CN111132698A - 结合nkg2d、cd16以及flt3的蛋白质 - Google Patents

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Abstract

描述了结合NKG2D受体、CD16以及肿瘤相关抗原FLT3的多特异性结合蛋白，以及用于治疗癌症的药物组合物和治疗方法。

Description

结合NKG2D、CD16以及FLT3的蛋白质
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年7月31日提交的美国临时专利申请号62/539,421的权益和优先权；所述临时专利申请的内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式以电子方式提交并且以全文引用的方式并入本文中。所述ASCII副本创建于2018年7月30日，名称为DFY-027WO_SL.txt并且大小为103,731字节。
技术领域
本发明涉及结合于NKG2D、CD16以及肿瘤相关抗原FLT3的多特异性结合蛋白。
背景技术
尽管文献中针对治疗癌症报道了大量研究工作和科学进展，但此疾病仍旧为重要健康问题。血液和骨髓癌为频繁被诊断的癌症类型，包括多发性骨髓瘤、白血病以及淋巴瘤。这些癌症的当前治疗选择并不对所有患者有效并且/或者可能具有大量有害副作用。其他类型的癌症也仍然对使用现有治疗选择的治疗形成挑战。
癌症免疫疗法为所需的，因为它们具高度特异性并且可使用患者自己的免疫系统促成癌细胞破坏。诸如双特异性T细胞衔接者(T-cell engager)等融合蛋白为文献中所描述的癌症免疫疗法，所述融合蛋白结合于肿瘤细胞和T细胞以促成肿瘤细胞破坏。文献中已描述结合于某些肿瘤相关抗原和某些免疫细胞的抗体。参见例如WO 2016/134371和WO2015/095412。
自然杀手(NK)细胞为先天免疫系统的组分并且构成循环淋巴细胞的约15％。NK细胞实际上浸润所有组织并且最初以它们在无需事先致敏的情况下有效杀死肿瘤细胞的能力为特征。活化NK细胞通过类似于细胞毒性T细胞的手段(即，经由含有穿孔素和颗粒酶的细胞溶解颗粒以及经由死亡受体路径)杀死靶细胞。活化NK细胞还分泌炎性细胞因子(诸如IFN-γ)以及促进其他白细胞招募至靶组织的趋化因子。
NK细胞通过多种活化以及它们表面的抑制受体对信号作出反应。举例来说，当NK细胞遇到健康的自身细胞时，它们的活性因杀手细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的活化而受到抑制。或者，当NK细胞遇到外来细胞或癌细胞时，它们经由它们的活化受体(例如NKG2D、NCR、DNAM1)而活化。NK细胞还由一些免疫球蛋白的恒定区通过它们表面的CD16受体活化。NK细胞对活化的总灵敏度取决于刺激信号与抑制信号的总和。
FMS样酪氨酸激酶-3(FLT3)为在多能祖细胞和普通淋巴祖细胞中表达的受体酪氨酸激酶，对造血和免疫系统的发育来说为重要的。通过FLT3进行信号传导在细胞存活、增殖以及分化中起重要作用。FLT3受体的突变可能导致产生白血病，例如急性骨髓性白血病、T细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病以及毛细胞白血病。FLT3的内部串联重复(FLT3-ITD)为与急性骨髓性白血病(AML)相关的最常见突变。
发明内容
本发明提供多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白结合于自然杀手细胞上的NKG2D受体和CD16受体，以及肿瘤相关抗原FLT3。此类蛋白质可接合超过一种NK活化受体，并且可阻断天然配体与NKG2D的结合。在某些实施方案中，所述蛋白质可激动人中的NK细胞。在一些实施方案中，所述蛋白质可激动人中以及诸如啮齿动物和食蟹猴等其他物种中的NK细胞。下文更详细地描述了本发明的各个方面和实施方案。
因此，本发明的一个方面提供一种蛋白质，所述蛋白质合并有第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点结合NKG2D；第二抗原结合位点，所述第二抗原结合位点结合肿瘤相关抗原FLT3；以及抗体Fc结构域、其足以结合CD16的部分或结合CD16的第三抗原结合位点。
抗原结合位点可各自合并有抗体重链可变域和抗体轻链可变域(例如如在抗体中那样排列，或融合在一起以形成scFv)，或抗原结合位点中的一者或多者可为单域抗体，诸如VHH抗体，如骆驼抗体；或VNAR抗体，如在软骨鱼中发现的那些VNAR抗体。
在一个方面中，本发明提供多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白结合于自然杀手细胞上的NKG2D受体和CD16受体，以及肿瘤相关抗原FLT3。NKG2D结合位点包括与选自以下的氨基酸序列至少90％同一的重链可变域：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:85以及SEQ ID NO:93。
在一些实施方案中，结合于NKG2D的第一抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:1有关的重链可变域，诸如通过具有与SEQ ID NO:1至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的氨基酸序列并且/或者合并有与SEQ IDNO:1的CDR1(SEQ ID NO:105)、CDR2(SEQ ID NO:106)以及CDR3(SEQ ID NO:107)序列相同的氨基酸序列。与SEQ ID NO:1有关的重链可变域可与多种轻链可变域连接以形成NKG2D结合位点。举例来说，合并有与SEQ ID NO:1有关的重链可变域的第一抗原结合位点可还合并有选自与以下有关的序列中的任一者的轻链可变域：SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36以及40。举例来说，第一抗原结合位点合并有氨基酸序列与SEQ ID NO:1至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的重链可变域以及氨基酸序列与选自以下的序列中的任一者至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的轻链可变域：SEQID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36以及40。
或者，第一抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:41有关的重链可变域以及与SEQID NO:42有关的轻链可变域。举例来说，第一抗原结合位点的重链可变域可与SEQ ID NO:41至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:41的CDR1(SEQ ID NO:43)、CDR2(SEQ ID NO:44)以及CDR3(SEQ ID NO:45)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变域可与SEQID NO:42至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:42的CDR1(SEQ ID NO:46)、CDR2(SEQ ID NO:47)以及CDR3(SEQ ID NO:48)序列相同的氨基酸序列。
在其他实施方案中，第一抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:49有关的重链可变域以及与SEQ ID NO:50有关的轻链可变域。举例来说，第一抗原结合位点的重链可变域可与SEQ ID NO:49至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:49的CDR1(SEQ ID NO:51)、CDR2(SEQ IDNO:52)以及CDR3(SEQ ID NO:53)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变域可与SEQ ID NO:50至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:50的CDR1(SEQ ID NO:54)、CDR2(SEQ ID NO:55)以及CDR3(SEQ ID NO:56)序列相同的氨基酸序列。
或者，第一抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:57有关的重链可变域以及与SEQID NO:58有关的轻链可变域，诸如通过分别具有与SEQ ID NO:57至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一以及与SEQ ID NO:58至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的氨基酸序列。
在另一实施方案中，第一抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:59有关的重链可变域以及与SEQ ID NO:60有关的轻链可变域。举例来说，第一抗原结合位点的重链可变域可与SEQ ID NO:59至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:59的CDR1(SEQ ID NO:134)、CDR2(SEQ IDNO:135)以及CDR3(SEQ ID NO:136)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变域可与SEQ ID NO:60至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:60的CDR1(SEQ ID NO:137)、CDR2(SEQ ID NO:138)以及CDR3(SEQ ID NO:139)序列相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，结合于NKG2D的第一抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:61有关的重链可变域以及与SEQ ID NO:62有关的轻链可变域。举例来说，第一抗原结合位点的重链可变域可与SEQ ID NO:61至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或合并有与SEQ ID NO:61的CDR1(SEQ ID NO:63)、CDR2(SEQ ID NO:64)以及CDR3(SEQ ID NO:65)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变域可与SEQ ID NO:62至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:62的CDR1(SEQID NO:66)、CDR2(SEQ ID NO:67)以及CDR3(SEQ ID NO:68)序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:69有关的重链可变域以及与SEQ IDNO:70有关的轻链可变域。举例来说，第一抗原结合位点的重链可变域可与SEQ ID NO:69至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:69的CDR1(SEQ ID NO:71)、CDR2(SEQ ID NO:72)以及CDR3(SEQ ID NO:73)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变域可与SEQID NO:70至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:70的CDR1(SEQ ID NO:74)、CDR2(SEQ ID NO:75)以及CDR3(SEQ ID NO:76)序列相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:77有关的重链可变域以及与SEQ ID NO:78有关的轻链可变域。举例来说，第一抗原结合位点的重链可变域可与SEQ ID NO:77至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:77的CDR1(SEQ ID NO:79)、CDR2(SEQ IDNO:80)以及CDR3(SEQ ID NO:81)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变域可与SEQ ID NO:78至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:78的CDR1(SEQ ID NO:82)、CDR2(SEQ ID NO:83)以及CDR3(SEQ ID NO:84)序列相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:85有关的重链可变域以及与SEQ ID NO:86有关的轻链可变域。举例来说，第一抗原结合位点的重链可变域可与SEQ ID NO:85至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:85的CDR1(SEQ ID NO:87)、CDR2(SEQ IDNO:88)以及CDR3(SEQ ID NO:89)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变域可与SEQ ID NO:86至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:86的CDR1(SEQ ID NO:90)、CDR2(SEQ ID NO:91)以及CDR3(SEQ ID NO:92)序列相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:93有关的重链可变域以及与SEQ ID NO:94有关的轻链可变域。举例来说，第一抗原结合位点的重链可变域可与SEQ ID NO:93至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:93的CDR1(SEQ ID NO:95)、CDR2(SEQ IDNO:96)以及CDR3(SEQ ID NO:97)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变域可与SEQ ID NO:94至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:94的CDR1(SEQ ID NO:98)、CDR2(SEQ ID NO:99)以及CDR3(SEQ ID NO:100)序列相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:101有关的重链可变域以及与SEQ ID NO:102有关的轻链可变域，诸如通过分别具有与SEQ ID NO:101至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一以及与SEQ ID NO:102至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:103有关的重链可变域以及与SEQ ID NO:104有关的轻链可变域，诸如通过分别具有与SEQID NO:103至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一以及与SEQ ID NO:104至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，结合于FLT3的第二抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:109有关的重链可变域以及与SEQ ID NO:113有关的轻链可变域。举例来说，第二抗原结合位点的重链可变域可与SEQ ID NO:109至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:109的CDR1(SEQ ID NO:110)、CDR2(SEQ ID NO:111)以及CDR3(SEQ ID NO:112)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变域可与SEQ ID NO:113至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:113的CDR1(SEQ ID NO:114)、CDR2(SEQ ID NO:115)以及CDR3(SEQ ID NO:116)序列相同的氨基酸序列。
或者，结合于FLT3的第二抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:117有关的重链可变域以及与SEQ ID NO:121有关的轻链可变域。举例来说，第二抗原结合位点的重链可变域可与SEQ ID NO:117至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:117的CDR1(SEQ ID NO:118)、CDR2(SEQID NO:119)以及CDR3(SEQ ID NO:120)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变域可与SEQ ID NO:121至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:121的CDR1(SEQ ID NO:122)、CDR2(SEQ ID NO:123)以及CDR3(SEQ ID NO:124)序列相同的氨基酸序列。
或者，结合于FLT3的第二抗原结合位点可合并有与SEQ ID NO:125有关的重链可变域以及与SEQ ID NO:129有关的轻链可变域。举例来说，第二抗原结合位点的重链可变域可与SEQ ID NO:125至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:125的CDR1(SEQ ID NO:126)、CDR2(SEQID NO:127)以及CDR3(SEQ ID NO:128)序列相同的氨基酸序列。类似地，第二抗原结合位点的轻链可变域可与SEQ ID NO:129至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一，并且/或者合并有与SEQ ID NO:129的CDR1(SEQ ID NO:130)、CDR2(SEQ ID NO:131)以及CDR3(SEQ ID NO:132)序列相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二抗原结合位点合并有具有与存在于第一抗原结合位点中的轻链可变域的氨基酸序列相同的氨基酸序列的轻链可变域。
在一些实施方案中，蛋白质合并有抗体Fc结构域中足以结合CD16的部分，其中抗体Fc结构域包含铰链和CH2结构域，和/或与人IgG抗体的氨基酸序列234-332至少90％同一的氨基酸序列。
还提供含有本文所描述的蛋白质中的任一者的制剂；含有表达所述蛋白质的一种或多种核酸的细胞，以及使用所述蛋白质增强肿瘤细胞死亡的方法。
本发明的另一方面提供一种治疗患者的癌症的方法。所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本文所描述的多特异性结合蛋白。要使用多特异性结合蛋白治疗的示例性癌症包括白血病，例如急性骨髓性白血病、T细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病以及毛细胞白血病。
附图说明
图1为异二聚多特异性抗体的图示。每个臂可表示NKG2D结合结构域，或FLT3结合结构域。在一些实施方案中，NKG2D结合结构域和FLT3结合结构域可拥有共同的轻链。
图2为异二聚多特异性抗体的图示。NKG2D结合结构域或FLT3结合结构域可呈scFv模式(右侧臂)。
图3为展示ELISA分析中NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对人重组NKG2D的结合亲和力的线图。
图4为展示ELISA分析中NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对食蟹猴重组NKG2D的结合亲和力的线图。
图5为展示ELISA分析中NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对小鼠重组NKG2D的结合亲和力的线图。
图6为展示根据流式细胞术NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)与表达人NKG2D的EL4细胞的结合的柱状图，示出平均荧光强度(MFI)相较于背景的倍数(FOB)。
图7为展示根据流式细胞术NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)与表达小鼠NKG2D的EL4细胞的结合的柱状图，示出平均荧光强度(MFI)相较于背景的倍数(FOB)。
图8为展示通过与天然配体ULBP-6竞争得到的NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对重组人NKG2D-Fc的特异性结合亲和力的线图。
图9为展示通过与天然配体MICA竞争得到的NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对重组人NKG2D-Fc的特异性结合亲和力的线图。
图10为展示通过与天然配体Rae-1δ竞争得到的NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对重组小鼠NKG2D-Fc的特异性结合亲和力的线图。
图11为示出通过定量TNF-α阳性细胞的百分比得到的NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对人NKG2D的活化的柱状图，所述TNF-α阳性细胞表达人NKG2D-CD3ξ融合蛋白。
图12为示出通过定量TNF-α阳性细胞的百分比得到的NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对小鼠NKG2D的活化的柱状图，所述TNF-α阳性细胞表达小鼠NKG2D-CD3ξ融合蛋白。
图13为示出NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对人NK细胞的活化的柱状图。
图14为示出NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对人NK细胞的活化的柱状图。
图15为示出NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对小鼠NK细胞的活化的柱状图。
图16为示出NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对小鼠NK细胞的活化的柱状图。
图17为示出NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)对肿瘤细胞的细胞毒性作用的柱状图。
图18为示出通过差示扫描荧光测定法测量的NKG2D结合结构域(以克隆形式列出)的熔解温度的柱状图。
图19A至图19C为使用CD16和NKG2D结合对NK细胞进行协同活化的柱状图。图19A展示CD107a的水平；图19B展示IFN-γ的水平；图19C展示CD107a和IFN-γ的水平。图中指示平均值(n＝2)±SD。数据代表使用五个不同健康供体的五个独立实验。
图20为呈Triomab形式的TriNKET的图示，所述Triomab形式为维持IgG样形状的三功能双特异性抗体。此嵌合体由两个半抗体组成，这两个半抗体各自具有一条轻链和一条重链，它们来源于两个亲本抗体。Triomab形式可为含有1/2的大鼠抗体和1/2的小鼠抗体的异二聚构建体。
图21为呈KiH常见轻链形式的TriNKET的图示，所述KiH常见轻链形式涉及杵入臼(KIH)技术。KiH为含有结合于靶标1和2的2个Fab以及通过异二聚化突变稳定化的Fc的异二聚体。呈KiH模式的TriNKET可为具有结合于靶标1和靶标2的2个Fab的异二聚构建体，含有两条不同的重链以及与两条重链配对的共同的轻链。
图22为呈双可变域免疫球蛋白(DVD-IgTM)形式的TriNKET的图示，所述双可变域免疫球蛋白形式经由天然存在的柔性接头组合两个单克隆抗体的靶标结合结构域，并且产生四价IgG样分子。DVD-IgTM为均二聚构建体，其中靶向抗原2的可变域融合至靶向抗原1的Fab的可变域的N端。DVD-IgTM形式含有一般Fc。
图23为呈正交Fab界面(正交Fab)形式的TriNKET的图示，所述正交Fab界面形式为含有融合至Fc并且结合于靶标1和靶标2的2个Fab的异二聚构建体。通过正交界面来确保轻链(LC)-重链(HC)配对。通过Fc中的突变来确保异二聚化。
图24为呈二合一Ig模式的TriNKET的图示。
图25为呈ES形式的TriNKET的图示，所述ES形式为含有融合至Fc并且结合于靶标1和靶标2的两个不同的Fab的异二聚构建体。通过Fc中的静电转向突变来确保异二聚化。
图26为呈Fab臂更换形式的TriNKET的图示：通过将重链和连接的轻链(半分子)与来自另一分子的重-轻链对交换来更换Fab臂从而产生双特异性抗体的抗体。Fab臂更换形式(cFae)为含有结合于靶标1和2的2个Fab以及通过异二聚化突变稳定化的Fc的异二聚体。
图27为呈SEED体形式的TriNKET的图示，所述SEED体形式为含有结合于靶标1和2的2个Fab以及通过异二聚化突变稳定化的Fc的异二聚体。
图28为呈LuZ-Y形式的TriNKET的图示，其中亮氨酸拉链用于诱导两个不同HC的异二聚化。LuZ-Y形式为含有融合至Fc并且结合于靶标1和2的两个不同scFab的异二聚体。通过融合至Fc的C端的亮氨酸拉链基序来确保异二聚化。
图29为呈Cov-X-体形式的TriNKET的图示。
图30A至图30B为呈κλ-体形式的TriNKET的图示，所述κλ-体形式为具有融合至通过异二聚化突变稳定化的Fc的两个不同的Fab的异二聚构建体：一个靶向抗原1的Fab含有κLC，并且靶向抗原2的第二Fab含有λLC。图30A为一种形式的κλ-体的示例性图示；图30B为另一κλ-体的示例性图示。
图31为Oasc-Fab异二聚构建体，所述Oasc-Fab异二聚构建体包括结合于靶标1的Fab和结合于靶标2的scFab，这两者均融合至Fc结构域。通过Fc结构域中的突变来确保异二聚化。
图32为DuetMab，所述DuetMab为含有结合于抗原1和2的两个不同的Fab以及通过异二聚化突变稳定化的Fc的异二聚构建体。Fab 1和2含有不同的S-S桥，从而确保正确的轻链和重链配对。
图33为CrossmAb，所述CrossmAb为具有结合于靶标1和2的两个不同的Fab以及通过异二聚化突变稳定化的Fc的异二聚构建体。对CL和CH1结构域以及VH和VL结构域进行转换，例如使CH1与VL呈直线融合，同时使CL与VH呈直线融合。
图34为Fit-Ig，所述Fit-Ig为均二聚构建体，其中结合于抗原2的Fab融合至结合于抗原1的Fab的HC的N端。构建体含有野生型Fc。
图35为示出靶向FLT3的TriNKET与EL4细胞上表达的NKG2D的结合的线图。使用FLT3单克隆抗体IMCEB10作为对照。
图36A和图36B为示出靶向FLT3的TriNKET与人AML细胞系Molm-13(图36A)和EOL-1(图36B)上表达的FLT3的结合的线图。使用FLT3单克隆抗体IMCEB10作为对照。
图37A和图37B为示出在37℃下孵育2小时和20小时之后EOL-1细胞(图37A)和Molm-13细胞(图37B)上靶向FLT3的TriNKET的内化的线图。使用林妥珠单抗(Lintuzumab)作为对照。
图38A和图38B为示出TriNKET介导的人NK细胞对表达FLT3的EOL-1细胞的细胞毒性的线图。图38A中示出了FLT3单克隆抗体IMCEB10以及含有衍生自IMCEB10的FLT3结合结构域的TriNKET。图38B中示出了FLT3单克隆抗体4G8以及含有衍生自4G8的FLT3结合结构域的TriNKET。
具体实施方式
本发明提供多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白结合自然杀手细胞上的NKG2D受体和CD16受体，以及肿瘤相关抗原FLT3。在一些实施方案中，多特异性蛋白还包括结合FLT3或另一肿瘤相关抗原的另一抗原结合位点。本发明还提供包含此类多特异性结合蛋白的药物组合物，以及出于诸如治疗癌症的目的使用此类多特异性蛋白和药物组合物的治疗方法。以下在多个部分中阐述本发明的各个方面；然而，在一个特定部分中所描述的本发明的方面不限于任何特定部分。
为促进对本发明的理解，许多术语和短语定义如下。
如本文所用的术语“一个”和“一种”意指“一个(种)或多个(种)”并且除非上下文为不适当的，否则包括复数。
如本文所用，术语“抗原结合位点”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。在人抗体中，抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度趋异性延伸段称为“高变区”，所述高变区之间插有称为“构架区”或“FR”的较保守侧接延伸段。因此，术语“FR”是指在免疫球蛋白中天然地存在于高变区之间和附近的氨基酸序列。在人抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区相对于彼此安置于三维空间中以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且重链和轻链中的每一者的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。在某些动物(诸如骆驼和软骨鱼)中，抗原结合位点由单一抗体链形成，提供“单域抗体”。抗原结合位点可存在于完整抗体中、抗体中保留抗原结合表面的抗原结合片段中或诸如scFv等重组多肽中，在单一多肽中使用肽接头将重链可变域连接至轻链可变域。
如本文所用的术语“肿瘤相关抗原”意指与癌症相关的任何抗原，包括但不限于蛋白质、糖蛋白、神经节苷脂、碳水化合物、脂质。此类抗原可在恶性细胞上或在肿瘤微环境中(诸如肿瘤相关血管、细胞外基质、间充质或免疫浸润物上)表达。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指要用本文所描述的方法和组合物治疗的有机体。此类有机体优选包括但不限于哺乳动物(例如鼠、猿、马、牛、猪、犬、猫等)并且更优选包括人。
如本文所用，术语“有效量”是指化合物(例如本发明的化合物)足以实现有益或所需结果的量。有效量可以一次或多次施用、施加或给药进行施用并且不旨在限于特定制剂或施用途径。如本文所用，术语“治疗”包括引起疾患、疾病、病症等改善或改善它们的症状的任何作用，例如减轻、降低、调节、改善或消除。
如本文所用，术语“药物组合物”是指使得组合物尤其适合用于体内或离体诊断或治疗用途的活性剂与惰性或活性载体的组合。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指标准医药载体中的任一者，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)，以及各种类型的润湿剂。组合物还可包括稳定剂和防腐剂。关于载体、稳定剂以及助剂的实例，参见例如Martin,Remington'sPharmaceutical Sciences,第15版,Mack Publ.Co.,Easton,PA[1975]。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的任何药学上可接受的盐(例如酸或碱)，所述药学上可接受的盐在向受试者施用后能够提供本发明化合物或它的活性代谢产物或残余物。如本领域技术人员已知的，本发明化合物的“盐”可衍生自无机或有机酸和碱。示例性酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸(诸如草酸)虽然本身不是药学上可接受的，但也可用于制备在获得本发明化合物和它们的药学上可接受的酸加成盐时可用作中间物的盐。
示例性碱包括但不限于碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨水以及具有式NW4 +的化合物(其中W为C1-4烷基)等。
示例性盐包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、富马酸盐、氟庚酸盐(flucoheptanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、扑酸盐(palmoate)、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐等。盐的其他实例包括本发明化合物的与诸如以下的适合的阳离子复合的阴离子：Na+、NH4 +以及NW4 +(其中W为C1-4烷基)等。
对于治疗性用途，本发明化合物的盐预期为药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱的盐也可以例如在药学上可接受的化合物的制备或纯化中获得应用。
在本说明书通篇中，在将组合物描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或在将工艺和方法描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，预期另外存在大体上由所叙述的组分组成或由所叙述的组分组成的本发明组合物，并且存在大体上由所叙述的加工步骤组成或由所叙述的加工步骤组成的根据本发明的工艺和方法。
除非另外指明，否则一般来说，指定百分比的组合物是按重量计。另外，如果变量未伴随定义，那么以变量的先前定义为准。
I.蛋白质
本发明提供多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白结合于自然杀手细胞上的NKG2D受体和CD16受体，以及肿瘤相关抗原FLT3。多特异性结合蛋白可用于本文所描述的药物组合物和治疗方法中。多特异性结合蛋白与自然杀手细胞上的NKG2D受体和CD16受体结合使自然杀手细胞破坏表达FLT3的肿瘤细胞的活性增强。多特异性结合蛋白与表达FLT3的细胞结合将癌细胞带至自然杀手细胞附近，这促使自然杀手细胞直接和间接破坏癌细胞。以下提供对一些示例性多特异性结合蛋白的进一步描述。
多特异性结合蛋白的第一组分结合于表达NKG2D受体的细胞，所述表达NKG2D受体的细胞可包括但不限于NK细胞、γδT细胞以及CD8+αβT细胞。在NKG2D结合后，多特异性结合蛋白可阻断天然配体(诸如ULBP6和MICA)结合于NKG2D以及活化NKG2D受体。
多特异性结合蛋白的第二组分结合FLT3。表达FLT3的细胞可见于白血病(例如急性骨髓性白血病和T细胞白血病)中。
多特异性结合蛋白的第三组分结合于表达CD16的细胞，CD16为包括自然杀手细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞以及滤泡树突细胞的白细胞表面的Fc受体。
本文所描述的多特异性结合蛋白可呈各种模式。举例来说，一种模式为包括第一免疫球蛋白重链、第一免疫球蛋白轻链、第二免疫球蛋白重链以及第二免疫球蛋白轻链的异二聚多特异性抗体(图1)。第一免疫球蛋白重链包括第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第一重链可变域以及任选的第一CH1重链结构域。第一免疫球蛋白轻链包括第一轻链可变域和第一轻链恒定域。第一免疫球蛋白轻链与第一免疫球蛋白重链一起形成结合NKG2D的抗原结合位点。第二免疫球蛋白重链包含第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第二重链可变域以及任选的第二CH1重链结构域。第二免疫球蛋白轻链包括第二轻链可变域和第二轻链恒定域。第二免疫球蛋白轻链与第二免疫球蛋白重链一起形成结合FLT3的抗原结合位点。第一Fc结构域和第二Fc结构域一起能够结合于CD16(图1)。在一些实施方案中，第一免疫球蛋白轻链与第二免疫球蛋白轻链相同。
另一示例性模式涉及包括第一免疫球蛋白重链、第二免疫球蛋白重链以及免疫球蛋白轻链的异二聚多特异性抗体(图2)。第一免疫球蛋白重链包括第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域，所述第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域经由接头或抗体铰链融合至由重链可变域和轻链可变域组成的单链可变片段(scFv)，所述重链可变域和轻链可变域配对并且结合NKG2D，或结合FLT3抗原。第二免疫球蛋白重链包括第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第二重链可变域以及任选的CH1重链结构域。免疫球蛋白轻链包括轻链可变域和轻链恒定域。第二免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链配对并且结合于NKG2D或结合肿瘤相关抗原FLT3。第一Fc结构域和第二Fc结构域一起能够结合于CD16(图2)。
一个或多个额外结合基序可任选经由接头序列融合至恒定区CH3结构域的C端。在某些实施方案中，抗原结合基序为单链或形成四价或三价分子的二硫化物稳定的可变区(scFv)。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈Triomab形式，所述Triomab形式为维持IgG样形状的三功能双特异性抗体。此嵌合体由两个半抗体组成，这两个半抗体各自具有一条轻链和一条重链，所述一条轻链和一条重链来源于两个亲本抗体。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白为KiH常见轻链(LC)形式，所述KiH常见轻链(LC)形式涉及杵入臼(KIH)技术。KIH涉及将CH3结构域工程化以在每条重链中形成“杵”或“臼”从而促进异二聚化。“杵入臼(KiH)”Fc技术后的原理为通过将小残基用庞大残基取代在一个CH3结构域(CH3A)中引入“杵”(例如EU编号中的T366WCH3A)。为容纳“杵”，通过将最靠近杵的相邻残基用较小残基置换在另一CH3结构域(CH3B)上形成互补的“臼”表面(例如T366S/L368A/Y407VCH3B)。通过结构指导的噬菌体文库筛选(Atwell S,Ridgway JB,WellsJA,Carter P.,Stable heterodimers from remodeling the domain interface of ahomodimer using a phage display library,J.Mol.Biol.(1997)270(l):26-35)对“臼”突变进行优化。KiH Fc变体的X射线晶体结构(Elliott JM,Ultsch M,Lee J,Tong R,Takeda K,Spiess C等,Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylatedhalf-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobicinteraction.J.Mol.Biol.(2014)426(9):1947-57；Mimoto F,Kadono S,Katada H,IgawaT,Kamikawa T,Hattori K.Crystal structure of a novel asymmetrically engineeredFc variant with improved affinity for FcγRs.Mol.Immunol.(2014)58(1):132-8)证实由CH3结构域间核心界面处的空间互补性驱动的疏水相互作用在热力学上有利于异二聚化，而杵-杵和臼-臼界面分别因空间位阻和有利相互作用的破坏而不利于均二聚化。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈双可变域免疫球蛋白(DVD-IgTM)形式，所述双可变域免疫球蛋白形式经由天然存在的柔性接头组合两个单克隆抗体的靶标结合结构域，并且产生四价IgG样分子。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈正交Fab界面(正交Fab)形式。在正交FabIgG方法(Lewis SM,Wu X,Pustilnik A,Sereno A,Huang F,Rick HL等,Generation ofbispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fabinterface.Nat.Biotechnol.(2014)32(2):191-8)中，基于结构的区域性设计仅在一个Fab中在LC和HCVH-CH1界面处引入互补突变，而未对另一Fab作出任何变化。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈二合一Ig模式。在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈ES形式，所述ES形式为含有融合至Fc并且结合于靶标1和靶标2的两个不同的Fab的异二聚构建体。通过Fc中的静电转向突变来确保异二聚化。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈κλ-体形式，所述κλ-体形式为具有融合至通过异二聚化突变稳定化的Fc的两个不同的Fab的异二聚构建体：靶向抗原1的Fab1含有κLC，而靶向抗原2的第二Fab含有λLC。图30A为一种形式的κλ-体的示例性图示；图30B为另一κλ-体的示例性图示。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈Fab臂更换形式(如下抗体，所述抗体通过将重链和连接的轻链(半分子)用来自另一分子的重链-轻链对交换来更换Fab臂，这产生双特异性抗体)。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈SEED体形式。将链更换工程化结构域(SEED)平台设计成产生不对称和双特异性抗体样分子，此能力扩展了天然抗体的治疗应用。此蛋白质工程化平台是基于在结构上更换保守CH3结构域内的免疫球蛋白的相关序列。SEED设计允许高效产生AG/GA异二聚体，同时不对AG和GA SEED CH3结构域的均二聚化有利。(Muda M.等,Protein Eng.Des.Sei.(2011,24(5):447-54))。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈LuZ-Y形式，其中亮氨酸拉链用于诱导两个不同HC的异二聚化。(Wranik,BJ.等,J.Biol.Chem.(2012),287:43331-9)。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈Cov-X-体形式。在双特异性CovX-体中，两个不同的肽使用分枝氮杂环丁酮接头连接一起并且在温和条件下以位点特异性方式融合至支架抗体。尽管药效团负责功能活性，但抗体支架产生长半衰期和Ig样分布。可对药效团进行化学优化或用其他药效团置换以产生优化或独特的双特异性抗体。(DoppalapudiVR等,PNAS(2010),107(52)；22611-22616)。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈Oasc-Fab异二聚形式，所述Oasc-Fab异二聚形式包括结合于靶标1的Fab，以及融合至Fc的结合于靶标2的scFab。通过Fc中的突变来确保异二聚化。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈DuetMab形式，所述DuetMab形式为含有结合于抗原1和2的两个不同的Fab以及通过异二聚化突变稳定化的Fc的异二聚构建体。Fab1和2含有不同的S-S桥，从而确保正确的LC和HC配对。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈CrossmAb形式，所述CrossmAb形式为具有融合至通过异二聚化稳定化的Fc并且结合于靶标1和2的两个不同的Fab的异二聚构建体。对CL和CH1结构域以及VH和VL结构域进行转换，例如使CH1与VL呈直线融合，同时使CL与VH呈直线融合。
在一些实施方案中，多特异性结合蛋白呈Fit-Ig形式，所述Fit-Ig形式为均二聚构建体，其中结合于抗原2的Fab融合至结合于抗原1的Fab的HC的N端。构建体含有野生型Fc。
表1列出了以组合形式可结合于NKG2D的重链可变域和轻链可变域的肽序列。NKG2D结合结构域对NKG2D的结合亲和力可变化，然而，它们全部活化人NKG2D和NK细胞。
Figure BDA0002427567180000171
Figure BDA0002427567180000181
Figure BDA0002427567180000191
Figure BDA0002427567180000201
Figure BDA0002427567180000211
Figure BDA0002427567180000221
Figure BDA0002427567180000231
Figure BDA0002427567180000241
或者，如US 9,273,136中所说明，由SEQ ID NO：101表示的重链可变域可与由SEQID NO：102表示的轻链可变域配对以形成可结合于NKG2D的抗原结合位点。
SEQ ID NO：101
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFI
RYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGL
GDGTYFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：102
QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDL
LPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTK
LTVL
或者，如US 7,879,985中所说明，由SEQ ID NO：103表示的重链可变域可与由SEQID NO：104表示的轻链可变域配对以形成可结合于NKG2D的抗原结合位点。
SEQ ID NO：103
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYS
GSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWG
QGTMVTVSS
SEQ ID NO：104
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASS
RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
在一个方面中，本公开提供多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白结合于自然杀手细胞上的NKG2D受体和CD16受体，以及抗原FLT3。表2列出了以组合形式可结合于FLT3的重链可变域和轻链可变域的一些示例性序列。
Figure BDA0002427567180000251
Figure BDA0002427567180000261
或者，可通过针对与由SEQ ID NO：133确定的氨基酸序列的结合进行筛选来鉴定可结合于FLT3的新颖抗原结合位点。
SEQ ID NO：133
MPALARDGGQLPLLVVFSAMIFGTITNQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSE
SPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQ
PHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFR
KMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCC
ARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELEN
KALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEK
GFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKF
CNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWT
WKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNS
LGTSCETILLNSPGPFPFIQDNISFYATIGVCLLFIVVLTLLICHKYKKQFRYESQLQMV
QVTGSSDNEYFYVDFREYEYDLKWEFPKENLEFGKVLGSGAFGKVMNATAYGISKT
GVSIQVAVKMLKEKADSSEREALMSELKMMTQLGSHENIVNLLGACTLSGPIYLIFE
YCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQSHPNSSMPGSREVQIHPDSD
QISGLHGNSFHSEDEIEYENQKRLEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSCV
HRDLAARNVLVTHGKVVKICDFGLARDIMSDSNYVVRGNARLPVKWMAPESLFEGI
YTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQNGFKMDQPFYATEEIYIIMQ
SCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLADAEEAMYQNVDGRVSECPHTYQNRRPFSREM
DLGLLSPQAQVEDS
在Fc结构域内，CD16结合由铰链区和CH2结构域介导。举例来说，在人IgG1内，与CD16的相互作用主要集中于氨基酸残基Asp 265-Glu 269、Asn 297-Thr 299、Ala 327-Ile332、Leu 234-Ser239以及在CH2结构域中的碳水化合物残基N-乙酰基-D-葡糖胺(参见Sondermann等，Nature，406(6793)：267-273)。基于已知结构域，可诸如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面展示cDNA文库来选择突变以增强或降低对CD16的结合亲和力，或可基于相互作用的已知三维结构进行设计。
可通过在同一细胞中表达两个不同抗体重链序列来实现异二聚抗体重链的组装，这可能会引起每条抗体重链的均二聚体的组装以及异二聚体的组装。促进异二聚体的优先组装可如US13/494870、US16/028850、US11/533709、US12/875015、US13/289934、US14/773418、US12/811207、US13/866756、US14/647480及US 14/830336中所示通过在每个抗体重链恒定区的CH3结构域中合并不同突变来实现。举例来说，可基于人IgG1在CH3结构域中实现突变，并且在第一多肽和第二多肽内合并独特的氨基酸取代对，从而允许这两条链彼此选择性异二聚化。下文说明的氨基酸取代位置全部是根据如Kabat中的EU索引进行编号。
在一种情况中，第一多肽中的氨基酸取代将原始氨基酸用选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)的更大氨基酸替代，并且第二多肽中的至少一种氨基酸取代将一个或多个原始氨基酸用选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)的一个或多个更小氨基酸替代，使得更大氨基酸取代(突起)适合放入更小氨基酸取代(空腔)的表面。举例来说，一个多肽可合并T366W取代，并且另一个多肽可合并三个取代，包括T366S、L368A以及Y407V。
本发明的抗体重链可变域可任选连接至与抗体恒定区(诸如具有或不具有CH1结构域的包括铰链、CH2以及CH3结构域的IgG恒定区)至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，恒定区的氨基酸序列与人抗体恒定区(诸如人IgG1恒定区、IgG2恒定区、IgG3恒定区或IgG4恒定区)至少90％同一。在另外一些实施方案中，恒定区的氨基酸序列与来自另一哺乳动物(诸如兔、狗、猫、小鼠或马)的抗体恒定区至少90％同一。可与人IgG1恒定区相比例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和/或K439处将一个或多个突变合并至恒定区中。示例性取代包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D以及K439E。
在某些实施方案中，可合并至人IgG1恒定区的CH1中的突变可位于氨基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171和/或V173处。在某些实施方案中，可合并至人IgG1恒定区的Cκ中的突变可位于氨基酸E123、F116、S176、V163、S174和/或T164处。
或者，氨基酸取代可选自以下表3中所示的取代集合。
Figure BDA0002427567180000281
Figure BDA0002427567180000291
或者，氨基酸取代可选自以下表4中所示的取代集合。
表4
第一多肽 第二多肽
集合1 K409W D399V/F405T
集合2 Y349S E357W
集合3 K360E Q347R
集合4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
集合5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
集合6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
或者，氨基酸取代可选自以下表5中所示的取代集合。
表5
第一多肽 第二多肽
集合1 T366K/L351K L351D/L368E
集合2 T366K/L351K L351D/Y349E
集合3 T366K/L351K L351D/Y349D
集合4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E
集合5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E
集合6 E356K/D399K K392D/K409D
或者，每条多肽链中的至少一个氨基酸取代可选自表6。
Figure BDA0002427567180000292
或者，至少一个氨基酸取代可选自以下表7中的取代集合，其中第一多肽栏中所指示的一个或多个位置由任何已知带负电荷的氨基酸替代，并且第二多肽栏中所指示的一个或多个位置由任何已知带正电荷的氨基酸替代。
表7
第一多肽 第二多肽
K392、K370、K409或K439 D399、E356或E357
或者，至少一个氨基酸取代可选自以下表8中的集合，其中第一多肽栏中所指示的一个或多个位置由任何已知带正电荷的氨基酸替代，并且第二多肽栏中所指示的一个或多个位置由任何已知带负电荷的氨基酸替代。
表8
第一多肽 第二多肽
D399、E356或E357 K409、K439、K370或K392
或者，氨基酸取代可选自以下表9中的集合。
Figure BDA0002427567180000301
或者或此外，可通过在第一或第二多肽链中的任一者上引入S354C并且在相对的多肽链上引入Y349C来增加异多聚蛋白的结构稳定性，这在两个多肽的界面内形成人工二硫键。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在位置T366处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由T366、L368以及Y407组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由T366、L368以及Y407组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在位置T366处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405以及T411组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405以及T411组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405以及T411组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405以及T411组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由L351、D399、S400以及Y407组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由T366、N390、K392、K409以及T411组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由T366、N390、K392、K409以及T411组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由L351、D399、S400以及Y407组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由Q347、Y349、K360以及K409组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由Q347、E357、D399以及F405组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由Q347、E357、D399以及F405组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由Y349、K360、Q347以及K409组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由K370、K392、K409以及K439组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由D356、E357以及D399组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由D356、E357以及D399组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由K370、K392、K409以及K439组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由L351、E356、T366以及D399组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由Y349、L351、L368、K392以及K409组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自由Y349、L351、L368、K392以及K409组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列在选自由L351、E356、T366以及D399组成的组的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因S354C取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因Y349C取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因Y349C取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因S354C取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因K360E和K409W取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因O347R、D399V以及F405T取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因O347R、D399V以及F405T取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因K360E和K409W取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因T366W取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因T366S、T368A以及Y407V取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因T366S、T368A以及Y407V取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因T366W取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因T350V、L351Y、F405A以及Y407V取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因T350V、T366L、K392L以及T394W取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列因T350V、T366L、K392L以及T394W取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中抗体恒定区的另一多肽链的氨基酸序列因T350V、L351Y、F405A以及Y407V取代而不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
可使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术制备上文所描述的多特异性蛋白。举例来说，可将编码第一免疫球蛋白重链的第一核酸序列克隆至第一表达载体中；可将编码第二免疫球蛋白重链的第二核酸序列克隆至第二表达载体中；可将编码免疫球蛋白轻链的第三核酸序列克隆至第三表达载体中；并且可将第一、第二以及第三表达载体一起稳定转染至宿主细胞中以产生多聚蛋白。
为实现多特异性蛋白的最高产率，可探索不同比率的第一、第二以及第三表达载体以确定用于转染至宿主细胞中的最佳比率。在转染之后，可将单一克隆分离以便使用诸如有限稀释、ELISA、FACS、显微术或Clonepix等本领域中已知的方法产生细胞库。
可将克隆在适合于生物反应器放大的条件下培养并且维持多特异性蛋白的表达。可使用本领域中已知的包括以下的方法将多特异性蛋白质分离和纯化：离心、深度过滤、细胞溶解、均质化、冷冻-解冻、亲和力纯化、凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用交换色谱以及混合模式色谱。
II.多特异性蛋白的特征
本文所描述的多特异性蛋白包括NKG2D结合位点、CD16结合位点以及FLT3结合位点。在一些实施方案中，多特异性蛋白同时结合于表达NKG2D和/或CD16的细胞(诸如NK细胞)以及表达FLT3的肿瘤细胞。多特异性蛋白与NK细胞结合可增强NK细胞破坏肿瘤细胞的活性。
在一些实施方案中，多特异性蛋白以类似于对应FLT3单克隆抗体(即，含有与合并至多特异性蛋白中的FLT3结合位点相同的FLT3结合位点的单克隆抗体)的亲和力结合于FLT3。在一些实施方案中，多特异性蛋白与对应FLT3单克隆抗体相比更有效地杀死表达FLT3的肿瘤细胞。
在某些实施方案中，本文所描述的包括NKG2D结合位点和FLT3结合位点的多特异性蛋白当与表达FLT3的细胞共培养时活化原代人NK细胞。NK细胞活化的标志为CD107a去颗粒作用增加以及IFN-γ细胞因子产生。此外，与对应FLT3单克隆抗体相比，在存在表达FLT3的细胞的情况下多特异性蛋白可显示优良人NK细胞活化。
在某些实施方案中，本文所描述的包括NKG2D结合位点和FLT3结合位点的多特异性蛋白增强与表达FLT3的细胞共培养的静置和IL-2活化的人NK细胞的活性。
在某些实施方案中，与结合于FLT3的对应单克隆抗体相比，多特异性蛋白在靶向表达中等水平和低水平FLT3的肿瘤细胞中提供优点。
III.治疗应用
本发明提供使用本文所描述的多特异性结合蛋白和/或本文所描述的药物组合物治疗癌症的方法。可使用所述方法治疗表达FLT3的多种癌症。在一些实施方案中，癌症为白血病，例如急性骨髓性白血病、T细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病或毛细胞白血病。
在另外一些实施方案中，癌症为乳腺癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌或胃癌、一种或多种涎腺导管癌、肺部腺癌或子宫癌的侵袭性形式，诸如子宫浆液性内膜癌。在另外一些实施方案中，癌症为脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、睾丸癌或子宫癌。在其他实施方案中，癌症为鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、肉瘤(例如血管肉瘤或软骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、胆道癌、甲状腺癌、肢端雀斑样黑素瘤、光化性角化病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、肛管癌、肛门癌、肛管直肠癌、星形细胞肿瘤、前庭球腺癌、基底细胞癌、胆管癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺癌、类癌、胆管细胞癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊腺瘤、消化系统癌症、十二指肠癌、内分泌系统癌症、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫骨膜样腺癌、内皮细胞癌、室管膜癌、上皮细胞癌、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、眼癌和眼眶癌、雌性生殖器官癌、局灶性结节性增生症、胆囊癌、胃窦癌、胃底贲门癌、胃泌素瘤、成胶质细胞瘤、胰升血糖素瘤、心脏癌、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝胆癌、肝细胞癌、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、回肠癌、胰岛素瘤、上皮内瘤样病变、上皮间鳞状细胞瘤形成、肝内胆管癌、侵入性鳞状细胞癌空肠癌联合癌症、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、骨盆癌、大细胞癌、大肠癌、平滑肌肉瘤、恶性小痣黑素瘤、淋巴瘤、雄性生殖器官癌、恶性黑素瘤、恶性间皮肿瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移癌、口癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神经系统癌症、神经上皮腺癌结节性黑素瘤、非上皮皮肤癌、非霍奇金氏淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突胶质细胞癌、口腔癌、骨肉瘤、乳头状浆液性腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、成肺细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌症、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌瘤、瘘管癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、分泌生长抑素的肿瘤、脊柱癌、鳞状细胞癌、横纹肌癌、间皮下癌、浅表扩散性黑素瘤、T细胞白血病、舌癌、未分化性癌、输尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿系统癌症、子宫颈癌、子宫体癌、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、疣状癌、VIP瘤、外阴癌、高分化癌或威尔姆氏瘤(Wilmstumor)。
在另外一些实施方案中，要治疗的癌症为非霍奇金氏淋巴瘤，诸如B细胞淋巴瘤或T细胞淋巴瘤。在某些实施方案中，非霍奇金氏淋巴瘤为B细胞淋巴瘤，诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节性边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病或原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤。在某些其他实施方案中，非霍奇金氏淋巴瘤为T细胞淋巴瘤，诸如前体成T-淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、血管成免疫细胞性T细胞淋巴瘤、结外自然杀手/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤或外周T细胞淋巴瘤。
IV.组合疗法
本发明的另一方面提供组合疗法。可将本文所描述的多特异性结合蛋白与额外治疗剂组合使用以治疗癌症。
可在治疗癌症时用作组合疗法的一部分的示例性治疗剂包括例如辐射、丝裂霉素、维甲酸、ribomustin、吉西他滨(gemcitabine)、长春新碱、依托泊苷(etoposide)、克拉屈滨(cladribine)、二溴甘露醇、胺甲喋呤、多柔比星(doxorubicin)、卡波醌(carboquone)、喷司他汀(pentostatin)、尼曲吖啶(nitracrine)、净司他丁(zinostatin)、西曲瑞克(cetrorelix)、来曲唑(letrozole)、雷替曲塞(raltitrexed)、道诺霉素(daunorubicin)、法屈唑(fadrozole)、福莫司汀(fotemustine)、胸腺法新(thymalfasin)、索布佐生(sobuzoxane)、奈达铂(nedaplatin)、阿糖胞苷、比卡米特(bicalutamide)、长春瑞滨、维司力农(vesnarinone)、胺鲁米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、丙谷胺(proglumide)、依利乙酸盐(elliptinium acetate)、酮色林(ketanserin)、脱氧氟尿苷、依曲替酯(etretinate)、异维甲酸、链佐星(streptozocin)、尼莫司汀(nimustine)、长春地辛、氟他米特(flutamide)、drogenil、布缩宫素(butocin)、卡莫氟(carmofur)、雷佐生(razoxane)、西索菲兰(sizofilan)、卡铂(carboplatin)、二溴卫矛醇、替加氟(tegafur)、异环磷酰胺、泼尼莫司汀(prednimustine)、皮西板尼(picibanil)、左旋咪唑(levamisole)、替尼泊苷(teniposide)、英丙舒凡(improsulfan)、依诺他滨(enocitabine)、麦角乙脲、羟甲烯龙(oxymetholone)、他莫昔芬(tamoxifen)、孕酮、美雄酮(mepitiostane)、表硫雄醇、福美司坦(formestane)、干扰素-α、干扰素-2α、干扰素-β、干扰素-γ(IFN-γ)、菌落刺激因子-1、菌落刺激因子-2、地尼白介素白喉连接物(denileukindiftitox)、白介素-2、促黄体激素释放因子以及上述剂的变化型式，所述变化型式可展现与它的同源受体的差异结合以及增加或降低的血清半衰期。
可在治疗癌症时用作组合疗法的一部分的另一类剂为免疫检查点抑制剂。示例性免疫检查点抑制剂包括抑制以下中的一者或多者的剂：(i)细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，(ii)程序化细胞死亡蛋白1(PD1)，(iii)PDL1，(iv)LAG3，(v)B7-H3，(vi)B7-H4，以及(vii)TIM3。CTLA4抑制剂伊匹单抗(ipilimumab)已由美国食品和药物管理局(UnitedStates Food and Drug Administration)批准用于治疗黑素瘤。
可在治疗癌症时用作组合疗法的一部分的其他剂为靶向非检查点靶标(例如赫塞汀(herceptin))和非细胞毒性剂(例如酪氨酸-激酶抑制剂)的单克隆抗体剂。
其他类别的抗癌剂包括例如：(i)选自以下的抑制剂：ALK抑制剂、ATR抑制剂、A2A拮抗剂、碱基切除修复抑制剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton'sTyrosine Kinase)抑制剂、CDC7抑制剂、CHK1抑制剂、周期蛋白依赖性激酶抑制剂、DNA-PK抑制剂、DNA-PK与mTOR的抑制剂、DNMT1抑制剂、DNMT1抑制剂加上2-氯-脱氧腺苷、HDAC抑制剂、刺猬信号传导路径抑制剂、IDO抑制剂、JAK抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂、MELK抑制剂、MTH1抑制剂、PARP抑制剂、磷酸肌醇3-激酶抑制剂、PARP1与DHODH的抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶-II抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR抑制剂以及WEE1抑制剂；(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS的激动剂；以及(iii)选自以下的细胞因子：IL-12、IL-15、GM-CSF以及G-CSF。
本发明的蛋白质还可用作手术移除原发病损的辅助物。
可对多特异性结合蛋白和额外治疗剂的量以及相对施用时间加以选择以实现所需组合治疗作用。举例来说，当向需要此类施用的患者施用组合疗法时，组合中的治疗剂或包含治疗剂的一种或多种药物组合物可以任何顺序施用，诸如依序、并行、一起、同时等。另外，举例来说，可将多特异性结合蛋白在一种或多种额外治疗剂发挥其预防或治疗作用的时间期间施用，或反之亦然。
V.药物组合物
本公开还提供含有治疗有效量的本文所描述的蛋白质的药物组合物。可将组合物配制成用于多种药物递送系统中。对于适当的制剂，组合物中还可包括一种或多种生理学上可接受的赋形剂或载体。适合用于本公开中的制剂可见于Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,第17版,1985中。对于药物递送方法的简单综述，参见例如Langer(Science 249:1527-1533,1990)。
本公开的静脉内药物递送制剂可含于袋、笔或注射器中。在某些实施方案中，可将袋连接至包含管和/或针的通道。在某些实施方案中，制剂可为冻干制剂或液体制剂。在某些实施方案中，可对制剂进行冷冻干燥(冻干)并且容纳于约12-60个小瓶中。在某些实施方案中，可对制剂进行冷冻干燥并且一个小瓶中可含有45mg的冷冻干燥制剂。在某些实施方案中，一个小瓶中可含有约40mg-约100mg的冷冻干燥制剂。在某些实施方案中，将来自12、27或45个小瓶的冷冻干燥制剂组合，以获得含治疗剂量的蛋白质的静脉内药物制剂。在某些实施方案中，制剂可为液体制剂并且以约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶加以储存。在某些实施方案中，制剂可为液体制剂并且以约600mg/小瓶加以储存。在某些实施方案中，制剂可为液体制剂并且以约250mg/小瓶加以储存。
蛋白质可存在于液体水性药物制剂中，所述液体水性药物制剂包括形成制剂的含治疗有效量的蛋白质的缓冲溶液。
可通过常规灭菌技术对这些组合物进行灭菌，或可进行无菌过滤。可将所得水溶液包装成按原样使用，或冻干，冻干制剂在施用之前与无菌水性载体组合。制剂的pH值典型地将在3与11之间，更优选在5与9之间或在6与8之间，并且最优选在7与8之间，诸如7至7.5。可将呈固体形式的所得组合物包装在多个单一剂量单元中，所述多个单一剂量单元各自含有固定量的一种或多种上述剂。还可将呈固体形式的组合物包装在用于灵活量的容器中。
在某些实施方案中，本公开提供一种具有延长的贮藏寿命的制剂，所述具有延长的贮藏寿命的制剂包括本公开的蛋白质与以下物质的组合：甘露糖醇、单水合柠檬酸、柠檬酸钠、二水合磷酸二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、聚山梨醇酯80、水以及氢氧化钠。
在某些实施方案中，制备包括含本公开的蛋白质的pH缓冲溶液的水性制剂。本发明的缓冲液可具有在约4至约8(例如约4.5至约6.0或约4.8至约5.5)范围内的pH值，或可具有约5.0至约5.2的pH值。上文所述pH值中间的范围也旨在为本公开的一部分。举例来说，使用任何上文所述值的组合作为上限和/或下限的值范围旨在被包括在内。将pH值控制在此范围内的缓冲液的实例包括乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(诸如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐以及其他有机酸缓冲液。
在某些实施方案中，制剂包括含有柠檬酸盐和磷酸盐以将pH值维持在约4至约8范围内的缓冲系统。在某些实施方案中，pH值范围可为约4.5至约6.0，或约pH值4.8至约5.5，或在约5.0至约5.2的pH值范围内。在某些实施方案中，缓冲系统包括单水合柠檬酸、柠檬酸钠、二水合磷酸二钠和/或二水合磷酸二氢钠。在某些实施方案中，缓冲系统包括约1.3mg/mL的柠檬酸(例如1.305mg/mL)、约0.3mg/mL的柠檬酸钠(例如0.305mg/mL)、约1.5mg/mL的二水合磷酸二钠(例如1.53mg/mL)、约0.9mg/mL的二水合磷酸二氢钠(例如0.86)以及约6.2mg/mL的氯化钠(例如6.165mg/mL)。在某些实施方案中，缓冲系统包括1-1.5mg/mL的柠檬酸、0.25至0.5mg/mL的柠檬酸钠、1.25至1.75mg/mL的二水合磷酸二钠、0.7至1.1mg/mL的二水合磷酸二氢钠以及6.0至6.4mg/mL的氯化钠。在某些实施方案中，用氢氧化钠调节制剂的pH值。
制剂中还可包括充当张力剂并且可稳定抗体的多元醇。将多元醇以可相对于所需制剂等张性变化的量添加至制剂中。在某些实施方案中，水性制剂可为等张的。还可相对于多元醇分子量改变所添加的多元醇的量。举例来说，与二糖(诸如海藻糖)相比，可添加较低量的单糖(例如甘露糖醇)。在某些实施方案中，可在制剂用作张力剂的多元醇为甘露糖醇。在某些实施方案中，甘露糖醇浓度可为约5至约20mg/mL。在某些实施方案中，甘露糖醇的浓度可为约7.5至15mg/mL。在某些实施方案中，甘露糖醇的浓度可为约10-14mg/mL。在某些实施方案中，甘露糖醇的浓度可为约12mg/mL。在某些实施方案中，制剂中可包括多元醇山梨糖醇。
还可将洗涤剂或表面活性剂添加至制剂中。示例性洗涤剂包括非离子洗涤剂，诸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)。所添加的洗涤剂的量使得它减少所配制抗体的聚集和/或使制剂中微粒的形成减至最少并且/或者减少吸附。在某些实施方案中，制剂可包括表面活性剂，所述表面活性剂为聚山梨醇酯。在某些实施方案中，制剂可含有洗涤剂聚山梨醇酯80或吐温80(Tween 80)。吐温80为用于描述聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯的术语(参见Fiedler,Lexikon derHifsstoffe,Editio Cantor Verlag Aulendorf,第4版,1996)。在某些实施方案中，制剂可含有约0.1mg/mL与约10mg/mL之间，或约0.5mg/mL与约5mg/mL之间的聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，可在制剂中添加约0.1％聚山梨醇酯80。
在实施方案中，将本公开的蛋白质产物配制成液体制剂。液体制剂可以10mg/mL浓度存在于用橡胶塞盖紧并且用铝锯齿形密封件密封的USP/Ph Eur I型50R小瓶中。塞子可由符合USP和Ph Eur的弹性体制成。在某些实施方案中，小瓶可填充有61.2mL的蛋白质产物溶液以允许60mL的可抽取体积。在某些实施方案中，可将液体制剂用0.9％盐水溶液稀释。
在某些实施方案中，可将本公开的液体制剂与稳定水平的糖组合制备成10mg/mL浓度溶液。在某些实施方案中，可在水性载体中制备液体制剂。在某些实施方案中，可以不大于可能产生静脉内施用不希望或不适合的粘度的量的量添加稳定剂。在某些实施方案中，糖可为二糖，例如蔗糖。在某些实施方案中，液体制剂还可包括缓冲剂、表面活性剂以及防腐剂中的一者或多者。
在某些实施方案中，可通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定液体制剂的pH值。在某些实施方案中，药学上可接受的酸可为盐酸。在某些实施方案中，碱可为氢氧化钠。
除聚集之外，去酰胺化也是常见的在发酵、收获/细胞净化、纯化、原料药/药物产品储存期间以及样品分析期间可能会出现的肽和蛋白质的产物变化型式。去酰胺化为NH3从蛋白质丢失，形成琥珀酰亚胺中间物，所述琥珀酰亚胺中间物可经历水解。琥珀酰亚胺中间物使得母体肽的质量降低17道尔顿。后续水解产生18道尔顿质量增加。归因于在水性条件下的不稳定性，琥珀酰亚胺中间物的分离为困难的。因而，去酰胺化典型地可检测为1道尔顿质量增加。天冬酰胺的去酰胺化产生天冬氨酸或异天冬氨酸。影响去酰胺化速率的参数包括pH值、温度、溶剂介电常数、离子强度、一级序列、局部多肽构象以及三级结构。肽链中靠近Asn的氨基酸残基影响去酰胺化速率。蛋白质序列中Asn后的Gly和Ser产生较高去酰胺化敏感度。
在某些实施方案中，可将本公开的液体制剂保存在pH值和湿度的条件下以防止蛋白质产物的脱氨基作用。
本文中所关注的水性载体为药学上可接受(对于向人施用安全并且无毒)并且可用于制备液体制剂的水性载体。说明性载体包括灭菌注射用水(SWFI)、抑细菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液(Ringer'ssolution)或右旋糖溶液。
可任选将防腐剂添加至本文的制剂中以减少细菌活动。添加防腐剂可例如有助于制备多用途(多剂量)制剂。
在特定情况下，静脉内(IV)制剂可为优选施用途径，诸如当患者在移植之后在医院中经由静脉内途径接收所有药物时。在某些实施方案中，在施用之前将液体制剂用0.9％氯化钠溶液稀释。在某些实施方案中，用于注射的稀释的药物产品为等张的并且适合于通过静脉内输注进行施用。
在某些实施方案中，可以10mM-200mM的量添加盐或缓冲液组分。盐和/或缓冲液为药学上可接受的并且衍生自各种已知酸(无机和有机)与“成碱”金属或胺。在某些实施方案中，缓冲液可为磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，缓冲液可为甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在此情况下，钠离子、钾离子或铵离子可充当反离子。
可任选将防腐剂添加至本文的制剂中以减少细菌活动。添加防腐剂可例如有助于制备多用途(多剂量)制剂。
本文中所关注的水性载体为药学上可接受(对于向人施用安全并且无毒)并且可用于制备液体制剂的水性载体。说明性载体包括灭菌注射用水(SWFI)、抑细菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
本公开的蛋白质可存在于包括蛋白质和冻干保护剂的冻干制剂中。冻干保护剂可为糖，例如二糖。在某些实施方案中，冻干保护剂可为蔗糖或麦芽糖。冻干制剂还可包括以下中的一者或多者：缓冲剂、表面活性剂、增容剂和/或防腐剂。
可用于稳定冻干药物产品的蔗糖或麦芽糖的量可呈至少1:2的蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比。在某些实施方案中，蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可为1:2至1:5。
在某些实施方案中，在冻干之前，可通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定制剂的pH值。在某些实施方案中，药学上可接受的酸可为盐酸。在某些实施方案中，药学上可接受的碱可为氢氧化钠。
在冻干之前，可将含有本公开的蛋白质的溶液的pH值调节为在6至8之间。在某些实施方案中，冻干药物产品的pH值范围可为7至8。
在某些实施方案中，可以10mM-200mM的量添加盐或缓冲液组分。盐和/或缓冲液为药学上可接受的并且衍生自各种已知酸(无机和有机)与“成碱”金属或胺。在某些实施方案中，缓冲液可为磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，缓冲液可为甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在此情况下，钠离子、钾离子或铵离子可充当反离子。
在某些实施方案中，可添加“增容剂”。“增容剂”为为冻干混合物增加质量并且促成冻干饼状物的物理结构(例如有助于制备维持开孔结构的大体上均匀的冻干饼状物)的化合物。说明性增容剂包括甘露糖醇、甘氨酸、聚乙二醇以及山梨糖醇。本发明的冻干制剂可含有此类增容剂。
可任选将防腐剂添加至本文的制剂中以减少细菌活动。添加防腐剂可例如有助于制备多用途(多剂量)制剂。
在某些实施方案中，可用水性载体对冻干药物产品进行配制。本文所关注的水性载体为药学上可接受(例如对于向人施用安全并且无毒)并且可用于在冻干之后制备液体制剂的水性载体。说明性稀释剂包括灭菌注射用水(SWFI)、抑细菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
在某些实施方案中，将本公开的冻干药物产品用灭菌注射用水，USP(SWFI)或0.9％氯化钠注射液，USP复原。在复原期间，将冻干粉末溶解至溶液中。
在某些实施方案中，将本公开的冻干蛋白质产物配至约4.5mL注射用水中并且用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。
可改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以对于特定患者、组合物以及施用模式获得有效实现所需治疗反应而对患者不具有毒性的活性成分量。
特定剂量可为用于每个患者的均匀剂量，例如50-5000mg的蛋白质。或者，患者的剂量可适合于患者的大致体重或表面积。确定适当剂量时的其他因素可包括所要治疗或预防的疾病或疾患、疾病的严重程度、施用途径以及患者的年龄、性别和医学状况。由本领域技术人员尤其根据本文所公开的剂量信息和分析常规地进行确定适当治疗剂量所必需的对计算的进一步细化。还可通过使用与适当剂量反应数据结合使用的已知用于确定剂量的分析来确定剂量。可在监测到疾病进展时对个别患者的剂量进行调节。可测量患者中的可靶向构建体或复合物的血液水平以观测是否需要调节剂量以达到或维持有效浓度。可使用药物基因组学来确定哪些可靶向构建体和/或复合物对给定个体来说最可能有效并且确定它们对给定个体来说最可能有效的剂量(Schmitz等,Clinica Chimica Acta 308:43-53,2001；Steimer等,Clinica Chimica Acta 308:33-41,2001)。
一般来说，基于体重的剂量为每千克体重约0.01μg至约100mg，诸如每千克体重约0.01μg至约100mg、每千克体重约0.01μg至约50mg、每千克体重约0.01μg至约10mg、每千克体重约0.01μg至约1mg、每千克体重约0.01μg至约100μg、每千克体重约0.01μg至约50μg、每千克体重约0.01μg至约10μg、每千克体重约0.01μg至约1μg、每千克体重约0.01μg至约0.1μg、每千克体重约0.1μg至约100mg、每千克体重约0.1μg至约50mg、每千克体重约0.1μg至约10mg、每千克体重约0.1μg至约1mg、每千克体重约0.1μg至约100μg、每千克体重约0.1μg至约10μg、每千克体重约0.1μg至约1μg、每千克体重约1μg至约100mg、每千克体重约1μg至约50mg、每千克体重约1μg至约10mg、每千克体重约1μg至约1mg、每千克体重约1μg至约100μg、每千克体重约1μg至约50μg、每千克体重约1μg至约10μg、每千克体重约10μg至约100mg、每千克体重约10μg至约50mg、每千克体重约10μg至约10mg、每千克体重约10μg至约1mg、每千克体重约10μg至约100μg、每千克体重约10μg至约50μg、每千克体重约50μg至约100mg、每千克体重约50μg至约50mg、每千克体重约50μg至约10mg、每千克体重约50μg至约1mg、每千克体重约50μg至约100μg、每千克体重约100μg至约100mg、每千克体重约100μg至约50mg、每千克体重约100μg至约10mg、每千克体重约100μg至约1mg、每千克体重约1mg至约100mg、每千克体重约1mg至约50mg、每千克体重约1mg至约10mg、每千克体重约10mg至约100mg、每千克体重约10mg至约50mg、每千克体重约50mg至约100mg。
可每天、每周、每月或每年给予一次或更多次剂量，或甚至每2至20年一次。本领域一般技术人员可基于所测量的可靶向构建体或复合物在体液或组织中的滞留时间和浓度而容易地估计给药重复率。本发明的施用可为静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内、通过导管灌注或通过直接病损内注射。这种施用可为每天一次或更多次、每周一次或更多次、每月一次或更多次以及每年一次或更多次地施用。
以上说明书描述了本发明的多个方面和实施方案。专利申请具体地说涵盖所述方面和实施方案的所有组合和变更。
实施例
现在总体描述的发明参考以下实施例将更容易理解，所述实施例仅仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的而被包括，并且不旨在限制本发明。
实施例1-NKG2D结合结构域结合于NKG2D
NKG2D结合结构域结合于纯化的重组NKG2D
使人、小鼠或食蟹猴NKG2D胞外域的核酸序列与编码人IgG1 Fc结构域的核酸序列融合并且引入所要表达的哺乳动物细胞中。在纯化之后，使NKG2D-Fc融合蛋白吸附至微板的孔。在用牛血清白蛋白将孔阻断以防止非特异性结合之后，滴定NKG2D结合结构域并且添加至预吸附有NKG2D-Fc融合蛋白的孔。使用二级抗体检测一级抗体结合，所述二级抗体缀合至辣根过氧化物酶并且特定地识别人κ轻链以避免Fc交叉反应性。将辣根过氧化物酶的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)添加至孔以目视观察结合信号，在450nM下测量其吸光度并且在540nM下校正。将NKG2D结合结构域克隆、同型对照或阳性对照(包含选自SEQ IDNO:101-104的重链和轻链可变域，或在eBioscience可获得的抗小鼠NKG2D克隆MI-6和CX-5)添加至每个孔。
同型对照显示与重组NKG2D-Fc蛋白质的最少结合，而阳性对照与重组抗原结合最强。由所有克隆产生的NKG2D结合结构域在人、小鼠以及食蟹猴重组NKG2D-Fc蛋白质中均展现结合，不过在克隆与克隆之间具有不同的亲和力。通常，每种抗NKG2D克隆以类似亲和力结合于人(图3)和食蟹猴(图4)重组NKG2D-Fc，但对小鼠(图5)重组NKG2D-Fc具有较低亲和力。
NKG2D结合结构域结合于表达NKG2D的细胞
将EL4小鼠淋巴瘤细胞系工程化以表达人或小鼠NKG2D-CD3ξ信号传导结构域嵌合抗原受体。以100nM浓度使用NKG2D结合克隆、同型对照或阳性对照以对EL4细胞上所表达的细胞外NKG2D进行染色。使用荧光团缀合的抗人IgG二级抗体检测抗体结合。通过流式细胞术对细胞进行分析，并且与亲本EL4细胞相比使用表达NKG2D的细胞的平均荧光强度(MFI)来计算相较于背景的倍数(FOB)。
由所有克隆产生的NKG2D结合结构域均结合于表达人和小鼠NKG2D的EL4细胞。阳性对照抗体(包含选自SEQ ID NO:101-104的重链和轻链可变域，或在eBioscience可获得的抗小鼠NKG2D克隆MI-6和CX-5)给出最佳FOB结合信号。在表达人NKG2D(图6)和小鼠(图7)NKG2D的细胞之间，每种克隆的NKG2D结合亲和力为类似的。
实施例2-NKG2D结合结构域阻断天然配体与NKG2D的结合
与ULBP-6的竞争
使重组人NKG2D-Fc蛋白质吸附至微板的孔，并且将孔用牛血清白蛋白阻断以减少非特异性结合。将饱和浓度的ULBP-6-His-生物素添加至孔，随后添加NKG2D结合结构域克隆。在2-小时孵育之后，将孔洗涤并且通过缀合至辣根过氧化物酶的链霉亲和素和TMB底物检测仍然结合于NKG2D-Fc包覆的孔的ULBP-6-His-生物素。在450nM下测量吸光度并且在540nM下校正。在扣除背景之后，由孔中与NKG2D-Fc蛋白质的结合被阻断的ULBP-6-His-生物素的百分比计算NKG2D结合结构域与NKG2D-Fc蛋白质的特异性结合。阳性对照抗体(包含选自SEQ ID NO:101-104的重链和轻链可变域)和各种NKG2D结合结构域阻断ULBP-6与NKG2D的结合，而同型对照显示几乎不与ULBP-6竞争(图8)。
ULBP-6序列由SEQ ID NO:108表示：MAAAAIPALLLCLPLLFLLFGWSRARRDDPHSLCYDITVIPKFRPGPRWCAVQGQVDEKTFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTMAWKAQNPVLREVVDILTEQLLDIQLENYTPKEPLTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSIDGQTFLLFDSEKRMWTTVHPGARKMKEKWENDKDVAMSFHYISMGDCIGWLEDFLMGMDSTLEPSAGAPLAMSSGTTQLRA TATTLILCCLLIILPCFILPGI(SEQ ID NO:108)
与MICA的竞争
使重组人MICA-Fc蛋白质吸附至微板的孔，并且将孔用牛血清白蛋白阻断以减少非特异性结合。将NKG2D-Fc-生物素添加至孔，随后添加NKG2D结合结构域。在孵育和洗涤之后，使用链霉亲和素-HRP和TMB底物检测仍然结合于MICA-Fc包覆的孔的NKG2D-Fc-生物素。在450nM下测量吸光度并且在540nM下校正。在扣除背景之后，由与MICA-Fc包覆的孔的结合被阻断的NKG2D-Fc-生物素的百分比计算NKG2D结合结构域与NKG2D-Fc蛋白质的特异性结合。阳性对照抗体(包含选自SEQ ID NO:101-104的重链和轻链可变域)和各种NKG2D结合结构域阻断MICA与NKG2D的结合，而同型对照显示几乎不与MICA竞争(图9)。
与Rae-1δ的竞争
将重组小鼠Rae-lδ-Fc(购自R&D Systems)吸附至微板的孔，并且将孔用牛血清白蛋白阻断以减少非特异性结合。将小鼠NKG2D-Fc-生物素添加至孔，随后添加NKG2D结合结构域。在孵育和洗涤之后，使用链霉亲和素-HRP和TMB底物检测仍然结合于Rae-lδ-Fc包覆的孔的NKG2D-Fc-生物素。在450nM下测量吸光度并且在540nM下校正。在扣除背景之后，由与Rae-lδ-Fc包覆的孔的结合被阻断的NKG2D-Fc-生物素的百分比计算NKG2D结合结构域与NKG2D-Fc蛋白质的特异性结合。阳性对照(包含选自SEQ ID NO:101-104的重链和轻链可变域，或在eBioscience可获得的抗小鼠NKG2D克隆MI-6和CX-5)和各种NKG2D结合结构域克隆阻断Rae-1δ与小鼠NKG2D的结合，而同型对照抗体显示几乎不与Rae-lδ竞争(图10)。
实施例3-NKG2D结合结构域克隆活化NKG2D
使人和小鼠NKG2D的核酸序列与编码CD3ξ信号传导结构域的核酸序列融合以获得嵌合抗原受体(CAR)构建体。然后使用吉普森组装(Gibson assembly)将NKG2D-CAR构建体克隆至逆转录病毒载体中并且转染至expi293细胞中用于产生逆转录病毒。用含有NKG2D-CAR的病毒以及8μg/mL聚凝胺感染EL4细胞。在感染之后24小时时，通过流式细胞术分析NKG2D-CAR在EL4细胞中的表达水平，并且选择在细胞表面上表达高水平的NKG2D-CAR的克隆。
为确定NKG2D结合结构域是否活化NKG2D，使它们吸附至微板的孔，并且在存在布雷菲德菌素-A(brefeldin-A)和莫能菌素(monensin)的情况下在抗体片段包覆的孔上将NKG2D-CAR EL4细胞培养4小时。通过流式细胞术测定细胞内TNF-α产生，即NKG2D活化的指示。将TNF-α阳性细胞的百分比归一化至用阳性对照处理的细胞。所有NKG2D结合结构域均活化人NKG2D(图11)与小鼠NKG2D(图12)两者。
实施例4-NKG2D结合结构域活化NK细胞
原代人NK细胞
使用密度梯度离心从人外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。用磁性珠粒使用负性选择从PBMC分离NK细胞(CD3-CD56+)，并且所分离NK细胞的纯度典型地>95％。然后将所分离的NK细胞在含有100ng/mL IL-2的培养基中培养24-48小时，然后将它们转移至微板中吸附NKG2D结合结构域的孔中，并且在含有荧光团缀合的抗CD107a抗体、布雷菲德菌素-A以及莫能菌素的培养基中培养。在培养之后，使用荧光团缀合的针对CD3、CD56以及IFN-γ的抗体通过流式细胞术测定NK细胞。在CD3-CD56+细胞中分析CD107a和IFN-γ染色以评估NK细胞活化。CD107a/IFN-γ双阳性细胞增加指示通过接合两个活化受体而非一个受体得到更佳的NK细胞活化。与同型对照相比，NKG2D结合结构域和阳性对照(例如由SEQ IDNO:101或SEQ ID NO:103表示的重链可变域，以及由SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:104表示的轻链可变域)显示更高百分比的NK细胞变为CD107a+和IFN-γ+(图13和图14呈现两个独立实验的数据，这两个独立实验各自使用不同供体的PBMC进行NK细胞制备)。
原代小鼠NK细胞
从C57Bl/6小鼠获得脾脏并且通过70μm细胞筛(cell strainer)破碎以获得单细胞悬浮液。使细胞集结成粒并且再悬浮于ACK溶解缓冲液(购自Thermo FisherScientific&A1049201；155mM氯化铵、10mM碳酸氢钾、0.01mM EDTA)中以移除红血细胞。将剩余细胞在100ng/mL hIL-2存在下培养72小时，然后收获并且准备用于NK细胞分离。然后用磁性珠粒使用负性清除(negative depletion)技术以典型地>90％的纯度从脾脏细胞分离NK细胞(CD3-NK1.1+)。将纯化的NK细胞在含有100ng/mL mIL-15的培养基中培养48小时，然后将它们转移至微板中吸附NKG2D结合结构域的孔中，并且在含有荧光团缀合的抗CD107a抗体、布雷菲德菌素-A以及莫能菌素的培养基中培养。在NKG2D结合结构域包覆的孔中培养之后，使用荧光团缀合的针对CD3、NK1.1以及IFN-γ的抗体通过流式细胞术测定NK细胞。在CD3-NK1.1+细胞中分析CD107a和IFN-γ染色以评估NK细胞活化。CD107a/IFN-γ双阳性细胞增加指示通过接合两个活化受体而非一个受体得到更佳的NK细胞活化。与同型对照相比，NKG2D结合结构域和阳性对照(选自在eBioscience可获得的抗小鼠NKG2D克隆MI-6和CX-5)显示更高百分比的NK细胞变为CD107a+和IFN-γ+(图15和图16呈现两个独立实验的数据，这两个独立实验各自使用不同的小鼠进行NK细胞制备)。
实施例5-NKG2D结合结构域实现靶肿瘤细胞的细胞毒性
人和小鼠原代NK细胞活化分析证实在与NKG2D结合结构域一起孵育之后NK细胞上的细胞毒性标记物增加。为说明这是否转化成增加的肿瘤细胞溶解，使用基于细胞的分析，其中每个NKG2D结合结构域发展为单特异性抗体。使用Fc区作为一个靶向臂，而Fab区(NKG2D结合结构域)充当另一靶向臂来活化NK细胞。将来源于人并且表达高水平的Fc受体的THP-1细胞用作肿瘤靶标并且使用珀金埃尔默(Perkin Elmer)DELFIA细胞毒性试剂盒。将THP-1细胞用BATDA试剂标记，并且以105个/mL再悬浮于培养基中。然后在37℃下将标记的THP-1细胞与NKG2D抗体和分离的小鼠NK细胞组合在微量滴定板的孔中持续3小时。在孵育之后，移出20μL的培养物上清液，与200μL的铕溶液混合并且在黑暗中在振荡下孵育15分钟。通过配备有时间分辨荧光模块的PheraStar读板仪(激发337nm，发射620nm)随时间推移测量荧光并且根据试剂盒说明书计算特异性溶解。
阳性对照ULBP-6(NKG2D的天然配体)显示小鼠NK细胞对THP-1靶细胞的特异性溶解增加。NKG2D抗体也使THP-1靶细胞的特异性溶解增加，而同型对照抗体显示使特异性溶解减少。虚线指示在不添加抗体的情况下小鼠NK细胞对THP-1细胞的特异性溶解(图17)。
实施例6-NKG2D抗体显示高热稳定性
使用差示扫描荧光测定法测定NKG2D结合结构域的熔解温度。相对于典型IgG1抗体，外推表观熔解温度为高的(图18)。
实施例7-通过使NKG2D与CD16交联对人NK细胞的协同活化
原代人NK细胞活化分析
使用密度梯度离心从外周人血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。使用负性磁性珠粒(StemCell#17955)从PBMC纯化NK细胞。如通过流式细胞术所测定NK细胞为>90％CD3-CD56+。然后在用于活化分析之前将细胞在含有100ng/mL hIL-2(Peprotech#200-02)的培养基中扩增48小时。将抗体在4℃下以2μg/mL(抗CD16，Biolegend#302013)和5μg/mL(抗NKG2D，R&D#MAB139)的浓度在100μL无菌PBS中包覆至96孔平底板上过夜，随后将孔充分洗涤以移除过量抗体。对于去颗粒作用的评估，将IL-2活化的NK细胞以5×105个细胞/mL再悬浮于补充有100ng/mL人IL-2(hIL2)和1μg/mL APC缀合的抗CD107a mAb(Biolegend#328619)的培养基中。然后将1×105个细胞/孔添加至抗体包覆的板上。分别以1:1000和1:270的最终稀释度添加蛋白质转运抑制剂布雷菲德菌素A(BFA，Biolegend#420601)和莫能菌素(Biolegend#420701)。将涂铺的细胞在37℃下在5％CO2中孵育4小时。对于IFN-γ的细胞内染色，将NK细胞用抗CD3(Biolegend#300452)和抗CD56 mAb(Biolegend#318328)标记，并且随后固定，透性化以及用抗IFN-γmAb(Biolegend#506507)标记。在对活CD56+CD3-细胞进行门控之后通过流式细胞术针对CD107a和IFN-γ的表达对NK细胞进行分析。
为研究受体组合的相对功效，通过板结合刺激进行NKG2D或CD16的交联以及两种受体的共交联。如图19(图19A至图19C)中所示，CD16与NKG2D的组合刺激使得CD107a(去颗粒作用)(图19A)和/或IFN-γ产生(图19B)的水平大大升高。虚线表示每种受体的个别刺激的相加作用。
在使用抗CD16、抗NKG2D或两种单克隆抗体的组合进行4小时板结合刺激之后对IL-2活化的NK细胞的CD107a水平和细胞内IFN-γ产量进行分析。图中指示平均值(n＝2)±SD。图19A展示CD107a的水平；图19B展示IFN-γ的水平；图19C展示CD107a和IFN-γ的水平。图19A至图19C中所示的数据代表使用五个不同健康供体的五个独立实验。
实施例8-TriNKET与细胞表达的人NKG2D的结合的评估
将EL4小鼠淋巴瘤细胞系工程化以表达人NKG2D。针对结合于EL4细胞上所表达的细胞外NKG2D的亲和力对多特异性结合蛋白(例如三特异性结合蛋白(TriNKET))进行测试，所述多特异性结合蛋白中的每一者含有NKG2D结合结构域、FLT3结合结构域以及结合于CD16的Fc结构域。将TriNKET稀释至20μg/mL，然后连续稀释。使用荧光团缀合的抗人IgG二级抗体检测TriNKET与NKG2D的结合。然后通过流式细胞术对细胞进行分析并且针对二级抗体对照对平均荧光强度(MFI)进行归一化以获得相较于背景的倍数(FOB)值。
所测试的TriNKET为A44-TriNKET-FLT3-IMCEB10(来自克隆ADI-27744的NKG2D结合结构域；以及衍生自FLT3单克隆抗体IMCEB10的FLT3结合结构域，例如通过合并SEQ IDNO:109的重链可变区和SEQ ID NO:113的轻链可变区)、A44-TriNKET-FLT3-4G8(来自克隆ADI-27744的NKG2D结合结构域；以及衍生自单克隆抗体4G8的FLT3结合结构域，例如通过合并SEQ ID NO:117的重链可变区和SEQ ID NO:121的轻链可变区)、A49-TriNKET-FLT3-IMCEB10(来自克隆ADI-27749的NKG2D结合结构域以及衍生自FLT3单克隆抗体IMCEB10的FLT3结合结构域，例如通过合并SEQ ID NO:109的重链可变区和SEQ ID NO:113的轻链可变区)、A49-TriNKET-FLT3-4G8(来自克隆ADI-27749的NKG2D结合结构域以及衍生自单克隆抗体4G8的FLT3结合结构域，例如通过合并SEQ ID NO:117的重链可变区和SEQ ID NO:121的轻链可变区)、C26-TriNKET-FLT3-4G8(来自克隆ADI-28226的NKG2D结合结构域；以及衍生自单克隆抗体4G8的FLT3结合结构域，例如通过合并SEQ ID NO:117的重链可变区和SEQ IDNO:121的轻链可变区)。使用FLT3单克隆抗体IMCEB10作为对照。含有NKG2D结合结构域(A44、A49或C26)的TriNKET显示结合于细胞表面表达的NKG2D。含有相同NKG2D结合结构域但FLT3结合结构域不同的TriNKET显示对细胞表面的NKG2D的类似结合亲和力(图35)。
实施例9-TriNKET与癌细胞上表达的FLT3的结合的评估
使用表达FLT3的人AML细胞系(Molm-13和EOL-1)来测定靶向FLT3的TriNKET与肿瘤相关抗原的结合。将TriNKET与细胞一起孵育，并且使用荧光团缀合的抗人IgG二级抗体检测结合。通过流式细胞术对细胞进行分析并且针对二级抗体对照对平均荧光强度(MFI)进行归一化以获得相较于背景的倍数(FOB)值。
含有IMCEB10或4G8的FLT3结合结构域的靶向FLT3的TriNKET显示与Molm-13和EOL-1细胞的阳性结合(图36A和图36B)。含有IMCEB10或4G8的FLT-3结合结构域的TriNKET与人AML细胞系的结合与NKG2D结合结构域无关。含有4G8的FLT3结合结构域的TriNKET显示更高的最大结合以及EC50值。
实施例10-靶向FLT3的TriNKET在表达FLT3的细胞上的内化
使用人AML细胞系Molm-13和EOL-1来评估在结合于细胞表面表达的FLT3之后靶向FLT3的TriNKET的内化。将TriNKET或单克隆抗体林妥珠单抗稀释至20μg/mL，并且用于对细胞进行染色。在染色之后，将三分之二的样品在37℃下放置过夜以促进内化，并且使用荧光团缀合的抗人IgG二级抗体检测另外三分之一的样品，从而得到基线MFI。在37℃下2小时和20小时的孵育之后，将样品从孵育器中移出，并且使用荧光团缀合的抗人IgG二级抗体检测细胞表面所结合的抗体，从而得到样品MFI。计算内化：内化百分比＝(1-(样品MFI/基线MFI))*100％。
图37A和图37B显示在分别与EOL-1和Molm-13细胞一起孵育之后靶向FLT3的TriNKET的内化。使用抗CD33单克隆抗体林妥珠单抗作为内化的阳性对照，因为CD33在Molm-13与EOL-1细胞系上表达。林妥珠单抗在两种细胞系上均显示高水平的内化，并且内化随时间推移而增加。与含有4G8的FLT3结合结构域的TriNKET相比，含有IMCEB10的FLT3结合结构域的TriNKET在2小时的孵育之后显示更高水平的内化。在20小时的孵育之后，含有4G8的FLT3结合结构域的TriNKET和含有IMCEB10的FLT3结合结构域的TriNKET在细胞上显示类似水平的内化。
实施例11-TriNKET增强人NK细胞对癌细胞的细胞毒性
为测试在存在靶向FLT3的TriNKET的情况下人NK细胞溶解表达FLT3的癌细胞的能力，将外周血单核细胞(PBMC)分离并且准备用于NK细胞分离。使用密度梯度离心从人外周血血沉棕黄层分离PBMC。将分离的PBMC洗涤并且准备用于NK细胞分离。用磁性珠粒使用负性选择技术分离NK细胞，并且所分离的NK细胞的纯度典型地>90％CD3-CD56+。将分离的NK细胞在含有100ng/mL IL-2的培养基中培养或在没有细胞因子的情况下静置过夜。第二天在细胞毒性分析中使用IL-2活化或静置的NK细胞。
如下准备所有细胞毒性分析：从培养物收获FLT3阳性肿瘤细胞EOL-1，用PBS洗涤，并且以106个/mL再悬浮于生长培养基中以便用BATDA试剂(Perkin Elmer C136-100)标记。遵循制造商的说明书对靶细胞进行标记。在标记之后，将细胞用HBS洗涤3次并且以0.5-1.0x105个/mL再悬浮于培养基中。为准备背景孔，将所标记细胞的等分试样放在一旁，并且将细胞从培养基中离心出来。将100μL的培养基小心地一式三份添加至孔中以避免扰乱集结成粒的细胞。将100μL的BATDA标记的细胞添加至96孔板的每个孔中。将孔保存用于从靶细胞的自发释放，并且通过添加1％氚核-X将孔准备用于靶细胞的最大溶解。将FLT3单克隆抗体或靶向FLT3的TriNKET在培养基中稀释并且将50μL的稀释的单克隆抗体或TriNKET添加至每个孔中。从培养物收获静置和/或活化的NK细胞，洗涤，并且根据所需效应细胞与靶细胞比率以105-2.0x106个/mL再悬浮于培养基中。将50μL的NK细胞添加至板的每个孔中以形成总共200μL培养体积。将板在37℃与5％CO2下孵育2-3小时，然后开展分析。
在培养2-3小时之后，将板从孵育器中移出并且通过在200g下离心5分钟使细胞集结成粒。将20μL的培养物上清液转移至由制造商提供的清洁微板，并且将200μL的室温铕溶液添加至每个孔中。保护板不受光影响并且在250rpm下在板振荡器上孵育15分钟。使用Victor 3或SpectraMax i3X仪器读取板。如下计算特异性溶解百分比：特异性溶解百分比＝((实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放))*100％。
靶向FLT3的TriNKET介导人NK细胞对FLT3阳性EOL-1癌细胞的细胞毒性。如图38A中所示，两种TriNKET(A49-TriNKET-IMCEB10和A44-TriNKET-IMCEB10)能够以剂量响应性方式增强NK细胞对癌细胞的细胞毒性活性。与对应FLT3单克隆抗体IMCEB10相比，两种TriNKET显著更有效。如图38B中所示，TriNKET(A49-TriNKET-4G8、A44-TriNKET-4G8以及C26-TriNKET-4G8)能够以剂量响应性方式增强NK细胞对癌细胞的细胞毒性活性。与对应FLT3单克隆抗体4G8相比，TriNKET显著更有效。此外，与含有IMCEB10的FLT3结合结构域的TriNKET相比，含有4G8的FLT3结合结构域的TriNKET在介导人NK细胞的细胞毒性中更有效。
以引用的方式并入
本文所参考的专利文件和科学论文各自的全部公开内容出于所有目的以引用的方式并入本文中。
等同物
本发明可在不背离它的精神或基本特征的情况下体现为其他特定形式。因此，前述实施方案应被视为在所有方面为说明性的，而不是限制本文所描述的发明。因此，本发明的范围由随附权利要求书而不是由前述说明书指示，并且在权利要求书等同性的意义和范围内的所有变化均旨在涵盖于其中。
序列表
<110> 蜻蜓治疗公司(DRAGONFLY THERAPEUTICS, INC.)
<120> 结合NKG2D、CD16以及FLT3的蛋白质
<130> DFY-027WO
<140>
<141>
<150> 62/539,421
<151> 2017-07-31
<160> 139
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Tyr Tyr Thr
85 90 95
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100 105
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115
<210> 10
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
<210> 11
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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100 105 110
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115
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 12
Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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100 105
<210> 15
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
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115
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
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Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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65 70 75 80
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100 105
<210> 19
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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100 105 110
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115
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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100 105
<210> 25
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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100 105
<210> 27
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
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85 90 95
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Ser Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ser Tyr Ser Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Phe Ile Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Leu Tyr Ser Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Phe Ile Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 42
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 43
Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 44
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 45
Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 46
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 47
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 48
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr
1 5
<210> 49
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 49
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 50
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 51
Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 52
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 52
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 53
Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 54
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 55
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 56
Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 57
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 57
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Glu Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 60
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 61
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 62
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 63
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 64
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 65
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 65
Ala Arg Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 66
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 67
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 68
Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Phe Thr
1 5
<210> 69
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 70
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 70
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 71
Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 72
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 73
Ala Arg Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 74
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 75
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 76
Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 77
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 79
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 80
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 81
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 81
Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 82
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 83
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 84
Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 85
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 87
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 88
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 89
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 89
Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 90
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 91
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 92
Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 93
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 94
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 94
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 95
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 96
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 97
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 97
Ala Arg Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 98
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 99
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 100
Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Phe Thr
1 5
<210> 101
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 101
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 102
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 102
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 103
<211> 115
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 103
Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Asn Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 104
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 104
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 105
Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 106
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 106
Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 107
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 107
Ala Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 108
<211> 246
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 108
Met Ala Ala Ala Ala Ile Pro Ala Leu Leu Leu Cys Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Phe Leu Leu Phe Gly Trp Ser Arg Ala Arg Arg Asp Asp Pro His Ser
20 25 30
Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg Pro Gly Pro Arg
35 40 45
Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr Phe Leu His Tyr
50 55 60
Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro Leu Gly Lys Lys
65 70 75 80
Leu Asn Val Thr Met Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro Val Leu Arg Glu
85 90 95
Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Leu Asp Ile Gln Leu Glu Asn
100 105 110
Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg Met Ser Cys Glu
115 120 125
Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln Phe Ser Ile Asp
130 135 140
Gly Gln Thr Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg Met Trp Thr Thr
145 150 155 160
Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp Glu Asn Asp Lys
165 170 175
Asp Val Ala Met Ser Phe His Tyr Ile Ser Met Gly Asp Cys Ile Gly
180 185 190
Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr Leu Glu Pro Ser
195 200 205
Ala Gly Ala Pro Leu Ala Met Ser Ser Gly Thr Thr Gln Leu Arg Ala
210 215 220
Thr Ala Thr Thr Leu Ile Leu Cys Cys Leu Leu Ile Ile Leu Pro Cys
225 230 235 240
Phe Ile Leu Pro Gly Ile
245
<210> 109
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Gly Ala His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 110
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 111
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 111
Asn Pro Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 112
Gly Val Gly Ala His Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 113
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 113
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Pro Ala Ile Ser Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 114
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 114
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Asp
1 5 10
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 115
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 116
Met Gln Gly Thr His Pro Ala Ile Ser
1 5
<210> 117
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 117
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 118
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 118
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 119
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 119
Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 120
Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe
1 5
<210> 121
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 121
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 122
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 122
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 123
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 124
Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 125
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 125
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Lys Gly Gly Ile Tyr Tyr Ala Asn His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 126
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 126
Asn Tyr Gly Leu His
1 5
<210> 127
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 127
Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser
1 5 10 15
<210> 128
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 128
Lys Gly Gly Ile Tyr Tyr Ala Asn His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 129
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 129
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Met Ala Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp
85 90 95
His Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg
<210> 130
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 130
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Met
1 5 10 15
Ala
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 131
Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 132
Gln Asn Asp His Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 133
<211> 993
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 133
Met Pro Ala Leu Ala Arg Asp Gly Gly Gln Leu Pro Leu Leu Val Val
1 5 10 15
Phe Ser Ala Met Ile Phe Gly Thr Ile Thr Asn Gln Asp Leu Pro Val
20 25 30
Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn Asn Asp Ser Ser Val Gly
35 40 45
Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu Ser Pro Glu Asp Leu Gly
50 55 60
Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr Val Tyr Glu Ala Ala Ala
65 70 75 80
Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr Leu Gln Val Leu Val Asp
85 90 95
Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val Phe Lys His Ser Ser Leu
100 105 110
Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn Arg Gly Val Val Ser Met
115 120 125
Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala Gly Glu Tyr Leu Leu Phe
130 135 140
Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Leu Phe Thr Val Ser Ile
145 150 155 160
Arg Asn Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Arg Arg Pro Tyr Phe Arg Lys Met
165 170 175
Glu Asn Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser Glu Ser Val Pro Glu Pro
180 185 190
Ile Val Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln Gly Glu Ser Cys Lys Glu
195 200 205
Glu Ser Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu Lys Val Leu His Glu Leu
210 215 220
Phe Gly Thr Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg Asn Glu Leu Gly Arg Glu
225 230 235 240
Cys Thr Arg Leu Phe Thr Ile Asp Leu Asn Gln Thr Pro Gln Thr Thr
245 250 255
Leu Pro Gln Leu Phe Leu Lys Val Gly Glu Pro Leu Trp Ile Arg Cys
260 265 270
Lys Ala Val His Val Asn His Gly Phe Gly Leu Thr Trp Glu Leu Glu
275 280 285
Asn Lys Ala Leu Glu Glu Gly Asn Tyr Phe Glu Met Ser Thr Tyr Ser
290 295 300
Thr Asn Arg Thr Met Ile Arg Ile Leu Phe Ala Phe Val Ser Ser Val
305 310 315 320
Ala Arg Asn Asp Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys Ser Ser Ser Lys His Pro
325 330 335
Ser Gln Ser Ala Leu Val Thr Ile Val Glu Lys Gly Phe Ile Asn Ala
340 345 350
Thr Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Glu Ile Asp Gln Tyr Glu Glu Phe Cys
355 360 365
Phe Ser Val Arg Phe Lys Ala Tyr Pro Gln Ile Arg Cys Thr Trp Thr
370 375 380
Phe Ser Arg Lys Ser Phe Pro Cys Glu Gln Lys Gly Leu Asp Asn Gly
385 390 395 400
Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Cys Asn His Lys His Gln Pro Gly Glu Tyr
405 410 415
Ile Phe His Ala Glu Asn Asp Asp Ala Gln Phe Thr Lys Met Phe Thr
420 425 430
Leu Asn Ile Arg Arg Lys Pro Gln Val Leu Ala Glu Ala Ser Ala Ser
435 440 445
Gln Ala Ser Cys Phe Ser Asp Gly Tyr Pro Leu Pro Ser Trp Thr Trp
450 455 460
Lys Lys Cys Ser Asp Lys Ser Pro Asn Cys Thr Glu Glu Ile Thr Glu
465 470 475 480
Gly Val Trp Asn Arg Lys Ala Asn Arg Lys Val Phe Gly Gln Trp Val
485 490 495
Ser Ser Ser Thr Leu Asn Met Ser Glu Ala Ile Lys Gly Phe Leu Val
500 505 510
Lys Cys Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Thr Ser Cys Glu Thr Ile Leu
515 520 525
Leu Asn Ser Pro Gly Pro Phe Pro Phe Ile Gln Asp Asn Ile Ser Phe
530 535 540
Tyr Ala Thr Ile Gly Val Cys Leu Leu Phe Ile Val Val Leu Thr Leu
545 550 555 560
Leu Ile Cys His Lys Tyr Lys Lys Gln Phe Arg Tyr Glu Ser Gln Leu
565 570 575
Gln Met Val Gln Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Glu Tyr Phe Tyr Val
580 585 590
Asp Phe Arg Glu Tyr Glu Tyr Asp Leu Lys Trp Glu Phe Pro Arg Glu
595 600 605
Asn Leu Glu Phe Gly Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val
610 615 620
Met Asn Ala Thr Ala Tyr Gly Ile Ser Lys Thr Gly Val Ser Ile Gln
625 630 635 640
Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Lys Ala Asp Ser Ser Glu Arg Glu
645 650 655
Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Met Met Thr Gln Leu Gly Ser His Glu
660 665 670
Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Leu Ser Gly Pro Ile Tyr
675 680 685
Leu Ile Phe Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Tyr Leu Arg
690 695 700
Ser Lys Arg Glu Lys Phe His Arg Thr Trp Thr Glu Ile Phe Lys Glu
705 710 715 720
His Asn Phe Ser Phe Tyr Pro Thr Phe Gln Ser His Pro Asn Ser Ser
725 730 735
Met Pro Gly Ser Arg Glu Val Gln Ile His Pro Asp Ser Asp Gln Ile
740 745 750
Ser Gly Leu His Gly Asn Ser Phe His Ser Glu Asp Glu Ile Glu Tyr
755 760 765
Glu Asn Gln Lys Arg Leu Glu Glu Glu Glu Asp Leu Asn Val Leu Thr
770 775 780
Phe Glu Asp Leu Leu Cys Phe Ala Tyr Gln Val Ala Lys Gly Met Glu
785 790 795 800
Phe Leu Glu Phe Lys Ser Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn
805 810 815
Val Leu Val Thr His Gly Lys Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu
820 825 830
Ala Arg Asp Ile Met Ser Asp Ser Asn Tyr Val Val Arg Gly Asn Ala
835 840 845
Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Phe Glu Gly Ile
850 855 860
Tyr Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu
865 870 875 880
Ile Phe Ser Leu Gly Val Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Val Asp Ala
885 890 895
Asn Phe Tyr Lys Leu Ile Gln Asn Gly Phe Lys Met Asp Gln Pro Phe
900 905 910
Tyr Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Ile Ile Met Gln Ser Cys Trp Ala Phe
915 920 925
Asp Ser Arg Lys Arg Pro Ser Phe Pro Asn Leu Thr Ser Phe Leu Gly
930 935 940
Cys Gln Leu Ala Asp Ala Glu Glu Ala Met Tyr Gln Asn Val Asp Gly
945 950 955 960
Arg Val Ser Glu Cys Pro His Thr Tyr Gln Asn Arg Arg Pro Phe Ser
965 970 975
Arg Glu Met Asp Leu Gly Leu Leu Ser Pro Gln Ala Gln Val Glu Asp
980 985 990
Ser
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 134
Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 135
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 135
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 136
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 136
Ala Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 137
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 137
Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 138
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 139
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5

Claims (38)

1.一种蛋白质，所述蛋白质包含：
(a)第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点结合NKG2D；
(b)第二抗原结合位点，所述第二抗原结合位点结合FLT3；以及
(c)抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分，或结合CD16的第三抗原结合位点。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点结合于人中的NKG2D。
3.如权利要求1或2所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含重链可变域和轻链可变域。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其中所述重链可变域和所述轻链可变域存在于相同多肽上。
5.根据权利要求3或4所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点包含重链可变域和轻链可变域。
6.根据权利要求5所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点的所述重链可变域和所述轻链可变域存在于相同多肽上。
7.根据权利要求5或6所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点的所述轻链可变域具有与所述第二抗原结合位点的所述轻链可变域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求中任一项的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与选自以下的氨基酸序列至少90％同一的重链可变域：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:85以及SEQ ID NO:93。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO:41至少90％同一的重链可变域以及与SEQ ID NO:42至少90％同一的轻链可变域。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO:49至少90％同一的重链可变域以及与SEQ ID NO:50至少90％同一的轻链可变域。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO:57至少90％同一的重链可变域以及与SEQ ID NO:58至少90％同一的轻链可变域。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO:59至少90％同一的重链可变域以及与SEQ ID NO:60至少90％同一的轻链可变域。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO:61至少90％同一的重链可变域以及与SEQ ID NO:62至少90％同一的轻链可变域。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO:69至少90％同一的重链可变域以及与SEQ ID NO:70至少90％同一的轻链可变域。
15.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO:77至少90％同一的重链可变域以及与SEQ ID NO:78至少90％同一的轻链可变域。
16.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO:85至少90％同一的重链可变域以及与SEQ ID NO:86至少90％同一的轻链可变域。
17.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO:93至少90％同一的重链可变域以及与SEQ ID NO:94至少90％同一的轻链可变域。
18.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO:101至少90％同一的重链可变域以及与SEQ ID NO:102至少90％同一的轻链可变域。
19.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO:103至少90％同一的重链可变域以及与SEQ ID NO:104至少90％同一的轻链可变域。
20.如权利要求1或2所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点为单域抗体。
21.如权利要求20所述的蛋白质，其中所述单域抗体为VHH片段或VNAR片段。
22.根据权利要求1-2或20-21中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点包含重链可变域和轻链可变域。
23.根据权利要求22所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点的所述重链可变域和所述轻链可变域存在于相同多肽上。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合FLT3，所述第二抗原结合位点的所述重链可变域包含与SEQ ID NO:109至少90％同一的氨基酸序列并且所述第二抗原结合位点的所述轻链可变域包含与SEQ ID NO:113至少90％同一的氨基酸序列。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合FLT3，所述第二抗原结合位点的所述重链可变域包含与SEQ ID NO:117至少90％同一的氨基酸序列并且所述第二抗原结合位点的所述轻链可变域包含与SEQ ID NO:121至少90％同一的氨基酸序列。
26.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合FLT3，所述第二抗原结合位点的所述重链可变域包含与SEQ ID NO:125至少90％同一的氨基酸序列并且所述第二抗原结合位点的所述轻链可变域包含与SEQ ID NO:129至少90％同一的氨基酸序列。
27.根据权利要求1-4或8-21中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点为单域抗体。
28.如权利要求27所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点为VHH片段或VNAR片段。
29.根据前述权利要求中任一项的蛋白质，其中所述蛋白质包含抗体Fc结构域中足以结合CD16的部分，其中所述抗体Fc结构域包含铰链和CH2结构域。
30.根据权利要求29所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域包含人IgG1抗体的铰链和CH2结构域。
31.根据权利要求29或30所述的蛋白质，其中所述Fc结构域包含与人IgG1抗体的氨基酸234-332至少90％同一的氨基酸序列。
32.根据权利要求31所述的蛋白质，其中所述Fc结构域包含与人IgG1的Fc结构域至少90％同一的氨基酸序列并且在选自由以下组成的组的一个或多个位置有所不同：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、K439。
33.一种制剂，所述制剂包含根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质和药学上可接受的载体。
34.一种细胞，所述细胞包含表达根据权利要求1-32中任一项所述的蛋白质的一种或多种核酸。
35.一种增强肿瘤细胞死亡的方法，所述方法包括使肿瘤细胞和自然杀手细胞暴露于有效量的根据权利要求1-32中任一项所述的蛋白质，其中所述肿瘤细胞表达FLT3。
36.一种治疗癌症的方法，其中所述方法包括向患者施用有效量的根据权利要求1-32中任一项所述的蛋白质或根据权利要求33所述的制剂。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述癌症为白血病。
38.根据权利要求37所述的治疗癌症的方法，其中所述白血病选自由以下组成的组：急性骨髓性白血病、T细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病以及毛细胞白血病。
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