2およびCD137によって完全な二重特異性コンストラクトを検出するサンドイッチELISAを使って検出した。トラスツズマブの血漿中レベルは標的HER2およびヒトFcによるサンドイッチELISAを使って決定した。データの当てはめは2コンパートメントモデルを使って行った。
二重特異性融合ポリペプチド、SEQ ID NO:3および4の対照抗体、ならびに陽性対照キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）のインビトロT細胞免疫原性評価の結果を掲載する図である。このアッセイは、32人のドナー、および世界人口における分布を反映したヒト白血球抗原（HLA）アロタイプで、実施例13に記載のPBMCに基づくフォーマットを使って行われた。（A）刺激指数（試験物の存在下および非存在下での増殖の対比）。平均応答をバーとして示す。応答ドナーを規定するしきい（刺激指数＞2）を点線として示す。（B）応答者の数。
ヒト化マウス腫瘍モデルにおけるCD137/HER2二重特異性物質または対照による処置後の相対的メジアン腫瘍体積。NSGマウスの皮下（s.c.）にSK-OV-3腫瘍を移植し、それを平均120mm3まで成長させた。マウスを処置群にランダムに割り当て、マウスに、7×106個の新鮮ヒトPBMCを静脈内（i.v.）投与し、0日目はPBMC注射の1時間後に、また7日目と14日目にも再び、表示した分子および用量を与えた。各群が含むマウスは10匹であるが、SEQ ID NO:32および33を調べる群は例外で、7匹のマウスからなった。腫瘍成長を3〜4日ごとに記録した。
HER2high NCI-N87標的細胞に依存してCD137経路を活性化する、図示した融合ポリペプチドの能力を調べた、代表的実験を掲載する図である。この実験では、NCI-N87腫瘍標的細胞をディッシュ上で終夜培養した。次の日、被覆標的細胞に、以下のとおり、さまざまな濃度の二重特異性融合ポリペプチドの存在下で、NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkatレポーター細胞を加えた。（A）SEQ ID NO:9および10（実線）またはSEQ ID NO:3および4の対照抗体（破線）。（B）抗CD137抗体SEQ ID NO:32および33。（C）抗CD137抗体SEQ ID NO:34および35。ルミネセンスシグナル（RLU）は、CD137経路活性化の相対的測定値に相当する。Graph Pad Prismソフトウェアで4パラメータ・ロジスティック曲線分析を行った。
（A）は、ヒト化マウス腫瘍モデルにおけるCD137/HER2二重特異性物質または対照による処置後のメジアン腫瘍体積を表す。NOGマウスの皮下（s.c.）にSK-OV-3腫瘍を移植し、それを平均120mm3まで成長させた。マウスを処置群にランダムに割り当て、マウスに、7×106個の新鮮ヒトPBMCを静脈内（i.v.）投与し、0日目はPBMC注射の1時間後に、また7日目と14日目にも再び、表示した分子および用量を与えた。各群が含むマウスは10匹であった。腫瘍成長を週に2回、20日間記録した。（B）は、処置後20日目に収穫した2匹のマウスからの腫瘍におけるヒトT細胞の浸潤に関するマーカーとしてのヒトリンパ球マーカーCD45に関する免疫組織化学検査の結果を表す。
（A）は、実施例16の処置群および対照群の、試験19日目に採取したPMBCのCD45、CD3およびCD8表現型を表す。図19Aの左側は、ヒトCD45を発現する総PMBCのパーセンテージを表し、図19Aの右側は、CD3およびCD8も発現するCD45発現PMBCのパーセンテージを表す。この図は、抗CD137mAb処置群におけるCD8＋ヒトエフェクターT細胞拡大の増加を表している。（B）は、実験16の処置群および対照群の死亡数を表す。図19Bにプロットした値は、10匹の群ごとの、自然に死亡するかまたは所定の全身状態基準に基づいて屠殺する必要があったマウスの数に相当する。
実施例18の処置群および対照群の死亡数。プロットした値は、10匹の群（SEQ ID NO:9および10、4μg: 9匹の群）ごとの、自然に死亡するかまたは所定の全身状態基準に基づいて屠殺する必要があったマウスの数に相当する。
ヒト化マウス腫瘍モデルにおけるCD137/HER2二重特異性物質または対照による処置後の相対的メジアン腫瘍体積。NSGマウスの皮下（s.c.）にSK-OV-3腫瘍を移植し、それを平均110mm3まで成長させた。マウスを処置群にランダムに割り当て、マウスに、7×106個の新鮮ヒトPBMCを静脈内投与し、0日目はPBMC注射の1時間後に、また7日目と14日目にも再び、表示した分子および用量の腹腔内注射を与えた。各群が含むマウスは10匹であるが、第7群（SEQ ID NO:9および10、4μg）は例外で、9匹しか含まなかった。腫瘍成長を3〜4日ごとに記録した。
ヒトCD45陽性リンパ球の免疫組織化学検査。腫瘍を腫瘍担持マウスから切除した。各群最大6つの腫瘍をホルマリン固定し、パラフィンに包埋し、抗ヒトCD45抗体を使って、免疫組織化学検査用に処理した。CD45陽性細胞は、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）染色によって同定した。グレースケール画像中のDAB陽性を明確に視覚化することができるように、画像のコントラストおよび輝度をデジタルに調整した。
図22に示す画像のDAB陽性のデジタル定量。この図は、さまざまな対照と比較した場合の、SEQ ID NO:9および10で処置した群におけるhCD45陽性ヒトリンパ球の頻度の増加を例証している（詳細については実施例17を参照されたい）。
実施例18の処置群および対照群の、試験19日目に採取したPMBCの表現型。（A）ヒトCD45を発現する総PMBCのパーセンテージ。（B）CD8を発現するCD45発現PMBCのパーセンテージ。この図は、陰性対照ならびにSEQ ID NO:9および10処置群と比較した、抗CD137 mAb（SEQ ID NO:32および33）処置群におけるCD8＋ヒトエフェクターT細胞拡大の増加を表している。
IV.開示の詳細な説明
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、任意の順序で、少なくとも2つのサブユニット、すなわちHER2/neuに特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含む第1サブユニットと、CD137に特異的なリポカリンムテインを含む第2サブユニットとを含有する。
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、任意の順序で、少なくとも2つのサブユニット、すなわちHER2/neuに特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含む第1サブユニットと、CD137に特異的なリポカリンムテインを含む第2サブユニットとを含有する。
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは第3サブユニットも含有しうる。例えばポリペプチドはCD137に特異的なサブユニットを含有しうる。いくつかの態様において、該第3サブユニットはCD137に特異的なリポカリンムテインを含む。
いくつかの態様では、1つのサブユニットを、本質的に図1に記載するように、別のサブユニットに連結することができる。例えば、1つのリポカリンムテインを、ペプチド結合を介して、免疫グロブリン重鎖ドメイン（VH）のC末、VHのN末、免疫グロブリン軽鎖（VL）のC末、および/またはVLのN末に連結することができる（図1参照）。いくつかの特定態様では、リポカリンムテインサブユニットを、そのN末および/またはそのC末で、免疫グロブリンサブユニットに融合することができる。例えば、リポカリンムテインは、免疫グロブリンの重鎖定常領域（CH）のC末または軽鎖定常領域（CL）のC末との間のペプチド結合を介して連結しうる。いくつかのさらなる態様において、ペプチド結合は、例えばSEQ ID NO:19に示す、構造化されていない（G4S）3リンカーでありうる。
この点に関して、1つのサブユニットを、そのN末および/またはそのC末で、別のサブユニットに融合しうる。例えば、1つのサブユニットが完全長免疫グロブリンを含む場合、別のサブユニットは、第2サブユニットのN末と該免疫グロブリンの重鎖定常領域（CH）のC末との間のペプチド結合を介して連結しうる。いくつかのさらなる態様では、第3サブユニットを、第3結合ドメインのN末と該免疫グロブリンの軽鎖定常領域（CL）のC末との間でペプチド結合を介して連結しうる。いくつかのさらなる態様において、ペプチド結合は、例えばSEQ ID NO:19に示す、構造化されていない（G4S）3リンカーでありうる。
サブユニットの1つが完全長免疫グロブリンを含む本開示の融合ポリペプチドであって、HER2/neuおよびCD137に同時に会合するポリペプチドに関するいくつかの態様において、Fc受容体陽性細胞に対する完全長免疫グロブリンのFc領域のFc機能は、同時に保存されていてもよい。
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるCD137特異的サブユニットは、CD137に特異的なリポカリンムテイン、例えばSEQ ID NO:2のリポカリンムテインでありうる。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるCD137特異的サブユニットは、CD137に特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメイン、例えばモノクローナル抗体（例えばSEQ ID NO:3および4の抗体）でありうる。
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるHER2/neu特異的サブユニットは、HER2/neuに特異的なリポカリンムテインでありうる。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるHER2/neu特異的サブユニットは、HER2/neuに特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインでありうる。
いくつかの態様では、本開示の融合ポリペプチドにおいて、CD137特異的サブユニットはHER2/neu特異的サブユニットに融合されている。
いくつかのより具体的な態様では、HER2/neu特異的サブユニットが完全長免疫グロブリン（モノクローナル抗体など）またはその抗原結合ドメインを含み、CD137特異的サブユニットがリポカリンムテインを含む。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、SEQ ID NO:5および6、7および8、9および10、11および12、13および14、または15および16からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
サブユニットの1つが完全長免疫グロブリンを含む本開示の融合ポリペプチドであって、HER2/neuおよびCD137に同時に会合するポリペプチドに関する他のいくつかの態様では、Fc受容体陽性細胞に対する完全長免疫グロブリンのFc領域のFc機能を、タンパク質工学によって低減または完全に抑制しうる。これは、例えばIgG1バックボーンからIgG4へと切り替えることによって達成されうる。IgG4はIgG1と比較して低減したFc-ガンマ受容体相互作用を呈することが公知だからである。Fc-ガンマ受容体への残存結合をさらに低減するために、IgG4バックボーンに、F234AおよびL235Aなどの突然変異を導入してもよい。加えて、IgG4半抗体の交換を最小限に抑えるために、S228P突然変異をIgG4バックボーンに導入しうる。いくつかのさらなる態様では、天然のグリコシル化モチーフを除去するために、追加のN297A突然変異が融合ポリペプチドの免疫グロブリン重鎖に存在しうる。実施例7は、アイソタイプのサブクラスに修飾を加えること、またはアイソタイプを工学的に操作することが、Fc受容体結合の喪失をもたらすことの証拠を提供している。
サブユニットの1つが完全長免疫グロブリンを含む本開示の融合ポリペプチドであって、HER2/neuおよびCD137に同時に会合するポリペプチドに関する他のいくつかの態様では、Fc領域が、例えばアイソタイプまたはアイソタイプのサブクラスを切り替えることによって、または工学的に操作することによって、例えば本明細書において記載するようにアイソタイプを工学的に操作することによって、修飾が加えられていてもよいにもかかわらず、新生児型Fc受容体（FcRn）陽性細胞に対する完全長免疫グロブリンのFc領域のFc機能は保たれている。実施例8は、Fc修飾を受けた（Fc-modified）またはFc操作を受けた（Fc-engineered）本開示の融合ポリペプチドのFc領域がFcRnへの結合を保っていることの証拠を提供している。
いくつかの態様では、腫瘍細胞上のHER2への、そしてT細胞またはNK細胞などの免疫系からのエフェクター細胞の表面上のCD137への、同時結合に起因して、本開示の融合ポリペプチドは、HER2依存的なエフェクター細胞活性化を呈することができ、それにより、免疫系のエフェクター細胞はHER2発現腫瘍細胞を能動的に溶解する。
いくつかのさらなる態様において、融合ポリペプチドは、例えば本質的にChacon, J. A. et al., PloS one 2013 8（4）:e60031に記載されているように標的依存的な腫瘍浸潤性リンパ球拡大をエクスビボで証明するアッセイにおいて測定した場合に、当該融合ポリペプチドに含まれる免疫グロブリンに匹敵するかそれより優れたレベルのHER2依存的CD137活性化を示す能力を有する。いくつかのさらなる態様において、融合ポリペプチドは、例えば本質的にKohrt, H. et al, J Clin Invest. 2012 Mar;122（3）:1066-75に記載されているようにヒト乳がんのインビボ異種移植片モデルにおいて測定した場合に、当該融合ポリペプチドに含まれる免疫グロブリンに匹敵するかそれより優れたレベルのHER2依存的CD137活性化を示す能力を有する。
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる免疫グロブリンのFc部分は、体内での融合ポリペプチドの安定性および残留性にとって極めて重要な、融合ポリペプチドの血清中レベルの維持に貢献しうる。例えば、Fc部分が内皮細胞上および食細胞上のFc受容体に結合すると、融合ポリペプチドは細胞内に移行して、血流へと再循環されることで、体内でのその半減期を向上させうる。
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、当該融合ポリペプチドに含まれるCD137に特異的なリポカリンムテイン、例えばSEQ ID NO:2のリポカリンムテインのEC50値と比べて、例えば該リポカリンムテインおよびポリペプチドを本質的に実施例3に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも同じくらいかそれより優れたEC50値で、CD137に結合することができうる。
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、例えばポリペプチドを本質的に実施例3に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約1nMまたはそれ未満、例えば約0.6nM、約0.5nM、約0.4nMまたは約0.3nMのEC50値で、CD137に結合することができうる。
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、当該融合ポリペプチドに含まれるHER2/neuに特異的な免疫グロブリン、例えばSEQ ID NO:3および4によって与えられる重鎖および軽鎖を有する抗体のEC50値と比べて、例えば該免疫グロブリンおよび融合ポリペプチドを本質的に実施例2に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、匹敵するEC50値で、HER2/neuに結合することができうる。
別の一局面において、融合ポリペプチドは、ポリペプチドを本質的に実施例2に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約1nMまたはそれ未満、例えば約0.4nM、約0.3nMまたは約0.2nMのEC50値で、HER2/neuをそのリガンドに結合させることができうる。
いくつかの態様において、CD137とHER2/neuとの両方に特異的な本開示の融合ポリペプチドは、例えば該融合ポリペプチドを本質的に実施例4に記載するELISAアッセイにおいて測定した場合に、CD137およびHER2/neuに同時に結合する能力を有しうる。
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、本質的に実施例5に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞応答共刺激する能力を有しうる。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、本質的に実施例5に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、IL-2および/またはIFNガンマ分泌ならびにT細胞増殖を誘発することができうる。いくつかのさらなる態様において、本開示の融合ポリペプチドは、本質的に実施例5に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞活性化の成功をもたらしうる。いくつかのさらなる態様において、本開示の融合ポリペプチドは、本質的に実施例6に記載するように、HER2/neu陽性腫瘍細胞の近傍において、T細胞によるIL-2および/またはIFNガンマの生産の局所的誘発をもたらしうる。本明細書にいう「HER2/neu陽性細胞の近傍において」とは、共に結合されている、すなわち1つの、同じ、本開示の融合ポリペプチドによって「連結」されている、結合されたT細胞とHER2/neu陽性腫瘍細胞との間の距離を意味する。
A.融合ポリペプチドに含まれる例示的免疫グロブリン
いくつかの態様では、融合ポリペプチドに関して、第1結合ドメインは、HER2/neuに特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含む。免疫グロブリンは、例えばIgG1またはIgG4でありうる。さらなる態様において、免疫グロブリンは、HER2/neuに対するモノクローナル抗体である。そのような免疫グロブリンの具体例をいくつか挙げると、トラスツズマブ（商品名Herclon、Herceptin）およびペルツズマブ（2C4とも呼ばれる、商品名Perjeta）がある。
いくつかの態様では、融合ポリペプチドに関して、第1結合ドメインは、HER2/neuに特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含む。免疫グロブリンは、例えばIgG1またはIgG4でありうる。さらなる態様において、免疫グロブリンは、HER2/neuに対するモノクローナル抗体である。そのような免疫グロブリンの具体例をいくつか挙げると、トラスツズマブ（商品名Herclon、Herceptin）およびペルツズマブ（2C4とも呼ばれる、商品名Perjeta）がある。
B.融合ポリペプチドに含まれる例示的リポカリンムテイン
本明細書にいう「リポカリン」は、複数（好ましくは4つ）のループにより一端においてペアワイズに接続されることで結合ポケットを規定している複数（好ましくは8つ）のβストランドを含む円柱状のβプリーツシート超二次構造領域を有する、重量が約18〜20kDAの単量体型タンパク質と定義される。サイズ、形状、および化学的特徴が異なる標的を収容する能力をそれぞれが有するリポカリンファミリーメンバー間に、さまざまな異なる結合様式を生じさせるのは、他の点では剛直なリポカリンスキャフォールドにおけるループの多様性である（例えばFlower, D.R.（1996）,前掲; Flower, D.R. et al.（2000）,前掲、またはSkerra, A.（2000）Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-3に概説されている）。事実、リポカリンタンパク質ファミリーは、広範なリガンドに結合するように、自然に進化しており、それらが共有する全体的配列保存のレベルは異常に低い（多くの場合、配列同一性は20％未満である）にもかかわらず、高度に保存された全体的フォールディングパターンを保っている。さまざまなリポカリンにおける位置間の対応は当業者には周知である。例えば米国特許第7,250,297号を参照されたい。
本明細書にいう「リポカリン」は、複数（好ましくは4つ）のループにより一端においてペアワイズに接続されることで結合ポケットを規定している複数（好ましくは8つ）のβストランドを含む円柱状のβプリーツシート超二次構造領域を有する、重量が約18〜20kDAの単量体型タンパク質と定義される。サイズ、形状、および化学的特徴が異なる標的を収容する能力をそれぞれが有するリポカリンファミリーメンバー間に、さまざまな異なる結合様式を生じさせるのは、他の点では剛直なリポカリンスキャフォールドにおけるループの多様性である（例えばFlower, D.R.（1996）,前掲; Flower, D.R. et al.（2000）,前掲、またはSkerra, A.（2000）Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-3に概説されている）。事実、リポカリンタンパク質ファミリーは、広範なリガンドに結合するように、自然に進化しており、それらが共有する全体的配列保存のレベルは異常に低い（多くの場合、配列同一性は20％未満である）にもかかわらず、高度に保存された全体的フォールディングパターンを保っている。さまざまなリポカリンにおける位置間の対応は当業者には周知である。例えば米国特許第7,250,297号を参照されたい。
上記のとおり、リポカリンは、その超二次構造、すなわち4つのループにより一端においてペアワイズに接続されることで結合ポケットを規定している8つのβストランドを含む円柱状のβプリーツシート超二次構造領域によって規定されるポリペプチドである。本開示は、本明細書において具体的に開示するリポカリンムテインに限定されない。この点に関して、本開示は、4つのループにより一端においてペアワイズに接続されることで結合ポケットを規定している8つのβストランドを含む円柱状のβプリーツシート超二次構造領域を有するリポカリンムテインであって、前記4つのループのうちの少なくとも3つのそれぞれの少なくとも1つのアミノ酸が変異しており、CD137に検出可能な親和性で結合するのに有効であるリポカリンムテインに関する。
一特定態様において、本明細書に開示するリポカリンムテインは、リポカリン-1、涙液プレアルブミンまたはフォン・エブネル腺タンパク質とも呼ばれるヒト涙液リポカリン（TLPCまたはTlc）のムテインである。本明細書において使用する用語「ヒト涙液リポカリン」または「Tlc」または「リポカリン-1」は、SWISS-PROT/UniProtデータバンクアクセッション番号P31025（アイソフォーム1）の成熟ヒト涙液リポカリンを指す。SWISS-PROT/UniProtデータバンクアクセッション番号P31025に示されるアミノ酸配列は、好ましい「リファレンス配列」として使用することができ、より好ましくは、SEQ ID NO:18に示すアミノ酸配列がリファレンス配列として使用される。
別の一特定態様において、本明細書に開示するリポカリンムテインは、ヒトリポカリン2のムテインである。本明細書において使用する用語「ヒトリポカリン2」または「ヒトLcn2」または「ヒトNGAL」は、SWISS-PROT/UniProtデータバンクアクセッション番号P80188の成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）を指す。本開示のヒトリポカリン2ムテインを、本明細書では、「hNGALムテイン」と呼ぶ場合もある。SWISS-PROT/UniProtデータバンクアクセッション番号P80188に示されるアミノ酸配列は、好ましい「リファレンス配列」として使用することができ、より好ましくは、SEQ ID NO:17に示すアミノ酸配列がリファレンス配列として使用される。
いくつかの態様において、CD137に検出可能な親和性で結合するリポカリンムテインは、ネイティブシステイン残基の、別のアミノ酸、例えばセリン残基による、アミノ酸置換を、少なくとも1つは含みうる。他のいくつかの態様において、CD137に検出可能な親和性で結合するリポカリンムテインは、野生型リポカリンの1つまたは複数のアミノ酸を置換する1つまたは複数の非ネイティブシステイン残基を含みうる。さらなる一特定態様において、本開示によるリポカリンムテインは、システイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を少なくとも2つは含み、それによって1つまたは複数のシステイン架橋を形成している。いくつかの態様において、該システイン架橋は少なくとも2つのループ領域を接続しうる。これらの領域の定義は、本明細書では、Flower（Flower, 1996,前掲、Flower, et al., 2000,前掲）およびBreustedt et al.（2005,前掲）に従って使用される。関連態様において、本開示は、CD137に結合することによってCD137の下流シグナリング経路を活性化する能力を有する1つまたは複数のリポカリンムテインを教示する。
CD137へと方向づけられた、またはCD137に特異的な、本開示のタンパク質は、明確なタンパク質スキャフォールドに基づく多くの特異的結合タンパク質ムテインを包含する。交換され、欠失し、または挿入されるヌクレオチドまたはアミノ酸のそれぞれの数は、好ましくは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上、例えば25、30、35、40、45または50個であり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11個は好ましく、9、10または11個はさらに好ましい。ただし、本開示のリポカリンムテインは、依然として、CD137に結合する能力を有することが好ましい。
一局面において、本開示は、CD137に少なくとも検出可能な親和性で結合するさまざまなリポカリンムテインを包含する。この意味で、CD137は、リファレンス野生型リポカリンの非天然リガンドであるとみなすことができ、ここで「非天然リガンド」とは、生理的条件下で野生型リポカリンに結合しない化合物を指す。野生型リポカリンを一定の配列位置における1つまたは複数の突然変異で工学的に操作することにより、本発明者らは、非天然リガンドであるCD137に対する高い親和性および高い特異性が可能であることを証明した。いくつかの態様では、野生型リポカリン上の一定の配列位置をコードする1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個またはそれ以上のヌクレオチドトリプレットにおいて、ヌクレオチドトリプレットの部分集合でこれらの位置における置換を行うことによって、ランダム突然変異誘発を実行しうる。
さらに、本開示のリポカリンムテインは、リファレンスリポカリンの直鎖ポリペプチド配列の一定の配列位置に対応する配列位置のうちの任意の1つまたは複数に、例えば少なくとも任意の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個に、変異アミノ酸残基を有しうる。
本開示のタンパク質は、変異アミノ酸配列位置以外では、「親」タンパク質スキャフォールド（リポカリンなど）の野生型（天然）アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様において、本開示によるリポカリンムテインは、1つまたは複数の配列位置に1つまたは複数のアミノ酸突然変異も、そのような突然変異が当該ムテインの結合活性およびフォールディングを、少なくとも本質的には、阻止することも、妨害することもないのであれば、保持しうる。そのような突然変異は、確立された標準的方法（Sambrook, J. et al.（2001）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）を使って、DNAレベルで非常に容易に実現することができる。アミノ酸配列改変の具体例は、挿入または欠失およびアミノ酸置換である。そのような置換は保存的でありうる。すなわち、アミノ酸残基は、特性が、とりわけ極性およびサイズに関して、化学的に類似しているアミノ酸残基で置き換えられる。保存的置換の例は、以下のグループのメンバー間での置き換えである:1）アラニン、セリン、およびスレオニン; 2）アスパラギン酸およびグルタミン酸; 3）アスパラギンおよびグルタミン; 4）アルギニンおよびリジン; 5）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン;ならびに6）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。他方、アミノ酸配列中に非保存的改変を導入することも可能である。加えて、単一のアミノ酸残基を置き換える代わりに、ヒト涙液リポカリンの一次構造のうちの1つまたは複数の連続アミノ酸を挿入または欠失させることも、それらの欠失または挿入が安定なフォールディングされた/機能的ムテイン（例えばN末およびC末が切断されたTlcムテイン）をもたらす限りにおいて、可能である。そのようなムテインでは、例えば、ポリペプチドのN末またはC末において、1つまたは複数のアミノ酸残基を付加し、または欠失させる。一般にそのようなムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列に対して、およそ少なくとも70％、例えば少なくとも約80％、例えば少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有しうる。一具体例として、本開示は、成熟ヒト涙液リポカリンの配列のN末の最初の4アミノ酸残基（His-His-Leu-Leu;位置1〜4）および/または成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列のC末の最後の2アミノ酸残基（Ser-Asp;位置157〜158）を欠失させた、上に定義したTlcムテイン（SEQ ID NO:32〜38）も包含する。加えて、別の一具体例として、本開示は、成熟ヒトリポカリン2（hNGAL）の直鎖ポリペプチド配列のアミノ酸残基（Lys-Asp-Pro、位置46〜48）を欠失させた、上に定義したNGALムテイン（SEQ ID NO:42）も包含する。
本明細書において開示するリポカリンムテインのアミノ酸配列は、他のリポカリンとの配列同一性と比較した場合に、リファレンスリポカリンに対して高い配列同一性を有する。この一般的状況において、本開示のリポカリンムテインのアミノ酸配列は、リファレンスリポカリンのアミノ酸配列に、少なくとも実質的に類似している。ただし、アミノ酸の付加または欠失の結果であるアラインメント中のギャップ（以下に定義する）は、おそらく存在するであろう。リファレンスリポカリンの配列に実質的に類似する本開示のリポカリンムテインのそれぞれの配列は、いくつかの態様では、リファレンスリポカリンの配列に対して、少なくとも70％の同一性または配列相同性、少なくとも75％の同一性または配列相同性、少なくとも80％の同一性または配列相同性、少なくとも82％の同一性または配列相同性、少なくとも85％の同一性または配列相同性、少なくとも87％の同一性または配列相同性、または少なくとも90％の同一性もしくは配列相同性、例えば少なくとも95％の同一性または配列相同性を有する。ただし、改変された位置または配列は保たれており、1つまたは複数のギャップが可能である。
本明細書において、本開示のリポカリンムテインは、それが、ある標的（例えばCD137）と1つまたは複数のリファレンス標的とを区別することができるのであれば、当該標的に「特異的に結合」する。結合特異性は絶対的特性ではなく相対的特性だからである。「特異的結合」は、例えばウェスタンブロット、ELISA試験、RIA試験、ECL試験、IRMA試験、FACS、IHCおよびペプチドスキャンに従って決定することができる。
一態様において、本開示のリポカリンムテインは、そのN末および/またはそのC末において、ムテインの血清中半減期を延ばすタンパク質ドメインである融合パートナーに融合される。さらなる特定態様において、前記タンパク質ドメインは、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合タンパク質である。
別の一態様において、本開示のリポカリンムテインは、ムテインの血清中半減期を延ばす化合物にコンジュゲートされる。より好ましくは、ムテインは、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロエチルデンプン（hydroethylstarch）、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群より選択される化合物にコンジュゲートされる。
さらに別の一態様において、本開示は、本明細書において開示するリポカリンムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関係する。本開示は該核酸分子を含有する宿主細胞を包含する。
一局面において、本開示は、CD137に結合するヒトリポカリンムテイン、およびその有用な応用を提供する。本開示は、本明細書に記載するCD137結合タンパク質を作製する方法、ならびにそのようなタンパク質を含む組成物も提供する。本開示のCD137結合タンパク質およびその組成物は、試料中のCD137を検出する方法において、または対象におけるCD137の結合方法において、使用されうる。本開示が提供する用途に付随するこれらの特徴を有するそのようなヒトリポカリンムテインが、以前に記載されたことはなかった。
1. CD137に特異的な例示的リポカリンムテイン
一局面において、本開示は、CD137結合性ヒト涙液リポカリンムテインを提供する。
一局面において、本開示は、CD137結合性ヒト涙液リポカリンムテインを提供する。
この点に関して、本開示は、KDで測って約300nM以下、さらには約100nM以下の親和性で、CD137に結合する能力を有する1つまたは複数のTlcムテインを提供する。
いくつかの態様において、そのようなTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:18）の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基を含む。
いくつかの特定態様において、そのようなTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列の位置26〜34、55〜58、60〜61、65、104〜106および108に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基を含有しうる。
さらなる特定態様において、そのようなTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列の位置101、111、114および153に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基をさらに含みうる。
別の特定態様において、Tlcは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1つまたは複数の位置に変異アミノ酸残基を含有しうる。
いくつかのさらなる態様において、Tlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列の配列位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1つまたは複数の配列位置に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26個、またはさらにそれ以上の変異アミノ酸残基を含むことができ、ここで該ポリペプチドは、CD137、特にヒトCD137に結合する。
いくつかのさらなる態様において、本開示は、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列との比較において、配列位置526〜34、55〜58、60〜61、65、104〜106、および108に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個、またはさらにそれ以上の変異アミノ酸残基を含むTlcムテインであり、かつCD137、特にヒトCD137に結合する、ポリペプチドに関する。
いくつかの態様において、本開示によるリポカリンムテインは、ネイティブシステイン残基の、例えばセリン残基によるアミノ酸置換を、少なくとも1つは含みうる。いくつかの態様において、本開示によるTlcムテインは、位置61および/または153にあるネイティブシステイン残基の、セリン残基などの別のアミノ酸によるアミノ酸置換を含む。これとの関連において、システイン残基61および153によって形成される野生型涙液リポカリンの構造ジスルフィド結合（Breustedt, et al., 2005,前掲参照）の（それぞれのナイーブ核酸ライブラリーのレベルでの）除去が、安定にフォールディングされるだけでなく、所与の非天然リガンドに高い親和性で結合することもできる涙液リポカリンムテインを与えうることがわかっていることに注目されたい。いくつかの特定態様において、本開示によるTlcムテインは、アミノ酸置換Cys61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Gly、Gln、Asp、Asn、Leu、Tyr、Met、Ser、ProまたはTrp、およびCys153→SerまたはAlaを含む。そのような置換は、Cys61とCys153とを連結する天然ジスルフィド架橋の形成を防止するのに有用であり、よってムテインの取り扱いを容易にすることが判明している。ただし、CD137に結合し、かつCys61とCys153との間に形成されたジスルフィド架橋を有する涙液リポカリンムテインも、本発明の一部である。
いくつかの態様では、構造ジスルフィド結合の排除により、本開示のムテインへの非天然人工ジスルフィド結合の（自発的）生成または計画的導入が可能になり、それによってムテインの安定性が増加するという、さらなる利点が得られうる。例えば、いくつかの態様では、位置61、101および153にあるシステインコドンの2つまたは3つすべてが、別のアミノ酸のコドンで置き換えられる。さらに、いくつかの態様において、本開示によるTlcムテインは、位置101にあるネイティブシステイン残基の、セリン残基またはヒスチジン残基によるアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、本開示によるムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列に関して位置28または105に、システイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を含む。
さらに、いくつかの態様において、本開示によるムテインは、位置111にあるネイティブアルギニン残基の、プロリン残基によるアミノ酸置換を含む。さらに、いくつかの態様において、本開示によるムテインは、位置114にあるネイティブリジン残基の、トリプトファン残基またはグルタミン酸によるアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、本発明によるCD137結合性Tlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:18）の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1つまたは複数の位置に、以下の変異アミノ酸残基:
のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、本開示によるTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンのこれらの配列位置における変異アミノ酸残基を、2つ以上、例えば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個、さらにはそれ以上、例えば13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26個、またはすべて含む。
いくつかのさらなる態様において、CD137に結合するTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下の組のアミノ酸置換:
のうちの1つを含む。
残りの領域、すなわち配列位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153とは異なる領域において、本開示のTlcムテインは、変異アミノ酸配列位置以外では、野生型（天然）アミノ酸配列を含みうる。
さらなる態様において、本開示によるTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの配列（SEQ ID NO:18）に対して、少なくとも70％の配列同一性または少なくとも70％の配列相同性を有する。
さらなる特定態様において、本開示のTlcムテインは、SEQ ID NO:32〜38のいずれか1つに示すアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
さらなる特定態様において、本開示のTlcムテインは、SEQ ID NO:32〜38からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％またはそれ以上の配列同一性を有する。
本開示は、SEQ ID NO:32〜38からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するTlcムテインの構造ホモログであって、該Tlcムテインとの関係において約60％超、好ましくは65％超、70％超、75％超、80％超、85％超、90％超、92％超、最も好ましくは95％超のアミノ酸配列相同性または配列同一性を有する構造ホモログも包含する。
本開示によるTlcムテインは、天然型のヒト涙液リポカリンの突然変異誘発を使って得ることができる。突然変異誘発のいくつかの態様において、置換（すなわち置き換え）は保存的置換である。しかしながら、リポカリンムテインがCD137に結合するその能力を保っており、かつ/または、それが、成熟ヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列（SWISS-PROTデータバンクアクセッション番号P31025）に対する少なくとも60％、例えば少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％またはそれ以上の配列同一性であるという点においてそのとき置換される配列に対して配列同一性を有する限り、非保存的置換、または下記の例示的置換からの1つまたは複数を含む、任意の置換が想定される。
いくつかの特定態様において、本開示は、KDで測って約200nM以下の親和性でCD137に結合するTlcムテインを提供する。
いくつかのさらなる態様において、本開示のTlcムテインは、CD137へのCD137Lの結合を妨害しない。
別の一局面において、本開示は、CD137へと方向づけられた、またはCD137に特異的な、新規特異的結合性ヒトリポカリン2（ヒトLcn2またはhNGAL）ムテインに関する。
この点に関して、本開示は、KDで測って200nM以下、約140nM以下、約50nM以下、さらには約10nM以下の親和性で、CD137に結合する能力を有する1つまたは複数のhNGALムテインを提供する。より好ましくは、hNGALムテインは、KDで測って約5nM以下の親和性を有することができる。
いくつかの態様において、本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:17）の位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置に、置換を含む。
特定の態様において、本開示のリポカリンムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SWISS-PROTデータバンクアクセッション番号P80188; SEQ ID NO:2）の配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する配列位置に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21個、またはさらにそれ以上の置換を含む。好ましくは、本開示は、成熟ヒトNGALの直鎖ポリペプチド配列の位置36、87および/または96に対応する位置における1つまたは複数の置換に加えて、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列の位置28、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、94、100、103、106、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置に置換を含む、リポカリンムテインに関すると想定される
いくつかのさらなる態様において、本開示は、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SWISS-PROTデータバンクアクセッション番号P80188; SEQ ID NO:17）との比較において、配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132および134に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個、さらにはそれ以上の変異アミノ酸残基を含むhNGALムテインであって、CD137、特にヒトCD137に結合する、ポリペプチドに関する。
いくつかの態様において、本開示のCD137結合性hNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:17）の配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134のうちの任意の1つまたは複数に、以下の変異アミノ酸残基:
のうちの1つまたは複数を含む。
いくつかの態様において、本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALのこれらの配列位置における変異アミノ酸残基を、2つ以上、例えば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個、さらにはそれ以上、例えば13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個、またはすべて含む。
いくつかのさらなる態様において、CD137に結合する本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列との比較において、以下のアミノ酸の置き換えを含む。
残りの領域、すなわち配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134とは異なる領域において、本開示のhNGALムテインは、変異アミノ酸配列位置以外では、野生型（天然）アミノ酸配列を含みうる。
別の一態様において、hNGALムテインは、成熟ヒトリポカリン2のアミノ酸配列（SWISS-PROTデータバンクアクセッション番号P80188）に対して、少なくとも70％、またはさらに高い配列同一性を有する。
さらなる特定態様において、本開示によるリポカリンムテインは、SEQ ID NO:2および39〜46からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
本開示のCD137結合性hNGALムテインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2および39〜46からなる群より選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも90％の同一性、例えば少なくとも95％の同一性など、高い配列同一性を有しうる。
本開示は、SEQ ID NO:2および39〜46からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するhNGALムテインの構造ホモログであって、該hNGALムテインとの関係において、約60％超、好ましくは65％超、70％超、75％超、80％超、85％超、90％超、92％超、最も好ましくは95％超のアミノ酸配列相同性または配列同一性を有する構造ホモログも包含する。
本開示のhNGALムテインは、天然型のヒトリポカリン2の突然変異誘発を使って得ることができる。突然変異誘発のいくつかの態様において、置換（すなわち置き換え）は保存的置換である。しかしながら、リポカリンムテインがCD137に結合するその能力を保っており、かつ/または、それが、成熟ヒトリポカリン2のアミノ酸配列（SWISS-PROTデータバンクアクセッション番号P80188）に対する少なくとも60％、例えば少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％またはそれ以上の同一性であるという点においてそのとき置換される配列に対して同一性を有する限り、非保存的置換、または下記の例示的置換からの1つまたは複数を含む、任意の置換が想定される。
いくつかのさらなる態様において、本開示は、KDで測って約5nM以下の親和性でCD137に結合するhNGALムテインを提供する。
C.融合物の例示的な使用、応用、および生産
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、CD137およびHER2の二重ターゲティングによる相乗効果をもたらしうる。例えば、エクスビボアッセイおよびマウスモデルにおいて証明されるとおり、NK細胞のCD137刺激は、NK細胞の機能および活性を強化することによって、トラスツズマブの活性を増進する（Kohrt, H. et al, J Clin Invest. 2012 Mar; 122（3）:1066-75）。
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、CD137およびHER2の二重ターゲティングによる相乗効果をもたらしうる。例えば、エクスビボアッセイおよびマウスモデルにおいて証明されるとおり、NK細胞のCD137刺激は、NK細胞の機能および活性を強化することによって、トラスツズマブの活性を増進する（Kohrt, H. et al, J Clin Invest. 2012 Mar; 122（3）:1066-75）。
それゆえに、本開示の融合ポリペプチドには、医学において、数多くの可能な応用が存在する。
一局面において、本開示は、試料中のCD137およびHER2を検出するための、本明細書において開示する融合ポリペプチドの使用、ならびにそれぞれの診断方法に関する。
別の一局面において、本開示は、CD137およびHER2/neuの同時結合のための、本明細書において開示する1つまたは複数の融合ポリペプチドの使用、またはそのようなポリペプチドを含む1つまたは複数の組成物の使用を特徴とする。
本開示は、CD137およびHER2との複合体形成のための、ここに記載する1つまたは複数の融合ポリペプチドの使用にも関係する。
それゆえに、本開示のさらなる一局面において、ここに開示する1つまたは複数の融合ポリペプチドは、CD137およびHER2の検出に使用される。そのような使用は、1つまたは複数の該融合ポリペプチドを、適切な条件下で、CD137およびHER2を含有すると疑われる試料と接触させ、それによって融合ポリペプチドとCD137およびHER2との間の複合体の形成を可能にする工程、および適切なシグナルによって複合体を検出する工程を含みうる。検出可能なシグナルは、上で説明したように、標識によって引き起こされるか、結合、すなわち複合体形成そのものによる物理的特性の変化によって引き起こされうる。一例は表面プラズモン共鳴であり、その値は、結合パートナー同士（そのうちの一方は、金箔などの表面に固定化されている）の結合中に変化する。
本明細書において開示する融合ポリペプチドは、CD137およびHER2の分離にも使用しうる。そのような使用は、1つまたは複数の該融合ポリペプチドを、適切な条件下で、CD137およびHER2を含有すると思われる試料と接触させ、それによって、融合ポリペプチドとCD137およびHER2との間の複合体の形成を可能にする工程、および複合体を試料から分離する工程を含みうる。
さらに別の一局面において、本開示は、本開示による融合ポリペプチドを含む診断キットまたは分析キットを特徴とする。
さらに別の一局面において、本開示では、診断におけるそれらの使用に加えて、本開示の融合ポリペプチドと薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物も考えられる。
さらにまた、本開示は、抗がん作用物質および/または免疫調節物質として使用するための、CD137およびHER2に同時に結合する融合ポリペプチドを提供する。したがって、本開示の融合ポリペプチドは、ヒト疾患、例えば侵攻性が高い一定タイプの乳がんを含むさまざまな腫瘍を処置または防止する方法において使用されることが想定される。したがって、ヒト疾患の処置または防止を必要とする対象におけるヒト疾患、例えば侵攻性が高い一定タイプの乳がんを含むさまざまな腫瘍を処置または防止する方法であって、対象に治療有効量の1つまたは複数の本開示の融合ポリペプチドを投与する工程を含む方法も提供される。
本開示の融合ポリペプチドは、HER2/neuが発現している腫瘍細胞を標的とすると同時に、そのような腫瘍細胞に近接する宿主の自然免疫系においてナチュラルキラー（NK）細胞を活性化することにより、標的抗腫瘍T細胞活性を増加させ、抗腫瘍免疫を強化し、それと同時に、腫瘍成長に対する直接的阻害効果を有し、それによって相乗的抗腫瘍結果をもたらしうる。加えて、本開示の融合ポリペプチドは、がん遺伝子活性を局所的に阻害し、NK細胞による細胞媒介性細胞傷害を誘発することにより、健常細胞に対するエフェクターリンパ球の副作用、すなわちオフターゲット毒性を低減しうる。
T細胞において、CD137媒介性シグナリングは、TRAFファミリーメンバーの動員、ならびにASK-1、MKK、MAPK3/MAPK4、p38、およびJNK/SAPKを含むいくつかのキナーゼの活性化につながる。次に、キナーゼの活性化に続いて、ATF-2、Jun、およびNF-κBを含むいくつかの転写因子の活性化および核移行が起こる。CD137媒介性シグナリングは、最適未満のT細胞受容体（TCR）誘発性増殖を増強することに加えて、T細胞、特にCD8＋ T細胞を、活性化誘導細胞死（AICD）から保護する。
本開示は、HER2/neuが発現している腫瘍細胞に会合したときに、T細胞を共刺激し、かつ/またはCD137の下流シグナリング経路を活性化するための、本開示の融合ポリペプチドの使用、またはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用を包含する。
本開示は、HER2/neuが発現している腫瘍細胞に会合したときに、T細胞を共刺激し、かつ/またはCD137の下流シグナリング経路を活性化する方法であって、1つまたは複数の、本開示の融合ポリペプチド、またはそのような融合ポリペプチドを含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む方法も特徴とする。
さらにまた本開示は、HER2/neuが発現している腫瘍細胞に会合したときに、CD137の下流シグナリング経路を活性化する方法であって、1つまたは複数の本開示の融合ポリペプチド、またはそのような融合ポリペプチドを含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む方法に関係する。
本開示では、HER2/neuが発現している腫瘍細胞に会合したときに、Tリンパ球増殖を誘発する方法であって、1つまたは複数の本開示の融合ポリペプチド、またはそのような融合ポリペプチドを含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む方法も考えられる。
本開示は、T細胞でのCD137クラスター化および活性化を、HER2/neuが発現している腫瘍細胞に方向づけるための、本開示の融合ポリペプチドの使用、またはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用を包含する。
本発明はさらに、HER2/neu陽性腫瘍細胞の近傍において局所的T細胞応答を誘発する方法であって、上述の融合ポリペプチドを適用する工程を含む方法を提供する。「局所的」とは、CD137を介してT細胞に結合し、HER2/neu陽性腫瘍細胞に会合したときに、T細胞がHER2/neu陽性細胞の近傍でサイトカイン、特にIL-2および/またはIFNガンマを生産することを意味する。そのようなサイトカインはT細胞の活性化を反映し、それは次に、直接的に、または例えばT細胞もしくはNK細胞などの他のキラー細胞を誘引することによって間接的に、HER2/neu陽性腫瘍細胞を殺すことができうる。
別の一態様において、本開示は、本明細書において開示する融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（DNAおよびRNA）にも関係する。さらに別の一態様において、本開示は、該核酸分子を含有する宿主細胞を包含する。遺伝コードの縮重は、同じアミノ酸を指定する別のコドンによる一定のコドンの置換を可能にするので、本開示は、融合ポリペプチドをコードする本明細書記載の具体的核酸分子に限定されず、機能的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むすべての核酸分子を包含する。この点に関して、本開示は、本開示の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にも関係する。
いくつかの態様において、本願において開示するリポカリンムテインをコードする核酸分子、例えばDNAは、本明細書において開示する融合ポリペプチドの発現を可能にするために、本開示の免疫グロブリンをコードする別の核酸分子に「機能的に連結され」うる。この点に関して、作動的連結とは、ある核酸分子の配列要素と別の核酸分子の配列要素とが、単一ポリペプチドとしての融合ポリペプチドの発現を可能にするような形で接続される連結である。
本開示は、本開示の融合ポリペプチドの生産方法であって、該融合ポリペプチドが、該ポリペプチドまたはその中の任意のサブユニットをコードする核酸から出発して、遺伝子工学的方法を使って生産される方法にも関係する。いくつかの態様において、本方法は、インビボで実行することができ、ポリペプチドを、例えば細菌宿主細胞または真核宿主細胞中で生産し、次に、その宿主生物またはその培養物から単離することができる。本開示の融合ポリペプチドをインビトロで、例えばインビトロ翻訳系を使って生産することも可能である。
融合ポリペプチドをインビボで生産する場合は、そのようなポリペプチドをコードする核酸を、組換えDNA技術（上で既に概説したもの）を使って、適切な細菌宿主細胞または真核宿主細胞中に導入する。この目的には、まず、確立された標準的方法を使って、本明細書に記載する融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含むクローニングベクターで宿主細胞を形質転換する。次に、異種DNAの発現を許し、したがって対応ポリペプチドの合成を許す条件下で、宿主細胞を培養する。次に、ポリペプチドを細胞から、または培養培地から、回収する。
本開示の一態様において、本方法は、hNGALをコードする少なくとも1つの核酸分子を、hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:17）の配列位置28、40〜52、60、68、65、70、71〜81、87、89、96、98、100〜106、114、118、120、125〜137および145に対応する配列位置のうちの少なくとも1つ、ときそれ以上をコードするヌクレオチドトリプレットにおける突然変異誘発に供する工程を含む。
加えて、いくつかの態様において、Cys76とCys175との間の天然ジスルフィド結合は、本開示のhNGALムテインでは除去しうる。したがって、そのようなムテインは、還元性の酸化還元環境を有する細胞コンパートメント、例えばグラム陰性菌の細胞質中で、生産することができる。
本開示は、表示した実験的突然変異誘発の配列位置以外に追加の突然変異を含む、本開示のリポカリンムテインをコードする核酸分子も包含する。そのような突然変異は許容されることが多く、例えばそれらがリポカリンムテインのフォールディング効率、血清中安定性、熱安定性またはリガンド結合親和性の改良に寄与するのであれば、有利であると判明する場合さえある。
本願において開示する核酸分子は、この核酸分子の発現を可能にするための1つ（または複数の）制御配列に「機能的に連結され」うる。
DNAなどの核酸分子は、それが、転写制御および/または翻訳制御に関する情報を含有する配列要素を含み、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「機能的に連結され」ているのであれば、「核酸分子を発現する能力を有する」または「ヌクレオチド配列の発現を可能にする」能力を有するという。機能的連結とは、制御配列要素と発現すべき配列とが遺伝子発現を可能にするような形で接続されている連結である。遺伝子発現に必要な制御領域の正確な性質は種間で変動しうるが、一般にこれらの領域はプロモーターを含み、原核生物の場合、それは、プロモーターそのもの、すなわち転写の開始を指示するDNA要素と、RNAに転写されたときに翻訳開始のシグナルを出すことになるDNA要素との両方を含有する。そのようなプロモーター領域は通常、転写および翻訳の開始に関与する5'非コード配列、例えば原核生物における-35/-10ボックスおよびシャイン・ダルガノ配列、または真核生物におけるTATAボックス、CAAT配列、および5'キャッピング要素を含む。これらの領域は、エンハンサー要素またはリプレッサー要素、ならびにネイティブポリペプチドを宿主細胞の特定コンパートメントに導くための、翻訳されるシグナル配列およびリーダー配列も含むことができる。
加えて、3'非コード配列は、転写終結、ポリアデニル化などに関与する制御要素を含有しうる。ただし、これらの終結配列が特定の宿主細胞において十分に機能しない場合には、それらをその細胞において機能的なシグナルで置換しうる。
それゆえに、本開示の核酸分子は、プロモーター配列などの制御配列を含むことができる。いくつかの態様において、本開示の核酸分子はプロモーター配列および転写終結配列を含む。適切な原核生物プロモーターには、例えばtetプロモーター、lacUV5プロモーターまたはT7プロモーターなどがある。真核細胞における発現に有用なプロモーターの例は、SV40プロモーターまたはCMVプロモーターである。
本開示の核酸分子は、ベクター、または他の任意の種類のクローニング媒体、例えばプラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド、もしくは人工染色体の一部であることもできる。
一態様では、核酸分子がファージミドに含まれる。ファージミドベクターとは、関心対象のcDNAに融合された、M13またはf1などの溶原性ファージの遺伝子間領域またはそれらの機能的部分をコードするベクターを表す。そのようなファージミドベクターと適当なヘルパーファージ（例えばM13K07、VCS-M13またはR408）とによる細菌宿主細胞の重感染後に、インタクトなファージ粒子が生産され、それによって、コードされている異種cDNAを、ファージ表面にディスプレイされたその対応ポリペプチドに物理的にカップリングすることが可能になる（例えばLowman, H.B.（1997）Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-3、またはRodi, D.J., and Makowski, L.（1999）Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-3参照）。
そのようなクローニング媒体は、上述の制御配列および本明細書に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸配列の他にも、発現に使用される宿主細胞に適合する種に由来する複製配列およびコントロール配列、ならびに形質転換細胞またはトランスフェクト細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーを含むことができる。当技術分野では数多くの適切なクローニングベクターが公知であり、市販されている。
本明細書に記載する融合ポリペプチドをコードするDNA分子（例えばSEQ ID NO:20および31）、そして特に、そのようなポリペプチドのコード配列を含有するクローニングベクターは、当該遺伝子を発現させる能力を有する宿主細胞中に形質転換することができる。形質転換は標準的技法を使って行うことができる。したがって本開示は、本明細書に開示する核酸分子を含有する宿主細胞にも向けられる。
形質転換細胞は、本開示の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養される。適切な宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）（E. coli）もしくは枯草菌（Bacillus subtilis）、または真核細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、SF9またはHigh5昆虫細胞、不死化哺乳動物細胞株（例えばHeLa細胞またはCHO細胞）または初代哺乳動物細胞であることができる。
本開示のリポカリンムテイン（本明細書において開示する融合ポリペプチドに含まれるものを含む）が分子内ジスルフィド結合を含むいくつかの態様では、適当なシグナル配列を使って、酸化性の酸化還元環境を有する細胞コンパートメントに新生ポリペプチドを向かわせることが好ましいであろう。そのような酸化性環境は、大腸菌などのグラム陰性菌のペリプラズムによって、またはグラム陽性菌の細胞外環境において、または真核細胞の小胞体（endoplasmatic reticulum）の内腔において提供されうるものであり、通常は構造的ジスルフィド結合の形成に有利である。
いくつかの態様では、宿主細胞の、好ましくは大腸菌の、サイトゾルにおいて本開示の融合ポリペプチドを生産することも可能である。その場合は、ポリペプチドを可溶性の折りたたまれた状態で直接的に得るか、封入体の形態で回収した後、インビトロで復元させることができる。さらなる選択肢は、酸化性の細胞内環境を有し、それゆえに、サイトゾルにおけるジスルフィド結合の形成を許しうる、特別な宿主株の使用である（Venturi et al.（2002）J. Mol. Biol. 315, 1-3）。
いくつかの態様において、本明細書に記載する本開示の融合ポリペプチドは、必ずしも、遺伝子工学だけを使って作製または生産されるとは限らない。むしろ、そのようなポリペプチドは、メリフィールド固相ポリペプチド合成などの化学合成によって得るか、インビトロでの転写および翻訳によって得ることもできる。例えば、分子モデリングを使って有望な突然変異を同定した後、求めている（設計した）ムテインまたはポリペプチドをインビトロで合成し、関心対象の標的に対する結合活性を調べることが可能である。タンパク質の固相および/または液相合成法は当技術分野において周知である（例えばBruckdorfer, T. et al.（2004）Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-3参照）。
別の一態様では、当業者に公知の確立された方法を使用するインビトロ転写/翻訳によって、本開示の融合ポリペプチドを生産しうる。
本開示によって考慮されているがそのタンパク質配列または核酸配列が本明細書において明示的には開示されていない融合ポリペプチドを調製するのに役立つ方法は、当業者には理解されるであろう。概要として、アミノ酸配列のそのような修飾には、例えば、一定の制限酵素のための切断部位を組み入れることによってポリペプチド遺伝子またはそのパーツのサブクローニングを簡単にするための、単一アミノ酸位置の指定突然変異誘発が含まれる。加えて、融合ポリペプチドのその標的（例えばCD137およびHER2）に対する親和性をさらに改良するために、これらの突然変異を組み入れることもできる。さらにまた、必要であれば、フォールディング安定性、血清中安定性、タンパク質耐性または水溶性を改良するため、または凝集傾向を低減するためなど、ポリペプチドの一定の特徴を調節するために、突然変異を導入することができる。例えばジスルフィド架橋形成を防止するために、天然のシステイン残基を別のアミノ酸に変異させうる。
この開示のさらなる目的、利点、および特徴は、限定を意図しない以下の実施例および添付するその図面を検討すれば、当業者には明白になるであろう。したがって、例示的態様および随意の特徴によって本開示を具体的に開示するが、当業者は、本明細書に開示する、そこに体現されている開示の変更態様および変形態様を採用することができ、そのような変更態様および変形態様はこの開示の範囲内にあるとみなされることを理解すべきである。
V.実施例
実施例1:融合ポリペプチドの発現および分析
HER2およびCD137に同時に会合するために、本発明者らは、SEQ ID NO:3および4によって与えられる重鎖および軽鎖を有する抗体を、構造化されていない（G4S）3リンカー（SEQ ID NO:19）を介してSEQ ID NO:2のリポカリンムテインに融合することにより、いくつかの代表的な抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドを作製した。設計した複数の異なるフォーマットを図1に示す。そのような融合ポリペプチド（SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、SEQ ID NO:15および16）を、SEQ ID NO:2のリポカリンムテインを、インビトロおよびインビボでのIgG4半抗体交換を最小限に抑えるためのS228P突然変異（Silva 2015参照）ならびにFc-ガンマ受容体相互作用を低減するためのF234AおよびL235A突然変異（Alegre 1992）を含有する工学的に操作されたIgG4バックボーンを有する突然変異させた抗体の変異体の4つの末部のうちのいずれか1つに融合することによって作製した。さらにまた、本発明者らは、SEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチドとの比較において、天然のグリコシル化モチーフを除去するために抗体重鎖中に追加のN297A突然変異を有する（Bolt 1993参照）、SEQ ID NO:7および8の融合ポリペプチドを作製した。この除去は、潜在的に、Fc-ガンマ受容体との相互作用をさらに低減しうる。加えて、本発明者らは、IgG1バックグラウンドを持つSEQ ID NO:3および4の抗体の重鎖のC末へのSEQ ID NO:2のリポカリンムテインの直接融合物であり、それゆえにIgG1抗体の元来のFc-ガンマ相互作用を保っている、SEQ ID NO:5および6の融合ポリペプチドを作製した。
実施例1:融合ポリペプチドの発現および分析
HER2およびCD137に同時に会合するために、本発明者らは、SEQ ID NO:3および4によって与えられる重鎖および軽鎖を有する抗体を、構造化されていない（G4S）3リンカー（SEQ ID NO:19）を介してSEQ ID NO:2のリポカリンムテインに融合することにより、いくつかの代表的な抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドを作製した。設計した複数の異なるフォーマットを図1に示す。そのような融合ポリペプチド（SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、SEQ ID NO:15および16）を、SEQ ID NO:2のリポカリンムテインを、インビトロおよびインビボでのIgG4半抗体交換を最小限に抑えるためのS228P突然変異（Silva 2015参照）ならびにFc-ガンマ受容体相互作用を低減するためのF234AおよびL235A突然変異（Alegre 1992）を含有する工学的に操作されたIgG4バックボーンを有する突然変異させた抗体の変異体の4つの末部のうちのいずれか1つに融合することによって作製した。さらにまた、本発明者らは、SEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチドとの比較において、天然のグリコシル化モチーフを除去するために抗体重鎖中に追加のN297A突然変異を有する（Bolt 1993参照）、SEQ ID NO:7および8の融合ポリペプチドを作製した。この除去は、潜在的に、Fc-ガンマ受容体との相互作用をさらに低減しうる。加えて、本発明者らは、IgG1バックグラウンドを持つSEQ ID NO:3および4の抗体の重鎖のC末へのSEQ ID NO:2のリポカリンムテインの直接融合物であり、それゆえにIgG1抗体の元来のFc-ガンマ相互作用を保っている、SEQ ID NO:5および6の融合ポリペプチドを作製した。
コンストラクトは遺伝子合成によって作製し、哺乳類発現ベクター中にクローニングした。次に、それらをCHO細胞中で一過性に発現させた。細胞培養培地中の融合ポリペプチドの濃度はForteBio Protein Aセンサー（Pall Corp.）を使って測定し、ヒトIgG1標準を使って定量した。コンストラクトの力価は下記表1に記載するとおりであった。
（表１）発現力価
プロテインAクロマトグラフィーを使用し、続いてリン酸緩衝食塩水（PBS）中でサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を行うことにより、融合ポリペプチドを精製した。SEC精製後に、単量体型タンパク質を含有するフラクションをプールし、分析用SECを使って再び分析した。この分析によれば、融合ポリペプチドは、検出可能な多量体種や凝集物がなく、完全に単量体であった。
実施例2:HER2に対する融合ポリペプチドの特異性
本発明者らは、ELISAアッセイを使って、組換えHER2（Sino Biological）に対する融合タンパク質の親和性を決定した。標的をPBS（5μg/mL）に溶解し、マイクロタイタープレートに4℃で終夜コーティングした。各インキュベーション工程後に、0.05％（v/v）Tween 20を補足したPBS（PBS-T）80μLで、プレートを5回洗浄した。プレートを、PBS中の2％BSA（w/v）により、室温で1時間ブロッキングした後、洗浄した。ベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4、トラスツズマブ、すなわちHerceptin（登録商標）、Roche Diagnostics）または融合ポリペプチドをさまざまな濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。PBS-T中の1:5000希釈抗ヒトIgG Fc-HRP（＃109-035-098、Jackson Laboratory）と共にインキュベーションした後、結合している試験対象の作用物質を検出した。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
本発明者らは、ELISAアッセイを使って、組換えHER2（Sino Biological）に対する融合タンパク質の親和性を決定した。標的をPBS（5μg/mL）に溶解し、マイクロタイタープレートに4℃で終夜コーティングした。各インキュベーション工程後に、0.05％（v/v）Tween 20を補足したPBS（PBS-T）80μLで、プレートを5回洗浄した。プレートを、PBS中の2％BSA（w/v）により、室温で1時間ブロッキングした後、洗浄した。ベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4、トラスツズマブ、すなわちHerceptin（登録商標）、Roche Diagnostics）または融合ポリペプチドをさまざまな濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。PBS-T中の1:5000希釈抗ヒトIgG Fc-HRP（＃109-035-098、Jackson Laboratory）と共にインキュベーションした後、結合している試験対象の作用物質を検出した。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図2にプロットした。その結果得られたEC50値を、データのシグモイドフィットの誤差を含めて、表2に掲載する。観察されたEC50値は、試験した融合ポリペプチドのすべてについて類似する範囲にあり（0.22〜0.31nM）、ベンチマーク抗体（SEQ ID NO:3および4）のEC50値（0.16nM）と同じ範囲にあった。
（表２）HER2結合に関するELISAデータ
実施例3:CD137に対する融合ポリペプチドの特異性
本発明者らは、ELISAアッセイを使って、組換えCD137-Fc融合物（＃838-4B-100、R&D Systems）に対する融合ポリペプチドおよびSEQ ID NO:2の陽性対照リポカリンムテインの親和性を決定した。標的をPBS（5μg/mL）に溶解し、マイクロタイタープレートに4℃で終夜コーティングした。各インキュベーション工程後に、80μLのPBS-Tで、プレートを5回洗浄した。プレートを、PBS中の2％BSA（w/v）により、室温で1時間ブロッキングした後、洗浄した。単量体型のCD137特異的リポカリンムテイン（SEQ ID NO:2）または融合ポリペプチドをさまざまな濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。PBS-T中の1:1000希釈抗hNGAL抗体（HRPにコンジュゲートされているもの）と共に室温で1時間インキュベーションした後、結合している試験対象の作用物質を検出した。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
本発明者らは、ELISAアッセイを使って、組換えCD137-Fc融合物（＃838-4B-100、R&D Systems）に対する融合ポリペプチドおよびSEQ ID NO:2の陽性対照リポカリンムテインの親和性を決定した。標的をPBS（5μg/mL）に溶解し、マイクロタイタープレートに4℃で終夜コーティングした。各インキュベーション工程後に、80μLのPBS-Tで、プレートを5回洗浄した。プレートを、PBS中の2％BSA（w/v）により、室温で1時間ブロッキングした後、洗浄した。単量体型のCD137特異的リポカリンムテイン（SEQ ID NO:2）または融合ポリペプチドをさまざまな濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。PBS-T中の1:1000希釈抗hNGAL抗体（HRPにコンジュゲートされているもの）と共に室温で1時間インキュベーションした後、結合している試験対象の作用物質を検出した。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図3にプロットする。その結果得られたEC50値を、データのシグモイドフィットの誤差を含めて、表3に掲載する。観察されたEC50値は、試験した融合ポリペプチドのすべてについて、実験誤差内でほぼ同一であり、0.30nM〜0.47nMの範囲にあり、SEQ ID NO:2の陽性対照リポカリンムテインで得られた値（0.49nM）よりわずかに優れていた。
（表３）CD137結合に関するELISAデータ
実施例4:ELISAにおける同時標的結合の証明
HER2およびCD137への融合ポリペプチドの同時結合を証明するために、二重結合ELISAフォーマットを使用した。PBS中の組換えHER2（Sino Biological）（5μg/mL）をマイクロタイタープレートに4℃で終夜コーティングした。Biotek ELx405 select CW洗浄機を使って、各インキュベーション工程後に、0.05％（v/v）Tween 20を補足したPBS（PBS-T）80μLで、プレートを5回洗浄した。プレートを、PBS中の2％BSA（w/v）により、室温で1時間ブロッキングした後、再び洗浄した。融合ポリペプチドをさまざまな濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。次に、ビオチン化ヒトCD137-Fcを、PBS-T中1μg/mLの定濃度で1時間加えた。洗浄後にExtravidin-HRP（Sigma-Adrich、PBS-T中に1:5000）をウェルに1時間加えた。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
HER2およびCD137への融合ポリペプチドの同時結合を証明するために、二重結合ELISAフォーマットを使用した。PBS中の組換えHER2（Sino Biological）（5μg/mL）をマイクロタイタープレートに4℃で終夜コーティングした。Biotek ELx405 select CW洗浄機を使って、各インキュベーション工程後に、0.05％（v/v）Tween 20を補足したPBS（PBS-T）80μLで、プレートを5回洗浄した。プレートを、PBS中の2％BSA（w/v）により、室温で1時間ブロッキングした後、再び洗浄した。融合ポリペプチドをさまざまな濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。次に、ビオチン化ヒトCD137-Fcを、PBS-T中1μg/mLの定濃度で1時間加えた。洗浄後にExtravidin-HRP（Sigma-Adrich、PBS-T中に1:5000）をウェルに1時間加えた。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
それぞれの実験データを図4にプロットした。試験した融合ポリペプチドはすべて明白な結合シグナルを示し、EC50値は1〜4nMの範囲にあったことから、これらの融合ポリペプチドはHER2およびCD137に同時に会合できることが証明された。
実施例5:被覆融合ポリペプチドを使った機能的T細胞活性化アッセイ
本発明者らは、T細胞活性化アッセイを使って、T細胞応答を共刺激するSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドの能力を評価した。この目的のために、SEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドを、さまざまな濃度で、抗ヒトCD3抗体（OKT3、eBioscience）と一緒にプラスチック製ディッシュにコーティングし、次に精製T細胞をその被覆表面上でインキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、3日間のインキュベーション後のT細胞増殖の継続を、4時間BrdUパルスを使って評価し、上清のインターロイキン2（IL-2））レベルを測定した。以下にこの実験を詳細に説明する。
本発明者らは、T細胞活性化アッセイを使って、T細胞応答を共刺激するSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドの能力を評価した。この目的のために、SEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドを、さまざまな濃度で、抗ヒトCD3抗体（OKT3、eBioscience）と一緒にプラスチック製ディッシュにコーティングし、次に精製T細胞をその被覆表面上でインキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、3日間のインキュベーション後のT細胞増殖の継続を、4時間BrdUパルスを使って評価し、上清のインターロイキン2（IL-2））レベルを測定した。以下にこの実験を詳細に説明する。
ポリスクロース密度勾配（BiochromのBiocoll 1.077g/mL）による遠心分離をBiochromのプロトコールに従って行うことにより、健常ボランティアドナーのヒト末梢血単核球（PBMC）をバフィーコートから単離した。結果として得られたPBMCから、Pan T細胞精製キット（Miltenyi Biotec GmbH）と製造者のプロトコールとを使って、Tリンパ球を単離した。精製されたT細胞を90％FCSおよび10％DMSOからなる緩衝液に再懸濁し、液体窒素を使って直ちに凍結し、さらなる使用まで液体窒素中で保存した。アッセイのために、T細胞を16時間融解し、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中で培養した。
以下の手順を実験条件ごとに三連で行った。0.5μg/mLの抗CD3抗体と濃度3μg/mL、10μg/mLおよび30μg/mLのSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドとの混合物200μLを使って、平底組織培養プレートを、4℃で終夜コーティングした。陰性対照として、抗CD3抗体だけを、すなわちSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドを添加せずに、捕捉した。翌日、ウェルをPBSで2回洗浄し、培養培地中のT細胞懸濁液100μL（5×104個のT細胞に相当）を各ウェルに加えた。プレートをガス透過性シール（4titude）で覆い、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で3日間インキュベートした。次に、上清中のIL-2濃度および細胞増殖を評価した。
T細胞増殖を定量するために、BrdU取り込みに基づく化学発光細胞増殖ELISAキット（Roche）を、製造者の説明書に従って使用した。簡単に述べると、3日目に、10μLのBrdU標識溶液を各ウェルに加え、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃でさらに4時間、増殖を進行させた。プレートを300gで10分遠心分離し、三連試料の上清は、後に行うIL-2定量のためにプールして、直ちに-20℃で保存した。次にプレートを60℃で1時間、乾燥した。200μLの「FixDenat」溶液を各ウェルに加え、そのプレートを室温で30分、インキュベートした。取り込まれたBRDUを、ペルオキシダーゼ標識抗BrdU抗体で、室温における2時間のインキュベーションによって標識した。PheraStar FSリーダーにおいて化学発光性のペルオキシダーゼ触媒反応を定量することにより、BrdUレベルを評価した。
細胞培養上清中のヒトIL-2レベルは、R&D SystemsのIL-2 DuoSet DuoSetキットを使って定量した。以下に記載する手順を実行する。第1工程では、PBSに希釈した1μg/mLの「ヒトIL-2捕捉抗体」（R&D System）を使って、384ウェルプレートを室温で2時間、コーティングした。次に、Biotek EL405 select CW洗浄機（Biotek）を使って、ウェルを80μlのPBS-T（0.05％Tween20を含有するPBS）で5回洗浄した。1％カゼイン（w/w）を追加含有するPBS-T中で1時間ブロッキングを行った後、プールした上清および培養培地に希釈したIL-2標準の濃度系列を、384ウェルプレート中、4℃で終夜、インキュベートした。捕捉されたIL-2の検出および定量を可能にするために、100ng/mLビオチン化ヤギ抗hIL-2-Bio検出抗体（R&D System）と1μg/mL Sulfotag標識ストレプトアビジン（Mesoscale Discovery）との混合物を、0.5％カゼインを含有するPBS-Tに入れて加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後に、25μLの読み取り緩衝液を各ウェルに加え、Mesoscale Discoveryリーダーを使って各ウェルの電気化学ルミネセンス（ECL）シグナルを読み取った。分析および定量はMesoscale Discoveryソフトウェアを使って行った。
T細胞増殖の評価に関する結果を図5に示す。10μg/mLおよび30μg/mLのSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドでコーティングしたウェルでは、3日間のインキュベーション後の継続的増殖に、SEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドを含有しない抗CD3抗体だけが捕捉された陰性対照と比較して、有意な増加がある。
IL-2測定の結果は、SEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドがT細胞活性化の成功をもたらしうることを示している（データ省略）。
実施例6:腫瘍細胞に結合した融合ポリペプチドを使った機能的T細胞活性化アッセイ
本発明者らは、標的細胞依存的T細胞活性化アッセイを使って、CD137およびHER2を同時に結合する能力を有するSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドの、HER2陽性細胞株上に固定化された場合のT細胞応答共刺激能力を評価した。本発明者らは、陰性対照として、SEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体を使用した。さらなる対照として、HER2陽性細胞に結合している二重特異性コンストラクトSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16を追い出すために、過剰量のSEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体の存在下で、実験を行った。この実験では、抗ヒトCD3抗体（OKT3、eBioscience）をプラスチック製培養ディッシュにコーティングした後、HER2陽性SKBR3細胞をそのディッシュ上で終夜培養した。翌日、精製T細胞を、さまざまな濃度の、SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチド、またはSEQ ID NO:3および4の対照抗体の存在下、被覆表面上でインキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、上清インターロイキン2（IL-2）およびインターフェロン-γ（IFN-γ）のレベルを測定した。以下にこの実験を詳述する。
本発明者らは、標的細胞依存的T細胞活性化アッセイを使って、CD137およびHER2を同時に結合する能力を有するSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチドの、HER2陽性細胞株上に固定化された場合のT細胞応答共刺激能力を評価した。本発明者らは、陰性対照として、SEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体を使用した。さらなる対照として、HER2陽性細胞に結合している二重特異性コンストラクトSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16を追い出すために、過剰量のSEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体の存在下で、実験を行った。この実験では、抗ヒトCD3抗体（OKT3、eBioscience）をプラスチック製培養ディッシュにコーティングした後、HER2陽性SKBR3細胞をそのディッシュ上で終夜培養した。翌日、精製T細胞を、さまざまな濃度の、SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16の融合ポリペプチド、またはSEQ ID NO:3および4の対照抗体の存在下、被覆表面上でインキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、上清インターロイキン2（IL-2）およびインターフェロン-γ（IFN-γ）のレベルを測定した。以下にこの実験を詳述する。
ポリスクロース密度勾配（BiochromのBiocoll 1.077g/mL）による遠心分離をBiochromのプロトコールに従って行うことにより、健常ボランティアドナーのヒト末梢血単核球（PBMC）をバフィーコートから単離した。結果として得られたPBMCから、Pan T細胞精製キット（Miltenyi Biotec GmbH）と製造者のプロトコールとを使って、Tリンパ球を単離した。精製されたT細胞を90％FCSおよび10％DMSOからなる緩衝液に再懸濁し、液体窒素を使って直ちに凍結し、さらなる使用まで液体窒素中で保存した。アッセイのために、T細胞を16時間融解し、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中で培養した。
以下の手順を実験条件ごとに三連で行った。平底組織培養プレートはプレコーティングを行わないか、または200μLの0.25μg/mL抗CD3抗体を使って37℃で1時間、プレコーティングした。次に、プレートをPBSで2回洗浄した。1ウェルあたり5×104個のSKBR3腫瘍細胞をプレーティングし、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で終夜接着させた。SKBR3細胞は前もって標準的条件下での培養で成長させ、Accutaseを使って剥離し、培養培地に再懸濁しておいた。
翌日、腫瘍細胞の増殖を阻止するために、腫瘍細胞を、濃度30μg/mlのマイトマイシンC（Sigma Aldrich）により、37℃で2時間処理した。プレートをPBSで2回洗浄し、100μLのT細胞懸濁液（5×104個のT細胞に相当）と、25μg/mLから0.4ng/mLまでにわたる11の異なる濃度の4つの融合ポリペプチドのうちのそれぞれ、または濃度25μg/mL、0.1μg/mLおよび0.4ng/mLの陰性対照とを、各ウェルに加えた。並行して同じ準備を、ただし最終濃度50μg/mLの単一特異性HER2結合抗体SEQ ID NO:3および4を添加して、行った。プレートをガス透過性シール（4titude）で覆い、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で3日間インキュベートした。次に、上清中のIL-2およびIFN-ガンマの濃度を、下記のとおり評価した。
細胞培養上清中のヒトIL-2レベルは、それぞれR&D SystemsのIL-2 DuoSetキットおよびIFN-γ DuoSetキットを使って定量した。どちらのサイトカインについても同様の手順を実行する。以下ではIL-2についてのみ、手順を説明する。第1工程では、PBSに希釈した1μg/mLの「ヒトIL-2捕捉抗体」（R&D System）を使って、384ウェルプレートを室温で2時間、コーティングした。次に、Biotek EL405 select CW洗浄機（Biotek）を使って、ウェルを80μlのPBS-T（0.05％Tween20を含有するPBS）で5回洗浄した。1％カゼイン（w/w）を追加含有するPBS-T中で1時間ブロッキングを行った後、プールした上清および培養培地に希釈したIL-2標準の濃度系列を、384ウェルプレート中、4℃で終夜、インキュベートした。100ng/mLビオチン化ヤギ抗hIL-2-Bio検出抗体（R&D System）と1μg/mL Sulfotag標識ストレプトアビジン（Mesoscale Discovery）との混合物を、0.5％カゼインを含有するPBS-Tに入れて加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後に、25μLの読み取り緩衝液を各ウェルに加え、Mesoscale Discoveryリーダーを使ってすべてのウェルの電気化学ルミネセンス（ECL）シグナルを読み取った。分析および定量はMesoscale Discoveryソフトウェアを使って行った。EC50値、バックグラウンドレベルおよびプラトーレベルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した1:1結合モデルに、データを当てはめた。当てはめた値から、プラトーレベルとバックグラウンドレベルとの商として、誘導係数を計算した。
二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:9および10に関する代表的実験の結果を図6に図示する。このデータは、IL-2（図6A）についてもIFN-γ（図6C）についても、二重特異性融合ポリペプチド濃度の上昇に伴う上清レベルの明白な増加を示している。低濃度の二重特異性融合ポリペプチドでは、上清において測定されるIL-2およびIFN-γ濃度が、陰性対照SEQ ID NO:3および4で測定されるバックグラウンドレベルに一致する。過剰量のHER2結合物質SEQ ID NO:3および4の存在下では、IL-2（図6B）とIFN-γ（図6D）のどちらの濃度も、もはやSEQ ID NO:9および10濃度依存的増加を示さず、バックグラウンドレベルで不変のままである。
SEQ ID NO:11および12（図7）ならびにSEQ ID NO:15および16（図9）の場合、この実験において到達するプラトーレベルは低いものの、IL-2およびIFN-γの濃度依存的誘導ならびに過剰量のSEQ ID NO:3および4による阻止に関する全体的結果は類似している。対照的に、ポリペプチド融合物SEQ ID NO:13および14の濃度を増加させても、IL-2濃度またはIFN-γ濃度に識別できる増加はない（図8）。
データのシグモイドフィットから得られるEC50値および誘導係数を、異なるPBMCドナーを使った独立した繰り返し実験に関するデータを含めて、表4に掲載する。このデータは、SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、ならびにSEQ ID NO:15および16に関するEC50値が同等であることを示している。ただし、誘導係数はSEQ ID NO:9および10＞SEQ ID NO:11および12＞SEQ ID NO:15および16の順に減少する。
この実験は、SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、ならびにSEQ ID NO:15および16の強力な機能的活性を、SEQ ID NO:13および14に活性がないことと共に、明確に証明している。実施例4および5に示したコンストラクトがいずれもほぼ同一の親和性であることを考えると、これは、コンストラクトの幾何学的配置（geometry）の重要な役割を浮き彫りにしている。
（表４）
実施例7:Fc-ガンマ受容体hFcγRI/CD64およびhFcγRIIIA/CD16aに対する親和性
Fc-ガンマ受容体hFcγRI/CD64（R&D Systems）およびhFcγRIIIA/CD16a（R&D Systems）に対する、工学的に操作されたIgG4に基づくバックボーンを持つポリペプチド融合物（SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16）の結合親和性を測定するために、表面プラズモン共鳴（SPR）に基づくアッセイを使用した。SEQ ID NO:3および4を、IgG1バックボーンを持つ単一特異性抗体の対照とした。SEQ ID NO:5および6を、IgG1に基づくポリペプチド融合物の対照とした。このSPR親和性アッセイでは、ポリペプチド融合物をビオチン化し、ビオチンCAPtureキット（Biotin CAPture Kit）（GE Healthcare）を使ってセンサーチップCAP上に捕捉した。センサーチップCAPをssDNAオリゴでプレ固定化処理（pre-immobilize）した。無希釈のビオチンCAPture試薬（相補的ssDNAオリゴとコンジュゲートされたストレプトアビジン）を、2μL/分の流速で300秒、適用した。次に10μg/mLのビオチン化ポリペプチド融合物を、5μL/分の流速で300秒、適用した。SEQ ID NO:3および4、ならびにポリペプチド融合物は、EZ-Link（登録商標）NHS-PEG4-ビオチン（Thermo Scientific）と共に室温で2時間インキュベートすることによってビオチン化した。反応混合物をZeba（商標）スピン脱塩プレート（Thermo Scientific）にローディングすることにより、反応しなかった過剰のビオチン試薬を除去した。リファレンスチャネルにはビオチンCAPture試薬だけをローディングした。
Fc-ガンマ受容体hFcγRI/CD64（R&D Systems）およびhFcγRIIIA/CD16a（R&D Systems）に対する、工学的に操作されたIgG4に基づくバックボーンを持つポリペプチド融合物（SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16）の結合親和性を測定するために、表面プラズモン共鳴（SPR）に基づくアッセイを使用した。SEQ ID NO:3および4を、IgG1バックボーンを持つ単一特異性抗体の対照とした。SEQ ID NO:5および6を、IgG1に基づくポリペプチド融合物の対照とした。このSPR親和性アッセイでは、ポリペプチド融合物をビオチン化し、ビオチンCAPtureキット（Biotin CAPture Kit）（GE Healthcare）を使ってセンサーチップCAP上に捕捉した。センサーチップCAPをssDNAオリゴでプレ固定化処理（pre-immobilize）した。無希釈のビオチンCAPture試薬（相補的ssDNAオリゴとコンジュゲートされたストレプトアビジン）を、2μL/分の流速で300秒、適用した。次に10μg/mLのビオチン化ポリペプチド融合物を、5μL/分の流速で300秒、適用した。SEQ ID NO:3および4、ならびにポリペプチド融合物は、EZ-Link（登録商標）NHS-PEG4-ビオチン（Thermo Scientific）と共に室温で2時間インキュベートすることによってビオチン化した。反応混合物をZeba（商標）スピン脱塩プレート（Thermo Scientific）にローディングすることにより、反応しなかった過剰のビオチン試薬を除去した。リファレンスチャネルにはビオチンCAPture試薬だけをローディングした。
親和性を決定するために、hFcγRI/CD64の3つの希釈液（40、8および1.6nMまたは100、25および6nM）またはhFcγRIIIA/CD16aの4〜5つの希釈液（200、40、8および1.6nMまたは1000、333、111、37および12nM）をランニング緩衝液（10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％v/vサーファクタントP20、3mM EDTA、pH7.4（GE Healthcare））中に調製し、チップ表面に適用した。30μL/分の流速を適用して、試料接触時間は180秒、解離時間はhFcγRI/CD64の場合で1800/2700秒、またはhFcγRIIIA/CD16aの場合で300秒とした。すべての測定を25℃で行った。センサーチップCAP表面の再生は、0.25M NaOHを含む6M Gua-HClを注入した後、ランニング緩衝液で追加洗浄を行い、120秒の安定化期間を経ることによって達成した。タンパク質測定の前に、コンディショニングのために、再生を3サイクル行った。データはBiacore T200評価ソフトウェア（V2.0）で評価した。二重参照を使用した。hFcγRI/CD64については、1:1結合モデルを使って生データを当てはめた。hFcγRIIIA/CD16aについては定常状態親和性モデルを使って生データを当てはめた。
表5に、hFcγRI/CD64に関するデータの当てはめの結果を示す。IgG1に基づく試験物SEQ ID NO:3および4、ならびにSEQ ID NO:5および6はどちらも0.3nMであり、hFcγRI/CD64結合がアンチカリンタンパク質へのSEQ ID NO:3および4の融合による影響を受けないことを証明している。ポリペプチド融合物SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16は、hFcγRI/CD64への検出可能な結合を示さなかった。これらのデータは、アイソタイプをIgG1から工学的に操作されたIgG4へと切り替えることによって、hFcγRI/CD64への結合を検出限界未満に低減できることを証明している。
（表５）
表6に、hFcγRIIIA/CD16aに関するデータの当てはめの結果を示す。結果として得られた、IgG1に基づく試験物SEQ ID NO:3および4、ならびにSEQ ID NO:5および6の、hFcγRIIIA/CD16aへの結合親和性は、互いに同等で、350nM前後であったのに対し、ポリペプチド融合物SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16は、hFcγRIIIA/CD16aへの検出可能な結合を示さなかった。これらのデータは、アイソタイプをIgG1から工学的に操作されたIgG4へと切り替えることによって、hFcγRIIIA/CD16aへの結合を検出限界未満に低減できることを証明している。
（表６）
実施例8:新生児型Fc受容体に対する親和性
工学的に操作されたIgG4に基づくバックボーンを持つポリペプチド融合物（SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16）の、新生児型Fc受容体（FcRn、Sino Biologicals、#CT009-H08H）に対する結合親和性を測定するために、表面プラズモン共鳴（SPR）に基づくアッセイを使用した。SEQ ID NO:3および4を、IgG1バックボーンを持つ単一特異性抗体の対照とした。SEQ ID NO:5および6を、IgG1に基づくポリペプチド融合物の対照とした。このSPR親和性アッセイでは、FcRnをCM5センサーチップ（GE Healthcare）上に製造者の説明書に従って共有結合で固定化した。簡単に述べると、デキストランマトリックスのカルボキシル基を、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）で活性化した後、FcRnタンパク質の1級アミンを、シグナルが約200RUに達するまで表面上のNHSエステルと反応させた。最後に、表面を横切るように1Mエタノールアミンの溶液を通すことによって、未反応のNHSエステルをブロッキングした。固定化手順中の流速は常に10μl/分とした。
工学的に操作されたIgG4に基づくバックボーンを持つポリペプチド融合物（SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16）の、新生児型Fc受容体（FcRn、Sino Biologicals、#CT009-H08H）に対する結合親和性を測定するために、表面プラズモン共鳴（SPR）に基づくアッセイを使用した。SEQ ID NO:3および4を、IgG1バックボーンを持つ単一特異性抗体の対照とした。SEQ ID NO:5および6を、IgG1に基づくポリペプチド融合物の対照とした。このSPR親和性アッセイでは、FcRnをCM5センサーチップ（GE Healthcare）上に製造者の説明書に従って共有結合で固定化した。簡単に述べると、デキストランマトリックスのカルボキシル基を、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）で活性化した後、FcRnタンパク質の1級アミンを、シグナルが約200RUに達するまで表面上のNHSエステルと反応させた。最後に、表面を横切るように1Mエタノールアミンの溶液を通すことによって、未反応のNHSエステルをブロッキングした。固定化手順中の流速は常に10μl/分とした。
親和性を決定するために、すべてのコンストラクトについて、6つの希釈液（1000nM、333nM、111nM、37nM、12nMおよび4nM）をランニング緩衝液（10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％v/vサーファクタントP20、3mM EDTA、pH6.0）中に調製し、チップ表面に適用した。30μL/分の流速を適用して、試料接触時間は180秒、解離時間は30秒とした。すべての測定を25℃で行った。センサーチップCAP表面の再生は、10mMグリシンpH3.0の注入で達成した。タンパク質測定の前に、コンディショニングのために、再生を3サイクル行う。データは、Biacore T200評価ソフトウェア（V2.0）により、二重参照で評価した。定常状態親和性モデルを使って生データを当てはめた。
結果として得られた、FcRnに対するポリペプチド融合物の結合親和性は、いずれも1〜2μMの範囲にあった。これは、アイソタイプをIgG1からIgG4に切り替えても、FcRn結合には検出可能な影響がないことを証明している。
（表７）
実施例9:HER2レベルが高い腫瘍細胞およびHER2レベルが低い腫瘍細胞を使った機能的T細胞活性化アッセイ
本発明者らは、標的細胞依存的T細胞活性化アッセイを使って、SEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチドの、T細胞応答を共刺激する能力を、標的細胞のHER2発現レベルの関数として評価した。この目的のために、本発明者らは、HER2高発現SKBR3細胞およびHER2高発現BT474細胞を、健常HER2発現細胞と類似するレベルでHER2を発現する細胞HepG2およびMCF7と共に使用した。比較のために、本発明者らは、SEQ ID NO:47および48、ならびにSEQ ID NO:49および50のリファレンス抗CD137モノクローナル抗体の挙動を調べた。陰性対照として、本発明者らはSEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体を使用した。さらにもう1つの陰性対照として、試験物の添加なしでこの実験を実行した（「媒体対照」）。この実験では、抗ヒトCD3抗体（OKT3、eBioscience）をプラスチック製培養ディッシュにコーティングしてから、そのディッシュ上でSKBR3、BT474、HepG2またはMCF7細胞を別々に終夜培養した。翌日、精製T細胞を、さまざまな濃度のSEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチド、リファレンス抗体SEQ ID NO:47および48ならびにSEQ ID NO:49および50、SEQ ID NO:3および4の対照抗体の存在下で、または試験物を添加することなく、被覆表面上でインキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、上清インターロイキン2（IL-2）レベルを測定した。以下にこの実験を詳述する。
本発明者らは、標的細胞依存的T細胞活性化アッセイを使って、SEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチドの、T細胞応答を共刺激する能力を、標的細胞のHER2発現レベルの関数として評価した。この目的のために、本発明者らは、HER2高発現SKBR3細胞およびHER2高発現BT474細胞を、健常HER2発現細胞と類似するレベルでHER2を発現する細胞HepG2およびMCF7と共に使用した。比較のために、本発明者らは、SEQ ID NO:47および48、ならびにSEQ ID NO:49および50のリファレンス抗CD137モノクローナル抗体の挙動を調べた。陰性対照として、本発明者らはSEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体を使用した。さらにもう1つの陰性対照として、試験物の添加なしでこの実験を実行した（「媒体対照」）。この実験では、抗ヒトCD3抗体（OKT3、eBioscience）をプラスチック製培養ディッシュにコーティングしてから、そのディッシュ上でSKBR3、BT474、HepG2またはMCF7細胞を別々に終夜培養した。翌日、精製T細胞を、さまざまな濃度のSEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチド、リファレンス抗体SEQ ID NO:47および48ならびにSEQ ID NO:49および50、SEQ ID NO:3および4の対照抗体の存在下で、または試験物を添加することなく、被覆表面上でインキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、上清インターロイキン2（IL-2）レベルを測定した。以下にこの実験を詳述する。
ポリスクロース密度勾配（BiochromのBiocoll 1.077g/mL）による遠心分離をBiochromのプロトコールに従って行うことにより、健常ボランティアドナーのヒト末梢血単核球（PBMC）をバフィーコートから単離した。結果として得られたPBMCから、Pan T細胞精製キット（Miltenyi Biotec GmbH）と製造者のプロトコールとを使って、Tリンパ球を単離した。精製されたT細胞を90％FCSおよび10％DMSOからなる緩衝液に再懸濁し、液体窒素を使って直ちに凍結し、さらなる使用まで液体窒素中で保存した。アッセイのために、T細胞を16時間融解し、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中で培養した。
以下の手順を実験条件ごとに三連で行った。平底組織培養プレートはプレコーティングを行わないか、または200μLの0.25μg/mL抗CD3抗体を使って37℃で1時間、プレコーティングした。次に、プレートをPBSで2回洗浄した。1ウェルあたり5×104個の標的腫瘍細胞をプレーティングし、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で終夜接着させた。標的細胞は前もって標準的条件下での培養で成長させ、Accutaseを使って剥離し、培養培地に再懸濁しておいた。
翌日、腫瘍細胞の増殖を阻止するために、腫瘍細胞を、濃度30μg/mlのマイトマイシンC（Sigma Aldrich）により、37℃で2時間処理した。プレートをPBSで2回洗浄し、100μLのT細胞懸濁液（5×104個のT細胞に相当）と、SEQ ID NO:9および10、リファレンス抗体SEQ ID NO:47および48ならびにSEQ ID NO:49および50、または陰性対照SEQ ID NO:3および4、もしくは媒体を、0.05nM〜5nMの範囲の濃度で（ただしBT474は例外であり、この場合は、濃度は0.1pM〜50nMの範囲にあった）、各ウェルに加えた。プレートをガス透過性シール（4titude）で覆い、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で3日間インキュベートした。次に、上清中のIL-2濃度を、下記のとおり評価した。
細胞培養上清中のヒトIL-2レベルは、R&D SystemsのIL-2 DuoSetキットを使って定量した。第1工程では、PBSに希釈した1μg/mLの「ヒトIL-2捕捉抗体」（R&D System）を使って、384ウェルプレートを室温で2時間、コーティングした。次に、Biotek EL405 select CW洗浄機（Biotek）を使って、ウェルを80μlのPBS-T（0.05％Tween20を含有するPBS）で5回洗浄した。1％カゼイン（w/w）を追加含有するPBS-T中で1時間ブロッキングを行った後、プールした上清および培養培地に希釈したIL-2標準の濃度系列を、384ウェルプレート中、4℃で終夜、インキュベートした。捕捉されたIL-2の検出および定量を可能にするために、100ng/mLビオチン化ヤギ抗hIL-2-Bio検出抗体（R&D System）と1μg/mL Sulfotag標識ストレプトアビジン（Mesoscale Discovery）との混合物を、0.5％カゼインを含有するPBS-Tに入れて加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後に、25μLの読み取り緩衝液を各ウェルに加え、Mesoscale Discoveryリーダーを使って各ウェルの電気化学ルミネセンス（ECL）シグナルを読み取った。分析および定量はMesoscale Discoveryソフトウェアを使って行った。
代表的実験の結果を図11に図示する。この図では、値は、試験物非存在下でのバックグラウンドIL-2生産量との対比でプロットされており、それゆえに、バックグラウンドと比較した倍率変化を表している。SEQ ID NO:3および4の陰性対照（図11A）が4つの細胞株のいずれにおいてもT細胞でのIL-2誘導をもたらさないのに対し、二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:9および10（図11A）の濃度上昇は、HER2高発現性SKBR3およびHER2高発現性BT474細胞の存在下で、T細胞にIL-2を生産させる。しかし、SEQ ID NO:9および10によるIL-2の増加は、HepG2細胞およびMCF7細胞では明白でない。この挙動は、4つすべての細胞株の存在下でT細胞においてIL-2を誘導する第1の抗CD137抗体SEQ ID NO:47および48（図11B）とも、4つの細胞株のいずれにおいてもIL-2の誘導をもたらさない第2の抗CD137抗体SEQ ID NO:49および50（図11C）とも、著しく異なる。
この実験は、SEQ ID NO:9および10によって規定される融合タンパク質が標的細胞のHER2密度に依存する形でT細胞を活性化することを証明している。HER2高発現性SKBR3細胞およびHER2高発現性BT474細胞は、IL-2生産によって測定される明白なT細胞活性化を示すが、HER2の発現レベルがかなり低いHepG2細胞およびMCF7細胞ではこの効果は見られない。この効果はHER2密度に起因するのであって、試験対象の細胞によって生じる共刺激の潜在的阻害または欠如（これはCD137シグナリングを無効にする）に起因するのではないと考えられることは、抗CD137抗体SEQ ID NO:47および48が4つの細胞タイプのすべてにおいてCD137シグナリングによってT細胞を活性化する能力を有するという事実によって明らかになる。
実施例10:中性pHの緩衝液中、高温における、融合ポリペプチドの4週間安定性試験
SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16によって規定される融合ポリペプチドの安定性を調べるために、本発明者らは、試料を、およそ20mg/mL（21〜23mg/mLの範囲）の濃度において、pH7.4のPBS中、40℃で、4週間インキュベートする実験を使用した。比較のために、本発明者らは、SEQ ID NO:3および4によって規定されるポリペプチドの同一条件下での挙動を調べた。試料を5mg/mL前後の濃度から20mg/mL前後の濃度まで遠心分離フィルタ（Ultracel-3K、Amicon）を使って濃縮し、この濃縮試料の一部をリファレンス物質として-20℃で保存した。次に、0.5mLチューブ（PCR-PT、Sarstedt）中の濃縮試料0.1mLを、インキュベータ（Memmert）中、40℃で、4週間保存した。次に、試料の保全性および単量体含量を調べるために、0.150mL/分の流速で、Agilent 1200シリーズGPC2システムでのSuperdex200 Increaseカラム分析用サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）に付した。20μgの試料をカラムに適用した。連続的フロースルー中の相対的タンパク質濃度を波長280nmにおける吸収によって検出した。
SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16によって規定される融合ポリペプチドの安定性を調べるために、本発明者らは、試料を、およそ20mg/mL（21〜23mg/mLの範囲）の濃度において、pH7.4のPBS中、40℃で、4週間インキュベートする実験を使用した。比較のために、本発明者らは、SEQ ID NO:3および4によって規定されるポリペプチドの同一条件下での挙動を調べた。試料を5mg/mL前後の濃度から20mg/mL前後の濃度まで遠心分離フィルタ（Ultracel-3K、Amicon）を使って濃縮し、この濃縮試料の一部をリファレンス物質として-20℃で保存した。次に、0.5mLチューブ（PCR-PT、Sarstedt）中の濃縮試料0.1mLを、インキュベータ（Memmert）中、40℃で、4週間保存した。次に、試料の保全性および単量体含量を調べるために、0.150mL/分の流速で、Agilent 1200シリーズGPC2システムでのSuperdex200 Increaseカラム分析用サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）に付した。20μgの試料をカラムに適用した。連続的フロースルー中の相対的タンパク質濃度を波長280nmにおける吸収によって検出した。
図12に、表示のとおり、すべての融合ポリペプチドならびに対照SEQ ID NO:3および4に関するSEC分析の結果を掲載する。各融合ポリペプチドに関して、それぞれ下側および上側のSECトレースは、それぞれリファレンス材料および40℃で4週間インキュベートした材料に対応する。リファレンス材料をインキュベートした材料と比較すると、SECトレースは、二重特異性融合ポリペプチドについても、対照SEQ ID NO:3および4についても、著しく変化していないことがわかり、凝集に対する融合ポリペプチドの安定性が証明される。
実施例11:マウスにおける融合ポリペプチドの薬物動態
SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16によって規定される融合ポリペプチドの薬物動態と、参照用のSEQ ID NO:3および4の薬物動態との分析を、マウスにおいて行った。およそ5週齢の雄CD-1マウス（1時点あたり3匹; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH）の尾静脈に10mg/kgの用量で融合ポリペプチドを注射した。試験物は5mL/kgの体積を使ってボーラスとして投与した。5分、1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間、4日、8日、14日および20日の時点において、マウスから血漿試料を得た。各動物および各時点について少なくとも100μLのLi-ヘパリン血漿が得られるように、十分な全血（イソフルラン麻酔下で採血）を収集した。薬物レベルは、標的HER2およびCD137によって完全な二重特異性コンストラクトを検出するサンドイッチELISAを使って決定した。トラスツズマブの血漿中レベルは、標的HER2およびヒトFcによるサンドイッチELISAを使って決定した。Prism GraphPad 5ソフトウェアを使用し、2コンパートメントモデルを使って、データを当てはめた。
SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16によって規定される融合ポリペプチドの薬物動態と、参照用のSEQ ID NO:3および4の薬物動態との分析を、マウスにおいて行った。およそ5週齢の雄CD-1マウス（1時点あたり3匹; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH）の尾静脈に10mg/kgの用量で融合ポリペプチドを注射した。試験物は5mL/kgの体積を使ってボーラスとして投与した。5分、1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間、4日、8日、14日および20日の時点において、マウスから血漿試料を得た。各動物および各時点について少なくとも100μLのLi-ヘパリン血漿が得られるように、十分な全血（イソフルラン麻酔下で採血）を収集した。薬物レベルは、標的HER2およびCD137によって完全な二重特異性コンストラクトを検出するサンドイッチELISAを使って決定した。トラスツズマブの血漿中レベルは、標的HER2およびヒトFcによるサンドイッチELISAを使って決定した。Prism GraphPad 5ソフトウェアを使用し、2コンパートメントモデルを使って、データを当てはめた。
図13に、コンストラクトSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16について、経時的な血漿中濃度のプロットを示す。いずれの場合も、参照用のSEQ ID NO:3および4について得られた結果と一緒にプロットされている。薬物動態はすべての場合で類似しているように見えた。200μg/mL前後の血漿中濃度から出発して、血漿中レベルは48時間以内に50μg/mL前後のレベルまで低下した後、20日後の実験終了時には25μg/mL前後のレベルまで、はるかに遅い速度でさらに減少する。2コンパートメントモデルの双指数関数的減衰を適用することでこのデータを正確に記述することができた。このモデルを使ったデータの当てはめ（図13、表8）の結果、終末半減期は、SEQ ID NO:3および4の13日と比べて、二重特異性融合ポリペプチドでは15〜21日であった。
このデータは、二重特異性融合物がマウスにおいて抗体様の長い終末半減期を有することを証明している。融合ポリペプチドの血漿中濃度を決定するために使用したアッセイは、HER2とCD137の両方に対する活性が保たれていることを必要とするので、この結果は、20日の時間経過の間、二重特異性分子が無傷であり活性なままであることも証明している。
（表８）2コンパートメントモデルに基づくデータの当てはめを使って得られたマウスにおける終末半減期
実施例12:カニクイザルにおける融合ポリペプチドの薬物動態
SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16によって規定される融合ポリペプチドの薬物動態と、参照用のSEQ ID NO:3および4の薬物動態との分析を、カニクイザルにおいて行った。雄カニクイザルに、用量3mg/kgの試験物を、60分かけて静脈内注入した。15分、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間、3日、4日、5日、6日、7日、9日、11日、14日、18日、および24日の時点において、カニクイザルから血漿試料を得た。薬物レベルは、標的HER2およびCD137によって完全な二重特異性コンストラクトを検出するサンドイッチELISAを使って決定した。トラスツズマブの血漿中レベルは、標的HER2およびヒトFcによるサンドイッチELISAを使って決定した。Prism GraphPad 5ソフトウェアを使用し、2コンパートメントモデルを使って、データを当てはめた。
SEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16によって規定される融合ポリペプチドの薬物動態と、参照用のSEQ ID NO:3および4の薬物動態との分析を、カニクイザルにおいて行った。雄カニクイザルに、用量3mg/kgの試験物を、60分かけて静脈内注入した。15分、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間、3日、4日、5日、6日、7日、9日、11日、14日、18日、および24日の時点において、カニクイザルから血漿試料を得た。薬物レベルは、標的HER2およびCD137によって完全な二重特異性コンストラクトを検出するサンドイッチELISAを使って決定した。トラスツズマブの血漿中レベルは、標的HER2およびヒトFcによるサンドイッチELISAを使って決定した。Prism GraphPad 5ソフトウェアを使用し、2コンパートメントモデルを使って、データを当てはめた。
図14に、コンストラクトSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:15および16について、経時的な血漿中濃度の半対数プロットを示す。いずれの場合も、参照用のSEQ ID NO:3および4について得られた結果と一緒にプロットされている。薬物動態はすべての場合で類似しているように見えた。血漿中レベルは、70μg/mL前後の血漿中濃度から出発して、24日の時間経過の間に、ゼロに近いレベルまで低下する。2コンパートメントモデルの双指数関数的減衰を適用することでこのデータを正確に記述することができた。このモデルを使ったデータの当てはめ（図14、表9）によれば、終末半減期は、SEQ ID NO:3および4の86時間と比較して、二重特異性融合ポリペプチドではおよそ64〜99時間の範囲であった。
それゆえにこのデータは、二重特異性融合物が、カニクイザルにおいて、リファレンスポリペプチドSEQ ID NO:3および4の半減期によく似た終末半減期を有することを証明している。
（表９）2コンパートメントモデルに基づくデータの当てはめを使って得られた雄カニクイザルにおける終末半減期
実施例13:融合ポリペプチドのエクスビボT細胞免疫原性評価
人間における抗薬物抗体形成のリスクを調べるために、二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、SEQ ID NO:15および16、ならびに参照用のSEQ ID NO:3および4、SEQ ID NO:3および4の対照抗体、そして陽性対照キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）のインビトロT細胞免疫原性評価を行った。この実験を行うために、世界人口における分布を反映するHLAアロタイプをカバーするように選択された32人のドナーのPBMCを融解し、洗浄し、1ウェルあたり3×105細胞の密度で96ウェルプレート上に播種した。アッセイ培地に希釈した試験物を、30μg/mLの濃度で細胞に加えた。ブランクとしてはアッセイ培地のみを使用し、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）をナイーブ陽性対照として使用した。PBMCを、湿潤雰囲気中、37℃および5％CO2で、7日間インキュベートした。7日目に、PBMCを表面表現型CD3＋およびCD4＋マーカーについて標識すると共に、DNAに取り込まれたEdU（5-エチニル-2'デオキシウリジン）（細胞増殖マーカーとして使用）について標識した。Guava easyCyte 8HTフローサイトメーターを使ってCD3＋CD4＋EdU＋増殖細胞のパーセンテージを測定し、GuavaSoft InCyteソフトウェアを使って分析した。
人間における抗薬物抗体形成のリスクを調べるために、二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、SEQ ID NO:15および16、ならびに参照用のSEQ ID NO:3および4、SEQ ID NO:3および4の対照抗体、そして陽性対照キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）のインビトロT細胞免疫原性評価を行った。この実験を行うために、世界人口における分布を反映するHLAアロタイプをカバーするように選択された32人のドナーのPBMCを融解し、洗浄し、1ウェルあたり3×105細胞の密度で96ウェルプレート上に播種した。アッセイ培地に希釈した試験物を、30μg/mLの濃度で細胞に加えた。ブランクとしてはアッセイ培地のみを使用し、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）をナイーブ陽性対照として使用した。PBMCを、湿潤雰囲気中、37℃および5％CO2で、7日間インキュベートした。7日目に、PBMCを表面表現型CD3＋およびCD4＋マーカーについて標識すると共に、DNAに取り込まれたEdU（5-エチニル-2'デオキシウリジン）（細胞増殖マーカーとして使用）について標識した。Guava easyCyte 8HTフローサイトメーターを使ってCD3＋CD4＋EdU＋増殖細胞のパーセンテージを測定し、GuavaSoft InCyteソフトウェアを使って分析した。
図15に、32人すべてのドナーおよび試験対象の全試験分子について、このアッセイの結果を掲載する。図15Aでは、試験物の存在下と非存在下とを対比した増殖の比によって得られる刺激指数をプロットした。応答ドナーを規定するしきい（刺激指数＞2）を点線で示す。図15Bでは、このしきいによって規定される応答ドナーの数をプロットした。リファレンスSEQ ID NO:3および4に応答するドナーの数は1にとどまっていて小さく、一方、陽性対照KLHに対しては、32人のドナーはすべてが、しきいを上回る強い増殖で応答することは、明らかである。二重特異性融合ポリペプチドの場合、応答ドナーの数は、ゼロ（SEQ ID NO:9および10）から1（SEQ ID NO:15および16）および2（SEQ ID NO:13および14）ないし3（SEQ ID NO:11および12）の範囲にある。
それゆえに、この実験は、二重特異性融合ポリペプチド、特にSEQ ID NO:9および10、ならびにSEQ ID NO:15および16が、インビトロT細胞免疫原性評価では、応答をほとんど誘発しないことを証明しており、これは、免疫原性応答を誘発するリスクが低いことを示している。
実施例14:ヒト化マウス腫瘍モデルにおけるCD137/HER2二重特異性物質による腫瘍成長阻害
インビボマウスモデルにおけるSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:32および33の活性を調べるために、本発明者らは、ヒトSK-OV-3腫瘍およびヒトPBMCが移植された免疫不全NOGマウス（Taconic、NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull）を使用した。
インビボマウスモデルにおけるSEQ ID NO:9および10、SEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14、ならびにSEQ ID NO:32および33の活性を調べるために、本発明者らは、ヒトSK-OV-3腫瘍およびヒトPBMCが移植された免疫不全NOGマウス（Taconic、NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull）を使用した。
4〜6週齢のNSGマウスに、マトリゲル/PBS（1:1）溶液中の5×106個のSK-OV-3細胞を皮下（s.c.）注射した。腫瘍を平均120mm3まで成長させ、実験の0日目にマウスを、腫瘍サイズおよび体重に従って、処置群にランダムに割り当てた。マウスに、7×106個の新鮮ヒトPBMCを、尾静脈に静脈内（i.v.）投与した。マウスに、0日目はPBMC注射の1時間後に、また7日目と14日目にも再び、20μgまたは100μgの処置薬または対照薬を腹腔内投与した。試験対象の分子は、IgG4アイソタイプ対照（カタログ番号DDXCH04P、Acris Antibodies GmbH）、HER2/CD137二重特異性物質SEQ ID NO:9および10（100μgまたは20μg）、SEQ ID NO:11および12（100μgまたは20μg）ならびにSEQ ID NO:13および14（100μg）、またはSEQ ID NO:32および33のCD137結合性ベンチマーク抗体（100μg）であった。各群が含むマウスは10匹であるが、SEQ ID NO:32および33を調べる群は例外で、7匹のマウスからなった。腫瘍成長を3〜4日ごとに記録した。
図16に、試験14日目における、出発体積を基準とするメジアン腫瘍サイズを示す。腫瘍成長阻害の強さで並べた最善の応答は、SEQ ID NO:9および10（100μg）、SEQ ID NO:9および10（20μg）およびSEQ ID NO:11および12（100μg）によって達成され、一方、20μgという低用量のSEQ ID NO:11および12、SEQ ID NO:13および14（100μg）、ならびにSEQ ID NO:32および33のCD137結合性ベンチマーク抗体は、アイソタイプ対照のそれと類似するメジアン応答を有する。
実施例15:NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkatレポーター細胞を使ったCD137経路活性化の研究
本発明者らは、標的細胞に基づくレポーターアッセイを使って、CD137およびHER2に同時に結合する能力を有するSEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチドの、標的細胞のHER2状態に依存してCD137経路を活性化する能力を評価した。この目的のために、本発明者らは、NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat細胞（Promega、CS196002）（これは、CD137を過剰発現するように工学的に操作されており、NF-κBルシフェラーゼレポーター遺伝子を保因している）と混合されたHER2高発現性NCI-N87胃がん細胞を使用した。比較のために本発明者らは、SEQ ID NO:32および33ならびにSEQ ID NO:34および35のリファレンス抗CD137モノクローナル抗体の挙動を調べた。本発明者らは、陰性対照として、SEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体を使用した。さらなる対照として、本発明者らは、SEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチド、SEQ ID NO:32および33ならびにSEQ ID NO:34および35の抗CD137モノクローナル抗体、そしてSEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体について、NCI-N87細胞非存在下でのCD137経路活性化も評価した。最後に、試験物の添加なしでも、この実験を実行した（「媒体対照」）。NCI-N87細胞のみの存在下で測定されるバックグラウンドシグナルを、NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat細胞が加えられていないウェルで評価した。この実験では、NCI-N87細胞をディッシュ上で終夜培養した。翌日、新たに融解したNF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat細胞（Promega、CS196002）を、被覆表面上、さまざまな濃度のSEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチド、リファレンス抗体SEQ ID NO:32および33ならびにSEQ ID NO:34および35、SEQ ID NO:3および4の対照抗体の存在下、または試験物の添加なしで、6時間インキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、Bio-Glo（商標）緩衝液（Promega、G7940）の添加によって誘発されるJurkatレポーター細胞上のルミネセンスを測定した。以下にこの実験を詳述する。
本発明者らは、標的細胞に基づくレポーターアッセイを使って、CD137およびHER2に同時に結合する能力を有するSEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチドの、標的細胞のHER2状態に依存してCD137経路を活性化する能力を評価した。この目的のために、本発明者らは、NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat細胞（Promega、CS196002）（これは、CD137を過剰発現するように工学的に操作されており、NF-κBルシフェラーゼレポーター遺伝子を保因している）と混合されたHER2高発現性NCI-N87胃がん細胞を使用した。比較のために本発明者らは、SEQ ID NO:32および33ならびにSEQ ID NO:34および35のリファレンス抗CD137モノクローナル抗体の挙動を調べた。本発明者らは、陰性対照として、SEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体を使用した。さらなる対照として、本発明者らは、SEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチド、SEQ ID NO:32および33ならびにSEQ ID NO:34および35の抗CD137モノクローナル抗体、そしてSEQ ID NO:3および4の単一特異性HER2結合抗体について、NCI-N87細胞非存在下でのCD137経路活性化も評価した。最後に、試験物の添加なしでも、この実験を実行した（「媒体対照」）。NCI-N87細胞のみの存在下で測定されるバックグラウンドシグナルを、NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat細胞が加えられていないウェルで評価した。この実験では、NCI-N87細胞をディッシュ上で終夜培養した。翌日、新たに融解したNF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat細胞（Promega、CS196002）を、被覆表面上、さまざまな濃度のSEQ ID NO:9および10の融合ポリペプチド、リファレンス抗体SEQ ID NO:32および33ならびにSEQ ID NO:34および35、SEQ ID NO:3および4の対照抗体の存在下、または試験物の添加なしで、6時間インキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、Bio-Glo（商標）緩衝液（Promega、G7940）の添加によって誘発されるJurkatレポーター細胞上のルミネセンスを測定した。以下にこの実験を詳述する。
以下の手順を実験条件ごとに三連で行った。平底組織培養プレートを使って1ウェルあたり5×104個の標的NCI-N87腫瘍細胞をコーティングし、一部のウェルは対照ウェルとして標的がん細胞なしのままにしておいた。細胞を、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で、終夜接着させた。標的細胞は、前もって標準的条件下での培養で成長させ、Accutaseを使って剥離し、培養培地に再懸濁しておいた。
翌日、プレートをPBSで2回洗浄し、50μLのNF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat細胞懸濁液（1.5×105細胞に相当）および25μLの、0.04nM〜10nMの範囲の濃度のSEQ ID NO:9および10、0.4nM〜10nMの範囲の濃度のリファレンス抗体SEQ ID NO:32および33ならびにSEQ ID NO:34および35、濃度10nMの陰性対照SEQ ID NO:3および4、または媒体を、各ウェルに加えた。プレートをガス透過性シール（4titude）で覆い、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で6時間インキュベートした。次に、75μLのBio-Glo（商標）緩衝液（Promega、G7940）を、細胞を含有する各ウェルに加え（1:1 v/v）、ルミネセンスプレートリーダー（Pherastar）を使ってルミネセンスを測定した。分析、定量および曲線の当てはめはGraphpad Prismソフトウェアを使って行った。
代表的実験の結果を図17に図示する。この図において、プロットされる値は、相対的ルミネセンス単位（RLU）で与えられている。二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:9および10の濃度上昇（図17A）は、SEQ ID NO:3および4の陰性対照とは対照的に（図16A）、HER2高発現性NCI-N87細胞の存在下で、レポーターJurkat細胞におけるCD137経路活性化を誘発する。さらにまた、標的NCI-N87細胞を欠く場合には、ルミネセンスの増加が観察されない。この挙動は、NCI-N87細胞の存在下でも非存在下でもJurkatレポーター細胞におけるCD137経路活性化を誘発する第1の抗CD137抗体SEQ ID NO:32および33（図17B）とも、Jurkatレポーター細胞におけるCD137経路活性化を全くもたらさない第2の抗CD137抗体SEQ ID NO:34および35（図17C）とも、著しく異なる。
この実験は、SEQ ID NO:9および10が、HER2を発現する標的細胞の存在に依存する形で、CD137経路を活性化することを証明している。というのも、NCI-N87細胞の非存在下では活性化が起こらなかったからである。これらのデータは、T細胞活性化におけるSEQ ID NO:9および10の作用様式が、がん細胞上のHER2の会合を介してCD137受容体を架橋することによるCD137経路の活性化であることを確証している。このHER2陽性細胞特異的作用様式はさらに、標的細胞が存在しても存在しなくてもCD137シグナリングによってT細胞を活性化する抗CD137抗体SEQ ID NO:32および33のデータと比較することで、さらに際立つ。
実施例16:ヒト化マウス腫瘍モデルにおけるCD137/HER2二重特異性物質による腫瘍成長阻害
実施例14と類似するプロトコールで、HER2陽性腫瘍細胞（SKOV-3）を移植した免疫無防備状態のマウスにヒトPBMCを注射し、3週間にわたって、100μg/週または20μg/週のSEQ ID NO:9および10、抗CD137抗体SEQ ID NO:32および33、または媒体とPBMCである対照（「PBMCのみ」）、PBMCなしの媒体である対照（「PBMCなし」）、もしくはアイソタイプ対照とPBMCである対照で処置した。具体的には、NOGマウスにSK-OV-3細胞を皮下（s.c.）注射し、腫瘍を平均で120mm3まで成長させてから、処置群にランダムに割り当てた。1つの処置群につき10匹とした。マウスの尾静脈に新鮮ヒトPBMCを静脈内（i.v.）移植し、1時間後に処置を開始した。マウスには、SEQ ID NO:9および10またはSEQ ID NO:32および33または対照の処置（20μgまたは100μg）を、週3回、腹腔内（i.p.）に施行した。腫瘍成長を週に2回記録した。処置後20日目に2匹のマウスから腫瘍を収穫し、ヒトT細胞の浸潤を、ヒトリンパ球マーカーCD45に関する染色による免疫組織化学検査によって評価した。
実施例14と類似するプロトコールで、HER2陽性腫瘍細胞（SKOV-3）を移植した免疫無防備状態のマウスにヒトPBMCを注射し、3週間にわたって、100μg/週または20μg/週のSEQ ID NO:9および10、抗CD137抗体SEQ ID NO:32および33、または媒体とPBMCである対照（「PBMCのみ」）、PBMCなしの媒体である対照（「PBMCなし」）、もしくはアイソタイプ対照とPBMCである対照で処置した。具体的には、NOGマウスにSK-OV-3細胞を皮下（s.c.）注射し、腫瘍を平均で120mm3まで成長させてから、処置群にランダムに割り当てた。1つの処置群につき10匹とした。マウスの尾静脈に新鮮ヒトPBMCを静脈内（i.v.）移植し、1時間後に処置を開始した。マウスには、SEQ ID NO:9および10またはSEQ ID NO:32および33または対照の処置（20μgまたは100μg）を、週3回、腹腔内（i.p.）に施行した。腫瘍成長を週に2回記録した。処置後20日目に2匹のマウスから腫瘍を収穫し、ヒトT細胞の浸潤を、ヒトリンパ球マーカーCD45に関する染色による免疫組織化学検査によって評価した。
この実験の結果を図18に報告する。図18Aは、経時的なメジアン腫瘍成長を示している。マウス10匹という完全な群サイズをもはや表さないデータポイントは、点線でつながれている。腫瘍成長阻害の強さで並べた最善の応答は、SEQ ID NO:9および10（100μg）によって達成され、低用量（20μg）の同抗体がそれに続いた。一方、SEQ ID NO:32および33のCD137結合性ベンチマーク抗体は、アイソタイプ対照のそれと類似するメジアン応答を有する。図18Bは、試験終了後の腫瘍の免疫組織化学検査を示している。ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍の切片（各群2つ）をヒトリンパ球マーカーCD45について染色し、図18Bに反映するように、専用ソフトウェアによって、CD45陽性細胞の頻度を定量した。この図は、SEQ ID NO:9および10（100μg）がヒト腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の頻度の増加をもたらし、一方、SEQ ID NO:9および10（20μg）ならびに対照はそうではなかったことを示している。
これらの結果は、高用量（100μg/週）および低用量（20μg/週）でのSEQ ID NO:9および10処置が、アイソタイプ対照または抗CD137ベンチマークと比較して、より強い細胞成長阻害（TGI）をもたらしたことを反映している。ヒトリンパ球マーカーCD45に関するIHC染色は、高用量（100μg）のSEQ ID NO:9および10についてはヒトTILの頻度の増加を示しているが、低用量（20μg）のSEQ ID NO:9および10はこの効果を示さない。これらのデータは、全体として、SEQ ID NO:9および10の二重機能性と合致している。一方において、CD137の腫瘍限局的ターゲティングは、腫瘍微小環境におけるTILの拡大をもたらし、SEQ ID NO:9および10による腫瘍限局的共刺激T細胞活性化が示唆されるが、同時に、20μgのSEQ ID NO:9および10では、TIL拡大が存在しなくても腫瘍成長阻害が観察されることから、その活性はHER2アンタゴニズムによって駆動されうることが示唆される。
実施例17:ヒト化NOGマウスSKOV-3腫瘍モデルにおけるPBMC表現型検査および死亡
SEQ ID NO:9および10の安全性を評価するために、実験16のマウスのマウス血液試料からPBMCを単離した。これらの試料を、PBMC移植後の19日目に採取し、ヒト表面マーカーCD45、CD3およびCD8に関するマルチカラーFACSによって分析した。末梢血を10mlの1×赤血球溶解緩衝液（0.15M NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM EDTA）に再懸濁し、15mlチューブ中、室温で1〜3分、溶解した。細胞を300×g、4℃で10分、遠心分離し、10mlのFC緩衝液（PBS中の2％ウシ胎児血清、pH7.4）で1回洗浄し、200μlのFC緩衝液に再懸濁した。細胞を5×105細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに移した。プレートを400×g、4℃で3分遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清を除去した。Fc-ブロック抗体（2.4G2抗体（0.5mg/ml、#553142-BD Bioscience）を緩衝液に1:100希釈したもの、10μl/ウェル）を各ウェルに加え、プレートを室温で15分インキュベートした。次に、ヒト標的hCD45（Life Technologies）、hCD3およびhCD8（どちらもBD Bioscience）に対する特異的抗体を加え（0.5〜1μg/試料）、プレートを遮光して4℃で30分インキュベートした。さらに1回の洗浄工程（プレートを400×g、4℃で3分、遠心分離）後、Attune Focusingサイトメーター（青色（488nm）/紫色（405nm）のレーザー構成）で分析するために、細胞を200μlのFC緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータはFlowJoデータ分析ソフトウェアで分析した。
SEQ ID NO:9および10の安全性を評価するために、実験16のマウスのマウス血液試料からPBMCを単離した。これらの試料を、PBMC移植後の19日目に採取し、ヒト表面マーカーCD45、CD3およびCD8に関するマルチカラーFACSによって分析した。末梢血を10mlの1×赤血球溶解緩衝液（0.15M NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM EDTA）に再懸濁し、15mlチューブ中、室温で1〜3分、溶解した。細胞を300×g、4℃で10分、遠心分離し、10mlのFC緩衝液（PBS中の2％ウシ胎児血清、pH7.4）で1回洗浄し、200μlのFC緩衝液に再懸濁した。細胞を5×105細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに移した。プレートを400×g、4℃で3分遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清を除去した。Fc-ブロック抗体（2.4G2抗体（0.5mg/ml、#553142-BD Bioscience）を緩衝液に1:100希釈したもの、10μl/ウェル）を各ウェルに加え、プレートを室温で15分インキュベートした。次に、ヒト標的hCD45（Life Technologies）、hCD3およびhCD8（どちらもBD Bioscience）に対する特異的抗体を加え（0.5〜1μg/試料）、プレートを遮光して4℃で30分インキュベートした。さらに1回の洗浄工程（プレートを400×g、4℃で3分、遠心分離）後、Attune Focusingサイトメーター（青色（488nm）/紫色（405nm）のレーザー構成）で分析するために、細胞を200μlのFC緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータはFlowJoデータ分析ソフトウェアで分析した。
図19Aは、実施例16の処置群および対照群から当該試験の19日目に採取したPMBCのCD45、CD3およびCD8表現型を表している。図19Aの左側はヒトCD45を発現する総PMBCのパーセンテージを表し、図19Aの右側は、CD45陽性細胞集団中のCD3＋CD8＋ Tエフェクター細胞の分率を表す。明らかにこれらの結果は、抗CD137抗体SEQ ID NO:32および33処置が、対照群またはSEQ ID NO:9および10と比較して、マウス末梢血におけるヒトリンパ球の、より大幅な拡大をもたらすこと、およびこの拡大がCD8＋ヒトエフェクターT細胞の大幅な増加と相関していることを証明している。図19Bは、実験16の処置群および対照群の死亡数を表す。図19Bにプロットした値は、10匹の群ごとの、自然に死亡するかまたは所定の全身状態基準に基づいて屠殺する必要があったマウスの数に相当する。これらの結果は、抗CD137 mAb処置が移植片対宿主病の加速をもたらし、試験終了時までに対照ならびにSEQ ID NO:9および10と比較して有意な死亡を伴ったことを反映している。PBMC表現型データと合わせると、これらの結果は、抗CD137 mAb処置によって誘発される異種移植片対宿主病（xGvHD）の加速が、対照群またはSEQ ID NO:9および10群と比較して著しく増加した、抗CD137群におけるCD8＋ヒトエフェクターT細胞の拡大によって引き起こされることを示している。
実施例18:ヒト化マウス腫瘍モデルにおけるCD137/HER2二重特異性物質による腫瘍成長阻害
インビボマウスモデルにおけるSEQ ID NO:9および10の活性を調べるために、本発明者らは、ヒトSK-OV-3腫瘍およびヒトPBMCが移植された免疫不全NOGマウス（Taconic、NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull）を使用した。受容体HER2およびCD137の単一特異性ターゲティングの効果と二重特異性ターゲティングの効果とを対比して評価するために、単一特異性CD137ターゲティング抗体SEQ ID NO:32および33ならびに単一特異性HER2ターゲティングコンストラクト（IgG4バックボーン）SEQ ID NO:51および52を並行して調べた。
インビボマウスモデルにおけるSEQ ID NO:9および10の活性を調べるために、本発明者らは、ヒトSK-OV-3腫瘍およびヒトPBMCが移植された免疫不全NOGマウス（Taconic、NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull）を使用した。受容体HER2およびCD137の単一特異性ターゲティングの効果と二重特異性ターゲティングの効果とを対比して評価するために、単一特異性CD137ターゲティング抗体SEQ ID NO:32および33ならびに単一特異性HER2ターゲティングコンストラクト（IgG4バックボーン）SEQ ID NO:51および52を並行して調べた。
4〜6週齢のNSGマウスに、マトリゲル/PBS（1:1）溶液中の5×106個のSK-OV-3細胞を皮下（s.c.）注射した。腫瘍を平均110mm3まで成長させ、実験の0日目にマウスを、腫瘍サイズおよび体重に従って、処置群にランダムに割り当てた。マウスに、7×106個の新鮮ヒトPBMCを、尾静脈に静脈内（i.v.）投与した。マウスに、0日目はPBMC注射の1時間後に、また7日目と14日目にも再び、4つの異なる濃度（200μg、100μg、20μgまたは4μg）のHER2/CD137二重特異性物質SEQ ID NO:9および10、アイソタイプ対照（100μg、カタログ番号C0004、Crown Bioscience Inc.、カリフォルニア州）、単一特異性CD137ターゲティング抗体SEQ ID NO:32および33（100μg）ならびに単一特異性HER2ターゲティング抗体SEQ ID NO:51および52（80μg）を、腹腔内投与した。SEQ ID NO:51および52の用量（80μg）は、100μg SEQ ID NO:9および10群の用量と等モルになるように選ばれたことに注意されたい。陰性対照として、媒体およびPBMCまたは媒体のみ（「PBMCなし」）を与えた群も含めた。各群が含むマウスは10匹であったが、SEQ ID NO:9および10の群は例外で、9匹のマウスからなった。というのも、1匹は、試験の4日目に、処置とは無関係な原因によって死亡したからである。腫瘍成長を3〜4日ごとに記録した。腫瘍成長阻害応答の統計的有意性を両側スチューデントT検定によって決定した。
図20は、PBMC移植後20日目における試験群間の死亡数を表している。PBMC異種移植片対宿主病（xGvHD）を原因とする死亡は、自然死または所定の基準に基づく倫理的屠殺をもたらした。際立ったことに、単一特異性CD137ターゲティング抗体SEQ ID NO:32および33は、他のどの群と比べてもxGvHDを強く加速することになり、試験終了時まで生き残ったマウスはいなかった。他の群も大半が試験終了前の死亡を示し、20日目における死亡数は最大3であった。SEQ ID NO:9および10の4つの処置群では明白な用量依存性がなく、死亡数はSEQ ID NO:51および52群ならびに「PBMCのみ」群と類似していた。これは、SEQ ID NO:9および10がxGvHDの発症に影響しないことを示している。
図21は、経時的な絶対メジアン腫瘍サイズを表している。死亡によってもはや完全でなくなった群については、値が点線で結ばれていることに注意されたい（上記参照）。際立ったことに、アイソタイプ対照群は、PBMCありおよびPBMCなしの媒体対照群と比較して、有意な腫瘍成長阻害をもたらした。それゆえに、以下の考察では、処置群にとって妥当な対照群を、アイソタイプ対照群とするように選んだ。この群と比較したところ、週用量200μgおよび100μgのSEQ ID NO:9および10、ならびに用量80μgのSEQ ID NO:51および52については、強い腫瘍成長阻害があり、すべての応答が同じ程度で、統計的に著しく有意であった（p＜0.001）。週用量20μgのSEQ ID NO:9および10は、アイソタイプ対照群と比較して腫瘍成長阻害傾向を示したが、統計的有意性は境界線上（p＝0.07）であった。アイソタイプ対照群の腫瘍成長と、SEQ ID NO:32および33のCD137結合性ベンチマーク抗体または最低用量のCD137/HER2二重特異性物質SEQ ID NO:9および10（4μg）の腫瘍成長との間には、20日目において統計的有意差はなかった。総合すると、このメジアン腫瘍成長曲線は、SEQ ID NO:9および10の強い用量依存的抗腫瘍活性を示しており、それは、SEQ ID NO:51および52に関する結果を考慮すると、主に、SEQ ID NO:9および10の抗HER2活性によって駆動されると思われる。
実施例19:ヒト化マウス腫瘍モデルにおける免疫組織化学検査による腫瘍浸潤性リンパ球の表現型検査
実施例18に記載のインビボ試験のフォローアップ分析において、9つの試験群のそれぞれのうち、5匹または6匹の腫瘍担持マウスから、試験終了時または倫理的屠殺時に腫瘍を切除し、ヒトリンパ球マーカーCD45に関する染色による免疫組織化学検査によって、ヒトT細胞の浸潤について評価した。この目的のために、腫瘍をホルマリン固定し、パラフィンに包埋し、抗ヒトCD45抗体を用いる免疫組織化学検査用に処理した。CD45陽性細胞は、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）染色によって同定した。グレースケール画像中のDAB陽性を明確に視覚化することができるように、画像のコントラストおよび輝度をデジタルに調整した。
実施例18に記載のインビボ試験のフォローアップ分析において、9つの試験群のそれぞれのうち、5匹または6匹の腫瘍担持マウスから、試験終了時または倫理的屠殺時に腫瘍を切除し、ヒトリンパ球マーカーCD45に関する染色による免疫組織化学検査によって、ヒトT細胞の浸潤について評価した。この目的のために、腫瘍をホルマリン固定し、パラフィンに包埋し、抗ヒトCD45抗体を用いる免疫組織化学検査用に処理した。CD45陽性細胞は、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）染色によって同定した。グレースケール画像中のDAB陽性を明確に視覚化することができるように、画像のコントラストおよび輝度をデジタルに調整した。
すべての染色腫瘍切片の概略を図22に掲載し、一方、図23には、専用ソフトウェアによるCD45陽性細胞の頻度のデジタル定量の結果を掲載する。図22は、他のすべての群と比較した、週用量200μg、100μgまたは20μgのSEQ ID NO:9および10処置群間の、明らかな定性的相違を例証しており、対応腫瘍薄片におけるDAB陽性がはるかに強いことは明らかである。「PBMCなし」群では染色が全くないことから、この染色手法の選択性が確認される。この定性的知見はデジタル定量（図23）によって確認される。すなわち、用量4μg群を除けば、SEQ ID NO:9および10処置動物からの腫瘍は、スライド中のヒトリンパ球の高い頻度を示す強いhCD45陽性を呈する。このhCD45陽性は、対照群（「PBMCのみ」またはアイソタイプ対照）またはHER2単一特異性物質SEQ ID NO:51および52もしくはCD137単一特異性ベンチマーク抗体SEQ ID NO:32および33で処置された群におけるものより、統計的に有意に高い（p＜0.01）。注目すべきことに、後者の群はさらに、対照群よりも統計的に有意に低い、例えばアイソタイプ対照と比較して統計的に有意に低い、ヒトリンパ球の存在を呈する（p＝0.02）。ただしこの効果には、倫理的屠殺が必要だったためにこの群のマウスで行われた早期の試料採取によるバイアスがかかっているのかもしれない。
総合すると、このデータは、週用量20μg以上で腫瘍におけるヒトリンパ球の頻度増加をもたらすSEQ ID NO:9および10の腫瘍限局的共刺激作用様式を例証している。重要なことに、この活性は、あくまで、SEQ ID NO:9および10の二重特異性活性によって駆動されている。なぜなら単一特異性HER2ターゲティング抗体SEQ ID NO:51および52ならびに単一特異性CD137ターゲティング抗体SEQ ID NO:32および33は、この活性を呈することがないからである。逆に、単一特異性CD137ターゲティング抗体SEQ ID NO:32および33は、陰性対照と比較してヒトリンパ球頻度の減少さえもたらす。
実施例20:ヒト化マウス腫瘍モデルにおけるPBMC表現型検査
SEQ ID NO:9および10の作用様式をさらに解明し、その安全性を評価するために、実験18のマウスの血液試料から、PBMCを単離した。これらの試料は、試験終了時のマウス屠殺後または倫理的屠殺後の最終採血によって採取し、ヒト表面マーカーCD45およびCD8についてマルチカラーFACSによって分析した。末梢血を10mlの1×赤血球溶解緩衝液（0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3、0.1mM EDTA）に再懸濁し、15mlチューブ中、室温で1〜3分、溶解した。細胞を300×g、4℃で10分、遠心分離し、10mlのFC緩衝液（PBS中の2％ウシ胎児血清、pH7.4）で1回洗浄し、200μlのFC緩衝液に再懸濁した。細胞を5×105細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに移した。プレートを400×g、4℃で3分遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清を除去した。Fc-ブロック抗体（2.4G2抗体（0.5mg/ml、#553142-BD Bioscience）を緩衝液に1:100希釈したもの、10μl/ウェル）を各ウェルに加え、プレートを室温で15分インキュベートした。次に、ヒト標的hCD45（Life Technologies）およびhCD8（BD Bioscience）に対する特異的抗体を加え（0.5〜1μg/試料）、プレートを遮光して4℃で30分インキュベートした。さらに1回の洗浄工程（プレートを400×g、4℃で3分、遠心分離）後、Attune Focusingサイトメーター（青色（488nm）/紫色（405nm）レーザー構成）で分析するために、細胞を200μlのFC緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータはFlowJoデータ分析ソフトウェアで分析した。
SEQ ID NO:9および10の作用様式をさらに解明し、その安全性を評価するために、実験18のマウスの血液試料から、PBMCを単離した。これらの試料は、試験終了時のマウス屠殺後または倫理的屠殺後の最終採血によって採取し、ヒト表面マーカーCD45およびCD8についてマルチカラーFACSによって分析した。末梢血を10mlの1×赤血球溶解緩衝液（0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3、0.1mM EDTA）に再懸濁し、15mlチューブ中、室温で1〜3分、溶解した。細胞を300×g、4℃で10分、遠心分離し、10mlのFC緩衝液（PBS中の2％ウシ胎児血清、pH7.4）で1回洗浄し、200μlのFC緩衝液に再懸濁した。細胞を5×105細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに移した。プレートを400×g、4℃で3分遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清を除去した。Fc-ブロック抗体（2.4G2抗体（0.5mg/ml、#553142-BD Bioscience）を緩衝液に1:100希釈したもの、10μl/ウェル）を各ウェルに加え、プレートを室温で15分インキュベートした。次に、ヒト標的hCD45（Life Technologies）およびhCD8（BD Bioscience）に対する特異的抗体を加え（0.5〜1μg/試料）、プレートを遮光して4℃で30分インキュベートした。さらに1回の洗浄工程（プレートを400×g、4℃で3分、遠心分離）後、Attune Focusingサイトメーター（青色（488nm）/紫色（405nm）レーザー構成）で分析するために、細胞を200μlのFC緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータはFlowJoデータ分析ソフトウェアで分析した。
図24は、試験終了後の実施例20の処置群および対照群からのPMBCのCD45およびCD8表現型を表している。図24Aは、CD45を発現する総PMBCのパーセンテージを表し、一方、図24Bは、CD45陽性細胞集団におけるCD45＋CD8＋Tエフェクター細胞の分率を表す。明らかに、これらの結果は、抗CD137抗体SEQ ID NO:32および33処置が、対照群またはすべての用量のSEQ ID NO:9および10と比較して、マウス末梢血におけるヒトリンパ球の、より大幅な拡大をもたらすこと、およびこの拡大がCD8＋ヒトエフェクターT細胞の、より大幅な増加と相関することを証明している。図20に示す死亡数データと組み合わせると、これらの結果は、抗CD137 mAb処置によって誘発されるxGvHDの加速が、対照群またはSEQ ID NO:9および10群と比較して増加した、抗CD137群におけるCD8＋ヒトエフェクターT細胞の拡大によって引き起こされることを示している。
実施例18、19および20の証拠を組み合わせると、以下の結論を引き出すことができる。
（i）SEQ ID NO:9および10は二重機能を有する。すなわちこれは、抗HER2効果による直接的な腫瘍退縮と、HER2腫瘍標的限局的なCD137ターゲティングによるヒトリンパ球密度の腫瘍限局的増加とをもたらす。
（ii）驚いたことに、直接的抗HER2効果は、いかなるFc-ガンマ受容体媒介エフェクター機能にも依存しない。CD137/HER2二重特異性物質SEQ ID NO:9および10ならびにHER2単一特異性抗体SEQ ID NO:51および52はどちらもエフェクター機能を一切引き出さないはず、すなわちどちらも、Fc-ガンマ受容体相互作用を本質的に排除する追加の突然変異を持つIgG4抗体バックボーンを持っているからである。
（iii）効力と安全性の両方に関する二重特異性腫瘍限局的CD137ターゲティングの利益は、単一特異的にCD137を標的とするベンチマーク抗体との比較によって明白になる。CD137/HER2二重特異性物質が、対照と比較して、腫瘍中のヒトリンパ球の大幅な増加をもたらすのに対し、単一特異性CD137ターゲティング抗体は対照と比較して減少さえもたらす。他方、単一特異性CD137ターゲティング抗体は、この試験ではマウスの末梢血におけるヒトCD8陽性T細胞の拡大をもたらし、その効果は、SEQ ID NO:9および10では明白でない。CD8＋エフェクター細胞の末梢拡大は、xGvHDによるマウス死亡の加速と相関する。CD137の全身性活性化がもたらすそのような毒性は、SEQ ID NO:32および33などの抗CD137抗体の臨床応用にも関連しうる。これらの観察結果は、SEQ ID NO:9および10の効力と安全性が、SEQ ID NO:32および33などの単一特異性抗CD137ベンチマークと比較して改良されていることを、強く裏付ける。
SEQ ID NO:9および10のインビボ効力のさまざまな局面を示すために本願記載のインビボモデルの変形を応用できることは、当業者には自明である。一般に、そのようなモデルは、ヒトHER2受容体またはその変異体に関して陽性である腫瘍細胞の移植（これは、元々HER2受容体陽性である腫瘍細胞、またはHER2のトランスフェクションもしくはウイルス形質導入などの方法によってHER2受容体陽性にされた腫瘍細胞によって可能になる）に基づくであろう。そのような細胞は、不死化がん細胞株または患者腫瘍から得ることができる。加えて、モデルは、ヒト起源またはマウス起源のアロ反応性またはHLA適合性の腫瘍反応性T細胞に依拠しうる。
（I）HER2陽性腫瘍およびアロ反応性PBMCに基づくヒト化モデル。そのようなモデルにおいて使用されるマウスは、典型的には、多少なりとも免疫無防備状態にあるだろう。不死化細胞株に基づくモデルの例は本願に掲載されていると共に、例えばSanmamed et al., Cancer Res. 2015 Sep 1;75（17）:3466-78に掲載されている。後者の刊行物には、患者由来の腫瘍細胞異種移植片に基づく典型的モデルの例も掲載されている。
（II）HER2陽性腫瘍および腫瘍細胞株上の1つまたは複数の抗原を認識するモノクローナルまたはポリクローナルT細胞に基づくヒト化モデル。そのようなモデルにおいて使用されるマウスは、典型的には、多少なりとも免疫無防備状態にあるだろう。腫瘍細胞特異的T細胞と腫瘍細胞とのさまざまな組み合わせが可能である。腫瘍細胞特異的T細胞は、部分的にまたは完全にHLA適合性のモノクローナルまたはポリクローナル腫瘍反応性T細胞を、例えばErskine et al., J Vis Exp. 2012 Aug 8;（66）:e3683に記載されているようなさまざまなプロトコールで作製することによって、または例えばWang et al., Cancer Immunol Res. 2016 Mar;4（3）:204-14もしくはHirschhorn-Cymerman et al., J Exp Med. 2012 Oct 22;209（11）:2113-26に記載されているようにT細胞に天然T細胞受容体を形質導入することによって、得ることができる。人工キメラ抗原受容体を使って天然TCRを置き換えることもできる。
（III）患者由来腫瘍細胞および自家患者由来PBMCまたは（拡大された）TIL。そのようなモデルにおいて使用されるマウスは、典型的には、多少なりとも免疫無防備状態にあるだろう。
（IV）CD137受容体が部分的にまたは完全にヒト化されており、したがってSEQ ID NO:9および10に結合できるようになっている、トランスジェニックマウスモデル。トランスジェニックマウスには、細胞生物学的方法によってヒトHER2を発現するようにしたマウス腫瘍が移植されるであろう。モデルの生理学的妥当性を増進するために、マウスをさらに、CD137リガンドおよび/またはヒトHER2に関してトランスジェニックにすることができる。
上述のモデルまたはそれらの変形は、以下の薬力学的効果の1つまたは複数を示す能力を有すると予想される:局所的増殖の直接的または間接的強化によるTIL頻度の増加、リンパ球細胞死の直接的または間接的抑制によるTIL頻度の増加、限定するわけではないがIL-2、IFN-γまたはTNF-αなどの炎症誘発性サイトカインの生産、またはSEQ ID NO:9および10の抗HER2活性だけによるのではない腫瘍成長への強い影響によって証明される腫瘍細胞を殺す能力の改良などといった、増殖または持久性とは異なるTIL活性の増加。影響を受けるリンパ球には、CD4およびCD8陽性T細胞、NK細胞またはNKT細胞などがあるが、それらに限定されるわけではない。限定するわけではないが内皮細胞、例えば腫瘍血管の内皮細胞など、他の細胞タイプは、特異的薬力学効果を示しうる。腫瘍内皮細胞の場合、SEQ ID NO:9および10によるCD137ターゲティングは、ターゲティング受容体またはターゲティングを強化する可溶性因子の発現による腫瘍への輸送の強化につながりうる（Palazon et al., Cancer Res. 2011 Feb 1;71（3）:801-11参照）。
これらのモデルは、リンパ球サブセットの特異的ターゲティングの追加効果、薬力学的効果および毒性効果の用量依存性、または処置スケジュールを研究するために、そのまま使用しうる。
本明細書に例示的に記載した態様は、本明細書において具体的に開示しない任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の限定が存在しなくても、適切に実施しうる。したがって例えば「含む（comprising）」、「包含する（including）」、「含有する（containing）」などの用語は、拡大的、非限定的に解釈されるべきである。加えて、本明細書において使用する用語および表現は、説明のために使用されているのであって、限定のために使用されているのではなく、そのような用語および表現の使用には、示され記載された特徴またはその部分のいずれの等価物も排除しようという意図はなく、さまざまな変更態様が本願発明の範囲内で可能であると認識される。したがって、本態様を好ましい態様および随意の特徴によって具体的に開示したが、当業者はその変更態様および変形態様を採ることができ、そのような変更態様および変形態様は本発明の範囲内にあるとみなされると理解すべきである。本明細書において記載した特許、特許出願、教科書および査読付き刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。さらにまた、参照により本明細書に組み入れられた参考文献における用語の定義または用法が、本明細書に掲載した当該用語の定義と一致しないか相反する場合は、本明細書に掲載した当該用語の定義が適用され、参考文献における当該用語の定義は適用されない。一般的開示に含まれる狭い種概念および下位類概念群のそれぞれも、本発明の一部を形成する。これには、削除される事項が本明細書に具体的に陳述されているかどうかに関わらず、類概念から任意の内容を除去するただし書きまたは消極的限定の付いた本発明の一般的記述が包含される。加えて、特徴がマーカッシュ群で記載される場合、それによって本開示がそのマーカッシュ群の任意の個々の要素または任意の要素の部分群についても記載されることは、当業者にはわかるであろう。さらなる態様は、以下の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
等価物:当業者は、本明細書に記載した本発明の具体的態様に対する多くの等価物を認識するか、せいぜい日常的な実験を使って確かめることができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。この明細書において言及した刊行物、特許および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることを具体的かつ個別に示したかのように、それと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
Claims (47)
- CD137にもHer2にも結合する能力を有する融合ポリペプチドであって、少なくとも2つのサブユニットを任意の順序で含み、第1サブユニットは完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含み、この第1結合ドメインはHER2に対する結合特異性を有し、かつ第2サブユニットはCD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含む、融合ポリペプチド。
- 融合ポリペプチドに含まれるCD137に特異的なリポカリンムテインと融合ポリペプチドとを本質的に実施例3に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、融合ポリペプチドに含まれるCD137に特異的なリポカリンムテインのEC50値と、少なくともほぼ同じかそれより優れたEC50値で、CD137に結合する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
- 本質的に実施例3に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約1nMのEC50値でCD137に結合する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
- 融合ポリペプチドに含まれるHER2/neuに特異的な免疫グロブリンと融合ポリペプチドとを本質的に実施例2に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、当該融合ポリペプチドに含まれるHER2/neuに特異的な免疫グロブリンのEC50値に匹敵するEC50値で、HER2/neuに結合する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
- 本質的に実施例2に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約1nMのEC50値でHER2/neuに結合する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
- 本質的に実施例4に記載するELISAアッセイにおいて測定した場合に、CD137およびHER2/neuに同時に結合する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
- 本質的に実施例4に記載するELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約4nMのEC50値でCD137およびHER2/neuに同時に結合する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
- 本質的に実施例5に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいてT細胞応答を共刺激する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
- 本質的に実施例5に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、IL-2分泌およびT細胞増殖を誘発することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
- 本質的に実施例5に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞活性化の成功をもたらす、請求項1記載の融合ポリペプチド。
- 前記ムテインが、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:18）の配列位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 前記ムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:18）との比較において以下の変異アミノ酸残基:
のうちの少なくとも1つを含む、請求項11記載の融合ポリペプチド。 - 前記ムテインのアミノ酸配列が以下の組のアミノ酸置換:
のうちの1つを含む、請求項11〜12のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。 - 前記ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:32〜38からなる群またはそのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項11〜13のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 前記ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:32〜38からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有する、請求項11〜13のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 前記ムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:17）の配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 前記ムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:17）との比較において、以下の変異アミノ酸残基:
のうちの少なくとも1つを含む、請求項16記載の融合ポリペプチド。 - 前記ムテインのアミノ酸配列が、以下の組のアミノ酸置換:
のうちの1つを含む、請求項16〜17のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。 - 前記ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2および39〜46からなる群またはそのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項16〜18のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 前記ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2および39〜46からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有する、請求項16〜18のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 1つのサブユニットが、本質的に図1に記載するように、ペプチド結合を介して別のサブユニットに連結されうる、請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 第1サブユニットと第2結合ドメインとが、第2サブユニットのリポカリンムテインのN末と第1サブユニットの免疫グロブリンの重鎖定常領域（CH）のC末との間のペプチド結合を介して連結されている、請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 第3サブユニットが、第3サブユニットのリポカリンムテインのN末と第1サブユニットの免疫グロブリンの軽鎖定常領域（CL）のC末との間でペプチド結合を介して第1サブユニットに連結されている、請求項1〜20のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- ペプチド結合が、構造化されていない（G4S）3リンカーである、請求項21〜23のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- SEQ ID NO:19に示すアミノ酸を含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- リポカリンムテインがSEQ ID NO:2に示すアミノ酸を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 免疫グロブリンがモノクローナル抗体である、請求項1〜25のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- モノクローナル抗体がトラスツズマブまたはペルツズマブである、請求項1〜25のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- モノクローナル抗体がSEQ ID NO:3および4によって与えられる重鎖および軽鎖を有する、請求項1〜25のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- モノクローナル抗体がIgG4バックボーンを有する、請求項1〜25のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- IgG4バックボーンが、S228P、N297A、F234A、およびL235Aからなる群より選択される突然変異のうちのいずれか1つを有する、請求項30記載の融合ポリペプチド。
- SEQ ID NO:5および6に示すアミノ酸、SEQ ID NO:7および8に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:9および10に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:11および12に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:13および14に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:15および16に示すアミノ酸を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
- 請求項1〜32のいずれか一項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
- 核酸分子の発現を可能にする制御配列に機能的に連結されている、請求項33記載の核酸分子。
- ベクター中またはファージミドベクター中に含まれている、請求項33または34記載の核酸分子。
- 請求項34〜35のいずれか一項記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
- 請求項1〜232のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを生産する方法であって、融合ポリペプチドが、ムテインをコードする核酸から出発して、遺伝子工学的方法を使って生産される、方法。
- 融合ポリペプチドが細菌宿主細胞または真核宿主細胞中で生産され、かつ、この宿主生物またはその培養物から単離される、請求項37記載の方法。
- CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合（engage）するための、請求項1〜32のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
- CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合するための、請求項1〜32のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
- CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合する方法であって、請求項1〜32のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
- T細胞を共刺激し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合する方法であって、請求項1〜32のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
- Tリンパ球増殖を誘発し、同時にHER2/neu陽性腫瘍細胞に会合する方法であって、請求項1〜32のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
- T細胞でのCD137クラスター化および活性化をHER2/neu陽性腫瘍細胞へ方向づける方法であって、請求項1〜32のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
- HER2/neu陽性腫瘍細胞の近傍において局所的T細胞応答を誘発する方法であって、請求項1〜32のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
- HER2/neu陽性腫瘍細胞の近傍において局所的NK細胞応答を誘発する方法であって、請求項1〜32のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
- HER2/neu陽性腫瘍細胞の近傍においてT細胞によるIL-2および/またはIFNガンマの生産を誘発する方法であって、請求項1〜32のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
Applications Claiming Priority (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15166179.0 | 2015-05-04 | ||
| EP15166179 | 2015-05-04 | ||
| EP15167917.2 | 2015-05-18 | ||
| EP15167917 | 2015-05-18 | ||
| EP15002702 | 2015-09-17 | ||
| EP15002702.7 | 2015-09-17 | ||
| EP15192870 | 2015-11-04 | ||
| EP15192870.2 | 2015-11-04 | ||
| EP16150705.8 | 2016-01-11 | ||
| EP16150705 | 2016-01-11 | ||
| EP16000862.9 | 2016-04-15 | ||
| EP16000862 | 2016-04-15 | ||
| PCT/EP2016/060041 WO2016177802A1 (en) | 2015-05-04 | 2016-05-04 | Anti-cancer fusion polypeptide |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018515085A true JP2018515085A (ja) | 2018-06-14 |
| JP2018515085A5 JP2018515085A5 (ja) | 2019-06-06 |
| JP6783797B2 JP6783797B2 (ja) | 2020-11-11 |
Family
ID=55948826
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017557310A Active JP6783797B2 (ja) | 2015-05-04 | 2016-05-04 | 抗がん融合ポリペプチド |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10865250B2 (ja) |
| EP (1) | EP3292148B1 (ja) |
| JP (1) | JP6783797B2 (ja) |
| KR (1) | KR20170138574A (ja) |
| CN (2) | CN114316067A (ja) |
| AU (1) | AU2016258977C1 (ja) |
| BR (1) | BR112017020434A2 (ja) |
| CA (1) | CA2980840A1 (ja) |
| HK (1) | HK1249526A1 (ja) |
| MX (1) | MX2017014083A (ja) |
| RU (1) | RU2727165C2 (ja) |
| SG (1) | SG11201708334RA (ja) |
| WO (1) | WO2016177802A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA201705961B (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018515084A (ja) * | 2015-05-04 | 2018-06-14 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | Ｃｄ１３７に特異的なタンパク質 |
| JP2018519803A (ja) * | 2015-05-18 | 2018-07-26 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | 抗がん性融合ポリペプチド |
| JP2021535149A (ja) * | 2018-08-27 | 2021-12-16 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | Ｃｄ１３７／ｈｅｒ２二重特異性物質とｐｄ−１系阻害物質とを含む併用療法およびその使用法 |
| WO2024085166A1 (ja) * | 2022-10-19 | 2024-04-25 | アステラス製薬株式会社 | がん治療におけるｐｄ－１シグナル阻害剤との組み合わせによる抗ｃｌｄｎ４－抗ｃｄ１３７二重特異性抗体の使用 |
| JP7476219B2 (ja) | 2019-02-26 | 2024-04-30 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | Ｃｄ１３７およびｇｐｃ３に特異的な新規融合タンパク質 |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2936611A1 (en) * | 2014-01-13 | 2015-07-16 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Multi-specific polypeptide useful for localized tumor immunomodulation |
| AR106188A1 (es) | 2015-10-01 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización |
| SG11201811064TA (en) | 2016-06-20 | 2019-01-30 | F Star Delta Ltd | Binding molecules binding pd-l1 and lag-3 |
| CN109311993B (zh) | 2016-06-20 | 2022-12-20 | F-星治疗有限公司 | Lag-3结合元件 |
| GB201612520D0 (en) | 2016-07-19 | 2016-08-31 | F-Star Beta Ltd | Binding molecules |
| MA47200A (fr) * | 2017-01-03 | 2019-11-13 | Hoffmann La Roche | Molécules bispécifiques de liaison à l'antigène comprenant un clone 20h4.9 anti-4-1bb |
| GB201700345D0 (en) * | 2017-01-09 | 2017-02-22 | F-Star Beta Ltd | Conditional agonists of immune responses |
| WO2018134279A1 (en) * | 2017-01-18 | 2018-07-26 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Novel fusion polypeptides specific for lag-3 and pd-1 |
| AU2018224094A1 (en) | 2017-02-24 | 2019-09-19 | Macrogenics, Inc. | Bispecific binding molecules that are capable of binding CD137 and tumor antigens, and uses thereof |
| PE20200757A1 (es) | 2017-07-11 | 2020-07-27 | Compass Therapeutics Llc | Anticuerpos agonistas que se unen a cd137 humano y sus usos |
| WO2019089753A2 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Compass Therapeutics Llc | Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof |
| CA3082321A1 (en) * | 2017-11-13 | 2019-05-16 | Crescendo Biologics Limited | Single domain antibodies that bind to cd137 |
| EP3713961A2 (en) | 2017-11-20 | 2020-09-30 | Compass Therapeutics LLC | Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof |
| CA3086098A1 (en) | 2017-12-19 | 2019-06-27 | F-Star Beta Limited | Fc binding fragments comprising a pd-l1 antigen-binding site |
| CN111655731A (zh) * | 2018-03-13 | 2020-09-11 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用靶向性4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法 |
| TW202003462A (zh) | 2018-03-26 | 2020-01-16 | 德商４Ｓｃ製藥公司 | 用於癌症療法的包括ｈｄａｃ抑制劑和ｃｄ１３７激動劑之組合 |
| KR20200144114A (ko) * | 2018-04-13 | 2020-12-28 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 4-1bbl을 포함하는 her-2 표적화 항원 결합 분자 |
| GB201811408D0 (en) | 2018-07-12 | 2018-08-29 | F Star Beta Ltd | CD137 Binding Molecules |
| WO2020011964A1 (en) | 2018-07-12 | 2020-01-16 | F-Star Beta Limited | Antibody molecules that bind pd-l1 and cd137 |
| GB201811404D0 (en) | 2018-07-12 | 2018-08-29 | F Star Beta Ltd | Anti-CD137 Antibodies |
| EP3952996A1 (en) | 2019-04-12 | 2022-02-16 | F. Hoffmann-La Roche AG | Bispecific antigen binding molecules comprising lipocalin muteins |
| WO2021020846A1 (en) * | 2019-07-26 | 2021-02-04 | Abl Bio Inc. | Anti-her2/anti-4-1bb bispecific antibody and use thereof |
| EP4054718A1 (en) | 2019-11-04 | 2022-09-14 | Pieris Pharmaceuticals GmbH | Her2/4-1bb bispecific fusion proteins for the treatment of cancer |
| CN115151573A (zh) * | 2020-02-28 | 2022-10-04 | 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 | 抗cd137构建体、多特异性抗体及其用途 |
| KR20230042524A (ko) * | 2020-08-07 | 2023-03-28 | 주식회사 유틸렉스 | 항-her2 / 항-4-1bb 이중특이적 항체 및 이의 용도 |
| JP2023541482A (ja) | 2020-09-18 | 2023-10-02 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | バイオマーカー法および使用法 |
| US20240084025A1 (en) * | 2021-01-25 | 2024-03-14 | Yuhan Corporation | Methods for purifying an anti-4-1bb/anti-her2 bispecific antibody |
| KR20230160366A (ko) | 2021-03-23 | 2023-11-23 | 피어이스 파마슈티컬즈 게엠베하 | 암 치료를 위한 her2/4-1bb 이중특이적 융합 단백질 |
| WO2022200478A1 (en) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Tumor treatment with a 4-1bb/her2-bispecific agent and a her2-targeted tyrosine kinase inhibitor |
| WO2023180523A1 (en) | 2022-03-24 | 2023-09-28 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Process for purifying fusion proteins |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009545301A (ja) * | 2006-08-01 | 2009-12-24 | ピエリス アーゲー | 涙リポカリンの突然変異タンパク質およびそれを得るための方法 |
| JP2013521311A (ja) * | 2010-03-05 | 2013-06-10 | ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー | 標的免疫調節抗体および融合タンパク質に基づく組成物および方法 |
| WO2013164694A1 (en) * | 2012-04-30 | 2013-11-07 | Biocon Limited | Targeted/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same |
Family Cites Families (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| EP0257956B2 (en) | 1986-08-19 | 2000-11-22 | Genentech, Inc. | Use of polypeptide growth factors and cytokines for the manufacture of a device and of a dispersion |
| JPH01215289A (ja) | 1988-02-22 | 1989-08-29 | Toa Nenryo Kogyo Kk | 遺伝子組換えによる正常ヒト血清アルブミンａの製造方法 |
| FR2649991B2 (fr) | 1988-08-05 | 1994-03-04 | Rhone Poulenc Sante | Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces |
| US5728553A (en) | 1992-09-23 | 1998-03-17 | Delta Biotechnology Limited | High purity albumin and method of producing |
| AU696387B2 (en) | 1994-05-18 | 1998-09-10 | Inhale Therapeutic Systems, Inc. | Methods and compositions for the dry powder formulation of interferons |
| DE4417598A1 (de) | 1994-05-19 | 1995-12-14 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung des Tetracyclinpromotors zur stringent regulierten Produktion von rekombinanten Proteinen in prokaryontischen Zellen |
| AU5132096A (en) | 1995-01-30 | 1996-08-21 | Terrapin Technologies, Inc. | Glubodies - multiplicities of proteins capable of binding a variety of small molecules |
| US5908621A (en) | 1995-11-02 | 1999-06-01 | Schering Corporation | Polyethylene glycol modified interferon therapy |
| US6620413B1 (en) | 1995-12-27 | 2003-09-16 | Genentech, Inc. | OB protein-polymer chimeras |
| DE19641876B4 (de) | 1996-10-10 | 2011-09-29 | Iba Gmbh | Streptavidinmuteine |
| WO1998016873A1 (fr) | 1996-10-14 | 1998-04-23 | Firm Forsat Ltd. | Procede de preparation de dispersions a base de composants chromogenes |
| AU737910B2 (en) | 1997-01-31 | 2001-09-06 | Regents Of The University Of California, The | Chimeric antibody fusion proteins for the recruitment and stimulation of an antitumor immune response |
| US6020163A (en) | 1997-08-06 | 2000-02-01 | Zymogenetics, Inc. | Lipocalin homolog |
| US20140080177A1 (en) | 1997-09-26 | 2014-03-20 | Pieris Ag | Anticalins |
| DE19742706B4 (de) | 1997-09-26 | 2013-07-25 | Pieris Proteolab Ag | Lipocalinmuteine |
| GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
| CA2233725A1 (en) | 1998-03-31 | 1999-09-30 | Hemosol Inc. | Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes |
| TR200003635T2 (tr) | 1998-06-08 | 2001-04-20 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Peg-IFN-ALFA ve ribavirinin kronik hepatit C tedavisinde kullanılması. |
| US6403564B1 (en) | 1998-10-16 | 2002-06-11 | Schering Corporation | Ribavirin-interferon alfa combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic hepatitis C infection |
| CA2343917A1 (en) | 1998-10-19 | 2000-04-27 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Materials and methods involving conditional retention domains |
| DE19926068C1 (de) | 1999-06-08 | 2001-01-11 | Arne Skerra | Muteine des Bilin-Bindungsproteins |
| EP1377306A1 (en) | 2001-03-09 | 2004-01-07 | Dyax Corp. | Serum albumin binding moieties |
| WO2003029462A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins |
| EP1430136A1 (en) | 2001-09-27 | 2004-06-23 | Pieris ProteoLab AG | Muteins of apolipoprotein d |
| WO2005019255A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-03-03 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of tear lipocalin |
| AU2003264100A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-03-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target |
| JP2007284351A (ja) | 2004-07-27 | 2007-11-01 | Osaka Bioscience Institute | アミロイド蛋白質の凝集を抑制する物質とその作用 |
| EP2899277A1 (en) | 2004-11-26 | 2015-07-29 | Pieris AG | Compound with affinity for the cytotoxic T lymphocyte-associated antigen (CTLA-4) |
| EP1929073A4 (en) | 2005-09-27 | 2010-03-10 | Amunix Inc | PROTEIN MEDICAMENT AND ITS USE |
| JP2011501673A (ja) | 2007-10-19 | 2011-01-13 | アボット・ラボラトリーズ | グリコシル化された哺乳動物ｎｇａｌ及びその使用 |
| US20110008345A1 (en) | 2007-11-30 | 2011-01-13 | Claire Ashman | Antigen-binding constructs |
| AU2009223784A1 (en) | 2008-03-08 | 2009-09-17 | Immungene, Inc. | Engineered fusion molecules immunotherapy in cancer and inflammatory diseases |
| AU2009264214B2 (en) | 2008-06-24 | 2013-06-06 | Technische Universitaet Muenchen | Muteins of hNGAL and related proteins with affinity for a given target |
| US20110305694A1 (en) | 2009-02-24 | 2011-12-15 | Paul Andrew Hamblin | Multivalent and/or multispecific rankl-binding constructs |
| AR076796A1 (es) | 2009-05-28 | 2011-07-06 | Glaxo Group Ltd | Proteinas de union al antigeno. composicion farmaceutica. uso. procedimiento. |
| CN106139123A (zh) | 2009-08-05 | 2016-11-23 | 爱力根公司 | 脂质运载蛋白突变蛋白的控制释放制剂 |
| EP3660510A3 (en) | 2009-12-07 | 2020-07-08 | Pieris Pharmaceuticals GmbH | Muteins of human lipocalin 2 (lcn2, hngal) with affinity for a given target |
| WO2012022742A1 (en) | 2010-08-16 | 2012-02-23 | Pieris Ag | Binding proteins for hepcidin |
| JP6100694B2 (ja) | 2010-11-15 | 2017-03-22 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | グリピカン−３（ｇｐｃ３）に対して親和性を有するヒトリポカリン２の突然変異タンパク質 |
| US9221885B2 (en) | 2010-12-02 | 2015-12-29 | Pieris Ag | Muteins of human lipocalin 2 with affinity for CTLA-4 |
| CA2936611A1 (en) * | 2014-01-13 | 2015-07-16 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Multi-specific polypeptide useful for localized tumor immunomodulation |
| SG11201705310TA (en) * | 2014-12-30 | 2017-07-28 | Celgene Corp | Anti-cd47 antibodies and uses thereof |
| US11382963B2 (en) | 2015-01-12 | 2022-07-12 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Engineered T cells and uses therefor |
| US10526382B2 (en) | 2015-01-28 | 2020-01-07 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Human neutrophil gelatinase-associated lipocalin (hNGAL) muteins capable of binding angiopoietin-2 (Ang-2) and methods of use thereof |
| AU2016221816B2 (en) | 2015-02-18 | 2020-07-02 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Novel proteins specific for pyoverdine and pyochelin |
| US11261221B2 (en) | 2015-05-04 | 2022-03-01 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Proteins specific for CD137 |
| CN107787327B (zh) | 2015-05-18 | 2022-02-08 | 皮里斯制药有限公司 | 对磷脂酰肌醇聚糖-3（gpc3）具有亲和力的人脂质运载蛋白2的突变蛋白 |
| TW201725212A (zh) | 2015-12-10 | 2017-07-16 | 第一三共股份有限公司 | 特異性於降鈣素基因相關胜肽的新穎蛋白 |
-
2016
- 2016-05-04 AU AU2016258977A patent/AU2016258977C1/en active Active
- 2016-05-04 MX MX2017014083A patent/MX2017014083A/es unknown
- 2016-05-04 KR KR1020177034820A patent/KR20170138574A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-05-04 WO PCT/EP2016/060041 patent/WO2016177802A1/en active Application Filing
- 2016-05-04 RU RU2017135596A patent/RU2727165C2/ru active
- 2016-05-04 SG SG11201708334RA patent/SG11201708334RA/en unknown
- 2016-05-04 JP JP2017557310A patent/JP6783797B2/ja active Active
- 2016-05-04 EP EP16721154.9A patent/EP3292148B1/en active Active
- 2016-05-04 BR BR112017020434A patent/BR112017020434A2/pt active Search and Examination
- 2016-05-04 CN CN202111366682.4A patent/CN114316067A/zh active Pending
- 2016-05-04 CN CN201680025273.9A patent/CN107636014B/zh active Active
- 2016-05-04 CA CA2980840A patent/CA2980840A1/en active Pending
- 2016-05-04 US US15/571,561 patent/US10865250B2/en active Active
-
2017
- 2017-09-01 ZA ZA2017/05961A patent/ZA201705961B/en unknown
-
2018
- 2018-06-22 HK HK18107992.3A patent/HK1249526A1/zh unknown
-
2020
- 2020-11-12 US US17/096,750 patent/US20210198380A1/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009545301A (ja) * | 2006-08-01 | 2009-12-24 | ピエリス アーゲー | 涙リポカリンの突然変異タンパク質およびそれを得るための方法 |
| JP2013521311A (ja) * | 2010-03-05 | 2013-06-10 | ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー | 標的免疫調節抗体および融合タンパク質に基づく組成物および方法 |
| WO2013164694A1 (en) * | 2012-04-30 | 2013-11-07 | Biocon Limited | Targeted/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KOHRT, H. ET AL., [ONLINE]: ""Stimulation of natural killer cells with an anti-CD137 antibody enhances the efficacy trastuzumab,", CANCER RES., vol. Vol. 72, Issue 8 Supplement, JPN6020014729, 2012, pages 138, ISSN: 0004256782 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018515084A (ja) * | 2015-05-04 | 2018-06-14 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | Ｃｄ１３７に特異的なタンパク質 |
| US11261221B2 (en) | 2015-05-04 | 2022-03-01 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Proteins specific for CD137 |
| JP2018519803A (ja) * | 2015-05-18 | 2018-07-26 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | 抗がん性融合ポリペプチド |
| JP2021535149A (ja) * | 2018-08-27 | 2021-12-16 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | Ｃｄ１３７／ｈｅｒ２二重特異性物質とｐｄ−１系阻害物質とを含む併用療法およびその使用法 |
| JP7459058B2 (ja) | 2018-08-27 | 2024-04-01 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | Ｃｄ１３７／ｈｅｒ２二重特異性物質とｐｄ－１系阻害物質とを含む併用療法およびその使用法 |
| JP7476219B2 (ja) | 2019-02-26 | 2024-04-30 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | Ｃｄ１３７およびｇｐｃ３に特異的な新規融合タンパク質 |
| WO2024085166A1 (ja) * | 2022-10-19 | 2024-04-25 | アステラス製薬株式会社 | がん治療におけるｐｄ－１シグナル阻害剤との組み合わせによる抗ｃｌｄｎ４－抗ｃｄ１３７二重特異性抗体の使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA201705961B (en) | 2023-12-20 |
| HK1249526A1 (zh) | 2018-11-02 |
| AU2016258977A1 (en) | 2017-11-30 |
| RU2017135596A (ru) | 2019-06-04 |
| CN107636014B (zh) | 2021-12-07 |
| RU2017135596A3 (ja) | 2019-09-16 |
| EP3292148B1 (en) | 2024-01-24 |
| MX2017014083A (es) | 2018-11-09 |
| SG11201708334RA (en) | 2017-11-29 |
| CN107636014A (zh) | 2018-01-26 |
| RU2727165C2 (ru) | 2020-07-21 |
| CN114316067A (zh) | 2022-04-12 |
| CA2980840A1 (en) | 2016-11-10 |
| JP6783797B2 (ja) | 2020-11-11 |
| US10865250B2 (en) | 2020-12-15 |
| BR112017020434A2 (pt) | 2018-06-26 |
| US20190010248A1 (en) | 2019-01-10 |
| AU2016258977C1 (en) | 2022-07-14 |
| EP3292148A1 (en) | 2018-03-14 |
| US20210198380A1 (en) | 2021-07-01 |
| AU2016258977B2 (en) | 2022-03-17 |
| WO2016177802A1 (en) | 2016-11-10 |
| KR20170138574A (ko) | 2017-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210198380A1 (en) | Anti-cancer fusion polypeptide | |
| US11919931B2 (en) | Anti-cancer fusion polypeptide capable of binding both CD137 and glypican-3 (GPC3) | |
| RU2628699C2 (ru) | Trail r2-специфические мультимерные скаффолды | |
| KR20220016945A (ko) | 다중특이적 단백질 | |
| JP7303391B2 (ja) | バイアス型ｉｌ２ムテイン、方法、および組成物 | |
| KR20230120139A (ko) | 재조합 cd3 결합 단백질 및 이의 용도 | |
| KR20220141299A (ko) | Il2 오르토로그 및 사용 방법 | |
| WO2024064713A1 (en) | Novel fusion protein specific for cd137 and cd228 | |
| JP2023546269A (ja) | Ｔ細胞を増殖させるための二重特異性コンストラクトおよび関連する方法 | |
| JP2021533203A (ja) | Ｃｄ１３７とｐｄ−ｌ１に特異的な新規融合タンパク質 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20171106 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190424 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190424 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200427 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200716 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20201014 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20201022 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6783797 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |