KR20220016945A - 다중특이적 단백질 - Google Patents

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KR20220016945A
KR20220016945A KR1020227000009A KR20227000009A KR20220016945A KR 20220016945 A KR20220016945 A KR 20220016945A KR 1020227000009 A KR1020227000009 A KR 1020227000009A KR 20227000009 A KR20227000009 A KR 20227000009A KR 20220016945 A KR20220016945 A KR 20220016945A
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크리스티안 라이헨
알렉산데르 린크
줄리아 헤프
빅토르 레비트스키
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몰리큘라 파트너스 아게
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Abstract

본 개시내용은 암 치료에 유용한 다중특이적 재조합 단백질에 관한 것이다.

Description

다중특이적 단백질
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 6월 4일자로 출원된 미국 임시 출원 제62/857,037호에 대하여 우선권을 주장하고, 그 개시 내용은 전체가 참조로 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 암 치료에 유용한 다중특이적 단백질에 관한 것이다.
서열 목록의 참조에 의한 통합
본 문서와 동시에 제출되고 다음과 같이 식별되는 컴퓨터 판독 가능한 뉴클레오타이드/아미노산 서열 목록 전체가 참조로 포함된다. ASCII(텍스트) 파일 파일명: 53893A_Seqlisting.txt; 크기: 107,894 바이트, 2020년 5월 21일에 생성됨.
종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 패밀리의 여러 구성원은 T 세포 반응을 유지하기 위해 초기 T 세포 활성화 후에 기능하므로 면역 체계의 조직 및 기능에서 중추적인 역할을 한다. CD27, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), HVEM, CD30 및 GITR은 T 세포에 공동자극 효과를 가질 수 있으며, 이는 T 세포가 초기 T 세포 활성화 후에도 T 세포 반응을 지속한다는 것을 의미한다(문헌[Watts T.H. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23, 23-68]). 질병 상태에 따라 공동자극 TNF 패밀리 구성원을 통한 자극은 질병을 악화시키거나 개선할 수 있다.
TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원인 4-1BB(CD137)는 T-세포 활성화에 의해 발현이 유도되는 분자로서 최초로 식별되었다(문헌[Kwon Y.H. and Weissman S.M. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1963-1967]). 후속 연구는 T- 및 B-림프구, NK-세포, NKT-세포, 단핵구, 호중구 및 수지상 세포 뿐만 아니라 내피 및 평활근 세포와 같은 비조혈 기원 세포에서 4-1BB의 발현을 입증했다. 다른 세포 유형에서 4-1BB의 발현은 대부분 유도될 수 있고 T-세포 수용체(TCR) 또는 B-세포 수용체 촉발과 같은 다양한 자극 신호뿐만 아니라 공동 자극 분자 또는 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 수용체를 통해 유도된 신호 전달에 의해 유도된다.
4-1BB 신호 전달은 NK 세포의 IFNγ 분비 및 증식을 자극할 뿐만 아니라 증가된 생존 및 사이토카인을 분비하고 공동-자극 분자를 상향 조절하는 능력에 의해 표시되는 수지상 세포(DC) 활성화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 4-1BB는 T 세포의 CD4+ 및 CD8+ 하위 집합 모두에서 TCR 유도 활성화를 조절하는 공동 자극 분자로 가장 잘 특징지어 진다. TCR 촉발과 함께 작용성 4-1BB 특이적 항체는 T 세포의 증식을 향상시키고 림포카인 분비를 자극하며 활성화 유도 세포 사멸에 대한 T 림프구의 민감도를 감소시킨다(문헌[Snell L.M. et al. (2011) Immunol. Rev. 244, 197-217]). 시험관내 T 세포에 대한 4-1BB 항체의 이러한 공동 자극 효과에 따라, 종양 보유 마우스에 대한 투여는 많은 실험적 종양 모델에서 강력한 항종양 효과를 유도한다(문헌[Melero I. et al. (1997), Nat. Med. 3, 682-685]; 문헌[Narazaki H. et al. (2010), Blood 115, 1941-1948]). 생체내 고갈 실험은 CD8+ T-세포가 4-1BB-특이적 항체의 항종양 효과에서 가장 중요한 역할을 한다는 것을 입증했다. 그러나, 4-1BB 특이적 항체를 포함하는 종양 모델 또는 병용 요법에 따라 DC, NK-세포 또는 CD4+ T-세포와 같은 다른 유형의 세포의 기여가 보고되었다(문헌[MuriUo O. et al. (2009), Eur. J. Immunol. 39, 2424-2436]; 문헌[Stagg J. et al. (2011), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 7142-7147]).
다른 림프구 하위 집합에 대한 직접적인 효과 이외에, 4-1BB 작용제는 또한 종양 혈관 내피에 대한 세포간 접착 분자 1(ICAM1) 및 혈관 세포 접착 분자 1(VCAM1)의 4-1BB 매개 상향 조절을 통해 종양에서 활성화된 T 세포의 침투 및 보유를 유도할 수 있다. 4-1BB 촉발은 또한 종양 미세 환경 또는 만성 감염 동안 면역 내성의 붕괴에 기여할 수 있는 가용성 항원에 대한 노출에 의해 유도된 T 세포 아네르기 상태를 역전시킬 수 있다.
4-1BB-특이적 작용성 항체의 전신 투여는 간 독성과 관련된 CD8+ T-세포의 확장을 유도하는 것으로 보고되었다(문헌[Dubrot J. et al. (2010), Cancer Immunol. Immunother. 59, 1223-1233]). 인간 임상 시험(ClinicalTrials.gov, NCT00309023)에서 12주 동안 3주마다 1회 투여된 4-1BB 작용제 항체(BMS-663513)는 흑색종, 난소 또는 신세포 암종 환자에서 질병의 안정화를 유도했다. 그러나, 다른 시험(NCT00612664)에서 제공된 동일한 항체가 4등급 간염을 유발하여 시험이 종료되었다(문헌[Simeone E. and Ascierto P.A. (2012), J. Immunotoxicology 9, 241-247]).
따라서, 바람직하지 않은 부작용을 피하면서 4-1BB와 효과적으로 결합하는 신세대 작용제가 필요하다.
본 명세서에 제공된 개시 내용에 기초하여, 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 실시형태(E)에 포함되는 것으로 의도된다.
E1. 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 단백질.
E2. E1에 있어서, 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 재조합 단백질.
E3. E2에 있어서, 상기 안키린 반복 도메인은 하기 화학식에 따라, N-말단에서 C-말단으로 배열되는 재조합 단백질: (FAP-결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인).
E4 E1 내지 E3 중 어느 하나에 있어서, 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함하는 재조합 단백질.
E5. E4에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 단백질.
E6. E5에 있어서, 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제5 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 재조합 단백질.
E7. E6에 있어서, 상기 안키린 반복 도메인은 하기 화학식에 따라, N-말단에서 C-말단으로 배열되는 재조합 단백질: (혈청 알부민 결합 도메인(본원에서 혈청 알부민 결합 도메인 1로도 지칭됨)) - (FAP-결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인) - (혈청 알부민 결합 도메인 (본원에서 혈청 알부민 결합 도메인 2로도 지칭됨)).
E8. E1 내지 E7 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인, 상기 4-1BB 결합 도메인, 및 상기 반감기 연장 모이어티 중 임의의 것 사이에 링커를 추가로 포함하는 재조합 단백질.
E9. E1 내지 E8 중 어느 하나에 있어서, N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 포함하는 재조합 단백질: (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인).
E10. E1 내지 E8 중 어느 하나에 있어서, N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 포함하는 재조합 단백질: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인).
E11. E4 또는 E8 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 재조합 단백질.
E12. E11에 있어서, 상기 면역글로불린 도메인이 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 면역글로불린의 Fc 도메인인 재조합 단백질.
E13. E12에 있어서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 면역글로불린의 Fc 도메인인 재조합 단백질.
E14. E13에 있어서, 상기 Fc 도메인은 이펙터 기능을 감소시키는 변형을 포함하는 재조합 단백질.
E15. E1 내지 E14 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP가 인간 FAP인 재조합 단백질.
E16. E1 내지 E15 중 어느 하나에 있어서, 상기 4-1BB가 인간 4-1BB인 재조합 단백질.
E17. E5 내지 E10 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민이 인간 혈청 알부민(HSA)인 재조합 단백질.
E18. E11 내지 E14 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인인 재조합 단백질.
E19. E1 내지 E18 중 어느 하나에 있어서, FAP에 대한 상기 재조합 단백질의 결합이 FAP의 프로테아제 활성을 25% 초과, 20% 초과, 15% 초과, 10% 초과, 또는 5% 초과만큼 감소시키지 않는 재조합 단백질.
E20. E1 내지 E19 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인이 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 SEQ ID NO: 2의 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 SEQ ID NO: 2의 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는 재조합 단백질.
E21. E1 내지 E20 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인이 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E22. E1 내지 E19 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E23. E1 내지 E20 및 E22 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인이 SEQ ID NO: 18-23 및 39-43 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E24. E1 내지 E20 및 E22 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인이 SEQ ID NO: 2, 18-22 및 43 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는 재조합 단백질.
E25. E1 내지 E20 및 E22 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인이 SEQ ID NO: 23 및 39-42 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 L는 A로 치환되고/되거나 마지막 위치의 N는 A로 치환되는 재조합 단백질.
E26. E1 내지 E20 및 E22 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인이 SEQ ID NO: 39와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 L는 A로 치환되고/되거나 마지막 위치의 N는 A로 치환되는 재조합 단백질.
E27. E1 내지 E20 및 E22 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP-결합 도메인이 SEQ ID NO: 43과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는 재조합 단백질.
E28. E1 내지 E27 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인은 (i) SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하는 재조합 단백질.
E29. E1 내지 E27 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하는 재조합 단백질.
E30. E1 내지 E29 중 어느 하나에 있어서, 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 SEQ ID NO: 3의 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 SEQ ID NO: 3의 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는 재조합 단백질.
E31. E1 내지 E30 중 어느 하나에 있어서, 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E32. E1 내지 E29 중 어느 하나에 있어서, 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 24-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E33. E1 내지 E30 및 E32 중 어느 하나에 있어서, 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 4-1BB 결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 24-29 및 51-55 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E34. E1 내지 E30 및 E32 중 어느 하나에 있어서, 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 24-28 및 54 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는 재조합 단백질.
E35. E1 내지 E30 및 E32 중 어느 하나에 있어서, 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 54과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는 재조합 단백질.
E36. E1 내지 E30 및 E32 중 어느 하나에 있어서, 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 29, 51-53 및 55 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/되거나 마지막 위치의 N은 A로 치환되는 재조합 단백질.
E37. E1 내지 E36 중 어느 하나에 있어서, 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 (i) SEQ ID NO: 3, 18-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하는 재조합 단백질.
E38. E1 내지 E37 중 어느 하나에 있어서, 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 18-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하는 재조합 단백질.
E39. E1 내지 E38 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 재조합 단백질:
(a) 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음; 및
(b) 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 24-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음.
E40. E1 내지 E35 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 재조합 단백질:
(a) 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음; 및
(b) 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 24-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음.
E41. E1 내지 E34 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 재조합 단백질:
(a) 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음; 및
(b) 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 24-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음.
E42. E1 내지 E34 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 재조합 단백질:
(a) 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음; 및
(b) 상기 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 24-29 및 51-55 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있음.
E43. E5 내지 E10, E15 내지 E17 및 E19 내지 E42 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인 또는 상기 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는 재조합 단백질.
E44. E5 내지 E10, E15 내지 E17 및 E19 내지 E43 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인 또는 상기 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E45. E5 내지 E10, E15 내지 E17 및 E19 내지 E42 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인 또는 상기 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 30-31 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 SEQ ID NO: 30-31 중 어느 하나의 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 SEQ ID NO: 30-31 중 어느 하나의 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는 재조합 단백질.
E46. E5 내지 E10, E15 내지 E17, E19 내지 E42 및 E45 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인 또는 상기 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 30-31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E47. E5 내지 E10, E15 내지 E17 및 E19 내지 E46 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인 또는 상기 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 (i) SEQ ID NO: 1 및 30-31 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하는 재조합 단백질.
E48. E5 내지 E10, E15 내지 E17 및 E19 내지 E47 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 도메인 또는 상기 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 1 및 30-31 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하는 재조합 단백질.
E49. E7 내지 E10, E15 내지 E17 및 E19 내지 E48 중 어느 하나에 있어서, N-말단 혈청 알부민 도메인(또는 혈청 알부민 도메인 1)은 SEQ ID NO: 5와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되는 재조합 단백질.
E50. E8 내지 E49 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E51. SEQ ID NO: 6과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 단백질은 FAP 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 재조합 단백질.
E52. E51에 있어서, 상기 FAP가 인간 FAP인 재조합 단백질.
E53. E51 및 E52에 있어서, 상기 4-1BB가 인간 4-1BB인 재조합 단백질.
E54. E1 내지 E53 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합하는 재조합 단백질.
E55. E1 내지 E54 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 약 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는 재조합 단백질.
E56. E1 내지 E54 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 약 1 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는 재조합 단백질.
E57. E1 내지 E56 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD 값으로 4-1BB에 결합하는 재조합 단백질.
E58. E1 내지 E57 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 4-1BB에 결합하는 재조합 단백질.
E59. E1 내지 E57 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 1 nM 이하의 KD 값으로 인간 4-1BB에 결합하는 재조합 단백질.
E60. E1 내지 E57 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 50 pM 이하의 KD 값으로 인간 4-1BB에 결합하는 재조합 단백질.
E61. E54 내지 E60 중 어느 하나에 있어서, 상기 KD가 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 PBS에서 측정되는 재조합 단백질.
E62. E61에 있어서, 상기 KD가 Biacore T200 기기를 사용하여 측정되는 재조합 단백질.
E63. E54 내지 E60 중 어느 하나에 있어서, 상기 KD가 생물층 간섭계(BLI)에 의해 측정되는 재조합 단백질.
E64. E63에 있어서, 상기 KD가 ForteBio Octet 기기를 사용하여 측정되는 재조합 단백질.
E65. E1 내지 E64 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질은 시험관내 IFNγ 방출 분석에 의한 평가 시 약 100 nM 이하, 약 75 nM 이하, 약 65 nM 이하, 약 55 nM 이하, 약 45 nM 이하, 약 35 nM 이하, 약 25 nM 이하, 약 15 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 4 nM 이하, 약 3 nM 이하, 약 2 nM 이하, 약 0.01 nM 내지 약 50 nM, 약 0.01 nM 내지 약 25 nM, 약 0.01 nM 내지 약 10 nM, 약 0.01 nM 내지 약 5 nM, 약 0.05 nM 내지 약 50 nM, 약 0.05 nM 내지 약 25 nM, 약 0.05 nM 내지 약 10 nM, 약 0.05 nM 내지 약 5 nM, 약 0.1 nM 내지 약 50 nM, 약 0.1 nM 내지 약 25 nM, 약 0.1 nM 내지 약 10 nM, 약 0.1 nM 내지 약 5 nM, 약 0.4 nM 내지 약 2 nM의 반 최대 유효 농도(EC50)를 갖는 재조합 단백질.
E66. E1 내지 E65 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질은 약 10 nM 이하의 EC50을 갖는 재조합 단백질.
E67. E1 내지 E66 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질은 약 0.1 nM 내지 약 10 nM의 EC50을 갖는 재조합 단백질.
E68. E65 내지 E67 중 어느 하나에 있어서, 상기 IFNγ 방출 분석은 인간 T 세포 IFNγ 방출 분석인 재조합 단백질.
E69. E68에 있어서, 상기 T 세포가 CD8+ T 세포인 재조합 단백질.
E70. E65 내지 E69 중 어느 하나에 있어서, 상기 IFNγ 방출 분석이 인간 IFN-감마 DuoSet ELISA(R&D 시스템)를 사용하여 측정되는 재조합 단백질.
E71. SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E72. E1 내지 E71 중 어느 하나의 재조합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
E73. SEQ ID NO: 17의 핵산 서열을 포함하는 E72의 단리된 핵산 분자.
E74. SEQ ID NO:17의 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E75. SEQ ID NO: 17의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E76. 고도로 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO: 17의 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
E77. E72 내지 E76 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
E78. E72 내지 E76 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
E79. E77의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
E80. E78 또는 E79에 있어서, 상기 세포가 박테리아 세포인 숙주 세포.
E81. E78 또는 E79에 있어서, 상기 숙주 세포가 대장균인 숙주 세포.
E82. E78 또는 E79에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포인 숙주 세포.
E83. E1 내지 E71 및 E74 내지 E76 중 어느 하나의 재조합 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 재조합 단백질이 발현되는 조건 하에 E78 내지 E82 중 어느 하나의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
E84. E83에 있어서, 상기 재조합 단백질을 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
E85. E1 내지 E71 및 E74 내지 E76 중 어느 하나의 재조합 단백질, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
E86. 치료적 유효량의 E1 내지 E71 및 E74 내지 E76 중 어느 하나의 재조합 단백질, 또는 E85의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법.
E87. E86에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
E88. E86 또는 E87에 있어서, 상기 암이 고형 종양을 포함하는 방법.
E89. E86 내지 E88 중 어느 하나에 있어서, 상기 암이 FAP를 발현하는 세포를 포함하는 방법.
E90. E86 내지 E89 중 어느 하나에 있어서, 암이 뇌암, 방광암, 유방암, 투명세포신암, 자궁경부암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 위암, 두경부 편평세포암, 입술암, 구강암, 간암, 폐 편평세포암, 흑색종, 중피종, 비소세포폐암(NSCLC), 비흑색종 피부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 육종, 소세포폐암(SCLC), 편평세포암 두경부(SCCHN), 삼중 음성 유방암 또는 갑상선암인 방법.
E91. E86 내지 E89 중 어느 하나에 있어서, 암이 부신피질 종양, 폐포 연부 육종, 암종, 연골육종, 결장직장 암종, 데스모이드 종양, 결합조직형성 소원형세포 종양, 내분비 종양, 내배엽 부비동 종양, 상피양 혈관내피종, 유잉 육종, 생식 세포 종양, 간모세포종, 간세포 암종, 흑색종, 신종, 신경모세포종, 비횡문근육종 연조직 육종(NRSTS), 골육종, 척수 주위 육종, 신세포 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 활액 육종 또는 윌름스 종양인 방법.
E92. E86 또는 E87에 있어서, 암이 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 또는 만성 골수성 백혈병(CML)인 방법.
E93. E86 또는 E87에 있어서, 암이 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 호지킨 림프종(HL), 외투 세포 림프종(MCL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL) 또는 소림프구성 림프종(SLL)인 방법.
E94. E86 내지 E93 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 약제학적 조성물이 정맥내 투여되는 방법.
E95. E86 내지 E93 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 약제학적 조성물이 피하 투여되는 방법.
E96. E86 내지 E95 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 약제학적 조성물이 약 1주에 2회, 1주에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 5주에 1회, 6주에 1회, 7주에 1회, 8주에 1회, 9주에 1회, 10주에 1회, 한 달에 2회, 한 달에 1회, 두 달에 1회, 세 달에 1회, 또는 네 달에 1회 투여되는 방법.
E96a. E86 내지 E95 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 약제학적 조성물이 약 0.5 mg/㎏ 내지 약 5 mg/㎏, 또는 약 0.015 mg/㎏ 내지 약 12 mg/㎏의 용량 범위로 투여되는 방법.
E96b. E86 내지 E95 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 약제학적 조성물이 약 2 mg/㎏의 용량으로 투여되는 방법.
E96c. E86 내지 E95 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 약제학적 조성물이 3주마다 투여되는 방법.
E97. 약제로서 사용하기 위한 E1 내지 E71 및 E74 내지 E76 중 어느 하나의 재조합 단백질, 또는 E85의 약제학적 조성물.
E98. 암 치료에 사용하기 위한, E1 내지 E71 및 E74 내지 E76 중 어느 하나의 재조합 단백질 또는 E85의 약제학적 조성물.
E99. 대상체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 E1 내지 E71 및 E74 내지 E76 중 어느 하나의 재조합 단백질, 또는 E85의 약제학적 조성물의 용도.
E100. 대상체에서 암을 치료하기 위한 E1 내지 E71 및 E74 내지 E76 중 어느 하나의 재조합 단백질, 또는 E85의 약제학적 조성물의 용도.
E101. 용기, E1 내지 E71 및 E74 내지 E76 중 어느 하나의 재조합 단백질, 또는 E85의 약제학적 조성물을 포함하는 용기 내의 조성물, 및 치료적 유효량의 재조합 단백질 또는 이를 필요로 하는 환자의 치료를 위한 약제학적 조성물을 투여하기 위한 지침을 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트.
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도 1은 본 개시내용의 재조합 다중특이적 단백질의 예시이다. 혈청 알부민 결합 안키린 반복 도메인은 FAP 결합 안키린 반복 도메인에 연결되고, 일련의 링커를 통해, 이는 4-1BB 결합 안키린 반복 도메인에 연결되고, 이는 또 다른 4-1BB 안키린 반복 도메인에 연결되고, 이는 혈청 알부민 결합 안키린 반복 도메인에 연결된다.
도 2는 하기 화학식을 갖는 본 개시내용의 다중특이적 재조합 단백질의 아미노산 서열이다: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인). (SEQ ID NO: 6). 혈청 알부민 결합 도메인의 서열은 밑줄로 표시되고, FAP-결합 도메인의 서열은 이탤릭체로 표시되고, 4-1BB 결합 도메인의 서열은 볼드체로 표시되고, 링커는 음영 처리로 표시된다.
도 3은 면역 반응을 유발하는 종양 세포에 근접한 T 세포 상의 4-1BB의 FAP/4-1BB 이중특이적 단백질-매개 클러스터링을 예시하는 개략도이다. 종양 항원 FAP(정상, 비악성 세포; 오른쪽의 "주변" 참조)가 없으면 FAP 결합 부족으로 인해 4-1BB의 최소 클러스터링이 발생하고, 면역 활성화가 제한될 것이다. 대조적으로, 암 관련 섬유아세포(왼쪽의 "종양")에서 FAP는 고도로 발현된다(실선 삼각형으로 표시); 따라서 FAP 결합을 통해 이중특이적 분자는 4-1BB 클러스터링 및 T 세포 공동 자극을 촉진한다.
도 4는 본원에 참조된 다양한 서열을 설명하는 차트이다.
도 5a 내지 도 5g는 6개의 4-1BB/FAP 이중특이적 단백질의 설계 및 선택된 기능 데이터를 설명한다(도 5a). 설계: 다양한 수의 4-1BB 특이적 안키린 반복 도메인과 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인의 유전적 융합. (도 5b 내지 도 5g) 시험관내 4-1BB 리포터 세포 분석. 인간 4-1BB 형질감염된 HT1080 세포에서 4-1BB 신호 전달 경로의 활성화는 FAP-발현 세포의 존재 하에 NF-κB-루시페라아제 리포터 분석에 의해 측정되었다. 발광 신호는 4-1BB 경로 활성화의 상대적 척도로 사용되었다.
도 6은 h4-1BB, hFAP 및 HSA에 대한 MpA의 동시 결합의 SPR 추적을 나타내는 그래프이다. 라인 (a) 고정된 h4-1BB에 대한 MpA 또는 PBST의 결합. 라인 (b) hFAP와 h4-1BB/MpA 복합체 또는 PBST 대조군 각각의 결합. 라인 (c) h41BB-MpA-hFAP 복합체, 또는 PBST 대조군 각각에 대한 HSA의 결합에 이어 1000초 해리 단계.
도 7은 시험관내에서 MpA가 1차 인간 T 세포에 의한 IFNγ 생산을 향상시킨다는 것을 입증하는 그래프이다. 플레이트 결합된 항-CD3 항체와 증가하는 농도의 MpA 및 플레이트-코팅된 인간 FAP에 결합된 대조군으로 자극된 정제된 CD8 T 세포에 의한 IFNγ 생산의 용량 의존적 향상은 ELISA에 의해 측정되었다. MpA 및 항-FAP-4-1BBL은 CD8 T 세포의 활성화를 유도하여 코팅된 FAP를 통해 플레이트에 결합될 때 용량 의존적 방식으로 IFNγ 분비를 증가시켰다. 비-FAP-표적화된 대조군 MpC는 T 세포에 의한 IFNγ 생산을 향상시키지 않았다.
도 8은 1 mg/㎏의 단일 정맥내 일시 투여 후 BALB/c 마우스에서 MpA의 그룹 평균 혈청 농도-시간 프로파일(평균 +/- max/min, 그룹당 N=3)을 보여주는 그래프이다.
도 9는 1 mg/㎏의 단일 정맥내 일시 투여 후 BALB/c 마우스에서 MpA의 평균 혈청 농도-시간 프로파일(평균 +/- max/min, 168시간 시점에서 N=6, 다른 모든 시점에서 N=3)을 보여주는 그래프이다.
도 10은 0.1 mg/㎏의 단일 정맥내 주입 후 사이노몰구스 원숭이에서 MpA의 혈청 농도-시간 프로파일(채워진 기호) 및 ADA 역가-시간 프로파일(열린 기호)을 보여주는 그래프이다. 첫 번째 농도 값 BLQ는 추적 과정을 나타내기 위해 0.2 nmol/L(LLOQ보다 5배 낮음)로 설정되었다. AMA-음성 샘플은 100(=MRD)의 역가로 블롯팅되어 추적 과정을 나타낸다. 투여 전 샘플에서 결정된 AMA 역가 값은 t=0h에서 블롯팅된다.
도 11은 1 mg/㎏의 단일 정맥내 주입 후 사이노몰구스 원숭이에서 MpA의 혈청 농도-시간 프로파일(채워진 기호) 및 ADA 역가-시간 프로파일(열린 기호)을 보여주는 그래프이다. 첫 번째 농도 값 BLQ는 추적 과정을 나타내기 위해 0.2 nmol/L(LLOQ보다 5배 낮음)로 설정되었다. ADA-음성 샘플은 100(=MRD)의 역가로 블롯팅되어 추적 과정을 나타낸다. 투여 전 샘플에서 결정된 ADA 역가 값은 t=0h에서 블롯팅된다.
도 12는 10 mg/㎏의 단일 정맥내 주입 후 사이노몰구스 원숭이에서 MpA의 혈청 농도-시간 프로파일(채워진 기호) 및 AMA 역가-시간 프로파일(열린 기호)을 보여주는 그래프이다. 첫 번째 농도 값 BLQ는 추적 과정을 나타내기 위해 0.2 nmol/L(LLOQ보다 5배 낮음)로 설정되었다. AMA-음성 샘플은 100(=MRD)의 역가로 블롯팅되어 추적 과정을 나타낸다. 투여 전 샘플에서 결정된 AMA 역가 값은 t=0h에서 블롯팅된다.
도 13은 0.1, 1 및 10 mg/㎏의 단일 정맥내 주입 후 사이노몰구스 원숭이에서 MpA의 혈청 농도-시간 프로파일을 보여주는 그래프이다. 첫 번째 값 BLQ는 추적 과정을 나타내기 위해 0.2 nmol/L(LLOQ보다 5배 낮음)로 설정되었다.
도 14는 0.1, 1 및 10 mg/㎏의 단일 정맥내 주입 후 사이노몰구스 원숭이에서 MpA의 용량-정규화된 혈청 농도-시간 프로파일을 보여주는 그래프이다. ADA의 영향을 받는 것으로 간주되는 값은 제외되었다.
도 15는 0.1, 1 및 10 mg/㎏의 단일 정맥내 주입 후 사이노몰구스 원숭이에서 MpA의 용량-정규화된 혈청-농도-시간 프로파일을 보여주는 그래프이다. ADA의 영향을 받는 것으로 간주되는 값은 제외되었다.
도 16a 및 도 16b. 인간 PBMC로 이식된 HT-29 이종이식 종양 보유 NOG 마우스에서의 종양 성장. 마우스를 항-h4-1BB mAb 20H4.9, 항-FAP-4-1BBL 융합 단백질 또는 MpB, MpA의 마우스 대리물로 처리했다. 도 16a는 MpB, 항-h4-1BB mAb 20H4.9, 항-FAP-4-1BBL 융합 단백질 또는 비히클 대조군을 투여 받은 마우스에서 평균 종양 부피를 보여주는 그래프이다. 도 16b는 시간(일)에 따른 개별 마우스의 종양 부피를 보여주는 그래프를 포함한다.
도 17. MpB가 유도되지 않은 항-h4-1BB mAb 20H4.9의 투여는 NOG 마우스에서 인간 PBMC에 의한 증가된 간 T 세포 침윤을 유도하였다.
도 18은 다양한 재조합 분자(표 19에 나타냄)의 존재 하에 평균 FAP 활성을 나타낸다. 재조합 인간 FAP(rhFAP)는 기질 Z-GLY-PRO-AMC를 460 nm에서 45분 후에 측정된 형광 생성물로 전환시켰다(100% 활성-1차 샘플로 정규화됨). 배경 활성(2차 및 3차 샘플)과 비교하여 분자 번호 1 및 3(MpA 및 "F"(MpA의 FAP 결합 도메인))은 FAP에 결합하지 않는 음성 대조군(음성 대조군 MpC 및 "N")과 유사하게 FAP 펩티다아제 활성에 대한 억제 효과를 나타내지 않았다. FAP 활성의 부분적 억제는 F†(대조군으로 사용된 대안적인 FAP 결합 안키린 반복 도메인) 또는 용량 의존적 억제를 나타내는 프로테아제 억제제 혼합물(PI)(1x, 3x, 5x 농축 PI 혼합물 사용)에서 관찰되었다. FAP 결합 항체에 대한 억제는 관찰되지 않았다. 평균 FAP 활동성(%)은 신호 정규화 후 4중항 측정에서 평균 및 표준 편차로 표시된다. 약어: H=알부민 결합 도메인; F=hFAP-결합 도메인; F†=대안적인 hFAP 결합 도메인 - FAP 활성 억제를 나타냄(대조군); B=h4-1BB 결합 도메인; N=비표적 결합 도메인(음성 대조군).
도 19a 및 도 19b는 상이한 결합 도메인 구성을 갖는 다양한 다중특이적 단백질의 기능 및 약동학적 비교를 요약한다. 도 19a는 시험관내 4-1BB 리포터 세포 분석의 결과를 보여준다. 인간 4-1BB 형질감염된 HT1080 세포에서 4-1BB 신호 전달 경로의 활성화는 FAP-발현 세포의 존재 하에 NF-κB-루시페라아제 리포터 분석에 의해 측정되었다. 발광 신호는 4-1BB 경로 활성화의 상대적 척도로 사용되었다. N-말단에서 C-말단으로 다양한 다중특이적 단백질의 결합 도메인 배열이 표시된다. 도 19b는 마우스에서 약동학 연구의 결과를 요약한 것이다. 이 그래프는 1 mg/㎏의 단일 정맥내 일시 투여 후 BALB/c 마우스의 평균 혈청 농도-시간 프로파일(평균 +/- max/min, 그룹당 N=3)을 보여준다. N-말단에서 C-말단으로 다양한 다중특이적 단백질의 결합 도메인 배열이 표시된다. H = HSA 결합 도메인, F = FAP 결합 도메인; B= 4-1BB 결합 도메인.
도 20은 인간에서 다양한 PD 마커 대 용량을 예측한다. 설정된 최소 PBPK 모델에서 파생된 노출 값(Cav)(문헌[Zhao, J., Y. Cao, and W.J. Jusko, Across-Species Scaling of Monoclonal Antibody Pharmacokinetics Using a Minimal PBPK Model. Pharm Res, 2015. 32(10): p. 3269-81] 기반)을 사용하여 마우스 종양 연구로부터 PD 효과를 번역하고(모두 최대 효과의 %로) 인간에서 용량-효과 관계를 예측했다. 예측 구간(음영 처리된 영역)은 인간에 대한 제거율을 조정하는 동안 설정된 하한 및 상한을 기반으로 한다. 참고: 예측된 전신 CD8 T 세포 활성화 및 확장은 인간화 PBMC 마우스 모델을 기반으로 했다. 건강한 NHP에서는 전신 T 세포 활성화가 관찰되지 않았다.
1. 개요
FAP 및 4-1BB에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 단백질이 본원에 개시된다. 또한, 결합 단백질을 코딩하는 핵산, 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물을 사용하는 방법이 개시된다. 한 양태에서, 본 개시내용의 물질 및 방법은 종양-연관 기질에서 FAP의 발현을 이용하여, 예를 들어 종양에서 림프구의 특이적 표적화 및 이러한 림프구에서 4-1BB의 선택적 활성화를 허용한다.
4-1BB 작용제 항체는 단일 요법 및 병용 요법 종양 모델 모두에서 예방 및 치료 환경에서 효능을 입증했으며 지속적인 항종양 보호 T 세포 기억 반응을 확립했다. 그러나, 4-1BB 작용제 항체의 임상 개발은 용량 제한 간독성으로 인해 방해를 받았다. 예를 들어, Urelumab(BMS-663513)의 I기 및 II기 데이터(미국 특허출원공개 2017/0247455 A1호)는 표적 및 용량 의존적으로 보이는 간 독성을 드러내어 Urelumab의 임상 개발을 중단했다.
본원에 기재된 다중특이적 재조합 단백질은 4-1BB의 암 표적-매개 클러스터링을 촉진함으로써, 이전 요법과 관련된 문제를 해결한다(예를 들어, 도 3 참조). 4-1BB는 리간드(4-1BBL)에 결합할 때 삼량체화를 겪으며; 4-1BB 다량체화 및 클러스터링은 신호 전달 경로의 활성화를 위한 전제 조건이다. 본원에 개시된 다중특이적 재조합 단백질은 이러한 클러스터링 효과를 이용하며; 4-1BB의 활성화는 종양 항원 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)의 발현과 관련이 있다.
섬유아세포 활성화 단백질 ®(FAP, Seprase라고도 함)은 암 관련 섬유아세포에 의해 많은 고형 종양의 기질에서 풍부하게 발현되는 II형 막 결합 당단백질이다. FAP는 폐, 결장직장, 방광, 난소 및 유방 암종을 포함한 상피 악성 종양(원발성 및 전이성)의 90% 이상의 반응성 기질 섬유모세포 및 뼈 및 연조직 육종의 악성 중간엽 세포에서 선택적으로 발현되지만, 일반적으로 정상적인 성인 조직에는 없다(문헌[Brennen et al., Mol Cancer Ther. 11: 257-266 (2012)]; 문헌[Garin-Chesa et al., Proc Natl Acad Sci USA 87, 7235-7239 (1990)]; 문헌[Rettig et al., Cancer Res. 53:3327-3335 (1993)]; 문헌[Rettig et al., Proc Natl Acad Sci USA 85, 3110-3 114 (1988)]). FAP는 특정 악성 종양 세포에서도 발현된다.
특정 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 도 3은 다중특이적 분자의 장점의 예를 예시한다. 종양 항원 FAP(정상, 비악성 세포)가 없는 경우 4-1BB의 최소 클러스터링이 발생하고 면역 활성화가 제한된다. 대조적으로, 암 관련 섬유아세포에서는 FAP가 고도로 발현되며; 따라서, FAP 결합을 통해 다중특이적 분자는 4-1BB 클러스터링 및 T 세포 공동 자극을 촉진한다. 이 전략의 장점은 두 가지이다: 활성화가 FAP를 발현하는 조직에 주로 국한될 것이기 때문에 전신 독성이 제한되어야 하고, 종양 매개 4-1BB 클러스터링이 강력한 작용을 유도해야 한다.
2. 정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 명명법이다.
"포함하는", "갖는", "비롯한" 및 "함유하는"이라는 용어는 달리 명시되지 않는 한 개방형 용어로 해석되어야 한다. 본 발명의 양태가 특징을 "포함하는" 것으로 기술되는 경우, 실시예는 또한 특징으로 "이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지는" 것으로 고려된다. 본원에 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 본 개시를 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구되지 않는 한 본 개시의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 본 개시의 실행에 필수적인 것으로 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다. 작업예에서 또는 달리 표시된 경우를 제외하고, 본 명세서에서 사용된 성분의 양 또는 반응 조건을 나타내는 모든 숫자는 해당 용어가 관련 기술 분야의 숙련자에 의해 해석될 것이기 때문에 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 값의 범위를 언급하는 것은 본원에 달리 표시되지 않는 한 범위 및 각 끝점에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 참조하는 속기 방법으로서 역할을 하기 위한 것이며, 각각의 개별 값과 끝점은 마치 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다.
"안키린 반복 도메인"은 원래 자연 발생 안키린 반복 단백질의 반복 단위로부터 유래된 적어도 하나의 안키린 반복 모티프를 포함하는 도메인을 지칭한다. 일반적으로 안키린 반복 모티프는 루프로 분리된 2개의 알파 헬릭스를 형성하는 약 33개의 잔기를 포함한다. 안키린 반복 단백질은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2002/020565호, 국제공개 WO 2010/060748호, 국제공개 WO 2011/135067호, 국제공개 WO 2012/069654호, 국제공개 WO 2012/069655호, 국제공개 WO 2014/001442호, 국제공개 WO 2014/191574호, 국제공개 WO 2014/083208호, 국제공개 WO 2016/156596호, 및 국제공개 WO 2018/054971호 참조(이들 모두는 그 전체가 참고로 포함됨). 안키린 반복 도메인은 임의로 적절한 캡핑 모듈을 추가로 포함한다.
안키린 반복 도메인은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 임의로 반감기 연장 도메인과 함께 본 개시내용에 따라 더 큰 안키린 반복 단백질로 모듈식으로 조립될 수 있다(예를 들어, 문헌[Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2-6, 2003], 국제공개 WO2012/069655호, 국제공개 WO 2002/020565호 참조).
안키린 반복 도메인은 그것이 대안적인 표적(예를 들어, 세포 또는 물질)보다 특정 표적(예를 들어, 세포 또는 물질)과 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 지속 시간으로 그리고/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 결합하는 경우 표적에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, FAP에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인은 다른 비-FAP 단백질에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력, 더 쉽게 그리고/또는 더 긴 지속 시간으로 FAP에 결합하는 안키린 반복 도메인이다. 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 안키린 반복 도메인은 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다는 것이 이 정의를 읽음으로써 또한 이해된다. 따라서 "특이적 결합"은 배타적 결합을 포함할 수 있지만 반드시 필요한 것은 아니다. 일반적으로, 지정된 분석 조건에서, 안키린 반복 도메인은 특정 표적 분자에 우선적으로 결합하고 시험 샘플에 존재하는 다른 성분에는 유의한 양으로 결합하지 않는다.
다양한 분석 형식을 사용하여 관심 분자에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 선택하거나 특성화할 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역분석, 면역침전, BIAcore™(GE Healthcare, Piscataway, NJ), 형광 활성화 세포 분류(FACS), Octet??(ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) 및 웨스턴 블롯 분석이 표적과 특이적으로 반응하는 안키린 반복 도메인을 식별하기 위해 사용될 수 있는 많은 분석 중 하나이다. 일반적으로, 특정 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 노이즈의 적어도 2배, 더 일반적으로 배경의 10배 이상이다. 훨씬 더 구체적으로, 안키린 반복 도메인은 평형 해리 상수(KD) 값이 < 1 μΜ, 예컨대 < 100 nM, < 10 nM, < 100 pM, < 10 pM, 또는 < 1 pM일 때 표적에 "특이적으로 결합"하는 것으로 언급된다.
KD 값은 종종 결합 친화도로도 지칭된다. 결합 친화도는 하나의 결합 파트너(예를 들어, 본원에 개시된 FAP 또는 4-1BB 결합 도메인)의 접촉 잔기와 그의 결합 파트너(예를 들어, FAP 또는 4-1BB)의 접촉 잔기 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 측정한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, 결합 친화도는 결합 쌍의 구성원 또는 결합 파트너 간의 1:1 상호작용을 반영하는 결합 친화도를 지칭한다. 하나의 결합 파트너에 대해 2개의 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질의 경우, 결합 친화도는 결합 단백질과 결합 파트너 간의 1:2 상호작용을 반영하는 결합 친화도를 의미할 수 있다.
결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 예시된 바와 같이, 결합 친화도는 특정 안키린 반복 도메인 및 그의 결합 표적의 해리 속도를 나타내는 KD 값으로 표현될 수 있다. KD는 결합 속도 또는 "온 속도(Kon)"에 대한 "오프 속도(Koff)"라고도 하는 해리 속도의 비이다. 따라서, KD는 Koff/Kon과 같으며 몰 농도(M)로 표시되며, KD가 작을수록 결합 친화도는 강하다.
KD 값은 임의의 적절한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. KD를 측정하는 한 가지 예시적인 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다(예를 들어, 문헌[Nguyen et al. Sensors (Basel). 2015 May 5; 15(5):10481-510] 참조). KD 값은 BIACORE® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하여 SPR에 의해 측정될 수 있다. BIAcore 동역학 분석은 표면에 고정된 분자(예를 들어, 에피토프 결합 도메인을 포함하는 분자)가 있는 칩으로부터 항원의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다. 단백질의 KD를 결정하는 또 다른 방법은 Bio-Layer Interferometry를 사용하는 것이다(예를 들어, 문헌[Shah et al. J Vis Exp. 2014; (84): 51383] 참조). KD 값은 OCTET® 기술(Octet QKe 시스템, ForteBio)을 사용하여 측정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, Sapidyne Instruments(Boise, Id.)로부터 입수가능한 KinExA®(Kinetic Exclusion Assay) 분석이 또한 사용될 수 있다. 2개의 결합 파트너 사이의 결합 친화도를 평가하기에 적합한 임의의 방법이 본원에 포함된다.
용어 "치료하다" 및 이와 관련된 단어가 반드시 100% 또는 완전한 치료를 의미하는 것은 아니다. 오히려, 당업자가 잠재적인 이점 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인식하는 다양한 정도의 치료가 존재한다. 이와 관련하여, 본 개시내용의 암을 치료하는 방법은 임의의 양 또는 임의의 수준의 치료를 제공할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 치료는 하나 이상의 병태 또는 증상의 치료(즉, 완화)를 포함할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법에 의해 제공되는 치료는 암의 진행을 늦추는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 T 세포 활성 또는 암에 대한 면역 반응의 향상, 종양 또는 암의 성장 또는 새로운 병변의 출현 감소, 종양 세포의 전이 감소, 종양 또는 암세포의 세포 사멸 증가, 종양 또는 암 세포 생존의 억제 등에 의해 암을 치료할 수 있다. 예시적인 양태에서, 방법은 암의 발병 또는 재발을 1일, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 15일, 30일, 2개월, 4개월, 6개월, 1년, 2년, 4년 또는 그 이상 지연시키는 방식으로 치료한다. 예시적인 양태에서, 방법은 대상체의 생존을 증가시키는 방식으로 치료한다. "치료"라는 용어에는 예방적 치료도 포함된다.
임의의 주어진 질병 또는 상태에서의 치료 반응은 그 질병 또는 상태에 특정한 표준화된 반응 기준에 의해 결정될 수 있다. 종양 반응은 자기공명영상(MRI) 스캔, x-방사선 영상, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔, 양전자 방출 단층촬영(PET) 스캔, 뼈 스캔, 초음파, 종양 생검 샘플링, 순환계 내 종양 세포 계수, 및/또는 종양 항원(예를 들어, 전립선 특이적 항원(PSA) 및/또는 알파펠토단백질(AFP))의 측정과 같은 스크리닝 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 이러한 치료적 반응에 더하여, 치료를 받는 대상체는 질병과 관련된 증상의 개선이라는 유익한 효과를 경험할 수 있다.
3. FAP 및 4-1BB를 표적으로 하는 다중특이적 분자
FAP 및 4-1BB를 표적으로 하는 다중특이적 분자가 본원에 개시되어 있다. 분자는 예를 들어 암 치료에 유용하다. 분자는 재조합 단백질을 포함할 수 있다.
3.1. 안키린 반복 도메인 및 안키린 반복 단백질
본원에 기재된 안키린 반복 도메인은 일반적으로 적어도 하나의 안키린 반복 모티프를 포함한다. 안키린 반복 모티프는 2개의 역평행 α-헬릭스에 이어 베타-팽대부 및 그 각각이 약 33개의 잔기를 갖는 다음 반복부에 연결하는 루프를 함유하는 베타-헤어핀으로 구성된다.
천연 안키린 반복 단백질에서, 반복은 여러 개에서 최대 24개의 반복으로 직렬로 발생한다(예를 들어, 문헌[Sedgwick 및 Smerdon TIBS(1999) 24 311-316] 참조). 루프를 포함하는 확장된 베타 헤어핀 또는 "핑거"는 표면에 홈을 형성한다. 안키린 모티프를 포함하는 3500개 이상의 서열이 SMART 도메인 데이터베이스에 나열되어 있다(문헌[Shultz et al. PNAS(1998) 95 5857-5864]).
설계된 안키린 반복 모티프를 포함하는 재조합 단백질, 또는 이의 결합 도메인은 또한 본원에서 DARPin® 단백질로 지칭된다. 문헌[Stumpp et al., Curr Opin Drug Discov Devel. 10(2): 153-9 (2007)]; 및 문헌[Binz et al., Nature Biotech. 22(5): 575-582 (2004)] 참조. DARPin® 단백질은 표적 단백질에 대한 높은 특이성과 높은 결합 친화도를 갖는 항체 모방체로 간주될 수 있다. 일반적으로, DARPin® 단백질은 적어도 하나의 안키린 반복 모티프, 예를 들어, 적어도 2개, 3개 이상의 안키린 반복 모티프를 포함한다.
본원에 기재된 안키린 반복 도메인은 일반적으로 구조를 제공하는 코어 스캐폴드, 및 표적에 결합하는 표적 결합 잔기를 포함한다. 구조적 코어는 보존된 아미노산 잔기를 포함하고, 표적 결합 표면은 표적에 따라 상이한 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어, 안키린 반복 모티프는 다음 서열을 포함할 수 있다: DxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNAx(SEQ ID NO: 11), 여기서 "x" 는 임의의 아미노산을 나타낸다.
국제공개 WO 2002/020565호에는 표적에 특이적으로 결합하는 단백질의 선택/스크리닝에 사용될 수 있는 안키린 반복 단백질 라이브러리가 기재되어 있다. 이러한 라이브러리를 만드는 방법도 제공된다.
다중 안키린 반복 도메인은 (공유 결합 또는 비공유 결합을 통해) 연결되어 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 형성할 수 있다. 이러한 분자가 도 1에 도시되어 있으며, 여기서 1개의 FAP-결합 도메인과 2개의 4-1BB 결합 도메인이 연결되어 다중특이적 분자를 형성한다. 분자는 또한 2개의 반감기 연장 모이어티를 포함하는데, 하나는 N-말단에 있고 다른 하나는 C-말단에 있다.
3.2. FAP-결합 도메인
하나의 매력적인 기질 세포 표적은 사실상 모든 상피암의 암 관련 기질 세포에서 고도로 발현되는 막횡단 세린 프로테아제인 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다. FAP는 또한 배아 발달 동안, 상처 치유 조직, 간경변 및 특발성 폐 섬유증과 같은 만성 염증 및 섬유증 상태에서 발현된다. 그러나, FAP는 양성 종양이나 대부분의 정상 정지 성인 기질 세포에서 면역조직화학에 의해 검출되지 않았다.
본원에 기재된 재조합 단백질은 본원에서 "FAP 결합 도메인"으로도 지칭되는 FAP에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 2의 서열에 대해 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 2의 서열에 대해 5개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 2의 서열에 대해 4개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 2의 서열에 대해 3개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 2의 서열에 대해 2개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 2의 서열에 대해 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치환(들)은 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 단백질 의 KD 값과 비교하여 1000배 초과, 100배 초과, 또는 10배 초과로 KD 값을 변경하지 않는다. 특정 실시형태에서, 치환은 표 1에 따른 보존적 치환이다. 특정 실시형태에서, 치환은 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 외부에서 예를 들어 알파 헬릭스를 연결하는 베타 루프에서 이루어진다. 특정 실시형태에서, 치환은 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 내에서 이루어진다. 예를 들어, 안키린 도메인은 하기 컨센서스 서열을 포함할 수 있다: DxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNAx (SEQ ID NO: 11)(여기서, "x"는 임의의 아미노산(바람직하게는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아님)을 나타냄); 또는 DxxGxTPLHLAAxxGHLEIVEVLLKzGADVNAx (SEQ ID NO: 12)(여기서, "x"는 임의의 아미노산(바람직하게는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아님)을 나타내고, "z"는 아스파라긴, 히스티딘, 또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택됨). 한 실시형태에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기에서 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기 외부에서 이루어진다.
또한, 마지막에서 두 번째 위치는 "A"(예를 들어, SEQ ID NO: 2, 18-22 및 43 참조) 또는 "L"(예를 들어, SEQ ID NO: 23 및 39-42 참조)일 수 있고/있거나, 마지막 위치는 "A"(예를 들어, SEQ ID NO: 2, 18-22 및 43 참조) 또는 "N"(예를 들어, SEQ ID NO: 23 및 39-42 참조)일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-22 및 43 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-22 및 43 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 일부 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 23 및 39-42 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/되거나 마지막 위치의 N은 A로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 23 및 39-42 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/되거나 마지막 위치의 N은 A로 치환된다. 서열은 임의로 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 포함할 수 있다(아래 참조).
또한, FAP 결합 도메인은 임의로 그 N-말단에 "G", "S" 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 34 비교). 따라서, 일부 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 (i) SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 재조합 단백질과 그의 표적(FAP) 사이의 친화도는 KD로 기술된다. 예시적인 실시형태에서, KD는 약 10-1 M 이하, 약 10-2 M 이하, 약 10-3 M 이하, 약 10-4 M 이하, 약 10-5 M 이하, 약 10-6 M 이하, 약 10-7 M 이하, 약 10-8 M 이하, 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 약 10-11 M 이하, 약 10-12 M 이하, 약 10-13 M 이하, 약 10-14 M 이하, 약 10-5 M 내지 약 10-15 M, 약 10-6 M 내지 약 10-15 M, 약 10-7 M 내지 약 10-15 M, 약 10-8 M 내지 약 10-15 M, 약 10-9 M 내지 약 10-15 M, 약 10-10 M 내지 약 10-15 M, 약 10-5 M 내지 약 10-14 M, 약 10-6 M 내지 약 10-14 M, 약 10-7 M 내지 약 10-14 M, 약 10-8 M 내지 약 10-14 M, 약 10-9 M 내지 약 10-14 M, 약 10-10 M 내지 약 10-14 M, 약 10-5 M 내지 약 10-13 M, 약 10-6 M 내지 약 10-13 M, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-8 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-13 M이다.
예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 10 nM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 1 nM 이하의 KD 값으로 FAP에 결합한다.
특정 실시형태에서, FAP는 인간 FAP(SEQ ID NO: 14)이다.
[표 1]
Figure pct00001
3.3. 4-1BB 결합 도메인
본 명세서에 개시된 재조합 단백질은 또한 4-1BB에 의해 유도된 T-세포 자극 활성을 이용한다. 이전 연구에서는 일부 4-1BB 작용제 단일클론 항체(mAb)가 공동자극 분자 발현을 증가시키고 세포용해성 T 림프구 반응을 현저하게 향상시켜 다양한 모델에서 항종양 효능을 나타내는 것으로 나타났다. 4-1BB 단일요법 및 조합 요법 종양 모델은 지속적인 항종양 보호 T 세포 기억 반응을 확립하였다(문헌[Lynch, 2008, Immunol Rev. 22: 277-286]).
본원에 기재된 재조합 단백질은 본원에서 "4-1BB 결합 도메인"으로도 지칭되는 4-1BB에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 포함한다. 4-1BB 작용제 항체와 마찬가지로 4-1BB 결합 도메인은 4-1BB 신호 전달 경로를 활성화한다. 본원에 기재된 재조합 단백질은 또한 1개 초과의 4-1BB 결합 도메인, 예를 들어 2개 또는 3개 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 제1 및 제2 4-1BB 결합 도메인, 또는 제1, 제2 및 제3 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 하기에 제공된 실시형태는 이러한 제1 4-1BB 결합 도메인, 제2 4-1BB 결합 도메인, 및/또는 제3 4-1BB 결합 도메인을 기술한다.
일부 실시형태에서, 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 24-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 4-1BB 결합 도메인 또는 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 24-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열, 또는 그 안에 하나 이상의 치환을 포함하는 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3의 서열에 대해 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3의 서열에 대해 5개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3의 서열에 대해 4개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3의 서열에 대해 3개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3의 서열에 대해 2개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3의 서열에 대해 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치환(들)은 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 단백질 의 KD 값과 비교하여 1000배 초과, 100배 초과, 또는 10배 초과로 KD 값을 변경하지 않는다. 특정 실시형태에서, 치환은 표 1에 따른 보존적 치환이다. 특정 실시형태에서, 치환은 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 외부에서 예를 들어 알파 헬릭스를 연결하는 베타 루프에서 이루어진다. 특정 실시형태에서, 치환은 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 내에서 이루어진다. 예를 들어, 안키린 도메인은 하기 컨센서스 서열을 포함할 수 있다: DxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNAx (SEQ ID NO: 11)(여기서, "x"는 임의의 아미노산(바람직하게는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아님)을 나타냄); 또는 DxxGxTPLHLAAxxGHLEIVEVLLKzGADVNAx (SEQ ID NO: 12)(여기서, "x"는 임의의 아미노산(바람직하게는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아님)을 나타내고, "z"는 아스파라긴, 히스티딘, 또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택됨). 한 실시형태에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기에서 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기 외부에서 이루어진다.
또한, 마지막에서 두 번째 위치는 "A"(예를 들어, SEQ ID NO: 3, 24-28 및 54 참조) 또는 "L"(예를 들어, SEQ ID NO: 29, 51-53, 및 55 참조)일 수 있고/있거나, 마지막 위치는 "A"(예를 들어, SEQ ID NO: 3, 24-28 및 54 참조) 또는 "N"(예를 들어, SEQ ID NO: 29, 51-53, 및 55 참조)일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3, 24-28 및 54 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3, 24-28 및 54 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 일부 실시형태에서, 4-1BB-결합 도메인은 SEQ ID NO: 29, 51-53, 및 55 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/되거나 마지막 위치의 N은 A로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 29, 51-53, 및 55 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 L은 A로 치환되고/되거나 마지막 위치의 N은 A로 치환된다. 서열은 임의로 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 포함할 수 있다(아래 참조).
또한, 4-1BB 결합 도메인은 임의로 그 N-말단에 "G", "S" 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 35 비교). 따라서, 일부 실시형태에서, 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3, 24-29, 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3, 24-29, 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 재조합 단백질과 그의 표적(4-1BB) 사이의 친화도는 KD로 기술된다. 예시적인 실시형태에서, KD는 약 10-1 M 이하, 약 10-2 M 이하, 약 10-3 M 이하, 약 10-4 M 이하, 약 10-5 M 이하, 약 10-6 M 이하, 약 10-7 M 이하, 약 10-8 M 이하, 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 약 10-11 M 이하, 약 10-12 M 이하, 약 10-13 M 이하, 약 10-14 M 이하, 약 10-5 M 내지 약 10-15 M, 약 10-6 M 내지 약 10-15 M, 약 10-7 M 내지 약 10-15 M, 약 10-8 M 내지 약 10-15 M, 약 10-9 M 내지 약 10-15 M, 약 10-10 M 내지 약 10-15 M, 약 10-5 M 내지 약 10-14 M, 약 10-6 M 내지 약 10-14 M, 약 10-7 M 내지 약 10-14 M, 약 10-8 M 내지 약 10-14 M, 약 10-9 M 내지 약 10-14 M, 약 10-10 M 내지 약 10-14 M, 약 10-5 M 내지 약 10-13 M, 약 10-6 M 내지 약 10-13 M, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-8 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-13 M이다.
예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 250 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 25 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD 값으로 4-1BB에 결합한다. 일부 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 10 nM 이하의 KD 값으로 4-1BB에 결합한다. 일부 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 1 nM 이하의 KD 값으로 4-1BB에 결합한다. 일부 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 50 pM 이하의 KD 값으로 4-1BB에 결합한다.
일부 실시형태에서, 4-1BB 클러스터링 및 T-세포 공동-자극을 추가로 촉진하기 위해 2개 이상의 4-1BB 결합 도메인이 바람직하다. T 세포 상의 4-1BB에 결합하는 4-1BB 리간드는 4-1BB 단량체의 삼량체화를 야기하는 것으로 보고되었다. 그러나, 삼량체화만으로는 4-1BB 수용체를 활성화하기에 충분하지 않다. 더 높은 정도의 클러스터링이 필요하다. 본원에 기재된 바와 같이, FAP-결합을 통해, 다중특이적 분자는 이미 종양 환경에서 4-1BB 클러스터링을 촉진한다. 4-1BB 클러스터링을 추가로 촉진하기 위해, 2개 이상의 4-1BB 결합 도메인을 사용하여 세포 표면에 "가교" 효과를 생성할 수 있다. 예를 들어, 도 5a 내지 도 5b에 도시된 바와 같이, 1가 4-1BB 바인더(F-B)는 4-1BB 경로를 활성화하기에 충분했다. 더 높은 효능은 2개의 4-1BB 결합 도메인(F-B-B) 또는 3개의 4-1BB 결합 도메인(F-B-B-B)을 사용하여 달성될 수 있었다. 도 5a 내지 도 5b는 또한 2개의 4-1BB 결합 도메인이 높은 효능으로 4-1BB 경로를 활성화하기에 충분하고 효율적인 4-1BB 클러스터링을 위해 3개의 4-1BB 결합 도메인을 가질 필요가 없다는 것을 보여준다.
특정 실시형태에서, 4-1BB는 인간 4-1BB(SEQ ID NO: 13)이다.
3.4. 반감기 연장 모이어티
"반감기 연장 모이어티"는 반감기 연장 모이어티가 없는 동일한 단백질과 비교하여 본원에 기재된 재조합 단백질의 생체내 혈청 반감기를 연장시킨다. 반감기 연장 모이어티의 예에는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 도메인, 말토스 결합 단백질(MBP), 인간 혈청 알부민(HSA) 결합 도메인, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 다중특이적 단백질은 본원에서 "혈청 알부민 결합 도메인"으로도 지칭되는 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 재조합 단백질은 또한 1개 초과의 혈청 알부민 결합 도메인, 예를 들어 2개 또는 3개 이상의 혈청 알부민 결합 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 제1 및 제2 혈청 알부민 결합 도메인, 또는 제1, 제2 및 제3 혈청 알부민 결합 도메인을 포함할 수 있다. 하기에 제공된 실시형태는 이러한 제1 혈청 알부민 결합 도메인, 제2 혈청 알부민 결합 도메인, 및/또는 제3 혈청 알부민 결합 도메인을 기술한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 반감기 연장 모이어티는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 혈청 알부민 결합 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본원에 기재된 반감기 연장 모이어티는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 반감기 연장 모이어티는 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본원에 기재된 반감기 연장 모이어티는 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열, 또는 그 안에 하나 이상의 치환을 포함하는 반감기 연장 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5의 서열에 대해 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5의 서열에 대해 5개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5의 서열에 대해 4개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5의 서열에 대해 3개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5의 서열에 대해 2개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5의 서열에 대해 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치환(들)은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5의 서열을 포함하는 단백질 의 KD 값과 비교하여 1000배 초과, 100배 초과, 또는 10배 초과로 KD 값을 변경하지 않는다. 특정 실시형태에서, 치환은 표 1에 따른 보존적 치환이다. 특정 실시형태에서, 치환은 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 외부에서 예를 들어 알파 헬릭스를 연결하는 베타 루프에서 이루어진다. 특정 실시형태에서, 치환은 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 내에서 이루어진다. 예를 들어, 안키린 도메인은 하기 컨센서스 서열을 포함할 수 있다: DxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNAx (SEQ ID NO: 11)(여기서, "x"는 임의의 아미노산(바람직하게는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아님)을 나타냄); 또는 DxxGxTPLHLAAxxGHLEIVEVLLKzGADVNAx (SEQ ID NO: 12)(여기서, "x"는 임의의 아미노산(바람직하게는 시스테인, 글리신 또는 프롤린이 아님)을 나타내고, "z"는 아스파라긴, 히스티딘, 또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택됨). 한 실시형태에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기에서 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 치환은 "x"로 지정된 잔기 외부에서 이루어진다.
또한, 마지막에서 두 번째 위치는 "A" 또는 "L"일 수 있고/있거나 마지막 위치는 "A"(예를 들어, SEQ ID NO: 1, 5, 30 및 31 참조) 또는 "N"(예를 들어, SEQ ID NO: 36 참조)일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1, 5, 및 30-31 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 마지막 위치의 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1, 5, 30, 및 31 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 서열은 임의로 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 포함할 수 있다(하기 참조).
또한, 혈청 알부민 결합 도메인은 임의로 그 N-말단에 "G", "S" 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 5 비교). 따라서, 일부 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1, 30 및 31 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1, 30, 및 31 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 또한, 일부 실시형태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 36과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 재조합 단백질과 그의 표적(혈청 알부민) 사이의 친화도는 KD로 기술된다. 예시적인 실시형태에서, KD는 약 10-1 M 이하, 약 10-2 M 이하, 약 10-3 M 이하, 약 10-4 M 이하, 약 10-5 M 이하, 약 10-6 M 이하, 약 10-7 M 이하, 약 10-8 M 이하, 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 약 10-11 M 이하, 약 10-12 M 이하, 약 10-13 M 이하, 약 10-14 M 이하, 약 10-5 M 내지 약 10-15 M, 약 10-6 M 내지 약 10-15 M, 약 10-7 M 내지 약 10-15 M, 약 10-8 M 내지 약 10-15 M, 약 10-9 M 내지 약 10-15 M, 약 10-10 M 내지 약 10-15 M, 약 10-5 M 내지 약 10-14 M, 약 10-6 M 내지 약 10-14 M, 약 10-7 M 내지 약 10-14 M, 약 10-8 M 내지 약 10-14 M, 약 10-9 M 내지 약 10-14 M, 약 10-10 M 내지 약 10-14 M, 약 10-5 M 내지 약 10-13 M, 약 10-6 M 내지 약 10-13 M, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-8 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-13 M이다.
예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 900 nM, 약 800 nM, 약 700 nM, 약 600 nM, 약 500 nM, 약 400 nM, 약 300 nM, 약 250 nM, 약 200 nM, 약 150 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 100 pM, 약 10 pM, 또는 약 1 pM 이하의 KD 값으로 혈청 알부민에 결합한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 100 nM 이하의 KD 값으로 혈청 알부민에 결합한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 10 nM 이하의 KD 값으로 혈청 알부민에 결합한다.
특정 실시형태에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)(SEQ ID NO: 15)이다.
일부 실시형태에서, 2개 이상의 혈청 알부민 결합 도메인이 바람직하다. 예시적인 실시형태에서, 하나의 혈청 알부민 결합 도메인은 N-말단에 위치하고, 하나의 혈청 알부민 결합 도메인은 C-말단에 위치한다. 예시적인 구현예에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: (i) 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인, (ii) FAP에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인, (iii) 4-1BB에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인, (iv) 4-1BB에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인, 및 (v) 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인. 특정 실시형태에서, N-말단 혈청 알부민 결합 도메인(본원에서 혈청 알부민 결합 도메인 1로도 지칭됨)은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, C-말단 혈청 알부민 결합 도메인(본원에서 혈청 알부민 결합 도메인 2로도 지칭됨)은 SEQ ID NO: 1와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 반감기 연장 모이어티는 면역글로불린 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 도메인은 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 공지된 중쇄 이소타입 중 임의의 하나로부터 유래된다: IgG(γ), IgM(μ), IgD(δ), IgE(ε), 또는 IgA(α). 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 공지된 중쇄 이소타입 또는 서브타입 중 임의의 하나로부터 유래된다: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2). 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 Fc 도메인이다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 중단되지 않은 천연 서열(즉, 야생형 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 도메인은 변경된 생물학적 활성을 야기하는 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 예를 들어, 적어도 하나의 점 돌연변이 또는 결실이 Fc 도메인에 도입되어, 이펙터 활성을 감소 또는 제거(예를 들어, 국제공개 WO 2005/063815호)하고/하거나 재조합 단백질의 생산 동안 균질성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 Fc 도메인이고 하기 무(無)-이펙터 치환 중 하나 이상을 포함한다: L234A, L235A 및 G237A(Eu 넘버링). 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 C-말단 위치(즉, Eu 넘버링에 의한 K447)에 위치한 라이신을 포함하지 않는다. 라이신의 부재는 재조합 단백질의 생산 동안 균질성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 C-말단 위치(K447, Eu 넘버링)에 위치한 라이신을 포함한다.
3.5. 링커
본원에 기재된 재조합 단백질은 링커를 포함할 수 있다. "링커"는 2개의 개별 엔티티(예를 들어, FAP-결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인)를 서로 결합시키고 두 엔티티 사이에 간격과 유연성을 제공하여 이들이 예를 들어 각각의 표적(예를 들어, FAP 및 4-1BB)에 특이적으로 결합하는 형태를 달성할 수 있게 하는 분자 또는 분자 그룹이다. 단백질 링커가 특히 바람직하고, 이들은 당업계에 잘 알려진 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 재조합 단백질의 성분으로서 발현될 수 있다. 2개 이상의 링커를 포함하는 본원에 기재된 재조합 단백질(예를 들어, 2개 이상의 "(링커)" 성분을 포함하는 화학식)의 경우, 링커는 모두 동일할 수 있거나, 링커의 일부 또는 전부는 서로 상이할 수 있다.
안키린 반복 도메인은 예를 들어 이황화 결합, 폴리펩타이드 결합 또는 가교제에 의해 공유적으로 연결될 수 있거나; 또는 비공유적으로, 이종이량체 단백질을 생성한다. 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인, 4-1BB 결합 도메인, 및 임의의 반감기 연장 모이어티 사이에 링커를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 링커는 펩티딜 링커이다. 일부 실시형태에서, 펩티딜 링커는 약 1 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함한다. 예시적인 링커는 예를 들어 글리신 풍부 펩타이드; 글리신 및 세린을 포함하는 펩타이드; 서열 [Gly-Gly-Ser]n을 갖는 펩타이드(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6임); 또는 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO: 16)을 갖는 펩타이드(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임)이다. 글리신 풍부 펩타이드 링커는 펩타이드 링커를 포함하며, 적어도 25%의 잔기가 글리신이다. 글리신 풍부 펩타이드 링커는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Chichili et al. Protein Sci. 2013 February; 22(2): 153-167]).
일부 실시형태에서, 펩티딜 링커는 프롤린-트레오닌이 풍부한 펩타이드 링커이다. 예시적인 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4의 프롤린-트레오닌이 풍부한 펩타이드 링커이다.
일부 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
3.6. N-말단 및 C-말단 캡핑 서열
본원에 개시된 재조합 단백질의 안키린 반복 도메인은 N-말단 또는 C-말단 캡핑 서열을 포함할 수 있다. 캡핑 서열은 안키린 반복 서열 모티프(들)의 N- 또는 C-말단에 융합된 추가 폴리펩타이드 서열을 지칭하며, 여기서 상기 캡핑 서열은 안키린 반복 서열 모티프(들)과 긴밀한 3차 상호작용(즉, 3차 구조 상호작용)을 형성하며, 이에 의해 측면의 안키린 반복 도메인의 소수성 코어가 용매에 노출되는 것을 차단하는 캡을 제공한다.
N- 및/또는 C-말단 캡핑 서열은 반복 단위에 인접한 자연 발생 반복 단백질에서 발견되는 캡핑 단위 또는 다른 구조 단위로부터 유래될 수 있다. 캡핑 서열의 예는 국제공개 WO 2002/020565호 및 국제공개 WO 2012/069655호, 미국 특허출원공개 US20130296221호, 및 문헌[Interlandi et al., J Mol Biol. 2008 Jan 18;375(3):837-54]에 기재되어 있다. N-말단 안키린 캡핑 모듈(즉, N-말단 캡핑 반복부)의 예는 SEQ ID NO: 7, 9, 10이고 안키린 C-말단 캡핑 모듈(즉, C-말단 캡핑 반복부)의 예는 SEQ ID NO: 8을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, N-말단 캡핑 서열은 GSDLGKKLLE AARAGQDDEV RILLKAGADV NA(SEQ ID NO: 9) 또는 GSDLGKKLLE AARAGQDDEV RELLKAGADV NA(SEQ ID NO: 10)을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 위치 24에 있는 아미노산 잔기 L은 V, I 또는 A로 임의로 대체되고; 위치 24 이외의 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개의 아미노산은 임의의 아미노산에 의해 임의로 교환되고; SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 위치 1의 G 및/또는 위치 2의 S는 임의로 누락된다.
3.7. FAP/4-1BB 이중 표적 이중특이적 또는 다중특이적 분자
일부 구현예에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: (i) FAP에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, (ii) 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 및 (iii) 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인. 제2 및 제3 안키린 반복 도메인은 동일한 서열을 가질 수 있거나 상이한 서열을 가질 수 있다.
예시적인 구현예에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: (FAP 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인). 예시적인 구현예에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인).
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 6과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열, 또는 그 안에 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 6의 서열에 대해 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 6의 서열에 대해 10개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 6의 서열에 대해 5개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 6의 서열에 대해 4개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 6의 서열에 대해 3개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 6의 서열에 대해 2개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 6의 서열에 대해 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치환(들)은 SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 단백질의 KD 값과 비교하여 FAP-결합 또는 4-1BB 결합에 대한 KD 값을 1000배 이상, 100배 이상, 또는 10배 이상 변화시키지 않는다. 특정 실시형태에서, 치환은 표 1에 따른 보존적 치환이다.
한 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 6과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 4-1BB 및 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 6과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 4-1BB 및 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 6과 적어도 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 4-1BB 및 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 6과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 4-1BB 및 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 6과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 4-1BB 및 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 4-1BB 및 인간 혈청 알부민에 결합한다. 한 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 4-1BB, 및 인간 혈청 알부민에 결합하고, 여기서 상기 재조합 단백질은 사이노몰구스 원숭이 모델에서 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 약 2.8일, 또는 약 4.5일의 소실 반감기를 가지며, 여기서 전형적으로 및 바람직하게는, 상기 사이노몰구스 원숭이에서의 소실 반감기는 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정된다. 한 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 4-1BB, 및 인간 혈청 알부민에 결합하고, 상기 재조합 단백질의 존재 하에, FAP 프로테아제 활성은 대조군과 비교하여 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 또는 2% 이하 만큼 감소되며, 여기서 전형적으로 그리고 바람직하게는 상기 대조군은 상기 재조합 단백질의 부재 하에 FAP 프로테아제 활성이고, 추가로 전형적으로 그리고 바람직하게는 상기 FAP 프로테아제 활성은 실시예 10에 기재된 바와 같이 측정된다. 한 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 4-1BB, 및 인간 혈청 알부민에 결합하고, 여기서 상기 재조합 단백질은 사이노몰구스 원숭이 모델에서 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 약 2.8일, 또는 약 4.5일의 소실 반감기를 가지며, 여기서 전형적으로 및 바람직하게는, 상기 사이노몰구스 원숭이에서의 소실 반감기는 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정되고, 상기 재조합 단백질의 존재 하에, FAP 프로테아제 활성은 대조군과 비교하여 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 또는 2% 이하만큼 감소되며, 여기서 전형적으로 그리고 바람직하게는 상기 대조군은 상기 재조합 단백질의 부재 하에 FAP 프로테아제 활성이고, 추가로 전형적으로 그리고 바람직하게는 상기 FAP 프로테아제 활성은 실시예 10에 기재된 바와 같이 측정된다.
특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 FAP 및 4-1BB에 결합 시 세포독성을 유도한다. 특정 실시형태에서, 세포독성은 T-세포 매개된 세포독성이다. 특정 실시형태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질의 생물학적 활성은 사이토카인 방출을 측정하는 시험관내 분석에 의해 평가된다. 혈청 및 세포독성 T 림프구(CTL) 활성에서 사이토카인(IFN-γ, TNF-알파 및 IL-2)의 생산은 4-1BB 활성화를 나타내는 것으로 보고되었다.
특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 시험관내 IFNγ 방출 분석에 의한 평가 시 약 100 nM 이하, 약 75 nM 이하, 약 65 nM 이하, 약 55 nM 이하, 약 45 nM 이하, 약 35 nM 이하, 약 25 nM 이하, 약 15 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 4 nM 이하, 약 3 nM 이하, 약 2 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.01 nM 내지 약 50 nM, 약 0.01 nM 내지 약 25 nM, 약 0.01 nM 내지 약 10 nM, 약 0.01 nM 내지 약 5 nM, 약 0.05 nM 내지 약 50 nM, 약 0.05 nM 내지 약 25 nM, 약 0.05 nM 내지 약 10 nM, 약 0.05 nM 내지 약 5 nM, 약 0.1 nM 내지 약 50 nM, 약 0.1 nM 내지 약 25 nM, 약 0.1 nM 내지 약 10 nM, 약 0.1 nM 내지 약 5 nM, 약 0.4 nM 내지 약 2 nM의 반 최대 유효 농도(EC50)를 갖는다.
예시적인 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 약 10 nM 이하의 EC50을 갖는다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 약 3 nM 이하의 EC50을 갖는다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 약 0.1 nM 내지 약 10 nM의 EC50을 갖는다.
특정 실시형태에서, IFNγ 방출 분석은 인간 T 세포 IFNγ 방출 분석이다. 특정 실시형태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 예시적인 실시형태에서, IFNγ 방출 분석은 제조사의 지침에 따라 인간 IFN-감마 DuoSet ELISA(R&D 시스템, 카탈로그 번호 DY285B)를 사용하여 측정된다. 예시적인 실시형태에서, EC50 값은 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 로지스틱 피팅 모델로 데이터를 피팅함으로써 결정된다. 예시적인 실시형태에서, EC50 값은 실시예 4에 기술된 방법을 사용하여 결정된다.
특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 마우스 모델에서 적어도 10시간, 적어도 20시간, 적어도 30시간, 적어도 40시간, 또는 약 44시간의 소실 반감기를 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 마우스에서의 소실 반감기는 실시예 5에 예시된 바와 같은 방법을 사용하여 측정된다. 특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 사이노몰구스 원숭이 모델에서 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 약 2.8일, 또는 약 4.5일의 소실 반감기를 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 사이노몰구스 원숭이에서의 소실 반감기는 실시예 6에 예시된 바와 같은 방법을 사용하여 측정된다.
특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질은 FAP 프로테아제 활성을 억제하지 않는다. 특정 실시형태에서, 다중특이적 재조합 단백질의 존재 하에, FAP 프로테아제 활성은 대조군과 비교하여 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 또는 2% 이하만큼 감소된다(대조군은 다중특이적 재조합 단백질의 부재 하에 FAP 프로테아제 활성일 수 있음). 예시적인 실시형태에서, FAP 활성은 실시예 10에 예시된 바와 같은 방법을 사용하여 측정된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, 여기서 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3, 24-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, 여기서 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3, 24-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, 여기서 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, 여기서 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고, 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고/있거나 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3, 24-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고, 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고/있거나 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, FAP 결합은 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3, 24-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, 여기서 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2, 18-23 및 39-43 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3, 24-29 및 51-55 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고, 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고, 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 하기 특성 중 임의의 하나 또는 임의의 조합을 추가로 가질 수 있다: (i) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (ii) 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (iii) FAP 결합 도메인은 4-1BB 결합 도메인의 N-말단에 위치하고; (iv) 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고; (v) 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 3 x 10-9 M 미만, 또는 1 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중 인간 FAP에 결합하고; (vi) 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하, 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 4-1BB-발현 HT1080 세포에서 인간 4-1BB를 활성화하고; (vii) 상기 FAP 결합 도메인 및 상기 4-1BB 결합 도메인은 펩티딜 링커, 바람직하게는 프롤린-트레오닌(PT) 풍부 링커(예컨대 SEQ ID NO: 4를 포함하는 링커) 또는 GS 링커에 의해 연결되고; (viii) 재조합 단백질은 1, 2 또는 3개의 4-1BB 결합 도메인을 포함하고; (ix) 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 포함하고; (x) 재조합 결합 단백질은 FAP, 4-1BB 및 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있고, (xi) 재조합 단백질은 FAP 프로테아제 활성을 억제하지 않거나, 또는 재조합 단백질의 존재 하에 FAP 프로테아제 활성의 감소가 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 또는 10% 이하이고; (xii) 재조합 단백질은 마우스 모델에서 적어도 10시간, 적어도 20시간, 적어도 30시간, 적어도 40시간, 또는 약 44시간의 소실 반감기를 갖고, (xiii) 재조합 단백질은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 약 2.8일, 또는 약 4.5일의 사이노몰구스 원숭이 모델에서의 소실 반감기를 갖는다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) FAP 결합 도메인은 4-1BB 결합 도메인의 N-말단에 위치한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) FAP 결합 도메인은 4-1BB 결합 도메인의 N-말단에 위치한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) FAP 결합 도메인은 4-1BB 결합 도메인의 N-말단에 위치한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) FAP 결합 도메인은 4-1BB 결합 도메인의 N-말단에 위치한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) FAP 결합 도메인은 4-1BB 결합 도메인의 N-말단에 위치한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고/하거나 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 3 x 10-9 M 미만, 또는1 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 결합한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고/하거나 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 3 x 10-9 M 미만, 또는1 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 결합한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고/하거나 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 3 x 10-9 M 미만, 또는1 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 결합한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고/하거나 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 3 x 10-9 M 미만, 또는1 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 결합한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고/하거나 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 3 x 10-9 M 미만, 또는1 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 결합한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 5 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고/하거나 재조합 단백질은 5 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 결합한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 5 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고/하거나 재조합 단백질은 5 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 결합한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 5 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고/하거나 재조합 단백질은 5 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 결합한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 4-1BB-발현 HT1080 세포에서 인간 4-1BB를 활성화한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하, 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 4-1BB-발현 HT1080 세포에서 인간 4-1BB를 활성화한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하, 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 4-1BB-발현 HT1080 세포에서 인간 4-1BB를 활성화한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하, 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 4-1BB-발현 HT1080 세포에서 인간 4-1BB를 활성화한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하, 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 4-1BB-발현 HT1080 세포에서 인간 4-1BB를 활성화한다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 4-1BB 결합 도메인은 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고; 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 상기 FAP 결합 도메인 및 상기 4-1BB 결합 도메인은 펩티딜 링커, 바람직하게는 프롤린-트레오닌(PT) 풍부 링커(예컨대 SEQ ID NO: 4를 포함하는 링커) 또는 GS 링커에 의해 연결된다. 재조합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 이러한 4-1BB 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 2개의 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고, 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고, 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 하기 특성 중 임의의 하나 또는 임의의 조합을 추가로 가질 수 있다: (i) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (ii) 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (iii) 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함하며: (FAP 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인); (iv) 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고; (v) 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 3 x 10-9 M 미만, 또는 1 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중 인간 FAP에 결합하고; (vi) 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하, 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 4-1BB-발현 HT1080 세포에서 인간 4-1BB를 활성화하고; (vii) 상기 FAP 결합 도메인 및 상기 4-1BB 결합 도메인은 펩티딜 링커, 바람직하게는 프롤린-트레오닌(PT) 풍부 링커(예컨대 SEQ ID NO: 4를 포함하는 링커) 또는 GS 링커에 의해 연결되고; (viii) 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함하며: (FAP 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인); (ix) 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 포함하고; (x) 재조합 결합 단백질은 FAP 및 4-1BB에 동시에 결합할 수 있고; (xi) 재조합 단백질은 FAP 프로테아제 활성을 억제하지 않거나, 또는 재조합 단백질의 존재 하에 FAP 프로테아제 활성의 감소가 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 또는 10% 이하이고; (xii) 재조합 단백질은 마우스 모델에서 적어도 10시간, 적어도 20시간, 적어도 30시간, 적어도 40시간, 또는 약 44시간의 소실 반감기를 갖고, (xiii) 재조합 단백질은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 또는 약 2.8일, 또는 약 4.5일의 사이노몰구스 원숭이 모델에서의 소실 반감기를 갖는다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 2개의 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: (FAP 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인). 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: (FAP 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인). 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고; 그리고/또는 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 3 x 10-9 M 미만, 또는 1 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 결합한다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 2개의 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: (FAP 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인). 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: (FAP 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인). 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고; 그리고/또는 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 3 x 10-9 M 미만, 또는 1 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 결합한다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 2개의 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: (FAP 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인). 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: (FAP 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인). 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고; 그리고/또는 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 3 x 10-9 M 미만, 또는 1 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 결합한다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 FAP 결합 도메인 및 2개의 4-1BB 결합 도메인을 포함하며, 여기서: (a) FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (b) 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고; 여기서 마지막에서 두 번째 위치는 L 또는 A일 수 있고, 마지막 위치는 N 또는 A일 수 있고; (c) 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: (FAP 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인). 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: (FAP 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인). 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 또는 3 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 결합하고; 그리고/또는 재조합 단백질은 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 3 x 10-9 M 미만, 또는 1 x 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 결합한다. 재조합 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에 혈청 알부민 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인, 및 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제5 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 하기 화학식에 따라, N-말단에서 C-말단으로 배열되며: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인), 여기서 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-7 M 미만 또는 10-8 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 인간 4-1BB, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합하고; 여기서 바람직하게는 상기 동시 결합은 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해, 더욱 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다. 특정 실시형태에서, 상기 2개의 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 그 N-말단은 임의로 추가로 G, S, 또는 GS를 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인, 및 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제5 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 하기 화학식에 따라, N-말단에서 C-말단으로 배열되며: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인), 여기서 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-7 M 미만 또는 10-8 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 인간 4-1BB, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합하고; 여기서 바람직하게는 상기 동시 결합은 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해, 더욱 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다. 특정 실시형태에서, 상기 2개의 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 1과 적어도 93% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 그 N-말단은 임의로 추가로 G, S, 또는 GS를 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인, 및 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제5 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 하기 화학식에 따라, N-말단에서 C-말단으로 배열되며: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인), 여기서 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-7 M 미만 또는 10-8 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 인간 4-1BB, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합하고; 여기서 바람직하게는 상기 동시 결합은 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해, 더욱 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다. 특정 실시형태에서, 상기 2개의 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 그 N-말단은 임의로 추가로 G, S, 또는 GS를 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인, 및 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제5 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 하기 화학식에 따라, N-말단에서 C-말단으로 배열되며: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인), 여기서 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-7 M 미만 또는 10-8 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 인간 4-1BB, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합하고; 여기서 바람직하게는 상기 동시 결합은 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해, 더욱 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다. 특정 실시형태에서, 상기 2개의 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 그 N-말단은 임의로 추가로 G, S, 또는 GS를 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인, 및 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제5 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 하기 화학식에 따라, N-말단에서 C-말단으로 배열되며: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인), 여기서 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-7 M 미만 또는 10-8 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 상기 재조합 단백질은 인간 4-1BB, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합하고; 여기서 바람직하게는 상기 동시 결합은 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해, 더욱 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다. 특정 실시형태에서, 상기 2개의 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고, 여기서 임의로 두번째 마지막 위치는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인, 및 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제5 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 하기 화학식에 따라, N-말단에서 C-말단으로 배열되며: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인), 여기서 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-7 M 미만 또는 10-8 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 재조합 단백질은 인간 FAP, 인간 4-1BB 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하, 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 4-1BB-발현 HT1080 세포에서 인간 4-1BB를 활성화한다. 인간 4-1BB, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민에 대한 동시 결합은 바람직하게는 PBS 중에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해, 더욱 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인, 및 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제5 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 하기 화학식에 따라, N-말단에서 C-말단으로 배열되며: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인), 여기서 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-7 M 미만 또는 10-8 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 재조합 단백질은 인간 FAP, 인간 4-1BB 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하, 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 4-1BB-발현 HT1080 세포에서 인간 4-1BB를 활성화한다. 인간 4-1BB, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민에 대한 동시 결합은 바람직하게는 PBS 중에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해, 더욱 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인, 및 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제5 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 하기 화학식에 따라, N-말단에서 C-말단으로 배열되며: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인), 여기서 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-7 M 미만 또는 10-8 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 재조합 단백질은 인간 FAP, 인간 4-1BB 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하, 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 4-1BB-발현 HT1080 세포에서 인간 4-1BB를 활성화한다. 인간 4-1BB, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민에 대한 동시 결합은 바람직하게는 PBS 중에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해, 더욱 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 단백질은 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인, 및 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제5 안키린 반복 도메인을 포함하며, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 하기 화학식에 따라, N-말단에서 C-말단으로 배열되며: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인), 여기서 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 FAP에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-9 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 단백질은 10-8 M 미만의 해리 상수(KD) 값으로 PBS 중 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 2개의 혈청 알부민 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 그 N-말단은 임의로 G, S, 또는 GS를 추가로 포함하고, 임의로 마지막에서 두 번째 위치의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치의 A는 N으로 치환되고, 상기 재조합 단백질은 인간 FAP, 인간 4-1BB 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커는 SEQ ID NO: 4로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 재조합 단백질은 약 10-8 M 이하, 또는 약 10-9 M 이하의 EC50 값으로 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 4-1BB-발현 HT1080 세포에서 인간 4-1BB를 활성화한다. 인간 4-1BB, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민에 대한 동시 결합은 바람직하게는 PBS 중에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해, 더욱 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다.
3.8. 핵산 및 다중특이적 단백질 생산 방법
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 절차에 의해 제조 및 발현될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 재조합 다중특이적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 단백질은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 및 임의로 반감기 연장 모이어티를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 또는 5를 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 6를 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 개시내용은 SEQ ID NO: 17의 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 그의 변이체를 제공하며, 여기서 이러한 변이체 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 17의 핵산 서열을 포함하는 핵산과 같은 본원에 개시된 임의의 핵산에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 17의 핵산 서열을 포함하는 핵산과 같은 본원에 개시된 임의의 핵산에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 17의 핵산을 포함하는 핵산 서열과 같은 본원에 개시된 임의의 핵산에 대해 적어도 96%의 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 17의 핵산 서열을 포함하는 핵산과 같은 본원에 개시된 임의의 핵산에 대해 적어도 97%의 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 17의 핵산 서열을 포함하는 핵산과 같은 본원에 개시된 임의의 핵산에 대해 적어도 98%의 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 17의 핵산 서열을 포함하는 핵산과 같은 본원에 개시된 임의의 핵산에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 공유한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 변이체를 제공하며, 이러한 변이체 폴리뉴클레오타이드는 매우 엄격한 조건 하에 SEQ ID NO: 17의 서열에 혼성화할 수 있다. "매우 엄격한 조건"에는 하기가 포함된다: (1) 세척에 낮은 이온 강도 및 고온, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 도데실황산나트륨을 사용; (2) 42℃에서 혼성화 동안 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 50%(v/v) 포름아미드와 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)과 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨 사용; 또는 (3) 42℃에서, 50% 포름아미드, 5×SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5× Denhardt 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA(50 pg/mL), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트, 42℃에서 0.2× SSC(염화나트륨/시트르산나트륨) 및 55℃에서 50% 포름아미드로 세척, 이어서 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1×SSC로 이루어진 매우 엄격한 세척.
임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오타이드도 본 개시내용에 포함된다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA(재조합, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 포함하고 DNA 분자에 일대일로 대응하는 hnRNA 분자와 인트론을 포함하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있지만 그럴 필요는 없다.
유전자 코드의 축퇴성의 결과로서, 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질(또는 그의 개별 도메인)을 코딩하는 많은 뉴클레오타이드 서열이 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소한의 상동성을 갖는다. 코돈 사용의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오타이드가 본 개시내용에 의해 구체적으로 고려된다.
본 개시내용은 또한 핵산 서열이 특정 세포에서 발현을 최대화하도록 최적화된 코돈-최적화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일반적으로, 코돈 최적화는 원래의 아미노산 서열을 유지하면서 원래 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 코돈)을 해당 숙주의 유전자에서 더 빈번하거나 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 숙주 세포에서 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 의미한다. 다양한 종이 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정한 편향을 보인다. 코돈 편향(유기체 간 코돈 사용의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율성과 상관관계가 있으며, 이는 무엇보다도 번역되는 코돈의 특성과 특정 전사 RNA(tRNA) 분자의 가용성에 의존하는 것으로 간주된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 자주 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 코돈 사용 표는 쉽게 사용할 수 있으며 이러한 표는 다양한 방식으로 맞춤화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]). Gene Forge(Aptagen; Jacobus, Pa.)와 같은 특정 숙주 세포에서 발현을 위한 특정 서열을 최적화하는 코돈을 위한 컴퓨터 알고리즘도 사용 가능하다. 일부 실시형태에서, 재조합 단백질을 코딩하는 서열 내의 하나 이상의 코돈(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개, 또는 그 이상, 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 상응한다.
적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 구성될 수 있거나 당업계에서 이용가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가 복제 능력이 있고, 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고, 그리고/또는 벡터를 포함하는 클론을 선택하는 데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, Bluescript(예를 들어, pBS SK+) 및 그 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 BioRad, Strategene 및 Invitrogen과 같은 상용 공급업체에서 입수 가능하다.
발현 벡터가 추가로 제공된다. 발현 벡터는 일반적으로 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오타이드 구조물이다. 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 필수 부분으로서 숙주 세포에서 복제가능하다는 것이 함축되어 있다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드, 및 국제공개 WO 87/04462호에 개시된 발현 벡터(들)을 포함하는 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 벡터 구성요소는 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다: 신호 시퀀스; 복제 원점; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 조절 요소(예컨대 프로모터, 인핸서 및 터미네이터). 발현(즉, 번역)을 위해서는 일반적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈과 같은 하나 이상의 번역 제어 요소가 또한 필요하다.
관심 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 자체를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용한 형질감염; 미세 발사체 폭격; 리포펙션; 및 감염(예를 들어, 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염원인 경우)을 포함하는 다수의 적절한 수단 중 임의의 것에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 따라 다를 것이다.
예시적인 숙주 세포는 대장균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포를 포함한다. 바람직한 숙주 세포는 당업계에 잘 알려진 많은 세포 중에서 대장균 세포, CHO 세포, 인간 배아 신장(HEK) 293 세포, 또는 Sp2.0 세포를 포함한다.
4. 치료 방법
본 명세서에 기재된 재조합 단백질은 예를 들어 암에 걸린 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용은 치료적 유효량의 본원에 기재된 재조합 단백질 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시형태에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 특정 실시형태에서, 암세포는 FAP를 발현한다. 특정 실시형태에서, 종양 기질 세포는 FAP를 발현한다.
일부 실시형태에서, 암은 뇌암, 방광암, 유방암, 투명세포신암, 자궁경부암, 결장 및 직장암, 자궁내막암, 위암, 두경부 편평세포암, 입술 및 구강암, 간암, 폐 편평세포암, 흑색종, 중피종, 비소세포폐암(NSCLC), 비흑색종 피부암, 난소암, 구강암, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 육종, 소세포폐암(SCLC), 편평세포암 두경부(SCCHN), 삼중 음성 유방암 또는 갑상선암이다.
일부 실시형태에서, 암은 부신피질 종양, 폐포 연부 육종, 암종, 연골육종, 결장직장 암종, 데스모이드 종양, 결합조직형성 소원형세포 종양, 내분비 종양, 내배엽 부비동 종양, 상피양 혈관내피종, 유잉 육종, 생식 세포 종양, 간모세포종, 간세포 암종, 흑색종, 신종, 신경모세포종, 비횡문근육종 연조직 육종(NRSTS), 골육종, 척수 주위 육종, 신세포 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 활액 육종 또는 윌름스 종양이다.
일부 실시형태에서, 암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 또는 만성 골수성 백혈병(CML)이다.
일부 실시형태에서, 암은 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 호지킨 림프종(HL), 외투 세포 림프종(MCL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL) 또는 소림프구성 림프종(SLL)이다.
실제로, 치료될 수 있는 암에는 폐포 횡문근육종, 뼈암, 항문암, 항문관 또는 항문직장암, 눈암, 간내담관암, 관절암, 암이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 목, 담낭 또는 흉막, 코, 비강 또는 중이의 암, 구강암, 외음부암, 식도암, 위장관 유암종, 하인두암, 후두암, 비인두암, 복막, 대망 및 장간막암, 인두암, 소장암, 연조직암, 위암, 고환암, 요관암 및 방광암이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
특정 양태에서, 암은 두경부암, 난소암, 자궁경부암, 방광암 및 식도암, 췌장암, 위장관암, 위암, 유방암, 자궁내막암 및 결장직장암, 간세포암종, 교모세포종, 방광암, 폐암 및 세기관지 폐포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC), 두경부암, 신장암, 삼중 음성 유방암, 또는 위암이다. 특정 실시형태에서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC), 소세포 폐암(SCLC), 두경부암, 신장암, 유방암, 흑색종, 난소암, 간암, 췌장암, 결장암, 전립선암, 위암, 림프종 또는 백혈병이다. 특정 실시형태에서, 암은 뇌암이다.
본원에 기재된 재조합 단백질은 종양을 제거하기 위한 수술 전 또는 후에 사용될 수 있고 방사선 요법 전, 동안 또는 후에 사용될 수 있다. 재조합 단백질은 촉진 또는 MRI, 초음파 또는 CAT 스캔과 같은 당업계에 잘 알려진 영상 기술에 의해 발견될 만큼 충분히 큰 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 단백질은 적어도 약 200 ㎣, 300 ㎣, 400 ㎣, 500 ㎣, 750 ㎣, 또는 1000 ㎣ 이하의 치수를 갖는 진행성 단계 종양을 치료하는 데 사용된다.
혈청 및 세포독성 T 림프구(CTL) 활성에서 사이토카인(IFN-γ, TNF-알파 및 IL-2)의 생산은 4-1BB 활성화를 나타내는 것으로 보고되었다(예를 들어, 문헌[Li et al., Cell Mol Immunol. 2008 Oct;5(5):379-84. doi: 10.1038/cmi.2008.47] 참조). 따라서 사이토카인 관련(예컨대 IFN-γ 관련) 발현 프로파일은 4-1BB 활성화에 대한 임상 반응을 예측할 수 있다.
예를 들어, 연구에 따르면 IFN-γ은 CD8+ T 세포의 항종양 및 항바이러스 효과를 향상시킬 수 있다. CD8+ T 세포는 IFNγ을 생성할 수 있으며, 이는 항원 제시 세포의 부위로 이동하는 능력을 향상시킨다. 반대로, 자가분비 또는 측분비 IFNγ의 결핍 또는 CTL에 대한 IFNγ 신호 전달의 차단은 세포독성 기능, 운동학 및 이펙터 세포 생존을 현저하게 감소시켰다. 세포독성 CD8+ T 세포 기능을 활성화하는 로컬 IFNγ의 필요성은 암 치료에 중요하다.
따라서, 대상체에서 T 세포 활성, 특히 CD8+ T-세포 매개 세포독성을 증가시키는 방법이 본원에서 제공된다. T 세포 활성의 이러한 증가는 예를 들어 T 세포 생존 및 이펙터 기능의 증가, 말단 분화 제한 및 복제 가능성의 상실, T 세포 수명 촉진, 및 표적(예를 들어, 암) 세포에 대한 세포독성의 향상을 포함한다. 특정 실시형태에서, T 세포 활성 또는 면역 반응은 암 세포 또는 암 조직 또는 종양 세포 또는 종양에 대해 지시된다. 특정 실시형태에서, 면역 반응은 체액성 면역 반응이다. 특정 실시형태에서, 면역 반응은 선천적 면역 반응이다. 특정 실시형태에서, 향상된 면역 반응은 T 세포 매개 면역 반응이다.
5. 약제학적 조성물 및 투여
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 재조합 다중특이적 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 표준 약제학적 담체에는 인산염 완충 식염수 용액, 물, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼과 같은 에멀젼 및 다양한 유형의 습윤제가 포함된다.
약제학적 조성물은 예를 들어 산성화제, 첨가제, 흡착제, 에어로졸 추진제, 공기 치환제, 알칼리화제, 케이킹 방지제, 항응고제, 항미생물 보존제, 항산화제, 방부제, 염기, 결합제, 완충제, 킬레이트제, 코팅제, 착색제, 건조제, 세제, 희석제, 소독제, 붕해제, 분산제, 용해 증진제, 염료, 연화제, 유화제, 에멀젼 안정화제, 충전제, 필름 형성제, 향미 증진제, 향미제, 유동 향상제, 겔화제, 과립화제, 습윤제, 윤활제, 점막접착제, 연고 베이스, 연고, 유성 비히클, 유기 베이스, 알약 베이스, 안료, 가소제, 광택제, 방부제, 격리제, 피부 침투제, 가용화제, 용제, 안정화제, 좌약 기제, 표면 활성제, 계면활성제, 현탁제, 감미제, 치료제, 증점제, 등장화제, 독성제, 점도 증가제, 수분 흡수제, 수혼화성 공용매, 연수제 또는 습윤제를 비롯한 임의의 약제학적으로 허용되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000)](전문이 참고로 포함됨) 참조. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)](전문이 참고로 포함됨) 참조.
약제학적 조성물은 생리학적으로 적합한 pH를 달성하도록 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 pH는 예를 들어 약 4 또는 약 5 내지 약 8.0, 또는 약 4.5 내지 약 7.5, 또는 약 5.0 내지 약 7.5일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 약제학적 조성물의 pH는 5.5 내지 7.5이다.
본원에 기재된 재조합 다중특이적 단백질은 비경구, 비강, 경구, 폐, 국소, 질 또는 직장 투여와 같은 임의의 적합한 투여 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제형에는 항산화제, 완충제, 정균제 및 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 포함된다. 자세한 내용은 문헌[Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., 페이지 238-250 (1982)], 및 문헌[ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., 페이지 622-630 (1986)] 참조.
치료 요법의 과정에 걸쳐 투여되는 본 개시내용의 활성제의 용량은 투여 시점으로부터 임상적으로 허용되는 시간 프레임(예를 들어, 1 내지 4주 이상(예를 들어, 5 내지 20주 이상))에서 암을 치료하기에 충분해야 한다. 특정 실시형태에서, 기간은 훨씬 더 길 수 있다. 투여량은 특정 활성제의 효능 및 동물(예를 들어, 인간)의 상태뿐만 아니라 때때로 치료할 동물(예를 들어, 인간)의 체중에 의해 결정될 것이다. 특정 용량의 투여 시 암이 치료되는 정도는 예를 들어 활성제의 세포독성 또는 활성제로 달성된 종양 퇴행의 정도로 나타낼 수 있다. 재조합 다중특이적 단백질의 세포독성을 측정하는 방법 및 종양 퇴행을 분석하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예로서 그리고 본 개시내용을 제한하려는 의도가 아니라, 본 개시내용의 활성제의 용량은 약 0.0001 내지 약 1 g/치료되는 대상체의 체중 ㎏/일, 약 0.0001 내지 약 0.001 g/체중 ㎏/일, 또는 약 0.01 mg 내지 약 1 g/체중 ㎏/일일 수 있다. 투여량 단위는 체표면적 평방 미터 당 밀리그램 단위의 양을 나타내는 rag/m2로 표시할 수도 있다.
PK/PD 모델 및 전임상 동물 모델에 기초하여, 치료 용량은 약 0.015 mg/㎏ 내지 약 12 mg/㎏ 범위, 예컨대 약 0.05 mg/㎏ 내지 약 10 mg/㎏, 약 0.1 mg/㎏ 내지 약 10 mg/㎏, 약 0.5 mg/㎏ 내지 약 10 mg/㎏, 약 0.5 mg/㎏ 내지 약 7.5 mg/㎏, 약 0.5 mg/㎏ 내지 약 5 mg/㎏, 약 0.5 mg/㎏, 약 1.0 mg/㎏, 약 1.5 mg/㎏, 약 2.0 mg/㎏, 약 2.5 mg/㎏, 약 3.0 mg/㎏, 약 3.5 mg/㎏, 약 4.0 mg/㎏, 약 4.5 mg/㎏, 또는 약 5 mg/㎏일 수 있는 것으로 여겨진다. 특정 실시형태에서, 다중특이적 단백질은 약 0.5 mg/㎏ 내지 약 5 mg/㎏으로 투여된다. 특정 실시형태에서, 다중특이적 단백질은 약 2 mg/㎏으로 투여된다.
본원에 기재된 재조합 다중특이적 단백질은 다른 항암제와 같은 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 각각의 치료제는 동시에(예를 들어, 동일한 약제로 또는 동시에), 동시에(즉, 임의의 순서로 차례로 투여되는 별도의 약제로) 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 순차 투여는 병용 요법의 치료제가 상이한 투여 형태(예를 들어, 한 제제는 정제 또는 캡슐이고 다른 제제는 멸균 액체임)로 존재하고/하거나 상이한 투여 일정, 예를 들어 적어도 매일 투여되는 화학요법제 및 덜 빈번하게 투여되는 생물요법제, 예를 들어 매주 1회, 2주마다 1회, 또는 3주에 1회 투여되는 경우에 유용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합 다중특이적 단백질은 약 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 월 1회 투여된다. 예를 들어, 재조합 다중특이적 단백질은 3주마다 약 0.5 mg/㎏, 약 1 mg/㎏, 약 2 mg/㎏, 약 3 mg/㎏, 약 4 mg/㎏, 또는 약 5 mg/㎏으로 투여될 수 있다.
실시예
실시예 1 - 다중특이적 결합 단백질의 설계
다양한 형식의 다중특이적 결합 단백질(도 5a 및 도 5b 참조)을 생성하고 h4-1BB-HT1080 리포터 세포의 NF-κB 활성화를 향상시키는 능력을 평가했다.
SEQ ID NO: 2에 제시된 FAP 결합 도메인, 및 SEQ ID NO: 3에 제시된 1 내지 3개의 4-1BB 결합 도메인을 포함하는 다양한 다중특이적 결합 단백질의 기능적 활성을 인간 FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 인간 4-1BB-형질감염된 NF-κB 리포터 세포(h4-1BB-HT1080)를 사용하여 평가하였다.
인간 FAP -발현 CHO 세포의 존재 하에 시험관내 NF - κB 활성화 분석: HT1080 인간 섬유육종 세포를 하기에 기술된 바와 같이 전장 인간 4-1BB 및 pNIFTY-루시아 NF-κB 리포터 유전자를 코딩하는 cDNA로 안정적으로 형질감염시켰다. 동일한 방식으로 CHO 세포를 인간 FAP를 코딩하는 cDNA로 안정적으로 형질감염시켰다. 96-웰 플레이트를 사용하여 40,000개의 h4-1BB-HT1080 리포터 세포 및 40,000개의 CHO-hFAP 세포를 플레이팅하고 다양한 농도의 MpA 또는 대조군 안키린 반복 단백질을 세포에 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 20시간 후, 상층액을 수집하고 새로운 96-웰 플레이트에서 원심분리하였다. QUANTI-Luc 시약을 상층액과 혼합하고 Tecan M1000 발광 플레이트 판독기에서 발광을 판독했다. EC50 값은 Graphpad Prism 소프트웨어(버전 7.02)를 사용하여 4개 매개변수 로지스틱 피팅 모델로 데이터를 피팅하여 결정했다.
인간 FAP를 발현하는 CHO 세포의 생성: CHO 세포를 안정적으로 형질감염시켜 세포 표면에서 인간 FAP를 발현시켰다. 인간 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)의 ORF의 GFP-융합물을 함유하는 플라스미드는 OriGene Technologies(#RG204692)로부터 입수하였다. 인간 FAP(GFP 없음)를 코딩하는 cDNA는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 서브클로닝되었다. 그런 다음 이 플라스미드를 CHO 세포로 형질감염시켜 리포펙타민을 사용하여 인간 FAP를 과발현하는 안정한 형질감염체를 생성했다. 다양한 양의 Geneticin G-418(Promega, V8091)을 사용하여 선택 압력을 가했다. hFAP의 발현은 항-FAP 항체 ESC11(국제공개 WO2011/040972호)을 사용하여 유세포분석법으로 분석하였다. 조건 1.9 mg/mL G-418로부터의 CHO-hFAP 형질감염체의 집단은 고 효능 DARPin® 분자의 구별을 허용하기 위해 효능 분석을 위한 FAP의 더 낮은 발현 수준에 대해 선택되었다.
결론: 도 5a 내지 도 5g에 도시된 바와 같이. 본 발명의 재조합 단백질에 의한 4-1BB 활성화는 FAP-발현 세포(CHO-FAP)의 존재에 의존하였다. FAP를 발현하지 않는 세포의 존재 하에(CHO-wt), 4-1BB의 활성화는 관찰되지 않았다. 4-1BB는 천연 삼량체 리간드(4-1BBL)에 결합할 때 삼량체화를 거치지만, 이 경우 4-1BB 활성화에 3개의 4-1BB 결합 도메인을 가질 필요는 없다. 1가 4-1BB 바인더(F-B)는 4-1BB를 활성화하기에 충분했다. 더 높은 효능은 2개의 4-1BB 결합 도메인(F-B-B) 또는 3개의 4-1BB 결합 도메인(F-B-B-B)을 사용하여 달성되었다. 3개의 4-1BB 결합 모듈을 가짐으로써 분자는 4-1BB 클러스터링("가교" 효과)을 추가로 촉진하여 T-세포 매개 세포독성을 추가로 향상시키는 것으로 여겨졌다. 놀랍게도, F-B-B(2개의 4-1BB 결합 모듈)와 비교할 때, F-B-B-B 형식(3개의 4-1BB 결합 모듈)은 활성을 크게 향상시키지 않았다. 따라서 추가 특성화를 위해 F-B-B 형식이 선택되었다. 이 형식은 다음 실시예에 설명된 다중특이적 결합 단백질 A(MpA)(SEQ ID NO: 6)에 사용된다.
실시예 2 - 다중특이적 분자의 결합 친화도
하기 실시예는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 다중특이적 결합 단백질 A(MpA)에서 상이한 도메인의 종 교차 반응성을 결정하기 위해 수행된 실험을 설명한다. MpA와 혈청 알부민, 4-1BB 및 FAP의 상호작용은 3종(인간, 사이노몰구스 원숭이 및 마우스)에 대해 분석되었다.
물질 및 방법
다른 종의 4- 1BB에 대한 MpA 결합을 위한 ProteOn 설정: SPR 측정은 ProteOn XPR36 기기(BioRad)를 사용하여 수행되었다. 실행 완충액은 0.005% Tween 20®(PBST)을 함유하는 PBS pH 7.4였다. bio.h4-1BB, bio.c4-1BB 및 bio.m4-1BB를 NLC 칩(BioRad)에 320 RU 수준으로 고정했다. 4-1BB에 대한 MpA의 결합은 100 μl/분의 일정한 유속을 사용하여 180초의 결합 및 1800초의 해리로 30, 10, 3.3, 1.1 및 0.3 nM의 연속 희석으로 MpA를 주입하여 측정되었다(표 3 참조). 측정을 3회 반복하고 10 mM 글리신 pH 2 및 124 mM H3PO4를 사용한 개별 측정 사이에 표적을 재생성했다. 신호는 L1 및 A6의 실행 완충액(PBST) 처리된 대조군 레인에 대해 이중 참조되었다. h4-1BB, c-4-1BB 및 m4-1BB는 각각 4-1BB의 인간, 사이노몰구스 및 마우스 이종상동체를 나타낸다.
다른 종의 혈청 알부민에 대한 MpA 결합을 위한 ProteOn 설정: SPR 측정은 ProteOn XPR36 기기(BioRad)를 사용하여 수행되었다. 실행 완충액은 0.005% Tween 20®(PBST)을 함유하는 PBS pH 7.4였다. 먼저, bio.h4-1BB를 NLC 칩(BioRad)에 320 RU 수준으로 코팅한 후 100 mM MpA를 30 μl/분의 일정한 유속으로 180초 동안 200 RU 수준까지 고정시켰다. MpA에 대한 혈청 알부민의 결합은 HSA(인간 혈청 알부민), CSA(사이노몰구스 혈청 알부민) 및 MSA(마우스 혈청 알부민)를 100 μl/분의 일정한 유속을 사용하여 180초 결합 및 1800초 해리 단계로 적정으로 적용하여 검출했다. HSA, CSA 및 MSA 결합은 연속적으로 측정되었고 bio.h4-1BB/MpA 복합체는 10 mM 글리신 pH 2 및 12 4 mM H3PO4로 매번 재생되었다. 따라서 MpA는 각 재생 단계 후에 다시 코팅되어야 했다. 신호는 L1 및 A6의 실행 완충액(PBST) 처리된 대조군 레인에 대해 이중 참조되었다. 피팅에는 1:1 Langmuir 모델이 사용되었다.
다른 종의 FAP에 대한 MpA 결합을 위한 ProteOn 설정: SPR 측정은 ProteOn XPR36 기기(BioRad)를 사용하여 수행되었다. 실행 완충액은 0.005% Tween 20®(PBST)을 함유하는 PBS pH 7.4였다. hFAP(인간 FAP), cFAP(사이노몰구스 FAP) 및 mFAP(마우스 FAP)를 각각 pH 5.3에서 2000 RU, 1700 RU 및 5000 RU 수준으로 GLC 칩(BioRad)에 고정했다. FAP와 MpA의 상호작용은 MpA 분자를 적정으로 적용하여 측정되었다(표 2 참조). 결합 및 해리 설정은 표 2에 요약되어 있다.
[표 2]
Figure pct00002
hFAP에 대한 MpA의 결합을 검출하기 위해 두 가지 독립적인 측정을 수행했다. 표적은 10 mM 글리신 pH 2 및 124 mM H3PO4를 사용하여 재생되었다. 신호는 L1 및 A6의 PBST 처리된 대조군 레인에 대해 이중 참조되었다. 피팅에는 1:1 Langmuir 모델이 사용되었다.
결과
4- 1BB에 대한 결합: 결과는 MpA가 KD = 13 ± 5 pM으로 인간 4-1BB에 결합하고 KD = 14 ± 8 pM으로 사이노몰구스 4-1BB에 결합한다는 것을 보여주었다(표 3에 표시됨).
[표 3]
Figure pct00003
따라서, 결과는 MpA가 유사한 겉보기 친화도로 인간 및 사이노 4-1BB에 결합함을 나타낸다. 그러나, MpA가 마우스 4-1BB에 교차 반응하지 않는다는 것을 나타내는 m4-1BB에 대한 결합이 검출되지 않았다. 이 발견은 인간과 사이노몰구스의 경우 95%, 인간과 마우스의 경우 56%의 서열 동일성과 일치하다.
혈청 알부민에 대한 결합: MpA는 각각 KD = 8 nM, 67 nM 및 38 nM의 친화도로 인간, 사이노몰구스 및 마우스 혈청 알부민에 교차 반응성인 것으로 결정되었다. 따라서, MpA는 사이노몰구스 또는 마우스 혈청 알부민보다 인간 혈청 알부민에 대해 4-8배 더 높은 친화도를 갖는다. 인간 대 사이노몰구스 또는 마우스의 서열 동일성이 각각 93% 및 72%이기 때문에 마우스 및 사이노에 대한 상이한 친화도는 에피토프 영역의 개별 돌연변이로 인한 것일 수 있다. 칩 표면에 대한 어느 정도의 비특이적 결합이 가장 높은 적용 농도의 MSA 및 CSA(33-100 nM)에 대해 관찰되었지만 혈청 알부민 결합에 대해 결정된 동역학 매개변수는 예상 범위에 속한다.
FAP에 대한 결합: MpA는 인간 및 사이노몰구스 FAP에 교차 반응하지만 mFAP에는 교차 반응하지 않는 것으로 결정되었다. MpA는 KD = 0.4 ± 0.2 nM의 친화도로 hFAP에 결합하고 KD = 0.8 nM으로 cFAP에 결합한다. 인간 및 사이노몰구스 FAP에 대한 MpA의 결합은 1.3E-04 s-1의 느린 오프 속도를 특징으로 한다. 인간과 사이노몰구스 FAP 사이의 유사한 친화도는 97%의 서열 동일성과 일치한다.
결론:
표면 플라즈몬 공명 측정은 MpA가 각각 13±5 pM 및 14±8 pM의 겉보기 친화도로 인간 및 사이노몰구스 4-1BB에 단단히 결합하는 것으로 나타났다. MpA는 m4-1BB에 교차 반응하지 않으며, 잠재적으로 56%의 세포외 도메인의 낮은 서열 유사성으로 인해 발생한다. MpA는 각각 8 nM, 67 nM 및 38 nM의 친화도로 인간, 사이노몰구스 및 마우스 혈청 알부민에 대한 결합을 보여주었다. 또한, MpA는 나노몰 이하 범위에서 인간 및 사이노몰구스 FAP에 결합하는 반면, 90%의 비교적 높은 서열 유사성에도 불구하고 마우스 FAP에 대한 교차 반응성은 검출될 수 없는 것으로 나타났다.
실시예 3 - 표면 플라즈몬 공명에 의해 분석된 4- 1BB , FAP 및 인간 혈청 알부민에 대한 MpA의 동시 결합
다음 실험은 인간 4-1BB, 인간 FAP 및 인간 혈청 알부민 각각에 대한 SEQ ID NO: 6을 포함하는 다중특이적 결합 단백질 A(MpA)의 동시 결합을 분석하기 위해 수행된 표면 플라즈몬 공명 실험을 설명한다.
분석은 다음 설정으로 수행되었다: 결합 측정을 시작하기 전에 비오티닐화된 인간 4-1BB를 NeutrAvidin 코팅된 NLC 칩 표면에 고정했다. 첫 번째 단계에서 4-1BB의 느린 오프 속도를 갖는 MpA를 첨가했다. 두 번째로, hFAP를 두 번째 표적으로 적용한 다음 HSA를 세 번째이자 최종 표적으로 첨가했다.
SPR 측정은 ProteOn XPR36 기기(BioRad)를 사용하여 수행되었다. 0.005% Tween 20을 함유하는 PBS pH 7.4를 실행 완충액으로 사용했다. 360 RU의 10 nM 비오티닐화된 인간 4-1BB(bio.h4-1BB-Fc)를 NeutrAvidin 코팅된 NLC 센서 칩에 고정했다. bio.4-1BB 고정화 칩에 연속적으로 100 nM MpA, 결합 180초, 해리 60초, 100 nM hFAP 결합 180초, 해리 60초 및 100 nM 인간 혈청 알부민 결합 180초, 해리 1000초가 독립적인 분석 단계로 적용되었다. 설정은 MpA가 이미 4-1BB에 결합된 경우에만 hFAP 및 HSA의 결합을 허용한다. 이 설정에 대한 요구 사항은 MpA가 세 번째 표적(HSA)을 적용하기 전에 빠른 신호 손실을 방지하기 위해 높은 친화도로 4-1BB 및 FAP에 결합한다는 것이다. 모든 대조군을 포함하기 위해 다른 분석물 레인이 사용되었다. 신호는 L1 및 A6의 PBST 처리된 대조군 레인에 대해 이중 참조되었다. 또한, 고정된 리간드의 양(RU)을 분석하여 다음 공식을 사용하여 복합체의 결합 화학량론을 결정할 수 있었다: 원자가리간드 = (Rmax x MW리간드) / (R리간드*MW분석물).
먼저, 결합 측정을 시작하기 전에 인간 4-1BB의 약 360개의 반응 단위(RU)를 SPR 칩에 고정했다. 첫 번째 단계에서, 200 RU의 MpA가 고정된 h4-1BB에 결합되었다(도 6에 주입(a)로 표시됨). 두 번째로, hFAP가 주입되었고 MpA에 대한 결합이 표시될 수 있었다(220 RU의 증가로 표시됨)(도 6에 주입(b)로 표시됨). 세 번째로, HSA가 주입되었다(도 6에 주입(c)로 표시됨). 후속 결합 단계에서 인간 혈청 알부민의 결합은 세 표적 모두에 대한 MpA의 동시 결합이 가능함을 나타낸다. 또한, 각 주입 단계 후 반응 단위의 최대량을 분석하여 결합 원자가를 정량화할 수 있었다(표 4에 요약됨).
[표 4]
Figure pct00004
따라서, HSA 결합 시 약 280의 RU는 2개의 HSA 분자가 MpA에 동시에 결합할 수 있음을 의미한다. 유추에 의해, MpA 대 4-1BB 및 FAP의 결합 비는 1:1로 결정되었다. h4-1BB에 대한 MpA의 2가(낮은 오프 속도)로 인해 관찰된 높은 겉보기 결합 친화성과 함께, MpA가 2개의 고정된 h4-1BB 분자에 결합할 수 있는 것으로 결정되었다.
실시예 4 - 4-1BB를 통한 인간 T 세포 활성화의 동시 자극
연구의 목적은 1차 인간 CD8 T 세포의 활성화를 공동 자극하고 시험관내에서 1차 인간 CD8 T 세포에 의한 항-CD3 매개 IFNγ 생산을 향상시키는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 다중특이적 결합 단백질 A(MpA)의 효능을 결정하는 것이었다. 1차 인간 CD8 T 세포에 의한 항-CD3 매개 IFNγ 생산을 향상시키는 MpA의 기능적 활성을 여러 다른 4-1BB 작용제 분자와 비교하였다. MpA는 플레이트 코팅된 FAP의 존재 하에 1-2 nM의 EC50으로 용량 의존적 방식으로 CD8 T 세포에 의한 IFNγ 분비를 향상시킬 수 있었다. 따라서, MpA는 FAP에 결합될 때 1차 인간 CD8 T 세포에 강력한 공동 자극을 제공할 수 있는 것으로 결정되었다. MpA의 효능은 4-1BB의 천연 삼량체 리간드와 항-FAP 항체의 융합인 항-FAP-4-1BBL(EC50 1-2 nM)에 필적했다.
물질 및 방법:
FAP -클러스터링을 사용한 시험관내 인간 T 세포 IFNγ 방출 분석: 버피 코트는 취리히 헌혈 센터에서 수득하였고 PBS로 희석했다. 그런 다음 PBMC를 류코셉 튜브를 사용하여 밀도 원심분리에 의해 단리했다. 여러 세척 단계 후, 제조업체의 권장 사항에 따라 음성 선택 인간 CD8 T 세포 단리 키트를 사용하여 CD8 T 세포를 PBMC로부터 정제했다. CD8 T 세포(1x105/웰)를 0.5 ㎍/ml 항-CD3 클론 OKT-3 및 Neutravadin으로 미리 코팅한 96-웰 플레이트에 접종한 후 다양한 농도의 시험 항목의 존재 하에 비오티닐화된 hFAP를 접종했다. 배양물을 37℃, 5% CO2에서 96시간 동안 배양한 후 상층액을 새로운 96-웰 플레이트로 제거하고 분석할 때까지 -20℃에서 보관했다. 상층액의 IFNγ 농도는 제조업체의 지침에 따라 인간 IFN-감마 DuoSet ELISA를 사용하여 검출되었다. EC50 값은 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 4개 매개변수 로지스틱 피팅 모델로 데이터를 피팅하여 결정했다.
항- Fc -클러스터링을 사용한 시험관내 인간 T 세포 IFNγ 방출 분석: 버피 코트는 취리히 헌혈 센터에서 수득하였고 PBS로 희석했다. PBMC는 류코셉 튜브를 사용하여 밀도 원심분리에 의해 단리되었다. 여러 세척 단계 후, 제조업체의 권장 사항에 따라 음성 선택 인간 CD8 T 세포 단리 키트를 사용하여 CD8 T 세포를 PBMC로부터 정제했다. CD8 T 세포(1x105/웰)를 1 ㎍/ml의 항-CD3(클론 OKT-3) 및 다양한 농도의 항-4-1BB 항체로 미리 코팅한 96웰 플레이트에 접종하고, 항-인간 IgG을 통해 웰에도 코팅했다. 배양물을 37℃, 5% CO2에서 96시간 동안 배양한 후 상층액을 새로운 96-웰 플레이트로 제거하고 분석할 때까지 -20℃에서 보관했다. 상층액의 IFNγ 농도는 제조업체의 지침에 따라 인간 IFN-감마 DuoSet ELISA를 사용하여 검출된다.
EC 50 결정: EC50 값은 GraphPad Prism 버전 7.02를 사용하여 로그 모드에서 x 값(농도)을 변환하고 EC50 값 결정을 위한 가변 기울기(4개 매개변수) 방정식을 사용한 응답 대 비선형 모드 로그(작용제)에 피팅하여 결정했다.
음성 대조군: SEQ ID NO: 38을 포함하는 다중도메인 단백질 C(MpC)는 FAP에 대한 결합에 대한 MpA의 약리학적 활성의 의존성을 입증하기 위해 음성 대조군으로 사용된다. MpA와 유사하게, MpC는 하기 5개의 안키린 반복 도메인으로 구성된다. HSA - 비-FAP - 4-1BB - 4-1BB - HSA. HSA 및 4-1BB 결합 도메인은 MpA에서와 동일하지만 "비-FAP" 도메인은 결합 표적이 없는 대조 안키린 반복 도메인이다. 검출을 용이하게 하기 위해 헥사-히스티딘 태그가 추가되었다.
마우스 대리물 : SEQ ID NO: 37을 포함하는 다중특이적 결합 단백질 B(MpB)는 하기 5개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 마우스 대리물이다: HSA - FAP* - 4-1BB - 4-1BB - HSA. HSA 및 4-1BB 결합 도메인은 MpA에서와 동일하다. FAP*는 마우스 FAP와 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 안키린 반복 도메인이다. MpB는 인간화 마우스 모델에서 약리학적 활성을 입증하는 데 사용되었다. 검출을 용이하게 하기 위해 헥사-히스티딘 태그가 추가되었다.
항- FAP -4- 1BBL: 항-FAP-4-1BBL은 항-FAP 항체에 융합된 천연 인간 4-1BB 리간드(4-1BBL)를 포함하는 융합 단백질이다(국제공개 WO 2016/075278호).
결과 및 토의:
MpA는 생체외 인간 CD8 T 세포의 IFNγ 분비를 향상시킨다: MpA는 플레이트에 결합된 FAP에 대한 가교를 통해 세포에 제시될 때 인간 CD8 T 세포에서 4-1BB를 활성화하는 능력에 대해 평가되었다. MpA는 1-2 nM의 EC50으로 농도 의존적 방식으로 CD8 세포의 IFNγ 분비를 유도했다(도 7). 반대로, MpA와 동일한 4-1BB 결합 도메인을 함유하지만 FAP 결합 도메인은 함유하지 않는 음성 대조군 MpC는 CD8 세포의 자극을 야기하지 않았으며, 이는 FAP를 통한 MpA의 클러스터링이 CD8 T 세포의 활성화에 필수적임을 시사한다. 항-FAP 항체에 융합된 천연 인간 4-1BB 리간드를 함유하는 항-FAP-4-1BBL 분자는 1-2 nM의 EC50으로 이 분석에서 유사한 효능을 나타냈다(도 7). MpB, 마우스 및 인간 FAP에 결합하는 FAP 결합 도메인 및 MpA와 동일한 4-1BB 결합 도메인을 포함하는 MpA의 마우스 대리물은 또한 1-2 nM의 필적하는 EC50으로 1차 인간 CD8 T 세포를 활성화할 수 있었다. MpA-His는 1-3 nM의 유사한 EC50을 가졌다. 대표적인 실험의 EC50 값은 표 5에 요약되어 있다.
[표 5]
Figure pct00005
항-4- 1BB 항체의 공동-자극 활성은 Fc -가교에 따라 다르다: 항-4-1BB mAbs는 단리된 인간 1차 CD8 T 세포의 항-CD3-매개 활성화를 향상시킨다(문헌[Fisher et al., Cancer Immunol Immunother 61, 1721-1733 (2012)]. 항-4-1BB mAbs의 작용 활성은 Fc-수용체를 통한 결합된 항체의 클러스터링 또는 플레이트 표면 상의 코팅에 따라 다른 것으로 나타났다. 가용성 형태 또는 플레이트 코팅된 항-Fc 항체에 결합된 단리된 인간 1차 CD8 T 세포에 의한 항-CD3 매개 IFNγ 생산을 향상시키는 항-4-1BB mAbs 20H4.9(IgG4; 미국 특허 제7,288,638호) 및 MOR-7480(국제공개 WO 2012/032433호)의 효능을 비교하였다. 이 분석에서, 항-4-1BB mAb 20H4.9는 0.97 nM의 EC50으로 Fc-가교 없이 IFNγ 생산을 향상시킬 수 있었다. 코팅된 항-Fc를 통한 가교는 효능을 0.04 nM의 EC50으로 약 25배 증가시켰다. 반면에, 항-4-1BB mAb MOR-7480은 시험된 임의의 농도에서 가용성 형태의 작용제 활성을 나타내지 않았다. 항-4-1BB mAb MOR-7480의 Fc 매개 가교는 0.42 nM의 EC50으로 향상된 IFNγ 생산을 야기했다. 항-Fc 항체를 통한 가교에 의한 항-4-1BB mAbs 20H4.9 및 MOR-7480의 효능 비교는 이 분석에서 항-4-1BB mAb 20H4.9의 효능보다 대략 10배 우수했다. 항-FAP-4-1BBL은 플레이트 코팅된 항-Fc를 통해 가교될 때 0.11 nM의 EC50으로 효능을 나타냈다. EC50 값이 표 6에 요약되어 있다.
[표 6]
Figure pct00006
결론:
이 연구의 목적은 CD8 T 세포의 활성화를 공동 자극하고 시험관내에서 1차 인간 CD8 T 세포에 의한 항-CD3 매개 IFNγ 생산을 향상시키는 MpA의 효능을 결정하고 이를 항-4-1BB 단일클론 항체 20H4.9 및 MOR-7480의 효능과 비교하는 것이었다. 1차 인간 CD8 T 세포에 의한 항-CD3 매개 IFNγ 생산을 향상시키는 MpA의 기능적 활성을 여러 다른 4-1BB 작용제 분자와 비교하였다. MpA는 플레이트 코팅된 FAP의 존재 하에 1-2 nM의 EC50으로 용량 의존적 방식으로 CD8 T 세포에 의한 IFNγ 분비를 향상시킬 수 있었다. 비-FAP-표적화된 대조군인 MpC는 IFNγ 생산의 향상을 나타내지 않았다. 따라서, MpA는 FAP에 결합될 때 1차 인간 CD8 T 세포에 강력한 공동 자극을 제공할 수 있는 것으로 결정되었다. MpA의 효능은 4-1BB의 천연 삼량체 리간드와 항-FAP 항체의 융합인 항-FAP-4-1BBL(EC50 1-2 nM)에 필적했다.
CD8 T 세포에 의한 항-CD3 매개 IFNγ 생산을 향상시키는 항-4-1BB mAbs 20H4.9 및 MOR-7480의 기능적 활성을 FAP 대신 항-Fc 항체로 코팅된 플레이트를 사용하여 분석 형식의 변형으로 평가하였다. 두 항체 모두 완전한 활성을 위해 항-Fc 항체를 통한 가교를 필요로 했지만 항체의 효능에서 몇 가지 차이가 나타났다. 항-4-1BB mAb 20H4.9는 가교 없이 일부 활성(EC50 0.97 nM)을 나타낸 반면, 항-4-1BB mAb MOR-7480은 시험된 전체 농도 범위에 걸쳐 가교 없이 불활성이었다. 코팅된 항-Fc의 존재 하에, 항-4-1BB mAb MOR-7480은 CD8 T 세포 활성화(EC50 0.42 nM)를 향상시킬 수 있었지만 항-4-1BB mAb 20H4.9는 약 10배 더 높은 효능(EC50 0.04 nM)을 나타냈다. 항-4-1BBL은 또한 FAP-의존적 분석 설정에서 1-2 nM의 EC50과 비교하여 0.11 nM의 EC50으로 이 Fc 가교 분석 형식에서 활성이었다. 따라서, 분석 형식은 분자의 전반적인 효능에 영향을 미치므로 FAP 의존적 또는 항-Fc 의존적 분석 형식으로 평가된 다양한 분자의 EC50 값을 직접 비교해서는 안 된다. 따라서, Fc-특이적 항-IgG를 사용하는 분석에서 시험된 항체의 더 낮은 EC50 값이 반드시 FAP-표적화된 4-1BB-특이적 시약과 비교하여 더 나은 작용제 효능을 갖는다는 것을 의미하지는 않는다.
실시예 5 - 마우스에서 다중특이적 결합 단백질 A(MpA)의 약동학
약동학(PK) 연구의 목적은 1 mg/㎏의 표적 용량 수준에서 단일 정맥내 투여 후 마우스에서 SEQ ID NO: 6을 포함하는 다중특이적 결합 단백질 A(MpA)의 PK 특성을 평가하는 것이었다.
단일 정맥내 일시 주사 후, 농도-시간 프로파일은 화합물 투여 후 약 6시간까지 지속된 혈청 농도의 빠른 초기 감소를 나타내고 6시간에서 168시간(분석된 마지막 시점) 사이의 단일 지수 감소와 유사한 느린 감소를 나타낸다. 44.8시간의 겉보기 평균 소실 반감기가 결정되었다. 동일한 시점에서 측정된 혈청 농도의 피험자 간 변동성은 낮았다(< 인자 2).
비구획 분석을 사용하여, 노출(AUCinf), 전신 청소율(Cl), 및 분포 부피는 다음과 같이 계산되었다: AUCinf=15600 h*(nmol/L), Cl=0.826 mL/(h*㎏), 및 Vss=51.5 mL/㎏. 분포 부피에 대해 결정된 값은 MpA가 동물의 전신 순환에 크게 제한되어 있음을 나타낸다.
재료/방법:
생체내 실험: 건강한 암컷 BALB/c 마우스(투여 전 체중 20.6-23.3 g)는 프랑스 Saint Berthevin Cedex의 Janvier에 의해 공급되었다. 시험 전 기간과 시험 기간 동안 동물은 종에 적합한 케이지에서 그룹으로 수용되었다. 동물은 알려진 포뮬레이션(No. 3437, Provimi Kliba, Kaiseraugust, Switzerland)의 표준 실험실 식단에 자유롭게 접근할 수 있었고 가정용 품질의 물을 자유롭게 사용할 수 있었다. 실험 시작 전에 동물을 개별적으로 표시했다.
MpA는 6마리 마우스 각각의 꼬리 정맥에 단일 정맥내 일시 주사로 투여되었다. 목표 용량 수준은 5 mL/㎏의 적용 부피로 1 mg/㎏이었다. MpA는 인산염 완충 식염수(PBS) 용액(Gibco Life Technologies, Grand Island, New York, USA, Ref.: 10010-015)에서 제형화되었다.
마우스를 동일한 수의 동물의 두 그룹으로 나누었다. 각 마우스에서 4개의 혈청 샘플을 수집했다. Multivette 600 튜브에 화합물을 투여한 후 5분, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 168시간에 약동학 조사를 위한 혈액 샘플(약 50 μl/샘플)을 복재 정맥에서 수집했다. 각각의 샘플링 시점에 대한 개별 동물의 할당은 혈청 농도-시간 데이터 표(아래 표 XXX)에 제공된다. 혈액을 실온에서 약 30분 동안 유지하여 응고시킨 후 원심분리(5분/12000g/4℃)하였다. 혈청을 동결하고 분석 보류 동안 -20℃에서 보관했다.
생물학적 분석(ELISA): PBS 중 1.9 nmol/L 토끼 단일클론 항-DARPin® 항체 1-1-1 웰당 100 μl를 4℃에서 밤새 NUNC Maxisorb ELISA 플레이트에 코팅하였다. 웰당 300 μl PBST(0.1% Tween20이 보충된 PBS)로 5회 세척한 후, 웰은 Heidolph Titramax 1000 쉐이커 (450 rpm)에서 실온(RT)에서 1시간 동안 0.25% 카제인(PBST-C)이 보충된 200 μl PBST로 차단되었다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. 100 μl의 희석된 혈청 샘플(1:5 희석 단계에서 1:20 - 1:312500) 또는 MpA 표준 곡선 샘플(1:3 희석 단계에서 0 및 50 - 0.0008 nmol/L)을 2시간 동안 RT에서 450rpm에서 진탕했다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. 그런 다음 웰을 PBST-C에서 1시간 동안 RT, 450 rpm에서 100 μl 인간 항-DARPin® 단일클론 Ab 1.4.8(500 ng/mL)과 함께 배양했다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. 그런 다음 웰을 100 μl 염소 항-인간 IgG/HRP접합체(Ab15, PBST-C 중 500 ng/mL)와 함께 배양하고 RT, 450 rpm에서 1시간 동안 배양했다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. ELISA는 50 μl/웰 TMB 기질 용액을 사용하여 5분 동안 전개되었고 50 μl 1 mol/L H2SO4를 첨가하여 중단되었다. 450 nm에서의 흡광도와 620 nm에서의 흡광도의 차이를 계산하였다. 샘플은 두 개의 다른 플레이트에서 2회 측정되었다. 희석된 혈청 샘플의 흡광도 값을 표준 곡선과 비교하여 샘플의 혈청 농도를 계산했다. 분석의 LLOQ는 1 nmol/L이었다.
약동학 분석: 다음 약동학적 매개변수를 계산했다: AUCinf, AUClast, AUC_%extrapol, Cmax, Tmax, Cl_pred, Vss_pred, t1/2.
최대 혈청 농도(Cmax) 및 발생 시간(Tmax)은 혈청 농도-시간 프로파일에서 직접 수득하였다. 혈청 농도-시간 곡선 아래 면적(AUCinf)은 최종 샘플링 지점(Tlast)까지 선형 사다리꼴 공식에 의해 결정되었고 말단 상의 단일 지수 감소를 가정하여 무한대로 외삽했다. 무한대까지의 외삽은 Clast / λz를 사용하여 수행되었으며, 여기서 λz는 로그 선형 회귀에 의해 추정된 최종 속도 상수를 나타내고 Clast는 최종 로그 선형 회귀에 의해 Tlast에서 추정된 농도를 나타낸다. 이 외삽에 사용된 혈청 농도-시간 포인트는 혈청 농도-시간 데이터 표(아래 표 7)에서 (*)로 표시된다. 총 혈청 청소율(Cl_pred) 및 겉보기 소실 반감기는 다음과 같이 계산되었다: Cl_pred = i.v. 용량 / AUCinf 및 t1/2 = ln2 / λz. 분포의 정상 상태 부피Vss는 다음과 같이 결정되었다: Vss = i.v. 용량 · AUMCinf / (AUCinf)2. AUMCinf는 AUCinf의 계산에 대해 설명한 것과 동일한 외삽 절차를 사용하여 무한대로 외삽된 약물 농도-시간 곡선의 첫 번째 모멘트 아래의 전체 면적을 나타낸다.
nmol/L로 주어진 농도를 기반으로 PK 매개변수를 계산하기 위해 mg/㎏으로 제공된 용량 값을 77713 g/mol의 MpA의 분자량을 사용하여 nmol/㎏으로 변환했다. 이에 의해 1 mg/㎏의 용량 수준이 12.87 nmol/㎏으로 전환되었다.
결과 및 토의:
생체내 동물 실험: MpA는 꼬리 정맥에 단일 정맥내 일시 주사로 암컷 BALB/c 마우스에 투여되었다. 연구에서 목표 용량 수준은 1 mg/㎏이었다.
각 연구에 대해, 6마리의 마우스를 동일한 수의 동물의 두 그룹으로 나누었다. 약동학 조사를 위해 각 마우스로부터 4개의 혈청 샘플을 다양한 시점에서 복재 정맥에서 수집했다. 각각의 샘플링 시점에 대한 개별 동물의 할당은 혈청 농도-시간 데이터 표(아래 표 7)에 제공된다. 분석 보류 동안 혈청을 20℃에서 동결했다.
생체내 실험에서 주요 문제 및 약물 관련 부작용은 보고되지 않았다.
생물학적 분석(ELISA): 희석된 혈청 샘플에서 MpA를 포획하기 위해 플레이트-결합된 토끼 단일클론 항-DARPin® IgG 1-1-1을 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 MpA의 혈청 농도를 결정했다. 인간 항-DARPin® 항체 1.4.8에 이어 염소 항-인간 IgG 및 홀스래디시 퍼옥시다아제(HRP)의 컨쥬게이트가 검출을 위해 사용되었다. 각 혈청 샘플의 MpA 농도는 표준 곡선을 사용하여 결정되었다.
개별 및 평균 혈청 농도-시간 데이터는 하기 표 7에 요약되어 있다. 동일한 시점에서 측정된 혈청 농도의 피험자 간 변동성은 낮았다(< 인자 2).
약동학 분석: 1 mg/㎏의 단일 정맥 투여 후 BALB/c 마우스에서 MpA의 개별 혈청 농도-시간 데이터가 표 7에 제시되어 있다. 혈청 농도의 그룹 평균(+/- max/min) 또는 전체 평균(+/- max/min)을 나타내는 해당 프로파일은 각각 도 8과 도 9에 제시되어 있다.
평균 농도-시간 데이터를 사용하여 비구획 분석(NCA)을 수행했다. 반감기 결정을 위해 선택된 데이터 포인트는 표 7에 제공된다(별표로 표시).
[표 7]
Figure pct00007
1 mg/㎏ MpA의 단일 정맥내 일시 주사 후, 농도-시간 프로파일은 화합물 투여 후 약 6시간까지 지속된 혈청 농도의 빠른 초기 감소를 나타내고 6시간에서 168시간(분석된 마지막 시점) 사이의 단일 지수 감소와 유사한 느린 감소를 나타낸다. 44.8시간의 겉보기 평균 소실 반감기가 결정되었다.
비구획 분석을 사용하여, 노출(AUCinf), 전신 청소율(Cl), 및 분포 부피는 다음과 같이 계산되었다: AUCinf=15600 h*(nmol/L), Cl=0.826 mL/(h*㎏), 및 Vss=51.5 mL/㎏. 분포 부피에 대해 결정된 값은 MpA가 동물의 전신 순환에 크게 제한되어 있음을 나타낸다.
결론: 약동학 분석은 MpA가 정맥내 일시 주사에 의해 1 mg/㎏의 시험 화합물을 투여한 후 마우스에서 44.8시간의 명백한 소실 반감기를 갖는다는 것을 나타낸다. 비구획 분석을 사용하여, 노출(AUCinf), 전신 청소율(Cl), 및 분포 부피는 다음과 같이 계산되었다: 15600 h*(nmol/L), 0.826 mL/(h*㎏) 및 51.5 mL/㎏. 분포 부피에 대해 결정된 값은 MpA가 전신 순환에 크게 제한되어 있음을 나타낸다.
실시예 6 - 사이노몰구스 원숭이에서 MpA의 약동학적 분석
목적은 0.1, 1 및 10 mg/㎏의 단일 용량을 30분에 걸쳐 정맥내 주입한 후 단백질 경험이 없는 사이노몰구스 원숭이에서 추가 N-말단 헥사-히스티딘 태그(His-MpA)를 포함하는 MpA의 PK 특성을 평가하는 것이었다. 본 연구를 위해 각 용량 수준에 대해 한 마리의 원숭이(Macaca fascicularis)가 사용되었다. 혈청 샘플을 13일 기간 동안 채취했다. His-MpA의 혈청 농도는 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 항-His-MpA 항체(AMA)의 측정은 ELISA로 측정하였다.
재료/방법:
생체내 동물 실험: 암컷 동물에게 PBS + 0.05% Tween 20 제형 중 His-MpA를 30분에 걸쳐 정맥내 주입을 통해 0.1, 1 및 10 mg/㎏의 목표 용량 수준 및 5.0 mL/㎏의 투여 부피로 투여했다. 약동학 평가를 위한 샘플은 투여 전 및 주입 종료 10분 및 3, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 192, 240, 288 및 312시간 후의 명목 시점에서 다시 수집되었다. 투여 전 샘플은 His-MpA 농도에 대해 측정되지 않았다. AMA 측정을 위한 샘플은 투여 전(-4일) 및 주입 종료 96, 120, 144, 192, 240, 288 및 312시간 후의 명목 시점에 다시 수집되었다. 120 및 288시간에 채취한 샘플은 항-약물 항체(ADA)에 대해 측정되지 않았다. 명목 샘플링 시점은 실제로 최대 48시간의 샘플에 대해 충족되었으며 이후 약간 변경되었다(72 +/- 0.25시간, 96-288 +/- 0.75시간, 312 +/- 1시간). 농도-시간 및 AMA-시간 데이터 평가의 평가에는 명목 시점이 사용되었다.
혈청 샘플에서 His - MpA를 측정하기 위한 ELISA: PBS 중 10 nM 폴리클론 염소 항-토끼 IgG 항체(Ab18) 100 μl를 4℃에서 밤새 NUNC Maxisorb ELISA 플레이트에 코팅하였다. 웰당 300 μl PBST(0.1% Tween20이 보충된 PBS)로 5회 세척한 후, 웰은 Heidolph Titramax 1000 쉐이커 (450 rpm)에서 실온(RT)에서 1시간 동안 0.25% 카제인(PBST-C)이 보충된 200 μl PBST로 차단되었다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. PBST-C 중 100 μl 5 nM 토끼 항-DARPin® 1-1-1 항체를 첨가하고 플레이트를 RT(22℃)에서 궤도 진탕(450 rpm)과 함께 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다.
100 μl의 희석된 혈청 샘플(1:5 희석 단계에서 1:20 - 1:62500) 또는 His-MpA 표준 곡선 샘플(1:3 희석 단계에서 0 및 50 - 0.0008 nmol/L)을 2시간 동안 RT에서 450 rpm에서 진탕했다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다.
그런 다음 웰을 100 μl 뮤린 항-RGS-His-HRP IgG(Ab06, PBST-C 중 1:2000)와 함께 배양하고 RT, 450 rpm에서 1시간 동안 배양했다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. ELISA는 50 μl/웰 TMB 기질 용액을 사용하여 5분 동안 전개되었고 50 μl 1 M H2SO4를 첨가하여 중단되었다. 450 nm에서의 흡광도와 620 nm에서의 흡광도의 차이를 계산하였다. 샘플은 두 개의 다른 플레이트에서 2회 측정되었다. 분석의 LLOQ는 1 nmol/L이었다.
혈청 샘플에서 항- His - MpA 항체를 측정하기 위한 ELISA: PBS 중 100 μl의 1 ㎍/mL His-MpA를 4℃에서 밤새 NUNC Maxisorb ELISA 플레이트에 코팅했다. 웰당 300 μl PBST(0.1% Tween20이 보충된 PBS)로 5회 세척한 후, 웰을 Heidolph Titramax 1000 쉐이커 (450 rpm)에서 실온(RT)에서 1시간 동안 0.25% 카제인(PBST-C)이 보충된 300 μl PBST로 차단했다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. 희석된 혈청 샘플 100 μl(시작 희석 1:100(=최소 요구 희석, MRD) - 1:5 희석 단계에서 1: 4882812500) 또는 항-DARPin® 항체 양성 대조군(샘플과 동일한 방식으로 희석)을 적용했다. 컷 포인트 결정을 위해 낮은 신호를 발생시키는 것으로 사전 시험된 12마리의 나이브 사이노몰구스 원숭이 혈청을 1:100의 MRD에서 동일한 플레이트에 적용했다(100 μl). 플레이트를 450 rpm에서 진탕하면서 RT에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. 그런 다음 웰을 100 μl 염소 항-hIgG-HRP(Ab15, PBST-C 중 0.5 ㎍/mL)와 함께 배양하고 RT, 450 rpm에서 45분 동안 배양했다. Ab15는 원숭이 IgG에 교차 반응하며 사이노몰구스 원숭이의 IgG를 인식한다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. ELISA는 50 μl/웰 TMB 기질 용액을 사용하여 5분 동안 전개되었고 50 μl 1 M H2SO4를 첨가하여 중단되었다. 450 nm에서의 흡광도와 620 nm에서의 흡광도의 차이를 계산하였다. 샘플은 두 개의 다른 플레이트에서 2회 측정되었다.
컷 포인트 값은 이 12개의 컷 포인트 혈청의 표준 편차에 정규 분포 계수 2.576(모든 값의 99%가 정규 분포 내에 있음) + 12개의 컷 포인트 혈청의 평균값을 곱하여 12개의 컷 포인트 혈청의 광학 밀도로부터 각 플레이트에 대해 계산되었다.
혈청 샘플의 AMA 역가는 4-파라미터 피팅 알고리즘을 사용하여 혈청 적정 곡선과 컷 포인트 값의 교차점에서 계산되었다. MRD에서 컷 포인트 값 미만의 광학 밀도를 야기한 혈청 샘플은 AMA 음성으로 간주되었다.
약동학 분석: 약동학 데이터 분석은 노스캐롤라이나주 파사이트에 있는 Phoenix 64의 일부로 WinNonlin 프로그램 버전 7.0을 사용하여 수행되었다. 정맥내 주입을 통해 투여된 동물의 농도-시간 데이터에 기초한 약동학적 매개변수의 계산을 비구획 분석으로 수행하였다(NCA 모델 200-202, IV 주입, 선형 사다리꼴 선형 보간, 주입 시간은 시점에서 0.5시간을 뺀 시간부터 0시간까지 지속되는 0.5시간으로 설정되었음). 다음 약동학적 매개변수를 계산했다:
AUCinf, AUClast, AUC_%extrapol, Cmax, Tmax, Cl_pred, Vss_pred, t1/2
혈청 농도-시간 곡선 아래 면적(AUCinf)은 최종 샘플링 지점(Tlast)까지 선형 사다리꼴 공식에 의해 결정되었고 말단 상의 단일 지수 감소를 가정하여 무한대로 외삽했다. 무한대까지의 외삽은 Clast / λz를 사용하여 수행되었으며, 여기서 λz는 로그 선형 회귀에 의해 추정된 최종 속도 상수를 나타내고 Clast는 최종 로그 선형 회귀에 의해 Tlast에서 추정된 농도를 나타낸다. 이 외삽에 사용된 혈청 농도-시간 포인트는 혈청 농도-시간 데이터 표에서 (*)로 표시되며 도 13 내지 도 17에 제공된다. 총 혈청 청소율(Cl_pred) 및 겉보기 소실 반감기는 다음과 같이 계산되었다: Cl_pred = i.v. 용량 / AUCinf 및 t1/2 = ln2 / λz. 분포의 정상 상태 부피Vss는 다음과 같이 결정되었다: Vss = i.v. 용량 · AUMCinf / (AUCinf)2. AUMCinf는 AUCinf의 계산에 대해 설명한 것과 동일한 외삽 절차를 사용하여 무한대로 외삽된 약물 농도-시간 곡선의 첫 번째 모멘트 아래의 전체 면적을 나타낸다.
nmol/L로 주어진 농도를 기반으로 PK 매개변수를 계산하기 위해 mg/㎏으로 제공된 용량 값을 78968 g/mol의 His-MpA의 분자량을 사용하여 nmol/㎏으로 변환했다. 노출 데이터의 용량-정규화는 mg/㎏으로 주어진 용량을 사용하여 수행되었다.
토의:
30분 주입으로 제공된 시험 화합물의 0.1 mg/㎏의 단일 정맥내 투여 후 사이노몰구스 원숭이(n=1)에서 His-MpA의 혈청 농도-시간 프로파일이 도 10에 제시된다. 동일한 동물에서 ADA 역가-시간 추적과 조합된 혈청 농도-시간 프로파일이 또한 도 10에 제시된다. 1 mg/㎏ 또는 10 mg/㎏을 주입한 동물에 대한 비교 가능한 데이터 세트는 각각 도 11과 도 12에 제시된다. 다른 용량 수준을 받은 동물의 결합된 혈청 농도-시간 프로파일은 도 13에 제시된다. ADA에 의해 영향을 받는 것으로 추정된 데이터 포인트가 제외된 다양한 용량 수준을 받은 동물의 결합된 혈청 농도-시간 프로파일은 도 14에 제시된다. 다른 용량 수준을 받은 동물의 결합된 용량-정규화된 농도-시간 프로파일이 도 15에 제시된다. 동물의 투여 전 샘플에서 AMA(또는 매우 낮은 신호)가 검출되지 않았다. 동물에 0.1, 1 및 10 mg/㎏의 용량 수준으로 His-MpA를 정맥내 주입한 후, 투여 후 144시간까지 AMA 역가의 증가가 관찰되지 않았다. 동물에서 AMA 생성의 시작은 모든 용량 그룹에서 144시간에서 192시간 사이에 관찰되었다. AMA 역가의 증가는 동물에서 His-MpA 노출의 급속한 손실과 결합되었다. AMA에 의해 영향을 받지 않는 것으로 추정된 동물의 농도-시간 데이터는 비구획 분석에 의해 PK 매개변수를 계산하는 데 사용되었다. 0.1, 1 및 10 mg/㎏의 단일 정맥내 주입 후 동물에 대해 계산된 매개변수는 표 9에 제시된다.
[표 9]
Figure pct00008
반감기를 계산하는 데 사용된 농도-시간 데이터 포인트는 각각 용량 수준 0.1, 1 및 10 mg/㎏에 대해 별표로 표 10에 강조 표시되어 있다.
[표 10]
Figure pct00009
His-MpA를 0.1, 1, 10 mg/㎏의 용량 수준으로 동물에게 단일 정맥내 투여하면 30분 주입 종료 10분에서 3시간 후에 관찰된 Cmax 값이 나타났으며, 이는 용량 증가에 비례하여 증가했다(각각, 43, 337 및 3300 nmol/L). 결과적으로, 농도-시간 추적의 과정은 다른 용량 수준에 대해 유사했으며, 화합물 투여 후 대략 24시간까지 지속된 혈청 농도의 빠른 초기 감소를 특징으로 하며, 그 후 대략 144시간(0.1 및 1 mg/㎏) 또는 192시간(10 mg/㎏)까지 대략 단일 지수 감소가 뒤따랐다. 단일 지수 상의 반감기 값은 각각 0.1, 1 및 10 mg/㎏을 투여한 동물에 대해 66시간(2.8일), 68시간(2.8일) 및 109시간(4.5일)으로 계산되었다. Cmax 값은 대략 용량 비례 방식으로 용량에 따라 증가했지만, 노출(AUCinf)은 0.1에서 1 mg/㎏사이에서 용량 비례적으로 증가했지만(각각, 2859 및 25825 h*nmol/L) 1에서 10 mg/㎏ 사이에서 비례적으로 용량보다 약간 더 많았다(각각, 25825 및 405680 h*nmol/L). 이는 더 낮은 용량 수준(0.00044 및 0.00049 L/h/㎏)을 받은 동물과 비교하여 10 mg/㎏ 동물(0.00031 L/h/㎏)에 대해 더 낮은 제거율 값을 야기한다. His-MpA의 농도-시간 프로파일에서 1과 10 mg/㎏ 사이의 비-선형 약동학적 거동은 0.1 및 1 mg/㎏ 용량에서 더 짧은 반감기가 관찰되지만 더 높은 용량에서는 더 긴 반감기가 관찰된다. 분포 부피에 대해 결정된 값(0.041, 0.046 및 0.048 L/㎏)은 His-MpA가 동물의 전신 순환에 크게 제한되어 있음을 나타낸다.
결론:
사이노몰구스 원숭이에서 His-MpA의 약동학 분석은 0.1, 1 및 10 mg/㎏의 용량 수준에서 His-MpA를 30분 단회 주입한 후 Cmax 값이 용량에 따라 대략 용량 비례 방식으로 증가함을 보여준다. 노출(AUCinf)은 0.1에서 1 mg/㎏ 사이에서 용량 비례적으로 증가했지만 1에서 10 mg/㎏ 사이에서 용량 비례적으로보다 약간 더 증가하였다. His-MpA의 농도-시간 프로파일에서 1과 10 mg/㎏ 사이의 비-선형 약동학적 거동은 0.1 및 1 mg/㎏ 용량에서 더 짧은 반감기가 관찰되지만(2.8일) 더 높은 용량에서는 더 긴 반감기가 관찰된다(4.5일). 분포 부피에 대해 결정된 값은 His-MpA가 동물의 전신 순환에 크게 제한되어 있음을 나타낸다.
설명된 연구에서 파생된 His-MpA의 약동학적 매개변수는 각각의 용량 그룹에서 단일 원숭이(n=1)의 데이터를 기반으로 한다. 동물은 화합물 주입 후 144시간에서 192시간 사이에 발병하여 AMA를 생성했다. AMA 역가의 상승은 동물에서 His-MpA 노출 손실과 관련이 있다.
실시예 7 - 생체내 다중특이적 단백질 A( MpA )에 의한 T 세포 활성화 모니터링
4-1BB(CD137)는 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 공동-자극 수용체이며, 조혈 계통의 다수의 세포에서 발현된다. 가장 적절하게, 4-1BB는 활성화 후 CD8+ T 세포에서 일시적으로 상향조절되지만, NK 세포 및 활성화된 CD4+ 헬퍼 T 세포뿐만 아니라 많은 다른 유형의 림프구 및 활성화된 내피에서도 발현될 수 있다.
기억 T 세포 활성화 및 증식에 대한 MpA 처리의 효과를 평가하고 사이노몰구스 원숭이에게 단일 정맥내 투여 시 항-4-1BB mAb MOR-7480과 비교하였다. 전혈 샘플은 이 연구의 수명 기간 동안 수집되었으며 T 세포 구획의 변화는 유세포 분석으로 모니터링되었다.
방법:
샘플 처리 및 염색: 사이노몰구스 원숭이의 전혈 샘플 2x100 μl를 분취하고 패널 1 또는 패널 2로 각각 염색했다. 패널 1 및 패널 2는 염색 항체 혼합물로 구성되었다. 먼저, 모든 샘플을 RT에서 10분 동안 정제된 NA/LE 인간 BD Fc 블록(1:200)과 함께 배양한 다음 샘플 당 50 μl의 BD Horizon Brilliant 염색 완충액을 첨가했다. 다음으로, 샘플을 각각 패널 1 또는 패널 2의 항체 혼합물과 함께 암실에서 30분 동안 배양했다. 그런 다음 2 mL의 1x FACS 용해 용액을 첨가하여 샘플을 용해하고 암실에서 실온에서 15분 동안 배양했다. 염색 완충액으로 2회 세척한 후, 세포막의 고정 및 투과를 위해 Cytofix/Cytoperm 용액 250 μl를 첨가하고, 암실에서 4℃에서 20분 동안 배양하였다. 배양 후, 3 mL의 1x 펌/세척 완충액을 첨가하고 4℃에서 500 x g에서 5분 동안 원심분리했다. 1 mL의 1x 펌/세척 완충액으로 추가 세척을 수행했다. 마지막으로, 샘플을 300 μl 염색 완충액에 재현탁했다.
샘플 획득: 샘플은 FACSLyric 기기(일련 번호 R659180000061), BD Biosciences에서 측정되었다.
데이터 분석: 보정 매트릭스가 있는 원시.fcs는 FlowJo 소프트웨어 버전 10.0.2를 사용하여 평가되었다. 요약 도표는 Graph Pad Prism 소프트웨어 버전 7을 사용하여 생성된다.
결과 및 토의
연구 개요: 그룹당 한 마리의 암컷 사이노몰구스 원숭이에게 표 11에 나타낸 바와 같이 His-MpA 또는 항-4-1BB mAb MOR-7480을 주입했다.
[표 11]
Figure pct00010
3개의 정의된 시점(1. 투여 전, 2. 6일 및 3. 13일)에서 1 ml의 전혈을 응고를 방지하기 위한 K3EDTA 코팅된 튜브에 원숭이 각각으로부터 수집했다. 추가 분석을 위해 전혈 샘플을 샘플링 후 3시간 이내에 실온에서 BioAgilytix/IPM으로 옮겼다.
수집된 전혈 샘플의 평가 결과: 기억 T 세포 사이의 증식을 평가하기 위해 His-MpA 또는 항-4-1BB mAb MOR-7480의 단일 정맥내 투여 후 여러 시점에서 사이노몰구스 원숭이로부터 혈액 샘플을 단리했다. 유세포 분석을 사용하여, 원숭이에서 CD95 및 CD28을 중심 기억(CD95+ CD28+) 및 이펙터 기억(CD95+ CD28-) 하위 집합과 나이브 T 세포(CD95-CD28-)의 마커로 사용하여 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포의 기억 하위 집합을 식별했다. Ki-67은 증식 마커로 분석되었고; CD25, CD69 및 4-1BB는 이전에 설명한 대로 T 세포 활성화 마커로 분석되었다(문헌[Fisher et al., Cancer Immunology and Immunotherapy, 61:1721-1733, 2012]).
게이팅 전략: 계통 마커 CD4, CD8, CD16, CD28 및 CD95를 사용하여 다음과 같이 표적 세포 집단을 정의했다:
1. 중앙 기억 T 세포(Tcm): CD8(또는 CD4)+CD28+CD95+
2. 이펙터 기억 T 세포(Tem): CD8(또는 CD4)+CD28-CD95+
3. 나이브 T 세포(Tn): CD8(또는 CD4)+CD28-CD95-
각각의 표적 세포 집단에서, 세포 증식(Ki-67 항원) 또는 활성화(4-1BB, CD25, CD69)를 평가하기 위해 하기 특정 마커의 발현을 모니터링하였다.
항-4- 1BB mAb MOR -7480( His - MpA 아님), 혈액 내 T 세포 기억 구획의 증식 증가: 3개의 정의된 시점에서 신선한 혈액 샘플의 분석은 항-4-1BB mAb MOR-7480 처리군의 동물에서 13일째에 CD8+ Tcm 및 Tem의 상당한 확장을 보여주었다(데이터는 나타내지 않음). 해당 그룹의 CD4+ Tcm 및 Tem 세포도 일부 확장을 나타내었지만 CD8+ 세포보다 정도가 적다. 이러한 팽창은 His-MpA 처리군에서 관찰되지 않았다.
CD25 및 CD69 활성화 마커의 발현 증가는 화합물 중 하나로 처리한 후 검출되지 않았다: CD8+ 및 CD4+ 기억 T 세포 구획에 대한 CD25 발현 분석은 임의의 처리 그룹에서 기준선(투여 전 시점)과 비교하여 어떠한 유의미한 변화도 나타내지 않았다. 예상대로 CD8+ 세포에서 CD25 발현은 음성이거나 낮았지만, CD4+ 세포는 모든 그룹에서 온건하지만 일정한 CD25 발현을 보였다. CD69는 연구 전반에 걸쳐 CD4 또는 CD8 하위 집합에서 발현되지 않았다(도시되지 않음).
결론
건강한 사이노몰구스 원숭이에게 His-MpA 또는 4-1BB 작용제 mAb MOR-7480을 투여하고 T 세포 증식 및 활성화 마커의 발현을 유세포 분석으로 모니터링했다. His-MpA는 항-4-1BB mAb MOR-7480과 대조적으로 CD8+ 또는 CD4+ Tcm 및 Tem 세포의 증식을 유도하지 않았다.
실시예 8 - 생체내에서 입증된 MpB 항종양 활성
하기 실시예는 인간 PBMC(MiXeno)로 재구성된 HT-29 결장암 이종이식 모델에서 항-4-1BB 작용성 항체 20H4.9 및 항-FAP-4-1BBL 융합 단백질과 비교하여 마우스 FAP에 결합하는 FAP 결합 도메인 및 인간 4-1BB에 결합하는 4-1BB 결합 도메인을 포함하는 MpA에 대한 마우스 대리물인 다중특이적 결합 단백질 B(MpB)의 반복 용량의 용량 의존적 효능을 평가하였다. 이 인간화된 마우스 모델은 면역 체크포인트 및 작용성 항-4-1BB 항체와 같은 공동 자극 약물의 면역 자극 효능을 시험하기 위한 적절한 개념 증명을 제공하는 것으로 설명되었다. 이 모델에서 항-4-1BB mAb 20H4.9를 사용한 치료는 종양 성장을 상당히 늦추기에 충분하다. 그러나, 이는 또한 처리되지 않은 마우스에 비해 조기 사망을 야기하는 가속화된 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 및 간 T 세포 침윤과 같은 강력한 전신 효과를 유도한다. 이 모델은 MpB가 항-4-1BB mAb 20H4.9, 비-표적화 4-1BB 작용성 단일클론 항체에 의해 생성된 비종양 효과의 일부를 피하면서 종양 내 T 세포 침윤을 증가시키고 종양 성장을 늦출 수 있는지 여부를 평가하는 데 사용되었다. 비교를 위해 FAP 표적 천연 4-1BB 리간드가 연구에 포함되었다.
물질 및 방법:
종양 실험: 면역 결핍 NOG 마우스의 오른쪽 옆구리에 HT-29 종양 세포(3.5 Х 106)를 피하 접종했다. 그런 다음 두 명의 건강한 인간 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 주사하여 마우스를 인간화했다(3.5 x 106 세포/마우스). 시험 물품을 표 12에 나타낸 바와 같이 미리 결정된 요법에 따라 종양-보유 마우스에 투여하였다.
[표 12]
Figure pct00011
종양 세포 및 PBMC 접종 날짜를 0일로 표시하였다. 종양 성장을 3 내지 4일마다 모니터링하였다. 실험 18일째에, 마우스를 희생시키고, 종양을 제거하고, 유세포 분석 및 정량적 면역형광법(QIF)으로 연구했다. 마우스가 이 시간 이후에 GVHD의 징후를 보이기 시작했기 때문에 종양 성장 분석은 18일로 제한되었다.
유세포 분석: 원시 FCS 파일의 데이터를 FlowJo 소프트웨어(TreeStar)로 분석했다. 세포는 인간 표면 마커 CD45, CD4 및 CD8을 발현하는 살아있는 림프구에 게이팅되었다. 죽은 세포는 살아있는 죽은 표지 염료 7-AAD의 통합을 통해 분석에서 제외되었다. 혈액에서 검출된 전체 인간 CD45 양성 세포의 백분율로서의 인간 CD8 T 세포의 백분율을 결정하였다.
면역조직화학: 조직을 부검 시 마우스로부터 회수하고 최적 절단 온도 화합물(Sakura)에 포매하고 사전 고정 없이 동결시켰다. OCT 내장된 저온 보존 표본을 7 μm 섹션으로 절단하고 유리 슬라이드에 고정했다. 슬라이드는 차가운 아세톤으로 고정되었다. 다중 면역형광 염색은 다음 항체로 수행되었다: 항-CD4(염소 Pab, R&D System #AF-379-NA), 항-CD8(토끼 PAb, Abcam #ab40555) 및 항-CD45(클론 HI30, Biolegend #304002). 이들 항체는 각각 항-양- Alexa Fluor® 647(Thermofisher # A21448), 항-토끼- 로다민 레드™-X(Jackson ImmunoResearch #711-296-152) 및 항-마우스IgG1- Alexa Fluor® 488(Jackson ImmunoResearch #115-545-205)에 의해 검출되었다. 이미지는 Zeiss Axio Scan.Z1 슬라이드스캐너에서 획득했다. 이미지를 Zen blue 소프트웨어로 전송하고 FIJI 패키지와 함께 ImageJ 1.51n 소프트웨어를 사용하여 분석하여 인간 CD45, CD8 및 CD4 T 세포의 수를 정량화했다.
통계 분석: 통계 분석은 Prism 7.0.2 소프트웨어(GraphPad Software)로 수행되었다. 종양 성장 및 체중 데이터는 반복 측정 양방향 ANOVA와 Tukey의 다중 비교 테스트(GraphPad Prism, Vers. 7.02)를 사용하여 통계적으로 유의한 차이를 분석했다. 생존 곡선은 Kaplan-Meier 방법으로 분석했고 로그 순위 테스트로 비교했다. 연구 종료 시점의 유세포 분석 데이터는 일방향 ANOVA(GraphPad Prism, Vers. 7.02)를 사용하여 분석되었다. 양측 P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
결과
종양 성장: 종양 성장은 시간이 지남에 따라 개별적으로 추적되었다(도 16 및 도 17). 상이한 처리군의 평균 종양 성장 곡선을 도 16에 나타냈다. 개별 마우스의 종양 성장 곡선을 도 17에 나타냈다.
독립 샘플 T 시험을 사용하여 종양 접종 후 18일째에 수득한 데이터에 대해 수행한 통계 분석 외에도, 반복 측정 양방향 ANOVA 이어서 Tukey의 다중 비교 시험을 사용하여 통계적으로 유의한 차이에 대해 종양 성장 데이터를 분석했다. 종양 성장 억제는 표 13에 요약되어 있다.
[표 13]
Figure pct00012
전체 종양 성장 곡선의 분석은 연구 종료 시 최종 종양 부피만을 분석하는 것과 비교하여 분석에 더 높은 힘을 제공한다. 양방향 ANOVA 분석이 항-4-1BB mAb 20H4.9 및 MpB 0.32 mg/㎏ 그룹에 추가하여 MPB 1.6 mg/㎏ 그룹에 대한 통계적 유의성을 나타냈다는 점을 제외하고 두 분석은 잘 상관된다. 종양 성장은 항-4-1BB mAb 20H4.9(p<0.001) 및 MpB 1.6 mg/㎏(p<0.05) 및 0.32 mg/㎏ 처리군(p<0.001)에서 지연되었지만 8 mg/㎏ MPB 또는 항-FAP-4-1BBL 융합 그룹에서는 그렇지 않았다. 항-FAP-4-1BBL 융합 역시 종양 성장을 억제하는 경향을 보였으나 그 효과는 통계적으로 유의하지 않았다. 투여된 비히클은 종양 성장에 유의한 영향을 미치지 않았다. 요약하면, 시험 물질인 항-4-1BB mAb 20H4.9 및 MpB는 피하 HT-29 인간 결장암 MiXeno 모델에서 유의한 항종양 활성을 입증했다.
혈액 및 종양의 면역표현형 분석: 유세포 분석에 의해 수득된 결과를 확인하기 위해, 18일째에 절제된 종양에서 인간 CD4 및 CD8 T 림프구 밀도를 조직학으로 분석했다. 조직학적 검사는 그룹당 5마리의 마우스의 조직을 사용하여 수행되었다(데이터는 표시되지 않음). MpB를 사용한 처리는 비히클 그룹과 비교하여 인간 CD8 T 림프구의 더 치밀한 침윤을 야기하였다. 시험된 모든 용량의 MpB 및 항-FAP-4-1BBL이 이러한 경향을 나타냈지만, 그 차이는 MpB 0.32 mg/㎏ 그룹에서만 유의성에 도달했다(P < 0.01; 도 18a). 한편, CD4 종양 침윤 림프구의 수는 모든 군에서 유의한 차이가 없었다.
이식편 대 숙주 질병: GVHD는 이식된 인간 T 림프구가 치료제에 의해 조절될 수 있는 면역 조절 전략을 시험하는 귀중한 모델로 간주된다. 3 내지 4주 후, 이식된 T 림프구가 4 내지 5주 후에 심각한 조직 손상의 징후와 함께 비장, 간 및 폐에 침투하기 시작한다. 항-4-1BB 작용제 항체를 사용한 처리는 인간 T 림프구의 입양 전달로 인한 GVHD를 가속화하고 악화시킨다.
따라서, 3.5 x 107 인간 PBMC를 주사한 마우스는 항-4-1BB mAb 20H4.9 처리군에서 입양 전달 후 2주째에 체중이 감소하기 시작했고(데이터는 나타내지 않음) 체중 감소 및 호흡 곤란, 구부린 자세 및/또는 털 손실의 징후로 인해 사전 정의된 동물 건강 종료 기준에 따라 대부분의 경우 18일째에 희생되어야 했다. 비히클 그룹의 마우스는 18일 연구 기간 동안 체중을 유지했으며 다른 모든 처리 그룹은 비히클 그룹과 비교하여 체중의 유의한 감소를 나타내지 않았다. 항-4-1BB mAb 20H4.9 처리군은 비히클 대조군(데이터는 표시되지 않음)과 비교하여 15일째부터 체중의 상당한 감소를 나타냈다(15일째에 P < 0.01 및 17일 및 18일째에 p < 0.001). 치명적인 GVHD에 대해 마우스를 추적했으며 대조군과 비교하여 항-4-1BB mAb 20H4.9 그룹에서 전체 생존의 유의한 감소가 관찰되었다. 대조군의 마우스는 죽지 않았고 유의미한 체중 감소도 관찰되지 않았다. 항-4-1BB mAb 20H4.9 처리군의 10마리 중 6마리(60%)의 마우스가 GVHD의 강한 징후를 보였고 사망하거나 ≥20% 체중 감소의 종료 기준에 도달하여 희생되었다. 30마리 마우스 중 1마리(3%)는 MpB 그룹에서 사망했지만 동물 중 어느 것도 20% 이상의 체중 감소를 나타내지 않았다(p < 0.001, 로그 순위 시험). 연구 초기(처리 1주 후)에서 죽은 것으로 발견된 그룹 4(MpB, 8 mg/㎏)의 한 마리의 마우스를 제외하고 다른 그룹의 모든 마우스는 18일째에 연구가 종료될 때까지 생존했다(데이터는 표시되지 않음).
MpB를 사용한 처리는 PBMC 표현형 결과가 말초 혈액에서 어느 정도의 CD8 T 세포 확장을 나타내었음에도 불구하고 GVHD의 악화로 이어지지 않았다. 한편, 항-4-1BB mAb 20H4.9를 사용한 처리는 MpB 및 비히클 대조군과 비교하여 체중 감소 및 사망률이 상당히 증가하여 GVHD를 가속화시켰다.
요약하면, 항-4-1BB mAb 20H4.9를 사용한 처리는 연구 종료(종양 세포/PBMC 접종 15일 후)에 GVHD의 가속화된 발병으로 인해 체중 및 전체 생존에 부정적인 영향을 미쳤다. 항-FAP-4-1BBL 융합 또는 MpB를 사용한 처리는 항-4-1BB mAb 20H4.9를 사용한 처리와 비교하여 유사한 항종양 활성을 나타내었음에도 불구하고 비히클 그룹과 비교하여 체중 감소 및 감소된 생존으로 이어지지 않았다.
간 T 세포 침윤의 조직학적 분석: 18일째에 절제된 간의 조직학적 검사는 그룹당 5마리 마우스의 조직을 사용하여 수행되었다. 항-4-1BB mAb 20H4.9의 투여는 공개된 결과와 유사하게 NOG 마우스에서 인간 PBMC에 의한 증가된 간 T 세포 침윤을 유도했다. 표면적에 의해 소형, 중형 및 대형으로 분류된 침윤물의 정량화는 항-4-1BB mAb 20H4.9가 비히클 그룹과 비교하여 상당히 더 큰 침윤물을 유도하고 FAP-표적화된 4-1BB 작용제 MpB 및 항-FAP-4-1BBL 융합 단백질을 사용한 처리는 간 T 세포 침윤의 증가를 유도하지 않았음을 확인시켜 주었다(도 18).
결론
시험 물질인 항-4-1BB mAb 20H4.9 및 MpB는 피하 HT-29 인간 결장암 MiXeno 모델에서 항종양 활성을 입증했다. MpB에 의한 처리는 또한 비히클 처리된 마우스와 비교하여 종양에서 인간 CD8 T 세포의 밀도를 증가시켰다. 모든 용량이 인간 CD8 T 세포 백분율에서 유사한 증가를 생성했기 때문에 0.32에서 8 mg/㎏의 시험된 범위에 걸쳐 MpB의 명확한 용량 반응은 없었으며 반면 항종양 효과는 더 낮은 2개의 용량에서 유의했지만 8 mg/㎏ 용량에서는 그렇지 않았다. 항-4-1BB mAb 20H4.9를 사용한 처리는 연구 종료에 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 가속화된 발병으로 인해 체중 및 전체 생존에 부정적인 영향을 미쳤다. 항-4-1BB mAb 20H4.9를 사용한 처리는 또한 간으로의 인간 T 세포 침윤을 증가시켰다. 대조적으로, MpB 및 항-FAP-4-1BBL 융합 단백질을 사용한 처리는 내약성이 우수하고 체중 감소 또는 감소된 생존을 야기하지 않았고 비히클 그룹과 비교하여 증가된 간 T 세포 침윤을 생성하지 않았다.
요약하면, MpB 처리는 HT-29 인간화 이종이식 모델에서 항-4-1BB mAb 20H4.9를 사용한 처리와 유사한 항종양 활성을 생성했다. 항-4-1BB mAb 20H4.9를 사용한 처리와 대조적으로, MpB는 인간 CD8+ 종양내 림프구의 비율을 증가시켰고, GVHD를 악화시키지 않았고, 상당한 체중 감소를 유도하지 않았고, 간으로의 T 세포의 침윤을 증가시키지 않았다.
실시예 9: FAP /4- 1BB 이중특이적 안키린 반복 단백질은 세포에 결합하고 FAP 매개 클러스터링을 통해 4-1BB 신호전달을 활성화
세포 표면에서 4-1BB의 작용제 매개 클러스터링은 4-1BB 신호 전달의 효과적인 활성화에 필요하거나 적어도 매우 유익한 것으로 생각된다. 4-1BB의 이러한 클러스터링 및 활성화가 FAP/4-1BB 이중특이적 분자에 의해 매개될 수 있는지 여부를 시험하기 위해 다양한 FAP/4-1BB-특이적 구조물을 시험했다.
FAP/4-1BB 이중특이적 구조물은 BamHI 및 HindIII 를 갖는 1가 4-1BB 결합 도메인을 코딩하는 서열을 및 FAP 결합 도메인 및 펩타이드 링커(SEQ ID NO: 4) 뿐만 아니라 BsaI 및 HindIII 갖는 간단한 단백질 정제를 용이하게 하는 N-말단 His-태그(SEQ ID NO: 56)를 코딩하는 서열을 제공하는 벡터(pMPCME298)를 분해함으로써 클로닝되었다. 벡터 및 1가 4-1BB 결합 도메인을 코딩하는 삽입물을 연결하고 유도성 대장균 박테리아로 형질전환시켰다. 구조물 당 3개의 클론이 Microsynth에 의해 시퀀싱되었다. 그런 다음 발현된 클론을 수정하고 2개의 트리톤 세척 단계로 벤치탑 정제를 사용하여 정제했다.
추가 기능 시험을 위해 다음 FAP-4-1BB 이중특이적 구조물이 생성되었다:
이중특이적 구조물 #44(N 말단에 융합된 His-태그(SEQ ID NO: 43)를 갖는 SEQ ID NO: 44; 4-1BB 결합 도메인으로서 SEQ ID NO: 3을 포함함);
이중특이적 구조물 #45(N 말단에 융합된 His-태그(SEQ ID NO: 43)를 갖는 SEQ ID NO: 45; 4-1BB 결합 도메인으로서 SEQ ID NO: 51을 포함함);
이중특이적 구조물 #46(N 말단에 융합된 His-태그(SEQ ID NO: 43)를 갖는 SEQ ID NO: 46; 4-1BB 결합 도메인으로서 SEQ ID NO: 52을 포함함);
이중특이적 구조물 #47(N 말단에 융합된 His-태그(SEQ ID NO: 43)를 갖는 SEQ ID NO: 47; 4-1BB 결합 도메인으로서 SEQ ID NO: 53을 포함함);
이중특이적 구조물 #48(N 말단에 융합된 His-태그(SEQ ID NO: 43)를 갖는 SEQ ID NO: 48; 4-1BB 결합 도메인으로서 SEQ ID NO: 54를 포함함);
이중특이적 구조물 #49(N 말단에 융합된 His-태그(SEQ ID NO: 43)를 갖는 SEQ ID NO: 49; 4-1BB 결합 도메인으로서 SEQ ID NO: 55를 포함함).
음성 대조군으로서, 인간 4-1BB에 대한 결합 특이성이 없는 안키린 반복 도메인(SEQ ID NO: 57)을 벡터에 클로닝하여 이중특이적 구조물 #50을 생성하였다: 이중특이적 구조물 #50(N 말단에 융합된 His-태그(SEQ ID NO: 56)를 갖는 SEQ ID NO: 50; 4-1BB 결합 도메인 대신 SEQ ID NO: 57을 포함함).
FAP-41BB 이중특이적 구조물은 4-1BB 및 FAP에 높은 친화도로 결합한다.
인간 4-1BB, 사이노 4-1BB 및 인간 FAP 표적에 대한 정확한 친화도 데이터를 수득하기 위해 FAP-41BB 이중특이적 구조물을 SPR로 조사했다.
분석 설정: 간단히 말해, SPR 측정은 위에서 설명한 바와 같은 ProteOn XPR36 기기(BioRad)를 사용하여 수행되었다. 비오티닐화된 인간 및 사이노몰구스 4-1BB 및 인간 FAP를 GLC 칩에서 NeutrAvidin(~6000 RU 사전 코팅)을 통해 직접 또는 간접적으로 고정하여 각각 600 RU, 700 RU 및 2000 RU에 도달했다. 코팅된 표적에 대한 FAP-4-1BB 이중특이적 구조물의 상호작용은 일정한 30 μl/분의 유속을 사용하여 120초의 결합 및 1800초의 해리로 50, 16.7, 5.6, 1.9 및 0.6 nM의 연속 희석액으로 이중특이적 구조물을 주입함으로써 측정되었다. 10 mM 글리신 pH 2 및 124 mM H3PO4를 사용하여 개별 측정 사이에 표적이 재생되었다. 신호는 실행 완충액(PBST) 처리된 대조군 레인에 대해 이중 참조되었다.
스크린: FAP-4-1BB 이중특이적 구조물의 SPR 측정 결과는 표 15에 요약되어 있다. FAP-4-1BB 이중특이적 구조물은 인간 4-1BB에 대해 0.4 내지 1.5 nM, 사이노몰구스 4-1BB에 대해 1.1 내지 2.9 nM 및 인간 FAP에 대해 0.1 내지 0.4 nM의 결합 친화도를 나타냈다. FAP-4-1BB 이중특이적 구조물은 h4-1BB보다 hFAP에 더 높은 친화도로 결합되었다. 사이노몰구스 4-1BB에 대한 교차 반응성 결합은 시험된 모든 FAP-4-1BB 이중특이적 구조물에 대해 확인되었으며, 인간 4-1BB와 비교하여 결합 친화도에서 최대 약 4배 차이가 있다.
[표 15]
Figure pct00013
FAP - 41BB 이중특이적 구조물은 FAP 유도 클러스터링에 의해 매개되는 4- 1BB -발현 세포에서 4-1BB 신호 전달을 활성화함
FAP-41BB 이중특이적 구조물은 FAP-결합을 통한 클러스터링에 의해 매개되는 4-1BB-발현 세포에서 4-1BB 신호 전달을 활성화하는 능력에 대해 추가로 시험되었다.
분석 설정: 인간-4-1BB 및 NF-κB-루시페라아제 리포터 유전자를 발현하는 HT1080 세포(실시예 1 참조)를 수확하고 MEMα 배지 + 10%(v/v) FBS, 1% PenStrep, 1 mg/mL G418, 100 ㎍/mL Normocin 및 100 ㎍/mL Zeocin이 보충된 글루타맥스에 재현탁했다. 96-웰 플레이트를 사용하여, 10,000 h4-1BB-HT1080-루시페라아제 세포를 FAP-비오틴-코팅된 스트렙타비딘 비드의 존재 하에 인간 FAP-코팅된 비드 및 증가하는 농도의 이중특이적 구조물과 함께 플레이팅했다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 20시간 동안 배양하였다. 이어서 상층액을 수집하고 새로운 96-웰 플레이트에서 원심분리하였다. QUANTI-Luc 시약(Invivogen, Cat. No. rep-qlc1)을 상층액과 혼합하고 Tecan M1000 발광 플레이트 판독기에서 발광을 판독했다. EC50 값은 Graphpad Prism 소프트웨어(버전 7.02)를 사용하여 4개 매개변수 로지스틱 피팅 모델로 데이터를 피팅하여 결정했다.
결과: 이 h4-1BB-HT1080 루시페라아제 리포터 분석은 개시된 이중특이적 구조물이 FAP-코팅된 비드의 존재 하에 4-1BB 작용을 나타낸다는 것을 입증하였다. 4-1BB 작용은 FAP-매개 클러스터링에 의존했는데, 그 이유는 이중특이적 구조물에서 FAP 코팅된 비드의 부재 또는 FAP 결합 도메인의 부재하에 작용제가 관찰되지 않았기 때문이다. 표 16은 이중특이적 구조물의 EC50 값을 제공한다:
[표 16]
Figure pct00014
FAP-4-1BB 이중특이적 구조물은 FAP-발현 세포의 존재 하에 공동-배양된 4-1BB-발현 HT1080 세포에서 NF-κB 리포터 유전자 활성화를 측정하는 분석을 사용하여 FAP-결합을 통한 클러스터링에 의해 매개되는 4-1BB-발현 세포에서 4-1BB 신호 전달을 활성화하는 능력에 대해 추가로 시험되었다.
인간 FAP를 발현하는 CHO 세포의 생성
간단히 말해서, 발현 벡터(pMPMPA13)는 인간 FAP를 코딩하는 cDNA를 사용하여 표준 분자 생물학 기술에 의해 생성되었다. 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(ATCC® CCL-121™)를 리포펙타민을 사용하여 발현 벡터로 형질감염시켰다. 다양한 농도의 Geneticin G-418(Promega, V8091)을 사용하여 선택 압력을 가했다. hFAP의 발현은 항-FAP 항체를 사용하는 유세포 분석에 의해 분석되었다. CHO-FAP 형질감염체의 2개의 상이한 집단(집단 1 및 집단 2)이 추가 실험을 위해 선택되었다. FACS 분석은 야생형 CHO 세포(CHO-wt)가 아닌 CHO-FAP 세포가 세포 표면에서 hFAP를 발현한다는 것을 입증했다(데이터는 나타내지 않음).
분석 설정: h4-1BB-HT1080-루시페라아제 세포 및 CHO-FAP 세포를 수확하고 MEMα 배지 + 10%(v/v) FBS, 1% PenStrep, 1 mg/mL G418, 100 ㎍/mL Normocin™ 및 100 ㎍/mL Zeocin™가 제공된 글루타맥스에 재현탁했다. 96-웰 플레이트를 사용하여 40,000개의 h4-1BB-HT1080-루시페라아제 세포 및 40,000개의 CHO-FAP 세포를 플레이팅하고 증가하는 농도의 FAP-4-1BB 이중특이적 구조물을 세포에 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 20시간 후, 상층액을 수집하고 새로운 96-웰 플레이트에서 원심분리하였다. QUANTI-Luc 시약(Invivogen, Cat. No. rep-qlc1)을 상층액과 혼합하고 Tecan M1000 발광 플레이트 판독기에서 발광을 판독했다. EC50 값은 Graphpad Prism 소프트웨어(버전 7.02)를 사용하여 4개 매개변수 로지스틱 피팅 모델로 데이터를 피팅하여 결정했다.
결과: 결과는 FAP-발현 세포의 존재 하에(집단 1), 모든 FAP-4-1BB 이중특이적 구조물이 FAP-결합을 통한 클러스터링에 의해 매개되는 필적할만한 정도로 4-1BB-발현 세포에서 4-1BB 신호 전달을 유도함을 보여주었다. 4-1BB에 결합하지 않는 이중특이적 구조물 #50은 4-1BB 신호 전달에 영향을 미치지 않았다. 표 17은 FAP-4-1BB 이중특이적 구조물의 EC50 값을 제공한다:
[표 17]
Figure pct00015
FAP-발현 세포의 제2 집단(집단 2)에서도 유사한 결과가 수득되었다. 표 18은 이중특이적 구조물의 EC50 값을 제공한다:
[표 18]
Figure pct00016
결론적으로, 시험된 모든 FAP/4-1BB 이중특이적 구조물은 FAP-결합을 통한 클러스터링에 의해 매개된 4-1BB-발현 세포에서 4-1BB 신호 전달을 활성화할 수 있었다.
실시예 10: 다중특이적 단백질의 존재 또는 부재하의 FAP의 프로테아제 활성
이 실시예는 고유 FAP 효소 활성이 다중특이적 재조합 단백질의 결합 시 억제되는지 여부를 결정하기 위해 다양한 FAP/4-1BB 결합 분자의 존재 하에 수행되었던 FAP 활성 분석을 설명한다.
FAP는 유형 II 단일 막횡단 세린 프로테아제로, 이의 발현은 종양(예를 들어, 상피암의 >90%에서 기질 섬유아세포 표면에서 발현됨), 상처 치유, 배아 조직 및 염증 부위(예를 들어, 동맥경화증/관절염)과 같은 조직 리모델링 부위에서 고도로 상향 조절되며, FAP 발현은 질병이 없는 성인 장기에서 검출하기 어렵다. 이 비정형 세린 프로테아제는 디펩티딜 펩티다아제(엑소펩티다아제)와 엔도펩티다아제 활성을 모두 가지고 있어 프롤린 후 결합에서 기질을 절단한다. 구조적으로, FAP는 짧은 세포질 N-말단 서열(4 aa), 단일 막횡단 헬릭스(21 aa) 및 8개의 블레이드 β-프로펠러 및 α/β-가수분해효소 도메인을 형성하는 세포외 도메인(735 aa)으로 이루어진다. FAP는 동종이량체로 활성이다. FAP 프로테아제 활성에 필수적인 촉매 트라이어드는 Ser624, Asp702 및 His734 잔기로 구성된다. 활성 부위는 베타 프로펠러의 중앙 구멍을 통해 또는 베타 프로펠러와 가수분해효소 도메인의 경계면에 있는 공동을 통해 접근할 수 있다.
FAP의 프로테아제 활성은 뉴로펩타이드 Y, 유형 I 콜라겐 및 α2-항플라스민뿐만 아니라 기질 Z-GLY-PRO-AMC를 포함한 다양한 기질의 절단을 생성하며, 이는 엑소펩티다아제 또는 엔도펩티다아제 활성 모두에 의해 형광 판독기로 측정될 수 있는 생성물로 절단될 수 있다.
FAP 활성 분석에서 시험된 분자는 표 19에 요약되어 있다.
[표 19]
Figure pct00017
FAP 활성 분석. rhFAP 표적을 분석 완충액(50 mM Tris, 1 M NaCl, 1 mg/ml BSA, pH 7.5)에 0.22 ㎍/ml로 희석하고 웰당 45 μl를 96-웰 플레이트에 첨가하였다(최종 농도. 0.03 ㎍/ml(0.3 nM)). 표 19에 나타낸 바와 같이 분자 1-5는 표적 샘플(최종 농도 135 nM)에 2.7 μM 분자 5 μl를 첨가하여 450배 몰 과량으로 적용하였다. 벤치마크 항-FAP 항체(분자 번호 6)는 분자 번호 1-5(최종 농도 135 nM)와 동일한 농도로 적용되었다. 프로테아제 억제제(PI) 혼합물(Merck의 eComplete, EDTA 무함유)을 다양한 희석액으로 사용하여 FAP 활성의 억제를 보여주었다. rhFAP/단백질 또는 rhFAP/PI 혼합물을 100 μM Z-GLY-PRO-AMC 기질(최종 농도 50 μM) 50 μl를 첨가하기 전에 300 rpm에서 90분 동안 배양했다. 측정 전에 플레이트를 4000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 분석을 방해하는 버블을 제거했다. 형광은 수동 증가가 105%로 설정된 형광 판독기를 사용하여 380 nm 여기 및 460 nm 방출에서 95분의 기간에 걸쳐 5분마다 측정되었다. 45분 후의 시점은 신호 대 잡음비가 70보다 큰 분석에 사용되었다. FAP 활성(%)은 100% 활성의 분석 대조군(FAP 및 기질, 분자 번호 1-6 없음) 및 0% 활성(FAP, MpA의 존재 하에 기질 없음)으로 정규화되었다. 4중항 측정을 수행하고 평균 및 표준 편차로 설명했다.
결과. 첫 번째 단계에서, 용량 반응 곡선은 50 μM의 고정된 기질 농도에서 0.01 nM에서 최대 1.2 nM까지의 FAP 농도를 사용하여 측정되었다. 선형 시간 의존적 신호 증가는 95분의 기간 동안 0.3 nM의 rhFAP 표적 농도에서 관찰되었다(0.999의 R2로 5분마다 측정). FAP의 효소 활성에 대한 단백질 결합의 효과를 결정하기 위해, FAP(0.3 nM)에 비해 450배 몰 과량이고 인간 FAP에 대한 MpA의 결합 친화도는 300배 이상(KD = 0.4 nM)인 FAP 결합 분자(예를 들어, 135 nM의 MpA)를 첨가함으로써 FAP 포화 조건 하에서 분석을 수행하였다.
도 18에 요약된 바와 같이, MpA, MpC 및 "F"(분자 번호 1-3)는 고유 디펩티딜 FAP 활성을 억제하지 않았다. 결과는 결합 시 FAP의 프로테아제 활성에 간섭을 나타내지 않는 항-FAP 항체인 벤치마크 mAb(분자 번호 6)와 유사하다. 부분적인 FAP 활성 억제는 대안적인 FAP 결합 분자(F†, 분자 번호 4, 분석 대조군으로 사용됨) 또는 프로테아제 억제제(PI) 혼합물을 사용하여 관찰되었다.
결론. FAP에 대한 MpA(HFBBH) 또는 이의 FAP 결합 도메인(F)의 결합은 형광 기질 Z-GLY-PRO-AMC를 절단하는 능력으로 측정한 FAP의 프로테아제 활성에 영향을 미치지 않았다.
실시예 11: 다중특이적 단백질의 대체 디자인의 비교
이 실시예는 다중특이적 단백질의 대체 디자인, 특히 FAP 결합 도메인, 4-1BB 결합 도메인 및 HSA 결합 도메인의 순서에 대한 비교 분석을 설명한다.
FAP-발현 CHO 세포의 존재 하에 공동-배양된 인간 4-1BB를 발현하는 HT1080 세포에서 NF-κB 활성화를 평가함으로써, HT1080 리포터 분석을 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방식으로 수행하였다.
분석 설정. NF-κB-루시페라아제 인간-4-1BB HT1080 세포 및 CHO-hFAP 세포를 수확하고 MEMα 배지+ 10%(v/v) FBS, 1% PenStrep, 1 mg/mL G418, 100 ㎍/mL Normocin™ 100 ㎍/mL Zeocin™가 제공된 글루타맥스에 재현탁했다. 96-웰 플레이트를 사용하여 40,000개의 h4-1BB-HT1080-루시페라아제 세포 및 40,000개의 CHO-hFAP 세포를 플레이팅하고 증가하는 농도의 다중특이적 단백질 분자를 세포에 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 20시간 후, 상층액을 수집하고 새로운 96-웰 플레이트에서 원심분리하였다. QUANTI-Luc 시약(Invivogen, Cat. No. rep-qlc1)을 상층액과 혼합하고 Tecan M1000 발광 플레이트 판독기에서 발광을 판독했다. EC50 값은 Graphpad Prism 소프트웨어(버전 7.02)를 사용하여 4개 매개변수 로지스틱 피팅 모델로 데이터를 피팅하여 결정했다.
인간 FAP를 발현하는 CHO 세포의 생성. 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(ATCC® CCL-121™)는 인간 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)(Uniprot 수탁 Q12884 또는 NCBI Refseq. NM_004460.4)의 서열을 함유하는 플라스미드 pMPMPA13으로 형질도입되었다. 더 자세한 설명은 실시예 1에서 찾을 수 있다.
인간 4- 1BB 및 NF - κB -루시페라아제를 발현하는 HT1080 세포의 생성. 섬유육종 세포주 HT1080(ATCC® CCL-121™)은 CMV-프로모터 및 네오마이신 내성 유전자의 제어 하에 OriGene Technologies(#RC200664)에서 입수한 인간 4-1BB의 cDNA(Myc-DDK-태깅됨)를 포함하는 플라스미드로 형질도입되었으며, 이는 인간 4-1BB의 서열(Uniprot 수탁 Q07011 또는 NCBI Refseq. NM_001561)을 함유한다. 세포를 최소 필수 배지(MEM) α 배지 + 10%(v/v) FBS 및 G418 (Geneticin®)이 보충된 글루타맥스에서 배양했다. 4-1BB 형질도입된 HT1080 세포는 마우스 항-인간 4-1BB 항체 클론 4B4-1(BD Pharmingen™, 카탈로그 번호 550890)을 사용하여 유세포 분석에 의해 인간 4-1BB 발현에 대해 평가되었다. 형질감염된 세포를 HT1080 세포를 발현하는 h4-1BB의 집단을 풍부하게 하기 위해 동일한 항체를 사용하는 유세포 분석에 의해 분류하였다. h4-1BB HT1080 세포는 NF-κB 조절된 마우스 인터페론 베타 최소 프로모터 및 리포펙타민을 사용하는 Zeocin™ 내성 유전자의 제어 하에 분비된 루시페라아제 리포터 유전자를 함유하는 NF-κB-루시페라아제 리포터 플라스미드 pNiFty3-N-Lucia(Invivogen, 카탈로그 코드 pnf3-lc2)로 추가로 형질감염되었다. 형질감염된 세포를 최소 필수 배지(MEM) α 배지 + 10%(v/v) FBS, G418(Geneticin®), Zeocin™(Invivogen, 카탈로그 번호 ant-zn-1) 및 Normocin™(Invivogen, Cat. No. ant-nr-1)이 보충된 글루타맥스에서 배양했다. h4-1BB-HT1080-Lucia 세포 집단을 분석에 사용했다.
도 19a는 FAP-발현 세포의 존재 하에 다중특이적 단백질의 모든 시험된 대안적 디자인이 국소화기를 통한 클러스터링에 의해 매개되는 4-1BB 신호전달을 필적할만한 정도로 유도함을 보여준다. 표 20은 이러한 대안적인 다중특이적 단백질 디자인의 EC50 값을 제공한다. 도 19b는 마우스에서 약동학 연구의 결과를 요약한 것이다. 표 21은 도 19b에 도시된 데이터를 요약한 것이다.
데이터에 따르면 여러 대체 설계 중 형식 HFBBH(MpA)는 시험된 모든 형식 변이체와 비교하여 유사한 기능적 활성을 가지면서 개선된 혈청 반감기를 나타낸다.
[표 20]
Figure pct00018
[표 21]
Figure pct00019
실시예 12: 인간 용량 선택을 위한 PK/PD 모델 외삽
이 실시예에서 약동학 연구는 MpA에 대한 인간 반감기가 광범위한 용량 범위에 걸쳐 5.9 내지 14일이라고 예측한다. 결합된 PK/PD 모델의 예측은 다음을 제공한다: (i) 최소의 예상 전신 PD 효과를 갖는 인간 시작 용량(0.015 mg/㎏에서 20% 수용체 점유율 기준), (ii) 예상되는 치료 최적 용량 범위(0.5 내지 5 mg/㎏), 및 (iii) 최적의 용량 범위 확인을 위해 최대 치료 효과를 초과할 수 있는 용량 수준(12 mg/㎏). 음영 영역의 예측 간격을 사용하여 인간에서의 용량에 대한 다양한 바이오마커의 % 효과 예측을 보여주는 도 20을 참조.
비임상 종 데이터를 기반으로 인간에서 MpA의 임상 약동학, 약력학 및 항종양 효과의 예측을 가능하게 하고 1상 시작 용량 및 요법의 뒷받침하는 정당성을 제공하는 번역 수학적 모델이 개발되었다.
분석의 주요 목적은 비임상 종 데이터를 사용하여 인간의 혈청/혈액 및 종양에서 MpA 약동학(PK) 및 약력학(PD)을 예측하는 것이었다. 사이노몰구스 원숭이와 마우스의 비임상 PK 정보를 사용하여 인간으로 번역될 수 있는 내피 혈관 구조에 따라 생리학적 구획의 일부를 함께 묶는다고 가정하여 최소 PBPK(mPBPK) 모델을 설정했다. 혈액 내 4-1BB 수용체 점유율, 혈청 내 가용성 4-1BB 농도(sCD137) 및 혈액/종양 내 CD8/CD4 T 세포 비의 변화와 같은 마우스에서 PK와 다양한 PD 바이오마커 종점 간의 관계가 모델링되었고, 인간 PK의 예측을 통합한 후 인간에서 예상되는 PD 효과를 예측하는 데 사용되었다.
분석은 비임상 PK 및 PD 데이터를 통합하여 인간에 대한 투여량 예측을 두 부분으로 안내하는 것을 목표로 했다: (i) 알로메트릭 스케일링 및 mPBPK 모델링을 통한 마우스 및 원숭이 데이터로부터의 혈청 및 종양에서의 인간 PK 노출 예측; 및 (ii) 마우스 유래 PKPD 관계를 사용하고 인간 결합 시험관내 매개변수를 고려하여 인간 PD 효과의 예측.
조직 부피 및 림프 흐름에 대한 생리학적 매개변수를 사용하여 마우스, 원숭이 및 인간에서 MpA의 약동학을 동일한 접근 방식을 사용하여 설명할 수 있다. 인간에 대한 약동학의 번역은 체중을 기준으로 하여 동량적으로 조정된 제거율을 기반으로 했으며 인간에서 MpA의 약력학 효과 예측을 위한 기초를 구성했다. 또한, FAP-결합 및 비-FAP 결합 분자 모두에 대한 데이터를 모델에 통합함으로써 이 약동학 모델의 일부로 MpA와 FAP의 결합 동역학을 특성화할 수도 있었다.
약력학 마커는 각각 다른 약물동력학-약력학 모델에 의해 설명되었다: 4-1BB 수용체 점유에 대한 Emax 모델 및 혈액 및 종양에서 CD8/CD4 T 세포 비에 대한 종 모양의 용량 반응을 설명하는 결합된 자극 및 억제 Emax 모델. 이러한 각 모델은 마우스 모델에서 관찰된 약력학을 적절하게 설명할 수 있었다. 이어서, 마우스와 인간의 약력학의 유사성을 가정하고 인간의 MpA 농도-시간 프로파일의 알로메트릭 예측을 기반으로, 각 마커에 대해 인간 용량 반응을 예측했다. 예측은 2 mg/㎏ MpA Q3W의 용량 요법으로 달성될 CD8/CD4 비 측면에서 최적의 반응을 나타냈다. 0.015 mg/㎏의 제안된 시작 용량에서 최소한의 생물학적 효과(CD8/CD4 비 ~20% 이하 증가)가 예상된다. 표적 결합의 포화로 인해(주로 FAP) MpA의 약동학에서 일부 비선형성이 예상되지만, 이러한 비선형성은 약력학적 효과가 차선책이 될 것으로 예상되는 고용량(> 5 mg/㎏)에서만 발생할 것으로 예상된다. 따라서, 임상 연구를 위해 코호트 간에 MpA 용량이 3배 증가하는 단계적 증가 계획이 제안된다.
결론적으로, 분석은 MpA의 집단 인간 mPBPK 및 PKPD에 대한 통찰력을 제공했다. PD 시뮬레이션의 결과는 2 mg/㎏의 용량에서 달성될 최적의 바이오마커 반응을 제안한다. 그런 다음 집단 PK 시뮬레이션을 성공적으로 사용하여 최대 바이오마커 반응을 이끌어내기 위해 적절한 평균 노출을 제공하기에 3주마다 투여하는 것이 충분할 것이며, 안전 문제에 대한 노출 경계가 없는 경우 추가 인간 투여 일정은 시뮬레이션되지 않았다. 0.015 mg/㎏의 MpA 용량 요법이 고형 종양 환자를 대상으로 한 최초 인간(FIH) 연구에서 평가를 위한 적절한 시작 용량이 될 것이라고 결론지었다.
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Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala 145 150 155 160 Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala 165 170 175 Asp Val Asn Ala Lys Asp Gln Glu His Gly Ser Thr Pro Leu His Leu 180 185 190 Ala Ala Asn Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala 195 200 205 Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asn Trp Trp Gly Asn Thr Pro Leu His 210 215 220 Leu Ala Ala Val Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys 225 230 235 240 Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Asn His Gly His Thr Pro Leu 245 250 255 His Leu Ala Ala Trp Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu 260 265 270 Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro 275 280 285 Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu 290 295 300 Gln Lys Ala Ala 305 <210> 49 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 49 Gly Ser Asp Leu Gly Glu Lys Leu Leu Val Ala Ala Leu Tyr Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln Trp Gly Leu Thr Pro Leu His Lys Ala Ala Leu Gln Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Glu Arg Gly His Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Arg Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Gln Lys Gly Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu 100 105 110 Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Val Ala Ala 145 150 155 160 Asn Val Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr His Gly Tyr Thr Pro Leu His His Ala 180 185 190 Ala Thr Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly 195 200 205 Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Gln Thr Gly Leu Thr Pro Leu His Leu 210 215 220 Ala Ala Ala Lys Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala 225 230 235 240 Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp His His Gly Tyr Thr Pro Ala Asp 245 250 255 Leu Ala Ala Phe Val Gly His Glu Asp Ile Ala Val Val Leu Gln Lys 260 265 270 Leu Asn <210> 50 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 50 Gly Ser Asp Leu Gly Glu Lys Leu Leu Val Ala Ala Leu Tyr Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln Trp Gly Leu Thr Pro Leu His Lys Ala Ala Leu Gln Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Glu Arg Gly His Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Arg Phe 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Gln Lys Gly Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu 100 105 110 Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala 145 150 155 160 Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala 165 170 175 Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala 180 185 190 Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly 195 200 205 Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu 210 215 220 Ala Ala Arg Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala 225 230 235 240 Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp 245 250 255 Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys 260 265 270 Ala Ala <210> 51 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 51 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Val Ala Ala Asn Val Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr His Gly Tyr Thr Pro Leu His His Ala Ala Thr Tyr Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Gln Thr Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Lys Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp His His Gly Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Phe Val Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Val Val Leu Gln Lys Leu Asn 115 120 <210> 52 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 52 Asp Leu Gly Arg Lys Leu Leu Gln Ala Ala Gln Leu Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Ser Arg Gly Ile Thr Pro Leu His Val Ala Ala Trp Gln Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Ser Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp His Ala Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Leu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Gln Glu Gly Arg Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu Gln Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Lys Val Leu Gln Lys Leu Asn 115 120 <210> 53 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 53 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Thr Tyr Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Lys Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Ser Ile Gly Ile Thr Pro Leu His Val Ala Ala His His Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Lys Asp Lys Trp Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Leu Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala 130 135 140 Gly His Asp Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 54 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 54 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Gln Glu His Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Tyr Gly His 35 40 45 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 50 55 60 Lys Asn Trp Trp Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Tyr Gly 65 70 75 80 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 85 90 95 Ala Lys Asp Asn His Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Tyr 100 105 110 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 115 120 125 Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp 130 135 140 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 55 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 55 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Val Ala Ala Asn Val Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr His Gly Tyr Thr Pro Leu His His Ala Ala Thr Tyr Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Gln Thr Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Lys Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp His His Gly Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Phe Val Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Val Val Leu Gln Lys Leu Asn 115 120 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 56 Met Arg Gly Ser His His His His His His 1 5 10 <210> 57 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 57 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125

Claims (21)

  1. 하기를 포함하는 재조합 단백질:
    섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 제1 안키린 반복 도메인, 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제2 안키린 반복 도메인, 4-1BB에 특이적으로 결합하는 제3 안키린 반복 도메인, 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제4 안키린 반복 도메인, 및 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 제5 안키린 반복 도메인,
    여기서 상기 안키린 반복 도메인은 하기 화학식에 따라, N-말단에서 C-말단으로 배열됨: (혈청 알부민 결합 도메인) - (FAP-결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인) - (4-1BB 결합 도메인) - (혈청 알부민 결합 도메인).
  2. 제1항에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO:2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP에 결합하는, 재조합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 FAP 결합 도메인은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 독립적으로 SEQ ID NO: 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 4-1BB에 결합하는, 재조합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-1BB 결합 도메인 각각은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-말단 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-말단 혈청 알부민 도메인은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단 혈청 알부민 결합 도메인은 SEQ ID NO: 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 혈청 알부민에 결합하는, 재조합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 혈청 알부민 도메인이 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 포함하는 재조합 단백질: (혈청 알부민 결합 도메인) - (링커) - (FAP-결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (4-1BB 결합 도메인) - (링커) - (혈청 알부민 결합 도메인), 여기서 링커는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함함.
  11. SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질.
  12. SEQ ID NO: 6과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 10 nM 이하의 KD 값으로 인간 FAP, 인간 4-1BB 및 인간 혈청 알부민에 결합하는 재조합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 시험관내 IFNγ 방출 분석에 의한 평가 시 약 0.1 nM 내지 약 5 nM의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 갖는, 재조합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 단백질, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  16. 제15항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  17. 제16항의 숙주 세포를 상기 재조합 단백질이 발현되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 단백질의 제조 방법.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 단백질 또는 제14항의 약제학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 암이 고형 종양인, 방법.
  21. 암 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 단백질 또는 제14항의 약제학적 조성물.
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