CN109790206A - 重组结合蛋白及其用途 - Google Patents

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CN109790206A CN201780058511.0A CN201780058511A CN109790206A CN 109790206 A CN109790206 A CN 109790206A CN 201780058511 A CN201780058511 A CN 201780058511A CN 109790206 A CN109790206 A CN 109790206A
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Abstract

本发明公开了新的重组结合蛋白，所述重组结合蛋白包含对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，并且包含对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，以及编码此类重组结合蛋白的核酸，包含此类重组结合蛋白或核酸的药物组合物，以及此类重组结合蛋白、核酸或药物组合物在治疗疾病中的用途。

Description

重组结合蛋白及其用途
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2016年9月22日提交给欧洲专利局的欧洲专利申请EP 16190221的权益和优先权。欧洲专利申请EP 16190221的内容以引用方式全文并入本文用于所有目的，包括所有表格、附图和权利要求，根据PCT第4.18条，还包括说明书、权利要求或附图的未包含在本文中但在PCT第20.5(a)条中提及的任何要素或部分的并入。
技术领域
本发明提供了新的重组结合蛋白。这些蛋白质包含两个对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，以及两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，通过多肽接头连接。这些重组结合蛋白可用于治疗疾病。特别地，重组结合蛋白包含对血清白蛋白具有结合特异性的表现出高储存稳定性的经设计的锚蛋白重复结构域。此外，提供了编码所述重组结合蛋白的核酸，包含所述重组结合蛋白或核酸的药物组合物，以及所述重组结合蛋白、核酸或药物组合物在治疗疾病中的用途。
背景技术
经设计的锚蛋白重复蛋白文库(WO2002/020565；Binz,H.K.、Amstutz,P.、Kohl,A.、Stumpp,M.T.、Briand,C.、Forrer,P.、Grütter,M.G.和Plückthun,A.，Nat.Biotechnol.22,575-582,2004，Stumpp,M.T.、Binz,H.K和Amstutz,P.，DrugDiscov.Today，13，695-701，2008)可用于选择靶标特异性经设计的锚蛋白重复结构域。此类靶标特异性经设计的锚蛋白重复结构域继而又可以用作重组结合蛋白的有价值组分，用于治疗疾病。已经描述了对人表皮生长因子受体2(HER2或ErbB2；UniProt P04626)具有结合特异性的不同经设计的锚蛋白重复结构域的选择(WO2014/083208)。在本发明中，公开了重组结合蛋白，其包含对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。
与例如表现出由FcRn再循环介导的较长系统半衰期的IgG抗体不同，包含经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质通常表现出快速的药代动力学清除率和较短的终末半衰期，除非该蛋白质包含改善药代动力学特性的要素，诸如例如WO2012/069654中所述的对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。使用血清白蛋白结合来改善蛋白质的药代动力学特性是本领域中熟知的方法(参见例如WO1991/001743；Frejd F.Y.，2012(在Kontermann,R(Ed.)“Therapeutic proteins:strategies to modulate their plasmahalf-lives”，Wiley-VCH Verlag GmbH，2012，ISBN 978-3-527-32849-9)；以及WO2012/069654)。为了在临床药物候选物中使用对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，希望改善已知对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的储存稳定性。本文公开了重组结合蛋白，其包含对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，其中对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域表现出改善的储存稳定性特性。与之前的报道(Hopp,J.、Horning,N.、Zettlitz,K.A.、Schwarz,A.、Fuss,N.、Müller,D.、Kontermann,R.E.Protein Eng.Des.Sel.23,827-834,2010)相反，我们惊奇地观察到，通过使两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域代替重组结合蛋白中的一个，可以改善重组结合蛋白的药代动力学特性。
HER2在某些类型的癌症的发病机制和进展中起重要作用。HER2是跨膜受体酪氨酸激酶(RTK)，它属于更广泛的ErbB受体家族(Bublil,E.M.和Yarden,Y.Curr.Opin.CellBiol.19(2)，124-34，2007)。ErbB受体家族在脊椎动物中是保守的，并且还包括ErbB1或表皮生长因子受体(EGFR)或HER1(UniProt P00533)和受体HER3(ErbB3；UniProt P21860)和HER4(ErbB4；UniProt Q15303)。所有ErbB受体共享广泛的序列和结构域同源性，并在所有组合中形成功能性同源二聚体(例如ErbB1-ErbB1、HER2-HER2和HER4-HER4)和异二聚体。受体同源和异源二聚化在配体结合或受体过表达时发生，并且继而又通过自身磷酸化激活细胞内受体激酶结构域。然后，这触发了下游细胞内的信号传导和生物学应答。众所周知的ErbB信号传导途径的拮抗剂包括单克隆抗体曲妥珠单抗(与HER2细胞外结构域的结构域IV结合并抑制HER2同源二聚化)和帕妥珠单抗(与HER2细胞外结构域的结构域II结合并抑制HER2/HER3异源二聚化)重要的是，曲妥珠单抗主要具有抗增殖效应，并且肿瘤可能在晚期疾病阶段从此类治疗中逃逸。帕妥珠单抗作为单一药剂具有出乎意料的低治疗功效，可通过干扰HER2/HER3异源二聚化来补充曲妥珠单抗的活性。因此，曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合对HER2阳性癌症的治疗具有吸引力(Capelan M.等人，Ann.Oncol.，24，273-82，2013)。
曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合已经导致这样的概念：HER2中两个结构域的双重靶向是优异的抗肿瘤功效所必需的。已经报道了靶向HER2的结构域II和IV的抗体混合物，或HER2的结构域I和另一个结构域(US 20110033460；例如也包括结构域IV)的同时靶向，或结构域I和结构域IV(WO2014/060365，Jost,Ch.等人，Structure，21，1-13，2013；Tamaskovic,R.等人，Nat Commun，7，11672，2016)，或结构域II和结构域IV(WO2014/083208)，或HER2的结构域IV上的曲妥珠单抗表位和HER2的结构域II上的帕妥珠单抗表位的同时靶向(WO2009/068625)。一些方法包括双互补位结合蛋白。有趣的是，在WO2009/068625中测试的一些双互补位结合蛋白具有拮抗效应，其他具有激动效应。WO2014/083208和Jost,Ch.等人(上述引文；WO2014/060365)的报道表明拮抗性双互补位结合蛋白的生成不是直接的。相反，必须优化仔细选择各个结构域(表位、粘结剂特性)以及结构排列(取向、距离、接头长度、接头组合物)以进行有效拮抗。另外，还必须优化药代动力学工程部分的选择及其结构排列。总之，这表示了至少250'000种不同变体的选择。
本文公开了一种重组结合蛋白，其包含(i)拮抗ErbB信号传导的双互补位结合蛋白，该ErbB信号传导由两个对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域组成，以及(ii)两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域并且具有改善的储存稳定性。这种重组结合蛋白，药物候选物，被显示为治疗各种疾病的有价值的药物候选物。是瑞士Molecular Partners股份公司的注册商标。
发明内容
本发明涉及包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述四个经设计的锚蛋白重复结构域中的两个是对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，并且其中所述四个经设计的锚蛋白重复结构域中的两个是对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。本发明特别地涉及重组结合蛋白，其包含与SEQ IDNO:21具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。本发明还涉及此类重组结合蛋白，其中所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个包含SEQID NO:14的氨基酸序列。本发明特别地涉及与由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白具有至少95％序列同一性的重组结合蛋白。在一个实施方案中，对包含SEQ ID NO:14的血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域，与对包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域相比，每个在PBS中表现出改善的储存稳定性，在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重组结合蛋白。在一个实施方案中，本发明涉及由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的重组结合蛋白。在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重组结合蛋白表现出比包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重组结合蛋白更高的储存稳定性。在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白用低于10-7M的抑制常数抑制BT474细胞增殖。在一个实施方案中，本发明的浓度为100nM的重组结合蛋白比浓度为100nM曲妥珠单抗表现出更强的BT474细胞中AKT-S473磷酸化的下调。本发明还涉及编码本发明的重组结合蛋白的核酸。本发明还涉及包含本发明的重组结合蛋白和/或核酸和药学上可接受的载体和/或稀释剂的药物组合物。本发明还涉及用于治疗疾病、肿瘤性疾病、癌症、乳腺癌、卵巢癌、胃窦癌、胃癌、子宫癌、结肠直肠癌、膀胱癌、HER2过表达型癌症、HER2表达型癌症、HER2成瘾癌症、局部HER2成瘾癌症、HER2扩增癌症、曲妥珠单抗耐药癌症、曲妥珠单敏感型癌症、胃肠癌或脑癌的本发明的药物组合物。本发明还涉及试剂盒，其包含本发明的重组结合蛋白或本发明的核酸或本发明的药物组合物。本发明还涉及产生本发明重组结合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(i)在细菌中表达所述重组结合蛋白，以及(ii)使用色谱法纯化所述重组结合蛋白。
附图说明
图1.包含对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的对HER2 具有特异性的重组结合蛋白的图示。
(a)对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的图示。此类锚蛋白重复结构域的实施例是经设计的锚蛋白重复结构域，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:12至15，特别是包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的经设计的锚蛋白重复结构域。(b)对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的图示。此类锚蛋白重复结构域的实施例是经设计的锚蛋白重复结构域，其包含选自由SEQ ID NO:16至20组成的组的氨基酸序列，特别是包含氨基酸序列SEQ ID NO:16和17的经设计的锚蛋白重复结构域。(c)多肽接头(例如，包含对应于SEQ ID NO:2至9中任一个的氨基酸序列的多肽，特别是包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽接头)的图示。(d)N-末端氨基酸序列的图示。此类N-末端氨基酸序列的实施例是例如序列MGS或GS(如例如存在于SEQ ID NO:21至30和32以及33中任一个的N末端处)，或者以对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列为例的多肽标签。(e)本文提供的重组结合蛋白的图示，该重组结合蛋白包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，以及两个对HER2各自具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，这些结构域通过多肽接头连接并且具有N-末端氨基酸序列。所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域侧接另外两个经设计的锚蛋白重复结构域。包含SEQ ID NO:21的氨基酸的重组结合蛋白对应于该图示。
图2.包含SEQ ID NO:14的蛋白质的改善的储存稳定性。
蛋白质#13-His(#13)和蛋白质#14-His(#14；参见实施例1)在4℃(1)、25℃(2)、40℃(3)，和60℃(4)下以10mg/ml在PBS中储存1周的SDS15％PAGE分析。蛋白质#14-His表现出比蛋白质#13-His更高的储存稳定性。M：标记物(下带：6.5kDa；在蛋白质#14-His水平处的条带：14.4kDa；在蛋白质#14-His PAGE的情况中的上带：21.5kDa)。
图3.通过对HER2具有结合特异性的重组结合蛋白抑制BT474细胞增殖。
如实施例6中所述进行BT474乳腺癌细胞增殖抑制。包含SEQ ID NO:21的重组结合蛋白表现出比包含SEQ ID NO:23的重组结合蛋白更低的IC50，表明在重组结合蛋白中具有SEQ ID NO:16和17比具有SEQ ID NO:18和17更有利。实心圆和实线：蛋白质#21-His；实心方块和虚线：蛋白质#23-His；三角形：无抑制剂。OD：OD405-OD620；C：nM的浓度。
图4.肿瘤异种移植小鼠实验。
a.)BT474乳腺癌肿瘤异种移植小鼠模型。如实施例7中所述进行建模。三角形：PBS；空心方块：曲妥珠单抗；带虚线的菱形：曲妥珠单抗&帕妥珠单抗；实心圆：对HER2具有结合特异性的重组结合蛋白(蛋白质#21-His)；V：肿瘤体积[mm3]；t：时间[d]。b.)BT474乳腺癌肿瘤异种移植小鼠模型，其比较了在治疗第18天的蛋白质#21-His(21)、蛋白质#23-His(23)、蛋白质#24-His(24)或蛋白质#25-His(25)。如实施例7中所述进行实验。蛋白质#21-His在抑制肿瘤生长方面明显比蛋白质#24-His(p＝0.0003)、蛋白质#23-His或蛋白质#25更有效。V：肿瘤体积[mm3]；t：时间[d]。c.)和d.)GXA3039胃窦癌来源于患者的肿瘤异种移植小鼠模型。如实施例7中所述进行两次实验。在这些实验中使用PBS(三角形)、帕妥珠单抗(空心倒三角形)、曲妥珠单抗(空心方块)、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的混合物(具有虚线的菱形)以及蛋白质#21。c.)蛋白质#21表现出对肿瘤生长的强烈抑制，类似于曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合，而单独的曲妥珠单抗不太有效。d.)蛋白质#21表现出对肿瘤生长的强烈抑制，类似于曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合。仅曲妥珠单抗和仅帕妥珠单抗的疗效显著较低。RTV：在治疗开始时参考肿瘤体积的相对肿瘤体积[％]；t：时间[d]。e.)GXF281胃窦癌来源于患者的肿瘤异种移植小鼠模型。如实施例7中所述进行实验。PBS(三角形)，拉帕替尼(空心方块)，以及蛋白质#21(实心圆)。与该模型中的拉帕替尼相比，蛋白质#21显示出对肿瘤生长的强烈抑制。RTV：在治疗开始时参考肿瘤体积的相对肿瘤体积[％]；t：时间[d]。
图5.小鼠的药代动力学分析。
a.)小鼠的药代动力学特性分析，根据实施例8比较蛋白质#21-His(实心圆)与蛋白质#23-His(方块)。该实验表明在重组结合蛋白中存在SEQ ID NO:16的药代动力学优势，而不是SEQ ID NO:18。b.)小鼠的药代动力学特性分析，根据实施例8和11比较蛋白质#30-His(实心圆；包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域)与蛋白质#29-His(实心方块；包含一个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域)。具有两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域改善超过用对血清白蛋白具有结合特异性的一个经设计的锚蛋白重复结构域实现的图谱的药代动力学图谱。c.)如实施例8和10中所述，包含GlySer多肽接头的重组结合蛋白(蛋白质#26-His；实心方块)与包含ProThr多肽接头的重组结合蛋白(蛋白质#27-His；实心圆)的药代动力学比较。具有ProThr多肽接头对小鼠的药代动力学特性具有有利影响。％ID：将注射剂量百分比标准化为1小时测量值[％]；t：时间[小时]。
图6.食蟹猴的药代动力学分析。
a)根据实施例9，在食蟹猴中蛋白质#21-His(实心圆)和蛋白质#23-His(实心方块)为1mg/kg时的药代动力学特性分析。对于蛋白质#21-His，观察到更长的终末半衰期，表明在重组结合蛋白中存在SEQ ID NO:16比存在SEQ ID NO:18更有利。b)根据实施例9，在食蟹猴中蛋白质#21-His为1mg/kg(实心圆)、5mg/kg(实心方块)和10mg/kg(实心三角形)时的药代动力学特性分析。蛋白质#21-His显示终末半衰期的剂量依赖性增加，从1mg/kg的47小时至5mg/kg的100小时至10mg/kg的约180小时。C：浓度[nM]；t：时间[小时]。
图7.BT474细胞的细胞凋亡诱导。
根据实施例6，测量不同浓度的蛋白质#21(实心圆)、曲妥珠单抗(空心方块)、帕妥珠单抗(空心倒三角形)或100nM曲妥珠单抗和不同浓度的帕妥珠单抗的混合物(空心菱形；虚线)诱导的BT474细胞的细胞凋亡。绘制的结果包括非线性回归拟合曲线。PBS(实心三角形)和100nM曲妥珠单抗(实心倒三角形)的测量显示为50pM的参照。C：浓度[nM]；RLU：相对光单位。
具体实施方式
本发明涉及包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述四个经设计的锚蛋白重复结构域中的两个是对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，并且其中所述四个经设计的锚蛋白重复结构域中的两个是对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。SEQ ID NO:21是此类重组结合蛋白的示例。
在一个实施方案中，对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每个与SEQ ID NO:14具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每个由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：(i)SEQ ID NO:14，和/或(ii)其中SEQ ID NO:14的最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸被任何氨基酸交换的序列。在一个实施方案中，对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每个由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：(i)SEQID NO:14，和/或(ii)其中SEQ ID NO:14的最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸被任何氨基酸交换的序列，并且对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每个与对选自由本申请的SEQ ID NO:12、13或15以及WO2012/069654的SEQ ID NO:17至25和43至48组成的组的血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的序列不同。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:10至20中任一个的倒数第二个氨基酸是Ala或Leu，优选Ala。在一个实施方案中，SEQ ID NO:10至20中任一个的C-末端氨基酸是Ala或Asn，优选Ala，或任选地缺失。例如，SEQ ID NO:29包含例如SEQ ID NO:15，其中倒数第二个氨基酸是Leu并且C-末端氨基酸缺失。优选，存在于本发明的重组结合蛋白中的任何经设计的锚蛋白重复结构域(即SEQ ID NO:10至20中的任一个)的倒数第二个氨基酸和C-末端氨基酸都是Ala。
在一个实施方案中，在SEQ ID NO:10至30和32至33中任一个的N末端处的氨基酸Gly、Ser任选地缺失。
在一个实施方案中，所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的氨基酸序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是相同的。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白的所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的氨基酸序列是相同的。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白的所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域每个包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白的所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计锚蛋白重复结构域每个由SEQ ID NO:14组成。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白的两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域能够同时各自结合一个血清白蛋白分子。
在一个实施方案中，本发明涉及包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述四个经设计的锚蛋白重复结构域中的两个是对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，并且其中所述四个经设计的锚蛋白重复结构域中的两个是对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，并且其中所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个由SEQ ID NO:14组成。
在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:14的所述经设计的锚蛋白重复结构域与包含SEQ ID NO:13的经设计的锚蛋白重复结构域相比，前者在PBS中表现出改善的储存稳定性。在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:14的所述经设计的锚蛋白重复结构域与包含SEQ IDNO:15的经设计的锚蛋白重复结构域相比，前者在PBS中表现出改善的储存稳定性。在一个实施方案中，由SEQ ID NO:14组成的所述经设计的锚蛋白重复结构域与由SEQ ID NO:13组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，前者在PBS中表现出改善的储存稳定性。在一个实施方案中，由SEQ ID NO:14组成的所述经设计的锚蛋白重复结构域与由SEQ ID NO:15组成的经设计的锚蛋白重复结构域相比，前者在PBS中表现出改善的储存稳定性。由SEQ ID NO:12至15组成的经设计的锚蛋白重复结构域是对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的示例
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，其中所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个包含氨基酸序列SEQ ID NO:14，并且其中与包含氨基酸序列SEQ IDNO:13的经设计的锚蛋白重复结构域相比，对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每个在PBS中表现出改善的储存稳定性，在PBS中以10mg/ml在40℃下储存1个月之后，优选减少量的降解产物。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，其中与对应的重组结合蛋白相比，所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，表现出改善的储存稳定性，在PBS中以10mg/ml在40℃下储存1个月之后，优选减少量的降解产物，其中所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。SEQ ID NO:21和22分别是包含SEQ ID NO:14和13的此类重组结合蛋白的示例。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，与仅包含一个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的对应的重组结合蛋白相比，前者表现出改善的药代动力学特性。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，与仅包含一个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的对应的重组结合蛋白相比，前者在食蟹猴中表现出更长的终末半衰期。实施例11(参见图5b)公开了具有改善的药代动力学特性的重组结合蛋白。
在一个实施方案中，所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域是所述两个对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，一个是N-末端并且一个是C-末端。
在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个与SEQ ID NO:16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:16，和/或(ii)其中SEQ ID NO:16的最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸被任何氨基酸交换的序列。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个包含SEQ ID NO:16。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个由SEQ ID NO:16组成。
在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个与SEQ ID NO:17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:17，和/或(ii)其中SEQ ID NO:17的最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸被任何氨基酸交换的序列。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个包含SEQ ID NO:17。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个由SEQ ID NO:17组成。
在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个与SEQ ID NO:16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性，并且对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个与SEQ ID NO:17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(i)SEQID NO:16，和/或(ii)其中SEQ ID NO:16的最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸被任何氨基酸交换的序列，并且对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:17，和/或(ii)其中SEQ IDNO:17的最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸被任何氨基酸交换的序列。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个包含SEQ ID NO:16，并且对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个包含SEQ IDNO:17。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个由SEQ ID NO:16组成，并且对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的一个由SEQ ID NO:17组成。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含SEQ ID NO:17的SEQ ID NO:16的N-末端。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含与SEQ ID NO:32具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(i)SEQ IDNO:32，和/或(ii)其中SEQ ID NO:32的最多20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸被任何氨基酸交换的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述四个经设计的锚蛋白重复结构域中的两个是对由SEQ ID NO:16和17组成的HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，并且其中所述四个经设计的锚蛋白重复结构域中的两个是对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，并且其中所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个由SEQID NO:14组成。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO:32和两个SEQ ID NO:14的重组结合蛋白。在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO:32和两个SEQ ID NO:14的重组结合蛋白，其中SEQ ID NO:32在N末端处侧接一个SEQ ID NO:14，并且在C末端处侧接一个SEQID NO:14。
在一个实施方案中，连接本发明的重组结合蛋白中存在的经设计的锚蛋白重复结构域的多肽接头包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：氨基酸序列SEQ ID NO:2至9、更优选SEQ ID NO:3至9、更优选SEQ ID NO:4至9、更优选SEQ ID NO:6或9、更优选SEQ IDNO:9，其中所述SEQ ID NO:2至9、更优选SEQ ID NO:3至9、更优选SEQ ID NO:4至9、更优选SEQ ID NO:6或9、更优选SEQ ID NO:9的最多4、3、2、1、0个氨基酸被任何氨基酸交换。在一个实施方案中，SEQ ID NO:7至9的侧接N-末端Gly、Ser和/或SEQ ID NO:2至6中任一个的侧接C-末端Gly、Ser任选地缺失。在一个实施方案中，SEQ ID NO:2至9中的任一个任选地另外包含Arg、Ser C-末端(例如存在于SEQ ID NO:29中)。在一个实施方案中，所述多肽接头包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2至9，更优选SEQ ID NO:3至9，更优选SEQ ID NO:4至9，更优选SEQ ID NO:6或9，更优选SEQ ID NO:9的氨基酸序列中的任一个。在一个实施方案中，连接本发明的重组结合蛋白中存在的经设计的锚蛋白重复结构域的多肽接头由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:2至9，更优选SEQ ID NO:3至9，更优选SEQ ID NO:4至9，更优选SEQ ID NO:6或9，更优选SEQ ID NO:9的氨基酸序列中的任一个。在一个实施方案中，连接本发明重组结合蛋白中存在的经设计的锚蛋白重复结构域的多肽接头各自由SEQ ID NO:9组成。在一个实施方案中，存在于本发明的重组结合蛋白中的所述多肽接头的70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是相同的，优选所述多肽接头是相同的。在一个实施方案中，所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，并且所述四个经设计的锚蛋白重复结构域通过多肽接头连接，每个接头由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明涉及包含从N至C末端的重组结合蛋白：SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:14，通过多肽接头连接。在一个实施方案中，本发明涉及包含从N至C末端的重组结合蛋白：SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:16-SEQID NO:9-SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:14。
在一个实施方案中，本发明涉及重组结合蛋白，其包含与由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白具有至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及重组结合蛋白，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:21，和/或(ii)其中SEQ IDNO:21的最多72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸被其他氨基酸交换的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及重组结合蛋白，其由与由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白具有至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，本发明涉及重组结合蛋白，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：(i)SEQID NO:21，以及(ii)其中SEQ ID NO:21的最多72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸被其他氨基酸交换的氨基酸序列。优选，SEQ ID NO:21中的所述氨基酸交换位于SEQ ID NO:21的第127至444位。
在一个实施方案中，本发明涉及重组结合蛋白，其包含与由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白具有至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述重组结合蛋白包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，并且其中所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。在一个实施方案中，本发明涉及重组结合蛋白，其包含与由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白具有至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述重组结合蛋白包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，并且其中所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成。在一个实施方案中，本发明涉及重组结合蛋白，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:21，和/或(ii)其中SEQ ID NO:21的最多72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸被其他氨基酸交换的氨基酸序列，其中所述重组结合蛋白包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，并且其中所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。在一个实施方案中，本发明涉及重组结合蛋白，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:21，和/或(ii)其中SEQ ID NO:21的最多72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸被其他氨基酸交换的氨基酸序列，其中所述重组结合蛋白包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，并且其中所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成。
在一个实施方案中，本发明涉及包含由SEQ ID NO:21组成的氨基酸序列的重组结合蛋白。在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重组结合蛋白。优选的是包含SEQ ID NO:21氨基酸序列的重组结合蛋白。优选的是SEQ ID NO:21。优选的是重组结合蛋白，其中氨基酸序列是SEQ ID NO:21。优选的是一种蛋白质，其中氨基酸序列是SEQ ID NO:21。优选的是由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白。优选的是由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的重组结合蛋白。
多个特征使得由SEQ ID NO:21编码的蛋白质成为本发明优选的重组结合蛋白。它包含两个对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域和两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，其中所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个由SEQ ID NO:14组成。两个对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在两个不同的表位处结合HER2。它是第一将血清白蛋白结合与双互补位HER2结合进行组合的重组结合蛋白。与对血清白蛋白具有结合特异性的已知经设计的锚蛋白重复结构域相比，SEQ ID NO:14的经设计的锚蛋白重复结构域显示出改善的储存稳定性特性(参见实施例2和3；图2)。与仅具有一个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的对应的重组结合蛋白相比，所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域令人惊讶地导致改善的重组结合蛋白的药代动力学特性(实施例11，图5)当两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域侧接对HER2具有结合特异性的其他经设计的锚蛋白重复结构域时，观察到最佳的药代动力学特性(实施例11)。对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域以及它们的结构排列的选择导致了该化合物的最大活性(实施例5、6和7)。经设计的锚蛋白重复结构域使用富含PT的接头连接，令人惊讶地导致改善的药代动力学特性(实施例10和11)。该分子在一个分子中结合至少两种药物(例如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)的功能，并且另外可以诱导HER2表达型细胞的细胞凋亡(实施例6，图7)。
在一个实施方案中，由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白与由SEQ ID NO:22组成的对应的重组结合蛋白相比，前者表现出改善的储存稳定性。在一个实施方案中，与由SEQ ID NO:22组成的对应的重组结合蛋白相比，在PBS中以10mg/ml在40℃下储存1个月之后，由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白表现出减少量的降解产物。
在一个实施方案中，由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白与由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白相比，前者表现出改善的药代动力学特性，其中已经去除了对血清白蛋白具有结合特异性的C-末端经设计的锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，由SEQ IDNO:21组成的所述重组结合蛋白与由SEQ ID NO:21的氨基酸1至422组成的重组结合蛋白相比，前者表现出改善的药代动力学特性。在一个实施方案中，由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白与由SEQ ID NO:33组成的重组结合蛋白相比，前者表现出改善的药代动力学特性。
在一个实施方案中，对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每个在PBS中用低于10-5M，优选低于10-6M，或更优选低于10-7M解离常数(Kd)结合小鼠、大鼠、狗、食蟹猴或人源的血清白蛋白，更优选小鼠、食蟹猴或人源的血清白蛋白，更优选食蟹猴或人源的血清白蛋白，更优选人源血清白蛋白。在一个实施方案中，对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每个由SEQ ID NO:14组成并在PBS中用低于10-5M，优选低于10-6M，或更优选低于10-7M的解离常数(Kd)结合人血清白蛋白。使用表面等离振子共振的解离常数确定的实施例在实施例5和WO2014/083208中给出。
在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每个在PBS中用低于10-6M，优选低于10-7M，更优选低于10-8M，或更优选低于10-9M的解离常数(Kd)结合人源HER2。在一个实施方案中，对由SEQ ID NO:16组成的HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中用低于10-6M，优选低于10-7M，更优选低于10-8M，更优选低于10-9M，更优选低于10-10M，或更优选低于10-11M的解离常数(Kd)结合人HER2。在一个实施方案中，对由SEQ ID NO:17组成的HER2具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中用低于10-6M，优选低于10-7M，更优选低于10-8M，或更优选低于10-9M的解离常数(Kd)结合人HER2。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白在PBS中用低于10-7M，优选低于10-8M，更优选低于10-9M，或更优选低于10-10M的解离常数(Kd)结合人源HER2。在一个实施方案中，对包含SEQ ID NO:32的HER2具有结合特异性的所述重组结合蛋白在PBS中用低于10-8M，优选低于10-9M，或更优选低于10-10M的解离常数(Kd)结合人血清白蛋白。在一个实施方案中，对包含SEQ ID NO:21的HER2具有结合特异性的所述重组结合蛋白在PBS中用低于10-7M，优选低于10-8M，更优选低于10-9M，或更优选低于10-10M解离常数(Kd)结合人源HER2。在一个实施方案中，对由SEQ ID NO:21组成的HER2具有结合特异性的所述重组结合蛋白在PBS中用低于10-7M，优选低于10-8M，更优选低于10-9M，或更优选低于10-10M的解离常数(Kd)结合人源HER2。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白用低于10-5M，优选低于10-6M，或更优选低于10-7M的解离常数(Kd)结合人血清白蛋白。在一个实施方案中，对包含SEQ ID NO:21的HER2具有结合特异性的所述重组结合蛋白在PBS中用低于10-5M，优选低于10-6M，或更优选低于10- 7M的解离常数(Kd)结合人血清白蛋白。在一个实施方案中，对由SEQ ID NO:21组成的HER2具有结合特异性的所述重组结合蛋白在PBS中用低于10-5M，优选低于10-6M，或更优选低于10-7M的解离常数(Kd)结合人血清白蛋白。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白用低于10-6M，优选低于10-7M，或更优选低于10-8M的抑制常数(IC50)抑制HER2表达型细胞的细胞增殖。此类细胞的实施例包括BT474、SKBR-3、SKOV-3、NCI-N87、ZR-75-30、HCC1419或MDA-MB175细胞。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白用低于10-6M，优选低于10-7M，或更优选低于10-8M的抑制常数(IC50)抑制BT474细胞增殖。在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:32的重组结合蛋白用低于10-6M，优选低于10- 7M，或更优选低于10-8M的抑制常数(IC50)抑制BT474细胞增殖。在一个实施方案中，包含SEQID NO:21的重组结合蛋白用低于10-6M，优选低于10-7M，或更优选低于10-8M的抑制常数(IC50)抑制BT474细胞增殖。在一个实施方案中，由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白用低于10-6M，优选低于10-7M，或更优选低于10-8M的抑制常数(IC50)抑制BT474细胞增殖。细胞抑制测定是本领域熟知的。在一个实施方案中，由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白比仅具有一个对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白更有效地抑制BT474细胞增殖。在一个实施方案中，由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白在没有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC；本领域从业者熟知)的帮助下抑制BT474细胞增殖。在一个实施方案中，由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白在没有IgG1-Fc片段辅助的情况下抑制BT474细胞增殖。
在一个实施方案中，包含、优选由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白诱导BT474细胞的细胞凋亡。在一个实施方案中，包含、优选由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白用小于100nM的半最大有效浓度(EC50)值诱导BT474细胞的细胞凋亡。优选，所述重组结合蛋白用小于90、80、70、60、50、40、30、20或10nM的EC50值诱导BT474细胞的细胞凋亡。优选，100nM的所述重组结合蛋白诱导BT474的细胞凋亡的程度大于100nM曲妥珠单抗、100nM帕妥珠单抗、或100nM曲妥珠单抗和100nM帕妥珠单抗的混合物。在一个实施方案中，包含、优选由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白诱导HER2表达型细胞的细胞凋亡。
在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:21的所述重组结合蛋白抑制RAS路径。在一个实施方案中，当用包含SEQ ID NO:21的所述重组结合蛋白处理时，与用曲妥珠单抗处理时相比，BT474中HER2磷酸化较少。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白能够同时结合HER2和人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白能够同时结合两分子人血清白蛋白。可以使用表面等离振子共振实验(实施例5)或与静态光散射偶联的尺寸排阻色谱法(实施例14)、本领域技术人员熟知的技术显示此类同时结合。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白以双互补位模式结合HER2。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白在两个不同的表位处结合HER2。
在一个实施方案中，本发明涉及包含第一经设计的锚蛋白重复结构域、第二经设计的锚蛋白重复结构域、第三经设计的锚蛋白重复结构域和第四经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述第一经设计的锚蛋白重复结构域和所述第二经设计的锚蛋白重复结构域各自对HER2具有结合特异性，并且其中所述第三经设计的锚蛋白重复结构域和所述第四经设计的锚蛋白重复结构域各自对血清白蛋白具有结合特异性。优选，所述重组结合蛋白由单个多肽链组成。更优选，所述第一经设计的锚蛋白重复结构域、所述第二经设计的锚蛋白重复结构域、所述第三经设计的锚蛋白重复结构域和所述第四经设计的锚蛋白重复结构域通过多肽接头连接。SEQ ID NO:21是此类重组结合蛋白的示例。
在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述第一经设计的锚蛋白重复结构域是HER2的结合结构域II。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述第二经设计的锚蛋白重复结构域是HER2的结合结构域IV。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述第一经设计的锚蛋白重复结构域是HER2的结合结构域II，并且对HER2具有结合特异性的所述第二经设计的锚蛋白重复结构域是HER2的结合结构域IV。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述第一经设计的锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:16。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述第二经设计的锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:17。在一个实施方案中，对HER2具有结合特异性的所述第一经设计的锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:16，并且对HER2具有结合特异性的所述第二经设计的锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:17。
在一个实施方案中，对包含SEQ ID NO:16的HER2具有结合特异性的所述第一经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中用低于10-6M，优选低于10-7M，更优选低于10-8M，更优选低于10-9M，更优选低于10-10M，或更优选低于10-11M的解离常数(Kd)结合人HER2。在一个实施方案中，对包含SEQ ID NO:17的HER2具有结合特异性的所述第二经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中用低于10-6M，优选低于10-7M，更优选低于10-8M，或更优选低于10-9M的解离常数(Kd)结合人HER2。
在一个实施方案中，对血清白蛋白具有结合特异性的所述第三经设计的锚蛋白重复结构域和所述第四经设计的锚蛋白重复结构域中的每个在PBS中用低于10-5M，优选低于10-6M，或更优选低于10-7M的解离常数(Kd)结合人血清白蛋白。在一个实施方案中，对血清白蛋白具有结合特异性的所述第三经设计的锚蛋白重复结构域和所述第四经设计的锚蛋白重复结构域各自包含SEQ ID NO:14，各自在PBS中用低于10-5M，优选低于10-6M，或更优选低于10-7M的解离常数(Kd)结合人血清白蛋白。
在“第一经设计的锚蛋白重复结构域”、“第二经设计的锚蛋白重复结构域”、“第三经设计的锚蛋白重复结构域”和“第四经设计的锚蛋白重复结构域”中使用的术语“第一”、“第二”、“第三”和任选地“第四”，不指示或暗示所述经设计的锚蛋白重复结构域在重组结合蛋白内的任何位置排列。在一个实施方案中，所述四个经设计的锚蛋白重复结构域位于N至C末端：第三-第一-第二-第四。
在一个实施方案中，重组结合蛋白在小鼠的肿瘤异种移植模型中抑制BT474细胞增殖。在一个实施方案中，重组结合蛋白抑制小鼠中HER2表达型来源于患者的异种移植癌症模型中的肿瘤生长。在一个实施方案中，重组结合蛋白抑制小鼠中HER2表达型来源于患者的异种移植胃窦癌模型中的肿瘤生长。术语“HER2表达型来源于患者的异种移植”具有来源于患者的癌症组织异种移植的含义，其中在所述组织中在至少一个细胞处在背景上表达HER2。
在本发明涉及经设计的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白(其包含与给定氨基酸序列具有至少88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列)的任何实施方案中，不相同的氨基酸可位于该经设计的锚蛋白重复结构域或该重组结合蛋白的任何位置处。
同样，在本发明涉及经设计的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白(其中至最多72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个氨基酸被任意氨基酸交换)的任何实施方案中，被交换的氨基酸氨基酸可位于经设计的锚蛋白重复结构域的任何位置处。修饰本发明(例如通过点突变)的重组结合蛋白的技术是本领域技术人员熟知的。从SEQ ID NO:21开始，本领域技术人员知道如何以及在何处交换氨基酸(例如使用WO2002/020565的知识)，以产生具有未改变的功能活性的高可能性的SEQ ID NO:21的序列变体。
在一个实施方案中，与缺乏对血清白蛋白具有结合特异性的所述第四经设计的锚蛋白重复结构域的对应的重组结合蛋白相比，所述重组结合蛋白表现出终末半衰期的增加，优选终末半衰期增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、或45％。在一个实施方案中，与仅包含一个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的对应的重组结合蛋白相比，所述重组结合蛋白表现出终末半衰期的增加，优选终末半衰期增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、或45％。实施例11中给出了终末半衰期这样增加的实施例。
在一个实施方案中，包含、优选由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白在食蟹猴中表现出1mg/kg的约47小时的终末半衰期。在一个实施方案中，包含、优选由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白在食蟹猴中表现出5mg/kg的约100小时的终末半衰期。在一个实施方案中，包含、优选由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白在食蟹猴中表现出10mg/kg的超过100小时的终末半衰期。在一个实施方案中，包含、优选由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白在食蟹猴中表现出100mg/kg的超过100小时的终末半衰期。
在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的经设计的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白、优选本发明的重组结合蛋白的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的重组结合蛋白的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码由SEQ ID NO:21组成的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码所述重组结合蛋白的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白的核酸。此外，本发明涉及包含本发明的任何核酸的载体。核酸是技术人员所熟知的。在实施例中，使用核酸在大肠杆菌中产生本发明的经设计的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域，和/或编码本发明的重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域的核酸，以及任选地药学上可接受的载体和/或稀释剂。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重组结合蛋白或编码重组结合蛋白的核酸以及任选地药学上可接受的载体和/或稀释剂的药物组合物。
药物可接受的载体和/或稀释剂是本领域技术人员已知的，并且将在下文更详细地说明。更进一步地，考虑包含上述重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域和/或核酸中的一者或多者(特别是重组结合蛋白和/或核酸)的诊断组合物。
药物组合物包含如本文所述的重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域和/或核酸，优选重组结合蛋白和/或核酸，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，例如如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol,A.Ed.，1980中所述。本领域技术人员已知的合适载体、赋形剂或稳定剂是盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、汉克氏溶液、固定油，油酸乙酯、5％右旋糖盐水、增强等渗性和化学稳定性的物质、缓冲液和防腐剂。其它合适载体包括本身不诱导产生对接收组合物的个体有害的抗体的任何载体，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。药物组合物还可以是组合制剂，其包含另外的活性药剂，诸如抗癌药剂或抗血管生成药剂，或另外的生物活性化合物。
本发明的一个实施方案涉及本发明的重组结合蛋白用于制造药物组合物的用途，所述重组结合蛋白包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域，其中与仅包含一个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的对应的重组结合蛋白相比，所述重组结合蛋白表现出增加的终末半衰期，优选增加的终末半衰期为至少5％，优选10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、或250％。
在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种如本文所述的重组结合蛋白和洗涤剂诸如非离子洗涤剂、缓冲液诸如磷酸盐以及糖诸如蔗糖。在一个实施方案中，此类组合物包含如上所述的重组结合蛋白和PBS。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的药物组合物或重组结合蛋白用于治疗疾病的用途。为此，将根据本发明的药物组合物或重组结合蛋白以治疗有效量施用给对其有需要的患者。施用可包括局部施用、口服施用和肠胃外施用。典型的施用途径是肠胃外施用。在肠胃外施用中，本发明的药物组合物将与如上所述的药学上可接受的赋形剂联合被配制成单位剂量可注射形式，诸如溶液、混悬液或乳液。施用的剂量和模式将取决于待治疗的个体和特定疾病。
此外，考虑将上述药物组合物或重组结合蛋白中的任一种用于治疗障碍。
在一个实施方案中，静脉内施用所述重组结合蛋白或本文所述的其它此类药物组合物。对于肠胃外应用，重组结合蛋白或所述药物组合物可以治疗有效量推注注射或通过缓慢输注来注射。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗医学病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本发明的重组结合蛋白的步骤。在一个实施方案中，本发明涉及治疗医学病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本发明的药物组合物的步骤。实施例7(图4)示出了使用包含SEQ ID NO:21的重组结合蛋白用于治疗癌症的效用。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的药物组合物用于治疗疾病的用途。在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗疾病的药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗医学病症的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及用作药物的由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白。在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗疾病的由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白。在一个实施方案中，所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子被认为用于治疗疾病。在一个实施方案中，本发明涉及包含所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子的药物。在一个实施方案中，本发明涉及由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白在药物组合物中用于治疗疾病的用途。在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗疾病的所述药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗疾病的所述重组结合蛋白。在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗疾病的所述核酸。在一个实施方案中，本发明涉及所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子作为治疗疾病的药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子用于治疗疾病的用途。在一个实施方案中，本发明涉及所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子用于制造药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子在制造用于治疗疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及制造用于治疗疾病的药物的方法，其中所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子是药物的活性成分。在一个实施方案中，本发明涉及使用所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子治疗疾病的方法。
术语“医学病症”(或障碍或疾病)包括自身免疫性障碍、炎性障碍、视网膜病变(特别是增殖性视网膜病变)、神经退行性障碍、感染、代谢疾病和肿瘤性疾病。本文所述的重组结合蛋白中的任一种可用于制备用于治疗此类障碍、特别是选自包含以下障碍的组的药物：自身免疫性障碍、炎性障碍、视网膜病变和肿瘤性疾病。“医学病症”可以是以细胞增殖不当为特征的病症。医学病症可能是过度增殖病症。本发明特别地涉及治疗医学病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本发明的重组结合蛋白或所述药物组合物的步骤。在一个优选的实施方案中，所述医学病症是肿瘤性疾病。如本文所用，术语“肿瘤性疾病”是指以细胞生长或肿瘤快速增殖为特征的细胞或组织的异常状态或病症。在一个实施方案中，所述医学病症是恶性肿瘤性疾病。在一个实施方案中，所述医学病症涉及癌症。在一个实施方案中，所述医学病症涉及HER2表达型癌症、HER2成瘾癌症、局部HER2成瘾癌症、HER2过表达型癌症、HER2扩增癌症、曲妥珠单抗耐药癌症和/或曲妥珠单敏感型癌症。在一个实施方案中，所述医学病症涉及乳腺癌和/或胃肠癌和/或脑癌。在一个实施方案中，所述医学病症涉及乳腺癌、卵巢癌、胃窦癌、胃癌、子宫癌、结肠直肠癌、膀胱癌和/或HER2过表达型癌症。术语“脑癌”可能涉及HER2过表达型癌症的脑癌细胞转移、HER2扩增癌症的脑癌细胞转移、HER2过表达型脑癌或HER2扩增的脑癌。术语“胃肠”癌症可能与胃窦癌、食道癌、结肠直肠癌、胆管癌、胆囊癌或胰腺癌有关。术语“治疗有效量”是指足以对患者产生期望效应的量。在一个实施方案中，所述医学病症涉及癌症，其中所述癌症的细胞表现出如通过IHC确定的高于背景的HER2表达水平。在一个实施方案中，所述医学病症涉及癌症，其中所述癌症的细胞表现出如通过IHC确定的HER2表达水平高于其附近的健康细胞的表达水平。此类高于背景的HER2表达水平是本领域从业者所熟知的，例如来自诸如(Dako)的测定。优选，高于背景的HER2表达水平涉及1+、2+或3+，更优选2+或3+的评分。Her2过表达是本领域从业者所熟知的(Rüschoff等人，2012.ModernPathology 25,637-650；Wolff等人，2013.J.Clin.Oncol.31(31),3997-4014)。
特别地，本发明涉及使用本发明的药物组合物治疗医学病症，其中所述医学病症是癌症。
本发明的重组结合蛋白或所述药物组合物用于治疗癌症疾病的用途也可与本领域已知的一个或多个其他治疗组合。如本文所用，术语“与…组合使用”是指按照给定服法进行的同时施用。这包括不同化合物的同步施用以及不同化合物的时移施用(例如，化合物A给出一次，并且之后化合物B给出若干次，反之亦然，或者两种化合物同步给出并且两种中的一种化合物在后续阶段中也给出)。可以例如共同施用的化合物的示例包括紫杉烷、蒽环类药物、铂基化疗、5-FU、PI3K抑制剂(诸如例如Apitolisib，Taselisib或Alpelisib)、MEK抑制剂(诸如例如曲美替尼，或考比替尼)、RAS抑制剂(诸如例如Salirasib)、RAF抑制剂、mTOR抑制剂(包括例如Apitolisib和依维莫司)、泛EGFR抑制剂、微管抑制剂(包括艾日布林)、靶向治疗包括细胞周期激酶抑制剂(诸如例如帕博西尼)、HER2抑制剂、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-DM1、帕妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、贝伐单抗、兰尼单抗、MP0250、易普利姆玛、派姆单抗、Nivolumab、Urelumab、Utolimumab或Atezolizumab。优选这些化合物以推荐剂量使用。在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:21的所述重组结合蛋白增强了PI3K抑制剂、mTOR抑制剂、艾日布林、曲妥珠单抗或拉帕替尼的效应。在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:21的所述重组结合蛋白能够使用较低剂量的PI3K抑制剂、mTOR抑制剂、艾日布林、曲妥珠单抗或拉帕替尼来治疗疾病。此类组合的示例在实施例17中给出。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的重组结合蛋白用于制造药物的用途，所述药物用于治疗医学病症、优选肿瘤性疾病、更优选癌症。
在一个实施方案中，本发明涉及本发明的药物组合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗可能是肿瘤性疾病、特别是癌症的医学病症。
待用于体内施用的制剂必须是无菌的或经过消毒的。这很容易通过经过无菌的过滤膜过滤实现。
在一个实施方案中，本发明涉及包含上述重复结构域中的任一者的重组结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含所述重组结合蛋白。在一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含编码所述重组结合蛋白的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含所述药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含所述重组结合蛋白和/或编码所述重组结合蛋白的核酸、和/或所述药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含包含、优选由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白；和/或包含、优选由SEQ ID NO:21组成编码重组结合蛋白的核酸；和/或包含包含、优选由SEQ IDNO:21组成的重组结合蛋白的药物组合物；和/或包含、优选由SEQ ID NO:21组成的编码重组结合蛋白的核酸。
在一个实施方案中，本发明涉及用于产生本发明的重组结合蛋白的方法。在一个实施方案中，本发明涉及产生包含、优选由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(i)在细菌中表达所述重组结合蛋白，以及(ii)使用色谱法纯化所述重组结合蛋白。所述方法可包括另外的步骤。在实施例1中给出了此类产生本发明的重组结合蛋白的方法。
本发明不限于实施例中描述的具体实施方案。其它来源可按照下文所述的概要使用和处理。
在整个本说明书中引用了多篇文献。这些文献的公开内容以引用方式并入本文。
本说明书涉及本说明书中命名为“P015_Sequence_Listing.txt”的氨基酸序列表的多个氨基酸序列，并且该序列记录(sequence protocol)的氨基酸序列以引用方式并入本文。
定义
在本发明的上下文中，术语“蛋白质”是指多肽，其中多肽的至少一部分通过在单个多肽链内和/或在多个多肽链之间形成二级、三级或四级结构而具有或能够获得限定的三维排列。如果蛋白质包含两个或更多个多肽链，则各个多肽链可非共价连接或共价连接，例如通过在两个多肽之间的二硫键连接。通过形成二级或三级结构而单独具有或能够获得限定的三维排列的蛋白质部分被称为“蛋白质结构域”。这种蛋白质结构域是本领域从业者熟知的。
如在重组蛋白质、重组蛋白质结构域、重组结合蛋白等中使用的术语“重组”，是指通过使用相关领域的从业者熟知的重组DNA技术产生所述多肽。例如，可将编码多肽的重组DNA分子(例如，通过基因合成产生)克隆到细菌表达质粒(例如，pQE30，QIAgen公司)、酵母表达质粒、哺乳动物表达质粒或植物表达质粒，或者能够体外表达的DNA中。如果例如将这种重组细菌表达质粒插入适当的细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))中，则该细菌可产生由该重组DNA编码的多肽。对应产生的多肽被称为重组多肽或重组蛋白质。
在本发明的上下文中，术语“结合蛋白”是指包含两个或更多个、优选三个或更多个、更优选四个或更多个结合结构域的蛋白质。优选，所述结合蛋白是重组结合蛋白。优选，所述结合蛋白包含四个重复结构域。更优选，所述结合蛋白包含四个经设计的锚蛋白重复结构域。优选，所述结合蛋白的所述结合结构域中的两个各自对血清白蛋白具有靶标特异性。同样优选，所述结合蛋白的所述结合结构域中的两个各自对HER2具有靶标特异性。
此外，任何此类结合蛋白可包含另外的多肽(诸如例如多肽标签、多肽接头、与其他结合蛋白质类结构域融合、细胞因子、激素或拮抗剂)，或本领域技术人员熟知的化学修饰(诸如与聚乙二醇、毒素(例如来自免疫原的DM1)、小分子、抗生素等的偶联)。
术语“结合结构域”是指表现出与蛋白质支架相同的“折叠”(即二级、三级和/或四级结构)并具有如下所述的预先确定的特性的蛋白质结构域。这种结合结构域可通过合理的或最常见的组合蛋白质工程技术即本领域已知的技术(Binz,H.K.、Amstutz,P.、Plückthun,A.，2005年。Nat.Biotech.23,1257-1268)来获得。例如，具有预先确定的特性的结合结构域可通过包括以下步骤的方法获得：(a)提供表现出与下文进一步所述的蛋白质支架相同折叠的蛋白质结构域的不同集合；以及(b)筛选所述不同集合和/或从所述不同集合中进行选择，以获得至少一个具有所述预先确定的特性的蛋白质结构域。蛋白质结构域的不同集合可通过符合所用的筛选系统和/或选择系统的若干方法来提供，并且可包括使用本领域技术人员熟知的方法，诸如噬菌体展示法或核糖体展示法。优选，所述结合结构域是重组结合结构域。
术语“蛋白质支架”是指具有高度耐受氨基酸插入、置换或缺失的暴露表面积的蛋白质。可用于生成本发明的结合结构域的蛋白质支架的示例是抗体或其片段(诸如，单链Fv或Fab片段)、来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白质A、来自欧洲粉蝶(Pieris brassicae)的胆汁三烯结合蛋白或其它载脂蛋白、锚蛋白重复蛋白或其它重复蛋白，以及人纤粘蛋白。蛋白质支架是本领域技术人员已知的(Binz等人，2005年(上述引文)；Binz等人，2004年(上述引文))。
术语“靶标”是指单个分子，诸如核酸分子、多肽或蛋白质、碳水化合物或任何其它天然存在的分子，包括这种单个分子的任何部分，或者两种或更多种这种分子的复合物。靶标可以是全细胞或组织样本，或者可以是任何非天然化合物。优选，靶标是天然存在的或非天然的多肽或包含化学修饰(例如，通过天然或非天然磷酸化、乙酰化或甲基化修饰)的多肽。在本发明的特定应用中，靶标是血清白蛋白和HER2。
术语“预先确定的特性”是指特性诸如结合靶标、阻断靶标、激活靶标介导的反应、酶活性以及相关的其它特性。根据所需特性的类型，普通技术人员将能够识别用于进行筛选和/或选择具有所需特性的结合结构域的方式和必要步骤。优选，所述预先确定的特性是特异性结合到靶标。
在本发明的上下文中，术语“多肽”涉及由多个(即两个或更多个)经由肽键连接的氨基酸的链组成的分子。优选，多肽由超过八个的经由肽键连接的氨基酸组成。术语“多肽”还包括通过半胱氨酸的S-S桥连接在一起的氨基酸的多个链。多肽是本领域技术人员熟知的。
术语“多肽标签”是指连接到多肽/蛋白质的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可用于纯化、检测或“靶向”(即定位到靶标位点)所述多肽/蛋白质，或者其中所述氨基酸序列改善多肽/蛋白质的物理化学行为，或者其中所述氨基酸序列具有效应子功能。结合蛋白的单个多肽标签可直接或经由多肽接头连接到结合蛋白的其它部分。这些多肽标签在本领域中是众所周知的，并且是本领域技术人员完全可用的。多肽标签的示例是较小多肽序列，例如His(例如，SEQ ID NO:1的His-标签)、myc、FLAG或Strep-标签；或多肽，诸如允许检测所述多肽/蛋白质的酶(例如，碱性磷酸酶)或可用于靶向的多肽(诸如，免疫球蛋白或其片段)和/或可用作效应子分子的多肽。
术语“多肽接头”是指能够连接例如两个蛋白质结构域、多肽标签和蛋白质结构域、蛋白质结构域和非蛋白质类化合物或聚合物(诸如，聚乙二醇)或者两个序列标签的氨基酸序列。这种另外的结构域、标签、非蛋白质类化合物或聚合物以及接头是相关领域技术人员已知的。示例的列表在专利申请WO2002/020565的说明书中提供。此类接头的特定示例是可变长度的甘氨酸-丝氨酸-接头和脯氨酸-苏氨酸-接头。甘氨酸-丝氨酸-接头的示例是SEQ ID NO:2至6中提供的GS和氨基酸序列，并且氨基酸序列SEQ ID NO:7至9中提供了脯氨酸-苏氨酸-接头的示例。
专利申请WO2002/020565和Forrer等人，2003(Forrer,P.、Stumpp,M.T.、Binz,H.K.、Plückthun,A.，2003.FEBS Letters 539，2-6)，包含重复蛋白特征和重复结构域特征、技术和应用的一般描述。术语“重复蛋白”是指包含一个或多个重复结构域的蛋白质。优选，重复蛋白包含最多六个重复结构域。更优选，重复蛋白包含最多五个重复结构域。更优选，重复蛋白包含最多四个重复结构域。此外，所述重复蛋白可包含另外的非重复蛋白结构域、多肽标签和/或多肽接头。重复结构域可以是如上文所述的结合结构域。
术语“重复结构域”是指包含两个或更多个连续重复模块作为结构单元的蛋白质结构域，其中所述结构单元具有相同的折叠，并且紧密堆叠以产生具有节点疏水核的超螺旋结构。紧接结构同源性，这种重复模块还具有序列同源性。优选，重复结构域还包含N-末端和/或C-末端封端重复。为了清楚起见，封端重复可以是重复模块。这种重复结构域、重复模块和封端重复、序列基元以及结构同源性和序列同源性是本领域从业者根据以下各项的示例所熟知的：锚蛋白重复结构域(WO2002/020565)、富含亮氨酸的重复结构域(WO2002/020565)、三十四肽重复结构域(Main,E.R.、Xiong,Y.、Cocco,M.J.、D'Andrea,L.、Regan,L.，Structure 11(5)，497-508，2003年)和犰狳重复结构域(WO2009/040338)。本领域从业者进一步熟知的是，这些重复结构域与包含重复氨基酸序列的蛋白质不同，在包含重复氨基酸序列的蛋白质中，每个重复氨基酸序列都能够形成单个结构域(例如，纤粘蛋白的FN3结构域)，或重复氨基酸序列不是结构单元，即所述重复氨基酸序列并未紧密堆叠起以产生具有节点疏水核的超螺旋结构。用于识别和确定重复模块或重复序列基元或者用于识别包含这种重复单元或基元的相关蛋白质家族的方法(诸如，同源性检索(等))在生物信息学领域中已经很成熟，并且是本领域从业者熟知的。
术语“经设计的重复蛋白”和“经设计的重复结构域”分别是指作为创新性规程(例如，专利申请WO2002/020565中所阐述)的结果而获得的重复蛋白或重复结构域。术语“经设计的”是指这种重复蛋白和重复结构域分别是人造的、合成的而非来源于自然界这一特性。WO2002/020565的经设计的重复蛋白或经设计的重复结构域分别包括经设计的锚蛋白重复蛋白或经设计的锚蛋白重复结构域。因此，本文中的经设计的锚蛋白重复蛋白对应于包含至少一个经设计的锚蛋白重复结构域的本发明蛋白质。此外，术语“非来源于自然界”是指所述结合蛋白或所述结合结构域的序列不作为序列数据库中(例如，GenBank、EMBL-Bank或Swiss-Prot中)的非人工序列条目存在。这些数据库和其它类似的序列数据库是本领域技术人员熟知的。本发明的重组结合蛋白或经设计的锚蛋白重复结构域是非天然存在的。
术语“重复模块”、“重复单元”、“封端重复”、“封端模块”以及与重复蛋白和重复结构域相关的其它术语在WO2002/020565有所定义，并且这些定义以引用方式并入本文。
术语“对靶标具有结合特异性”、“特异性结合到靶标”、“高特异性结合到靶标”、“特异于靶标”或“靶标特异性”等是指，在PBS中结合蛋白或结合结构域以比其结合到不相关的蛋白质(诸如，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP))更低的离解常数(即，其以更高的亲和力结合)结合到靶标。优选，靶标在PBS中的解离常数(“Kd”)是MBP的对应解离常数的至少1/102、更优选至少1/103、更优选至少1/104，或更优选至少1/105。确定蛋白质-蛋白质相互作用的解离常数的方法，诸如基于表面等离振子共振(SPR)的技术(例如，SPR均衡分析)或等温滴定量热法(ITC)是本领域技术人员熟知的。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH)下进行测量，则特定蛋白质-蛋白质相互作用的测量Kd值可以是变化的。因此，优选利用标准化蛋白质溶液和标准化缓冲液(诸如，PBS)来进行Kd值的测量。
术语“PBS”是指包含137mM NaCl、10mM磷酸盐和2.7mM KCl并且pH为7.4的磷酸盐缓冲水溶液。
在本发明的上下文中，术语“抑制细胞增殖”和类似术语是指所述重组结合蛋白抑制细胞增殖的能力。抑制的强度通常通过评估半最大抑制浓度(IC50)来进行测量。术语“抑制”和IC50值的评估在本领域中已经很成熟。
术语“小鼠血清白蛋白”是指UniProt登录号P07724，术语“食蟹猴血清白蛋白”(即食蟹猕猴)是指UniProt登录号A2V9Z4，以及术语“人血清白蛋白”是指UniProt登录号P02768。
如本文所用，HER2涉及人表皮生长因子受体2，也称为Neu、ErbB-2、CD340(分化簇340)或p185。HER2是表皮生长因子受体(EGFR/ErbB)家族的成员。在人类中，HER2由ERBB2编码，它是位于人体17号染色体长臂处(17q12)的已知原癌基因。HER2具有UniProtKB/Swiss-Prot编号P04626。人HER2由1255个氨基酸和21个氨基酸信号序列、631个氨基酸的细胞外区域(例如包含结构域I至IV的胞外域)、23个氨基酸的跨膜区域和580个氨基酸的细胞质结构域组成。
在本发明的上下文中，“改善的储存稳定性”是指通过在PBS中以10mg/ml在40℃储存1个月后发生的考马斯染色的SDS-PAGE检测到的降解条带的量的减少，优选降解产物的量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。通过SDS-PAGE评估储存稳定性的方法是本领域技术人员熟知的。具有改善的储存稳定性特性的经设计的锚蛋白重复结构域和重组结合蛋白的示例在实施例2和实施例3中给出。
表达“仅包含一个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白”是指具有本发明的重组结合蛋白的组成的重组结合蛋白，其中通过去除对血清白蛋白具有结合特异性的所有(除了一个以外)经设计的锚蛋白重复结构域和对应的多肽接头，将对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的数量减少为一个。
术语“双互补位结合蛋白”是指针对位于相同靶标蛋白质上的两个不同表位的结合蛋白。例如，靶向HER2的双互补位结合蛋白包含靶向HER2上的第一表位的至少第一结合结构域和靶向HER2上的不同第二表位的第二结合结构域。由SEQ ID NO:32组成的蛋白质是双互补位结合蛋白，其包含两个对靶向HER2上的不同表位的HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白包含SEQ ID NO:32。
在本发明中，表达“表现出改善的药代动力学特性”、“改善的药代动力学特性”或“药代动力学特性改善”具有以下含义：与所比较的蛋白质的对应药代动力学参数相比，重组结合蛋白的药代动力学参数得以改善。对应的示例示于实施例8、实施例9、实施例10和实施例11(参见图5和图6)中。优选，改善的药代动力学特性是减少的清除率，和/或增加的暴露率，和/或增加的终末半衰期。更优选，改善的药代动力学特性是增加的终末半衰期。在一个实施方案中，与仅包含一个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的对应的重组结合蛋白相比，包含至少两个、更优选包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的本发明的重组结合蛋白表现出至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或250％的增加的终末半衰期，和/或减少的清除率，和/或增加的暴露率。在一个实施方案中，与仅包含一个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的对应的重组结合蛋白相比，包含至少两个、更优选包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的本发明的重组结合蛋白表现出增加的终末半衰期，优选至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或250％的增加的终末半衰期。
优选，在哺乳动物、更优选小鼠和/或食蟹猴、更优选食蟹猴中评估清除率和/或暴露率和/或终末半衰期。优选，当在小鼠中测量清除率和/或暴露率和/或终末半衰期时，考虑注射后最多48小时的数据来进行评价。更优选，在小鼠中评价终末半衰期时，用从24小时至48小时的数据进行计算。优选，当在食蟹猴中测量清除率和/或暴露率和/或终末半衰期时，考虑注射后最多第7天的数据进行评价。更优选，在食蟹猴中评价终末半衰期时，用从第1天至第5天的数据进行计算。本领域技术人员能够进一步识别效应诸如靶标介导的清除率，并在计算终末半衰期时考虑它们。药物(诸如，本发明的重组结合蛋白)的术语“终末半衰期”是指达到伪平衡后药物血浆浓度达到施加于哺乳动物的该药物浓度的一半所需的时间(例如，在小鼠中用从24小时至48小时的数据进行计算，或者在食蟹猴中用从第1天至第5天的数据进行计算)。并未将终末半衰期定义为施用给哺乳动物的药物剂量消除一半所需的时间。术语“终末半衰期”是本领域技术人员熟知的。优选，药代动力学比较以任何剂量、更优选以当量剂量(即相同的mg/kg剂量)或等摩尔剂量(即相同的mol/kg剂量)、更优选以等摩尔剂量(即相同的mol/kg剂量)进行。本领域技术人员应当理解，动物中当量和/或等摩尔剂量给药经受至少20％，更优选为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的实验剂量变化。优选，用于药代动力学测量的剂量选自0.001mg/kg至1000mg/kg、更优选选自0.01mg/kg至100mg/kg、更优选选自0.1mg/kg至50mg/kg、更优选选自0.5mg/kg至10mg/kg。
实施例
常用材料和方法：本文公开的所有标准材料和试剂是本领域技术人员已知的，并且可商购获得或者可以使用熟知的技术制备。细胞系购自LGC/ATCC(法国/美国)。细胞培养基来自Invitrogen/Lubio(瑞士)。除非另行指出，否则根据所述的已建立的方案进行这些方法(例如Sambrook J.、Fritsch E.F.和Maniatis T.，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory 1989，纽约)，这是本领域从业者所熟知的。使用的一些方法先前已经在WO2012/069654和WO2014/083208中描述。
经设计的锚蛋白重复结构域：WO2012/069654中描述了生成对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的方法。WO2014/083208中描述了生成对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的方法，以及此类经设计的锚蛋白重复结构域的实施例和生成双互补位结合蛋白的方法。通常在WO2002/020565中描述了经设计的锚蛋白重复结构域。
实施例1：重组DNA、蛋白质表达和蛋白质纯化
通过本领域技术人员熟知的遗传手段生成编码经设计的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白的DNA。重组结合蛋白选自包括氨基酸序列SEQ ID NO:21至33的组，任选地另外在N末端具有SEQ ID NO:1，或者经设计的锚蛋白重复结构域选自包括氨基酸序列SEQ IDNO:10至20的组，任选地另外在N末端具有SEQ ID NO:1，使用标准技术在大肠杆菌的细胞质中表达，例如使用来自Qiagen(德国)的pQE表达系统。在氨基酸GS在N末端处的情况下，因为起始Met之后是小Gly残基(即，例如在SEQ ID NO:21的位置1处的氨基酸)，因此由表达载体另外编码的Met残基在大肠杆菌细胞质中被有效地从所表达的多肽上切除。使用弗氏压碎器(French press)裂解细胞，并使用本领域技术人员熟知的标准色谱技术将蛋白质从细胞粗提物纯化至接近均质。
以下列表定义了本发明中使用的蛋白质：
蛋白质#10-His：SEQ ID NO:10，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#11-His：SEQ ID NO:11，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#12-His：SEQ ID NO:12，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#13-His：SEQ ID NO:13，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#14-His：SEQ ID NO:14，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#15-His：SEQ ID NO:15，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#16-His：SEQ ID NO:16，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#17-His：SEQ ID NO:17，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#18-His：SEQ ID NO:18，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#19-His：SEQ ID NO:19，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#20-His：SEQ ID NO:20，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#21：SEQ ID NO:21
蛋白质#21-His：SEQ ID NO:21，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#22：SEQ ID NO:22
蛋白质#22-His：SEQ ID NO:22，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#23：SEQ ID NO:23
蛋白质#23-His：SEQ ID NO:23，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#24：SEQ ID NO:24
蛋白质#24-His：SEQ ID NO:24，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#25：SEQ ID NO:25
蛋白质#25-His：SEQ ID NO:25，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#26：SEQ ID NO:26
蛋白质#26-His：SEQ ID NO:26，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#27：SEQ ID NO:27
蛋白质#27-His：SEQ ID NO:27，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#28：SEQ ID NO:28
蛋白质#28-His：SEQ ID NO:28，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#29：SEQ ID NO:29
蛋白质#29-His：SEQ ID NO:29，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#30：SEQ ID NO:30
蛋白质#30-His：SEQ ID NO:30，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#31-His：SEQ ID NO:31(在其N末端处包含His标签)
蛋白质#32：SEQ ID NO:32
蛋白质#32-His：SEQ ID NO:32，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
蛋白质#33：SEQ ID NO:33
蛋白质#33-His：SEQ ID NO:33，其His-标签(SEQ ID NO:1)与其N末端融合
实施例2：生成稳定性改善的具有对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋 白重复结构域(SEQ ID NO:14)。
与通常经设计的锚蛋白重复知识相比，我们发现蛋白质#12-His、蛋白质#13-His和蛋白质#15-His(WO2012/069654；参见实施例1)在PBS中以10mg/kg在40℃下长时间温育后降解，因此不适合用作药物候选物的组分。对SEQ ID NO:13的氨基酸序列的分析显示了大量潜在的降解位点。在另外的潜在降解位点中，降解可例如发生在SEQ ID NO:13的第5个天冬酰胺(包括天冬酰胺-甘氨酸二肽)、第13个天冬氨酸或第10个甘氨酸中的任一个附近。SEQ ID NO:13还包含大量的潜在氧化位点。因此，需要分析大量突变体和组合突变体以分离表现出改善的储存稳定性特性的变体。令人惊讶的是，我们可以通过仅突变SEQ ID NO:13的80位来生成对储存稳定性表现出主要效应的功能变体。当将在SEQ ID NO:13的80位处的天冬氨酸突变为谷氨酸时，生成对血清白蛋白具有结合特异性的功能性经设计的锚蛋白重复结构域，对应于SEQ ID NO:14，其确实显示出储存稳定性的显著改善(实施例3；图2)。蛋白质#14-His，与蛋白质#13-His一样，在pH 7.4的PBS中显示出对人、小鼠和食蟹猴血清白蛋白的低纳摩尔亲和力(解离常数(Kd)低于100nM)(根据制造商(BioRad公司)的ProteOn表面等离振子共振测量)。令人惊讶的是，蛋白质#14-His与蛋白质#13-His相比，前者另外表现出改善的热变性中点，如使用众所周知的技术通过热解折叠确定(Niesen,F.H.、Berglund,H.、Vedadi,M.，Nature Protocols 2，2212-2221,2007；蛋白质#13-His：Tm＝86℃；蛋白质#14-His，Tm＝89.5℃；pH 6.0)。
实施例3：当使用SEQ ID NO:14时蛋白质储存稳定性的改善。
如实施例1中所述制备蛋白质#13-His、蛋白质#14-His和蛋白质#15-His，并将样本在PBS中浓缩至10mg/ml。然后在-80℃或40℃下将蛋白质#14-His和蛋白质#15-His在玻璃小瓶中储存1个月，之后在SDS 15％PAGE上分析。虽然蛋白质#14-His和蛋白质#15-His在-80℃下储存时显示出相同的稳定性，但是蛋白质#14-His在40℃下储存1个月之后，与SDS 15％ PAGE上的蛋白质#15-His相比，前者显示出>50％减少的显著减少量的降解产物。类似地，当在PBS中以10mg/ml在4℃、25℃、40℃和60℃下储存一周时，与蛋白质#13-His相比，蛋白质#14-His显示出显著减少量的降解产物。特别地，分别在40℃或60℃下储存时，与蛋白质#13-His相比，蛋白质#14-His在SDS 15％PAGE上显示出>50％减少的降解产物(图2)。这些发现说明，与蛋白质#13-His和蛋白质#15-His相比，蛋白质#14-His具有改善的储存稳定性。类似地，当比较蛋白质#12-His、蛋白质#13-His、蛋白质#14-His与蛋白质#15-His(参见实施例1)的储存稳定性时，通过将蛋白质以10mg/ml在PBS中在玻璃小瓶中在40℃下温育1个月，并且与蛋白质#15-His相比，蛋白质#12-His、蛋白质#13-His和蛋白质#14-His表现出>30％减少的降解产物。
当测试蛋白质#21和蛋白质#22(分别对应于SEQ ID NO:21和22的氨基酸序列组成的重组结合蛋白)的储存稳定性时，还观察到储存稳定性改善。如实施例1所述制备蛋白质#21和蛋白质#22，将样本在PBS中浓缩至10mg/ml，并在-80℃或40℃下在玻璃小瓶中储存1个月，随后通过标准尺寸排阻色谱法分析。虽然蛋白质#21和蛋白质#22在-80℃下储存时显示相同的洗脱图谱，但蛋白质#21在40℃下储存时显示出与蛋白质#22相比显著更多的单体物质。这表明，在重组结合蛋白中存在SEQ ID NO:21比存在SEQ ID NO:22在储存稳定性方面更有利。类似地，在40℃下于玻璃小瓶中以10mg/ml在PBS中储存1个月后通过SDS-PAGE分析时，蛋白质#21比蛋白质#22表现出更低的降解产物量，确认了与包含SEQ ID NO:22的重组结合蛋白相比，包含SEQ ID NO:21的重组结合蛋白的储存稳定性较高。这继而表明，对重组结合蛋白中存在由SEQ ID NO:14组成的血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域与对存在由SEQ ID NO:13组成的血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域相比，前者对于储存稳定性更有利。
实施例4：药物候选物的生成
早先已经公开了对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的实施例(WO2014/083208；WO2014/060365；Steiner,D.、Forrer,P.和Plückthun,A.、J.Mol.Biol.382，1211-1227，2008；Zahnd,C.、Pecorari,F.、Straumann,N.、Wyler,E.和Plückthun,A.、J.Biol.Chem.281(46)，35167-35175，2006)。在WO2014/083208和WO2014/060365中，对结合不同结构域的HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域进行组合，导致显示出对肿瘤细胞生长的增强抑制的双互补位结合蛋白。
由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白是包含两个对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的药物候选物(分别为SEQ ID NO:16和17)，以及两个侧接的对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域(每个SEQ ID NO:14)，通过多肽接头(每个SEQ ID NO:9)连接(参见图1)。该重组结合蛋白已经通过复杂的规程识别，包括蛋白质工程和优化步骤等。在第一步骤中，通过克隆，表达和纯化生成数百种对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的组合作为双互补位结合蛋白(参见实施例1)。然后如WO2014/083208中所述并如下所述筛选双互补位结合蛋白对HER2的亲和力以及细胞效力和细胞增殖抑制。由该工作产生的双互补位结合蛋白的代表性结果在实施例5和6中给出。重要的是，该分子需要是双互补位的，因为仅有一个对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域导致分子没有细胞抑制效力。在重组结合蛋白中进一步工程化。该步骤包括(其中之一)药代动力学工程，通过将对各种形式的血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域添加到(即添加对分子中不同位置处的血清白蛋白具有结合特异性的不同数量的经设计的锚蛋白重复结构域)双互补位结合蛋白中，并通过测试各种多肽接头。测试这些蛋白质的体内功效(代表性实施例7)、小鼠的药代动力学(代表性实施例8)和食蟹猴(代表性实施例9)中的药代动力学以及细胞效力。多肽接头的优化包括测试接头对药代动力学图谱的效应的步骤(代表性实施例10)。通过药代动力学测量(代表性实施例11)和效力测量(代表性实施例12)评估药代动力学工程工作的优化。此外，测试各种药物候选物在大肠杆菌中的重组表达水平(实施例13)。由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白是由该工作产生的蛋白质。它是人类使用的药物候选物。
蛋白质#31(由SEQ ID NO:31组成的重组结合蛋白)对应于由蛋白质#21组成的蛋白质和在N末端处的SEQ ID NO:1的氨基酸。
实施例5：HER2通过包含SEQ ID NO:21的重组结合蛋白的高亲和力结合。
如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#21-His。如WO2014/083208中所述通过表面等离振子共振评估其对HER2的亲和力。通过对不同浓度获得的共振单位值的总体拟合来确定27pM的解离常数，这是本领域从业者熟知的方法。相比之下，包含对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的另一个组合的蛋白质#23-His(参见实施例1)表现出64pM的解离常数。同样，对应于SEQ ID NO:16和17的经设计的锚蛋白重复结构域的组合与基于对WO2014/083208中已知的HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域生成的大多数组合相比，前者表现出更好的解离常数。
表面等离振子共振测量进一步显示，由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白不与HER3或EGFR的细胞外结构域相互作用。
表面等离振子共振测量进一步显示，由SEQ ID NO:16或17组成的经设计的锚蛋白重复结构域(在N末端处各自另外包含SEQ ID NO:1)对于HER2结合分别表现出9pM和152pM的解离常数。
表面等离振子共振实验进一步显示，蛋白质#21可以同时结合人HER2和人血清白蛋白。
表面等离振子共振实验进一步显示，100nM的蛋白质#21以21nM的解离常数(Kd)结合人血清白蛋白。
实施例6：包含SEQ ID NO:21的重组结合蛋白的高细胞效力和细胞凋亡的诱导。
如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#21-His和蛋白质#23-His。通过使用BrdU标记(BrdU，细胞增殖ELISA，罗氏公司)测量DNA合成来确定重组结合蛋白对BT474细胞增殖的效应。简而言之，在100ul完全培养基中的96孔板中每孔接种10000个BT474细胞并温育24小时。添加重组结合蛋白或对照温育另外的72小时。最后24小时添加用于细胞标记的BrdU。根据制造商的方案检测标记的(增殖的)细胞。使用GraphPad prism软件分析数据，在x轴上绘制log[c]而在y轴上绘制OD 450-602nm。使用非线性回归拟合(log(拮抗剂)与响应-可变斜率(四个参数))来拟合数据，得到IC50值。结果示于图3中。蛋白质#21-His以1.5nM的表观IC50值抑制BT474细胞的增殖。对于蛋白质#23-His，观察IC50为2.4nM，高出60％(即较差)，表明在重组结合蛋白中具有SEQ ID NO:16和17比具有SEQ ID NO:18和17更有利。同样，对应于SEQ ID NO:16和17的经设计的锚蛋白重复结构域的组合与基于对WO2014/083208中已知的HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域生成的大多数组合观察到的结果相比，前者抑制具有较低表观IC50值的BT474细胞。
由SEQ ID NO:21(蛋白质#21)组成的重组结合蛋白进一步表现出对多种癌症细胞系的强增殖抑制，包括细胞系SKBR-3、SKOV-3、NCI-N87、ZR-75-30、HCC1419或MDA-MB175。
通过蛋白质#21对细胞凋亡的诱导通过使用Caspase 3/7-Glo系统(瑞士，Promega公司)测量Caspase 3/7活化来确定。简而言之，在100μl完全培养基中的96孔板中每孔接种10000个BT474细胞并温育24小时。添加蛋白质#21和基准温育另外的24小时。根据制造商的方案添加Caspase Glo试剂温育1小时。通过测量荧光素酶活性监测Caspase 3/7活化。另选地，使用细胞死亡检测ELISAPLUS系统(瑞士，罗氏公司)确定细胞凋亡的诱导。根据制造商的方案进行测定。细胞数目和温育时间与Caspase Glo读数相似。使用GraphPad prism软件分析数据，在x轴上绘制浓度而在y轴上绘制OD405/490nm或相对光单位(RLU；在Tecan M-1000读取器上测量)。使用非线性回归拟合(log(激动剂)与响应-可变斜率(四个参数))来拟合数据。结果示于图7中。对于蛋白质#21，观察到EC50为2.4nM。细胞凋亡在诱导细胞系SKBR-3、SKOV-3、NCI-N87、ZR-75-30、HCC1419或MDA-MB175的细胞凋亡中同样表现出高效力。相比之下，抗体曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的混合物不诱导BT474细胞的细胞凋亡(图7)。
重要的是，这些测定显示蛋白质#21，其中SEQ ID NO:32侧接SEQ ID NO:14，表现出高细胞效力，类似于单独使用SEQ ID NO:32时。
实施例7：在小鼠肿瘤异种移植模型中包含SEQ ID NO:21的重组结合蛋白的高功 效。
如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#21-His、蛋白质#23-His、蛋白质#24-His、蛋白质#25-His。在一项研究中，将蛋白质#21-His与曲妥珠单抗和PBS相比。结果示于图4a中。BT474乳腺癌肿瘤异种移植小鼠模型基本上使用本领域技术人员熟知的规程如下进行：对BT474人乳腺癌细胞进行培养，重悬浮，并将每只小鼠包含50:50基质胶(BD Biosciences公司)的200μl RPMI1640的培养基中的2*107个细胞注射到雌性Balb/c裸小鼠的右侧腹中。在肿瘤体积约200mm3至300mm3时，将小鼠随机分组，每组8只动物，并且通过静脉施用PBS曲妥珠单抗(10mg/kg)、曲妥珠单抗(10mg/kg)和帕妥珠单抗(10mg/kg)，或蛋白质#21-His(35mg/kg)开始肿瘤治疗，施用7剂，间隔3天(Q3Dx7)。测量肿瘤体积持续32天。蛋白质#21-His比曲妥珠单抗更有效地抑制肿瘤生长。
在使用BT474细胞的类似研究中(相同的设置和规程；所有均为35mg/kg剂量)，将蛋白质#21-His与蛋白质#23-His、蛋白质#24-His和蛋白质#25-His相比。治疗之后第18天的结果示于图4b中。重要的是，蛋白质#21-His在抑制肿瘤方面比蛋白质#23-His、蛋白质#24-His或蛋白质#25-His更有效。
此外，如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#21。PBS、蛋白质#21(60mg/kg)、曲妥珠单抗(10mg/kg)、帕妥珠单抗(10mg/kg)以及曲妥珠单抗与帕妥珠单抗(各10mg/kg)的组合用于本领域技术人员所熟知的来源于患者的胃窦癌肿瘤异种移植小鼠模型中。所有组每三天剂量给药6次。简而言之，在裸小鼠中连续传代从异种移植中获得肿瘤片段。在从供体小鼠中取出之后，将肿瘤切成碎片(4mm至5mm直径)用于皮下植入。当肿瘤达到约100mm3至120mm3的体积时，将小鼠随机分组。在每个实验中，将随机化和治疗起始日指定为第0天。在随机化当天用卡尺进行二维测量，然后每周测量两次以监测肿瘤生长。通过将第x天的单个肿瘤体积(Tx)除以第0天(T0)的相同肿瘤的单个体积乘以100％来计算第x天的单个肿瘤(单个RTV)的相对体积。根据测试组与对照组的中值RTV值乘以100％的比率计算特定日的肿瘤抑制(T/C的％)。图4c显示了与曲妥珠单抗以及曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合相比，蛋白质#21在胃窦癌PDX模型GXA3039中的功效。蛋白质#21表现出对肿瘤生长的强烈抑制，类似于曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合，而单独的曲妥珠单抗不太有效。图4d显示了在相同模型中比较蛋白质#21与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗以及曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合的第二个实验。蛋白质#21表现出对肿瘤生长的强烈抑制，类似于曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合。仅曲妥珠单抗和仅帕妥珠单抗的疗效显著较低。这表明该肿瘤模型可能随时间推移获得了曲妥珠单抗耐药性。这继而又表明蛋白质#21即使在曲妥珠单抗耐药癌症中也是有效的。
在类似的实验中，与拉帕替尼的标准治疗(图4e)相比，在本领域技术人员熟知的胃窦癌PDX小鼠模型GXA281中进一步测试蛋白质#21。简而言之，如上所述进行肿瘤植入和肿瘤生长监测。拉帕替尼以100mg/kg/天的剂量每天静脉剂量给药持续21天，并且蛋白质#21以40mg/kg静脉剂量给药，每三天6次。
该实施例的这些实验示出了用作治疗疾病的药物的包含SEQ ID NO:21的蛋白质的效用。
实施例8：包含SEQ ID NO:21的重组结合蛋白在小鼠中的有利药代动力学特性。
在该实施例中显示的测量是如实施例11中所述的半衰期工程工作的结果。如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#21-His和蛋白质#23-His。如别处所述，在小鼠中评估His-标记的蛋白质的药代动力学特性(Zahnd,C.、Kawe,M.、Stumpp,M.T.、de Pasquale,C.、Tamaskovic,R.、Nagy-Davidescu,G.、Dreier,B.、Schibli,R.、Binz,H.K.、Waibel,R.、Plückthun,A.、Cancer Res.70，1595-1605，2010)。结果示于图5中。蛋白质#21-His表现出为30.4小时的终末半衰期，在48小时之后剩余19.5％的ID。相比之下，蛋白质#23-His表现出为24.7小时的终末半衰期，在48小时之后剩余6.5％的ID。因此，重组结合蛋白中存在的SEQID NO:16似乎比存在SEQ ID NO:18更有利。
实施例9：包含SEQ ID NO:21的重组结合蛋白在食蟹猴中的有利药代动力学特性。
在该实施例中显示的测量是如实施例11中所述的半衰期工程工作的结果。如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#21-His、蛋白质#23-His和蛋白质#24-His。在食蟹猴中评估蛋白质的药代动力学特性。经由静脉内输注以在1mg/kg之间的目标剂量水平将蛋白质施用至食蟹猴持续30分钟。在剂量给药前和再次在选定的时间点收集血液样本，例如在输注结束后(即注射后)5分钟、10分钟、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时、216小时和240小时。允许血液样本在室温下静置并离心以生成血清，随后在-80℃下储存以待分析。使用本领域技术人员熟知的规程确定药代动力学参数。使用兔单克隆抗经设计的锚蛋白重复结构域抗体作为捕获试剂以及鼠类单克隆抗经设计的锚蛋白重复结构域抗体作为检测试剂，并使用标准曲线，通过夹心ELISA确定蛋白质的血清浓度。使用标准软件诸如Phoenix WinNonLin(Certara,Princeton,USA)或GraphPadPrism(GraphPad Software,La Jolla,USA)和标准分析诸如非隔室分析来确定药代动力学参数。蛋白质#21-His和蛋白质#23-His的结果示于图6中。蛋白质#21-His表现出为47小时的终末半衰期，而蛋白质#23-His表现出为35小时的终末半衰期，蛋白质#24-His表现出为45小时的终末半衰期。一旦浓度低于100nM，则蛋白质也表现出显著的靶标介导的清除率。靶标介导的清除率是本领域技术人员熟知的，并且从例如靶向HER2的抗体中已知。
类似地，如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#21-His。如上所述，以1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg在食蟹猴中评估蛋白质的药代动力学特性。如上所述评价药代动力学参数，并且结果示于图6中。观察到终末半衰期从1mg/kg的47小时至5mg/kg的100小时至10mg/kg的超过100小时的剂量依赖性增加。一旦浓度低于100nM，则观察到靶标介导的清除率。
当测试蛋白质#21(如实施例1中所述表达和纯化)时，观察到类似的结果。如上所述，以1mg/kg、10mg/kg和100mg/kg在食蟹猴中评估蛋白质的药代动力学特性。如上所述评价药代动力学参数。观察到终末半衰期的剂量依赖性增加。对于蛋白质#21，在食蟹猴中以100mg/kg的剂量观察到终末半衰期为109.5小时或130.6小时。
实施例10：通过选择多肽接头改善药物特性。
连接蛋白质结构域的多肽接头是本领域技术人员熟知的。富含Gly-Ser的接头在单链Fv抗体片段中为人们所熟知的，其中已经证明它们最适合连接两条Fv多肽链。令人惊讶的是，我们发现与富含Gly-Ser的接头相比，富含Pro-Thr的接头对重组结合蛋白的药代动力学特性具有积极影响，该重组接合蛋白包含两个对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域和两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#26-His和蛋白质#27-His。如实施例8中所述进行小鼠的药代动力学分析。在静脉注射后48小时，蛋白质#27-His剩余7％的注射剂量，而蛋白质#26-His仅剩余5.3％的注射剂量。类似地，蛋白质#27-His表现出比蛋白质#26-His更长的终末半衰期。
实施例11：工程药代动力学特性
本领域已知许多用于药代动力学工程的选择，包括聚乙二醇化、多肽延伸、Fc融合、血清白蛋白融合和与血清白蛋白的结合等(Kontermann,R(Ed.)“Therapeuticproteins:strategies to modulate their plasma half-lives”，Wiley-VCH VerlagGmbH，2012，ISBN 978-3-527-32849-9)。从例如与对包含SEQ ID NO:16和17的HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的组合开始，存在数百种潜在的药物候选物变体(药代动力学修饰工程的选择、多肽接头的选择(例如SEQ ID NO:2至9等许多)、其他方面等)。我们发现，使用两个对由SEQ ID NO:14组成的血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域(参见实施例2和3)，并且通过使用富含Pro-Thr的多肽接头(SEQ ID NO:9)，产生了SEQ ID NO:21，实现了有益的药代动力学特性，并且与其他测试形式相比具有明显的优势。选择多肽接头的效应的结果示于例如实施例10中。蛋白质#29-His和蛋白质#30-His的小鼠药代动力学图谱的比较，令人惊讶地显示了与仅具有一个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复蛋白相比，具有两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的益处(参见图5)，因为关于白蛋白结合结构域的文献表明，与仅存在一个白蛋白结合结构域相比，分子中存在的两个白蛋白结合结构域对药代动力学特性没有任何益处(Hopp等人，上述引文)。类似地，当比较蛋白质#21(由SEQ ID NO:21组成的重组结合蛋白)与蛋白质#21变体时，其中对血清白蛋白具有结合特异性的C-末端经设计的锚蛋白重复结构域缺失(SEQ ID NO:21的1至422个氨基酸，产生蛋白质#33)，蛋白质#21表现出显著改善的药代动力学特性，特别是更长的终末半衰期。比较蛋白质#21的食蟹猴药代动力学图谱与5mg/kg剂量的聚乙二醇化蛋白质#28(其包含对HER2具有结合特异性的相同经设计的锚蛋白重复结构域(SEQ ID NO:16和17)，但蛋白质#28包含40kDa PEG部分而不是两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域)，表明包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质表现出显著改善的药代动力学特性。如实施例9中所述，蛋白质#21-His和蛋白质#24-His的药代动力学图谱的比较显示了具有两个对侧接SEQ ID NO:16和17的血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域而不是在N-末端都具有它们是更有利的(参见图6)。
对于该实施例中的研究，根据实施例1制备蛋白质#21-His、蛋白质#24-His、蛋白质#28-His、蛋白质#29-His和蛋白质#30-His。通过将PEG-部分马来酰亚胺偶联到蛋白质#28-His的游离C-末端半胱氨酸上，使用40kDa PEG部分(NOF Sunbright GL2-400MA)另外聚乙二醇化蛋白质#28-His，随后使用本领域技术人员熟知的标准纯化方法、规程纯化至均质。如实施例8和9中所述进行小鼠或食蟹猴的药代动力学分析。
实施例12：与包含SEQ ID NO:24的重组结合蛋白相比，包含SEQ ID NO:21的重组 结合蛋白表现出更好的体内效力
如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#21-His和蛋白质#24-His。如实施例7中所述进行小鼠异种移植实验。结果示于图4b中。在治疗32天之后，蛋白质#21-His表现出比蛋白质#24-His显著更好的肿瘤抑制。这表明具有对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域(其侧接对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域)(如SEQ IDNO:#21中所见)比具有对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域(在对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的两个N-末端)(如SEQ ID NO:#24中所见)更有利。
实施例13：在大肠杆菌中的高重组表达产量。
将编码蛋白质#21、蛋白质#23和蛋白质#25的序列克隆到标准T7启动子载体中，并在大肠杆菌HMS174(DE3)中表达这些蛋白质。对于蛋白质#21实现4.4g/l的滴度，而蛋白质#23显示出1.9g/l的滴度，并且蛋白质#25显示出2.1g/l的滴度，表明蛋白质#21的最佳表达。令人惊讶的是，尽管使用相同的组分(经设计的锚蛋白重复结构域和多肽接头)，但蛋白质#21中使用的经设计的锚蛋白重复结构域的排列导致观察到比例如在蛋白质#25中使用的另一种排列更高的重组表达。有趣的是，对应于SEQ ID NO:16和17的经设计的锚蛋白重复结构域的组合与基于对WO2014/083208中已知的HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域生成的大多数组合相比，前者表现出更好的重组蛋白表达。
实施例14：通过蛋白质#21同时结合两种血清白蛋白分子。
如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#21。使用30μM蛋白质#21、60μM人血清白蛋白(CSL Behring 20％溶液用于通过Superdex 200 26/60柱((GE Healthcare)美国通用电气医疗集团)上的尺寸排阻色谱法纯化人血清白蛋白的单体部分)或两者的1:2混合物在PBS中进行与静态光散射(Superdex 200 10/300GL((GE Healthcare)美国通用电气医疗集团)、Agilent 1200((Life Technologies)美国生命科技公司)、Wyatt Optilab Trex(RI)和三角度激光光散射仪(MALS))偶联的尺寸排阻色谱法。
蛋白质#21作为单体峰洗脱，并且通过MALS确定的分子量为65.2kDa，其在其理论分子量(66437Da)的1.2kDa内。将血清白蛋白作为55.1kDa的单体峰进行洗脱(理论分子量58917Da)。两个分子的1:2混合物(摩尔比)导致平均分子量为169.8kDa(范围：186.2kDa至136.6kDa)的主峰，包含对应于1:2复合物(理论分子量：191.8kDa)以及1:1复合物(132.8kDa)的分子量物质。另外，检测到小的游离血清白蛋白峰对应于实验中使用的6.5％的血清白蛋白。未检测到包含对应于游离蛋白质#21的分子量的峰。这些结果表明，蛋白质#21可以同时结合两种血清白蛋白分子。
实施例15：蛋白质#21的高度的热稳定性。
如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#21。使用Jasco J-815CD光谱仪在氮气气氛(3L/min)中使用圆二向色性评价热稳定性。使用溶液内温度控制传感器测量117.100F-QS比色皿(Hellma公司，d＝1cm)中在PBS中0.4μM的蛋白质#21，从20℃加热至95℃(低于45℃：+3℃/min；高于45℃：+1℃/min)，在222nm处记录信号，在95℃下延迟1分钟，并且随后进行冷却阶段(与加热阶段相比，倒置程序)将CD信号归一化为平均残余椭圆率(MRE)，单位为deg cm2dmol-1。另外，记录了远紫外CD光谱。
蛋白质#21表现出典型的α-螺旋蛋白质的CD光谱，在208nm和222nm处具有特征性最小值。蛋白质#21在稳定的基线(斜率无变化)之后表现出高度的热稳定性，在78℃以上检测到在222nm处的信号损失。
实施例16：蛋白质#21对磷酸化蛋白质组的影响。
如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#21。用蛋白质#21(100nM)、曲妥珠单抗(100nM)、帕妥珠单抗(100nM)、曲妥珠单抗(100nM)和帕妥珠单抗(100nM)的混合物或PBS处理BT474或NCI-N87细胞18小时。然后如Britton,D等人所述使细胞经受磷酸化蛋白质组质谱分析。(Britton,D.、Zen,Y.、Quaglia,A.、Selzer,S.、Mitra,Vl.、C.、Jung,S.、G.、Schmid,P.、Prefot,P.、Hoehle,C.、Koncarevic,S.、Gee,J.、Nicholson,R.、Ward,M.、Castellano,L.、Stebbing,J.、Zucht,H.D.、Sarker,D.、Heaton,N.和Pike,I.，2014，PLOS One 9(3),e90948)。该分析显示，与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和两者的组合相比，用蛋白质#21进行的细胞处理差异地调节了多种磷酸化肽。结果示于表1中。重要的是，蛋白质#21与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗以及曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的混合物表现出一些显著差异，因为它在1073/1078/1083、1139/1151、1172/1174、1174和1240位点处抑制了更强的磷酸化HER2。在其他磷酸化位点，磷酸化增加(772)。在HER2的下游，发现mTOR信号传导级联的特异性成员在用蛋白质#21处理后被差异调节；例如，与下调仅为在0.88倍的范围的其他组相比，S6激酶的磷酸肽(S441/T444/S447)被下调至PBS的0.63倍。此外，映射到MAPK1和MAPK3的磷酸化肽显著下调。
通过针对AKT-S473(BioConcept：Phospho-Akt1(Ser473)夹心ELISA试剂盒#7160)的磷酸位点特异性ELISA分析相同样本显示，与其中下调仅在0.3倍至0.7倍的范围内的其他组相比，蛋白质#21下调至PBS的0.16倍。ELISA的结果示于表2中。
这些结果表明，与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和两者的组合相比，蛋白质#21差异地调节HER2下游信号传导。在AKT-mTOR路径中观察到最大的差异，AKT-mTOR路径是细胞存活的关键路径，这继而又解释了为什么蛋白质#21诱导了细胞凋亡。磷酸肌醇3-激酶(PI3K/Akt)路径被认为是通过阻断细胞凋亡来维持细胞存活的关键路径中的一个。其例如通过HER2/HER3-异二聚化病理性激活，因此可导致恶性增殖。
在该实验中，进一步观察到，与仅暴露于PBS相比，BT474和NCI-N87细胞暴露于蛋白质#21分别使Foxo3a蛋白质的细胞水平增加1.88倍和2.8倍。通过暴露于曲妥珠单抗，BT474和NCI-N87细胞中Foxo3a蛋白质水平的对应分别增加1.14倍和1.32倍；并且通过暴露于帕妥珠单抗分别增加1.21倍和1.25倍；并且通过暴露于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗分别增加1.28倍和1.19倍。因此，与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗或两者的组合相比，蛋白质#21导致更高的细胞Foxo3a蛋白质水平的增加。本领域从业者已知Akt1使Foxo3a磷酸化，导致Foxo3a的降解并促进细胞存活。Akt磷酸化的抑制导致Foxo3a的稳定化并因此增加Foxo3a水平。在增加的水平中，Foxo3a可以易位至细胞核并诱导细胞凋亡。
表1：通过质谱评价不同蛋白质对BT474细胞蛋白质(HER2、AKT、mTOR、RPS6KB1/S6 激酶、RAF)的磷酸化蛋白质组的效应(对于PBS的倍数变化)。
表2：通过ELISA评价不同蛋白质对不同BT474细胞蛋白质(AKT、HER2、HER3、HER1/ EGFR)的磷酸化状态的效应(对PBS的倍数变化)。
实施例17：使用包含SEQ ID NO:21的重组结合蛋白进行联合用药以改善治疗。
如实施例1中所述表达并纯化蛋白质#21和蛋白质#21-His。进行标准BrdU细胞增殖测定，这是本领域技术人员熟知的。简而言之，通过使用BrdU标记(BrdU，细胞增殖ELISA，罗氏公司)测量DNA合成来确定蛋白质#21-His、其他化合物或蛋白质#21-His与其他化合物组合对细胞增殖的效应。简而言之，在100μl完全培养基中的96孔板中每孔接种10000个细胞并温育24小时。添加蛋白质#21-His和/或化合物温育另外的72小时。最后24小时添加用于细胞标记的BrdU。根据制造商的方案检测标记的(增殖的)细胞。使用GraphPad prism软件(log[c]与OD450-602nm曲线图)分析数据。使用非线性回归拟合(log(拮抗剂)与响应-可变斜率(四个参数))来拟合数据。
蛋白质#21-His与微管抑制剂艾日布林的组合：测试蛋白质#21-His、艾日布林或蛋白质#21-His和艾日布林的组合抑制BT474和MDA-MB175细胞增殖的能力。在次优浓度的蛋白质#21-His(BT474中2nM和MDA-MB175中4nM)之上，以1’000nM开始滴定艾日布林。在两种细胞系中，两种分子的组合本身优于艾日布林。艾日布林作为单一药剂对BT474细胞无活性，但与蛋白质#21-His组合显示出有效的抑制。艾日布林自身在MDA-MB175细胞上显示出非常低的效力，但是与蛋白质#21-His组合得到了改善。IC50值在表3中给出。这些数据显示出蛋白质#21-His可以与艾日布林组合并增强其活性。
蛋白质#21-His和pI3K抑制剂GDC-0941的组合：测试蛋白质#21-His、GDC-0941或蛋白质#21-His和GDC-0941的组合抑制BT474和MDA-MB175细胞增殖的能力。在次优浓度的蛋白质#21-His(BT474中2nM和MDA-MB175中4nM)之上，以20’000nM开始滴定GDC-0941。在两种细胞系中，两种分子的组合本身优于GDC-0941。GDC-0941自身显示出活性，但与蛋白质#21-His组合的效力增加。GDC-0941在BT474中的效力强烈增加，表明具有协同效应。类似地，蛋白质#21-His增加GDC-0941在MDA-MB175细胞中的效力，其中效应似乎是相加的。IC50值在表3中给出。这些数据显示蛋白质#21-His可以与GDC-0941组合并增强其活性。
蛋白质#21-His、mTOR抑制剂依维莫司的组合：测试蛋白质#21-His、依维莫司或蛋白质#21-His与依维莫司的组合抑制BT474和MDA-MB175细胞增殖的能力。在次优浓度的蛋白质#21-His(BT474中2nM和MDA-MB175中4nM)之上，以1mM开始滴定依维莫司。在两种细胞系中，两种分子的组合本身优于依维莫司。依维莫司自身显示出活性，但与蛋白质#21-His组合的效力增加。依维莫司在BT474细胞中的效力强烈增加，表明具有协同效应。类似地，蛋白质#21-His增加依维莫司在MDA-MB175细胞中的效力，其中效应似乎是相加的。IC50值在表3中给出。这些数据显示出蛋白质#21-His可以与依维莫司组合并增强其活性。
蛋白质#21-His、泛HER抑制剂拉帕替尼的组合：测试蛋白质#21-His、拉帕替尼或蛋白质#21-His与拉帕替尼的组合抑制BT474和MDA-MB175细胞增殖的能力。在次优浓度的蛋白质#21-His(BT474中2nM和MDA-MB175中4nM)之上，以10000nM开始滴定拉帕替尼。在两种细胞系中，两种分子的组合本身优于拉帕替尼。拉帕替尼自身显示出活性，但与蛋白质#21-His组合的效力增加。拉帕替尼在BT474细胞中的效力强烈增加，表明具有协同效应。类似地，蛋白质#21-His增加拉帕替尼在MDA-MB175细胞中的效力，其中效应似乎是相加的。IC50值在表3中给出。这些数据显示蛋白质#21-His可以与拉帕替尼组合并增强其活性。
蛋白质#21与曲妥珠单抗的组合：测试蛋白质#21、曲妥珠单抗或蛋白质#21与曲妥珠单抗的组合抑制BT474和MDA-MB175细胞增殖的能力。在次优浓度的蛋白质#21(BT474中1nM和MDA-MB175中10nM)之上，以100nM开始滴定曲妥珠单抗。在两种细胞系中，两种分子的组合本身优于曲妥珠单抗。曲妥珠单抗自身仅显示出有限的活性，并且仅诱导细胞增殖停滞但不诱导细胞凋亡，而蛋白质#21诱导细胞凋亡。次优浓度的蛋白质#21与曲妥珠单抗的组合导致增殖的抑制。这显示出两种分子可以组合，并且蛋白质#21可以增强曲妥珠单抗的活性。通过在恒定浓度的曲妥珠单抗(50nM)之上滴定蛋白质#21也可以确认组合的效应。
类似地，蛋白质#21与Apitolisib、Taselisib、Alpelisib、帕博西尼、曲美替尼、考比替尼或Salirasib的组合比单独的蛋白质#21或单独的Apitolisib、Taselisib、Alpelisib、帕博西尼、曲美替尼、考比替尼或Salirasib更有效地抑制了BT474细胞的增殖(见表3)。对于用Apitolisib、Taselisib、Alpelisib或帕博西尼的实验，使用2nM的蛋白质#21并滴定Apitolisib、Taselisib、Alpelisib或帕博西尼的浓度以确定IC50值。对于使用曲美替尼(10-5M)、考比替尼(10-5M)或Salirasib(3*10-5M)的实验，滴定蛋白质#21以确定IC50值。
概括地说，蛋白质#21或蛋白质#21-His可以与若干类乳腺癌标准治疗药物组合以增强其对HER2过表达型细胞的生长抑制效应。这指出增强功效的临床可能性和/或标准治疗剂量的减少以减少毒性。
表3：不同化合物和蛋白质#21-His或蛋白质#21与BT474或MDA-MB175细胞上的化 合物的组合的细胞增殖抑制常数(IC50[nM])的实施例
序列表
<110> 分子组合公司
<120> 重组结合蛋白
<130> P015
<160> 33
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-标签
<400> 1
Met Arg Gly Ser His His His His His His
1 5 10
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GlySer接头
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GlySer接头
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GlySer接头
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GlySer接头
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GlySer接头
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ProThr接头
<400> 7
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr
1 5
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ProThr接头
<400> 8
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr
1 5 10 15
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ProThr接头
<400> 9
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Pro Thr Pro Thr Pro Thr
20
<210> 10
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 10
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Thr Asp Asn Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Asn Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Ser Asp Leu Thr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Thr
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Tyr Asp Asn Asp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys
100 105 110
Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp
115 120 125
Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile
130 135 140
Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 11
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 11
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp
100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 12
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 12
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 13
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 13
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 14
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 14
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
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100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 15
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 15
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 16
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 16
Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
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100 105 110
Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 17
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 17
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
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100 105 110
Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 18
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 18
Gly Ser Asp Leu Gly Val Lys Leu Leu Trp Ala Ala Ala Arg Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
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35 40 45
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Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 19
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 19
Gly Ser Asp Leu Gly Val Lys Leu Leu Trp Ala Ala Ala Arg Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
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35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
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65 70 75 80
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85 90 95
Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp
100 105 110
Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 20
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计的锚蛋白重复结构域
<400> 20
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
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35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
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100 105 110
Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 21
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 21
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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195 200 205
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210 215 220
Ala Ala Gln His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala
225 230 235 240
Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp
245 250 255
Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys
260 265 270
Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro
275 280 285
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305 310 315 320
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro
325 330 335
Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
340 345 350
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr
355 360 365
Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val
370 375 380
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys
385 390 395 400
Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu
405 410 415
Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
420 425 430
Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu
435 440 445
Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val
450 455 460
Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe
465 470 475 480
Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile
485 490 495
Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe
500 505 510
Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu
515 520 525
Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp
530 535 540
Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu
545 550 555 560
Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
565 570
<210> 22
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 22
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala
145 150 155 160
Ala Lys Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala
165 170 175
Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala
180 185 190
Ala Gln Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly
195 200 205
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210 215 220
Ala Ala Gln His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala
225 230 235 240
Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp
245 250 255
Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys
260 265 270
Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro
275 280 285
Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu
290 295 300
Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu
305 310 315 320
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro
325 330 335
Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
340 345 350
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr
355 360 365
Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val
370 375 380
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys
385 390 395 400
Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu
405 410 415
Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro
420 425 430
Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu
435 440 445
Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val
450 455 460
Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe
465 470 475 480
Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile
485 490 495
Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe
500 505 510
Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu
515 520 525
Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp
530 535 540
Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu
545 550 555 560
Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
565 570
<210> 23
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 23
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser
115 120 125
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Val Lys Leu Leu Trp Ala Ala
145 150 155 160
Ala Arg Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala
165 170 175
Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Ile Thr Pro Leu His Ile Ala
180 185 190
Ala Thr Asn Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly
195 200 205
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ile Thr Gly Glu Thr Pro Leu His His
210 215 220
Ala Ala Asp Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala
225 230 235 240
Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ala Gly Val Thr Pro Ala Asp
245 250 255
Leu Ala Ala Ala Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys
260 265 270
Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro
275 280 285
Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu
290 295 300
Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu
305 310 315 320
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro
325 330 335
Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
340 345 350
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr
355 360 365
Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val
370 375 380
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val
450 455 460
Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe
465 470 475 480
Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile
485 490 495
Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe
500 505 510
Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
565 570
<210> 24
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 24
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
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100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser
115 120 125
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala
145 150 155 160
Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala
165 170 175
Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala
180 185 190
Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly
195 200 205
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu
210 215 220
Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala
225 230 235 240
Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp
245 250 255
Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys
260 265 270
Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro
275 280 285
Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu
290 295 300
Leu Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu
305 310 315 320
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro
325 330 335
Leu His Ile Ala Ala Gln Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
340 345 350
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr
355 360 365
Pro Leu His Leu Ala Ala Gln His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val
370 375 380
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp
385 390 395 400
Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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500 505 510
Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu
515 520 525
Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp
530 535 540
Lys Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu
545 550 555 560
Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
565 570
<210> 25
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 25
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
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Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala
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Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala
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Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala
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Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala
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Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp
245 250 255
Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys
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Leu Trp Ala Ala Ala Arg Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu
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Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Ile Thr Pro
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515 520 525
Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp
530 535 540
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545 550 555 560
Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
565 570
<210> 26
<211> 562
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 26
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
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100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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530 535 540
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545 550 555 560
Ala Ala
<210> 27
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 27
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
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Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys
565 570 575
Ala Ala
<210> 28
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含两个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 28
Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
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Ala Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Cys
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<210> 29
<211> 414
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含三个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 29
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
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Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Ile Thr
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405 410
<210> 30
<211> 562
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 30
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Ala Lys Leu Leu Ser Asp Leu
290 295 300
Gly Val Lys Leu Leu Trp Ala Ala Ala Arg Gly Gln Asp Asp Glu Val
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Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala
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465 470 475 480
Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly
485 490 495
Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu
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Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys His
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Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp
530 535 540
Ile Ser Ile Gly Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys
545 550 555 560
Ala Ala
<210> 31
<211> 580
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含四个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 31
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Leu Gly Lys
1 5 10 15
Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu
20 25 30
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
245 250 255
Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Trp Gly
260 265 270
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275 280 285
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
290 295 300
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325 330 335
Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala
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355 360 365
Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala
370 375 380
Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala
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485 490 495
Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
500 505 510
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu
515 520 525
His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu
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545 550 555 560
Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu
565 570 575
Gln Lys Ala Ala
580
<210> 32
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含两个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 32
Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
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35 40 45
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130 135 140
Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala
145 150 155 160
Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala
165 170 175
Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala
180 185 190
Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly
195 200 205
Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu
210 215 220
Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala
225 230 235 240
Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp
245 250 255
Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys
260 265 270
Ala Ala
<210> 33
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含三个经设计的锚蛋白重复结构域的蛋白质
<400> 33
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly
35 40 45
His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp
100 105 110
Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser
115 120 125
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala
145 150 155 160
Ala Lys Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala
165 170 175
Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala
180 185 190
Ala Gln Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly
195 200 205
Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu
210 215 220
Ala Ala Gln His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala
225 230 235 240
Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp
245 250 255
Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys
260 265 270
Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro
275 280 285
Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu
290 295 300
Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu
305 310 315 320
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro
325 330 335
Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
340 345 350
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr
355 360 365
Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val
370 375 380
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys
385 390 395 400
Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu
405 410 415
Val Leu Gln Lys Ala Ala
420

Claims (15)

1.一种重组结合蛋白，所述重组结合蛋白包含与SEQ ID NO:21具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述重组结合蛋白包含两个对HER2具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域和两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。
2.根据权利要求1所述的重组结合蛋白，其中所述两个对血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域中的每个包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的重组结合蛋白，其中所述重组结合蛋白包含与由SEQ ID NO:21组成的所述重组结合蛋白具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组结合蛋白，其中对血清白蛋白具有结合特异性的所述经设计的锚蛋白重复结构域中的每个，与对包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的血清白蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域相比，在PBS中表现出改善的储存稳定性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组结合蛋白，其中所述重组结合蛋白包含所述SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组结合蛋白，其中所述重组结合蛋白由所述SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的重组结合蛋白，其中所述重组结合蛋白用低于10-7M的抑制常数抑制BT474细胞增殖。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组结合蛋白，其中浓度为100nM的所述重组结合蛋白比浓度为100nM曲妥珠单抗表现出更强的BT474细胞中AKT-S473磷酸化的下调。
9.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1至8中任一项所述的重组结合蛋白。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至8中任一项所述的重组结合蛋白或根据权利要求9所述的核酸，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗疾病。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗癌症。
13.根据权利要求10所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗乳腺癌、卵巢癌、胃窦癌、胃癌、子宫癌、结肠直肠癌、膀胱癌或HER2过表达型癌症。
14.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至8中任一项所述的重组结合蛋白或根据权利要求9所述的核酸或根据权利要求10所述的药物组合物。
15.一种产生根据权利要求1至8中任一项所述的重组结合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在细菌中表达所述结合蛋白，以及(ii)使用色谱法纯化所述结合蛋白。
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