TW201936638A - 雙特異性異質二聚體雙功能抗體及彼等之用途 - Google Patents

雙特異性異質二聚體雙功能抗體及彼等之用途 Download PDF

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廖德米拉 奇斯特柯發
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Abstract

雙特異性異質二聚體雙功能抗體(diabody)分子及彼等於治療癌症之用途。該雙特異性異質二聚體雙功能抗體分子包含二個相聯結以形成二個表位結合位點的多肽鏈，該二個表位結合位點識別P-鈣黏蛋白(cadherin)腫瘤細胞相關抗原及CD3 T細胞抗原。

Description

雙特異性異質二聚體雙功能抗體及彼等之用途 [相關申請案]
本申請案主張2014年7月1日提交之美國臨時申請案第62/019,762號及2015年4月17日提交之美國臨時申請案第62/148,920號的利益，其全文以引用方式納入本文。
[序列表]
本申請案係經由EFS-Web以電子方式提交且包含以電子方式遞呈之.txt格式的序列表。該txt檔案含有2015年6月12日創建之標題為“PC72054A_Sequence_Listing.txt”的序列表且其大小為248KB。包含在此.txt檔案中之序列表為本專利此說明書之一部分，其全文以引用方式納入本文。
本發明關於雙特異性異質二聚體雙功能抗體(diabody)及彼等於治療癌症之用途。
現已研發各種策略來產生能夠招募T細胞以介導腫瘤細胞滅殺之雙特異性分子。然而，由於製造效率低且穩定性質差，大部分製造該等分子的努力受到限制。為了解決這些問題，現已研發基於共價連接、雙特異性異質二聚體雙功能抗體結構之由Fv衍生的策略，亦稱為雙親和性重新靶向(DART®)蛋白質(美國專利公開號第2007/0004909、2009/0060910和2010/0174053號)。
對於克服與產生雙特異性抗體相關之挑戰並提供高度特異性且有效的作用劑的雙特異性異質二聚體雙功能抗體仍然是有需要的，該高度特異性且有效的作用劑能與表現靶的抗原之腫瘤細胞結合並招募和透過活化CD3來活化T細胞，導致用於癌症之創新而有效的治療。
本發明提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該雙特異性異質二聚體雙功能抗體能夠特異結合至P-鈣黏蛋白(cadherin)之表位及結合至CD3之表位。
本發明提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該雙特異性異質二聚體雙功能抗體能夠特異性結合至P-鈣黏蛋白之表位和結合至CD3之表位，其中該雙特異性異質二聚體雙功能抗體包含第一多肽鏈和第二條多肽鏈，其中：a.該第一多肽鏈包含(從N端至C端之方向)：i.結構域1，其包含子結構域1A和子結構域1B，和ii.第一異質 二聚體-提升結構域；及b.該第二多肽鏈包含(從N端至C端之方向)：i.結構域2，其包含子結構域2A和子結構域2B，和ii.第二異質二聚體-提升結構域；且其中子結構域1A和子結構域2A形成P-鈣黏蛋白VL/VH結合結構域，此P-鈣黏蛋白VL/VH結合結構域包含抗P-鈣黏蛋白抗體之可變重鏈(VH)結構域(P-CAD VH)和抗P-鈣黏蛋白抗體之可變輕鏈(VL)結構域(P-CAD VL)，且子結構域1B和子結構域2B形成CD3 VL/VH結合結構域，此CD3 VL/VH結合結構域包含抗CD3抗體之VL結構域(CD3 VL)，和抗CD3抗體之VH結合結構域(CD3 VH)；或者其中子結構域1A和子結構域2A形成CD3 VL/VH結合結構域，此CD3 VL/VH結合結構域包含CD3 VL和CD3 VH且子結構域1B和子結構域2B形成P-鈣黏蛋白VL/VH結合結構域，此P-鈣黏蛋白VL/VH結合結構域包含P-CAD VH和P-CAD VL。
於本發明之另一態樣中，該子結構域1A包含P-CAD VL或CD3 VL，若該子結構域1A包含CD3 VL，則該子結構域1B包含P-CAD VH，或者若該子結構域1A包含P-CAD VL，則該子結構域1B包含CD3 VH；且其中根據所選擇之用於子結構域1A的VL結構域，該子結構域2B包含P-CAD VL或CD3 VL，若該子結構域2B包含CD3 VL，則該子結構域2A包含P-CAD VH，或者若該子結構域2B包含P-CAD VL，則該子結構域2A包含CD3 VH。
於本發明之一特殊態樣中，該子結構域1A包含P- CAD VL而該子結構域1B包含CD3 VH，且該子結構域2B包含CD3 VL而該子結構域2A包含P-CAD VH；且其中該子結構域1A之P-CAD VL和該子結構域2A之P-CAD VH形成能夠特異結合至P-鈣黏蛋白之表位的VL/VH結合結構域，而子結構域1B之CD3 VH和子結構域2B之CD3 VL形成能夠特異結合至CD3之表位的VL/VH結合結構域。
於一特殊態樣中，子結構域1A包含CD3 VL而子結構域1B包含P-CAD VH，且該子結構域2B包含P-CAD VL而該子結構域2A包含CD3 VH；其中該子結構域1A之CD3 VL和子結構域2A之CD3 VH形成能夠特異結合至CD3之表位的VL/VH結合結構域，而該子結構域1B之P-CAD VH和子結構域2B之P-CAD VL形成能夠特異結合至P-鈣黏蛋白之表位的VL/VH結合結構域。
於另一態樣中，該子結構域1A包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VH結合結構域(P-CAD VH)或抗CD3抗體之VH結合結構域(CD3 VH)，而若該子結構域1A包含CD3 VH，則該子結構域1B包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VL結合結構域(P-CAD VL)，或者若該子結構域1A包含P-CAD VH，則該子結構域1B包含抗CD3抗體(CD3 VL)；且其中根據所選擇之用於子結構域1A的VH結構域，該子結構域2B包含P-CAD VH或CD3 VH，若該子結構域2B包含CD3 VH，則該子結構域2A包含P-CAD VL，而若該子結構域2B包含P-CAD VH，則該子結構域2A包含CD3 VL。
於一特殊之態樣中，該子結構域1A包含P-CAD VH而子結構域1B包含CD3 VL，且該子結構域2B包含CD3 VH，而子結構域2A包含P-CAD VL；其中該子結構域1A之P-CAD VH和子結構域2A之P-CAD VL形成能夠特異結合至P-鈣黏蛋白之表位的VL/VH結合結構域，且該子結構域1B之CD3 VL和子結構域2B之CD3 VH形成能夠特異結合至CD3之表位的VL/VH結合結構域。
於一特殊之態樣中，該子結構域1A包含CD3 VH而子結構域1B包含P-CAD VL，且該子結構域2B包含P-CAD VH，而子結構域2A包含CD3 VL；其中該子結構域1A之CD3 VH和子結構域2A之CD3 VL形成能夠特異結合至CD3之表位的VL/VH結合結構域，且該子結構域1B之P-CAD VL和子結構域2B之P-CAD VH形成能夠特異結合至P-鈣黏蛋白之表位的VL/VH結合結構域。
本發明進一步提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該第一異質二聚體提升結構域和第二異質二聚體提升結構域包含含有CH2和CH3結構域之IgG Fc區，其中與野生型IgG Fc區相比較，該CH2結構域及/或CH3結構域之胺基酸序列包含至少一個胺基酸修飾以形成球形突起(knob)或孔(hole)。於一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域和第二異質二聚體提升結構域二者不同時為球形突起或不同時為孔；及/或其中該第一異質二聚體提升結構域和第二異質二聚體提升結構域形成IgG免疫球蛋白Fc區。於另一態樣中，該形成球形突起之IgG Fc區包含 SEQ ID NO：63之序列，而形成孔之IgG Fc區包含SEQ ID NO：64之序列。
本發明進一步提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該第一異質二聚體提升結構域和第二異質二聚體提升結構域包含E-卷(coil)區(此E-卷區包含麩胺酸和帶負電荷之α-螺旋卷)或K卷區(此K卷區包含賴胺酸和帶正電荷之螺旋卷)；且其中該第一異質二聚體提升結構域和第二異質二聚體提升結構域二者不同時為E-卷區或不同時為K-卷區。於一態樣中，該E-卷區包含SEQ ID NO：61之序列，及/或該K-卷區包含SEQ ID NO：62之序列。
本發明進一步提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該子結構域1A和子結構域1B可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)連接且不相聯結以形成VL/VH表位結合結構域，而該子結構域2B和子結構域2A可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)連接且不相聯結以形成VL/VH表位結合結構域。於本發明之一態樣中，該甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)包含SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69之序列。
本發明進一步提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該第一異質二聚體提升結構域包含在子結構域1B上之半胱胺酸連接子(連接子2)及/或該第二異質二聚體提升結構域包含在子結構域2A上之半胱胺酸連接子(連接子2)。於一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域及/或該第二異質二聚體提升結構域之連接子2進一步包含至少一個 甘胺酸殘基。於另一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域及/或該第二異質二聚體提升結構域之連接子2包含GFNRGEC(SEQ ID NO：70)、GVEPKSC(SEQ ID NO：71)、GGCGGG(SEQ ID NO：72)、GCPPCP(SEQ ID NO：73)、GGTGGCPPCP(SEQ ID NO：74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：75)或GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：76)之序列。於另一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域之連接子2包含GCPPCP(SEQ ID NO：73)、GGTGGCPPCP(SEQ ID NO：74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：75)或GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：76)之序列，且該第二異質二聚體提升結構域之連接子2包含GCPPCP(SEQ ID NO：73)、GGTGGCPPCP(SEQ ID NO：74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：75)或GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：76)之序列。於另一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域之連接子2包含GGCGGG(SEQ ID NO：72)之序列，而該第二異質二聚體提升結構域之連接子2包含GGCGGG(SEQID NO：72)之序列。於另一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域之連接子2包含GFNRGEC(SEQ ID NO：70)之序列，而該第二異質二聚體提升結構域之連接子2包含GVEPKSC(SEQ ID NO：71)之序列，或者該第一異質二聚體提升結構域之連接子2包含GVEPKSC(SEQ ID NO：71)之序列，而該第二異質二聚體提升結構域之連接子2包含 GFNRGEC(SEQ ID NO：70)之序列。
本發明提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該雙特異性異質二聚體雙功能抗體特異結合至人P-鈣黏蛋白之胞外結構域3(ECD3)。本發明進一步提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該雙特異性異質二聚體雙功能抗體特異結合至在P-鈣黏蛋白上之表位，但不結合至在E-鈣黏蛋白或VE-鈣黏蛋白上之表位。本發明亦提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該雙特異性異質二聚體雙功能抗體特異結合至在人P-鈣黏蛋白上之表位，但不結合至在小鼠P-鈣黏蛋白上之表位。
本發明提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該雙特異性異質二聚體雙功能抗體顯示出延長之血清和腫瘤半衰期。藥代動力學分析可藉由各種分析，諸如ELISA進行。本發明進一步提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該雙特異性異質二聚體雙功能抗體在P-鈣黏蛋白表現水準增加時或受體密度水準增加時顯示出較低之EC50。該EC50可藉由各種玻管內和活體內細胞毒性分析測定。
本發明提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其包含含有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23之序列的P-CAD VL之P-CAD VL CDR1、P-CAD VL CDR2及P-CAD VL CDR3；含有SEQ ID NO：45或46之序列的CD3 VH之CD3 VH CDR1、CD3 VH CDR2和CD3 VH CDR3；含有SEQ ID NO：47之序列的CD3 VL之CD3 VL CDR1、CD3 VL CDR2和CD3 VL CDR3；及/或含有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14,16、18、20、22或24之序列的P-CAD VH之P-CAD VH CDR1、P-CAD VH CDR2及P-CAD VH CDR3。
本發明提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其包含下列群組：含有SEQ ID NO：35或36之序列的P-CAD VL CDR1、含有SEQ ID NO：37或38之序列的P-CAD VL CDR2及含有SEQ ID NO：39、40、41、42、43或44之序列的P-CAD VL CDR3；含有SEQ ID NO：48之序列的CD3 VH CDR1、含有SEQ ID NO：49或50之序列的CD3 VH CDR2及含有SEQ ID NO：51之序列的CD3 VH CDR3；含有SEQ ID NO：55之序列的CD3 VL CDR1、含有SEQ ID NO：56之序列的CD3 VL CDR2及含有SEQ ID NO：57之序列的CD3 VL CDR3；及/或含有SEQ ID NO：25或33之序列的P-CAD VH CDR1、含有SEQ ID NO：26或34之序列的P-CAD VH CDR2及含有SEQ ID NO：27、28、29、30、31或32之序列的P-CAD VH CDR3。
於本發明之一態樣中，該P-CAD VL CDR1包含SEQ ID NO：35之序列，該P-CAD VL CDR2包含SEQ ID NO：37之序列，該P-CAD VL CDR3包含SEQ ID NO：41之序列，該P-CAD VH CDR1包含SEQ ID NO：25之序列，該P-CAD VH CDR2包含SEQ ID NO：26之序列，且該P-CAD VH CDR3包含SEQ ID NO：28之序列。於另 一態樣中，該P-CAD VL CDR1包含SEQ ID NO：35之序列；該P-CAD VL CDR2包含SEQ ID NO：37之序列；且該P-CAD VL CDR3包含SEQ ID NO：42之序列，該P-CAD VH CDR1包含SEQ ID NO：25之序列，該P-CAD VH CDR2包含SEQ ID NO：26之序列，且該P-CAD VH CDR3包含SEQ ID NO：29之序列。於另一態樣中，該P-CAD VL CDR1包含SEQ ID NO：35之序列；該P-CAD VL CDR2包含SEQ ID NO：37之序列，該P-CAD VL CDR3包含SEQ ID NO：43之序列，該P-CAD VH CDR1包含SEQ ID NO：25之序列，該P-CAD VH CDR2包含SEQ ID NO：26之序列，且該P-CAD VH CDR3包含SEQ ID NO：30之序列。於另一態樣中，該P-CAD VL CDR1包含SEQ ID NO：35之序列；該P-CAD VL CDR2包含SEQ ID NO：37之序列，該P-CAD VL CDR3包含SEQ ID NO：39之序列，該P-CAD VH CDR1包含SEQ ID NO：25之序列，該P-CAD VH CDR2包含SEQ ID NO：26之序列，且該P-CAD VH CDR3包含SEQ ID NO：31之序列。
本發明進一步提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其包含：P-CAD VL，其包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23之序列；CD3 VH，其包含SEQ ID NO：45或46之序列；CD3 VL，其包含SEQ ID NO：47之序列；及P-CAD VH，其包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24 之序列。於一態樣中，該P-CAD VL包含SEQ ID NO：5之序列且該P-CAD VH包含SEQ ID NO：6之序列。於另一態樣中，該P-CAD VL包含SEQ ID NO：7之序列且該P-CAD VH包含SEQ ID NO：8之序列。於另一態樣中，該P-CAD VL包含SEQ ID NO：9之序列且該P-CAD VH包含SEQ ID NO：10之序列。於另一態樣中，該P-CAD VL包含SEQ ID NO：15之序列且該P-CAD VH包含SEQ ID NO：16之序列。
本發明進一步提供能夠特異結合至P-鈣黏蛋白之表位和結合至CD3之表位的雙特異性異質二聚體雙功能抗體，此雙特異性異質二聚體雙功能抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：90之序列且該第二條多肽鏈包含SEQ ID NO：91之序列。本發明進一步提供能夠特異結合至P-鈣黏蛋白之表位及結合至CD3之表位的雙特異性異質二聚體雙功能抗體，此雙特異性異質二聚體雙功能抗體包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：92之序列且該第二條多肽鏈包含SEQ ID NO：93之序列。
本發明進一步提供能夠特異結合至P-鈣黏蛋白之表位及結合至CD3之表位的雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：88之序列且該第二條多肽鏈包含SEQ ID NO：89之序列。
本發明進一步提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體， 其中該第一多肽鏈和第二多肽鏈可藉由至少一個二硫鍵彼此共價鍵結。
本發明進一步提供能夠特異結合至P-鈣黏蛋白之表位及結合至CD3之表位的雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈及第二條多肽鏈包含如第30A、30B、31A、31B、32A或32B圖中所列之序列。於本發明之另一態樣中，該雙特異性異質二聚體雙功能抗體包含如表5中所列之第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈。
本發明提供雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該雙特異性異質二聚體雙功能抗體可與可檢測之標記共軛結合，該可檢測之標記包含，但不限於螢光團(fluorophore)或放射性核素(radionuclide)。
本發明提供結合至P-鈣黏蛋白且競爭結合至本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體的雙特異性異質二聚體雙功能抗體。
本發明進一步提供醫藥組成物，其包含治療有效量之本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體和醫藥上可接受之載體。
本發明進一步提供用於治療有需要治療P-鈣黏蛋白相關病症的患者中之P-鈣黏蛋白相關病症的方法，其包含投予該患者本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體或包含本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體的醫藥組成物。本發明進一步提供用於治療有需要治療P-鈣黏蛋 白相關病症的患者中之P-鈣黏蛋白相關病症的方法，其包含投予該患者本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體或包含本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體的醫藥組成物，其中係活化或誘導細胞溶解性T細胞反應。
本發明進一步提供用於療法中之本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體。本發明進一步提供本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體於製造用於療法中之藥物的用途。於另一態樣中，該療法為P-鈣黏蛋白相關病症的治療。本發明進一步提供用於療法中之本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中該療法係活化或誘導細胞溶解性T細胞反應。
於一態樣中，該P-鈣黏蛋白相關病症為癌症。於另一態樣中，該癌症為表現P-鈣黏蛋白或P-鈣黏蛋白陽性之癌症。該癌症包括，但不限於乳癌、結腸直腸癌、卵巢癌、胃癌、甲狀腺癌、前列腺癌、子宮頸癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、子宮內膜癌、頭頸癌、睾丸癌及膠質母細胞癌。
本發明進一步提供以重組方式製造本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體的經分離之宿主細胞、包含編碼本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體的核苷酸序列的經分離之多核苷酸及包含該多核苷酸之載體。
本發明進一步提供製造本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體的方法，其包含在能導致製造雙特異性異質二聚體雙功能抗體的條件下培養本文所揭示之宿主細 胞，並從該培養上清液純化該雙特異性異質二聚體雙功能抗體。
本發明進一步提供本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其中晶體結構組裝成緊密之球形結構，此結構係藉由介於一對半胱胺酸殘基之間的二硫鍵聯穩定化，該對半胱胺酸殘基由位在子結構域1B之位置239處的半胱胺酸殘基(Cys239)及位在子結構域2A之位置246處的半胱胺酸殘基(Cys246)所組成；且，其中該晶體衍射用於測定原子坐標之X射線，以提供較約2.0埃更佳之解析率。
本發明進一步提供能夠特異結合至P-鈣黏蛋白之表位和結合至CD3之表位的雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其包含第一多肽鏈和第二條多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含(從N端至C端之方向)：結構域1，其包含子結構域1A(其包含含有SEQ ID NO：47之序列的抗CD3抗體之VL結合結構域(CD3 VL))和子結構域1B(其包含含有SEQ ID NO：6之序列的抗P-鈣黏蛋白抗體之VH結合結構域(P-CAD VH))，其中該子結構域1A和子結構域1B可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接且不相聯結以形成VL/VH表位結合結構域；該第二多肽鏈包含(從N端至C端之方向)：結構域2，其包含子結構域2B(其包含含有SEQ ID NO：5之序列的P-CAD VL)和子結構域2A(其包含含有SEQ ID NO：45之序列的CD3 VH)，其中該子結構域2B和子結構域2A可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接且不相聯結以形成VL/VH表位結合結 構域；其中晶體結構組裝成緊密之球形結構，此結構係藉由介於一對半胱胺酸殘基之間的二硫鍵聯穩定化，該對半胱胺酸殘基包含位在子結構域1B之位置239處的半胱胺酸殘基(Cys239)及一位在子結構域2A之位置246處的半胱胺酸殘基(Cys246)；且，其中該晶體衍射用於測定原子坐標之X射線，以提供較約2.0埃更佳之解析率。
於另一態樣中，本文所描述之雙特異性異質二聚體雙功能抗體含有二個彼此分隔約40埃之抗原結合位點且該結合位點可位於該雙特異性異質二聚體雙功能抗體的正交相對側。
本發明進一步提供根據本文所揭示之晶體結構來鑑定用於形成在雙特異性異質二聚體雙功能抗體內之二硫鍵聯的半胱胺酸殘基之額外位置的方法，其中係分析該晶體結構中之一對可供用於以一對可形成二硫鍵聯之半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基位置。於本發明之一特殊態樣中，該用於以一對可形成二硫鍵聯之半胱胺酸殘基取代的一對胺基酸殘基之位置可選自由下列所組成之群組：胺基酸位置Gln121(VH1B)Gly160(VL1A)、Val129(VH1B)Gly244(VL1A)、Val123(VH1 B)Gly160(VL1A)、Gly126(VH1B)Ser242(VL1A)及Ala127(VH1B)Ser242(VL1A)。該二硫鍵聯可減少溶劑可及性並降低連接子之長度。
本發明進一步提供遺傳工程處理雙特異性異二聚體雙功能抗體變體之方法以試圖形成更穩定之域間聯結，其中該遺傳工程係透過在域間界面(根據本文所揭示之晶體結 構)中的胺基酸定點誘變進行，其中該胺基酸定點誘變填滿大的內部空隙/孔。於本發明之一特殊態樣中，該定點誘變可經由以具有大體積芳族側鏈之胺基酸替換小胺基酸來增加胺基酸側鏈體積。於本發明之另一態樣中，該小胺基酸可選自由下列所組成之群組：在位置Ala44(VL1A)、Val213(VH2A)、Leu238(VH2A)或Met231(VL2B)處之胺基酸。於本發明之另一態樣中，該具有大體積芳族側鏈之胺基酸可選自由下列所組成之群組：苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸。
本發明進一步提供結合至P-鈣黏蛋白之抗體，其包含含有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13,15、17、19、21或23之序列的輕鏈可變區(VL)之CDR1、CDR2和CDR3及/或含有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24之序列的重鏈可變區(VH)之CDR1、CDR2和CDR3。
於本發明之另一態樣中，本文所揭示之抗體包含含有SEQ ID NO：35或36之序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO：37或38之序列的VL CDR2、含有SEQ ID NO：39、40、41、42、43或44之序列的VL CDR3、含有SEQ ID NO：25或33之序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO：26或34之序列的VH CDR2及含有SEQ ID NO：27、28、29、30、31或32之序列的VH CDR3。
於本發明之另一態樣中，本文所揭示之抗體包含含有SEQ ID NO：35或36之序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO：37或38之序列的VL CDR2、含有SEQ ID NO：39、40、41、42、43或44之序列的VL CDR3、含有SEQ ID NO：25之序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO：26之序列的VH CDR2及含有SEQ ID NO：27、28、29、30、31或32之序列的VH CDR3。
於本發明之另一態樣中，本文所揭示之抗體包含含有SEQ ID NO：35之序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO：37之序列的VL CDR2、含有SEQ ID NO：42之序列的VL CDR3、含有SEQ ID NO：25之序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO：26之序列的VH CDR2及含有SEQ ID NO：29之序列的VH CDR3。
本發明進一步提供結合至P-鈣黏蛋白之抗體，其包含含有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23之序列的輕鏈可變區及/或含有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24之序列的重鏈可變區。於本發明之另一態樣中，本文所揭示之抗體包含含有SEQ ID NO：5之序列的輕鏈可變區及/或含有SEQ ID NO：6之序列的重鏈可變區。於本發明之另一態樣中，本文所揭示之抗體包含含有SEQ ID NO：7之序列的輕鏈可變區及/或含有SEQ ID NO：8之序列的重鏈可變區。於本發明之另一態樣中，本文所揭示之抗體包含含有SEQ ID NO：9之序列的輕鏈可變區及/或含有SEQ ID NO：10之序列的重鏈可變區。於本發明之另一態樣中，本文所揭示之抗體包含含有SEQ ID NO：15之序列的輕 鏈可變區及/或含有SEQ ID NO：16之序列的重鏈可變區。
本發明進一步提供結合至P-鈣黏蛋白並與本文所揭示之抗體競爭結合至P-鈣黏蛋白之抗體。
本發明進一步提供醫藥組成物，其包含治療上有效量之本文所揭示的抗體及醫藥上可接受之載體。
本發明進一步提供用於治療有需要治療P-鈣黏蛋白相關病症的患者中之P-鈣黏蛋白相關病症的方法，其包含投予該患者本文所揭示之抗體或包含本文所揭示之抗體的醫藥組成物。本發明進一步提供用於療法中之本文所揭示的抗體。本發明進一步提供本文所揭示之抗體於製造用於療法中之藥物的用途。
於一態樣中，該P-鈣黏蛋白相關病症為癌症。於另一態樣中，該癌症為表現P-鈣黏蛋白或P-鈣黏蛋白陽性之癌症。該癌症包括，但不限於乳癌、結腸直腸癌、卵巢癌、胃癌、甲狀腺癌、前列腺癌、子宮頸癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、子宮內膜癌、頭頸癌、睾丸癌及膠質母細胞癌。
本發明進一步提供編碼本文所揭示之抗體的核酸。於本發明之另一態樣中，該核酸可包含選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：98、100、102、104、106、108、110、112、114和116。於本發明之進一步態樣中，該核酸可包含選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：97、99、101、103、105、107、109、111、113和 115。本發明進一步提供包含本文所揭示之核酸的載體及包含本文所揭示之載體的宿主細胞。
本發明進一步提供本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體或抗體，其中該P-CAD VL包含：P-CAD VL CDR1序列，此P-CAD VL CDR1序列包含XL1.1-XL1.2-XL1.3-XL1.4-XL1.5-XL1.6-XL1.7-XL1.8-XL1.9-XL1.10-XL1.11-XL1.12-XL1.13，其中XL1.1至XL1.13各自獨立為根據表57、表58或表59之第3行的胺基酸殘基；P-CAD VL CDR2序列，此P-CAD VL CDR2序列包含XL2.1-XL2.2-XL21.3-XL2.4-XL2.5-XL2.6-XL2.7，其中XL2.1至XL2.7各自獨立為根據表60、表61或表62之第3行的胺基酸殘基；及P-CAD VL CDR3序列，此P-CAD VL CDR3序列包含XL3.1-XL3.2-XL3.3-XL3.4-XL3.5-XL3.6-XL3.7-XL3.8-XL3.9-XL3.10-XL3.11，其中XL3.1至XL3.11各自獨立為根據表63、表64或表65之第3行的胺基酸殘基；該P-CAD VH包含：P-CAD VH CDR1序列，此P-CAD VH CDR1序列包含XH1.1-XH1.2-XH1.3-XH1.4-XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10或XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10，其中XH1.1至XH1.10各自獨立為根據表48、表49或表50之第3行的胺基酸殘基；P-CAD VH CDR2序列，此P-CAD VH CDR2序列包含XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10-XH2.11-XH2.12-XH2.13-XH2.14-XH2.15-XH2.16-XH2.17或XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10，其中XH2.1至XH2.17各自獨立為根據表51、表52 或表53之第3行的胺基酸殘基；P-CAD VH CDR3序列，此P-CAD VH CDR3序列包含XH3.1-XH3.2-XH2.3-XH3.4-XH3.5-XH3.6-XH3.7-XH3.8-XH3.9，其中XH3.1至XH3.9各自獨立為根據表54、表55或表56之第3行的胺基酸殘基。
於一態樣中，XL1.1至XL1.13各自獨立為根據表57之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL1.1至XL1.13各自獨立為根據表58之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL1.1至XL1.13各自獨立為根據表59之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL2.1至XL2.7各自獨立為根據表60之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL2.1至XL2.7各自獨立為根據表61之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL2.1至XL2.7各自獨立為根據表62之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL3.1至XL3.11各自獨立為根據表63之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL3.1至XL3.11各自獨立為根據表64之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL3.1至XL3.11各自獨立為根據表65之第3行的胺基酸殘基。
於另一態樣中，XH1.1至XH1.10各自獨立為根據表48之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH1.1至XH1.10各自獨立為根據表49之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH1.1至XH1.10各自獨立為根據表50之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH2.1至XH2.17各自獨立為根據表51之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH2.1至XH2.17各自獨立為根據表52之第3行的胺基酸殘基。於另 一態樣中，XH2.1至XH2.17各自獨立為根據表53之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH3.1至XH3.9各自獨立為根據表54之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH3.1至XH3.9各自獨立為根據表55之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH3.1至XH3.9各自獨立為根據表56之第3行的胺基酸殘基。
本發明進一步提供本文所揭示之雙特異性異質二聚體雙功能抗體或抗體，其中該P-CAD VL包含：P-CAD VL CDR1序列，此P-CAD VL CDR1序列包含XL1.1-XL1.2-XL1.3-XL1.4-XL1.5-XL1.6-XL1.7-XL1.8-XL1.9-XL1.10-XL1.11-XL1.12-XL1.13，其中XL1.1至XL1.13各自獨立為根據表69之第3行或第4行的胺基酸殘基；P-CAD VL CDR2序列，此P-CAD VL CDR2序列包含XL2.1-XL2.2-XL21.3-XL2.4-XL2.5-XL2.6-XL2.7，其中XL2.1至XL2.7各自獨立為根據表70之第3行或第4行的胺基酸殘基；及P-CAD VL CDR3序列，此P-CAD VL CDR3序列包含XL3.1-XL3.2-XL3.3-XL3.4-XL3.5-XL3.6-XL3.7-XL3.8-XL3.9-XL3.10-XL3.11，其中XL3.1至XL3.11各自獨立為根據表71之第3行或第4行的胺基酸殘基；該P-CAD VH包含：P-CAD VH CDR1序列，此P-CAD VH CDR1序列包含XH1.1-XH1.2-XH1.3-XH1.4-XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10或XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10，其中XH1.1至XH1.10各自獨立為根據表66之第3行或第4行的胺基酸殘基；P-CAD VH CDR2序列，此P-CAD VH CDR2序列包含XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4- XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10-XH2.11-XH2.12-XH2.13-XH2.14-XH2.15-XH2.16-XH2.17或XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10，其中XH2.1至XH2.17各自獨立為根據表67之第3行或第4行的胺基酸殘基；及P-CAD VH CDR3序列，此P-CAD VH CDR3序列包含XH3.1-XH3.2-XH2.3-XH3.4-XH3.5-XH3.6-XH3.7-XH3.8-XH3.9，其中XH3.1至XH3.9各自獨立為根據表68之第3行或第4行的胺基酸殘基。
於一態樣中，XL1.1至XL1.13各自獨立為根據表69之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL1.1至XL1.13各自獨立為根據表69之第4行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL2.1至XL2.7各自獨立為根據表70之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL2.1至XL2.7各自獨立為根據表70之第4行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL3.1至XL3.11各自獨立為根據表71之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XL3.1至XL3.11各自獨立為根據表71之第4行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH1.1至XH1.10各自獨立為根據表66之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH1.1至XH1.10各自獨立為根據表66之第4行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH2.1至XH2.17各自獨立為根據表67之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH2.1至XH2.17各自獨立為根據表67之第4行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH3.1至XH3.9各自獨立為根據表68之第3行的胺基酸殘基。於另一態樣中，XH3.1至XH3.9各自獨立為根據表68之第4 行的胺基酸殘基。
此外，本發明提供XH1.8為G，XH2.5為Y，XH3.1為I，XH3.7為F，XL3.3為W，XL2.6為N，XH2.16為Q，XH3.5為N，XH3.9為I，XL1.8為G，XL2.2為N，XL2.3為N，XL3.2為T及/或XL3.4為D。本發明亦提供本文所描述之態樣的任何組合。
[詳細說明]
本發明描述新穎之雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其包含特異結合P-鈣黏蛋白之抗原結合結構域及特異結合 CD3之抗原結合結構域以招募和活化細胞溶解性T細胞。該雙特異性異質二聚體雙功能抗體可進一步包含Fc結構域。此外，本文中證明該雙特異性異質二聚體雙功能抗體成功地引導和活化T細胞對表現P-鈣黏蛋白之腫瘤細胞的細胞毒性。另外，本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體具有增強之藥物動力學性質以延長活體內半衰期且係經設計成在表現P-鈣黏蛋白之腫瘤的存在下經由該CD3複合物來吸引和活化多株T細胞群。
本發明描述針對源自人噬菌體展示庫之P-鈣黏蛋白的完整人單鏈抗體結合結構域之分離和表徵。本發明進一步提供這些P-鈣黏蛋白結合結構域共價連接至抗CD3抗體之抗原結合結構域(為先前描述之DART格式)(Mooreet al.,Blood,117(17)：4542-4551,2011)以創建能夠同時結合至P-鈣黏蛋白和CD3之雙特異性異質二聚體雙功能抗體。此外，於本發明之一態樣中，該抗P-鈣黏蛋白/抗CD3 DART蛋白，亦稱為雙特異性異質二聚體雙功能抗體，成功地指導並活化T細胞對表現P-鈣黏蛋白之細胞的細胞毒性。
除非另外定義，本文所使用之所有技藝術語、符號和其他科學術語或用辭意圖具有本發明相關技藝之技術人士熟習所通常理解的含義。於一些情況中，本文中定義具有通常理解之含義的術語係為了清楚及/或快速參考，而本文中包含該類定義不應被必然解釋為代表與本技藝中所通常理解者有顯著差異。除非另有說明，實行本發明時係使 用在本技藝之技術範圍內的習知分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學及免疫學技術。該等技術在文獻中有充分解釋，諸如Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1999，包括到2001年之補充資料)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987，包括到2001年之補充資料)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版(Sambrook and Russel,2001)。
P-鈣黏蛋白(鈣黏蛋白3，CDH3)屬於跨膜糖蛋白之經典鈣黏蛋白超家族，其調節發育期間之鈣依賴性細胞-細胞黏著和組織穩態(Gumbiner et al.,J.Cell Biol.,148：399-403,(2000))。該鈣黏蛋白胞內結構域直接與連接至肌動蛋白(actin)細胞骨骼網絡之細胞質連環蛋白(catenin)交互作用，提供穩定之細胞交互作用的分子基礎。該鈣黏蛋白/連環蛋白複合物，以及由此結構控制之傳信通路代表重大的調控機制，透過其對細胞生長、分化、移動和存活的影響來指導細胞命運決定(Cavallaro et al,2011)。經典鈣黏蛋白包括E-鈣黏蛋白(CDH1)、N-鈣黏蛋白(CDH2)和P-鈣黏蛋白(CDH3)。正常組織中之P-鈣黏蛋白的表現水準低且主要侷限於肌上皮細胞及複層上皮(stratified epithelium)的基底層。現已有報導，P-鈣黏蛋白之表現在各種不同腫瘤中增加，包括乳癌、胃癌、子宮內膜癌、胰腺癌和結直腸癌且為生存率低之末期疾病患者中的良好預測指標(Hardy et al,2002；Imai et al,2008；Parades et al, 2005；Stefansson et al,2004；Taniuchi et al,2005)。基因表現略圖分析及免疫組織化學分析進一步表明肺癌(包括，但不限於非小細胞肺癌和小細胞肺癌)、卵巢癌、頭頸癌、甲狀腺癌和膀胱癌。
CD3(分化3之簇)為包含四個不同鏈ε、δ、γ和ζ而形成εδ、εγ和ζζ二聚體的T細胞共受體蛋白質複合物。
這些二聚體與稱為T細胞受體(TCR)之分子聯結，並在T淋巴細胞中產生活化信號。該TCR和CD3分子一起包含該TCR複合物。眾所周知，抗CD3抗體透過活化內源性淋巴因子之製造來引起細胞毒性T細胞產生且能夠選擇性地殺死腫瘤靶的(Yun et al.,Cancer Research,49：4770-4774(1989))。
更具體地說，T細胞表現能夠誘導抗原特異性免疫反應之TCR複合物(Smith-Garvin et al,2009)。抗原為由腫瘤細胞和經病毒感染之細胞所表現的肽，其能夠刺激免疫反應。細胞內表現之抗原結合至第I型主要組織相容性(第I型MHC)分子並被運送至表面而與T細胞在此接觸。若TCR對與抗原複合之第I型MHC的結合親和力足夠，則將開始形成免疫突觸。透過免疫突觸來傳信之作用係透過該形成εδ、εγ和ζζ二聚體的CD3共同受體來介導。這些二聚體與TCR聯結並在T淋巴細胞中產生活化信號。此傳信級聯指導T細胞介導滅殺表現該抗原之細胞。細胞毒性係由從T細胞至靶細胞的粒酶B(granzyme)和穿孔素(perforin)釋出並轉移所介導。
不受理論所束縛，咸信，本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體可允許T細胞免去TCR和該與抗原複合之第I型MHC交互作用的必要性，取而代之的是透過指導表現在T細胞上之CD3(諸如CD3ε)和表現在腫瘤上之P-鈣黏蛋白共接合來重新指導T細胞針對靶的細胞。
本文所使用之“效應子功能”係指支持由雙特異性異質二聚體雙功能抗體之抗CD3結合結構域與細胞毒性T細胞交互作用所導致之生化事件的能力。
如本文所使用之術語“抗體”係指單株抗體、多特異性抗體、人抗體、人化抗體、合成抗體、嵌合型抗體、多株抗體、駱駝化抗體、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫鍵鍵聯之雙特異性Fvs(sdFv)、內抗體和抗獨特型(抗Id)抗體(包括，例如針對本發明抗體之抗Id和抗-抗ld抗體)及上述任一項之表位結合片段或結合結構域。尤其是，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子之免疫活性片段，即，含有抗原結合位點之分子。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和lgA2)或子類別。
如本文所使用之術語“雙特異性異質二聚體雙功能抗體”係指具有二或多個多肽鏈或蛋白質之複合物，該二或多個多肽鏈或蛋白質各自包含至少一個抗體VL和一個抗體VH結構域或其片段，其中二個抗體結合結構域同時包含在單一多肽鏈內且其中各多肽鏈中之VL和VH結構域 係來自不同抗體。
如本文所使用之術語“免疫特異結合”、“免疫特異識別”，“特異結合”、“特異識別”及類似術語係指特異結合至抗原(例如表位或免疫複合物)且不特異結合至另一分子之分子，例如結合結構域。特異結合至抗原之分子可以較低之親和力結合至其他肽或多肽，此可藉由本技藝已知之分析，例如免疫分析，BIACORE®或其他分析來測定。較佳地，特異結合抗原之分子不與其他蛋白質交叉反應。
如本文所使用之術語“重鏈”、“輕鏈”、“可變區”或“可變結構域”、“框架區”、“恆定結構域”，等具有彼等在免疫學技藝中的普通含義且係指在天然存在之免疫球蛋白中的結構域和重組結合蛋白之對應結構域(例如人化抗體、單鏈抗體、嵌合型抗體，等)。該天然存在之免疫球蛋白的基本結構單位為具有二個輕鏈和二個重鏈的四聚體，通常以約150,000Da之糖蛋白形式表現。每一條鏈之胺基端(N端)部分均包含具有約100至110或更多個胺基酸之可變區，此可變區主要負責識別抗原。每一條鏈之羧基端(C端)部分界定恆定區。每一條輕鏈係由輕鏈可變結構域(VL)和輕鏈恆定結構域(CL)所組成。每一條重鏈係由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(具有CH1、鉸鏈、CH2和CH3結構域)所組成。該IgG分子之可變區包含高可變區，稱為互補決定區(CDR)，其含有與抗原接觸之殘基和非CDR區段，稱為框架區(FR)，其通常維持結構並決定CDR環之定位(雖然某些框架殘基亦可接觸抗原)。各VH 和VL包含三個CDR和四個FR，從胺基端到羧基端係依下列結構排列：n-FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4-c。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)和類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和lgA2)或子類別。
該“鉸鏈區”或“鉸鏈結構域”通常被定義為從人IgG1之Glu216至Pro230的伸展區。其他IgG同種異型之鉸鏈區可經由將形成重鏈間S--S鍵之第一個和最後一個半胱胺酸殘基放在相同位置來與IgG1序列比對。
如本文所使用之術語“Fc區”、“Fc結構域”或類似術語係用於定義IgG重鏈之C端區。IgG之Fc區包含二個恆定結構域，CH2和CH3。人IgG Fc區之CH2結構域通常從胺基酸231延伸至胺基酸341(根據Kabat編號系統)。人IgG Fc區之CH3結構域通常從胺基酸342延伸至447(根據Kabat編號系統)。人IgG Fc區之CH2結構域(亦稱為“Cγ2”結構域)之獨特處在於其並非緊密搭配另一個結構域。而是，二個N-連接之分支碳水化合物鏈穿插在完整之天然IgG的二個CH2結構域之間。
當提及結合蛋白、結合結構域或抗體(如本文所廣泛定義者)時，各結構域之胺基酸分配係根據Kabat、Chothia、Kabat和Chothia二者之累積、AbM、接觸及/或構形定義或任何本技藝中所周知之CDR測定方法的定義。抗體CDR可被視為最初由Kabat等人定義之高可變區。參見，例如Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C.。該CDR之位置亦可被視為結構性環結構，其最初係由Chothia和其他人描述。參見，例如Chothia et al.,1989,Nature 342：877-883。其他識別CDR的方法包括“AbM定義”(此為Kabat和Chothia之間的折衷方法且係使用牛津分子AbM抗體建模軟體(Oxford Molecular’s AbM antibody modeling software)(Accelrys，加州聖地牙哥)推衍)，或包括基於所觀察到之抗原接觸的CDR之“接觸定義”，此方法列於如MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.,262：732-745中。於另一方法中，本文中稱為CDR之“構象定義”，該CDR之位置可被視為對抗原結合具有焓貢獻之殘基。參見，例如Makabe et al.,2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166。還有其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法的其中一者，但仍可能與至少一部分之Kabat CDR重疊，雖然其可能鑑於預測或實驗發現特定之殘基或殘基團或甚至是整個CDR不會顯著影響抗原結合而被縮短或延長。如本文所使用者，CDR可指藉由本技藝中已知之任何方法(包括方法的組合)定義的CDR。本文所使用之方法可利用根據這些方法中之任一方法所定義的CDR。在任何包含一個以上之CDR的指定態樣，該CDR可根據Kabat、Chothia、延伸者、AbM、接觸及/或構形定義中之任一者定義。
人化抗體係指含有源自非人免疫球蛋白之最小序列的非人(例如鼠)抗體形式，該非人(例如鼠)抗體形式為嵌合 型免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或其他抗原結合子序列或抗體之結合結構域)。較佳地，人化抗體為其中該來自接受者之互補決定區(CDR)(受體抗體)的殘基被來自具有所需之特異性、親和力和能力的非人物種(諸如小鼠、大鼠或兔)之CDR(供體抗體)的殘基替換之人免疫球蛋白。
術語“單株抗體”係指源自單一選殖株(包括任何真核、原核或噬菌體選殖株)之抗體，而非製造該單株抗體之方法。本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體之結合結構域來源的單株抗體可使用本技藝中已知之多種技術製備，包括使用雜交瘤、重組株和噬菌體顯示技術或彼等之組合。例如，單株抗體可使用雜交瘤技術，包括那些本技藝中所已知者來製造。
抗體亦可使用本技藝中已知之各種噬菌體展示法產生。在噬菌體展示法中係將功能性抗體結構域展示在攜帶編碼該抗體之多核苷酸序列的噬菌體顆粒之表面上。於一特定態樣中，可利用該等噬菌體來展示抗原結合結構域，諸如從組庫或組合抗體庫(例如人或鼠)表現之Fab和Fv或二硫鍵穩定化之Fv。可與所欲抗原結合之抗原結合結構域之噬菌體可使用抗原選擇或鑑定，例如使用經標記之抗原或使用結合至或被截留在固體表面或小珠上的抗原。這些方法中所使用之噬菌體通常為絲狀噬菌體，包括fd和M13。抗原結合結構域係以與噬菌體基因Ⅲ或基因V Ⅲ蛋白之重組融合蛋白形式表現。可用來製造本發明之免疫 球蛋白或其片段的噬菌體展示法之實例包括那些揭示於Brinkmann et al.(1995)“Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments”,J.Immunol.Methods,182：41-50中者。
該多種IgG同種異型的功能特性及彼等之結構域為本技藝所周知。IgG1、IgG2、gG3和IgG4之胺基酸序列為本技藝所已知者。從特定之IgG同種異型選擇及/或組合二或多個結構域以用於本發明之方法中可根據任何已知之親代同種異型之參數，包括對FcγR之親和力來進行。例如，使用來自表現出對FcγR Ⅱ B有限之結合力或不結合FcγR Ⅱ B之IgG同種異型(例如IgG2或IgG4)的區或結構域可發現特定用途，其中期望將雙特異性異質二聚體雙功能抗體進行工程處理以將對活化受體之結合最大化並將對抑制性受體之結合最小化。類似地，使用已知會優先結合C1q或FcγR Ⅲ A之來自IgG同種異型(例如IgG3)的Fc區或結構域可與本技藝中已知之Fc胺基酸修飾組合以用來增強由抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)、增進遺傳工程處理雙特異性異質二聚體雙功能抗體分子，從而將效應子功能活性，例如：補體活化或ADCC最大化。以類似方式，可在IgG同種異型之Fc區或結構域中製造突變以將Fc區之效應子功能最小化或消除。
術語“表位”係指分子中能被抗體識別且與該抗體之一或多個抗原結合區結合的部分。表位通常包含化學活性表 面分組之分子，諸如胺基酸或糖側鏈，且具有特定之三維結構特徵和特定之電荷特徵。本文所使用之術語“抗原性表位”的定義為抗體可特異結合至其之多肽部分，此可藉由本技藝中所熟知之任何方法，例如習知之免疫分析測定。“非線性表位”或“構形表位”包含在抗原蛋白(其為與特異於該表位之抗體結合者)內之不連續多肽(或胺基酸)。一旦在抗原上測定出期望之表位，就可能產生針對該表位之抗體，例如使用本文所描述之技術。在發現過程中，抗體之產生和表徵可以闡明關於期望之表位的信息。然後，從此信息有可能進行競爭性篩選結合至相同表位的抗體。達成此任務的一種方法為進行競爭和交叉競爭研究以找出彼此競爭或交叉競爭之抗體，例如競爭結合至該抗原之抗體。
一種方法係識別該與抗體結合之表位或“表位測繪”。本技藝中已知多種用於測繪和表徵蛋白質上之表位位置的方法，包括解析抗體-抗原複合物之晶體結構、競爭分析、基因片段表現分析及基於合成肽的分析，如描述於，例如Harlow and Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999的第11章中所描述者。於另外之實例中，表位測繪可用於測定抗體所結合之序列。表位測繪係從各種來源市售購得，例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15，8219 PH Lelystad，荷蘭)。於另外之實例中，可進行抗原結合結構域之誘變、結構域交換實驗和丙胺酸掃描誘 變以鑑定表位結合所需、足夠及/或所要求之殘基。結合親和力和抗原結合結構域交互作用之截止速率可藉由競爭性結合分析來測定。競爭性結合分析的一種實例為放射免疫分析，其包含培育經標記之抗原並偵測與該經標記之抗原結合的分子。本發明之分子對抗原的親和力及結合的截止速率可藉由Scatchard分析從飽和度數據測定。
本發明分子對抗原之親和力和結合性質可使用本技藝中已知之用於抗原結合結構域的玻管內分析(以生物化學或免疫學為基礎的分析)進行初步測定，該等分析包括，但不限於酶聯免疫吸附試驗(ELISA)分析、表面電漿共振(surface plasmon resonance)(SPR)分析、生物膜層干涉技術(bio-layer interferometry)或免疫沉澱分析。本發明分子在活體內模型(諸如本文所描述和揭示者)中可具有與基於玻管內分析者類似的結合特性。然而，本發明不排除在以玻管內為基礎的分析中未展現出所需表型，但在活體內展現出所需表型之本發明分子。
如本文所使用之術語“結合親和力(KD)”意指特定抗原-抗體交互作用之解離速率。KD為解離速率(rate of dissociation)(亦稱為“解離速率(off-rate)(koff)”)對結合速率(association rate)(或“進行速率(on-rate)(kon)”)之比。因此，KD等於koff/kon且係以莫耳濃度(M)表示。其依循KD越小，結合親和力越強。因此，與KD為1nM相比較，KD為1μM表示結合親和力弱。抗體之KD值可使用本技藝所公認之方法測定。一種用於測定抗體之KD的方法係使用 表面等電漿共振(SPR)技術，通常係使用生物傳感器系統，諸如BIACORE®系統。BIAcore動力學分析包含分析來自芯片之抗原與其表面上之固定化分子(例如包含表位結合結構域之分子)的結合和解離。用於測定抗體之KD的另一種方法係使用生物膜層干涉技藝，通常係採用OCTET®技術(OctetQKe系統，ForteBio)。
如本文所使用之術語“核酸”及“核苷酸序列”包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)、DNA和RNA分子之組合或雜種DNA/RNA分子及DNA或RNA分子之類似物。該等類似物可使用，例如核苷酸類似物產生，其包括，但不限於肌苷或三苯甲基化鹼基。該等類似物亦可包含DNA或RNA分子，此DNA或RNA分子包含增添該分子有利屬性(諸如，例如核酸酶抗性或增加之跨越細胞膜的能力)之經修飾的支架。該核酸或核苷酸序列可為單股、雙股，可同時含有單股和雙股部分且可含有三股部分，但較佳為雙股DNA。
本發明亦包括編碼本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體(包括該抗體之多肽和結合區)的多核苷酸。編碼本發明之分子的多核苷酸可藉由本技藝中已知之任何方法取得，且該多核苷酸之核苷酸序列可藉由本技藝中已知之任何方法測定。
編碼本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體的多核苷酸可包括下列者：只有該變體之編碼序列、該變體之編碼序列及另外之編碼序列，諸如功能性多肽或信號或分泌 序列或親蛋白序列；該抗體之編碼序列和該抗體之非編碼序列，諸如內含子或非編碼序列5’及/或編碼序列之3’。術語“編碼雙特異性異質二聚體雙功能抗體之多核苷酸”包含其中包括該變體之另外的編碼序列的多核苷酸，但亦包含其中包括另外之編碼及/或非編碼序列的多核苷酸。本技藝中已知經優化以用於特定宿主細胞/表現系統之多核苷酸序列可以很容易地從所需之蛋白質的胺基酸序列取得(見GENEART®AG，德國雷根斯堡)。
如本文所使用之術語“癌症”係指由細胞異常失控生長所導致之贅生物或腫瘤。於一些態樣中，癌症係指一直保持局部化的良性腫瘤。於其他態樣中，癌症係指已侵入並破壞鄰近之身體結構且擴散至遠方位點的惡性腫瘤。於一些態樣中，該癌症與特定之癌抗原相關。
如本文所使用之“治療有效量”係指足以治療或管理疾病或病症之治療劑的量。治療有效量可指足以使疾病的發作延遲或最小化(例如使癌症的擴散延遲或最小化)的治療劑之量。治療有效量亦可指在治療或管理疾病中提供治療益處之治療劑的量。此外，關於本發明之治療劑的治療有效量意指在治療或管理疾病中提供治療益處之單獨之治療劑的量或與其他療法組合之治療劑的量。
如本文所使用之術語“預防劑”係指任何可用於預防病症或防止疾病復發或擴散的作用劑。預防有效量可指足以防止過度增生性疾病(尤其是癌症)復發或擴散，或這些情況在患者中發生之預防劑的量，前述患者包括，但不限於 那些易罹患過度增生性疾病者，例如那些遺傳上易罹患癌症或先前暴露於致癌物質者。預防有效量亦可指在預防疾病中提供預防益處之預防劑的量。此外，關於本發明之預防劑的預防有效量意指在預防疾病中提供預防益處之單獨之預防劑的量或與其他作用劑組合之預防劑的量。
如本文所使用之術語“預防(prevent、preventing及prevention)”係指由投予預防或治療劑所導致之防止個體中之病症的一或多種症狀復發或發作。
如本文所使用之術語“組合”係指使用一種以上之預防及/或治療劑。當使用術語“組合”時並不限制將預防及/或治療劑投予患有病症之個體的順序。換言之，該組合療法可與該治療劑分別、連續或同時進行治療。
本發明分子之重組表現
一旦已取得編碼本發明分子(即，結合結構域)之核酸序列，可使用本技藝中所周知之技術藉由重組DNA技術製造該用於製造分子之載體。
編碼本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體結合結構域之多核苷酸可包括可操作地連接至該抗體編碼序列之表現控制多核苷酸序列，包括本技藝已知之天然關聯或異源啟動子區。該表現控制序列可為在能夠轉化或轉染真核宿主細胞之載體中的真核啟動子系統，但亦可使用用於原核宿主之控制序列。一旦已將載體納入適當之的宿主細胞株中，使該宿主細胞在適合表現該核苷酸序列，及依需 要，適合收集和純化該抗體之條件下繁殖。真核細胞株包括CHO細胞株、各種COS細胞株、HeLa細胞、骨髓瘤細胞株、經轉化之B細胞或人胚腎細胞株。
雙特異性異質二聚體雙功能抗體
如前述，雙特異性異質二聚體雙功能抗體係指二或多個多肽鏈或蛋白質之複合物，其各自包含至少一個抗體VL結構域及一個抗體VH結構域或其片段，其中二個抗體結合結構域同時包含在單一多肽鏈內且其中在各多肽鏈中之VL和VH結構域係來自不同抗體。於特定態樣中，雙特異性異質二聚體雙功能抗體包括同時含有VL和VH結構域之多肽鏈的二聚體或四聚體。該包含多聚體型蛋白質之個別多肽鏈可藉由鏈間二硫鍵共價連接到至少一個該多聚體之其他肽。
本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體包含利用雙親和力重新靶向(Dual-Affinity Re-Targeting)(DART®)平台技術(美國專利申請出版物第2007/0004909、2009/0060910和2010/0174053號)共價連接至抗CD3(CD3)結合結構域之抗P-鈣黏蛋白(P-CAD)結合結構域。該DART技術提供之共價連接可導致可能具有優異之穩定性、理想之重和輕鏈配對和抗原識別的分子。再者，最小之連接子大小和內含物可降低免疫原性之可能。本發明之DART蛋白同時對準T細胞(CD3)和腫瘤細胞(P-CAD)並成功地指導和活化T細胞之細胞毒性對表現P-鈣黏蛋白之 腫瘤細胞。
雙特異性異質二聚體雙功能抗體的每個多肽鏈包含VL結構域和VH結構域，其可經共價連接(連接子1)從而使抗體結合結構域受自組裝之限制。此外，每個多肽鏈包含異質二聚體化結構域，其提升多個多肽鏈之異質二聚體化並降低不同多肽鏈同質二聚體化之可能性。該異質二聚體化結構域可位於多肽鏈之N-端或C端。該異質二聚體化結構域可包含長度為1、2、3、4、5、6或更多個胺基酸殘基之半胱胺酸連接子(連接子2)。二個多肽鏈之交互作用可能產生二個VL/VH配對，形成二個表位結合結構域，即，二價分子。該VH或VL結構域不會被限制在該多肽鏈內的任何位置，即，限制在胺基或羧基端，該結構域亦不會被限制在彼此之相對位置，即，該VL結構域可在VH結構域之N端，反之亦然。唯一的限制為用於形成功能性雙功能抗體之可用的互補性多肽鏈。當VL和VH結構域係源自特異於不同抗原之抗體時，形成功能性雙特異性異質二聚體雙功能抗體需要二個不同多肽鏈交互作用，即，形成異質二聚體。相反地，當二個不同的多肽鏈自由交互作用時，例如在重組表現系統中，一個包含VLA和VHB(A為第一表位且B為第二表位)，而另一個包含VLB和VHA，二個不同的結合位點可形成：VLA-VHA和VLB-VHB。在所有雙特異性異質二聚體雙功能抗體多肽鏈對方面，該二條鏈有可能發生錯誤比對或錯誤結合，例如VL-VL或VH-VH結構域之交互作用。然而，功能性雙 特異性異質二聚體雙功能抗體之純化係根據適當二聚體化之結合位點之免疫特異性，使用本技藝中已知或本文示例之基於親和力的任何方法(例如親和力層析法)很容易地管理。
本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體可同時結合二個分開和截然不同的表位。於某些態樣中，至少一個表位結合位點係特異於表現在免疫效應子細胞上(例如表現在T淋巴細胞上)之CD3決定簇。於一態樣中，該雙特異性異質二聚體雙功能抗體分子結合至該效應子細胞決定簇且亦活化該效應子細胞。於一態樣中，該表位結合結構域能夠結合與乳癌、直腸結腸癌、卵巢癌、胃癌、甲狀腺癌、前列腺癌、子宮頸癌、胰腺癌、肺癌(包含，但不限於：非小細胞肺癌和小細胞癌)、膀胱癌、肝癌、子宮內膜癌、頭頸癌、睾丸癌和膠質母細胞瘤癌症相關之P-鈣黏蛋白腫瘤相關抗原。
本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體包含通常衍生自免疫球蛋白或抗體之抗原結合結構域。該衍生用於本發明方法中之結合結構域的抗體可來自任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物(例如人、非人靈長類、鼠、驢、羊、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、馬或雞)。較佳地，該抗體為人或人化單株抗體。如本文所使用之“人”抗體包括具有人免疫球蛋白之胺基酸序列的抗體，並包括從人免疫球蛋白庫或合成之人免疫球蛋白編碼序列庫分離出的抗體、或從表現來自人基因之抗體的小鼠分離出的抗體。
本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體可以各種方式表徵。尤其是，可分析本發明之分子免疫特異性地結合至抗原的能力。然後，可分析已被鑑定為可免疫特異性地結合至抗原之分子對該抗原之特異性和親和力。
本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體可使用本技藝中所周知之各種方法製造，包含蛋白質從頭合成及編碼該結合蛋白之核酸的重組表現。該需要之核酸序列可藉由重組方法製造(例如對該所需多核苷酸之較早製備的變體進行PCR誘變)或藉由固相合成DNA製造。通常係使用重組表現方法。於一態樣中，本發明提供包含編碼抗CD3 VH及/或VL之序列的多核苷酸；於另一態樣中，本發明提供包含編碼抗P-鈣黏蛋白VH及/或VL之序列的多核苷酸。由於遺傳密碼之簡併性，多種不同之核酸序列編碼各免疫球蛋白胺基酸序列且本發明包括所有編碼本文所描述之結合蛋白的核酸。
連接子/肽
該雙特異性異質二聚體雙功能抗體之多肽鏈可包含多種不同之連接子和肽。該連接子和肽可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個胺基酸。於某些態樣中，該雙特異性異質二聚體雙功能抗體之多肽鏈可包含甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)。於另一態樣中，該連接子1可包含，但不限於GGGSGGGG(SEQ ID NO：68)和GGGGSGGGG(SEQ ID NO：69之序列。
於某些態樣中，該雙特異性異質二聚體雙功能抗體之多肽鏈可包含半胱胺酸連接子(連接子2)。於另一態樣中，該連接子2可進一步包含至少一個甘胺酸殘基。於一態樣中，該連接子2可包含，但不限於選自GFNRGEC(SEQ ID NO：70)、GVEPKSC(SEQ ID NO：71)和GGCGGG(SEQ ID NO：72)之序列。於某些態樣中，該連接子2可包含具有序列CPPCP(SEQ ID NO：60)及至少一個甘胺酸殘基之截短的IgG1鉸鏈區。於另一態樣中，該連接子2可包含，但不限於GCPPCP(SEQ ID NO：73)、GGTGGCPPCP(SEQ ID NO：74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：75)和GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：76)之序列。
於某些態樣中，該雙特異性異質二聚體雙功能抗體之多肽鏈可包含連接子3。於一態樣中，該連接子3可包含，但不限於KAPSSSPME(SEQ ID NO：77)之序列。
於某些態樣中，該雙特異性異質二聚體雙功能抗體之多肽鏈可包含肽1。於某些態樣中，該肽1可包含具有序列CPPCP(SEQ ID NO：60)之截短的IgG1鉸鏈區。於一態樣中，該肽1可包含，但不限於DKTHTCPPCP(SEQ ID NO：96)之序列。
VF-DART
於本發明之一態樣中，如第2和3圖中所示之稱為VF-DART的雙特異性異質二聚體雙功能抗體包含第一多 肽鏈(1)和第二條多肽鏈(2)。
於一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含抗P-鈣黏蛋白抗體(P-CAD VL)或抗CD3抗體(CD3 VL)之VL結合區，(ii)子結構域1B，若該子結構域1A包含CD3 VL，則該子結構域1B包含抗P-CAD抗體之VH結合區(P-CAD VH)，或者若該子結構域1A包含P-CAD VL，則該子結構域1B包含抗CD3抗體之VH結合區(CD3 VH)，且該子結構域1A和子結構域1B可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使該子結構域1B和子結構域1A不相聯結以形成表位結合位點；且可包含在子結構域1B上含有半胱胺酸連接子(連接子2)之第一異質二聚體提升結構域。
於另一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含P-CAD VH或CD3 VH，(ii)子結構域1B，若該子結構域1A包含CD3 VH，則該子結構域1B包含P-CAD VL，或者若該子結構域1A包含P-CAD VH，則該子結構域1B包含CD3 VL，該子結構域1A和子結構域1B可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接從而使該子結構域1B和子結構域1A不相聯結以形成表位結合位點；且可包含在子結構域1B上含有半胱胺酸連接子(連接子2)之第一異質二聚體提升結構域。
於一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含P-CAD VL和(ii)子結構域1B，其包含CD3 VH。於另一態樣中，該第一多肽鏈(1)可 包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含CD3 VL和(ii)子結構域1B，其包含P-CAD VH。於進一步之態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含P-CAD VH和(ii)子結構域1B，其包含CD3 VL。於另一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含CD3 VH和(ii)子結構域1B，其包含P-CAD VL。
於一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，根據所選擇之用於子結構域1A的VL結構域，其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VL結合區(P-CAD VL)或抗CD3抗體之VL結合區(CD3 VL)，(ii)子結構域2A，若該子結構域2B包含CD3 VL，則其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VH結合區(P-CAD VH)，或者若該子結構域2B包含P-CAD VL，則其包含抗CD3抗體之VH結合區(CD3 VH)，且該子結構域2B和子結構域2A可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使該子結構域2B和子結構域2A不相聯結以形成表位結合位點；且可包含在子結構域2A上含有半胱胺酸連接子(連接子2)之第二異質二聚體提升結構域。
於另一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含P-CAD VH或CD3 VH，(ii)子結構域2A，若該子結構域2B包含CD3 VH，則其包含P-CAD VL，或者若該子結構域2B包含P-CAD VH，則其包含CD3 VL，且該子結構域2B和子結構域2A可藉由 甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使該子結構域2B和子結構域2A不相聯結以形成表位結合位點；且可包含在子結構域2A上含有半胱胺酸連接子(連接子2)之第二異質二聚體提升結構域。
於一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含P-CAD VL和(ii)子結構域2A，其包含CD3 VH。於另一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含CD3 VL和(ii)子結構域2A，其包含P-CAD VH。於進一步之態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含P-CAD VH和(ii)子結構域2A，其包含CD3 VL。於另一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含CD3 VH和(ii)子結構域2A，其包含P-CAD VL。
於VF-DART之另一態樣中，該子結構域1A和子結構域2A可聯結以形成第一結合位點，其具有結合至在CD3或P-鈣黏蛋白上之表位的VL/VH結合結構域，而子結構域1B和子結構域2B可聯結以形成第二結合位點，其具有結合至在P-鈣黏蛋白或CD3上之表位的VL/VH結合結構域。
該第一多肽鏈(1)和第二多肽鏈(2)可彼此共價結合，例如在位於該第一和第二異質二聚體提升結構域內之半胱胺酸殘基處。於一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域之連接子2中的半胱胺酸殘基和該第二異質二聚體提升結 構域之連接子2中的半胱胺酸殘基可藉由至少一個二硫鍵連接。
於本發明之一態樣中，該CD3 VL可包含SEQ ID NO：48之序列且該CD3 VH可為選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：47和89。於另一態樣中，該P-CAD VL可為選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11,13、15、17、19、21和23且該P-CAD VH可為選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24。於一態樣中，該甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)可包含選自由下列所組成之群組的序列：GGGSGGGG(SEQ ID NO：68)和GGGGSGGGG(SEQ ID NO：69)。於本發明之一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域之半胱胺酸連接子(連接子2)可包含GFNRGEC之序列(SEQ ID NO：70)，而該第二異質二聚體提升結構域之半胱胺酸連接子(連接子2)可包含GVEPKSC的序列(SEQ ID NO：71)。於本發明之另一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域之半胱胺酸連接子(連接子2)可包含GVEPKSC之序列(SEQ ID NO：71)，而該第二異質二聚體提升結構域之半胱胺酸連接子(連接子2)可包含GFNRGEC之序列(SEQ ID NO：70)。
本文所描述之具有各種不同P-鈣黏蛋白和CD3抗體之VF-DART蛋白的第一和第二多肽鏈之序列提供於第30A和30B圖中。
含有E/K卷區之EK-DART
具有雙特異性異質二聚體雙功能抗體之二種不同的多肽鏈之異質二聚體的形成亦可藉由使用對該相對成員具有親和力且對其本身具排斥作用的結構域來獲得提升。該等結構域之實例為捲曲之卷結構域。例如，第一多肽鏈(1)可包括第一異質二聚體提升結構域(其具有形成帶負電荷之α-螺旋卷(E-卷)的麩胺酸富集區)，而第二多肽鏈(2)可包括第二異質二聚體提升結構域(其具有形成帶正電荷之螺旋卷(K-卷)的賴胺酸富集區)，其允許靜電交互作用以促進異質二聚體形成。同質二聚體之形成可能減少，因為E-卷對另一含有E-卷之多肽將具有排斥力，在K-卷方面反之亦然。
於本發明之一態樣中，如第4圖中所示之稱為EK-DART的雙特異性異質二聚體雙功能抗體包含第一多肽鏈(1)和第二多肽鏈(2)。
於一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VL結合區(P-CAD VL)或抗CD3抗體之VL結合區(CD3 VL)，(ii)子結構域1B，若該子結構域1A包含CD3 VL，則其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VH結合區(P-CAD VH)，或者若該子結構域1A包含P-CAD VL，則其包含抗CD3抗體之VH結合區(CD3 VH)，且該子結構域1A和子結構域1B可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使子 結構域1A和子結構域1B不相聯結以形成表位結合位點；並可包含第一異質二聚體提升結構域，此第一異質二聚體提升結構域包含：(i)在子結構域1B上之半胱胺酸連接子(連接子2)，和(ii)共價連接至該連接子2之E-卷區。
於另一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含P-CAD VH或CD3 VH，(ii)子結構域1B，若該子結構域1A包含CD3 VH，則其包含P-CAD VL，或者若該子結構域1A包含P-CAD VH，則其包含CD3 VL，且該子結構域1A和子結構域1B可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使子結構域1A和子結構域1B不相聯結以形成表位結合位點；並可包含第一異質二聚體提升結構域，此第一異質二聚體提升結構域包含：(i)在子結構域1B上之半胱胺酸連接子(連接子2)，和(ii)共價連接至該連接子2之E-卷區。
於一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含P-CAD VL和(ii)子結構域1B，其包含CD3 VH。於另一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：子結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含CD3 VL和(ii)子結構域1B，其包含P-CAD VH。於進一步之態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含P-CAD VH和(ii)子結構域1B，其包含CD3 VL。於另一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含CD3 VH和(ii)子結構域1B，其包含P-CAD VL。
於一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，根據所選擇之用於子結構域1A的VL結構域，其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VL結合區(P-CAD VL)或抗CD3抗體之VL結合區(CD3 VL)，(ii)子結構域2A，若該子結構域2B包含CD3 VL，則其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VH結合區(P-CAD VH)，或者若該子結構域2B包含P-CAD VL，則其包含抗CD3抗體之VH結合區(CD3 VH)，且該子結構域2B和子結構域2A可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使子結構域2B和子結構域2A不相聯結以形成表位結合位點；並可包含第二異質二聚體提升結構域，此第二異質二聚體提升結構域包含：(i)在子結構域2A上之半胱胺酸連接子(連接子2)，和(ii)共價連接至該連接子2之K-卷區。
於另一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含P-CAD VH或CD3 VH，(ii)子結構域2A，若該子結構域2B包含CD3 VH，則其包含P-CAD VL，或者若該子結構域2B包含P-CAD VH，則其包含CD3 VL，且該子結構域2B和子結構域2A可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使子結構域2B和子結構域2A不相聯結以形成表位結合位點；並可包含第二異質二聚體提升結構域，此第二異質二聚體提升結構域包含：(i)在子結構域2A上之半胱胺酸連接子(連接子2)，和(ii)共價連接至該連接子2之K-卷區。
於一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其 包含(i)子結構域2B，其包含P-CAD VL及(ii)子結構域2A，其包含CD3 VH。於另一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含CD3 VL及(ii)子結構域2A，其包含P-CAD VH。於進一步之態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含P-CAD VH及(ii)子結構域2A，其包含CD3 VL。於另一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含CD3 VH及(ii)子結構域2A，其包含P-CAD VL。
於EK-DART之另一態樣中，該子結構域1A和子結構域2A可相聯結以形成具有結合至在CD3或P-鈣黏蛋白上之表位的VL/VH結合結構域區之第一結合位點，且該子結構域1B和子結構域2B可相聯結以形成具有結合至在P-鈣黏蛋白或CD3上之表位的VL/VH結合結構域區之第二結合位點。
該第一多肽鏈(1)和該第二多肽鏈(2)可在，例如位於該第一和第二異質二聚體提升結構域內之半胱胺酸殘基處彼此共價結合。於一態樣中，該在第一異質二聚體提升結構域之連接子2中之半胱胺酸殘基及該在第二異質二聚體提升結構域之連接子2中之半胱胺酸殘基可藉由至少一個二硫鍵連接。
於本發明之一態樣中，該CD3 VL可包含SEQ ID NO：48之序列且該CD3 VH可為選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：47及89。於另一態樣中，該P- CAD VL可為選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23且該P-CAD VH可為選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24。於一態樣中，該甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)可包含選自由下列所組成之群組的序列：GGGSGGGG(SEQ ID NO：68)和GGGGSGGGG(SEQ ID NO：69)。本發明的於一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域和第二異質二聚體提升結構域之半胱胺酸連接子(連接子2)可包含GGCGGG之序列(SEQ ID NO：72)。於一態樣中，第一異質二聚體提升結構域進一步包含麩胺酸富集區(E-卷)，此麩胺酸富集區(E-卷)包含EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK之序列(SEQ ID NO：61)。於另一態樣中，該第二異質二聚體提升結構域進一步包含賴胺酸富集區(K-卷)，此賴胺酸富集區(K-卷)包含KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE之序列(SEQ ID NO：62)。
表1和第31A和31B圖提供具有本文所描述之各種不同P-鈣黏蛋白和CD3抗體的EK-DART蛋白之第一和第二多肽鏈之序列。
包含Fc區或其部分之雙特異性異質二聚體雙功能抗體
本發明包含含有Fc區或結構域，或其部分之雙特異性異質二聚體雙功能抗體。於某些態樣中，該Fc區或其部分包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之Fc區的一或多個 恆定結構域(例如CH2或CH3結構域)。於其他態樣中，本發明包含含有Fc區或其部分之分子，其中該Fc區或其部分相對於與彼等相當之野生型Fc區或其部分而言包含至少一個胺基酸修飾(例如取代)。變體Fc區為本技藝所周知且如本技藝中所周知之任何結合活性或效應子功能分析(例如ELISA、SPR分析或ADCC)所分析者，其主要用於改變包含該變體Fc區之抗體的表型。該等變體Fc區或其部分可延長藉由本發明之包含Fc區或其部分的雙功能抗體分子所展現出的血漿半衰期和穩定性。於其他態樣中，本發明包含本技藝中已知之任何Fc變體的用途。
於某些態樣中，對該Fc區之胺基酸進行的一或多種修飾可降低Fc區之親和力和活動性(avidity)，因此，可降低本發明之雙功能抗體分子對一或多個FcγR受體之親和力和活動性。於一特定之態樣中，本發明包含含有變體Fc區或其部分之雙功能抗體，其中該變體Fc區相對於野生型Fc區而言包含至少一個胺基酸修飾，該變體Fc區僅結合一個FcγR，其中該FcγR為FcγR Ⅲ A。於另一特定之態樣中，本發明包含含有變體Fc區或其部分之雙功能抗體，其中該變體Fc區相對於野生型Fc區而言包含至少一個胺基酸修飾，該變體Fc區僅結合一個FcγR，其中該FcγR為FcγR Ⅱ A。於另一特定之態樣中，本發明包含含有變體Fc區或其部分之雙功能抗體，其中該變體Fc區相對於野生型Fc區而言包含至少一個胺基酸修飾，該變體Fc區僅結合一個FcγR，其中該FcγR為FcγR Ⅱ B。於某些 態樣中，本發明包含含有變體Fc區之分子，其中相對於不包含Fc區或包含野生型Fc區之分子而言，由使用熟習本技藝之人士所已知及本文中所描述之方法測得該變體賦予或介導降低之ADCC活性(或其他效應子功能)及/或增加對FcγR Ⅱ B(CD32B)之結合力。
本發明亦包含含有來自二或多個IgG同種異型之結構域或區的Fc區之用途。如本技藝中所知，該Fc區之胺基酸修飾可深刻地影響經Fc介導之效應子功能及/或結合活性。然而，當在選定之IgG同種異型的背景下實施時，這些功能特性中之變化可被進一步細修及/或操作。類似地，該同種異型Fc之本質特徵可藉由一或多個胺基酸修飾而操作。由於該多種IgG同種異型(即，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)之鉸鏈及/或Fc區的胺基酸序列中之差異，該多種IgG同種異型顯示出不同的物理和功能特性，包含血清半衰期、補體結合(complement fixation)、FcγR結合親和力和效應子功能活性(例如ADCC、CDC)。於某些態樣中，該胺基酸修飾和IgG Fc區係根據其各自、分別的結合及/或效應子功能活性獨立地選擇以將雙功能抗體進行遺傳工程處理成具有所需特性。於大部分態樣中，該胺基酸修飾和IgG鉸鏈/Fc區已在IgG1之背景下依本文中之描述或本技藝所知者分別分析結合及/或效應子功能活性。於某些態樣中，在雙功能抗體分子或其他含Fc之分子(例如免疫球蛋白和)的背景下，該胺基酸修飾和IgG鉸鏈/Fc區顯示出類似之功能性，例如降低之ADCC活性(或 其他效應子功能)及/或對FcγR Ⅱ B之結合力增加。於其他態樣中，本發明包含含有本技藝已知之胺基酸修飾組合及展現新穎性質之選定的IgG區之變體Fc區，當該修飾及/或區依本文之描述獨立分析時檢測不到這些性質。
LP-DART
於本發明之一態樣中，稱為LP-DART，具有Fc區之雙特異性異質二聚體雙功能抗體顯示於第1和5圖中。LP-DART可包含二個結合靶的抗原和CD3(其融合至IgG之Fc結構域)之scFv結構域。於本發明之一態樣中，該雙特異性異質二聚體雙功能抗體可包含二個結合P-鈣黏蛋白和CD3ε(其融合至IgG1之Fc結構域)之scFv結構域。尤其是，第1A和1B圖顯示出四種替換之抗P-鈣黏蛋白/抗人CD3 LP-DART的代表，而第5圖顯示經組裝之LP-DART的一般示意圖。該LP-DART類似於上述VF-DART或EK-DART之結構，除了該第一和第二異質二聚體提升結構域包含具有免疫球蛋白Fc區之CH 2及/或CH3結構域的免疫球蛋白Fc區外，其中該CH 2及/或CH3結構域已經過改變以包含球形突起(突起)或孔(腔)。對該LP-DART之Fc部分所進行之修飾描述於下文中。
於本發明之一態樣中，如第1A、1B和5圖中所示之LP-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體包含第一多肽鏈(1)和第二多肽鏈(2)。
於一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其 包含(i)子結構域1A，其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VL結合區(P-CAD VL)或抗CD3抗體之VL結合區(CD3 VL)，(ii)子結構域1B，若該子結構域1A包含CD3 VL，則其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VH結合區(P-CAD VH)，或者若該子結構域1A包含P-CAD VL，則其包含抗CD3抗體之VH結合區(CD3 VH)，且該子結構域1A和子結構域1B可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使該子結構域1A和子結構域1B不相聯結以形成表位結合位點；並可包含第一異質二聚體提升結構域，該第一異質二聚體提升結構域包含：(i)在子結構域1B上之半胱胺酸連接子(連接子2)及(ii)Fc區，其具有經改變之CH2及/或CH3結構域以包含共價連接至該連接子2之球形突起Fc鏈(突起)或孔Fc鏈(腔)。
於另一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含P-CAD VH或CD3 VH，(ii)子結構域1B，若該子結構域1A包含CD3 VH，則其包含P-CAD VL，或者若該子結構域1A包含P-CAD VH，則其包含抗CD3 VL，且該子結構域1A和子結構域1B可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使該子結構域1A和子結構域1B不相聯結以形成表位結合位點；並可包含第一異質二聚體提升結構域，該第一異質二聚體提升結構域包含：(i)在子結構域1B上之半胱胺酸連接子(連接子2)及(ii)Fc區，其具有經改變之CH2及/或CH3結構域以包含共價連接至該連接子2之球形突起Fc 鏈(突起)或孔Fc鏈(腔)。
於一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含P-CAD VL及(ii)子結構域1B，其包含CD3 VH。於另一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含CD3 VL及(ii)子結構域1B，其包含P-CAD VH。於進一步之態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含P-CAD VH及(ii)子結構域1B，其包含CD3 VL。於另一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含CD3 VH及(ii)子結構域1B，其包含P-CAD VL。
於一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，根據所選擇之用於子結構域1A的VL結構域，其包含抗P-鈣黏蛋白抗體(P-CAD VL)之VL結合區或抗CD3抗體之VL結合區(CD3 VL)，(ii)子結構域2A，若該子結構域2B包含CD3 VL，則其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VH結合區(P-CAD VH)，或者若該子結構域2B包含P-CAD VL，則其包含抗CD3抗體之VH結合區(CD3 VH)，且該子結構域2B和子結構域2A可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使該子結構域2B和子結構域2A不相聯結以形成表位結合位點；並可包含第二異質二聚體提升結構域，該第二異質二聚體提升結構域包含：(i)在子結構域2A上之半胱胺酸連接子(連接子2)及(ii)Fc區，其具有經改變之CH2及/或CH3結構域以 包含共價連接至該連接子2之球形突起Fc鏈(突起)(若該第一異質二聚體區包含孔Fc鏈(腔))或孔Fc鏈(腔)(若該第一異質二聚體區包含球形突起Fc鏈(突起))。
於另一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含P-CAD VH或CD3 VH，(ii)子結構域2A，若該子結構域2B包含CD3 VH，則其包含P-CAD VL，或者若該子結構域2B包含P-CAD VH，則其包含CD3 VL，且該子結構域2B和子結構域2A可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使該子結構域2B和子結構域2A不相聯結以形成表位結合位點；並可包含第二異質二聚體提升結構域，該第二異質二聚體提升結構域包含：(i)在子結構域2A上之半胱胺酸連接子(連接子2)及(ii)Fc區，其具有經改變之CH2及/或CH3結構域以包含共價連接至該連接子2之球形突起Fc鏈(突起)(若該第一異質二聚體區包含孔Fc鏈(腔))或孔Fc鏈(腔)(若該第一異質二聚體區包含球形突起Fc鏈(突起))。
於一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含P-CAD VL及(ii)子結構域2A，其包含CD3 VH。於另一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含CD3 VL及(ii)子結構域2A，其包含P-CAD VH。於進一步之態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含P-CAD VH及(ii)子結構域2A，其包含CD3 VL。於另一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構 域2，其包含(i)子結構域2B，其包含CD3 VH及(ii)子結構域2A，其包含P-CAD VL。
於LP-DART之另一態樣中，該子結構域1A和子結構域2A可相聯結以形成第一結合位點，其具有結合至在CD3或P-鈣黏蛋白上之表位的VL/VH結合結構域區，且該子結構域1B和子結構域2B可相聯結以形成第二結合位點，其具有結合至在P-鈣黏蛋白或CD3上之表位的VL/VH結合結構域區。
該第一多肽鏈(1)和第二多肽鏈(2)可彼此共價鍵結，例如在位於該第一和第二異質二聚體提升結構域之內的半胱胺酸殘基處。於一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域之連接子2中的半胱胺酸殘基和該第二異質二聚體提升結構域之連接子2中的半胱胺酸殘基可藉由至少一個二硫鍵連接。
於本發明之一態樣中，該CD3 VL可包含SEQ ID NO：48之序列且該CD3 VH可為選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：47和89。於另一態樣中，該P-CAD VL可為選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23且P-CAD VH可為選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24。於一態樣中，該甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)可包含選自由下列所組成之群組的序列：GGGSGGGG(SEQ ID NO：68)和GGGGSGGGG(SEQ ID NO：69)。
於本發明之另一態樣中，該半胱胺酸連接子(連接子2)可包含具有序列CPPCP(SEQ ID NO：60)之截短的IgG1鉸鏈區及至少一個在該鉸鏈區前之甘胺酸殘基。於一態樣中，該連接子2可包含選自由下列所組成之群組的序列：GCPPCP(SEQ ID NO：73)、GGTGGCPPCP(SEQ ID NO：74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：75)和GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：76)。
於一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域可包含Fc區，其具有經改變之CH2及/或CH3結構域以包含含有SEQ ID NO：63之序列的球形突起Fc鏈(突起)或含有SEQ ID NO：64之序列的孔Fc鏈(腔)。於另一態樣中，該第二異質二聚體提升結構域可包含Fc區，其具有經改變之CH2及/或CH3結構域以包含含有SEQ ID NO：63之序列的球形突起Fc鏈(突起)(若該第一異質二聚體區包含孔Fc鏈(腔))或含有SEQ ID NO：64之序列的孔Fc鏈(腔)(若該第一異質二聚體區包含球形突起Fc鏈(突起))。
表2和第32A和32B圖提供LP-DART蛋白之第一和第二多肽鏈的胺基酸序列，該LP-DART蛋白具有本文所描述之各種不同的P-鈣黏蛋白和CD3抗體。SEQ ID NO：117至124提供之對應的核苷酸序列參看括號中者。
人IgG1 CH2-CH3中之效應子無效突變和移除C端Lys
修飾人IgG1之Fc區以移除該經常在轉譯後裂解之C-端賴胺酸殘基，並使用標準之引物定向的PCR誘變法引入突變L234A、L235A和G237A至因結合至FcγR Ⅲ的扁圓的效應子功能(效應子無效表型)。
人IgG1 CH2-CH3中之孔中球形突起(knobs-in-holes)突變
“孔中球形突起”為本技藝中已知之用於將抗體重鏈同型二聚體進行遺傳工程處理以使之異質二聚體化的有效設計策略。在此方法中，“球形突起”變體係藉由以較大之胺 基酸替換IgG1之Fc區的一個鏈中之小胺基酸(例如Y349C和T366W)來取得。該“球形突起”係設計成插入Fc區之互補鏈的CH3結構域內之“孔”中，該孔係經由以較小之殘基替換較大之殘基(例如S354C、T366S、L368A和Y407V)來創建。
該孔中球形突起之命名類似於突起和腔之命名且可互換使用。
“突起”或“球形突起”係指至少一個從該第一多肽之界面突出的胺基酸側鏈，因此其可可定位在相鄰界面(即，該第二多肽之界面)中之補償性腔中以藉此穩定該異質二聚體，因而較有利於形成異質二聚體，勝過，例如形成同質二聚體。該突起可能存在於該原始界面或可以合成方式引入(例如經由改變編碼該界面之核酸)。通常，編碼該第一多肽之界面的核酸係經過修改成編碼該突起。為了實現此點，以編碼至少一個具有較該“原始”胺基酸殘基更大之側鏈體積的“輸入”胺基酸殘基的核酸替換該編碼至少一個第一多肽之界面中的“原始”胺基酸殘基之核酸。被替換之原始殘基的數目之上限為該第一多肽之界面中的殘基總數。
某些用於形成突起的輸入殘基通常為天然存在之胺基酸殘基且較佳地，選自精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)和色胺酸(W)。
“腔”或“孔”係指從該第二多肽之界面凹陷，因此可容納在該第一多肽之相鄰界面上的對應突起的至少一個胺基 酸側鏈。該腔可存在於原始界面中或可以合成方式引入(例如藉由改變編碼該界面之核酸)。通常，編碼該第二多肽之界面的核酸被修改以編碼該腔。為了實現此點，以編碼至少一個具有較該“原始”胺基酸殘基更小之側鏈體積的“輸入”胺基酸殘基的DNA替換編碼在該第二多肽之界面中的至少一個“原始”胺基酸殘基的核酸。被替換之原始殘基的數目之上限為該第二多肽之界面中的殘基總數。
某些用於形成腔的輸入殘基通常為天然存在之胺基酸殘基且較佳地，選自丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)和纈胺酸(V)。
“原始”胺基酸殘基為被“輸入”殘基替換之胺基酸殘基，該“輸入”殘基可具有較該“原始”殘基更小或更大之側鏈體積。該輸入之胺基酸殘基可為天然存在或非天然存在之胺基酸殘基，但較佳為前者。“天然存在”之胺基酸殘基意指由遺傳密碼編碼的那些殘基。“非天然存在”之胺基酸殘基意指非由遺傳密碼編碼的殘基，但其可與該多肽鏈中之相鄰胺基酸殘基共價結合。非天然存在之胺基酸殘基的實例為正白胺酸、鳥胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸及其他胺基酸殘基類似物，諸如，例如描述於Ellman et al.,Meth.Enzym.202：301-336(1991)中者。本發明之方法涉及替換至少一個原始胺基酸殘基，但可替換一個以上之原始殘基。通常，該第一或第二多肽之界面中可包含之被替換的原始胺基酸殘基不超過全部殘基數。
該突起或球形突起“可定位”在腔或孔中，此意指該分 別在第一多肽和第二多肽之界面上的突起和腔之空間位置及該突起和腔之尺寸為使得該突起可位於該腔內而不會顯著干擾該第一和第二多肽在界面處之正常聯結。因為突起，諸如Tyr、Phe和Trp通常不會從界面的軸垂直延伸，突起與對應之腔的比對係依賴根據三維結構塑造之突起/腔對的模型，諸如藉由X射線晶體學或核磁共振(NMR)所取得者。此可使用本技藝中被廣為接受之技術實現。
因此，為了有利於所產生之Fc區的異質二聚體化，引入互補性突變，從而使得各Fc鏈可攜帶一組突變，用於球形突起(或突起)Fc鏈(SEQ ID NO：63)的突變為Y349C和T366W，或者用於孔(或腔)Fc鏈(SEQ ID NO：64)的突變為S354C、T366S、L368A和Y407V(如表3中所提供者)。當被共轉染入合適之哺乳動物宿主中時，編碼SEQ ID NO：63和64之胺基酸序列的DNA製造Fc區，此Fc區主要為與一個孔(或腔)Fc鏈相聯結之雙特異性異質二聚體加工的球形突起(或突起)Fc鏈。
使用重疊引物延伸PCR，引入5’BspEI限制酶識別序 列TCCGGA(SEQ ID NO：67)以用於將該球形突起(突起)和孔(腔)Fc鏈分殖入含有3’BspEI位點之各DART鏈中。此限制位點編碼在DART-Fc交界處框架內插入胺基酸絲胺酸和甘胺酸(ser-gly)。依實施例6中之描述建構抗P-鈣黏蛋白/抗CD3 LP-DART蛋白。
在熱穩定性研究中，本發明之抗P-鈣黏蛋白/抗CD3 LP-DART蛋白係穩定防止聚集且為針對人CD3和P-鈣黏蛋白之強力的雙特異性雙功能抗體-Fc融合物。該孔中球形突起Fc結構域允許提升在CHO細胞中之表現並改善純化從而獲致高純度之所需異質二聚體。在Fc結構域內之經遺傳工程處理之突變廢止FcγR結合，因而有可能避免ADCC介導之T細胞耗竭。此外，如差示掃描量熱法(DSC)和強制聚集分析所顯示者，當與臨床核准之單株抗體相比較時，將Fc結構域納入DART蛋白可增強該分子之穩定性。此外，該Fc結構域改善該藥代動力學變化形廓。
MP3 DART
第6和7圖分別為N端MP3-DART和C端MP3-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體的示意圖示。該等MP3-DART蛋白係由三個多肽鏈所組成：第一多肽鏈(1)、第二多肽鏈(2)和第三多肽鏈(3)。
於本發明之一態樣中，如第6圖中所示之N-端MP3-DART可包含(依N端至C端之方向)：第一多肽鏈(1)，其 包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VL結合區(P-CAD VL)或抗CD3抗體之VL結合區(CD3 VL)，(ii)子結構域1B，若該子結構域1A包含CD3 VL，則其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VH結合區(P-CAD VH)，或者若該子結構域1A包含P-CAD VL，則其包含抗CD3抗體之VH結合區(CD3 VH)，且該子結構域1A和子結構域1B可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使該子結構域1A和子結構域1B不相聯結以形成表位結合位點；並可包含第一異質二聚體提升結構域，該第一異質二聚體提升結構域包含：(i)在子結構域1B上之半胱胺酸連接子(連接子2)及(ii)在連接子2上之半胱胺酸肽1，及(iii)具有IgG結構域之CH2及/或CH3結構域的Fc區，其共價連接至該肽1。
於本發明之另一態樣中，如第7圖中所示之C-端MP3-DART可包含(依N端至C端之方向)：第一多肽鏈(1)，其包含：第一異質二聚體提升結構域，其包含(i)半胱胺酸肽1，(ii)具有IgG Fc結構域之CH2及/或CH3結構域的Fc區，和(iii)在Fc區上之連接子3；及結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VL結合區(P-CAD VL)或抗CD3抗體之VL結合區(CD3 VL)，(ii)子結構域1B，若該子結構域1A包含CD3 VL，則其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VH結合區(P-CAD VH)，或者若該子結構域1A包含P-CAD VL，則其包含抗CD3抗體之VH結合區(CD3 VH)，且該子結構域1A和子結構 域1B可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使該子結構域1A和子結構域1B不相聯結以形成表位結合位點，和(iv)在子結構域1B上之半胱胺酸連接子(連接子2)。
於另一態樣中，該N-端MP3-DART或C-端MP3-DART之第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含P-CAD VH或CD3 VH，(ii)子結構域1B，若該子結構域1A包含CD3 VH，則其包含P-CAD VL，或者若該子結構域1A包含P-CAD VH，則其包含CD3 VL。
於一態樣中，該N-端MP3-DART或C-端MP3-DART之第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含P-CAD VL及(ii)子結構域1B，其具有CD3 VH。於另一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含CD3 VL和(ii)子結構域1B，其包含P-CAD VH。於進一步之態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其包含P-CAD VH和(ii)子結構域1B，其包含CD3 VL。於另一態樣中，該第一多肽鏈(1)可包含：結構域1，其包含(i)子結構域1A，其具有CD3 VH和(ii)子結構域1B，其包含P-CAD VL。
於另一態樣中，該N-端MP3-DART或C-端MP3-DART之第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，根據所選擇之用於該MP3-DART之第一多肽鏈 的VL結構域，其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VL結合區(P-CAD VL)或抗CD3抗體之VL結合區(CD3 VL)，(ii)子結構域2A，若該子結構域2B包含CD3 VL，則其包含抗P-鈣黏蛋白抗體之VH結合區(P-CAD VH)，或者若該子結構域2B包含P-CAD VL，則其包含抗CD3抗體之VH結合區(CD3 VH)且該子結構域2B和子結構域2A可藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)共價連接，從而使該子結構域2B和子結構域2A不相聯結以形成表位結合位點；並可包含第二異質二聚體提升結構域，此第二異質二聚體提升結構域包含在子結構域2A上之半胱胺酸連接子(連接子2)。
於另一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含P-CAD VH或CD3 VH，(ii)子結構域2A，若該子結構域2B包含CD3 VH，則其包含P-CAD VL，或者若該子結構域2B包含P-CAD VH，則其包含CD3 VL。
於一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含P-CAD VL和(ii)子結構域2A，其具有CD3 VH。於另一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含CD3 VL和(ii)子結構域2A，其包含P-CAD VH。於進一步之態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其包含P-CAD VH和(ii)子結構域2A，其包含CD3 VL。於另一態樣中，該第二多肽鏈(2)可包含：結構域2，其包含(i)子結構域2B，其具有CD3 VH和(ii)子結 構域2A，其包含P-CAD VL。
於一態樣中，該N-端MP3-DART或C-端MP3-DART之第三多肽鏈(3)可包含(依N端至C端之方向)：第三異質二聚體提升結構域，其包含(i)半胱胺酸肽1和(ii)具有IgG Fc結構域之CH2及/或CH3結構域的Fc區。
於本發明之一態樣中，該子結構域1A和子結構域2A可相聯結以形成具有VL/VH區之第一結合位點，其結合至在CD3或P-鈣黏蛋白上之表位，而該子結構域1B和子結構域2B可相聯結以形成具有VL/VH區之第二結合位點，其結合至在P-鈣黏蛋白或CD3上之表位。
該第一多肽鏈(1)和第二多肽鏈(2)可彼此共價結合，例如在位於該第一和第二異質二聚體提升結構域內之半胱胺酸殘基處。於一態樣中，該在第一異質二聚體提升結構域上之連接子2中的半胱胺酸殘基和在第二異質二聚體提升結構域上之連接子2中的半胱胺酸殘基可藉由至少一個二硫鍵連接。
該第一多肽鏈(1)之第一異質二聚體提升結構域及第三多肽鏈(3)之第三異質二聚體提升結構域可彼此相聯結以形成免疫球蛋白Fc區。該第一多肽鏈(1)和第三多肽鏈(3)可彼此共價結合，例如在位於該第一和第三異質二聚體提升結構域內之半胱胺酸殘基處。於另一態樣中，該在第一異質二聚體提升結構域上之肽1中的半胱胺酸殘基及在第三異質二聚體提升結構域上之肽1中的半胱胺酸殘基可藉由至少一個二硫鍵連接。
於本發明之一態樣中，該CD3 VL可包含SEQ ID NO：48之序列且該CD3 VH可為選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：47和89。於另一態樣中，該P-CAD VL可為選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23且P-CAD VH可為選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24。於一態樣中，該甘胺酸-絲胺酸連接子(連接子1)可包含選自由下列所組成之群組的序列：GGGSGGGG(SEQ ID NO：68)和GGGGSGGGG(SEQ ID NO：69)。
於本發明之一態樣中，該半胱胺酸連接子(連接子2)可包含選自由下列所組成之群組的序列：GFNRGEC(SEQ ID NO：70)和GVEPKSC(SEQ ID NO：71)。於另一態樣中，該第一異質二聚體提升結構域之半胱胺酸連接子(連接子2)可包含GFNRGEC之序列(SEQ ID NO：70)且該第二異質二聚體提升結構域之半胱胺酸連接子(連接子2)可包含GVEPKSC之序列(SEQ ID NO：71)。
於某些態樣中，該第三異質二聚體提升結構域之連接子3可包含KAPSSSPME之序列(SEQ ID NO：77)。
於某些態樣中，該在第一和第三異質二聚體提升區上之肽1可包含具有序列CPPCP(SEQ ID NO：60)之截短的IgG1鉸鏈區。於一態樣中，該肽1可包含，但不限於DKTHTCPPC之序列(SEQ ID NO：96)。
本文所描述之球形突起和孔策略可用於MP3-DART 構建體中以確保該第一和第三多肽鏈正確配對。類似於本文中所描述之LP-DART，人IgG1之Fc區可經修飾以除去該經常在轉譯後裂解之C-端賴胺酸殘基，並引入突變L234A、L235A和G237A至因為結合至FcγR Ⅲ的扁圓的效應子功能(效應子無效表型)。於一態樣中，球形突起係藉由修飾天然IgG Fc區，使其包含修飾的T366W來創建。於另一態樣中，孔係藉由修飾天然IgG Fc區，使其包含修飾的T366S、L368A和Y407V來創建。較佳地，該第一多肽鏈包含該球形突起且該第三多肽鏈包含孔。為了協助從該第三多肽鏈之任何同型二聚體純化MP3-DARTTM，較佳地，該第三多肽鏈之CH2和CH3結構域的蛋白A結合位點係藉由位置435(H435R)處之胺基酸取代發生突變。因此，該第三多肽鏈之任一同型二聚體不會結合至蛋白A，而該MP3-DARTTM保留其經由在該第一多肽鏈上之蛋白A結合位點結合蛋白A之能力。因此，該球形突起(或突起)Fc鏈可具有SEQ ID NO：65之序列而該孔(或腔)Fc鏈可具有SEQ ID NO：66之序列(如表4中所提供者)。
表5描述以本文所描述之各種不同P-鈣黏蛋白和CD3-1抗體建構之示例性N-端MP3-DART和C-端MP3-DART蛋白的第一(1)、第二(2)和第三(3)多肽鏈。SEQ ID NO：125-158提供表5中所描述之N-端和C-端MP3-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體之多肽鏈1、2和3的胺基酸和核苷酸序列(參考括號中者)。
經遺傳工程處理之半胱胺酸殘基
於某些態樣中，該雙特異性異質二聚體雙功能抗體之每個多肽鏈可經遺傳工程處理以包含至少一個半胱胺酸殘基，該至少一個半胱胺酸殘基可與本發明之另一多肽鏈上的對應半胱胺酸殘基交互作用以形成鏈間二硫鍵。該鏈間二硫鍵可用於穩定該雙功能抗體分子，提升表現並在重組 系統中回復，導致穩定且一致之調製劑並改善該經分離及/或純化之產物在活體內的穩定性。該半胱胺酸殘基可以單一胺基酸形式或該多肽鏈之任一部分中的較大胺基酸序列(例如鉸鏈區)之一部分的形式引入。於一特定之態樣，至少一個半胱胺酸殘基經遺傳工程處理以出現在多肽鏈之C端。
癌症治療
本發明包含用於治療、預防或管理個體中之癌症的方法和組成物，其包含投予該個體治療上有效量之根據本發明進行遺傳工程處理的雙特異性異質二聚體雙功能抗體，該分子進一步結合癌抗原。本發明之分子可於預防、抑制、減少原發性腫瘤和轉移之癌細胞的生長及/或消退特別有用。雖然不欲受特定之作用機制的束縛，本發明之分子可介導可能導致腫瘤清除、腫瘤減少或彼等之組合的效應子功能。
因此，本發明提供預防或治療特徵為P-鈣黏蛋白癌抗原之癌症的方法，該方法藉由將雙特異性異質二聚體雙功能抗體進行遺傳工程處理以使其免疫特異性地識別在T細胞上之P-鈣黏蛋白癌抗原和CD3抗原。該已根據本發明進行遺傳工程處理之雙特異性異質二聚體雙功能抗體係用於預防或治療癌症，因為其具有由抗CD3誘導之活化的殺手T細胞之細胞毒性活性。
因此，本發明之一態樣提供治療有需要治療P-鈣黏蛋 白陽性癌症之患者中的P-鈣黏蛋白陽性癌症之方法，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：乳癌、結腸直腸癌、卵巢癌、胃癌、甲狀腺癌、前列腺癌、子宮頸癌、胰腺癌、肺癌(包含，但不限於非小細胞肺癌和小細胞肺癌)、膀胱癌、肝癌、子宮內膜癌、頭頸癌、睾丸癌及膠質母細胞癌。
本發明亦提供本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體於治療本文所定義之癌症之方法中的用途。此外，本發明提供本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體於製造用於治療如本文所定義之癌症的藥物之用途。
於一特定之態樣中，相對於沒有本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體存在時癌細胞生長，本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體抑制或減少癌細胞生長至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。
於一特定之態樣中，相較於沒有本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體存在時，本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體可增加殺死細胞或增加抑制或減少癌細胞增長至少5%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%。
本發明進一步包含將本發明之分子與熟習本技藝之人士所已知之用於治療或預防癌症之其他療法組合投予，該用於治療或預防癌症之其他療法包含，但不限於目前之標準和實驗性化療、生物療法、免疫療法、放射療法或手術。於一些態樣中，本發明之分子可與治療或預防上有效量之一或多種作用劑、治療性抗體或其他熟習本技藝之人士所已知之用於治療及/或預防癌症的作用劑組合投予。
因此，用於治療癌症之方法包含投予有需要治療癌症之患者有效量之本發明的雙特異性異質二聚體雙功能抗體和化療劑的組合。該等組合治療可分別、依序或同時投予。適合之化療劑包含，但不限於5-氟尿嘧啶、天門冬醯胺酶、BCNU、博萊黴素(bleomycin)、加利車黴素(calicheamicin)、喜樹鹼(camptothecin)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、癌得星(cytoxan)、達卡巴嗪(dacarbazine)、更生黴素(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、多西紫杉醇(docetaxel)、阿黴素(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)、羥基脲、伊達比星(idarubicin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、L-天門冬醯胺酶、巰嘌呤(mercaptopurine)、甲胺蝶呤(methotrexate)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、氮芥、亞硝基脲(nitrosourea)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、普卡黴素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbizine)、紫杉醇(taxol)、硫 鳥嘌呤(thioguanine)、托泊替康(topotecan)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)和長春瑞濱(vinorelbine)。
本文所提供之投予劑量和頻率係包含在術語治療上有效和預防上有效之內。該劑量和頻率可進一步根據特異於各患者之因素而有不同，其取決於投予之特定治療或預防劑、癌症之嚴重性和類型、投予途徑及該患者之年齡、體重、反應和過往病史。合適之方案可由熟習本技藝之人士經由考慮該等因素，並依照，例如文獻中報導及Physician’s Desk Reference(56版，2002)中建議之劑量來選擇。
本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體可為用於投予之醫藥組成物形式，該醫藥組成物係配製成適合用於所選擇之投予模式及醫藥上可接受之稀釋劑或賦形劑(諸如緩衝劑、表面活性劑、防腐劑、增溶劑、等張劑、穩定劑、載體和類似物)。Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.,Easton Pa.,18th ed.,1995提供從業者大致上已知之配製技術概要。
這些醫藥組成物可藉由本技藝中已知之可達成一般預期之治療癌症的目的之任何方式來投予。該投予路線可為胃腸道外途徑，本文中所定義之胃腸道外途徑包含，但不限於靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下和關節內注射和輸注之投予模式。投予之劑量可取決於接受者之年齡、健康和體重、同時進行之治療(如果有)種類、治療頻率及期望之 效果的性質。
在本發明之範圍內的組成物包括所有其中存在能有效取得所需之治療癌症的醫療效果之雙特異性異質二聚體雙功能抗體的量之組成物。雖然患者彼此間的個別需求可能有所不同，測定所有成分之有效量的最佳範圍係在一般技術之臨床醫師的能力範圍之內。
本發明提供可用於上述方法中之套組。於一態樣中，套組包含本發明之雙特異性異質二聚體雙功能抗體。於另一態樣中，套組進一步包含在一或多個容器中之一或多種用於治療癌症之其他預防或治療劑。於某些態樣中，該其他預防或治療劑為化療劑。於其他態樣中，該預防或治療劑為生物或激素治療。
較佳地，本發明之數種醫藥組成物、預防或治療劑之態樣在用於人體中之前先在活體外、細胞培養系統及動物模型有機體，諸如囓齒類動物模型系統中測試所需之治療活性。
本發明之預防及/或治療方案的毒性和效力可能藉由標準醫藥程序在細胞培養或實驗動物中測定，例如用於測定LD50(造成50%群體死亡之劑量)和ED50(在50%群體中治療有效之劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比為治療指數且其可以LD50/ED50比表示。展現大的治療指數之預防及/或治療劑為較佳者。
此外，可使用熟習本技藝之技術人員所已知之任何分析來評估本文所揭示之療法或組合療法於治療或預防癌症 之預防及/或治療用途。
生物寄存
本發明之代表性物質於2013年12月20日寄存在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，美國維吉尼亞州馬納薩斯(Manassas)大學大道(University Boulevard)10801號，20110-2209。具有ATCC登錄編號為PTA-120809之載體153 LP-DARTA包含編碼P-鈣黏蛋白LP-DART(Fc融合雙功能抗體)鏈A之重組人DNA插入子，而具有ATCC登錄編號為PTA-120810之載體153 LP-DART B包含編碼P-鈣黏蛋白LP-DART(Fc融合雙功能抗體)鏈B之重組人DNA插入子。其寄存係根據布達佩斯條約中關於用於專利程序目的之微生物寄存的國際認可條款和根據布達佩斯條約之管理條款進行。這確保該寄存之培養物從寄存之日起可維持存活30年。該寄存之培養物將根據布達佩斯條約的條款由ATCC予以提供，並受制於輝瑞公司和ATCC之間的協議，此確保該寄存之培養物的後代在相關之美國專利發佈時或任何美國或外國專利申請案對公眾公開(以先行者為準)時能被永久和不受限制地取得，並保證美國專利商標局專員所決定之可取用該寄存之培養物的後代之個人將有權按35 U.S.C.第122節及根據之比此35 U.S.C.第122節之專員規則(包括37 C.F.R.第1.14節，特別參考886OG 638)來取得。
本申請案之受讓人已同意若寄存物質之培養在合適之 條件下培養而死亡或損失或被破壞，該物質將在通知時以另一相同物質及時更換。寄存物質之可用性並不能被解釋為被許可在違反任何政府當局根據其專利法所授予的權利下實施本發明。
下列用於實行本發明之特定態樣的實施例僅用於說明目的且不欲以任何方式限制本發明的範圍。
第1A和1B圖提供四個LP-DART P-鈣黏蛋白/CD3雙特異性異質二聚體雙功能抗體之替換代表的示意圖，其具有包含經優化之Fc區的第一異質二聚體提升結構域和第二異質二聚體提升結構域以經由“在孔中之球形突起”聯結來聯結。
第2圖提供VF-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體之示意圖，該VF-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體同時對準並活化T細胞(經由CD3抗原)和腫瘤細胞(經由P-鈣黏蛋白抗原)，其具有第一多肽鏈(1)，其中第一異質二聚體提升結構域包含C端肽，此C端肽與第二多肽鏈(2)之第二異質二聚體提升結構域的C端肽形成用於穩定之二硫鍵。
第3圖提供具有第一多肽鏈(1)和第二多肽鏈(2)之組裝的VF-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體之示意圖，其中第一異質二聚體提升結構域(諸如SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：71，詳細描述於下文中)和第二異質二 聚體提升結構域(諸如SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：70，取決於該第一異質二聚體提升結構域之選擇)包含一半胱胺酸殘基。
第4圖提供經組裝之EK-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體之示意圖，該EK-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體具有第一多肽鏈(1)(其中第一異質二聚體提升結構域包含形成帶負電荷之α-螺旋卷(E-卷)的麩胺酸富集區)和第二多肽鏈(2)(其中第二異質二聚體提升結構域包含形成帶正電荷之螺旋卷(K-卷)的賴胺酸富集區)。
第5圖提供經組裝之LP-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體之示意圖，該LP-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體具有包含經優化之Fc區的第一異質二聚體提升結構域和第二異質二聚體提升結構域以經由“在孔中之球形突起”聯結來聯結。
第6圖提供稱為MP3-DART之具有Fc結構域的替換之雙特異性異質二聚體雙功能抗體的結構。該雙特異性異質二聚體雙功能抗體係連接至Fc結構域之N端側，因此被稱為“N-端MP3-DART”。該N-端MP3-DART包含示意圖表示之第一、第二和第三多肽鏈。N-端MP3-DART之最終結構表示在圖中。
第7圖提供稱為MP3-DART之具有Fc結構域的替換之雙特異性異質二聚體雙功能抗體的結構。該雙特異性異質二聚體雙功能抗體係連接至Fc結構域之C端側，因此被稱為“C-端MP3-DART”。該C-端MP3 DART包含示意 圖表示之第一、第二和第三多肽鏈。C-端MP3-DART之最終結構表示在圖中。
第8圖提供線性回歸分析，其比較細胞毒性T淋巴細胞(CTL)之活性對相關之細胞表面P-鈣黏蛋白表現。
第9圖顯示在小鼠HCT116結腸直腸癌模型中，177 EK-DART在活體內降低腫瘤體積之能力。
第10圖顯示在小鼠HCT116結腸直腸癌模型中，153 EK-DART在活體內降低腫瘤體積之能力。
第11圖顯示在小鼠HCT116結腸直腸癌模型中，154 EK-DART在活體內降低腫瘤體積之能力。
第12圖顯示在小鼠HCT116結腸直腸癌模型中，35 EK-DART在活體內降低腫瘤體積之能力。
第13圖顯示在小鼠HCT116結腸直腸癌模型中，153 LP-DART在活體內降低腫瘤體積之能力。
第14圖顯示在小鼠HCT116結腸直腸癌模型中，153 LP-DART在活體內降低腫瘤體積之能力。
第15圖顯示在小鼠Du145前列腺癌模型中，153 LP-DART在活體內降低腫瘤體積之能力。
第16圖顯示在小鼠H1650肺癌模型中，153 LP-DART在活體內降低腫瘤體積之能力。
第17A-17D圖顯示在已建立之腫瘤+植入之人T細胞模型中，153 LP-DART在活體內降低腫瘤體積之能力，第17E圖顯示該腫瘤體積之單向ANOVA分析。
第18A和18B圖顯示在已建立之腫瘤人T細胞繼承 性轉移模型中，153 LP-DART在活體內降低腫瘤體積之能力。
第19圖顯示在P-鈣黏蛋白陽性患者來源之結腸直腸腫瘤異種移植物中，153 LP-DART在活體內降低腫瘤體積之能力。
第20圖顯示在腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)之153 LP-DART介導劑量依賴性增加。
第21A-21D圖提供用於評估經螢光團標記之153 LP-DART和T細胞的性質之玻管內分析。
第22A-22D圖提供在HCT116異種移植模型中之153 LP-DART的生物分佈和靶向，其係採用縱向FMT成像。
第23A-23C圖顯示來自FMT成像、研究之藥物動力學數據(ELISA)。
第24A圖顯示出經螢光團標記之T細胞活性和未經標記之T細胞活性的評估，而第24B圖顯示出在HCT116腫瘤模型中經螢光團標記之T細胞的細胞進踪動力學，其係使用FMT成像(活體內)。
第25圖提供經設計之用於晶體學的DART構建體之示意團，其具有共價連接至P-CAD VH結構域之命名為“6XHIS”的C-端His標籤和共價連接至CD3 VH結構域之命名為“FLAG”的C-端FLAG。
第26圖提供晶體35 DART蛋白之晶體結構的圖示。
第27圖提供晶體35 DART蛋白的圖示，其顯示用於抗CD3 CDR區和抗P-CAD CDR區之抗原結合位點。
第28圖提供晶體35 DART蛋白變體之示意圖，該晶體35 DART蛋白變體透過在含有大的內部空隙/孔的域間界面中之定點誘變而具有更穩定之域間聯結，該大的內部空隙/孔中可填充具有各種胺基酸之增加的側鏈體積。
第29圖提供晶體35 DART蛋白之晶體結構的圖示，該晶體35 DART蛋白具有各種不同之二硫鍵位置(Cys-Cys位點)以降低該二硫鍵之溶劑可及性並降低連接子之長度。
第30A和30B圖提供本發明之VF-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體之第一和第二多肽鏈的胺基酸序列。
第31A和31B圖提供本發明之EK-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體之第一和第二多肽鏈的胺基酸序列。
第32A和32B圖提供本發明之LP-DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體之第一和第二多肽鏈的胺基酸序列。
第33圖提供本發明之DART雙特異性異質二聚體雙功能抗體之第一和第二多肽鏈的胺基酸序列。
第34圖提供用於P-鈣黏蛋白153 LP-DART之表位繪測的P-鈣黏蛋白-胞外結構域(ECD)-Fc融合蛋白構建體。
第35圖提供完整長度之P-鈣黏蛋白表位序列(UniProt P22223，CADH3，人鈣黏蛋白-3)。
實施例1 P-鈣黏蛋白抗體和雙特異性異質二聚體雙功能抗體之產生
構建雙特異性異質二聚體雙功能抗體以評估各抗體之重組製造、純化和結合特性。藉由本文所描述之重組表現系統製造該經親和純化之雙特異性異質二聚體雙功能抗體。ELISA和SPR分析進一步揭露該共價雙特異性異質二聚體雙功能抗體同時對靶抗原，P-鈣黏蛋白和CD-3表現出親和力且可同時結合二種抗原。
A.噬菌體展示
利用本技藝中已知之技術，以包含衍生自未經免疫化之人供體的單鏈片段可變(scFv)之噬菌體顯示庫鑑定結合至該P-鈣黏蛋白之胞外結構域(ECD)的scFv部分。藉由標準ELISA技術，在P-鈣黏蛋白蛋白構建體和P-鈣黏蛋白表現細胞上測量表現在該噬菌體表面上之scFv結合。
B.定序分析
使用習知方法，以引物5’GGAGATTTTCAACGTGAA 3’(SEQ ID NO：58)和5’CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG 3’(SEQ ID NO：59)將未純化之細菌甘油貯存物或純化之質粒形式的ScFv片段進行測序。
C.轉化成DART
選擇顯示出強力之重組P-鈣黏蛋白或細胞表面結合(>3x背景或陰性細胞之結合)的ScFv片段以用於分殖入DART蛋白質。DART設計和選殖方法先前已有描述(Johnson et al,J Mol Biol,399：436-449,2010；Moore et al,Blood,117(17)：4542-51，2011)。用於改造來自噬菌體展示庫之新穎抗P-鈣黏蛋白scFv的方法如下：以納入用於VH之BamHI/BspEI和用於VL之BssHII/BamHI的引物藉由標準聚合酶鏈反應(PCR)擴增片段。根據製造商的說明書(新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs))，以對應之限制性內切酶切斷片段。
為了產生DART表現載體，將抗P-鈣黏蛋白VH(P-CAD VH)或VL(P-CAD VL)scFv進行凝膠純化(QIAGEN®凝膠純化套組)並分別連接入含有抗CD3 VL(CD3 VL)或VH(CD3 VH)scFv之哺乳動物表現載體中。
為了產生如第2和3圖所示之VF-DART，該DART表現載體進一步包含各自具有半胱胺酸連接子(連接子2)之第一和第二異質二聚體提升結構域，諸如GFNRGEC (SEQ ID NO：70)或GVEPKSC(SEQ ID NO：77)。
為了產生如第4圖中所示之EK-DART，該DART表現載體進一步包含各自具有半胱胺酸連接子(連接子2)，諸如GGCGGG(SEQ ID NO：72)和E-卷結構域(SEQ ID NO：61)或K-卷結構域(SEQID NO：62)之第一和第二異質二聚體提升結構域。
為了產生如第1和5圖中所示之LP-DART，該DART表現載體進一步包含各自具有半胱胺酸連接子(連接子2)，諸如GCPPCP(SEQ ID NO：73)、GGTGGCPPCP(SEQ ID NO：74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：75)或GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：76)及“球形突起”Fc鏈(SEQ ID NO：63)或“孔”Fc鏈(SEQ ID NO：64)之第一和第二異質二聚體提升結構域。
除了來自噬菌體展示庫之新穎的抗P-鈣黏蛋白scFv外，亦將來自抗P-鈣黏蛋白臨床mAb PF-03732010VH(Zhang et al,Clin Cancer Res.16(21),5177-5188,2010)之VH和VL結構域分殖入上述各種DART表現載體中以作為陽性對照組。
然後，藉由將表現載體共同轉染入HEK 293細胞中來將DART蛋白瞬時表現在哺乳動物細胞中。使用與CNBr-活化之瓊脂糖4B(GE Healthcare，紐澤西州Piscataway)偶合之抗捲曲的卷mAb 15F1將保留P-鈣黏蛋白親和力之DART蛋白進行親和純化。藉由SDS-PAGE和SEC評估該純化之DART蛋白的生化性質。
表6提供藉由本文所描述之技術產生的抗P-鈣黏蛋白scFv選殖株之VL和VH胺基酸序列。根據Kabat之選殖株20和30的CDR下方有劃線。SEQ ID NO：97-116提供該對應之核苷酸序列(參考括號中者)。
表7a和7b分別提供使用Kabat和AbM編號命名之所產生的抗P-鈣黏蛋白VH scFv選殖株的CDR序列。
表7c中提供所產生之抗P-鈣黏蛋白VL scFv選殖株的CDR序列。
表8顯示在親和力成熟之P-鈣黏蛋白選殖株中發現的胺基酸突變。這些數據表明基於該解析之晶體結構的對VL/VH折疊和配體交互作用的潛在影響。CDR結合袋內之突變顯示出改善配體交互作用之潛力。CDR結合袋外所發現之突變表明改善VL/VH之折疊的作用。
表9提供藉由本文中所描述之技術產生之抗CD3 scFv選殖株的VL和VH胺基酸序列。
表10a和10b分別提供使用Kabat和AbM編號命名之所產生之抗CD3 VH scFv選殖株的CDR序列。
表10c提供所產生之抗CD3 VL scFv選殖株的CDR序列。
實施例2 構建抗P-鈣黏蛋白/抗人CD3 LP-DART
藉由PCR擴增抗P-鈣黏蛋白/抗人CD3 DART蛋白，從而使各DART蛋白在每一端含有一用於選殖入哺乳動物表現載體中之限制性內切酶選殖位點，參見表11和第33A和33B圖。
然後，將編碼該DART蛋白序列之核酸融合至各編碼 該經修飾之Fc構建體(例如該“球形突起”Fc鏈(SEQ ID NO：63)和“孔”Fc鏈(SEQ ID NO：64))的核酸，該經修飾之Fc構建體各自以半胱胺酸連接子(諸如GCPPCP(SEQ ID NO：73)、GGTGGCPPCP(SEQ ID NO：74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：75)和GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：76))連接至DART之C端。
PCR擴增後，以BspEI和Hind Ⅲ(5’DART選殖位點)或EcoRI(3’Fc選殖位點)其中之一分解DART和Fc鏈核酸二者。經由從瓊脂糖凝膠切除來將經分解之DNA分離出，接著在室溫下純化30分鐘，再連接入經Hind Ⅲ-EcoRI分解之表現載體中。然後，將連接物轉化入勝任之大腸桿菌DH5α中，並在37℃下，在含有100μg/mL羧苄青黴素(carbenicillin)之瓊脂糖平皿上生長一整夜。計算株落數，揀選後在YT-肉湯+100μg/mL羧苄青黴素中生長過夜，並使用標準方法分離出DNA。然後，在哺乳動物細胞中表現之前，將所有DNA構建體的二股進行測序。然後，將互補性構建體對共同轉染入含有HEK 293細胞(100萬個細胞/ml)的1L對數期培養物中。轉染後24小時，加入蛋白腖，使最終濃度為0.75%並在收穫前令細胞再另外生長5天。然後，收集耗盡之培養物，離心以去除細胞碎片，再通過20μm過濾器。然後，利用本技藝中已知之技術純化蛋白質。抗P-鈣黏蛋白/抗人CD3 LP-DART之示意實例顯示於第1A和1B圖中。
實施例3 P-鈣黏蛋白scFv-Fc和DART蛋白之結合性質
使用標準ELISA技術分析P-鈣黏蛋白scFv-Fc構建體(融合至人IgG Fc區之P-鈣黏蛋白VH和VL)和DART蛋白對P-鈣黏蛋白蛋白構建體及對P-鈣黏蛋白表現細胞之結合性質。表12中之數據證明噬菌體來源之P-鈣黏蛋白scFv-Fc構建體與重組人P-鈣黏蛋白具有強力結合且與鼠P-鈣黏蛋白沒有可檢測之結合。
P-鈣黏蛋白scFv-Fc在以細胞為基礎之ELISA中對各種P-鈣黏蛋白表現細胞類型的結合性質顯示於表13中。該噬菌體來源之P-鈣黏蛋白scFv-Fc構建體顯現出與H1650細胞及與SW480-huPcad和CHO-huPcad細胞類型具有強力結合。
如表14中所顯示者，本發明之抗P-鈣黏蛋白EK-DART蛋白質在ELISA格式中顯示出與H1650細胞上之細胞表面表現的P-鈣黏蛋白及與重組人P-鈣黏蛋白-Fc具有強力結合，但與其他鈣黏蛋白家族成員，E-鈣黏蛋白和VE-鈣黏蛋白則無結合。EK-DART係為E/K卷結構域建構體。PF EK-DART為利用如實施例1中所描述之來自抗P-鈣黏蛋白臨床mAb PF-03732010之VH和VL的陽性對照組。表14中之所有EK-DART蛋白包含CD3-2。
實施例4 DART蛋白之表面電漿共振(SPR)分析
使用BIACORE®3000生物傳感器(GE Healthcare)藉由SPR分析EK-DART蛋白對P-鈣黏蛋白和CD3之結合親和力。依製造商之建議，藉由胺偶合套組將抗原huCD3εδ和人P-鈣黏蛋白-Fc或人/食蟹猴/鼠P-鈣黏蛋白-ECD其中之一固定在CM-5傳感器晶片上。表15顯示出噬菌體來源之EK-DART蛋白對食蟹猴(“cyno”)P-鈣黏蛋白ECD之 結合親和力，而表16顯示出噬菌體來源之EK-DART蛋白對人可溶性CD3蛋白之結合親和力。表15和16中之所有EK-DART蛋白包含CD3-2。
表17中，該Biacore數據顯示具CD3-2之經優化的EK-DART蛋白對cyno P-鈣黏蛋白ECD的結合親和力與具CD3-2之親代35 EK-DART的比較。表17中之所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。
表18中，該Biacore數據證明親代35 EK-DART和經優化之EK-DART蛋白對可溶性CD3δε之結合親和力。表18中之所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。
表19中顯示出各種DART格式在pH7.4下對cyno P-鈣黏蛋白之結合親和力。比較VF、EK、LP、MP3-C端及MP3-N-端格式中之DART蛋白與P-鈣黏蛋白選殖株153 VH和VL結合結構域。153 VF-DART顯示出最高之結合親和力和最快之進行速率。153 EK-DART和153 LP-DART蛋白之KD值類似。速率較慢所指示者，153 MP3-DART蛋白對cyno P-鈣黏蛋白之結合親和力稍低。該%活性(Rmax)低，所有153 DART蛋白質之Rmax均類似。除了包含CD3-2的153 EK-DART外，表19中之所有DART蛋白均包含CD3-1。
表20中顯示出各種DART格式在pH7.4下對shCD3(可溶性人CD3)之結合親和力。比較VF、EK、LP、MP3-C端及MP3-N-端格式之DART蛋白與P-鈣黏蛋白選殖株#153 VH和VL結合結構域。153 VF-DART顯示出對shCD3之進行速率最快且結合親和力最高。153 EK、LP和MP3 DART蛋白對shCD3之親和力類似。對shCD3之%活性(Rmax)較所觀察到之對cyno P-鈣黏蛋白的%活性為佳。除了包含CD302的153 EK-DART外，表20中之所有DART蛋白均包含CD3-1。
實施例5 P-鈣黏蛋白DART蛋白之表徵
使用差示掃描量熱(DSC)分析決定噬菌體來源之EK-DART蛋白之熱穩定性的特徵。表21顯示該P-鈣黏蛋白EK-DART蛋白具有有利之熱變化形廓，其Tm1轉變溫度高於65℃。強制聚集分析證明P-鈣黏蛋白EK-DART蛋白在40℃下對熱壓力之抗性。表21中之所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。
親和力成熟之P-鈣黏蛋白EK-DART蛋白之其他生物物理性質顯示於表22a中。這些分子之理論pI約為8.5。表22a中之所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。
表22b顯示出親和力成熟之P-鈣黏蛋白VF-DART蛋白的功能性表徵。來自二種類型之細胞毒性T淋巴細胞(CTL)分析的數據顯示出沒有E-K卷之雙特異性異質二聚體雙功能抗體保留了細胞毒性。在EK-DART中可見到對配體之較高親和力相當於CTL之較高效力。表22b中之所有VF-DART蛋白均包含CD3-1。
表22c含有親和力成熟之P-鈣黏蛋白VF-DART蛋白之生物物理特徵數據。VF-DART蛋白之分析指出直到65℃才檢測到聚集顯著增加。數據表明VF-DART格式可改善在低溫下之強制聚集變化形廓，但不影響Tm1。LC/MS數據指出在表現和純化之後形成適當之異質二聚體。表22c中之所有VF-DART蛋白均包含CD3-1。
實施例6 P-鈣黏蛋白LP-DART蛋白之表徵
表23摘述以親代選殖株P-CAD 35和CD3-2產生之8個不同的P-鈣黏蛋白LP-DART構建體(# 1~# 8)之各種功能和生物物理數據。
例如LP-DART # 1之第一多肽鏈(1)之名稱為：CD3 VL x P-CAD 35 VH-球形突起，其中該CD3 VL係指具有SEQ ID NO：47之抗CD3-2抗體VL結合區，P-CAD 35 VH係指具有SEQ ID NO：6之抗P-鈣黏蛋白抗體選殖株35 VH結合區，而“球形突起”係指具有SEQ ID NO：63之Fc球形突起鏈。LP-DART # 1之第二多肽鏈(2)之名稱為：P-CAD 35VL xCD3VH-孔，其中該P-CAD 35VL係指具有SEQ ID NO：5之抗P-鈣黏蛋白抗體選殖株35 VL結合區，CD3 VH係指具有SEQ ID NO：46之抗CD3-2抗體VH結合區，而“孔”係指具有SEQ ID NO：64之Fc孔鏈。分析具有序列CPPCP(SEQ ID NO：60)及至少一個甘胺酸殘基之帶有截短之IgG1鉸鏈的各種半胱胺酸連接子(連接子2)。將LP-DART構建體# 1-# 8與親代35 EK-DART進行比較。
數據證明介於DART部分和Fc結構域之間的較短連接子(連接子2)與對各配體之較高親和力和CTL分析中之較高效力有關。這表明較短之連接子(連接子2)可防止Fc結構域干擾在DART部分上之配體結合位點。該數據亦表明方向：CD3 VL x P-CAD 35 VH孔和P-CAD 35 VL x CD3 VH-球形突起(如LP-DART # 5至LP-DART # 8中所示)對產生LP-DART最為理想。
表24顯示出納入高親合力P-鈣黏蛋白VH和VL結合結構域及高親和力抗CD3 VH和VL結合結構域之數個P-鈣黏蛋白LP-DART蛋白在玻管內的功能性表徵。這些數據證明增加之親和力與增加之CTL效力有關；類似於在P-鈣黏蛋白VF-DART和EK-DART格式中所觀察到之關聯性。表24中之所有LP-DART蛋白均包含CD3-1。如同33、34及35親代選殖株，153 LP-DART不結合至鼠P-鈣黏蛋白。
表25顯示出數個P-鈣黏蛋白LP-DART蛋白之生物物理特徵。P-鈣黏蛋白LP-DART蛋白之DSC顯示出與使用P-鈣黏蛋白EK-DART和VF-DART蛋白所取得者類似之Tm1值。強制聚集分析表明在較低之溫度下穩定性較P-鈣黏蛋白EK-DART格式更提升且整體變化形廓類似於臨床mAb。LC/MS數據指出在表現和純化後形成適當之異質二聚體。表25中之所有LP-DART蛋白均包含CD3-1。
表26提供結合至cyno P-鈣黏蛋白ECD和可溶性CD35δε之P-鈣黏蛋白LP-DART蛋白、153 LP-DART和154 LP-DART的Biacore SPR數據。該數據證明與對應之 EK-DART的親和力相比較，彼等對各配體之親和力稍微下降。表26中之所有LP-DART蛋白均包含CD3-1。
實施例7 定量P-鈣黏蛋白之表現 A.在用於玻管內研究之經遺傳工程處理以表現螢光素酶的癌細胞株上定量P-鈣黏蛋白之表現
進行流式細胞術實驗以評估抗P-鈣黏蛋白mAb(PF-03732010)結合，以測定在10種癌細胞株之小組間的內源性細胞表面P-鈣黏蛋白表現之相對水準。將用於玻管內試驗之所有腫瘤細胞株進行遺傳工程處理以表現螢光素酶。依用於飽和FACS結合之描述收集顯示出在一個範圍內之P-鈣黏著蛋白受體表現的腫瘤細胞株。將每一樣本之 2.5×105細胞轉移至96孔圓底聚丙烯培養盤。在室溫下，以5μg/ml和10μg/ml之經藻紅蛋白(phycoerythrin)(PE)標記的抗人P-鈣黏蛋白mAb(PF-03732010)(mAb與PE(eBioscience)係以1：1之比例共軛結合)為細胞染色30分鐘或以與對照組小鼠IgG1mAb(Biolegend)共軛結合之PE為細胞染色30分鐘。使用LSR Ⅱ，以FACS Diva軟體取得細胞之前，以FACS緩衝液加上10ng/ml碘化丙啶清洗細胞並將其重新懸浮。使用0.5mL FACS緩衝液將QuantiBRITE PE小珠(BD Pharmingen)重構成，並以與腫瘤細胞樣本相同之電壓設定，使用LSR Ⅱ取得。依照製造商規定之用於QuantiBRITE PE小珠套組的實驗計劃，使用小珠和腫瘤細胞二者之PE幾何平均螢光強度來計算每一個細胞結合之經PE標記的抗體數目(ABC)。以5μg/mL和10μg/mL之用於各腫瘤細胞株之經PE標記的抗人P-鈣黏蛋白mAb進行Quantibrite分析以測定平均受體密度之Log10值，使用GraphPad Prism 5.0軟體，將所測定之平均受體密度之Log10值相對於相同靶的腫瘤細胞株之平均玻管內細胞毒性EC50的Log10值進行繪圖，以測定介於受體密度和細胞毒性EC50之間的線性回歸曲線擬合。
表27中所顯示，在整個小組和與源自多種癌症類型(包括乳癌、肺癌和結腸直腸癌)之細胞株結合的抗P-鈣黏蛋白mAb之間可觀察到廣範圍之細胞表面P-鈣黏蛋白表現。相反地，該對照mAb並未表現出可察知之結合。MFI=平均螢光強度；ABC=每一細胞結合之抗體。
B.在用於活體內研究之癌細胞株上定量P-鈣黏蛋白之表現
進行流式細胞術實驗以評估抗P-鈣黏蛋白mAb(PF-03732010)結合，以測定在用於活體內研究之癌細胞株小組之間的內源性細胞表面P-鈣黏蛋白表現之相對水準。依用於飽和FACS結合之描述收集顯示出在一個範圍內之P-鈣黏著蛋白受體表現的腫瘤細胞株。將每一樣本之2.5×105細胞轉移至96孔圓底聚丙烯培養盤。在室溫下，以5μg/ml和10μg/ml之經藻紅蛋白(PE)標記的抗人P-鈣黏蛋白mAb(PF-03732010)(mAb與PE(eBioscience)係以1：1之比例共軛結合)為細胞染色30分鐘或以7.5μg/ml之與對照組小鼠IgG1mAb(Biolegend)共軛結合之PE為細胞染色30分鐘。使用LSR Ⅱ，以FACS Diva軟體取得細胞之前，以FACS緩衝液加上10ng/ml碘化丙啶清洗細胞並將其重新懸浮。使用0.5mL FACS緩衝液將 QuantiBRITE PE小珠(BD Pharmingen)重構成，並以與腫瘤細胞樣本相同之電壓設定，使用LSR Ⅱ取得。依照製造商規定之用於QuantiBRITE PE小珠套組的實驗計劃，使用小珠和腫瘤細胞二者之PE幾何平均螢光強度來計算每一個細胞結合之經PE標記的抗體數目(ABC)。
在源自結腸直腸癌和乳癌之細胞株上觀察到廣範圍之細胞表面P-鈣黏蛋白表現並據此評定等級；如表28中所示，HCT116>SUM149>SW480>LS174T>SW620。相反地，該同種異型對照mAb對任何細胞株均未顯示出可察知之結合。
實施例8 玻管內細胞毒性分析 A. EK-DART細胞毒性T淋巴細胞(CTL)分析
依先前之描述(Moore et al.,Blood,117(17)：4542-4551，2011)，在T細胞定向之細胞滅殺分析中篩選顯示出強力之重組P-鈣黏蛋白/CD3蛋白結合及強烈之細胞結合信號(>3x背景或EC50約等於PF03732010-DART)的EK-DART蛋白。表29顯示出有效之對本發明之P-鈣黏蛋 白EK-DART蛋白的T細胞定向細胞毒性。如使用LDH釋出分析所測得者，在E：T比為30：1之人PBMC的存在下，經遺傳工程處理以過度表現人P-鈣黏蛋白之CHO細胞和內源性表現高水準P-鈣黏蛋白之癌細胞株(H1650)在培育24小時後同時被EK-DART蛋白有效溶解。如同以P-鈣黏蛋白EK-DART分子重新定向之T細胞滅殺的作用機制所預期者，將培育時間延長至40小時可進一步增加細胞滅殺的效力。相反地，如同基於缺乏P-鈣黏蛋白之表現所預期者，在親代CHO細胞株上未觀察到滅殺。表29中之所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。
對抗表現人P-鈣黏蛋白和組成性表現螢光素酶報告子構建體之腫瘤細胞，經優化的P-鈣黏蛋白EK-DART蛋白的T細胞定向之細胞毒性顯示於表30中。表30中之所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。
B. LP-DART細胞毒性T淋巴細胞(CTL)分析
藉由細胞毒性T淋巴細胞(CTL)分析評估經介導之153 LP-DART的細胞滅殺。在逐漸增加濃度之153 LP-DART的存在下，以比例為10：1之效應子(T細胞)對靶的(CHO細胞)將CHO親代和CHO P-鈣黏蛋白細胞與CD3+T細胞一起培育。48小時後測量細胞存活力，計算出之半最大有效濃度(EC50)為0.41pM。結果顯示出153 LP-DART表現出對CHO P-鈣黏蛋白細胞具強大滅殺力，但在上述陰性對照組CHO親代細胞上未測到活性。因此，CTL活性係取決於P-鈣黏蛋白表現。
藉由細胞毒性T淋巴細胞(CTL)分析評估經介導之153 LP-DART的腫瘤滅殺。分析經優化之153 LP-DART蛋白對抗表現人P-鈣黏蛋白和組成性表現之螢光素酶報告子構建體的腫瘤細胞之T細胞定向的細胞毒性。在逐漸增加濃度之153 LP-DART的存在下，以3：1之效應子(T細胞)對靶的(腫瘤細胞)的比例將CD3+T細胞與一組癌細胞株一起培育。72小時後測量細胞存活力並計算各癌細胞株之半最大有效濃度(EC50)(如表31中所示)。該數據證明 153 LP-DART在癌症模型中介導有效之抗腫瘤活性。EC50=半最大有效濃度；S.D.=標準偏差；pM=微微莫耳；NA=無活性。
C. CTL活性對細胞表面P-鈣黏蛋白表現水準的比較
收集來自A部分之顯示出在一個範圍內之P-鈣黏著蛋白受體表現的腫瘤細胞株並將每一樣本之2.5×105細胞轉移至96孔圓底聚丙烯培養盤。在室溫下，以5μg/ml和10μg/ml之經藻紅蛋白(PE)標記的抗人P-鈣黏蛋白mAb(輝瑞PF-03732010)(mAb與PE(eBioscience)係以1：1之比例共軛結合)為細胞染色30分鐘或以與對照組小鼠IgG1mAb(Biolegend)共軛結合之PE為細胞染色30分鐘。使用LSR Ⅱ，以FACS Diva軟體取得細胞之前，以FACS緩衝液加上10ng/ml碘化丙啶清洗細胞並將其重新懸浮。使用0.5mL FACS緩衝液將QuantiBRITE PE小珠(BD Pharmingen)重構成，並以與腫瘤細胞樣本相同之電壓設定，使用LSR Ⅱ取得。依照製造商規定之用於 QuantiBRITE PE小珠套組的實驗計劃，使用小珠和腫瘤細胞二者之PE幾何平均螢光強度來計算每一個細胞結合之經PE標記的抗體數目(ABC)。
以5μg/mL和10μg/mL之用於各腫瘤細胞株之經PE標記的抗P-鈣黏蛋白mAb進行Quantibrite分析以測定平均受體密度之Log10值，使用GraphPad Prism 5.0軟體，將所測定之平均受體密度之Log10值相對於相同靶的腫瘤細胞株之平均玻管內細胞毒性EC50的Log10值進行繪圖，以測定介於受體密度和細胞毒性EC50之間的線性回歸曲線擬合。如第8圖中所示，較低之EC 50與增加之抗P-鈣黏蛋白mAb與細胞表面結合之間有顯著的關係，P值=0.0127。這表明CTL活性與P-鈣黏蛋白表現水準相關。
實施例9 人PBMC重構異種移植研究
依下述在活體內異種移植重構實驗中測試各種顯示出強力之T細胞定向的細胞毒性(<10ng/ml EC50)之DART蛋白。
A.從人全血分離PBMC和T細胞
藉由使用Ficoll梯度離心，從全血中分離出來自健康人供體之PBMC。簡單地說，以無菌PBS將全血1：1稀釋。將35mL之稀釋血液層疊在50mL試管中之15mL FICOLL-PAQUETM PLUS上，將試管在1400rpm離心20 分鐘並關閉剎車。將二種相之間的淺黃覆蓋層收集入50mL試管中並以45mL PBS，經由在600xg(1620rpm)離心5分鐘清洗之。丟棄上清液並以PBS清洗細胞小丸一次，藉由錐蟲藍染料排除法測定活細胞數。將PBMC重新懸浮在完全培養基(RPMI 1640、10%FBS、2mM麩胺醯胺、10Mm HEPES、100μ/100μ/mL青黴素/鏈黴素(P/S))中，使PBMC之最終濃度為2.5x106細胞/mL。
B. T細胞分離及活化
根據RosettaSep T細胞分離套組中所提供之製造商之實驗計劃，從肝素化之全血分離出人T細胞。接著，將該純化之T細胞與抗CD3(OKT-3；1μg/mL)和抗CD28(66μg/mL)抗體接觸48小時以活化該T細胞。刺激後，在IL-2(7.6毫微克/毫升)之存在下，使細胞生長在具有10%FBS和1%青黴素/鏈黴素之RPMI1640培養基中長達3週。
C.腫瘤模型
將人T細胞和腫瘤細胞(HCT116、Du145或H1650)以1：5(分別為1×106和5×106)之比例合併並懸浮在200μL之無菌生理鹽水中，再於研究第0天(SD0)經由皮下途徑注射(SC)。在SD0、1、2和3，藉由尾靜脈注射，經靜脈內途徑(Ⅳ)投予在100μL中之各種P-鈣黏蛋白EK-DART(CD3-2)、P-DART(CD3-1)或對照DART(CD3-2)蛋白 連同對照組。各治療組包含8隻動物。
HCT116腫瘤模型中之P-CAD 177 EK-DART：將劑量為0.5、0.2、0.1或0.05mg/kg之P-CAD 177 EK-DART投予四個治療組並將載劑對照組(單獨植入之HCT116細胞或+T細胞)投予一個治療組(0mg/kg)。
HCT116腫瘤模型中之P-CAD 153 EK-DART：將劑量為0.5、0.2、0.1或0.05mg/kg之P-CAD 153 EK-DART投予四個治療組並將載劑對照組(單獨植入之HCT116細胞或+T細胞)投予一個治療組(0mg/kg)。
HCT116腫瘤模型中之P-CAD 154 EK-DART：將劑量為0.5、0.2、0.1或0.05mg/kg之P-CAD 154 EK-DART投予四個治療組並將載劑對照組(單獨植入之HCT116細胞或+T細胞)投予一個治療組(0mg/kg)。
HCT116腫瘤模型中之P-CAD 35 EK-DART：將劑量為0.5、0.2、0.1或0.05mg/kg之P-CAD 35 EK-DART投予四個治療組並將載劑對照組(單獨植入之HCT116細胞或+T細胞)投予一個治療組(0mg/kg)。
HCT116腫瘤模型中之P-CAD 153 LP-DART：將劑量為0.5、0.2、0.1或0.05mg/kg之P-CAD 153 LP-DART或載劑對照組(單獨植入之HCT116細胞或+T細胞)投予治療組。
HCT116腫瘤模型中之P-CAD 153 LP-DART：將劑量為100、10、1、0.1或0.01μg/kg之P-CAD 153 LP-DART或載劑對照組(單獨植入之HCT116細胞)、載劑對照組(植 入之HCT116細胞+T細胞)或4420-hXR32 LP-DART(100μg/kg)對照組投予治療組。
Du145腫瘤模型中之P-CAD 153 LP-DART：將劑量為100、10、1、0.1或0.01μg/kg之P-CAD 153 LP-DART或載劑對照組(單獨植入之Du145細胞)、載劑對照組(植入之HCT116細胞+T細胞)或4420-hXR32 LP-DART(100μg/kg)對照組投予治療組。
H1650腫瘤模型中之P-CAD 153 LP-DART：將劑量為100、10、1、0.1或0.01μg/kg之P-CAD 153 LP-DART或載劑對照組(單獨植入之H1650細胞)、載劑對照組(植入之H1650細胞+T細胞)或4420-hXR32 LP-DART(100μg/kg)對照組投予治療組。
C.收集數據和統計分析
動物重量：在注射腫瘤細胞之時間開始每週記錄個別動物的體重二次，直到研究完成。
瀕死/死亡率：每週觀察動物的總體瀕死情形二次，並每日觀察動物之死亡率。評估動物之死亡為與藥物相關或技術上基於，包括大體觀察和體重減輕之因素；每日記錄動物死亡。
腫瘤體積：在植入腫瘤一週內開始每週記錄個別腫瘤體積二次，一直持續到研究完成。
從計算數據來審查經歷技術或藥物相關之死亡的動物。
腫瘤生長抑制：使用下列公式計算包含經治療之動物的每一組之腫瘤生長抑制(TGI)數值：
從計算之TGI來審查經歷部分或完全反應之動物，或經歷技術相關或藥物相關之死亡的動物。國家癌症協會之化合物活性的標準為TGI>58%(Corbett etal.(2004)Anticancer Drug Development Guide；Totowa,NJ：Humana 99-123)。
部分/完整腫瘤反應：將第1天之腫瘤測量值小於1mm3的個別小鼠歸類為具有部分反應(PR)並使用下列公式測定腫瘤消退百分比(%TR)數值：
缺乏可觸知之腫瘤的個別小鼠被歸類為經歷完整反應(CR)。
腫瘤體積統計：在治療組和對照組之間進行比較腫瘤體積之統計分析。在這些分析方面，使用方差雙向分析，再使用Bonferroni事後檢定。使用GraphPad PRISM®軟體(5.02版本)進行所有分析。從分析中審查來自經歷技術或藥物相關之死亡的個別動物之重量和腫瘤數據。不過，來自報告部分或完全反應之動物的腫瘤數據包含在這些計 算中。
D. HCT116腫瘤模型結果
將細胞株HCT116與活化之T細胞預先混合並在研究第0天(SD0)依上文中之詳細描述經由皮下(SC)植入NOD/SCID γ基因剔除小鼠中(N=8/組)。在植入腫瘤細胞/T細胞混合物的同一天[(SD0)]開始以各種P-鈣黏蛋白EK-DART、LP-DART或對照組DART蛋白進行治療，隨後額外進行每日注射3天，共進行4次每日注射。以4種劑量水準(0.5、0.2、0.1和0.05mg/kg)之P-鈣黏蛋白EK-DART、LP-DART或對照組DART蛋白治療動物。結果顯示於第9-14圖中。
載劑治療組(單獨之HCT 116細胞或加上T細胞)中之HCT 116腫瘤顯示出相對積極生長的活體內變化形廓。在研究第20天(SD20)，載劑治療組中之腫瘤的平均體積為約125mm3，而到研究第35天(SD35)前，腫瘤平均體積已經達到約450mm3。在研究第45天(SD45)實驗結束前，腫瘤平均體積已經達到約750mm3。對大部分測試之P-鈣黏蛋白DART蛋白而言，在所有劑量水準下HCT 116腫瘤之生長受到明顯抑制。在SD45實驗結束前，所有治療組之腫瘤平均體積範圍為約100至0mm3，除了177 EK-DART之腫瘤平均體積範圍為約500至100mm3。
E. Du145結果
將細胞株Du145與活化之T細胞預先混合並在SD0依上文中之詳細描述，經由SC植入NOD/SCID γ基因剔除小鼠中(N=8/組)。在植入腫瘤細胞/T細胞混合物的同一天[(SD0)]開始以153 LP-DART進行治療，隨後額外進行每日注射3天，共進行4次每日注射。以5種劑量水準(100、10、1、0.1和0.01μg/kg)之153 LP-DART治療動物。結果顯示於第15圖中。
在載劑治療組(單獨之Du145細胞或加上T細胞)中之Du145腫瘤顯示出在活體內具有相對積極生長的變化形廓。Du145腫瘤之生長受到劑量水準為100、10和1μg/kg之153 LP-DART明顯抑制，且在實驗結束(SD74)前，腫瘤平均體積為0mm3。劑量水準為0.1μg/kg之153 LP-DART明顯抑制Du145腫瘤之生長且在實驗結束前(SD74)，腫瘤的平均體積為約500mm3。
F. H1650結果
將細胞株H1650與活化之T細胞預先混合並在SD0依上文中之詳細描述，經由SC植入NOD/SCID γ基因剔除小鼠中(N=8/組)。在植入腫瘤細胞/T細胞混合物的同一天[(SD0)]開始以153 LP-DART進行治療，隨後額外進行每日注射3天，共進行4次每日注射。以5種劑量水準(100、10、1、0.1和0.01μg/kg)之153 LP-DART治療動物。結果顯示於第16圖中。
在載劑治療組(單獨之H1650細胞或加上T細胞)中之 H1650腫瘤顯示出具有相對積極生長的活體內變化形廓。H1650腫瘤之生長明顯受到劑量水準為100、10和1μg/kg之153 LP-DART抑制，且在實驗結束(SD49)前，腫瘤平均體積為50mm3。劑量水準為0.1μg/kg之153 LP-DART明顯抑制H1650腫瘤之生長且在實驗結束(SD49)前，腫瘤的平均體積為約400mm3。
在Winn模型之背景下，當在植入當日開始給藥並持續3天或連續更多天時，各種EK-DART、LP-DART和對照DART蛋白可有效地抑制SC植入NOD/SCID小鼠中之HCT116、Du145和H1650腫瘤的生長。根據國家癌症協會所建立之標準，在三種模型中，劑量水準為0.1mg/kg及更高之各種DART蛋白(TGI>58)被認為是有活性的。
實施例10 建立之腫瘤人PBMC移植模型
根據定量型流式細胞術分析，設立四個藉著P-鈣黏蛋白高(HCT116)、中(SW480)、低(Ls174T)和陰性(SW620)表現分類之獨立的人大腸結腸癌的異種移植腫瘤模型。HCT116顯示出相對最高之細胞表面P-鈣黏蛋白表現水準(43,801ABC，表28)，SW480顯示出相對適度之細胞表面P-鈣黏蛋白表現水準(12,665 ABC，表28)，而Ls174T顯示出相對低之細胞表面P-鈣黏蛋白表現水準(4,160 ABC，表28)。
在第0天，經由皮下途徑在NOD scidγ(NSG)動物右 側植入5×106 HCT116、5×106 SW480、2×106 Ls174T或5×106 SW620腫瘤細胞。根據預測之腫瘤生長隨機分組(第5天)的前7天經由腹膜內途徑為動物注射0.2毫升在PBS中之細胞懸浮液，以為動物接種5×106新鮮分離之人外周血單核細胞(PBMC)。PBMC植入後一週(第12天)，測量所有研究動物之腫瘤體積並收集用於流式細胞術之血液樣本。以BD Pharmlyse溶液(BD Pharmingen)溶解來自各樣本之紅血球細胞，將所產生之細胞小丸進行人CD3、人CD4和人CD8染色並使用BD Pharmingen LSR Ⅱ，以FACS Diva軟體，藉由流式細胞術分析。建立每一隻動物之藉由前向散射相對側邊散射門控所測定之以淋巴細胞總數之百分比表示的人CD3+細胞。使用數字游標卡尺(digital vernier caliper)(Mitutoyo America，伊利諾州Aurora)收集腫瘤測量值，並藉由使用經修改之橢球公式1/2(寬度2×長度)計算體積。
使用雙參數隨機化來建立每組包含10隻動物之治療組，腫瘤體積和人CD3+細胞植入值之間權重相等。經由靜脈內注射，在每隻動物之側尾靜脈給予動物劑量為0.05mg/kg或0.5mg/kg之153 LP-DART(CD3-1)、0.5mg/kg之陰性對照雙特異性(抗FITC和CD3ε異質二聚體雙功能抗體Fc融合蛋白)或作為載劑之DPBS。每二週收集腫瘤測量值以相對於對照組評估對腫瘤生長之抑制，並持續監測移植物抗宿主病(例如體重下降、脫髮、駝背姿勢)之跡象。
顯現出腫瘤體積(mm3)相對時間作圖之腫瘤生長圖顯示於第17A-17D圖中，對應之數據表顯示於下列表32-35中。該數據證明每週投予用於HCT116(高)、SW480(中)腫瘤模型之最高劑量(0.5mg/kg)時會導致腫瘤消退，而投予用於LSs174T(低)腫瘤模型之最高劑量(0.5mg/kg)時會導致適度功效。與經載劑治療之小鼠相比較，投予陰性對照雙特異性抗體顯示出並未增加腫瘤抑制。在HCT116腫瘤模型中，第17A圖顯示出在0.05和0.5mg/kg之153 LP-DART劑量下，腫瘤生長抑制(TGI)分別為61.9%和105.1%。第17A-17D圖進一步證明已建立之異種移植腫瘤的腫瘤生長抑制係取決於P-鈣黏蛋白表現水準。
第17E圖顯示出在HCT116腫瘤模型中，在移植後第25天收集之腫瘤體積(mm3)的單向ANOVA分析，此係使用Dunnet氏多重比較試驗相對於載劑對照組進行。該數據證明在給予劑量為0.05mg/kg和0.5mg/kg之153 LP-DART的組別中腫瘤生長均明顯受抑制(* p<0.05)。
帶有HCT116腫瘤之NSG動物經P-鈣黏蛋白153 LP-DART治療後的藥代動力學分析結果顯示於表36中。投予動物單次0.05或0.5mg/kg之153 LP-DART的IV劑量，並在給藥後之指定時間點將n=3組別中之動物安樂死以收集血清和腫瘤。藉由三明治ELISA，相對標準曲線進行LP-DART的分析。該153 LP-DART在血清和腫瘤中顯示出延長之半衰期。
實施例11 建立之腫瘤人T細胞繼承性轉移模式
分析藉由繼承性轉移人T細胞來抑制HCT 116(結腸)和SUM149(乳腺)之腫瘤生長。HCT116顯現出相對最高之細胞表面P-鈣黏蛋白表現水準(43,801 ABC，表28)，而SUM149顯示出相對適度之細胞表面P-鈣黏蛋白表現水準(15,426 ABC，表28)。以輔以2X GlutaMax-1、1%PenStrep和20ng/ml重組之人IL-2(Life Technologies公司，加州Carlsbad)的OpTmizer CTS T細胞擴增無血清培養基(T Cell Expansion Serum-Free Media)將T細胞再懸浮成0.5×106細胞/ml。然後，以1x10e6珠/ml(2珠/細胞)將Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28磁珠(Life Technologies公司)加入T細胞中，並根據製造商之實驗計劃將細胞培養一週。在收穫時，以磁鐵除去珠並以1×107細胞/ml將細胞再懸浮於DPBS中以用於活體內接種。
在異種移植研究方面，在NSG小鼠之側邊接種5×106之HCT116細胞或在乳房脂肪墊中接種5×106之SUM149細胞，總注射量為0.2mL。將HCT116細胞懸浮在DPBS 中，將SUM149細胞懸浮在生長培養基中並以1：1之比例與Matrigel基底膜基質(BD Biosciences公司，加州聖荷西市)混合。
使用數字游標卡尺(Mitutoyo America，伊利諾州Aurora)收集腫瘤測量值，並藉由使用經修改之橢球公式1/2(寬度2×長度)計算體積。一旦腫瘤已經達到增長階段，將小鼠隨機分配並接受初始劑量，第二天為小鼠接種2×106培養之T細胞。每週給予小鼠在0.2mL中之大丸劑注射液中的劑量5次，並經由每隻動物之側尾靜脈，經靜脈內途徑投予所有化合物和T細胞。每二週收集腫瘤測量值，並持續監測移植物抗宿主病之跡象(例如體重減輕、脫髮、駝背姿勢)。
第18A圖(表37)中顯示藉由繼承性轉移人T細胞來抑制HCT 116(結腸)之腫瘤生長，而第18B圖(表38)中顯示藉由繼承性轉移人T細胞來抑制SUM149(乳腺)之腫瘤生長。每週投予最高劑量(0.5mg/kg)之153 LP-DART(CD3-1)會導致具有腫瘤消退之劑量反應，而投予較低劑量(0.05mg/kg)時會導致腫瘤停滯，而最終腫瘤復發。與經載劑治療之小鼠相比較，投予陰性對照LP-DART顯示出並未增加腫瘤抑制。與上述實施例10之移植T細胞模型相比較，繼承性T細胞轉移模型允許在小鼠死於GVHD前(分別為2週和≧6週)的延長153 LP-DART給藥。
實施例12 P-鈣黏蛋白陽性患者來源之異種移植(PDX)
分析活體內P-鈣黏蛋白陽性PDX的腫瘤生長抑制。以抗P-鈣黏蛋白抗體進行FFPE腫瘤樣本之陽性染色來鑑定P-鈣黏蛋白陽性患者來源之大腸結腸腫瘤異種移植，PDX-CRX-11260。將PDX-CRX-11260腫瘤組織植入NSG動物並生長至大約為100mm3。將動物隨機分成n=7之 劑量組並每週給予載劑、0.05mg/kg 153 LP-DART(CD3-1)或0.5mg/kg153 LP-DART(CD3-1)。在初始劑量後一天，所有動物接受2×106個在活體外擴增之人T細胞。
PDX-CRX-11260之腫瘤生長抑制顯示於第19A圖(表39)中。0.05mg/kg 153 LP-DART劑量組證實7隻動物中有3隻具有完全反應，而0.5mg/kg 153 LP-DART劑量組證實7隻動物中有7隻具有完全反應。該數據證明153 LP-DART表現出強力抑制P-鈣黏蛋白陽性結腸腫瘤PDX之腫瘤生長。
實施例13 劑量依賴性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之累積
將人外周血單核細胞(PBMC)移植入帶有HCT116腫瘤之小鼠中並給予不同劑量之153 LP-DART(CD3-1)(n=3)，在給藥後6天將小鼠安樂死以評估腫瘤浸潤性人 CD3+淋巴細胞。將腫瘤樣本收集入含有人腫瘤細胞分離緩衝液(Miltenyi Biotech)的gentleMACS C管中並採用製造商建議之用於人軟腫瘤之實驗計劃，使用gentleMACS組織分離器(Miltenyi Biotech)將腫瘤樣本加工成單一細胞懸浮液。然後，以含有2mM EDTA之DPBS清洗細胞懸浮液，並藉由錐蟲藍排除法和血球計數器測定存活細胞數。從每個樣本收集1x106個活細胞，置入含有2%FBS和0.02%疊氮化鈉之PBS中，並在冰上以CD3 FITC(BD Pharmingen公司)染色30分鐘。清洗後，在使用LSR Ⅱ，以FACS Diva軟體(BD Pharmingen公司)分析前不久，在各樣本中立即加入碘化丙錠。
藉由FlowJo軟體(Treestar)分析數據，使用GraphPad Prism5.0軟體將總活細胞中之CD3+細胞百分比相對於未經治療之對照組繪製分組圖，該分組係藉由Dunnet’s多重比較試驗，經由單向ANOVA測定顯著性。結果顯示於第20圖中，表40證明腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)係以劑量依賴方式增加。此外，腫瘤組織之人CD3的免疫組織化學(IHC)染色(未顯示出)證明以153 LP-DART治療具有P-鈣黏蛋白陽性腫瘤和人T細胞之動物會導致腫瘤內累積CD3+淋巴細胞。
實施例14 使用FMT成像之P-鈣黏蛋白LP-DART之生物分佈和腫瘤靶向
使用具有建立之皮下HCT116異種移植物的NSG或無胸腺裸鼠。包含移植T細胞之研究接受從健康之人志願者分離出的T細胞。當腫瘤達到300-500mm3時開始生物分佈研究。將P-鈣黏蛋白153 LP-DART(CD3-1)或陰性對照-DART(非靶向結構域x CD3結合結構域)與近紅外線螢光團VivoTag680XL(VT680)共軛結合，該螢光團對雙特異性標記之比係介於1至2.75，結果產生：P-鈣黏蛋白153 LP-DART-VivoTag680XL和對照-LP-DART-VivoTag680XL。
藉由分光光度計測定標記效率。以CellVue815(CV815)標記用於輸送研究之T細胞。藉由流式細胞術測定細胞表面P-鈣黏蛋白之表現和P-鈣黏蛋白153 LP-DART結合。以細胞毒性T淋巴細胞(CTL)分析測量T細胞活性。在注射經標記之雙特異性抗體後縱向進行FMT成像。使用TrueQuant軟體分析數據。在不同時間點收集血漿和組織以藉由ELISA進行PK分析。
A.在試管內表徵經標記之生物分子
為了測定VT680標記是否影響該分子性質，進行品質控制研究：藉由FACS分析玻管內與細胞之結合及藉由細胞毒性分析進行分子活性之分析。比較經VT680標記和未經標記之對照LP-DART和P-鈣黏蛋白153 LP-DART之性質。在以CV815標記之T細胞方面，評估T細胞擴增，亦評估在效應子細胞上之細胞毒性。表41顯示出用於生物分佈研究之分子。
DOL=標記程度。
進行直接可溶性P-鈣黏蛋白之ELISA以評估結合能力：第21A圖顯示出在P-鈣黏蛋白153 LP-DART上標記VT680對P-鈣黏蛋白結合的影響最小。最小降幅為DOL依賴性。對照-LP-DART(經標記或未經標記的)不與P-鈣黏蛋白結合。
進行直接可溶性CD3之ELISA以評估結合能力：第21 B圖顯示出在P-鈣黏蛋白153 LP-DART上標記VT680會顯著降低對CD3ε/δ蛋白之結合。降低之結合度為DOL依賴性。對照-LP-DART之結合力較P-鈣黏蛋白153 LP-DART低。VT680標記顯著降低對CD3ε/δ之結合。
使用表現螢光素酶之HCT116細胞作為用於玻管內細胞毒性之“靶細胞”，在對P-鈣黏蛋白153 LP-DART進行滴定之24小時分析中，純化之人T淋巴細胞“效應子”細胞對靶的之比=10：1。第21C圖中所示之細胞毒性圖說明當以VT680標記P-鈣黏蛋白153 LP-DART，DOL為2.0時細胞細胞毒性降低。
比較以細胞標記染料標記後T細胞之細胞存活力和擴增：以螢光細胞追踪染料-VivoTrack680和CellVue815(CV815)標記從供體分離出之人T細胞。第21D圖顯示出VivoTrack680或CV815均不會影響T細胞之細胞存活力和擴增。
B.活體內FMT成像和PK分析數據
採用縱向FMT成像分析在HCT116異種移植模型中之P-鈣黏蛋白蛋白153 LP-DART的生物分佈和靶向。將在50%基質膠(matrigel)中之一百萬個HCT116細胞注射入雌性nu/nu小鼠(8週齡)之SQ側邊。令腫瘤生長至大小~300-500mm3。為動物注射等同於1nmole之VT680的探針(經VT680標記之生物分子)(表41)。在注射後5min、24hr、48hr、96hr和240hr縱向進行活體內FMT成像(全身)。在每個時間點收集血液(血漿)樣本。在研究之間歇時間點和結束時，將動物安樂死並灌注PBS/生理鹽水以從血管腔室除去血液。在活體外進行組織(腫瘤、肝、脾、腎、肺和腦)成像。使用TrueQuant軟體分析該FMT數 據。在活體外成像後，將組織快速冷凍以用於未來的PK分析。藉由ELISA進行血漿和組織樣本的PK分析。在生物分佈研究中未進行T細胞植入。
FMT成像顯示出P-鈣黏蛋白153 LP-DART特異針對HCT116腫瘤。活體內非侵入性FMT成像揭露出與對照LP-DART相比較，腫瘤中累積大量之P-鈣黏蛋白153 LP-DART(圖像未顯示)。活體內動力學顯示出腫瘤中之尖峰累積約在注射後96小時，如第22A圖所示。如第22B圖所示，證明累積之組成及從各種組織、腫瘤與血管腔室清除的全身分佈和清除數據顯示出P-鈣黏蛋白153 LP-DART與對照-LP-DART之間並無全面之顯著差異。
如第22C和22D圖所示，腫瘤和在48，96和240小時選擇之組織的活體外分析證明P-鈣黏蛋白153 LP-DART滲透入組織中。腫瘤顯示出其在所有時間點之P-鈣黏蛋白153 LP-DART累積較對照-LP-DART高出20-30倍。在注射240小時後，腫瘤中仍檢測到可測得之P-鈣黏蛋白153 LP-DART。在活體外比較在各種器官(肝(第22D圖)、腎、脾、肺和腦(數據未顯示))中之累積顯示出P-鈣黏蛋白153 LP-DART或陰性對照DART之間並無差異。
藉由藥代動力學方法比較FMT數據以確認FMT成像的變化形廓。藉由例行之藥代動力學方法，ELISA評估來自FMT研究之樣本。來自腫瘤和肝之PK數據顯示出與上述之FMT成像數據具有類似之趨勢。如第23A圖所示，該血漿變化形廓顯示出P-CAD-LP-DART之血漿暴露較對 照LP-DART延長~2-3倍。如第23B圖所示，活體外腫瘤樣本之評估顯示出P-CAD-LP-DART的累積增加~7倍。如第23 C圖所示，活體外肝臟樣本之評估顯示出在48小時累積增加，然而，在96小時和240小時則無顯著差異。
C.細胞性追踪植入之T細胞
使用FMT成像進行HCT116模型中植入之T細胞的細胞性追踪。將在50%基質膠(matrigel)中之一百萬個HCT116細胞注射入雌性NSG小鼠(8週齡)的SQ側邊。當腫瘤尺寸為~300-500mm3時，經由SQ途徑注射P-鈣黏蛋白153 LP-DART(以VT680標記或未經標記)。注射藥物後24小時，經由靜脈內途徑注射五百萬個以CV815標記之T細胞。在細胞植入後進行縱向FMT成像。使用用於P-鈣黏蛋白153 LP-DART-VT680和T細胞CV815組之680nm的和800nm雷射進行連續成像。
以CellVue標記之T細胞的細胞進蹤研究顯示出T細胞和P-鈣黏蛋白153 LP-DART共同定位在腫瘤內。如第24A圖所示，以CV815標記和未經標記之T細胞的T細胞活性評估證明以螢光團標記T細胞對T細胞之細胞毒性的能力並無影響(試管內)。如第24B圖所示，藉由FMT成像以螢光團標記之T細胞在腫瘤內之活體內輸送動力學證明植入細胞後第7天，在P-鈣黏蛋白153 LP-DART注射組中之T細胞輸送和累積顯著增加。
FMT圖像(未顯示出)證明經VivoTag680標記之P-鈣黏蛋白153 LP-DART對準腫瘤及經CV815標記之T細胞在植入細胞後第5天和第7天輸送至腫瘤。此組接受經CV815標記之T細胞+經VivoTag680標記之P-鈣黏蛋白153 LP-DART。使用DOL為1.0之P-鈣黏蛋白153 LP-DART-VT680。DOL為1.0顯示出對結合至P-鈣黏著蛋白和CD3蛋白質的影響最低。
實施例15 結晶化和結構測定
在結晶化試驗方面，利用第25圖中所顯示之純化的DART蛋白。尤其是，設計不具有異質二聚體提升結構域之用於結晶學的DART蛋白(具有選殖株35 P-CAD VLNH結合結構域及選殖株CD3結合結構域)，其具有稱為“6XHIS”之共價連接至P-CAD 35 VH結構域之C-端His標籤HHHHHH(SEQ ID NO：78)及稱為“FLAG”之共價連接至CD3 VH結構域的C端FLAG序列GGCGGDYKDDDDK(SEQ ID NO：79)(以下稱為“晶體35 DART”)。
將純化之晶體35 DART在含有TBS之蛋白溶液中濃縮成9.6mg/mL。藉由懸滴蒸氣擴散法，從含有15% PEG 8K和0.5M硫酸鋰之條件取得晶體。該六角盤樣晶體具有與三方晶系空間群(trigonal space group)P321一致之對稱性，晶胞參數a=b=142.81Å；c=62.69Å且在晶體不對 稱單位中具有一個晶體35 DART分子。使用含有25%乙二醇貯庫溶液將晶體冷凍保護，然後在液態氮中快速冷凍。在Argonne國家實驗室(APS)中，在IMCA光束線17-ID處從單一冷凍晶體收集解析度設為2.0Å之數據。使用autoPROC和SCALA處理和調整數據規模。最終數據組為96.8%完成度，平均冗餘為9.9且Rsym為14.2%。
從單鏈Fv片段模型(從Brookhaven PDB紀錄碼，1moe製備)開始，以PHASER進行分子置換來測定該結構。經由分別搜尋晶體35 DART分子之四個次單位的每一次單位來取得溶液。進行幾個手工調整迭代輪並使用COOT重建模型和使用autoBUSTER細化晶體來產生最終之晶體35 DART模型，晶體Rwork為17.6%且Rfree為20.5%，其中Rwork=||Fobs|-|Fcalc||/|Fobs|且Rfree等於Rwork，但計算從細化過程省略之隨機選擇的5%反射。
最終之晶體35 DART模型包含二個鏈，重鏈(H)和輕鏈(L)，具有H鏈之殘基1-110、117-239和L鏈之殘基2-110、116-246。存在於該模型中之非蛋白質原子包括574個水分子和5個硫酸離子。由於缺乏電子密度(很可能是由於紊亂)，連接子區中缺失之胺基酸(11個殘基)並未模塑在結構中。
第26圖顯示出晶體35 DART蛋白之晶體結構的圖示。在該結晶中，晶體35 DART組裝成非常緊密之球形結構，其與先前發表之雙功能抗體結構(第27圖)差別相當大(參見Carmichael et al.,J.Mol.Biol.326：341-351 (2003)；Perisic,et al.,Structure,2(12)：1217-1226(1994))。其在次單位之間具有意料外之擴展的界面且具有作為穩定結構之明確證據的在二條多肽鏈之間的二硫鍵聯，Cys239(VH1B)-Cys246(VL2A)。該四個次單位，VL1A、VH1B、VL2B和VH2A均促成該結合界面，來自該二條鏈之框架胺基酸殘基的貢獻最大。稍後之觀察表明以其他CDR序列構建之其他DART蛋白(結合至不同的腫瘤相關抗原)可與晶體35 DART分享類似之架構及類似之結構域界面。
儘管包裝相當緊密，該晶體35 DART界面並不像Fab分子中之天然存在的界面般高度富集和形狀互補，該Fab分子之特徵在於重鏈和輕鏈結構域之間具有高度的鏈間聯結。在晶體35 DART中，在一個鏈或結構域中之未被另一個鏈或結構域的突起互補的幾個凹陷導致小的內部包裝缺陷和大的空孔，在晶體結構中填滿結合水(第28圖)。
在晶體35 DART上的二個抗原結合位點彼此分隔約40Å且位於分子之正交相對側。在此背景下，“正交相對側”意指在晶體35 DART上的二個結合位點彼此之相對角度為~90°。
該抗CD3 CDR區係位在次單位界面之遠端，而抗P-CAD CDR區係在較鄰近之區域內(參見第27圖)。
此外，產生新穎之單鏈DART(scDART)變體以解決雙鏈雙功能抗體錯配之問題(根據該晶體結構可使用各種不同的VH和VL鏈方向性)。將另外之半胱胺酸殘基進行遺 傳工程處理以誘導在scDART蛋白內之共價鍵聯，以進一步改善單鏈雙功能抗體之穩定性。該方法為Dani et al.(Prot.Eng.16(3)：187-193(2003))之變化，其採用進一步分析來將各個位點之品質分級。亦使用此方法將各種二硫鍵位置進行遺傳工程處理以減少二硫鍵之溶劑可及性並縮短連接子之長度。例如，用於引入立體化學上最佳之二硫化物的造型位置建議下列用於半胱胺酸誘變之胺基酸殘基對(參見第29圖)：此外，使用Discovery Studio(Accelrys軟體公司)穩定性預測實驗計劃及Rosetta v2.3穩定性實驗計劃，透過在域間界面進行定點誘變來將DART變體(包括scDART變體)進行遺傳工程處理以填補大的內部空隙/孔(第26圖)，以試圖進一步改善域間聯結之穩定性。例如，經由以具有大體積之芳香族側鏈像是苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸替換相對較小之胺基酸來增加在Ala44(VL1A)、Val213(VH2A)、Leu238(VH2A)或Met231(VL2B)位置處的側鏈體積。將單一表面半胱胺酸突變體進一步根據晶體結構進行遺傳工程處理，探查用於位點特異性生物結合方法之各種位置。
實施例16 P-鈣黏蛋白153 LP-DART之表位測繪
為了鑑別P-鈣黏蛋白153 LP-DART之結合表位，產生可溶性P-鈣黏蛋白胞外結構域(ECD)-Fc融合蛋白構建 體。各P-鈣黏蛋白-Fc構建體包含一個信號肽、前肽和P-鈣黏蛋白ECD子結構域區(ECD1、ECD1-2、ECD1-3、ECD1-4或ECD1-5)，其經由可裂解之連接子遺傳融合至人IgG1之鉸鏈及CH2和CH3結構域，如第34圖所示。用於產生ECD-Fc構建體之ECD1、ECD2、ECD3、ECD4和ECD5 P-鈣黏蛋白子結構域片段對應於在全長P-鈣黏蛋白表位中識別之序列(UniProt P22223、CADH3、人鈣黏蛋白-3)，其顯示於第35圖中且進一步表徵在表42中。
藉由DNA測序確認所有構建體且根據製造商之方法瞬時轉染入FreeStyleTM293 HEK細胞(Life Technologies公司，紐約州格蘭德島)中，並表現5-7天。為了增進前肽之加工處理，將含有PACE裂解酶之表現載體隨著含有P-鈣黏蛋白之載體共同轉染。使用標準的蛋白A層析技術(Protein A FF，GE Healthcare，紐澤西州Piscataway)，隨 後藉由凝膠過濾尺寸排阻層析法(Superdex200，GE Healthcare，紐澤西州Piscataway)來純化所欲之可溶性蛋白。使用市售之抗人P-鈣黏蛋白單株和多株抗體，藉由結合ELISA來決定純化之蛋白質的純度和活性特徵。在蛋白質ELISA中使用純化之P-鈣黏蛋白ECD-Fc構建體來測定與153 LP-DART結合之P-鈣黏蛋白的ECD子結構域為何者。
表43顯示出153LP-DART及其他各種抗P-鈣黏蛋白DART分子，連同用於確認ECD-Fc構建體之正確表現和折疊的多株抗體(R & D系統，明尼蘇達州Minneapolis)與所產生之P-鈣黏蛋白ECD-Fc構建體的結合結果。結果顯示出153 LP-DART不與ECD1-Fc或ECD1-2-FC結合，但確實與所有包含ECD3之構建體(ECD1-3-Fc、ECD1-4-Fc和ECD1-5-Fc)結合。此數據證明153 LP-DART在ECD3內與人P-鈣黏蛋白結合。
如表24(上文)中所示，153 LP-DART不會與鼠P-鈣黏蛋白結合，因此，153 LP-DART識別人P-鈣黏蛋白之ECD3上的表位(SEQ ID NO：164)，人P-鈣黏蛋白ECD3 之序列與來自鼠P-鈣黏蛋白ECD3之序列(SEQ ID NO：172)不同。表44顯示出人與鼠P-鈣黏蛋白ECD-3之比對，說明這些直系同源物之間的差異。(；)代表相似，(.)代表不同且(-)代表非常不同的殘基。
為了測定結合表位及結合親和力在T細胞重新靶向細胞毒性分析中對效力是否有影響，分析各種抗P-鈣黏蛋白EK-DART之細胞毒性T-淋巴細胞(CTL)分析的結果。藉由Biacore和ELISA比較該細胞毒性值(見表29)與對可溶性和細胞表面表現之P-鈣黏蛋白的結合親和力(見表14-16、24)。PF-DART以個位數nM之結合親和力在ECD2中結合P-鈣黏蛋白且具有nM以下之CTL細胞毒活性。35 EK-DART(153 EK-DART之親代選殖株)以約35nM之結合親和力在ECD3中結合P-鈣黏蛋白，幾乎較PF-DART之結合親和力低35倍，但仍以類似之效力滅殺(低於nM)。此數據表明在ECD3(其更接近細胞膜)中結合導致較高之CTL效力。153 LP-DART亦以較35 EK-DART(0.5nM)更強之結合親合力在ECD3中結合P-鈣黏蛋白且顯示出最高之CTL活性(低於pM)。
實施例17 抗P-鈣黏蛋白CDR之互補位(paratope)測繪
為了進一步了解互補決定區(CDR)中有哪些胺基酸(AA)殘基涉及scFv 153結合至人P-鈣黏蛋白，藉由並行定點誘變將所有非丙胺酸CDR AA個別突變成丙胺酸。
定點誘變
設計63個寡核苷酸(長度為33-45個鹼基)(表45)。調整各個寡核苷酸之寡核苷酸長度以具有彼此相當之預測的熔解溫度(Tm)值。設計各個寡核苷酸使成為選殖株153 scFv之有義股的反向互補且“AGC”(丙胺酸密碼子，GCT的反向互補)之任一側均鄰接15-21個鹼基。
使用已發表之實驗計劃(Tonikian R et al,Nat.Protoc.2007；2(6)：1368-86)製造單股DNA。簡單地說，根據製造商(Lucigen，威斯康辛州米德爾頓)之實驗計劃將噬菌體表現載體轉化入CJ236電穿孔勝任細胞(electro-competent cell)並將0.05%之細胞平皿接種在LB/Amp盤上。增長一整夜後，在六個生長在輔以100μg/mL之胺苄青黴素、10μg/mL之氯黴素和1e+ 10 M13KO7輔助噬菌體顆粒的2xTY/2%葡萄糖中的1毫升培養物中接種獨立之選殖株，在37℃下生長2小時後，再加入卡那黴素，使濃度為25μg/mL。在37℃下振盪4個多小時之後，匯集顯示出濁度之培養物並在2-L震盪三角培養瓶中擴展成120毫升之培養物(輔以100μg/mL之胺苄青黴素、25μg/mL之卡那黴素、0.25μg/mL之尿嘧啶核苷的2xTY/2%葡萄糖)。增長一整夜後，經由離心(6000rpm，10分鐘)收集培養上清液並在100mL之上清液中加入20mL PEG/NaCl且藉由PEG-沉澱純化噬菌體。將純化之噬菌體(重新懸浮在1mL之PBS中)溶解並根據製造商的實驗計劃(Qiaprep spin M13套組，目錄編號27704)純化單股尿嘧啶DNA。藉由 NanoDrop(Thermo)量化DNA。
將寡核苷酸在三-EDTA緩衝液(50μM，在200μL中)中調整為正規形式。接著，在37℃下，在96孔格式中將200皮莫耳之各寡核苷酸(4μL)磷酸化90分鐘並在65℃下熱滅活20分鐘。該反應混合物含有下列者：4μL之寡核苷酸、2μL之10xPNK緩衝液、2μL之10mM ATP、1μL之100mM DTT、11μL之水、2μL之T4 PNK(T4多核苷酸激酶)。依下述在96孔格式中設立定點誘變反應：2.2μL之單股尿嘧啶模板DNA(200ng)、2μL之Pfu Turbo Cx緩衝液、2μL之100mM DTT、0.4μL之NAD+、0.16μL之dNTP、10μL之水、0.2μL(0.5單位之Pfu Turbo Cx)、1μL之Taq DNA連接酶、2μL之20倍稀釋的磷酸化反應物(0.9皮莫耳)。將反應依下述培育：95℃下3分鐘，55℃下90秒，68℃下15分鐘，45℃下15分鐘。接著，加入1μL(1皮莫耳)之5’磷酸化之OmpA寡核苷酸並將反應物依下述進一步培育：95℃下30秒，55℃下45秒，68℃下10分鐘，45℃下15分鐘。在這些培育之後，加入2μL或2單位之UDG：尿嘧啶DNA糖基化酶和5個單位之外切核酸酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ)混合物以分解該模板，先在37℃下60分鐘，然後在65℃下20分鐘。最後，將2μL之各反應物匯集起來(共63個反應物)並將0.3μL電穿孔入用於測序之ER2738電勝任細胞。
製備用於ELISA之表現scFv的噬菌體
scFv可表現在噬菌體顆粒之表面上。為了製備在其表面上表現scFv的噬菌體，使用QPixTM2 Colony採選器(Molecular Devices，加州Sunnyvale)，在含有1mL輔以2%葡萄糖/100μg/mL胺苄青黴素的2X TY培養基之96-深孔盤中接種0.5-1μL解凍之甘油貯存物(每一個孔一個選殖株)並在37℃下(900rpm)生長~4小時。接著，加入5μL之輔助噬菌體的1：29稀釋液(8.3×1013pfu)，並將該盤進一步在37℃下培育30分鐘，不搖動，再在300rpm下培育1小時。將該96-深孔盤進行離心並以含有介質的卡那黴素/非葡萄糖培養基(輔以50μg/mL之卡那黴素和100μg/mL之胺苄青黴素的2X TY)替換該培養基。令盤在25℃下(900rpm)生長過夜，並在離心後收穫在該上清液中之噬菌體。
ELISA測量scFv蛋白對人P-鈣黏蛋白-Fc之結合
在4℃下，將在PBS+Ca2+和Mg2+中之濃度為2μg/mL的P-鈣黏蛋白-ECD1-3-Fc蛋白或陰性對照蛋白塗層在96孔Nunc Maxisorp®盤(Thermo Fisher Scientific，康乃迪克州Madison)上一整夜。使用PBS+Ca2+和Mg2+將盤清洗三次並在室溫下，在3%乳汁/PBS+Ca2+和Mg2+中阻斷1小時。在室溫下，將依上述製備之噬菌體樣本加入該經阻斷之盤中1小時。以PBS+Ca2+和Mg2+將盤清洗三次，再加入二級抗體(抗M13-HRP 1：2000，GE Healthcare，紐澤西州Piscataway)。在室溫下將盤進一步培育1小時並以 PBS+Ca2+和Mg2+清洗六次。使用TMB(SurModics，明尼蘇達州Eden Prairie)發展信號，以H2S04終止反應並在EnVision®盤式分析儀(Perkin Elmer，麻薩諸塞州Waltham)上，在450nm讀取吸光度。
評估與人P-鈣黏蛋白之結合
藉由ELISA測試抗P-鈣黏蛋白scFv 153丙胺酸突變體之噬菌體製劑與人P-鈣黏蛋白-Fc蛋白之結合。以總結合信號(OD450)及與親代選殖株153相比較之結合百分比的形式繪製數據圖。然後，根據選殖株153之結合百分比的標準偏差計算Z-積分。此分析之數據呈現於表46和表47中。
結果指出噬菌體上之scFv表現良好並顯現出預期之選殖株153的結合活性。某些CDR殘基被認為重要，因為突變成Ala將負面影響人P-鈣黏蛋白之結合且Z積分小於-1。某些CDR殘基被認為是中等重要，因為突變成Ala將導致Z積分介於-0.2和-1.0之間。這些結果表明H1.8、H2.5、H3.1、H3.7和L3.3對人P-鈣黏蛋白之結合而言是重要的AA，而H2.6、H2.16、H3 5、H3.9、L1.8、L2.2、L2.3、L3.2和L3.2對結合而言是適度重要的。
本文所提供之丙胺酸掃描數據和結構信息(實施例15)表明在抗P-鈣黏蛋白scFv 153中有相當數量之CDR殘基可被取代而不會顯著影響抗原結合。因此，進行進一步分析以測定哪些CDR殘基可在不會顯著影響P-鈣黏蛋白結合下被取代。表48-65顯示出使用Discovery Studio 4.0 Stability預測算法所預測之每個位置的Delta Delta G(DDG)穩定性。穩定性評分(DDG)指出突變對蛋白質穩定性之預測效果。
表66-71顯示出在每個CDR位置之人序列的Abysis分析結果。將來自抗P-鈣黏蛋白153之各CDR與來自數 據庫之人抗體序列的對應CDR相比較。此數據庫結合來自多個數據庫之所有人序列，該多個數據庫包括：PDB、Kabat數據庫、IMGT數據庫、VBASE和輝瑞之內部數據庫。在此數據庫中之人抗體序列為以Abysis編號之Kabat，而CDR殘基之頻率僅使用與抗P-鈣黏蛋白選殖株153中所發現者具有相同長度的CDR計算。表66-71顯示出每個位置處之替換胺基酸，其中該所列出之殘基存在於至少5%或10%之人序列中。原始P-鈣黏蛋白153殘基亦包含在第3行和第4行中，即使他們並不在上述之5%或10%類別中。
本文所引用之每一專利、專利申請案和出版物之揭示 內容的全文以引用方式併入本文中。
雖然本發明已參考特定之實施態樣揭示，顯然地，其他熟習本技藝之人士可設計本發明之其他實施態樣和變化而不悖離本發明之真正精神和範圍。所附之申請專利範圍包括所有該等實施態樣和等效之變化。
<110> 美商輝瑞股份有限公司 (Pfizer Inc.)
<120> 雙特異性異質二聚體雙功能抗體及彼等之用途
<130> PC72054A DIV 02
<140> TW 107142295
<141> 2015-06-29
<160> 239
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 1
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<211> 118
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<211> 118
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<223> 合成之肽序列
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<210> 9
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<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 10
<210> 11
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<220>
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<400> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 134
<210> 135
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 135
<210> 136
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 136
<210> 137
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 137
<210> 138
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 138
<210> 139
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 139
<210> 140
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 140
<210> 141
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 141
<210> 142
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 142
<210> 143
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 143
<210> 144
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 144
<210> 145
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 145
<210> 146
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 146
<210> 147
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 147
<210> 148
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 148
<210> 149
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 149
<210> 150
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 150
<210> 151
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 151
<210> 152
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 152
<210> 153
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 153
<210> 154
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 154
<210> 155
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 155
<210> 156
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 156
<210> 157
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 157
<210> 158
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 158
<210> 159
<211> 829
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 159
<210> 160
<211> 24
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 160
<210> 161
<211> 83
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 161
<210> 162
<211> 108
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 162
<210> 163
<211> 113
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 163
<210> 164
<211> 112
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 164
<210> 165
<211> 106
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 165
<210> 166
<211> 104
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 166
<210> 167
<211> 179
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 167
<210> 168
<211> 221
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 168
<210> 169
<211> 333
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 169
<210> 170
<211> 439
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 170
<210> 171
<211> 543
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 171
<210> 172
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 172
<210> 173
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 173
<210> 174
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 174
<210> 175
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 175
<210> 176
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 176
<210> 177
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 177
<210> 178
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 178
<210> 179
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 179
<210> 180
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 180
<210> 181
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 181
<210> 182
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 182
<210> 183
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 183
<210> 184
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 184
<210> 185
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 185
<210> 186
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 186
<210> 187
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 187
<210> 188
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 188
<210> 189
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 189
<210> 190
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 190
<210> 191
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 191
<210> 192
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 192
<210> 193
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 193
<210> 194
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 194
<210> 195
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 195
<210> 196
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 196
<210> 197
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 197
<210> 198
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 198
<210> 199
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 199
<210> 200
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 200
<210> 201
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 201
<210> 202
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 202
<210> 203
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 203
<210> 204
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 204
<210> 205
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 205
<210> 206
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 206
<210> 207
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 207
<210> 208
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 208
<210> 209
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 209
<210> 210
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 210
<210> 211
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 211
<210> 212
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 212
<210> 213
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 213
<210> 214
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 214
<210> 215
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 215
<210> 216
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 216
<210> 217
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 217
<210> 218
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 218
<210> 219
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 219
<210> 220
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 220
<210> 221
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 221
<210> 222
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 222
<210> 223
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 223
<210> 224
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 224
<210> 225
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 225
<210> 226
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 226
<210> 227
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 227
<210> 228
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 228
<210> 229
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 229
<210> 230
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 230
<210> 231
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 231
<210> 232
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 232
<210> 233
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 233
<210> 234
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 234
<210> 235
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之核苷酸序列
<400> 235
<210> 236
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 236
<210> 237
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 237
<210> 238
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 238
<210> 239
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之肽序列
<400> 239

Claims (10)

  1. 一種能夠特異結合至P-鈣黏蛋白之表位及結合至CD3之表位的雙特異性異質二聚體雙功能抗體，其包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈及該第二條多肽鏈包含如第30A、30B、31 A、31B、32A或32B圖中所提出之序列。
  2. 一種結合至P-鈣黏蛋白且競爭結合至如申請專利範圍第1項之雙特異性異質二聚體雙功能抗體的雙特異性異質二聚體雙功能抗體。
  3. 一種醫藥組成物，其包含治療有效量之如申請專利範圍第1至2項中任一項之雙特異性異質二聚體雙功能抗體和醫藥上可接受之載體。
  4. 一種如申請專利範圍第1至2項中任一項之雙特異性異質二聚體雙功能抗體於製造用於治療P-鈣黏蛋白相關病症之藥物的用途。
  5. 如申請專利範圍第4項之用途，其中該P-鈣黏蛋白相關病症為癌症。
  6. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：乳癌、結腸直腸癌、卵巢癌、胃癌、甲狀腺癌、前列腺癌、子宮頸癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、子宮內膜癌、頭頸癌、睾丸癌及膠質母細胞癌。
  7. 如申請專利範圍第4項之用途，其中該藥物活化細胞毒性T細胞反應。
  8. 一種經分離之宿主細胞，其重組製造如申請專利範圍第1至2項中任一項之雙特異性異質二聚體雙功能抗體。
  9. 一種經分離之多核苷酸，其包含編碼如申請專利範圍第1至2項中任一項之雙特異性異質二聚體雙功能抗體的核苷酸序列。
  10. 一種載體，其包含如申請專利範圍第9項之多核苷酸。
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TW104120955A TWI659042B (zh) 2014-07-01 2015-06-29 雙特異性異質二聚體雙功能抗體及彼等之用途

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US (2) US9884921B2 (zh)
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WO (1) WO2016001810A1 (zh)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2020120613A (ru) 2014-12-05 2021-12-06 Мемориал Слоан-Кеттеринг Кэнсер Сентер Антитела, нацеленные на рецептор, связанный с g-белками, и способы их применения
RS62870B1 (sr) 2014-12-05 2022-02-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Himerni antigenski receptori sa ciljanim delovanjem na receptore spregnute sa g-proteinom i njihove upotrebe
TW202311292A (zh) * 2015-04-17 2023-03-16 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄｈ３與ｃｄ３之雙特異性抗體構築體
EP3322735A4 (en) * 2015-07-15 2019-03-13 Zymeworks Inc. BISPECIFIC ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS CONJUGATED TO A MEDICINAL PRODUCT
US20190185578A1 (en) * 2016-07-29 2019-06-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibody exhibiting increased alternative fviii-cofactor-function activity
CN106496331B (zh) * 2016-11-08 2020-03-13 北京智岭生物医药科技有限公司 一种FSH-Fc融合蛋白及其制备方法和用途
AU2018219887A1 (en) 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
AU2018243114C1 (en) * 2017-03-29 2022-05-05 Cytoarm Co., Ltd. Antigen-specific T cells and uses thereof
EP3601345A1 (en) * 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
CN110382542B (zh) * 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
CN108866635B (zh) * 2017-05-09 2021-11-26 安升（上海）医药科技有限公司 多特异性蛋白药物及其文库、以及制备方法和应用
EP3630808A1 (en) 2017-06-02 2020-04-08 Pfizer Inc Recombinant robo2 proteins, compositions, methods and uses thereof
US20180371088A1 (en) * 2017-06-22 2018-12-27 Development Center For Biotechnology TARGET CELL-DEPENDENT T CELL ENGAGING AND ACTIVATION ASYMMETRIC HETERODIMERIC Fc-ScFv FUSION ANTIBODY FORMAT AND USES THEREOF IN CANCER THERAPY
US10759870B2 (en) 2017-09-29 2020-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multispecific antigen-binding molecules having blood coagulation factor VIII (FVIII) cofactor function-substituting activity and pharmaceutical formulations containing such a molecule as an active ingredient
KR101973060B1 (ko) * 2017-10-20 2019-04-26 주식회사 녹십자 항-cd3 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
CN109706164A (zh) * 2017-10-26 2019-05-03 深圳新诺微环生物科技有限公司 微环dna表达连接人和猴cd20与效应细胞抗原的桥接分子及其应用
CN109706163A (zh) * 2017-10-26 2019-05-03 深圳新诺微环生物科技有限公司 微环dna表达连接人与动物靶细胞与效应细胞的桥接分子及其应用
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
PE20201342A1 (es) 2018-02-28 2020-11-25 Pfizer Variantes de il-15 y usos de las mismas
WO2019217332A1 (en) * 2018-05-07 2019-11-14 Dragonfly Therapeutics, Inc. A protein binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
TWI816396B (zh) * 2018-05-23 2023-09-21 美商輝瑞大藥廠 特異性針對gucy2c之抗體及其用途
KR102602329B1 (ko) 2018-05-23 2023-11-16 화이자 인코포레이티드 Cd3에 특이적인 항체 및 이의 용도
WO2020132574A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 CentryMed Pharmaceutical Inc. Protease cleavable bispecific antibodies and uses thereof
WO2020128893A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Pfizer Inc. Combination treatments of cancer comprising a tlr agonist
CN110357969B (zh) * 2019-05-27 2022-03-08 北京志道生物科技有限公司 一种GLP1-EGFa异源二聚体蛋白、功能及方法
US11339159B2 (en) 2019-07-17 2022-05-24 Pfizer Inc. Toll-like receptor agonists
CN113416258B (zh) * 2019-10-24 2023-08-29 北京免疫方舟医药科技有限公司 一种多特异性抗体及其制备方法和用途
US11702474B2 (en) 2019-12-17 2023-07-18 Pfizer Inc. Antibodies specific for CD47, PD-L1, and uses thereof
CA3164804A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Pfizer Inc. Once daily cancer treatment regimen with a prmt5 inhibitor
EP4118105A2 (en) 2020-03-09 2023-01-18 Pfizer Inc. Cd80-fc fusion protein and uses thereof
JP2023524854A (ja) 2020-05-13 2023-06-13 ファイザー・インク がんを処置するための方法、治療、および使用
MX2023000662A (es) 2020-07-17 2023-02-27 Pfizer Anticuerpos terapeuticos y sus usos.
AU2021339096A1 (en) 2020-09-14 2023-04-06 Pfizer Inc. Methods, therapies and uses for treating cancer
WO2022153161A1 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Pfizer Inc. Treatment of cancer using a prmt5 inhibitor
WO2023218320A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Anti-lymphotoxin beta receptor antibodies and methods of use thereof
WO2023242769A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 Pfizer Inc. Il-12 variants, anti-pd1 antibodies, fusion proteins, and uses thereof
WO2024003773A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Pfizer Inc. 2,7-naphthyridine compounds as mastl inhibitors
WO2024009191A1 (en) 2022-07-05 2024-01-11 Pfizer Inc. Pyrido[4,3-d]pyrimidine compounds
WO2024074977A1 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Pfizer Inc. Substituted 1 h-pyrazolo-pyridine and-pyrimidine compounds
WO2024084364A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Pfizer Inc. Compounds for the treatment of cancer

Family Cites Families (196)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0088994B1 (en) 1982-03-15 1991-06-19 Schering Corporation Hybrid dna, binding composition prepared thereby and processes therefor
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
WO1991001752A1 (en) 1989-07-27 1991-02-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunosuppressive monoclonal antibodies, hybridomas and methods of transplantation
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5811267A (en) 1990-10-29 1998-09-22 Chiron Corporation Isolated nucleic acid molecules encoding antigen binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
JPH08504320A (ja) 1992-09-25 1996-05-14 コモンウエルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼーション 標的結合性ポリペプチド
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
JP3720353B2 (ja) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
DE69327229T2 (de) 1992-12-11 2000-03-30 Dow Chemical Co Multivalente einkettige Antikörper
ES2199959T3 (es) 1993-02-04 2004-03-01 Borean Pharma A/S Procedimiento mejorado para el replegamiento de proteinas.
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
IT1271461B (it) 1993-12-01 1997-05-28 Menarini Ricerche Sud Spa Anticorpo monoclonale bispecifico anti-cd3/anti-egfr,processo per la produzione e suo uso.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
WO1997014719A1 (en) 1995-10-16 1997-04-24 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
DE69738326T2 (de) 1996-07-12 2008-07-03 Mcgill University, Montreal Verbindungen und verfahren zur regulierung der zellanlagerung
JP2000516452A (ja) 1996-07-16 2000-12-12 プリュックテュン，アンドレアス 可溶性が増大した免疫グロブリンスーパーファミリードメインおよびフラグメント
WO1998041613A1 (en) 1997-03-14 1998-09-24 Otten Gillis R Targeted cytolysis of cancer cells
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
AU2152299A (en) 1997-10-27 1999-05-24 Unilever Plc Multivalent antigen-binding proteins
US6485910B1 (en) 1998-02-09 2002-11-26 Incyte Genomics, Inc. Ras association domain containing protein
AU3295299A (en) 1998-02-19 1999-09-06 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for regulating lymphocyte activation
HUP9900956A2 (hu) 1998-04-09 2002-04-29 Aventis Pharma Deutschland Gmbh. Egyláncú, több antigéntkötőhely kialakítására képes molekulák, előállításuk és alkalmazásuk
US6783961B1 (en) 1999-02-26 2004-08-31 Genset S.A. Expressed sequence tags and encoded human proteins
AU761587B2 (en) 1998-04-21 2003-06-05 Amgen Research (Munich) Gmbh CD19xCD3 specific polypeptides and uses thereof
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9812545D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
ATE251181T1 (de) 1998-07-28 2003-10-15 Micromet Ag Heterominikörper
DK1124568T3 (da) 1998-10-21 2008-01-02 Altor Bioscience Corp Polyspecifikke bindingsmolekyler og anvendelser deraf
US20020142000A1 (en) 1999-01-15 2002-10-03 Digan Mary Ellen Anti-CD3 immunotoxins and therapeutic uses therefor
DE19905048A1 (de) 1999-02-08 2000-08-10 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verwendung depletorisch oder mitogen wirkender Antikörper in der Immuntherapie
AU2001243142A1 (en) 2000-02-03 2001-08-14 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
HUP0300369A2 (hu) 2000-04-11 2003-06-28 Genentech, Inc. Többértékű antitestek és alkalmazásuk
WO2001080883A1 (en) 2000-04-26 2001-11-01 Elusys Therapeutics, Inc. Bispecific molecules and uses thereof
US20040047854A1 (en) 2001-07-27 2004-03-11 Black Roy A. Human disintegrin protein
GB0025307D0 (en) 2000-10-16 2000-11-29 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
US20040053245A1 (en) 2001-02-05 2004-03-18 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and polypeptides
US20050118164A1 (en) 2001-03-09 2005-06-02 William Herman Targeted ligands
WO2002072635A2 (en) 2001-03-13 2002-09-19 University College London Specific binding members
JP2005522982A (ja) 2001-05-31 2005-08-04 カイロン コーポレイション 癌治療のための標的としてのｐ−カドヘリン
US7189507B2 (en) 2001-06-18 2007-03-13 Pdl Biopharma, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
JP4303105B2 (ja) 2001-06-28 2009-07-29 ドマンティス リミテッド 二重特異性リガンドとその利用
WO2003022987A2 (en) 2001-07-26 2003-03-20 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of hepatitis c infection, compositions and methods of screening for modulators of hepatitis c infection
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
DE60124912T2 (de) 2001-09-14 2007-06-14 Affimed Therapeutics Ag Multimerische, einzelkettige, Tandem-Fv-Antikörper
US20040241703A1 (en) 2002-08-19 2004-12-02 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20050069549A1 (en) 2002-01-14 2005-03-31 William Herman Targeted ligands
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2003227504A1 (en) 2002-04-15 2003-10-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD OF CONSTRUCTING scDb LIBRARY
EP1354600A1 (en) 2002-04-19 2003-10-22 Affimed Therapeutics AG Antibody combination useful for tumor therapy
US20040018493A1 (en) 2002-07-12 2004-01-29 Anastasio Alison E. Haplotypes of the CD3E gene
EP1541588A4 (en) 2002-07-18 2007-09-12 Cellfree Sciences Co Ltd SINGLE CHAIN ANTIBODIES AND USE THEREOF
US7820166B2 (en) 2002-10-11 2010-10-26 Micromet Ag Potent T cell modulating molecules
US9701754B1 (en) 2002-10-23 2017-07-11 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
EP1560597A4 (en) 2002-10-29 2007-06-27 Pharmacia Corp DIFFERENTIALLY EXPRESSED GENES INVOLVED IN CANCER, POLYPEPTIDES CODED THEREWITH, AND METHODS OF USING GENES
WO2004044000A2 (en) 2002-11-14 2004-05-27 Adherex Technologies, Inc. Compounds and methods for modulating functions of classical cadherins
CA2504144A1 (en) 2002-11-26 2004-06-10 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis of immune related diseases using pro7
JP2006524991A (ja) 2003-05-08 2006-11-09 エクサイト セラピーズ インコーポレーティッド 抗原特異的ｔ細胞の作製および単離の方法
ATE455127T1 (de) 2003-05-31 2010-01-15 Micromet Ag Humane anti-humane cd3-bindungsmoleküle
CN100509850C (zh) 2003-05-31 2009-07-08 麦克罗梅特股份公司 用于治疗b细胞相关疾病的包含双特异性抗cd3、抗cd19抗体构建体的药物组合物
AU2004247737B2 (en) 2003-06-11 2009-04-23 Wyeth Platelet glycoprotein IB alpha variant fusion polypeptides and methods of use thereof
US20050163782A1 (en) 2003-06-27 2005-07-28 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
AU2004220325B2 (en) 2003-06-30 2011-05-12 Domantis Limited Polypeptides
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
US20070037204A1 (en) 2003-08-08 2007-02-15 Hiroyuki ABURANTAI Gene overexpressed in cancer
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
WO2005028507A1 (en) 2003-09-24 2005-03-31 Monash University CRYSTAL STRUCTURE OF CD3&epsiv;Ϝ/OKT3 COMPLEX
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
EP1593690B1 (en) 2004-05-05 2009-07-01 Micromet AG Preparation of ScFv antibody fragments
DK1753783T3 (en) 2004-06-03 2014-11-17 Novlmmune Sa Anti-CD3 antibodies, and methods of use thereof
JP2008512352A (ja) 2004-07-17 2008-04-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 新規な四価の二重特異性抗体
AU2005282700A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
KR20130105885A (ko) 2005-01-05 2013-09-26 에프-스타 비오테크놀로기쉐 포르슝스 운드 엔트비클룽스게스.엠.베.하. 상보성 결정부위와 다른 분자의 부위에서 처리된 결합성을 갖는 합성 면역글로불린 영역
US7998695B2 (en) 2005-02-10 2011-08-16 Oncotherapy Science, Inc. Method of diagnosing bladder cancer
US20120237442A1 (en) 2005-04-06 2012-09-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Design and Construction of Novel Multivalent Antibodies
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9296816B2 (en) * 2005-04-15 2016-03-29 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
AU2006238930B2 (en) * 2005-04-26 2010-12-23 Pfizer Inc. P-cadherin antibodies
US8603986B2 (en) 2005-04-28 2013-12-10 Mcgill University Compounds and methods for modulating cadherin-mediated processes
US9241994B2 (en) 2005-06-10 2016-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
JP2006345852A (ja) 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corp 抗体複合体
BRPI0615745A2 (pt) 2005-09-12 2011-05-24 Novimmune Sa formulação de anticorpo anti-cd3
JP5686953B2 (ja) 2005-10-11 2015-03-18 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 交差種特異的（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を含む組成物および該組成物の使用
JP5399712B2 (ja) 2005-12-21 2014-01-29 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 可溶性ｃｅａに対する抵抗性を有する医薬組成物
WO2007075672A2 (en) 2005-12-23 2007-07-05 Lankenau Institute For Medical Research Prognostic cancer markers
JP2009528257A (ja) * 2006-02-28 2009-08-06 オンコセラピー・サイエンス株式会社 抗ｃｄｈ３抗体のエフェクター機能を用いて細胞を障害する方法
WO2007106507A2 (en) 2006-03-14 2007-09-20 Petrie Howard T Detection of gene expression in mixed sample or tissue
KR101516823B1 (ko) 2006-03-17 2015-05-07 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 안정화된 폴리펩티드 조성물
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
US8535677B2 (en) 2006-06-06 2013-09-17 Oxford Biotherapeutics, Ltd. Antibody drug conjugate treatment of colorectal cancer
TWI615403B (zh) 2007-02-21 2018-02-21 腫瘤療法 科學股份有限公司 表現腫瘤相關抗原之癌症的胜肽疫苗
ES2695047T3 (es) * 2007-04-03 2018-12-28 Amgen Research (Munich) Gmbh Dominio de unión específico entre especies
TR201816277T4 (tr) 2007-04-03 2018-11-21 Amgen Res Munich Gmbh Çapraz-tür-spesifik bağlama alanı.
WO2008124858A2 (en) 2007-04-11 2008-10-23 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges. M.B.H. Targeted receptor
EP2164508B1 (en) 2007-06-04 2014-01-08 Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences Agents for the treatment of inflammatory diseases and methods of using same
JP2010535032A (ja) 2007-07-31 2010-11-18 メディミューン，エルエルシー 多重特異性エピトープ結合性タンパク質およびその用途
ES2628395T3 (es) 2007-08-15 2017-08-02 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Anticuerpo regulado por proteasa
CN104356225B (zh) 2007-08-20 2018-02-13 肿瘤疗法科学股份有限公司 Cdh3 肽以及含有cdh3 肽的药剂
ES2622460T3 (es) 2007-09-26 2017-07-06 Ucb Biopharma Sprl Fusiones de anticuerpos con doble especificidad
US20100310451A1 (en) 2007-11-01 2010-12-09 The Royal Institution For The Advancement Of Learn Altered n-cadherin processing in tumor cells by furin and proprotein convertase 5a (pc5a)
US20110008345A1 (en) 2007-11-30 2011-01-13 Claire Ashman Antigen-binding constructs
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
EP2080812A1 (en) 2008-01-18 2009-07-22 Transmedi SA Compositions and methods of detecting post-stop peptides
KR20110014607A (ko) 2008-04-29 2011-02-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
RU2011103199A (ru) 2008-06-30 2012-08-10 Онкотерапи Сайенс, Инк. (Jp) Антитела против cdh3, меченные радиоизотопной меткой, и их применение
TW201008574A (en) 2008-08-19 2010-03-01 Oncotherapy Science Inc INHBB epitope peptides and vaccines containing the same
PT2352763E (pt) 2008-10-01 2016-06-02 Amgen Res (Munich) Gmbh Anticorpos biespecíficos de cadeia única com especificidade para antigénios-alvo com elevado peso molecular
WO2010037835A2 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Micromet Ag Cross-species-specific pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinxcd3, epcamxc d3, igf-1rxcd3 or fapalpha xcd3 bispecific single chain antibody
CA2738565C (en) 2008-10-01 2023-10-10 Micromet Ag Cross-species-specific psmaxcd3 bispecific single chain antibody
WO2010037838A2 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Micromet Ag Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
WO2010040545A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Novoplant Gmbh Proteolytically stable antibody formats
WO2010042904A2 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Tcr complex immunotherapeutics
US20110020221A1 (en) 2009-04-09 2011-01-27 The Johns Hopkins University Cancer stem cell expression patterns and compounds to target cancer stem cells
WO2010126137A1 (ja) 2009-05-01 2010-11-04 国立大学法人 東京大学 抗カドヘリン抗体
JP5719354B2 (ja) 2009-05-27 2015-05-20 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 三重又は四重特異性抗体
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
WO2011028811A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
WO2011031833A2 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Theraclone Sciences, Inc. Human anti-cancer antibodies
ES2667258T3 (es) 2009-09-10 2018-05-10 Ucb Biopharma Sprl Anticuerpos multivalentes
EP3187877A1 (en) 2009-09-25 2017-07-05 XOMA Technology Ltd. Screening methods
EP2490714A4 (en) 2009-10-20 2013-11-13 Glaxo Group Ltd ASSAY OF ANTI-CD3 ANTIBODIES IN AUTOIMMUNE DISEASES
WO2011056997A1 (en) 2009-11-04 2011-05-12 Fabrus Llc Methods for affinity maturation-based antibody optimization
GB0920127D0 (en) 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
WO2011071541A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 The Scripps Research Institute Cadherin modulatory agents
KR20120107122A (ko) 2009-12-22 2012-09-28 노파르티스 아게 치료법에서 사용하기 위한 ４가 ｃｄ４７―항체 불변 영역 융합 단백질
US20110165161A1 (en) 2009-12-23 2011-07-07 Shih-Yao Lin Anti-epcam antibodies that induce apoptosis of cancer cells and methods using same
DK2519542T3 (en) 2009-12-28 2019-01-14 Onco Therapy Science Inc ANTI-CDH3 ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF.
CN102014475B (zh) 2010-01-08 2012-01-04 华为技术有限公司 资源映射、码分复用方法及装置
WO2011085178A1 (en) 2010-01-11 2011-07-14 Trustees Of Dartmouth College Monomeric bi-specific fusion protein
CA2789310C (en) 2010-02-10 2018-01-09 Fujifilm Ri Pharma Co., Ltd. Radioactive metal-labeled anti-cadherin antibody
PL2361936T3 (pl) 2010-02-25 2016-10-31 Cząsteczka wiążąca antygen i jej zastosowania
US8569450B2 (en) 2010-03-03 2013-10-29 Health Research Inc. CD3 epsilon immunogens and antibodies
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
SG185027A1 (en) 2010-05-03 2012-11-29 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
MX339622B (es) * 2010-08-02 2016-06-02 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y sus usos.
BR112013002940A2 (pt) 2010-08-13 2019-09-24 Baylor Res Institute adjuvantes de nova vacina baseados no direcionamento dos adjuvantes para os anticorpos diretamente às células que apresentam antígenos
MX358739B (es) 2010-08-14 2018-09-03 Abbvie Inc Star Proteinas de union a amiloide beta.
RU2608640C2 (ru) 2010-08-16 2017-01-23 Новиммун С.А. Способы получения мультиспецифичных и мультивалентных антител
NZ610267A (en) 2010-10-08 2015-05-29 Hope City A monoclonal antibody framework binding interface for meditopes, meditope delivery systems and methods for their use
JP2014015396A (ja) 2010-10-29 2014-01-30 Perseus Proteomics Inc 高い親和性を有する抗ｃｄｈ３抗体
DK2634194T3 (en) 2010-10-29 2018-10-01 Perseus Proteomics Inc ANTI-CDH3 ANTIBODY WITH HIGH INTERNALIZATION CAPACITY
KR102244173B1 (ko) 2010-11-30 2021-04-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 세포상해 유도 치료제
US20120195900A1 (en) 2010-12-22 2012-08-02 Abbott Laboratories Tri-variable domain binding proteins and uses thereof
EP2654792A4 (en) 2010-12-22 2016-05-11 Abbvie Inc HALF IMMUNOGLOBULIN BINDING PROTEINS AND USES THEREOF
US10689447B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
TW201247706A (en) 2011-03-08 2012-12-01 Baylor Res Inst Novel vaccine adjuvants based on targeting adjuvants to antibodies directly to antigen-presenting cells
JP2014515598A (ja) 2011-03-10 2014-07-03 エイチシーオー アンティボディ， インク． 二重特異性三鎖抗体様分子
CA2830254C (en) 2011-03-16 2019-09-10 Amgen Inc. Fc variants
JP6130307B2 (ja) 2011-03-17 2017-05-17 ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム 再指向性免疫療法
AU2012227883A1 (en) 2011-03-17 2013-10-24 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Bi- and monospecific, asymmetric antibodies and methods of generating the same
WO2012129227A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 Baylor Research Institute Dendritic cells (dcs) targeting for tuberculosis (tb) vaccine
TW201300418A (zh) 2011-03-25 2013-01-01 Baylor Res Inst 用於抗ｃ型肝炎病毒免疫之組合物及方法
TWI803876B (zh) 2011-03-28 2023-06-01 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
DK2699598T3 (en) 2011-04-19 2019-04-23 Pfizer COMBINATIONS OF ANTI-4-1BB ANTIBODIES AND ADCC-INducing ANTIBODIES FOR TREATMENT OF CANCER
JP2014518615A (ja) 2011-04-22 2014-08-07 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー 前立腺特異的膜抗原結合タンパク質および関連組成物ならびに方法
CN107936121B (zh) * 2011-05-16 2022-01-14 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
PL2714733T4 (pl) 2011-05-21 2019-08-30 Macrogenics, Inc. Cząsteczki wiążące CD3 zdolne do wiązania z ludzkim i nieludzkim CD3
CA2836873C (en) 2011-05-21 2019-10-22 Macrogenics, Inc. Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life
DK2714738T3 (en) 2011-05-24 2019-01-28 Zyngenia Inc MULTIVALENT AND MONOVALENT MULTISPECIFIC COMPLEXES AND THEIR APPLICATIONS
WO2012162583A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Design and construction of novel multivalent antibodies
EP2726510B1 (en) 2011-05-27 2023-03-08 F. Hoffmann-La Roche AG Dual targeting
BR112013031762A2 (pt) 2011-06-16 2016-09-13 Novartis Ag proteínas solúveis para utilização como terapêuticos
US9127061B2 (en) 2011-06-24 2015-09-08 Perseus Proteomics Inc. Anti-human P-cadherin (CDH3) recombinant antibody
US20140242081A1 (en) 2011-07-18 2014-08-28 Micromet Ag Dosing regimens for treatment of cea-expressing cancers
BR112014001573B8 (pt) 2011-07-22 2022-11-08 Affimed Therapeutics Ag Molécula fv ao antígeno multivalente
MY171038A (en) 2011-08-23 2019-09-23 Roche Glycart Ag Bispecific antigen binding molecules
RU2617970C2 (ru) 2011-08-23 2017-04-28 Рош Гликарт Аг Антитела, не содержащие fc-фрагмента, включающие два fab-фрагмента, и способы их применения
EP2747781B1 (en) 2011-08-23 2017-11-15 Roche Glycart AG Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
UA116192C2 (uk) 2011-08-23 2018-02-26 Рош Глікарт Аг Активуюча т-клітини біоспецифічна антигензв'язуюча молекула
US20130058947A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc Novel Modulators and Methods of Use
WO2013041865A1 (en) 2011-09-22 2013-03-28 Immunocore Limited T cell receptors
JP2014533929A (ja) 2011-09-23 2014-12-18 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー ５ｔ４およびｃｄ３に対する二重特異的結合性分子
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
ES2628075T3 (es) 2011-12-19 2017-08-01 Synimmune Gmbh Molécula de anticuerpo biespecífica
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
ES2680151T3 (es) 2012-03-01 2018-09-04 Amgen Research (Munich) Gmbh Moléculas de unión de polipéptidos de larga duración
JP6113717B2 (ja) 2012-04-04 2017-04-12 株式会社ペルセウスプロテオミクス 抗ｃｄｈ３（ｐ−カドヘリン）抗体の薬剤コンジュゲート
SG10201608307WA (en) 2012-04-20 2016-11-29 Emergent Product Dev Seattle Cd3 binding polypeptides
EA039663B1 (ru) * 2012-05-03 2022-02-24 Амген Инк. Применение антитела против pcsk9 для снижения сывороточного холестерина лпнп и лечения связанных с холестерином расстройств
US10647756B2 (en) * 2015-05-18 2020-05-12 Pfizer Inc. Humanized antibodies

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