KR20220083770A - Nkg2d, cd16 및 flt3에 결합하는 단백질 - Google Patents

Nkg2d, cd16 및 flt3에 결합하는 단백질 Download PDF

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Abstract

NKG2D 수용체, CD16 및 FLT3에 결합하는 다중-특이적 결합 단백질, 뿐만 아니라 자가면역 질환 또는 암의 치료에 유용한 제약 조성물 및 치료 방법이 기재되어 있다.

Description

NKG2D, CD16 및 FLT3에 결합하는 단백질
본 출원은 2019년 10월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 62/915,123을 우선권 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 텍스트 포맷의 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF) 전체를 참조로 포함한다. 서열 목록 텍스트 파일은 명칭 "14247-474-888_SEQ_LISTING"이고, 2020년 10월 5일에 생성되었으며, 317,572 바이트 크기이다.
기술분야
본 발명은 NKG2D, CD16, 및 FLT3에 결합하는 다중-특이적 결합 단백질에 관한 것이다.
암의 치료를 위해 문헌에 보고된 실질적인 연구 노력 및 과학적 진보에도 불구하고 이 질환은 계속해서 상당한 건강 문제이다. 다발성 골수종, 백혈병 및 림프종을 비롯하여 혈액암 및 골수암은 흔히 진단되는 암 유형이다. 이들 암에 대한 현행 치료 옵션은 모든 환자에 대해 효과적인 것은 아니고/거나 실질적인 부작용을 가질 수 있다. 다른 유형의 암 또한 기존 치료 옵션을 사용하여 치료하는 것이 도전과제로 남아있다.
암 면역요법은 고도로 특이적이고 환자 자신의 면역계를 사용하여 암 세포의 파괴를 용이하게 할 수 있기 때문에 바람직하다. 융합 단백질, 예컨대 이중-특이적 T-세포 연관체는 종양 세포 및 T-세포에 결합하여 종양 세포의 파괴를 용이하게 하는, 문헌에 기재된 암 면역요법이다. 특정 종양-연관 항원 및 특정 면역 세포에 결합하는 항체는 문헌에 기재되었다. 예를 들어, WO 2016/134371 및 WO 2015/095412를 참조한다.
자연 킬러 (NK) 세포는 선천성 면역계의 성분이고, 순환 림프구의 대략 15%를 구성한다. NK 세포는 사실상 모든 조직에 침윤하고, 선행 감작화에 대한 필요없이 효과적으로 종양 세포를 사멸시키는 능력을 원래 특징으로 갖고 있다. 활성화된 NK 세포는 세포독성 T 세포와 유사한 수단에 의해 - 즉, 퍼포린 및 그랜자임을 함유하는 세포용해 과립을 통해서, 뿐만 아니라 사멸 수용체 경로를 통해서 표적 세포를 사멸시킨다. 활성화된 NK 세포는 또한 표적 조직으로의 다른 백혈구의 동원을 촉진하는 염증성 시토카인, 예컨대 IFN-γ 및 케모카인을 분비한다.
NK 세포는 그의 표면 상의 다양한 활성화 수용체 및 억제 수용체를 통해 신호에 반응한다. 예를 들어, NK 세포가 건강한 자기-세포와 직면할 때, 그의 활성은 킬러-세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR)의 활성화를 통해 억제된다. 대안적으로, NK 세포가 외래 세포 또는 암 세포와 직면할 때, 이들은 그의 활성화 수용체 (예를 들어, NKG2D, NCR, DNAM1)를 통해 활성화된다. NK 세포는 또한 그의 표면 상의 CD16 수용체를 통해 일부 이뮤노글로불린의 불변 영역에 의해 활성화된다. 활성화에 대한 NK 세포의 전체 감수성은 자극 신호와 억제 신호의 합에 좌우된다. NKG2D는 NKG2D가 활성화 수용체로서 작용하는 본질적으로 모든 자연 킬러 세포에 의해 발현되는 유형-II 막횡단 단백질이다. NKG2D는 또한 공동자극 수용체로서 작용하는 T 세포 상에서 발견된다. NKG2D를 통해 NK 세포 기능을 조정하는 능력은 악성종양을 비롯한 다양한 치료 상황에서 유용하다.
FLK2, STK1 또는 CD135로 또한 불리는 Fms 관련 티로신 키나제3 (FLT3)은 클래스 III 수용체 티로신 키나제이다. FLT3은 세포외 영역에 다중 이뮤노글로불린-유사 도메인을 포함하는 막횡단 단백질이다. FLT3은 FLT3 동종이량체화 및 자가인산화를 유도하는 FLT3LG의 결합에 의해 활성화될 수 있다. 활성화된 FLT3은 후속적으로 다중 세포질 이펙터 분자, 예컨대 Akt, Erk 및 mTOR을 인산화 및 활성화시켜, 세포 증식을 촉진하고 아폽토시스를 감소시킨다. FLT3의 구성적 활성화를 유발하는 돌연변이가 급성 골수성 백혈병 및 급성 림프모구성 백혈병에서 관찰되었다.
본 발명은 자연 킬러 세포 상의 NKG2D 수용체 및 CD16 수용체, 및 종양-연관 항원 FLT3에 결합하는 다중-특이적 결합 단백질을 제공한다. 이러한 단백질은 1종 초과의 종류의 NK 활성화 수용체에 결속할 수 있고, 천연 리간드의 NKG2D에 대한 결합을 차단할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 단백질은 인간에서 NK 세포를 효능화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 단백질은 인간에서 및 다른 종, 예컨대 설치류 및 시노몰구스 원숭이에서 NK 세포를 효능화시킬 수 있다. 본원에 기재된 단백질 중 어느 하나를 함유하는 제제; 상기 단백질을 발현하는 하나 이상의 핵산을 함유하는 세포, 및 상기 단백질을 사용하여 종양 세포 사멸을 증진시키는 방법이 제공된다.
따라서, 본 발명의 한 측면은
(a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
(b) FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
(c) CD16에 결합하기에 충분한 항체 Fc 도메인 또는 그의 부분, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
를 포함하는 단백질을 제공하며,
여기서 FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 하기를 포함한다:
(i) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 55의 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 1 (CDR1), 상보성-결정 영역 2(CDR2) 및 상보성-결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH); 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL);
(ii) 각각 서열식별번호: 59, 63 및 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 86, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
(iii) 각각 서열식별번호: 87, 88 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 91, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
(iv) 각각 서열식별번호: 97, 99 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 101, 102 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
(v) 각각 서열식별번호: 87, 98 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 106, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
(vi) 각각 서열식별번호: 109, 110 및 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 112, 113 및 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
(vii) 각각 서열식별번호: 117, 118 및 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 120, 121 및 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
(viii) 각각 서열식별번호: 87, 98 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 106, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
(ix) 각각 서열식별번호: 62, 33 및 127의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 128, 129 및 130의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL; 또는
(x) 각각 서열식별번호: 132, 133 및 134의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 65, 66 및 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL.
특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열식별번호: 37과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열식별번호: 38과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH 및 VL은 각각 서열식별번호: 9 및 10; 13 및 10; 17 및 10; 9 및 22; 9 및 26; 9 및 30; 9 및 34; 37 및 38; 41 및 42; 45 및 42; 또는 49 및 42의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 단일쇄 가변 단편 (scFv)으로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 3, 12, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 31, 32, 35, 36, 39, 40, 43, 44, 47, 48, 51 및 52로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 59, 63 및 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 86, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 78, 63, 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 80, 66, 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 62, 63, 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 65, 66, 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열식별번호: 76과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열식별번호: 77과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH 및 VL은 각각 서열식별번호: 68 및 69; 72 및 73; 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, scFv는 서열식별번호: 70, 71, 74, 75, 81, 및 82로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 87, 88 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 91, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 97, 99 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 101, 102 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 87, 98 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 106, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 109, 110 및 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 112, 113 및 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 117, 118 및 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 120, 121 및 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 87, 98 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 106, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 62, 33 및 127의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 128, 129 및 130의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 132, 133 및 134의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 65, 66 및 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정 시 20 nM 이하의 해리 상수 (KD)로 인간 FLT3에 결합한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 SPR에 의해 측정 시 10 nM 이하의 KD로 인간 FLT3에 결합한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 시노몰구스 FLT3에 결합한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 FLT3에의 결합에 대해 FLT3L과 경쟁하지 않는다.
특정 실시양태에서, 단백질은 CD16에 결합하기에 충분한 항체 Fc 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 Fab 단편이고, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 scFv이다. 특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 scFv이고, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 Fab 단편이다.
특정 실시양태에서, 단백질은 FLT3에 결합하는 추가의 항원-결합 부위를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 scFv이고, FLT3에 결합하는 제2 및 추가의 항원-결합 부위는 각각 Fab 단편이다. 특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 scFv이고, FLT3에 결합하는 제2 및 추가의 항원-결합 부위는 각각 scFv이다.
특정 실시양태에서, FLT3에 결합하는 scFv 및/또는 NKG2D에 결합하는 scFv는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, scFv는 Ala-Ser 또는 Gly-Ser을 포함하는 힌지를 통해 CD16에 결합하기에 충분한 항체 불변 도메인 또는 그의 부분에 연결된다. 특정 실시양태에서, 힌지는 아미노산 서열 Thr-Lys-Gly를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, scFv의 중쇄 가변 도메인은 scFv의 경쇄 가변 도메인과 디술피드 가교를 형성한다. 특정 실시양태에서, 디술피드 가교는 카바트(Kabat) 넘버링 스킴 하에 넘버링된, 중쇄 가변 도메인의 C44와 경쇄 가변 도메인의 C100 사이에 형성된다. 특정 실시양태에서, scFv의 중쇄 가변 도메인은 가요성 링커를 통해 scFv의 경쇄 가변 도메인에 연결된다. 특정 실시양태에서, 가요성 링커는 (G4S)4를 포함한다. 특정 실시양태에서, scFv 내에서 중쇄 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인의 C-말단에 위치한다. 특정 실시양태에서, scFv 내에서 중쇄 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인의 N-말단에 위치한다.
특정 실시양태에서, Fab는 항원-결합 부위와 Fc 또는 그의 부분 사이에 위치하지 않는다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242 및 270 또는 271의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 276, 236 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 하기를 포함한다:
(i) 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242 및 255 또는 256의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 276, 236 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL; 또는
(ii) 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242 및 243 또는 244의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 276, 236 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL.
특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위의 VH는 서열식별번호: 254와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제1 항원-결합 부위의 VL은 서열식별번호: 239와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위의 VH는 서열식별번호: 254의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 항원-결합 부위의 VL은 서열식별번호: 239의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 Fc 도메인은 인간 IgG1 항체 Fc 도메인이다. 특정 실시양태에서, 항체 Fc 도메인 또는 그의 부분은 서열식별번호: 136과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 Fc 도메인의 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄는 서열식별번호: 136과 비교하여, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 및 K439로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 Fc 도메인의 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄는 서열식별번호: 136과 비교하여, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D 및 K439E로부터 선택된 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 중쇄 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄는 서열식별번호: 136과 비교하여, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 및 K439로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 1개 이상의 돌연변이를 포함하고; 항체 중쇄 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄는 서열식별번호: 136과 비교하여 Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, D401, F405, Y407, K409, T411 및 K439로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 중쇄 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄는 서열식별번호: 136과 비교하여 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된, K360E 및 K409W 치환을 포함하고; 항체 중쇄 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄는 서열식별번호: 136과 비교하여 Q347R, D399V 및 F405T 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 중쇄 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄는 서열식별번호: 136과 비교하여, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 Y349C 치환을 포함하고; 항체 중쇄 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄는 서열식별번호: 136과 비교하여 S354C 치환을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포 및 자연 킬러 세포를 유효량의 본원에 개시된 단백질 또는 제약 조성물에 노출시키는 것을 포함하는, 종양 세포 사멸을 증진시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 본원에 개시된 단백질 또는 제약 조성물을 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 암은 혈액 악성종양이다. 특정 실시양태에서, 혈액 악성종양은 백혈병이다. 특정 실시양태에서, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 골수이형성증, 급성 T-림프모구성 백혈병 및 급성 전골수구성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 암은 FLT3을 발현한다.
본 발명의 다양한 측면 및 실시양태는 하기에 추가로 상세하게 기재된다.
도 1은 이종이량체 다중특이적 항체, 예를 들어 삼중특이적 결합 단백질 (TriNKET)의 대표도이다. 각각의 아암은 NKG2D-결합 도메인, 또는 FLT3에 상응하는 결합 도메인을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, NKG2D 결합 도메인 및 FLT3 결합 도메인은 공통 경쇄를 공유할 수 있다.
도 2a-2e는 다중-특이적 결합 단백질, 예를 들어 삼중특이적 결합 단백질 (TriNKET)의 5가지 예시적인 포맷을 도시한다. 도 2a에 제시된 바와 같이, NKG2D-결합 도메인 또는 FLT3 결합 도메인은 scFv 포맷을 취할 수 있다 (좌측 아암). NKG2D-표적화 scFv, FLT3-표적화 Fab 단편 및 이종이량체화된 항체 불변 영역을 함유하는 항체는 본원에서 F3-TriNKET로 지칭된다. FLT3-표적화 scFv, NKG2D-표적화 Fab 단편, 및 CD16에 결합하는 이종이량체화된 항체 불변 영역/도메인을 함유하는 항체는 본원에서 F3'-TriNKET로 지칭된다 (도 2e). 도 2b에 제시된 바와 같이, NKG2D-결합 도메인 및 FLT3-결합 도메인 둘 다 scFv 포맷을 취할 수 있다. 도 2c 내지 2d는 FLT3에 결합하는 2개의 항원-결합 부위, 및 이종이량체화된 항체 불변 영역에 융합된 NKG2D-결합 부위를 포함하는 3개의 항원-결합 부위를 갖는 항체의 예시이다. 이들 항체 포맷은 본원에서 F4-TriNKET로 지칭된다. 도 2c는 2개의 FLT3-결합 부위가 Fab 단편 포맷이고, NKG2D 결합 부위가 scFv 포맷인 것을 예시한다. 도 2d는 FLT3 결합 부위가 scFv 포맷이고, NKG2D 결합 부위가 scFv 포맷인 것을 예시한다. 도 2e는 종양-표적화 scFv, NKG2D-표적화 Fab 단편, 및 CD16에 결합하는 이종이량체화된 항체 불변 영역/도메인 ("CD 도메인")을 함유하는 삼중특이적 항체 (TriNKET)를 나타낸다. 상기 항체 포맷은 본원에서 F3'-TriNKET로 지칭된다. 특정의 예시적인 다중특이적 결합 단백질에서, 항체 불변 영역 상의 이종이량체화 돌연변이는 한 불변 도메인 상의 K360E 및 K409W; 및 반대쪽 불변 도메인 상의 Q347R, D399V 및 F405T를 포함한다 (CD 도메인에서 삼각형 락-앤-키 형상으로서 제시됨). Fab 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 사이의 굵은 막대는 디술피드 결합을 나타낸다.
도 3은 트리오맙 형태의 TriNKET의 대표도이며, 이는 IgG-유사 형상을 유지하는 삼관능성 이중특이적 항체이다. 이러한 키메라는 2종의 모 항체로부터 유래된, 각각 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄를 갖는 2종의 절반 항체로 이루어진다. 트리오맙 형태는 1/2의 래트 항체 및 1/2의 마우스 항체를 함유하는 이종이량체 구축물일 수 있다.
도 4는 KiH 공통 경쇄 형태의 TriNKET의 대표도이며, 이는 노브-인투-홀 (knobs-into-holes (KIH)) 기술을 수반한다. KiH는 표적 1 및 2에 결합하는 2개의 Fab 단편, 및 이종이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc를 함유하는 이종이량체이다. KiH 포맷의 TriNKET는 2개의 상이한 중쇄 및 두 중쇄와 쌍을 형성하는 공통 경쇄를 함유하는, 표적 1 및 표적 2에 결합하는 2개의 Fab 단편을 갖는 이종이량체 구축물일 수 있다.
도 5는 이중-가변 도메인 이뮤노글로불린 (DVD-IgTM) 형태의 TriNKET의 대표도이며, 이는 가요성 자연 발생 링커를 통해 2개의 모노클로날 항체의 표적-결합 도메인을 조합하고, 4가 IgG-유사 분자를 생성한다. DVD-IgTM은 항원 2를 표적화하는 가변 도메인이 항원 1을 표적화하는 Fab 단편의 가변 도메인의 N-말단에 융합된 동종이량체성 구축물이다. DVD-IgTM 형태는 정상 Fc를 함유한다.
도 6은 직교 Fab 단편 계면 (Ortho-Fab) 형태의 TriNKET의 대표도이며, 이는 Fc에 융합된, 표적 1 및 표적 2에 결합하는 2개의 Fab 단편을 함유하는 이종이량체 구축물이다. 경쇄 (LC)-중쇄 (HC) 쌍 형성은 직교 계면에 의해 보장된다. 이종이량체화는 Fc 내의 돌연변이에 의해 보장된다.
도 7은 2-인-1 Ig 포맷의 TriNKET의 대표도이다.
도 8은 ES 형태의 TriNKET의 대표도이며, 이는 Fc에 융합된, 표적 1 및 표적 2에 결합하는 2개의 상이한 Fab 단편을 함유하는 이종이량체 구축물이다. 이종이량체화는 Fc 내의 정전기적 스티어링 돌연변이에 의해 보장된다.
도 9는 Fab 아암 교환 형태의 TriNKET의 대표도이다: 중쇄 및 부착된 경쇄 (절반-분자)를 또 다른 분자로부터의 중쇄-경쇄 쌍과 교환함으로써 Fab 단편 아암을 교환하여 이중특이적 항체를 생성하는 항체. Fab 아암 교환 형태 (cFae)는 표적 1 및 2에 결합하는 2개의 Fab 단편 및 이종이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc를 함유하는 이종이량체이다.
도 10은 SEED 바디 형태의 TriNKET의 대표도이며, 이는 표적 1 및 2에 결합하는 2개의 Fab 단편, 및 이종이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc를 함유하는 이종이량체이다.
도 11은 LuZ-Y 형태의 TriNKET의 대표도이고, 여기서 류신 지퍼를 사용하여 2개의 상이한 HC의 이종이량체화를 유도한다. LuZ-Y 형태는 Fc에 융합된, 표적 1 및 2에 결합하는 2개의 상이한 scFab를 함유하는 이종이량체이다. 이종이량체화는 Fc의 C-말단에 융합된 류신 지퍼 모티프를 통해 보장된다.
도 12는 Cov-X-바디 형태의 TriNKET의 대표도이다.
도 13a-13b는 κλ-바디 형태의 TriNKET의 대표도이며, 이는 이종이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc에 융합된 2개의 상이한 Fab 단편을 갖는 이종이량체 구축물이다: 항원 1을 표적화하는 1개의 Fab 단편은 카파 LC를 함유하고, 항원 2를 표적화하는 제2 Fab 단편은 람다 LC를 함유한다. 도 13a는 κλ-바디의 한 형태의 예시적인 대표도이고; 도 13b는 또 다른 κλ-바디의 예시적인 대표도이다.
도 14는 둘 다 Fc 도메인에 융합된, 표적 1에 결합하는 Fab 단편 및 표적 2에 결합하는 scFab를 포함하는 Oasc-Fab 이종이량체 구축물이다. 이종이량체화는 Fc 도메인 내의 돌연변이에 의해 보장된다.
도 15는 항원 1 및 2에 결합하는 2개의 상이한 Fab 단편, 및 이종이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc를 함유하는 이종이량체 구축물인 듀엣맙이다. Fab 단편 1 및 2는 정확한 경쇄 및 중쇄 쌍 형성을 보장하는 차등 S-S 가교를 함유한다.
도 16은 표적 1 및 2에 결합하는 2개의 상이한 Fab 단편, 및 이종이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc를 갖는 이종이량체 구축물인 크로스맙이다. CL 및 CH1 도메인 및 VH 및 VL 도메인은 스위칭되며, 예를 들어 CH1은 VL과 인-라인으로 융합되는 반면 CL은 VH와 인-라인으로 융합된다.
도 17은 항원 2에 결합하는 Fab 단편이 항원 1에 결합하는 Fab 단편의 HC의 N-말단에 융합되는 동종이량체성 구축물인 Fit-Ig이다. 상기 구축물은 야생형 Fc를 함유한다.
도 18은 hFLT3에 결합하는 뮤린 하이브리도마 상청액으로부터 수집된 항체의 SPR 프로파일을 보여주는 센소그램의 세트이다.
도 19는 hFLT3에 결합하는 뮤린 mAb 서브클론으로부터 수집된 항체의 SPR 프로파일을 보여주는 센소그램의 세트이다.
도 20은 포화 농도의 가용성 FLT3-리간드에 의한 FLT3-발현 EOL-1 암 세포에 결합하는 후보 항체의 능력의 감소를 도시하는 막대 그래프이다.
도 21a-21c는 FLT3-발현 세포주 RMA-hFLT3 (도 21a), RMA-cFLT3 (도 21b), 및 REH (도 21c)에 대한 FLT3-표적화 TriNKET F3'-1158 및 그의 모 모노클로날 항체의 결합을 보여주는 선 그래프이다.
도 22a-22b는 T227M 돌연변이를 갖는 FLT3을 발현하는 MOLM-13 세포 (도 22a), 및 ITD 돌연변이를 갖는 FLT2를 발현하는 MV4-11 세포에 대한 FLT3-표적화된 TriNKET F3'-1158 및 그의 모 모노클로날 항체의 결합을 보여주는 선 그래프이다.
도 23a-23b는 FLT3-표적화 TriNKET F3'-1158 및 그의 모 모노클로날 항체의 FLT3-발현 세포주 REH (도 23a) 및 EOL-1 (도 23b)로의 내재화를 보여주는 선 그래프이다.
도 24a-24d는 TriNKET F3'-1158 및 그의 모 모노클로날 항체의 존재 하에 FLT3-발현 암 세포주 EOL-1 (도 24a), REH (도 24b), RS4-11 (도 24c) 및 MV4-11 (도 24d)의 NK 세포-매개 용해를 보여주는 막대 그래프이다.
도 25는 TriNKET F3'-1158, 그의 NKG2D-데드 변이체 ("F3'-1158 데드-2D"), 그의 Fc-침묵 변이체 ("F3'-1158si") 또는 그의 모 모노클로날 항체 1158 mAb의 존재 하에 FLT3-발현 암 세포주 REH의 NK 세포-매개 용해를 도시하는 선 그래프이다.
도 26은 TriNKET F3'-1158 및 그의 모 모노클로날 항체의 존재 하에 FLT3-발현 급성 림프모구성 백혈병 세포주 RS4-11의 CD8 T-세포 매개 용해를 보여주는 선 그래프이다.
도 27은 혈액 세포에 대한 TriNKET F3'-1158 및 그의 모 모노클로날 항체의 결합을 보여주는 히스토그램의 세트이다.
도 28a-28b는 FLT3-리간드의 부재 (도 28a) 또는 존재 (도 28b) 하에 TriNKET F3'-1158 및 그의 모 모노클로날 항체에 의한 FLT3 인산화를 보여주는 막대 그래프이다. 도 7a의 FLT3-리간드 샘플은 양성 대조군으로서의 역할을 한다.
본 발명은 자연 킬러 세포 상의 NKG2D 수용체 및 CD16 수용체, 및 종양-연관 항원 FLT3에 결합하는 다중-특이적 결합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 다중-특이적 단백질은 FLT3에 결합하는 추가의 항원-결합 부위를 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 자가면역 질환 및 암을 치료하는 것과 같은 목적을 위한, 이러한 다중-특이적 결합 단백질을 포함하는 제약 조성물, 및 이러한 다중-특이적 단백질 및 제약 조성물을 사용하는 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 측면은 부문별로 나누어 제시되지만, 하나의 특정한 부문에 기재된 본 발명의 측면은 임의의 특정한 부문으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 문구를 아래에 정의한다.
본원에 사용된 단수형태 용어는 "하나 이상"을 의미하며, 달리 문맥상 부적절하지 않는 한 복수형을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원-결합 부위"는 항원 결합에 참여하는 이뮤노글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 인간 항체에서, 항원 결합 부위는 중쇄 ("H") 및 경쇄 ("L")의 N-말단 가변 ("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내의 3개의 고도로 분기된 스트레치는 "초가변 영역"으로 지칭되고, 이는 "프레임워크 영역" 또는 "FR"로 공지된 보다 보존된 플랭킹 스트레치들 사이에 개재된다. 따라서, 용어 "FR"은 이뮤노글로불린 내의 초가변 영역 사이에서 및 그에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 인간 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역 및 중쇄의 3개의 초가변 영역은 서로에 대해 3차원 공간으로 배치되어 항원-결합 표면을 형성한다. 항원-결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보적이고, 각각의 중쇄 및 경쇄의 3개의 초가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. 특정 동물, 예컨대 낙타 및 연골 어류에서, 항원-결합 부위는 "단일 도메인 항체"를 제공하는 단일 항체 쇄에 의해 형성된다. 항원-결합 부위는 무손상 항체에, 항원-결합 표면을 보유하는 항체의 항원-결합 단편에, 또는 재조합 폴리펩티드, 예컨대 단일 폴리펩티드에서 중쇄 가변 도메인을 경쇄 가변 도메인에 연결하기 위한 펩티드 링커를 사용하는 scFv에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "종양-연관 항원"은 암과 연관된 단백질, 당단백질, 강글리오시드, 탄수화물, 지질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 항원을 의미한다. 이러한 항원은 악성 세포 상에서 또는 종양 미세환경에서, 예컨대 종양-연관 혈관, 세포외 매트릭스, 중간엽 기질 또는 면역 침윤물 상에서 발현될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료될 유기체를 지칭한다. 이러한 유기체는 바람직하게는 포유동물 (예를 들어, 뮤린, 원숭이, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않으며, 보다 바람직하게는 인간을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 유익한 또는 바람직한 결과를 얻기에 충분한 화합물 (예를 들어, 본 발명의 화합물)의 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있으며, 특정한 제제화 또는 투여 경로로 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에 사용된 용어 "치료"는 상태, 질환, 장애 등의 개선을 유발하는 임의의 효과, 예를 들어, 경감, 감소, 조정, 호전 또는 제거, 또는 그의 증상의 호전을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "제약 조성물"은 조성물을 특히 생체내 또는 생체외 진단 또는 치료 용도에 적합하게 하는 불활성 또는 활성 담체와 활성제의 조합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제약상 허용되는 담체"는 임의의 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼 (예를 들어, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀젼) 및 다양한 유형의 습윤제를 지칭한다. 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 아주반트의 예는, 예를 들어 문헌 [Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]]를 참조한다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 염"은 대상체에 투여시 본 발명의 화합물 또는 그의 활성 대사물 또는 잔류물을 제공할 수 있는 본 발명의 화합물의 임의의 제약상 허용되는 염 (예를 들어, 산 또는 염기)을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물의 "염"은 무기 또는 유기 산 및 염기로부터 유래할 수 있다. 예시적인 산은 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-술폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-술폰산, 벤젠술폰산 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 산, 예컨대 옥살산은 그 자체는 제약상 허용되지는 않지만, 본 발명의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 산 부가 염을 얻는 중간체로서 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다.
예시적인 염기는 알칼리 금속 (예를 들어, 나트륨) 수산화물, 알칼리 토금속 (예를 들어, 마그네슘) 수산화물, 암모니아, 및 화학식 (NW)4 +의 화합물 (여기서, W는 C1-4 알킬임) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 염은 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 푸마레이트, 플루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로아이오다이드, 2-히드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 운데카노에이트 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 염의 다른 예는 적합한 양이온 예컨대 Na+ , NH4 + , 및 NW4 + (여기서 W는 C1-4 알킬 기임) 등과 배합된 본 발명의 화합물의 음이온을 포함한다.
치료 용도를 위해서, 본 발명의 화합물의 염은 제약상 허용되는 것으로서 여겨진다. 그러나, 제약상 허용되지 않는 산 및 염기의 염이 또한 예를 들어, 제약상 허용되는 화합물의 제조 또는 정제에서 사용되는 것을 발견할 수 있다.
본원에 사용된 "FLT3" (또한 FLK2, STK1 또는 CD135로 공지됨)은 유니프롯(Uniprot) 수탁 번호 P36888의 단백질 및 관련 이소형을 지칭한다.
본원에 사용된 "FLT3L" (또한 FLT3-리간드로 공지됨)은 유니프롯 수탁 번호 P49771의 단백질 및 관련 이소형을 지칭한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 조성물이 특정한 성분을 갖거나, 포괄하거나 또는 포함하는 것으로 기재되거나 또는 공정 및 방법이 특정 단계를 갖거나, 포괄하거나 또는 포함하는 것으로 기재되는 경우에, 이는 추가적으로, 언급된 성분으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 본 발명의 조성물이 존재하고, 언급된 공정 단계로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 본 발명에 따른 공정 및 방법이 존재하는 것으로 고려된다.
일반적으로, 백분율을 명시하는 조성물은 달리 명시되지 않는 한 중량 기준이다. 또한, 변수에 정의가 수반되지 않는다면, 앞선 변수의 정의를 따른다.
I. 단백질
본 발명은 자연 킬러 세포 상의 NKG2D 수용체 및 CD16 수용체, 및 종양-연관 항원 FLT3에 결합하는 다중-특이적 결합 단백질을 제공한다. 다중-특이적 결합 단백질은 본원에 기재된 제약 조성물 및 치료 방법에 유용하다. 자연 킬러 세포 상의 NKG2D 수용체 및 CD16 수용체에 대한 다중-특이적 결합 단백질의 결합은 FLT3을 발현하는 종양 세포의 파괴에 대한 자연 킬러 세포의 활성을 증진시킨다. FLT3-발현 종양 세포에 대한 다중-특이적 결합 단백질의 결합은 이들 세포를 자연 킬러 세포와 근접하게 하여, 자연 킬러 세포에 의한 종양 세포의 직접적 및 간접적 파괴를 용이하게 한다. NKG2D, CD16, 및 또 다른 표적에 결합하는 다중-특이적 결합 단백질은 국제 출원 공개 번호 WO2018148445 및 WO2019157366에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함되지 않는다. 일부 예시적인 다중-특이적 결합 단백질에 대한 추가의 기재가 하기에 제공된다.
다중-특이적 결합 단백질의 제1 성분은, NK 세포, γδ T 세포 및 CD8+ αβ T 세포를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 NKG2D 수용체-발현 세포에 결합하는 항원-결합 부위이다. NKG2D 결합시, 다중-특이적 결합 단백질은 천연 리간드, 예컨대 ULBP6 및 MICA가 NKG2D에 결합하고 NK 세포를 활성화시키는 것을 차단할 수 있다.
다중-특이적 결합 단백질의 제2 성분은 FLT3에 결합하는 항원-결합 부위이다. FLT3-발현 세포는, 예를 들어 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 급성 림프모구성 백혈병 (ALL)에서 발견될 수 있다. FLT3-발현 세포는 다른 암 및 종양 유형, 예를 들어 혈액 악성종양, 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 골수이형성증, 급성 T-림프모구성 백혈병 및 급성 전골수구성 백혈병과 연관되어 발견될 수 있다.
다중-특이적 결합 단백질의 제3 성분은, 자연 킬러 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 비만 세포 및 여포성 수지상 세포를 비롯한 백혈구의 표면 상의 Fc 수용체인 CD16을 발현하는 세포에 결합하는 항체 Fc 도메인 또는 그의 부분 또는 항원-결합 부위이다.
다중-특이적 결합 단백질의 추가의 항원-결합 부위는 FLT3에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 scFv이고, 제2 및 추가의 항원-결합 부위는 각각 Fab 단편이고 FLT3에 결합한다. 특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 scFv이고, 제2 및 추가의 항원-결합 부위는 각각 scFv이고 FLT3에 결합한다.
항원-결합 부위는 각각 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있거나 (예를 들어, 항체에서와 같이 배열되거나, 또는 함께 융합되어 scFv를 형성함), 또는 항원-결합 부위 중 하나 이상은 단일 도메인 항체, 예컨대 낙타류 항체와 같은 VHH 항체 또는 연골 어류에서 발견되는 항체와 같은 VNAR 항체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 제1 항원-결합 부위에 존재하는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 다중-특이적 결합 단백질은 다양한 포맷을 취할 수 있다. 예를 들어, 하나의 포맷은 제1 이뮤노글로불린 중쇄, 제1 이뮤노글로불린 경쇄, 제2 이뮤노글로불린 중쇄 및 제2 이뮤노글로불린 경쇄를 포함하는 이종이량체 다중-특이적 항체이다 (도 1). 제1 이뮤노글로불린 중쇄는 제1 Fc (힌지-CH2-CH3) 도메인, 제1 중쇄 가변 도메인 및 임의로 제1 CH1 중쇄 도메인을 포함한다. 제1 이뮤노글로불린 경쇄는 제1 경쇄 가변 도메인 및 임의로 제1 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 제1 이뮤노글로불린 경쇄는 제1 이뮤노글로불린 중쇄와 함께 NKG2D에 결합하는 항원-결합 부위를 형성한다. 제2 이뮤노글로불린 중쇄는 제2 Fc (힌지-CH2-CH3) 도메인, 제2 중쇄 가변 도메인 및 임의로 제2 CH1 중쇄 도메인을 포함한다. 제2 이뮤노글로불린 경쇄는 제2 경쇄 가변 도메인 및 임의로 제2 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 제2 이뮤노글로불린 경쇄는 제2 이뮤노글로불린 중쇄와 함께 FLT3에 결합하는 항원-결합 부위를 형성한다. 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 함께 CD16에 결합할 수 있다 (도 1). 일부 실시양태에서, 제1 이뮤노글로불린 경쇄는 제2 이뮤노글로불린 경쇄와 동일하다.
또 다른 예시적인 포맷은 제1 이뮤노글로불린 중쇄, 제2 이뮤노글로불린 중쇄 및 이뮤노글로불린 경쇄를 포함하는 이종이량체 다중-특이적 항체를 포함한다 (도 2a). 제1 이뮤노글로불린 중쇄는 쌍을 형성하여 NKG2D에 결합하거나 또는 FLT3에 결합하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인으로 구성된 단일쇄 가변 단편 (scFv)에 링커 또는 항체 힌지를 통해 융합된 제1 Fc (힌지-CH2-CH3) 도메인을 포함한다. 제2 이뮤노글로불린 중쇄는 제2 Fc (힌지-CH2-CH3) 도메인, 제2 중쇄 가변 도메인 및 CH1 중쇄 도메인을 포함한다. 이뮤노글로불린 경쇄는 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 제2 이뮤노글로불린 중쇄는 이뮤노글로불린 경쇄와 쌍을 형성하고, NKG2D에 결합하거나 또는 FLT3에 결합한다. 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 함께 CD16에 결합할 수 있다 (도 2a).
또 다른 예시적인 포맷은 제1 이뮤노글로불린 중쇄 및 제2 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 이종이량체 다중-특이적 항체를 포함한다 (도 2b). 제1 이뮤노글로불린 중쇄는 쌍을 형성하여 NKG2D에 결합하거나 또는 FLT3에 결합하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인으로 구성된 단일쇄 가변 단편 (scFv)에 링커 또는 항체 힌지를 통해 융합된 제1 Fc (힌지-CH2-CH3) 도메인을 포함한다. 제2 이뮤노글로불린 중쇄는 쌍을 형성하여 NKG2D에 결합하거나 또는 FLT3에 결합하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인으로 구성된 단일쇄 가변 단편 (scFv)에 링커 또는 항체 힌지를 통해 융합된 제2 Fc (힌지-CH2-CH3) 도메인을 포함한다. 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 함께 CD16에 결합할 수 있다 (도 2b).
일부 실시양태에서, 상기 기재된 단일쇄 가변 단편 (scFv)은 힌지 서열을 통해 항체 불변 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 힌지는 아미노산 Ala-Ser 또는 Gly-Ser을 포함한다. 일부 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 scFv 및 항체 중쇄 불변 도메인을 연결하는 힌지는 아미노산 Ala-Ser을 포함한다. 일부 실시양태에서, FLT3에 결합하는 scFv 및 항체 중쇄 불변 도메인을 연결하는 힌지는 아미노산 Gly-Ser을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 힌지는 아미노산 Ala-Ser 및 Thr-Lys-Gly를 포함한다. 힌지 서열은 표적 항원에 대한 결합의 가요성, 및 가요성과 최적 기하구조 사이의 균형을 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 단일쇄 가변 단편 (scFv)은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인과 디술피드 가교를 형성하여 scFv의 안정성을 증진시킨다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인의 C44 잔기와 경쇄 가변 도메인의 C100 잔기 사이에 디술피드 가교가 형성될 수 있고, 아미노산 위치는 카바트 하에 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인은 가요성 링커를 통해 경쇄 가변 도메인에 연결된다. 임의의 적합한 링커, 예를 들어 (G4S)4 링커가 사용될 수 있다. scFv의 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인의 N-말단에 위치한다. scFv의 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인의 C 말단에 위치한다.
본원에 기재된 다중-특이적 결합 단백질은 1개 이상의 추가의 항원-결합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 항원-결합 부위(들)는 임의로 링커 서열을 통해 불변 영역 CH2 도메인의 N-말단 또는 불변 영역 CH3 도메인의 C-말단에 융합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 항원-결합 부위(들)는 임의로 디술피드-안정화된 단일쇄 가변 영역 (scFv)의 형태를 취하여, 4가 또는 3가 다중특이적 결합 단백질을 생성한다. 예를 들어, 다중-특이적 결합 단백질은 NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위, FLT3에 결합하는 추가의 항원-결합 부위, 및 CD16에 결합하기에 충분한 항체 불변 영역 또는 그의 부분 또는 CD16에 결합하는 제4 항원-결합 부위를 포함한다. 이들 항원 결합 부위 중 어느 하나는 Fab 단편 또는 scFv, 예컨대 상기 기재된 scFv의 형태를 취할 수 있다.
일부 실시양태에서, 추가의 항원-결합 부위는 제2 항원-결합 부위와 상이한 FLT3의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 추가의 항원-결합 부위는 제2 항원-결합 부위와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 추가의 항원-결합 부위는 제2 항원-결합 부위와 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 항원-결합 부위는 제2 항원-결합 부위와 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 항원-결합 부위는 제2 항원-결합 부위와 동일한 아미노산 서열(들)을 갖는다. 예시적인 포맷이 도 2c 및 2d에 제시된다. 따라서, 다중-특이적 결합 단백질은 FLT3의 2가 결속을 제공할 수 있다. 다중-특이적 단백질에 의한 FLT3의 2가 결속은 종양 세포 표면 상의 FLT3을 안정화시키고 종양 세포에 대한 NK 세포의 세포독성을 증진시킬 수 있다. 다중-특이적 단백질에 의한 FLT3의 2가 결속은 종양 세포에 대한 다중-특이적 단백질의 보다 강한 결합을 부여하여, 종양 세포에 대한, 특히 낮은 수준의 FLT3을 발현하는 종양 세포에 대한 NK 세포의 보다 강한 세포독성 반응을 용이하게 할 수 있다.
다중-특이적 결합 단백질은 추가의 포맷을 취할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 트리오맙 형태이며, 이는 IgG-유사 형상을 유지하는 삼관능성 이중특이적 항체이다. 이러한 키메라는 2종의 모 항체로부터 유래된, 각각 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄를 갖는 2종의 절반 항체로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 노브-인투-홀(knobs-into-holes) (KiH) 기술과 관련된 KiH형태이다. KiH는 CH3 도메인을 조작하여 각각의 중쇄에 "노브" 또는 "홀"을 생성하여 이종이량체화를 촉진하는 것을 수반한다. "노브-인투-홀 (KiH)" Fc 기술의 개념은 작은 잔기를 벌키 잔기로 치환함으로써 하나의 CH3 도메인 (CH3A)에 "노브"를 도입하는 것이었다 (예를 들어, EU 넘버링에서 T366WCH3A). "노브"를 수용하기 위해, 노브에 가장 가까운 이웃 잔기를 보다 작은 잔기로 대체함으로써 다른 CH3 도메인 (CH3B) 상에 상보적 "홀" 표면을 생성하였다 (예를 들어, T366S/L368A/Y407VCH3B). "홀" 돌연변이는 구조화된-가이드된 파지 라이브러리 스크리닝에 의해 최적화되었다 (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library, J. Mol. Biol. (1997) 270(1):26-35). KiH Fc 변이체의 X선 결정 구조 (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, et al., Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J. Mol. Biol. (2014) 426(9):1947-57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcγRs. Mol. Immunol. (2014) 58(1):132-8)는 이종이량체화가 CH3 도메인간 코어 계면에서의 입체 상보성에 의해 유도되는 소수성 상호작용에 의해 열역학적으로 선호되는 반면, 노브-노브 및 홀-홀 계면은 각각 입체 장애 및 유리한 상호작용의 파괴로 인해 동종이량체화를 선호하지 않는다는 것을 입증하였다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 이중-가변 도메인 이뮤노글로불린 (DVD-IgTM) 형태이며, 이는 2종의 모노클로날 항체의 표적 결합 도메인을 가요성 자연 발생 링커를 통해 조합하고, 4가 IgG-유사 분자를 생성한다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 직교 Fab 계면 (오르토-Fab) 형태이다. 오르토-Fab IgG 접근법 (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al., Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32(2):191-8)에서, 구조-기반 영역 설계는 단지 1개의 Fab 단편에서 LC 및 HCVH-CH1 계면에 상보적 돌연변이를 도입하며, 다른 Fab 단편에 대해서는 어떠한 변화도 이루어지지 않는다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 2-인-1 Ig 포맷이다. 일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 ES 형태이며, 이는 Fc에 융합된, 표적 1 및 표적 2에 결합하는 2개의 상이한 Fab 단편을 함유하는 이종이량체 구축물이다. 이종이량체화는 Fc 내의 정전기적 스티어링 돌연변이에 의해 보장된다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 κλ-바디 형태를 가지며, 이는 이종이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc에 융합된 2개의 상이한 Fab 단편을 갖는 이종이량체 구축물이고: 항원 1을 표적화하는 Fab 단편1은 카파 LC를 함유하는 반면에, 항원 2를 표적화하는 제2 Fab 단편은 람다 LC를 함유한다. 도 13a는 κλ-바디의 한 형태의 예시적인 대표도이고; 도 13b는 또 다른 κλ-바디의 예시적인 대표도이다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 Fab 아암 교환 형태 (중쇄 및 부착된 경쇄 (절반-분자)를 또 다른 분자로부터의 중쇄-경쇄 쌍으로 스와핑함으로써 Fab 단편 아암을 교환하여 이중특이적 항체를 생성하는 항체)이다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 SEED 바디 형태이다. 가닥-교환 조작된 도메인 (SEED) 플랫폼은 비대칭의 이중특이적 항체-유사 분자를 생성하도록 설계되었으며, 이는 천연 항체의 치료 용도를 확장시키는 능력을 갖는다. 이러한 단백질 조작된 플랫폼은 보존된 CH3 도메인 내의 이뮤노글로불린의 구조적으로 관련된 서열의 교환을 기반으로 한다. SEED 설계는 AG/GA 이종이량체의 효율적인 생성을 가능하게 하는 반면에, AG 및 GA SEED CH3 도메인의 동종이량체는 선호하지 않는다. (Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54)).
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 LuZ-Y 형태를 가지며, 여기서 류신 지퍼를 사용하여 2개의 상이한 HC의 이종이량체화를 유도한다. (Wranik, BJ. et al., J. Biol. Chem. (2012), 287:43331-9).
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 Cov-X-바디 형태이다. 이중특이적 CovX-바디에서, 2개의 상이한 펩티드가 분지형 아제티디논 링커를 사용하여 함께 연결되고, 부위-특이적 방식으로 온화한 조건 하에 스캐폴드 항체에 융합된다. 약물작용발생단은 기능적 활성을 담당하는 반면에, 항체 스캐폴드는 긴 반감기 및 Ig-유사 분포를 부여한다. 약물작용발생단은 화학적으로 최적화될 수 있거나 또는 다른 약물작용발생단으로 대체되어, 최적화된 또는 고유한 이중특이적 항체를 생성할 수 있다. (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52);22611-22616).
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 Fc에 융합된, 표적 1에 결합하는 Fab 단편 및 표적 2에 결합하는 scFab를 포함하는 Oasc-Fab 이종이량체 형태이다. 이종이량체화는 Fc 내의 돌연변이에 의해 보장된다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 듀엣맙 형태이며, 이는 항원 1 및 2에 결합하는 2개의 상이한 Fab 단편 및 이종이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc를 포함하는 이종이량체 구축물이다. Fab 단편 1 및 2는 정확한 LC 및 HC 쌍 형성을 보장하는 차등 S-S 가교를 함유한다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 크로스맙 형태이며, 이는 이종이량체화에 의해 안정화된 Fc에 융합된, 표적 1 및 2에 결합하는 2개의 상이한 Fab 단편을 갖는 이종이량체 구축물이다. CL 및 CH1 도메인 및 VH 및 VL 도메인은 스위칭되며, 예를 들어 CH1은 VL과 인-프레임으로 융합되는 반면 CL은 VH와 인-프레임으로 융합된다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 결합 단백질은 Fit-Ig 형태이며, 이는 항원 2에 결합하는 Fab 단편이 항원 1에 결합하는 Fab 단편의 HC의 N 말단에 융합된 동종이량체 구축물이다. 상기 구축물은 야생형 Fc를 함유한다.
다중-특이적 결합 단백질의 개별 성분은 하기에 보다 상세하게 기재된다.
NKG2D-결합 부위
자연 킬러 세포 상의 NKG2D 수용체 및 CD16 수용체, 및 암 세포 상의 종양-연관 항원에 결합시, 다중-특이적 결합 단백질은 1종 초과의 NK-활성화 수용체에 결속할 수 있고, NKG2D에 대한 천연 리간드의 결합을 차단할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 단백질은 인간에서 NK 세포를 효능화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 단백질은 인간에서 및 다른 종, 예컨대 설치류 및 시노몰구스 원숭이에서 NK 세포를 효능화시킬 수 있다.
표 1은, 조합되어 NKG2D에 결합할 수 있는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 펩티드 서열을 열거한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 Fab 포맷으로 배열된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 함께 융합되어 scFv를 형성한다.
표 1에 열거된 NKG2D 결합 부위는 NKG2D에 대한 그의 결합 친화도가 다양할 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 이들 모두는 인간 NK 세포를 활성화시킨다.
달리 나타내지 않는 한, 표 1에 제공된 CDR 서열은 카바트(Kabat) 하에 결정된다.
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특정 실시양태에서, NKG2D (예를 들어, 인간 NKG2D)에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 표 1에 개시된 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH)과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 표 1에 개시된 동일한 항체의 항체 경쇄 가변 도메인 (VL)과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 표 1에 개시된 항체의 VH 및 VL 서열의 카바트 (문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, Bethesda] 참조), 코티아 (예를 들어, 문헌 [Chothia C & Lesk A M, (1987), J Mol Biol 196: 901-917] 참조), 맥칼룸 (문헌 [MacCallum R M et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745] 참조), 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 CDR 결정 방법 하에 결정된 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 표 1에 개시된 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는, 예컨대 서열식별번호: 138과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 갖고/거나 서열식별번호: 138의 CDR1 (서열식별번호: 140), CDR2(서열식별번호: 141) 및 CDR3 (서열식별번호: 142) 서열과 동일한 아미노산 서열을 혼입함으로써 서열식별번호: 138과 관련된 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 서열식별번호: 138과 관련된 중쇄 가변 도메인은 다양한 경쇄 가변 도메인과 커플링되어 NKG2D 결합 부위를 형성할 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 138과 관련된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 139, 144, 146, 148, 150, 154, 156, 158, 160, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 및 181과 관련된 서열 중 어느 하나로부터 선택된 경쇄 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 138과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 139, 144, 146, 148, 150, 154, 156, 158, 160, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179 및 181로부터 선택된 서열 중 어느 하나와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 182의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 183과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 184 또는 185, 186, 및 189 또는 190의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 187, 188, 및 191의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 184 또는 185, 186, 및 189 또는 190의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 187, 188, 및 191의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 192의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 161과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 193 또는 194, 195, 및 196 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 198, 199, 및 200의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 193 또는 194, 195, 및 196 또는 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 198, 199, 및 200의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 201의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 202와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 203의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 204와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 184, 205 및 206의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 207, 188 및 208의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 184, 205 및 206의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 207, 188 및 208의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 209의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 210과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 211 또는 212, 213, 및 214 또는 215의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 216, 217 및 218의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 211 또는 212, 213, 및 214 또는 215의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 216, 217, 및 218의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 219의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 220과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 221 또는 222, 223, 및 224 또는 225의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 226, 217 및 227의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 221 또는 222, 223, 및 224 또는 225의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 226, 217 및 227의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 247의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 248과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 211 또는 212, 249, 및 250 또는 251의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 252, 199 및 253의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 211 또는 212, 249, 및 250 또는 251의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 252, 199 및 253의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 228의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 229와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 230 또는 231, 232, 및 233 또는 234의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 235, 236, 및 237의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 230 또는 231, 232, 및 233 또는 234의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 235, 236, 및 237의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 238의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 239와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 243 또는 244의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 243 또는 244의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 254의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 239와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 255 또는 256의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 255 또는 256의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 257의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 239와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 258 또는 259의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 258 또는 259의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 260의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 239와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 261 또는 262의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 261 또는 262의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 263의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 239와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 264 또는 265의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 264 또는 265의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 266의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 239와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 267 또는 268의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 267 또는 268의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 269의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 239와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 270 또는 271의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 270 또는 271의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 272의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 273과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열식별번호: 274의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 275와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
다중-특이적 결합 단백질은 NK 세포, γδ T 세포 및 CD8+ αβ T 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 NKG2D-발현 세포에 결합할 수 있다. NKG2D 결합시, 다중-특이적 결합 단백질은 천연 리간드, 예컨대 ULBP6 및 MICA가 NKG2D에 결합하고 NK 세포를 활성화시키는 것을 차단할 수 있다.
다중-특이적 결합 단백질은 백혈구의 표면 상의 Fc 수용체인 CD16을 발현하는 세포, 예컨대 자연 킬러 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 비만 세포 및 여포성 수지상 세포에 결합한다. 본 개시내용의 단백질은 2 nM 내지 120 nM, 예를 들어, 2 nM 내지 110 nM, 2 nM 내지 100 nM, 2 nM 내지 90 nM, 2 nM 내지 80 nM, 2 nM 내지 70 nM, 2 nM 내지 60 nM, 2 nM 내지 50 nM, 2 nM 내지 40 nM, 2 nM 내지 30 nM, 2 nM 내지 20 nM, 2 nM 내지 10 nM, 약 15 nM, 약 14 nM, 약 13 nM, 약 12 nM, 약 11 nM, 약 10 nM, 약 9 nM, 약 8 nM, 약 7 nM, 약 6 nM, 약 5 nM, 약 4.5 nM, 약 4 nM, 약 3.5 nM, 약 3 nM, 약 2.5 nM, 약 2 nM, 약 1.5 nM, 약 1 nM, 약 0.5 nM 내지 약 1 nM, 약 1 nM 내지 약 2 nM, 약 2 nM 내지 3 nM, 약 3 nM 내지 4 nM, 약 4 nM 내지 약 5 nM, 약 5 nM 내지 약 6 nM, 약 6 nM 내지 약 7 nM, 약 7 nM 내지 약 8 nM, 약 8 nM 내지 약 9 nM, 약 9 nM 내지 약 10 nM, 약 1 nM 내지 약 10 nM, 약 2 nM 내지 약 10 nM, 약 3 nM 내지 약 10 nM, 약 4 nM 내지 약 10 nM, 약 5 nM 내지 약 10 nM, 약 6 nM 내지 약 10 nM, 약 7 nM 내지 약 10 nM, 또는 약 8 nM 내지 약 10 nM의 KD의 친화도로 NKG2D에 결합한다. 일부 실시양태에서, NKG2D-결합 부위는 10 내지 62 nM의 KD로 NKG2D에 결합한다.
FLT3-결합 부위
본원에 개시된 다중-특이적 결합 단백질의 FLT3-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 표 2는, 조합되어 FLT3에 결합할 수 있는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 일부 예시적인 서열을 열거한다. CDR 서열은 코티아 넘버링 하에 확인된다.
표 2: FLT3에 결합하는 예시적인 항원-결합 부위의 서열
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대안적으로, FLT3에 결합할 수 있는 신규 항원-결합 부위는 서열식별번호: 135로 정의되는 아미노산 서열, 그의 성숙 세포외 단편, 또는 FLT3의 도메인을 함유하는 단편에 대한 결합에 대해 스크리닝함으로써 확인될 수 있다 (예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO 2018/220584 참조).
서열식별번호: 135 (성숙 인간 FLT3 세포외 도메인)
NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNIS
특정 실시양태에서, FLT3 (예를 들어, 인간 FLT3)에 결합하는 제2 항원-결합 부위는 표 2에 개시된 항체의 항체 중쇄 가변 도메인 (VH)와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH, 및 표 2에 개시된 동일한 항체의 VH와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 표 2에 개시된 항체의 VH 및 VL 서열의 카바트 (문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, Bethesda] 참조), 코티아 (예를 들어, 문헌 [Chothia C & Lesk A M, (1987), J Mol Biol 196: 901-917] 참조), 맥칼룸 (문헌 [MacCallum R M et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745] 참조), 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 CDR 결정 방법 하에 결정된 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 표 2에 개시된 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 12H10.G7과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 2와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 GB87 또는 GB95와 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 10과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 3 또는 12와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 GB88 또는 GB96과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 10과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 15 또는 16과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 GB89 또는 GB97과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 10과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 19 또는 20과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 GB90 및 GB98과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 22와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 23 또는 24와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 GB91 및 GB99와 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 26과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 27 또는 28과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 GB92 또는 GB100과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 30과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 31 또는 32와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 GB93 또는 GB101과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 34와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 35 또는 36과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 GB94 또는 GB102와 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 37의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 38과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 39 또는 40과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 GB102 D101E와 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 41의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 42와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 43 또는 44와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 GB102 M34I와 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 42와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 47 또는 48과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 GB102 M34I/D101E와 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 42와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 51 또는 52와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 인간화 12H10.G7과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 42와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 인간화 12H10.G7과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 56의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 57과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 인간화 12H10.G7과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 58의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 42와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 11, 4 및 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 14A5.E8과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 60의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열식별번호: 61과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 65, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 65, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 mAb 1551 또는 1552와 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 68의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 69와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 65, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 65, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 70 또는 71과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 mAb 1553 또는 1554와 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 72의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 73과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 65, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 65, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 74 또는 75와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 mAb 1689와 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 76의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 77과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 78, 63 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 80, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 78, 63 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 80, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 scFv로서 존재하고, 여기서 scFv는 서열식별번호: 81 또는 82와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 인간화 14A5.E8과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 84와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 59, 63 및 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 86, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 59, 63 및 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 86, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 11F4.B9와 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 85의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 90과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 87, 88 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 91, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 87, 88 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 91, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 인간화 11F4.B9와 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 94와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 87, 88 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 91, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 87, 88 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 91, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 4A4.A3과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 95의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 96과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 97, 99 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 101, 102 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 97, 99 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 101, 102 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 4A4.H7과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 104의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 105와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 87, 98 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 106, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 87, 98 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 106, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 15A11.C8과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 107의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 108과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 109, 110 및 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 112, 113 및 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 109, 110 및 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 112, 113 및 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 12C9.E5와 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 115의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 116과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 117, 118 및 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 120, 121 및 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 117, 118 및 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 120, 121 및 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 1A2.A3과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 123의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 124와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 87, 98, 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 106, 92, 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 87, 98, 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 106, 92, 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 4H2.E3과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 125의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 126과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 62, 33 및 127의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 128, 129 및 130의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 62, 33 및 127의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 128, 129 및 130의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 14H8.E7과 관련된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 서열식별번호: 131의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 83과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 각각 서열식별번호: 132, 133 및 134의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 각각 서열식별번호: 65, 66 및 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 (a) 각각 서열식별번호: 132, 133 및 134의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 (b) 각각 서열식별번호: 65, 66 및 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
각각의 상기 실시양태에서, 본원에서 FLT3에 함께 결합하는 VH 및/또는 VL 서열은 FLT3에 결합하는 그의 능력에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 VH 및/또는 VL의 프레임워크 영역에서 아미노산 변경 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 10개의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가)을 함유할 수 있는 것으로 고려된다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 제2 항원-결합 부위는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (예를 들어, 하기 실시예 1에 기재된 방법을 사용함) 또는 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정 시 1 nM 이하, 5 nM 이하, 또는 10 nM 이하, 15 nM 이하, 또는 20 nM 이하의 KD (즉, 해리 상수)로 FLT3 (예를 들어, 인간 FLT3)에 결합하고/거나, 대상체의 체액, 조직 및/또는 세포로부터의 FLT3에 결합한다. 특정 실시양태에서, 임의의 상기 단리된 항체는 SPR (예를 들어, 하기 실시예 1에 기재된 방법을 사용함) 또는 BLI에 의해 측정 시 1 x 10-5, 1 x 10-4, 1 x 10-3, 5 x 10-3, 0.01, 0.02 또는 0.05 1/s 이하의 Kd (즉, 오프-레이트, 또한 Koff로 불림)를 갖는다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 제2 항원-결합 부위, 예를 들어 상기 개시된 12H10.G7, GB87, GB88, GB89, GB90, GB91, GB92, GB93, GB94, GB95, GB96, GB97, GB98, GB99, GB100, GB101, GB102, GB102 M34I, GB102 D101E, GB102 M34I/D101E, 또는 인간화 12H10.G7과 관련된 항원-결합 부위는 T227M 돌연변이를 갖는 인간 FLT3 변이체 또는 그의 세포외 영역에 결합한다. hFLT3-T227M의 세포외 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다: NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGMDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNIS (서열식별번호: 318).
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 제2 항원-결합 부위, 예를 들어 상기 개시된 12H10.G7, GB87, GB88, GB89, GB90, GB91, GB92, GB93, GB94, GB95, GB96, GB97, GB98, GB99, GB100, GB101, GB102, GB102 M34I, GB102 D101E, GB102 M34I/D101E, 또는 인간화 12H10.G7과 관련된 항원-결합 부위는 ITD 돌연변이를 갖는 인간 FLT3 변이체 또는 그의 세포외 영역에 결합한다. hFLT3-ITD의 세포외 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다: NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNIS (서열식별번호: 319).
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 제2 항원-결합 부위, 예를 들어 상기 개시된 12H10.G7, GB87, GB88, GB89, GB90, GB91, GB92, GB93, GB94, GB95, GB96, GB97, GB98, GB99, GB100, GB101, GB102, GB102 M34I, GB102 D101E, GB102 M34I/D101E, 인간화 12H10.G7, 14A5.E8, 1551, 1552, 1553, 1554, 1689, 인간화 14A5.E8, 11F4.B9, 4A4.A3, 4A4.H7, 15A11.C8, 1A2.A3, 4H2.E3 또는 14H8.E7과 관련된 항원-결합 부위는 시노몰구스 FLT3에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 제2 항원-결합 부위, 예를 들어 상기 개시된 12H10.G7, GB87, GB88, GB89, GB90, GB91, GB92, GB93, GB94, GB95, GB96, GB97, GB98, GB99, GB100, GB101, GB102, GB102 M34I, GB102 D101E, GB102 M34I/D101E, 인간화 12H10.G7, 14A5.E8, 1551, 1552, 1553, 1554, 1689, 인간화 14A5.E8, 11F4.B9, 4A4.A3, 4A4.H7, 12C9.E5, 1A2.A3, 4H2.E3 또는 14H8.E7과 관련된 항원-결합 부위는 FLT3에의 결합에 대해 FLT3L과 경쟁하지 않는다.
특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 FLT3 (예를 들어, 인간 FLT3, 시노몰구스 FLT3)에의 결합에 대해 상기 기재된 항원-결합 부위와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 FLT3에의 결합에 대해 상기 개시된 1A2.A3과 관련된 항원-결합 부위와 경쟁한다. 한 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 FLT3에의 결합에 대해 1A2.A3과 경쟁한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제2 항원-결합 부위는 FLT3에의 결합에 대해 상기 개시된 4A4.A3과 관련된 항원-결합 부위와 경쟁한다. 한 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 FLT3에의 결합에 대해 4A4.A3과 경쟁한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제2 항원-결합 부위는 FLT3에의 결합에 대해 상기 개시된 4H2.E3과 관련된 항원-결합 부위와 경쟁한다. 한 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 FLT3에의 결합에 대해 4H2.E3과 경쟁한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제2 항원-결합 부위는 FLT3에의 결합에 대해 상기 개시된 11F4.B9와 관련된 항원-결합 부위와 경쟁한다. 한 실시양태에서, 제2 항원-결합 부위는 FLT3에의 결합에 대해 11F4.B9와 경쟁한다.
Fc 도메인
Fc 도메인 내에서, CD16 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 의해 매개된다. 예를 들어, 인간 IgG1 내에서, CD16과의 상호작용은 주로 CH2 도메인 내의 아미노산 잔기 Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 및 탄수화물 잔기 N-아세틸-D-글루코사민에 집중된다 (문헌 [Sondermann et al., Nature, 406 (6793):267-273] 참조). 공지된 도메인에 기반하여, 돌연변이는 예컨대 파지-제시된 라이브러리 또는 효모 표면-제시된 cDNA 라이브러리를 사용함으로써 CD16에의 결합 친화도를 증진시키거나 감소시키도록 선택될 수 있거나, 상호작용의 공지된 3차원 구조에 기반하여 디자인될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 항체 Fc 도메인 또는 그의 부분은 힌지 및 CH2 도메인을 포함한다.
이종이량체 항체 중쇄의 어셈블리는 동일한 세포에서 2개의 상이한 항체 중쇄 서열을 발현시킴으로써 달성될 수 있으며, 이는 각각의 항체 중쇄의 동종이량체의 어셈블리 뿐만 아니라 이종이량체의 어셈블리를 유도할 수 있다. 이종이량체의 우선적인 어셈블리의 촉진은 US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934, US14/773418, US12/811207, US13/866756, US14/647480 및 US14/830336에 제시된 바와 같이 각각의 항체 중쇄 불변 영역의 CH3 도메인에 상이한 돌연변이를 포함시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 인간 IgG1을 기준으로 CH3 도메인에서 이루어질 수 있고, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 내에 특유의 아미노산 치환 쌍을 포함시키는 것은 이들 2개의 쇄가 서로 선택적으로 이종이량체화하는 것을 가능하게 한다. 하기 예시된 아미노산 치환의 위치는 모두 카바트(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스에 따라 넘버링된다.
한 시나리오에서, 제1 폴리펩티드 내의 아미노산 치환은 원래의 아미노산을 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 또는 트립토판 (W)으로부터 선택된 더 큰 아미노산으로 대체하고, 제2 폴리펩티드 내의 적어도 1개의 아미노산 치환은 원래의 아미노산(들)을 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T) 또는 발린 (V)으로부터 선택된 더 작은 아미노산(들)으로 대체하고, 이로써 더 큰 아미노산 치환 (융기부)이 더 작은 아미노산 치환 (공동)의 표면 내로 끼워맞춤된다. 예를 들어, 한 폴리펩티드는 T366W 치환을 포함할 수 있고, 다른 것은 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한 3개의 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 중쇄 가변 도메인은 임의로, 항체 불변 영역, 예컨대 CH1 도메인이 있거나 없이 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG 불변 영역과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열에 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 불변 영역의 아미노산 서열은 인간 항체 불변 영역, 예컨대 인간 IgG1 불변 영역, IgG2 불변 영역, IgG3 불변 영역 또는 IgG4 불변 영역에 대해 적어도 90% 동일하다. 한 실시양태에서, CD16에 결합하기에 충분한 항체 Fc 도메인 또는 그의 부분은 야생형 인간 IgG1 Fc 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열식별번호: 136)와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 상기 불변 영역의 아미노산 서열은 또 다른 포유동물, 예컨대 토끼, 개, 고양이, 마우스 또는 말로부터의 항체 불변 영역에 대해 적어도 90% 동일하다.
일부 실시양태에서, scFv 또는 Fab 단편에 연결된 항체 불변 도메인은 CD16에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 항체 Fc 도메인의 부분 (예를 들어, CD16에 결합하기에 충분한 항체 Fc 도메인의 부분)을 혼입하며, 여기서 항체 Fc 도메인은 힌지 및 CH2 도메인 (예를 들어, 인간 IgG1 항체의 힌지 및 CH2 도메인), 및/또는 인간 IgG 항체의 아미노산 서열식별번호: 234-332와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
1개 이상의 돌연변이가, 인간 IgG1 불변 영역과 비교하여, 예를 들어 Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 및/또는 K439에서 불변 영역 내로 포함될 수 있다. 예시적인 치환은 예를 들어, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I , Y407V, K409F, K409W, K409D, K409R, T411D, T411E, K439D, 및 K439E를 포함한다.
특정 실시양태에서, 인간 IgG1 불변 영역의 CH1에 도입될 수 있는 돌연변이는 아미노산 V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 및/또는 V173에 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG1 불변 영역의 Cκ 내로 포함될 수 있는 돌연변이는 아미노산 E123, F116, S176, V163, S174 및/또는 T164에 있을 수 있다.
대안적으로, 아미노산 치환은 표 3에 제시된 하기 치환 세트로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00029
대안적으로, 아미노산 치환은 표 4에 제시된 하기 치환 세트로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00030
대안적으로, 아미노산 치환은 하기 표 5에 제시된 치환 세트로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00031
대안적으로, 각각의 폴리펩티드 쇄에서 적어도 1개의 아미노산 치환은 표 6으로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00032
대안적으로, 적어도 1개의 아미노산 치환은 표 7에 나타낸 하기 치환 세트로부터 선택될 수 있으며, 제1 폴리펩티드 칼럼에서 나타낸 위치(들)는 임의의 공지된 음으로 하전된 아미노산으로 교체되고, 제2 폴리펩티드 칼럼에서 나타낸 위치(들)는 임의의 공지된 양으로 하전된 아미노산으로 교체된다.
Figure pct00033
대안적으로, 적어도 1개의 아미노산 치환은 표 8에 나타낸 하기 치환 세트로부터 선택될 수 있으며, 제1 폴리펩티드 칼럼에서 나타낸 위치(들)는 임의의 공지된 양으로 하전된 아미노산으로 교체되고, 제2 폴리펩티드 칼럼에서 나타낸 위치(들)는 임의의 공지된 음으로 하전된 아미노산으로 교체된다.
Figure pct00034
대안적으로, 아미노산 치환은 표 9의 하기 세트로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00035
대안적으로 또는 추가로, 이종다량체 단백질의 구조적 안정성은 제1 또는 제2 폴리펩티드 쇄 상에 S354C 및 반대쪽 폴리펩티드 쇄 상에 Y349C를 도입함으로써 증가될 수 있으며, 이는 2개의 폴리펩티드의 계면 내에 인공적인 디술피드 가교를 형성한다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 위치 T366에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 T366, L368 및 Y407로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 T366, L368 및 Y407로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 위치 T366에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 E357, K360, Q362, S364, L368, K370, T394, D401, F405 및 T411로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 Y349, E357, S364, L368, K370, T394, D401, F405 및 T411로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 Y349, E357, S364, L368, K370, T394, D401, F405 및 T411로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 E357, K360, Q362, S364, L368, K370, T394, D401, F405 및 T411로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 L351, D399, S400 및 Y407로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 T366, N390, K392, K409 및 T411로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 T366, N390, K392, K409 및 T411로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 L351, D399, S400 및 Y407로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 Q347, Y349, K360 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 Q347, E357, D399 및 F405로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 Q347, E357, D399 및 F405로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 Y349, K360, Q347 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 K370, K392, K409 및 K439로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 D356, E357 및 D399로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 D356, E357 및 D399로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 K370, K392, K409 및 K439로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 L351, E356, T366 및 D399로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 Y349, L351, L368, K392 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 Y349, L351, L368, K392 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 L351, E356, T366 및 D399로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 S354C 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 Y349C 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 Y349C 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 S354C 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 K360E 및 K409W 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 Q347R, D399V 및 F405T 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 Q347R, D399V 및 F405T 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 K360E 및 K409W 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 T366W 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 T366S, T368A 및 Y407V 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 T366S, T368A 및 Y407V 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 T366W 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 T350V, T366L, K392L 및 T394W 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
일부 실시양태에서, 항체 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 T350V, T366L, K392L 및 T394W 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하고, 항체 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열은 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V 치환에 의해 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열과 상이하다.
예시적인 다중-특이적 결합 단백질
각각 항체 불변 영역에 연결된 FLT3에 결합하는 항원-결합 부위 및 NKG2D에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 TriNKET의 예가 하기 열거되며, 여기서 항체 불변 영역은 2개의 Fc 쇄의 이종이량체화를 가능하게 하는 돌연변이를 포함한다. 코티아(Chothia) 하의 CDR 서열은 밑줄표시된다. F3-GB102는 F3 포맷이고, 즉 FLT3에 결합하는 항원-결합 부위는 Fab이고, NKG2D에 결합하는 항원-결합 부위는 scFv이다. 다른 TriNKET는 F3' 포맷이고, 즉, FLT3에 결합하는 항원-결합 부위는 scFv이고, NKG2D에 결합하는 항원-결합 부위는 Fab이다. 각각의 TriNKET에서, scFv는 VL의 위치 100 및 VH의 위치 44의 아미노산 잔기를 Cys로 치환하여 scFv의 VH와 VL 사이의 디술피드 가교의 형성을 용이하게 하는 것을 포함한다.
scFv의 VH 및 VL은 링커, 예를 들어 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 펩티드 링커는 가요성 링커이다. 링커의 아미노산 조성과 관련하여, 가요성을 부여하고, 본 발명의 단백질의 다른 도메인의 구조 및 기능을 방해하지 않으며, 프로테아제로부터의 절단에 저항하는 특성을 갖는 펩티드가 선택된다. 예를 들어, 글리신 및 세린 잔기는 일반적으로 프로테아제 저항성을 제공한다. 특정 실시양태에서, VL은 (GlyGlyGlyGlySer)4 ((G4S)4) 링커 (서열식별번호: 137)를 통해 VH에 N-말단 또는 C-말단 연결된다.
링커 (예를 들어, 가요성 링커)의 길이는 "짧은", 예를 들어 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아미노산 잔기, 또는 "긴", 예를 들어 적어도 13개의 아미노산 잔기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 15-20, 20-50, 20-40, 20-30 또는 20-25개의 아미노산 잔기 길이이다.
특정 실시양태에서, 링커는 (GS)n (SEQ ID NO:290), (GGS)n (서열식별번호: 291), (GGGS)n (서열식별번호: 292), (GGSG)n (서열식별번호: 293), (GGSGG)n (서열식별번호: 294), 및 (GGGGS)n (서열식별번호: 295) 서열을 포함하거나 그로 이루어지며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이다. 특정 실시양태에서, 링커는 표 10에 열거된 바와 같은 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 201, 서열식별번호: 202, 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 152, 및 서열식별번호: 154로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
Figure pct00036
F3-GB102에서, NKG2D-결합 scFv는 Ala-Ser 링커를 통해 Fc의 N-말단에 연결된다. F3'-TriNKET에서, FLT3-결합 scFv는 Gly-Ser 링커를 통해 Fc의 N-말단에 연결된다. Ala-Ser 또는 Gly-Ser 링커는 가요성과 최적 기하구조 사이의 균형을 이루도록 엘보우 힌지 영역 서열에 포함된다. 특정 실시양태에서, 추가의 서열 Thr-Lys-Gly는 힌지에서 Ala-Ser 또는 Gly-Ser 서열에 N-말단 또는 C-말단 부가될 수 있다.
이들 예시적인 TriNKET를 기재하기 위해 본원에 사용된 바와 같이, Fc는 항체 힌지, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 예시적인 TriNKET에서, scFv에 연결된 Fc 도메인은 Q347R, D399V 및 F405T의 돌연변이를 포함하고, Fab에 연결된 Fc 도메인은 이종이량체를 형성하기 위해 매칭 돌연변이 K360E 및 K409W를 포함한다. scFv에 연결된 Fc 도메인은 CH3 도메인 내에 S354C 치환을 추가로 포함하고, 이는 Fab에 연결된 Fc 상의 Y349C 치환과 디술피드 결합을 형성한다. 이들 치환은 이 하위섹션에 기재된 서열에서 굵은 글씨로 표시된다.
예를 들어, 본 개시내용의 TriNKET는 F3'-GB102이다. F3'-GB102는 (a) Fc 도메인에 연결된, GB102로부터 유래된 FLT3-결합 scFv 서열 및 (b) 중쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 부분, 및 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄 부분을 포함하는 A49MI로부터 유래된 NKG2D-결합 Fab 단편을 포함하며, 여기서 CH1 도메인은 Fc 도메인에 연결된다. F3'-GB102는 다음에 제시된 바와 같은 3개의 폴리펩티드를 포함한다.
GB102-VL-VH-Fc (서열식별번호: 277)
Figure pct00037
A49MI-VH-CH1-Fc (서열식별번호: 278)
Figure pct00038
A49MI-VL-CL (서열식별번호: 279)
Figure pct00039
GB102-VL-VH-Fc는 Gly-Ser을 포함하는 힌지를 통해 Fc 도메인에 연결된 FLT3-결합 scFv의 전체 서열을 나타낸다. scFv에 연결된 Fc 도메인은 하기 기재된 바와 같이 이종이량체화를 위한 Q347R, D399V, 및 F405T 치환, 및 A49MI-VH-CH1-Fc에서의 Y349C 치환과 디술피드 결합을 형성하기 위한 S354C 치환을 포함한다. scFv (서열식별번호: 40)는 (G4S)4 링커를 통해 GB102의 경쇄 가변 도메인의 C-말단에 연결된 GB102의 중쇄 가변 도메인을 포함한다. scFv의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 또한 각각 VL 및 VH에서의 R100C 및 G44C 치환의 결과로서 VL의 C100과 VH의 C44 사이의 디술피드 가교를 통해 연결된다.
A49MI-VH-CH1-Fc는 Fc 도메인에 연결된, NKG2D-결합 A49MI의 중쇄 가변 도메인 (서열식별번호: 254) 및 CH1 도메인을 포함하는 Fab 단편의 중쇄 부분을 나타낸다. A49MI-VH-CH1-Fc 내의 Fc 도메인은 CH3 도메인 내에 Y349C 치환을 포함하고, 이는 GB102-VL-VH-Fc 내의 Fc 상의 S354C 치환과 디술피드 결합을 형성한다. A49MI-VH-CH1-Fc에서, Fc 도메인은 또한 GB102-VL-VH-Fc에서의 Fc와의 이종이량체화를 위한 K360E 및 K409W 치환을 포함한다.
A49MI-VL-CL은 NKG2D-결합 A49MI의 경쇄 가변 도메인 (서열식별번호: 239) 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 Fab 단편의 경쇄 부분을 나타낸다.
본 개시내용의 또 다른 TriNKET는 F3-GB102이다. F3-GB102는 (a) Fc 도메인에 연결된, A49로부터 유래된 NKG2D-결합 scFv 서열 및 (b) 중쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 부분, 및 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄 부분을 포함하는 GB102로부터 유래된 FLT3-결합 Fab 단편을 포함하며, 여기서 CH1 도메인은 Fc 도메인에 연결된다. F3-GB102는 다음에 제시된 바와 같은 3개의 폴리펩티드를 포함한다.
A49-VL-VH-Fc (서열식별번호: 280)
Figure pct00040
GB102-VH-CH1-Fc (서열식별번호: 281)
Figure pct00041
Figure pct00042
GB102-VL-CL (서열식별번호: 282)
Figure pct00043
A49-VL-VH-Fc는 Ala-Ser을 포함하는 힌지를 통해 Fc 도메인에 연결된 NKG2D-결합 scFv의 전체 서열을 나타낸다. scFv에 연결된 Fc 도메인은 하기 기재된 바와 같이 이종이량체화를 위한 Q347R, D399V, 및 F405T 치환, 및 GB102-VH-CH1-Fc에서의 Y349C 치환과 디술피드 결합을 형성하기 위한 S354C 치환을 포함한다. scFv (서열식별번호: 246)는 (G4S)4 링커를 통해 A49의 경쇄 가변 도메인의 C-말단에 연결된 A49의 중쇄 가변 도메인을 포함한다. scFv의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 또한 각각 VL 및 VH에서의 Q100C 및 G44C 치환의 결과로서 VL의 C100과 VH의 C44 사이의 디술피드 가교를 통해 연결된다.
GB102-VH-CH1-Fc는 Fc 도메인에 연결된, FLT3-결합 GB102의 중쇄 가변 도메인 (서열식별번호: 37) 및 CH1 도메인을 포함하는 Fab 단편의 중쇄 부분을 나타낸다. GB102-VH-CH1-Fc 내의 Fc 도메인은 CH3 도메인 내에 Y349C 치환을 포함하고, 이는 A49-VL-VH-Fc 내의 Fc 상의 S354C 치환과 디술피드 결합을 형성한다. GB102-VH-CH1-Fc에서, Fc 도메인은 또한 A49-VL-VH-Fc에서의 Fc와의 이종이량체화를 위한 K360E 및 K409W 치환을 포함한다.
GB102-VL-CL은 FLT3-결합 GB102의 경쇄 가변 도메인 (서열식별번호: 38) 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 Fab 단편의 경쇄 부분을 나타낸다.
본 개시내용의 또 다른 TriNKET는 F3'-1553이다. F3'-1553은 (a) Fc 도메인에 연결된, mAb 1553으로부터 유래된 FLT3-결합 scFv 서열 및 (b) 중쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 부분, 및 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄 부분을 포함하는 A49MI로부터 유래된 NKG2D-결합 Fab 단편을 포함하며, 여기서 CH1 도메인은 Fc 도메인에 연결된다. F3'-1553은 3개의 폴리펩티드: 1553-VH-VL-Fc, A49MI-VH-CH1-Fc, A49MI-VL-CL을 포함한다. A49MI-VH-CH1-Fc 및 A49MI-VL-CL은 F3'-GB102와 관련하여 상기 기재되어 있다. 1553-VH-VL-Fc의 폴리펩티드는 하기에 제시된다.
1553-VH-VL-Fc (서열식별번호: 283)
Figure pct00044
1553-VH-VL-Fc는 Gly-Ser을 포함하는 힌지를 통해 Fc 도메인에 연결된 FLT3-결합 scFv의 전체 서열을 나타낸다. scFv에 연결된 Fc 도메인은 하기 기재된 바와 같이 이종이량체화를 위한 Q347R, D399V, 및 F405T 치환, 및 A49MI-VH-CH1-Fc에서의 Y349C 치환과 디술피드 결합을 형성하기 위한 S354C 치환을 포함한다. scFv (서열식별번호: 74)는 (G4S)4 링커를 통해 1553의 경쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 1553의 중쇄 가변 도메인을 포함한다. scFv의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 또한 각각 VL 및 VH에서의 G100C 및 G44C 치환의 결과로서 VL의 C100과 VH의 C44 사이의 디술피드 가교를 통해 연결된다.
본 개시내용의 또 다른 TriNKET는 F3'-1689이다. F3'-1689는 (a) Fc 도메인에 연결된, mAb 1689로부터 유래된 FLT3-결합 scFv 서열 및 (b) 중쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 부분, 및 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄 부분을 포함하는 A49MI로부터 유래된 NKG2D-결합 Fab 단편을 포함하며, 여기서 CH1 도메인은 Fc 도메인에 연결된다. F3'-1689는 3개의 폴리펩티드를 포함한다: 1689-VH-VL-Fc, A49MI-VH-CH1-Fc, A49MI-VL-CL. A49MI-VH-CH1-Fc 및 A49MI-VL-CL은 F3'-GB102와 관련하여 상기 기재되어 있다. 1689-VH-VL-Fc의 폴리펩티드는 하기에 제시된다.
1689-VH-VL-Fc (서열식별번호: 284)
Figure pct00045
Figure pct00046
1689-VH-VL-Fc는 Gly-Ser을 포함하는 힌지를 통해 Fc 도메인에 연결된 FLT3-결합 scFv의 전체 서열을 나타낸다. scFv에 연결된 Fc 도메인은 하기 기재된 바와 같이 이종이량체화를 위한 Q347R, D399V, 및 F405T 치환, 및 A49MI-VH-CH1-Fc에서의 Y349C 치환과 디술피드 결합을 형성하기 위한 S354C 치환을 포함한다. scFv (서열식별번호: 81)는 FLT3에 대한 결합 친화도를 잠재적으로 증가시키는, 1553-VH-VL-Fc 내의 scFv에 대한 돌연변이의 세트를 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 TriNKET는 F3'-GB102_M34I이다. F3'-GB102_M34I는 (a) Fc 도메인에 연결된, GB102 M34I로부터 유래된 FLT3-결합 scFv 서열 및 (b) 중쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 부분, 및 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄 부분을 포함하는 A49MI로부터 유래된 NKG2D-결합 Fab 단편을 포함하며, 여기서 CH1 도메인은 Fc 도메인에 연결된다. F3'-GB102_M34I는 3개의 폴리펩티드를 포함한다: GB102_M34I-VL-VH-Fc, A49MI-VH-CH1-Fc, A49MI-VL-CL. A49MI-VH-CH1-Fc 및 A49MI-VL-CL은 F3'-GB102와 관련하여 상기 기재되어 있다. GB102_M34I-VL-VH-Fc의 폴리펩티드는 하기에 제시된다.
GB102_M34I-VL-VH-Fc (서열식별번호: 285)
Figure pct00047
GB102_M34I-VL-VH-Fc는 Gly-Ser을 포함하는 힌지를 통해 Fc 도메인에 연결된 FLT3-결합 scFv의 전체 서열을 나타낸다. scFv에 연결된 Fc 도메인은 하기 기재된 바와 같이 이종이량체화를 위한 Q347R, D399V, 및 F405T 치환, 및 A49MI-VH-CH1-Fc에서의 Y349C 치환과 디술피드 결합을 형성하기 위한 S354C 치환을 포함한다. scFv (서열식별번호: 48)는 추정 서열 문제를 제거하기 위해 GB102-VL-VH-Fc 내의 VH에 대해 M34I 치환을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 TriNKET는 F3'-GB102_D101E이다. F3'-GB102_D101E는 (a) Fc 도메인에 연결된, GB102 D101E로부터 유래된 FLT3-결합 scFv 서열 및 (b) 중쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 부분, 및 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄 부분을 포함하는 A49MI로부터 유래된 NKG2D-결합 Fab 단편을 포함하며, 여기서 CH1 도메인은 Fc 도메인에 연결된다. F3'-GB102_D101E는 3개의 폴리펩티드를 포함한다: GB102_D101E-VL-VH-Fc, A49MI-VH-CH1-Fc, A49MI-VL-CL. A49MI-VH-CH1-Fc 및 A49MI-VL-CL은 F3'-GB102와 관련하여 상기 기재되어 있다. GB102_D101E-VL-VH-Fc의 폴리펩티드는 하기에 제시된다.
GB102_D101E-VL-VH-Fc (서열식별번호: 286)
Figure pct00048
GB102_D101E-VL-VH-Fc는 Gly-Ser을 포함하는 힌지를 통해 Fc 도메인에 연결된 FLT3-결합 scFv의 전체 서열을 나타낸다. scFv에 연결된 Fc 도메인은 하기 기재된 바와 같이 이종이량체화를 위한 Q347R, D399V, 및 F405T 치환, 및 A49MI-VH-CH1-Fc에서의 Y349C 치환과 디술피드 결합을 형성하기 위한 S354C 치환을 포함한다. scFv (서열식별번호: 44)는 추정 서열 문제를 제거하기 위해 GB102-VL-VH-Fc 내의 VH에 대해 D101E 치환을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 TriNKET는 F3'-GB102_M34I_D101E이다. F3'-GB102_M34I_D101E는 (a) Fc 도메인에 연결된, GB102 M34I/D101E로부터 유래된 FLT3-결합 scFv 서열 및 (b) 중쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 부분, 및 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄 부분을 포함하는 A49MI로부터 유래된 NKG2D-결합 Fab 단편을 포함하며, 여기서 CH1 도메인은 Fc 도메인에 연결된다. F3'-GB102_M34I_D101E는 3개의 폴리펩티드를 포함한다: GB102_M34I_D101E-VL-VH-Fc, A49MI-VH-CH1-Fc, A49MI-VL-CL. A49MI-VH-CH1-Fc 및 A49MI-VL-CL은 F3'-GB102와 관련하여 상기 기재되어 있다. GB102_M34I_D101E-VL-VH-Fc의 폴리펩티드는 하기에 제시된다.
GB102_M34I_D101E-VL-VH-Fc (서열식별번호: 287)
Figure pct00049
GB102_M34I_D101E-VL-VH-Fc는 Gly-Ser을 포함하는 힌지를 통해 Fc 도메인에 연결된 FLT3-결합 scFv의 전체 서열을 나타낸다. scFv에 연결된 Fc 도메인은 하기 기재된 바와 같이 이종이량체화를 위한 Q347R, D399V, 및 F405T 치환, 및 A49MI-VH-CH1-Fc에서의 Y349C 치환과 디술피드 결합을 형성하기 위한 S354C 치환을 포함한다. scFv (서열식별번호: 52)는 추정 서열 문제를 제거하기 위해 GB102-VL-VH-Fc 내의 VH에 대해 M34I 및 D101E 치환을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 TriNKET는 F3'-GB99이다. F3'-GB99는 (a) Fc 도메인에 연결된, GB99로부터 유래된 FLT3-결합 scFv 서열 및 (b) 중쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 부분, 및 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄 부분을 포함하는 A49MI로부터 유래된 NKG2D-결합 Fab 단편을 포함하며, 여기서 CH1 도메인은 Fc 도메인에 연결된다. F3'-GB99는 3개의 폴리펩티드: GB99-VL-VH-Fc, A49MI-VH-CH1-Fc, A49MI-VL-CL을 포함한다. A49MI-VH-CH1-Fc 및 A49MI-VL-CL은 F3'-GB102와 관련하여 상기 기재되어 있다. GB99-VL-VH-Fc의 폴리펩티드가 하기에 기재된다.
GB99-VL-VH-Fc (서열식별번호: 288)
Figure pct00050
GB99-VL-VH-Fc는 Gly-Ser을 포함하는 힌지를 통해 Fc 도메인에 연결된 FLT3-결합 scFv의 전체 서열을 나타낸다. scFv에 연결된 Fc 도메인은 하기 기재된 바와 같이 이종이량체화를 위한 Q347R, D399V, 및 F405T 치환, 및 A49MI-VH-CH1-Fc에서의 Y349C 치환과 디술피드 결합을 형성하기 위한 S354C 치환을 포함한다. scFv (서열식별번호: 28)는 항체 구조 및 활성을 잠재적으로 개선하기 위해 GB102-VL-VH-Fc 내의 scFv에 대해 프레임워크 영역 내에 복귀 돌연변이의 세트를 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 TriNKET는 F3'-GB89이다. F3'-GB89는 (a) Fc 도메인에 연결된, GB89로부터 유래된 FLT3-결합 scFv 서열 및 (b) 중쇄 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 부분, 및 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄 부분을 포함하는 A49MI로부터 유래된 NKG2D-결합 Fab 단편을 포함하며, 여기서 CH1 도메인은 Fc 도메인에 연결된다. F3'-GB89는 3개의 폴리펩티드: GB89-VH-VL-Fc, A49MI-VH-CH1-Fc, A49MI-VL-CL을 포함한다. A49MI-VH-CH1-Fc 및 A49MI-VL-CL은 F3'-GB102와 관련하여 상기 기재되어 있다. GB89-VH-VL-Fc의 폴리펩티드는 하기에 제시된다.
GB89-VH-VL-Fc (서열식별번호: 289)
Figure pct00051
Figure pct00052
GB89-VH-VL-Fc는 Gly-Ser을 포함하는 힌지를 통해 Fc 도메인에 연결된 FLT3-결합 scFv의 전체 서열을 나타낸다. scFv에 연결된 Fc 도메인은 하기 기재된 바와 같이 이종이량체화를 위한 Q347R, D399V, 및 F405T 치환, 및 A49MI-VH-CH1-Fc에서의 Y349C 치환과 디술피드 결합을 형성하기 위한 S354C 치환을 포함한다. scFv (서열식별번호: 19)는 (G4S)4 링커를 통해 GB89의 경쇄 가변 도메인의 N-말단에 연결된 GB89의 중쇄 가변 도메인을 포함한다. scFv의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 또한 각각 VL 및 VH에서의 R100C 및 G44C 치환의 결과로서 VL의 C100과 VH의 C44 사이의 디술피드 가교를 통해 연결된다. scFv는 또한 항체 구조 및 활성을 잠재적으로 개선하기 위해 GB102-VL-VH-Fc의 VH 및 VL에 대해 프레임워크 영역 내에 일련의 복귀 돌연변이를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TriNKET는, NKG2D-결합 Fab 단편에 연결된, Fc 도메인이 Q347R, D399V 및 F405T의 치환을 포함하고, HER2-결합 scFv에 연결된 Fc 도메인이 이종이량체를 형성하기 위한 매칭되는 치환 K360E 및 K409W를 포함하는 것을 제외하고는, EW-RVT Fc 돌연변이를 포함하는 상기 기재된 예시적인 TriNKET 중 하나와 동일하다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TriNKET는, NKG2D-결합 Fab 단편에 연결된 Fc 도메인이 T366S, L368A 및 Y407V의 "홀" 치환을 포함하고, HER2-결합 scFv에 연결된 Fc 도메인이 이종이량체를 형성하기 위한 T366W의 "노브" 치환을 포함하는 것을 제외하고는, KiH Fc 돌연변이를 포함하는 상기 기재된 예시적인 TriNKET 중 하나와 동일하다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 TriNKET는, NKG2D-결합 Fab 단편에 연결된, Fc 도메인이 CH3 도메인에 S354C 치환을 포함하고, HER2-결합 scFv에 연결된 Fc 도메인이 디술피드 결합을 형성하기 위한 CH3 도메인 내의 매칭되는 Y349C 치환을 포함하는 것을 제외하고는, 상기 기재된 예시적인 TriNKET 중 하나와 동일하다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 단백질의 생산 및/또는 저장 동안, N-말단 글루타메이트 (E) 또는 글루타민 (Q)이 환화되어 락탐을 형성할 수 있음 (예를 들어, 자발적으로 또는 생산 및/또는 저장 동안 존재하는 효소에 의해 촉매됨)을 인정할 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서 폴리펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 잔기가 E 또는 Q인 경우, E 또는 Q가 피로글루타메이트로 대체된 상응하는 아미노산 서열이 또한 본원에서 고려된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 단백질 생산 및/또는 저장 동안, 단백질의 C-말단 리신 (K)이 제거될 수 있음 (예를 들어, 자발적으로 또는 생산 및/또는 저장 동안 존재하는 효소에 의해 촉매됨)을 인지할 것이다. 이러한 K의 제거는 종종 Fc 도메인을 포함하는 단백질에서 그의 C-말단에서 관찰된다. 따라서, 폴리펩티드의 아미노산 서열 (예를 들어, Fc 도메인 서열)의 C-말단 잔기가 K인 일부 실시양태에서, K가 제거된 상응하는 아미노산 서열이 또한 본원에서 고려된다.
상기 기재된 다중-특이적 단백질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 제1 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 제1 핵산 서열을 제1 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있고; 제2 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 제2 핵산 서열을 제2 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있고; 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 서열을 제3 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있고; 제1, 제2 및 제3 발현 벡터를 함께 숙주 세포 내로 안정하게 형질감염시켜 다량체 단백질을 생산할 수 있다.
다중-특이적 단백질의 최고 수율을 달성하기 위해, 제1, 제2 및 제3 발현 벡터의 상이한 비를 탐색하여 숙주 세포 내로의 형질감염을 위한 최적의 비를 결정할 수 있다. 형질감염 후, 단일 클론을 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 제한된 희석, ELISA, FACS, 현미경검사, 또는 클론픽스(Clonepix)를 사용하여 세포 뱅크 생성을 위해 단리할 수 있다.
클론을 생물-반응기 규모-확대에 적합한 조건 하에 배양하고, 다중-특이적 단백질의 발현을 유지할 수 있다. 다중-특이적 단백질을 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 원심분리, 심층 여과, 세포 용해, 균질화, 동결-해동, 친화도 정제, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 교환 크로마토그래피 및 혼합-모드 크로마토그래피를 사용하여 단리하고 정제할 수 있다.
II. 다중-특이적 단백질의 특징
본원에 기재된 다중-특이적 단백질은 NKG2D-결합 부위, FLT3에 결합하는 FLT3-결합 부위, 및 CD16에 결합하기에 충분한 항체 Fc 도메인 또는 그의 부분, 또는 CD16에 결합하는 항원-결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중-특이적 단백질은 F4-TriNKET 포맷에 예시된 바와 같이 FLT3에 결합하는 추가의 항원-결합 부위를 함유한다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 단백질은 상응하는 모노클로날 항체, 즉 다중-특이적 단백질에 혼입된 것과 동일한 FLT3-결합 부위를 함유하는 모노클로날 항체와 유사한 열 안정성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 단백질은 NKG2D 및/또는 CD16을 발현하는 세포, 예컨대 NK 세포, 및 FLT3을 발현하는 세포, 예컨대 특정 종양 세포에 동시에 결합한다. 다중-특이적 단백질의 NK 세포에 대한 결합은 FLT3-발현 종양 세포의 파괴에 대한 NK 세포의 활성을 증진시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 단백질은 상응하는 항-FLT3 모노클로날 항체 (즉, 다중-특이적 단백질에 혼입된 것과 동일한 FLT3-결합 부위를 함유하는 모노클로날 항체)와 유사한 친화도로 FLT3에 결합한다. 일부 실시양태에서, 다중-특이적 단백질은 상응하는 모노클로날 항체보다 FLT3을 발현하는 종양 세포를 사멸시키는데 더 효과적이다.
특정 실시양태에서, FLT3에 대한 결합 부위를 포함하는 본원에 기재된 다중-특이적 단백질은 FLT3을 발현하는 세포와 공동-배양할 때 1차 인간 NK 세포를 활성화시킨다. NK 세포 활성화는 CD107a 탈과립화 및 IFN-γ 시토카인 생산의 증가에 의해 표시된다. 또한, 상응하는 항-FLT3 모노클로날 항체와 비교하여, 다중-특이적 단백질은 FLT3을 발현하는 세포의 존재 하에 인간 NK 세포의 우수한 활성화를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, FLT3에 대한 결합 부위를 포함하는 본원에 기재된 다중-특이적 단백질은 FLT3을 발현하는 세포와 공동-배양할 때 휴지시킨 및 IL-2-활성화된 인간 NK 세포의 활성을 증진시킨다.
일부 실시양태에서, FLT3에 결합하는 상응하는 모노클로날 항체와 비교하여, 다중-특이적 단백질은 중간 및 낮은 수준의 FLT3을 발현하는 종양 세포를 표적화하는데 있어서 이점을 제공한다.
일부 실시양태에서, TriNKET의 2가 F4 포맷 (즉, TriNKET는 FLT3에 결합하는 추가의 항원-결합 부위를 포함함)은 TriNKET가 FLT3에 결합하는 결합력을 개선시키고, 이는 사실상 종양 세포의 표면 상에서 높은 수준의 FLT3의 발현 및 유지를 안정화시킨다. 일부 실시양태에서, F4-TriNKET는 상응하는 F3-TriNKET 또는 F3'-TriNKET보다 종양 세포를 보다 강력하게 사멸시키도록 매개한다.
III. 치료 용도
본 발명은 본원에 기재된 다중-특이적 결합 단백질 및/또는 본원에 기재된 제약 조성물을 사용하여 자가면역 질환 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 FLT3을 발현하는 다양한 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
치료 방법은 치료될 암에 따라 특징화될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 암은 혈액 악성종양 또는 백혈병이다. 특정 실시양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 골수이형성증, 골수이형성 증후군, 급성 T-림프모구성 백혈병, 또는 급성 전골수구성 백혈병, 만성 골수단핵구성 백혈병, 또는 만성 골수성 백혈병의 골수성 모구성 발증이다.
FLT3 표적화 다중-특이적 결합 단백질에 의해 치료되는 다른 예시적인 암은 유방암, 난소암, 식도암, 방광암 또는 위암, 타액관 암종, 타액관 암종, 폐의 선암종 또는 자궁암의 공격성 형태, 예컨대 자궁 장액성 자궁내막 암종을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 암은 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 백혈병, 폐암, 간암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 직장암, 신암, 위암, 고환암 또는 자궁암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 편평 세포 암종, 선암종, 소세포 암종, 흑색종, 신경모세포종, 육종 (예를 들어, 혈관육종 또는 연골육종), 후두암, 이하선암, 담도암, 갑상선암, 말단 흑자 흑색종, 광선 각화증, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 선양 낭성 암종, 선종, 선육종, 선편평상피 암종, 항문관암, 항문암, 항문직장암, 성상세포 종양, 바르톨린선 암종, 기저 세포 암종, 담도암, 골암, 골수암, 기관지암, 기관지선 암종, 카르시노이드, 담관암종, 연골육종, 맥락총 유두종/암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 투명 세포 암종, 결합 조직 암, 낭선종, 소화기계암, 십이지장암, 내분비계암, 내배엽동 종양, 자궁내막 증식증, 자궁내막 기질 육종, 자궁내막양 선암종, 내피 세포 암, 상의 세포 암, 상피 세포 암, 유잉 육종, 안구 및 안과 암, 여성 생식기 암, 초점성 결절성 증식증, 담낭암, 위 유문동 암, 위 안저 암, 가스트린종, 교모세포종, 글루카곤종, 심장암, 혈관모세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간 선종, 간 선종증, 간담도암, 간세포성 암종, 호지킨병, 회장암, 인슐린종, 상피내 신생물, 상피간 편평 세포 신생물, 간내 담관암, 침습성 편평 세포 암종, 공장암, 관절암, 카포시 육종, 골반암, 대세포 암종, 대장암, 평활근육종, 악성 흑자 흑색종, 림프종, 남성 생식기 암, 악성 흑색종, 악성 중피 종양, 수모세포종, 수질상피종, 수막암, 중피암, 전이성 암종, 구강암, 점액표피양 암종, 다발성 골수종, 근육암, 비도암, 신경계암, 신경상피 선암종 결절성 흑색종, 비-상피 피부암, 비-호지킨 림프종, 귀리 세포 암종, 핍지교세포암, 구강암, 골육종, 유두상 장액성 선암종, 음경암, 인두암, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 거짓육종, 폐 모세포종, 직장암, 신세포 암종, 호흡기계암, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 장액성 암종, 부비동암, 피부암, 소세포 암종, 소장암, 평활근암, 연부조직암, 소마토스타틴-분비 종양, 척추암, 편평 세포 암종, 가로무늬근암, 중피하암, 표재 확산성 흑색종, T 세포 백혈병, 설암, 미분화 암종, 요관암, 요도암, 방광암, 비뇨기계암, 자궁경부암, 자궁체부암, 포도막 흑색종, 질암, 사마귀양 암종, VIP종, 외음부암, 잘-분화된 암종, 또는 윌름스 종양이다.
일부 다른 실시양태에서, 치료될 암은 비-호지킨 림프종, 예컨대 B-세포 림프종 또는 T-세포 림프종이다. 특정 실시양태에서, 비-호지킨 림프종은 B-세포 림프종, 예컨대 미만성 대 B-세포 림프종, 원발성 종격 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 소림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 B-세포 림프종, 결절외 변연부 B-세포 림프종, 결절성 변연부 B-세포 림프종, 비장 변연부 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 림프형질세포성 림프종, 모발상 세포 백혈병 또는 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종이다. 특정의 다른 실시양태에서, 비-호지킨 림프종은 T-세포 림프종, 예컨대 전구체 T-림프모구성 림프종, 말초 T-세포 림프종, 피부 T-세포 림프종, 혈관면역모세포성 T-세포 림프종, 결절외 자연 킬러/T-세포 림프종, 장병증 유형 T-세포 림프종, 피하 지방층염-유사 T-세포 림프종, 역형성 대세포 림프종, 또는 말초 T-세포 림프종이다.
IV. 조합 요법
본 발명의 또 다른 측면은 조합 요법을 제공한다. 본원에 기재된 다중-특이적 결합 단백질은 자가면역 질환을 치료하거나 암을 치료하기 위해 추가의 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.
자가면역 염증성 질환을 치료하는데 조합 요법의 일부로서 사용될 수 있는 예시적인 치료제는 문헌 [Li et al. (2017) Front. Pharmacol., 8:460]에 기재되어 있고, 예를 들어 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID) (예를 들어, COX-2 억제제), 글루코코르티코이드 (예를 들어, 프레드니손/프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 및 플루오린화 글루코코르티코이드, 예컨대 덱사메타손 및 베타메타손), 질환-변형 항류마티스 약물 (DMARD) (예를 들어, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 금 화합물, 술파살라진, 아자티오프린, 시클로포스파미드, 항말라리아제, D-페니실라민 및 시클로스포린), 항-TNF 생물제제 (예를 들어, 인플릭시맙, 에타네르셉트, 아달리무맙, 골리무맙, 세르톨리주맙 페골 및 그의 바이오시밀러), 및 CTLA-4를 표적화하는 다른 생물제제 (예를 들어, 아바타셉트), IL-6 수용체 (예를 들어, 토실리주맙), IL-1 (예를 들어, 아나킨라), Th1 면역 반응 (IL-12/IL-23) (예를 들어, 우스테키누맙), Th17 면역 반응 (IL-17) (예를 들어, 세쿠키누맙) 및 CD20 (예를 들어, 리툭시맙)을 포함한다.
암 치료에서 조합 요법의 일부로서 사용될 수 있는 예시적인 치료제에는 예를 들어 방사선, 미토마이신, 트레티노인, 리보무스틴, 겜시타빈, 빈크리스틴, 에토포시드, 클라드리빈, 미토브로니톨, 메토트렉세이트, 독소루비신, 카르보쿠온, 펜토스타틴, 니트라크린, 지노스타틴, 세트로렉릭스, 레트로졸, 랄티트렉세드, 다우노루비신, 파드로졸, 포테무스틴, 티말파신, 소부족산, 네다플라틴, 시타라빈, 비칼루타미드, 비노렐빈, 베스나리논, 아미노글루테티미드, 암사크린, 프로글루미드, 엘리프티늄 아세테이트, 케탄세린, 독시플루리딘, 에트레티네이트, 이소트레티노인, 스트렙토조신, 니무스틴, 빈데신, 플루타미드, 드로게닐, 부토신, 카르모푸르, 라족산, 시조필란, 카르보플라틴, 미토락톨, 테가푸르, 이포스파미드, 프레드니무스틴, 피시바닐, 레바미솔, 테니포시드, 임프로술판, 에노시타빈, 리수리드, 옥시메톨론, 타목시펜, 프로게스테론, 메피티오스탄, 에피티오스타놀, 포르메스탄, 인터페론-알파, 인터페론-2 알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마 (IFN-γ), 콜로니 자극 인자-1, 콜로니 자극 인자-2, 데니류킨 디프티톡스, 인터류킨-2, 루테인화 호르몬 방출 인자, 및 그의 동족 수용체에 대한 차별적인 결합, 또는 증가된 또는 감소된 혈청 반감기를 나타낼 수 있는 상기 언급된 작용제의 변형체가 포함된다.
암 치료에서 조합 요법의 일부로서 사용될 수 있는 추가의 부류의 작용제는 면역 체크포인트 억제제이다. 예시적인 면역 체크포인트 억제제는 (i) 세포독성 T 림프구-연관 항원 4 (CTLA4), (ii) 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG3, (v) B7-H3, (vi) B7-H4 및 (vii) TIM3 중 1종 이상을 억제하는 작용제를 포함한다. CTLA4 억제제 이필리무맙은 흑색종의 치료를 위한 것으로 미국 식품 의약품국에 의해 승인되었다.
암 치료에서 조합 요법의 일부로서 사용될 수 있는 또 다른 작용제는 비-체크포인트 표적을 표적화하는 모노클로날 항체 작용제 (예를 들어, 헤르셉틴) 및 비-세포독성제 (예를 들어, 티로신-키나제 억제제)이다.
또 다른 카테고리의 항암제는, 예를 들어 (i) ALK 억제제, ATR 억제제, A2A 길항제, 염기 절제 복구 억제제, Bcr-Abl 티로신 키나제 억제제, 브루톤 티로신 키나제 억제제, CDC7 억제제, CHK1 억제제, 시클린-의존성 키나제 억제제, DNA-PK 억제제, DNA-PK 및 mTOR 둘 다의 억제제, DNMT1 억제제, DNMT1 억제제 플러스 2-클로로-데옥시아데노신, HDAC 억제제, 헤지호그 신호전달 경로 억제제, IDO 억제제, JAK 억제제, mTOR 억제제, MEK 억제제, MELK 억제제, MTH1 억제제, PARP 억제제, 포스포이노시티드 3-키나제 억제제, PARP1 및 DHODH 둘 다의 억제제, 프로테아솜 억제제, 토포이소머라제-II 억제제, 티로신 키나제 억제제, VEGFR 억제제 및 WEE1 억제제로부터 선택된 억제제; (ii) OX40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 또는 ICOS의 효능제; 및 (iii) IL-12, IL-15, GM-CSF 및 G-CSF로부터 선택된 시토카인을 포함한다.
본 발명의 단백질은 또한 원발성 병변의 외과적 제거에 대한 부가법으로서 사용될 수 있다.
다중-특이적 결합 단백질 및 추가의 치료제의 양 및 상대적 투여 시기는 목적하는 조합된 치료 효과를 달성하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어 그러한 투여를 필요로 하는 환자에게 조합 요법을 투여시, 조합된 치료제, 또는 치료제를 포함하는 제약 조성물 또는 조성물들은 임의의 순서로, 예를 들어 순차적으로, 공동으로, 함께, 동시에 등으로 투여될 수 있다. 추가로, 예를 들어 다중-특이적 결합 단백질은 추가의 치료제(들)가 그의 예방적 또는 치료적 효과를 발휘하는 시간 동안에 투여될 수 있거나 또는 그 반대의 경우일 수 있다.
V. 제약 조성물
본 개시내용은 또한 치료 유효량의 본원에 기재된 단백질을 함유하는 제약 조성물을 특색으로 한다. 이러한 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기 위해 제제될 수 있다. 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 부형제 또는 담체가 적절한 제제를 위해 조성물 내에 또한 포함될 수 있다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985]에서 확인된다. 약물 전달 방법의 간략한 리뷰를 위해, 예를 들어, 문헌 [Langer (Science 249:1527-1533, 1990)]을 참조한다.
본 개시내용의 정맥내 약물 전달 제제는 백, 펜, 또는 시린지에 함유될 수 있다. 특정 실시양태에서, 백은 튜브 및/또는 바늘을 포함하는 채널에 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 동결건조 제제 또는 액체 제제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 동결-건조되고 (동결건조되고), 약 12-60개의 바이알에 함유될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 동결-건조될 수 있고, 45 mg의 동결-건조 제제는 1개의 바이알에 함유될 수 있다. 특정 실시양태에서, 약 40 mg 내지 약 100 mg의 동결-건조 제제는 1개의 바이알에 함유될 수 있다. 특정 실시양태에서, 12, 27, 또는 45개의 바이알로부터의 동결-건조 제제는 조합되어 정맥내 약물 제제 중 단백질의 치료 용량을 얻을 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 액체 제제이고, 약 250 mg/바이알 내지 약 1000 mg/바이알로서 저장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 액체 제제이고, 약 600 mg/바이알로서 저장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 액체 제제이고, 약 250 mg/바이알로서 저장될 수 있다.
단백질은 제제를 형성하는 완충 용액 중 치료 유효량의 단백질을 포함하는 액체 수성 제약 제제로 존재할 수 있다.
이러한 조성물은 통상의 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나 또는 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용되도록 포장될 수 있거나, 또는 동결건조될 수 있고, 동결건조 제제는 투여 전에 멸균 수성 담체와 조합된다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 더욱 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5일 것이다. 고체 형태의 생성된 조성물은 각각 고정된 양의 상기-언급된 작용제 또는 작용제들을 함유하는 다중 단일 용량 단위에 패키징될 수 있다. 고체 형태의 조성물은 또한 유연한 양을 위한 용기에 패키징될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 단백질을 만니톨, 시트르산 1수화물, 시트르산나트륨, 인산이나트륨 2수화물, 인산이수소나트륨 2수화물, 염화나트륨, 폴리소르베이트 80, 물 및 수산화나트륨과 조합하여 포함하는, 연장된 보관 수명을 갖는 제제를 제공한다.
특정 실시양태에서, pH-완충 용액 중에 본 개시내용의 단백질을 포함하는 수성 제제가 제조된다. 본 발명의 완충제는 약 4 내지 약 8, 예를 들어, 약 4.5 내지 약 6.0, 또는 약 4.8 내지 약 5.5 범위의 pH를 가질 수 있거나, 약 5.0 내지 약 5.2의 pH를 가질 수 있다. 상기 열거된 pH의 중간 범위가 또한 본 개시내용의 일부인 것으로 의도된다. 예를 들어, 상한치 및/또는 하한치로서 상기 열거된 임의의 값의 조합을 사용하는 값의 범위가 포함되도록 의도된다. pH를 이 범위 내에서 제어할 완충제의 예는 아세테이트 (예를 들어, 아세트산나트륨), 숙시네이트 (예컨대 숙신산나트륨), 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 다른 유기 산 완충제를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제제는 약 4 내지 약 8 범위의 pH를 유지하기 위해 시트레이트 및 포스페이트를 함유하는 완충제 시스템을 포함한다. 특정 실시양태에서 pH 범위는 약 4.5 내지 약 6.0, 또는 약 pH 4.8 내지 약 5.5, 또는 약 5.0 내지 약 5.2의 pH 범위일 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충제 시스템은 시트르산 1수화물, 시트르산나트륨, 인산이나트륨 2수화물, 및/또는 인산이수소나트륨 2수화물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제 시스템은 약 1.3 mg/mL의 시트르산 (예를 들어, 1.305 mg/mL), 약 0.3 mg/mL의 시트르산나트륨 (예를 들어, 0.305 mg/mL), 약 1.5 mg/mL의 인산이나트륨 2수화물 (예를 들어, 1.53 mg/mL), 약 0.9 mg/mL의 인산이수소나트륨 2수화물 (예를 들어, 0.86 mg/mL), 및 약 6.2 mg/mL의 염화나트륨 (예를 들어, 6.165 mg/mL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제 시스템은 약 1 내지 약 1.5 mg/mL의 시트르산, 약 0.25 내지 약 0.5 mg/mL의 시트르산나트륨, 약 1.25 내지 약 1.75 mg/mL의 인산이나트륨 2수화물, 약 0.7 내지 약 1.1 mg/mL의 인산이수소나트륨 2수화물, 및 약 6.0 내지 약 6.4 mg/mL의 염화나트륨을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제의 pH는 수산화나트륨으로 조정된다.
장성개질제로서 작용하고, 항체를 안정화시킬 수 있는 폴리올이 또한 제제에 포함될 수 있다. 폴리올은 제제의 요구되는 등장성에 관하여 변경될 수 있는 양으로 제제에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 수성 제제는 등장성일 수 있다. 첨가되는 폴리올의 양은 또한 폴리올의 분자량에 관하여 변경될 수 있다. 예를 들어, 이당류 (예컨대 트레할로스)에 비해 보다 적은 양의 모노사카라이드 (예를 들어, 만니톨)가 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 장성 작용제로서 제제에 사용될 수 있는 폴리올은 만니톨이다. 특정 실시양태에서, 만니톨 농도는 약 5 내지 약 20 mg/mL일 수 있다. 특정 실시양태에서, 만니톨의 농도는 약 7.5 내지 약 15 mg/mL일 수 있다. 특정 실시양태에서, 만니톨의 농도는 약 10 내지 약 14 mg/mL일 수 있다. 특정 실시양태에서, 만니톨의 농도는 약 12 mg/mL일 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리올 소르비톨이 제제에 포함될 수 있다.
세정제 또는 계면활성제가 또한 제제에 첨가될 수 있다. 예시적인 세제는 비이온성 세제, 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188)를 포함한다. 첨가되는 세제의 양은 그것이 제제화된 항체의 응집을 감소시키고/거나, 제제에서 미립자의 형성을 최소화하고/거나, 흡착을 감소시키도록 하는 양이다. 특정 실시양태에서, 제제는 폴리소르베이트인 계면활성제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 세정제 폴리소르베이트 80 또는 트윈(Tween) 80을 함유할 수 있다. 트윈(Tween) 80은 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄모노올레에이트를 기재하는데 사용되는 용어이다 (문헌 [Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th ed., 1996] 참조). 특정 실시양태에서, 제제는 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 0.5 mg/mL 내지 약 5 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 약 0.1% 폴리소르베이트 80이 제제에 첨가될 수 있다.
실시양태에서, 본 개시내용의 단백질 생성물은 액체 제제로서 제제화된다. 액체 제제는 고무 마개로 밀폐되고 알루미늄 크림프 밀봉 마개로 밀봉된 USP / Ph Eur 유형 I 50R 바이알 내에 10 mg/mL 농도로 제시될 수 있다. 스토퍼는 USP 및 Ph Eur에 따른 엘라스토머로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 바이알은 60 mL의 추출가능한 부피를 허용하기 위해 61.2 mL의 단백질 생성물 용액으로 충전될 수 있다. 특정 실시양태에서, 액체 제제는 0.9% 염수 용액으로 희석될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 액체 제제는 안정화 수준으로 당과 조합되어 10 mg/mL 농도 용액으로서 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서 액체 제제는 수성 담체 중에 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 안정화제는 정맥내 투여에 바람직하지 않거나 적합하지 않은 점도를 발생시킬 수 있는 양 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 당은 디사카라이드, 예를 들어 수크로스일 수 있다. 특정 실시양태에서, 액체 제제는 또한 완충제, 계면활성제, 및 보존제 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 액체 제제의 pH는 제약상 허용되는 산 및/또는 염기의 첨가에 의해 설정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약상 허용되는 산은 염산일 수 있다. 특정 실시양태에서, 염기는 수산화나트륨일 수 있다.
응집 이외에도, 탈아미드화는 발효, 수거/세포 정화, 정제, 약물 물질/약물 생성물 저장 동안 및 샘플 분석 동안 발생할 수 있는 펩티드 및 단백질의 통상적인 생성물 변이체이다. 탈아미드화는 가수분해를 겪을 수 있는 숙신이미드 중간체를 형성하는 단백질로부터의 NH3의 손실이다. 숙신이미드 중간체는 모 펩티드의 17 달톤 질량 감소를 발생시킨다. 후속 가수분해는 18 달톤 질량 증가를 발생시킨다. 숙신이미드 중간체의 단리는 수성 조건 하에서의 불안정성으로 인해 어렵다. 따라서, 탈아미드화는 전형적으로 1 달톤 질량 증가로서 검출가능하다. 아스파라긴의 탈아미드화는 아스파르트산 또는 이소아스파르트산 중 어느 하나를 생성한다. 탈아미드화의 속도에 영향을 미치는 파라미터는 pH, 온도, 용매 유전 상수, 이온 강도, 1차 서열, 국소 폴리펩티드 입체형태 및 3차 구조를 포함한다. 펩티드 쇄에서 Asn에 인접한 아미노산 잔기는 탈아미드화 속도에 영향을 미친다. 단백질 서열 내 Asn 다음의 Gly 및 Ser은 탈아미드화에 보다 높은 감수성을 유발한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 액체 제제는 단백질 생성물의 탈아미노화를 방지하기 위한 pH 및 습도의 조건 하에서 보존될 수 있다.
본원에서 관심의 수성 담체는 제약상 허용되고 (인간에의 투여를 위해 안전하고 비-독성임), 액체 제제의 제조에 유용한 것이다. 예시적인 담체는 멸균 주사용수 (SWFI), 정박테리아 주사용수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어, 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.
보존제는 박테리아 작용을 감소시키기 위해 본원의 제제에 임의로 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는, 예를 들어 다중-용도 (다중-용량) 제제의 생산을 용이하게 할 수 있다.
정맥내 (IV) 제제는 특정한 경우, 예컨대 환자가 IV 경로를 통해 모든 약물을 받는 이식 후 입원 중인 경우 바람직한 투여 경로일 수 있다. 특정 실시양태에서, 액체 제제는 투여 전에 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석된다. 특정 실시양태에서, 주사용 희석된 약물 생성물은 등장성이고, 정맥내 주입에 의한 투여에 적합하다.
특정 실시양태에서, 염 또는 완충제 성분은 10 mM-200 mM의 양으로 첨가될 수 있다. 염 및/또는 완충제는 제약상 허용되고, "염기 형성" 금속 또는 아민을 갖는 다양한 공지된 산 (무기 및 유기)으로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 완충제는 포스페이트 완충제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충제는 글리시네이트, 카르보네이트, 시트레이트 완충제일 수 있으며, 이 경우, 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 이온은 반대이온으로서 기능할 수 있다.
보존제는 박테리아 작용을 감소시키기 위해 본원의 제제에 임의로 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는, 예를 들어 다중-용도 (다중-용량) 제제의 생산을 용이하게 할 수 있다.
본원에서 관심의 수성 담체는 제약상 허용되고 (인간에의 투여를 위해 안전하고 비-독성임), 액체 제제의 제조에 유용한 것이다. 예시적인 담체는 멸균 주사용수 (SWFI), 정박테리아 주사용수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어, 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.
본 개시내용의 단백질은 단백질 및 동결건조보호제를 포함하는 동결건조 제제로 존재할 수 있다. 동결건조보호제는 당, 예를 들어 디사카라이드일 수 있다. 특정 실시양태에서, 동결건조보호제는 수크로스 또는 말토스일 수 있다. 동결건조 제제는 또한 완충제, 계면활성제, 벌킹제, 및/또는 보존제 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
동결건조 약물 제품의 안정화에 유용한 수크로스 또는 말토스의 양은 적어도 1:2의 단백질 대 수크로스 또는 말토스의 중량비일 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질 대 수크로스 또는 말토스 중량 비는 1:2 내지 1:5의 비일 수 있다.
특정 실시양태에서, 동결건조 전에, 제제의 pH는 제약상 허용되는 산 및/또는 염기의 첨가에 의해 설정될 수 있다. 특정 실시양태에서 제약상 허용되는 산은 염산일 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약상 허용되는 염기는 수산화나트륨일 수 있다.
동결건조 전에, 본 개시내용의 단백질을 함유하는 용액의 pH는 6 내지 8로 조정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 동결건조 약물 생성물에 대한 pH 범위는 7 내지 8일 수 있다.
특정 실시양태에서, 염 또는 완충제 성분은 10 mM-200 mM의 양으로 첨가될 수 있다. 염 및/또는 완충제는 제약상 허용되고, "염기 형성" 금속 또는 아민을 갖는 다양한 공지된 산 (무기 및 유기)으로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 완충제는 포스페이트 완충제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충제는 글리시네이트, 카르보네이트, 시트레이트 완충제일 수 있으며, 이 경우, 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 이온은 반대이온으로서 기능할 수 있다.
특정 실시양태에서, "벌킹제"가 첨가될 수 있다. "벌킹제"는 동결건조된 혼합물에 덩어리를 첨가하고, 동결건조된 케이크의 물리적 구조에 기여하는 (예를 들어, 개방 기공 구조를 유지하는 본질적으로 균일한 동결건조된 케이크의 생산을 용이하게 하는) 화합물이다. 예시적인 벌킹제는 만니톨, 글리신, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비톨을 포함한다. 본 발명의 동결건조 제제는 이러한 벌킹제를 함유할 수 있다.
보존제는 박테리아 작용을 감소시키기 위해 본원의 제제에 임의로 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는, 예를 들어 다중-용도 (다중-용량) 제제의 생산을 용이하게 할 수 있다.
특정 실시양태에서, 동결건조 약물 생성물은 수성 담체로 구성될 수 있다. 본원의 관심 수성 담체는 제약상 허용되며 (예를 들어, 인간에게 투여하기에 안전하고 비-독성임), 동결건조 후에 액체 제제의 제조에 유용한 것이다. 예시적인 희석제는 멸균 주사용수 (SWFI), 정박테리아 주사용수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어, 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 동결건조 약물 제품은 멸균 주사용수, USP (SWFI) 또는 0.9% 염화나트륨 주사액, USP로 재구성된다. 재구성 동안, 동결건조된 분말은 용액 내로 용해된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 동결건조 단백질 생성물은 약 4.5 mL 주사용수로 구성되고, 0.9% 염수 용액 (염화나트륨 용액)으로 희석된다.
본 발명의 제약 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 아니면서, 특정한 환자에 대한 치료 반응, 조성물 및 투여 방식을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변경될 수 있다.
구체적 용량은 각각의 환자에 대해 균일한 용량, 예를 들어, 50 내지 5000 mg의 단백질일 수 있다. 대안적으로, 환자의 용량은 환자의 대략적 체중 또는 표면적에 맞춰질 수 있다. 적절한 투여량을 결정하는데 있어서 다른 인자는 치료되거나 예방될 질환 또는 상태, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 의학적 상태를 포함할 수 있다. 치료를 위한 적절한 투여량을 결정하는데 필요한 계산의 추가의 개선은 특히 본원에 개시된 투여량 정보 및 검정의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이루어진다. 투여량은 또한 적절한 용량-반응 데이터와 함께 사용되는 투여량을 결정하기 위한 공지된 검정의 사용을 통해 결정될 수 있다. 개별 환자의 투여량은 질환 과정을 모니터링함에 따라 조정될 수 있다. 환자에서 표적화가능한 구축물 또는 복합체의 혈액 수준은 투여량이 유효 농도에 도달하거나 이를 유지하도록 조정되는 것이 필요한지를 알기 위해 측정될 수 있다. 게놈약학은 어느 표적화가능한 구축물 및/또는 복합체, 및 그의 투여량이 주어진 개체에 대해 유효할 가능성이 가장 큰지를 결정하는데 사용될 수 있다 (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001).
일반적으로, 체중 기준 투여량은 체중 kg당 약 0.01 μg 내지 약 100 mg, 예컨대 약 0.01 μg 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 0.01 μg 내지 약 50 mg/kg 체중, 약 0.01 μg 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 0.01 μg 내지 약 1 mg/kg 체중, 약 0.01 μg 내지 약 100 μg/kg 체중, 약 0.01 μg 내지 약 50 μg/kg 체중, 약 0.01 μg 내지 약 10 μg/kg 체중, 약 0.01 μg 내지 약 1 μg/kg 체중, 약 0.01 μg 내지 약 0.1 μg/kg 체중, 약 0.1 μg 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 0.1 μg 내지 약 50 mg/kg 체중, 약 0.1 μg 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 0.1 μg 내지 약 1 mg/kg 체중, 약 0.1 μg 내지 약 100 μg/kg 체중, 약 0.1 μg 내지 약 10 μg/kg 체중, 약 0.1 μg 내지 약 1 μg/kg 체중, 약 1 μg 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 1 μg 내지 약 50 mg/kg 체중, 약 1 μg 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 1 μg 내지 약 1 mg/kg 체중, 약 1 μg 내지 약 100 μg/kg 체중, 약 1 μg 내지 약 50 μg/kg 체중, 약 1 μg 내지 약 10 μg/kg 체중, 약 10 μg 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 10 μg 내지 약 50 mg/kg 체중, 약 10 μg 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 10 μg 내지 약 1 mg/kg 체중, 약 10 μg 내지 약 100 μg/kg 체중, 약 10 μg 내지 약 50 μg/kg 체중, 약 50 μg 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 50 μg 내지 약 50 mg/kg 체중, 약 50 μg 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 50 μg 내지 약 1 mg/kg 체중, 약 50 μg 내지 약 100 μg/kg 체중, 약 100 μg 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 100 μg 내지 약 50 mg/kg 체중, 약 100 μg 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 100 μg 내지 약 1 mg/kg 체중, 약 1 mg 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 1 mg 내지 약 50 mg/kg 체중, 약 1 mg 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 10 mg 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 10 mg 내지 약 50 mg/kg 체중, 약 50 mg 내지 약 100 mg/kg 체중이다.
용량은 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 이상, 또는 심지어 2 내지 20년마다 1회 주어질 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 체액 또는 조직에서 표적화가능한 구축물 또는 복합체의 측정된 체류 시간 및 농도에 기반하여 투여를 위한 반복 비율을 용이하게 추정할 수 있다. 본 발명의 투여는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 흉막내, 척수강내, 강내, 카테터를 통한 관류에 의해 또는 직접 병변내 주사에 의해서일 수 있다. 이는 매일 1회 이상, 매주 1회 이상, 매월 1회 이상, 및 매년 1회 이상 투여될 수 있다.
상기 기재는 본 발명의 여러 측면 및 실시양태를 기재한다. 본 특허 출원은 구체적으로 상기 측면 및 실시양태의 모든 조합 및 순열을 고려한다.
실시예
이제 일반적으로 기재되어 있는 본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이며, 이는 단지 본 발명의 특정 측면 및 실시양태의 예시 목적으로 포함되며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1. 선택된 하이브리도마 클론의 상청액의 특징화
마우스를 hFLT3-His 융합 단백질로 면역화시킴으로써 FLT3-특이적 항체를 생성하였다. 228개 하이브리도마의 상청액을 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 FLT3 결합에 대해 평가하고, 96개 하이브리도마를 hFLT3-His 단백질에 비공유 결합시켰다. 예비 생물층 간섭측정법 (BLI) 결합 친화도 추정, FLT3을 발현하는 인간 및 시노몰구스 원숭이 세포에 대한 결합, 및 에피토프의 다양성에 기초하여 11개의 클론을 선택하였다. hFLT3-His에 결합하는 이들 11개의 클론의 능력을 고해상도 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 추가로 분석하였다. 비아코어(Biacore) 8K 기기를 사용하여 생리학적 온도를 모방하기 위해 37℃에서 실험을 수행하였다. 비아코어 센소그램 및 동역학적 파라미터를 표 12에 제시하고, 미가공 데이터 및 피팅을 도 18에 나타낸다. 11개의 하이브리도마 중 7개가 10 nM 미만의 KD로 결합하였고, 5개가 느린 해리 속도 상수 (kd <5 x 10-4 s-1)를 나타냈다.
참조 mAb를 사용한 하이브리도마 융합체의 비닝을 옥텟레드(OctetRed)384 (포르테바이오(ForteBio))를 사용하여 BLI에 의해 수행하였다. 간략하게, 하이브리도마 상청액을 항-마우스 IgG 포획 센서 팁 상에 15분 동안 로딩하고, PBSF 중에서 5분 동안 평형화시켰다. 센서를 200 nM hFLT3-His에 침지시키고, 180초 동안 회합되도록 하고, 이어서 100 nM 대조군 IgG 또는 200 nM FTL3-리간드 용액에 침지시켰다. 반응 단위의 증가는 하이브리도마가 참조 mAb에 대해 비-경쟁자임을 나타내는 반면, 하이브리도마가 참조 mAb와 경쟁하였음을 나타내는 신호의 증가는 나타내지 않았다. FL23 (암젠) 및 FL39 (암젠)는 도메인 1에 결합한다. 공지된 FLT3-리간드 차단제인 EB10 (임클론(ImClone))은 도메인 3에 결합한다. FL61 (암젠(Amgen))은 또한 도메인 3에 결합하지만, FLT3-리간드 차단제는 아니다. 4G8 (신이뮨(Synimmune))은 도메인 4에 결합한다. NC7 (임클론)은 도메인 5에 결합한다. 이들 참조 항체의 VH 및 VL 서열은 표 11에 제공된다.
표 11. 참조 항체
Figure pct00053
하이브리도마 중 5종, 즉 4A4, 11F4, 1A2, 4H2, 및 13C9로부터 생산된 항체는 hFLT3-His에의 결합에 대해 참조 항체 중 어느 것과도 경쟁하지 않는 것으로 관찰되었다. 시노몰구스 원숭이 FLT3 (cFLT3)과의 교차-반응성을 cFLT3을 발현하는 동질유전자 RMA 세포에 대한 항체의 결합을 측정함으로써 평가하였다.
간략하게, RMA 세포를 cFLT3 또는 인간 FLT3 (hFLT3)을 코딩하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입시켰다. hFLT3 또는 cFLT3 동질유전자 세포주, 뿐만 아니라 FLT3+ 암 세포주에 대한 조 하이브리도마 수거물로부터의 α-FLT3 mAb의 결합을 하기와 같이 수행하였다. 96 웰 둥근 바닥 플레이트의 웰당 100,000개의 RMA, REH 또는 SEM 세포를 첨가하였다. 세포를 스핀 다운시키고, 펠릿을 볼텍싱에 의해 부드럽게 해리시켰다. 웰당 50 μL의 좀비(Zombie) 라이브/데드 염료 (PBS + 1:2000 염료)를 첨가하고, 암실에서 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제 (PBS + 2% FBS) 200 μL로 세척하였다. 50 μL의 하이브리도마 상청액을 세척된 세포에 첨가하고, 혼합물을 암실에서 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1회 세척한 다음, 50 μL의 항-마우스 Fc-PE 2차 시약 (1:200 희석)을 첨가하고, 암실에서 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 얼음 상에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드 50 μL로 고정시켰다. 세포를 다시 세척한 다음, 200 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 획득을 위해 준비될 때까지 4℃에서 저장하였다. 샘플을 HTS (고처리량 샘플러)가 장착된 BD FACS셀레스타(FACSCelesta) 상에서 실행하였다.
FLT3을 발현하는 것으로 보고된 인간 ALL 세포주인 REH 암 세포 (ATCC 카탈로그 번호 CRL-8286)에 대한 하이브리도마 상청액의 결합 친화도를 또한 측정하였다. 표 12에 제시된 바와 같이, 대부분의 클론은 hFLT3을 발현하는 암 세포에 대한 결합 친화도 및 cFLT3과의 교차-반응성을 나타내었다. 14A5 및 15A11에 대한 시노몰구스 원숭이 FLT3 결합 데이터는 수집하지 않았다.
표 12. 후보 하이브리도마로부터 생산된 항체에 대한 FLT3-His 결합의 동역학 파라미터 및 친화도
Figure pct00054
실시예 2. 정제된 항-FLT3 뮤린 항체의 분석
실시예 1에 기재된 분석에 기초하여, 8개의 하이브리도마 (4A4, 11F4, 12H10, 15A11, 12C09, 1A2, 14A5, 4H2)를 서브클로닝 및 서열분석을 위해 선택하였다. 각각의 모 하이브리도마로부터 2개의 서브클론을 생산하고 분석하였다. 각각의 하이브리도마로부터의 서열은 고유한 것으로 결정되었다. 각각의 서브클론을 하이브리도마 배양물로부터 정제하고, hFLT3-His에 대한 결합을 도 19에 제시된 바와 같이 SPR에 의해 확인하였다. 정제된 뮤린 서브클로닝된 mAb에 대한 hFLT3의 동역학 상수 및 결합 친화도를 표 13에 나타낸다. 참조 항체를 사용한 비닝을 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 수행하였고, 4종의 항체, 즉 4A4.A3, 11F4.B9, 1A2.A3 및 4H2.E3은 hFLT3-His에의 결합에 대해 참조 항체 중 어느 것과도 경쟁하지 않았다.
표 13: 정제된 뮤린 서브클론에 대한 hFLT3 결합의 동역학 파라미터 및 친화도
Figure pct00055
정제된 서브클로닝된 mAb의 세포 결합을 동질유전자 인간 및 시노몰구스 원숭이 FLT3 발현 RMA 세포주로 확인하였다. 12C9.E5를 제외하고, 모든 클론은 세포 표면 발현된 인간 및 시노몰구스 원숭이 FLT3에 결합하였다 (표 14). 유사하게, 모든 서브클론은 FLT3을 발현하는 것으로 보고된 인간 ALL 세포주인 SEM (DSMZ 카탈로그 번호 ACC 546)에 높은 친화도로 결합하였다.
표 14: 인간 및 시노몰구스 원숭이 FLT3 RMA 세포주에 대한 정제된 마우스 mAb의 세포 결합 확인
Figure pct00056
실시예 3. 선택된 항-FLT3 뮤린 항체의 리간드 차단 특성
본 실시예는 FLT3-리간드와의 FLT3 상호작용을 차단하는 선택된 항-FLT3 뮤린 항체의 능력을 특징화하도록 설계된 실험을 기재한다. FLT3-발현 EOL-1 암 세포 (DSMZ 카탈로그 번호 ACC 386)에 결합하는 α-FLT3 mAb의 능력을 포화 농도의 가용성 FLT3-리간드의 첨가 전 및 후에 시험하였다. 각각의 항체에 대해, 그의 리간드 차단 백분율 값을, 지시된 FLT3-리간드의 부재 하에 수득된 신호에 대한 FLT3-리간드의 존재 하에 수득된 mAb 결합 신호의 감소로서 계산하였다. 공지된 FLT3-리간드 차단제 EB10 mAb를 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 20에 제시된 바와 같이, 12H10.G7, 11F4.B9 및 4A4.A3, 14A5.E8 항체는 FLT3-리간드에 대한 FLT3의 결합을 방해하지 않은 반면, 15A11.C8 항체는 FLT3에 대한 FLT3-리간드의 결합을 차단하였다.
실시예 4. 추정 서열 문제 분석
본 실시예는 12H10.G7, 11F4.B9 및 4A4.A3, 14A5.E8 항체의 CDR (코티아 하에 확인됨)에서의 잠재적 서열 문제를 조사하기 위해 설계된 실험을 기재한다. 하기 잠재적 문제가 고려되었다: M (잠재적 산화 부위); NG, NS 및 NT 서열 모티프 (잠재적 탈아미드화 부위); DG, DS 및 DT 서열 모티프 (잠재적 이성질화 부위); DP 서열 모티프 (화학적 가수분해에 대한 잠재적 부위). 결과를 표 15에 요약한다.
표 15. 선택된 뮤린 mAb의 CDR에서의 추정 서열 문제
Figure pct00057
또한, 카바트 하의 12H10.G7의 CDRH1 내에 속하는 M34에서의 추정 서열 문제가 또한 확인되었다. 추정 서열 문제 모티프를 제거하기 위해 이들 항체의 변이체를 설계하였다.
실시예 5. 인간화 및 친화도 성숙
재조합 hFLT3 단백질에 대한 동역학 및 친화도, 인간 및 시노몰구스 원숭이 FLT3을 발현하는 세포주에 대한 결합, 상이한 AML 및 ALL 암 세포에 대한 결합, 비닝 프로파일, 뿐만 아니라 인간 FLT3-리간드 결합을 억제하지 않는 것에 관하여 수집된 데이터에 기초하여, 4종의 마우스 하이브리도마 서브클론, 즉 12H10.G7, 11F4.B9, 4A4.A3 및 14A5.E8을 인간화를 위해 선택하였다. 4A4.A3 및 14A5.E8이 12H10.G7 및 11F4.B9보다 hFLT3에 대해 약간 더 낮은 친화도를 나타내었지만, 이들 항체는 각각 고유한 에피토프 (참조 항체와 교차-차단하지 않음) 및 FLT3의 도메인 1에 결합하는 것으로 보였고, 따라서 에피토프 다양성을 조사하기 위해 추가로 분석하였다.
12H10.G7 항체를 인간화하여, 동일한 VH 및 VL 서열을 공유하는 상기 기재된 바와 같은 GB94 및 GB102를 생성하였다. 복귀 돌연변이를 프레임워크 영역에 도입하여 변이체 GB87 내지 GB93 및 GB95 내지 GB101을 생성하였다.
11F4.B9 항체를 인간화하여 상기 기재된 바와 같이 1153 및 1154를 생성하였고, 이는 동일한 VH 및 VL 서열을 공유하였다. 복귀 돌연변이를 프레임워크 영역에 도입하여 변이체 1151 및 1152를 생성하였다. 1153 항체를 또한 친화도 성숙에 적용하였다. 간략하게, 1553 FLT3 scFv의 CDR에 초점을 맞춘 라이브러리를 설계하고, 효모의 표면 상에 디스플레이하였다. 효모를 비오티닐화 인간 FLT3-His 항원과 함께 인큐베이션함으로써 FACS 선택을 2회 수행하였다. FACS-풍부화된 산출물 샘플을 추가의 CDR 돌연변이체와 조합하여 제2 라이브러리를 제조하였다. 비오티닐화 인간 FLT3-His를 사용하여 100 nM에서 1 nM로 적정함으로써 2 라운드의 추가의 FACS 선택을 수행하였다. 분류를 10 nM에서 수행하였고, 여기서 모체에 비해 라이브러리에 대한 신호의 명백한 증가가 관찰되었다. 분류된 효모 클론을 플레이팅하고, 스크리닝하였다.
실시예 6. 세포 발현된 인간 암 항원에 대한 TriNKET 결합의 평가
인간 및 시노몰구스 원숭이 FLT3을 이소성으로 발현하는 동질유전자 세포주를 사용하여 인간 및 시노몰구스 원숭이 FLT3 사이의 교차-반응성을 평가하였다. hFLT3 또는 cFLT3을 발현하는 인간 암 세포주 RMA를 사용하여 FLT3-표적화 TriNKET 및 모 mAb의 종양 항원 결합을 평가하였다. 인간 AML 세포주 MOLM-13 및 MV4-11 및 인간 ALL 세포주 REH를 사용하여 TriNKET 또는 모 mAb의 결합 능력을 평가하였다. 특히, 각각 FLT3-T227M 및 FLT3-ITD를 발현하는 MOLM-13 세포 및 MV4-11 세포를 사용하여 돌연변이체 FLT3에 결합하는 FLT3-표적화 TriNKET 및 모 mAb의 능력을 평가하였다.
인간 IgG1 포맷의 GB102 모노클로날 항체 (1158 mAb로도 불림) 및 상기 기재된 그의 상응하는 TriNKET F3'-GB102 (F3'-1158로 또한 불림)를 희석하고, 각각의 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 형광단 접합된 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 평균 형광 강도 (MFI) 값을 2차 항체 단독 대조군에 대해 정규화하여 백그라운드 대비 배수 (FOB) 값을 수득하였다.
도 21a 및 도 21b에 제시된 바와 같이, F3'-1158 및 1158 mAb는 각각 인간 및 시노몰구스 FLT3을 동등한 효력으로 이소 발현하는 RMA 세포에 결합하였다. 도 21c에 제시된 바와 같이, F3'-1158 및 1158 mAb는 인간 ALL 세포인 REH 세포에 결합하였다. 도 22a 및 22b에 제시된 바와 같이, F3'-1158 및 1158 mAb는 각각 MOLM-13 세포 및 MV4-11 세포에 결합하였으며, 이는 각각 FLT3-T227M 및 FLT3-ITD를 발현하였다.
실시예 7. TriNKET 또는 mAb 내재화의 평가
호산구성 백혈병으로부터 유래된 EOL-1 인간 암 세포주를 사용하여 F3'-1158 또는 1158 mAb와의 인큐베이션 후 FLT3의 내재화를 평가하였다. 이중 플레이트 내의 EOL-1 세포를 F3'-1158, 1158 mAb, 또는 hIgG1 이소형 대조군 항체와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 세척하고, 전체 FLT3을 비-경쟁 항-FLT3 항체를 사용하여 염색하였다. FLT3의 내재화를 하기와 같이 계산하였다:
% 내재화 = (1-(샘플 MFI 2시간/hIgG1 이소형 MFI 2시간)) x 100%
도 23a-23b는 REH (도 23a) 및 EOL-1 (도 23b)에서 F3'-1158 및 1158 mAb와 함께 인큐베이션한 후의 FLT3의 내재화를 보여준다. 모 mAb는 FLT3의 10% 미만의 내재화를 유도한 반면, FLT3-표적화 TriNKET는 FLT3의 5% 미만의 내재화를 유도하였다.
실시예 8. 1차 인간 NK 세포 세포독성 검정
표적 세포의 용해를 DELFIA 세포독성 검정에 의해 측정하였다. 간략하게, FLT3을 발현하는 인간 암 세포주를 배양물로부터 수거하고, HBS로 세척하고, BATDA 시약 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer) C136-100)으로 표지하기 위해 성장 배지 중에 106/mL로 재현탁시켰다. 표적 세포의 표지에 대해 제조업체의 지침을 따랐다. 표지 후에, 세포를 HBS로 3회 세척하고, 배양 배지 중에 0.5-1.0x105/mL로 재현탁하였다. 100 μl의 BATDA 표지된 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. FLT3에 대한 모노클로날 항체 또는 TriNKET를 배양 배지 중에 희석하고, 50 μl의 희석된 mAb 또는 TriNKET를 각각의 웰에 첨가하였다.
NK 세포를 제조하기 위해, PBMC를 밀도 구배 원심분리를 사용하여 인간 말초 혈액 백혈구 연층으로부터 단리하고, 세척하고, NK 세포 단리를 위해 제조하였다. 자기 비드에 의한 음성 선택 기술을 사용하여 NK 세포를 단리하였다. 단리된 NK 세포의 순도는 전형적으로 >90% CD3-CD56+이었다. 단리된 NK 세포를 밤새 휴지시키고, 배양물로부터 수거하였다. 이어서 세포를 세척하고, 5:1의 이펙터-대-표적 (E:T) 비를 위해 배양 배지 중에 105-2.0x106/mL의 농도로 재현탁시켰다. 50 μl의 NK 세포를 총 200 μl 배양 부피로 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2로 37℃에서 2-3시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후에, 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고, 세포를 200 xg에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 20 μl의 배양 상청액을 깨끗한 마이크로플레이트로 옮기고, 200 μl의 실온 유로퓸 용액 (퍼킨 엘머 C135-100)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 빛으로부터 보호하고, 플레이트 진탕기 상에서 250 rpm으로 15분 동안 인큐베이션한 다음, 스펙트라맥스(SpectraMax) i3X 기기를 사용하여 판독하였다.
유로퓸과 형광 킬레이트를 형성할 수 있는 물질의 자발적 방출을 NK 세포의 부재 하에 인큐베이션된 표적 세포에서 측정하였다. 이러한 물질의 최대 방출을 1% 트리톤(Triton)-X로 용해된 표적 세포에서 측정하였다. % 특이적 용해를 하기와 같이 계산하였다:
% 특이적 용해 = ((실험적 방출 - 자발적 방출) /
(최대 방출 - 자발적 방출)) * 100%.
도 24a-24d는 인간 AML 또는 ALL 세포주 EOL-1 (도 24a), Reh (도 24b), RS4-11 (도 24c), 및 MV4-11 (도 24d)의 1차 NK 세포-매개 사멸을 증진시키는데 있어서 F3'-1158 또는 1158 mAb의 활성을 보여준다. F3'-1158은 그의 모 mAb 1158 mAb와 비교하여 보다 강력한 사멸을 입증하였다.
NKG2D에 결합하는 항원-결합 부위 및 Fc의 이펙터 기능이 F3'-1158의 세포독성에 기여하는지 여부를 평가하기 위해, 2개의 TriNKET 변이체를 구축하였다. 제1 변이체는 NKG2D에 결합하는 A49 항원-결합 부위의 경쇄 가변 도메인에 돌연변이를 함유한다. 그 결과, 상기 변이체는 인간 NKG2D에 결합하지 않는다. 돌연변이체 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASNSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSTKSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDDLPTFGGGTKVEIK (서열식별번호: 305)이다. 상기 제1 변이체의 아미노산 서열은 그 외에는 F3'-1158의 것과 동일하다. 제2 변이체는 Fc 도메인에 돌연변이를 함유한다. 구체적으로, Fc 도메인의 각각의 폴리펩티드 쇄는 Fcγ 수용체에 대한 Fc의 결합을 감소시키는 것으로 보고된 L234A/L235A/P329G 치환 (EU 넘버링 시스템 하에 넘버링됨)을 함유한다. 상기 제2 변이체의 아미노산 서열은 그 외에는 F3'-1158의 것과 동일하다.
표적 세포의 NK 세포-매개 용해를 유도하는 이들 변이체의 능력을 상기 기재된 DELFIA 세포독성 검정을 사용하여 평가하였다. 도 25에 제시된 바와 같이, NKG2D-표적화 도메인 및 Fc 도메인에서의 돌연변이는 세포독성을 실질적으로 감소시켰다. 이 결과는 NKG2D에 대한 결합 및 Fcγ 수용체에 대한 결합이 둘 다 F3'-1158의 세포독성 활성에 기여하였음을 시사하였다.
실시예 9. 1차 인간 T 세포 세포독성 검정
CD8+ T 세포를 면역 이펙터 세포로서 사용한 것을 제외하고는, 실시예 8에 기재된 바와 같이 DELFIA 세포독성 검정에 의해 표적 세포의 용해를 측정하였다. CD8+ T 세포를 하기와 같이 제조하였다: 인간 PBMC를 제조업체의 지침에 따라 림포프렙(Lymphoprep) 및 셉메이트(SepMate) 50을 사용한 밀도 구배 원심분리를 사용하여 인간 말초 혈액 백혈구 연층으로부터 단리하였다. 단리된 PBMC를 배양 배지 중 1 μg/mL ConA (IL-2 배양 보충물)로 37℃에서 18시간 동안 자극하였다. 이어서 ConA를 제거하고, PBMC를 25 유닛/mL IL-2와 함께 37℃에서 4일 동안 배양하였다. CD8+ T 세포를 제조업체의 지침에 따라 자기 비드 (이지셉(EasySep)TM 인간 CD8+ T 세포 단리 키트)로 음성 선택 기술을 사용하여 정제하였다. CD8+ T 세포를 10 ng/mL IL-15를 함유하는 배지에서 37℃에서 6-13일 동안 배양한 후, 세포용해 검정에 사용하였다.
도 26에 제시된 바와 같이, F3'-1158은 RS4-11 표적 세포를 용해시키는 CD8 T 세포의 능력을 유의하게 증진시켰지만, 1158 mAb는 그렇지 않았다. F3'-1158은 RS4-11 세포의 CD8+ T 세포-매개 용해를 용량-의존성 방식으로 증가시켰다.
실시예 10. 인간 전혈에 대한 TriNKET 또는 mAb 결합의 평가
상이한 유형의 혈액 세포에 결합하는 F3'-1158 및 1158 mAb의 능력을 평가하였다. 간략하게, 인간 전혈을 F3'-1158, 1158 mAb, 또는 인간 IgG1 이소형 대조군 항체와 함께 인큐베이션하였다. 혈액 세포를 유동 세포측정법에 의해 분석하고, F3'-1158, 1158 mAb, 또는 이소형 대조군 항체의 결합을 형광단 접합된 항-인간 IgG 2차 항체를 사용하여 검출하였다.
도 27에 제시된 바와 같이, F3'-1158 및 1158 mAb는 혈액 내의 과립구, 단핵구, B 세포, NK 세포, CD8+ T 세포, 및 CD4+ T 세포에 대한 유의한 결합을 나타내지 않았다.
실시예 11. FLT3 신호전달의 활성화
FLT3 신호전달의 마커인 FLT3의 인산화를 pFLT3 ELISA (R&D 시스템즈 DYC368)에 의해 측정하였다. EOL-1 세포를 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. F3'-1158, 1158 mAb 및/또는 FLT3L을 첨가하였다. 샘플을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고, 즉시 300 xg에서 5분 동안 펠릿화하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 세포 펠릿을 200 μL의 용해 완충제 #9 중에 재현탁시키고, 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 2000 xg에서 5분 동안 펠릿화하고, 상청액을 깨끗한 시험 튜브로 옮겼다. 단백질 농도를 BCA 총 단백질 검정을 사용하여 정량화하였다. 샘플을 IC 희석제 #12 중에 적절하게 희석하였다. 용해물을 제조업체의 지침에 따라 측정하였다. 각각의 샘플에서의 pFLT3 농도를 유도된 표준 곡선으로부터의 값의 내삽에 의해 결정하였다. 공지된 표준의 광학 밀도 값을 그의 각각의 농도에 대해 플롯팅하고, 데이터를 선형 회귀 모델에 피팅하였다.
도 28a에 나타낸 바와 같이, FLT3L은 pFLT3 수준의 3배 증가를 초래한 반면, F3'-1158 및 1158 mAb는 유의한 FLT3 인산화를 유도하지 않았다. 도 28b는 세포를 FLT3L과 조합된 F3'-1158 또는 1158 mAb와 함께 인큐베이션한 경우에, F3'-1158 또는 1158 mAb가 FLT3L-유도된 FLT3 인산화를 억제하지 않았음을 보여준다. 이들 결과는 1158 mAb가 FLT3 결합에 대해 FLT3L과 경쟁하지 않았다는 관찰과 일치하였다.
참조에 의한 포함
달리 언급되지 않는 한, 본원에 언급된 각각의 특허 문헌 및 과학 논문의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
등가물
본 발명은 그의 취지 또는 본질적인 특성을 벗어나지 않으면서 다른 구체적 형태로 구현될 수 있다. 그러므로 상기 실시양태들은 모든 면에서 본원에 기재된 발명을 제한하기 보다는 설명적인 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범주는 상기 기재에 의해서가 아니라 첨부된 청구범위에 의해 지정되고, 청구범위의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화가 포함되는 것으로 의도된다.
서열 목록
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SEQUENCE LISTING <110> DRAGONFLY THERAPEUTICS, INC. <120> PROTEINS BINDING NKG2D, CD16 AND FLT3 <130> 14247-474-228 <140> TBA <141> <150> 62/915,123 <151> 2019-10-15 <160> 319 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12H10.G7-VH <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Arg Gln Leu Gly Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12H10.G7-VL <400> 2 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr 20 25 30 Gly Ser Ser Phe Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Glu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv of humanized 12H10.G7 GB87(VH-VL) <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Arg Gln Leu Gly Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Phe Val His 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu 180 185 190 Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Glu Pro Trp Thr Phe 225 230 235 240 Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 245 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12H10.G7-VH CDR2 <400> 4 Asn Pro Tyr Asn Asp Asp 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12H10.G7-VH CDR3 <400> 5 Trp Arg Gln Leu Gly Ser Leu Asp Ser 1 5 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12H10.G7-VL CDR1 <400> 6 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Phe Val His 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12H10.G7-VL CDR2 <400> 7 Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12H10.G7-VL CDR3 <400> 8 Gln Gln Asn Asn Glu Glu Pro Trp Thr 1 5 <210> 9 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 12H10.G7-VH <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Arg Gln Leu Gly Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr 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Glu Ser Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Phe Val His 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu 180 185 190 Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Glu Pro Trp Thr Phe 225 230 235 240 Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 245 <210> 48 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv of humanized 12H10.G7 GB102 M34I (VL-VH) <400> 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr 20 25 30 Gly Ser Ser Phe Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Glu Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 130 135 140 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 145 150 155 160 Thr Arg Tyr Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu 165 170 175 Glu Trp Met Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn 180 185 190 Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser 195 200 205 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Arg Gln Leu Gly Ser Leu Asp Ser Trp Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 49 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 12H10.G7 GB102 M34I/D101E-VH <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala 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consensus VH CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa = Asn or Val <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa = Thr or Tyr <400> 54 Arg Xaa Val Tyr Leu Xaa Phe Asp Tyr 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 12H10.G7 consensus 1-VH CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa = Glu or Asp <400> 55 Trp Arg Gln Leu Gly Ser Leu Xaa Ser 1 5 <210> 56 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 12H10.G7 consensus 2 -VH <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa = Ser or Arg <220> <221> misc_feature <222> (95)..(95) <223> Xaa = Tyr or His <400> 56 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Xaa Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Arg Gln Leu Gly Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 57 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 12H10.G7 consensus 2 -VL <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa = Ala or Asp <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa = Arg or Gly <220> <221> misc_feature <222> (87)..(87) <223> Xaa = Ala or Val <220> <221> misc_feature <222> (89)..(89) <223> Xaa = Thr or Val <400> 57 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Xaa Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr 20 25 30 Gly Ser Ser Phe Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Xaa Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Glu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 58 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 12H10.G7 consensus 3-VH <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa = Met or Ile <220> <221> misc_feature <222> (106)..(106) <223> Xaa = Glu or Asp <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Val Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Arg Gln Leu Gly Ser Leu Xaa Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 14A5.E8 consensus VH CDR1 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa = Pro or Thr <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ser or Tyr <400> 59 Gly Tyr Thr Phe Xaa Xaa Tyr 1 5 <210> 60 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14A5.E8-VH <400> 60 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Ile Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Val Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 61 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14A5.E8-VL <400> 61 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 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CDR2 <400> 66 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14A5.E8-VL or Humanized 14A5.E8 consensus VL CDR3 <400> 67 Gln Gln Trp Thr Ser Lys Ser Pro Thr 1 5 <210> 68 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 14A5.E8 1551/1552-VH <400> 68 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Ile Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ser Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Val Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 14A5.E8 1551/1552-VL <400> 69 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Lys Ser Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 70 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv of humanized 14A5.E8 1551(VH-VL) <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Ile Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ser Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 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Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Lys Ser Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 115 120 125 Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 130 135 140 Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile 145 150 155 160 Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Met Gly Asn 165 170 175 Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Ile Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys Asn 180 185 190 Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ser Asp Thr Ala Tyr Met Glu 195 200 205 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 210 215 220 Arg Val Val Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 72 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 14A5.E8 1553/1554-VH <400> 72 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Ile Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Val Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 14A5.E8 1553/1554-VL <400> 73 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Lys Ser Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 74 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv of humanized 14A5.E8 1553(VH-VL) <400> 74 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Ile Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Val Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 145 150 155 160 Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala 180 185 190 Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Trp Thr Ser Lys Ser Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys <210> 75 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv of humanized 14A5.E8 1554(VL-VH) <400> 75 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Lys Ser Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 115 120 125 Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 130 135 140 Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile 145 150 155 160 Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Met Gly Asn 165 170 175 Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Ile Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys Asn 180 185 190 Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu 195 200 205 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 210 215 220 Arg Val Val Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 76 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 14A5.E8 1689-VH <400> 76 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Tyr Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Ile Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asn Val Tyr Leu Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 77 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 14A5.E8 1689-VL <400> 77 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Lys Ser Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 14A5.E8 1689-VH CDR1 <400> 78 Gly Tyr Thr Phe Pro Tyr Tyr 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 14A5.E8 1689-VH CDR3 <400> 79 Arg Asn Val Tyr Leu Thr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 14A5.E8 1689-VL CDR1 <400> 80 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His 1 5 10 <210> 81 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv of humanized 14A5.E8 1689 (VH-VL) <400> 81 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Tyr Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Ile Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asn Val Tyr Leu Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 145 150 155 160 Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala 180 185 190 Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Trp Thr Ser Lys Ser Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys <210> 82 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv of humanized 14A5.E8 1689 (VL-VH) <400> 82 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Lys Ser Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 115 120 125 Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 130 135 140 Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Tyr Tyr Trp Ile 145 150 155 160 Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Met Gly Asn 165 170 175 Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Ile Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys Asn 180 185 190 Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu 195 200 205 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 210 215 220 Arg Asn Val Tyr Leu Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 83 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14H8.E7-VL <400> 83 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Met Glu Thr Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Lys Ser Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 84 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 14A5.E8 consensus VL <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa = Met or Ile <400> 84 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Xaa 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Lys Ser Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 85 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11F4.B9-VH <400> 85 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Gly Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Ile Pro Ser Thr Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Glu Arg Trp Gly Asp Tyr Tyr Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 14A5.E8 consensus VL CDR1 <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa = Met or Ile <400> 86 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Xaa His 1 5 10 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11F4.B9-VH CDR1 <400> 87 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 1 5 <210> 88 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11F4.B9-VH CDR2 <400> 88 Ile Pro Ser Thr Gly Ser 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11F4.B9-VH CDR3 <400> 89 Trp Gly Asp Tyr Tyr Gly Arg Asp Tyr 1 5 <210> 90 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11F4.B9-VL <400> 90 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 91 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11F4.B9-VL CDR1 <400> 91 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11F4.B9-VL CDR2 <400> 92 Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11F4.B9-VL CDR3 <400> 93 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr 1 5 <210> 94 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 11F4.B9-VL <400> 94 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 95 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A4.A3-VH <400> 95 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Ile Trp Phe Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Ser Thr 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ser Ser Val Asp Thr Thr Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Gln Ile Thr Thr Val Val Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ser Pro Leu Thr Val Ser Pro 115 120 <210> 96 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A4.A3-VL <400> 96 Arg Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ile 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Arg Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Gly 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Phe Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A4.A3-VH CDR1 <400> 97 Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Gly Met 1 5 <210> 98 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A4.H7-VH CDR2 <400> 98 Tyr Pro Asn Thr Gly Ile 1 5 <210> 99 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A4.A3-VH CDR2 <400> 99 Trp Phe Asn Asp Asn 1 5 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A4.A3-VH CDR3 <400> 100 Ile Thr Thr Val Val Gly Thr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 101 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A4.A3-VL CDR1 <400> 101 Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ile Tyr Leu His 1 5 10 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A4.A3-VL CDR2 <400> 102 Arg Thr Ser Asp Leu Ala Ser 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A4.A3-VL CDR3 <400> 103 Gln Gln Gly Ser Ser Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 104 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A4.H7-VH <400> 104 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Glu Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Thr Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Thr Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Trp Gly Asp Tyr Tyr Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 105 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A4.H7-VL <400> 105 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Thr Val Asp Thr His 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A4.H7-VL CDR1 <400> 106 Arg Ala Ser Glu Thr Val Asp Thr His Gly Asn Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 107 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 15A11.C8-VH <400> 107 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg His Thr Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Val Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Ile Phe Tyr Thr Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Gln Gly Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 108 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 15A11.C8-VL <400> 108 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Arg Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Tyr Thr Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Gly Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ser Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 15A11.C8-VH CDR1 <400> 109 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 1 5 <210> 110 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 300 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly 50 <210> 301 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 301 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 302 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 302 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 303 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 303 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 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Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 313 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-FLT3 mAb FL23(Amgen) VL <400> 313 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Tyr Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 314 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-FLT3 mAb FL39(Amgen) VH <400> 314 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Ala 20 25 30 Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Thr Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Val Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Val Gly Tyr Gly Ser Gly Trp Tyr Gly Phe Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 315 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-FLT3 mAb FL39(Amgen) VL <400> 315 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 316 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-FLT3 mAb FL61(Amgen) VH <400> 316 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Glu Ile Thr Met Val Arg Gly Val Ile Gly Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 317 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-FLT3 mAb FL61(Amgen) VL <400> 317 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 318 <211> 517 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> extracellular region of hFLT3-T227M <400> 318 Asn Gln Asp Leu Pro Val Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn 1 5 10 15 Asn Asp Ser Ser Val Gly Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu 20 25 30 Ser Pro Glu Asp Leu Gly Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr 35 40 45 Val Tyr Glu Ala Ala Ala Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr 50 55 60 Leu Gln Val Leu Val Asp Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val 65 70 75 80 Phe Lys His Ser Ser Leu Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn 85 90 95 Arg Gly Val Val Ser Met Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala 100 105 110 Gly Glu Tyr Leu Leu Phe Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile 115 120 125 Leu Phe Thr Val Ser Ile Arg Asn Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Arg Arg 130 135 140 Pro Tyr Phe Arg Lys Met Glu Asn Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser 145 150 155 160 Glu Ser Val Pro Glu Pro Ile Val Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln 165 170 175 Gly Glu Ser Cys Lys Glu Glu Ser Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu 180 185 190 Lys Val Leu His Glu Leu Phe Gly Met Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg 195 200 205 Asn Glu Leu Gly Arg Glu Cys Thr Arg Leu Phe Thr Ile Asp Leu Asn 210 215 220 Gln Thr Pro Gln Thr Thr Leu Pro Gln Leu Phe Leu Lys Val Gly Glu 225 230 235 240 Pro Leu Trp Ile Arg Cys Lys Ala Val His Val Asn His Gly Phe Gly 245 250 255 Leu Thr Trp Glu Leu Glu Asn Lys Ala Leu Glu Glu Gly Asn Tyr Phe 260 265 270 Glu Met Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Arg Thr Met Ile Arg Ile Leu Phe 275 280 285 Ala Phe Val Ser Ser Val Ala Arg Asn Asp Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys 290 295 300 Ser Ser Ser Lys His Pro Ser Gln Ser Ala Leu Val Thr Ile Val Glu 305 310 315 320 Lys Gly Phe Ile Asn Ala Thr Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Glu Ile Asp 325 330 335 Gln Tyr Glu Glu Phe Cys Phe Ser Val Arg Phe Lys Ala Tyr Pro Gln 340 345 350 Ile Arg Cys Thr Trp Thr Phe Ser Arg Lys Ser Phe Pro Cys Glu Gln 355 360 365 Lys Gly Leu Asp Asn Gly Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Cys Asn His Lys 370 375 380 His Gln Pro Gly Glu Tyr Ile Phe His Ala Glu Asn Asp Asp Ala Gln 385 390 395 400 Phe Thr Lys Met Phe Thr Leu Asn Ile Arg Arg Lys Pro Gln Val Leu 405 410 415 Ala Glu Ala Ser Ala Ser Gln Ala Ser Cys Phe Ser Asp Gly Tyr Pro 420 425 430 Leu Pro Ser Trp Thr Trp Lys Lys Cys Ser Asp Lys Ser Pro Asn Cys 435 440 445 Thr Glu Glu Ile Thr Glu Gly Val Trp Asn Arg Lys Ala Asn Arg Lys 450 455 460 Val Phe Gly Gln Trp Val Ser Ser Ser Thr Leu Asn Met Ser Glu Ala 465 470 475 480 Ile Lys Gly Phe Leu Val Lys Cys Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Thr 485 490 495 Ser Cys Glu Thr Ile Leu Leu Asn Ser Pro Gly Pro Phe Pro Phe Ile 500 505 510 Gln Asp Asn Ile Ser 515 <210> 319 <211> 517 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> extracellular region of hFLT3-ITD <400> 319 Asn Gln Asp Leu Pro Val Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn 1 5 10 15 Asn Asp Ser Ser Val Gly Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu 20 25 30 Ser Pro Glu Asp Leu Gly Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr 35 40 45 Val Tyr Glu Ala Ala Ala Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr 50 55 60 Leu Gln Val Leu Val Asp Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val 65 70 75 80 Phe Lys His Ser Ser Leu Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn 85 90 95 Arg Gly Val Val Ser Met Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala 100 105 110 Gly Glu Tyr Leu Leu Phe Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile 115 120 125 Leu Phe Thr Val Ser Ile Arg Asn Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Arg Arg 130 135 140 Pro Tyr Phe Arg Lys Met Glu Asn Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser 145 150 155 160 Glu Ser Val Pro Glu Pro Ile Val Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln 165 170 175 Gly Glu Ser Cys Lys Glu Glu Ser Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu 180 185 190 Lys Val Leu His Glu Leu Phe Gly Thr Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg 195 200 205 Asn Glu Leu Gly Arg Glu Cys Thr Arg Leu Phe Thr Ile Asp Leu Asn 210 215 220 Gln Thr Pro Gln Thr Thr Leu Pro Gln Leu Phe Leu Lys Val Gly Glu 225 230 235 240 Pro Leu Trp Ile Arg Cys Lys Ala Val His Val Asn His Gly Phe Gly 245 250 255 Leu Thr Trp Glu Leu Glu Asn Lys Ala Leu Glu Glu Gly Asn Tyr Phe 260 265 270 Glu Met Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Arg Thr Met Ile Arg Ile Leu Phe 275 280 285 Ala Phe Val Ser Ser Val Ala Arg Asn Asp Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys 290 295 300 Ser Ser Ser Lys His Pro Ser Gln Ser Ala Leu Val Thr Ile Val Glu 305 310 315 320 Lys Gly Phe Ile Asn Ala Thr Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Glu Ile Asp 325 330 335 Gln Tyr Glu Glu Phe Cys Phe Ser Val Arg Phe Lys Ala Tyr Pro Gln 340 345 350 Ile Arg Cys Thr Trp Thr Phe Ser Arg Lys Ser Phe Pro Cys Glu Gln 355 360 365 Lys Gly Leu Asp Asn Gly Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Cys Asn His Lys 370 375 380 His Gln Pro Gly Glu Tyr Ile Phe His Ala Glu Asn Asp Asp Ala Gln 385 390 395 400 Phe Thr Lys Met Phe Thr Leu Asn Ile Arg Arg Lys Pro Gln Val Leu 405 410 415 Ala Glu Ala Ser Ala Ser Gln Ala Ser Cys Phe Ser Asp Gly Tyr Pro 420 425 430 Leu Pro Ser Trp Thr Trp Lys Lys Cys Ser Asp Lys Ser Pro Asn Cys 435 440 445 Thr Glu Glu Ile Thr Glu Gly Val Trp Asn Arg Lys Ala Asn Arg Lys 450 455 460 Val Phe Gly Gln Trp Val Ser Ser Ser Thr Leu Asn Met Ser Glu Ala 465 470 475 480 Ile Lys Gly Phe Leu Val Lys Cys Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Thr 485 490 495 Ser Cys Glu Thr Ile Leu Leu Asn Ser Pro Gly Pro Phe Pro Phe Ile 500 505 510 Gln Asp Asn Ile Ser 515

Claims (66)

  1. (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하기에 충분한 항체 Fc 도메인 또는 그의 부분, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질이며,
    여기서 FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위는
    (i) 각각 서열식별번호: 11, 4 및 55의 아미노산 서열을 포함하는 상보성-결정 영역 1 (CDR1), 상보성-결정 영역 2(CDR2) 및 상보성-결정 영역 3 (CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH); 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL);
    (ii) 각각 서열식별번호: 59, 63 및 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 86, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
    (iii) 각각 서열식별번호: 87, 88 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 91, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
    (iv) 각각 서열식별번호: 97, 99 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 101, 102 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
    (v) 각각 서열식별번호: 87, 98 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 106, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
    (vi) 각각 서열식별번호: 109, 110 및 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 112, 113 및 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
    (vii) 각각 서열식별번호: 117, 118 및 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 120, 121 및 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
    (viii) 각각 서열식별번호: 87, 98 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 106, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL;
    (ix) 각각 서열식별번호: 62, 33 및 127의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 128, 129 및 130의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL; 또는
    (x) 각각 서열식별번호: 132, 133 및 134의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 65, 66 및 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL
    을 포함하는 것인 단백질.
  2. 제1항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 11, 4 및 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  3. 제2항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 11, 4 및 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  4. 제2항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 11, 4 및 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, VH가 서열식별번호: 37과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열식별번호: 38과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, VH가 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  7. 제6항에 있어서, VH 및 VL이 각각 서열식별번호: 9 및 10; 13 및 10; 17 및 10; 9 및 22; 9 및 26; 9 및 30; 9 및 34; 37 및 38; 41 및 42; 45 및 42; 또는 49 및 42의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 부위가 단일쇄 가변 단편 (scFv)으로서 존재하고, scFv가 서열식별번호: 3, 12, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 31, 32, 35, 36, 39, 40, 43, 44, 47, 48, 51 및 52로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  9. 제1항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 59, 63 및 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 86, 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  10. 제9항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 78, 63, 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 80, 66, 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  11. 제9항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 62, 63, 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 65, 66, 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, VH가 서열식별번호: 76과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열식별번호: 77과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, VH가 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  14. 제13항에 있어서, VH 및 VL이 각각 서열식별번호: 68 및 69; 72 및 73; 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 부위가 scFv로서 존재하고, scFv가 서열식별번호: 70, 71, 74, 75, 81, 및 82로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  16. 제1항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 87, 88 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 91, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  17. 제1항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 97, 99 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 101, 102 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  18. 제1항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 87, 98 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 106, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  19. 제1항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 109, 110 및 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 112, 113 및 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  20. 제1항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 117, 118 및 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 120, 121 및 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  21. 제1항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 87, 98 및 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 106, 92 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  22. 제1항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 62, 33 및 127의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 128, 129 및 130의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  23. 제1항에 있어서, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 132, 133 및 134의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 65, 66 및 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 부위가 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정 시 20 nM 이하의 해리 상수 (KD)로 인간 FLT3에 결합하는 것인 단백질.
  25. 제2항 내지 제8항, 제16항, 제17항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 부위가 SPR에 의해 측정 시 10 nM 이하의 KD로 인간 FLT3에 결합하는 것인 단백질.
  26. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 부위가 서열식별번호: 318의 아미노산 서열을 포함하는 인간 FLT3 변이체에 결합하는 것인 항원-결합 부위.
  27. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 부위가 서열식별번호: 319의 아미노산 서열을 포함하는 인간 FLT3 변이체에 결합하는 것인 항원-결합 부위.
  28. 제2항 내지 제21항 및 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 부위가 시노몰구스 FLT3에 결합하는 것인 단백질.
  29. 제2항 내지 제20항 및 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 부위가 FLT3에의 결합에 대해 FLT3L과 경쟁하지 않는 것인 단백질.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, CD16에 결합하기에 충분한 항체 Fc 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 단백질.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위가 Fab 단편이고, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 scFv인 단백질.
  32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위가 scFv이고, FLT3에 결합하는 제2 항원-결합 부위가 Fab 단편인 단백질.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, FLT3에 결합하는 추가의 항원-결합 부위를 추가로 포함하는 단백질.
  34. 제1항 내지 제30항 및 제32항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위가 scFv이고, FLT3에 결합하는 제2 및 추가의 항원-결합 부위가 각각 Fab 단편인 단백질.
  35. 제1항 내지 제30항 및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위가 scFv이고, FLT3에 결합하는 제2 및 추가의 항원-결합 부위가 각각 scFv인 단백질.
  36. 제31항, 제32항, 제34항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서, FLT3에 결합하는 scFv 및/또는 NKG2D에 결합하는 scFv가 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 단백질.
  37. 제36항에 있어서, scFv가 Ala-Ser 또는 Gly-Ser을 포함하는 힌지를 통해, CD16에 결합하기에 충분한 항체 불변 도메인 또는 그의 부분에 연결되는 것인 단백질.
  38. 제37항에 있어서, 힌지가 아미노산 서열 Thr-Lys-Gly를 추가로 포함하는 것인 단백질.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, scFv의 중쇄 가변 도메인이 scFv의 경쇄 가변 도메인과 디술피드 가교를 형성하는 것인 단백질.
  40. 제39항에 있어서, 디술피드 가교가 카바트(Kabat) 넘버링 스킴 하에 넘버링된, 중쇄 가변 도메인의 C44와 경쇄 가변 도메인의 C100 사이에 형성되는 것인 단백질.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, scFv의 중쇄 가변 도메인이 가요성 링커를 통해 scFv의 경쇄 가변 도메인에 연결되는 것인 단백질.
  42. 제41항에 있어서, 가요성 링커가 (G4S)4를 포함하는 것인 단백질.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 내에서 중쇄 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인의 C-말단에 위치하는 것인 단백질.
  44. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 내에서 중쇄 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인의 N-말단에 위치하는 것인 단백질.
  45. 제31항 내지 제34항 및 제36항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, Fab가 항원-결합 부위와 Fc 또는 그의 부분 사이에 위치하지 않는 것인 단백질.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위가 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242, 및 270 또는 271의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 276, 236, 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 단백질.
  47. 제46항에 있어서, NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위가
    (i) 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242 및 255 또는 256의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 276, 236 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL; 또는
    (ii) 각각 서열식별번호: 240 또는 241, 242 및 243 또는 244의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 서열식별번호: 276, 236 및 245의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VL
    을 포함하는 것인 단백질.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 제1 항원-결합 부위의 VH가 서열식별번호: 254와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 제1 항원-결합 부위의 VL이 서열식별번호: 239와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원-결합 부위의 VH가 서열식별번호: 254의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 항원-결합 부위의 VL이 서열식별번호: 239의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 Fc 도메인이 인간 IgG1 항체 Fc 도메인인 단백질.
  51. 제50항에 있어서, 항체 Fc 도메인 또는 그의 부분이 서열식별번호: 136과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 항체 Fc 도메인의 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄가 서열식별번호: 136과 비교하여, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 및 K439로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 단백질.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 Fc 도메인의 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄가 서열식별번호: 136과 비교하여, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D 및 K439E로부터 선택된 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 단백질.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄가 서열식별번호: 136과 비교하여, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 및 K439로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 1개 이상의 돌연변이를 포함하고; 항체 중쇄 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄가 서열식별번호: 136과 비교하여 Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, D401, F405, Y407, K409, T411 및 K439로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 단백질.
  55. 제54항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄가 서열식별번호: 136과 비교하여, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 K360E 및 K409W 치환을 포함하고; 항체 중쇄 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄가 서열식별번호: 136과 비교하여 Q347R, D399V 및 F405T 치환을 포함하는 것인 단백질.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역의 한 폴리펩티드 쇄가 서열식별번호: 136과 비교하여, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 Y349C 치환을 포함하고; 항체 중쇄 불변 영역의 다른 폴리펩티드 쇄가 서열식별번호: 136과 비교하여 S354C 치환을 포함하는 것인 단백질.
  57. (a) 서열식별번호: 278의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드;
    (b) 서열식별번호: 279의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및
    (c) 서열식별번호: 277, 283, 284, 285, 286, 287, 288 및 289로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드
    를 포함하는 단백질.
  58. (a) 서열식별번호: 280의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드;
    (b) 서열식별번호: 281의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드; 및
    (c) 서열식별번호: 282의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드
    를 포함하는 단백질.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  60. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포.
  61. 종양 세포 및 자연 킬러 세포를 유효량의 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 단백질 또는 제59항의 제약 조성물에 노출시키는 것을 포함하는, 종양 세포 사멸을 증진시키는 방법.
  62. 유효량의 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 단백질 또는 제59항의 제약 조성물을 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 암이 혈액 악성종양인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 혈액 악성종양이 백혈병인 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 골수이형성증, 급성 T-림프모구성 백혈병 및 급성 전골수구성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 FLT3을 발현하는 것인 방법.
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