JP2024508969A - 新規のＤＡＲＰｉｎに基づくＣＤ３３エンゲージャ - Google Patents

Abstract

本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、アンキリン反復ドメインがヒトＣＤ３３に対する結合特異性を有する、組換え結合タンパク質に関する。くわえて、本発明は、そのような組換え結合タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの疾患を治療又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月９日に出願された米国特許仮出願第６３／１５８，５３９号、２０２１年４月９日に出願された米国特許第６３／１７２，８１８号、及び２０２１年１２月９日に出願された米国特許出願第６３／２６５，１７９号に対して優先権の利益を主張するものである。これら特許出願の開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、ここで、アンキリン反復ドメインは、ヒトＣＤ３３に対する結合特異性を有する。くわえて、本発明は、そのような組換え結合タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌など、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、の疾患を治療又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、急速な細胞増殖、侵攻性の臨床経過、及び一般的に高い死亡率を特徴とする、不均一かつ複雑な悪性疾患である。治療抵抗性は、ＡＭＬ関連死の未だに主要な原因である（Ｗｉｎｅｒ及びＳｔｏｎｅ、「Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ」；２０１９年；１０巻）。化学療法を用いる標準プロトコルは、依然として世界的に適用される主要な治療アプローチであるが、免疫療法における最近の進歩は、化学療法抵抗性ＡＭＬに対して有効な治療選択肢を提供している。そのような免疫療法アプローチには、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、及びキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）が含まれる。

ＣＤ３３は、ＡＭＬ芽細胞及び白血病性幹細胞の約８０～９０％で発現されるので、ＣＤ３３は、癌、特にＡＭＬの治療のための魅力的な標的である（Ｅｈｎｉｎｇｅｒら、「Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ」、第４巻、第ｅ２１８、２０１４年）。ＣＤ３３はまた、ＡＭＬ治療の標的として臨床的に検証されており、ここで、抗ＣＤ３３抗体は、単剤療法として使用されるか、又は細胞傷害性剤とコンジュゲートされるかのいずれかである（Ｗｉｎｅｒ＆Ｓｔｏｎｅ、「Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ」；２０１９年；第１０巻）。しかしながら、これらの薬物は、有意な有害作用又は低い有効性のいずれかを示している。例えば、細胞傷害性剤カリチアマイシンにコンジュゲートしたヒト化抗ＣＤ３３モノクローナル抗体である、ゲムツズマブオゾガマイシンによる治療は、有意な血液学的及び肝毒性をもたらした。

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、リンパ系悪性腫瘍の管理に強く影響してきたアプローチである。この技術をＡＭＬにも適用することに大きな関心が寄せられているが、実際には、これは困難であることが証明されている。モノクローナル抗体に関して、ＣＤ３３は、ＡＭＬにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞療法のための最も有望な標的であると考えられている。しかしながら、このアプローチについての前臨床モデルは、非ＡＭＬ細胞に対して広範な副作用（オンターゲット／オフ腫瘍毒性）を示し、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、別の認識されている副作用である。

二重特異性抗体を用いた腫瘍細胞のＴ細胞指向性殺傷は、ＡＭＬを含む様々な癌型の治療に利用されている別の最近の治療ツールである。これらのＴ細胞エンゲージャ（ＴＣＥ）二重特異性抗体は、２つの異なる可変領域を含み、一方はＴ細胞受容体複合体サブユニットＣＤ３に結合し、他方は腫瘍細胞表面抗原に結合する。これらの２つの標的へのＴＣＥの結合は、細胞間の機能的接続を提供し、Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞に対して細胞傷害活性をもたらし、正常なＴＣＲ－ＭＨＣ相互作用を回避する（Ｅｌｌｅｒｍａｎ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ」；第１５４巻：第１０２～１１７頁（２０１９年））。ＡＭＧ３３０は、ＡＭＬ細胞に対してＴ細胞の細胞障害性を引き起こすことができる、ＣＤ３及びＣＤ３３に対して二重特異性抗体である。

しかしながら、多重特異性抗体療法及び二重特異性抗体療法の両方は、製造コストが高いことなどのいくつかの欠点を提示し、かつサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）（Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ－ Ｖｏｒｎｈａｇｅｎら、「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ」；第６巻（第１号）：第５６頁（２０１８年）；Ｌａｂｒｊｉｎら、「Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ」；第１８巻（第８号）：第５８５～６０８頁（２０１９年））、及び／又はオンターゲット／オフ腫瘍毒性（Ｗｅｉｎｅｒら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」；第５５巻（第２０号）：第４５８６～４５９３頁（１９９５年）；Ｗｅｉｎｅｒら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．」；第４２巻（第３号）；第１４１～１５０頁（１９９６年））などの特定の重篤な副作用を引き起こすリスクを抱えている。抗体ベースのＴ細胞エンゲージャは、天然のＴＣＲ－ＭＨＣ相互作用と比較して、ＣＤ３に対して１０００倍超高い親和性を示すことが多い（（Ｗｕら、「Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ」；第１８２巻：第１６１～７５頁（２０１８年）；国際公開第２０１４／１６７０２２号；Ｊｕｎｎｔｉｌａら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」；第１９巻：第５５６１～７１頁（２０１４年）；Ｙａｎｇら、「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ａｕｇ．」；第１５巻（第１３７号）：第１０９７～１００頁（１９８６年））。この高い親和性は、Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞殺傷の点でより低い効率と相関している（Ｂｏｒｔｏｌｅｔｔｏら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第３２巻；第１１号：３１０２～３１０７頁（２００２年）；Ｅｌｌｅｒｍａｎ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ」；第１５４巻：第１０２～１１７頁（２０１９年）；Ｍａｎｄｉｋｉａｎら、「Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．」；第１７巻（第４号）：第７７６頁、ＬＰ－７８５（２０１８年）；Ｖａｆａら、「Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」；第１０巻：第４４６頁（２０２０年））。更に、ＴＣＥによって標的化される腫瘍表面マーカのダウンレギュレーションは、ＴＣＥ治療に対して腫瘍の耐性をもたらし得る。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、上述したように、多くの点で癌療法の課題及び現在利用可能な癌療法の欠点を例示する癌の一種である。ＡＭＬについては、高い死亡率による医学的必要性が高いままであり、再発性又は難治性ＡＭＬの処置は、未だに治療が困難である。

したがって、有益な特性を有する新規のＣＤ３３特異的結合タンパク質が依然として必要とされている。そのような結合タンパク質は、ＡＭＬなどの癌を含む、疾患の治療及び特徴付けのための治療及び診断アプローチに有用であり得る。特に、癌細胞上のＣＤ３３を特異的に標的とするように機能することができ、かつ例えば１つ以上の結合部分などの他の官能性部分（functional moieties）と容易に組み合わせることもまたできる、新しいＣＤ３３特異的結合タンパク質が必要とされている。

本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、ここで、アンキリン反復ドメインは、ヒトＣＤ３３に対する結合特異性を有する。くわえて、本発明は、そのような組換え結合タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌など、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、の疾患を治療又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。

本発明の組換え結合タンパク質は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ＣＤ３３に特異的に結合するか、又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ＣＤ３３を標的とする。本発明のそのような結合タンパク質は、新しい治療剤又は診断剤を生成するためのツール又は構成要素として役立ち得る。本明細書中には、ＣＤ３３特異的アンキリン反復ドメインが１つの分子中の１つ以上他の官能性部分と組み合わされる、組換え結合タンパク質もまた開示される。そのような他の官能性部分には、免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する結合部分、半減期延長部分、別の腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する結合部分、及び／又は細胞傷害性剤が含まれる。したがって、ＣＤ３３に対する結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質は、現在の治療様式と比較して改善された毒性プロファイル及び／又は治療濃度域を提供し得る、新規治療分子の生成に有用である。

本明細書で提供される開示に基づいて、当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されることが意図される。

１．一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインは、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１、並びに（２）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１のいずれかにおける最大９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、アンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質に関する。

２．第２の実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

３．第３の実施形態では、本発明は、当該アンキリン反復ドメインが、ＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に、約１００ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_D）で、任意選択で約０．１ｎＭ～約１００ｎＭの間のＫ_Dで結合する、実施形態１又は２のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質に関する。

４．第４の実施形態では、本発明は、当該アンキリン反復ドメインが、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭの範囲にわたるＥＣ₅₀でヒトＣＤ３３に結合する、実施形態１～３のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質に関する。

５．第５の実施形態では、本発明は、免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する結合部分を更に含む、実施形態１～４のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質に関する。

６．第６の実施形態では、本発明は、当該免疫細胞がＴ細胞であり、免疫細胞上に発現される当該標的がＣＤ３である、実施形態５に記載の組換え結合タンパク質に関する。

７．第７の実施形態では、本発明は、免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する当該結合部分が、アンキリン反復ドメインである、実施形態５～６のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質に関する。

８．第８の実施形態では、本発明は、免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する当該結合部分が、ヒトＣＤ３に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである、実施形態５～７のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質に関する。

９．第９の実施形態では、本発明は、免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する当該結合部分が、ヒトＣＤ３に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、ヒトＣＤ３に対する結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つと少なくとも８５％アミノ酸配列同一性であるアミノ酸配列を含む、実施形態５～７のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１０．第１０の実施形態では、本発明は、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１１．第１１の実施形態では、本発明は、ヒトＣＤ３３に対する結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメイン、及び免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する当該結合部分が、ペプチドリンカーと共有結合している、実施形態５～１０のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１２．第１２の実施形態では、本発明は、当該ペプチドリンカーが、プロリン－トレオニンに富むペプチドリンカーである、実施形態１１に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１３．第１３の実施形態では、本発明は、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列が、１～５０個のアミノ酸の長さを有する、実施形態１１又は１２に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１４．第１４の実施形態では、本発明は、当該結合タンパク質が、半減期延長部分を更に含む、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１５．第１５の実施形態では、本発明は、当該半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである、実施形態１４に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１６．第１６の実施形態では、本発明は、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号５２～５４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１５に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１７．第１７の実施形態では、本発明は、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号５２～５４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１５及び１６に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１８．第１８の実施形態では、本発明は、当該結合タンパク質が、腫瘍細胞において発現される標的に対して結合特異性を有する少なくとも１つの結合部分を更に含み、腫瘍細胞において発現される当該標的が、ヒトＣＤ３３とは異なる、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質に関する。

１９．第１９の実施形態では、本発明は、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。

２０．第２０の実施形態では、本発明は、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質又は実施形態１９に記載の核酸、並びに薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む、医薬組成物に関する。

２１．第２１の実施形態では、本発明は、ヒト患者の腫瘍組織における免疫細胞活性化の方法であって、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質、実施形態１９に記載の核酸、又は実施形態２０に記載の医薬組成物を、当該患者へ投与する工程を含む、方法に関する。

２２．第２２の実施形態では、本発明は、当該免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態２１に記載の方法に関する。

２３．第２３の実施形態では、本発明は、医学的状態を治療する方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量の実施形態１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質、実施形態１９に記載の核酸、又は実施形態２０に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法に関する。

２４．第２４の実施形態では、本発明は、当該医学的状態が、癌である、実施形態２３に記載の方法に関する。

２５．第２５の実施形態では、本発明は、当該医学的状態が、液性腫瘍を特徴とする癌である、実施形態２３に記載の方法に関する。

２６．第２６の実施形態では、本発明は、当該医学的状態が、白血病である、実施形態２３に記載の方法に関する。

２７．第２７の実施形態では、本発明は、当該医学的状態が、急性骨髄性白血病である、実施形態２３に記載の方法に関する。

２８．第２８の実施形態では、本発明は、治療における使用のための、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質、実施形態１９の核酸、又は実施形態２０の医薬組成物に関する。

２９．第２９の実施形態では、本発明は、癌の治療に使用するための、任意選択では液性腫瘍を特徴とする癌の治療に使用するための、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質、実施形態１９に記載の核酸、又は実施形態２０に記載の医薬組成物に関する。

３０．第３０の実施形態では、本発明は、当該癌が、白血病であり、任意選択では当該癌が、急性骨髄性白血病である、実施形態２９に記載の使用のための組換え結合タンパク質又は医薬組成物に関する。

ヒトＣＤ３３に対するアンキリン反復タンパク質結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。図１Ａ．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９のＳＰＲ分析；図１Ｂ．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０のＳＰＲ分析。様々な濃度の精製されたアンキリン反復タンパク質を、オン速度及びオフ速度測定のために不動化したヒトＣＤ３３を有するＧＬＣチップに適用した。得られたＳＰＲトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質のＣＤ３３に対する結合を分析し、決定した。ＲＵ、共鳴単位；ｓ、時間（秒）。 ヒトＣＤ３３に対するアンキリン反復タンパク質結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。図１Ａ．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９のＳＰＲ分析；図１Ｂ．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０のＳＰＲ分析。様々な濃度の精製されたアンキリン反復タンパク質を、オン速度及びオフ速度測定のために不動化したヒトＣＤ３３を有するＧＬＣチップに適用した。得られたＳＰＲトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質のＣＤ３３に対する結合を分析し、決定した。ＲＵ、共鳴単位；ｓ、時間（秒）。 ＣＤ３３発現腫瘍細胞への本発明の例示的な結合タンパク質の結合。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０（全て単一ドメインフォーマット）の濃度依存性結合曲線を示す。 活性化マーカＣＤ２５によって決定される短期Ｔ細胞活性化である。汎Ｔエフェクター細胞及びＭｏｌｍ－１３標的細胞を、５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。選択されたアンキリン反復タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３３、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３２によって誘導される、Ｔ細胞活性化を示す。 ＬＤＨ放出を測定する細胞傷害性アッセイによって評価した腫瘍細胞殺傷。汎Ｔエフェクター細胞及びＭｏｌｍ－１３標的細胞を、５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３３、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３２によって引き起こされるＴ細胞による、腫瘍細胞殺傷を示す。 ＨＴＲＦによって決定された全長及び切断型ＣＤ３３標的へのＣＤ３３特異的アンキリン反復タンパク質の結合。試験した３つ全てのアンキリン反復タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、又はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４は、全長ＣＤ３３に結合するが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９のみが切断型ＣＤ３３に結合する。シグナルを百分率で示す（バックグラウンド補正し、各タンパク質について観察された最大ＨＴＲＦシグナルに対して正規化した）。Ａ．Ｕ．におけるＨＴＲＦシグナルを番号として示す。 結合競合ＥＬＩＳＡ。ビオチン化ヒトＣＤ３３標的を、競合物質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、又はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４）の有無にかかわらずプレインキュベートした。その後、結合標的を不動化ＡＭＧ３３０に対して試験した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１については、ＡＭＧ３３０との部分的競合が観察された。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４はＡＭＧ３３０との完全な競合を示すが、一方で、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９はＡＭＧ３３０との競合を示さない。 図７Ａ．ｈＰＢＭＣを腹腔内注射し、ｈＰＢＭＣ注射の２日後にＭＯＬＭ－１３腫瘍細胞を皮下異種移植し、かつ、ＰＢＳ １×（黒丸）又は０．５ｍｇ／ｋｇのマルチドメインフォーマットでのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９（黒四角）で処理した、マウス（ドナー当たりｎ＝５マウス／使用した２匹のｈＰＢＭＣドナー）における経時的な腫瘍増殖。腫瘍細胞異種移植の４日後に処置を開始した。データを平均＋ＳＥＭで表示する。図７Ｂ．図７Ａに記載されるマウスにおける腫瘍細胞異種移植の１７日後の腫瘍体積の評価。 図７Ａ．ｈＰＢＭＣを腹腔内注射し、ｈＰＢＭＣ注射の２日後にＭＯＬＭ－１３腫瘍細胞を皮下異種移植し、かつ、ＰＢＳ １×（黒丸）又は０．５ｍｇ／ｋｇのマルチドメインフォーマットでのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９（黒四角）で処理した、マウス（ドナー当たりｎ＝５マウス／使用した２匹のｈＰＢＭＣドナー）における経時的な腫瘍増殖。腫瘍細胞異種移植の４日後に処置を開始した。データを平均＋ＳＥＭで表示する。図７Ｂ．図７Ａに記載されるマウスにおける腫瘍細胞異種移植の１７日後の腫瘍体積の評価。 図８Ａ．野生型又はＣＤ３３ノックアウトＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞を用いたマルチドメインフォーマットのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図８Ｂ．野生型又はＣＤ３３ノックアウトＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞を用いたマルチドメインフォーマットのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。 図８Ａ．野生型又はＣＤ３３ノックアウトＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞を用いたマルチドメインフォーマットのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図８Ｂ．野生型又はＣＤ３３ノックアウトＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞を用いたマルチドメインフォーマットのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。

本明細書では、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質が開示され、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、ヒトＣＤ３３に対する結合特異性を有する。組換え結合タンパク質をコードする核酸、結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及び結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物を用いる方法もまた開示される。

アンキリン反復ドメイン
設計されたアンキリン反復モチーフ又はモジュールを含む、記載された組換え結合タンパク質又はその結合ドメインはまた、本明細書では、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質とも称される（Ｓｔｕｍｐｐら、「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．」第１０巻（第２号）：第１５３～９頁（２００７年）；及び、Ｂｉｎｚら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．」第２２巻（第５号）：第５７５～５８２頁（２００４年））。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、標的タンパク質に対して高い特異性及び高い結合親和性を有する抗体模倣体とみなすことができる。一般に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、少なくとも１つのアンキリン反復ドメインを含み、かつ２、３、４、５、又はそれ以上のアンキリン反復ドメインを含んでもよい。

本明細書に記載のアンキリン反復ドメインは、一般に、構造を提供するコア足場、及び標的に結合する標的結合残基を含む。構造コアは、保存されたアミノ酸残基を含み、標的結合表面は、標的に応じて異なるアミノ酸残基を含む。

設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー（国際公開第２００２／０２０５６５号、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，５７５－５８２，２００４；Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，１３，６９５－７０１，２００８）は、高い親和性でそれらの標的に結合する標的特異的設計アンキリン反復ドメインの選択に使用することができる。次に、そのような標的特異的設計アンキリン反復ドメインを、疾患を治療するための組換え結合タンパク質の価値ある成分として使用することができる。設計アンキリン反復タンパク質は、モノクローナル抗体の限界を克服する可能性を有する結合分子のクラスであり、したがって新規な治療的アプローチを可能にする。そのようなアンキリン反復タンパク質は、単一の設計アンキリン反復ドメインを含んでもよく、又は同じ若しくは異なる標的特異性を有する２つ以上の設計アンキリン反復ドメインの組合せを含んでもよい（Ｓｔｕｍｐｐら、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３，６９５－７０１，２００８；米国特許第９，４５８，２１１号）。単一の設計アンキリン反復ドメインのみを含むアンキリン反復タンパク質は、高い親和性及び特異性で所与の標的タンパク質に結合するように選択され得る小タンパク質（１４ｋＤａ）である。これらの特徴、及び１つのタンパク質中の２つ以上の設計アンキリン反復ドメインを組み合わせる可能性は、設計アンキリン反復タンパク質を、理想的なアゴニスト、拮抗薬及び／又は阻害薬候補にする。更に、そのようなアンキリン反復タンパク質は、様々なエフェクター機能、例えば細胞傷害性剤又は半減期延長剤を担持し、完全に新しい薬物フォーマットを可能にするように操作することができる。

設計されたアンキリン反復タンパク質はまた、モノクローナル抗体では容易にアクセスできないエピトープを標的とし得る。記載された設計されたアンキリン反復タンパク質の更なる利点は、それらが一般に低い免疫原性能を有し、オフターゲット効果がないか又はわずかである点である。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）候補はまた、迅速、低コスト、及び高収率の製造、並びに４℃で最長数年までの貯蔵寿命を含む、好ましい開発特性を示す。総合すると、設計されたアンキリン反復タンパク質は、既存の抗体薬物を超える可能性を有する次世代のタンパク質治療薬の一例である。

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ所有の商標である。

上記のように、ＣＤ３３は、特定の癌の治療、特にＡＭＬの治療のための魅力的な治療標的である。本明細書中に記載される組換え結合タンパク質は、ヒトＣＤ３３に特異的に結合するアンキリン反復ドメイン及びアンキリン反復モジュールを含む。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１、並びに（２）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１のいずれかにおける最大９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、アンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１、並びに（２）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１のいずれかにおける、最大９個まで、最大８個まで、最大７個まで、最大６個まで、最大５個まで、最大４個まで、最大３個まで、最大２個まで、又は最大１個までのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、アンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質に関する。

別の実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８のいずれか１つと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

更なる実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８のいずれか１つと、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号２と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号３と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号４と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号５と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号７と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号８と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号９と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１１と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１２と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１３と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１４と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１６と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号７７と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号７８と、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

更なる実施形態では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、当該アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質に関する。

更なる態様では、本発明は、免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する少なくとも１つの結合部分を更に含む、上記の組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、当該免疫細胞は、Ｔ細胞である。別の実施形態では、当該免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。本発明における使用のための免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する結合部分の例としては、抗体、代替足場、及びポリペプチドが挙げられる。

抗体は、抗体又は免疫グロブリン分子に由来する抗原結合ドメインを含む任意のポリペプチド又はタンパク質を含む。抗原結合ドメインは、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び例えば、ヒト又はラクダ科動物起源の可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来し得る。いくつかの例では、抗原結合ドメインが、結合部分が最終的に使用されるのと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおける使用のために、本明細書に記載の結合部分の抗原結合ドメインが、ヒト又はヒト化抗原結合ドメインを含むことは有益であり得る。抗体は、当該技術分野で周知の技術を用いて得ることができる。

一実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対する結合特異性を有する結合部分は、抗体である。

一実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対する結合特異性を有する結合部分は、ラクダ科ナノボディーである。ラクダ科ナノボディー（ラクダ科単一ドメイン抗体又はＶＨＨとしても知られる）は、ラマ、ラクダ、及びアルパカなどの哺乳動物のラクダ科に由来する。他の抗体とは異なり、ラクダ科抗体は軽鎖を欠き、２つの同一の重鎖から構成される。ラクダ科抗体は、典型的には、約１５ｋＤａの領域の比較的低い分子量を有する。

一実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対する結合特異性を有する結合部分は、サメ抗体ドメインである。ラクダ科ナノボディーと同様に、サメ抗体ドメインも軽鎖を欠いている。

抗原（薬物分子など）に結合することができ、抗体又は免疫グロブリン分子に由来しない結合ドメインを含む任意のポリペプチド又はタンパク質を、代替足場は含む。代替足場の結合ドメインは、様々な異なるポリペプチド又はタンパク質構造を含んでもよく、又はそれに由来してもよい。代替足場としては、アドネクチン（モノボディー）、アフィボディー、アフィリン、アフィマー及びアプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、アルマジロ反復タンパク質ベースの足場、アトリマー、アビマー、アンキリン反復タンパク質ベースの足場（例えば、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質）、フィノマー、ノッチン、及びクニッツドメインペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。代替足場は、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｃａｌｉｆ）．２０１７ Ｊｕｎｅ １２；１０（１）：２９３－３２０．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖａｎｃｈｅｍ－０６１５１６－０４５２０５に記載されている。

一実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対する結合特異性を有する結合部分は、代替足場である。一実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対する結合特異性を有する結合部分は、アドネクチン、モノボディー、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、反復タンパク質ドメイン、アルマジロ反復ドメイン、アトリマー、アビマー、アンキリン反復ドメイン、フィノマー、ノッチン、クニッツドメイン、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか又はこれらに関連する抗原結合ドメインを含む。

アドネクチンは、元々はヒトフィブロネクチンＩＩＩ型タンパク質（１０Ｆｎ３）の１０番目の細胞外ドメインに由来する。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、７又は８個のβ鎖を有し、これらは２つのβシートの間に分布しており、βシート自体が互いにパッキングしてタンパク質のコアを形成し、更にループ（ＣＤＲに類似）を含み、ループはベータ鎖を互いに接続し、溶媒が露出している。βシートサンドイッチの各縁部には少なくとも３つのそのようなループが存在し、縁部は、β鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６８１８４１８号を参照されたい）。この構造のために、この非抗体足場は、抗体の抗原結合特性の性質及び親和性に類似した抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、インビボでの抗体の親和性成熟のプロセスに類似するインビトロでのループ無作為化及びシャッフリング手法において使用することができる。

アフィボディー親和性リガンドは、細菌黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の表面タンパク質であるプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルから構成される。この足場ドメインは５８個のアミノ酸からなり、そのうちの１３個を無作為化して、多数のリガンドバリアントを有するアフィボディーライブラリーを作製する（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号を参照されたい）。アフィボディー分子は抗体を模倣しているが、抗体の場合の約１５０ｋＤａと比較して、約６ｋＤａの分子量を有し、かなり小さくなっている。サイズの違いにもかかわらず、アフィボディー分子の結合部位は抗体の結合部位と類似性を有する。

アフィリンは、構造的にヒトユビキチンに由来する（歴史的にはγ－Ｂクリスタリンにも由来する）合成抗体模倣物である。アフィリンは、主にβシート構造及び約２０ｋＤａの総分子量を有する２つの同一のドメインからなる。アフィリンは、修飾に好適ないくつかの表面露出したアミノ酸を含有する。アフィリンは、抗原に対する親和性及び特異性において抗体に似ているが、構造においては似ていない。

アフィマーは、ペプチドアプタマの一種であり、ＳＱＴ（Ｓｔｅｆｉｎ Ａ ｑｕａｄｒｕｐｌｅ ｍｕｔａｎｔ－Ｔｒａｃｙ）（ステフィンＡ四重変異体－トレイシー）として知られる構造を有する。アプタマー及びアフィマーは、結合ペプチドのＮ末端及びＣ末端両方が不活性な足場に埋め込まれた、構造上の制約のために不活性で剛性のあるタンパク質足場と親和的に結合する原因となる短いペプチドである。

アフィチンは、特異的結合親和性を得るように操作されたＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄのバリアントである。Ｓａｃ７ｄは、元々は超好熱菌古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓに由来し、ＤＮＡと結合してそれの熱変性を防止する。アフィチンは、商業的にはＮａｎｏｆｉｔｉｎとして知られている。

アルファボディーは、様々な抗原に結合するように操作された小さな（約１０ｋＤａ）タンパク質であり、したがって抗体模倣物である。アルファボディー足場は、コイルドコイル構造に基づいてコンピュータで設計される。標準的なアルファボディー足場は、高グリシン／セリンリンカーを介して連結された、各々４つのヘプタッド反復（７残基のストレッチ）から構成される３つのαヘリックスを含有する。標準的なヘプタッド配列は、「ＩＡＡＩＱＫＱ」である。細胞外及び細胞内タンパク質を標的とするアルファボディーの能力は、それらの高い結合親和性と組み合わせて、抗体では到達することができない標的にそれらが結合することを可能にし得る。

アンチカリンは、リポカリンに見出される強固で保存的なβバレル構造を有する結合タンパク質の群である。リポカリンは、シグナル伝達分子などの様々な生物学的分子の認識、貯蔵、及び輸送を担う１つのペプチド鎖（１５０～１９０アミノ酸）を含む細胞外タンパク質の一種である。

アルマジロ反復タンパク質ベースの足場は、真核生物において豊富であり、広範な生物学的プロセス、特に核輸送に関連するプロセスに関与する。アルマジロ反復タンパク質ベースの足場は、通常、３～５個の内部反復及び２個のキャッピングエレメントからなる。それらはまた、タンデム伸長スーパーヘリックス構造を有し、これは、延長された立体構造で対応するペプチドリガンドと結合することが可能である。

アトリマーは、テトラネクチンとして知られるトリマー血漿タンパク質に由来する足場であり、３つの同一の単位からなるＣ型レクチンのファミリーに属する。テトラネクチン内のＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）の構造は、標的化分子との相互作用を媒介する５つの柔軟なループを有する。

アビマーは、ＨＥＲ３などの天然のＡドメイン含有タンパク質に由来し、アミノ酸リンカーを介して連結された多数の異なる「Ａドメイン」モノマー（２～１０）からなる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７５７５６号、同第２００５／００５３９７３号、同第２００５／００４８５１２号、及び同第２００６／０００８８４４号に記載される方法論を使用して、標的抗原に結合することができるアビマーを作製することができる。

フィノマーは、ヒトＦｙｎチロシンキナーゼのＳｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）のアミノ酸８３～１４５から進化した小さな球状タンパク質（約７ｋＤａ）である。フィノマーは、その高い熱安定性、システインを含まない足場、及びヒト起源により、潜在的な免疫原性を低減する、魅力的な結合分子である。

システインノットミニタンパク質としても知られているノッチンは、典型的には、３つの逆平行βシートと、システインノットを作り出すジスルフィド結合によって縛られた拘束ループとを含む３０アミノ酸長のタンパク質である。このジスルフィド結合が高い熱安定性を与え、ノッチンを魅力的な抗体模倣物にしている。

クニッツドメインペプチド又はクニッツドメイン阻害剤は、構造フレームワークを不安定化することなく変異され得る３つのジスルフィド結合及び３つのループを有する約６０個のアミノ酸を含む不規則な二次構造を有するプロテアーゼ阻害剤の一種である。

一実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対する結合特異性を有する結合部分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する抗原結合ドメインを含むポリペプチド又はタンパク質である。

好ましい実施形態では、免疫細胞上に発現する標的に対する結合特異性を有する結合部分は、アンキリン反復ドメインである。

当該免疫細胞上に発現される標的の性質には、特に制限はない。一実施形態では、標的は、Ｔ細胞である免疫細胞上に発現され、当該免疫細胞上に発現される標的は、ＣＤ３である。

したがって、好ましい実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該第１のアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１、並びに（２）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１のいずれかにおける、最大９個まで、最大８個まで、最大７個まで、最大６個まで、最大５個まで、最大４個まで、最大３個まで、最大２個まで、又は最大１個までのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、ＣＤ３、より好ましくはヒトＣＤ３に対する結合特異性を有する、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換え結合タンパク質に関する。

別の実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該第１のアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１、並びに（２）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１のいずれかにおける、最大９個まで、最大８個まで、最大７個まで、最大６個まで、最大５個まで、最大４個まで、最大３個まで、最大２個まで、又は最大１個までのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換される配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、当該第２のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、当該第２のアンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つと、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換え結合タンパク質に関する。

更なる実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該第１のアンキリン反復ドメインが、配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、当該第２のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、当該第２のアンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つと、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換え結合タンパク質に関する。

別の実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該第１のアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１、並びに（２）配列番号２９～５１のいずれかにおける、最大９個まで、最大８個まで、最大７個まで、最大６個まで、最大５個まで、最大４個まで、最大３個まで、最大２個まで、又は最大１個までのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換される配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、当該第２のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３に対する結合特異性を有し、当該第２のアンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換え結合タンパク質に関する。

別の実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該第１のアンキリン反復ドメインが、配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、当該第２のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３に対する結合特異性を有し、当該第２のアンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換え結合タンパク質に関する。

好ましい実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該第１のアンキリン反復ドメインが、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８のいずれか１つと、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、当該第２のアンキリン反復ドメインが、ＣＤ３、より好ましくはヒトＣＤ３に対する結合特異性を有する、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換え結合タンパク質に関する。

別の実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該第１のアンキリン反復ドメインが、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８のいずれか１つと、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、当該第２のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、当該第２のアンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つと、少なくとも約８５％の配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該第１のアンキリン反復ドメインが、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、当該第２のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、当該第２のアンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つと、少なくとも約８５％の配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該第１のアンキリン反復ドメインが、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８のいずれか１つと、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、当該第２のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３に対する結合特異性を有し、当該第２のアンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換え結合タンパク質に関する。

更なる実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、当該第１のアンキリン反復ドメインが、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、当該第２のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３に対する結合特異性を有し、当該第２のアンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換え結合タンパク質に関する。

本発明は、更に、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有する、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、当該第２のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有し、当該組換え結合タンパク質が、配列番号１７～２８及び配列番号８２～８４のいずれか１つと、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％などのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換え結合タンパク質に関する。

一実施形態では、本発明は、（ｉ）第１のアンキリン反復ドメインであって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対する結合特異性を有する、第１のアンキリン反復ドメインと、（ｉｉ）第２のアンキリン反復ドメインであって、当該第２のアンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３に対する結合特異性を有し、当該組換え結合タンパク質が、配列番号１７～２８及び配列８２～８４のいずれか１つと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２のアンキリン反復ドメインと、を含む、組換え結合タンパク質に関する。

半減期延長部分
「半減期延長部分」は、半減期延長部分を有しない同じタンパク質と比較して、本明細書に記載の組換え結合タンパク質のインビボでの血清半減期を延長する。半減期延長部分の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え結合タンパク質は、本明細書では「血清アルブミン結合ドメイン」ともまた呼ばれる、血清アルブミン（好ましくは、ヒト血清アルブミンなど）に特異的に結合するアンキリン反復ドメインを含む。本明細書に記載の組換え結合タンパク質はまた、２つ以上の血清アルブミン結合ドメイン、例えば、２つ又は３つの血清アルブミン結合ドメインを含んでもよい。したがって、本明細書に記載の組換え結合タンパク質は、第１及び第２の血清アルブミン結合ドメイン、又は第１、第２、及び第３の血清アルブミン結合ドメインを含んでもよい。以下に提供される実施形態は、そのような第１の血清アルブミン結合ドメイン、第２の血清アルブミン結合ドメイン、及び／又は第３の血清アルブミン結合ドメインを記載する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の半減期延長部分は、結合部分のアンキリン反復ドメインが、配列番号５２～５４のいずれか１つと、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、血清アルブミン特異性アンキリン反復ドメインを含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の半減期延長部分は、配列番号５２～５４のいずれか１つと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本明細書に記載の半減期延長部分は、配列番号５３と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の半減期延長部分は、配列番号５３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは、本発明の組換え結合タンパク質のＮ末端に位置する。いくつかの実施形態では、２つ以上の血清アルブミン結合ドメインが好ましい。いくつかの実施形態では、２つの血清アルブミン結合ドメインは、本発明の組換え結合タンパク質のＮ末端に位置する。

いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンドメインは、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、既知の重鎖アイソタイプであるＩｇＧ（γ）、ＩｇＭ（μ）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＥ（ε）、又はＩｇＡ（α）のいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、既知の重鎖アイソタイプ又はサブタイプであるＩｇＧ₁（γ１）、ＩｇＧ₂（γ２）、ＩｇＧ₃（γ３）、ＩｇＧ₄（γ４）、ＩｇＡ₁（α１）、ＩｇＡ₂（α２）のいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ₁のＦｃドメインである。

いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの中断されていない天然配列（すなわち、野生型配列）を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、変化した生物学的活性をもたらす変異体Ｆｃドメインを含む。例えば、少なくとも１つの点変異又は欠失は、エフェクター活性を低減又は排除するために（例えば、国際特許公開第ＷＯ２００５／０６３８１５号）、及び／又は組換え結合タンパク質の生産中に均質性を増加させるために、Ｆｃドメインに導入されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ₁のＦｃドメインであり、以下のエフェクターヌル置換であるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ（Ｅｕ番号付け）の１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＣ末端位置（すなわち、Ｅｕ番号付けによるＫ４４７）に位置するリジンを含まない。リジンを含まないことは、組換え結合タンパク質の生産中に均質性を増加させ得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｃ末端位置（Ｋ４４７、Ｅｕ番号付け）に位置するリジンを含む。

腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する更なる結合部分
更なる態様では、本発明は、ＣＤ３３とは異なる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する結合特異性を有する少なくとも１つの結合部分を更に含む、上記の組換え結合タンパク質に関する。一実施形態では、ＣＤ３３とは異なる当該１つ以上のＴＡＡは、同じ癌に由来する細胞においてＣＤ３３と同時発現されるＴＡＡである。更なる実施形態では、ＣＤ３３とは異なる当該１つ以上のＴＡＡは、液性腫瘍を特徴とする癌において、ＣＤ３３と同時発現するＴＡＡである。好ましい実施形態では、ＣＤ３３とは異なる当該１つ以上のＴＡＡは、白血病においてＣＤ３３と同時発現されるＴＡＡ、例えば、ＡＭＬ癌細胞においてＣＤ３３と同時発現されるＴＡＡなどである。本発明における使用のための、ＣＤ３３とは異なる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する結合特異性を有する結合部分の例としては、抗体、代替足場、及びポリペプチドが挙げられる。ＡＭＬ癌細胞で発現されるＴＡＡを含む、多くのＴＡＡが当技術分野で公知である。

置換
いくつかの実施形態では、配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１の配列に対する本発明の組換え結合タンパク質の任意のアンキリン反復モジュールにおいて、９個以上はなく（no more 9）、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１の配列に対して、５個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１の配列に対して、４個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１の配列に対して、３個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１の配列に対して、２個以下の置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１の配列に対して、１個以下の置換が行われる。

いくつかの実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質の任意のアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列の１５％以下（no more 15%）、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、又は７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下が、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８の配列に対する置換によって改変されている。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の１０％以下（no more 10%）が、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８の配列に対する置換によって改変される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の８％以下（no more 8%）が、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８の配列に対する置換によって改変される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の６％以下（no more 6%）が、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８の配列に対する置換によって改変される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の４％以下（no more 4%）が、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８の配列に対する置換によって改変される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の２％以下（no more 2%）が、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８の配列に対する置換によって改変される。

いくつかの態様では、結合剤に対して行われるアミノ酸置換（複数可）は、非置換結合剤のＫ_D値と比較して、Ｋ_D値を約１０００倍超、約１００倍超、又は約１０倍超変化させない。例えば、いくつかの態様では、アミノ酸置換（複数可）は、配列番号１～１６、配列番号２９～５１、配列番号７７～８１の配列のいずれかを含む結合剤のＣＤ３３に対するＫ_D値と比較して、Ｋ_D値を約１０００倍超、約３００倍超、約１００倍超、約５０倍超、約２５倍超、約１０倍超、又は約５倍超変化させない。

特定の実施形態では、置換は、表１による保存的置換である。特定の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基の外側、例えば、アルファヘリックスを接続するベータループ内で行われる。

特定の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基内で行われる。他の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基の外側で行われる。例示としては、アンキリンドメインは、コンセンサス配列：ｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧｘｘｘｌＶｘＶＬＬｘｘＧＡＤＶＮＡ（配列番号６２）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸（好ましくはシステイン、グリシン、又はプロリンではない）を表し、又はｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡＡｘｘＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫｚＧＡＤＶＮＡ（配列番号６３）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸（好ましくはシステイン、グリシン、若しくはプロリンではない）を表し、「ｚ」は、アスパラギン、ヒスチジン、又はチロシンからなる群から選択される。一実施形態では、置換は、「ｘ」として指定される残基に対して行われる。別の実施形態では、置換は、「ｘ」として指定されない残基に対して行われる。

くわえて、本発明の組換え結合タンパク質の任意のアンキリン反復ドメインの最後から２番目の位置は、「Ａ」若しくは「Ｌ」であり得、かつ／又は最後の位置は、「Ａ」若しくは「Ｎ」であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、各アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１６、配列番号５２～５９、及び配列番号７７～７８うちのいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、任意選択的には、最後から２番目の位置のＡはＬで置換され、かつ／若しくは最後の位置のＡはＮで置換されており、又は任意選択的には、最後から２番目の位置のＬはＡで置換されており、かつ／若しくは最後の位置のＮはＡで置換されている。例示的な実施形態では、各アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１６、配列番号５２～５８、及び配列番号７７～７８のいずれかと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択的には、最後から２番目の位置のＡはＬで置換されており、かつ／又は最後の位置のＡはＮで置換されている。更に、本発明の結合タンパク質に含まれる任意のアンキリン反復ドメインの配列は、任意選択で、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを含んでもよい（以下を参照されたい）。

くわえて、本発明の組換え結合タンパク質に含まれる各アンキリン反復ドメインは、任意選択で、そのＮ末端に「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、各アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１６、配列番号５２～５９、及び配列番号７７～７８のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、更に、そのＮ末端にＧＳ（例えば、配列番号６４におけるように）を含むか、又はＧＳの代わりにＧ若しくはＳのみを含む。

結合親和性
特定の実施形態では、組換え結合タンパク質とその標的（すなわち、ヒトＣＤ３３）との間の親和性は、Ｋ_Dに関して記載されている。例示的な実施形態では、Ｋ_Dは、約１０^-1Ｍ以下、約１０^-2Ｍ以下、約１０^-3Ｍ以下、約１０^-4Ｍ以下、約１０^-5Ｍ以下、約１０^-6Ｍ以下、約１０^-7Ｍ以下、約１０^-8Ｍ以下、約１０^-9Ｍ以下、約１０^-10Ｍ以下、約１０^-11Ｍ以下、約１０^-12Ｍ以下、約１０^-13Ｍ以下、約１０^-14Ｍ以下、約１０^-5Ｍ～約１０^-15Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-15Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-15Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-15Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-15Ｍ、約１０^-10Ｍ～約１０^-15Ｍ、約１０^-5Ｍ～約１０^-14Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-14Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-14Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-14Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-14Ｍ、約１０^-10Ｍ～約１０^-14Ｍ、約１０^-5Ｍ～約１０^-13Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-13Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-13Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-13Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-13Ｍ、約１０^-10Ｍ～約１０^-13Ｍ、約１０^-5Ｍ～約１０^-12Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-12Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-12Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-12Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-12Ｍ、約１０^-10Ｍ～約１０^-12Ｍ、約１０^-5Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-10Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-5Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-5Ｍ～約１０^-9Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-9Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-9 Ｍ、又は約１０^-8Ｍ～約１０^-9Ｍである。

例示的な実施形態では、組換え結合タンパク質は、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約１０ｐＭ、又は約１ｐＭ以下のＫ_D値で、ヒトＣＤ３３に結合する。例示的な一実施形態では、組換え結合タンパク質は、１００ｎＭ以下のＫ_D値でＣＤ３３に結合する。別の例示的な実施形態では、組換え結合タンパク質は、１０ｎＭ以下のＫ_D値でＣＤ３３に結合する。

一態様では、組換え結合タンパク質は、約５０００、約４０００、約３０００、約２０００、約１０００、約９００、約７００、約５００、約４００、約３００、約２００、約１５０、約１００、約７０、約６０、約５０、約４０、約３０、約２０、約１５、約１０、約７、約５、約３、約１、約０．５、又は約０．１ｎＭ未満のＥＣ₅₀でヒトＣＤ３３に結合する。したがって、一態様では、当該結合タンパク質は、約５μＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約４μＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約３μＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約２μＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約１μＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約９００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約８００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約６００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する。別の態様では、当該結合タンパク質は、約７００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約５００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約４００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約３００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約２００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約１００ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約７０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約６０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約５０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約４０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約３０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約２０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約１５ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約１０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約７ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約５ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約３ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約１ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ３３に結合する；別の態様では、当該結合タンパク質は、約０．５ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ３３に結合する；更なる態様では、当該結合タンパク質は、約０．１ｎＭ未満のＥＣ₅₀でＣＤ３３に結合する。

追加的ポリペプチド
一態様では、本発明の組換え結合タンパク質は、ポリペプチドタグを更に含む。ポリペプチドタグは、ポリペプチド／タンパク質に結合されたアミノ酸配列であり、ここで、当該アミノ酸配列は、当該ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、若しくは標的化に有用であり、又は、当該アミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善し、又は、当該アミノ酸配列はエフェクター機能を有する。組換え結合タンパク質の個々のポリペプチドタグは、組換え結合タンパク質の他の部位に、直接又はペプチドリンカーを介して接続してもよい。ポリペプチドタグは技術分野で周知であり、当業者には十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小ポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、若しくはＳｔｒｅｐタグ、又は酵素（例えばアルカリホスファターゼ）等のポリペプチドであり、これらにより、当該ポリペプチド／タンパク質、又は標的化に使用できるポリペプチド（免疫グロブリン又はそれらのフラグメント等）及び／若しくはエフェクター分子として使用できるポリペプチドの検出が可能となる。

一態様では、本発明の組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカーを更に含む。ペプチドリンカーは、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非タンパク質化合物若しくはポリエチレングリコールなどのポリマー、又はタンパク質ドメインと生物学的活性分子、タンパク質ドメインとローカライザ、又は２つの配列タグを、結合させることができるアミノ酸配列である。ペプチドリンカーは、当業者に既知である。例の一覧は、特許出願公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号の明細書に提供されている。一態様では、本発明において使用するためのペプチドリンカーは、１～５０アミノ酸の長さを有する。別の態様では、本発明において使用するためのペプチドリンカーは、約５～約４０アミノ酸の長さを有する。別の態様では、本発明において使用するためのペプチドリンカーは、約１０～約３０アミノ酸の長さを有する。

ペプチドリンカーの具体例は、グリシン－セリン－リンカー及び可変長のプロリン－トレオニンに富むリンカーである。本発明の文脈において、プロリン－トレオニンに富むリンカーは、そのアミノ酸配列中に少なくとも約２０％のプロリン残基及び少なくとも約２０％のトレオニン残基を含む。グリシン－セリン－リンカーの例は、アミノ酸配列ＧＳ及び配列番号６７のアミノ酸配列であり、プロリン－トレオニンに富むリンカーの例は、配列番号６５及び６６のアミノ酸配列である。

Ｎ末端及びＣ末端キャッピング配列
本明細書に開示される組換え結合タンパク質のアンキリン反復ドメインは、Ｎ末端又はＣ末端キャッピング配列を含んでもよい。キャッピング配列は、アンキリン反復配列モチーフ（複数可）のＮ末端又はＣ末端に融合された追加のポリペプチド配列を指し、ここで、当該キャッピング配列は、アンキリン反復配列モチーフ（複数可）との厳密な三次相互作用（すなわち、三次構造相互作用）を形成し、それによって、側面のアンキリン反復ドメインの疎水性コアを、溶媒に曝露することから遮蔽するキャップを提供する。

Ｎ末端及び／又はＣ末端のキャッピング配列は、キャッピング単位、又は反復単位に隣接する天然に存在する反復タンパク質中に見出される他の構造単位に由来してもよい。キャッピング配列の例は、国際公開第２００２／０２０５６５号及び同第２０１２／０６９６５５号、米国特許出願公開第２０１３／０２９６２２１号、並びにＩｎｔｅｒｌａｎｄｉら、「Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．」２００８ Ｊａｎ １８；３７５（３）：８３７－５４に記載されている。Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュール（すなわち、Ｎ末端キャッピング反復）の例としては、配列番号６９～７２が挙げられ、アンキリンＣ末端キャッピングモジュール（すなわち、Ｃ末端キャッピング反復）の例としては、配列番号７３～７６が挙げられる。

核酸及び方法
別の態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。更に、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含むベクターに関する。核酸は、当業者に周知である。実施例において、核酸は、本発明の設計アンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質を、大腸菌で生産するために使用した。

組成物、使用及び治療方法
一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメイン、及び／又は本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメインをコードする核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。

一態様では、本発明は、組換え結合タンパク質、又は本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。

薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は当業者に既知であり、下記でより詳細に説明する。

医薬組成物は、本明細書に記載のような組換え結合タンパク質、及び／又は設計アンキリン反復ドメイン、及び／又は核酸、好ましくは、組換え結合タンパク質及び／又は核酸、並びに例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年）に記載のような、薬学的に許容される担体、賦形剤、若しくは安定剤を含む。

当業者に既知の、好適な担体、希釈剤、賦形剤又は安定剤としては、例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、５％デキストロース生理食塩水、等張性及び化学的安定性を高める物質、緩衝液並びに保存剤が挙げられる。他の好適な担体としては、それ自体が、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の生産を誘発しない任意の担体、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、及びアミノ酸コポリマーなどが挙げられる。医薬組成物はまた、抗癌剤若しくは抗血管新生剤、又は更なる生物活性化合物等の、追加の有効成分を含む、合剤であってもよい。インビボ投与に使用される組成物は、無菌でなくてはならない、又は、滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌濾過膜で濾過することにより、容易に実施される。

一態様では、医薬組成物は、本明細書に記載のような少なくとも１つの組換え結合タンパク質、並びに非イオン性洗剤などの洗剤、リン酸塩緩衝液などの緩衝液、及びスクロースなどの糖を含む。一態様では、そのような組成物は、上記のような組換え結合タンパク質及びＰＢＳを含む。

別の態様では、本発明は、ヒトを含む哺乳動物におけるＴ細胞の腫瘍局所的活性化の方法であって、当該哺乳動物に、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。

別の態様では、本発明は、医学的状態を処置するための方法であって、医学的状態を処置することを必要とする患者に、治療有効量の本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。

別の態様では、本発明は、医学的状態を治療するための方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量の、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む本発明の組換え結合タンパク質、当該組換え結合タンパク質をコードする核酸、又は当該結合タンパク質を含む医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。

一態様では、本発明は、疾患の治療において使用するための、本発明による医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸に関する。その目的のため、本発明による医薬組成物、核酸又は組換え結合タンパク質は、これらを必要とする患者に、治療有効量で投与される。投与としては、局所投与、経口投与、及び非経口投与を挙げることができる。典型的な投与経路は非経口投与である。親的（parental）投与において、本発明の医薬組成物は、上で定義したような薬学的に許容される賦形剤と共に、溶液、懸濁液、又はエマルションなどの単位用量の注射可能な形態で処方される。用量及び投与方法は、治療される個体及び疾患によって異なる。

更に、上述の医薬組成物、核酸又は組換えタンパク質のいずれかは、障害の治療における使用のためのものとみなされる。

一態様では、本明細書に記載の当該組換え結合タンパク質又はそのような他の医薬組成物は、静脈内投与される。非経口用途のため、組換え結合タンパク質又は当該医薬組成物は、ボーラス注入として又は緩徐な点滴注入により、治療有効量で注入することができる。

一態様では、本発明は、疾患の治療のための医薬品としての、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一態様では、本発明は、医薬品の製造のための、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一態様では、本発明は、疾患の治療のための医薬品を製造するための、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一態様では、本発明は、疾患の治療のための医薬品の製造のためのプロセスであって、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸分子、又は本発明の医薬組成物が、医薬品の有効成分である、プロセスに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を使用する、疾患の治療方法に関する。

一態様では、本発明は更に、それを必要とする対象の医学的状態を治療するためのそのような組換え結合タンパク質の使用を提供する。

本明細書で使用される場合、当該医学的状態又は疾患は、癌、好ましくは液性腫瘍、より好ましくは白血病、更により好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の使用はまた、当技術分野において既知の１つ以上の他の療法との併用とすることができる。用語「～との併用」は、本明細書で使用する場合、所与の投与計画の下で実施される共投与を指すものとする。これには、異なる化合物の同時投与及び異なる化合物の時間を変えた投与が含まれる（例えば、化合物Ａを１回投与し、かつ化合物Ｂをその後に数回投与する、若しくは逆もまた同様、又は、両化合物を同時に投与し、かつ２つのうちの１つを後の段階でまた投与する）。

一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質を含むキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質、及び／又は本発明の核酸、及び／又は本発明の医薬組成物を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明のＣＤ３３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８を含む組換えタンパク質、並びに／又はＣＤ３３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８を含む組換えタンパク質をコードする核酸、並びに／又はＣＤ３３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８を含む組換えタンパク質を含む医薬組成物を備える、キットに関する。一態様では、本発明は、配列番号１～５９及び配列番号７７～８１のアミノ酸配列のいずれか１つを含む組換えタンパク質、並びに／又は当該組換えタンパク質をコードする核酸、並びに／又は組換えタンパク質を含む医薬組成物を備える、キットに関する。

一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を産生するための方法に関する。一態様では、本発明は、組換え結合タンパク質、例えば、配列番号１～５９及び配列番号７７～８４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を生産するための方法であって、（ｉ）当該組換え結合タンパク質を好適な宿主細胞（例えば、細菌中）で発現させる工程と、（ｉｉ）当該組換え結合タンパク質を（例えば、クロマトグラフィーを使用して）精製する工程と、を含む、方法に関する。当該方法は追加の工程を含んでもよい。本発明の組換え結合タンパク質のこのような産生方法は、実施例１に記載される。

本発明は、実施例に記載の特定の態様に制限されない。本明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、添付の配列表に開示されている多くのアミノ酸配列、核酸配列、及び配列番号を参照する。

定義
本明細書で別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質並びに核酸化学の技術に関連して使用される命名法は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。

用語「含む（comprising）」、「有する」、「含む（including）」、及び「含有／収容する（containing）」は、特に明記しない限り、非限定的用語として解釈されるべきである。本発明の態様で、ある特徴について、「～を含む」と説明されている場合、態様では、その特徴について「～からなる」又は「～から本質的になる」も考えられる。本明細書で提供されるありとあらゆる例、又は例示を意味する文言（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をよりよく説明することを意図するものであり、別段の請求がない限り、本開示の範囲に制限を課さない。本明細書におけるいかなる文言も、特許請求されていない任意の要素を本開示の実施に不可欠なものとして示すものとして解釈されるべきではない。実施されている例以外、又は別段の指示がない限り、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語が当業者によって解釈されるように、その用語によって修飾されると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「約」は、特に明記しない限り、所与の数値の±１０％に相当する。

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲内に入る各別個の値及び各エンドポイントを個々に指す簡略法として役立つことを単に意図しており、各別個の値及びエンドポイントは、本明細書において個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。

本発明の文脈において、用語「タンパク質」とは、ポリペプチドを含む分子を指し、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内及び／又は複数のポリペプチド鎖間において二次、三次、又は四次構造を形成することによって、定義された三次元配列を有する、又は獲得することができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。二次及び／又は三次構造を形成することによって定義された三次元配列を個別に有する、又は獲得することができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。

組換えタンパク質及び組換えポリペプチドなどで使用される用語「組換え」とは、当該タンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術の使用によって産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって産生される）を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はインビトロ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば、大腸菌）に挿入すると、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされたポリペプチド（複数可）を生産することができる。それに応じて生産されたポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。

本発明の文脈において、用語「結合タンパク質」は、結合ドメインを含むタンパク質を指す。結合タンパク質はまた、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の結合ドメインを含んでもよい。好ましくは、この結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。本発明の結合タンパク質は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。

更に、任意のそのような結合タンパク質は、当業者に周知の追加のポリペプチド（例えば、ポリペプチドタグ、ペプチドリンカー、結合特異性を有する他のタンパク質ドメインへの融合、サイトカイン、ホルモン、又はアンタゴニストなど）、又は化学修飾（ポリエチレングリコール、毒素（例えば、免疫原からのＤＭ１）、小分子、抗生物質などへのカップリングなど）を含み得る。本発明の結合タンパク質は、ローカライザ分子を含んでもよい。

用語「結合ドメイン」は、標的に対して結合特異性を示すタンパク質ドメインを意味する。好ましくは、この結合ドメインは、組換え結合ドメインである。

本明細書で使用される場合、用語「標的」は、核酸分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然に存在する分子などの個々の分子を指し、そのような個々の分子の任意の一部を含むか、又はそのような分子の２つ以上の複合体、又は細胞全体若しくは組織試料、又は任意の非天然化合物を指す。好ましくは、標的はＣＤ３３である。より好ましくは、標的はヒトＣＤ３３である。

本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」はまた、システインのＳ－Ｓ架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も含む。ポリペプチドは、当業者に周知である。

特許出願公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号及びＦｏｒｒｅｒら、２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２～６）には、反復タンパク質の特徴及び反復ドメインの特徴、技術、及び用途の一般的な説明が含まれる。用語「反復タンパク質」とは、１つ以上の反復ドメインドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、反復タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの反復ドメインを含む。更に、当該反復タンパク質は、追加の非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ、及び／又はペプチドリンカーを含んでもよい。反復ドメインは、結合ドメインであり得る。

用語「反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、この反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールを更に含む。明確にするために、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。そのような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造的相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、ロイシンリッチ反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１（５），４９７～５０８，２００３）、及びアルマジロ反復ドメイン（国際公開第２００９／０４０３３８号）の実施例から、当業者に周知である。そのような反復ドメインが反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なることは、当業者には更に周知であり、反復されるアミノ酸配列は全て、個々のドメイン（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成することができる。

用語「アンキリン反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続するアンキリン反復モジュールを含む反復ドメインを指す。アンキリン反復ドメインは、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、任意選択で半減期延長ドメインと共に、より大きなアンキリン反復タンパク質にモジュール式に組み立てられてもよい（例えば、Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６，２００３、国際公開第２００２／０２０５６５号、国際公開第２０１６／１５６５９６号、国際公開第２０１８／０５４９７１号を参照されたい）。

設計された反復タンパク質、設計反復ドメインなどにおいて使用される用語「設計された」は、そのような反復タンパク質及び反復ドメインがそれぞれ人工的であり、自然界では生じないという特性を指す。本発明の結合タンパク質は、反復タンパク質を設計し、これらは少なくとも１つの設計アンキリン反復ドメインを含む。好ましくは、設計反復ドメインは、設計アンキリン反復ドメインである。

用語「標的相互作用残基」は、標的との直接的な相互作用に寄与する反復モジュールのアミノ酸残基を指す。

用語「フレームワーク残基」は、反復モジュールのアミノ酸残基を指し、これは、折り畳みトポロジーに寄与する、すなわち、当該反復モジュールの折り畳みに寄与するか、又は隣接モジュールとの相互作用に寄与する。そのような寄与は、反復モジュール内の他の残基との相互作用、又はα－ヘリックス若しくはβ－シートに見られるポリペプチド骨格構造への影響、又は直鎖ポリペプチド若しくはループを形成するアミノ酸ストレッチへの関与であってもよい。そのようなフレームワーク及び標的相互作用残基は、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ及び／若しくはＣＤ分光法などの物理化学法によって得られる構造データの分析によって、又は構造生物学及び／若しくはバイオインフォマティクスにおいて当業者に周知の既知の関連する構造情報と比較することによって同定され得る。

用語「反復モジュール」は、元々は天然に生じる反復タンパク質の反復単位に由来する、設計反復ドメインの反復されたアミノ酸配列及び構造単位を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質のファミリー又はサブファミリー、例えば、アンキリン反復タンパク質ファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。更に、反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、例えば、実施例１に記載されるように、標的上で選択された反復ドメインから得られ、同じ標的特異性を有する相同反復モジュールから推定される「反復配列モチーフ」を含み得る。

したがって、用語「アンキリン反復モジュール」は、元々天然に存在するアンキリン反復タンパク質の反復単位に由来する反復モジュールを指す。アンキリン反復タンパク質は、当業者に周知である。設計アンキリン反復タンパク質は、以前に記載されており、例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号、同第２０１０／０６０７４８号、同第２０１１／１３５０６７号、同第２０１２／０６９６５４号、同第２０１２／０６９６５５号、同第２０１４／００１４４２号、同第２０１４／１９１５７４号、同第２０１４／０８３２０８号、同第２０１６／１５６５９６号、及び同第２０１８／０５４９７１号を参照されたく、これらは全て、その全体が参照により組み込まれる。典型的には、アンキリン反復モジュールは、ループによって分離された２つのアルファヘリックスを形成する約３１～３３個のアミノ酸残基を含む。

反復モジュールは、標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されていないアミノ酸残基を有する位置（「非ランダム化位置」）及び標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されたアミノ酸残基を有する位置（「ランダム化位置」）を含み得る。非ランダム化された位置は、フレームワーク残基を含む。ランダム化された位置は、標的相互作用残基を含む。「ランダム化された」とは、例えば、反復モジュールのアミノ酸位置で２つ以上のアミノ酸が許可され、通常の２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許可された、若しくはシステイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などの、２０個の天然に存在するアミノ酸のほとんどが許可されたことを意味する。

用語「反復配列モチーフ」は、１つ以上の反復モジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、当該反復モジュールは、同じ標的に対して結合特異性を有する反復ドメインに由来する。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。当該フレームワーク残基位置は、反復モジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、当該標的相互作用残基位置は、反復モジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。反復配列モチーフは、非ランダム化位置及びランダム化位置を含む。

用語「反復単位」は、１つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、当該「反復単位」は複数のコピーに見出され、タンパク質のフォールディングを決定する全ての当該モチーフに共通の定義されたフォールディングトポロジーを示す。そのような反復単位の例としては、ロイシンに富む反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、及びロイシンに富むバリアント反復単位が挙げられる。

用語「標的に対して結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、「高い特異性で標的に結合する」、「標的に対して特異的な」又は「標的特異性」、又は「特異的に結合する」などは、結合タンパク質又は結合ドメインが、大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などの非関連タンパク質に結合するよりも、ＰＢＳ中で、標的に、より低い解離定数で結合する（すなわち、より高い親和性で結合する）ことを意味する。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での解離定数（「Ｋ_D」）は、ＭＢＰに対する対応する解離定数よりも、少なくとも１０²倍、より好ましくは少なくとも１０³倍、より好ましくは少なくとも１０⁴倍、又はより好ましくは少なくとも１０⁵倍低い。タンパク質－タンパク質間の相互作用の解離定数を測定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（例えば、ＳＰＲ平衡解析）又は等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、当業者に周知である。特定のタンパク質－タンパク質相互作用のＫ_Dの測定値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変動し得る。したがって、Ｋ_D値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及びＰＢＳ等の標準化緩衝液を使用して実施される。ＣＤ３３に対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（Ｋ_D）の、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析による典型的かつ好ましい決定は、実施例２に説明されている。様々なアッセイ形式を使用して、目的の薬物分子に特異的に結合する結合部分を選択又は特徴付けることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）及びウエスタンブロット分析は、標的薬物分子に特異的に結合する結合部分を同定するために使用され得る多くのアッセイの一部である。典型的には、特異的又は選択的結合は、少なくとも２倍のバックグラウンドシグナル又はノイズ、より典型的には１０倍超のバックグラウンドシグナルである。より具体的には、結合剤は、平衡解離定数（Ｋ_D）値が＜１μＭ、例えば、＜５００ｎＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜１００ｐＭ、又は＜１０ｐＭである場合、標的に「特異的に結合する」と言われる。

「結合剤」又は「結合部分」という用語は、標的分子に特異的に結合することができる任意の分子を指す。用語「結合剤」は、例えば、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプチド（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、「Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ」、第２６６巻：第５１８２～５１９０頁（１９９１年））、代替足場、抗体模擬体、反復タンパク質、例えば、設計アンキリン反復タンパク質、受容体タンパク質、及び標的分子のいずれかの他の天然に存在する相互作用パートナーを含み、天然タンパク質と、例えば、非天然残基を含むように、及び／又は天然残基を欠いているように修飾され若しくは遺伝子操作されたタンパク質とを含むことができる。

用語「ＰＢＳ」は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩及び２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４であるリン酸緩衝水溶液を意味する。

好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期は、哺乳動物、より好ましくはマウス及び／又はカニクイザル、より好ましくはカニクイザルで評価する。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をマウスで測定する場合、評価は、注入後最大４８時間までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、マウスにおける終末相半減期の評価は、２４時間～４８時間で計算される。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をカニクイザルで測定する場合、評価は、注射後最大７日目までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、カニクイザルにおける終末相半減期の評価は、１日目～５日目で計算する。当業者は、標的媒介クリアランスなどの効果を更に特定し、終末相半減期を計算する場合、それらを考慮することができる。本発明の組換え結合タンパク質などの薬物の用語「終末相半減期」とは、偽平衡に達した後、哺乳動物に適用した薬物の血漿中濃度の半分に達するのに必要な時間を指す（例えば、マウスでは２４時間～４８時間で計算し、又はカニクイザルでは１日目～５日目で計算する）。終末相半減期は、哺乳動物に投与された薬物の用量の半分を排泄するのに必要な時間とは定義されない。終末相半減期という用語は、当業者に周知である。好ましくは、薬物動態の比較は、任意の用量、より好ましくは同等の用量（すなわち、同一のｍｇ／ｋｇ用量）又は等モル用量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ用量）、より好ましくは等モル投与量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ用量）で行う。当業者であれば、動物での同等及び／又は等モルの投与は、少なくとも約２０％、より好ましくは約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％の実験的な投与量のばらつきを伴うことを理解する。好ましくは、薬物動態の測定に用いられる投与量は、約０．００１～約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．５～約１０ｍｇ／ｋｇから選択される。

「ＣＤ３」又は「分化クラスター３」という用語は、３つの対（εγ、εδ、ζζ）として集合する４つの異なるポリペプチド鎖、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びゼータ（ζ）から構成される多量体タンパク質複合体を指す。ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞受容体と非共有結合的に会合するＴ細胞共受容体として機能する。それは、任意の形態のＣＤ３、並びにＣＤ３の活性の少なくとも一部を保持するその変異体、アイソフォーム、及び種相同体を指し得る。したがって、本明細書に定義及び開示される結合タンパク質はまた、ヒト以外の種からＣＤ３に結合してもよい。他の場合では、結合タンパク質は、ヒトＣＤ３に完全に特異的であってもよく、種又は他のタイプの交差反応性を示さなくてもよい。ヒトＣＤ３に対する特定の参照によってなど異なる指示がない限り、ＣＤ３は、天然配列ＣＤ３、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシの全ての哺乳動物種を含む。ヒトＣＤ３ガンマ、デルタ及びゼータのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）参照配列、それぞれＮＰ＿００００６４．１、ＮＰ＿０００７２３．１、及びＮＰ＿９３２１７０．１に示されている。

本明細書で使用される用語「ＣＤ３発現細胞」は、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ Ｔ細胞）及びＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）などのＴ細胞を含むがこれらに限定されない、細胞表面上にＣＤ３（分化クラスター３）を発現するいずれかの細胞を指す。

「ＣＤ３３」という用語は、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３を指し、これは、細胞間相互作用を媒介し、免疫細胞を静止状態に維持する役割を果たすシアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）である。ヒトＣＤ３３（ｈＣＤ３３）のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）参考資料第Ｐ２０１３８号に示されている。

用語「Ｔ細胞の腫瘍限局性活性化」は、非腫瘍組織と比較して、Ｔ細胞が腫瘍組織において優先的に活性化されることを意味する。

更に、用語「ペプチド」とはまた、例えばグリコシル化によって修飾されたペプチドと、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質、４～６００アミノ酸長の長さの各々、例えばインスリン及び免疫グロブリンなどのジスルフィド結合によって架橋されたタンパク質と、を包含する。用語「化学的又は生化学的薬剤」とは、レシピエントに投与され得る任意の自然起源又は合成の化合物を含むことが意図される。好ましい態様では、ローカライザは、標的特異性アンキリン反復ドメインである。

「医学的状態」（又は障害又は疾患）という用語には、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症（特に増殖性網膜症）、神経変性障害、感染症、代謝性疾患、及び腫瘍性疾患が含まれる。本明細書に記載の組換え結合タンパク質のいずれかを、そのような障害、特に、腫瘍性疾患の治療のための薬剤の調製に使用することができる。「医学的状態」は、不適切な細胞増殖を特徴とするものである場合がある。医学的状態は、過剰増殖状態である場合がある。本発明は、特に、医学的状態を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、本発明の組換え結合タンパク質又は上記の医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む、治療方法に関する。好ましい態様では、当該医学的状態は、腫瘍性疾患である。用語「腫瘍性疾患」は、本明細書で使用する場合、急速に増殖する細胞増殖又は腫瘍を特徴とする、細胞又は組織の異常な状態（state or condition）を指す。一態様では、当該医学的状態は、悪性腫瘍性疾患である。一態様では、当該医学的状態は、癌、好ましくは白血病、より好ましくは急性骨髄性白血病である。用語「治療有効量」は、患者において所望の効果をもたらすのに十分な量を意味する。

用語「抗体」は、インタクトな抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の任意のフラグメント及び変異体も意味する。そのようなフラグメント及び変異体もまた、当技術分野において周知であり、インビトロ及びインビボの両方で常時使用されている。したがって、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、及び単鎖Ｖ領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、キメラ抗体、抗体融合ポリペプチド、及び非従来型抗体を包含する。

用語「癌」及び「癌性」は、本明細書では、典型的には、調節されていない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は記載するために使用される。癌は、固形腫瘍及び液性腫瘍、並びに原発性腫瘍及び転移性を包含する。「腫瘍」は、１つ以上の癌性細胞を含む。固形腫瘍は、典型的には、腫瘍間質も含む。癌の例としては、原発性及び転移性癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病、並びに任意の他の上皮及びリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。脳癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、明細胞腎臓癌、頭頸部扁平上皮癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、悪性黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、三重陰性乳癌、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、悪性中皮腫、結腸直腸癌、又は胃癌が挙げられる。

以下に開示の出発物質及び試薬は、当業者に既知であり、市販されている、及び／又は周知の技術を用いて調製することができる。

材料
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。誘導性大腸菌発現株は、例えば、大腸菌のＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）などのクローニング及びタンパク質生産に使用した。

分子生物学
特に明記しない限り、方法は、既知のプロトコルに従って実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．、及びＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。

設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第３３２巻第４８９～５０３頁、２００３年；Ｂｉｎｚら（２００４年）、上記引用に記載されている。このような方法により、ランダム化アンキリン反復モジュール及び／又はランダム化キャッピングモジュールを有する、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを構築することができる。例えば、そのようなライブラリーはしたがって、固定化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号６９、７０、又は７１のＮ末端キャッピングモジュール）、又はランダム化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号７２による）、及び固定化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号７３、７４、又は７５のＣ末端キャッピングモジュール）又はランダム化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号７６による）に基づいて組み立てられてもよい。好ましくは、そのようなライブラリーは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）及びＰのいずれも有することがないように組み立てられる。

更に、そのようなライブラリー内のそのようなランダム化されたモジュールは、ランダム化されたアミノ酸位置を有する追加のポリペプチドループ挿入を含んでもよい。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体又はデノボ生成ペプチドライブラリーの補体決定領域（ＣＤＲ）ループライブラリーである。例えば、そのようなループ挿入は、ガイダンスとして、ヒトリボヌクレアーゼＬのＮ末端アンキリン反復ドメインの構造を用いて設計することができた（Ｔａｎａｋａ，Ｎ．、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ、Ｋｕｓａｋａｂｅ，Ｙ、Ｇｏｔｏ，Ｙ．、Ｋｉｔａｄｅ，Ｙ、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｔ．，ＥＭＢＯ Ｊ．．２３（３０），３９２９－３９３８，２００４）。２つのアンキリン反復の境界近くに存在するβターンに１０個のアミノ酸が挿入される、このアンキリン反復ドメインと同様に、アンキリン反復タンパク質ライブラリーは、アンキリン反復ドメインの１つ以上のβターンに挿入された可変長（例えば、１～２０個のアミノ酸）のランダム化ループ（固定化及びランダム化位置を有する）を含有してもよい。アンキリン反復タンパク質ライブラリーのいずれかのそのようなＮ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＲＩＬＬＡＡモチーフ、ＲＩＬＬＫＡモチーフ、又はＲＥＬＬＫＡモチーフを有し（例えば、配列番号１の位置１９～２４に存在）、アンキリン反復タンパク質ライブラリーのいずれかのそのようなＣ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＫＬＮモチーフ、ＫＬＡモチーフ、又はＫＡＡモチーフを有する（例えば、配列番号１の最後の３つのアミノ酸に存在）。配列番号６９～７１は、ＲＩＬＬＡＡモチーフ、ＲＩＬＬＫＡモチーフ、又はＲＥＬＬＫＡモチーフを含むＮ末端キャッピングモジュールの例を提供し、配列番号７３～７５は、ＫＬＮモチーフ、ＫＬＡモチーフ、又はＫＡＡモチーフを含むＣ末端キャッピングモジュールの例を提供する。

そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーの設計は、標的と相互作用するアンキリン反復ドメインの既知の構造によって誘導され得る。タンパク質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ：ＰＤＢ）の独自の受託コード又は識別コード（ＰＤＢ－ＩＤ）によって識別される、そのような構造の例は、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ－３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０、及び２ＺＧＤである。

Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーなどの、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーの例が説明されている（米国特許第７，４１７，１３０号、Ｂｉｎｚら、２００３年、上記引用；Ｂｉｎｚら、２００４年、上記引用）。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃの数字は、Ｎ末端及びＣ末端のキャッピングモジュール間に存在するランダム化反復モジュールの数を説明している。

反復単位及びモジュール内の位置を定義するために使用される命名法は、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用に基づき、アンキリン反復モジュールとアンキリン反復単位との境界が、１アミノ酸位置シフトするという修飾を伴う。例えば、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置１は、本開示のアンキリン反復モジュールの位置２に対応し、結果として、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置３３は、本開示の以下のアンキリン反復モジュールの位置１に相当する。

実施例１：ＣＤ３３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「ＰＮＡＳ」第９４巻第４９３７～４２頁（１９９７年））を用いて、ヒトＣＤ３３（ｈＣＤ３３）（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ２０１３８）に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用による記載と同様のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択した。選択されたクローンの組換えヒトＣＤ３３標的（ＣＤ３３のＥＣＤの全長細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、及びＣＤ３３のＥＣＤのスプライス変異体）への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）によって評価され、数百のｈＣＤ３３特異的結合タンパク質が正常に選択されたことを示した。例えば、配列番号６１、３、５、７～９、及び１４～１６のアンキリン反復ドメインは、ｈＣＤ３３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。

リボソームディスプレイによるＣＤ３３特異性アンキリン反復タンパク質の選択
ｈＣＤ３３特異的アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒトＣＤ３３のビオチン化細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を標的タンパク質として、上記のようなアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコル（例えば、Ｚａｈｎｄ、Ｃ．、Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」第４巻第６９～７９頁、２００７年参照）を使用して、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）により行った。ＣＤ３３標的（Ｅｖｉｔｒｉａ）は、Ｃ末端Ｆｃタグ及びＡｖｉタグを含有し、酵素ＢｉｒＡ－ＧＳＴを使用してビオチン化した。ＣＤ３３の２つの異なる形態を、選択のために使用した。ＣＤ３３の可変ドメイン及び定常ドメインの両方を含有するＣＤ３３の全長ＥＣＤ（残基１８～２５９）（配列番号６０）、並びに定常ドメインのみを含有するＣＤ３３のＥＣＤのスプライス変異体（残基１４０～２５９）（配列番号６１）ＣＤ３３。計４ラウンドの標準的なリボソーム選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド１からラウンド４への選択圧力を増加させた（Ｂｉｎｚら、２００４年、上記引用）。ビオチン化非ＣＤ３３ Ｆｃドメインと併せてストレプトアビジン及びニュートラアビジンビーズを使用することによって、各ラウンドにおいて脱選択戦略を適用した。各選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する４５から２８に一定に減少させた。

高親和性ＣＤ３３特異性アンキリン反復タンパク質を富化するために、標準リボソームディスプレイ選択（上記）の第４ラウンドからの出力を、選択ストリンジェンシの増加を伴うオフ速度選択ラウンドに供した（Ｚａｈｎｄ（２００７年）上記引用）。最後の標準選択ラウンドを、オフレート選択ラウンドの後に実施して、オフレート選択された結合タンパク質を増幅及び回収した。これら最後の２つの選択ラウンドでは、ＲＴ－ＰＣＲサイクルの数はそれぞれ３０及び３５であった。

合計３つの異なる選択アプローチが、以下の差異を伴って、上記のように行われた。第１のアプローチでは、全長ＣＤ３３タンパク質のＥＣＤに対してのみ選択を行った。第２のアプローチでは、全長ＣＤ３３ ＥＣＤ及びスプライス変異体ＥＣＤの標的を各ラウンドで交互にした。第３のアプローチでは、ＨＩＭ－３－４ ＣＤ３３結合抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を添加することによって、第１のアプローチの条件を使用して競合溶出工程を適用した。各アプローチから、全長ＣＤ３３及び／又はそのスプライス変異体に対して結合剤を生成した。

選択されたクローンは、粗抽出物ＨＴＲＦによって示されるようにヒトＣＤ３３に特異的に結合する。
溶液中でｈＣＤ３３に特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準プロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイによって同定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、Ｃ末端ＣＤ３特異性アンキリン反復ドメイン、引き続いてＦｌａｇタグを含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクター（ｐＭＰＤＶ０４５）の誘導体にクローニングし、大腸菌のＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ－寒天（１％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有）上に播種し、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。１６０μｌの成長培地（１％グルコースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有するＴＢ）を含有する９６ウェルプレートに単一のコロニーを播種し（単一のウェル中に各クローン）、３７℃、８００ｒｐｍで振盪しながら、一晩インキュベートした。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する１５０μＬの新鮮なＴＢ培地に、新しい９６ウェルプレート中８．５μＬの一晩培養物を播種した。３７℃及び７００ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、４時間続けた。細胞を収集し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、８μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（９００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μＬのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。

各溶解したクローンの抽出物を、ＰＢＳＴＢ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４を補充したＰＢＳ）中で、６ｎＭ（最終濃度）ビオチン化ｈＣＤ３３（ＥＣＤ ＣＤ３３の全長又はスプライス変異体）、１：４００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：４００（最終濃度）の抗６Ｈｉｓ－Ｄ２抗体ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）と一緒に、１：１０００希釈（最終濃度）として３８４ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で６０分間インキュベートした。３４０ｎｍの励起波長及び６６５±１０ｎｍの発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００でＨＴＲＦを読み取った。そのような粗細胞抽出物ＨＴＲＦによる数百のクローンのスクリーニングは、ｈＣＤ３３に特異的なアンキリン反復ドメインを明らかにした。ｈＣＤ３３に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１、３、５、７～９、及び１４～１６で提供される。

これらのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、任意選択では、それらのＮ末端にＧ、Ｓ、又はＧＳ配列を追加的に含む。

ｈＣＤ３３に対して結合特異性を有する追加のアンキリン反復タンパク質の操作

配列番号２、４、６、及び１０～１３は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１（配列番号１）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３（配列番号３）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５（配列番号５）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（配列番号９）の配列にそれぞれ基づいて操作された、ｈＣＤ３３に対する結合特異性を有するアンキリン反復タンパク質である。

配列番号１及び配列番号３については、芳香族残基の数を減少させ、表面電荷を変化させるために配列を改変した。両方のＮ末端キャッピングモジュールにおいて、ＲＩＬＬＡＡモチーフをＲＩＬＬＫＡで置換し、アスパラギン酸（１８位）をロイシンで置換した。両方のＣ末端キャッピングモジュールにおいて、グルタミン酸（１８位）をグルタミン酸で置換した。配列番号３については、Ｎ末端キャッピングモジュールにおいて追加のフェニルアラニン（１４位）をバリンで置換した。配列番号１については、Ｎ末端キャッピングモジュールにおいて追加のトリプトファン（７位）をバリンで置換し、第２の内部反復（１８～２１位）におけるＥＤＩＡモチーフをＬＥＩＶで置換した。操作された変異体は、５：１の比で汎Ｔ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞を使用して４８時間インキュベートした後に標準的なＬＤＨ殺傷アッセイにおいて測定された２倍を超えて、親バージョンと比較して、Ｔ細胞殺傷（他のＴＡＡ及びＣＤ３結合アンキリン反復ドメインと組み合わせて評価された）を変化させなかった。

配列番号９については、芳香族残基の数を減少させ、表面電荷を変化させ、及び／又はフレームワークを最適化するために配列を改変した。全てのＮ末端キャッピングモジュールにおいて、ＲＩＬＬＡＡモチーフは、ＲＥＬＬＫＡによって置換された。３つの変異体では、Ｂｉｎｚら（２００４年）「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」に記載されているように標準的なアンキリン反復タンパク質フレームワークを得るために第２の内部反復中のバリン（１２位）を除去するか、若しくはＣ末端キャッピング反復中のグリシン（１８位）をグルタミン酸により置換するか、又は療法の組合せのいずれかを導入した。１つの変異体では、Ｎ末端キャッピングモジュール中のチロシン（７位）をバリンにより置換した。操作された変異体は、ＨＴＲＦによって測定される場合はｈＣＤ３３に対する結合を維持し、ＦＡＣＳによって測定される場合はＭＯＬＭ１３細胞に対する細胞結合を維持した。

配列番号５については、セリン（６位）は、Ｎ末端キャッピングモジュールにおいてグリシンに置き換えられた。操作された変異体は、５：１の比で汎Ｔ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞を使用して４８時間インキュベートした後に標準的なＬＤＨ殺傷アッセイにおいて測定された２倍を超えて、親バージョンと比較して、Ｔ細胞殺傷（ＣＤ３結合アンキリン反復ドメインと組み合わせて評価された）を変化させなかった。

ＣＤ３３特異性アンキリン反復タンパク質の発現
更なる分析のために、上記のように粗細胞抽出物ＨＴＲＦで特異的なヒトＣＤ３３結合を示す選択されたクローンを、容易な精製のためにそれらのＮ末端に融合されるＨｉｓタグ（配列番号８５）を用いて、大腸菌細胞で発現させた。発現したタンパク質を標準プロトコルに従って精製した。０．１１ｍｌの静置一晩培養物（ＴＢ、１％のグルコース、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン；３７℃）を使用して、９６ディープウェルプレートで０．９９ｍＬの培養物（ＴＢ、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３７℃）に接種した。３７℃（７００ｒｐｍ）で２時間インキュベートした後、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら（９００ｒｐｍ）３７℃で６時間インキュベートした。細胞を収集し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、ＤＮＡａｓｅ Ｉ（２００ユニット／ｍｌ）及びリゾチーム（０．４ｍｇ／ｍｌ）を補充した５０μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（９００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、６０μＬの低塩リン酸ナトリウム緩衝液を添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。合計で、８つの個々の発現をプールした後、遠心分離（３，２００ｇ、６０分間、４℃）によって細胞破片を除去した。ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて上清を濾過した後、９６ウェルＴｈｅｒｍｏ ＨｉｓＰｕｒコバルトスピンプレートを用いて精製し、９６ウェルＴｈｅｒｍｏ Ｚｅｂａスピン脱塩プレートを用いてＰＢＳ中でタンパク質溶液を再緩衝化した。精製されたタンパク質は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ＨＰＬＣシステム上で標準Ｓｅｐｈａｄｅｘ １５０／５カラムを使用して、ＰＢＳ中で可溶性及び単量体であった。

親和性成熟ＣＤ３３特異的結合タンパク質の生成
最初に同定されたＣＤ３３特異性結合タンパク質の更なる開発において、標的タンパク質に対して非常に高い親和性及び／又はそれからの非常に低いオフ速度を有する新たな変異体が、親和性成熟を用いて生成された。それにより、１つの最初に同定されたＣＤ３３特異性結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２（「親」結合タンパク質）を、親和性成熟のための好適な出発点として選択した。親和性成熟手順は、出発点として使用されるアンキリン反復ドメインの各無作為化位置の飽和変異誘発を伴った。親和性成熟手順によって生成された配列を、競合ＨＴＲＦによってより低いオフレートについてスクリーニングした。簡単に説明する。単一アミノ酸点突然変異変異体を、単一のＮＮＫ縮重コドンを有するプライマーを使用して親プラスミド（ｐＭＣＨＥ１１９０）上で標準的なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＰＣＲによって生成して、潜在的な結合位置に２０個全てのアミノ酸を導入した。Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号８５）を含有する、アンキリン反復タンパク質の粗抽出物（ＣＥ）を、ビオチン化標的と共にインキュベートした後、過剰の非ｆｌａｇタグ化親ＣＤ３３特異性結合タンパク質を添加し、ＨＴＲＦシグナルを経時的に測定した。親クローンよりも高いＨＴＲＦシグナルに基づいて同定された有益な変異を、タンパク質工学によって結合タンパク質において組み合わせた。このようにして、親和性成熟タンパク質＃２９及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０が、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２に由来して生成された。

次いで、このような親和性成熟ＣＤ３３特異的結合ドメインを、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にサブクローニングすることで、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号８５）をコードし、その後、配列番号７７又は７８のＣＤ３３特異的結合ドメイン、ペプチドリンカー（配列番号６５）、及び配列番号５７のＣ末端ＣＤ３結合ドメインをコードする発現構築物を得た。Ｔ細胞エンゲージャフォーマット中のこれらの構築物を大腸菌細胞中で発現させ、標準プロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。タンパク質を、エフェクター細胞（Ｅ）としての健常ドナーＰＢＭＣ、及び標的細胞（Ｔ）としてのＭｏｌｍ－１３－Ｎ１腫瘍細胞（５：１のＥ：Ｔ比）から単離された初代Ｔ細胞を使用して、用量依存的インビトロＴ細胞活性化及び腫瘍細胞殺傷アッセイについて試験した。４８時間の共培養物のアッセイインキュベーション並びにフローサイトメトリー及びＬＤＨ放出による分析。全ての構築物を大腸菌細胞中で発現させ、標準的なプロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。

実施例２：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有する組換えアンキリン反復タンパク質の解離定数（Ｋ_D）の決定
組換えヒトＣＤ３３標的上の精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。そのために、本発明のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、＃３、＃５、＃７～＃９、及び＃１４～＃１６をサブクローニングし、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体において上記のように発現させることで、Ｎ末端Ｈｉｓタグ及びＣＤ３３特異的アンキリン反復ドメイン、続いて、配列表に列挙される５つのＣＤ３特異的アンキリン反復ドメインのうち１つを含有する構築物を得た。

簡潔には、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用してＳＰＲ測定を行った。泳動用緩衝液は、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ）であった。ｂｉｏ．ｈＣＤ３３全長標的（配列番号６０）を、ＮＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上に５４０ＲＵのレベルまで固定化し、スプライシングされた変異体（配列番号６１）を５６０ＲＵのレベルまで固定化した。全長及びＣＤ３３ ＥＣＤのスプライシング型変異体へのＴＣＥフォーマットの９６ウェル精製ＣＤ３３特異的結合タンパク質の相互作用を、１００μＬ／分の一定流量を用いて、１２０秒の会合及び１２００秒の解離を有する、５０ｎＭの結合タンパク質を注入することによって測定した。２Ｍ ＭｇＣｌ₂を用いて個々の測定の間に標的を再生した。シグナルを、泳動用緩衝液（ＰＢＳＴ）処理された対照レーンに対して二重参照した。

表２ａは、ＴＣＥフォーマット（すなわち、ＣＤ３特異的アンキリン反復ドメインでフォーマット化）における、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、＃３、＃５、＃７～９、及び＃１４～１６について得られたＫ_D値を示す。解離定数（Ｋ_D）を、当業者に既知の標準的な手順を用いて、推定されたオンレート及びオフレートから算出した。選択されたアンキリン反復タンパク質とヒト切断及び全長ＣＤ３３との結合相互作用のＫ_D値を、０．４７～１７ｎＭの範囲ないであると単トレースＳＰＲによって決定した（表２ａ参照）。表２ａの値は複数の反復の平均である。

更に、組換えヒトＣＤ３３標的に対する２つの追加的な精製アンキリン反復タンパク質の結合親和性を、測定し、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃１、＃３、＃６、＃７～＃９、及び＃１４～＃１６について上記と同様の手順で分析した。簡単に説明すると、ｂｉｏ．ｈＣＤ３３を、ＮＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上に１１８０ＲＵのレベルまでコーティングした。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０を、１００ｕＬ／分の一定流量で、１２０秒の会合相及び１２００秒の解離相を有する、１００ｎＭの単一濃度で分析物として適用した。標的を４Ｍ ＭｇＣｌ２で再生した。シグナルを、Ｌ１及びＡ６の泳動用緩衝液（０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）を含有するＰＢＳＴ ＰＢＳ ｐＨ７．４）処理された対照レーンに対して二重参照した。１：１ラングミュアモデルをフィッティングに使用した。この研究で得られたＫ_D値を表２ｂに要約する。

表２ｂは、ｂｉｏ．ｈＣＤ３３全長標的に結合する、本発明のＣＤ３３特異的アンキリン反復タンパク質のＫ_D値を示す。Ｋ_D値を、当業者に既知の標準的な手順を用いて、推定されたオンレート及びオフレートから算出した。表２ｂの値は複数の反復の平均である。

図１（Ａ～Ｂ）は、ヒトＣＤ３３に対するアンキリン反復タンパク質結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を示す。図１ＡはＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９のＳＰＲ分析を示し、図１ＢはＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０のＳＰＲ分析を示す。
実施例３：雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ３３特異的アンキリン反復タンパク質の薬物動態解析
本発明のＣＤ３３特異性アンキリン反復ドメインが、治療剤の開発に有用であるためにインビボで適切な血清半減期を有し得るかどうかを決定するために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０の薬物動態プロファイルを、マウスで分析した。そのために、ＤＡＲＰｉｎ構築物は、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号８５）、半減期延長のためのＨＳＡ結合アンキリン反復ドメイン（配列番号５３）、ペプチドリンカー（配列番号６５など）、及びＣＤ３３特異的結合ドメインの１つをＣ末端でコードする、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体へと、上記のようにサブクローニングされ、発現される。例えば、以下のアンキリン反復タンパク質をコードする発現ベクターを構築する。

インビボ投与及び試料採取
上記のヒト血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメイン（配列番号５３）でフォーマットした、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０を、各アンキリン反復融合タンパク質について、６匹のマウスの尾静脈に単回静脈内ボーラス注射として投与した。目標用量レベルは、５ｍＬ／ｋｇの適用容量で１ｍｇ／ｋｇである。アンキリン反復融合タンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に配合する。

マウスを、等しい数の動物を有する２つの群に分割する。各マウスから４つの血清試料を採取する。薬物動態調査のための血液試料を、化合物投与後５分、４時間、２４時間、４８時間、７６時間、９６時間、及び１６８時間に採取する。血液を室温に維持して凝固させ、続いて遠心分離し、血清を採取する。

血清試料中のアンキリン反復タンパク質を測定するためのＥＬＩＳＡによる生物分析
ＰＢＳ中の１０ｎＭのポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂ１８）の１ウェル当たり１００μＬを、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングする。１ウェル当たり３００μＬのＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ）で５回洗浄した後、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００振盪器（４５０ｒｐｍ）で、０．２５％のカゼイン（ＰＢＳＴ－Ｃ）を補充した３００μｌのＰＢＳＴで、室温（ＲＴ）で１時間ウェルをブロックする。プレートを上記のように洗浄する。ＰＢＳＴ－Ｃ中の１００μＬの５ｎｍｏｌ／Ｌのウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ^{(登録商標)}１－１－１抗体を添加し、プレートを軌道振盪（４５０ｒｐｍ）しながら室温（２２℃）で１時間インキュベートする。上記のようにプレートを洗浄する。

希釈した血清試料（１：５の希釈工程で１：２０～１：３１２５００）又はアンキリン反復タンパク質標準曲線試料（１：３の希釈工程で０及び５０～０．０００８ｎｍｏｌ／Ｌ）の１００μＬを、４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で２時間適用する。プレートを上記のように洗浄する。

次いで、ウェルを１００μＬのマウス抗ＲＧＳ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ＩｇＧ（Ａｂ０６、ＰＢＳＴ－Ｃ中１：２０００）と共にインキュベートし、室温、４５０ｒｐｍで１時間インキュベートする。プレートを上記のように洗浄する。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液を５分間使用して、１ｍｏｌ／ＬのＨ₂ＳＯ₄を１００μＬ添加することによって停止させてＥＬＩＳＡを展開する。４５０ｎｍでの吸光度及び６２０ｎｍでの吸光度の差を算出する。試料は、２つの異なるプレートにて二連で測定する。

薬物動態解析
薬物動態データ分析を、Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａの一部としてＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムのバージョン７．０を使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓで行う。静脈内ボーラス注射を介して投与された動物の平均濃度－時間データに基づく薬物動態パラメータの算出を、ノンコンパートメント分析（ＮＣＡモデル２００－２０２、ＩＶボーラス、線形台形線形補間）を用いて行う。薬物動態パラメータは、以下のように算出される：
ＡＵＣｉｎｆ、ＡＵＣｌａｓｔ、ＡＵＣ＿％ｅｘｔｒａｐｏｌ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｃｌ＿ｐｒｅｄ、Ｖｓｓ＿ｐｒｅｄ、ｔ１／２。

最大血清濃度（Ｃｍａｘ）及びそれらの発生時間（Ｔｍａｘ）は、血清濃度－時間プロファイルから直接得られる。血清濃度－時間曲線の下の面積（ＡＵＣｉｎｆ）は、最後のサンプリング点（Ｔｌａｓｔ）までの線形台形公式及び終末相の単一指数関数的減少を仮定した無限大への外挿によって決定する。無限大までの外挿は、Ｃｌａｓｔ／λｚを使用して実行され、ここで、λｚは、対数線形回帰によって推定された最終速度定数を示し、Ｃｌａｓｔは、最終対数線形回帰によってＴｌａｓｔで推定された濃度を示す。総血清クリアランス（Ｃｌ＿ｐｒｅｄ）及び見かけの終末相半減期を以下のように算出する：Ｃｌ＿ｐｒｅｄ＝静脈内用量／ＡＵＣｉｎｆ及びｔ１／２＝ｌｎ２／λｚ。定常状態分布体積Ｖｓｓは、以下によって決定する：Ｖｓｓ＝ｉ．ｖ．投与量・ＡＵＭＣｉｎｆ／（ＡＵＣｉｎｆ）２。ＡＵＭＣｉｎｆは、ＡＵＣｉｎｆの計算について記載したのと同じ外挿手順を使用して、無限大に外挿された薬物濃度－時間曲線の第１の瞬間の総面積を示す。ｎｍｏｌ／Ｌの用量で与えられた濃度に基づいてＰＫパラメータを算出するために、ｍｇ／ｋｇとして与えられた投与量値をアンキリン反復タンパク質の分子量を使用してｎｍｏｌ／ｋｇに変換する。表３は、上記のようにヒト血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメインでフォーマット化された、本発明の３つのアンキリン反復タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０のおよその予測半減期を示す。

結論として、本発明のＣＤ３３特異的アンキリン反復ドメインは、半減期延長部分、例えば血清アルブミン特異的結合ドメインなどと組み合わせて、治療剤の開発に有用であるためにインビボで適切な血清半減期を達成することができる。

実施例４：ＣＤ３３発現腫瘍細胞への本発明のアンキリン反復タンパク質の結合の決定
細胞の表面上に発現されたＣＤ３３に対する本発明の結合タンパク質の結合を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）フローサイトメトリーによって分析した。この目的のために、ＣＤ３３発現腫瘍細胞（Ｍｏｌｍ－１３ Ｎ１）を、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００’０００細胞で播種した。単一特異性フォーマットのＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３０を、２０００ｎＭで開始して、１：５の希釈比で滴定した。腫瘍細胞を、希釈したＤＡＲＰｉｎタンパク質で再懸濁し、４℃で６０分間インキュベートした。アッセイは、２％ウシ胎児血清を含み、ヒト血清アルブミン２０μＭ（ＨＳＡ）を含まないＰＢＳ中で行った。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質特異性腫瘍細胞結合を、非標識一次抗ウサギＤＡＲＰｉｎ（登録商標）抗体（抗ウサギ１－１－１抗体、ＣｅＰｏｗｅｒ）を２μｇ／ｍＬで添加することによって検出した。続いて４℃で少なくとも３０分間のインキュベーション工程を行った。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識した２μｇ／ｍＬの抗ウサギ二次ヤギ抗体を添加した。同じインキュベーション条件を適用した。最後に、細胞を２回洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ固定緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に室温（ＲＴ）で１５分間再懸濁した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質標識腫瘍細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、分析用のＦｌｏｗＪｏソフトウェア、及びデータプロット用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を用いて、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって測定した（図２は、ＣＤ３３発現腫瘍細胞に対する、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質３０の結合曲線を示す）。表４は、それらのＥＣ５０値によって表される、細胞上に発現されたＣＤ３３に対する３つの例示的なアンキリン反復タンパク質の結合の定量化を示す。

結論として、本発明のＣＤ３３特異的結合タンパク質は、約２ｎＭ以下のＥＣ５０で細胞の表面上に発現されるＣＤ３３に結合する。

実施例５：標的特異的短期Ｔ細胞活性化アッセイによる、本発明のＣＤ３３特異的アンキリン反復タンパク質の特異性及び効力の評価。
本発明の上述の例示的なＣＤ３３特異性アンキリン反復タンパク質の特異性及び効力を、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカのＦＡＣＳ測定によるインビトロ短期Ｔ細胞活性化アッセイにおいて評価した。試験したタンパク質、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３０を、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャフォーマットで評価した。このようなＴ細胞エンゲージャタンパク質は、前述のＣＤ３３特異的アンキリン反復ドメインにくわえて、ＣＤ３特異的結合ドメイン（配列番号５７）を含み、それぞれ、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３３、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３１、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３２として示されている。

したがって、１ウェル当たり１００，０００個の精製された汎Ｔエフェクター細胞及び２０，０００個のＭｏｌｍ－１３標的細胞を、６００μＭヒト血清アルブミンの存在下、３７℃で４８時間、選択されたＤＡＲＰｉｎタンパク質の段階希釈物と２連で同時インキュベートした（Ｅ：Ｔ比５：１）。４８時間後、細胞を洗浄し、１：１，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１：４００マウス抗ヒトＣＤ８Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：１００マウス抗ヒト－ＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて、４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８（３－ＰＬ－フィット）を用いてデータをプロットした。図３は、活性化マーカＣＤ２５によって測定される、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３３、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３１、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３２によって引き起こされる短期Ｔ細胞活性化を示す。試験した本発明のＣＤ３３特異的結合タンパク質は全て、Ｔ細胞エンゲージャフォーマットで、腫瘍細胞上に発現したＣＤ７３３に結合し、Ｔ細胞を活性化することができた。

実施例６：標的特異的短期腫瘍細胞殺傷アッセイを用いた、Ｔ細胞エンゲージャフォーマットにおける本発明のＣＤ３３特異的アンキリン反復タンパク質の特異性及び効力の評価
Ｔ細胞エンゲージャフォーマット（すなわち、それぞれＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３３、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３１、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３２）における、本発明のＣＤ３３特異的アンキリン反復タンパク質、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３０の特異性及び効力もまた、ＬＤＨ放出を測定するインビトロ短期細胞傷害性アッセイを用いて評価した。この目的のために、１００，０００個の精製汎Ｔエフェクター細胞及び２０，０００個のＭｏｌｍ－１３標的細胞／ウェルを、６００μＭヒト血清アルブミンの存在下において、示されたＴ細胞エンゲージャタンパク質の段階希釈物と二連で、３７℃にて４８時間にわたり共インキュベートした（Ｅ：Ｔ比５：１）。４８時間のインキュベーション後、細胞をスピンダウンし、各ウェルの１００μＬの上清を、製造業者のプロトコル（ＬＤＨ検出キット；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、インキュベーション３０分間）に従ってＬＤＨ放出について分析した。吸光度を、ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００Ｐｒｏリーダーによって４９２ｎｍ～６２０ｎｍで測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してＯＤ値をプロットした。

図４は、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３３、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３１、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３２によって引き起こされる腫瘍細胞殺傷を示す。試験した本発明のＣＤ３３特異的結合タンパク質は全て、Ｔ細胞エンゲージャフォーマットで、腫瘍細胞上に発現したＣＤ３３に結合し、腫瘍細胞を次いで死滅させるＴ細胞を活性化することができた。

実施例７：本発明のＣＤ３３特異的結合タンパク質によって結合されるＣＤ３３エピトープの決定
本発明のＣＤ３３特異的アンキリン反復タンパク質によって結合されるＣＤ３３エピトープを、ＨＴＲＦ、及びベンチマーク対照分子ＡＭＧ３３０類似体に対する競合ＥＬＩＳＡを用いて調査した（Ｅｖｉｔｒｉａから購入したＣＤ３－ＣＤ３３特異的ＢｉＴＥ（登録商標））。

ヒトＣＤ３３（Ｅｖｉｔｒｉａから購入）への結合についての一価ＣＤ３３特異的結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４、並びにＡＭＧ３３０類似体の競合を、ＨＴＲＦ及び競合ＥＬＩＳＡによって評価した。

最初に、３つのＣＤ３３特異的結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４の粗抽出物を用いて、ＨＴＲＦによる全長（Ｖ／Ｃ２ドメイン）及び切断型ＣＤ３３（Ｃ２ドメイン）に対する結合実験を行った。Ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ及び抗Ｈｉｓ－Ｄ２ＨＴＲＦ試薬を用いて、ＣＤ３３標的への結合を検出した。簡単に記載すると、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４の粗抽出物を、ＰＢＳＴＢで１：２５０（最終的１：１０００）に希釈し、３８４ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、６００８２８０）へと添加した。次いで、ビオチン化標的＿ｈＣＤ３３－Ｆｃ（ｋｉｈ）－Ａｖｉ（全長ＣＤ３３；Ｅｖｉｔｒｉａより購入）及びｈＣＤ３３－Ｃ２－Ｆｃ（ｋｉｈ）－Ａｖｉ（切断型ＣＤ３３；Ｅｖｉｔｒｉａより購入）を、それぞれ８ｎＭ（最終６ｎＭ）まで希釈し、ＨＴＲＦ試薬Ｍａｂ Ａｎｔｉ－６Ｈｉｓ－ｄ２及びＳｔｒｅｐ－Ｔｂと混合し、両方とも１：２００希釈した（最終１：４００）。図５に示すように、３つ全てのＣＤ３３特異的結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４は、全長ＣＤ３３への結合を示すが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９のみが切断型ＣＤ３３標的に結合する。これらのデータは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９がＣ２ドメインに結合し、一方で、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９１及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４がＣＤ３３のＶドメインに結合することを示す。

次に、ＣＤ３３結合ベンチマーク分子ＡＭＧ３３０を同様に用いて競合ＥＬＩＳＡ実験を行った。Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら（２０１４年）によって示されるようにＶドメインの頂部に結合するＡＭＧ３３０類似体を、マイクロプレート上に不動化した。ビオチン化ＣＤ３３標的、並びに５０倍過剰のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４を、２時間プレインキュベートした後、ペルオキシダーゼに共有結合したストレプトアビジンを介してＡＭＧ３３０への結合を直接測定した。簡単に記載すると、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルプレートを、１０ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４、並びに５ｎＭのＡＭＧ３３０類似体により一晩コーティングした。ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＰＢＳＴＣ（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．２５％カゼインを含有するＰＢＳ）で、４５０ｒｐｍにて４時間１５分間にわたりブロッキングした。一方で、５００ｎＭの競合物質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４を、２０ｎＭのｂｉｏ．ｈＣＤ３３と、１：１の比で室温にて２時間にわたりプレインキュベートした。競合物質を含まないＢｉｏ．ｈＣＤ３３を陽性対照として含めた。次いで、プレインキュベートした試料をコーティングしたＭａｘｉＳｏｒｐプレートに添加し、室温及び４５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ストレプトアビジン－ＰＯＤ抗体（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号：１１ ０８９ １５３ ００１）で標的を検出した。検出のために、新たに調製したＴＭＢ緩衝液（３０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ４．１、５％（ｖ／ｖ）ＴＭＢ溶液（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ製）及び０．１６％Ｈ２Ｏ２）を添加し、反応を１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をＯＤ４５０で測定し、Ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いてＯＤ６２０について参照した。緩衝液（ＰＢＳ）値を差し引くことによってデータを分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを分析に使用した。

予想されるように、Ｃ２ドメイン結合ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９は、ＡＭＧ３３０と同様の競合的結合を示さない。Ｖドメイン結合分子ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１又はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４の両方について、競合により、それぞれ、ＥＬＩＳＡシグナルの完全又は部分的な阻害が得られた。したがって、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１はＶドメインに結合し、ＡＭＧ３３０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４との部分競合を示す。くわえて、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４はまた、Ｖドメインにも結合し、かつＡＭＧ３３０との結合について完全に競合するが、一方で、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９はＣ２ドメインに結合することで、ＣＤ３３へのＡＭＧ３３０の同時結合を可能にする（図６）

実施例８：ＰＢＭＣヒト化マウス及びＭＯＬＭ－１３腫瘍モデルにおける、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を含む例示的なマルチドメインＴＣＥ結合タンパク質のインビボ有効性評価
ヒト血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメイン、それぞれ腫瘍関連抗原１（ＴＡＡ１）及び腫瘍関連抗原２（ＴＡＡ２）に対する結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメイン、並びにＣＤ３に対する結合特異性を有する１つのアンキリン反復ドメインを追加的に含む、マルチドメインＴ細胞エンゲージャ結合タンパク質でフォーマットされたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を、腫瘍細胞株ＭＯＬＭ－１３を保有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ヒト化マウスモデルで試験した。インビボ実験を、６～９週齢の雌免疫不全ＮＸＧマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓによって提供された）において実施した。マウスを、標準的な齧歯類マイクロアイソレーターケージ（２０±１℃の室温、５０±１０％の相対湿度及び１２時間の明暗サイクル）内の標準化環境条件下で維持した。マウスに、放射線照射食品及び床敷並びに０．２２ｕｍ濾過飲料水を与えた。全ての実験は、スイス動物保護法に従って州及び連邦の獣医学当局からの認可を受けて行った。

マウスに、ＰＢＭＣ（２人の異なるドナーからのバフィーコートから調製した５×１０⁶個のＰＢＭＣ）を、癌細胞の異種移植の２日前に腹腔内注射した。ＭＯＬＭ－１３細胞を、マウスの右側腹部の皮下に（ｓ．ｃ．）異種移植した。２匹のｈＰＢＭＣドナーを使用した。処置は、癌細胞移植の４日後に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。処置は以下のように施した：
－マルチドメインＴＣＥフォーマットのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、又はビヒクルを、０．５ｍｇ／ｋｇで２週間にわたり、週に３回、ｉ．ｖ．投与した
腫瘍サイズをキャリパー測定によって評価した。腫瘍体積は、以下の式を用いて計算した：腫瘍体積（ｍｍ³）＝０．５×長さ×幅²。

図７（Ａ～Ｂ）に見られるように、マルチドメインＴＣＥフォーマットでのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９は、実験の全期間にわたって（図７Ａ）、及び最初の注射の１７日後に（図７Ｂ）、腫瘍増殖及び腫瘍体積の阻害に関して良好な有効性を示した。

実施例９：ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭＯＬＭ１３野生型及びＭＯＬＭ１３ ＣＲＩＳＰＲ ＣＤ３３ノックアウト（ＫＯ）標的細胞を用いた、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９又はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０を含む例示的なマルチドメインＴＣＥ結合タンパク質のインビトロ有効性評価
ヒト血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメイン、それぞれ腫瘍関連抗原１（ＴＡＡ１）及び腫瘍関連抗原２（ＴＡＡ２）に対する結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメイン、並びにＣＤ３に対する結合特異性を有する１つのアンキリン反復ドメインを追加的に含む、マルチドメインＴ細胞エンゲージャ結合タンパク質で各々フォーマットされたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０を、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカをＦＡＣＳで測定することによって、インビトロ短期Ｔ細胞活性化アッセイで試験した。このアッセイでは、汎Ｔ細胞を標的細胞と共培養し、これにより、標的細胞は、（１）ＣＤ３３、ＴＡＡ１、及びＴＡＡ２の野生型標的発現を有するＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞、又は（２）ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）技術によってＣＤ３３（ＴＡＡ１及びＴＡＡ２ではない）の発現が排除されたＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞のいずれかであった（図８Ａ及び図８Ｂ）。

この目的のために、１ウェル当たり１００，０００個の精製された汎Ｔエフェクター細胞及び２０，０００個の標的細胞を、２０μＭのヒト血清アルブミンの存在下で、３７℃で４８時間、それぞれのマルチドメインＴ細胞エンゲージャ結合タンパク質の段階希釈物と２連で同時インキュベートした（Ｅ：Ｔ比５：１）。４８時間後、細胞を洗浄し、１：１，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：４００マウス抗ヒトＣＤ８ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：１００マウス抗ヒト－ＣＤ ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８（３－ＰＬ－フィット）を用いてデータをプロットする。

結果は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９（図８Ａ）又はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０（図８Ｂ）のいずれかを含む例示的なマルチドメインＴ細胞エンゲージャ結合タンパク質の両方が、野生型発現を有するＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞の存在下においてＴ細胞を強力に活性化することができたことを実証している（曲線１；ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９ＴＣＥのＥＣ５０値：５．７１ｐＭ；ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０ ＴＣＥのＥＣ５０値：５．６０ｐＭ）。更に、結果はまた、Ｍｏｌｍ－１３腫瘍細胞におけるＣＤ３３の発現が排除された場合、Ｔ細胞の活性化が有意に減少したことも実証している（曲線２；ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９ ＴＣＥのＥＣ５０値：２７．３６ｐＭ；ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０ ＴＣＥのＥＣ５０値：４７．００ｐＭ）。これは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９（図８Ａ）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０（図８Ｂ）が、例示的なマルチドメインＴ細胞エンゲージャ結合タンパク質に関連して機能的であり、かつ標的細胞上のＣＤ３３に特異的に結合するそれらの能力のために、多重特異性Ｔ細胞エンゲージャタンパク質の全体的な効力に有意に寄与したという証拠を提供する。

本明細書は、明細書内で引用された参考文献の教示に照らして最も十分に理解される。本明細書内の態様は、本発明の態様の例示を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の態様が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示で引用された全ての刊行物、特許、及びＧｅｎＢａｎｋ配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するか、又は一致しない限り、本明細書は、任意のそのような資料に優先する。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。

当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

Claims (30)

1. アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、前記アンキリン反復ドメインが、（１）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１、並びに（２）配列番号２９～５１及び配列番号７９～８１のいずれかにおける最大９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、アンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質。
2. アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリン反復ドメインが、ヒトＣＤ３３に対して結合特異性を有し、前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１～１６及び配列番号７７～７８のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質。
3. 前記アンキリン反復ドメインが、ＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に、約１００ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_D）で、任意選択で約０．１ｎＭ～約１００ｎＭの間のＫ_Dで結合する、請求項１又は２のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
4. 前記アンキリン反復ドメインが、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭの範囲にわたるＥＣ₅₀でヒトＣＤ３３に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
5. 免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する結合部分を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
6. 前記免疫細胞がＴ細胞であり、免疫細胞上に発現される前記標的がＣＤ３である、請求項５に記載の組換え結合タンパク質。
7. 免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する前記結合部分が、アンキリン反復ドメインである、請求項５～６のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
8. 免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する前記結合部分が、ヒトＣＤ３に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである、請求項５～７のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
9. 免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する前記結合部分が、ヒトＣＤ３に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、ヒトＣＤ３に対する結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つと少なくとも８５％アミノ酸配列同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
10. ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号５５～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の組換え結合タンパク質。
11. ヒトＣＤ３３に対する結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメイン、及び免疫細胞上に発現される標的に対する結合特異性を有する前記結合部分が、ペプチドリンカーと共有結合している、請求項５～１０のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
12. 前記ペプチドリンカーが、プロリン－トレオニンに富むペプチドリンカーである、請求項１１に記載の組換え結合タンパク質。
13. 前記ペプチドリンカーのアミノ酸配列が、１～５０個のアミノ酸の長さを有する、請求項１１又は１２に記載の組換え結合タンパク質。
14. 前記結合タンパク質が、半減期延長部分を更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
15. 前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである、請求項１４に記載の組換え結合タンパク質。
16. ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号５２～５４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組換え結合タンパク質。
17. ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号５２～５４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１１及び１２に記載の組換え結合タンパク質。
18. 前記結合タンパク質が、腫瘍細胞において発現される標的に対して結合特異性を有する少なくとも１つの結合部分を更に含み、腫瘍細胞において発現される前記標的が、ヒトＣＤ３３とは異なる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質。
19. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質をコードする、核酸。
20. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質又は請求項１９に記載の核酸、並びに薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む、医薬組成物。
21. ヒト患者の腫瘍組織における免疫細胞活性化の方法であって、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質、請求項１９に記載の核酸、又は請求項２０に記載の医薬組成物を、前記患者へ投与する工程を含む、方法。
22. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項２１に記載の方法。
23. 医学的状態を治療する方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量の請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質、請求項１９に記載の核酸、又は請求項２０に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
24. 前記医学的状態が、癌である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記医学的状態が、液性腫瘍を特徴とする癌である、請求項２３に記載の方法。
26. 前記医学的状態が、白血病である、請求項２３に記載の方法。
27. 前記医学的状態が、急性骨髄性白血病である、請求項２３に記載の方法。
28. 治療に使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質、請求項１９に記載の核酸、又は請求項２０に記載の医薬組成物。
29. 癌の治療に使用するための、任意選択では液性腫瘍を特徴とする癌の治療に使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え結合タンパク質、請求項１９に記載の核酸、又は請求項２０に記載の医薬組成物。
30. 前記癌が、白血病であり、任意選択では前記癌が、急性骨髄性白血病である、請求項２９に記載の使用のための組換え結合タンパク質又は医薬組成物。

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