ES2628075T3 - Molécula de anticuerpo biespecífica - Google Patents

Abstract

Una molécula de anticuerpo biespecífica recombinante que consiste en un fragmento Fab que comprende un primer sitio de unión para un primer antígeno, un fragmento Fv monocatenario que comprende un segundo sitio de unión para un segundo antígeno y un dominio CH2 de inmunoglobulina, donde el fragmento Fab comprende además la región de bisagra, donde el fragmento Fab y el fragmento Fv monocatenario están unidos a través del dominio CH2, donde al menos un resto de aminoácido del dominio CH2 que puede mediar la unión a receptores Fc está ausente o mutado, y donde además los restos de aminoácido de las posiciones de secuencia 226 y 229 (numeración de posiciones de secuencia de acuerdo con el índice EU) están ausentes o mutadas, donde dicho al menos un resto de aminoácido de la región de bisagra o el dominio CH2 que puede mediar la unión a receptores Fc está ausente o mutado, se selecciona del grupo que consiste en la posición de secuencia 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 297, 327 y 330 (numeración de posiciones de secuencia de acuerdo con el índice EU).

Description

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aproximadamente 10-9 a 10-11 M o incluso superior. De esta manera, también se incluyen en la presente invención moléculas de anticuerpo con una afinidad del primer sitio de unión y/o el segundo sitio de unión en el intervalo picomolar (con una KD de 10-12 M). Si es necesario, la unión no específica de un sitio de unión puede reducirse sin afectar de forma sustancial a la unión específica variando las condiciones de unión.

5 En algunas realizaciones, un antígeno al que se une un anticuerpo de acuerdo con la invención es un antígeno que está incluido en la matriz extracelular o es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, un antígeno al que se une un anticuerpo de acuerdo con la invención es un antígeno asociado a tumores. Se entiende que dicho antígeno asociado a tumores puede incluirse en la matriz extracelular o puede ser un antígeno de la superficie celular.

La expresión "matriz extracelular" se refiere a la región de tejido de un animal multicelular, incluyendo un ser humano, que se encuentra en el espacio intercelular, es decir, entre las células del tejido respectivo. La matriz extracelular es básicamente una red de proteínas tales como colágenos fibrilares y no fibrilares o elastina, de

15 glicoproteínas tales como laminina o fibronectina, de proteoglicanos tales como condroitín sulfato o queratán sulfato y de polisacáridos tales como ácido hialurónico. La matriz extracelular sirve, entre otras cosas, para separar tejidos diferentes entre sí o para regular la comunicación intercelular. En algunas realizaciones, un antígeno asociado a tumores puede expresarse parcial o exclusivamente en la matriz extracelular de un tumor.

La expresión "antígeno de la superficie celular", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que se presenta en la superficie de una célula. Típicamente, dicha molécula se localiza en o sobre la membrana plasmática de la célula de tal forma que al menos parte de esta molécula permanece accesible desde el entorno, es decir, desde el exterior de la célula. Una molécula respectiva consiste en o incluye típicamente restos de aminoácido y/o sacárido. Un ejemplo ilustrativo de una molécula de la superficie celular, que está localizada en la membrana 25 plasmática, es una proteína transmembrana que, en su conformación tridimensional, tiene regiones de hidrofilia e hidrofobia. Una o más regiones hidrófobas permiten que la molécula de la superficie celular esté incluida o esté insertada en la membrana plasmática hidrófoba de la célula, mientras que las regiones hidrófilas de la proteína se extienden sobre cualquier lado de la membrana plasmática hacia el citoplasma y el espacio extracelular, respectivamente. Los ejemplos de una molécula de la superficie celular localizada en la membrana plasmática incluyen, pero sin limitación, una proteína con un resto de cisteína modificado postraduccionalmente que lleva un grupo palmitoilo, una proteína modificada en el resto de cisteína C-terminal que lleva un grupo farnesilo o una proteína modificada en el extremo C que lleva un anclaje de glicosil fosfatidil inositol ("GPI"). Estos grupos permiten la unión covalente de proteínas a la superficie externa de la membrana plasmática, con lo que permanecen accesibles para el reconocimiento por moléculas extracelulares tales como anticuerpos. Los ejemplos de antígenos

35 de la superficie celular incluyen una molécula de receptor de la superficie celular tal como un receptor acoplado a proteína G (por ejemplo, el receptor β adrenérgico), un receptor de tirosina quinasa (tal como EGFR, EGFRvIII, Her2/neu, HER2/c-neu, PDGFRα, ILR-1, TNFR, CD30, CD33 o GMCSFR), un receptor de membrana con actividad tirosina quinasa asociada (tal como IL6R o LIFR) o un receptor de membrana con actividad Ser/Thr quinasa (tal como TGFβR), por nombrar solo algunos ejemplos.

Los ejemplos de antígeno asociado a tumores que está incluido en la matriz extracelular incluyen, pero sin limitación, un proteoglicano tal como el Proteoglicano de Condroitín Sulfato asociado a Melanoma (CSPG4) o CD44v6, incluyendo una mucina tal como Muc-1 o una enzima unida a la membrana tal como la anhidrasa Carbónica IX (CAIX). Son ejemplos de dichos antígenos tenascina y la proteína activadora del fibroblasto (FAP).

45 La expresión "molécula de anticuerpo aislada", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son elementos que podrían interferir con los usos de diagnóstico

o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo se purifica hasta más de un 95 % en peso de anticuerpo, según se determina por el método de Lowry, tal como más de un 99 % en peso. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo se purifica en un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos Nterminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria. En algunas realizaciones, el anticuerpo se purifica hasta la homogeneidad a juzgar por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de

55 Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. En algunas realizaciones, puede estar presente una molécula de anticuerpo aislada dentro de células recombinantes, sin que estén presentes uno o más componentes del entorno natural del anticuerpo. Típicamente, un anticuerpo aislado se prepara por al menos una etapa de purificación.

Los términos "VH" y "VL" se usan en el presente documento para hacer referencia al dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera, respectivamente, de una inmunoglobulina. Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consiste en una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables. De esta manera, la expresión "región hipervariable" se refiere a los restos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable incluye restos de aminoácido de una "Región Determinante de Complementariedad" o "CDR". Hay tres CDR (o regiones CDR) de cadena pesada y 65 tres CDR (o regiones CDR) de cadena ligera en la parte variable de una inmunoglobulina. De esta manera, "CDR", como se usa en el presente documento, se refiere a las tres CDR de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) o

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engineered into conserved framework regions, Biochemistry 1994, 33, 6551-5459). Dichos fragmentos scFv también se conocen como fragmentos scFv estabilizador por disulfuro (ds-scFv).

La expresión "región Fc" o "fragmento Fc" se usa en el presente documento para definir una región C terminal de

5 una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. La parte Fc interviene en la función efectora de los anticuerpos, por ejemplo, la activación del sistema del complemento, y de células efectoras inmunitarias que llevan el receptor Fc, tales como células NK. En las moléculas de IgG humanas, la región Fc se genera por escisión mediante papaína del extremo N terminal en la Cys226. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región Fc de cadena pesada de IgG humana normalmente se define como un tramo desde el resto de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxilo de la misma. La lisina C terminal (resto 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc puede retirarse, por ejemplo, durante la producción o purificación de la molécula de anticuerpo, o mediante modificación recombinante por ingeniería genética del ácido nucleico que codifica una cadena pesada de la molécula de anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede incluir poblaciones de

15 anticuerpo con todos los restos K447 retirados, y poblaciones de anticuerpo sin los restos K447 retirados, y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el resto K447. Las regiones Fc de secuencia nativa adecuadas para uso en los anticuerpos de la divulgación incluyen IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 e IgG4 de mamífero, por ejemplo, humanas o murinas. La región Fc contiene dos o tres dominios constantes, dependiendo de la clase del anticuerpo. En realizaciones en las que la inmunoglobulina es una IgG, la región Fc tiene un dominio CH2 y un dominio CH3.

Una molécula de anticuerpo de acuerdo con la invención tiene dos cadenas, una cadena más corta, que en algunas realizaciones puede ser una cadena ligera, y una cadena principal, que en algunas realizaciones puede considerarse también la cadena pesada. La molécula de anticuerpo normalmente es un dímero de estas dos cadenas. Basándose 25 en los dominios incluidos en una molécula de anticuerpo de la invención, puede considerarse que la molécula de anticuerpo tiene un fragmento Fab, que generalmente incluye una región de bisagra, un dominio CH2, y un fragmento Fv monocatenario. En algunas moléculas de la divulgación, la molécula de anticuerpo también tiene un dominio CH3, generalmente dispuesto en posición C terminal del dominio CH2. En algunas moléculas, la disposición de los dominios de un anticuerpo de la divulgación corresponde a la disposición de dominios en una inmunoglobulina. Como dos ejemplos, la cadena más corta de una molécula de anticuerpo de la invención puede tener un dominio VL en el extremo N y un dominio CL en el extremo C de la cadena más corta, y la cadena principal puede tener un dominio VH en el extremo N y un dominio CH1 en el extremo C terminal de la misma. En algunas realizaciones, la cadena más corta puede tener un dominio VL en el extremo N y un dominio CH1 en el extremo C de la cadena más corta. En algunas realizaciones, la cadena más corta puede tener un dominio VH en el extremo N y un dominio CH1

35 en el extremo C de la cadena más corta. En algunas realizaciones, la cadena más corta puede tener un dominio VH en el extremo N y un dominio CL en el extremo C de la cadena más corta. En algunas realizaciones, la cadena principal puede tener un dominio VL en el extremo N y un dominio CH1 en el extremo C terminal de la misma. En algunas realizaciones, la cadena principal puede tener un dominio VH en el extremo N y un dominio CL en el extremo C terminal de la misma. En algunas realizaciones, la cadena principal puede tener un dominio VL en el extremo N y un dominio CL en el extremo C terminal de la misma.

La cadena más corta del anticuerpo puede estar unida a la cadena principal del anticuerpo por medio de uno o más, incluyendo dos o tres, enlaces disulfuro. Un enlace disulfuro respectivo puede definir un puente entre un resto de cisteína C terminal de la cadena más pequeña y un resto de cisteína dentro de la región de bisagra de la cadena

45 principal del anticuerpo.

En una molécula de anticuerpo de acuerdo con la invención, la región C terminal de la cadena principal puede definirse por un fragmento Fv monocatenario. El extremo C de la cadena principal, en algunas realizaciones, puede definirse por el dominio VH del fragmento scFv. En algunas realizaciones, el extremo C de la cadena principal puede definirse por el dominio VL del fragmento scFv. Por consiguiente, el fragmento scFv, en algunas realizaciones, puede acoplarse al dominio CH2 de la cadena principal a través del dominio VH, por ejemplo, al extremo N terminal del dominio VH. En algunas realizaciones, el fragmento scFv puede acoplarse al domino CH2 de la cadena principal a través del dominio VL, por ejemplo, el extremo N terminal del dominio VL. En algunas realizaciones, el dominio CH2 de la molécula de anticuerpo está unido al fragmento scFv a través del dominio variable de la cadena ligera

55 (dominio VL) del fragmento scFv. En algunas realizaciones, el dominio CH2 está unido al fragmento scFv a través del dominio variable de la cadena pesada (dominio VH) del fragmento scFv.

En algunas realizaciones, el fragmento Fab de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la invención, está unido al dominio CH2 a través de un dominio de cadena pesada del fragmento Fab. Por consiguiente, la cadena principal del anticuerpo puede tener un dominio de cadena pesada tal como un dominio CH1 (supra), que está acoplado al dominio CH2. Como se ha explicado anteriormente, un dominio CH1 respectivo puede acoplarse al dominio CH2 a través de una región de bisagra. El dominio de cadena pesada respectivo del fragmento Fab, en algunas realizaciones, puede estar dispuesto en el extremo N de la cadena polipeptídica de la cadena principal del anticuerpo. En algunas realizaciones, el fragmento Fab de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la invención 65 está unido al dominio CH2 a través de un dominio de cadena ligera del fragmento Fab. Por consiguiente, la cadena principal de la molécula de anticuerpo puede tener un dominio de cadena ligera tal como un dominio CL, que está

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coestimuladora secundaria. Otro ejemplo de un receptor de células T es 4-1BB, capaz de unirse al Ligando de 4-1BB en las células presentadoras de antígeno (APC), con lo que se genera una señal coestimuladora para la célula T. Otro ejemplo de un receptor encontrado predominantemente en las células T es CD5, que también se encuentra en las células B a bajos niveles. Otro ejemplo de un receptor que modifica las funciones de las células T es CD95,

5 también conocido como receptor Fas, que media la señalización apoptótica por un ligando Fas expresado en la superficie de otras células. Se ha notificado que CD95 modula las vías de señalización dirigidas por TCR/CD3 en los linfocitos T en reposo.

Un ejemplo de una molécula receptora específica de células NK es CD16, un receptor Fc de baja afinidad, y NKG2D. Un ejemplo de una molécula receptora que está presente en la superficie tanto de las células T como de las células citolíticas naturales (NK) es CD2 y otros miembros de la superfamilia de CD2. CD2 puede actuar como molécula coestimuladora en células T y NK.

En algunas realizaciones, el primer sitio de unión de la molécula de anticuerpo se une a un antígeno de superficie

15 asociado a tumores y el segundo sitio de unión se une a una molécula receptora específica de células T y/o una molécula receptora específica de células citolíticas naturales (NK). En algunas realizaciones, el primer sitio de unión de la molécula de anticuerpo se une a uno de A33, CAMPATH-1 (CDw52), antígeno carcinoembrionario (CEA), carboanhidrasa IX (MN/CA IX), CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, CDCP1, Her3, proteoglicano 4 de condroitín sulfato (CSPG4, proteoglicano de condroitín sulfato asociado a melanoma), CLEC14, Derlin1, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), EGFR de2-7, EGFRvIII, EpCAM, Endoglina, Ep-CAM, proteína activadora de fibroblasto (FAP), proteína de unión a folato, G250, tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT-3, CD135), c-Kit (CD117), CSF1R (CD115), frizzled 1-10, Her2/neu, HLA-DR, IGFR, receptor de IL-2, IL3R, MCSP (proteoglicano de condroitín sulfato de la superficie celular asociado a melanoma), Muc-1, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), antígeno de células madre de próstata

25 (PSCA), antígeno específico de próstata (PSA), TAG-72, Tenascina, Tem1-8, Tie2 y VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), PDGFR-α (CD140a), PDGFR-β (CD140b) y el segundo sitio de unión se une a una molécula receptora específica de células T y/o una molécula receptora específica de células citolíticas naturales (NK). En algunas realizaciones, el primer sitio de unión de la molécula de anticuerpo se une a un antígeno de superficie asociado a tumores y el segundo sitio de unión se une a uno de CD3, el receptor de células T (TCR), CD28, CD16, NKG2D, 0x40, 4-1 BB, CD2, CD5 y CD95.

En algunas realizaciones, el primer sitio de unión de la molécula de anticuerpo se une a una molécula receptora específica de células T y/o una molécula receptora específica de células citolíticas naturales (NK) y el segundo sitio de unión se une a un antígeno de superficie asociado a tumores. En algunas realizaciones, el primer sitio de unión 35 del anticuerpo se une a una molécula receptora específica de células T y/o una molécula receptora específica de células citolíticas naturales (NK) y el segundo sitio de unión se une a uno de A33, CAMPATH-1 (CDw52), antígeno carcinoembrionario (CEA), carboanhidrasa IX (MN/CA IX), CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, CDCP1, Her3, proteoglicano 4 de condroitín sulfato (CSPG4, proteoglicano de condroitín sulfato asociado a melanoma), CLEC14, Derlin1, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), EGFR de2-7, EGFRvIII, EpCAM, Endoglina, Ep-CAM, proteína activadora de fibroblasto (FAP), proteína de unión a folato, G250, tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT-3, CD135), frizzled 1-10, Her2/neu, HLA-DR, IGFR, receptor de IL2, IL3R, MCSP (proteoglicano de condroitín sulfato de la superficie celular asociado a melanoma), Muc-1, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), antígeno de células madre de próstata (PSCA), antígeno específico de próstata (PSA), TAG-72, Tenascina, Tem1-8, Tie2 y VEGFR2. En algunas realizaciones, el primer sitio de unión del

45 anticuerpo se une a uno de CD3, el receptor de células T (TCR), CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 y CD95, y el segundo sitio de unión se une a un antígeno de superficie asociado a tumores.

El término "glicosilación" significa la unión de oligosacáridos (carbohidratos que contienen dos o más azúcares sencillos unidos entre sí, por ejemplo, de dos a aproximadamente doce azúcares sencillos unidos entre sí) a una glicoproteína. Las cadenas laterales de oligosacárido típicamente están unidas al esqueleto de la glicoproteína a través de enlaces N u O. Los oligosacáridos de anticuerpos desvelados en el presente documento generalmente están unidos a un dominio CH2 de una región Fc como N-oligosacáridos. "N-glicosilación" se refiere a la unión del resto de carbohidrato a un resto de asparagina en una cadena de glicoproteína. El experto en la materia reconocerá que, por ejemplo, cada uno de los dominios CH2 de las IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 murinas así como las IgG1,

55 IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgD humanas tienen un solo sitio de N-glicosilación en el resto 297.

Las secuencias de dominios o regiones incluidas en una molécula de anticuerpo de acuerdo con la invención pueden ser secuencias de cualquier especie deseada. Dependiendo del uso posterior de la molécula de anticuerpo, sin embargo, puede ser deseable en algunas realizaciones introducir alteraciones que impidan efectos secundarios indeseados producidos por el anticuerpo. El uso de anticuerpos no humanos intactos en el tratamiento de enfermedades o trastornos humanos lleva asociada la posibilidad de los problemas ahora bien establecidos de la inmunogenicidad, que significa que el sistema inmunitario del paciente puede reconocer el anticuerpo intacto no humano como no propio y crear una respuesta neutralizadora. Esto es particularmente evidente tras la administración múltiple del anticuerpo no humano a un paciente humano. Se han creado diversas técnicas a lo largo 65 de los años para solucionar estos problemas y, generalmente, implican reducir la composición de secuencias de aminoácidos no humanos en el anticuerpo intacto conservando al mismo tiempo la facilidad relativa en la obtención

de anticuerpos no humanos a partir de un animal inmunizado, por ejemplo, un ratón, rata o conejo. En general se han usado dos enfoques para conseguir esto. El primero son anticuerpos quiméricos, que generalmente tienen un dominio variable no humano (por ejemplo, de roedor tal como de ratón) fusionado a una región constante humana. Como el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo se define por restos dentro del dominio variable, el anticuerpo 5 quimérico conserva su afinidad de unión por el antígeno pero adquiere las funciones efectoras de la región constante humana y, por lo tanto, puede realizar funciones efectoras tales como las descritas anteriormente. Los anticuerpos quiméricos típicamente se producen usando métodos de ADN recombinante. Se aísla ADN que codifica los anticuerpos (por ejemplo, ADNc) y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleotídicas que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas H y L del anticuerpo de la invención). Las células de hibridoma sirven como fuente típica de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se pone en vectores de expresión que después se introducen por transfección en células hospedadoras tales como células COS de E. coli, células CHO o células de mieloma que de otra forma no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis del anticuerpo. El ADN puede modificarse sustituyendo las regiones constantes H y L no humanas, por ejemplo murinas, por la secuencia codificante de cadenas L y H humanas

15 correspondientes (véase, por ejemplo Morrison; PNAS [1984] 81,6851).

El segundo enfoque implica la generación de anticuerpos humanizados en los que el contenido no humano del anticuerpo se reduce por humanización de los dominios variables. Han ganado popularidad dos técnicas de humanización. La primera es la humanización por injerto de CDR. Las CDR definen bucles (supra) y la especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo se define principalmente por la topografía y por las características químicas de su superficie de CDR. Estas características, a su vez, se determinan por la conformación de las CDR individuales, por la disposición relativa de las CDR y por la naturaleza y disposición de las cadenas laterales de los restos que incluyen las CDR. Puede conseguirse un gran disminución de la inmunogenicidad injertando solo las CDR de anticuerpos no humanos, por ejemplo murinos (anticuerpos "donadores") sobre regiones marco ("regiones marco 25 aceptoras") y constantes humanas (véase Jones et al (1986) Nature 321, 522-525 y Verhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536). Sin embargo, el injerto de CDR per se puede no dar como resultado la retención completa de las propiedades de unión a antígeno y con frecuencia se observa que algunos restos marco (algunas veces denominados "retromutaciones") del anticuerpo donador necesitan conservarse en la molécula humanizada si se desea recuperar una afinidad de unión a antígeno significativa (véase Queen C et al (1989) PNAS 86, 10,02910,033, Co, M et al (1991) Nature 351, 501-502). En este caso, se eligen dominios variables humanos que muestran la mayor homología de secuencia con el anticuerpo donador no humano a partir de una base de datos para proporcionar la región marco humana (FR). La selección de FR humanas puede realizarse a partir de anticuerpos humanos individuales o anticuerpos humanos consenso. Cuando se sustituyen restos clave necesarios del anticuerpo donador en la región marco aceptora humana para conservar las conformaciones de CDR, puede usarse

35 un modelado informático del anticuerpo para ayudar a identificar dichos restos importantes desde el punto de vista estructural. Véase, por ejemplo, el documento WO99/48523.

Como alternativa, la humanización puede conseguirse por un proceso de remodelación de la superficie ("veneering"). Un análisis estadístico de dominios variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana y murina única reveló que los patrones precisos de restos expuestos son diferentes en los anticuerpos humanos y murinos, y las posiciones de la superficie más individuales tienen una fuerte preferencia por un pequeño número de restos diferentes (véase Padlan E. A. et al; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498 y Pedersen J. T. et al (1994) J. Mol. Biol. 235; 959-973). Por lo tanto, es posible reducir la inmunogenicidad de un Fv no humano al reemplazar restos expuestos en sus regiones marco que difieren de los encontrados normalmente en los anticuerpos humanos. Como

45 la antigenicidad de las proteínas puede correlacionarse con la accesibilidad de la superficie, el reemplazo de los restos de la superficie puede ser suficiente para hacer que el dominio variable de ratón sea "invisible" al sistema inmunitario humano (véase también Mark G. E. et al (1994) en Handbook of Experimental Pharmacology vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, págs. 105-134). Este procedimiento de humanización se denomina remodelación de la superficie ("veneering") porque solo se altera la superficie del anticuerpo, permaneciendo sin alterar los restos de soporte.

Una molécula de anticuerpo de la invención puede producirse usando cualquier sistema de expresión conocido y bien establecido y la tecnología de cultivo de células recombinantes, por ejemplo, por expresión en hospedadores bacterianos (sistemas procariotas), o sistemas eucariotas tales como levaduras, hongos, células de insecto o células

55 de mamífero. Una molécula de anticuerpo de la presente invención puede producirse en organismos transgénicos tales como una cabra, una planta o un ratón transgénico XENOMOUSE, una cepa de ratón modificada por ingeniería genética que tiene fragmentos grandes de los loci de inmunoglobulina humana y es deficiente en la producción de anticuerpos de ratón. Un anticuerpo también puede producirse por síntesis química.

Para la producción recombinante de una molécula de anticuerpo de la invención, típicamente se aísla un polinucleótido que codifica el anticuerpo y se inserta en un vector replicable tal como un plásmido para la clonación (amplificación) o expresión adicional. Un ejemplo ilustrativo de un sistema de expresión adecuado es un sistema glutamato sintetasa (tal como el vendido por Lonza Biologics), siendo la célula hospedadora, por ejemplo, CHO o NS0. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos 65 convencionales. Los vectores que pueden usarse incluyen plásmidos, virus, fagos, transposones y minicromosomas, de los cuales son una realización típica los plásmidos. En general, estos vectores incluyen además una secuencia

señal, origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y secuencias de terminación de la transcripción unidas operativamente al polinucleótido de cadena ligera y/o pesada para facilitar la expresión. Los polinucleótidos que codifican las cadenas ligera y pesada pueden insertarse en vectores separados y transfectarse al interior de la misma célula hospedadora o, si se desea, tanto la cadena pesada como la cadena

5 ligera pueden insertarse en el mismo vector para la transfección en la célula hospedadora. Las dos cadenas pueden disponerse, por ejemplo, bajo el control de un operón dicistrónico y expresarse para dar como resultado la molécula de anticuerpo funcional y correctamente plegada como se describe en Skerra, A. (1994) Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli, Gene 151, 131-135, o Skerra, A. (1994) A general vector, pASK84, for cloning, bacterial production, and single-step purification of antibody Fab fragments, Gene 141, 79-8. De esta manera, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para construir un vector que codifica las cadenas ligera y/o pesada de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, incluyendo dicho método insertar en un vector, un polinucleótido que codifica una cadena ligera y/o cadena pesada de una molécula de anticuerpo de la invención.

15 Cuando se usan técnicas recombinantes, la molécula de anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente al medio (véase también Skerra 1994, supra). Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, el desecho en forma de partículas, bien las células hospedadoras o bien los fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan en el espacio periplásmico de E coli. El anticuerpo también puede producirse en un entorno oxidante. Dicho entorno oxidante puede proporcionarse por el periplasma de bacterias Gram negativas tales como E. coli, en el medio extracelular de bacterias Gram positivas o en el lumen del retículo endoplásmico de células eucariotas (incluyendo células animales tales como células de insecto o de mamífero) y normalmente favorece la formación de enlaces disulfuro estructurales. Sin embargo, también es posible producir una molécula de anticuerpo de la invención en el

25 citosol de una célula hospedadora tal como E. coli. En este caso, el polipéptido puede obtenerse directamente en un estado soluble y plegado o recuperarse en forma de cuerpos de inclusión, seguido por renaturalización in vitro. Otra opción es el uso de cepas hospedadoras específicas que tienen un medio intracelular oxidante, que de esta manera puede permitir la formación de enlaces disulfuro en el citosol (Venturi M, Seifert C, Hunte C. (2002) “High level production of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm.” J. Mol. Biol. 315, 1-8).

La molécula de anticuerpo producida por las células puede purificarse usando cualquier tecnología de purificación convencional, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad una técnica de purificación preferida. Las moléculas de anticuerpo pueden purificarse por purificación de afinidad con proteínas/ligandos que se unen de forma específica y reversible a

35 dominios constantes tales como los dominios CH1 o los dominios CL. Son ejemplos de dichas proteínas bacterianas que se unen a inmunoglobulina tales como Proteína a, Proteína G, Proteína A/G o Proteína L, donde la unión de la proteína L se restringe a moléculas de anticuerpo que contienen cadenas ligera kappa. Un método alternativo para la purificación de anticuerpos con cadenas ligeras κ es el uso de anticuerpos anti-kappa acoplados a perlas (KappaSeIect). La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La Proteína A puede usarse para purificar anticuerpos (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Se recomienda la Proteína G para todos los isotipos de ratón y para la gamma3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La elección del método de purificación que se usa para una molécula de anticuerpo particular de la invención está dentro del conocimiento del experto en la materia.

45 También es posible equipar a una de las cadenas de la molécula de anticuerpo de la invención con una etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad tales como Strep-tag® o Strep-tag® Il (Schmidt, T.G.M. et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 753-766), la etiqueta myc, la etiqueta FLAG™-tag, la etiqueta His6 o la etiqueta HA facilitan la detección y también simplifican la purificación de la molécula de anticuerpo recombinante.

Los términos "mutado", "mutante" y "mutación", cuando hacen referencia a un ácido nucleico o un polipéptido, se refieren al intercambio, deleción o inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, en comparación con el ácido nucleico o polipéptido natural, es decir, con una secuencia de referencia que puede considerarse que define el tipo silvestre.

55 A este respecto, se entiende que el término "posición", cuando se usa de acuerdo con la presente invención, significa la posición de un aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos representada en el presente documento. Esta posición puede indicarse con respecto a una secuencia nativa parecida, por ejemplo, una secuencia de una cadena o dominio de IgG natural. El término "correspondiente", como se usa en el presente documento, también incluye que una posición no está determinada necesariamente, o no solo, por el número de nucleótidos/aminoácidos precedentes. De esta manera, la posición de un aminoácido dado de acuerdo con la presente invención que puede sustituirse puede variar debido a la deleción o adición de aminoácidos en cualquier sitio en la cadena de anticuerpo.

65 De esta manera, por una "posición correspondiente" de acuerdo con la presente divulgación se entiende que los aminoácidos pueden diferir en el número indicado, pero pueden seguir teniendo aminoácidos extraños similares.

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En el caso de moléculas de anticuerpo que se unen a CD3 como una diana, es posible, por ejemplo, evaluar la unión a través de la mitogenicidad de dichas moléculas de anticuerpo de unión a CD3 en las células. La mitogenicidad está mediada por la unión de anticuerpos CD3 a los receptores Fc en células accesorias tales como monocitos. Si una molécula de anticuerpo de la invención que tiene un sitio de unión para CD3 no muestra ningún efecto mitogénico 5 mientras que el anticuerpo anti-CD3 monoclonal parental que tiene una parte Fc funcional induce una mitosis fuerte en las células T, está claro que, debido a la ausencia de mitosis, la molécula de anticuerpo de la invención carece de la capacidad de unión a Fc y, por lo tanto, puede considerarse una molécula "knock-out para Fc". Se han descrito ejemplos ilustrativos de un método para evaluar la mitogenicidad mediada por anti CD3 por Davis, Vida y Lipsky (J.Immunol (1986) 137, 3758), y por Ceuppens, JL, y van Vaeck, F, (véase J.Immunol. (1987) 139, 4067, o Cell. Immunol. (1989) 118, 136). Se han descrito otros ejemplos adecuados ilustrativos de un ensayo para evaluar la mitogenicidad de un anticuerpo por Rosenthal-Allieri et al. (Rosenthal-Allieri MA, Ticcioni M, Decked M, Breittmeyer JP, Rochet N, Rouleaux M, y Senik A, Bernerd A, Cell Immunol. 1995 163(1):88-95) y Grosse-Hovest et al. (Grosse-Hovest L, Hartlapp I, Marwan W, Brem G, Rammensee H-G, y Jung G, Eur J Immunol. [2003] May;33(5):1334-1340). Además, la ausencia de unión de Fc puede evaluarse por la capacidad de una molécula de anticuerpo de la

15 invención de mediar una o más de las funciones efectoras bien conocidas de la parte Fc.

Como se ha indicado anteriormente, pueden realizarse sustituciones o deleciones de restos de cisteína para introducir o retirar uno o más enlaces disulfuro, incluyendo la introducción o eliminación de un enlace disulfuro potencial o previamente existente. Por lo tanto, el enlace entre una cadena principal y una cadena de peso menor/longitud más corta de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la invención puede controlarse, incluyendo establecerse, reforzarse o anularse. Al introducir o retirar uno o más restos de cisteína, puede introducirse o retirarse un puente disulfuro. Como ejemplo ilustrativo, una molécula de anticuerpo tetramérica de acuerdo con la divulgación generalmente tiene uno o más enlaces disulfuro que se unen a dos moléculas de anticuerpo diméricas. Uno de estos enlaces disulfuro típicamente se define por una cisteína en la cadena principal de una primera molécula de

25 anticuerpo dimérica y una cisteína en la región de bisagra de una segunda molécula de anticuerpo dimérica. A este respecto, en algunas realizaciones, un anticuerpo de acuerdo con la invención puede incluir una sustitución de aminoácidos de un resto de cisteína nativo en las posiciones 226 y/o 229, con respecto a la secuencia de inmunoglobulina IgG humana de acuerdo con la numeración de Kabat [Índice EU], por otro resto de aminoácido.

También pueden realizarse sustituciones o deleciones de restos de aminoácido tales como arginina, asparagina, serina, treonina o tirosina para modificar el patrón de glicosilación de un anticuerpo. Como ejemplo ilustrativo, una molécula de IgG tiene un solo carbohidrato biantenar unido a N en Asn297 del dominio CH2. En el caso de la IgG de suero o producida ex vivo en hibridomas o células modificadas por ingeniería genética, las IgG son heterogéneas con respecto al carbohidrato unido a Asn297. En el caso de la IgG humana, el oligosacárido del núcleo típicamente

35 consiste en GlcNAc2Man3GlcNAc, con números diferentes de restos externos.

Como se ha indicado, además de la unión a antígenos/epítopos, se sabe que una inmunoglobulina tiene "funciones efectoras" adicionales, actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante de secuencia de aminoácidos) de una inmunoglobulina, y varían con el isotipo de inmunoglobulina. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a Clq y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación negativa de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptores de células B); y activación de células B. Ejercer funciones efectoras de un anticuerpo generalmente implica reclutar células efectoras. Varias funciones efectoras de inmunoglobulinas están mediadas por receptores Fc (FcR), que se

45 unen a la región Fc de un anticuerpo. Los FcR se definen por su especificidad por isotipos de inmunoglobulina; los receptores Fc para anticuerpos IgG se denominan FcγR, en el caso de IgE FcεR, en el caso de IgA FcαR y así sucesivamente. Cualquiera de estas funciones efectoras (o la pérdida de dichas funciones efectoras) tales como CDC o ADCC puede usarse para evaluar si una molécula de anticuerpo de la invención carece de la capacidad de unirse a Fc.

En este contexto, debe indicarse que la expresión "receptor Fc" o "FcR" define un receptor, generalmente una proteína, que es capaz de unirse a la región Fc de un anticuerpo. Los receptores Fc se encuentran en la superficie de ciertas células del sistema inmunitario de un organismo, por ejemplo células citolíticas naturales, macrófagos, neutrófilos y mastocitos. Los receptores de Fcin vivo se unen a inmunoglobulinas que están inmovilizadas en células

55 infectadas o presentes en patógenos invasores. Su actividad estimula a las células fagocíticas o citotóxicas para que destruyan microbios o células infectadas por fagocitosis mediada por anticuerpos o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. Algunos virus tales como flavivirus usan receptores Fc para ayudarlos a infectar a las células, por medio de un mecanismo conocido como potenciación de la infección dependiente de anticuerpos. Los FcR se han revisado en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 2534 (1994); y de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995).

"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la vía clásica del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su antígeno afín. Para

65 evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1997).

La expresión "sistema del complemento" se usa en la técnica para hacer referencia a varias proteínas pequeñas — denominadas factores del complemento — que se encuentran en la sangre, generalmente circulantes como precursores inactivos (pro-proteínas). La expresión se refiere a la capacidad de este sistema inalterable y no adaptable de "complementar" la capacidad de anticuerpos y células fagocíticas de eliminar patógenos tales como 5 bacterias, así como complejos de antígeno-anticuerpo, de un organismo. Un ejemplo de factores del complemento es el complejo C1, que incluye C1q y dos serina proteasas, C1r y C1s. El complejo C1 es un componente de la vía CDC. C1q es una molécula hexavalente con un peso molecular de aproximadamente 460.000 y una estructura parecida a un ramo de tulipanes en el que seis "tallos" de colágeno están conectados a seis regiones de cabeza globulares. Para activar la cascada del complemento, C1q tiene que unirse al menos a dos moléculas de IgG1, IgG2

o IgG3.

"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que Ig secretadas unidas a receptores Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas -tales como células citolíticas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos -permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan

15 específicamente a una célula diana que lleva un antígeno y posteriormente destruyan la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y son necesarios para destruir la célula diana por este mecanismo. Las células primarias para mediar la ADCC, células NK, expresan únicamente FcγRIII, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcyRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en las Patentes de Estados Unidos n.º 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen, pero sin limitación, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células citolíticas naturales (NK). En algunas realizaciones, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes et al., PNAS USA 95: 652-656 (1998).

25 Varias funciones efectoras de anticuerpo están mediadas por receptores Fc (FcR), que se unen a la región Fc de un anticuerpo. Los FcR se definen por su especificidad por isotipos de inmunoglobulina; los receptores Fc para anticuerpos IgG se denominan FcγR, en el caso de IgE FcεR, en el caso de IgA FcαR y así sucesivamente. Se han identificado tres subclases de FcγR: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) y FcγRIII (CD16).

Volviendo ahora a los ácidos nucleicos de la invención, una molécula de ácido nucleico que codifica una o más cadenas de un anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser cualquier ácido nucleico en cualquier configuración posible, tal como monocatenario, bicatenario o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN, moléculas de ARN, análogos del ADN o ARN generados usando análogos de

35 nucleótidos o usando química de ácidos nucleicos, moléculas de ácido nucleico bloqueadas (LNA) y moléculas de proteína y ácido nucleico (PNA). El ADN o ARN puede ser de origen genómico o sintético y puede ser mono o bicatenario. Dicho ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ARNm, ARNc, ARN sintético, ADN genómico, ADNc, ADN sintético, un copolímero de ADN y ARN, oligonucleótidos, etc. Un ácido nucleico respectivo puede contener además análogos de nucleótidos no naturales y/o estar unido a una etiqueta de afinidad o un marcador.

En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena, tal como una cadena principal y/o una cadena más pequeña de un anticuerpo de acuerdo con la invención se incluye en un vector tal como un plásmido. Cuando se incluye una sustitución o deleción en una cadena de anticuerpo, en comparación con un dominio o región natural de un anticuerpo, la secuencia codificante del dominio/región nativa respectiva, por ejemplo, 45 incluida en la secuencia de una inmunoglobulina, puede usarse como punto de partida para la mutagénesis. Para la mutagénesis de posiciones de aminoácidos seleccionadas, el experto en la materia tiene a su disposición los diversos métodos convencionales establecidos para mutagénesis dirigida. Una técnica usada comúnmente es la introducción de mutaciones por medio de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) usando mezclas de oligonucleótidos sintéticos, que llevan una composición de bases degeneradas en las posiciones de la secuencia deseadas. Por ejemplo, el uso del codón NNK o NNS (donde N = adenina, guanina o citosina o timina; K = guanina o timina; S = adenina o citosina) permite la incorporación de los 20 aminoácidos más el codón de terminación ámbar durante la mutagénesis, mientras que el codón VVS limita el número de aminoácidos posiblemente incorporados a 12, ya que excluye la incorporación de los aminoácidos Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val en la posición seleccionada de la secuencia polipeptídica; el uso del codón NMS (donde M = adenina o citosina), por ejemplo,

55 restringe el número de aminoácidos posibles a 11 en una posición de la secuencia seleccionada ya que excluye la incorporación de los aminoácidos Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val en una posición de la secuencia seleccionada. A este respecto, debe indicarse que en un ácido nucleico de una molécula de anticuerpo, también pueden incorporarse ciertos codones de otros aminoácidos (distintos de los 20 aminoácidos naturales habituales) tales como selenocisteína o pirrolisina. También es posible, como se describe por Wang, L., et al. (2001) Science 292, 498-500, o Wang, L., y Schultz, P.G. (2002) Chem. Comm. 1, 1-11, usar codones "artificiales", tales como UAG, que normalmente se reconocen como codones de terminación para insertar otros aminoácidos no habituales, por ejemplo, o-metil-L-tirosina o p-aminofenilalanina.

El uso de bloques de construcción de nucleótidos con especificidad de pares de bases reducida, como por ejemplo

65 inosina, 8-oxo-2’desoxiguanosina o 6(2-desoxi-β-D-ribofuranosil)-3,4-dihidro-8H-pirimin-do-1,2-oxazina-7-ona (Zaccolo et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603), es otra opción para la introducción de mutaciones en un segmento

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(Figura 2) contienen genes de región constante de cadena pesada humana y de cadena ligera humana. De esta manera, la inserción de los segmentos V amplificados y digeridos reconstituye la organización genómica original de los genes de Ig en los vectores sin alterar ningún aminoácido de las regiones V.

5 El vector original para la cadena pesada contiene la cadena pesada de Ig de isotipo γ1 humana (Figura 2A). Se introdujeron sitios de restricción en las posiciones requeridas en intrones para intercambiar el fragmento AatII-CIaI con el fragmento VDJ de la cadena pesada de anticuerpos monoclonales 4G8 (anti-Flt3), BV10 (anti-FLT3), 4G7 (anti-CD19), C225 (anti-EGFR) y 9.2.27 (anti-CSPG4) o cualquier otro anticuerpo monoclonal. La región relevante para la clonación del fragmento VDJ se muestra ampliada en la Figura 2B. El fragmento a intercambiar contiene

10 partes del primer intrón con un sitio de restricción AatII, el segundo exón de la secuencia líder, la región VDJ y parte del intrón de cadena pesada con el sitio de restricción ClaI. Para la sustitución de todos los exones de la región constante de la cadena pesada γ1 humana, se introdujeron sitios de restricción en la posición requerida en el intrón de cadena pesada (MIuI) y en la región poliA de la cadena pesada 5'-UTR (región pA; SpeI), como se muestra en la Figura 2A y 2C.

15 Además, con los vectores de expresión construidos, es posible intercambiar la región constante entera del isotipo Igγ1 humano (fragmento MIul-SpeI; véase la Figura 2A) contra regiones constantes de todos los demás isotipos de anticuerpo o contra partes Fc con función efectora optimizada o reducida. En el caso de anticuerpos optimizados para desencadenar ADCC, se introdujeron sustituciones de aminoácidos en el dominio CH2 de la región constante

20 γ1 humana como se muestra en las solicitudes de patente Internacionales WO2011/076922 y WO2011/089211. Para generar anticuerpos biespecíficos como se representa en las Figuras 1A-N, pueden insertarse fragmentos de ADN flanqueados por MluI y SpeI que contienen exones que codifican dominios constantes de tipo silvestre o modificados de la cadena pesada de Ig. El fragmento MIul-SpeI a intercambiar se muestra ampliado en la Figura 2C. Puede incluirse la adición de la segunda especificidad de antígeno de un anticuerpo biespecífico, fragmentos scFv en

25 orientación VH-VL o VL-VH mediante los sitios de enzimas de restricción BspEI y SpeI, como también se muestra en la Figura 2A. La región relevante para la clonación de un fragmento scFv en orientación VL-VH se muestra ampliada en la Figura 2C. Se generaron fragmentos scFv con la especificidad por CD3 (clon humanizado UCHT1; orientación VL-VH), CD28 (clon 9.3; orientación VL-VH), TCRα/β (clon BMA031; orientación VH-VL) por PCR con oligonucleótidos F y F' indicados en la Tabla 2. Como alternativa, se sintetizaron como fragmentos de ADN en

30 GeneArt, Regensburg, Alemania. Este método se usó para genes que codificaban los anticuerpos dirigidos a CD16 (clon 3G8; orientación VL-VH). El fragmento de ADN de los segmentos scFv en la orientación VH-VL y VL-VH respectivamente se digirió con las nucleasas de restricción apropiadas (resumido en la Tabla 2) y después se ligó al vector de expresión.

35 El vector original para la cadena ligera contiene la región VJ de la cadena ligera y la región C del gen κ humano (Figura 2D). Se introdujeron sitios de restricción en las localizaciones requeridas (Xhol y SpeI) para sustituir el fragmento XhoI-SpeI de cadena ligera con el fragmento VJ apropiado de la cadena ligera de anticuerpos monoclonales 4G8 (anti-FLT3), BV10 (anti-FLT3), 4G7 (anti-CD19), C225 (anti-EGFR) y 9.2.27 (anti-CSPG4) o cualquier otro anticuerpo monoclonal. La región adyacente al fragmento a intercambiar se muestra en la Figura 2E.

40 Esta región contiene partes del segundo exón de la secuencia líder, un sitio de restricción adecuado (XhoI) para fusión en fase, la región VJ y partes del intrón de la cadena kappa con el sitio de restricción SpeI. Para reemplazar el dominio constante de la cadena ligera (CL), se introdujeron sitios de restricción en las localizaciones requeridas (PmII y BsmBI). La región adyacente al fragmento a intercambiar se muestra ampliada en la Figura 2F. Esta región contiene partes del intrón de la cadena kappa, un sitio de restricción adecuado (PmII), la región CL y partes de la

45 región poliA (región pA) de la cadena kappa región 3’-UTR con el sitio de restricción (BsmBI).

Tabla 1: Oligonucleótidos usados para la amplificación de segmentos VDJ y VJ para la inserción en vectores de expresión

Oligonucleótidos usados para el segmento VDJ de la cadena pesada

C

4G7-H-for 5’-ctc ttc aca ggt gtc ctc tct gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct g-3’ (SEQ ID NO: 27)

C'

4G7-H-for 5’-ggg aga agg tag gac tca cct gag gag act gtg aga gtg gtg cct tgg ccc cag tag tc-3’ (SEQ ID NO: 28)

C

9.2.27-H-for 5’-tct tca cag gtg tcc tct ccc agg tga agc tgc agc aat ctg gac ctg agcs’ (SEQ ID NO: 29)

C'

9.2.27-H-rev 5’-aat ggg aga agg tag gac tca cct gag gag acg gtg acc gtg gtc cct tgg-3’ (SEQ ID NO: 30)

C

4G8-H-for 5’-tct ctt cac agg tgt cct ctc tca ggt cca act gca gca gcc tgg ggc tga gc-3’ (SEQ ID NO: 31)

C'

4G8-H-for 5’-gag aag gta gga ctc acc tga gga gac tgt gag agt ggt gcc ttg gcc cca g-3’ (SEQ ID NO: 32)

Oligonucleótidos usados para el segmento VDJ de la cadena pesada

C

BV10-H-for 5’-aga cgt cca ctc tgt ctt tct ctt cac agg tgt cct ctc cca ggt gca gct gaa gca gtc-3’ (SEQ ID NO: 33)

C'

BV10-H-for 5’-gag aag gta gga ctc acc tga gga gac ggt gac tga ggt tcc ttg acc c-3’ (SEQ ID NO: 34)

E

universal for (AatII) 5’-aga cgt cca ctc tgt ctt tct ctt cac agg tgt cct ctc c-3’ (SEQ ID NO: 35)

E’

universal rev (CIaI) 5’-tat cga ttt aga atg gga gaa ggt agg act cac-3’ (SEQ ID NO: 36)

Oligonucleótidos usados para el segmento VJ de la cadena ligera

D

4G7-L-for (XhoI) 5’-act cga gga gat att gtg atg act cag gct gca ccc tct ata c-3’ (SEQ ID NO: 37)

D’

4G7-L-rev (SpeI) 5’-aac tag tac tta cgt ttc agc tcc agc ttg gtc cca gca ccg aac gigs’ (SEQ ID NO: 38)

D

9.2.27-L-for (XhoI) 5’-tct cga gga gac atc gag ctc act cag tct cca gct tct ttg-3’ (SEQ ID NO: 39)

D’

9.2.27-L-rev (SpeI) 5’-aac tag tac tta cgt ttg atc tcc agc ttg gtg ccc cct cca aag g-3’ (SEQ ID NO: 40)

D

4G8-L-for (XhoI) 5’-act cga gga gat att gtg cta act cag tct cca gcc acc ctg-3’ (SEQ ID NO: 41)

D’

4G8-L-rev (SpeI) 5’-tac tag tac tta cgt ttt att tcc agc ttg gtc ccc cct cc-3’ (SEQ ID NO: 42)

D

BV10-L-for (XhoI) 5’-act cga gga gac att gtg atg aca cag tct cca tcc tcc c-3’ (SEQ ID NO: 43)

D’

BV10-L-rev (SpeI) 5’-act agt act tac gtt tca gct cca gct tgg tcc cag cac cga acg tg-3’ (SEQ ID NO: 44)

Los sitios de restricción se muestran en negrita y se indican por letras entre paréntesis.

Tabla 2: Oligonucleótidos usados para la amplificación de segmentos scFv para la inserción en vectores deexpresión

Oligonucleótidos usados para el segmento scFv

F

UCHT1 -for (BspEI) 5’-atc cgg aga tat cca gat gac cca gtc ccc gag ctc cct g-3’ (SEQ ID NO: 45)

F’

UCHT1-rev (SpeI) 5’-tac tag tta tca cga gga gac ggt gac cag ggt tcc ttg acc cca-3’ (SEQ ID NO: 46)

F

BMA031-for (BspEI) 5’-atc cgg aga agt gca gct gca gca gtc cgg ccc tga gct-3’ (SEQ ID NO: 47)

F’

BMA031-rev (SpeI) 5’-tac tag tta tca ctt cag ttc cag ctt ggt gcc agc gcc gaa ggt-3’ (SEQ ID NO: 48)

F

9.3-for (BspEI) 5’-atc cgg aga cat tgt gct gac cca gtc ccc tgc ctc cct gg-3’ (SEQ ID NO: 49)

F’

9.3-rev (SpeI) 5’-tac tag tta tca aga gct cac agt cac tgt ggt gcc ctg gcc cca-3’ (SEQ ID NO: 50)

5 Los sitios de restricción se muestran en negrita y se indican por letras entre paréntesis.

De esta manera, se obtuvieron moléculas de anticuerpo biespecíficas con FLT3xCD3 (4G8xUCHT1, BV10xUCHT1), FLT3xTCRα/β (4G8xBMA031, BV10xBMA031), FLT3xCD28 (4G8x9.3, BV10x9.3), FLT3xCD16 (4G8x3G8,

10 BV10x3G8), CD19xCD3 (4G7XUCHT1), CD19xTCRα/β (4G7xBMA031), CD19xCD28 (4G7x9.3), CD19xCD16 (4G7X3G8), CSPG4xCD3 (9.2.27xUCHT1), CSPG4xTCRα/β (9.2.27XBMA031), CSPG4xCD28 (9.2.27x9.3), CSPG4xCD16 (9.2.27x3G8), EGFRxCD3 (C225xUCHT1), EGFRxTCRα/β (C225xBMA031), EGFRxCD28 (C225x9.3), EGFRxCD16 (C225x3G8) como bsFc-ko-1 tetravalentes y bsFc-ko-1/2 bivalentes. Las secuencias de las cadenas correspondientes se representan como SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 26 y en la Figura 6.

15 La cotransfección de los vectores de expresión que codificaban la cadena pesada y ligera quimérica (IgG1/κ) o cadenas pesadas modificadas en la línea celular de mieloma no productora de Ig Sp2/0 produjo transfectomas

estables que secretaban anticuerpos monoclonales biespecíficos que son capaces de unirse específicamente al antígeno deseado. La caracterización funcional de estas moléculas de anticuerpo se ilustra en los siguientes experimentos usando moléculas de anticuerpo biespecíficas FLT3xCD3, CD19xTCRα/β y CSPGxCD3.

5 Ejemplo III

Se determinó la activación de células T por los dos formatos de anticuerpo del Ejemplo I, el formato bsFcko-1/2 y el formato bsFcko-1, con y sin células REH positivas para FLT3/CD19. Los datos se muestran en la Figura 3. Las moléculas de anticuerpo biespecíficas usadas tenían el sitio de unión a FLT3 (primer sitio de unión) del clon 4G8 y un sitio de unión a CD3 (segundo sitio de unión) del clon UCHT1. La molécula de "formato bsFcko-1/2" estaba compuesta por las cadenas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 6) y la molécula de "formato bsFcko-1" estaba compuesta por las cadenas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 26. La molécula de anticuerpo biespecífica que se une a CSPG4 y CD3 estaba en el "formato bsFcko-1/2" y estaba compuesta por las cadenas de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 18. Además, se usó una molécula de anticuerpo biespecífica en el "formato bsFcko-1/2" que se unía a CD19 y

15 TCRα/β compuesta por las cadenas de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 15.

A) Se obtuvieron células mononucleares humanas (PBMC) a partir de sangre periférica de donantes sanos y se aislaron usando centrifugación en gradiente de densidad. Se transfirieron PBMC a placas de 96 pocillos (100.000/pocillo). Posteriormente, se añadieron células REH positivas para FLT3/CD19 irradiadas (50.000/pocillo) o medio y finalmente se añadieron anticuerpos a las concentraciones indicadas (Figura 3A). Después de 24 horas, las células se incubaron con 3H timidina (0,5 μCi/pocillo). Después de 24 horas más, las células se aplicaron en filtros de fibra de vidrio usando un recolector de células. Posteriormente se detectó la radiactividad por medio de un contador de centelleo.

25 B) Se incubó sangre entera heparinizada (50 μl/pocillo) en placas de 96 pocillos con y sin células REH positivas para FLT3/CD19 (50.000/pocillo) y con anticuerpos a las concentraciones indicadas en la Figura 3B. Después de 24 horas, se determinó la concentración de TNF en el sobrenadante por ELISA.

Se cultivaron células REH (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ, Braunschweig, Alemania) y PBMC en medio RPMI 1640 complementado con suero fetal bovino al 10 % (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania), estreptomicina y penicilina al 1 % (Lonza, Basel, Suiza).

Ejemplo IV

35 Se determinó la lisis de células REH que expresaban FLT3/CD19 (Figura 4A) y células SKMel63 que expresaban CSPG (Figura 4B) por anticuerpos biespecíficos y células citolíticas CD8+T activadas.

Se estimularon células mononucleares humanas (PBMC) usando el anticuerpo de CD3 monoespecífico UCHT1 (10 ng/ml) durante tres días. Posteriormente, se aislaron las células CD8+T activadas por selección positiva usando clasificación magnética de células. Las células se añadieron a células REH positivas para FLT3/CD19 marcadas con 51Cr (Figura 4A) o células SKMel63 positivas para CSPG4 (Figura 4B) y se incubaron con anticuerpos a las concentraciones indicadas. Después de 4 horas, se recogieron los sobrenadantes celulares en placas de centelleo y se determinó la radiactividad en un contador de centelleo.

45 Se analizó el porcentaje de lisis específica usando las siguientes condiciones experimentales: cpm(exp)-cpm(bg) ⁄ cpm(100)-cpm(bg), donde cpm(bg) corresponde a la liberación de cromo sin anticuerpo y células efectoras, y cpm(100) corresponde a la liberación de cromo después de la incubación de las células diana con un detergente.

Las células SKMel63 se obtuvieron de Dr. B. Gückel, Klinik für Gynäkologie, University of Tübingen, Alemania.

Ejemplo V

Se comparó la agregación y la tasa de producción de anticuerpos FLT3 x CD3 (sitio de unión a FLT: clon 4G8, sitio de unión a CD3: clon UCHT1) que tenían especificidad idéntica entre tres formatos diferentes: formato

55 monocatenario biespecífico (bs-scFv), Formato bsFcko-1/2 y Formato bsFcko-1. La molécula de anticuerpo del "formato bsFcko-1/2" estaba compuesta por las cadenas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 6 y la molécula de anticuerpo del "formato bsFcko-1" estaba compuesta por las cadenas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 26.

Las moléculas monocatenarias biespecíficas se purificaron por cromatografía de afinidad usando proteína L.

Se realizó filtración en gel usando una columna superdex 200 PC3.2/30 y un SMARTSystem (GE-Healthcare, Munich, Alemania). Las proteínas convencionales usadas fueron catalasa (232 kDa, de hígado bovino), aldolasa (158 kDa; de músculo de conejo), albúmina (67 kDa; de suero bovino) y ribonucleasa A (13,7 kDa; de páncreas bovino). Los resultados se muestran en la Figura 5A. Es evidente por la Figura 5A que la formación de agregados es 65 considerablemente más pronunciada si el anticuerpo se expresa como bs-scFv (tasa de agregación del 43 %) en lugar de como bsFcko-1/2 (sin agregación detectada) o bsFcko-1 (tasa de agregación del 2 %), es decir, las

moléculas de anticuerpo biespecíficas de la presente invención siguen siendo moléculas monoméricas esencialmente sin ninguna tendencia a la agregación.

Para la comparación de las tasas de producción, se introdujeron los genes que codificaban moléculas biespecíficas

5 que contenían la especificidad por 4G8 (anti FLT3) y por UCHT1 (anti CD3) en los formatos representados en células Sp2/0 y los anticuerpos se purificaron usando cromatografía de afinidad. La cantidad de anticuerpo purificado a partir de los sobrenadantes de clones seleccionados para la producción máxima se representa en la Figura 5B. Las concentraciones de anticuerpo se determinaron por espectroscopía óptica suponiendo una densidad óptica a 280 nm de 1,4 para una concentración de anticuerpo de 1 mg/ml. Las tasas de producción para las moléculas de anticuerpo bsFcko-1/2 y bsFcko-1 fueron significativamente mayores que las correspondientes a la molécula bs-scFv respectiva.

Un experto en la materia apreciaría fácilmente que la presente invención está bien adaptada para conseguir los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como los inherentes a la misma. Las composiciones,

15 métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas y compuestos específicos descritos en el presente documento son actualmente representativos de ciertas realizaciones ejemplares y no deben considerarse limitaciones del alcance de la invención. La indicación o discusión de un documento publicado previamente en esta memoria descriptiva no debe considerarse necesariamente una aceptación de que el documento forma parte del estado de la técnica o es del conocimiento común general.

La invención descrita de forma ilustrativa en el presente documento puede ponerse en práctica de forma adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no desvelados de forma específica en el presente documento. De esta manera, por ejemplo, los términos "que comprende", "que incluye", "que contiene", etc. deben considerarse en sentido amplio y sin limitación. Además, los términos y expresiones empleados en el

25 presente documento se han usado como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención en el uso de dichos términos y expresiones de excluir ningún equivalente de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, sino que se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada.

La invención se ha descrito en el presente documento en sentido amplio y genérico. También forman parte de la invención cada una de las especies y agrupamientos subgenéricos más restringidos que están dentro de la divulgación genérica. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una condición o limitación negativa que elimine cualquier materia objeto del género, independientemente de si el material eliminado se menciona específicamente en el presente documento o no.

35 Dentro de las siguientes reivindicaciones se incluyen otras realizaciones. Además, cuando las características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos Markush, los expertos en la materia reconocerán que la invención también se describe de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.

Lista de referencias

1. Davis,L., Vida,R. and Lipsky,P.E. Regulation of human T lymphocyte mitogenesis by antibodies to CD3,

J.Immunol., 137: 3758-3767, 1986. 45

2.

Jung,G., Ledbetter,J.A. and Muller-Eberhard,H.J. Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 84: 4611-4615, 1987.

3.

Jung,G. and Eberhard,H.J. An in-vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates, Immunol. Today, 9: 257-260, 1988.

4.

Staerz,U.D., Kanagawa,O. and Bevan,M.J. Hybrid antibodies can target sites for attack by T cells, Nature, 314:628-631, 1985.

55 5. Perez,P., Hoffman,R.W., Shaw,S., Bluestone,J.A. and Segal,D.M. Specific targeting of cytotoxic T cells by anti-T3 linked to anti-target cell antibody, Nature, 316: 354-356, 1985.

6.

Jung,G., Honsik,C.J., Reisfeld,R.A. and Muller-Eberhard,H.J. Activation of human peripheral blood mononuclear cells by anti-T3: killing of tumor target cells coated with anti-target-anti-T3 conjugates, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 83: 4479-4483, 1986.

7.

Jung,G. and Eberhard,H.J. An in-vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates, Immunol. Today, 9: 257-260, 1988.

65 8. Jung,G., Freimann,U., Von,M.Z., Reisfeld,R.A. and Wilmanns,W. Target cell-induced T cell activation with bi-and trispecific antibody fragments, Eur.J.Immunol., 21: 2431-2435, 1991.

9.

Rosenberg,S.A., Lotze,M.T., Yang,J.C., Aebersold,P.M., Linehan,W.M., Seipp,C.A. and White,D.E. Experience with the use of high-dose interleukin-2 in the treatment of 652 cancer patients, Ann.Surg., 210: 474-484, 1989.

10.

Tibben,J.G., Boerman,O.C., Massuger,L.F., Schijf,C.P., Claessens,R.A. and Corstens,F.H. Pharmacokinetics,

5 biodistribution and biological effects of intravenously administered bispecific monoclonal antibody OC/TR F(ab’)2 in ovarian carcinoma patients, Int.J.Cancer, 66: 477-483, 1996.

11. Kroesen,B.J., Buter,J., Sleijfer,D.T., Janssen,R.A., van der Graaf,W.T., The,T.H., de,L.L. and Mulder,N.H. Phase

I study of intravenously applied bispecific antibody in renal cell cancer patients receiving subcutaneous interleukin 2, 10 Br.J.Cancer, 70: 652-661, 1994.

12. Jung,G. and Eberhard,H.J. An in-vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates, Immunol. Today, 9: 257-260, 1988.

15 13 Jung,G., Freimann,U., Von,M.Z., Reisfeld,R.A. and Wilmanns,W. Target cell-induced T cell activation with biand trispecific antibody fragments, Eur.J.Immunol., 21: 2431-2435, 1991.

14 Bargou,R., Leo,E., Zugmaier,G., Klinger,M., Goebeler,M., Knop,S., Noppeney,R., Viardot,A., Hess,G., Schuler, M., Einsele,H., Brandl,C., Wolf,A., Kirchinger,P., Klappers,P., Schmidt,M., Riethmuller,G., Reinhardt,C., Baeuerle,

20 P.A. and Kufer,P. Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody, Science, 321: 974-977, 2008.

15. Topp,M.S., Kufer,P., Gokbuget,N., Goebeler,M., Klinger,M., Neumann,S., Horst,H.A., Raff,T., Viardot,A., Schmid,M., Stelljes,M., Schaich,M., Degenhard,E., Kohne-Volland,R., Bruggemann,M., Ottmann,O., Pfeifer,H.,

25 Burmeister, T., Nagorsen,D., Schmidt,M., Lutterbuese,R., Reinhardt,C., Baeuerle,P.A., Kneba,M., Einsele,H., Riethmuller, G., Hoelzer,D., Zugmaier,G. and Bargou,R.C. Targeted therapy with the T-cell-engaging antibody blinatumomab of chemotherapy-refractory minimal residual disease in B-lineage acute lymphoblastic leukemia patients results in high response rate and prolonged leukemia-free survival, J.Clin.Oncol., 29: 2493-2498, 2011.

30 16. Brischwein,K., Parr,L., Pflanz,S., Volkland,J., Lumsden,J., Klinger,M., Locher,M., Hammond,S.A., Kiener,P., Kufer,P., Schlereth,B. and Baeuerle,P.A. Strictly target cell-dependent activation of T cells by bispecific single-chain antibody constructs of the BiTE class, J.Immunother., 30: 798-807, 2007.

17. Bargou,R., Leo,E., Zugmaier,G., Klinger,M., Goebeler,M., Knop,S., Noppeney,R., Viardot,A., Hess,G., Schuler, 35 M., Einsele,H., Brandl,C., Wolf,A., Kirchinger,P., Klappers,P., Schmidt,M., Riethmuller,G., Reinhardt,C., Baeuerle,

P.A. and Kufer,P. Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody, Science, 321: 974-977, 2008.

18. Topp,M.S., Kufer,P., Gokbuget,N., Goebeler,M., Klinger,M., Neumann,S., Horst,H.A., Raff,T., Viardot,A.,

40 Schmid,M., Stelljes,M., Schaich,M., Degenhard,E., Kohne-Volland,R., Bruggemann,M., Ottmann,O., Pfeifer,H., Burmeister, T., Nagorsen,D., Schmidt,M., Lutterbuese,R., Reinhardt,C., Baeuerle,P.A., Kneba,M., Einsele,H., Riethmuller, G., Hoelzer,D., Zugmaier,G. and Bargou,R.C. Targeted therapy with the T-cell-engaging antibody blinatumomab of chemotherapy-refractory minimal residual disease in B-lineage acute lymphoblastic leukemia patients results in high response rate and prolonged leukemia-free survival, J.Clin.Oncol., 29: 2493-2498, 2011.

45

19. Grosse-Hovest,L., Hartlapp,I., Marwan,W., Brem,G., Rammensee,H.G. and Jung,G. A recombinant bispecific single-chain antibody induces targeted, supra-agonistic CD28-stimulation and tumor cell killing, Eur.J.Immunol., 33: 1334-1340, 2003.

50 20. Grosse-Hovest,L., Muller,S., Minoia,R., Wolf,E., Zakhartchenko,V., Wenigerkind,H., Lassnig,C., Besenfelder,U., Muller,M., Lytton,S.D., Jung,G. and Brem,G. Cloned transgenic farm animals produce a bispecific antibody for T cellmediated tumor cell killing, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 101: 6858-6863,2004.

21. Marvin,J.S. and Zhu,Z. Recombinant approaches to IgG-like bispecific antibodies, Acta Pharmacol.Sin., 26:64955 658, 2005.

22. Mabry,R., Lewis,K.E., Moore,M., McKernan,P.A., Bukowski,T.R., Bontadelli,K., Brender,T., Okada,S., Lum,K., West,J., Kuijper,J.L., Ardourel,D., Franke,S., Lockwood,L., Vu,T., Frank,A., Appleby,M.W., Wolf,A., Reardon,B., Hamacher,N.B., Stevens,B., Lewis,P., Lewis,K.B., Gilbertson,D.G., Lantry,M., Julien,S.H., Ostrander,C., Chan,C.,

60 Byrnes-Blake,K., Brody,J., Presnell,S., Meengs,B., Levin,S.D. and Snavely,M. Engineering of stable bispecific antibodies targeting IL-17A and IL-23, Protein Eng Des Sel, 23: 115-127, 2010.

23. Marvin,J.S. and Zhu,Z. Recombinant approaches to IgG-like bispecific antibodies, Acta Pharmacol.Sin., 26:649

658, 2005. 65

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