JP2024513559A - 新規なＤＡＲＰｉｎベースのＣＤ７０エンゲージャー - Google Patents

Abstract

本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有する、組換え結合タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような組換え結合タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの疾患を処置又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月９日に出願された米国仮出願第６３／１７２，９７３号、２０２１年４月９日に出願された米国仮出願第６３／１７３，１８６号、及び２０２１年１２月９日に出願された米国仮出願第６３／２６５，１８１号に対する優先権の利益を主張するものである。これら特許出願の開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有する、組換え結合タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような組換え結合タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌、例えば急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）などの疾患を処置又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、急速な細胞増殖、侵攻性の臨床経過、及び一般的に高い死亡率を特徴とする、不均一かつ複雑な悪性疾患である。処置に対する抵抗性は、ＡＭＬ関連死の未だに主要な原因である（Ｗｉｎｅｒ＆Ｓｔｏｎｅ，Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ；２０１９；１０）。化学療法を用いる標準的なプロトコルは、依然として世界的に適用される主要な治療アプローチであるが、免疫療法における近年の進歩は、化学療法抵抗性ＡＭＬに対して有効な治療選択肢を提供している。そのような免疫療法アプローチには、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、及びキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（chimeric antigen receptor－expressing T cell、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が含まれる。

ＣＤ７０はＡＭＬ芽細胞のおよそ８６～１００％に発現しているため、ＣＤ７０は、癌、特にＡＭＬの処置に魅力的な標的である（Ｐｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，３２（４），２０１７，５０６－５１９）。ＣＤ７０はまた、白血病幹細胞に対して高度に特異的である。現在、ＣＤ７０を標的とするモノクローナル抗体（クサツズマブ）が臨床試験中である。第Ｉ相試験では有望な結果が示されたが、第ＩＩ相試験で示された有効性は期待外れのものであった（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｖａｌｕａｔｅ．ｃｏｍ／ｖａｎｔａｇｅ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎｅｗｓ／ｓｎｉｐｐｅｔｓ／ａｒｇｅｎｘｓ－ｃｕｓａｔｕｚｕｍａｂ－ｃｕｌｍｉｎａｔｅｓ－ｄｉｓａｐｐｏｉｎｔｍｅｎｔを参照されたい）。既存の多くの抗体療法と同様に、その潜在的な安全性プロファイルについての懸念も存在している（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓａｒｅｎａ．ｃｏｍ／ｃｏｍｍｅｎｔ／ａｒｇｅｎｘｓ－ｃｕｓａｔｕｚｕｍａｂ－ｉｎ－ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ－ｕｎｔｒｅａｔｅｄ－ａｍｌ－ｄｒａｗｓ－ｖａｒｉｅｄ－ｅｘｐｅｒｔ－ｆｏｒｅｃａｓｔｓ／を参照されたい）。更に、抗体が標的とする腫瘍表面マーカーのダウンレギュレーションは、抗体療法に対する腫瘍の抵抗性をもたらし得る。

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法とは、リンパ系悪性腫瘍の管理に強く影響してきたアプローチである。この技術をＡＭＬにも適用することに大きな関心が寄せられているが、実際には、これは困難であることが証明されている。モノクローナル抗体に関して、ＣＤ７０は、ＡＭＬにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞療法のための最も有望な標的の１つであると考えられている。

ＡＭＬとは、多くの点で癌療法の課題及び現在利用可能な癌療法の欠点（有効性の低さ及び問題のある副作用プロファイルなど）を例示する癌の一種である。ＡＭＬについては、高い死亡率による医学的必要性が高いままであり、再発性又は難治性ＡＭＬの処置は、未だに治療が困難である。

したがって、有益な特性を有する新たなＣＤ７０特異的結合タンパク質が依然として必要とされている。そのような結合タンパク質は、癌、例えばＡＭＬなどの疾患を処置及び特徴付けるための治療的及び診断的アプローチに有用であり得る。特に、癌細胞上のＣＤ７０を特異的に標的とするのに役立つことができ、かつ例えば１つ以上の結合部分などの他の機能的部分と容易に組み合わせることもできる、新たなＣＤ７０特異的結合タンパク質が必要とされている。

本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有する、組換え結合タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような組換え結合タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの疾患を処置又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。

本発明の組換え結合タンパク質は、腫瘍関連抗原（tumor－associated antigen、ＴＡＡ）ＣＤ７０に特異的に結合するか、又はそれを標的とする。本発明のそのような結合タンパク質は、新たな治療剤又は診断剤を生成するためのツール又はビルディングブロックとして役立ち得る。ＣＤ７０特異的アンキリン反復ドメインが１つの分子中で１つ以上の他の機能的部分と組み合わされている組換え結合タンパク質もまた本明細書に開示される。そのような他の機能的部分としては、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する結合部分、半減期延長部分、別の腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有する結合部分、及び／又は細胞毒性剤が挙げられる。したがって、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質は、現在の治療法と比較して改善された毒性プロファイル及び／又は治療濃度域を提供し得る新規な治療分子の生成に有用である。

本明細書で提供される開示に基づいて、当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができるだろう。そのような等価物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されることが意図される。

１．第１の実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２４～４５及び７３～７７、並びに（２）配列番号２４～４５及び７３～７７のいずれかにおける最大９個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質に関する。

２．第２の実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～１２及び７１～７２のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

３．第３の実施形態では、本発明は、当該アンキリン反復ドメインが、ＰＢＳ中で、約１５０ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_D）でヒトＣＤ７０と結合する、実施形態１又は２に記載の組換え結合タンパク質に関する。

４．第４の実施形態では、本発明は、当該アンキリン反復ドメインが、約０．２ｎＭ～約５００ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でヒトＣＤ７０と結合する、前述の実施形態のいずれかに記載の組換え結合タンパク質に関する。

５．第５の実施形態では、本発明は、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する結合部分を更に含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組換え結合タンパク質に関する。

６．第６の実施形態では、本発明は、当該免疫細胞がＴ細胞であり、免疫細胞上に発現する当該標的がＣＤ３である、実施形態５に記載の組換え結合タンパク質に関する。

７．第７の実施形態では、本発明は、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する当該結合部分がアンキリン反復ドメインである、実施形態５又は６に記載の組換え結合タンパク質に関する。

８．第８の実施形態では、本発明は、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する当該結合部分が、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである、実施形態５～７のいずれかに記載の組換え結合タンパク質に関する。

９．第９の実施形態では、本発明は、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する当該結合部分が、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５～７のいずれかに記載の組換え結合タンパク質に関する。

１０．第１０の実施形態では、本発明は、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１１．第１１の実施形態では、本発明は、ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインと、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する当該結合部分とが、ペプチドリンカーによって共有結合している、実施形態５～１０のいずれかに記載の組換え結合タンパク質に関する。

１２．第１２の実施形態では、本発明は、当該ペプチドリンカーが、プロリン－トレオニンリッチペプチドリンカーである、実施形態１１に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１３．第１３の実施形態では、本発明は、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列が、１～５０アミノ酸の長さを有する、実施形態１１又は１２に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１４．第１４の実施形態では、本発明は、当該結合タンパク質が、半減期延長部分を更に含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組換え結合タンパク質に関する。

１５．第１５の実施形態では、本発明は、当該半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである、実施形態１４に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１６．第１６の実施形態では、本発明は、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号５２～５４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１５に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１７．第１７の実施形態では、本発明は、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号５２～５４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１５又は１６に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１８．第１８の実施形態では、本発明は、当該結合タンパク質が、腫瘍細胞において発現する標的に対して結合特異性を有する少なくとも１つの結合部分を更に含み、腫瘍細胞において発現する当該標的がヒトＣＤ７０とは異なる、前述の実施形態のいずれかに記載の組換え結合タンパク質に関する。

１９．第１９の実施形態では、本発明は、前述の実施形態のいずれかに記載の組換え結合タンパク質をコードする、核酸に関する。

２０．第２０の実施形態では、本発明は、実施形態１～１８のいずれかに記載の組換え結合タンパク質又は実施形態１９に記載の核酸と、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物に関する。

２１．第２１の実施形態では、本発明は、ヒト患者の腫瘍組織における免疫細胞活性化の方法であって、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質、実施形態１９に記載の核酸、又は実施形態２０に記載の医薬組成物を当該患者に投与する工程を含む、方法に関する。

２２．第２２の実施形態では、本発明は、当該免疫細胞がＴ細胞である、実施形態２１に記載の方法に関する。

２２ａ．実施形態２２ａでは、本発明は、当該免疫細胞がナチュラルキラー（Natural Killer、ＮＫ）細胞である、実施形態２１に記載の方法に関する。

２３．第２３の実施形態では、本発明は、医学的状態を処置する方法であって、医学的状態の処置を必要とする患者に、治療有効量の実施形態１～１８のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質、実施形態１９に記載の核酸、又は実施形態２０に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法に関する。

２４．第２４の実施形態では、本発明は、当該医学的状態が癌である、実施形態２３に記載の方法に関する。

２５．第２５の実施形態では、本発明は、当該医学的状態が液性腫瘍を特徴とする癌である、実施形態２３に記載の方法に関する。

２６．第２６の実施形態では、本発明は、当該医学的状態が白血病である、実施形態２３に記載の方法に関する。

２７．第２７の実施形態では、本発明は、当該医学的状態が急性骨髄性白血病である、実施形態２３に記載の方法に関する。

２８．第２８の実施形態では、本発明は、療法に使用するための、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質、実施形態１９に記載の核酸、又は実施形態２０に記載の医薬組成物に関する。

２９．第２９の実施形態では、本発明は、癌の処置に使用するための、任意選択で液性腫瘍を特徴とする癌の処置に使用するための、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の組換え結合タンパク質、実施形態１９に記載の核酸、又は実施形態２０に記載の医薬組成物に関する。

３０．第３０の実施形態では、本発明は、当該癌が白血病であり、任意選択で当該癌が急性骨髄性白血病である、実施形態２９に記載の使用のための組換え結合タンパク質、又は核酸、又は医薬組成物に関する。

ヒトＣＤ７０に結合するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。様々な濃度の精製されたアンキリン反復タンパク質を、オンレート及びオフレート測定のためにヒトＣＤ７０が固定化されたＧＬＣチップに適用した。得られたＳＰＲトレースを使用して、アンキリン反復タンパク質のＣＤ７０への結合を分析及び決定した。ＲＵ、共鳴単位；ｓ、時間（秒）。 本発明の例示的な結合タンパク質のＣＤ７０発現腫瘍細胞への結合。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２５の濃度依存性結合曲線を示す。 活性化マーカーＣＤ２５を測定することによって決定された短期Ｔ細胞活性化。汎エフェクターＴ細胞及びＭｏｌｍ－１３標的細胞を、５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。選択されたアンキリン反復タンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２６、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７によって誘導されたＴ細胞活性化を示す。 ＬＤＨ放出を測定する細胞毒性アッセイによって評価された腫瘍細胞殺傷。汎エフェクターＴ細胞及びＭｏｌｍ－１３標的細胞を、５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。選択されたアンキリン反復タンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２６、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７によって誘発されたＴ細胞による腫瘍細胞殺傷を示す。 ＥＬＩＳＡによる、競合剤としてのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２又はｍＡｂ ＡＲＧＸ－１１０類似体の存在下又は非存在下での、プレートに固定化された異なるＣＤ７０結合分子のヒトＣＤ７０標的への結合。ビオチン化ヒトＣＤ７０標的を競合剤（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２又はＡＲＧＸ－１１０類似体）と共に又はそれなしでプレインキュベートした後、抗ストレプトアビジン－ＰＯＤ検出剤を使用して、固定化されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２（図５Ａ）、ＣＤ２７（図５Ｂ）、又はＡＲＧＸ－１１０類似体（図５Ｃ）への結合を決定した。ＣＤ７０への競合結合は、試験した全ての分子、すなわち、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＣＤ２７、及びＡＲＧＸ－１１０類似体で観察された。 ＥＬＩＳＡによる、競合剤としてのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２又はｍＡｂ ＡＲＧＸ－１１０類似体の存在下又は非存在下での、プレートに固定化された異なるＣＤ７０結合分子のヒトＣＤ７０標的への結合。ビオチン化ヒトＣＤ７０標的を競合剤（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２又はＡＲＧＸ－１１０類似体）と共に又はそれなしでプレインキュベートした後、抗ストレプトアビジン－ＰＯＤ検出剤を使用して、固定化されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２（図５Ａ）、ＣＤ２７（図５Ｂ）、又はＡＲＧＸ－１１０類似体（図５Ｃ）への結合を決定した。ＣＤ７０への競合結合は、試験した全ての分子、すなわち、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＣＤ２７、及びＡＲＧＸ－１１０類似体で観察された。 ＥＬＩＳＡによる、競合剤としてのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２又はｍＡｂ ＡＲＧＸ－１１０類似体の存在下又は非存在下での、プレートに固定化された異なるＣＤ７０結合分子のヒトＣＤ７０標的への結合。ビオチン化ヒトＣＤ７０標的を競合剤（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２又はＡＲＧＸ－１１０類似体）と共に又はそれなしでプレインキュベートした後、抗ストレプトアビジン－ＰＯＤ検出剤を使用して、固定化されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２（図５Ａ）、ＣＤ２７（図５Ｂ）、又はＡＲＧＸ－１１０類似体（図５Ｃ）への結合を決定した。ＣＤ７０への競合結合は、試験した全ての分子、すなわち、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＣＤ２７、及びＡＲＧＸ－１１０類似体で観察された。 図６Ａ：ｈＰＢＭＣを腹腔内注射し、ｈＰＢＭＣ注射の２日後、ＭＯＬＭ－１３腫瘍細胞を皮下に異種移植し、ＰＢＳ １×（黒丸）、又は０．５ｍｇ／ｋｇのマルチドメインフォーマットのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４（黒四角）で処置したマウス（ドナー当たりｎ＝５マウス／２人のｈＰＢＭＣドナーを使用）における経時的な腫瘍増殖。腫瘍細胞異種移植後４日目に処置を開始した。データを平均＋ＳＥＭで表示する。図６Ｂ：図６Ａに記載したマウスにおける腫瘍細胞異種移植後１７日目の腫瘍体積の評価。 図６Ａ：ｈＰＢＭＣを腹腔内注射し、ｈＰＢＭＣ注射の２日後、ＭＯＬＭ－１３腫瘍細胞を皮下に異種移植し、ＰＢＳ １×（黒丸）、又は０．５ｍｇ／ｋｇのマルチドメインフォーマットのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４（黒四角）で処置したマウス（ドナー当たりｎ＝５マウス／２人のｈＰＢＭＣドナーを使用）における経時的な腫瘍増殖。腫瘍細胞異種移植後４日目に処置を開始した。データを平均＋ＳＥＭで表示する。図６Ｂ：図６Ａに記載したマウスにおける腫瘍細胞異種移植後１７日目の腫瘍体積の評価。 野生型又はＣＤ７０ノックアウトＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞を使用したマルチドメインフォーマットのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。

本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有する、組換え結合タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような組換え結合タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの疾患を処置又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。

アンキリン反復ドメイン
設計アンキリン反復モチーフ又はモジュールを含む、記載される組換え結合タンパク質又はその結合ドメインは、本明細書においてＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質とも称される（Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．１０（２）：１５３－９（２００７）、及びＢｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（５）：５７５－５８２（２００４）を参照されたい）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、標的タンパク質に対して高い特異性及び高い結合親和性を有する抗体模倣物と見なすことができる。一般に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、少なくとも１つのアンキリン反復ドメイン、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上のアンキリン反復ドメインを含む。

本明細書に記載のアンキリン反復ドメインは、概して、構造を提供するコア足場、及び標的に結合する標的結合残基を含む。構造コアは、保存されたアミノ酸残基を含み、標的結合表面は、標的に応じて異なるアミノ酸残基を含む。

設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー（国際公開第２００２／０２０５６５号、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，５７５－５８２，２００４、Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３，６９５－７０１，２００８）は、高い親和性でそれらの標的に結合する標的特異的設計アンキリン反復ドメインの選択に使用することができる。次に、そのような標的特異的設計アンキリン反復ドメインを、疾患を処置するための組換え結合タンパク質の価値ある成分として使用することができる。設計アンキリン反復タンパク質は、モノクローナル抗体の限界を克服する可能性を有する結合分子の一種であり、したがって新規な治療アプローチを可能にする。そのようなアンキリン反復タンパク質は、単一の設計アンキリン反復ドメインを含んでもよく、又は同じ若しくは異なる標的特異性を有する２つ以上の設計アンキリン反復ドメインの組み合わせを含んでもよい（Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３，６９５－７０１，２００８、米国特許第９，４５８，２１１号）。単一の設計アンキリン反復ドメインのみを含むアンキリン反復タンパク質は、高い親和性及び特異性で所与の標的タンパク質と結合するように選択され得る小タンパク質（１４ｋＤａ）である。これらの特徴、及び２つ以上の設計アンキリン反復ドメインを組み合わせて１つのタンパク質にできることは、設計アンキリン反復タンパク質を、理想的なアゴニスト、アンタゴニスト及び／又は阻害薬候補にする。更に、そのようなアンキリン反復タンパク質は、様々なエフェクター機能、例えば細胞毒性剤又は半減期延長剤を担持し、完全に新しい薬物フォーマットを可能にするように操作することができる。

設計アンキリン反復タンパク質はまた、モノクローナル抗体では容易にアクセスできないエピトープを標的とし得る。記載される設計アンキリン反復タンパク質の更なる利点は、それらが概して免疫原性が低く、オフターゲット効果を有さないか又はわずかに有することである。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）候補はまた、迅速、低コスト、かつ高収率で製造され、４℃で最大数年間保管可能であるなど、好ましい開発特性を示す。まとめると、設計アンキリン反復タンパク質は、既存の抗体薬を凌ぐ可能性を有する次世代のタンパク質治療薬の一例である。

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ所有の商標である。

上述したように、ＣＤ７０は、特定の癌、特にＡＭＬの処置に魅力的な治療標的である。本明細書に記載の組換え結合タンパク質は、ヒトＣＤ７０に特異的に結合するアンキリン反復ドメイン及びアンキリン反復モジュールを含む。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２４～４５及び７３～７７、並びに（２）配列番号２４～４５及び７３～７７のいずれかにおける最大９個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２４～４５及び７３～７７、並びに（２）配列番号２４～４５及び７３～７７のいずれかにおける最大９個、最大８個、最大７個、最大６個、最大５個、最大４個、最大３個、最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号２４～４５及び７３～７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質に関する。

別の実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～１２及び７１～７２のいずれか１つと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

更なる実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～１２及び７１～７２のいずれか１つと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号２と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号３と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号４と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号５と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号７と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号８と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号９と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１１と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１２と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号７１と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号７２と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

更なる実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～１２及び７１～７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

更なる態様では、本発明は、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する少なくとも１つの結合部分を更に含む、上記の組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、当該免疫細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、当該免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。本発明に使用するための、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する結合部分の例としては、抗体、代替足場、及びポリペプチドが挙げられる。

抗体は、抗体又は免疫グロブリン分子に由来する抗原結合ドメインを含む任意のポリペプチド又はタンパク質を含む。抗原結合ドメインは、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び例えば、ヒト又はラクダ科動物起源の可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来し得る。いくつかの例では、抗原結合ドメインが、結合部分が最終的に使用されるのと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおける使用の場合、本明細書に記載の結合部分の抗原結合ドメインが、ヒト又はヒト化抗原結合ドメインを含むことが有益であり得る。抗体は、当該技術分野で周知の技法を用いて得ることができる。

一実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する結合部分は、抗体である。

一実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する結合部分は、ラクダ科ナノボディーである。ラクダ科ナノボディー（ラクダ科単一ドメイン抗体又はＶＨＨとしても知られる）は、ラマ、ラクダ、及びアルパカなどの哺乳動物のラクダ科に由来する。他の抗体とは異なり、ラクダ科抗体は軽鎖を欠き、２つの同一の重鎖から構成される。ラクダ科抗体は、典型的には、概ね１５ｋＤａの範囲の比較的低い分子量を有する。

一実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する結合部分は、サメ抗体ドメインである。ラクダ科ナノボディーと同様に、サメ抗体ドメインも軽鎖を欠いている。

抗原（薬物分子など）と結合することができ、抗体又は免疫グロブリン分子に由来しない結合ドメインを含む任意のポリペプチド又はタンパク質を、代替足場は含む。代替足場の結合ドメインは、様々な異なるポリペプチド又はタンパク質構造を含んでもよく、又はそれに由来してもよい。代替足場としては、アドネクチン（モノボディー）、アフィボディー、アフィリン、アフィマー及びアプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、アルマジロ反復タンパク質ベースの足場、アトリマー、アビマー、アンキリン反復タンパク質ベースの足場（例えば、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質）、フィノマー、ノッチン、並びにクニッツドメインペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。代替足場は、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｃａｌｉｆ）．２０１７ Ｊｕｎｅ １２；１０（１）：２９３－３２０．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖａｎｃｈｅｍ－０６１５１６－０４５２０５に記載されている。

一実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する結合部分は、代替足場である。一実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する結合部分は、アドネクチン、モノボディー、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、反復タンパク質ドメイン、アルマジロ反復ドメイン、アトリマー、アビマー、アンキリン反復ドメイン、フィノマー、ノッチン、クニッツドメイン、又はＴ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）に由来するか又はそれらに関連する抗原結合ドメインを含む。

アドネクチンは、元々はヒトフィブロネクチンＩＩＩ型タンパク質の１０番目の細胞外ドメイン（１０Ｆｎ３）に由来する。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、それら自体で互いをパッキングしてタンパク質のコアを形成する２つのベータシートの間に分布している７又は８個のベータ鎖を有し、更に、ベータ鎖を互いに接続し、溶媒曝露されるループ（ＣＤＲに類似）を含有する。ベータシートサンドイッチの各縁部には少なくとも３つのそのようなループが存在し、縁部は、ベータ鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号を参照されたい）。この構造のために、この非抗体足場は、抗体の抗原結合特性の性質及び親和性に類似した抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、インビボでの抗体の親和性成熟のプロセスに類似するインビトロでのループランダム化及びシャッフリング手法において使用することができる。

アフィボディー親和性リガンドは、細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の表面タンパク質であるプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルから構成される。この足場ドメインは５８個のアミノ酸からなり、そのうちの１３個をランダム化して、多数のリガンドバリアントを有するアフィボディーライブラリーを作製する（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号を参照されたい）。アフィボディー分子は抗体を模倣しているが、抗体の場合の概ね１５０ｋＤａと比較してかなり小さく、概ね６ｋＤａの分子量を有する。サイズの違いにもかかわらず、アフィボディー分子の結合部位は抗体の結合部位と類似性を有する。

アフィリンは、構造的にヒトユビキチンに由来する（歴史的にはガンマ－Ｂクリスタリンにも由来する）合成抗体模倣物である。アフィリンは、主にベータシート構造及び約２０ｋＤａの総分子質量を有する２つの同一のドメインからなる。それらは、修飾に好適ないくつかの表面露出したアミノ酸を含有する。アフィリンは、抗原に対する親和性及び特異性において抗体に似ているが、構造においては似ていない。

アフィマーは、ペプチドアプタマーの一種であり、ＳＱＴ（Stefin A quadruple mutant－Tracy）（ステフィンＡ四重変異体－トレイシー）として知られる構造を有する。アプタマー及びアフィマーは、結合ペプチドのＮ末端及びＣ末端の両方が不活性な足場に埋め込まれた、構造を拘束するための不活性で剛性のあるタンパク質足場を有する、親和性結合を担う短いペプチドである。

アフィチンは、特異的結合親和性を得るように操作されたＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄのバリアントである。Ｓａｃ７ｄは、元々は超好熱菌古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓに由来し、ＤＮＡと結合してその熱変性を防止する。アフィチンは、商業的にはＮａｎｏｆｉｔｉｎとして知られている。

アルファボディーは、様々な抗原に結合するように操作された小さな（およそ１０ｋＤａ）タンパク質であり、したがって抗体模倣物である。アルファボディー足場は、コイルドコイル構造に基づいてコンピュータで設計される。標準的なアルファボディー足場は、グリシン／セリンリッチリンカーを介して接続された、各々４つのヘプタッド反復（７残基のストレッチ）から構成される３つのαヘリックスを含有する。標準的なヘプタッド配列は、「ＩＡＡＩＱＫＱ」である。アルファボディーの細胞外及び細胞内タンパク質を標的とする能力は、それらの高い結合親和性と組み合わせて、抗体では到達することができない標的にそれらが結合することを可能にし得る。

アンチカリンは、リポカリンに見出される強固で保存的なβバレル構造を有する結合タンパク質の群である。リポカリンは、シグナル伝達分子などの様々な生物学的分子の認識、貯蔵、及び輸送を担う１つのペプチド鎖（１５０～１９０アミノ酸）を含む細胞外タンパク質の一種である。

アルマジロ反復タンパク質ベースの足場は、真核生物において豊富であり、広範な生物学的プロセス、特に核輸送に関連するプロセスに関与する。アルマジロ反復タンパク質ベースの足場は、通常、３～５個の内部反復及び２個のキャッピングエレメントからなる。それらはまた、タンデム伸長スーパーヘリックス構造を有し、これは、伸長された立体構造で対応するペプチドリガンドと結合することが可能である。

アトリマーは、３つの同一の単位からなるＣ型レクチンのファミリーに属する、テトラネクチンとして知られるトリマー血漿タンパク質に由来する足場である。テトラネクチン内のＣ型レクチンドメイン（C－type lectin domain、ＣＴＬＤ）の構造は、標的化分子との相互作用を媒介する５つの柔軟なループを有する。

アビマーは、ＨＥＲ３などの天然のＡドメイン含有タンパク質に由来し、アミノ酸リンカーを介して結合されたいくつかの異なる「Ａドメイン」モノマー（２～１０）からなる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７５７５６号、同第２００５／００５３９７３号、同第２００５／００４８５１２号、及び同第２００６／０００８８４４号に記載される方法を使用して、標的抗原に結合することができるアビマーを作製することができる。

フィノマーは、ヒトＦｙｎチロシンキナーゼのＳｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）のアミノ酸８３～１４５から進化させた小さな球状タンパク質（およそ７ｋＤａ）である。フィノマーは、その高い熱安定性、システインを含まない足場、及びヒト起源のために魅力的な結合分子であり、潜在的な免疫原性を低減する。

システインノットミニタンパク質としても知られているノッチンは、典型的には、３つの逆平行βシートと、システインノットを作り出すジスルフィド結合によって縛られた拘束ループと、を含む３０アミノ酸長のタンパク質である。このジスルフィド結合が高い熱安定性を与え、ノッチンを魅力的な抗体模倣物にしている。

クニッツドメインペプチド又はクニッツドメイン阻害剤は、構造フレームワークを不安定化することなく変異され得る３つのジスルフィド結合及び３つのループを有する約６０個のアミノ酸を含有する不規則な二次構造を有するプロテアーゼ阻害剤の一種である。

一実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する結合部分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する抗原結合ドメインを含むポリペプチド又はタンパク質である。

好ましい実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する結合部分は、アンキリン反復ドメインである。

当該免疫細胞上に発現する標的の性質には特に制限はない。一実施形態では、標的はＴ細胞である免疫細胞上に発現し、当該免疫細胞上に発現する標的はＣＤ３である。

したがって、好ましい実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、（１）配列番号２４～４５及び７３～７７、並びに（２）配列番号２４～４５及び７３～７７のいずれかにおける最大９個、最大８個、最大７個、最大６個、最大５個、最大４個、最大３個、最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、ＣＤ３、より好ましくはヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む組換え結合タンパク質に関する。

別の実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、（１）配列番号２４～４５及び７３～７７、並びに（２）配列番号２４～４５及び７３～７７のいずれかにおける最大９個、最大８個、最大７個、最大６個、最大５個、最大４個、最大３個、最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、配列番号５５～５９のいずれか１つと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む組換え結合タンパク質に関する。

更なる実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、配列番号２４～４５及び７３～７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、配列番号５５～５９のいずれか１つと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む組換え結合タンパク質に関する。

別の実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、（１）配列番号２４～４５及び７３～７７、並びに（２）配列番号２４～４５及び７３～７７のいずれかにおける最大９個、最大８個、最大７個、最大６個、最大５個、最大４個、最大３個、最大２個、又は最大１個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、配列番号５５～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む組換え結合タンパク質に関する。

別の実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、配列番号２４～４５及び７３～７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、配列番号５５～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む組換え結合タンパク質に関する。

別の好ましい実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、配列番号１～１２及び７１～７２のいずれか１つと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、ＣＤ３、より好ましくはヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む組換え結合タンパク質に関する。

別の実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、配列番号１～１２及び７１～７２のいずれか１つと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、配列番号５５～５９のいずれか１つと少なくとも約８５％の配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、配列番号１～１２及び７１～７２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、配列番号５５～５９のいずれか１つと少なくとも約８５％の配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、配列番号１～１２及び７１～７２のいずれか１つと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、配列番号５５～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む組換え結合タンパク質に関する。

更なる実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、配列番号１～１２及び７１～７２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、配列番号５５～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む組換え結合タンパク質に関する。

本発明は更に、（ｉ）ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有する第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する第２のアンキリン反復ドメインと、を含む組換え結合タンパク質であって、配列番号１３～２３及び７８～８１のいずれか１つと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、（ｉ）ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有する第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する第２のアンキリン反復ドメインと、を含む組換え結合タンパク質であって、配列番号１３～２３及び７８～８１のいずれか１つと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

半減期延長部分
「半減期延長部分」は、半減期延長部分を有さない同じタンパク質と比較して、本明細書に記載の組換え結合タンパク質のインビボでの血清半減期を延長する。半減期延長部分の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（glutathione S transferase、ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質（maltose binding protein、ＭＢＰ）、ヒト血清アルブミン（human serum albumin、ＨＳＡ）結合ドメイン、又はポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え結合タンパク質は、本明細書では「血清アルブミン結合ドメイン」とも称される、血清アルブミン（例えば、好ましくはヒト血清アルブミン）と特異的に結合するアンキリン反復ドメインを含む。本明細書に記載の組換え結合タンパク質はまた、２つ以上の血清アルブミン結合ドメイン、例えば、２つ又は３つの血清アルブミン結合ドメインを含んでもよい。したがって、本明細書に記載の組換え結合タンパク質は、第１及び第２の血清アルブミン結合ドメイン、又は第１、第２、及び第３の血清アルブミン結合ドメインを含んでもよい。以下に提供される実施形態は、そのような第１の血清アルブミン結合ドメイン、第２の血清アルブミン結合ドメイン、及び／又は第３の血清アルブミン結合ドメインを記載する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の半減期延長部分は、配列番号５２～５４のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメインを含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の半減期延長部分は、配列番号５２～５４のいずれか１つと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本明細書に記載の半減期延長部分は、配列番号５３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の半減期延長部分は、配列番号５３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、本発明の組換え結合タンパク質のＮ末端に位置する。いくつかの実施形態では、２つ以上の血清アルブミン結合ドメインが好ましい。いくつかの実施形態では、２つの血清アルブミン結合ドメインは、本発明の組換え結合タンパク質のＮ末端に位置する。

いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンドメインは、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、既知の重鎖アイソタイプであるＩｇＧ（γ）、ＩｇＭ（μ）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＥ（ε）、又はＩｇＡ（α）のいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、既知の重鎖アイソタイプ又はサブタイプであるＩｇＧ₁（γ１）、ＩｇＧ₂（γ２）、ＩｇＧ₃（γ３）、ＩｇＧ₄（γ４）、ＩｇＡ₁（α１）、ＩｇＡ₂（α２）のいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ₁のＦｃドメインである。

いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの中断されていない天然配列（すなわち、野生型配列）を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、変更された生物学的活性をもたらすバリアントＦｃドメインを含む。例えば、少なくとも１つの点変異又は欠失は、エフェクター活性を低減又は排除するために（例えば、国際公開第２００５／０６３８１５号）、及び／又は組換え結合タンパク質の産生中に均質性を増加させるために、Ｆｃドメインに導入されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ₁のＦｃドメインであり、以下のエフェクターヌル置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ（Ｅｕ番号付け）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＣ末端位置に位置するリジン（すなわち、Ｅｕ番号付けによるＫ４４７）を含まない。リジンを含まないことは、組換え結合タンパク質の産生中に均質性を増加させ得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｃ末端位置に位置するリジン（Ｋ４４７、Ｅｕ番号付け）を含む。

腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有する更なる結合部分
更なる態様では、本発明は、ＣＤ７０とは異なる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して結合特異性を有する少なくとも１つの結合部分を更に含む、上記の組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、ＣＤ７０とは異なる当該１つ以上のＴＡＡは、同じ癌に由来する細胞においてＣＤ７０と共発現するＴＡＡである。更なる実施形態では、ＣＤ７０とは異なる当該１つ以上のＴＡＡは、液性腫瘍を特徴とする癌においてＣＤ７０と共発現するＴＡＡである。好ましい実施形態では、ＣＤ７０とは異なる当該１つ以上のＴＡＡは、白血病においてＣＤ７０と共発現するＴＡＡ、例えば、ＡＭＬ癌細胞によってＣＤ７０と共発現されるＴＡＡである。本発明に使用するための、ＣＤ７０とは異なる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して結合特異性を有する結合部分の例としては、抗体、代替足場、及びポリペプチドが挙げられる。ＡＭＬ癌細胞において発現するＴＡＡを含む多くのＴＡＡが当該技術分野で既知である。

置換
いくつかの実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質の任意のアンキリン反復モジュールにおいて、配列番号２４～４５及び７３～７７の配列に対して、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２４～４５及び７３～７７の配列に対して、５個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２４～４５及び７３～７７の配列に対して、４個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２４～４５及び７３～７７の配列に対して、３個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２４～４５及び７３～７７の配列に対して、２個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２４～４５及び７３～７７の配列に対して、１個以下の置換が行われる。

いくつかの実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質の任意のアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列の１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、又は７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下が、配列番号１～１２及び７１～７２の配列に対して置換によって変更される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の１０％以下が、配列番号１～１２及び７１～７２の配列に対して置換によって変更される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の８％以下が、配列番号１～１２及び７１～７２の配列に対して置換によって変更される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の６％以下が、配列番号１～１２及び７１～７２の配列に対して置換によって変更される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の４％以下が、配列番号１～１２及び７１～７２の配列に対して置換によって変更される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の２％以下が、配列番号１～１２及び７１～７２の配列に対して置換によって変更される。

いくつかの態様では、結合剤に対して行われるアミノ酸置換は、Ｋ_D値を、非置換結合剤のＫ_D値と比較して、約１０００倍を超えて、約１００倍を超えて、又は約１０倍を超えては変化させない。例えば、いくつかの態様では、アミノ酸置換は、Ｋ_D値を、配列番号１～１２、２４～４５、及び７１～７７の配列のいずれかを含む結合剤のＣＤ７０に対するＫ_D値と比較して、約１０００倍を超えて、約３００倍を超えて、約１００倍を超えて、約５０倍を超えて、約２５倍を超えて、約１０倍を超えて、又は約５倍を超えては変化させない。

特定の実施形態では、置換は、表１に記載の保存的置換である。特定の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造コア残基外、例えば、アルファヘリックスを接続するベータループ内で行われる。

特定の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造コア残基内で行われる。他の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造コア残基外で行われる。例えば、アンキリンドメインは、コンセンサス配列：ｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧｘｘｘｌＶｘＶＬＬｘｘＧＡＤＶＮＡ（配列番号６２）（式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸（好ましくはシステイン、グリシン、又はプロリンではない）を表す）、又はｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡＡｘｘＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫｚＧＡＤＶＮＡ（配列番号６３）（式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸（好ましくはシステイン、グリシン、又はプロリンではない）を表し、「ｚ」は、アスパラギン、ヒスチジン、又はチロシンからなる群から選択される）を含んでもよい。一実施形態では、置換は、「ｘ」として指定されている残基に対して行われる。別の実施形態では、置換は、「ｘ」として指定されていない残基に対して行われる。

加えて、本発明の組換え結合タンパク質の任意のアンキリン反復ドメインの最後から２番目の位置は、「Ａ」若しくは「Ｌ」であり得、かつ／又は最後の位置は、「Ａ」若しくは「Ｎ」であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、各アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１２、５２～５９、及び７１～７２のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡはＬで置換されており、かつ／若しくは最後の位置のＡはＮで置換されているか、又は任意選択で、最後から２番目の位置のＬはＡで置換されており、かつ／若しくは最後の位置のＮはＡで置換されている。例示的な実施形態では、各アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１２、５２～５８、及び７１～７２のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡはＬで置換されており、かつ／又は最後の位置のＡはＮで置換されている。更に、本発明の結合タンパク質に含まれる任意のアンキリン反復ドメインの配列は、任意選択で、そのＮ末端にＧ、Ｓ、又はＧＳを含み得る（以下を参照されたい）。

加えて、本発明の組換え結合タンパク質に含まれる各アンキリン反復ドメインは、任意選択で、そのＮ末端に「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、各アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１２、５２～５９、及び７１～７２のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、更にそのＮ末端にＧＳ含むか（例えば、配列番号６１及び６４にあるように）、又はＧＳの代わりにＧ若しくはＳのみを含む。

結合親和性
特定の実施形態では、組換え結合タンパク質とその標的（すなわち、ヒトＣＤ７０）との間の親和性は、Ｋ_Dを単位として記載される。例示的な実施形態では、Ｋ_Dは、約１０^-1Ｍ以下、約１０^-2Ｍ以下、約１０^-3Ｍ以下、約１０^-4Ｍ以下、約１０^-5Ｍ以下、約１０^-6Ｍ以下、約１０^-7Ｍ以下、約１０^-8Ｍ以下、約１０^-9Ｍ以下、約１０^-10Ｍ以下、約１０^-11Ｍ以下、約１０^-12Ｍ以下、約１０^-13Ｍ以下、約１０^-14Ｍ以下、約１０^-5Ｍ～約１０^-15Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-15Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-15Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-15Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-15Ｍ、約１０^-10Ｍ～約１０^-15Ｍ、約１０^-5Ｍ～約１０^-14Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-14Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-14Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-14Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-14Ｍ、約１０^-10Ｍ～約１０^-14Ｍ、約１０^-5Ｍ～約１０^-13Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-13Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-13Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-13Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-13Ｍ、約１０^-10Ｍ～約１０^-13Ｍ、約１０^-5Ｍ～約１０^-12Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-12Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-12Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-12Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-12Ｍ、約１０^-10Ｍ～約１０^-12Ｍ、約１０^-5Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-10Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-5Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-5Ｍ～約１０^-9Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-9Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-9Ｍ、又は約１０^-8Ｍ～約１０^-9Ｍである。

例示的な実施形態では、組換え結合タンパク質は、約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約１０ｐＭ、又は約１ｐＭ以下のＫ_D値でヒトＣＤ７０と結合する。例示的な一実施形態では、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下のＫ_D値でＣＤ７０と結合する。別の例示的な実施形態では、組換え結合タンパク質は、１０ｎＭ以下のＫ_D値でＣＤ７０と結合する。

一態様では、組換え結合タンパク質は、約５００、約４００、約３００、約２００、約１５０、約１００、約７０、約６０、約５０、約４０、約３０、約２０、約１５、約１０、約７、約５、約３、約１、約０．５、又は約０．１ｎＭ未満のＥＣ₅₀でヒトＣＤ７０と結合する。したがって、一態様では、当該結合タンパク質は、約５００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ７０と結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約４００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ７０と結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約３００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ７０と結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約２００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ７０と結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約１００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ７０と結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約７０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ７０と結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約６０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ７０と結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約５０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ７０と結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約４０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ７０と結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約３０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ７０に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約２０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ７０に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約１５ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ７０に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約１０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ７０に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約７ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ７０に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約５ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ７０に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約３ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ７０に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約１ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ７０に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約０．５ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ７０に結合する；更なる態様では、当該結合タンパク質は、約０．１ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ７０に結合する。

追加のポリペプチド
一態様では、本発明の組換え結合タンパク質は、ポリペプチドタグを更に含む。ポリペプチドタグとは、ポリペプチド／タンパク質に結合されたアミノ酸配列であり、ここで、当該アミノ酸配列は、当該ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、若しくは標的化に有用であるか、又は、当該アミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善するか、又は、当該アミノ酸配列はエフェクター機能を有する。組換え結合タンパク質の個々のポリペプチドタグは、組換え結合タンパク質の他の部位に、直接又はペプチドリンカーを介して接続されてもよい。ポリペプチドタグは全て当該技術分野で周知であり、当業者には十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、当該ポリペプチド／タンパク質の検出を可能にする、小ポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、若しくはＳｔｒｅｐタグ、又は酵素（例えばアルカリホスファターゼ）などのポリペプチド、あるいは標的化に使用できるポリペプチド（免疫グロブリン又はそのフラグメントなど）及び／又はエフェクター分子として使用できるポリペプチドである。

一態様では、本発明の組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカーを更に含む。ペプチドリンカーとは、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非タンパク質化合物若しくはポリエチレングリコールなどのポリマー、タンパク質ドメインと生物学的に活性な分子、タンパク質ドメインとローカライザ、又は２つの配列タグを、結合させることができるアミノ酸配列である。ペプチドリンカーは、当業者に既知である。例の一覧は、国際公開第２００２／０２０５６５号の明細書に提供されている。一態様では、本発明に使用するためのペプチドリンカーは、１～５０アミノ酸の長さを有する。別の態様では、本発明に使用するためのペプチドリンカーは、約５～約４０アミノ酸の長さを有する。別の態様では、本発明に使用するためのペプチドリンカーは、約１０～約３０アミノ酸の長さを有する。

ペプチドリンカーの具体例は、可変長のグリシン－セリンリンカー及びプロリン－トレオニンリッチリンカーである。本発明の文脈において、プロリン－トレオニンリッチリンカーは、そのアミノ酸配列中に少なくとも約２０％のプロリン残基及び少なくとも約２０％のトレオニン残基を含む。グリシン－セリンリンカーの例は、アミノ酸配列ＧＳ及び配列番号６７のアミノ酸配列であり、プロリン－トレオニンリッチリンカーの例は、配列番号６５及び６６のアミノ酸配列である。

Ｎ末端及びＣ末端キャッピング配列
本明細書に開示される組換え結合タンパク質のアンキリン反復ドメインは、Ｎ末端又はＣ末端キャッピング配列を含んでもよい。キャッピング配列とは、アンキリン反復配列モチーフのＮ末端又はＣ末端に融合された追加のポリペプチド配列を指し、当該キャッピング配列は、アンキリン反復配列モチーフとの厳密な三次相互作用（すなわち、三次構造相互作用）を形成し、それによって、側面のアンキリン反復ドメインの疎水性コアが溶媒に曝露しないように遮蔽するキャップを提供する。

Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピング配列は、キャッピング単位、又は反復単位に隣接する天然に存在する反復タンパク質中に見出される他の構造単位に由来してもよい。キャッピング配列の例は、国際公開第２００２／０２０５６５号及び同第２０１２／０６９６５５号、米国特許出願公開第２０１３／０２９６２２１号、並びにＩｎｔｅｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８ Ｊａｎ １８；３７５（３）：８３７－５４に記載されている。Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュール（すなわち、Ｎ末端キャッピング反復）の例としては、配列番号４６～４７及び６９～７０が挙げられ、アンキリンＣ末端キャッピングモジュール（すなわち、Ｃ末端キャッピング反復）の例としては、配列番号４８～５１が挙げられる。

核酸及び方法
別の態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。更に、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含むベクターに関する。核酸は、当業者に周知である。実施例において、核酸は、本発明の設計アンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質を、大腸菌で産生するために使用した。

組成物、使用、及び処置方法
一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメイン、並びに／又は本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメインをコードする核酸と、任意選択で、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物に関する。

一態様では、本発明は、組換え結合タンパク質又は本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸と、任意選択で、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物に関する。

薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は当業者に既知であり、以下でより詳細に説明する。

医薬組成物は、組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメイン、並びに／又は核酸、好ましくは、本明細書に記載の組換え結合タンパク質及び／又は核酸と、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６^th ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０に記載の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤と、を含む。

当業者に既知の、好適な担体、希釈剤、賦形剤、又は安定剤としては、例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、５％デキストロース生理食塩水、等張性及び化学的安定性を高める物質、緩衝液、並びに防腐剤が挙げられる。他の好適な担体としては、それ自体が、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の産生を誘導しない任意の担体、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、及びアミノ酸コポリマーが挙げられる。医薬組成物はまた、抗癌剤若しくは抗血管新生剤、又は更なる生物活性化合物などの追加の活性剤を含む、合剤であってもよい。インビボ投与に使用される組成物は、無菌でなくてはならないか又は滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌濾過膜で濾過することにより、容易に達成される。

一態様では、医薬組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つの組換え結合タンパク質と、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤、リン酸緩衝液などの緩衝液、及びスクロースなどの糖と、を含む。一態様では、そのような組成物は、上記の組換え結合タンパク質とＰＢＳとを含む。

別の態様では、本発明は、ヒトを含む哺乳動物におけるＴ細胞の腫瘍局所的活性化の方法であって、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を当該哺乳動物に投与する工程を含む、方法を提供する。

別の態様では、本発明は、医学的状態を処置する方法であって、医学的状態の処置を必要とする患者に、治療有効量の本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。

別の態様では、本発明は、医学的状態を処置する方法であって、医学的状態の処置を必要とする患者に、治療有効量の、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む本発明の組換え結合タンパク質、当該組換え結合タンパク質をコードする核酸、又は当該結合タンパク質を含む医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。

一態様では、本発明は、疾患の処置に使用するための、本発明による医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸に関する。その目的のため、本発明による医薬組成物、核酸、又は組換え結合タンパク質は、これらを必要とする患者に、治療有効量で投与される。投与としては、局所投与、経口投与、及び非経口投与を挙げることができる。典型的な投与経路は非経口投与である。非経口投与では、本発明の医薬組成物は、上記で定義したような薬学的に許容される賦形剤と共に、溶液、懸濁液、又はエマルションなどの単位用量の注射剤形で配合され得る。用量及び投与方法は、処置される個体及び疾患に依存し得る。

更に、上述の医薬組成物、核酸又は組換えタンパク質のいずれも、障害の処置に使用するためのものと見なされる。

一態様では、本明細書に記載の当該組換え結合タンパク質又はそのような他の医薬組成物は、静脈内投与される。非経口用途の場合、組換え結合タンパク質又は当該医薬組成物は、ボーラス注入として又は緩徐な点滴注入により、治療有効量で注射することができる。

一態様では、本発明は、疾患の処置のための医薬品としての、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の使用に関する。一態様では、本発明は、医薬品の製造のための、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の使用に関する。一態様では、本発明は、疾患の処置のための医薬品の製造のための、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の使用に関する。一態様では、本発明は、疾患の処置のための医薬品を製造するための方法であって、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物が、医薬品の有効成分である、方法に関する。一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を使用する、疾患の処置方法に関する。

一態様では、本発明は更に、医学的状態の処置を必要とする対象の医学的状態を処置するための、そのような組換え結合タンパク質の使用を提供する。

本明細書で使用される場合、当該医学的状態又は疾患は、癌、好ましくは液性腫瘍、より好ましくは白血病、更により好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物はまた、当該技術分野で既知の１つ以上の他の療法と併用することができる。用語「と併用」は、本明細書で使用される場合、所与の投与計画の下で実施される共投与を指すものとする。これには、異なる化合物の同時投与及び異なる化合物の時間を変えた投与が含まれる（例えば、化合物Ａを１回投与し、かつ化合物Ｂをその後に数回投与する、若しくはその逆、又は、両化合物を同時に投与し、かつ２つのうちの１つを後の段階でまた投与する）。

一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質を含むキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸を含むキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を含むキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質、及び／又は本発明の核酸、及び／又は本発明の医薬組成物を含むキットに関する。一態様では、本発明は、本発明のＣＤ７０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１～１２及び７１～７２を含む組換えタンパク質、並びに／又はＣＤ７０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１～１２及び７１～７２を含む組換えタンパク質をコードする核酸、並びに／又はＣＤ７０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１～１２及び７１～７２を含む組換えタンパク質を含む医薬組成物を含むキットに関する。一態様では、本発明は、配列番号１～４５及び７１～８１のアミノ酸配列のいずれか１つを含む組換えタンパク質、並びに／又は当該組換えタンパク質をコードする核酸、並びに／又は組換えタンパク質を含む医薬組成物を含むキットに関する。

一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を産生する方法に関する。一態様では、本発明は、組換え結合タンパク質、例えば、配列番号１～４５及び７１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を産生する方法であって、（ｉ）当該組換え結合タンパク質を好適な宿主細胞（例えば、細菌）中で発現させる工程と、（ｉｉ）当該組換え結合タンパク質を（例えば、クロマトグラフィーを使用して）精製する工程と、を含む、方法に関する。当該方法は追加の工程を含んでもよい。本発明の組換え結合タンパク質のこのような産生方法は、実施例１に記載される。

本発明は、実施例に記載の特定の態様に制限されない。本明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、添付の配列表に開示されているいくつかのアミノ酸配列、核酸配列、及び配列番号を参照する。

定義
本明細書で別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学に関連して使用される命名法と、それらの技法とは、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。

用語「含む（comprising）」、「有する」、「含む(including）」、及び「含有する（containing）」は、特に明記しない限り、非限定的用語として解釈されるべきである。本発明の態様がある特徴を「含む」と記載されている場合、態様がその特徴「からなる」か又は「から本質的になる」も企図されている。本明細書で提供されるありとあらゆる例、又は例示を意味する文言（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をよりよく説明することを意図するものであり、別段の特許請求がない限り、本開示の範囲に制限を課すものではない。本明細書におけるいかなる文言も、特許請求されていない任意の要素を本開示の実施に不可欠なものとして示すものとして解釈されるべきではない。実施されている例、又は別途指示がある場合を除き、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合において、用語「約」によって、その用語が当業者によって解釈されるように、修飾されると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「約」は、特に明記しない限り、所与の数値の±１０％に相当する。

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲内に入る各別個の値及び各エンドポイントを個々に指す簡略法として役立つことを単に意図しており、各別個の値及びエンドポイントは、本明細書において個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。

本発明の文脈において、用語「タンパク質」とは、ポリペプチドを含む分子を指し、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内及び／又は複数のポリペプチド鎖間において二次、三次、及び／又は四次構造を形成することによって、定義された三次元配列を有するか、又は獲得することができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。二次及び／又は三次構造を形成することによって定義された三次元配列を個別に有するか、又は獲得することができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。

組換えタンパク質及び組換えポリペプチドなどで使用される用語「組換え」とは、当該タンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術の使用によって産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって産生される）を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はインビトロ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば、大腸菌）に挿入すると、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされたポリペプチドを産生することができる。それに応じて産生されたポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。

本発明の文脈において、用語「結合タンパク質」とは、結合ドメインを含むタンパク質を指す。結合タンパク質はまた、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の結合ドメインを含んでもよい。好ましくは、当該結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。本発明の結合タンパク質は、ＣＤ７０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。

更に、任意のそのような結合タンパク質は、当業者に周知の追加のポリペプチド（例えば、ポリペプチドタグ、ペプチドリンカー、結合特異性を有する他のタンパク質ドメインへの融合、サイトカイン、ホルモン、又はアンタゴニストなど）、又は化学修飾（ポリエチレングリコール、毒素（例えば、免疫原からのＤＭ１）、小分子、抗生物質などへのカップリングなど）を含み得る。本発明の結合タンパク質は、ローカライザ分子を含んでもよい。

用語「結合ドメイン」とは、標的に対して結合特異性を示すタンパク質ドメインを意味する。好ましくは、当該結合ドメインは、組換え結合ドメインである。

本明細書で使用される場合、用語「標的」とは、核酸分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然に存在する分子などの個々の分子（そのような個々の分子の任意の一部を含む）、又はそのような分子の２つ以上の複合体、又は細胞全体若しくは組織試料、又は任意の非天然化合物を指す。好ましくは、標的はＣＤ７０である。より好ましくは、標的はヒトＣＤ７０である。

本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」にはまた、システインのＳ－Ｓ架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も含まれる。ポリペプチドは、当業者に周知である。

国際公開第２００２／０２０５６５号及びＦｏｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６）には、反復タンパク質の特徴及び反復ドメインの特徴、技法、及び用途の一般的な説明が含まれる。用語「反復タンパク質」とは、１つ以上の反復ドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、反復タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの反復ドメインを含む。更に、当該反復タンパク質は、追加の非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ、及び／又はペプチドリンカーを含んでもよい。反復ドメインは、結合ドメインであり得る。

用語「反復ドメイン」とは、構造単位として２つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、当該反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールを更に含む。明確にするために、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。そのような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造的相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、ロイシンリッチ反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１（５），４９７－５０８，２００３）、及びアルマジロ反復ドメイン（国際公開第２００９／０４０３３８号）の実施例から、当業者に周知である。そのような反復ドメインが反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なることは、当業者には更に周知であり、反復されるアミノ酸配列は全て、個々のドメイン（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成することができる。

用語「アンキリン反復ドメイン」とは、構造単位として２つ以上の連続するアンキリン反復モジュールを含む反復ドメインを指す。アンキリン反復ドメインは、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、任意選択で半減期延長ドメインと共に、より大きなアンキリン反復タンパク質にモジュール式に組み立てられてもよい（例えば、Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６，２００３、国際公開第２００２／０２０５６５号、国際公開第２０１６／１５６５９６号、国際公開第２０１８／０５４９７１号を参照されたい）。

設計反復タンパク質及び設計反復ドメインなどで使用される用語「設計」とは、そのような反復タンパク質及び反復ドメインがそれぞれ人工的であり、自然界には存在しないという特性を指す。本発明の結合タンパク質は、設計反復タンパク質であり、これらは少なくとも１つの設計アンキリン反復ドメインを含む。好ましくは、設計反復ドメインは、設計アンキリン反復ドメインである。

用語「標的相互作用残基」とは、標的との直接的な相互作用に寄与する反復モジュールのアミノ酸残基を指す。

用語「フレームワーク残基」とは、反復モジュールのアミノ酸残基を指し、これは、フォールディングトポロジーに寄与する、すなわち、当該反復モジュールのフォールディングに寄与するか、又は隣接モジュールとの相互作用に寄与する。そのような寄与は、反復モジュール内の他の残基との相互作用、又はαヘリックス若しくはβシートに見られるポリペプチド骨格構造への影響、又は直鎖ポリペプチド若しくはループを形成するアミノ酸ストレッチへの関与であってもよい。そのようなフレームワーク及び標的相互作用残基は、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ及び／若しくはＣＤ分光法などの物理化学的方法によって得られる構造データの分析によって、又は構造生物学及び／若しくはバイオインフォマティクスにおいて当業者に周知の既知の関連する構造情報と比較することによって同定され得る。

用語「反復モジュール」とは、元々は天然に存在する反復タンパク質の反復単位に由来する、設計反復ドメインの反復されたアミノ酸配列及び構造単位を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質のファミリー又はサブファミリー、例えば、アンキリン反復タンパク質ファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。更に、反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、例えば、実施例１に記載されるように、標的上で選択された反復ドメインから得られ、同じ標的特異性を有する相同反復モジュールから推定される「反復配列モチーフ」を含み得る。

したがって、用語「アンキリン反復モジュール」とは、元々は天然に存在するアンキリン反復タンパク質の反復単位に由来する反復モジュールを指す。アンキリン反復タンパク質は、当業者に周知である。設計アンキリン反復タンパク質は、以前に記載されており、例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号、同第２０１０／０６０７４８号、同第２０１１／１３５０６７号、同第２０１２／０６９６５４号、同第２０１２／０６９６５５号、同第２０１４／００１４４２号、同第２０１４／１９１５７４号、同第２０１４／０８３２０８号、同第２０１６／１５６５９６号、及び同第２０１８／０５４９７１号を参照されたく、これらは全て、それらの全体が参照により組み込まれる。典型的には、アンキリン反復モジュールは、ループによって分離された２つのアルファヘリックスを形成する約３１～３３個のアミノ酸残基を含む。

反復モジュールは、標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されていないアミノ酸残基を有する位置（「非ランダム化位置」）及び標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されたアミノ酸残基を有する位置（「ランダム化位置」）を含み得る。非ランダム化位置は、フレームワーク残基を含む。ランダム化位置は、標的相互作用残基を含む。「ランダム化された」とは、反復モジュールのあるアミノ酸位置で２つ以上のアミノ酸が許可されたこと、例えば、通常の２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許可されたか、又はシステイン以外のアミノ酸、若しくはグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などの、２０個の天然に存在するアミノ酸のほとんどが許可されたことを意味する。

用語「反復配列モチーフ」とは、１つ以上の反復モジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、当該反復モジュールは、同じ標的に対して結合特異性を有する反復ドメインに由来する。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。当該フレームワーク残基位置は、反復モジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、当該標的相互作用残基位置は、反復モジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。反復配列モチーフは、非ランダム化位置及びランダム化位置を含む。

用語「反復単位」とは、１つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、当該「反復単位」は複数のコピーに見出され、タンパク質のフォールディングを決定する全ての当該モチーフに共通の定義されたフォールディングトポロジーを示す。そのような反復単位の例としては、ロイシンリッチ反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、及びロイシンリッチバリアント反復単位が挙げられる。

用語「標的に対して結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、「高い特異性で標的に結合する」、「標的に特異的な」、「標的特異性」、又は「特異的に結合する」などは、結合タンパク質又は結合ドメインが、大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などの非関連タンパク質に結合するよりも、ＰＢＳ中で、標的に、より低い解離定数で結合する（すなわち、より高い親和性で結合する）ことを意味する。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での解離定数（「Ｋ_D」）は、ＭＢＰに対する対応する解離定数の、少なくとも１０^-2倍、より好ましくは少なくとも１０^-3倍、より好ましくは少なくとも１０^-4倍、又はより好ましくは少なくとも１０^-5倍である。タンパク質－タンパク質相互作用の解離定数を決定する方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（例えば、ＳＰＲ平衡分析）又は等温滴定熱量測定（isothermal titration calorimetry、ＩＴＣ）は、当業者に周知である。特定のタンパク質－タンパク質相互作用のＫ_Dの測定値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変動し得る。したがって、Ｋ_D値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及びＰＢＳなどの標準化緩衝液を使用して実施される。ＣＤ７０に対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（Ｋ_D）の典型的かつ好ましい決定は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を使用して実施される。様々なアッセイ形式を使用して、目的の薬物分子と特異的に結合する結合部分を選択又は特徴付けることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）及びウエスタンブロット分析は、標的薬物分子に特異的に結合する結合部分を同定するために使用され得る多くのアッセイの一部である。典型的には、特異的又は選択的結合は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドシグナルの１０倍超となる。より具体的には、結合剤は、平衡解離定数（Ｋ_D）値が＜１μＭ、例えば、＜５００ｎＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜１００ｐＭ、又は＜１０ｐＭである場合、標的と「特異的に結合する」と言われる。

用語「結合剤」又は「結合部分」とは、標的分子と特異的に結合することができる任意の分子を指す。結合剤としては、例えば、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプチド（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：５１８２－５１９０（１９９１））、代替足場、抗体模擬体、反復タンパク質、例えば、設計アンキリン反復タンパク質、受容体タンパク質、及び標的分子の任意の他の天然に存在する相互作用パートナーが挙げられ、天然タンパク質と、例えば、非天然残基を含むように、及び／又は天然残基を欠くように修飾又は遺伝子操作されたタンパク質と、を含むことができる。

用語「ＰＢＳ」とは、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩及び２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４であるリン酸緩衝水溶液を意味する。

好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期は、哺乳動物、より好ましくはマウス及び／又はカニクイザル、より好ましくはカニクイザルで評価する。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をマウスで測定する場合、評価は、注射後最大４８時間までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、マウスにおける終末相半減期の評価は、２４時間～４８時間で計算される。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をカニクイザルで測定する場合、評価は、注射後最大７日目までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、カニクイザルにおける終末相半減期の評価は、１日目～５日目で計算される。当業者は、標的媒介クリアランスなどの効果を更に特定し、終末相半減期を計算する場合、それらを考慮することができる。本発明の組換え結合タンパク質などの薬物の用語「終末相半減期」とは、偽平衡に達した後、哺乳動物に適用した薬物の血漿中濃度の半分に達するのに必要な時間を指す（例えば、マウスでは２４時間～４８時間で計算され、又はカニクイザルでは１日目～５日目で計算される）。終末相半減期は、哺乳動物に投与された薬物の用量の半分を排泄するのに必要な時間とは定義されない。終末相半減期という用語は、当業者に周知である。好ましくは、薬物動態の比較は、任意の用量、より好ましくは等用量（すなわち、同じｍｇ／ｋｇ用量）又は等モル用量（すなわち、同じｍｏｌ／ｋｇ用量）、より好ましくは等モル投与量（すなわち、同じｍｏｌ／ｋｇ用量）で行う。当業者であれば、動物での同等及び／又は等モルの投与は、少なくとも約２０％、より好ましくは約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％の実験的な用量のばらつきを伴うことを理解する。好ましくは、薬物動態の測定に用いられる用量は、約０．００１～約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．５～約１０ｍｇ／ｋｇから選択される。

用語「ＣＤ３」又は「分化抗原群３」とは、３つの対（εγ、εδ、ζζ）として集合するイプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びゼータ（ζ）の４つの異なるポリペプチド鎖から構成される多量体タンパク質複合体を指す。ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞受容体と非共有結合するＴ細胞共受容体として機能する。それは、任意の形態のＣＤ３、並びにＣＤ３の活性の少なくとも一部を保持するそのバリアント、アイソフォーム、及び種相同体を指し得る。したがって、本明細書に定義及び開示される結合タンパク質はまた、ヒト以外の種由来のＣＤ３と結合してもよい。他の場合では、結合タンパク質は、ヒトＣＤ３に対して完全に特異的であってもよく、種又は他のタイプの交差反応性を示さなくてもよい。ヒトＣＤ３への具体的な言及などによる異なる指示がない限り、ＣＤ３は、全ての哺乳動物種、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシの天然配列ＣＤ３を含む。ヒトＣＤ３ガンマ、デルタ及びゼータ鎖のアミノ酸配列は、それぞれＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）参照配列ＮＰ＿００００６４．１、ＮＰ＿０００７２３．１、及びＮＰ＿９３２１７０．１に示されている。

本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ３発現細胞」とは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）及びヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）などのＴ細胞を含むがこれらに限定されない、細胞表面上にＣＤ３（分化抗原群３）を発現する任意の細胞を指す。

用語「ＣＤ７０」とは、ＣＤ２７のリガンドとして機能するサイトカインであるＣＤ７０抗原を指す。ＣＤ７０－ＣＤ２７経路は、特に抗ウイルス応答の間、Ｔ細胞免疫の生成及び維持において重要な役割を果たす。ヒトＣＤ７０（ｈＣＤ７０）のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）参照番号Ｐ３２９７０に示されている。

用語「Ｔ細胞の腫瘍局所的活性化」とは、Ｔ細胞が、非腫瘍組織と比較して、腫瘍組織において優先的に活性化されることを意味する。

更に、用語「ペプチド」にはまた、例えばグリコシル化によって修飾されたペプチドと、各々４～６００アミノ酸長の長さの、例えばインスリン及び免疫グロブリンなどの、例えばジスルフィド結合によって架橋された２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質と、が包含される。用語「化学又は生化学剤」とは、レシピエントに投与され得る任意の天然に存在するか又は合成の化合物を含むことが意図される。好ましい態様では、ローカライザは、標的特異的アンキリン反復ドメインである。

用語「医学的状態」（又は障害若しくは疾患）には、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症（特に増殖性網膜症）、神経変性障害、感染症、代謝性疾患、及び新生物疾患が含まれる。本明細書に記載の組換え結合タンパク質のいずれかを、そのような障害、特に、新生物疾患などの障害の処置のための医薬品の調製に使用することができる。「医学的状態」は、不適切な細胞増殖を特徴とするものである場合がある。医学的状態は、過剰増殖状態である場合がある。本発明は、特に、医学的状態を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療有効量の本発明の組換え結合タンパク質又は当該医薬組成物を投与する工程を含む、方法に関する。好ましい態様では、当該医学的状態は、新生物疾患である。用語「新生物疾患」とは、本明細書で使用される場合、急速に増殖する細胞増殖又は新生物を特徴とする、細胞又は組織の異常な状態（state or condition）を指す。一態様では、当該医学的状態は、悪性新生物疾患である。一態様では、当該医学的状態は、癌、好ましくは白血病、より好ましくは急性骨髄性白血病である。用語「治療有効量」とは、患者に対して所望の効果をもたらすのに十分な量を意味する。

用語「抗体」とは、インタクトな抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の任意のフラグメント及びバリアントも意味する。そのようなフラグメント及びバリアントもまた、当該技術分野で周知であり、インビトロ及びインビボの両方で常時使用されている。したがって、用語「抗体」には、インタクトな免疫グロブリン分子、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、及び単鎖Ｖ領域フラグメント（ｓｃＦｖ）など、二重特異性抗体、キメラ抗体、抗体融合ポリペプチド、並びに非従来型抗体が包含される。

用語「癌」及び「癌性」は、本明細書では、典型的には、制御されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は記載するために使用される。癌には、固形腫瘍及び液性腫瘍、並びに原発性腫瘍及び転移が包含される。「腫瘍」は、１つ以上の癌性細胞を含む。固形腫瘍は、典型的には、腫瘍間質も含む。癌の例としては、原発性及び転移性癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病、並びに任意の他の上皮及びリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより具体的な例としては、脳癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、明細胞腎臓癌、頭頸部扁平上皮癌腫、肺腺癌腫、肺扁平上皮癌腫、悪性黒色腫、非小細胞肺癌（non－small－cell lung cancer、ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌腫、小細胞肺癌（small－cell lung cancer、ＳＣＬＣ）、三重陰性乳癌、急性リンパ芽球性白血病（acute lymphoblastic leukemia、ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic myeloid leukemia、ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B－cell lymphoma、ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（Hodgkin’s lymphoma、ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma、ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（multiple myeloma、ＭＭ）、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome、ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（non－Hodgkin’s lymphoma、ＮＨＬ）、頭頸部の扁平上皮癌腫（Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck、ＳＣＣＨＮ）、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia、ＣＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（small lymphocytic lymphoma、ＳＬＬ）、悪性中皮腫、結腸直腸癌、又は胃癌が挙げられる。

以下に開示の出発物質及び試薬は、当業者に既知であり、市販されている、及び／又は周知の技法を用いて調製することができる。

材料
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。誘導性大腸菌発現株、例えば、大腸菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を、クローニング及びタンパク質産生に使用した。

分子生物学
特に明記しない限り、方法は、既知のプロトコルに従って実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。

設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを作製する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９－５０３，２００３、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，２００４（上記引用）に記載されている。このような方法により、ランダム化アンキリン反復モジュール及び／又はランダム化キャッピングモジュールを有する、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを構築することができる。したがって、例えば、そのようなライブラリーは、固定化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号４６、６９、又は７０のＮ末端キャッピングモジュール）、又はランダム化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号４７による）、及び固定化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号４８、４９、又は５０のＣ末端キャッピングモジュール）、又はランダム化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号５１による）に基づいて組み立てられ得る。好ましくは、そのようなライブラリーは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）及びＰのいずれも有することがないように組み立てられる。

更に、そのようなライブラリー内のそのようなランダム化モジュールは、ランダム化アミノ酸位置を有する追加のポリペプチドループ挿入を含んでもよい。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体又はデノボ作製ペプチドライブラリーの補体決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）ループライブラリーである。例えば、そのようなループ挿入は、ガイダンスとして、ヒトリボヌクレアーゼＬのＮ末端アンキリン反復ドメインの構造を用いて設計され得る（Ｔａｎａｋａ，Ｎ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ，Ｋｕｓａｋａｂｅ，Ｙ，Ｇｏｔｏ，Ｙ．，Ｋｉｔａｄｅ，Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｔ．，ＥＭＢＯ Ｊ．．２３（３０），３９２９－３９３８，２００４）。１０個のアミノ酸が２つのアンキリン反復の境界近くに存在するベータターンに挿入されているこのアンキリン反復ドメインと同様に、アンキリン反復タンパク質ライブラリーは、アンキリン反復ドメインの１つ以上のベータターンに挿入された可変長（例えば１～２０アミノ酸）のランダム化ループ（固定化及びランダム化位置を有する）を含有し得る。アンキリン反復タンパク質ライブラリーの任意のそのようなＮ末端キャッピングモジュールは、好ましくはＲＩＬＬＡＡ、ＲＩＬＬＫＡ、又はＲＥＬＬＫＡモチーフを有し（例えば、配列番号１、２、及び９の１９～２４位に存在）、アンキリン反復タンパク質ライブラリーの任意のそのようなＣ末端キャッピングモジュールは、好ましくはＫＬＮ、ＫＬＡ、又はＫＡＡモチーフを有する（例えば、配列番号１の最後の３個のアミノ酸に存在）。配列番号４６、６９、及び７０は、ＲＩＬＬＡＡ、ＲＩＬＬＫＡ、又はＲＥＬＬＫＡモチーフを含むＮ末端キャッピングモジュールの例を提供し、配列番号４８～５０は、ＫＬＮ、ＫＬＡ、又はＫＡＡモチーフを含むＣ末端キャッピングモジュールの例を提供する。

そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーの設計は、標的と相互作用するアンキリン反復ドメインの既知の構造によって誘導され得る。タンパク質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＰＤＢ）の固有受託コード又は識別コード（ＰＤＢ－ＩＤ）によって識別される、そのような構造の例は、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ－３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０、及び２ＺＧＤである。

Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーなどの、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーの例は、記載されている（米国特許第７，４１７，１３０号、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３，（上記引用）、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（上記引用））。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃにおける数字は、Ｎ末端キャッピングモジュールとＣ末端キャッピングモジュールとの間に存在するランダム化反復モジュールの数を説明している。

反復単位及びモジュール内の位置を定義するために使用される命名法は、アンキリン反復モジュール及びアンキリン反復単位の境界が１アミノ酸位置シフトするという修正を加えた、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（上記引用）に基づく。例えば、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（上記引用）のアンキリン反復モジュールの１位は、本開示のアンキリン反復モジュールの２位に対応し、結果として、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（上記引用）のアンキリン反復モジュールの３３位は、本開示の以下のアンキリン反復モジュールの１位に相当する。

実施例１：ＣＤ７０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ＰＮＡＳ ９４，４９３７－４２，１９９７）を用いて、ヒトＣＤ７０（ｈＣＤ７０）に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（上記引用）によって記載されているのと同様のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択した。選択したクローンの組換えヒトＣＤ７０標的に対する結合を、粗抽出物ホモジニアス時間分解蛍光測定（Homogeneous Time Resolved Fluorescence、ＨＴＲＦ）によって評価し、数百のｈＣＤ７０特異的結合タンパク質が成功裏に選択されたことが示された。例えば、配列番号１～１２のアンキリン反復ドメインは、ｈＣＤ７０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。配列番号２４～４５は、ｈＣＤ７０に対して結合特異性を有する選択された結合タンパク質のアンキリン反復モジュールを構成する。

リボソームディスプレイによるＣＤ７０特異的アンキリン反復タンパク質の選択
ｈＣＤ７０特異的アンキリン反復タンパク質の選択は、標的タンパク質としてのヒトＣＤ７０のビオチン化細胞外ドメイン（配列番号６０）、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルを用いる、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（上記引用））によって実施した（例えば、Ｚａｈｎｄ，Ｃ．，Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，６９－７９，２００７を参照されたい）。ＣＤ７０標的（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、Ｃ末端Ｆｃタグを含有し、５倍過剰のビオチンを用いて化学的にビオチン化した。合計４ラウンドの標準リボソーム選択を採用し、ラウンド１からラウンド４まで、漸減する標的濃度及び漸増する洗浄ストリンジェンシーを使用して、選択圧を増加させた（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（上記引用））。ストレプトアビジン及びニュートラアビジンビーズを使用することによって、各ラウンドにおいて選択解除戦略を適用した。各選択ラウンド後の逆転写（reverse transcription、ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整して、４５から２８に一定に減少させた。

高親和性ＣＤ７０特異的アンキリン反復タンパク質を富化するために、標準リボソームディスプレイ選択（上記）の第４ラウンドからの出力を、選択ストリンジェンシーを増加させたオフレート選択ラウンドに供した（Ｚａｈｎｄ，２００７（上記引用））。最後の標準選択ラウンドを、オフレート選択ラウンドの後に実施して、オフレート選択された結合タンパク質を増幅及び回収した。ラウンド５及び６では、ＲＴ－ＰＣＲサイクルの数は、それぞれ３０及び３５であった。

選択されたクローンは、粗抽出物ＨＴＲＦによって示されるようにヒトＣＤ７０に特異的に結合する
溶液中でｈＣＤ７０に特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイによって同定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクター（ｐＭＰＤＶ２５）の誘導体にクローニングし、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ－寒天（１％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有）上に播種し、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーをピッキングして、１６０μｌの成長培地（１％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ）を含有する９６ウェルプレートに入れ（単一のウェル中に各クローン）、８００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１５０μｌの新鮮なＴＢ培地に、新しい９６ウェルプレート中の８．５μｌの一晩培養物を播種した。３７℃及び７００ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、４時間続けた。細胞を採取し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、８μｌのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（９００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μｌのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。

溶解した各クローンの抽出物を、ＰＢＳＴＢ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４を補充したＰＢＳ）への１：２０００希釈物（最終濃度）として、２ｎＭ（最終濃度）ビオチン化ｈＣＤ７０、１：４００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：４００（最終濃度）の抗６Ｈｉｓ－Ｄ２抗体ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）と一緒に、３８４ウェルプレートのウェルへ適用し、ＲＴで６０分間インキュベートした。３４０ｎｍの励起波長及び６６５±１０ｎｍの発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００でＨＴＲＦを読み取った。そのような粗細胞抽出物ＨＴＲＦによる数百のクローンのスクリーニングは、ｈＣＤ７０に対して特異性を有するアンキリン反復ドメインを明らかにした。ｈＣＤ７０に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１～１２：
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１（配列番号１）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２（配列番号２）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３（配列番号３）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４（配列番号４）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５（配列番号５）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６（配列番号６）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（配列番号７）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（配列番号８）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（配列番号９）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１０（配列番号１０）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１１（配列番号１１）、及び
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１２（配列番号１２）に提供されている。

これらのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、任意選択で、それらのＮ末端にＧ、Ｓ、又はＧＳ配列を更に含む。

ｈＣＤ７０に対して結合特異性を有する追加のアンキリン反復タンパク質の操作
配列番号２及び５を、それぞれ配列番号１及び４の配列に基づいて操作した。表面電荷を変化させるために、両方の配列を改変した。両方のＮ末端キャッピングモジュールにおいて、ＲＩＬＬＡＡモチーフをＲＩＬＬＫＡで置き換え、アスパラギン酸（１５位）をロイシンで置き換えた。更に、配列番号１のＣ末端キャッピングモジュールを、セリン（１１２位）をグリシンで置き換え、グルタミン酸（１１４位）をグルタミンで置き換えて改変した。

ＣＤ７０特異的アンキリン反復タンパク質の発現
更なる分析のために、上記のような粗細胞抽出物ＨＴＲＦにおいて特異的ヒトＣＤ７０結合を示す選択されたクローンを、精製しやすいようにそれらのＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号８２）を融合させて大腸菌細胞において発現させた。発現したタンパク質を、それらのＨｉｓタグを標準的なプロトコルに従って使用して精製した。０．１１ｍｌの静置一晩培養物（ＴＢ、１％グルコース、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３７℃）を使用して、９６ディープウェルプレート中の０．９９ｍｌの培養物（ＴＢ、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３７℃）に接種した。３７℃（７００ｒｐｍ）で２時間インキュベートした後、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪（９００ｒｐｍ）しながら３７℃で６時間インキュベートした。細胞を採取し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、ＤＮＡａｓｅ Ｉ（２００ユニット／ｍｌ）及びリゾチーム（０．４ｍｇ／ｍｌ）を補充した５０μｌのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（９００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、６０μｌの低塩リン酸ナトリウム緩衝液を添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。合計で、８つの個々の発現をプールした後、細胞片を遠心分離によって除去した（３，２００ｇ、６０分間、４℃）。ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて上清を濾過した後、９６ウェルＴｈｅｒｍｏ ＨｉｓＰｕｒコバルトスピンプレートを用いて精製し、９６ウェルＴｈｅｒｍｏ Ｚｅｂａスピン脱塩プレートを用いてＰＢＳ中でタンパク質溶液を再緩衝化した。精製されたタンパク質は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステム上で標準Ｓｅｐｈａｄｅｘ １５０／５カラムを使用して、ＰＢＳ中で可溶性及び単量体であった。

ｈＣＤ７０に対して結合特異性を有する親和性成熟アンキリン反復タンパク質の生成
最初に同定されたＣＤ７０特異的結合タンパク質の更なる開発において、標的タンパク質に対して親和性が非常に高い、かつ／又は標的タンパク質からのオフレートが非常に低い結合ドメインを、親和性成熟を用いて生成した。２つの最初に同定された結合タンパク質（「親」結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９）を、親和性成熟の適切な出発点として選択した。親和性成熟手順は、出発点として使用されるアンキリン反復ドメインの各ランダム化位置の飽和変異誘発を伴った。親和性成熟手順によって生成された配列を、競合ＨＴＲＦによってより低いオフレートについてスクリーニングした。簡単に説明すると、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号８２）を含有するアンキリン反復タンパク質の粗抽出物をビオチン化標的と共にインキュベートした後、過剰の非タグ化親ＣＤ７０特異的結合タンパク質を添加し、ＨＴＲＦシグナルを経時的に測定した。親クローンと比較して高いＨＴＲＦシグナルに基づいて同定された有益な変異を、タンパク質操作によって結合タンパク質において組み合わせた。このようにして、親タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２（配列番号２）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（配列番号９）をそれぞれ起源とする親和性成熟ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４（配列番号７１）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２５（配列番号７２）を生成した。

次いで、そのような親和性成熟ＣＤ７０特異的結合ドメインを、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にサブクローニングして、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号８２）、続いてＣＤ７０特異的結合ドメイン（配列番号７１又は７２）、ペプチドリンカー（配列番号６５）、及びＣ末端ＣＤ３特異的結合ドメイン（配列番号５７）をコードする発現構築物を得た。Ｔ細胞エンゲージャーフォーマットのこれらの構築物を大腸菌細胞において発現させ、標準的なプロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。タンパク質を、健常ドナーＰＢＭＣから単離した初代Ｔ細胞をエフェクター細胞（Ｅ）として、Ｍｏｌｍ－１３－Ｎ１腫瘍細胞を標的細胞（Ｔ）として用いた（５：１のＥ：Ｔ比）アッセイで、用量依存的インビトロＴ細胞活性化及び腫瘍細胞殺傷について試験した。共培養物のアッセイインキュベーションを４８時間実施し、フローサイトメトリー及びＬＤＨ放出による分析を行った。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４（配列番号７１）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２５（配列番号７２）は、それらの親結合タンパク質と比較してＥＣ５０値がそれぞれおよそ７倍及び３１倍の改善を示し、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された単量体性は９５％超を示した。更なる工程において、ＣＤ７０特異的結合タンパク質であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４（配列番号７１）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２５（配列番号７２）を、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号８２）をコードするｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にサブクローニングし、大腸菌において一価の設計アンキリン反復タンパク質として発現させ、標準的なプロトコルに従って精製及び特徴付けた。

実施例２：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有する組換えアンキリン反復タンパク質の解離定数（Ｋ_D）の決定
組換えヒトＣＤ７０標的に対する精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。

Ｂｉｏ．ＣＤ７０をＮＬＣチップ上に固定化し、アンキリン反復タンパク質を１００ｎＭの開始濃度での滴定として適用し、次いで１．２ｎＭまで滴定した。シグナルを、Ｌ１及びＡ６のＰＢＳＴ処理された対照レーンに対して二重参照した。分析物注入を１２０秒間行い、続いて解離を１５００秒間行った。この研究で得られたＫ_D値を表２ａにまとめる。

更に、組換えヒトＣＤ７０標的に対する２つの更なる精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を測定し、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２、＃３、＃５～＃１２について上記の手順で分析した。簡単に説明すると、ニュートラアビジンをＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上に５３００ＲＵのレベルまでプレコートした。第２の工程において、ｂｉｏ．ｈＣＤ７０を５１０ＲＵのレベルまで固定化した。ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２４及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２５のｂｉｏ．ｈＣＤ７０への結合を、１００、４０、１６、６．４、及び２．６ｎＭの段階希釈でＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子を注入することによって測定した。全ての記載された測定について、１００μｌ／分の一定流を用いて、１２０秒の会合及び１２００秒の解離を適用した。ＣＤ７０標的を、４Ｍ ＭｇＣｌ₂を３０秒間適用して再生した。シグナルをインタースポット及び泳動用緩衝液（ＰＢＳＴ：０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ ｐＨ７．４）処理された対照レーンＡ６に対して二重参照した。１：１ラングミュアモデルをフィッティングに使用した。この研究で得られたＫ_D値を表２ｂにまとめる。

図１は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４（配列番号７１）のＳＰＲ分析を示す。

実施例３：雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ７０特異的アンキリン反復タンパク質の薬物動態分析
本発明のＣＤ７０特異的アンキリン反復ドメインが、治療剤の開発に有用となる適切な血清半減期をインビボで有し得るかどうかを決定するために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２５の薬物動態プロファイルを、マウスで分析する。そのために、ＤＡＲＰｉｎ構築物を上記のようにｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にサブクローニングし、発現させて、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（例えば配列番号８２）、続いて半減期延長のためのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合アンキリン反復ドメイン（例えば配列番号５３）、ペプチドリンカー（例えば配列番号６５）、及びＣ末端にＣＤ７０特異的結合ドメインの１つをコードする発現構築物を得る。

インビボ投与及び試料採取
上記のヒト血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメイン（配列番号５３）を用いてフォーマットされたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２５を、各アンキリン反復融合タンパク質について、６匹のマウスの尾静脈に単回静脈内ボーラス注射として投与する。目標用量レベルは、５ｍＬ／ｋｇの適用容量で１ｍｇ／ｋｇである。アンキリン反復融合タンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に配合する。

マウスを、等しい数の動物を有する２つの群に分割する。各マウスから４つの血清試料を採取する。薬物動態調査のための血液試料を、化合物投与の５分、４時間、２４時間、４８時間、７６時間、９６時間、及び１６８時間後に伏在静脈から採取する。血液を室温に維持して凝固させ、続いて遠心分離し、血清を採取する。

血清試料中のアンキリン反復タンパク質を測定するためのＥＬＩＳＡによる生物分析
１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ中１０ｎＭポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂ１８）を、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。１ウェル当たり３００μｌのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ）で５回洗浄した後、０．２５％カゼインを補充した３００μｌのＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ－Ｃ）を用いてＨｅｉｄｏｌｐｈ Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００振盪器（４５０ｒｐｍ）で室温（room temperature、ＲＴ）で１時間ウェルをブロックする。プレートを上記のように洗浄する。１００μｌのＰＢＳＴ－Ｃ中５ｎｍｏｌ／Ｌウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１－１－１抗体を添加し、プレートを軌道振盪（４５０ｒｐｍ）しながらＲＴ（２２℃）で１時間インキュベートする。プレートを上記のように洗浄する。

１００μｌの希釈した血清試料（１：５の希釈工程で１：２０～１：３１２５００）又はアンキリン反復タンパク質標準曲線試料（１：３の希釈工程で０及び５０～０．０００８ｎｍｏｌ／Ｌ）を、４５０ｒｐｍで振盪しながらＲＴで２時間適用する。プレートを上記のように洗浄する。

次いで、ウェルを１００μｌのマウス抗ＲＧＳ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ＩｇＧ（Ａｂ０６、ＰＢＳＴ－Ｃ中１：２０００）と共にインキュベートし、ＲＴ、４５０ｒｐｍで１時間インキュベートする。プレートを上記のように洗浄する。１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液を５分間使用してＥＬＩＳＡを発色させ、１００μｌの１ｍｏｌ／Ｌ Ｈ₂ＳＯ₄を添加することにより停止させる。４５０ｎｍでの吸光度と６２０ｎｍでの吸光度との差を計算する。試料は、２つの異なるプレートで、二連で測定する。

薬物動態分析
薬物動態データ分析を、Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａの一部としてＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムのバージョン７．０を使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓで行う。静脈内ボーラス注射を介して投与された動物の平均濃度－時間データに基づく薬物動態パラメータの計算を、ノンコンパートメント分析（ＮＣＡモデル２００－２０２、ＩＶボーラス、線形台形線形補間）を用いて行う。例えば、以下の薬物動態パラメータを計算する。
ＡＵＣｉｎｆ、ＡＵＣｌａｓｔ、ＡＵＣ＿％ｅｘｔｒａｐｏｌ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｃｌ＿ｐｒｅｄ、Ｖｓｓ＿ｐｒｅｄ、ｔ１／２。

最大血清濃度（Ｃｍａｘ）及びそれらの発生時間（Ｔｍａｘ）は、血清濃度－時間プロファイルから直接得られる。血清濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ）は、最後のサンプリング点（Ｔｌａｓｔ）までの線形台形公式及び終末相の単一指数関数的減少を仮定した無限大までの外挿によって決定する。無限大までの外挿は、Ｃｌａｓｔ／λｚを使用して実行され、ここで、λｚは、対数線形回帰によって推定された終末速度定数を示し、Ｃｌａｓｔは、終末対数線形回帰によってＴｌａｓｔで推定された濃度を示す。総血清クリアランス（Ｃｌ＿ｐｒｅｄ）及び見かけの終末相半減期は、以下のように計算される。Ｃｌ＿ｐｒｅｄ＝ｉ．ｖ．用量／ＡＵＣｉｎｆ及びｔ１／２＝ｌｎ２／λｚ。定常状態分布容積Ｖｓｓは、Ｖｓｓ＝ｉ．ｖ．用量・ＡＵＭＣｉｎｆ／（ＡＵＣｉｎｆ）２によって決定される。ＡＵＭＣｉｎｆは、ＡＵＣｉｎｆの計算について記載したのと同じ外挿手順を使用して、無限大まで外挿された薬物濃度－時間曲線の１次モーメント下の総面積を示す。ｎｍｏｌ／Ｌ用量で与えられた濃度に基づいてＰＫパラメータを計算するために、ｍｇ／ｋｇとして与えられた値を、アンキリン反復タンパク質の分子量を使用してｎｍｏｌ／ｋｇに変換する。表３は、上記のヒト血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメインを用いてフォーマットされた、本発明のアンキリン反復タンパク質であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２５のおよその予測半減期を示す。

結論として、本発明のＣＤ７０特異的アンキリン反復ドメインを、半減期延長部分、例えば血清アルブミン特異的結合ドメインなどと組み合わせることで、それらが治療剤の開発に有用となる適切な血清半減期をインビボで達成することができる。

実施例４：本発明のアンキリン反復タンパク質のＣＤ７０発現腫瘍細胞への結合の決定
本発明の結合タンパク質の、細胞の表面上に発現するＣＤ７０への結合を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）フローサイトメトリーによって分析した。この目的のために、ＣＤ７０発現腫瘍細胞（Ｍｏｌｍ－１３ Ｎ１）を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００，０００細胞で播種した。ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃９、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２４、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２５を、２０００ｎＭから開始して１：５の希釈比で滴定した。腫瘍細胞を、希釈したＤＡＲＰｉｎタンパク質で再懸濁し、４℃で６０分間インキュベートした。アッセイは、２％ウシ胎児血清を含み、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含まないＰＢＳ中で行った。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質特異的腫瘍細胞結合を、非標識一次抗ウサギＤＡＲＰｉｎ（登録商標）抗体（抗ウサギ１－１－１抗体、ＣｅＰｏｗｅｒ）を２μｇ／ｍｌで添加することによって検出した。続いて４℃で少なくとも３０分間のインキュベーション工程を行った。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識した二次ヤギ抗ウサギ抗体を２μｇ／ｍｌで添加した。同じインキュベーション条件を適用した。最後に、細胞を２回洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ固定緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に室温（ＲＴ）で１５分間再懸濁した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質標識腫瘍細胞の蛍光強度中央値（Median fluorescence intensity、ＭＦＩ）を、分析にＦｌｏｗＪｏソフトウェア、データプロットにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮＸＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって測定した。図２は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２５のＣＤ７０発現腫瘍細胞への結合曲線を示す。表４は、ＥＣ５０値で表した、４つの例示的なアンキリン反復タンパク質の、細胞上に発現するＣＤ７０への結合を定量化したものを示す。

結論として、本発明のＣＤ７０特異的結合タンパク質は、約５００ｎＭ以下のＥＣ５０で細胞の表面上に発現するＣＤ７０に結合する。

実施例５：標的特異的短期Ｔ細胞活性化アッセイを用いた、Ｔ細胞エンゲージャーフォーマットにおける本発明のＣＤ７０特異的アンキリン反復タンパク質の特異性及び効力の評価
上述の本発明の例示的なＣＤ７０特異的アンキリン反復タンパク質の特異性及び効力を、ＣＤ８＋Ｔ細胞上の活性化マーカーとしてＣＤ２５を測定するＦＡＣＳによるインビトロ短期Ｔ細胞活性化アッセイにおいて評価した。試験したタンパク質であるＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃９、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２４、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２５を、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーフォーマットで評価した。このようなＴ細胞エンゲージャータンパク質は、言及したＣＤ７０特異的アンキリン反復ドメインに加えてＣＤ３特異的結合ドメイン（配列番号５７）を含み、それぞれＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２８、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２９、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２６、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２７として示される。

したがって、１ウェル当たり１００，０００個の精製された汎エフェクターＴ細胞及び２０，０００個のＭｏｌｍ－１３標的細胞を、６００μＭヒト血清アルブミンの存在下で、３７℃で４８時間、選択されたＤＡＲＰｉｎタンパク質の段階希釈物と２連で共インキュベートした（Ｅ：Ｔ比５：１）。４８時間後、細胞を洗浄し、１：１，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：４００のマウス抗ヒトＣＤ８ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：１００のマウス抗ヒトＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８（３－ＰＬ－フィット）を用いてデータをプロットした。図３は、活性化マーカーＣＤ２５によって測定される、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２８、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２９、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２６、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２７によって誘発される短期Ｔ細胞活性化を示す。Ｔ細胞エンゲージャーフォーマットにおける試験した本発明のＣＤ７０特異的結合タンパク質の全ては、腫瘍細胞上に発現するＣＤ７０に結合し、Ｔ細胞を活性化することができた。

実施例６：標的特異的短期腫瘍細胞殺傷アッセイを用いた、Ｔ細胞エンゲージャーフォーマットにおける本発明のＣＤ７０特異的アンキリン反復タンパク質の特異性及び効力の評価
Ｔ細胞エンゲージャーフォーマットにおける、本発明のＣＤ７０特異的アンキリン反復タンパク質であるＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃９、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２４、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２５（すなわち、それぞれＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２８、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２９、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２６、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２７）の特異性及び効力はまた、ＬＤＨ放出を測定するインビトロ短期細胞毒性アッセイを使用して評価した。この目的のために、１ウェル当たり１００，０００個の精製された汎エフェクターＴ細胞及び２０，０００個のＭｏｌｍ－１３標的細胞を、６００μＭヒト血清アルブミンの存在下で、３７℃で４８時間、記載のＴ細胞エンゲージャータンパク質の段階希釈物と２連で共インキュベートした（Ｅ：Ｔ比５：１）。４８時間のインキュベーション後、細胞を遠心沈降し、各ウェルの１００μｌの上清を、製造業者のプロトコルに従ってＬＤＨ放出について分析した（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０分間のインキュベーション）。吸光度を、ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００Ｐｒｏリーダーによって４９２ｎｍ－６２０ｎｍで測定した。ＯＤ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してプロットした。

図４は、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２８、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２９、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２６、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２７によって誘発された腫瘍細胞殺傷を示す。Ｔ細胞エンゲージャーフォーマットにおける試験した本発明のＣＤ７０特異的結合タンパク質の全ては、腫瘍細胞上に発現するＣＤ７０に結合し、腫瘍細胞を殺傷するＴ細胞を活性化することができた。

実施例７：本発明のＣＤ７０特異的結合タンパク質が結合するＣＤ７０エピトープの決定
本発明のＣＤ７０特異的アンキリン反復タンパク質が結合するＣＤ７０エピトープを、ベンチマークの対照分子ＡＲＧＸ－１１０類似体（ＣＤ７０特異的抗体、Ｅｖｉｔｒｉａから購入）及び可溶性形態の天然ＣＤ７０結合受容体ＣＤ２７（ＣＤ２７－Ｆｃ、ＡＭＤ１２１８０７１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）に対する競合ＥＬＩＳＡを使用して調査した。

ヒトＣＤ７０への結合について、ＣＤ７０特異的結合タンパク質であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２とヒトＣＤ２７（ＣＤ７０の受容体）及び抗ＣＤ７０抗体であるＡＲＧＸ－１１０類似体との競合を、競合ＥＬＩＳＡによって評価した。第１の設定では、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２をマイクロプレート上に固定化した。ビオチン化標的（ＢｉｏｈＣＤ７０－Ｆｃ－三量体、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって提供された）及び競合分子の１つをおよそ２時間プレインキュベートした後、ビオチン化標的の固定化されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２への結合を、ペルオキシダーゼに共有結合したストレプトアビジンを介して直接測定した。第２及び第３の設定では、ＣＤ２７－Ｆｃ又はＡＲＧＸ－１１０類似体のいずれかをマイクロプレート上に固定化し、同様の競合ＥＬＩＳＡを行った。

簡潔に述べると、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルプレートを、１０ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＣＤ２７－Ｆｃ又は５ｎＭ ＡＲＧＸ－１１０類似体で一晩コーティングした。ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＰＢＳＴＣ（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．２５％カゼインを含有するＰＢＳ）を用いて４５０ｒｐｍで２時間１５分にわたってブロックした。一方、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２ １０００ｎＭ及び５００ｎＭ ＡＲＧＸ－１１０を、２０ｎＭのｂｉｏ．ｈＣＤ７０と１：１の比でＲＴで２時間プレインキュベートした。競合剤を含まないＢｉｏ．ｈＣＤ７０を陽性対照として含めた。次いで、プレインキュベートした試料を、コーティングしたＭａｘｉＳｏｒｐプレートに添加し、ＲＴ及び４５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、ストレプトアビジン－ＰＯＤ抗体（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１ ０８９ １５３ ００１）で標的を検出した。検出のために、新たに調製したＴＭＢ緩衝液（３０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ４．１、５％（ｖ／ｖ）ＴＭＢ溶液（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ製）及び０．１６％ Ｈ２Ｏ２）を添加し、反応を１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄で停止させた。Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、吸光度をＯＤ４５０で測定し、ＯＤ６２０に対して参照した。データは、緩衝液（ＰＢＳ）値を差し引くことによって分析した。分析にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用した。

ヒトＣＤ７０標的を５０倍モル過剰のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２（陽性競合対照）又は２５倍モル過剰のＡＲＧＸ－１１０類似抗体と共にプレインキュベートした場合、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２及びＡＲＧＸ－１１０類似体の両方が、プレートに固定化されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２のｈＣＤ７０標的への結合と効率的に競合することができ、それによって、プレートに固定化されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２のｈＣＤ７０への結合をベースラインレベルまで低下させた（図５Ａ）。同様に、ｈＣＤ７０標的への結合についての効率的な競合が、設定２及び３、すなわちプレートに固定化されたＣＤ２７（図５Ｂ）又はプレートに固定化されたＡＲＧＸ－１１０類似体（図５Ｃ）において観察された。

結論として、試験した全てのＣＤ７０結合分子（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＣＤ２７、及びＡＲＧＸ－１１０）は、ＣＤ７０への結合について互いに競合し、これらがＣＤ７０上の同じ又は重複するエピトープに結合し得ることを示した。

実施例８：ＰＢＭＣヒト化マウス及びＭＯＬＭ－１３腫瘍モデルにおけるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４を含む例示的なマルチドメインＴＣＥ結合タンパク質のインビボでの有効性評価
ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメイン、すなわち、それぞれ腫瘍関連抗原１（ＴＡＡ１）及び腫瘍関連抗原２（ＴＡＡ２）に対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメイン、並びにＣＤ３に対して結合特異性を有する１つのアンキリン反復ドメインを更に含むマルチドメインＴ細胞エンゲージャー結合タンパク質でフォーマットされたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４を、腫瘍細胞株ＭＯＬＭ－１３を有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ヒト化マウスモデルにおいて試験した。インビボ実験を、６～９週齢の雌免疫不全ＮＸＧマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓによって提供された）において実施した。マウスを、標準的な齧歯類マイクロアイソレーターケージ内の標準化環境条件下（２０±１℃の室温、５０±１０％の相対湿度及び１２時間の明暗サイクル）で維持した。マウスに、放射線照射食品及び床敷並びに０．２２ｕｍ濾過飲料水を与えた。全ての実験は、スイス動物保護法に従って州及び連邦の獣医学当局からの認可を受けて行った。

癌細胞の異種移植の２日前に、ｈＰＢＭＣ（２人の異なるドナーのバフィーコートから調製した５×１０⁶個のＰＢＭＣ）をマウスに腹腔内注射した。ＭＯＬＭ－１３細胞を、マウスの右側腹部の皮下に（ｓ．ｃ．）異種移植した。２人のｈＰＢＭＣドナーを使用した。処置は、癌細胞移植の４日後から静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。処置は以下のように施した：
マルチドメインＴＣＥフォーマットのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４又はビヒクルを、０．５ｍｇ／ｋｇで、２週間、週に３回ｉ．ｖ．投与した。

腫瘍サイズをキャリパー測定によって評価した。腫瘍体積は、以下の式を用いて計算した：腫瘍体積（ｍｍ³）＝０．５×長さ×幅²。

図６（Ａ～Ｂ）に見られるように、マルチドメインＴＣＥフォーマットのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４は、実験の全期間にわたって（図６Ａ）、及び最初の注射の１７日後に（図６Ｂ）、腫瘍増殖及び腫瘍体積の阻害に関して良好な有効性を示した。

実施例９：ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭＯＬＭ１３野生型及びＭＯＬＭ１３ ＣＲＩＳＰＲ ＣＤ７０ノックアウト（Ｋｎｏｃｋ－Ｏｕｔ、ＫＯ）標的細胞を用いた、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク＃２４を含む例示的なマルチドメインＴＣＥ結合タンパク質のインビトロでの有効性評価
ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメイン、すなわち、それぞれ腫瘍関連抗原１（ＴＡＡ１）及び腫瘍関連抗原２（ＴＡＡ２）に対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメイン、並びにＣＤ３に対して結合特異性を有する１つのアンキリン反復ドメインを更に含むマルチドメインＴ細胞エンゲージャー結合タンパク質でフォーマットされたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４を、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカーを測定するＦＡＣＳによるインビトロ短期Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験した。このアッセイでは、汎Ｔ細胞を標的細胞と共培養し、標的細胞は、（１）ＣＤ７０、ＴＡＡ１、及びＴＡＡ２の野生型標的発現を有するＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞、又は（２）ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）技術によってＣＤ７０（ＴＡＡ１及びＴＡＡ２ではなく）の発現が排除されたＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞のいずれかであった（図７）。

この目的のために、１ウェル当たり１００，０００個の精製された汎エフェクターＴ細胞及び２０，０００個の標的細胞を、２０μＭヒト血清アルブミンの存在下で、３７℃で４８時間、マルチドメインＴ細胞エンゲージャー結合タンパク質の段階希釈物と２連で共インキュベートした（Ｅ：Ｔ比５：１）。４８時間後、細胞を洗浄し、１：１，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：４００のマウス抗ヒトＣＤ８ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：１００のマウス抗ヒトＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８（３－ＰＬ－フィット）を用いてデータをプロットした。

結果は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４を含む例示的なマルチドメインＴ細胞エンゲージャー結合タンパク質が、野生型発現を有するＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞の存在下でＴ細胞を強力に活性化できたことを実証する（図７、曲線１；ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４ ＴＣＥについてのＥＣ５０値：５．７１ｐＭ）。結果は、Ｍｏｌｍ－１３腫瘍細胞におけるＣＤ７０の発現が排除された場合、Ｔ細胞の活性化が有意に低減されたことを更に実証する（図７、曲線２；ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４ ＴＣＥについてのＥＣ５０値：２０．７０ｐＭ）。これは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４が、例示的なマルチドメインＴ細胞エンゲージャー結合タンパク質の状態において機能的であり、標的細胞上のＣＤ７０に特異的に結合する能力によって多重特異性Ｔ細胞エンゲージャータンパク質の全体的な効力に有意に寄与したという証拠を提供する。

本明細書は、明細書内で引用された参考文献の教示に照らして最も十分に理解される。本明細書内の態様は、本発明の態様の例示を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の態様が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示で引用された全ての刊行物、特許、及びＧｅｎＢａｎｋ配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するか、又は一致しない場合には、本明細書が、任意のそのような資料に優先する。本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。

当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

配列

Claims (30)

1. アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、前記アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２４～４５及び７３～７７、並びに（２）配列番号２４～４５及び７３～７７のいずれかにおける最大９個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質。
2. アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有し、前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１～１２及び７１～７２のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質。
3. 前記アンキリン反復ドメインが、ＰＢＳ中で、約１５０ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_D）でヒトＣＤ７０と結合する、請求項１又は２に記載の組換え結合タンパク質。
4. 前記アンキリン反復ドメインが、約０．２～約５００ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でヒトＣＤ７０と結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
5. 免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する結合部分を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
6. 前記免疫細胞がＴ細胞であり、免疫細胞上に発現する前記標的がＣＤ３である、請求項５に記載の組換え結合タンパク質。
7. 免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する前記結合部分がアンキリン反復ドメインである、請求項５又は６に記載の組換え結合タンパク質。
8. 免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する前記結合部分が、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである、請求項５～７のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
9. 免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する前記結合部分が、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
10. ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の組換え結合タンパク質。
11. ヒトＣＤ７０に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインと、免疫細胞上に発現する標的に対して結合特異性を有する前記結合部分とが、ペプチドリンカーによって共有結合している、請求項５～１０のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
12. 前記ペプチドリンカーが、プロリン－トレオニンリッチペプチドリンカーである、請求項１１に記載の組換え結合タンパク質。
13. 前記ペプチドリンカーのアミノ酸配列が、１～５０アミノ酸の長さを有する、請求項１１又は１２に記載の組換え結合タンパク質。
14. 前記結合タンパク質が、半減期延長部分を更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
15. 前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである、請求項１４に記載の組換え結合タンパク質。
16. ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号５２～５４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組換え結合タンパク質。
17. ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号５２～５４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１５又は１６に記載の組換え結合タンパク質。
18. 前記結合タンパク質が、腫瘍細胞において発現する標的に対して結合特異性を有する少なくとも１つの結合部分を更に含み、腫瘍細胞において発現する前記標的がヒトＣＤ７０とは異なる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
19. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質をコードする、核酸。
20. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質又は請求項１９に記載の核酸と、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
21. ヒト患者の腫瘍組織における免疫細胞活性化の方法であって、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質、請求項１９に記載の核酸、又は請求項２０に記載の医薬組成物を前記患者に投与する工程を含む、方法。
22. 前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項２１に記載の方法。
23. 医学的状態を処置する方法であって、医学的状態の処置を必要とする患者に、治療有効量の請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質、請求項１９に記載の核酸、又は請求項２０に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
24. 前記医学的状態が癌である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記医学的状態が液性腫瘍を特徴とする癌である、請求項２３に記載の方法。
26. 前記医学的状態が白血病である、請求項２３に記載の方法。
27. 前記医学的状態が急性骨髄性白血病である、請求項２３に記載の方法。
28. 療法に使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質、請求項１９に記載の核酸、又は請求項２０に記載の医薬組成物。
29. 癌の処置に使用するための、任意選択で液性腫瘍を特徴とする癌の処置に使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質、請求項１９に記載の核酸、又は請求項２０に記載の医薬組成物。
30. 前記癌が白血病であり、任意選択で前記癌が急性骨髄性白血病である、請求項２９に記載の使用のための組換え結合タンパク質、又は核酸、又は医薬組成物。

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