TW202128759A - 結合ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ及ｆｌｔ３之蛋白質 - Google Patents

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Abstract

描述結合NKG2D受體、CD16及FLT3之多特異性結合蛋白，以及可用於治療自體免疫疾病或癌症之醫藥組合物及治療方法。

Description

結合NKG2D、CD16及FLT3之蛋白質
本發明係關於結合於NKG2D、CD16及FLT3之多特異性結合蛋白。
儘管在文獻中已報導用於治療癌症之大量研究工作及科學進展，但此疾病仍然為顯著健康問題。血液及骨髓癌係經常被診斷出之癌症類型，包括多發性骨髓瘤、白血病及淋巴瘤。目前針對此等癌症之治療方案並非對所有患者皆有效和/或可能具有嚴重不良副作用。使用現有之治療方案來治療其他類型之癌症亦仍然具有挑戰性。
癌症免疫療法係理想的，因為其係高度特異性的，且可利用患者自身之免疫系統促進癌細胞之破壞。諸如雙特異性T細胞銜接蛋白之融合蛋白係文獻中描述之與腫瘤細胞及T細胞結合以促進腫瘤細胞破壞的癌症免疫療法。在文獻中已描述與某些腫瘤相關抗原及某些免疫細胞結合之抗體。參見例如WO 2016/134371及WO 2015/095412。
自然殺手(NK)細胞係先天免疫系統之組成部分，約佔循環淋巴細胞之15％。NK細胞實際上浸潤所有組織且最初的特徵為其能夠有效殺死腫瘤細胞而無需預先敏化。活化之NK細胞藉由類似於細胞毒性T細胞之方式，亦即經由含有穿孔素及顆粒酶之細胞溶解顆粒以及經由死亡受體路徑殺死靶細胞。活化NK細胞亦分泌諸如IFN-γ之發炎細胞介素及促進其他白細胞募集至靶組織之趨化介素。
NK細胞經由其表面上之各種活化及抑制受體對信號作出反應。例如，當NK細胞遇到健康自身細胞時，其活性經由活化殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)受到抑制。可替代地，當NK細胞遇到外來細胞或癌細胞時，其經由其活化受體(例如NKG2D、NCR、DNAM1)活化。NK細胞亦藉由一些免疫球蛋白之恆定區經由其表面上之CD16受體活化。NK細胞對活化之總敏感性視刺激及抑制信號總和而定。NKG2D係一種II型跨膜蛋白，基本上由NKG2D充當活化受體之所有自然殺手細胞表表現。NKG2D亦存在於T細胞中，在T細胞中其用作共刺激受體。經由NKG2D調節NK細胞功能之能力可用於包括惡性病之多種治療環境中。
Fms相關酪胺酸激酶3 (FLT3)亦稱為FLK2、STK1或CD135，係一種III類受體酪胺酸激酶。FLT3係一種跨膜蛋白，其在胞外區包括多個免疫球蛋白樣域。FLT3可藉由結合FLT3LG來活化，從而誘導FLT3均二聚及自身磷酸化。活化之FLT3隨後磷酸化且活化多個細胞質效應分子，諸如Akt、Erk及mTOR，從而促進細胞增殖且減少細胞凋亡。在急性骨髓性白血病及急性淋巴母細胞白血病中已觀察到導致FLT3組成型活化的突變。
本發明提供結合於自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體以及腫瘤相關抗原FLT3的多特異性結合蛋白。此類蛋白質可接合超過一種NK活化受體，且可阻斷天然配位體與NKG2D之結合。在某些實施例中，蛋白質可折磨人類中之NK細胞。在一些實施例中，蛋白質可折磨人類中及諸如嚙齒動物及食蟹獼猴之其他物種中的NK細胞。亦提供含有本文所述之蛋白質中之任一種的調配物；含有一或多種表現該等蛋白質之核酸的細胞，及使用該等蛋白質增強腫瘤細胞死亡之方法。
因此，本發明之一態樣提供一種蛋白質，該蛋白質包含： (a)    結合NKG2D之第一抗原結合位點； (b)    結合FLT3之第二抗原結合位點；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其一部分，或結合CD16之第三抗原結合位點， 其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含： (i) 包含互補決定區1 (CDR1)、互補決定區2 (CDR2)及互補決定區3 (CDR3)之之重鏈可變域(VH)，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變域(VL)，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列； (ii) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 59、63及54之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 86、66及67之胺基酸序列； (iii) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列； (iv) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 97、99及100之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 101、102及103之胺基酸序列； (v) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列； (vi) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 109、110及111之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 112、113及114之胺基酸序列； (vii) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 117、118及119之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 120、121及122之胺基酸序列； (viii) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列； (ix) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、33及127之胺基酸序列分別；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 128、129及130之胺基酸序列；或 (x) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 132、133及134之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66及46之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及50之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含與SEQ ID NO:37至少90%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO:38至少90%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列。在某些實施例中，VH及VL包含以下胺基酸序列：SEQ ID NO: 9及10; 13及10; 17及10; 9及22; 9及26; 9及30; 9及34; 37及38; 41及42; 45及42；或49及42。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈單鏈可變片段(scFv)存在，且其中scFv包含選自SEQ ID NO: 3、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51及52之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 59、63及54之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 86、66及67之胺基酸序列。在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 78、63、79之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 80、66、67之胺基酸序列。在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、63、64之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66、67之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含與SEQ ID NO:76至少90%一致之胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO:77至少90%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO:84之胺基酸序列。在某些實施例中，VH及VL包含以下胺基酸序列：SEQ ID NO: 68及69; 72及73；或76及77。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，且其中scFv包含選自SEQ ID NO: 70、71、74、75、81及82之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 97、99及100之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 101、102及103之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 109、110及111之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 112、113及114之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 117、118及119之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 120、121及122之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、33及127之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 128、129及130之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 132、133及134之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66及46之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點以如藉由表面等離子體共振(SPR)所量測之小於或等於20 nM之解離常數(KD )結合人類FLT3。在某些實施例中，第二抗原結合位點以如藉由SPR所量測之小於或等於10 nM之KD 結合人類FLT3。在某些實施例中，第二抗原結合位點結合食蟹獼猴FLT3。在某些實施例中，第二抗原結合位點不與FLT3L競爭結合FLT3。
在某些實施例中，蛋白質包含足以結合CD16之抗體Fc域或其一部分。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點為Fab片段，且結合FLT3之第二抗原結合位點為scFv。在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點為scFv，且結合FLT3之第二抗原結合位點為Fab片段。
在某些實施例中，蛋白質進一步包含結合FLT3之額外抗原結合位點。在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點為scFv，且結合FLT3之第二及額外抗原結合位點各自為Fab片段。在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點為scFv，且結合FLT3之第二及額外抗原結合位點各自為scFv。
在某些實施例中，結合FLT3之scFv及/或結合NKG2D之scFv包含重鏈可變域及輕鏈可變域。在某些實施例中，scFv經由包含Ala-Ser或Gly-Ser之鉸鏈連接於足以結合CD16之抗體恆定域或其一部分。在某些實施例中，鉸鏈進一步包含胺基酸序列Thr-Lys-Gly。在某些實施例中，scFv之重鏈可變域與scFv之輕鏈可變域形成二硫橋鍵。在某些實施例中，根據Kabat編號方案進行編號，在重鏈可變域之C44與輕鏈可變域之C100之間形成二硫橋鍵。在某些實施例中，scFv之重鏈可變域經由可撓性連接子連接於scFv之輕鏈可變域。在某些實施例中，可撓性連接子包含(G4 S)4 。在某些實施例中，在scFv內，重鏈可變域位於輕鏈可變域之C端。在某些實施例中，在scFv內，重鏈可變域位於輕鏈可變域之N端。
在某些實施例中，Fab不位於抗原結合位點與Fc或其部分之間。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及270或271之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含： (i) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及255或256之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO:276、236及245之胺基酸序列；或 (ii) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及243或244之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。
在某些實施例中，第一抗原結合位點之VH包含與SEQ ID NO:254至少90%一致之胺基酸序列，且第一抗原結合位點之VL包含與SEQ ID NO:239至少90%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點之VH包含SEQ ID NO:254之胺基酸序列，且第一抗原結合位點之VL包含SEQ ID NO:239之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗體Fc域為人類IgG1抗體Fc域。在某些實施例中，抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:136至少90%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，根據EU編號系統進行編號，抗體Fc域之至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136在一或多個位置包含一或多個選自以下之突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及K439。在某些實施例中，根據EU編號系統進行編號，抗體Fc域之至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136包含一或多個選自以下之突變：Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D及K439E。在某些實施例中，根據EU編號系統進行編號，抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136在一或多個位置包含一或多個選自以下之突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及K439；且抗體重鏈恆定區之另一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136在一或多個位置包含一或多個選自以下之突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、D401、F405、Y407、K409、T411及K439。在某些實施例中，根據EU編號系統進行編號，抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136包含K360E及K409W取代； 且抗體重鏈恆定區之另一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136包含Q347R、D399V及F405T取代。在某些實施例中，根據EU編號系統進行編號，抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136包含Y349C取代； 且抗體重鏈恆定區之另一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136包含S354C取代。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含本文揭示之蛋白質及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明提供一種細胞，該細胞包含編碼本文揭示之蛋白質的一或多種核酸。
在另一態樣中，本發明提供一種增強腫瘤細胞死亡之方法，該方法包括將腫瘤細胞及自然殺手細胞暴露於有效量之本文揭示之蛋白質或醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明提供一種治療癌症之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之本文揭示之蛋白質或醫藥組合物。
在某些實施例中，癌症為血液惡性病。在某些實施例中，血液惡性病為白血病。在某些實施例中，選自由以下組成之群：急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、骨髓化生不良、急性T-淋巴母細胞白血病及急性前髓細胞白血病。在某些實施例中，癌症表現FLT3。
下文進一步詳細描述本發明之多個態樣及實施例。
本申請案主張2019年10月15日申請之美國臨時申請案第62/915,123號的優先權，所述臨時申請案整體以引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案以引用之方式整體併入呈ASCII文本格式之序列表之電腦可讀形式(CRF)。序列表文本文件標題為「14247-474-888_SEQ_LISTING」，於2020年10月5日創建，且大小為317,572位元組。
本發明提供結合於自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體以及腫瘤相關抗原FLT3的多特異性結合蛋白。在一些實施例中，多特異性蛋白進一步包括結合FLT3之額外抗原結合位點。本發明亦提供包含此類多特異性結合蛋白之醫藥組合物，及使用此類多特異性蛋白及醫藥組合物之治療方法，以達成諸如治療自體免疫疾病及癌症之目的。本發明之多個態樣在下文中分幾章節闡述；然而，在一個特定章節中描述之本發明之態樣不限於任何特定章節。
為幫助理解本發明，下文定義許多術語及片語。
如本文所用，術語「一種(a/an)」意謂「一或多種」且除非上下文不相宜，否則包括複數。
如本文所用，術語「抗原結合位點」係指參與抗原結合之免疫球蛋白分子之一部分。在人類抗體中，抗原結合位點由重鏈(「H」)及輕(「L」)鏈之N端可變(「V」)區之胺基酸殘基形成。重鏈及輕鏈之V區內之三個高度相異之延伸段稱為「高變區」，其插入稱為「構架區」或「FR」的更保守之位於兩側之延伸段之間。因此，「FR」係指在免疫球蛋白中之高變區之間天然存在且與高變區相鄰的胺基酸序列。在人類抗體分子中，輕鏈之三個高變區及重鏈之三個高變區相對於彼此呈三維空間佈置，形成抗原結合表面。抗原結合表面與結合抗原之三維表面互補，且重鏈及輕鏈中之每一者的三個高變區稱為「互補決定區」或「CDR」。在諸如駱駝及軟骨魚之某些動物中，抗原結合位點由單個抗體鏈形成，提供「單域抗體」。抗原結合位點可呈完整抗體、抗體之保留抗原結合表面之抗原結合片段或諸如scFv之重組多肽存在，在單個多肽中使用肽連接子將重鏈可變域連接至輕鏈可變域。
如本文所用，術語「腫瘤相關抗原」意謂包括但不限於與癌症相關之蛋白質、糖蛋白、神經節苷脂、碳水化合物、脂質的任何抗原。此類抗原可在惡性細胞上或腫瘤微環境中，諸如腫瘤相關之血管、細胞外基質、間質基質或免疫浸潤物上表現。
如本文所用，術語「個體」及「患者」係指有待由本文所述之方法及組合物治療之生物體。此類生物體較佳包括(但不限於)哺乳動物(例如鼠類、猿、馬、牛、豬科動物、犬科動物、貓科動物等)且更佳包括人類。
如本文所用，術語「有效量」係指化合物(例如本發明之化合物)足以實現有益或所需結果之量。有效量可分一或多次投藥、施加或劑量來投與，且不意欲限於特定調配或投藥途徑。如本文所用，術語「治療」包括使疾患、疾病、病症及其類似物好轉或改善其症狀之任何作用，例如減輕、降低、調節、改善或消除。
如本文所用，術語「醫藥組合物」係指活性劑與惰性或活性載劑之組合，使得組合物特別適合於活體內或離體之診斷或治療用途。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指任何標準醫藥載劑，諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、水、乳液(如諸如油/水或水/油乳液)及各種類型潤濕劑。組合物亦可包括穩定劑和防腐劑。關於載劑、穩定劑及佐劑之實例，參見例如Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 第15版, Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之任何醫藥學上可接受之鹽(例如酸或鹼)，其在投與個體後，能夠提供本發明之化合物或其活性代謝物或殘餘物。如所屬領域之技術人員已知，本發明化合物之「鹽」可源自於無機酸或有機酸及無機鹼或有機鹼。示例性酸包括(但不限於)鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、丁二酸、甲苯-對磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸及其類似物。諸如草酸之其他酸雖然本身在醫藥學上並非可接受的，但可用於製備適用作獲得本發明之化合物及其醫藥學上可接受之酸加成鹽的中間物的鹽。
示例性鹼包括(但不限於)鹼金屬(例如鈉)氫氧化物、鹼土金屬(例如鎂)氫氧化物、氨及式NW4 + 之化合物，其中W為C1-4 烷基，及其類似物。
示例性鹽包括(但不限於)：乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、氟庚酸鹽(flucoheptanoate)、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽(palmoate)、果膠酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、苯丙酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一酸鹽及其類似物。鹽之其他實例包括本發明化合物之陰離子與諸如Na+ 、NH4 + 及NW4 + (其中W為C1-4 烷基)及其類似物之合適陽離子化合而成的鹽。
對於治療用途，預期本發明化合物之鹽為醫藥學上可接受的。然而，非醫藥學上可接受之酸及鹼之鹽亦可用於例如製備或純化醫藥學上可接受之化合物。
如本文所用，「FLT3」(亦稱FLK2、STK1或CD135)係指Uniprot寄存編號P36888之蛋白質及相關同功型。
如本文所用，「FLT3L」(亦稱FLT3-配位體)係指Uniprot寄存編號P49771之蛋白質及相關同功型。
在整個說明書中，在組合物描述為具有、包括或包含特定組分之情況下，或者在製程及方法描述為具有、包括或包含特定步驟之情況下，預期另外存在基本上由所述組分組成或由所述組分組成之本發明之組合物，且存在基本上由所述加工步驟組成或由所述加工步驟組成的根據本發明之製程及方法。
一般而言，除非另作說明，否則指定百分比之組合物係以重量計。此外，若變數未伴有定義，則以變數之先前定義為準。I. 蛋白質
本發明提供結合於自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體以及腫瘤相關抗原FLT3的多特異性結合蛋白。多特異性結合蛋白可用於本文所述之醫藥組合物及治療方法。多特異性結合蛋白結合於自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體可增強自然殺手細胞破壞表現FLT3之腫瘤細胞的活性。多特異性結合蛋白結合於表現FLT3之腫瘤細胞使此等細胞接近自然殺手細胞，此幫助對準腫瘤細胞及自然殺手細對胞腫瘤細胞之間接破壞。結合NKG2D、CD16及另一個標靶之多特異性結合蛋白揭示於國際申請公開案第WO2018148445號及第WO2019157366號中，該等公開案不以引用之方式併入本文中。下文提供一些示例性多特異性結合蛋白之其他描述。
多特異性結合蛋白之第一組分為結合於表現NKG2D受體之細胞的抗原結合位點，該等細胞可包括但不限於NK細胞、γδ T細胞及CD8+ αβ T細胞。在NKG2D結合後，多特異性結合蛋白可阻斷諸如ULBP6及MICA之天然配位體結合於NKG2D及活化NK細胞。
多特異性結合蛋白之第二組分為結合FLT3之抗原結合位點。表現FLT3之細胞可見於例如急性骨髓性白血病(AML)及急性淋巴母細胞白血病(ALL)。可發現與其他癌症及腫瘤類型，例如血液惡性病、白血病、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、骨髓化生不良、急性T淋巴母細胞性白血病及急性前髓細胞白血病相關之表現FLT3之細胞。
多特異性結合蛋白之第三組分為結合於表現CD16之細胞的抗體Fc域或其一部分或抗原結合位點，CD16為在包括自然殺手細胞、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、肥大細胞及濾泡樹突狀細胞之白細胞表面上的Fc受體。
多特異性結合蛋白之額外抗原結合位點可結合FLT3。在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點為scFv，且結合FLT3之第二抗原結合位點及結合FLT3之額外抗原結合位點各自為Fab片段。在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點為scFv，且結合FLT3之第二抗原結合位點及結合FLT3之額外抗原結合位點各自為scFv。
抗原結合位點各可併入抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域(例如呈抗體中排列，或融合在一起，形成scFv)，或抗原結合位點中之一或多個可為單域抗體，諸如VH H抗體如駱駝科抗體，或VNAR 抗體如軟骨魚中發現之VNAR 抗體。
在一些實施例中，第二抗原結合位點併入胺基酸序列與第一抗原結合位點中存在之輕鏈可變域之胺基酸序列一致的輕鏈可變域。
本文所述之多特異性結合蛋白可採取多種格式。舉例而言，一種格式為包括第一免疫球蛋白重鏈、第一免疫球蛋白輕鏈、第二免疫球蛋白重鏈及第二免疫球蛋白輕鏈之異二聚體多特異性抗體(圖1)。第一免疫球蛋白重鏈包括第一Fc (鉸鏈-CH2-CH3)域、第一重鏈可變域及視情況第一CH1重鏈域。第一免疫球蛋白輕鏈包括第一輕鏈可變域及視情況第一輕鏈恆定域。第一免疫球蛋白輕鏈與第一免疫球蛋白重鏈一起形成結合NKG2D之抗原結合位點。第二免疫球蛋白重鏈包含第二Fc (鉸鏈-CH2-CH3)域、第二重鏈可變域及視情況第二CH1重鏈域。第二免疫球蛋白輕鏈包括第二輕鏈可變域及視情況第二輕鏈恆定域。第二免疫球蛋白輕鏈與第二免疫球蛋白重鏈一起形成結合FLT3之抗原結合位點。第一Fc域及第二Fc域一起能夠結合於CD16 (圖1)。在一些實施例中，第一免疫球蛋白輕鏈與第二免疫球蛋白輕鏈一致。
另一種示例性格式涉及包括第一免疫球蛋白重鏈、第二免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈之異二聚體多特異性抗體(圖2A)。第一免疫球蛋白重鏈包括第一Fc (鉸鏈-CH2-CH3)域，該Fc域經由連接子或抗體鉸鏈與由配對且結合NKG2D或結合FLT3之重鏈可變域及輕鏈可變域構成之單鏈可變片段(scFv)融合。第二免疫球蛋白重鏈包括第二Fc (鉸鏈-CH2-CH3)域、第二重鏈可變域及CH1重鏈域。免疫球蛋白輕鏈包括輕鏈可變域及輕鏈恆定域。第二免疫球蛋白重鏈與免疫球蛋白輕鏈配對且結合於NKG2D或結合FLT3。第一Fc域及第二Fc域一起能夠結合於CD16 (圖2A)。
另一種示例性格式涉及包括第一免疫球蛋白重鏈及第二免疫球蛋白重鏈之異二聚體多特異性抗體(圖2B)。第一免疫球蛋白重鏈包括第一Fc (鉸鏈-CH2-CH3)域，該Fc域經由連接子或抗體鉸鏈與由配對且結合NKG2D或結合FLT3之重鏈可變域及輕鏈可變域構成之單鏈可變片段(scFv)融合。第二免疫球蛋白重鏈包括第二Fc (鉸鏈-CH2-CH3)域，該Fc域經由連接子或抗體鉸鏈與由配對且結合NKG2D或結合FLT3之重鏈可變域及輕鏈可變域構成之單鏈可變片段(scFv)融合。第一Fc域及第二Fc域一起能夠結合於CD16 (圖2B)。
在一些實施例中，上述單鏈可變片段(scFv)經由鉸鏈序列連接於抗體恆定域。在一些實施例中，鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser或Gly-Ser。在一些實施例中，連接結合NKG2D之scFv與抗體重鏈恆定域之鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser。在一些實施例中，連接結合FLT3之scFv與抗體重鏈恆定域之鉸鏈包含胺基酸Gly-Ser。在一些其他實施例中，鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser及Thr-Lys-Gly。鉸鏈序列可提供結合於標靶抗原之可撓性及可撓性與最佳幾何形狀之間的平衡。
在一些實施例中，上述單鏈可變片段(scFv)包括重鏈可變域及輕鏈可變域。在一些實施例中，重鏈可變域與輕鏈可變域形成二硫橋鍵，以增強scFv之穩定性。舉例而言，可在重鏈可變域之C44殘基與輕鏈可變域之C100殘基之間形成二硫橋鍵，胺基酸位置根據Kabat進行編號。在一些實施例中，重鏈可變域經由可撓性連接子連接於輕鏈可變域。可使用任何合適連接子，例如(G4 S)4 連接子。在scFv之一些實施例中，重鏈可變域位於輕鏈可變域之N端。在scFv之一些實施例中，重鏈可變域位於輕鏈可變域之C端。
本文所述之多特異性結合蛋白可進一步包括一或多個額外抗原結合位點。額外抗原結合位點可與恆定區CH2域之N端或恆定區CH3域之C端視情況經由連接子序列融合。在某些實施例中，額外抗原結合位點採取單鏈可變區(scFv)之形式，其視情況經二硫化物穩定，產生四價或三價多特異性結合蛋白。舉例而言，多特異性結合蛋白包括結合NKG2D之第一抗原結合位點、結合FLT3之第二抗原結合位點、結合FLT3之額外抗原結合位點及足以結合CD16之抗體恆定區或其一部分或結合CD16之第四抗原結合位點。此等抗原結合位點中之任一者可採取Fab片段或scFv的形式，諸如上述scFv。
在一些實施例中，額外抗原結合位點結合與第二抗原結合位點不同的FLT3之抗原決定基。在一些實施例中，額外抗原結合位點結合與第二抗原結合位點相同之抗原決定基。在一些實施例中，額外抗原結合位點包含與第二抗原結合位點相同之重鏈及輕鏈CDR序列。在一些實施例中，額外抗原結合位點包含與第二抗原結合位點相同之重鏈及輕鏈可變域序列。在一些實施例中，額外抗原結合位點具有與第二抗原結合位點相同之胺基酸序列。示例性格式展示於圖2C及2D中。因此，多特異性結合蛋白可提供FLT3之二價接合。多特異性蛋白對FLT3之二價接合可將FLT3穩定在腫瘤細胞表面上且增強NK細胞對腫瘤細胞之細胞毒性。多特異性蛋白對FLT3之二價接合可賦予更強的多特異性蛋白對腫瘤細胞之結合，藉此促進更強的NK細胞對腫瘤細胞、尤其對表現低水準FLT3之腫瘤細胞之細胞毒性反應。
多特異性結合蛋白可採取額外格式。在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈三功能抗體形式，其為保持IgG樣形狀之三官能雙特異性抗體。此嵌合體由兩個半抗體組成，各半抗體具有來源於兩個親本抗體之一個輕鏈及一個重鏈。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白為KiH形式，其涉及杵-臼(KiH)技術。KiH涉及對CH 3域進行工程改造，以在各重鏈中建立「杵」或「臼」以促進異二聚。「杵-臼(KiH)」Fc技術背後之概念係藉由用體積大之殘基取代小殘基(例如EU編號中T366WCH3A )而在一個CH3域中引入「杵」(CH3A)。為容納「杵」，藉由用較小殘基替換最鄰近之殘基(例如T366S/L368A/Y407VCH3B )，在其他CH3域(CH3B)上建立互補「 臼」表面。「臼」突變藉由結構引導之噬菌體文庫篩選來優化(Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library,J. Mol. Biol. (1997) 270(1):26-35)。KiH Fc變異體之X射綫晶體結構 (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C等人, Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction.J. Mol. Biol. (2014) 426(9):1947-57；Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcγRs.Mol. Immunol. (2014) 58(1):132-8)顯示藉由CH3域間核心界面上之空間互補性推動之疏水性相互作用，在熱力學上有助於異二聚，而杵-杵及臼-臼分別由於位阻及有利之相互作用的破環而不利於同二聚。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈雙重可變域免疫球蛋白(DVD-Ig™)形式，其經由天然存在之可撓性連接子組合兩種單株抗體之標靶結合域且產生四價IgG樣分子。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈正交Fab界面(Ortho-Fab)形式。在ortho-Fab IgG方法(Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL等人, Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface.Nat. Biotechnol. (2014) 32(2):191-8)中，基於結構之區域設計只在一個Fab片段中之LC及HCVH-CH1 界面上引入互補突變，另一個Fab片段無任何改變。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈2合1型Ig格式。在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈ES形式，其為含有與Fc融合的兩個結合於標靶1及標靶2之不同Fab片段的異二聚體構築體。藉由Fc之靜電轉向突變確保異二聚。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈κλ-體形式，其為具有與藉由異二聚突變穩定之Fc融合之兩個不同Fab片段的異二聚體構築體：靶向抗原1之Fab片段1含有κLC，而靶向抗原2之第二Fab片段含有λLC。圖13A為κλ-體之一種形式的示例性圖示；圖13B為另一κλ-體之示例性圖示。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈Fab臂交換形式(藉由用來自另一分子之重鏈-輕鏈對替換重鏈及所附接之輕鏈(半分子)來交換Fab片段臂的抗體，產生雙特異性抗體)。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈SEED體形式。鏈交換之工程改造域(SEED)平台經設計以產生不對稱及雙特異性抗體樣分子，能夠擴大天然抗體之治療性應用。此蛋白質工程改造平台係基於交換保守CH3域內之免疫球蛋白之結構相關序列。SEED設計允許有效產生AG/GA異二聚體，同時不支持AG及GA SEED CH3域之同二聚。(Muda M.等人,Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54))。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈LuZ-Y形式，其中白胺酸拉煉用於誘導兩個不同HC之異二聚。(Wranik, BJ.等人,J. Biol. Chem. (2012), 287:43331-9)。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈Cov-X體形式。在雙特異性CovX體中，兩種不同肽使用支鏈氮雜環丁酮連接子接合在一起且與支架抗體在溫和條件下以位點特異性方式融合。藥效基團負責功能活性，而抗體支架給予長半衰期及Ig樣分佈。藥效基團可在化學上優化或用其他藥效基團替換以產生優化或獨特的雙特異性抗體。(Doppalapudi VR等人,PNAS (2010), 107(52);22611-22616)。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈Oasc-Fab異二聚體形式，其包括與Fc融合的結合於標靶1之Fab片段及結合於標靶2之scFab。藉由Fc之突變確保異二聚。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈DuetMab形式，其為含有兩個結合於抗原1及2之不同Fab片段及藉由異二聚突變穩定之Fc的異二聚體構築體。Fab片段1及2含有確保正確LC與HC配對之差別S-S橋。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈CrossmAb形式，其為具有與藉由異二聚突變穩定之Fc融合的兩個結合於標靶1及2之不同Fab片段的異二聚體構築體。CL及CH1域與VH及VL域切換，例如CH1與VL同框融合，而CL與VH同框融合。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白呈Fit-Ig形式，其為同二聚體構築體，其中結合於抗原2之Fab片段與結合於抗原1之Fab片段之HC的N端融合。構築體含有野生型Fc。
下文更詳細地描述多特異性結合蛋白之個別組分。 NKG2D 結合位點
在結合於自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體以及癌細胞上之腫瘤相關抗原後，多特異性結合蛋白可接合超過一種NK活化受體，且可阻斷天然配位體與NKG2D之結合。在某些實施例中，蛋白質可折磨人類中之NK細胞。在一些實施例中，蛋白質可折磨人類中及諸如嚙齒動物及食蟹獼猴之其他物種中的NK細胞。
表1列出組合時可結合於NKG2D之重鏈可變域及輕鏈可變域之肽序列。在一些實施例中，重鏈可變域及輕鏈可變域呈Fab格式排列。在一些實施例中，重鏈可變域及輕鏈可變域融合在一起，形成scFv。
表1中列出之NKG2D結合位點在與NKG2D之結合親和力方面可變化，然而，其均活化人類NK細胞。
除非另外指示，否則表1中提供之CDR序列係根據Kabat確定。
表1      
純系 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列
ADI-27705 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:138) CDR1 (SEQ ID NO:140) – GSFSGYYWS CDR2 (SEQ ID NO:141) – EIDHSGSTNYNPSLKS CDR3 (SEQ ID NO:142) – ARARGPWSFDP DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:139)
ADI-27724 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:143) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:144)
ADI-27740 (A40) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:145) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSFYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:146)
ADI-27741 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:147) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQSNSYYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:148)
ADI-27743 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:149) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:150)
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ADI-28226 (C26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:153) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:154)
ADI-28154    QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:155) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:156)
ADI-29399 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:157) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:158)
ADI-29401 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:159) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDIYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:160)
ADI-29403 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:162) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:163)
ADI-29405 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:164) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:165)
ADI-29407 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:166) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:167)
ADI-29419 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:168) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSSFSTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:169)
ADI-29421 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:170) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYESYSTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:171)
ADI-29424 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:172) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSFITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:173)
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ADI-29426 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:176) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:177)
ADI-29429 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:178) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYELYSYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:179)
ADI-29447 (F47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:180) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDTFITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:181)
ADI-27727    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDSSIRHAYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:182) CDR1 (SEQ ID NO:184) – GTFSSYAIS (非Kabat)或SYAIS (SEQ ID NO:185) CDR2 (SEQ ID NO:186) – GIIPIFGTANYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO:189) – ARGDSSIRHAYYYYGMDV (非Kabat)或GDSSIRHAYYYYGMDV (SEQ ID NO:190) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:183) CDR1 (SEQ ID NO:187) – KSSQSVLYSSNNKNYLA CDR2 (SEQ ID NO:188) – WASTRES CDR3 (SEQ ID NO:191) – QQYYSTPIT
ADI-29443 (F43) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSDRFHPYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:192) CDR1 (SEQ ID NO:193) – GSISSSSYYWG (非Kabat)或SSSYYWG (SEQ ID NO:194) CDR2 (SEQ ID NO:195) – SIYYSGSTYYNPSLKS CDR3 (SEQ ID NO:196) – ARGSDRFHPYFDY (非Kabat)或GSDRFHPYFDY (SEQ ID NO:197) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFDTWPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:161) CDR1 (SEQ ID NO:198) – RASQSVSRYLA CDR2 (SEQ ID NO:199) – DASNRAT CDR3 (SEQ ID NO:200) – QQFDTWPPT
ADI-29404 (F04) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:201) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCEQYDSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:202)
ADI-28200 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGRKASGSFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:203) CDR1 (SEQ ID NO:184) – GTFSSYAIS CDR2 (SEQ ID NO:205) – GIIPIFGTANYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO:206) – ARRGRKASGSFYYYYGMDV DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:204) CDR1 (SEQ ID NO:207) – ESSQSLLNSGNQKNYLT CDR2 (SEQ ID NO:188) – WASTRES CDR3 (SEQ ID NO:208) – QNDYSYPYT
ADI-29379 (E79) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGAPNYGDTTHDYYYMDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:209) CDR1 (SEQ ID NO:211) – YTFTSYYMH (非Kabat)或SYYMH (SEQ ID NO:212) CDR2 (SEQ ID NO:213) - IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO:214) – ARGAPNYGDTTHDYYYMDV (非Kabat)或GAPNYGDTTHDYYYMDV (SEQ ID NO:215) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDDWPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:210) CDR1 (SEQ ID NO:216) - RASQSVSSNLA CDR2 (SEQ ID NO:217) - GASTRAT CDR3 (SEQ ID NO:218) - QQYDDWPFT
ADI-29463 (F63) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDTGEYYDTDDHGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:219) CDR1 (SEQ ID NO:221) -  YTFTGYYMH (非Kabat)或GYYMH (SEQ ID NO:222) CDR2 (SEQ ID NO:223) - WINPNSGGTNYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO:224) – ARDTGEYYDTDDHGMDV  (非Kabat)或DTGEYYDTDDHGMDV (SEQ ID NO:225) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDDYWPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:220) CDR1 (SEQ ID NO:226) -  RASQSVSSNLA CDR2 (SEQ ID NO:217) - GASTRAT CDR3 (SEQ ID NO:227) - QQDDYWPPT
ADI-27744 (A44) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGGYYDSGAGDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:228) CDR1 (SEQ ID NO:230) – FTFSSYAMS (非Kabat)或SYAMS (SEQ ID NO:231) CDR2 (SEQ ID NO:232) -  AISGSGGSTYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO:233) - AKDGGYYDSGAGDY (非Kabat)或DGGYYDSGAGDY (SEQ ID NO:234) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSYPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:229) CDR1 (SEQ ID NO:235) - RASQGIDSWLA CDR2 (SEQ ID NO:236) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:237) - QQGVSYPRT
ADI-27749 (A49) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:238) CDR1 (SEQ ID NO:240) – FTFSSYSMN (非Kabat)或SYSMN (SEQ ID NO:241) CDR2 (SEQ ID NO:242) - SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO:243) – ARGAPMGAAAGWFDP (非Kabat)或GAPMGAAAGWFDP (SEQ ID NO:244) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:239) CDR1 (SEQ ID NO:276) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:236) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:245) - QQGVSFPRT
在VH中具有Q44C且VL中具有G100C之scFv (VL-VH)，連接子加下劃綫：DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFG C GTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGK C LEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:246)
ADI-29378 (E78) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGAGFAYGMDYYYMDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:247) CDR1 (SEQ ID NO:211) – YTFTSYYMH (非Kabat)或SYYMH (SEQ ID NO:212) CDR2 (SEQ ID NO:249) - IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO:250) – AREGAGFAYGMDYYYMDV  (非Kabat)或EGAGFAYGMDYYYMDV (SEQ ID NO:251) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSDNWPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:248) CDR1 (SEQ ID NO:252) - RASQSVSSYLA CDR2 (SEQ ID NO:199) - DASNRAT CDR3 (SEQ ID NO:253) - QQSDNWPFT
A49MI EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAP I GAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:254) CDR1: FTFSSYSMN (SEQ ID NO:240) (非Kabat)或SYSMN (SEQ ID NO:241) CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:242) CDR3: (非Kabat) ARGAP I GAAAGWFDP (SEQ ID NO:255)或GAP I GAAAGWFDP (SEQ ID NO:256) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:239) CDR1 (SEQ ID NO:276) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:236) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:245) - QQGVSFPRT
A49MQ EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAP Q GAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:257) CDR1: FTFSSYSMN (SEQ ID NO:240) (非Kabat)或SYSMN (SEQ ID NO:241) CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:242) CDR3 (非Kabat) (SEQ ID NO:258) - ARGAPQ GAAAGWFDP或CDR3 (SEQ ID NO:259) - GAPQ GAAAGWFDP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:239) CDR1 (SEQ ID NO:276) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:236) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:245) - QQGVSFPRT   
A49ML EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPL GAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:260) CDR1: FTFSSYSMN (SEQ ID NO:240) (非Kabat)或SYSMN (SEQ ID NO:241) CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:242) CDR3 (非Kabat) (SEQ ID NO:261) - ARGAPL GAAAGWFDP或CDR3 (SEQ ID NO:262) - GAPL GAAAGWFDP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:239) CDR1 (SEQ ID NO:276) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:236) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:245) - QQGVSFPRT
A49MF EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPF GAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:263) CDR1: FTFSSYSMN (SEQ ID NO:240) (非Kabat)或SYSMN (SEQ ID NO:241 ) CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:242) CDR3 (非Kabat) (SEQ ID NO:264) - ARGAPF GAAAGWFDP或CDR3 (SEQ ID NO:265) - GAPF GAAAGWFDP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:239) CDR1 (SEQ ID NO:276) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:236) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:245) - QQGVSFPRT
A49MV EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPV GAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:266) CDR1: FTFSSYSMN (SEQ ID NO:240) (非Kabat)或SYSMN (SEQ ID NO:241 ) CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:242) CDR3 (非Kabat) (SEQ ID NO:267) - ARGAPV GAAAGWFDP或CDR3 (SEQ ID NO:268) - GAPV GAAAGWFDP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:239) CDR1 (SEQ ID NO:276) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:236) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:245) - QQGVSFPRT
A49-一致 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPX GAAAGWFDPWGQGTLVTVSS，其中X為M、L、I、V、Q或F (SEQ ID NO:269) CDR1: FTFSSYSMN (SEQ ID NO:240) (非Kabat)或SYSMN (SEQ ID NO:241 ) CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:242) CDR3 (非Kabat) (SEQ ID NO:270) - ARGAPX GAAAGWFDP或CDR3 (SEQ ID NO:271) – GAPX GAAAGWFDP，其中X為M、L、I、V、Q或F DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:239) CDR1 (SEQ ID NO:276) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:236) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:245) - QQGVSFPRT
US 9,273,136中之NKG2D結合劑 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:272) QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:273)
US 7,879,985中之NKG2D結合劑 QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:274) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:275)
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點(例如人類NKG2D)包含：包含與表1中所揭示之抗體的VH至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的抗體重鏈可變域(VH)，及包含與表1中所揭示之相同抗體的VH至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的抗體輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含表1中揭示之抗體之VH及VL序列的根據Kabat或所屬領域中已知之任何其他CDR確定方法確定之重鏈CDR1、CDR2及CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3 (參見Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH公開案第91-3242號, Bethesda)、Chothia (參見例如Chothia C及Lesk A M, (1987), J Mol Biol 196: 901-917)、MacCallum (參見MacCallum R M等人, (1996) J Mol Biol 262: 732-745)。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含表1中揭示之抗體之重鏈CDR1、CDR2及CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，結合於NKG2D之第一抗原結合位點包含與SEQ ID NO:138相關，例如具有與SEQ ID NO:138至少90% (例如至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列，及/或併入與SEQ ID NO:138之CDR1 (SEQ ID NO:140)、CDR2 (SEQ ID NO:141)及CDR3 (SEQ ID NO:142)序列一致之胺基酸序列的重鏈可變域。與SEQ ID NO:138相關之重鏈可變域可與多種輕鏈可變域偶合，形成NKG2D結合位點。舉例而言，併入與SEQ ID NO:138相關之重鏈可變域之第一抗原結合位點可進一步併入選自與SEQ ID NO: 139、144、146、148、150、154、156、158、160、163、165、167、169、171、173、175、177、179及181相關之序列中之任一者的輕鏈可變域。舉例而言，第一抗原結合位點併入具有與SEQ ID NO:138至少90% (例如至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的重鏈可變域及具有與選自SEQ ID NO: 139、144、146、148、150、154、156、158、160、163、165、167、169、171、173、175、177、179及181之序列中之任一者至少90% (例如至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的輕鏈可變域。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:182之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:183至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 184或185、186及189或190之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 187、188及191之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 184或185、186及189或190之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 187、188及191之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:192之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:161至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 193或194、195及196或197之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 198、199及200之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 193或194、195及196或197之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 198、199及200之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:201之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:202至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:203之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:204至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 184、205及206之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 207、188及208之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 184、205及206之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 207、188及208之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:209之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:210至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 211或212、213及214或215之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 216、217及218之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 211或212、213及214或215之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 216、217及218之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:219之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:220至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 221或222、223及224或225之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 226、217及227之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 221或222、223及224或225之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 226、217及227之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:247之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:248至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 211或212、249及250或251之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 252、199及253之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 211或212、249及250或251之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 252、199及253之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:228之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:229至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 230或231、232及233或234之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 235、236及237之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 230或231、232及233或234之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 235、236及237之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:238之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:239至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及243或244之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及243或244之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:254之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:239至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及255或256之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及255或256之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:257之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:239至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及258或259之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及258或259之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:260之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:239至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及261或262之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及261或262之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:263之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:239至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及264或265之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及264或265之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:266之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:239至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及267或268之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及267或268之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:269之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:239至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及270或271之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及270或271之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:272之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:273至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:274之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:275至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。
多特異性結合蛋白可結合於表現NKG2D之細胞，包括但不限於NK細胞、γδ T細胞及CD8+ αβ T細胞。在NKG2D結合後，多特異性結合蛋白可阻斷諸如ULBP6及MICA之天然配位體結合於NKG2D及活化NK細胞。
多特異性結合蛋白結合於表現CD16之細胞，CD16為包括自然殺手細胞、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、肥大細胞及濾泡樹突狀細胞之白細胞之表面上的Fc受體。本揭示案之蛋白質以KD 如下之親和力結合於NKG2D：2 nM至120 nM，例如2 nM至110 nM、2 nM至100 nM、2 nM至90 nM、2 nM至80 nM、2 nM至70 nM、2 nM至60 nM、2 nM至50 nM、2 nM至40 nM、2 nM至30 nM、2 nM至20 nM、2 nM至10 nM、約15 nM、約14 nM、約13 nM、約12 nM、約11 nM、約10 nM、約9 nM、約8 nM、約7 nM、約6 nM、約5 nM、約4.5 nM、約4 nM、約3.5 nM、約3 nM、約2.5 nM、約2 nM、約1.5 nM、約1 nM、介於約0.5 nM至約1 nM、約1 nM至約2 nM、約2 nM至3 nM、約3 nM至4 nM，約4 nM至約5 nM、約5 nM至約6 nM、約6 nM至約7 nM、約7 nM至約8 nM、約8 nM至約9 nM、約9 nM至約10 nM、約1 nM至約10 nM、約2 nM至約10 nM、約3 nM至約10 nM、約4 nM至約10 nM、約5 nM至約10 nM、約6 nM至約10 nM、約7 nM至約10 nM或約8 nM至約10 nM之間。在一些實施例中，NKG2D結合位點以10至62 nM之KD 結合於NKG2D。 FLT3 結合位點
本文揭示之多特異性結合蛋白之FLT3結合位點包含重鏈可變域及輕鏈可變域。表2列出組合時可結合於FLT3之重鏈可變域及輕鏈可變域之一些示例性序列。CDR序列係根據Chothia編號鑑別。表 2 ：結合 FLT3 之示例性抗原結合位點之序列
純系 VH VL
12H10.G7 EVQLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTRYVMHWVKQRPGQGLEWIGFINPYNDDTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO:1] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRSDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEEPWTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:2] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB87/GB95 (VH及VL中之回復突變加下劃綫) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITS DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYH CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:9] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTISSLQAEDA AT YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:10] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]   
人類化12H10.G7 GB87/GB95之scFv GB87 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:3] GB95 (VL-VH)： DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:12]
人類化12H10.G7 GB88/GB96 (VH及VL中之回復突變加下劃綫) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYH CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:13] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTISSLQAEDA AT YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:10] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB88/GB96之scFv GB88 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:15] GB96 (VL-VH)： DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:16]
人類化12H10.G7 GB89/GB97 (VH及VL中之回復突變加下劃綫) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITS DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:17] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTISSLQAEDA AT YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:10] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB89/GB97之scFv GB89 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:19] GB97 (VL-VH)： DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:20]
人類化12H10.G7 GB90/GB98 (VH及VL中之回復突變加下劃綫) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITS DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYH CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:9] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTISSLQAEDA AT YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:22]    CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB90/GB98之scFv GB90 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:23] GB98 (VL-VH)： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:24]
人類化12H10.G7 GB91/GB99 (VH及VL中之回復突變加下劃綫) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITS DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYH CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:9] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDA AT YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:26]    CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB91/GB99之scFv GB91 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:27]    GB99 (VL-VH)： DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:28]
人類化12H10.G7 GB92/GB100 (VH及VL中之回復突變加下劃綫) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITS DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYH CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:9] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTISSLQAEDVAT YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:30] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB92/GB100之scFv GB92 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:31] GB100 (VL-VH)： DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTV [SEQ ID NO:32]
人類化12H10.G7 GB93/GB101 (VH及VL中之回復突變加下劃綫) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITS DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYH CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:9] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTISSLQAEDA AVYYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:34] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB93/GB101之scFv GB93 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:35] GB101 (VL-VH)： DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:36]
人類化12H10.G7 GB94/GB102    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:37] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:38] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB94/GB102之scFv GB94 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:39] GB102 (VL-VH)： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:40]
人類化12H10.G7 GB102 D101E QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLESWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:41] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:42] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB102 D101E之scFv VH-VL：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLESWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:43] VL-VH： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLESWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:44]
人類化12H10.G7 GB102 M34I QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVIHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:45] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:42] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT  [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB102 M34I之scFv VH-VL： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVIHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:47] VL-VH：DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVIHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:48]
人類化12H10.G7 GB102 M34I/ D101E QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVIHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLESWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:49] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLES  [SEQ ID NO:50] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:42] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT  [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB102 M34I/D101E之scFv VH-VL： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVIHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLESWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:51] VL-VH：DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVIHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLESWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:52]
人類化12H10.G7一致1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVX1 HWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLX2 SWGQGTTVTVSS 其中X1 為M或I，且X2 為E或D [SEQ ID NO:53] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLXS，其中X為E或D [SEQ ID NO:55] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:42] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT  [SEQ ID NO:8]   
人類化12H10.G7一致2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITX1 DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYX2 CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS 其中X1 為S或R，且X2 為Y或H [SEQ ID NO:56] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPX1 SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSX2 TDFTLTISSLQAEDX3 AX4 YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK 其中X1 為A或D，X2 為R或G，且X3 為A或V，且X4 為T或V [SEQ ID NO:57] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7一致3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVX1 HWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLX2 SWGQGTTVTVSS 其中X1 為M或I，且X2 為E或D [SEQ ID NO:58] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLXS，其中X為E或D [SEQ ID NO:55] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:42] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT  [SEQ ID NO:8]
14A5.E8 EVQLQESGAELVQPGASVRLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSSIINYNENFKNRATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO:60] CDR1：GYTFTSY [SEQ ID NO:62] CDR2：YPGSSI [SEQ ID NO:63] CDR3：RVVYLYFDY [SEQ ID NO:64] QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWTSKSPTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:61] CDR1：SASSSVSYMH [SEQ ID NO:65] CDR2：DTSKLAS [SEQ ID NO:66] CDR3：QQWTSKSPT [SEQ ID NO:67]
人類化14A5.E8 1551/1552 (VH及VL中之回復突變加下劃綫) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYWINWVRQR PGKGLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTV DTSS DTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:68] CDR1：GYTFTSY [SEQ ID NO:62] CDR2：YPGSSI [SEQ ID NO:63] CDR3：RVVYLYFDY [SEQ ID NO:64] EIVLTQSPATLSLSPGEK ATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTS FTLTISSLEPEDA AVYYCQQWTSKSPTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:69] CDR1：SASSSVSYMH [SEQ ID NO:65] CDR2：DTSKLAS [SEQ ID NO:66] CDR3：QQWTSKSPT [SEQ ID NO:67]
人類化14A5.E8 1551/1552之scFv 1551 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYWINWVRQRPGKCLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTVDTSSDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGEKATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTSFTLTISSLEPEDAAVYYCQQWTSKSPTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:70] 1552 (VL-VH)： EIVLTQSPATLSLSPGEKATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTSFTLTISSLEPEDAAVYYCQQWTSKSPTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYWINWVRQRPGKCLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTVDTSSDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:71]
人類化14A5.E8 1553/1554 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYWINWVRQAPGKGLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:72] CDR1：GYTFTSY [SEQ ID NO:62] CDR2：YPGSSI [SEQ ID NO:63] CDR3：RVVYLYFDY [SEQ ID NO:64] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:73] CDR1：SASSSVSYMH [SEQ ID NO:65] CDR2：DTSKLAS [SEQ ID NO:66] CDR3：QQWTSKSPT [SEQ ID NO:67]
人類化14A5.E8 1553/1554之scFv 1553 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYWINWVRQAPGKCLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:74]    1554 (VL-VH)： EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYWINWVRQAPGKCLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:75]
人類化14A5.E8 1689 (自親和力成熟1553) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFPYYWINWVRQAPGKGLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRNVYLTFDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:76] CDR1：GYTFPYY [SEQ ID NO:78] CDR2：YPGSSI [SEQ ID NO:63] CDR3：RNVYLTFDY [SEQ ID NO:79] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:77] CDR1：SASSSVSYIH [SEQ ID NO:80] CDR2：DTSKLAS [SEQ ID NO:66] CDR3：QQWTSKSPT [SEQ ID NO:67]
人類化14A5.E8 1689 (自1553親和力成熟)之scFv VH-VL： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFPYYWINWVRQAPGKCLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRNVYLTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:81] VL-VH： EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFPYYWINWVRQAPGKCLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRNVYLTFDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:82]
人類化14A5.E8一致 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFX1 X2 YWINWVRQX3 PGKX4 LEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTX5 DTSX6 DTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRX7 VYLX8 FDYWGQGTLVTVSS 其中X1 為P或T，X2 為S或Y，X3 為A或R，X4 為C或G，X5 為V或E，X6 為S或T，X7 為N或V，且X8 為T或Y [SEQ ID NO:29] CDR1：GYTFX1 X2 Y，其中X1為P或T，且X2 為S或Y [SEQ ID NO:59] CDR2：YPGSSI [SEQ ID NO:63] CDR3：RX1 VYLX2 FDY，其中X1 為N或V，且X2 為T或Y [SEQ ID NO:54] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYXHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGGGTKVEIK 其中X為M或I [SEQ ID NO:84] CDR1：SASSSVSYXH，其中X為M或I [SEQ ID NO:86] CDR2：DTSKLAS [SEQ ID NO:66] CDR3：QQWTSKSPT [SEQ ID NO:67]
11F4.B9 EVQLQESGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYIHWVKQGPEKSLEWIGEIIPSTGSTIYNQKFKAKATLTVDKSSSTAYLQLKSLTSEDSAVYYCERWGDYYGRDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO:85] CDR1：GYSFTGY [SEQ ID NO:87] CDR2：IPSTGS [SEQ ID NO:88] CDR3：WGDYYGRDY [SEQ ID NO:89] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPRTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:90] CDR1：RASESVDIYGNSFMH [SEQ ID NO:91] CDR2：RASNLES [SEQ ID NO:92] CDR3：QQSNEDPRT [SEQ ID NO:93]
人類化11F4.B9 (回復突變加下劃綫) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQG PGQGLEWMGEIIPSTGSTIYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCE RWGDYYGRDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:14] CDR1：GYSFTGY [SEQ ID NO:87] CDR2：IPSTGS [SEQ ID NO:88] CDR3：WGDYYGRDY [SEQ ID NO:89] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTIN SLQAEDVAT YYCQQSNEDPRTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:94] CDR1：RASESVDIYGNSFMH [SEQ ID NO:91] CDR2：RASNLES [SEQ ID NO:92] CDR3：QQSNEDPRT [SEQ ID NO:93]
4A4.A3 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLTTYGMGVGWIRQPSGKGLEWLANIWFNDNKYYNSTLKSRLTISKDTSNNQVFLKISSVDTTDTATYYCAQITTVVGTFDYWGQGSPLTVSP [SEQ ID NO:95] CDR1：GFSLTTYGM [SEQ ID NO:97] CDR2：WFNDN [SEQ ID NO:99] CDR3：ITTVVGTFDY [SEQ ID NO:100] RIVMTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSIYLHWYQQKPGFSPKLLIFRTSDLASGVPPRFGGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSFPRTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:96] CDR1：SASSSISSIYLH [SEQ ID NO:101] CDR2：RTSDLAS [SEQ ID NO:102] CDR3：QQGSSFPRT [SEQ ID NO:103]
4A4.H7 EVQLQESGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYIHWVKQSPEESLEWIGEIYPNTGITTYNQKFTAKATLTVDKSSNTAYMQLKSLTSEDSAVYYCTRWGDYYGRDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO:104] CDR1：GYSFTGY [SEQ ID NO:87] CDR2：YPNTGI [SEQ ID NO:98] CDR3：WGDYYGRDY [SEQ ID NO:89] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASETVDTHGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPRTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:105] CDR1：RASETVDTHGNSFMH [SEQ ID NO:106] CDR2：RASNLES [SEQ ID NO:92] CDR3：QQSNEDPRT [SEQ ID NO:93]
15A11.C8 EVQLQESGGGLVKTGGSRKLSCAASGFTFSDYGMHWVRHTPEKGLEWVVYISSGGNTIFYTDTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAVYFCVRQGYYYAMDYWGQGASVTVSS [SEQ ID NO:107] CDR1：GFTFSDY [SEQ ID NO:109] CDR2：SSGGNT [SEQ ID NO:110] CDR3：QGYYYAMDY [SEQ ID NO:111] DIQMTQTTSSLSASLGDRVTIRCRASQDITNYLNWYQQKPDGAVKLLISYTSILQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQGDVATYFCQQGSSLPWTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:108] CDR1：RASQDITNYLN [SEQ ID NO:112] CDR2：YTSILQS [SEQ ID NO:113] CDR3：QQGSSLPWT [SEQ ID NO:114]
12C9.E5 EVQLQESGAELVRPGASVKLSCKASGYIFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGAIDPETGITAYSQKFKGKATLTTDTSSSTAYMEFRSLTSEDSAVYYCTRGGLLYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO:115] CDR1：GYIFTDY [SEQ ID NO:117] CDR2：DPETGI [SEQ ID NO:118] CDR3：GGLLY [SEQ ID NO:119] DVVMTQTPLSLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSDGETYLNWLQQRPGQSPKRLMYQVSKLDPGIPDRFSGSGSETDFTLKISRVEAEDLGIYYCLQGTFYPHTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:116] CDR1：KSSQSLLYSDGETYLN [SEQ ID NO:120] CDR2：QVSKLDP [SEQ ID NO:121] CDR3：LQGTFYPHT [SEQ ID NO:122]
1A2.A3 EVQLQESGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYIHWVKQSPEESLEWIGEIYPNTGITTYNQKFTAKATLTVDKSSNTAYMQLKSLTSEDSAVYYCTRWGDYYGRDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO:123] CDR1：GYSFTGY [SEQ ID NO:87] CDR2：YPNTGI [SEQ ID NO:98] CDR3：WGDYYGRDY [SEQ ID NO:89] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASETVDTHGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPRTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:124] CDR1：RASETVDTHGNSFMH [SEQ ID NO:106] CDR2：RASNLES [SEQ ID NO:92] CDR3：QQSNEDPRT [SEQ ID NO:93]
4H2.E3 EVQLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYLMHWMKQKPGQGLEWIGYINPYSDGIKYNEKFRDKATLTSDKSSNTAYMELSSLTSEDSAVYYCAHSSGYVGYAMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO:125] CDR1：GYTFTSY [SEQ ID NO:62] CDR2：NPYSDG [SEQ ID NO:33] CDR3：SSGYVGYAMDY [SEQ ID NO:127] GIVMTQTTPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTTFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIK [SEQ ID NO:126] CDR1：RSSKSLLHSNGNTYLY [SEQ ID NO:128] CDR2：RMSNLAS [SEQ ID NO:129] CDR3：MQHLEYPFT [SEQ ID NO:130]
14H8.E7 EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWINWLKQRPGQGLEWIGNIYPGSTIINYNEKFKNKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARRVVYLYFDSWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO:131] CDR1：GYTFTNY [SEQ ID NO:132] CDR2：YPGSTI [SEQ ID NO:133] CDR3：RVVYLYFDS [SEQ ID NO:134] QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIFDTSKLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTITNMETEDAATYYCQQWSSKSPTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:83] CDR1：SASSSVSYMH [SEQ ID NO:65] CDR2：DTSKLAS [SEQ ID NO:66] CDR3：QQWSSKSPT [SEQ ID NO:46]
可替代地，可結合於FLT3之新穎抗原結合位點可藉由針對與由SEQ ID NO:135定義之胺基酸序列、其成熟胞外片段或含有FLT3域之片段的結合篩選來鑑別(參見例如國際申請公開案第WO 2018/220584號)。 SEQ ID NO:135 (成熟人類FLT3胞外域) NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNIS
在某些實施例中，結合FLT3之第二抗原結合位點(例如人類FLT3)包含：包含與表2中所揭示之抗體的VH至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的抗體重鏈可變域(VH)，及包含與表2中所揭示之相同抗體的VH至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的抗體輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含表2中所揭示之抗體之VH及VL序列的根據Kabat或所屬領域中已知之任何其他CDR確定方法確定的重鏈CDR1、CDR2及CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3 (參見Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH公開案第91-3242號, Bethesda)、Chothia (參見例如Chothia C及Lesk A M, (1987), J Mol Biol 196: 901-917)、MacCallum (參見MacCallum R M等人, (1996) J Mol Biol 262: 732-745)。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含表2中所揭示之抗體之重鏈CDR1、CDR2及CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與12H10.G7相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:1之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:2至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與GB87或GB95相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:10至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 3或12至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與GB88或GB96相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:13之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:10至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 15或16至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與GB89或GB97相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:17之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:10至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 19或20至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與GB90及GB98相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:22至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 23或24至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與GB91及GB99相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:26至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 27或28至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與GB92或GB100相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:30至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 31或32至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與GB93或GB101相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:34至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 35或36至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與GB94或GB102相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:37之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:38至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 39或40至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與GB102 D101E相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:41之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:42至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及50之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 43或44至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與GB102 M34I相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:45之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:42至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 47或48至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與GB102 M34I/D101E相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:49之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:42至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及50之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及50之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 51或52至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與人類化12H10.G7相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:53之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:42至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與人類化12H10.G7相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:56之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:57至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與人類化12H10.G7相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:58之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:42至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與14A5.E8相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:60之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:61至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、63及64之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66及67之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、63及64之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66及67之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與mAb 1551或1552相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:68之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:69至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、63及64之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66及67之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、63及64之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66及67之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 70或71至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與mAb 1553或1554相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:72之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:73至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、63及64之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66及67之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、63及64之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66及67之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 74或75至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與mAb 1689相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:76之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:77至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 78、63及79之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 80、66及67之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 78、63及79之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 80、66及67之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點呈scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 81或82至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與人類化14A5.E8相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:29之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:84至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 59、63及54之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 86、66及67之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 59、63及54之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 86、66及67之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與11F4.B9相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:85之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:90至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與人類化11F4.B9相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:14之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:94至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與4A4.A3相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:95之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:96至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 97、99及100之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 101、102及103之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 97、99及100之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 101、102及103之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與4A4.H7相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:104之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:105至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與15A11.C8相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:107之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:108至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 109、110及111之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 112、113及114之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 109、110及111之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 112、113及114之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與12C9.E5相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:115之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:116至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 117、118及119之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 120、121及122之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 117、118及119之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 120、121及122之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與1A2.A3相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:123之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:124至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、98、89之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 106、92、93之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、98、89之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 106、92、93之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與4H2.E3相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:125之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:126至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、33及127之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 128、129及130之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、33及127之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 128、129及130之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與14H8.E7相關。舉例而言，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含與SEQ ID NO:131之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO:83至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列的VL。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 132、133及134之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66及46之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：(a)包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 132、133及134之胺基酸序列；及(b)包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66及46之胺基酸序列。
在前述實施例中之各者中，本文中預期一起結合FLT3之VH及/或VL序列可在不顯著影響其結合於FLT3之能力的情況下在VH及/或VL之構架區中含有胺基酸改變(例如至少1個、2個、3個、4個、5個或10個胺基酸取代、缺失或添加)。
在某些實施例中，本文揭示之第二抗原結合位點以如藉由表面電漿子共振(SPR) (例如使用下文實例1中所述之方法)或藉由生物膜層干涉測量法(BLI)所量測，1 nM或更低、5 nM或更低或10 nM或更低、15 nM或更低或20 nM或更低之KD (亦即解離常數)結合FLT3 (例如人類FLT3)，及/或結合來自個體之體液、組織及/或細胞之FLT3。在某些實施例中，如藉由(SPR) (例如使用下文實例1中所述之方法)或藉由BLI所量測，上述分離之抗體中之任一種的Kd (亦即解離速率，亦稱為Koff )等於或低於1 × 10-5 、1 × 10-4 、1 × 10-3 、5 × 10-3 、0.01、0.02或0.05 1/s。
在某些實施例中，本文揭示之第二抗原結合位點，例如與以上揭示之12H10.G7、GB87、GB88、GB89、GB90、GB91、GB92、GB93、GB94、GB95、GB96、GB97、GB98、GB99、GB100、GB101、GB102、GB102 M34I、GB102 D101E、GB102 M34I/D101E或人類化12H10.G7有關之抗原結合位點，結合具有T227M突變之人類FLT3變異體或其胞外區。hFLT3-T227M之胞外區之胺基酸序列為NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGMDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNIS (SEQ ID NO:318)。
在某些實施例中，本文揭示之第二抗原結合位點，例如與以上揭示之12H10.G7、GB87、GB88、GB89、GB90、GB91、GB92、GB93、GB94、GB95、GB96、GB97、GB98、GB99、GB100、GB101、GB102、GB102 M34I、GB102 D101E、GB102 M34I/D101E或人類化12H10.G7有關之抗原結合位點，結合具有ITD突變之人類FLT3變異體或其胞外區。hFLT3-ITD之胞外區之胺基酸序列為NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNIS (SEQ ID NO:319)。
在某些實施例中，本文揭示之第二抗原結合位點，例如與以上揭示之12H10.G7、GB87、GB88、GB89、GB90、GB91、GB92、GB93、GB94、GB95、GB96、GB97、GB98、GB99、GB100、GB101、GB102、GB102 M34I、GB102 D101E、GB102 M34I/D101E、人類化12H10.G7、14A5.E8、1551、1552、1553、1554、1689、人類化14A5.E8、11F4.B9、4A4.A3、4A4.H7、15A11.C8、1A2.A3、4H2.E3或14H8.E7有關之抗原結合位點，結合食蟹獼猴FLT3。
在某些實施例中，本文揭示之第二抗原結合位點，例如與以上揭示之12H10.G7、GB87、GB88、GB89、GB90、GB91、GB92、GB93、GB94、GB95、GB96、GB97、GB98、GB99、GB100、GB101、GB102、GB102 M34I、GB102 D101E、GB102 M34I/D101E、人類化12H10.G7、14A5.E8、1551、1552、1553、1554、1689、人類化14A5.E8、11F4.B9、4A4.A3、4A4.H7、12C9.E5、1A2.A3、4H2.E3或14H8.E7有關之抗原結合位點，不與FLT3L競爭結合FLT3。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與上述抗原結合位點競爭結合於FLT3 (例如人類FLT3、食蟹獼猴FLT3)。在某些實施例中，第二抗原結合位點與一個與以上揭示之1A2.A3有關之抗原結合位點競爭結合於FLT3。在一個實施例中，第二抗原結合位點與1A2.A3競爭結合於FLT3。在某些實施例中，本發明之第二抗原結合位點與一個與以上揭示之4A4.A3有關之抗原結合位點競爭結合於FLT3。在一個實施例中，第二抗原結合位點與4A4.A3競爭結合於FLT3。在某些實施例中，本發明之第二抗原結合位點與一個與以上揭示之4H2.E3有關之抗原結合位點競爭結合於FLT3。在一個實施例中，第二抗原結合位點與4H2.E3競爭結合於FLT3。在某些實施例中，本發明之第二抗原結合位點與一個與以上揭示之11F4.B9有關之抗原結合位點競爭結合於FLT3。在一個實施例中，第二抗原結合位點與11F4.B9競爭結合於FLT3。 Fc 域
在Fc域內，CD16結合藉由鉸鏈區及CH2域介導。舉例而言，在人類IgG1內，與CD16之相互作用主要集中在CH2域中之胺基酸殘基Asp 265-Glu 269、Asn 297-Thr 299、Ala 327-Ile 332、Leu 234-Ser 239及碳水化合物殘基N-乙醯基-D-葡糖胺上(參見Sondermann等人, Nature, 406 (6793):267-273)。基於已知之域，諸如藉由使用噬菌體呈現文庫或酵母表面呈現之cDNA文庫，可選擇突變以增強或降低對CD16之結合親和力，或可基於已知的相互作用之三維結構進行設計。因此，在某些實施例中，抗體Fc域或其部分包含鉸鏈及CH2域。
異二聚體抗體重鏈之組裝可藉由在同一細胞中表現兩種不同抗體重鏈序列來實現，該表現可引起各抗體重鏈之同二聚體之組裝以及異二聚體之組裝。促進異二聚體之優先組裝可藉由將不同突變併入各抗體重鏈恆定區之CH3域中來實現，如US13/494870、US16/028850、US11/533709、US12/875015、US13/289934、US14/773418、US12/811207、US13/866756、US14/647480及US14/830336所示。舉例而言，可基於人類IgG1且在第一多肽及第二多肽內併入允許此兩個鏈選擇性地彼此異聚之數對不同胺基酸取代，在CH3域中進行突變。以下示出之胺基酸取代之位置均根據如Kabat中之EU索引編號。
在一種情況下，第一多肽中之胺基酸取代用選自精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)或色胺酸(W)之較大胺基酸替換原始胺基酸，且第二多肽中之至少一個胺基酸取代用選自丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)或纈胺酸(V)之較小胺基酸替換原始胺基酸，使得較大胺基酸取代(突起)適合於較小胺基酸取代之表面(腔)。舉例而言，一種多肽可併入T366W取代，且另一種多肽可併入包括T366S、L368A及Y407V之三個取代。
本發明之抗體重鏈可變域可視情況與至少與抗體恆定區、諸如包括鉸鏈、CH2及CH3域且有或無CH1域之IgG恆定區90%一致之胺基酸序列偶合。在一些實施例中，恆定區之胺基酸序列與人類抗體恆定區、諸如人類IgG1恆定區、IgG2恆定區、IgG3恆定區或IgG4恆定區至少90%一致。在一個實施例中，足以結合CD16之抗體Fc域或其一部分包含與野生型人類IgG1 Fc序列DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:136)至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致的胺基酸序列。在一些其他實施例中，恆定區之胺基酸序列與來自另一哺乳動物、諸如兔、犬、貓、小鼠或馬之抗體恆定區至少90%一致。
在一些實施例中，與scFv或Fab片段連接之抗體恆定域能夠結合CD16。在一些實施例中，蛋白質併入抗體Fc域之一部分(例如足以結合CD16之抗體Fc域之一部分)，其中抗體Fc域包含鉸鏈及CH2域(例如人類IgG1抗體之鉸鏈及CH2域)及/或與人類IgG抗體之胺基酸序列234-332至少90%一致之胺基酸序列。
與人類IgG1恆定區相比，一或多個突變可例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及/或K439處併入恆定區中。示例性取代包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I 、Y407V、K409F、K409W、K409D、K409R、T411D、T411E、K439D及K439E。
在某些實施例中，可併入人類IgG1恆定區之CH1中的突變可在胺基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171及/或V173處。在某些實施例中，可併入人類IgG1恆定區之Cκ中的突變可在胺基酸E123、F116、S176、V163、S174及/或T164處。
可替代地，胺基酸取代可選自表3中所示之以下各組取代。
表3      
   第一多肽 第二多肽
第1組 S364E/F405A Y349K/T394F
第2組 S364H/D401K Y349T/T411E
第3組 S364H/T394F Y349T/F405A
第4組 S364E/T394F Y349K/F405A
第5組 S364E/T411E Y349K/D401K
第6組 S364D/T394F Y349K/F405A
第7組 S364H/F405A Y349T/T394F
第8組 S364K/E357Q L368D/K370S
第9組 L368D/K370S S364K
第10組 L368E/K370S S364K
第11組 K360E/Q362E D401K
第12組 L368D/K370S S364K/E357L
第13組 K370S S364K/E357Q
第14組 F405L K409R
第15組 K409R F405L
可替代地，胺基酸取代可選自表4中所示之以下各組取代。
表4      
   第一多肽 第二多肽
第1組 K409W D399V/F405T
第2組 Y349S E357W
第3組 K360E Q347R
第4組 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
第5組 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
第6組 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
可替代地，胺基酸取代可選自表5中所示之以下各組取代。
表5      
   第一多肽 第二多肽
第1組 T366K/L351K L351D/L368E
第2組 T366K/L351K L351D/Y349E
第3組 T366K/L351K L351D/Y349D
第4組 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E
第5組 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E
第6組 E356K/D399K K392D/K409D
可替代地，各多肽鏈中之至少一個胺基酸取代可選自表6。
表6   
第一多肽 第二多肽
L351Y、D399R、D399K、S400K、S400R、Y407A、Y407I、Y407V T366V、T366I、T366L、T366M、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F K392D、K392E、K409F、K409W、T411D及T411E
可替代地，至少一個胺基酸取代可選自表7中之以下各組取代，其中在第一多肽列中指示之位置經任何已知之帶負電之胺基酸替換，且在第二多肽列中指示之位置經任何已知之帶正電之胺基酸替換。
表7   
第一多肽 第二多肽
K392、K370、K409或K439 D399、E356或E357
可替代地，至少一個胺基酸取代可選自表8中之以下各組，其中在第一多肽列中指示之位置經任何已知之帶正電之胺基酸替換，且在第二多肽列中指示之位置經任何已知之帶負電之胺基酸替換。
表8   
第一多肽 第二多肽
D399、E356或E357 K409、K439、K370或K392
可替代地，胺基酸取代可選自表9中所示之以下各組。
表9
第一多肽 第二多肽
T350V、L351Y、F405A及Y407V T350V、T366L、K392L及T394W
可替代地或另外，可藉由在第一或第二多肽鏈中之任一個上引入S354C，及在相對多肽鏈上引入Y349C，在兩種多肽之界面內形成人工二硫橋鍵來增加異多聚體蛋白質之結構穩定性。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於位置T366，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由T366、L368及Y407組成之群的一或多個位置。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由T366、L368及Y407組成之群的一或多個位置，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於位置T366。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405及T411組成之群的一或多個位置且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405及T411組成之群的一或多個位置。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405及T411組成之群的一或多個位置且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405及T411組成之群的一或多個位置。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由L351、D399、S400及Y407組成之群的一或多個位置且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由T366、N390、K392、K409及T411組成之群的一或多個位置。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由T366、N390、K392、K409及T411組成之群的一或多個位置且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由L351、D399、S400及Y407組成之群的一或多個位置。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由Q347、Y349、K360及K409組成之群的一或多個位置，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由Q347、E357、D399及F405組成之群的一或多個位置。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由Q347、E357、D399及F405組成之群的一或多個位置，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由Y349、K360、Q347及K409組成之群的一或多個位置。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由K370、K392、K409及K439組成之群的一或多個位置，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由D356、E357及D399組成之群的一或多個位置。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由D356、E357及D399組成之群的一或多個位置，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由K370、K392、K409及K439組成之群的一或多個位置。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由L351、E356、T366及D399組成之群的一或多個位置，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由Y349、L351、L368、K392及K409組成之群的一或多個位置。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由Y349、L351、L368、K392及K409組成之群的一或多個位置，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於選自由L351、E356、T366及D399組成之群的一或多個位置。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於S354C取代且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於Y349C取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於Y349C取代且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於S354C取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於K360E及K409W取代且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於Q347R, D399V及F405T取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於Q347R、D399V及F405T取代且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於K360E及K409W取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T366W取代且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T366S、T368A及Y407V取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T366S、T368A及Y407V取代且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T366W取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T350V、L351Y、F405A及Y407V取代且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T350V、T366L、K392L及T394W取代。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T350V、T366L、K392L及T394W取代且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列的不同之處在於T350V、L351Y、F405A及Y407V取代。 示例性多特異性結合蛋白
以下列出包含各連接於抗體恆定區的結合FLT3之抗原結合位點及結合NKG2D之抗原結合位點的TriNKET之實例，其中抗體恆定區包括使兩個Fc鏈能夠進行異二聚之突變。根據Chothia之CDR序列加下劃綫。F3-GB102呈F3格式，亦即結合FLT3之抗原結合位點為Fab，且結合NKG2D之抗原結合位點為scFv。其他TriNKET呈F3'格式，亦即結合FLT3之抗原結合位點為scFv，且結合NKG2D之抗原結合位點為Fab。在各TriNKET中，scFv包含Cys對VL之位置100及VH之位置44處之胺基酸殘基的取代，藉此促進scFv之VH與VL之間二硫橋鍵的形成。
scFv之VH及VL可經由連接子、例如肽連接子連接。在某些實施例中，肽連接子為可撓性連接子。關於連接子之胺基酸組成，選擇具有賦予可撓性，不干擾本發明之蛋白質之其他域的結構與功能且抵抗蛋白酶裂解之特性的肽。舉例而言，甘胺酸及絲胺酸殘基通常提供蛋白酶抗性。在某些實施例中，VL經由(GlyGlyGlyGlySer)4 ((G4 S)4 )連接子(SEQ ID NO:137)在N端或C端連接至VH。
連接子(例如可撓性連接子)之長度可為「短的」，例如0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或12個胺基酸殘基，或「長的」，例如至少13個胺基酸殘基。在某些實施例中，連接子長度為10-50個、10-40個、10-30個、10-25個、10-20個、15-50個、15-40個、15-30個、15-25個、15-20個、20-50個、20-40個、20-30個或20-25個胺基酸殘基。
在某些實施例中，連接子包含以下或由其組成：(GS)n (SEQ ID NO:290)、(GGS)n (SEQ ID NO:291)、(GGGS)n (SEQ ID NO:292)、(GGSG)n (SEQ ID NO:293)、(GGSGG)n (SEQ ID NO:294)及(GGGGS)n (SEQ ID NO:295)序列，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在某些實施例中，連接子包含選自以下之胺基酸序列或由其組成：SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:154，如表10中所列出。
表10      
SEQ ID 胺基酸序列
SEQ ID NO:296 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS
SEQ ID NO:297 GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGS
SEQ ID NO:298 GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS
SEQ ID NO:299 GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSG
SEQ ID NO:300 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
SEQ ID NO:301 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:137 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:302 GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:303 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:304 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
在F3-GB102中，結合NKG2D之scFv經由Ala-Ser連接子連接於Fc之N端。在F3'-TriNKET中，結合FLT3之scFv經由Gly-Ser連接子連接於Fc之N端。在肘鉸鏈區序列處包括Ala-Ser或Gly-Ser連接子以在可撓性與最佳幾何形狀之間達成平衡。在某些實施例中，額外序列Thr-Lys-Gly可在鉸鏈處在N端或C端添加至Ala-Ser或Gly-Ser序列。
如本文描述此等示例性TriNKET所用，Fc包括抗體鉸鏈、CH2及CH3。在各示例性TriNKET中，連接於scFv之Fc域包含Q347R、D399V及F405T之突變，且連接於Fab之Fc域包含匹配突變K360E及K409W，以形成異二聚體。連接於scFv之Fc域進一步在CH3域中包括S354C取代，該取代與連接於Fab之Fc上之Y349C取代形成二硫鍵。此等取代為此分段中描述之序列中的粗體。
舉例而言，本揭示案之TriNKET為F3'-GB102。F3'-GB102包括(a)與Fc域連接的源自於GB102之結合FLT3之scFv序列；及(b)源自於A49MI之結合NKG2D之Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域連接至Fc域。F3'-GB102包括如以下闡述之三種多肽。 GB102-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:277) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVH WYQQKPGQPPKLLIYLASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWT FGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRY VMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDD TKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDS WGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:278) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSY SMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSY IYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDP WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:279) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLA WYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPR TFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
GB102-VL-VH-Fc表示結合FLT3之scFv經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接於Fc域的完全序列。連接於scFv之Fc域包括用於異二聚之Q347R、D399V及F405T取代，及用於與如下所述之A49MI-VH-CH1-Fc中之Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代。scFv (SEQ ID NO:40)包括經由(G4 S)4 連接子連接至GB102之輕鏈可變域之C端的GB102之重鏈可變域。作為分別VL及VH中之R100C及G44C取代之結果，scFv之重鏈及輕鏈可變域亦經由VL之C100與VH之C44之間的二硫橋鍵連接。
A49MI-VH-CH1-Fc表示連接至Fc域之Fab片段之重鏈部分，該重鏈部分包含結合NKG2D之A49MI的重鏈可變域(SEQ ID NO:254)及CH1域。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域包括CH3域中之Y349C取代，其與GB102-VL-VH-Fc中之Fc上的S354C取代形成二硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代以與GB102-VL-VH-Fc中之Fc進行異二聚。
A49MI-VL-CL表示包含結合NKG2D之A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:239)及輕鏈恆定域的Fab片段的輕鏈部分。
本揭示案之另一TriNKET為F3-GB102。F3-GB102包括：(a)連接於Fc域的源自於A49之結合NKG2D之scFv序列，及(b)源自於GB102之結合FLT3之Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分，及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域連接至Fc域。F3-GB102包括如以下闡述之三種多肽。 A49-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:280) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLA WYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRT FGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSY SMNWVRQAPGKCLEWVSSISSSSSY IYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPMGAAAGWFDP WGQGTLVTVSS AS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GB102-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:281) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRY VMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDD TKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDS WGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GB102-VL-CL (SEQ ID NO:282) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVH WYQQKPGQPPKLLIYLASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWT FGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
A49-VL-VH-Fc表示結合NKG2D之scFv經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接於Fc域的完全序列。連接於scFv之Fc域包括用於異二聚之Q347R、D399V及F405T取代，及用於與如下所述之GB102-VH-CH1-Fc中之Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代。scFv (SEQ ID NO:246)包括經由(G4 S)4 連接子連接至A49之輕鏈可變域之C端的A49之重鏈可變域。作為分別VL及VH中之Q100C及G44C取代之結果，scFv之重鏈及輕鏈可變域亦經由VL之C100與VH之C44之間的二硫橋鍵連接。
GB102-VH-CH1-Fc表示連接至Fc域之Fab片段之重鏈部分，該重鏈部分包含結合FLT3之GB102的重鏈可變域(SEQ ID NO:37)及CH1域。GB102-VH-CH1-Fc中之Fc域包括CH3域中之Y349C取代，其與A49-VL-VH-Fc中之Fc上的S354C取代形成二硫鍵。在GB102-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代以與A49-VL-VH-Fc中之Fc進行異二聚。
GB102-VL-CL表示包含結合FLT3之GB102之輕鏈可變域(SEQ ID NO:38)及輕鏈恆定域的Fab片段的輕鏈部分。
本揭示案之另一TriNKET為F3'-1553。F3'-1553包括：(a)連接於Fc域的源自於mAb 1553之結合FLT3之scFv序列，及(b)源自於A49MI之結合NKG2D之Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分，及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域連接至Fc域。F3'-1553包括三種多肽：1553-VH-VL-Fc、A49MI-VH-CH1-Fc、A49MI-VL-CL。上文在F3'-GB102之情況下描述A49MI-VH-CH1-Fc及A49MI-VL-CL。以下闡述1553-VH-VL-Fc之多肽。 1553-VH-VL-Fc (SEQ ID NO:283) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSY WINWVRQAPGKCLEWMGNIYPGSSI INYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDY WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMH WYQQKPGQAPRLLIYDTSKLAS GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPT FGCGTKVEIK GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
1553-VH-VL-Fc表示結合FLT3之scFv經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接於Fc域的完全序列。連接於scFv之Fc域包括用於異二聚之Q347R、D399V及F405T取代，及用於與如下所述之A49MI-VH-CH1-Fc中之Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代。scFv (SEQ ID NO:74)包括經由(G4 S)4 連接子連接至1553之輕鏈可變域之N端的1553之重鏈可變域。作為分別VL及VH中之G100C及G44C取代之結果，scFv之重鏈及輕鏈可變域亦經由VL之C100與VH之C44之間的二硫橋鍵連接。
本揭示案之另一TriNKET為F3'-1689。F3'-1689包括：(a)連接於Fc域的源自於mAb 1689之結合FLT3之scFv序列，及(b)源自於A49MI之結合NKG2D之Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分，及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域連接至Fc域。F3'-1689包括三種多肽：1689-VH-VL-Fc、A49MI-VH-CH1-Fc、A49MI-VL-CL。上文在F3'-GB102之情況下描述A49MI-VH-CH1-Fc及A49MI-VL-CL。以下闡述1689-VH-VL-Fc之多肽。 1689-VH-VL-Fc (SEQ ID NO:284) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFPYY WINWVRQAPGKCLEWMGNIYPGSSI INYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRNVYLTFDY WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYIH WYQQKPGQAPRLLIYDTSKLAS GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPT FGCGTKVEIK GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
1689-VH-VL-Fc表示結合FLT3之scFv經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接於Fc域的完全序列。連接於scFv之Fc域包括用於異二聚之Q347R、D399V及F405T取代，及用於與如下所述之A49MI-VH-CH1-Fc中之Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代。scFv (SEQ ID NO:81)相對於1553-VH-VL-Fc中之scFv包含一組可能增加對FLT3之結合親和力的突變。
本揭示案之另一TriNKET為F3'-GB102_M34I。F3'-GB102_M34I包括：(a)連接於Fc域的源自於GB102 M34I之結合FLT3之scFv序列，及(b)源自於A49MI之結合NKG2D之Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分，及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域連接至Fc域。F3'-GB102_M34I包括三種多肽：GB102_M34I-VL-VH-Fc、A49MI-VH-CH1-Fc、A49MI-VL-CL。上文在F3'-GB102之情況下描述A49MI-VH-CH1-Fc及A49MI-VL-CL。以下闡述GB102_M34I-VL-VH-Fc之多肽。 GB102_M34I-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:285) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVH WYQQKPGQPPKLLIYLASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWT FGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRY VIHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDD TKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDS WGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
GB102_M34I-VL-VH-Fc表示結合FLT3之scFv經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接於Fc域的完全序列。連接於scFv之Fc域包括用於異二聚之Q347R、D399V及F405T取代，及用於與如下所述之A49MI-VH-CH1-Fc中之Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代。scFv (SEQ ID NO:48)相對於GB102-VL-VH-Fc中之VH包含M34I取代以去除假定序列傾向性。
本揭示案之另一TriNKET為F3'-GB102_D101E。F3'-GB102_D101E包括：(a)連接於Fc域的源自於GB102 D101E之結合FLT3之scFv序列，及(b)源自於A49MI之結合NKG2D之Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分，及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域連接至Fc域。F3'-GB102_D101E包括三種多肽：GB102_D101E-VL-VH-Fc、A49MI-VH-CH1-Fc、A49MI-VL-CL。上文在F3'-GB102之情況下描述A49MI-VH-CH1-Fc及A49MI-VL-CL。以下闡述GB102_D101E-VL-VH-Fc之多肽。 GB102_D101E-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:286) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVH WYQQKPGQPPKLLIYLASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRY VMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDD TKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLES WGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
GB102_D101E-VL-VH-Fc表示結合FLT3之scFv經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接於Fc域的完全序列。連接於scFv之Fc域包括用於異二聚之Q347R、D399V及F405T取代，及用於與如下所述之A49MI-VH-CH1-Fc中之Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代。scFv (SEQ ID NO:44)相對於GB102-VL-VH-Fc中之VH包含D101E取代以去除假定序列傾向性。
本揭示案之另一TriNKET為F3'-GB102_M34I_D101E。F3'-GB102_M34I_D101E包括：(a)連接於Fc域的源自於GB102 M34I/D101E之結合FLT3之scFv序列，及(b)源自於A49MI之結合NKG2D之Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分，及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域連接至Fc域。F3'-GB102_M34I_D101E包括三種多肽：GB102_M34I_D101E-VL-VH-Fc、A49MI-VH-CH1-Fc、A49MI-VL-CL。上文在F3'-GB102之情況下描述A49MI-VH-CH1-Fc及A49MI-VL-CL。以下闡述GB102_M34I_D101E-VL-VH-Fc之多肽。 GB102_M34I_D101E-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:287) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVH WYQQKPGQPPKLLIYLASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWT FGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRY VIHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDD TKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLES WGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
GB102_M34I_D101E-VL-VH-Fc表示結合FLT3之scFv經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接於Fc域的完全序列。連接於scFv之Fc域包括用於異二聚之Q347R、D399V及F405T取代，及用於與如下所述之A49MI-VH-CH1-Fc中之Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代。scFv (SEQ ID NO:52)相對於GB102-VL-VH-Fc中之VH包含M34I及D101E取代以去除假定序列傾向性。
本揭示案之另一TriNKET為F3'-GB99。F3'-GB99包括：(a)連接於Fc域的源自於GB99之結合FLT3之scFv序列，及(b)源自於A49MI之結合NKG2D之Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分，及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域連接至Fc域。F3'-GB99包括三種多肽：GB99-VL-VH-Fc、A49MI-VH-CH1-Fc、A49MI-VL-CL。上文在F3'-GB102之情況下描述A49MI-VH-CH1-Fc及A49MI-VL-CL。以下闡述GB99-VL-VH-Fc之多肽。 GB99-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:288) DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVH WYQQKPGQPPKLLIYLASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWT FGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRY VMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDD TKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDS WGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
GB99-VL-VH-Fc表示結合FLT3之scFv經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接於Fc域的完全序列。連接於scFv之Fc域包括用於異二聚之Q347R、D399V及F405T取代，及用於與如下所述之A49MI-VH-CH1-Fc中之Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代。scFv (SEQ ID NO:28)相對於GB102-VL-VH-Fc中之scFv在構架區中包含一組可能提高抗體結構及活性的回復突變。
本揭示案之另一TriNKET為F3'-GB89。F3'-GB89包括：(a)連接於Fc域的源自於GB89之結合FLT3之scFv序列，及(b)源自於A49MI之結合NKG2D之Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分，及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域連接至Fc域。F3'-GB89包括三種多肽：GB89-VH-VL-Fc、A49MI-VH-CH1-Fc、A49MI-VL-CL。上文在F3'-GB102之情況下描述A49MI-VH-CH1-Fc及A49MI-VL-CL。以下闡述GB89-VH-VL-Fc之多肽。 GB89-VH-VL-Fc (SEQ ID NO:289) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRY VMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDD TKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDS WGQGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVH WYQQKPGQPPKLLIYLASNLES GVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWT FGCGTKVEIK GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
GB89-VH-VL-Fc表示結合FLT3之scFv經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接於Fc域的完全序列。連接於scFv之Fc域包括用於異二聚之Q347R、D399V及F405T取代，及用於與如下所述之A49MI-VH-CH1-Fc中之Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代。scFv (SEQ ID NO:19)包括經由(G4 S)4 連接子連接至GB89之輕鏈可變域之N端的GB89之重鏈可變域。作為分別VL及VH中之R100C及G44C取代之結果，scFv之重鏈及輕鏈可變域亦經由VL之C100與VH之C44之間的二硫橋鍵連接。scFv相對於GB102-VL-VH-Fc中之VH及VL在構架區中包含一組可能提高抗體結構及活性的回復突變。
在某一實施例中，本揭示案之TriNKET與上述示例性TriNKET中之一者一致，其除連接於結合NKG2D之Fab片段之Fc域包含Q347R、D399V及F405T之取代且連接於結合HER2之scFv之Fc域包含用於形成異二聚體之匹配取代K360E及K409W之外包括EW-RVT Fc突變。在某些實施例中，本揭示案之TriNKET與上述示例性TriNKET中之一者一致，其除連接於結合NKG2D之Fab片段之Fc域包含T366S、L368A及Y407V之「臼」取代且連接於結合HER2之scFv之Fc域包含用於形成異二聚體之T366W之「杵」取代之外包括KiH Fc突變。
在某些實施例中，除連接於結合NKG2D之Fab片段之Fc域在CH3域中包括S354C取代且連接於結合HER2之scFv之Fc域在CH3域中包括匹配Y349C取代以形成二硫鍵之外，本揭示案之TriNKET與上述示例性TriNKET中之一者一致。
所屬領域之技術人員應瞭解在蛋白質產生及/或儲存期間，N端麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q)可環化形成內醯胺(例如自發地，或由在產生及/或儲存期間存在之酶催化)。因此，在多肽之胺基酸序列之N端殘基為E或Q的一些實施例中，本文中亦涵蓋E或Q替換為焦麩胺酸鹽之對應胺基酸序列。
所屬領域之技術人員亦應瞭解在蛋白質蛋白質產生及/或儲存期間，可移除蛋白質之C端離胺酸(K)(例如自發地，或由在蛋白質產生及/或儲存期間存在之酶催化)。在C端包含Fc域之蛋白質下常常觀察到此類K移除。因此，在多肽(例如Fc域序列)之胺基酸序列之C端殘基為K的一些實施例中，本文中亦涵蓋K移除之對應胺基酸序列。
上述多特異性蛋白質可使用所屬領域之技術人員熟知之重組DNA技術製成。舉例而言，編碼第一免疫球蛋白重鏈之第一核酸序列可選殖至第一表現載體中；編碼第二免疫球蛋白重鏈之第二核酸序列可選殖至第二表現載體中；編碼免疫球蛋白輕鏈之第三核酸序列可選殖至第三表現載體中；且第一、第二及第三表現載體可穩定地一起轉染至宿主細胞中以產生多聚體蛋白質。
為實現多特異性蛋白質之最高產量，可探索第一、第二及第三表現載體之不同比率以確定轉染至宿主細胞之最佳比率。在轉染之後，可使用所屬領域中已知之方法，諸如有限稀釋、ELISA、FACS、顯微術或Clonepix分離單個純系以產生細胞庫。
純系可在適合於生物反應器擴大之條件下培養且維持多特異性蛋白質之表現。多特異性蛋白質可使用所屬領域中已知之方法，包括離心、深度過濾、細胞溶解、均質化、凍融、親和力純化、凝膠過濾、離子交換層析法、疏水性相互作用交換層析法及混合模式層析法來分離及純化。II. 多特異性蛋白質之特徵
本文所述之多特異性蛋白質包括NKG2D結合位點、結合FLT3之FLT3結合位點及足以結合CD16之抗體Fc域或其一部分或結合CD16之抗原結合位點。在一些實施例中，多特異性蛋白質含有結合於FLT3之額外抗原結合位點，如在F4-TriNKET格式中舉例說明。
在一些實施例中，多特異性蛋白質顯示與對應單株抗體，亦即含有與多特異性蛋白質中併入之FLT3結合位點相同的FLT3結合位點的單株抗體類似之熱穩定性。
在一些實施例中，多特異性蛋白質同時結合於表現NKG2D及/或CD16之細胞，諸如NK細胞，及表現FLT3之細胞，諸如某些腫瘤細胞。多特異性蛋白質結合於NK細胞可增強NK細胞破壞表現FLT3之腫瘤細胞的活性。
在一些實施例中，多特異性蛋白質以與對應抗FLT3單株抗體(亦即含有與多特異性蛋白質中併入之FLT3結合位點相同的FLT3結合位點的單株抗體)類似之親和力結合於FLT3。在一些實施例中，多特異性蛋白質比對應單株抗體更有效地殺死表現FLT3之腫瘤細胞。
在某些實施例中，包括FLT3結合位點之本文所述之多特異性蛋白質在與表現FLT3之細胞共培養時活化初級人類NK細胞。NK細胞活化之標志為CD107a脫粒及IFN-γ細胞介素產生增加。此外，與對應抗FLT3單株抗體相比，多特異性蛋白質可展示在表現FLT3之細胞存在下對人類NK細胞之優良活化。
在一些實施例中，包括FLT3結合位點之本文所述之多特異性蛋白質在與表現FLT3之細胞共培養時增強靜息及IL-2活化之人類NK細胞的活性。
在一些實施例中，與結合於FLT3之對應單株抗體相比，多特異性蛋白質提供靶向表現中等及低水準FLT3之腫瘤細胞的益處。
在一些實施例中，TriNKET之二價F4格式(亦即TriNKET包括結合於FLT3之額外抗原結合位點)提高TriNKET結合於FLT3之親合力，此實際上穩定高水準FLT3在腫瘤細胞表面上之表現及維持。在一些實施例中，F4-TriNKET比對應F3-TriNKET或F3'-TriNKET介導更有效之腫瘤細胞殺死。III. 治療應用
本發明提供使用本文所述之多特異性結合蛋白及/或本文所述之醫藥組合物治療自體免疫疾病或癌症之方法。該等方法可用於治療多種表現FLT3之癌症。
治療方法可根據有待治療之癌症表徵。舉例而言，在某些實施例中，癌症為血液惡性病或白血病。在某些實施例中，癌症為急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、骨髓化生不良、骨髓發育不良症候群、急性T淋巴母細胞性白血病或急性前髓細胞白血病、慢性骨髓單核球性白血病或慢性骨髓性白血病之骨髓胚細胞危象。
靶向FLT3之多特異性結合蛋白可治療之其他示例性癌症包括乳癌、卵巢癌、食道癌、膀胱或胃癌、唾液腺管癌、唾液腺管癌、肺腺癌或子宮癌之侵襲性形式，諸如子宮漿液性子宮內膜癌。在一些其他實施例中，癌症為腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、直腸癌、腎癌、胃癌、睾丸癌或子宮癌。在其他實施例中，癌症為鱗狀細胞癌、腺癌、小細胞癌、黑色素瘤、神經母細胞瘤、肉瘤(例如血管肉瘤或軟骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、膽道癌、甲狀腺癌、肢端黑色素瘤、光化性角化病、急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、腺樣囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鱗癌、肛管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星形細胞腫瘤、大前庭腺癌、基底細胞癌、膽管癌、骨癌、骨髓癌、支氣管癌、支氣管腺癌、類癌瘤、膽管細胞癌、軟骨肉瘤、脈絡叢乳頭狀瘤/癌瘤、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、透明細胞癌、結締組織癌、囊腺瘤、消化系統癌、十二指腸癌、內分泌系統癌、內胚竇瘤、子宮內膜增生、內膜肉瘤、子宮骨膜樣腺癌、內皮細胞癌、室管膜癌、上皮細胞癌、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、眼睛及眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性結節性增生症、膽囊癌、胃竇癌、胃底癌、胃泌素瘤、膠質母細胞瘤、胰升糖素瘤、心臟癌、血管母細胞瘤、血管內皮瘤、血管瘤、肝臟腺瘤、肝臟腺瘤病、肝膽癌、肝細胞癌、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、迴腸癌、胰島瘤、上皮內瘤樣病變、上皮間鱗狀細胞瘤形成、肝內膽管癌、侵襲性鱗狀細胞癌、空腸癌、關節癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、骨盆癌、大細胞癌、大腸癌、平滑肌肉瘤、惡性小痣黑色素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、惡性黑色素瘤、惡性間皮腫瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、腦膜癌、間皮癌、轉移癌、口癌、黏液表皮樣癌、多發性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神經系統癌、神經上皮腺癌結節性黑色素瘤、非上皮性皮膚癌、非霍奇金氏淋巴瘤、燕麥細胞癌、寡樹突神經癌、口腔癌、骨肉瘤、乳頭漿液性腺癌、陰莖癌、咽癌、垂體瘤、漿細胞瘤、 假性肉瘤、肺母細胞瘤、直腸癌、腎細胞癌、呼吸系統癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、漿液性癌、竇癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑肌癌、軟組織癌、分泌生長激素抑制素之腫瘤、脊柱癌、鱗狀細胞癌、橫紋肌癌、間皮下癌、表淺擴散型黑色素瘤、T細胞白血病、舌癌、未分化癌、輸尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿系統癌、子宮頸癌、子宮體癌、葡萄膜黑素瘤、陰道癌、疣狀癌、VIP瘤、外陰癌、高分化癌或威爾姆氏腫瘤(Wilms tumor)。
在一些其他實施例中，有待治療之癌症為非霍奇金氏淋巴瘤，諸如B細胞淋巴瘤或T細胞淋巴瘤。在某些實施例中，非霍奇金氏淋巴瘤為B細胞淋巴瘤，諸如彌漫性大B細胞淋巴瘤、初級縱隔的B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、結外邊緣區B細胞淋巴瘤、結節邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、淋巴漿細胞性淋巴瘤、毛細胞白血病或初級中樞神經系統(CNS)淋巴瘤。在某些其他實施例中，非霍奇金氏淋巴瘤為T細胞淋巴瘤，諸如前驅T淋巴母細胞性淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、結外自然殺手/T細胞淋巴瘤、腸病型T細胞淋巴瘤、皮下脂膜炎樣T細胞淋巴瘤、退行性大細胞淋巴瘤或周邊T細胞淋巴瘤。IV. 組合療法
本發明之另一態樣提供組合療法。本文所述之多特異性結合蛋白可與額外治療劑組合使用來治療自體免疫疾病或治療癌症。
可在治療自體免疫發炎性疾病中用作組合療法之一部分的示例性治療劑描述於Li等人 (2017) Front. Pharmacol., 8:460中，且包括例如非類固醇消炎藥(NSAID) (例如COX-2抑制劑)、糖皮質素(例如潑尼松(prednisone)/潑尼松龍(prednisolone)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)及氟化糖皮質素(諸如地塞米松(dexamethasone)及倍他米松(betamethasone))、改善疾病之抗風濕藥(DMARD) (例如甲胺喋呤(methotrexate)、來氟米特(leflunomide)、金化合物(gold compound)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、抗瘧疾藥、D-青黴胺(D-penicillamine)及環孢黴素(cyclosporine))、抗TNF生物製劑(例如英夫利昔單抗(infliximab)、依那西普(etanercept)、阿達木單抗(adalimumab)、戈利木單抗(golimumab)、聚乙二醇結合賽妥珠單抗(Certolizumab pegol)及其生物類似藥)及其他靶向CTLA-4之生物製劑(例如阿巴西普(abatacept))、IL-6受體(例如托珠單抗(tocilizumab))、IL-1 (例如阿那白滯素(anakinra))、Th1免疫反應(IL-12/IL-23) (例如優特克單抗(ustekinumab))、Th17免疫反應(IL-17) (例如蘇金單抗(secukinumab)及CD20 (例如利妥昔單抗(rituximab))。
在治療癌症中可用作組合療法之一部分的示例性治療劑包括例如放射綫、絲裂黴素(mitomycin)、維甲酸(tretinoin)、瑞苯莫斯汀(ribomustin)、吉西他濱(gemcitabine)、長春新鹼(vincristine)、依託泊苷(etoposide)、克拉屈濱(cladribine)、二溴甘露醇(mitobronitol)、甲胺喋呤(methotrexate)、多柔比星(doxorubicin)、卡巴醌(carboquone)、噴司他丁(pentostatin)、二胺硝吖啶(nitracrine)、淨司他丁(zinostatin)、西曲瑞克(cetrorelix)、來曲唑(letrozole)、雷替曲塞(raltitrexed)、道諾黴素(daunorubicin)、法倔唑(fadrozole)、福莫司汀(fotemustine)、胸腺法新(thymalfasin)、索布佐生(sobuzoxane)、奈達鉑(nedaplatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、比卡米特(bicalutamide)、長春瑞濱(vinorelbine)、維司力農(vesnarinone)、胺魯米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、丙麩胺(proglumide)、依利醋銨(elliptinium acetate)、酮舍林(ketanserin)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、阿維A酯(etretinate)、異維A酸(isotretinoin)、鏈脲黴素(streptozocin)、尼莫司汀(nimustine)、長春地辛(vindesine)、氟他米特(flutamide)、屈洛尼爾(drogenil)、甘胺硫嘌呤(butocin)、卡莫氟(carmofur)、雷佐生(razoxane)、西佐喃(sizofilan)、卡鉑(carboplatin)、二溴衛矛醇(mitolactol)、替加氟(tegafur)、異環磷醯胺(ifosfamide)、潑尼莫司汀(prednimustine)、溶鏈菌製劑(picibanil)、左旋四咪唑(levamisole)、替尼泊苷(teniposide)、英丙舒凡(improsulfan)、依諾他濱(enocitabine)、麥角乙脲(lisuride)、羥甲烯龍(oxymetholone)、他莫昔芬(tamoxifen)、黃體酮(progesterone)、美雄烷(mepitiostane)、表硫雄醇(epitiostanol)、福美坦(formestane)、干擾素-α、干擾素-2α、干擾素-β、干擾素-γ (IFN-γ)、群落刺激因子-1、群落刺激因子-2、地尼白介素(denileukin diftitox)、介白素-2、促黃體激素釋放因子及可展現與同源受體之差別結合或血清半衰期增加或減少的上述藥劑之變體。
在治療癌症中可用作組合療法之一部分的其他類別藥劑為免疫檢查點抑制劑。示例性免疫檢查點抑制劑包括抑制以下中之一或多者的藥劑：(i)細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (CTLA4)；(ii)計劃性細胞死亡蛋白1 (PD1)；(iii) PDL1；(iv) LAG3；(v) B7-H3；(vi) B7-H4；及(vii) TIM3。CTLA4抑制劑伊匹單抗(ipilimumab)已經美國食品與藥物管理局(United States Food and Drug Administration)批准用於治療黑色素瘤。
在治療癌症中可用作組合療法之一部分的其他藥劑為靶向非檢查點標靶之單株抗體藥劑(例如赫塞汀(herceptin))及非細胞毒性劑(例如酪胺酸激酶抑制劑)。
抗癌劑之其他類別包括例如：(i)選自ALK抑制劑、ATR抑制劑、A2A拮抗劑、鹼基切除修復抑制劑、Bcr-Abl酪胺酸激酶抑制劑、布魯頓氏酪胺酸激酶抑制劑(Bruton's Tyrosine Kinase Inhibitor)、CDC7抑制劑、CHK1抑制劑、細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑、DNA-PK抑制劑、DNA-PK與mTOR之抑制劑、DNMT1抑制劑、DNMT1抑制劑加2-氯-去氧腺苷、HDAC抑制劑、刺蝟信號傳導路徑抑制劑(Hedgehog Signaling Pathway Inhibitor)、IDO抑制劑、JAK抑制劑、mTOR抑制劑、MEK抑制劑、MELK抑制劑、MTH1抑制劑、PARP抑制劑、磷酸肌醇3-激酶抑制劑、PARP1與DHODH之抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓撲異構酶-II抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、VEGFR抑制劑及WEE1抑制劑；(ii) OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS之促效劑；及(iii)選自IL-12、IL-15、GM-CSF及G-CSF之細胞介素。
本發明之蛋白質亦可用作手術移除原發性病變之輔助劑。
可選擇多特異性結合蛋白及額外治療劑之量及相對投與時機以實現所需組合治療作用。舉例而言，當向需要此類投與之患者投與組合療法時，組合中之治療劑或包含治療劑之醫藥組合物或組合物可以任何次序，諸如相繼、同時、一起、同時及其類似次序投與。此外，舉例而言，多特異性結合蛋白可在其他治療劑發揮其預防或治療作用期間投與，或反之亦然。V. 醫藥組合物
本揭示案特徵亦在於含有治療有效量之本文所述之蛋白質的醫藥組合物。組合物可調配用於多種藥物遞送系統。一或多種生理學上可接受之賦形劑或載劑亦可包括在組合物中以達成適當調配。用於本揭示案中之合適調配物可見於Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 第17版, 1985中。關於藥物遞送之方法之簡評，參見例如Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。
本揭示案之靜脈內藥物遞送調配物可含於袋、筆或注射器中。在某些實施例中，袋可連接至包含管及/或針之通道。在某些實施例中，調配物可為凍乾調配物或液體調配物。在某些實施例中，調配物可冷凍乾燥(凍乾)且含於約12-60個小瓶中。在某些實施例中，調配物可冷凍乾燥且45 mg冷凍乾燥之調配物可含於一個小瓶中。在某些實施例中，約40 mg-約100 mg冷凍乾燥之調配物可含於一個小瓶中。在某些實施例中，將來自12個、27個或45個小瓶之冷凍乾燥調配物組合以獲得靜脈內藥物調配物中治療劑量之蛋白質。在某些實施例中，調配物可為液體調配物且以約250毫克/小瓶至約1000毫克/小瓶儲存。在某些實施例中，調配物可為液體調配物且以約600毫克/小瓶儲存。在某些實施例中，調配物可為液體調配物且以約250毫克/小瓶儲存。
蛋白質可存在於液體水性醫藥調配物中，該調配物在形成調配物之緩衝溶液中包括治療有效量之蛋白質。
此等組合物可藉由習知之滅菌技術來滅菌，或可無菌過濾。所得水溶液可經包裝原樣使用，或凍乾，凍乾製劑在投與之前與無菌水性載劑組合。製劑之pH值通常將在3與11之間，更佳5與9之間或6與8之間且最佳7與8之間，諸如7至7.5。呈固體形式之所得組合物可包裝成多個單劑量單元，各含有固定量之以上提及之藥劑。呈固體形式之組合物亦可包裝於容器中，量靈活。
在某些實施例中，本揭示案提供一種具有延長之儲存期限的調配物，其包括本揭示案之蛋白質，與甘露糖醇、檸檬酸一水合物、檸檬酸鈉、磷酸二鈉二水合物、磷酸二氫鈉二水合物、氯化鈉、聚山梨醇酯80、水及氫氧化鈉組合。
在某些實施例中，製備在pH緩衝溶液中包括本揭示案之蛋白質的水性調配物。本發明之緩衝液可具有在約4至約8，例如約4.5至約6.0或約4.8至約5.5之範圍內的pH值，或可具有約5.0至約5.2之pH值。上述pH值中間之範圍亦意欲為本揭示案之一部分。舉例而言，意欲包括使用上述值中之任一者的組合作為上限及/或下限的數值範圍。控制pH值在此範圍內之緩衝液之實例包括乙酸鹽(例如乙酸鈉)、丁二酸鹽(諸如丁二酸鈉)、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽及其他有機酸緩衝液。
在某些實施例中，調配物包括含有檸檬酸鹽及磷酸鹽之緩衝系統以維持pH值在約4至約8範圍內。在某些實施例中，pH值範圍可為約4.5至約6.0，或約pH 4.8至約5.5，或在約5.0至約5.2之pH範圍內。在某些實施例中，緩衝系統包括檸檬酸一水合物、檸檬酸鈉、磷酸二鈉二水合物及/或磷酸二氫鈉二水合物。在某些實施例中，緩衝系統包括約1.3 mg/mL檸檬酸(例如1.305 mg/mL)、約0.3 mg/mL檸檬酸鈉(例如0.305 mg/mL)、約1.5 mg/mL磷酸二鈉二水合物(例如1.53 mg/mL)、約0.9 mg/mL磷酸二氫鈉二水合物(例如0.86 mg/mL)及約6.2 mg/mL氯化鈉(例如6.165 mg/mL)。在某些實施例中，緩衝系統包括約1至約1.5 mg/mL檸檬酸、約0.25至約0.5 mg/mL檸檬酸鈉、約1.25至約1.75 mg/mL磷酸二鈉二水合物、約0.7至約1.1 mg/mL磷酸二氫鈉二水合物及約6.0至約6.4 mg/mL氯化鈉。在某些實施例中，調配物之pH值用氫氧化鈉來調整。
用作張力劑且可穩定抗體之多元醇亦可包括在調配物中。多元醇以可隨調配物之所需等張性而變之量添加至調配物中。在某些實施例中，水性調配物可為等張的。所附加之多元醇之量亦可隨多元醇之分子量而改變。舉例而言，與二醣(諸如海藻糖)相比，可添加較低量之單醣(例如甘露糖醇)。在某些實施例中，在調配物中可用作張力劑之多元醇為甘露糖醇。在某些實施例中，甘露糖醇濃度可為約5至約20 mg/mL。在某些實施例中，甘露糖醇濃度可為約7.5至約15 mg/mL。在某些實施例中，甘露糖醇濃度可為約10至約14 mg/mL。在某些實施例中，甘露糖醇濃度可為約12 mg/mL。在某些實施例中，多元醇山梨糖醇可包括在調配物中。
洗滌劑或界面活性劑亦可添加至調配物中。示例性洗滌劑包括非離子型洗滌劑，諸如聚山梨酸酯(例如聚山梨酸酯20、80等)或泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)。所添加之洗滌劑之量使得其降低調配抗體之聚集，及/或使微粒在調配物中之形成降至最少及/或減少吸附。在某些實施例中，調配物可包括界面活性劑聚山梨酸酯。在某些實施例中，調配物可含有洗滌劑聚山梨醇酯80或Tween 80。Tween 80為用於描述聚氧化乙烯(20)去水山梨糖醇單油酸酯之術語(參見Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 第4版, 1996)。在某些實施例中，調配物可含有約0.1 mg/mL與約10 mg/mL之間，或約0.5 mg/mL與約5 mg/mL之間的聚山梨醇酯酯80。在某些實施例中，調配物中可添加約0.1%聚山梨醇酯酯80。
在實施例中，本揭示案之蛋白質產物調配為液體調配物。液體調配物可以10 mg/mL濃度呈現於用橡皮塞封閉且用鋁鋸齒形密封蓋密封的USP/Ph Eur I型50R小瓶中。塞子可由符合USP及Ph Eur之彈性體製成。在某些實施例中，小瓶可裝滿61.2 mL蛋白質產物溶液以允許60 mL之可萃取體積。在某些實施例中，液體調配物可用0.9%鹽水溶液稀釋。
在某些實施例中，本揭示案之液體調配物可製備成10 mg/mL濃度溶液，與穩定水準之糖組合。在某些實施例中，液體調配物可在水性載劑中製備。在某些實施例中，穩定劑之添加量可不超過可引起對於靜脈內投與而言不合需要或不適合之黏度的量。在某些實施例中，糖可為二醣，例如蔗糖。在某些實施例中，液體調配物亦可包括緩衝劑、界面活性劑及防腐劑中之一或多種。
在某些實施例中，液體調配物之pH值可藉由添加醫藥學上可接受之酸及/或鹼來設定。在某些實施例中，醫藥學上可接受之酸可為鹽酸。在某些實施例中，鹼可為氫氧化鈉。
除聚集外，脫醯胺為在醱酵、收穫/細胞淨化、純化、原料藥/藥品儲存期間及在樣品分析期間可能發生的肽及蛋白質之常見產物變異體。脫醯胺係NH3 自蛋白質損失，形成丁二醯亞胺中間物，可經歷水解。丁二醯亞胺中間物引起親本肽質量減少17道爾頓。隨後水解引起質量增加18道爾頓。丁二醯亞胺中間物之分離由於在水性條件下之不穩定性而困難。因而，脫醯胺通常可偵測，因為質量增加1道爾頓。天冬醯胺之脫醯胺產生天冬胺酸或異天冬胺酸。影響脫醯胺速率之參數包括pH值、溫度、溶劑介電常數、離子強度、初級序列、局部多肽構形及三級結構。肽鏈中鄰近Asn之胺基酸殘基影響脫醯胺速率。蛋白質序列中在Asn後之Gly及Ser引起對脫醯胺之敏感度更高。
在某些實施例中，本揭示案之液體調配物可保存在預防蛋白質產物脫胺基之pH值及濕度的條件下。
本文中所關注之水性載劑為在醫藥學上可接受(投與人類安全且無毒)且可用於製備液體調配物之載劑。例示性載劑包括滅菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH值緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。
防腐劑可視情況添加至本文中之調配物中以減少細菌作用。防腐劑之添加可例如促進多用途(多劑量)調配物之產生。
靜脈內(IV)調配物可為特定情況下的較佳投藥途徑，諸如當患者在醫院中在移植之後經由IV途徑接受所有藥物時。在某些實施例中，液體調配物在投與前用0.9%氯化鈉溶液稀釋。在某些實施例中，經稀釋用於注射之藥品為等張的且適合於藉由靜脈內輸注投與。
在某些實施例中，鹽或緩衝液組分可以10 mM-200 mM之量添加。鹽及/或緩衝液為醫藥學上可接受的，且衍生自多種已知酸(無機及有機)與「形成鹼」之金屬或胺。在某些實施例中，緩衝液可為磷酸鹽緩衝液。在某些實施例中，緩衝液可為甘胺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩衝液，在此情況下鈉、鉀或銨離子可充當相對離子。
防腐劑可視情況添加至本文中之調配物中以減少細菌作用。防腐劑之添加可例如促進多用途(多劑量)調配物之產生。
本文中所關注之水性載劑為在醫藥學上可接受(投與人類安全且無毒)且可用於製備液體調配物之載劑。例示性載劑包括滅菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH值緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
本揭示案之蛋白質可呈包括蛋白質及凍乾保護劑之凍乾調配物存在。凍乾保護劑可為糖，例如二醣。在某些實施例中，凍乾保護劑可為蔗糖或麥芽糖。凍乾調配物亦可包括緩衝劑、界面活性劑、增積劑及/或防腐劑中之一或多種。
可用於穩定凍乾藥品之蔗糖或麥芽糖之量可呈至少1:2蛋白質與蔗糖或麥芽糖之重量比。在某些實施例中，蛋白質與蔗糖或麥芽糖重量比可為1:2至1:5。
在某些實施例中，在凍乾之前調配物之pH值可藉由添加醫藥學上可接受之酸及/或鹼來設定。在某些實施例中，醫藥學上可接受之酸可為鹽酸。在某些實施例中，醫藥學上可接受之鹼可為氫氧化鈉。
在凍乾前，含有本揭示案之蛋白質之溶液的pH值可調整在6至8之間。在某些實施例中，凍乾藥品之pH範圍可為7至8。
在某些實施例中，鹽或緩衝液組分可以10 mM-200 mM之量添加。鹽及/或緩衝液為醫藥學上可接受的，且衍生自多種已知酸(無機及有機)與「形成鹼」之金屬或胺。在某些實施例中，緩衝液可為磷酸鹽緩衝液。在某些實施例中，緩衝液可為甘胺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩衝液，在此情況下鈉、鉀或銨離子可充當相對離子。
在某些實施例中，可添加「增積劑」。「增積劑」為添加物質至凍乾混合物且有助於凍乾餅之物理結構(例如促進基本上均一之維持開孔結構之凍乾餅的產生)的化合物。例示性填充劑包括甘露糖醇、甘胺酸、聚乙二醇及山梨糖醇。本發明之凍乾調配物可含有此類增積劑。
防腐劑可視情況添加至本文中之調配物中以減少細菌作用。防腐劑之添加可例如促進多用途(多劑量)調配物之產生。
在某些實施例中，凍乾藥品可用水性載劑復原。本文中所關注之水性載劑為在醫藥學上可接受(例如投與人類安全且無毒)且在凍乾之後可用於製備液體調配物之載劑。例示性稀釋劑包括滅菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH值緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
在某些實施例中，本揭示案之凍乾藥品用USP滅菌注射用水 (SWFI)或0.9% USP氯化鈉注射液復原。在復原期間，凍乾粉末溶於溶液中。
在某些實施例中，本揭示案之凍乾蛋白質產物用約4.5 mL注射用水復原且用0.9%鹽水溶液(氯化鈉溶液)稀釋。
本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量水準可變化，以便獲得針對特定患者、組合物及投與模式，活性成分有效實現所需治療反應且對患者無毒之量。
特定劑量可為針對每個患者之均一劑量，例如50-5000 mg蛋白質。可替代地，患者之劑量可適合於患者之近似體重或表面積。確定適當劑量之其他因素可包括有待治療或預防之疾病或疾患、疾病之嚴重程度、投藥途徑及患者之年齡、性別及醫療條件。通常藉由所屬領域之技術人員，尤其根據劑量資訊及本文揭示之分析來進行確定治療適當劑量必需之計算的進一步修正。劑量亦可經由使用已知之與適當劑量-反應資料結合用於確定劑量的分析確定。可在監測疾病進展時調整個別患者之劑量。可量測患者中可靶向構築體或複合物之血液水準，以看是否需要調整劑量達到或維持有效濃度。醫藥基因組學可用於確定何種可靶向構築體及/或複合物及其劑量最可能對給定個體有效(Schmitz等人,Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001；Steimer等人,Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001)。
一般而言，基於體重之劑量為每公斤體重約0.01 μg至約100 mg，諸如約0.01 μg至約100 mg/kg體重、約0.01 μg至約50 mg/kg體重、約0.01 μg至約10 mg/kg體重、約0.01 μg至約1 mg/kg體重、約0.01 μg至約100 μg/kg體重、約0.01 μg至約50 μg/kg體重、約0.01 μg至約10 μg/kg體重、約0.01 μg至約1 μg/kg體重、約0.01 μg至約0.1 μg/kg體重、約0.1 μg至約100 mg/kg體重、約0.1 μg至約50 mg/kg體重、約0.1 μg至約10 mg/kg體重、約0.1 μg至約1 mg/kg體重、約0.1 μg至約100 μg/kg體重、約0.1 μg至約10 μg/kg體重、約0.1 μg至約1 μg/kg體重、約1 μg至約100 mg/kg體重、約1 μg至約50 mg/kg體重、約1 μg至約10 mg/kg體重、約1 μg至約1 mg/kg體重、約1 μg至約100 μg/kg體重、約1 μg至約50 μg/kg體重、約1 μg至約10 μg/kg體重、約10 μg至約100 mg/kg體重、約10 μg至約50 mg/kg體重、約10 μg至約10 mg/kg體重、約10 μg至約1 mg/kg體重、約10 μg至約100 μg/kg體重、約10 μg至約50 μg/kg體重、約50 μg至約100 mg/kg體重、約50 μg至約50 mg/kg體重、約50 μg至約10 mg/kg體重、約50 μg至約1 mg/kg體重、約50 μg至約100 μg/kg體重、約100 μg至約100 mg/kg體重、約100 μg至約50 mg/kg體重、約100 μg至約10 mg/kg體重、約100 μg至約1 mg/kg體重、約1 mg至約100 mg/kg體重、約1 mg至約50 mg/kg體重、約1 mg至約10 mg/kg體重、約10 mg至約100 mg/kg體重、約10 mg至約50 mg/kg體重、約50 mg至約100 mg/kg體重。
可每天、每週、每月或每年給予劑量一次或更多次，或甚至每2至20年一次。所屬領域之普通技術人員容易基於所量測之滯留時間及可靶向構築體或複合物在體液或組織中之濃度估計給藥重複率。本發明之投與可為靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、胸膜內、鞘內、腔內、經由導管灌注或藉由直接損害內注射。此可每天投與一次或更多次，每週投與一次或更多次，每月投與一次或更多次，及每年投與一次或更多次。
以上說明描述本發明之多個態樣及實施例。專利申請案特別涵蓋態樣及實施例之所有組合及變換。 實例
參考以下實例將更容易地理解現在概述之本發明，該等實例僅僅出於說明本發明之某些態樣及實施例而包括且不意欲限制本發明。實例 1. 所選雜交瘤純系之上清液的表徵
藉由用hFLT3-His融合蛋白對小鼠進行免疫接種來產生FLT3特異性抗體。藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)針對FLT3結合來評定228個雜交瘤之上清液，且96個雜交瘤非共價結合於hFLT3-His蛋白。基於初步生物膜層干涉測量法(BLI)結合親和力判斷、結合於表現FLT3之人類及食蟹獼猴細胞及抗原決定基多樣性選擇十一個純系。藉由高解析度表面電漿子共振(SPR)進一步分析此11個純系結合hFLT3-His之能力。使用Biacore 8K儀器在37℃下進行實驗以模擬生理溫度。Biacore感測圖及動力學參數呈現於表 12 中，且原始資料及擬合展示於圖 18 中。十一個雜交瘤中之七個雜交瘤以小於10 nM之KD 結合，且五個顯示緩慢解離速率常數(k d ＜5 × 10-4 s-1 )。
藉由BLI使用OctetRed384 (ForteBio)對與參考mAb之雜交瘤融合物進行分箱。簡言之，將雜交瘤上清液負載至抗小鼠IgG捕獲感測器尖端上15分鐘且在PBSF中平衡5分鐘。將感測器浸入200 nM hFLT3-His中，且使之締合180秒，接著浸入100 nM對照IgG或200 nM FTL3-配位體溶液中。反應單元之增加指示雜交瘤非參考mAb之競爭者，而信號無增加指示雜交瘤與參考mAb競爭。FL23 (Amgen)及FL39 (Amgen)結合於域1。EB10 (ImClone)(一種已知之FLT3-配位體阻斷劑)結合於域3。FL61 (Amgen)亦結合於域3，但不為FLT3-配位體阻斷劑。4G8 (Synimmune)結合於域4。NC7 (Imclone)結合於域5。此等參考抗體之VH及VL序列提供於表11中。 表11. 參考抗體
α-FLT3 mAb VH VL
4G8 (Synimmune)，美國申請公開案第2015/0119555A1號中揭示 QVQLQQPGAELVKPGASLKLSCKSSGYTFTSYWMHWVRQRPGHGLEWIGEIDPSDSYKDYNQKFKDKATLTVDRSSNTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARAITTTPFDFWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:306) DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGVYFCQQSNTWPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:307)
EB10 (ImClone/Lilly)，美國申請公開案第2011/0008355A1號中揭示 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVGAHDAFDIWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:308) DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSDTDFTLQISRVEAEDVGVYYCMQGTHPAISFGQGTRLEIK (SEQ ID NO:309)
NC7 (Imclone/Lilly)，美國申請公開案第2011/0008355A1號中揭示 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:310) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK (SEQ ID NO:311)
FL23 (Amgen)，美國申請公開案第2017/0037149A1號中揭示 QVTLKESGPALVKPTETLTLTCTVSGFSFRNARMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTLTNMDPVDTATYFCARMPEYSSGWSGAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:312) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGYDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLIISSLQPEDFATYYCLQHNSFPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:313)
FL39 (Amgen)，美國申請公開案第2017/0037149A1號中揭示 QVTLKESGPTLVKPTETLTLTCTLSGFSLNNARMGVSWIRQPPGKCLEWLAHIFSNDEKSYSTSLKNRLTISKDSSKTQVVLTMTNVDPVDTATYYCARIVGYGSGWYGFFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:314) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO:315)
FL61 (Amgen)，美國申請公開案第2017/0037149A1號中揭示 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNEFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGEITMVRGVIGYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:316) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:317)
觀察到由雜交瘤中之五個，即4A4、11F4、1A2、4H2及13C9產生之抗體不與參考抗體中之任一者競爭結合於hFLT3-His。藉由量測抗體與表現cFLT3之等基因RMA細胞的結合來評估與食蟹獼猴FLT3 (cFLT3)之交叉反應性。
簡言之，將RMA細胞用編碼cFLT3或人類FLT3 (hFLT3)之逆轉錄病毒載體轉導。來自粗雜交瘤收穫物之α-FLT3 mAb與hFLT3或cFLT3等基因細胞株以及FLT3+癌細胞株之結合如下進行。96孔圓底盤每孔添加100,000個RMA、REH或SEM細胞。將細胞短暫離心且藉由旋轉使糰粒輕輕解離。每孔添加50 μL Zombie活/死染料(PBS + 1:2000染料)且在室溫下在黑暗中培育20分鐘。將細胞用200 μL FACS緩衝液(PBS +2% FBS)洗滌。將50 μL雜交瘤上清液添加至洗滌之細胞且將混合物在冰上在黑暗中培育30分鐘。將細胞洗滌一次且接著添加50 μL抗小鼠Fc-PE第二試劑(1:200稀釋)，且在冰上在黑暗中培育20分鐘。洗滌細胞且用50 μL  4%多聚甲醛在冰上固定15分鐘。再次洗滌細胞且接著再懸浮於200 μL FACS緩衝液中且儲存在4℃下直至準備獲取。樣品在裝備HTS (高通量采樣器)之BD FACSCelesta上操作。
亦量測雜交瘤上清液對據報導表現FLT3之人類ALL細胞株REH癌細胞(ATCC，目錄號CRL-8286)之結合親和力。如表12所示，大部分純系展示對表現hFLT3之癌細胞之結合親和力及與cFLT3之交叉反應性。不收集14A5及15A11之食蟹獼猴FLT3結合資料。表 12. FLT3 -His 與由候選雜交瘤產生之抗體結合的動力學參數及親和力
測試物品 分箱概況 37℃ 下SPR 細胞結合MFI
k a (1/Ms) k d (1/s) KD (nM) RMA-hFLT3 RMA-cFLT3 REH
4A4 獨特 3.38×105 3.35×10-4 1.0 1493 2002 2002
11F4 獨特 1.73×105 1.88×10-4 1.1 305 495 495
12H10 4G8 1.74×105 3.43×10-4 2.0 544 696 696
15A11 EB10 4.99×105 1.17×10-4 2.3 332 n/a n/a
12C9 FL23 5.67×104 3.11×10-4 5.4 1020 3937 664
1A2 獨特 1.14×105 7.49×10-4 6.5 238 461 461
14A5 FL23 1.70×105 1.49×10-3 8.7 1005 n/a 2071
4H2 獨特 8.05×104 9.18×10-4 11 570 1017 1017
13C9 獨特 2.12×105 3.02×10-3 14 546 834 834
8F02 FL23 1.67×105 2.80×10-3 17 829 2729 2271
14H08 FL23 1.29×105 2.40×10-3 19 959 3074 1776
實例 2. 經純化之抗 FLT3 鼠類抗體之分析
基於實例1中所述之分析，選擇八個雜交瘤(4A4、11F4、12H10、15A11、12C09、1A2、14A5、4H2)進行次選殖及測序。產生兩個來自各親本雜交瘤之次純系且分析。測得來自各雜交瘤之序列為獨特的。自雜交瘤培養物純化各次純系，且藉由SPR確認與hFLT3-His之結合，如圖 19 所示。hFLT3與經純化之鼠類次選殖mAb結合的動力學常數及親和力展示於表13中。使用實例1中所述之方法用參考抗體進行分箱，且四種抗體，即4A4.A3、11F4.B9、1A2.A3及4H2.E3，不與參考抗體中之任一種競爭結合於hFLT3-His。表 13 ： hFLT3 與經純化之鼠類次純系之結合的動力學參數及親和力
測試物品 k a (1/Ms) k d (1/s) KD ， (nM)
1A2.A3 1.1×105 8.9×10-4 8.5
4A4.A3 1.1×105 8.2×10-4 7.3
4H2.E3 5.7×104 1.0×10-3 17.6
11F4.B9 1.5×105 2.5×10-4 1.7
12C9.E5 3.4×104 6.3×10-4 18.7
12H10.G7 1.0×105 5.5×10-4 5.4
14A5.E8 1.3×105 1.9×10-3 15.1
15A11.C8 4.5×104 4.8×10-4 10.5
用表現人類及食蟹獼猴FLT3之等基因RMA細胞株證實細胞與經純化之次選殖mAb的結合。除12C9.E5外，所有結合於細胞表面之純系均表現人類及食蟹獼猴FLT3 (表14)。類似地，所有次純系均以高親和力結合於SEM (DSMZ，目錄號ACC 546)，SEM為據報導表現FLT3之人類ALL細胞株。表 14 ：經純化之小鼠 mAb 與人類及食蟹獼猴 FLT3 RMA 細胞株之細胞結合的確認
測試物品 RMA-hFLT3 EC50 (nM) RMA-hFLT3 最大MFI RMA-cFLT3 EC50 (nM) RMA-cFLT3 最大MFI SEM EC50 (nM) SEM 最大MFI
1A2.A3 0.80 499 1.82 2834 5.47 1361
4A4.A3 0.72 1021 1.07 5566 3.29 2352
4H2.E3 0.66 696 1.56 3454 7.57 1510
11F4.B9 0.53 493 1.23 2589 2.43 1141
12C9.E5 NB* NB NB NB NB NB
12H10.G7 0.36 1136 0.94 5262 3.20 2831
14A5.E8 約2.07 415 1.25 1779 約1.07 1956
15A11.C8 0.41 1406 0.82 6512 約1.13 3861
實例 3. 所選抗 FLT3 鼠類抗體之配位體阻斷特性
本實例描述經設計以表徵所選抗FLT3鼠類抗體阻斷FLT3與FLT3-配位體之相互作用之能力的實驗。在添加飽和濃度之可溶性FLT3-配位體之前及之後測試α-FLT3 mAb結合表現FLT3之EOL-1癌細胞(DSMZ，目錄號ACC 386)之能力。對於各抗體，因為指示在FLT3-配位體存在下獲得之mAb結合信號相對於在缺乏FLT3-配位體下獲得之mAb結合信號下降，所以計算其配位體阻斷值之百分比。已知之FLT3-配位體阻斷劑EB10 mAb用作陽性對照。如圖 20 所示，12H10.G7、11F4.B9及4A4.A3、14A5.E8抗體不干擾FLT3與FLT3-配位體之結合，而15A11.C8抗體阻斷FLT3-配位體與FLT3之結合。實例 4. 假定序列傾向性分析
本實例描述經設計以檢查12H10.G7、11F4.B9及4A4.A3、14A5.E8抗體之CDR (根據Chothia鑑別)中之潛在序列傾向性的實驗。考慮以下潛在傾向性：M (潛在氧化位點)；NG、NS及NT序列基元(潛在脫醯胺位點)；DG、DS及DT序列基元(潛在異構化位點)；DP序列基元(化學水解之潛在位點)。結果概述於15表中。表 15. 所選鼠類 mAb 之 CDR 中之假定序列傾向性
純系ID 潛在序列傾向性基元 序列傾向性基元位置
12H10.G7 DS (異構化位點) CDRH3
14A5.E8 M (氧化位點) CDRL1
11F4.B9 M (氧化位點)、NS (脫醯胺) CDRL1
DP (化學水解) CDRL3
4A4.A3 無   
另外，亦鑑別在M34序列傾向性，根據Kabat，其屬12H10.G7之CDRH1。此等抗體之變異體經設計以移除假定序列傾向性基元。實例 5. 人類化及親和力成熟
基於關於對重組hFLT3蛋白之動力學及親和力、與表現人類及食蟹獼猴FLT3之細胞株的結合、與不同AML及ALL癌細胞之結合、分箱概況以及不抑制人類FLT3-配體結合所收集的資料，選擇四種小鼠雜交瘤次純系，即12H10.G7、11F4.B9、4A4.A3及14A5.E8用於人類化。雖然4A4.A3及14A5.E8顯示比12H10.G7及11F4.B9略低之對hFLT3之親和力，但此等抗體似乎分別結合於FLT3之獨特抗原決定基(不與參考抗體交叉阻斷)及域1，因此進行進一步分析以探索抗原決定基多樣性。
將12H10.G7抗體人類化以建立如上所述之GB94及GB102，兩者共享相同VH及VL序列。在構架區中引入回復突變以建立變異體GB87至GB93及GB95至GB101。
將11F4.B9抗體人類化以建立如上所述之1153及1154，兩者共享相同VH及VL序列。在構架區中引入回復突變以建立變異體1151及1152。1153抗體亦進行親和力成熟。簡言之，設計集中於1553 FLT3 scFv之CDR上的文庫且在酵母表面上呈現。藉由將酵母與生物素化人類FLT3-His抗原一起培育，進行FACS選擇兩次。FACS富集之輸出樣品與額外CDR突變體組合以製造第二文庫。藉由用生物素化人類FLT3-His自100 nM至1 nM滴定進行兩輪額外FACS選擇。在10 nM下進行分選，其中與親本相比，觀察到文庫存在信號明顯增加。塗鋪分選之酵母純系且篩選。實例 6. TriNKET 與表現人類癌症抗原之細胞之結合的評定
異位表現人類及食蟹獼猴FLT3之等基因細胞株用於評定人類與食蟹獼猴FLT3之間的交叉反應性。表現hFLT3或cFLT3之人類癌細胞株RMA用於評定靶向FLT3之TriNKET與親本mAb之腫瘤抗原結合。人類AML細胞株MOLM-13及MV4-11及人類ALL細胞株REH用於評定TriNKET或親本mAb之結合能力。詳言之，分別表現FLT3-T227M及FLT3-ITD之MOLM-13細胞及MV4-11細胞用於評定靶向FLT3之TriNKET及親本mAb結合突變FLT3之能力。
將呈人類IgG1格式之GB102單株抗體(亦稱為1158 mAb)及上述其對應TriNKET F3'-GB102 (亦稱為F3'-1158)稀釋且與相應細胞一起培育。接著細胞與螢光團結合之抗人類IgG二級抗體一起培育且藉由流式細胞術分析。將平均螢光強度(MFI)值相對於只二級抗體之對照正規化以獲得相比於背景之倍數(FOB)值。
如圖21A 及圖21B 所示，F3'-1158及1158 mAb各以同等效力結合異位表現人類及食蟹獼猴FLT3之RMA細胞。如圖 21C 所示，F3'-1158及1158 mAb結合人類ALL細胞REH細胞。如圖 22A 及22B 所示，F3'-1158及1158 mAb各結合分別表現FLT3-T227M及FLT3-ITD之MOLM-13細胞及MV4-11細胞。實例 7. TriNKET 或 mAb 內化之評定
在與F3'-1158或1158 mAb一起培育之後源自於嗜酸性球白血病之EOL-1人類癌細胞株用於評定FLT3之內化。將一式兩份盤中EOL-1細胞與F3'-1158、1158 mAb或hIgG1同型對照抗體一起在37℃下培育兩小時。在培育之後，洗滌細胞且使用非競爭性抗FLT3抗體染色總FLT3。如下計算FLT3內化： 內化% = (1-(2小時樣品MFI/2小時hIgG1同型MFI)) × 100%
圖 23A-23B 展示在REH (圖 23A )及EOL-1 (圖 23B )中與F3'-1158及1158 mAb一起培育之後FLT3之內化。親本mAb誘導小於10%之FLT3內化，而靶向FLT3之TriNKET誘導小於5%之FLT3內化。實例 8. 初級人類 NK 細胞之細胞毒性分析
藉由DELFIA細胞毒性分析量測靶細胞之溶解。簡言之，自培養物中收穫表現FLT3之人類癌細胞株，用HBS洗滌，且再以106 /mL懸浮於生長培養基中以用BATDA試劑(Perkin Elmer C136-100)標記。關於靶細胞之標記，遵循製造商說明書。在標記之後，將細胞用HBS洗滌三次，且以0.5-1.0×105 /mL再懸浮於培養基中。將100 μl  BATDA標記之細胞添加至96孔盤之各孔。在培養基中稀釋針對FLT3之單株抗體或TriNKET，且將50 μl稀釋之mAb或TriNKET添加至各孔。
為製備NK細胞，使用密度梯度離心自人類周邊血液白細胞層分離PBMC，洗滌，且準備用於NK細胞分離。使用陰性選擇技術利用磁性珠粒分離NK細胞。分離之NK細胞之純度通常＞90% CD3-CD56+。將分離之NK細胞靜息隔夜且自培養物收穫。接著洗滌細胞且以105 -2.0×106 /mL之濃度再懸浮於培養基中，效應與標靶(E:T)比率為5:1。將50 μl NK細胞添加至盤之各孔中，總共200 μl培養物體積。將盤在37℃下在5% CO2 下培育2-3小時。
在培育之後，自培育箱移除盤且藉由在200×g下離心5分鐘將細胞糰粒化。將20 μl培養物上清液轉移至乾淨微量培養盤中，且將200 μl室溫銪溶液(Perkin Elmer C135-100)添加至各孔中。將盤避光且在盤式震盪器上在250 rpm下培育15分鐘，接著使用SpectraMax i3X儀器讀取。
在缺乏NK細胞下培育之標靶細胞中量測可與銪形成螢光螯合物之物質的自發釋放。在用1% Triton-X溶解之標靶細胞中量測此類物質之最大釋放。如下計算特定溶解%： 特定溶解% = ((實驗釋放 – 自發釋放) /  (最大釋放–自發釋放))×100%。
圖 24A-24D 顯示F3'-1158或1158 mAb增強初級NK細胞介導之人類AML或ALL細胞株EOL-1 (圖 24A )、Reh (圖 24B )、RS4-11 (圖 24C )及MV4-11 (圖 24D )之殺死的活性。F3'-1158顯示與其親本mAb 1158 mAb相比更有效之殺死。
為評定結合NKG2D之抗原結合位點及Fc之效應功能是否有助於F3'-1158之細胞毒性，構築兩種TriNKET變異體。第一變異體在結合NKG2D之A49抗原結合位點之輕鏈可變域中含有突變。因此，此變異體不結合人類NKG2D。突變輕鏈可變域之胺基酸序列為DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASNSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSTKSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDDLPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:305)。此第一變異體之胺基酸序列在其他方面與F3'-1158之胺基酸序列一致。第二變異體在Fc域中含有突變。具體而言，Fc域之各多肽鏈含有L234A/L235A/P329G取代(根據EU編號系統進行編號)，據報導，減少Fc與Fcγ受體之結合。此第二變異體之胺基酸序列在其他方面與F3'-1158之胺基酸序列一致。
此等變異體誘發NK細胞介導之標靶細胞溶解的能力使用上述DELFIA細胞毒性分析評定。如圖 25 所示，靶向NKG2D之域及Fc域中之突變基本上降低細胞毒性。此結果表明，結合於NKG2D與結合於Fcγ受體均影響F3'-1158之細胞毒活性。實例 9. 初級人類 T 細胞之細胞毒性分析
除了CD8+ T細胞用作免疫效應細胞之外，藉由如實例8中所述之DELFIA細胞毒性分析量測標靶細胞之溶解。如下製備CD8+ T細胞：利用Lymphoprep及SepMate 50，根據製造商說明書，使用密度梯度離心自人類周邊血白細胞層分離人類PBMC。在培養基中，在37℃下，用1 μg/mL ConA (IL-2培養補充物)刺激分離之PBMC 18小時。接著移除ConA且將PBMC與25單位/毫升IL-2在37℃下培養4天。根據製造商說明書，使用陰性選擇技術利用磁性珠粒(EasySep™人類CD8+ T細胞分離套組)純化CD8+ T細胞。將CD8+ T細胞在含有10 ng/mL IL-15之培養基中在37℃下培養6-13天，接著用於細胞溶解分析中。
如圖 26 所示，F3'-1158，而非1158 mAb，顯著增強CD8 T細胞溶解RS4-11標靶細胞之能力。F3'-1158以劑量依賴性方式增加CD8+ T細胞介導之RS4-11細胞溶解。實例 10. TriNKET 或 mAb 與人類全血之結合的評定
評定F3'-1158及1158 mAb結合不同類型血細胞之能力。簡言之，將人類全血與F3'-1158、1158 mAb或人類IgG1同型對照抗體一起培育。藉由流式細胞術來分析血細胞，且使用螢光團結合之抗人類IgG二級抗體偵測F3'-1158、1158 mAb或同型對照抗體之結合。
如圖 27 所示，F3'-1158及1158 mAb未顯示顯著結合於血液中之顆粒球、單核球、B細胞、NK細胞、CD8+ T細胞及CD4+ T細胞。實例 11. FLT3 信號傳導之活化
藉由pFLT3 ELISA (R & D Systems DYC368)量測FLT3之磷酸化(FLT3信號傳導之標記物)。將EOL-1細胞塗鋪在96孔圓底盤中。添加F3'-1158、1158 mAb及/或FLT3L。將樣品在室溫下培育5分鐘且立即在300×g下糰粒化5分鐘。將細胞用PBS洗滌兩次。使細胞糰粒再懸浮於200 μL溶解緩衝液#9中且在冰上培育15分鐘。將樣品在2000×g下糰粒化5分鐘，且將上清液轉移至乾淨試管中。使用BCA總蛋白分析定量蛋白質濃度。視情況將樣品在IC稀釋劑#12中稀釋。根據製造商說明書量測溶解產物。藉由自推導之標準曲綫內插值，確定各樣品中之pFLT3濃度。已知標準之光密度值相對於其相應濃度繪圖且資料擬合成綫性回歸模型。
如圖 28A 所示，FLT3L引起pFLT3水準增加3倍，而F3'-1158及1158 mAb不誘導顯著FLT3磷酸化。圖 28B 顯示，當細胞與F3'-1158或1158 mAb以及FLT3L一起培育時，F3'-1158與1158 mAb均不抑制FLT3L誘導之FLT3磷酸化。此等結果符合1158 mAb不與FLT3L競爭結合FLT3之觀察結果。 以引用之方式併入
除非相反地陳述，否則本文中提及之各專利文件及科學論文之整個揭示內容均以引用之方式併入以達成所有目的。 同等物
在不脫離本發明之精神或基本特徵下本發明可藉由其他特定形式體現。因此，認為上述實施例在所有方面均為說明性，而非限制本文所述之本發明。因此本發明之範疇藉由隨附申請專利範圍指示，而非藉由以上描述指示，且意欲其中涵蓋在申請專利範圍之同等含義及範疇內的所有改變。
圖 1 為異二聚體、多特異性抗體、例如三特異性結合蛋白(TriNKET)之圖示。各臂可表示NKG2D結合域或與FLT3對應之結合域。在一些實施例中，NKG2D結合域及FLT3結合域可共享共同輕鏈。圖 2A-2E 示出多特異性結合蛋白、例如三特異性結合蛋白(TriNKET)之五種示例性格式。如圖 2A 所示，NKG2D結合域或FLT3結合域可採取scFv格式(左臂)。含有靶向NKG2D之scFv、靶向FLT3之Fab片段及異二聚之抗體恆定區的抗體在本文中稱為F3-TriNKET。含有靶向FLT3之scFv、靶向NKG2D之Fab片段及結合CD16之異二聚之抗體恆定區/域的抗體在本文中稱為F3'-TriNKET (圖 2E )。如圖 2B 所示，NKG2D結合域與FLT3結合域均可採取scFv格式。圖 2C 至 2D 示出具有三個抗原結合位點之抗體，包括結合FLT3之兩個抗原結合位點，及與異二聚之抗體恆定區融合的NKG2D結合位點。此等抗體格式在本文中稱為F4-TriNKET。圖 2C 示出兩個FLT3結合位點呈Fab片段格式，且NKG2D結合位點呈scFv格式。圖 2D 示出FLT3結合位點呈scFv格式，且NKG2D結合位點呈scFv格式。圖 2E 表示含有靶向腫瘤之scFv、靶向NKG2D之Fab片段及結合CD16之異二聚之抗體恆定區/域(「CD域」)的三特異性抗體(TriNKET)。抗體格式在本文中稱為F3'-TriNKET。在某些示例性多特異性結合蛋白中，抗體恆定區上之異二聚突變包括一個恆定域上之K360E及K409W；及相對恆定域上之Q347R、D399V及F405T (顯示為CD域中之三角形鎖鑰形狀)。Fab片段之重鏈與輕鏈可變域之間的粗條表示二硫鍵。圖 3 為呈三功能抗體(Triomab)形式之TriNKET的圖示，其為保持IgG樣形狀之三功能之雙特異性抗體。此嵌合體由兩個半抗體組成，各半抗體具有來源於兩個親本抗體之一個輕鏈及一個重鏈。三功能抗體形式可為含有1/2大鼠抗體及1/2小鼠抗體之異二聚體構築體。圖 4 為呈KiH共同輕鏈形式之TriNKET的圖示，其涉及杵-臼(KIH)技術。KiH為含有2個結合於標靶1及2之Fab片段及由異二聚突變穩定之Fc的異二聚體。呈KiH格式之TriNKET可為具有2個結合於標靶1及標靶2之Fab片段的異二聚體構築體，其含有兩個不同重鏈及與兩個重鏈配對之共同輕鏈。圖 5 呈雙重可變域免疫球蛋白(DVD-Ig™)形式之TriNKET的圖示，其經由天然存在之可撓性連接子組合兩種單株抗體之標靶結合域且產生四價IgG樣分子。DVD-Ig™為一種同二聚體構築體，其中靶向抗原2之可變域與靶向抗原1之Fab片段之可變域的N端融合。DVD-Ig™形式含有正常Fc。圖 6 為呈正交Fab片段界面(Ortho-Fab)形式之TriNKET的圖示，其為含有與Fc融合之2個結合於標靶1及標靶2之Fab片段的異二聚體構築體。藉由正交界面確保輕鏈(LC)-重鏈(HC)配對。藉由Fc之突變確保異二聚。圖 7 為呈2合1型Ig格式之TriNKET的圖示。圖 8 為呈ES形式之TriNKET的圖示，其為含有與Fc融合之兩個結合於標靶1及標靶2之不同Fab片段的異二聚體構築體。藉由Fc之靜電轉向突變確保異二聚。圖 9 為呈Fab臂交換形式之TriNKET的圖示：藉由用來自另一分子之重鏈-輕鏈對替換重鏈及所附接之輕鏈(半分子)來交換Fab片段臂的抗體。Fab臂交換形式(cFae)為含有2個結合於標靶1及2之Fab片段及由異二聚突變穩定之Fc的異二聚體。圖 10 為呈SEED體形式之TriNKET的圖示，其為含有2個結合於標靶1及標靶2之Fab片段及藉由異二聚突變穩定之Fc的異二聚體。圖 11 為呈LuZ-Y形式之TriNKET的圖示，其中白胺酸拉煉用於誘導兩個不同HC之異二聚。LuZ-Y形式為含有與Fc融合之兩個結合於標靶1及2之不同scFab的異二聚體。經由與Fc之C端融合的白胺酸拉煉基元來確保異二聚。圖 12 為呈Cov-X體形式之TriNKET的圖示。圖 13A-13B 為呈κλ-體形式之TriNKET的圖示，其為具有與藉由異二聚突變穩定之Fc融合之兩個不同Fab片段的異二聚體構築體：靶向抗原1之一個Fab片段含有κLC，且靶向抗原2之第二Fab片段含有λLC。圖13A為κλ-體之一種形式的示例性圖示；圖13B為另一κλ-體之示例性圖示。圖 14 為包括結合於標靶1之Fab片段及結合於標靶2之scFab的Oasc-Fab異二聚體構築體，Fab片段及scFab兩者均與Fc域融合。藉由Fc域之突變確保異二聚。圖 15 為一種DuetMab，其為含有兩個結合於抗原1及2之不同Fab片段及藉由異二聚突變穩定之Fc的異二聚體構築體。Fab片段1及2含有確保正確輕鏈與重鏈配對之差別S-S橋。圖 16 為一種CrossmAb，其為具有兩個結合於標靶1及2之不同Fab片段及藉由異二聚突變穩定之Fc的異二聚體構築體。CL及CH1域與VH及VL域切換，例如CH1與VL串聯融合，而CL與VH串聯融合。圖 17 為Fit-Ig，其為一種同二聚體構築體，其中結合於抗原2之Fab片段與結合於抗原1之Fab片段之HC的N端融合。構築體含有野生型Fc。圖 18 為一組感測圖，其示出自鼠類雜交瘤上清液收集之結合於hFLT3之抗體的SPR概況。圖 19 為一組感測圖，其示出自鼠類mAb子純系收集之結合於hFLT3之抗體的SPR概況。圖 20 為描繪藉由飽和濃度之可溶性FLT3-配位體降低候選抗體結合表現FLT3之EOL-1癌細胞之能力的條形圖。圖 21A-21C 為展示靶向FLT3之TriNKET F3'- 1158及其親本單株抗體與表現FLT3之細胞株RMA-hFLT3 (圖 21A )、RMA-cFLT3 (圖 21B )及REH (圖 21C )的結合的綫圖。圖 22A-22B 為展示靶向FLT3之TriNKET F3'-1158及其親本單株抗體與表現具有T227M突變之FLT3之MOLM-13細胞(圖 22A )及表現具有ITD突變之FLT2之MV4-11細胞的結合的綫圖。圖 23A-23B 為展示靶向FLT3之TriNKET F3'-1158及其親本單株抗體內化至表現FLT3之細胞株REH (圖 23A )及EOL-1 (圖 23B )中的綫圖。圖 24A-24D 為展示表現FLT3之癌細胞株EOL-1 (圖 24A )、REH (圖 24B )、RS4-11 (圖 24C )及MV4-11 (圖 24D )在TriNKET F3'-1158及其親本單株抗體存在下之NK細胞介導之溶解的條形圖。圖 25 為描繪表現FLT3之癌細胞株REH在TriNKET F3'-1158、其NKG2D死亡變異體(「F3'-1158死亡-2D」)、其Fc沉默變異體(「F3'-1158si」)或其親本單株抗體1158mAb存在下的NK細胞介導之溶解的綫圖。圖 26 為展示表現FLT3之急性淋巴母細胞白血病細胞株RS4-11在TriNKET F3'-1158及其親本單株抗體存在下的CD8 T細胞介導之溶解的綫圖。圖 27 為一組展示TriNKET F3'-1158及其親本單株抗體與血細胞之結合的直方圖。圖 28A-28B 為展示TriNKET F3'-1158及其親本單株抗體在FLT3-配位體缺乏(圖 28A )或存在(圖 28B )下之FLT3磷酸化的條形圖。圖7A中之FLT3-配位體樣品充當陽性對照。
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Claims (66)

  1. 一種蛋白質，其包含： (a) 結合NKG2D之第一抗原結合位點； (b) 結合FLT3之第二抗原結合位點；及 (c) 足以結合CD16之抗體Fc域或其一部分，或結合CD16之第三抗原結合位點， 其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含： (i) 包含互補決定區1 (CDR1)、互補決定區2 (CDR2)及互補決定區3 (CDR3)之重鏈可變域(VH)，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變域(VL)，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列； (ii) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 59、63及54之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 86、66及67之胺基酸序列； (iii) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列； (iv) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 97、99及100之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 101、102及103之胺基酸序列； (v) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列； (vi) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 109、110及111之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 112、113及114之胺基酸序列； (vii) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 117、118及119之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 120、121及122之胺基酸序列； (viii) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列； (ix) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、33及127之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 128、129及130之胺基酸序列；或 (x) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 132、133及134之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66及46之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。
  3. 如請求項2之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。
  4. 如請求項2之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 11、4及50之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列。
  5. 如請求項2至4中任一項之蛋白質，其中該VH包含與SEQ ID NO:37至少90%一致之胺基酸序列，且該VL包含與SEQ ID NO:38至少90%一致之胺基酸序列。
  6. 如請求項2至5中任一項之蛋白質，其中該VH包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列。
  7. 如請求項6之蛋白質，其中該VH及該VL分別包含以下胺基酸序列：SEQ ID NO: 9及10；13及10；17及10；9及22；9及26；9及30；9及34；37及38；41及42；45及42；或49及42。
  8. 如請求項2至7中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點呈單鏈可變區片段(scFv)存在，且其中該scFv包含選自SEQ ID NO: 3、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51及52之胺基酸序列。
  9. 如請求項1之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 59、63及54之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 86、66及67之胺基酸序列。
  10. 如請求項9之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 78、63、79之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 80、66、67之胺基酸序列。
  11. 如請求項9之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、63、64之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66、67之胺基酸序列。
  12. 如請求項9至11中任一項之蛋白質，其中該VH包含與SEQ ID NO:76至少90%一致之胺基酸序列，且該VL包含與SEQ ID NO:77至少90%一致之胺基酸序列。
  13. 如請求項9至12中任一項之蛋白質，其中該VH包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:84之胺基酸序列。
  14. 如請求項13之蛋白質，其中該VH及該VL分別包含以下胺基酸序列：SEQ ID NO: 68及69；72及73；或76及77。
  15. 如請求項9至14中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點呈scFv存在，且其中該scFv包含選自SEQ ID NO: 70、71、74、75、81及82之胺基酸序列。
  16. 如請求項1之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列。
  17. 如請求項1之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 97、99及100之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 101、102及103之胺基酸序列。
  18. 如請求項1之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列。
  19. 如請求項1之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 109、110及111之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 112、113及114之胺基酸序列。
  20. 如請求項1之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 117、118及119之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 120、121及122之胺基酸序列。
  21. 如請求項1之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列。
  22. 如請求項1之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 62、33及127之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 128、129及130之胺基酸序列。
  23. 如請求項1之蛋白質，其中該結合FLT3之第二抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 132、133及134之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 65、66及46之胺基酸序列。
  24. 如前述請求項中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點以如藉由表面電漿子共振(SPR)所量測之小於或等於20 nM之解離常數(KD )結合人類FLT3。
  25. 如請求項2至8、16、17及21中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點以如藉由SPR所量測之小於或等於10 nM之KD 結合人類FLT3。
  26. 如請求項2至8中任一項之抗原結合位點，其中該抗原結合位點結合包含SEQ ID NO:318之胺基酸序列之人類FLT3變異體。
  27. 如請求項2至8中任一項之抗原結合位點，其中該抗原結合位點結合包含SEQ ID NO:319之胺基酸序列之人類FLT3變異體。
  28. 如請求項2至21及23至27中任一項之蛋白質，其中該抗原結合位點結合食蟹獼猴FLT3。
  29. 如請求項2至20及22至28中任一項之蛋白質，其中該抗原結合位點不與FLT3L競爭結合FLT3。
  30. 如前述請求項中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含足以結合CD16之抗體Fc域或其一部分。
  31. 如請求項1至30中任一項之蛋白質，其中該結合NKG2D之第一抗原結合位點為Fab片段，且該結合FLT3之第二抗原結合位點為scFv。
  32. 如請求項1至30中任一項之蛋白質，其中該結合NKG2D之第一抗原結合位點為scFv，且該結合FLT3之第二抗原結合位點為Fab片段。
  33. 如前述請求項中任一項之蛋白質，其進一步包含結合FLT3之額外抗原結合位點。
  34. 如請求項1至30及32至33中任一項之蛋白質，其中該結合NKG2D之第一抗原結合位點為scFv，且該結合FLT3之第二抗原結合位點及該結合FLT3之額外抗原結合位點各自為Fab片段。
  35. 如請求項1至30及33中任一項之蛋白質，其中該結合NKG2D之第一抗原結合位點為scFv，且該結合FLT3之第二抗原結合位點及該結合FLT3之額外抗原結合位點各自為scFv。
  36. 如請求項31、32、34或35之蛋白質，其中該結合FLT3之scFv及/或該結合NKG2D之scFv包含重鏈可變域及輕鏈可變域。
  37. 如請求項36之蛋白質，其中該scFv經由包含Ala-Ser或Gly-Ser之鉸鏈連接於足以結合CD16之抗體恆定域或其一部分。
  38. 如請求項37之蛋白質，其中該鉸鏈進一步包含胺基酸序列Thr-Lys-Gly。
  39. 如請求項36至38中任一項之蛋白質，其中該scFv之該重鏈可變域與該scFv之該輕鏈可變域形成二硫橋鍵。
  40. 如請求項39之蛋白質，其中根據Kabat編號方案進行編號，在該重鏈可變域之C44與該輕鏈可變域之C100之間形成二硫橋鍵。
  41. 如請求項36至40中任一項之蛋白質，其中該scFv之該重鏈可變域經由可撓性連接子連接於該scFv之該輕鏈可變域。
  42. 如請求項41之蛋白質，其中該可撓性連接子包含(G4 S)4 。
  43. 如請求項36至42中任一項之蛋白質，其中在該scFv內，該重鏈可變域位於該輕鏈可變域之C端。
  44. 如請求項36至42中任一項之蛋白質，其中在該scFv內，該重鏈可變域位於該輕鏈可變域之N端。
  45. 如請求項31至34及36至44中任一項之蛋白質，其中該Fab不位於抗原結合位點與該Fc或其部分之間。
  46. 如前述請求項中任一項之蛋白質，其中該結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及270或271之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。
  47. 如請求項46之蛋白質，其中該結合NKG2D之第一抗原結合位點包含： (i) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及255或256之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO:276、236及245之胺基酸序列；或 (ii) 包含CDR1、CDR2及CDR3之VH，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 240或241、242及243或244之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2及CDR3之VL，該CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO: 276、236及245之胺基酸序列。
  48. 如請求項46或47之蛋白質，其中該第一抗原結合位點之該VH包含與SEQ ID NO:254至少90%一致之胺基酸序列，且該第一抗原結合位點之該VL包含與SEQ ID NO:239至少90%一致之胺基酸序列。
  49. 如請求項46至48中任一項之蛋白質，其中該第一抗原結合位點之該VH包含SEQ ID NO:254之胺基酸序列，且該第一抗原結合位點之該VL包含SEQ ID NO:239之胺基酸序列。
  50. 如前述請求項中任一項之蛋白質，其中該抗體Fc域為人類IgG1抗體Fc域。
  51. 如請求項50之蛋白質，其中該抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:136至少90%一致之胺基酸序列。
  52. 如請求項50或51之蛋白質，其中根據EU編號系統進行編號，該抗體Fc域之至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136在一或多個選自以下之位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及K439。
  53. 如請求項50至52中任一項之蛋白質，其中根據EU編號系統進行編號，該抗體Fc域之至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136包含一或多個選自以下之突變：Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D及K439E。
  54. 如請求項50至53中任一項之蛋白質，其中根據EU編號系統進行編號，該抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136在一或多個選自以下之位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及K439；且該抗體重鏈恆定區之另一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136在一或多個選自以下之位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、D401、F405、Y407、K409、T411及K439。
  55. 如請求項54之蛋白質，其中根據EU編號系統進行編號，該抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136包含K360E及K409W取代；且該抗體重鏈恆定區之另一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136包含Q347R、D399V及F405T取代。
  56. 如請求項54或55之蛋白質，其中根據EU編號系統進行編號，該抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136包含Y349C取代；且該抗體重鏈恆定區之另一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:136包含S354C取代。
  57. 一種蛋白質，其包含： (a) 包含SEQ ID NO:278之胺基酸序列之第一多肽； (b) 包含SEQ ID NO:279之胺基酸序列之第二多肽；及 (c) 包含選自SEQ ID NO: 277、283、284、285、286、287、288及289之胺基酸序列之第三多肽。
  58. 一種蛋白質，其包含： (a) 包含SEQ ID NO:280之胺基酸序列之第一多肽； (b) 包含SEQ ID NO:281之胺基酸序列之第二多肽；及 (c) 包含SEQ ID NO:282之胺基酸序列之第三多肽。
  59. 一種醫藥組合物，其包含如前述請求項中任一項之蛋白質及醫藥學上可接受之載劑。
  60. 一種細胞，其包含編碼如請求項1至58中任一項之蛋白質的一或多種核酸。
  61. 一種增強腫瘤細胞死亡之方法，該方法包括將腫瘤細胞及自然殺手細胞暴露於有效量之如請求項1至58中任一項之蛋白質或如請求項59之醫藥組合物。
  62. 一種治療癌症之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之如請求項1至58中任一項之蛋白質或如請求項59之醫藥組合物。
  63. 如請求項62之方法，其中該癌症為血液惡性病。
  64. 如請求項63之方法，其中該血液惡性病為白血病。
  65. 如請求項63或64之方法，其中選自由以下組成之群：急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、骨髓化生不良、急性T-淋巴母細胞白血病及急性前髓細胞白血病。
  66. 如請求項62至65中任一項之方法，其中該癌症表現FLT3。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019157366A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor
AU2022333099A1 (en) * 2021-08-24 2024-02-08 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Gdf15 fusion proteins and uses thereof
AU2022358500A1 (en) * 2021-09-29 2024-04-04 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and baff-r
WO2023107956A1 (en) * 2021-12-08 2023-06-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and 5t4
WO2024040195A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
WO2024102693A2 (en) 2022-11-07 2024-05-16 Xencor, Inc. Il-18-fc fusion proteins

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL2014108B1 (en) * 2015-01-09 2016-09-30 Aduro Biotech Holdings Europe B V Altered april binding antibodies.
CA2992539A1 (en) * 2015-07-16 2017-01-19 Cellerant Therapeutics, Inc. Cysteine-substituted immunoglobulins
BR112020001972A2 (pt) * 2017-07-31 2020-08-04 Dragonfly Therapeutics, Inc. proteínas de ligação a nkg2d, cd16 e flt3

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CA3153858A1 (en) 2021-04-22
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EP4045538A1 (en) 2022-08-24
IL292261A (en) 2022-06-01
MX2022004430A (es) 2022-07-19
PE20221316A1 (es) 2022-09-07

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