TW202330603A - 結合ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６和ｂａｆｆ—ｒ的蛋白 - Google Patents

結合ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６和ｂａｆｆ—ｒ的蛋白 Download PDF

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Abstract

描述了結合NKG2D受體、CD16和B細胞活化因子受體（BAFF-R）的多特異性結合蛋白，以及可用於治療癌症和自體免疫性炎性疾病的該等多特異性結合蛋白的藥物組成物和治療方法。

Description

結合NKG2D、CD16和BAFF-R的蛋白
本申請關於與細胞上的NKG2D、CD16和B細胞活化因子受體（BAFF-R）結合的多特異性結合蛋白、包含此類蛋白的藥物組成物以及使用此類蛋白和藥物組成物之治療方法（包括用於癌症的治療）。
儘管進行了大量的研究工作，但癌症仍然是全球各國的重大臨床和經濟負擔。根據世界衛生組織（WHO）的數據，它係第二大死因。手術、放射療法、化學療法、生物療法、免疫療法、激素療法、幹細胞移植和精準醫療係現有的治療方式。儘管在該等領域進行了廣泛的研究，但尚未確定一種高效的治癒性解決方案，特別是對於最具侵襲性的癌症。此外，許多現有的抗癌治療方式具有顯著的不良副作用。
癌症免疫療法係理想的，因為它們具有高度特異性，並且可以利用患者自身的免疫系統促進癌細胞的破壞。融合蛋白例如雙特異性T細胞接合器係文獻中描述的癌症免疫療法，它們與腫瘤細胞和T細胞結合以促進腫瘤細胞的破壞。
自然殺傷（NK）細胞係先天免疫系統的組分，約占循環淋巴球的15%。NK細胞浸潤幾乎所有組織，最初被表徵為無需事先致敏即可有效殺傷腫瘤細胞。活化的NK細胞藉由類似於細胞毒性T細胞的方式殺傷靶細胞 -即，藉由含有穿孔素和顆粒酶的細胞溶解顆粒以及藉由死亡受體途徑的方式。活化的NK細胞還分泌炎性細胞介素，如IFN-γ和趨化介素，它們促進其他白血球募集到靶組織。
NK細胞藉由其表面的各種活化性和抑制性受體對訊息作出反應。例如，當NK細胞遇到健康的自身細胞時，它們的活性會藉由殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（KIR）的活化而受到抑制。可替代地，當NK細胞遇到外來細胞或癌細胞時，它們會藉由其活化性受體（例如，NKG2D、NCR、DNAM1）被活化。NK細胞也可藉由其表面的CD16受體被某些免疫球蛋白的恒定區活化。NK細胞對活化的總體敏感性取決於刺激性訊息和抑制性訊息的總和。NKG2D係II型跨膜蛋白，基本上由所有自然殺傷細胞表現，此時NKG2D作為活化性受體。NKG2D也存在於T細胞上，此時它充當共刺激受體。藉由NKG2D調節NK細胞功能的能力可用於包括惡性腫瘤在內的各種治療環境。
BAFF-R，也稱為BAFF受體、TNF受體超家族成員13C（TNFRSF13C）、CD268、或BR3，係TNF受體超家族的III型跨膜蛋白。BAFF-R在晚期過渡（T2）B細胞階段和所有成熟B細胞上表現，在生髮中心B細胞上下調，在記憶細胞上重新表現，在漿細胞上不存在（Davidson (2012) Curr. Rheumatol. Rep.[當前風濕病報告], 14(4): 295-302）。BAFF-R係B細胞活化因子（BAFF）的受體，BAFF係B細胞存活因子。BAFF可以結合三種受體：BAFF-R、跨膜活化物和CAML相互作用物（TACI）以及B細胞成熟抗原（BCMA）。在這三種受體中，BAFF-R係參與濾泡和緣帶脾臟B細胞發育的主要受體（Schiemann等人 (2001) Science [科學], 293: 2111-14）。
BAFF/BAFF-R傳訊軸可能在B細胞增生中發揮作用。在非何杰金氏淋巴瘤（NHL）患者中觀察到BAFF-R表現增加以及BAFF血清水平升高（Shen等人 (2016) Adv. Clin. Exp. Med. [臨床與實驗醫學進展], 25(5):837-44）。BAFF-R中的某些單核苷酸多態性（SNP）與慢性淋巴球白血病（CLL）的風險增加有關（Jesek等人 (2016) Tumour Biol. [腫瘤生物學], 37(10):13617-26）。BAFF/BAFF-R軸也涉及自體免疫性炎性疾病（Mackay等人 (1999) J. Exp. Med. [實驗醫學雜誌], 190:1697-1710）。部分全身性紅斑狼瘡（SLE）患者血清中的BAFF水平升高（Cheema 等人(2001) Arthritis Rheum. [關節炎和風濕病學], 44:1313-19），並且在SLE中BAFF-R始終存在於血液B細胞上（Carter 等人(2005) Arthritis Rheum. [關節炎和風濕病學], 52:3943-54）。由於觀察到與保護性B細胞相比，自身反應性B細胞的存活對BAFF有更大的依賴性（Lesley等人 (2004) Immunity [免疫], 20:441-53），已經提出異常高水平的BAFF可能藉由增強自身反應性B細胞的存活而促進自體免疫性疾病的發病機制。
因此，在該領域仍然需要結合BAFF-R的新的和有用的蛋白，用於治療癌症和自體免疫性炎性疾病。
本申請提供了與自然殺傷細胞上的 NKG2D受體和CD16受體、以及BAFF-R結合的多特異性結合蛋白。該等蛋白可以接合多於一個種類的NK活化性受體，並可阻斷天然配體與NKG2D的結合。在某些實施方式中，蛋白可以激動人的NK細胞。在一些實施方式中，蛋白可以激動人和其他物種例如齧齒動物和石蟹獼猴中的NK細胞。還提供了含有本文揭露的任何一種蛋白的配製物；含有一或多種表現該等蛋白的核酸的細胞，以及使用該等蛋白增強腫瘤細胞死亡的方法。
因此，一方面，本申請提供了一種蛋白，其包含： (a) 結合NKG2D的第一抗原結合位點； (b) 結合B細胞活化因子受體（BAFF-R）的第二抗原結合位點；以及 (c) 足以結合CD16的抗體Fc結構域或其部分，或結合CD16的第三抗原結合位點。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點係Fab片段，並且結合BAFF-R的第二抗原結合位點係scFv。在一些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點係scFv，並且結合BAFF-R的第二抗原結合位點係Fab片段。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，該蛋白進一步包含結合BAFF-R的另外抗原結合位點。在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點係scFv，並且結合BAFF-R的第二抗原結合位點和另外的抗原結合位點各自是Fab片段。在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點係scFv，並且結合BAFF-R的第二抗原結合位點和另外的抗原結合位點各自是scFv。在某些實施方式中，第二抗原結合位點和另外的抗原結合位點的胺基酸序列係相同的。在某些實施方式中，第二抗原結合位點和另外的抗原結合位點的胺基酸序列係不同的。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，結合NKG2D的scFv經由包含Ala-Ser或Gly-Ser的鉸鏈連接至足以結合CD16的抗體恒定結構域或其部分，其中scFv包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域。在某些實施方式中，每個結合BAFF-R的scFv經由包含Ala-Ser或Gly-Ser的鉸鏈連接至足以結合CD16的抗體恒定結構域或其部分，其中scFv包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域。在某些實施方式中，鉸鏈進一步包含胺基酸序列Thr-Lys-Gly。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，在結合NKG2D的scFv中，scFv的重鏈可變結構域與scFv的輕鏈可變結構域形成雙硫鍵。在一些實施方式中，在每個結合BAFF-R的scFv中，scFv的重鏈可變結構域與scFv的輕鏈可變結構域形成雙硫鍵。在一些實施方式中，雙硫鍵在重鏈可變結構域的C44和輕鏈可變結構域的C100之間形成，按照Kabat編號方案編號。在一些實施方式中，在結合NKG2D的scFv中，重鏈可變結構域藉由柔性連接子連接至輕鏈可變結構域。在一些實施方式中，在每個結合BAFF-R的scFv中，重鏈可變結構域藉由柔性連接子連接至輕鏈可變結構域。在某些實施方式中，柔性連接子包含(G 4S) 4。在某些實施方式中，在結合NKG2D的scFv中，重鏈可變結構域位於輕鏈可變結構域的C末端。在某些實施方式中，在每個結合BAFF-R的scFv中，重鏈可變結構域位於輕鏈可變結構域的C末端。在某些實施方式中，在結合NKG2D的scFv中，重鏈可變結構域位於輕鏈可變結構域的N末端。在某些實施方式中，在每個結合BAFF-R的scFv中，重鏈可變結構域位於輕鏈可變結構域的N末端。在某些實施方式中，結合NKG2D的Fab片段不位於抗原結合位點和Fc或其部分之間。在某些實施方式中，結合BAFF-R的Fab片段沒有位於抗原結合位點和Fc或其部分之間。
另一方面，本文提供了一種蛋白，其包含： (a) 包含結合NKG2D的Fab片段的第一抗原結合位點； (b) 包含單鏈可變片段（scFv）的第二抗原結合位點結合B細胞活化因子受體（BAFF-R）；以及 (c) Fc結構域，其包含第一抗體恒定結構域和第二抗體恒定結構域形成結合CD16的異二聚物， 其中scFv藉由鉸鏈連接到第一抗體恒定結構域的N末端，並且Fab連接到第二抗體恒定結構域的N末端。
在一些實施方式中，鉸鏈包含Gly-Ser，
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，第一抗原結合位點結合人NKG2D。在一些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含以下：VH，其包含分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 81、82和112的互補決定區1（CDR1）、互補決定區2（CDR2）和互補決定區3（CDR3）；和VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在一些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含以下：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 81、82和97的胺基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列；和VL，其包含分別由SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 95至少90%相同的胺基酸序列，並且該VL包含與SEQ ID NO: 85至少90%相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列並且該VL包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，第二抗原結合位點包含以下：重鏈可變結構域，其包含分別為SEQ ID NO: 260、249和261的CDR1、CDR2和CDR3序列；和輕鏈可變結構域，其包含分別為SEQ ID NO: 217、77和259的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，第二抗原結合位點包含以下：重鏈可變結構域，其包含分別為SEQ ID NO: 214、233和248的CDR1、CDR2和CDR3序列；和輕鏈可變結構域，其包含分別為SEQ ID NO: 217、77和249的CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些實施方式中，第二抗原結合位點包含與SEQ ID NO: 250至少90%相同的重鏈可變結構域和與SEQ ID NO: 251至少90%相同的輕鏈可變結構域。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，第二抗原結合位點包含相對於SEQ ID NO: 250具有G44C取代的VH，和相對於SEQ ID NO: 251具有G100C取代的VL。在一些實施方式中，第二抗原結合位點包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 252的VH和含有胺基酸序列SEQ ID NO: 253的VL，或含有胺基酸序列SEQ ID NO: 250的VH和含有胺基酸序列SEQ ID NO: 251的VL。在一些實施方式中，第二抗原結合位點包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 252的VH和含有胺基酸序列SEQ ID NO: 253的VL。在一些實施方式中，第二抗原結合位點包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 250的VH和含有胺基酸序列SEQ ID NO: 251的VL。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，第二抗原結合位點包含單鏈可變片段（scFv），並且scFv包含含有SEQ ID NO: 252的胺基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 253的胺基酸序列的VL。在一些實施方式中，第二抗原結合位點包含scFv，並且scFv包含與選自由SEQ ID NO: 254和255組成之群組的序列至少90%相同的胺基酸序列。在一些實施方式中，第二抗原結合位點包含scFv，並且scFv包含與SEQ ID NO: 254至少90%相同的胺基酸序列。在一些實施方式中，第二抗原結合位點包含scFv並且scFv包含SEQ ID NO: 254的胺基酸序列。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，該蛋白包含與SEQ ID NO: 270至少90%相同的胺基酸序列。在一些實施方式中，該蛋白包含SEQ ID NO: 270的胺基酸序列。在一些實施方式中，該蛋白包含與SEQ ID NO: 271至少90%相同的胺基酸序列。在一些實施方式中，該蛋白包含SEQ ID NO: 271的胺基酸序列。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，第二抗原結合位點以小於或等於5 nM的解離常數（K D）結合人BAFF-R，如藉由表面電漿共振（SPR）測量。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，第二抗原結合位點抑制（例如，阻斷）BAFF-R與BAFF的結合（例如，至少50%，至少75%、至少90%、至少95%或至少99%，如在競爭性結合測定中測量）。
另一方面，本文提供了一種蛋白，其包含： (a) 第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體的VH和VL，其中該VH包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列，並且該VL包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列； (b) 第二抗原結合位點，其包含抗BAFF-R抗體的VH和VL，其中該VH包含SEQ ID NO: 252的胺基酸序列，並且該VL包含SEQ ID NO: 253的胺基酸序列；以及 (c) 足以結合CD16的抗體Fc結構域或其部分，或結合CD16的第三抗原結合位點。
另一方面，本文提供了一種蛋白，其包含： (a) 第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體的VH和VL，其中該VH包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列，並且該VL包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列； (b) 第二抗原結合位點，其包含SEQ ID NO: 254的胺基酸序列；以及 (c) 足以結合CD16的抗體Fc結構域或其部分，或結合CD16的第三抗原結合位點。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，抗體Fc結構域係人IgG1抗體Fc結構域。在一些實施方式中，抗體Fc結構域或其部分包含與SEQ ID NO: 118至少90%相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，抗體Fc結構域的至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO: 118在選自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、和K439的一或多個位置處包含一或多個突變，根據EU編號系統進行編號。在某些實施方式中，抗體Fc結構域的至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO: 118包含選自Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、F405L、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、K409R、T411D、T411E、K439D、和K439E的一或多個突變，根據EU編號系統進行編號。在某些實施方式中，抗體重鏈恒定區的一個多肽鏈相對於SEQ ID NO: 118在選自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439的一或多個位置處包含一或多個突變；並且抗體重鏈恒定區的另一個多肽鏈相對於SEQ ID NO: 118在選自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、D401、F405、Y407、K409、T411、和K439的一或多個位置處包含一或多個突變，根據EU編號系統進行編號。在某些實施方式中，抗體重鏈恒定區的一個多肽鏈包含相對於SEQ ID NO: 118的K360E和K409W取代；並且抗體重鏈恒定區的另一個多肽鏈包含相對於SEQ ID NO: 118的Q347R、D399V和F405T取代，根據EU編號系統進行編號。在某些實施方式中，抗體重鏈恒定區的一個多肽鏈包含相對於SEQ ID NO: 118的F405L取代；並且抗體重鏈恒定區的另一個多肽鏈包含相對於SEQ ID NO: 118的K409R取代，根據EU編號系統進行編號。在某些實施方式中，抗體重鏈恒定區的一個多肽鏈包含相對於SEQ ID NO: 118的Y349C取代；並且抗體重鏈恒定區的另一個多肽鏈包含相對於SEQ ID NO: 118的S354C取代，根據EU編號系統進行編號。
另一方面，本申請提供了一種蛋白，其包含： (a) 包含SEQ ID NO: 270的胺基酸序列的第一多肽； (b) 包含SEQ ID NO: 194的胺基酸序列的第二多肽；以及 (c) 包含SEQ ID NO: 195的胺基酸序列的第三多肽。
另一方面，本申請提供了一種蛋白，其包含： (a) 第一多肽，其包含與SEQ ID NO: 270的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列； (b) 第二多肽，其包含與SEQ ID NO: 194的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列；以及 (c) 第三多肽，其包含與SEQ ID NO: 195的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含： (a) 第一多肽，其包含與SEQ ID NO: 270的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列； (b) 第二多肽，其包含與SEQ ID NO: 194的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；以及 (c) 第三多肽，其包含與SEQ ID NO: 195的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含： (a) 第一多肽，其包含與SEQ ID NO: 270的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列； (b) 第二多肽，其包含與SEQ ID NO: 194的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列；以及 (c) 第三多肽，其包含與SEQ ID NO: 195的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含： (a) 第一多肽，其包含與SEQ ID NO: 270的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列； (b) 第二多肽，其包含與SEQ ID NO: 194的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列；以及 (c) 第三多肽，其包含與SEQ ID NO: 195的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含： (a) 第一多肽，其包含與SEQ ID NO: 270的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列； (b) 包含SEQ ID NO: 194的胺基酸序列的第二多肽；以及 (c) 包含SEQ ID NO: 195的胺基酸序列的第三多肽。
在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含： (a) 第一多肽，其包含與SEQ ID NO: 270的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列； (b) 包含SEQ ID NO: 194的胺基酸序列的第二多肽；以及 (c) 包含SEQ ID NO: 195的胺基酸序列的第三多肽。
在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含： (a) 第一多肽，其包含與SEQ ID NO: 270的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列； (b) 包含SEQ ID NO: 194的胺基酸序列的第二多肽；以及 (c) 包含SEQ ID NO: 195的胺基酸序列的第三多肽。
在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含多肽，該多肽包含與SEQ ID NO: 270的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含含有與SEQ ID NO: 270的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列的多肽。在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含含有與SEQ ID NO: 270的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列的多肽。
在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含多肽，該多肽包含與與SEQ ID NO: 194的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含含有與SEQ ID NO: 194的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列的多肽。在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含含有與SEQ ID NO: 194的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列的多肽。
在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含多肽，該多肽包含與SEQ ID NO: 195的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含含有與SEQ ID NO: 195的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列的多肽。在一些實施方式中，本文提供的蛋白包含含有與SEQ ID NO: 195的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列的多肽。
另一方面，本申請提供了一種蛋白，其包含： (a) 包含SEQ ID NO: 271的胺基酸序列的第一多肽； (b) 包含SEQ ID NO: 272的胺基酸序列的第二多肽；以及 (c) 包含SEQ ID NO: 273的胺基酸序列的第三多肽。
另一方面，本申請提供了一種藥物組成物，其包含本文揭露的蛋白和藥學上可接受的載劑。
另一方面，本申請提供了一種細胞，其包含一或多種編碼本文揭露的蛋白的核酸。
另一方面，本申請提供了一種增強腫瘤細胞死亡的方法，該方法包括將腫瘤細胞和自然殺傷細胞暴露於有效量的本文揭露的蛋白或本文揭露的藥物組成物。
另一方面，本申請提供了一種治療癌症的方法，該方法包括向有需要的受試者投與有效量的本文揭露的蛋白或本文揭露的藥物組成物。在一些實施方式中，癌症選自由以下組成之群組：B細胞非何杰金氏淋巴瘤（B-NHL）、慢性淋巴球白血病（CLL）、套細胞淋巴瘤（MCL）、濾泡性淋巴瘤（FL）、彌漫性大B-細胞淋巴瘤（DLBCL）、緣帶淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織（MALT）淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤和急性淋巴球白血病（ALL）。
另一方面，本申請提供了一種增強B細胞死亡的方法，該方法包括將B細胞和自然殺傷細胞暴露於有效量的本文揭露的蛋白或本文揭露的藥物組成物。
另一方面，本申請提供了一種治療自體免疫性炎性疾病的方法，該方法包括向有需要的受試者投與有效量的本文揭露的蛋白或本文揭露的藥物組成物。
在本文揭露的蛋白的一些實施方式中，蛋白係純化的蛋白。在一些實施方式中，使用選自由以下組成的方法純化蛋白：離心、深度過濾、細胞裂解、均質化、凍融、親和純化、凝膠過濾、離子交換層析、疏水相互作用交換層析和混合模式層析。
交叉引用
本申請要求2021年9月29日提交的美國臨時申請案號63/250,160的權益，其全部揭露內容藉由引用以其整體併入本文。 序列表
本申請包含XML文件格式的電腦可讀序列表，其全部內容藉由引用以其整體併入本文。標題為「14247-700-228_seqlist.xml」的序列表XML文件創建於2022年9月16日，大小為305,046位元組。
本申請提供了結合自然殺傷細胞上的NKG2D受體和CD16受體以及癌細胞或B細胞上的BAFF-R的多特異性結合蛋白。在一些實施方式中，多特異性蛋白進一步包括結合BAFF-R的另外抗原結合位點。本申請還提供了包含此類多特異性結合蛋白的藥物組成物，以及使用此類多特異性蛋白和藥物組成物之治療方法，用於治療自體免疫性疾病和癌症等目的。本申請中描述的多特異性結合蛋白的各個方面在以下部分中闡述；然而，一個特定部分中描述的多特異性結合蛋白的方面不限於任何特定部分。
為了促進對本申請的理解，下面定義了許多術語和短語。
如本文所用的術語「一個（a）」/「一種（an）」和「該（the）」意指「一或多個」，並且包括複數，除非上下文係不適當的。
如本文所用，術語「抗原結合位點」係指免疫球蛋白分子中參與抗原結合的部分。在人抗體中，抗原結合位點由重鏈（「H」）和輕鏈（「L」）的N末端可變區（「V」）的胺基酸殘基形成。重鏈和輕鏈V區內的三個高度不同的延伸段稱為「高度變異區」，它們介於更保守的稱為「框架區」或「FR」的側翼延伸段之間。因此，術語「FR」係指天然存在於免疫球蛋白高度變異區之間和附近的胺基酸序列。在人抗體分子中，輕鏈的三個高度變異區和重鏈的三個高度變異區在三維空間中相對彼此佈置以形成抗原結合表面。抗原結合表面與結合抗原的三維表面互補，每條重鏈和輕鏈的三個高度變異區稱為「互補決定區」或「CDR」。在某些動物中，例如駱駝和軟骨魚，抗原結合位點由提供「單結構域抗體」的單抗體鏈形成。抗原結合位點可以存在於完整抗體中、在保留抗原結合表面的抗體的抗原結合片段中，或在重組多肽如scFv中，其中在單個多肽中使用肽連接子將重鏈可變結構域連接到輕鏈可變結構域。
本文所用的術語「腫瘤相關抗原」係指與癌症相關的任何抗原，包括但不限於蛋白、醣蛋白、神經節苷脂、碳水化合物或脂質。這種抗原可以在惡性細胞或腫瘤微環境中表現，例如腫瘤相關血管、細胞外基質、間充質基質或免疫浸潤。在本揭露之某些實施方式中，術語「腫瘤相關抗原」係指BAFF-R，其被本揭露之多特異性結合蛋白中存在的第二和/或另外的抗原結合位點靶向。然而，據瞭解，BAFF-R也可能與非腫瘤或癌症的疾病和障礙相關。
如本文所用，術語「受試者」和「患者」係指將藉由本文所述之方法和組成物治療的生物體。此類生物體較佳的是包括但不限於哺乳動物（例如鼠、猴、馬科、牛科、豬、犬、貓等），並且，更較佳的是包括人。
如本文所用，術語「有效量」係指足以實現有益或期望結果的化合物（例如本申請的化合物）。有效量可以在一或多個投與、應用或劑量來進行投與，並且不旨在限於特定的配製物或投與途徑。如本文所用，術語「治療」包括任何作用，例如減輕、減少、調節、改善或消除，導致病症、疾病、障礙等的改善，或改善了其症狀。
如本文所用，術語「藥物組成物」係指活性劑與載劑（惰性的或活性的）的組合，使得該組成物尤其適合體內或離體的診斷或治療用途。
如本文所用，術語「藥學上可接受的載劑」係指任何標準藥用載劑，例如磷酸鹽緩衝鹽溶液、水、乳液（例如，例如油/水或水/油乳液）和各種類型的潤濕劑。組成物還可以包括穩定劑和防腐劑。對於載劑、穩定劑、和輔助劑的實例，參見例如Martin， Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明頓藥物科學]，第15版，麥克出版公司（Mack Publ. Co.），伊斯頓（Easton）, 賓夕凡尼亞州（PA）[1975]。
如本文所用，術語「藥學上可接受的鹽」係指本申請中描述的化合物的任何藥學上可接受的鹽（例如酸或鹼），當給予受試者時，其能夠提供本申請中描述的化合物或其活性代謝物或殘餘物。如熟悉該項技術者已知的，本申請中描述的化合物的「鹽」可以源自無機的或有機的酸和鹼。示例性酸包括但不限於鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、丁二酸、對甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、等。其他酸，例如草酸，雖然其自身不是藥學上可接受的，但可以用作獲得本申請中描述的化合物及其藥學上可接受的酸加成鹽的中間體來在鹽的製備中採用。
示例性鹼包括但不限於鹼金屬（例如鈉）氫氧化物、鹼土金屬（例如鎂）氫氧化物、氨、以及具有式NW 4 +的化合物，其中W係C 1-4烷基等。
示例性的鹽包括但不限於：乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、氟庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘化物、2-羥基-乙磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽（palmoate）、果膠酸鹽（pectinate）、過硫酸鹽、苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽等。鹽的其他實例包括與適合的陽離子（例如Na +、NH 4 +、和NW 4 +（其中W係C 1-4烷基基團））等複合的本申請中描述的化合物的陰離子。
對於治療用途，將本申請中描述的化合物考慮為係藥學上可接受的。然而，非藥學上可接受的酸和鹼的鹽也可以找到用途，例如在藥學上可接受的化合物的製備或純化方面。
如本文所用，BAFF-R（也稱為BAFF受體、B細胞活化因子受體、BR3、TNFRSF13C、腫瘤壞死因子受體超家族成員13C、TNF受體超家族成員13C、CD268和BLyS受體3）指Uniprot登錄號Q96RJ3的蛋白和相關亞型和異種同源物。
在整個說明書中，在組成物被描述為具有、包括或包含具體化合物的情況下，或在製程和方法被描述為具有、包括、或包含具體步驟的情況下，考慮到另外地，存在本申請中描述的組成物，其基本上由或由敘述的化合物組成，並且存在根據本申請的製程和方法，其基本上由或由敘述的加工步驟組成。
一般而言，除非另有說明，否則指定百分比的組成物均按重量計。另外，如果變數未附帶定義，則以該變數之前的定義為準。 I. 蛋白
本申請提供了結合自然殺傷細胞上的NKG2D受體和CD16受體以及癌細胞上的BAFF-R的多特異性結合蛋白。多特異性結合蛋白可用於本文所述之藥物組成物和治療方法中。多特異性結合蛋白與自然殺傷細胞上的NKG2D受體和CD16受體的結合增強了自然殺傷細胞破壞表現BAFF-R抗原的腫瘤細胞的活性。多特異性結合蛋白與表現BAFF-R的細胞的結合使癌細胞接近自然殺傷細胞，這促進了自然殺傷細胞對腫瘤細胞的直接和間接破壞。結合NKG2D、CD16和另一個靶標的多特異性結合蛋白在國際申請公開號WO 2018148445和WO 2019157366中揭露，其未藉由引用併入本文。下面提供了一些示例性多特異性結合蛋白的進一步描述。
多特異性結合蛋白的第一組分係抗原結合位點，其可與表現NKG2D受體的細胞結合，該等細胞包括但不限於NK細胞、γδ T細胞和CD8 +αβ T細胞。在NKG2D結合後，多特異性結合蛋白可能會阻止天然配體（例如ULBP6和MICA）與NKG2D結合並活化NK細胞。
多特異性結合蛋白的第二組分係與BAFF-R結合的抗原結合位點。表現BAFF-R的細胞可以在以下中發現：B細胞非何杰金氏淋巴瘤（B-NHL）、例如慢性淋巴球白血病（CLL）、套細胞淋巴瘤（MCL）、濾泡性淋巴瘤（FL）、彌漫性大B-細胞淋巴瘤（DLBCL）、緣帶淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織（MALT）淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、急性淋巴球白血病（ALL）；和自體免疫性炎性疾病。
多特異性結合蛋白的第三組分係抗體Fc結構域或其一部分，或與表現CD16的細胞結合的抗原結合位點，CD16係白血球表面的Fc受體，白血球包括自然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、肥胖細胞和濾泡樹突細胞。
多特異性結合蛋白的另外抗原結合位點可以結合BAFF-R。在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點係scFv，並且結合BAFF-R的第二抗原結合位點和另外的抗原結合位點各自是Fab片段。在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點係scFv，並且結合BAFF-R的第二抗原結合位點和另外的抗原結合位點各自是scFv。在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點係Fab片段，並且結合BAFF-R的第二抗原結合位點和另外的抗原結合位點各自是scFv。在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點係Fab，並且結合BAFF-R的第二抗原結合位點和另外的抗原結合位點各自是Fab片段。
本文所述之多特異性結合蛋白可以採用多種形式。例如，一種形式係異二聚物多特異性抗體，其包括第一免疫球蛋白重鏈、第一免疫球蛋白輕鏈、第二免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白輕鏈（ 圖 1）。第一免疫球蛋白重鏈包括第一Fc（鉸鏈-CH2-CH3）結構域、第一重鏈可變結構域和視需要的第一CH1重鏈結構域。第一免疫球蛋白輕鏈包括第一輕鏈可變結構域和視需要的第一輕鏈恒定結構域。第一免疫球蛋白輕鏈與第一免疫球蛋白重鏈一起形成結合NKG2D的抗原結合位點。第二免疫球蛋白重鏈包含第二Fc（鉸鏈-CH2-CH3）結構域、第二重鏈可變結構域和視需要的第二CH1重鏈結構域。第二免疫球蛋白輕鏈包括第二輕鏈可變結構域和視需要的第二輕鏈恒定結構域。第二條免疫球蛋白輕鏈與第二條免疫球蛋白重鏈一起形成結合BAFF-R的抗原結合位點。在一些實施方式中，第一Fc結構域和第二Fc結構域一起能夠結合CD16（ 圖 1）。在一些實施方式中，第一免疫球蛋白輕鏈與第二免疫球蛋白輕鏈相同。
抗原結合位點可以各自併入抗體重鏈可變結構域和抗體輕鏈可變結構域（例如，如在抗體中排列，或融合在一起形成scFv），或一或多個抗原結合位點可為單結構域抗體，例如像駱駝科動物抗體那樣的V HH抗體或像在軟骨魚中發現的抗體那樣的V NAR抗體。
在一些實施方式中，第二抗原結合位點併入具有與存在於第一抗原結合位點中的輕鏈可變結構域的胺基酸序列相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
另一種示例性形式涉及異二聚物多特異性抗體，其包括第一免疫球蛋白重鏈、第二免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈（例如， 圖 2A）。在一些實施方式中，第一免疫球蛋白重鏈包括第一Fc（鉸鏈-CH2-CH3）結構域，其藉由連接子或抗體鉸鏈與由重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域構成的單鏈可變片段（scFv）融合，該重鏈可變結構域和該輕鏈可變結構域配對並結合NKG2D，或結合BAFF-R。在一些實施方式中，第二免疫球蛋白重鏈包括第二Fc（鉸鏈-CH2-CH3）結構域、第二重鏈可變結構域和CH1重鏈結構域。免疫球蛋白輕鏈包括輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。在一些實施方式中，第二免疫球蛋白重鏈與免疫球蛋白輕鏈配對並結合NKG2D或結合BAFF-R，條件係當第一Fc結構域融合到結合NKG2D的scFv時，與免疫球蛋白輕鏈配對的第二免疫球蛋白重鏈結合BAFF-R但不結合NKG2D，反之亦然。在一些實施方式中，第一免疫球蛋白重鏈中的scFv結合BAFF-R；並且第二免疫球蛋白重鏈中的重鏈可變結構域和免疫球蛋白輕鏈中的輕鏈可變結構域在配對時結合NKG2D（例如， 圖 2E）。在一些實施方式中，第一免疫球蛋白重鏈中的scFv結合NKG2D；並且第二免疫球蛋白重鏈中的重鏈可變區和免疫球蛋白輕鏈中的輕鏈可變區配對時結合BAFF-R。在一些實施方式中，第一Fc結構域和第二Fc結構域一起能夠結合CD16（例如， 圖 2A ）。在一些實施方式中，第一Fc結構域和第二Fc結構域一起能夠結合CD16（例如， 圖 2A）。
另一種示例性形式涉及異二聚物多特異性抗體，其包括第一免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白重鏈（例如， 圖 2B）。在一些實施方式中，第一免疫球蛋白重鏈包括第一Fc（鉸鏈-CH2-CH3）結構域，其藉由連接子或抗體鉸鏈與由重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域構成的單鏈可變片段（scFv）融合，該重鏈可變結構域和該輕鏈可變結構域配對並結合NKG2D，或結合BAFF-R。在一些實施方式中，第二免疫球蛋白重鏈包括第二Fc（鉸鏈-CH2-CH3）結構域，其藉由連接子或抗體鉸鏈與由重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域構成的單鏈可變片段（scFv）融合，該重鏈可變結構域和該輕鏈可變結構域配對並結合NKG2D，或結合BAFF-R，條件係當第一Fc結構域與結合NKG2D的scFv融合時，與scFv融合的第二Fc結構域結合BAFF-R但不結合NKG2D，反之亦然。在一些實施方式中，第一Fc結構域和第二Fc結構域一起能夠結合CD16（例如， 圖 2B）。
在一些實施方式中，上述單鏈可變片段（scFv）藉由鉸鏈序列連接至抗體恒定結構域。在一些實施方式中，鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser或Gly-Ser。在一些實施方式中，鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser或Gly-Ser。在一些實施方式中，連接scFv（例如，結合NKG2D的scFv或結合BAFF-R的scFv）和抗體重鏈恒定結構域的鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser。在一些實施方式中，連接scFv（例如，結合NKG2D的scFv或結合BAFF-R的scFv）和抗體重鏈恒定結構域的鉸鏈包含胺基酸Gly-Ser。在一些其他實施方式中，鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser和Thr-Lys-Gly。鉸鏈序列可以提供與靶抗原結合的柔性，以及柔性和最佳幾何結構之間的平衡。
在一些實施方式中，上述單鏈可變區片段（scFv）包括重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域。在一些實施方式中，重鏈可變結構域與輕鏈可變結構域形成雙硫鍵以增強scFv的穩定性。例如，可在重鏈可變結構域的C44殘基和輕鏈可變結構域的C100殘基之間形成雙硫鍵，胺基酸位置按照Kabat編號。在一些實施方式中，重鏈可變結構域藉由柔性連接子連接至輕鏈可變結構域。可以使用任何合適的連接子，例如，(G 4S) 4連接子（(GlyGlyGlyGlySer) 4（SEQ ID NO: 119））。在scFv的一些實施方式中，重鏈可變結構域位於輕鏈可變結構域的N末端。在scFv的一些實施方式中，重鏈可變結構域位於輕鏈可變結構域的C末端。
本文所述之多特異性結合蛋白進一步可包括一或多個另外的抗原結合位點。一或多個另外的抗原結合位點可以視需要地藉由連接子序列融合到恒定區CH2結構域的N末端或恒定區CH3結構域的C末端。在某些實施方式中，一或多個另外的抗原結合位點採取單鏈可變區（scFv）的形式，其視需要地經二硫鍵穩定，產生四價或三價多特異性結合蛋白。例如，多特異性結合蛋白包括結合NKG2D的第一抗原結合位點、結合BAFF-R的第二抗原結合位點、結合BAFF-R的另外的抗原結合位點，以及足以結合CD16的抗體恒定區或其部分或結合CD16的第四抗原結合位點。該等抗原結合位點中之任何一個都可以採用Fab片段或scFv的形式，例如上述的scFv。
在一些實施方式中，另外的抗原結合位點結合與第二抗原結合位點不同的BAFF-R表位。在一些實施方式中，另外的抗原結合位點結合與第二抗原結合位點相同的表位。在一些實施方式中，另外的抗原結合位點包含與第二抗原結合位點相同的重鏈和輕鏈CDR序列。在一些實施方式中，另外的抗原結合位點包含與第二抗原結合位點相同的重鏈和輕鏈可變結構域序列。在一些實施方式中，另外的抗原結合位點具有與第二抗原結合位點相同的一或多個胺基酸序列。在一些實施方式中，另外的抗原結合位點包含與第二抗原結合位點的重鏈和輕鏈可變結構域序列不同的重鏈和輕鏈可變結構域序列。在一些實施方式中，另外的抗原結合位點具有與第二抗原結合位點的序列不同的胺基酸序列。在一些實施方式中，第二抗原結合位點和另外的抗原結合位點結合不同的腫瘤相關抗原。在一些實施方式中，第二抗原結合位點和另外的抗原結合位點結合不同的抗原。 圖 2C和 圖 2D中顯示了示例性形式。因此，多特異性結合蛋白可以提供BAFF-R的二價接合。多特異性蛋白與BAFF-R的二價接合可以穩定腫瘤細胞表面的BAFF-R並增強NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。多特異性蛋白與BAFF-R的二價接合可以賦予多特異性蛋白與腫瘤細胞更強的結合，從而促進NK細胞對腫瘤細胞，尤其是對表現低水平BAFF-R的腫瘤細胞產生更強的細胞毒性響應。
多特異性結合蛋白可以採用其他形式。在一些實施方式中，多特異性結合蛋白呈三功能抗體形式，它係保持IgG樣形狀的三功能雙特異性抗體。這種嵌合體由兩個半抗體組成，每個半抗體具有一個輕鏈和一個重鏈，它們源自兩個親代抗體。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白係呈KiH共同輕鏈（LC）形式，其結合了杵-臼（KiH）技術（例如 圖 21中表示的多特異性結合蛋白）。KiH共同LC形式係異二聚物，其包含結合第一靶標的Fab、結合第二靶標的Fab和藉由異二聚化突變穩定的Fc結構域。兩個Fab各自包含重鏈和輕鏈，其中每個Fab的重鏈彼此不同，並且與各自對應的重鏈配對的輕鏈係兩個Fab共有的。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白係KiH形式，其涉及杵-臼（KiH）技術。KiH涉及對C H3結構域進行工程改造，以在每條重鏈中創建「杵」或「臼」，以促進異二聚化。「杵-臼（KiH）」Fc技術背後的概念係藉由用大殘基代替小殘基（例如，T366W CH3A，EU編號）在一個CH3結構域（CH3A）中引入「杵」。為了容納「杵」，藉由用更小的殘基替換離杵最近的鄰近殘基（例如，T366S/L368A/Y407V CH3B）在另一個CH3結構域（CH3B）上創建了互補的「臼」表面。「臼」突變藉由以下進行優化：結構化引導的噬菌體文庫篩選（Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library [利用噬菌體顯示文庫改造同二聚物的結構域介面得到穩定的異二聚物], J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] (1997) 270(1):26-35）。KiH Fc變體的X射線晶體結構（Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C,等人, Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction.[藉由CH2-CH3疏水相互作用介導的頂球和空穴的非糖基化半抗體同源二聚物的反平行構象] J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] (2014) 426(9):1947-57；Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcγRs. [對FcγR親和力提高的新型不對稱工程改造的Fc變體的晶體結構] Mol. Immunol.[分子免疫學] (2014) 58(1):132-8）表明異二聚化在熱力學上有利於由CH3結構域核心介面處的空間互補性驅動的疏水相互作用，而杵-杵和臼-臼介面分別由於立體阻礙和有利相互作用的破壞而不利於同二聚化。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白呈雙可變結構域免疫球蛋白（DVD-Ig™）形式，其藉由柔性的天然存在的連接子組合兩個單株抗體的靶結合結構域，並產生四價IgG樣分子。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白呈正交Fab介面（Ortho-Fab）形式。在正交Fab IgG方法中（Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL,等人, Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface.[藉由基於結構的正交Fab介面設計產生雙特異性IgG抗體] Nat. Biotechnol.[自然生物技術] (2014) 32(2):191-8），基於結構的區域設計只在一個Fab片段中的LC和HC VH-CH1介面處引入了互補突變，而對另一個Fab片段沒有任何改變。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白係二合一Ig形式。在一些實施方式中，多特異性結合蛋白呈ES形式，它係異二聚物構建體，包含兩個與靶標1和靶標2結合的不同Fab片段融合到Fc。Fc中的靜電引導突變確保異二聚化。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白係ĸλ體形式，它係異二聚物構建體，具有兩個不同的Fab片段融合到藉由異二聚化突變穩定的Fc：靶向抗原1的Fab片段1包含κ LC，靶向抗原2的Fab片段2包含λ LC。 圖 13A係一種形式的ĸλ體的示例性代表； 圖 13B係另一個ĸλ體的示例性代表。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白呈Fab臂交換形式（抗體，其藉由將重鏈和附著的輕鏈（半分子）與另一分子的重-輕鏈對交換來交換Fab片段臂，產生雙特異性抗體）。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白係呈SEED體形式。鏈交換工程改造結構域（SEED）平臺旨在生成不對稱和雙特異性抗體樣分子，這係一種擴展天然抗體治療應用的能力。該蛋白工程平臺基於在保守的CH3結構域內交換結構相關的免疫球蛋白序列。SEED設計允許有效生成AG/GA異二聚物，而不利於AG和GA SEED CH3結構域的同二聚化。（Muda M.等人, Protein Eng. Des. Sel.[蛋白工程化設計與篩選] (2011, 24(5):447-54)）。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白係呈LuZ-Y形式，其中白胺酸拉鍊用於誘導兩個不同HC的異二聚化。（Wranik, BJ.等人, J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] (2012), 287:43331-9）。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白係呈Cov-X-體形式。在雙特異性CovX-體中，兩種不同的肽使用支鏈氮環丁酮連接子連接在一起，並在溫和條件下以位點特異性方式融合到支架抗體上。藥效基團負責功能活性，而抗體支架則具有較長的半衰期和Ig樣分佈。可以對藥效基團進行化學優化或用其他藥效基團替換，以生成優化的或獨特的雙特異性抗體。（Doppalapudi VR等人, PNAS[美國國家科學院院刊] (2010), 107(52);22611-22616）。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白呈OAsc-Fab異二聚物形式，其包括結合靶標1的Fab片段，以及融合到Fc的結合靶標2的scFab。Fc中的突變確保了異二聚化。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白係呈DuetMab形式，它係異二聚物構建體，包含兩個結合抗原1和2的不同Fab片段，以及藉由異二聚化突變穩定的Fc。Fab片段1和2包含差異S-S橋，可確保正確的LC和HC配對。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白係呈CrossmAb形式，它係異二聚物構建體，具有兩個結合靶標1和2不同Fab片段，融合到藉由異二聚化穩定的Fc。CL和CH1結構域以及VH和VL結構域被交換，例如，CH1與VL在框內融合，並且CL與VH在框內融合。
在一些實施方式中，多特異性結合蛋白係呈Fit-Ig形式，它係同二聚物構建體，其中結合抗原2的Fab片段融合到結合抗原1的Fab片段的HC的N末端。該構建體包含野生型Fc。
下文更詳細地描述了多特異性結合蛋白的各個組分。 NKG2D- 結合位點
在與 自然殺傷細胞上的NKG2D受體和CD16受體、以及BAFF-R結合後，多特異性結合蛋白可以結合多於一個類型的NK活化性受體，並可阻斷天然配體與NKG2D的結合。在某些實施方式中，蛋白可以激動人的NK細胞。在一些實施方式中，蛋白可以激動人和其他物種例如齧齒動物和石蟹獼猴中的NK細胞。在一些實施方式中，蛋白可以激動人和其他物種例如石蟹獼猴中的NK細胞。
表 1列出了重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的肽序列，它們組合起來可以結合NKG2D。在一些實施方式中，重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域以Fab形式排列。在一些實施方式中，重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域融合在一起形成scFv。
表 1中列出的NKG2D結合位點在其與NKG2D的結合親和力方面可以不同，但是它們都活化人NK細胞。
除非另有說明， 表 1中提供的CDR序列係根據Kabat編號確定的。
[ 表 1]
殖株 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列
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ADI-29379 （E79） QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGAPNYGDTTHDYYYMDVWGKGTTVTVSS （SEQ ID NO: 52） CDR1（SEQ ID NO: 53）- YTFTSYYMH（非Kabat）或SYYMH（SEQ ID NO: 54） CDR2（SEQ ID NO: 55）- IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 - ARGAPNYGDTTHDYYYMDV（非Kabat）（SEQ ID NO: 56）或GAPNYGDTTHDYYYMDV（SEQ ID NO: 57） EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDDWPFTFGGGTKVEIK （SEQ ID NO: 58） CDR1（SEQ ID NO: 59）- RASQSVSSNLA CDR2（SEQ ID NO: 60）- GASTRAT CDR3（SEQ ID NO: 61）- QQYDDWPFT
ADI-29463 （F63） QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDTGEYYDTDDHGMDVWGQGTTVTVSS （SEQ ID NO: 62） CDR1 - YTFTGYYMH（非Kabat）（SEQ ID NO: 63）或GYYMH（SEQ ID NO: 64） CDR2（SEQ ID NO: 65）- WINPNSGGTNYAQKFQG CDR3 - ARDTGEYYDTDDHGMDV（非Kabat）（SEQ ID NO: 66）或DTGEYYDTDDHGMDV（SEQ ID NO: 67） EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDDYWPPTFGGGTKVEIK （SEQ ID NO: 68） CDR1（SEQ ID NO: 59）- RASQSVSSNLA CDR2（SEQ ID NO: 60）- GASTRAT CDR3（SEQ ID NO: 69）- QQDDYWPPT
ADI-27744 （A44） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGGYYDSGAGDYWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 70） CDR1- FTFSSYAMS（非Kabat）（SEQ ID NO: 71）或SYAMS（SEQ ID NO: 115） CDR2（SEQ ID NO: 72）- AISGSGGSTYYADSVKG CDR3 - AKDGGYYDSGAGDY（非Kabat）（SEQ ID NO: 73）或DGGYYDSGAGDY（SEQ ID NO: 74） DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSYPRTFGGGTKVEIK （SEQ ID NO: 75） CDR1（SEQ ID NO: 76）- RASQGIDSWLA CDR2（SEQ ID NO: 77）- AASSLQS CDR3（SEQ ID NO: 78）- QQGVSYPRT
ADI-27749 （A49） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGAPMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 79） CDR1 - FTFSSYSMN（SEQ ID NO: 80）（非Kabat）或SYSMN（SEQ ID NO: 81） CDR2（SEQ ID NO: 82）- SISSSSSYIYYADSVKG CDR3- ARGAPMGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 83）（非Kabat）或GAPMGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 84） DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLL IYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK （SEQ ID NO: 85） CDR1（SEQ ID NO: 86）- RASQGISSWLA CDR2（SEQ ID NO: 77）- AASSLQS CDR3（SEQ ID NO: 87）- QQGVSFPRT
scFv（VL-VH），在VH中有Q44C，在VL中有G100C，連接子為斜體：DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFG CGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGK CLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 88)
ADI-29378 （E78） QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGAGFAYGMDYYYMDVWGKGTTVTVSS （SEQ ID NO: 89） CDR1 - YTFTSYYMH（SEQ ID NO: 53）（非Kabat）或SYYMH（SEQ ID NO: 54） CDR2（SEQ ID NO: 55）- IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 - AREGAGFAYGMDYYYMDV（SEQ ID NO: 90）（非Kabat）或EGAGFAYGMDYYYMDV（SEQ ID NO: 91） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSDNWPFTFGGGTKVEIK （SEQ ID NO: 92） CDR1（SEQ ID NO: 93）- RASQSVSSYLA CDR2（SEQ ID NO: 44）- DASNRAT CDR3（SEQ ID NO: 94）- QQSDNWPFT
A49MI EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 95) CDR1：FTFSSYSMN（SEQ ID NO: 80）（非 Kabat）或SYSMN（SEQ ID NO: 81） CDR2：SISSSSSYIYYADSVKG （SEQ ID NO: 82） CDR3：ARGAPIGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 96）（非 Kabat）或GAPIGAAAGWFDP （SEQ ID NO: 97） DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLL IYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK （SEQ ID NO: 85） CDR1（SEQ ID NO: 86）- RASQGISSWLA CDR2（SEQ ID NO: 77）- AASSLQS CDR3（SEQ ID NO: 87）- QQGVSFPRT
scFv（VL-VH），在VH中有Q44C，在VL中有G100C，連接子為斜體： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFG CGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGK CLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 275)
A49MQ EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGAPQGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 98） CDR1：FTFSSYSMN（SEQ ID NO: 80）（非 Kabat）或SYSMN（SEQ ID NO: 81） CDR2：SISSSSSYIYYADSVKG （SEQ ID NO: 82） CDR3 - ARGAPQGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 99）（非Kabat）或GAPQGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 100） DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLL IYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK （SEQ ID NO: 85） CDR1（SEQ ID NO: 86）- RASQGISSWLA CDR2（SEQ ID NO: 77）- AASSLQS CDR3（SEQ ID NO: 87）- QQGVSFPRT
A49ML EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGAPLGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 101） CDR1：FTFSSYSMN（SEQ ID NO: 80）（非 Kabat）或SYSMN（SEQ ID NO: 81） CDR2：SISSSSSYIYYADSVKG （SEQ ID NO: 82） CDR3 - ARGAPLGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 102）（非Kabat）或GAPLGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 103） DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLL IYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK （SEQ ID NO: 85） CDR1（SEQ ID NO: 86）- RASQGISSWLA CDR2（SEQ ID NO: 77）- AASSLQS CDR3（SEQ ID NO: 87）- QQGVSFPRT
A49MF EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGAPFGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 104） CDR1：FTFSSYSMN（SEQ ID NO: 80）（非 Kabat）或SYSMN（SEQ ID NO: 81） CDR2：SISSSSSYIYYADSVKG （SEQ ID NO: 82） CDR3 - ARGAPFGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 105）（非Kabat）或GAPFGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 106） DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLL IYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK （SEQ ID NO: 85） CDR1（SEQ ID NO: 86）- RASQGISSWLA CDR2（SEQ ID NO: 77）- AASSLQS CDR3（SEQ ID NO: 87）- QQGVSFPRT
A49MV EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGAPVGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 107） CDR1：FTFSSYSMN（SEQ ID NO: 80）（非 Kabat）或SYSMN（SEQ ID NO: 81） CDR2：SISSSSSYIYYADSVKG （SEQ ID NO: 82） CDR3- ARGAPVGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 108）（非Kabat）或GAPVGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 109） DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLL IYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK （SEQ ID NO: 85） CDR1（SEQ ID NO: 86）- RASQGISSWLA CDR2（SEQ ID NO: 77）- AASSLQS CDR3（SEQ ID NO: 87）- QQGVSFPRT
A49-共有 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RGAP XGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS，其中X係M、L、I、V、Q或F （SEQ ID NO: 110） CDR1：FTFSSYSMN（SEQ ID NO: 80）（非 Kabat）或SYSMN（SEQ ID NO: 81） CDR2：SISSSSSYIYYADSVKG （SEQ ID NO: 82） CDR3- ARGAP XGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 111）（非Kabat）或GAP XGAAAGWFDP（SEQ ID NO: 112），其中X係M、L、I、V、Q、或F DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLL IYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK （SEQ ID NO: 85） CDR1（SEQ ID NO: 86）- RASQGISSWLA CDR2（SEQ ID NO: 77）- AASSLQS CDR3（SEQ ID NO: 87）- QQGVSFPRT
US 9,273,136中的NKG2D結合劑 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 113) QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 114)
US 7,879,985中的NKG2D結合劑 QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 116) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 117)
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點（例如，人NKG2D）包含抗體重鏈可變結構域（VH）和抗體輕鏈可變結構域（VL），該重鏈可變結構域包含與表1中揭露的抗體的VH至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，並且該抗體輕鏈可變結構域包含與表1中揭露的相同的抗體的VL至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含表1中揭露的抗體的VH和VL序列的重鏈CDR1、CDR2和CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2和CDR3，按照Kabat（參見Kabat 等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學目的蛋白序列], NIH出版號91-3242, 貝塞斯達），Chothia （參見，例如，Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 196: 901-917），MacCallum（參見MacCallum R M等人, (1996) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 262: 732-745），或本領域已知的任何其他CDR測定方法確定。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含表1中揭露的抗體的重鏈CDR1、CDR2和CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含衍生自SEQ ID NO: 1的重鏈可變結構域，例如藉由與SEQ ID NO: 1至少90%（例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，和/或摻入與SEQ ID NO: 1的CDR1（SEQ ID NO: 2）、CDR2（SEQ ID NO: 3）和CDR3（SEQ ID NO: 4）序列相同的胺基酸序列。與SEQ ID NO: 1相關的重鏈可變結構域可與多種輕鏈可變結構域偶合形成NKG2D結合位點。例如，摻入與SEQ ID NO: 1相關的重鏈可變結構域的第一抗原結合位點可進一步摻入選自衍生自SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、和46的序列的輕鏈可變結構域。例如，第一抗原結合位點摻入具有與SEQ ID NO: 1至少90%（例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有與選自SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、和46中任何一個序列至少90%（例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 26的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 32的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 27或28、29、和30或31的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 27，29和30，或分別為SEQ ID NO: 28、29和31）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 33、34和35的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 27或28、29、和30或31的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 27，29和30，或分別為SEQ ID NO: 28、29和31）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 33、34和35的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 36的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 42的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 37或38、39、和40或41的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 37，39和40，或分別為SEQ ID NO: 38、39和41）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 43、44和45的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 37或38、39、和40或41的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 37，39和40，或分別為SEQ ID NO: 38、39和41）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 43、44和45的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 47的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 49的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 27、29和48的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 50、34和51的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 27、29和48的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 50、34和51的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 52的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 58的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 53或54、55、和56或57的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 53，55和56，或分別為SEQ ID NO: 54、55和57）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 59、60和61的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 53或54、55、和56或57的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 53，55和56，或分別為SEQ ID NO: 54、55和57）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 59、60和61的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 62的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 68的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 63或64、65、和66或67的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 63，65和66，或分別為SEQ ID NO: 64、65和67）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 59、60和69的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 63或64、65、和66或67的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 63，65和66，或分別為SEQ ID NO: 64、65和67）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 59、60和69的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 89的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 92的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 53或54、55、和90或91的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 53，55和90，或分別為SEQ ID NO: 54、55和91）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 93、44和94的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 53或54、55、和90或91的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 53，55和90，或分別為SEQ ID NO: 54、55和91）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 93、44和94的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 70的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 75的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 71或115、72、和73或74的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 71，72和73，或分別為SEQ ID NO: 115、72和74）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 76、77和78的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 71或115、72、和73或74的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 71，72和73，或分別為SEQ ID NO: 115、72和74）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 76、77和78的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 79的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 85的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和83或84的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和83，或分別為SEQ ID NO: 81、82和84）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和83或84的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和83，或分別為SEQ ID NO: 81、82和84）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 95的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 85的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和96或97的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和96，或分別為SEQ ID NO: 81、82和97）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和96或97的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和96，或分別為SEQ ID NO: 81、82和97）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 98的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 85的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和99或100的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和99，或分別為SEQ ID NO: 81、82和100）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和99或100的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和99，或分別為SEQ ID NO: 81、82和100）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 101的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 85的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和102或103的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和102，或分別為SEQ ID NO: 81、82和103）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和102或103的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和102，或分別為SEQ ID NO: 81、82和103）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 104的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 85的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和105或106的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和105，或分別為SEQ ID NO: 81、82和106）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和105或106的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和105，或分別為SEQ ID NO: 81、82和106）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 107的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 85的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和108或109的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和108，或分別為SEQ ID NO: 81、82和109）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和108或109的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和108，或分別為SEQ ID NO: 81、82和109）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 110的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 85的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和111或112的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和111，或分別為SEQ ID NO: 81、82和112）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第一抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、和111或112的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 80，82和111，或分別為SEQ ID NO: 81、82和112）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 113的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 114的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合NKG2D的第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 116的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 117的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。
多特異性結合蛋白可以結合 表現NKG2D的細胞，包括但不限於NK細胞、γδ T細胞和CD8 +αβ T細胞。在NKG2D結合後，多特異性結合蛋白可能會阻止天然配體（例如ULBP6和MICA）與NKG2D結合並活化NK細胞。
多特異性結合蛋白與表現CD16的細胞結合，CD16係白血球表面的Fc受體，白血球包括自然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、肥胖細胞和濾泡樹突細胞。本揭露之蛋白以2 nM至120 nM的K D親和力結合NKG2D，例如，2 nM至110 nM、2 nM至100 nM、2 nM至90 nM、2 nM至80 nM、2 nM至70 nM、2 nM至60 nM、2 nM至50 nM、2 nM至40 nM、2 nM至30 nM、2 nM至20 nM、2 nM至10 nM、約15 nM、約14 nM、約13 nM、約12 nM、約11 nM、約10 nM、約9 nM、約8 nM、約7 nM、約6 nM、約5 nM、約4.5 nM、約4 nM、約3.5 nM、約3 nM、約2.5 nM、約2 nM、約1.5 nM、約1 nM、約0.5 nM至約1 nM、約1 nM至約2 nM、約2 nM至3 nM、約3 nM至4 nM、約4 nM至約5 nM、約5 nM至約6 nM、約6 nM至約7 nM、約7 nM至約8 nM、約8 nM至約9 nM、約9 nM至約10 nM、約1 nM至約10 nM、約2 nM至約10 nM、約3 nM至約10 nM、約4 nM至約10 nM、約5 nM至約10 nM、約6 nM至約10 nM、約7 nM至約10 nM、或約8 nM至約10 nM。在一些實施方式中，NKG2D結合位點以10至62 nM的KD結合NKG2D。 BAFF-R 結合位點
本文揭露的多特異性結合蛋白的BAFF-R位點包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域。
一方面，本揭露提供了與自然殺傷細胞上的NKG2D受體和CD16受體、以及BAFF-R結合的多特異性結合蛋白。 表 2列出了重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的一些示例性序列，它們組合起來可以結合BAFF-R。
除非另有說明，否則CDR序列按照Chothia編號鑒定。
[ 表 2]
來源 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列
伊利尤單抗（莫弗西斯公司（Morphosys）/諾華公司（Novartis）） QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWGWIRQSPGRGLEWLGRIYYRSKWYNSYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARYQWVPKIGVFDSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 145) CDR1：SNSAAWG（SEQ ID NO: 157）（Kabat）或SSNSAAWG（SEQ ID NO: 135） CDR2：RIYYRSKWYNSYAVSVKS（SEQ ID NO: 158）（Kabat）或WLGRIYYRSKWYNS（SEQ ID NO: 136） CDR3：YQWVPKIGVFDS（SEQ ID NO: 159）（Kabat）或ARYQWVPKIGVFD（SEQ ID NO: 137） DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQFILPEYLSWYQQKPGQAPRLLIYGSSSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFYSSPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 146) CDR1：RASQFILPEYLS（SEQ ID NO: 160）（Kabat） CDR2：GSSSRAT（SEQ ID NO: 161）（Kabat） CDR3：QQFYSSPLT（SEQ ID NO: 162）（Kabat）
衍生自伊利尤單抗的scFv （連接子斜體） VL-VH（SEQ ID NO: 207） DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQFILPEYLSWYQQKPGQAPRLLIYGSSSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFYSSPLTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGG GSGGGGSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWGWIRQSPGRCLEWLGRIYYRSKWYNSYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARYQWVPKIGVFDSWGQGTLVTVSS VH-VL（SEQ ID NO: 138） QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWGWIRQSPGRCLEWLGRIYYRSKWYNSYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARYQWVPKIGVFDSWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQFILPEYLSWYQQKPGQAPRLLIYGSSSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFYSSPLTFGCGTKVEIK
V3-46s（基因泰克公司（Genentech））（WO 2006073941） EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSSSIHWVRQAPGKGLEWVAWVLPSVGFTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVCYNRLGVCAGGMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 147) CDR1：TISSSS（SEQ ID NO: 163）（Kabat） CDR2：AWVLPSVGFTD（SEQ ID NO: 164）（Kabat） CDR3：RVCYNRLGVCAGG（SEQ ID NO: 165）（Kabat） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSQISPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 148) CDR1：QDVSTA（SEQ ID NO: 166）（Kabat） CDR2：YSASFLY（SEQ ID NO: 167）（Kabat） CDR3：CQQSQIS（SEQ ID NO: 168）（Kabat）
衍生自V3-46s的scFv （連接子斜體） VL-VH（SEQ ID NO: 139） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSQISPPTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSSSIHWVRQAPGKCLEWVAWVLPSVGFTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVCYNRLGVCAGGMDYWGQGTLVTVSS VH-VL（SEQ ID NO: 140） EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSSSIHWVRQAPGKCLEWVAWVLPSVGFTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVCYNRLGVCAGGMDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSQISPPTFGCGTKVEIK
V3-46s-42（基因泰克公司）（WO 2006073941） EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSSSIHWVRQAPGKGLEWVAWVLPSVGFTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVCYNRLGVCAGGMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 147) CDR1：TISSSS（SEQ ID NO: 163）（Kabat） CDR2：AWVLPSVGFTD（SEQ ID NO: 164）（Kabat） CDR3：RVCYNRLGVCAGG（SEQ ID NO: 165）（Kabat） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDISTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSQISPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 150) CDR1：EDISTA（SEQ ID NO: 169）（Kabat） CDR2：YAASFLY（SEQ ID NO: 170）（Kabat） CDR3：CQQSQIS（SEQ ID NO: 168）（Kabat）
衍生自V3-46s-42的scFv （連接子斜體） VL-VH（SEQ ID NO: 141） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDISTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSQISPPTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSSSIHWVRQAPGKCLEWVAWVLPSVGFTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVCYNRLGVCAGGMDYWGQGTLVTVSS VH-VL（SEQ ID NO: 142） EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSSSIHWVRQAPGKCLEWVAWVLPSVGFTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVCYNRLGVCAGGMDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDISTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSQISPPTFGCGTKVEIK
Hu9.1-73（基因泰克公司）（WO 2006073941） EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPMAGFYTSWVRQAPGKGLEWVGFIRDKANGYTTEYNPSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAQVRRALDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 151) CDR1：GFYTS（SEQ ID NO: 171）（Kabat） CDR2：FIRDKANGYTTEYNPSVKG（SEQ ID NO: 172）（Kabat） CDR3：VRRALDY（SEQ ID NO: 173）（Kabat） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAQHLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 152) CDR1：KSSQSLLYSSNQNNYLA（SEQ ID NO: 174）（Kabat） CDR2：WAQHLDS（SEQ ID NO: 175）（Kabat） CDR3：QQYYTYPYT（SEQ ID NO: 176）（Kabat）
衍生自Hu9.1-73的scFv （連接子斜體） VL-VH（SEQ ID NO: 143） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAQHLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPMAGFYTSWVRQAPGKCLEWVGFIRDKANGYTTEYNPSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAQVRRALDYWGQGTLVTVSS VH-VL（SEQ ID NO: 144） EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPMAGFYTSWVRQAPGKCLEWVGFIRDKANGYTTEYNPSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAQVRRALDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAQHLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGCGTKVEIK
人源化mAb hCOH-1（希望之城（City of Hope））（WO 2017214170） QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQHPGKGLEYIGYISYSGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASPNYPFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 153) CDR1：GDSITSGY（非 Kabat）（SEQ ID NO: 177）或SGYWN（SEQ ID NO: 178）（Kabat） CDR2：ISYSGST（非 Kabat）（SEQ ID NO: 179）或YISYSGSTYYNPSLKS（SEQ ID NO: 180）（Kabat） CDR3：ASPNYPFYAMDY（非 Kabat）（SEQ ID NO: 181）或PNYPFYAMDY（SEQ ID NO: 182）（Kabat） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFLNWFQQKPGQAPRLLIYAASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 154) CDR1：ESVDNYGISF（非 Kabat）（SEQ ID NO: 183）或RASESVDNYGISFLN（SEQ ID NO: 184）（Kabat） CDR2：AAS（SEQ ID NO: 185）（非Kabat）或AASNRAT（SEQ ID NO: 186）（Kabat） CDR3：QQSKEVPWT（SEQ ID NO: 187）（Kabat）
衍生自hCOH-1的scFv （連接子斜體） VL-VH（SEQ ID NO: 149） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFLNWFQQKPGQAPRLLIYAASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQHPGKCLEYIGYISYSGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASPNYPFYAMDYWGQGTLVTVSS VH-VL（SEQ ID NO: 190） QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQHPGKCLEYIGYISYSGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASPNYPFYAMDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFLNWFQQKPGQAPRLLIYAASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGCGTKVEIK
人源化mAb hCOH-2（希望之城（City of Hope））（WO 2017214170） EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQHPGKGLEYIGYISYSGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQYSLKLSSVTAADTAVYYCASPNYPFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 155) CDR1：GDSITSGY（非 Kabat）（SEQ ID NO: 177）或SGYWN（SEQ ID NO: 178）（Kabat） CDR2：ISYSGST（非 Kabat）（SEQ ID NO: 179）或YISYSGSTYYNPSLKS（SEQ ID NO: 180）（Kabat） CDR3：ASPNYPFYAMDY（非 Kabat）（SEQ ID NO: 181）或PNYPFYAMDY（SEQ ID NO: 182）（Kabat） DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQAPRLLIYAASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 156) CDR1：ESVDNYGISF（非 Kabat）（SEQ ID NO: 183）或RASESVDNYGISFMN（SEQ ID NO: 188）（Kabat） CDR2：AAS（非Kabat）（SEQ ID NO: 185）或AASNRAT（SEQ ID NO: 186）（Kabat） CDR3：QQSKEVPWT（SEQ ID NO: 187）（Kabat）
衍生自hCOH-2的scFv （連接子斜體） VL-VH（SEQ ID NO: 191） DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQAPRLLIYAASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQHPGKCLEYIGYISYSGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQYSLKLSSVTAADTAVYYCASPNYPFYAMDYWGQGTLVTVSS VH-VL（SEQ ID NO: 192） EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQHPGKCLEYIGYISYSGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQYSLKLSSVTAADTAVYYCASPNYPFYAMDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQAPRLLIYAASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGCGTKVEIK
1129_A01 (AB0369 scFv) EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTMLRGLIIEDYGMDVWGQGTTVTVSS  (SEQ ID NO: 310) CDR1：GFTFSSY（SEQ ID NO: 214） CDR2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215） CDR3：RFTMLRGLIIEDYGMDV（SEQ ID NO: 216） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 276) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
1203_A01 CDR1：GFTFSSY（SEQ ID NO: 214） CDR2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215） CDR3：RFTMLRGVFIEDYGMDV（SEQ ID NO: 219） CDR1：RASQSVSSNLA（SEQ ID NO: 59） CDR2：GASTRAT（SEQ ID NO: 60） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
1203_A02 CDR1：GFTFSTY（SEQ ID NO: 220） CDR2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215） CDR3：RNTMVRGVIIEDYGMDV（SEQ ID NO: 221） CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSSPLT（SEQ ID NO: 222）
AB0605scfv EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTMLRGQYIEDYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 277) CDR1：GFTFSSY（SEQ ID NO: 214） CDR2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215） CDR3：RFTMLRGQYIEDYGMDV（SEQ ID NO: 223） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 276) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
AB0606scfv EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTMLRGWYIEDYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 278) CDR1：GFTFSSY（SEQ ID NO: 214） CDR2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215） CDR3：RFTMLRGWYIEDYGMDV（SEQ ID NO: 224） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 276) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
AB0622scfv EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTMLRGWIIEDYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 279) CDR1：GFTFSSY（SEQ ID NO: 214） CDR2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215） CDR3：RFTMLRGWIIEDYGMDV（SEQ ID NO: 225） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 276) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
共有 1 （ AB0605, AB0606, AB0622 ） CDR1：GFTFSSY（SEQ ID NO: 214） CDR2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215） CDR3：RFTMLRG X 1X 2 IEDYGMDV其中X 1係Q或W，X 2係I或Y（SEQ ID NO: 226） CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
AB0679scFv EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFPFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTMLRGWYIEDYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 280) CDR1：GFPFSSY（SEQ ID NO: 227） CDR2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215） CDR3：RFTMLRGWYIEDYGMDV（SEQ ID NO: 224） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 276) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
AB0681scFv EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGEWFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTHLRGWIIEDYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 281) CDR1：GEWFSSY（SEQ ID NO: 228） CDR2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215） CDR3：RFTHLRGWIIEDYGMDV（SEQ ID NO: 229） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 276) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
AB0682scFv EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSSGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTMLRGWYIEDYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 282) CDR1：GFTFSSS（SEQ ID NO: 230） CDR2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215） CDR3：RFTMLRGWYIEDYGMDV（SEQ ID NO: 224） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 276) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
共有 2 （ AB0679 ， AB0681 ， AB0682 ） CDR1：G X 1X 2 FSSX 3其中 X1係F或E， X 2 係T、P或W， X 3 係Y或S（SEQ ID NO: 231） CDR2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215） CDR3：RFT X 1 LRGW X 2 IEDYGMDV其中X 1係M或H，X 2 係I或Y（SEQ ID NO: 232） CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
AB0898 EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSSGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDASNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTRLRGWYIEDYGLDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 283) CDR1：GFTFSSS（SEQ ID NO: 230） CDR2：WYDASN（SEQ ID NO: 233） CDR3：RFTRLRGWYIEDYGLDV（SEQ ID NO: 242） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 276) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
AB0899 EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSSGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDASNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTYLRGWYIEDYGLDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 284) CDR1：GFTFSSS（SEQ ID NO: 230） CDR2：WYDASN （SEQ ID NO: 233） CDR3：RFTYLRGWYIEDYGLDV（SEQ ID NO: 234） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 276) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
AB0900 EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSSGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDASNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTSLRGWYIEDYGLDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 285) CDR1：GFTFSSS（SEQ ID NO: 230） CDR2：WYDASN（SEQ ID NO: 233） CDR3：RFTSLRGWYIEDYGLDV（SEQ ID NO: 235） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 276) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
共有 3 （ AB0898 ， AB0899 ， AB0900 ） CDR1：GFTFSSS（SEQ ID NO: 230） CDR2：WYDASN（SEQ ID NO: 233） CDR3：RFT XLRGWYIEDYGLDV其中X係R、Y或S（SEQ ID NO: 236） CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSTPLT（SEQ ID NO: 218）
AB1080scFv EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDASNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTHLRGWYIEDYGLDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 286) CDR1：GFTFSSY（SEQ ID NO: 214） CDR2：WYDASN（SEQ ID NO: 233） CDR3：RFTHLRGWYIEDYGLDV（SEQ ID NO: 237） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 253) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSIPLT（SEQ ID NO: 249）
AB1081scFv EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDESNKYYGDSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTNLRGWIIEDYGLDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 287) CDR1：GFAFSSY（SEQ ID NO: 238） CDR2：WYDESN（SEQ ID NO: 239） CDR3：RFTNLRGWIIEDYGLDV（SEQ ID NO: 240） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 253) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSIPLT（SEQ ID NO: 249）
AB1084scFv EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDASNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTRLRGWYIEDYGLDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 288) CDR1：GFTFSMY（SEQ ID NO: 241） CDR2：WYDASN（SEQ ID NO: 233） CDR3：RFTRLRGWYIEDYGLDV（SEQ ID NO: 242） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 253) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSIPLT（SEQ ID NO: 249）
AB1085scFv EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFGSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTHLRGQYIEDYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 289) CDR1：GFTFGSY（SEQ ID NO: 243） CDR2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215） CDR3：RFTHLRGQYIEDYGMDV（SEQ ID NO: 244） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO: 253) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSIPLT（SEQ ID NO: 249）
共有 4 （ AB1080 ， AB1081 ， AB1084 ， AB1085 ） CDR1：GF X 1 F X 2X 3 Y其中X 1係T或A，X 2係S或G，X 3 係S或M（SEQ ID NO: 245） CDR2：WYD XSN其中X係G、A或E（SEQ ID NO: 246） CDR3：RFT X 1 LRG X 2X 3 IEDYG X 4 DV其中X 1係H、N或R，X 2係W或Q，X 3係I或Y，X 4 係M或L（SEQ ID NO: 247） CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYS XPLT其中X係T或I（SEQ ID NO: 259）
AB1424/ AB1612 EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYGMHWVRQAPGK GLEWVAVI WYDASNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR RFTHLRGQYIEDYGLDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 250) CDR1：GFTFSSY（SEQ ID NO: 214） CDR2：WYDASN（SEQ ID NO: 233） CDR3：RFTHLRGQYIEDYGLDV（SEQ ID NO: 248） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSIPLTFG GGTKVEIK (SEQ ID NO: 251) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSIPLT（SEQ ID NO: 249）
AB1424/1612（具有用於雙硫鍵形成的半胱胺酸異二聚化突變） EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYGMHWVRQAPGK CLEWVAVI WYDASNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR RFTHLRGQYIEDYGLDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 252) CDR1：GFTFSSY（SEQ ID NO: 214） CDR2：WYDASN（SEQ ID NO: 233） CDR3：RFTHLRGQYIEDYGLDV（SEQ ID NO: 248） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSIPLTFG CGTKVEIK (SEQ ID NO: 253) CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYSIPLT（SEQ ID NO: 249）
AB1424/1612 scFv （VH-VL） EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYGMHWVRQAPGK CLEWVAVI WYDASNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR RFTHLRGQYIEDYGLDVWGQGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEIVLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSIPLTFG CGTKVEIK （SEQ ID NO: 254）
AB 1424/1612 scFv （VL-VH） EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSIPLTFG CGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYGMHWVRQAPGK CLEWVAVI WYDASNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR RFTHLRGQYIEDYGLDVWGQGTTVTVSS （SEQ ID NO: 255）
共有 5 （ AB0369 ， AB1080 ， AB1085 ， AB1424/AB1612 ） CDR1：GFTFXSY，其中X係S或G（SEQ ID NO: 256） CDR2：WYDXSN，其中X係G或A（SEQ ID NO: 257） CDR3：RFT X 1 LRG X 2X 3 IEDYG X 4 DV其中X 1為M或H，X 2為L，W，或Q，X 3係I或Y，X 4係M或L（SEQ ID NO: 258） CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYS XPLT其中X係T或I（SEQ ID NO: 259）
共有 6 （主共有） CDR1：G X 1X 2 F X 3X 4X 5 其中X 1係F或E，X 2 係T、P、W或A，X 3係S或G，X 4係S或M，X 5係Y或S（SEQ ID NO: 260） CDR2：WYD XSN其中X係G、A或E（SEQ ID NO: 246） CDR3：RFT X 1 LRG X 2X 3 IEDYG X 4 DV其中X 1 係M、H、N、R、Y或S，X 2係L、Q或W，X 3係I或Y，X 4係M或L（SEQ ID NO: 261） CDR1：RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 217） CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO: 77） CDR3：QQSYS XPLT其中X係T或I（SEQ ID NO: 259）
3A1 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKAS GYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEI DPFDSYTNYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMLLSSLTSDDSAVYYCAR ERLRLWSYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 263) CDR1：GYTFTSY（SEQ ID NO: 291） CDR2：DPFDSY（SEQ ID NO: 292） CDR3：ERLRLWSYYFDY（SEQ ID NO: 293） DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRLSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHDPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 264) CDR1：RSSQSIVHSNGNTYLE（SEQ ID NO: 294） CDR2：KVSNRLS（SEQ ID NO: 295） CDR3：FQGSHDPFT（SEQ ID NO: 296）
7G4 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKAS GYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEV DPSDSYTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYILLSNLTSDDSAVYYCAR ERVRLWSYFFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 265) CDR1：GYTFTSY（SEQ ID NO: 291） CDR2：DPSDSY（SEQ ID NO: 297） CDR3：ERVRLWSYFFDY（SEQ ID NO: 298） DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRLSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHDPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 266) CDR1：RSSQSIVHSNGNTYLE（SEQ ID NO: 294） CDR2：KVSNRLS（SEQ ID NO: 295） CDR3：FQGSHDPFT（SEQ ID NO: 296）
1B3-A7 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCVVS GFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATIS DGGGYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSEDTAIYYCAR DDLGGGNYVSSYFDVWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 267) CDR1：GFTFSNY（SEQ ID NO: 299） CDR2：DGGGY（SEQ ID NO: 300） CDR3：DDLGGGNYVSSYFDV（SEQ ID NO: 301） DVVMTQTPLSLPVSPGDQASISC RSSQSLVHSNGNTYLYWYLQKPGQSPKLLIY RVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFC FQGTHVPLTFGSGTKLELK (SEQ ID NO: 268) CDR1：RSSQSLVHSNGNTYLY（SEQ ID NO: 302） CDR2：RVSNRFS（SEQ ID NO: 303） CDR3：FQGTHVPLT（SEQ ID NO: 304）
10H7-C5 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS GFSFSRYAMSWVRQTPEKRLEWVATIS DGGSYTHYRDNVKGRFTISRDNAKNNLNLQMSHLKSEDTAIYYCAR NEMGLYFDYDVYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 269) CDR1：GFSFSRY（SEQ ID NO: 305） CDR2：DGGSY（SEQ ID NO: 306） CDR3：NEMGLYFDYDVYAMDY（SEQ ID NO: 307） DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQSLLHSNGNTYLYWYLQKPGQSPKLLIH RVSNRFSGVPDRFGGSGSGTDFTLKIIRVEAEDLGVYFC FQGTHVPWTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO: 262） CDR1：RSSQSLLHSNGNTYLY（SEQ ID NO: 308） CDR2：RVSNRFS （SEQ ID NO: 303） CDR3：FQGTHVPWT （SEQ ID NO: 309）
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點（例如，人BAFF-R）包含抗體重鏈可變結構域（VH）和抗體輕鏈可變結構域（VL），該重鏈可變結構域包含與表2中揭露的抗體的VH至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，並且該抗體輕鏈可變結構域包含與表2中揭露的相同的抗體的VL至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含表2中揭露的抗原結合位點的VH和VL序列的重鏈CDR1、CDR2和CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2和CDR3，按照Kabat（參見Kabat 等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學目的蛋白序列], NIH出版號91-3242, 貝塞斯達），Chothia（參見，例如，Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 196: 901-917），MacCallum（參見MacCallum R M等人, (1996) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 262: 732-745），或本領域已知的任何其他CDR測定方法確定。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含表2中揭露的抗體的重鏈CDR1、CDR2和CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 145的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 146的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 157或135、158或136、和159或137的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 157、158和159，或分別為SEQ ID NO: 135、136和137）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 160、161和162的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 157或135、158或136和159或137的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 157、158和159；或分別為SEQ ID NO: 135、136和137）的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 160、161和162的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點作為scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 207或138至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 147的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 148的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 163、164和165的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 166、167和168的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 163、164和165的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 166、167和168的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點作為scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 139或140至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 147的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 150的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 163、164和165的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 169、170和168的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 163、164和165的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 169、170和168的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點作為scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 141或142至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 151的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 152的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 171、172和173的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 174、175和176的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 171、172和173的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 174、175和176的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點作為scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 143或144至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 153的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 154的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 177或178、179或180、和181或182的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 177、179和181，或分別為SEQ ID NO: 178、180和182）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 183或184、185或186和187的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 183、185和187；或分別為SEQ ID NO: 184、186和187）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 177或178、179或180和181或182的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 177、179和181；或分別為SEQ ID NO: 178、180和182）的CDR1、CDR2和CDR3；和 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 183或184、185或186和187的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 183、185和187；或分別為SEQ ID NO: 184、186和187）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點作為scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 149或190至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 155的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 156的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 177或178、179或180、和181或182的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 177、179和181，或分別為SEQ ID NO: 178、180和182）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 183或188、185或186和187的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 183、185和187；或分別為SEQ ID NO: 188、186和187）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 177或178、179或180和181或182的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 177、179和181；或分別為SEQ ID NO: 178、180和182）的CDR1、CDR2和CDR3；和 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 183或188、185或186和187的胺基酸序列（例如，分別為SEQ ID NO: 183、185和187；或分別為SEQ ID NO: 188、186和187）的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點作為scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 191或192至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點的VH包含分別包含SEQ ID NO: 260、249和261的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點的VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和259的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 260、249和261的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和259的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 310的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 276的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 214、215和216的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 214、215和216的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 59、60和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 214、215和219的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 59、60和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 220、215和221的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和222的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 220、215和221的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和222的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點的VH包含分別包含SEQ ID NO: 214、215和226的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點的VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 214、215和226的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 277的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 276的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 214、215和223的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 214、215和223的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 278的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 276的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 214、215和224的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 214、215和224的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 279的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 276的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 214、215和225的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 214、215和225的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點的VH包含分別包含SEQ ID NO: 231、215和232的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點的VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 231、215和232的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 280的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 276的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 227、215和224的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 227、215和224的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 281的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 276的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 228、215和229的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 228、215和229的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 282的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 276的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 230、215和224的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 230、215和224的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點的VH包含分別包含SEQ ID NO: 230、233和236的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點的VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 230、233和236的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 283的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 276的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 230、233和242的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 230、233和242的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 284的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 276的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 230、233和234的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 230、233和234的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 285的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 276的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 230、233和235的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 230、233和235的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和218的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點的VH包含分別包含SEQ ID NO: 245、246和247的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點的VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和259的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 245、246和247的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和259的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 286的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 253的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 214、233和237的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和249的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 214、233和237的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和249的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 287的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 253的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 238、239和240的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和249的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 238、239和240的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和249的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 288的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 253的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 241、233和242的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和249的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 241、233和242的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和249的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 289的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 289的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 243、215和244的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和249的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 243、215和244的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和249的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點的VH包含分別包含SEQ ID NO: 256、257和258的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點的VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和259的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 256、257和258的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和259的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 250或252的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 251或253的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 214、233和248的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和249的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 214、233和248的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 217、77和249的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點作為scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO: 254或255至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 263的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 264的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 291、292和293的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 294、295和296的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 291、292和293的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 294、295和296的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 265的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 266的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 291、297和298的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 294、295和296的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 291、297和298的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 294、295和296的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 267的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 268的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 299、300和301的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 302、303和304的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 299、300和301的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 302、303和304的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 269的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列，該VL包含與SEQ ID NO: 262的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在某些實施方式中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 305、306和307的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，VL包含分別包含SEQ ID NO: 308、303和309的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含 (a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 305、306和307的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；以及 (b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 308、303和309的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在某些實施方式中，結合BAFF-R的第二抗原結合位點係scFv。例如，在某些實施方式中，第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 207、138、139、140、141、142、143、144、149、190、191、192、254或255的胺基酸序列。
可替代地，可結合BAFF-R的新抗原結合位點可藉由篩選與胺基酸序列的結合來鑒定，該胺基酸序列藉由結合SEQ ID NO: 189定義的胺基酸序列、其變體、其成熟胞外片段或含有BAFF-R結構域的片段來定義。 SEQ ID NO: 189 MRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQESVGAGAGEAALPLPGLLFGAPALLGLALVLALVLVGLVSWRRRQRRLRGASSAEAPDGDKDAPEPLDKVIILSPGISDATAPAWPPPGEDPGTTPPGHSVPVPATELGSTELVTTKTAGPEQQ
預期在scFv中，VH和VL可以藉由連接子連接，例如，(GlyGlyGlyGlySer) 4 即(G 4S) 4連接子（SEQ ID NO: 119）。熟悉該項技術者將理解，任何其他揭露的連接子（參見，例如，表10）可以用於具有本文揭露的VH和VL序列的scFv中（例如，見表2）。
在每個前述實施方式中，本文預期結合BAFF-R的scFv、VH和/或VL序列可包含VH和/或VL的框架區中的胺基酸改變（例如，至少1、2、3、4、5個或10個胺基酸取代、缺失或添加）而不影響它們對BAFF-R的能力。例如，本文預期結合BAFF-R的scFv、VH和/或VL序列可含有半胱胺酸異二聚化突變，促進scFv的VH和VL之間雙硫鍵的形成。
在某些實施方式中，第二抗原結合位點與上述相應的抗原結合位點競爭結合BAFF-R。
在某些實施方式中，第二抗原結合位點阻斷BAFF-R與BAFF配體的相互作用。 Fc 結構域
在Fc結構域內，CD16結合由鉸鏈區和CH2結構域介導。例如，在人IgG1中，與CD16的相互作用主要集中在CH2結構域中的胺基酸殘基Asp 265 -  Glu 269、Asn 297 - Thr 299、Ala 327 - Ile 332、Leu 234 - Ser 239和碳水化合物殘基N-乙醯基-D-胺基葡萄糖（參見，Sondermann 等人, Nature [自然], 406 (6793):267-273）。基於已知的結構域，可以選擇突變以增強或降低與CD16的結合親和力，例如藉由使用噬菌體顯示文庫或酵母表面展示的cDNA文庫，或者可以基於已知的三維結構設計相互作用。因此，在某些實施方式中，抗體Fc結構域或其部分包含鉸鏈和CH2結構域。
異二聚物抗體重鏈的組裝可以藉由在同一細胞中表現兩個不同的抗體重鏈序列來完成，這可能導致每個抗體重鏈的同二聚物的組裝以及異二聚物的組裝。如US 13/494870、US 16/028850、US 11/533709、US 12/875015、US 13/289934、US 14/773418、US 12/811207、US 13/866756、US 14/647480、US 13/642253、和US 14/830336中所示，促進異二聚物的優先裝配可以藉由在每個抗體重鏈恒定區的CH3結構域中摻入不同的突變來實現。例如，可以基於人IgG1在CH3結構域中進行突變，並在第一多肽和第二多肽內摻入不同的胺基酸取代對，使這兩條鏈彼此選擇性異二聚化。下面所示的胺基酸取代位置均根據Kabat中的EU索引編號（Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學目的蛋白序列], 第5版, United States Public Health Service, National Institutes of Health [公共衛生服務，美國國立衛生研究院], 貝塞斯達, 其全部內容藉由引用併入）。抗體領域的技術者將理解，此慣例由免疫球蛋白序列特定區域的非連續編號組成，從而能夠使對免疫球蛋白家族中的保守位置的引用標準化。因此，由EU索引或Kabat編號方案定義的任何給定免疫球蛋白的位置不一定與其順序序列相對應。
知道根據Kabat或EU索引編號的殘基編號，普通技術者可以應用本領域的教導根據任何常用的編號慣例來鑒定本發明內的胺基酸序列修飾。應當理解，SEQ ID NO提供給定多肽內胺基酸的順序編號，因此可能不符合Kabat或EU索引提供的相應胺基酸編號。
在一種情況下，第一多肽中的胺基酸取代用選自精胺酸（R）、苯丙胺酸（F）、酪胺酸（Y）或色胺酸（W）的較大胺基酸替代原始胺基酸，並且第二多肽中之至少一個胺基酸取代用選自丙胺酸（A）、絲胺酸（S）、蘇胺酸（T）或纈胺酸（V）的較小胺基酸替代一或多個原始胺基酸，使得較大的胺基酸取代（突起）適合進入較小的胺基酸取代（腔）的表面。例如，一個多肽可以摻入T366W取代，而另一個可以摻入三個取代，包括T366S、L368A和Y407V。
本申請中描述的抗體重鏈可變結構域可以視需要地偶合至與抗體恒定區至少90%相同的胺基酸序列，例如包括鉸鏈、CH2和CH3結構域（具有或不具有CH1結構域）的IgG恒定區。在一些實施方式中，恒定區的胺基酸序列與人抗體恒定區（例如人IgG1恒定區、IgG2恒定區、IgG3恒定區或IgG4恒定區）至少90%相同。在一個實施方式中，足以結合CD16的抗體Fc結構域或其部分包含與野生型人IgG1 Fc序列DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（SEQ ID NO: 118）至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）相同的胺基酸序列。在一些其他實施方式中，恒定區的胺基酸序列與來自其他哺乳動物（例如兔、狗、貓、小鼠或馬）的抗體恒定區至少90%相同。
在一些實施方式中，與scFv或Fab片段連接的抗體恒定結構域能夠結合CD16。在一些實施方式中，蛋白摻入了抗體Fc結構域的一部分（例如，足以結合CD16的抗體Fc結構域的一部分），其中抗體Fc結構域包含鉸鏈和CH2結構域（例如，鉸鏈和人IgG1抗體的CH2結構域）和/或與人IgG抗體的胺基酸序列234-332至少90%相同的胺基酸序列。
與人IgG1恒定區相比，一或多個突變可以摻入恒定區，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和/或K439。示例性取代包括，例如，Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、F405L、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、K409R、T411D、T411E、K439D、和K439E。
在某些實施方式中，可摻入人IgG1恒定區的CH1中的突變可以在胺基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171和/或V173處。在某些實施方式中，可摻入人IgG1恒定區的Cκ中的突變可以在胺基酸E123、F116、S176、V163、S174和/或T164處。
可替代地，胺基酸取代可選自 表 3中所示的下列取代組。
[ 表 3]      
   第一多肽 第二多肽
組1 S364E/F405A Y349K/T394F
組2 S364H/D401K Y349T/T411E
組3 S364H/T394F Y349T/F405A
組4 S364E/T394F Y349K/F405A
組5 S364E/T411E Y349K/D401K
組6 S364D/T394F Y349K/F405A
組7 S364H/F405A Y349T/T394F
組8 S364K/E357Q L368D/K370S
組9 L368D/K370S S364K
組10 L368E/K370S S364K
組11 K360E/Q362E D401K
組12 L368D/K370S S364K/E357L
組13 K370S S364K/E357Q
組14 F405L K409R
組15 K409R F405L
可替代地，胺基酸取代可選自 表 4中所示的下列取代組。
[ 表 4]      
   第一多肽 第二多肽
組1 K409W D399V/F405T
組2 Y349S E357W
組3 K360E Q347R
組4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
組5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
組6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
可替代地，胺基酸取代可選自 表 5中所示的下列取代組。
[ 表 5]      
   第一多肽 第二多肽
組1 T366K/L351K L351D/L368E
組2 T366K/L351K L351D/Y349E
組3 T366K/L351K L351D/Y349D
組4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E
組5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E
組6 E356K/D399K K392D/K409D
可替代地，每條多肽鏈中之至少一個胺基酸取代可以選自 表 6。
[ 表 6]   
第一多肽 第二多肽
L351Y、D399R、D399K、S400K、S400R、Y407A、Y407I、Y407V T366V、T366I、T366L、T366M、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F K392D、K392E、K409F、K409W、T411D和T411E
可替代地，至少一個胺基酸取代可以選自 表 7中的以下取代組，其中第一多肽列中指示的一或多個位置被任何已知的帶負電荷的胺基酸替代，並且第二多肽列中指示的一或多個位置被任何已知的帶正電荷的胺基酸替代。
[ 表 7]   
第一多肽 第二多肽
K392、K370、K409、或K439 D399、E356、或E357
可替代地，至少一個胺基酸取代可以選自 表 8中的以下組，其中第一多肽列中指示的一或多個位置被任何已知的帶正電荷的胺基酸替代，並且第二多肽列中指示的一或多個位置被任何已知的帶負電荷的胺基酸替代。
[ 表 8]   
第一多肽 第二多肽
D399、E356、或E357 K409、K439、K370、或K392
可替代地，胺基酸取代可選自 表 9中的以下組。
[ 表 9]
第一多肽 第二多肽
T350V、L351Y、F405A、和Y407V T350V、T366L、K392L、和T394W
可替代地或另外地，異集合體蛋白的結構穩定性可藉由在第一或第二多肽鏈中之任一個上引入S354C和在相對多肽鏈上引入Y349C來增加，這在兩個多肽的介面內形成人工雙硫鍵。
在一些實施方式中，抗體恒定區一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在位置T366處不同，並且其中抗體恒定區另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由T366、L368和Y407組成之群組位置處不同。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由T366、L368和Y407組成之群組位置處不同，並且其中抗體恒定區另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在位置T366處不同。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405、和T411組成之群組位置處不同，並且其中抗體恒定區的另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405、和T411組成之群組位置處不同。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411組成之群組位置處不同，並且其中抗體恒定區的另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411組成之群組位置處不同。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由L351、D399、S400和Y407組成之群組位置處不同，並且其中抗體恒定區的另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由T366、N390、K392、K409和T411組成之群組位置處不同。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由T366、N390、K392、K409和T411組成之群組位置處不同，並且其中抗體恒定區的另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由L351、D399、S400和Y407組成之群組位置處不同。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由Q347、Y349、K360和K409組成之群組位置處不同，並且其中抗體恒定區的另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由Q347、E357、D399和F405組成之群組位置處不同。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由Q347、E357、D399和F405組成之群組位置處不同，並且其中抗體恒定區的另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由Y349、K360、Q347和K409組成之群組位置處不同。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由K370、K392、K409和K439組成之群組位置處不同，並且其中抗體恒定區的另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由D356、E357和D399組成之群組位置處不同。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由D356、E357和D399組成之群組位置處不同，並且其中抗體恒定區的另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由K370、K392、K409和K439組成之群組位置處不同。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由L351、E356、T366和D399組成之群組位置處不同，並且其中抗體恒定區的另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由Y349、L351、L368、K392和K409組成之群組位置處不同。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由Y349、L351、L368、K392和K409組成之群組位置處不同，並且其中抗體恒定區的另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列在一或多個選自由L351、E356、T366和D399組成之群組位置處不同。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於S354C取代，並且其中抗體恒定區另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於Y349C取代。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於Y349C取代，並且其中抗體恒定區另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於S354C取代。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於K360E和K409W取代，並且其中抗體恒定區另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於Q347R、D399V和F405T取代。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於Q347R、D399V和F405T取代，並且其中抗體恒定區另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於K360E和K409W取代。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於T366W取代，並且其中抗體恒定區另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於T366S、T368A和Y407V取代。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於T366S、T368A和Y407V取代，並且其中抗體恒定區另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於T366W取代。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於T350V、L351Y、F405A和Y407V取代，並且其中抗體恒定區另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於T350V、T366L、K392L和T394W取代。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於T350V、T366L、K392L和T394W取代，並且其中抗體恒定區另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於T350V、L351Y、F405A和Y407V取代。
在一些實施方式中，抗體恒定區的一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於F405L取代，並且其中抗體恒定區另一個多肽鏈的胺基酸序列與IgG1（例如，人IgG1）恒定區的胺基酸序列的不同之處在於K409R取代。 示例性多特異性結合蛋白
下面列出的是包含結合BAFF-R的抗原結合位點和結合NKG2D的抗原結合位點的TriNKET的實例，每個抗原結合位點都連接到抗體恒定區，其中抗體恒定區包括能夠使兩條Fc鏈異二聚化的突變。
示例性的靶向BAFF-R的TriNKET被設想為呈F3'、F4和2-Fab形式。如上所述，在F3'形式中，結合BAFF-R的抗原結合位點係scFv，結合NKG2D的抗原結合位點係Fab。在F4形式中，結合BAFF-R的抗原結合位點係Fab片段，結合NKG2D的抗原結合位點係scFv。在每個TriNKET中，scFv可以包含VH和VL區域中的Cys取代，促進在scFv的VH和VL之間形成雙硫鍵。在2-Fab形式中，結合BAFF-R的抗原結合位點和結合NKG2D的抗原結合位點都是Fab。
scFv的VH和VL可藉由連接子連接，例如，肽連接子。在某些實施方式中，肽連接子係柔性連接子。關於連接子的胺基酸組成，選擇具有賦予柔性、不干擾本申請中描述的蛋白的其他結構域的結構和功能並且抵抗蛋白酶切割的特性的肽。例如，甘胺酸和絲胺酸殘基通常提供蛋白酶抗性。在某些實施方式中，VL藉由(GlyGlyGlyGlySer) 4（(G 4S) 4）連接子（SEQ ID NO: 119）連接到VH的N末端或C末端。
連接子的長度（例如，柔性連接子）可為「短的」，例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸殘基，或「長的」，例如，至少13個胺基酸殘基。在某些實施方式中，連接子長度係10-50、10-40、10-30、10-25、10-20、15-50、15-40、15-30、15-25、15-20、20-50、20-40、20-30、或20-25個胺基酸殘基。
在某些實施方式中，連接子包含以下或選自由以下組成之群組：(GS) n（SEQ ID NO: 120）、(GGS) n（SEQ ID NO: 121）、(GGGS) n（SEQ ID NO: 122）、(GGSG) n（SEQ ID NO: 123）、(GGSGG) n（SEQ ID NO: 124）、和(GGGGS) n（SEQ ID NO: 125）序列，其中n係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20。在某些實施方式中，連接子包含以下或選自由以下組成之群組： 表 10中所列的SEQ ID NO: 119和SEQ ID NO: 126-134。
[ 表 10]   
SEQ ID 胺基酸序列
SEQ ID NO: 126 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS
SEQ ID NO: 127 GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGS
SEQ ID NO: 128 GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS
SEQ ID NO: 129 GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSG
SEQ ID NO: 130 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
SEQ ID NO: 131 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 119 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 132 GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 133 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 134 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
SEQ ID NO: 274 SGSGGGGS
在F3’-TriNKET中，結合BAFF-R的scFv藉由Ala-Ser或Gly-Ser連接子連接到Fc的N末端。Ala-Ser或Gly-Ser連接子包含在肘部鉸鏈區序列中，以在柔性和最佳幾何形狀之間平衡。在某些實施方式中，另外的胺基酸序列Thr-Lys-Gly可以添加到鉸鏈處的Ala-Ser或Gly-Ser序列的N末端或C末端。在F4 TriNKET中，結合NKG2D的scFv藉由包含胺基酸序列SGSGGGGS（SEQ ID NO: 274）的短連接子連接到Fc的C末端。
如本文所用描述該等示例性TriNKET，Fc包括抗體鉸鏈、CH2和CH3。在每個示例性TriNKET中，連接到scFv的Fc結構域包含Q347R、D399V和F405T的突變，連接到Fab的Fc結構域包含匹配突變K360E和K409W以形成異二聚物。連接到scFv的Fc結構域進一步包括CH3結構域中的S354C取代，它與連接到Fab的Fc上的Y349C取代形成二硫鍵。該等取代在本小節中描述的序列中以粗體顯示。
例如，本揭露中描述的TriNKET係伊利尤單抗F3'。伊利尤單抗F3'包括 (a) 結合BAFF-R的scFv序列，其包含表2中描述的伊利尤單抗的VH和VL序列，呈VH位於VL的C末端的取向，連接到Fc結構域和 (b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。伊利尤單抗F3'包括三種多肽：scFv-伊利尤單抗-VL-VH-Fc（SEQ ID NO: 193）、A49MI-VH-CH1-Fc（SEQ ID NO: 194）和A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）。
scFv- 伊利尤單抗 -VL-VH-Fc（SEQ ID NO: 193）（「鏈S」）DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQFILPEYLSWYQQKPGQAPRLLIYGSSSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFYSSPLTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWGWIRQSPGRCLEWLGRIYYRSKWYNSYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARYQWVPKIGVFDSWGQGTLVTVSSASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP RVYTLPP CRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL VSDGSF TLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
A49MI-VH-CH1-Fc（SEQ ID NO: 194）（「鏈H」）EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSI SSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR GAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）（「鏈L」）DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
scFv-伊利尤單抗-VL-VH-Fc（SEQ ID NO: 193）代表藉由包含Ala-Ser的鉸鏈連接到Fc結構域的結合BAFF-R的scFv的完整序列。與scFv連接的Fc結構域包括用於異二聚化的Q347R、D399V和F405T取代以及用於與A49MI-VH-CH1-Fc中的Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代，如下所述。scFv具有SEQ ID NO: 207的胺基酸序列，其包括伊利尤單抗的重鏈可變結構域藉由(G 4S) 4連接子連接到伊利尤單抗的輕鏈可變結構域的C末端。scFv包含VH和VL區域中在G44和Q100處的Cys取代，促進在scFv的VH和VL之間形成雙硫鍵。
A49MI-VH-CH1-Fc（SEQ ID NO: 194）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc中的Fc結構域包括CH3結構域中的Y349C取代，它與scFv-伊利尤單抗-VL-VH-Fc中Fc上的S354C取代形成二硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc結構域還包括K360E和K409W取代，用於與scFv-伊利尤單抗-VL-VH-Fc中的Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）代表Fab片段的輕鏈部分，包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的另一種TriNKET係伊利尤單抗-2-Fab。伊利尤單抗-2-Fab包括 (a) 結合BAFF-R的Fab片段，其包含表2中描述的伊利尤單抗的VH序列和VL序列，包括包含重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，和包含輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域連接到Fc結構域（不包括商用伊利尤單抗抗體中存在的抗體依賴性細胞毒性增強突變）；(b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。伊利尤單抗-2-Fab包括四種多肽：伊利尤單抗-VH-CH1-Fc-Genmab、伊利尤單抗-VL-CL、A49MI-VH-CH1-Fc、和A49MI-VL-CL-Genmab。
伊利尤單抗-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 196） QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWGWIRQSPGRGLEWLGRIYYRSKWYNSYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARYQWVPKIGVFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
伊利尤單抗 -VL-CL（SEQ ID NO: 197）DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQFILPEYLSWYQQKPGQAPRLLIYGSSSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFYSSPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 213）EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSI SSSSSYIY YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR GAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
伊利尤單抗-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 196）代表Fab片段的重鏈部分，其包含結合BAFF-R的伊利尤單抗的重鏈可變結構域（SEQ ID NO: 145）和CH1結構域，連接至Fc結構域。伊利尤單抗-VH-CH1-Fc-Genmab中的Fc結構域包括F405L取代，用於與A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（其包括K409R取代）中的Fc異二聚化。
伊利尤單抗-VL-CL（SEQ ID NO: 197）代表包含結合的BAFF-R的伊利尤單抗的輕鏈可變結構域（SEQ ID NO: 146）和輕鏈恒定結構域的Fab片段的輕鏈部分。
A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 213）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接到Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab中的Fc結構域包括K409R取代，用於與伊利尤單抗-VH-CH1-Fc-Genmab（包括F405L取代）中的Fc異二聚化。
如上所述，A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的另一個示例性TriNKET係hCOH-1-F3’ TriNKET。hCOH-1-F3’包括 (a) 衍生自表2的hCOH-1的結合BAFF-R的scFv序列，呈VH位於VL的C末端的取向，連接到Fc結構域以及 (b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。hCOH-1-F3'包括三種多肽：scFv-hCOH-1-VL-VH-Fc、A49MI-VH-CH1-Fc和A49MI-VL-CL。
scFv-hCOH-1-VL-VH-Fc（SEQ ID NO: 198）（「鏈S」）EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFLNWFQQKPGQAPRLLIYAASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQHPGKCLEYIGYISYSGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASPNYPFYAMDYWGQGTLVTVSSASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP RVYTLPP CRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL VSDGSF TLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-hCOH-1-VL-VH-Fc（SEQ ID NO: 198）代表藉由包含Ala-Ser的鉸鏈連接到Fc結構域的結合BAFF-R的scFv的完整序列。與scFv連接的Fc結構域包括用於異二聚化的Q347R、D399V和F405T取代以及用於與A49MI-VH-CH1-Fc中的Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代，如下所述。scFv具有SEQ ID NO: 149的胺基酸序列，其包括hCOH-1的重鏈可變結構域藉由(G 4S) 4連接子連接到hCOH-1的輕鏈可變結構域的C末端。scFv包含VH和VL區域中在G44和G100處的Cys取代，促進在scFv的VH和VL之間形成雙硫鍵。
如上所述，A49MI-VH-CH1-Fc（SEQ ID NO: 194）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接到Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc中的Fc結構域包括CH3結構域中的Y349C取代，它與scFv-hCOH-1-VL-VH-Fc中Fc上的S354C取代形成二硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc結構域還包括K360E和K409W取代，用於與scFv-hCOH-1-VL-VH-Fc中的Fc異二聚化。
如上所述，A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的另一種TriNKET係hCOH-1-2-Fab。hCOH-1-2-Fab包括 (a) 衍生自hCOH-1的結合BAFF-R的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接；(b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。hCOH-1-2-Fab包括四種多肽：hCOH-1-VH-CH1-Fc-Genmab、hCOH-1-VL-CL、A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab、和A49MI-VL-CL。
hCOH-1-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 208）QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQHPGKGLEYIGYISYSGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASPNYPFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF LLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
hCOH-1-VL-CL（SEQ ID NO: 209）EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFLNWFQQKPGQAPRLLIYAASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
hCOH-1-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 208）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合BAFF-R的hCOH-1（SEQ ID NO: 153）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域。hCOH-1-VH-CH1-Fc-Genmab中的Fc結構域包括F405L取代，用於與A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（其包括K409R取代）中的Fc異二聚化。
hCOH-1-VL-CL（SEQ ID NO: 209）代表包含結合的BAFF-R的hCOH-1的輕鏈可變結構域（SEQ ID NO: 154）和輕鏈恒定結構域的Fab片段的輕鏈部分。
A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 213）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接到Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab中的Fc結構域包括K409R取代，用於與hCOH-1-VH-CH1-Fc-Genmab（包括F405L取代）中的Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的另一個示例性TriNKET係hCOH-2-F3'。hCOH-2-F3’包括 (a) 衍生自表2的hCHO-2的結合BAFF-R的scFv序列，呈VH位於VL的C末端的取向，連接到Fc結構域以及(b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。hCOH-2-F3'包括三種多肽：scFv-hCOH-1-VL-VH-Fc、A49MI-VH-CH1-Fc和A49MI-VL-CL。
scFv-hCOH-2-VL-VH-Fc（SEQ ID NO: 210）（「鏈 S」）DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQAPRLLIYAASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQHPGKCLEYIGYI SYSGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQYSLKLSSVTAADTAVYYCASPNYPFYAMDYWGQGTLVTVSSASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREP RVYTLPP CRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVL VSDGSF TLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-hCOH-2-VL-VH-Fc（SEQ ID NO: 210）代表藉由包含Ala-Ser的鉸鏈連接到Fc結構域的結合BAFF-R的scFv的完整序列。與scFv連接的Fc結構域包括用於異二聚化的Q347R、D399V和F405T取代以及用於與A49MI-VH-CH1-Fc中的Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代，如下所述。scFv具有SEQ ID NO: 191的胺基酸序列，其包括hCOH-2的重鏈可變結構域藉由(G 4S) 4連接子連接到hCOH-2的輕鏈可變結構域的C末端。scFv包含VH和VL區域中在G44和G100處的Cys取代，促進在scFv的VH和VL之間形成雙硫鍵。
A49MI-VH-CH1-Fc（SEQ ID NO: 194）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc中的Fc結構域包括CH3結構域中的Y349C取代，它與scFv-hCOH-2-VL-VH-Fc中Fc上的S354C取代形成二硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc結構域還包括K360E和K409W取代，用於與scFv-hCOH-2-VL-VH-Fc中的Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）代表Fab片段的輕鏈部分，包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的另一種TriNKET係hCOH-2-2-Fab。hCOH-2-2-Fab包括 (a) 衍生自hCOH-2的結合BAFF-R的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接；(b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。hCOH-2-2-Fab包括四種多肽：hCOH-2-VH-CH1-Fc-Genmab、hCOH-2-VL-CL、A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab、和A49MI-VL-CL。
hCOH-2-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 199）EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQHPGKGLEYIGYISYSGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQYSLKLSSVTAADTAVYYCASPNYPFYAMDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF LLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
hCOH-2-VL-CL（SEQ ID NO: 200）DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQAPRLLIYAASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
hCOH-2-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 199）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合BAFF-R的hCOH-2（SEQ ID NO: 155）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域。hCOH-2-VH-CH1-Fc-Genmab中的Fc結構域包括F405L取代，用於與A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（其包括K409R取代）中的Fc異二聚化。
hCOH-2-VL-CL（SEQ ID NO: 200）代表包含結合的BAFF-R的hCOH-2的輕鏈可變結構域（SEQ ID NO: 156）和輕鏈恒定結構域的Fab片段的輕鏈部分。
A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 213）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接到Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab中的Fc結構域包括K409R取代，用於與hCOH-2-VH-CH1-Fc-Genmab（包括F405L取代）中的Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的另一個示例性TriNKET係V3-46s-F3’。V3-46s-F3’包括 (a) 衍生自表2的V3-46s的結合BAFF-R的scFv序列，呈VH位於VL的C末端的取向，連接到Fc結構域以及(b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。V3-46s-F3'包括三種多肽：scFv-hCOH-1-VL-VH-Fc、A49MI-VH-CH1-Fc和A49MI-VL-CL。
scFv-V3-46s-VL-VH-Fc （SEQ ID NO: 201）（「鏈 S」）DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSQISPPTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSSSIHWVRQAPGKCLEWVAWVLPSVGFTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVCYNRLGVCAGGMDYWGQGTLVTVSSASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP RVYTLPP CRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVL VSDGSF TLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPG
scFv-V3-46s-VL-VH-Fc（SEQ ID NO: 201）代表藉由包含Ala-Ser的鉸鏈連接到Fc結構域的結合BAFF-R的scFv的完整序列。與scFv連接的Fc結構域包括用於異二聚化的Q347R、D399V和F405T取代以及用於與A49MI-VH-CH1-Fc中的Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代，如下所述。scFv具有SEQ ID NO: 139的胺基酸序列，其包括V3-46s的重鏈可變結構域藉由(G 4S) 4連接子連接到V3-46s的輕鏈可變結構域的C末端。scFv包含VH和VL區域中在G44和Q100處的Cys取代，促進在scFv的VH和VL之間形成雙硫鍵。
A49MI-VH-CH1-Fc（SEQ ID NO: 194）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc中的Fc結構域包括CH3結構域中的Y349C取代，它與scFv-V3-46s-VL-VH-Fc中Fc上的S354C取代形成二硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc結構域還包括K360E和K409W取代，用於與scFv-V3-46s-VL-VH-Fc中的Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）代表Fab片段的輕鏈部分，包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的另一種TriNKET係V3-46s-2-Fab。V3-46s-2-Fab包括 (a) 衍生自V3-46s的結合BAFF-R的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接；(b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。V3-46s-2-Fab包括四種多肽：V3-46s-VH-CH1-Fc-Genmab、V3-46s-VL-CL、A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab、和A49MI-VL-CL。
V3-46s-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 202）EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSSSIHWVRQAPGKGLEWVAWVLPSVGFTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVCYNRLGVCAGGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SF LLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
V3-46s-VL-CL（SEQ ID NO: 203）DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSQISPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
V3-46s-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 202）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合BAFF-R的V3-46s（SEQ ID NO: 147）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域。V3-46s-VH-CH1-Fc-Genmab中的Fc結構域包括F405L取代，用於與A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（其包括K409R取代）中的Fc異二聚化。
V3-46s-VL-CL（SEQ ID NO: 203）代表包含結合的BAFF-R的V3-46s的輕鏈可變結構域（SEQ ID NO: 148）和輕鏈恒定結構域的Fab片段的輕鏈部分。
A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 213）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接到Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab中的Fc結構域包括K409R取代，用於與V3-46s-VH-CH1-Fc-Genmab（包括F405L取代）中的Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的另一個示例性TriNKET係V3-46s-42-F3’。V3-46s-42-F3’包括 (a) 衍生自表2的V3-46s-42的結合BAFF-R的scFv序列，呈VH位於VL的C末端的取向，連接到Fc結構域以及(b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。V3-46s-42-F3'包括三種多肽：scFv-V3-46s-42-VL-VH-Fc、A49MI-VH-CH1-Fc、和A49MI-VL-CL。
scFv-V3-46s-42-VL-VH-Fc(SEQ ID NO: 204)（「鏈 S」）DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDISTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSQISPPTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSSSIHWVRQAPGKCLEWVAWVLPSVGFTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVCYNRLGVCAGGMDYWGQGTLVTVSSASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP RVYTLPP CRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVL VSDGSF TLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPG
scFv-V3-46s-42-VL-VH-Fc（SEQ ID NO: 204）代表藉由包含Ala-Ser的鉸鏈連接到Fc結構域的結合BAFF-R的scFv的完整序列。與scFv連接的Fc結構域包括用於異二聚化的Q347R、D399V和F405T取代以及用於與A49MI-VH-CH1-Fc中的Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代，如下所述。scFv具有SEQ ID NO: 141的胺基酸序列，其包括V3-46s-42的重鏈可變結構域藉由(G 4S) 4連接子連接到V3-46s-42的輕鏈可變結構域的C末端。scFv包含VH和VL區域中在G44和Q100處的Cys取代，促進在scFv的VH和VL之間形成雙硫鍵。
A49MI-VH-CH1-Fc（SEQ ID NO: 194）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc中的Fc結構域包括CH3結構域中的Y349C取代，它與scFv-V3-46s-42-VL-VH-Fc中Fc上的S354C取代形成二硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc結構域還包括K360E和K409W取代，用於與scFv-V3-46s-42-VL-VH-Fc中的Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）代表Fab片段的輕鏈部分，包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的另一種TriNKET係V3-46s-42-2-Fab。V3-46s-42-2-Fab包括 (a) 衍生自V3-46s-42的結合BAFF-R的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接；(b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。V3-46s-42-2-Fab包括四種多肽：V3-46s-42-VH-CH1-Fc-Genmab、V3-46s-42-VL-CL、A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab和A49MI-VL-CL。
V3-46s-42-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 202）EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSSSIHWVRQAPGKGLEWVAWVLPSVGFTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVCYNRLGVCAGGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SF LLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
V3-46s-42-VL-CL（SEQ ID NO: 206）DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDISTAVAWYQQKPGKAPKLLIYAASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSQISPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
V3-46s-42-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 205）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合BAFF-R的V3-46s-42（SEQ ID NO: 147）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域。V3-46s-42-VH-CH1-Fc中的Fc結構域包括F405L取代，用於與A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（其包括K409R取代）中的Fc異二聚化。
V3-46s-42-VL-CL（SEQ ID NO: 206）代表包含結合的BAFF-R的V3-46s-42的輕鏈可變結構域（SEQ ID NO: 150）和輕鏈恒定結構域的Fab片段的輕鏈部分。
A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 213）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接到Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab中的Fc結構域包括K409R取代，用於與V3-46s-42-VH-CH1-Fc-Genmab（包括F405L取代）中的Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的另一個示例性TriNKET係Hu9.1-73-F3’ TriNKET。Hu9.1-73-F3’ TriNKET包括 (a) 衍生自表2的Hu9.1-73的結合BAFF-R的scFv序列，呈VH位於VL的C末端的取向，連接到Fc結構域以及(b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。Hu9.1-73-F3'包括三種多肽：scFv-Hu9.1-73-VL-VH-Fc、A49MI-VH-CH1-Fc、和A49MI-VL-CL。
scFv-Hu9.1-73-VL-VH-Fc（SEQ ID NO: 211）（「鏈 S」）DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAQHLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPMAGFYTSWVRQAPGKCLEWVGFIRDKANGYTTEYNPSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAQVRRALDYWGQGTLVTVSSASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP RVYTLPP CRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL VSDGSF TLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-Hu9.1-73-VL-VH-Fc（SEQ ID NO: 211）代表藉由包含Ala-Ser的鉸鏈連接到Fc結構域的結合BAFF-R的scFv的完整序列。與scFv連接的Fc結構域包括用於異二聚化的Q347R、D399V和F405T取代以及用於與A49MI-VH-CH1-Fc中的Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代，如下所述。scFv具有SEQ ID NO: 143的胺基酸序列，其包括scFv-Hu9.1-73的重鏈可變結構域藉由(G 4S) 4連接子連接到scFv-Hu9.1-73的輕鏈可變結構域的C末端。scFv包含VH和VL區域中在G44和Q100處的Cys取代，促進在scFv的VH和VL之間形成雙硫鍵。
A49MI-VH-CH1-Fc（SEQ ID NO: 194）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc中的Fc結構域包括CH3結構域中的Y349C取代，它與scFv-Hu9.1-73-VL-VH-Fc中Fc上的S354C取代形成二硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc結構域還包括K360E和K409W取代，用於與scFv-Hu9.1-73-VL-VH-Fc中的Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）代表Fab片段的輕鏈部分，包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的另一種TriNKET係Hu9.1-73-2-Fab。Hu9.1-73-2-Fab包括 (a) 衍生自Hu9.1-73的結合BAFF-R的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接；(b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。Hu9.1-73-2-Fab包括四種多肽：Hu9.1-73-VH-CH1-Fc-Genmab、Hu9.1-73-VL-CL、A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab、和A49MI-VL-CL。
Hu9.1-73-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 212）EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPMAGFYTSWVRQAPGKGLEWVGFIRDKANGYTTEYNPSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAQVRRALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF LLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Hu9.1-73-VL-CL（SEQ ID NO: 205）DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAQHLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYTYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Hu9.1-73-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 212）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合BAFF-R的Hu9.1-73（SEQ ID NO: 151）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域。Hu9.1-73-VH-CH1-Fc中的Fc結構域包括F405L取代，用於與A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（其包括K409R取代）中的Fc異二聚化。
Hu9.1-73-VL-CL（SEQ ID NO: 205）代表包含結合的BAFF-R的Hu9.1-73的輕鏈可變結構域（SEQ ID NO: 152）和輕鏈恒定結構域的Fab片段的輕鏈部分。
A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab（SEQ ID NO: 213）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接到Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc-Genmab中的Fc結構域包括K409R取代，用於與Hu9.1-73-VH-CH1-Fc-Genmab（包括F405L取代）中的Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的TriNKET的另一個實例係AB1424/1612-F3'。AB1424/1612-F3'包括 (a) 衍生自表2的AB1424/1612（具有用於雙硫鍵形成的半胱胺酸異二聚化突變）的結合BAFF-R的scFv序列，呈VH位於VL的N末端的取向，連接到Fc結構域以及(b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的Fab片段，包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接。AB1424/1612-F3'包括三種多肽：scFv-AB1424/1612-VL-VH-Fc（SEQ ID NO: 193）、A49MI-VH-CH1-Fc（SEQ ID NO: 194）和A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）。
scFv-AB1424/1612-VH-VL-Fc(SEQ ID NO: 270)（「鏈 S」）EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDASNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTHLRGQYIEDYGLDVWGQGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGCGTKVEIKGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
A49MI-VH-CH1-Fc（SEQ ID NO: 194）（「鏈 H」）EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSI SSSSSYIY YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR GAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）（「鏈L」）DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
scFv-AB1424/1612-VH-VL-Fc（SEQ ID NO: 270）代表藉由包含Ala-Ser的鉸鏈連接到Fc結構域的結合BAFF-R的scFv的完整序列。與scFv連接的Fc結構域包括用於異二聚化的Q347R、D399V和F405T取代以及用於與A49MI-VH-CH1-Fc中的Y349C取代形成二硫鍵的S354C取代，如下所述。scFv具有SEQ ID NO: 254的胺基酸序列，其包括AB1424/1612的重鏈可變結構域藉由(G 4S) 4連接子連接到AB1424/1612的輕鏈可變結構域的C末端。scFv包含VH和VL區域中在G44和G100處的半胱胺酸取代，促進在scFv的VH和VL之間形成雙硫鍵。
A49MI-VH-CH1-Fc（SEQ ID NO: 194）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 95）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc中的Fc結構域包括CH3結構域中的Y349C取代，它與scFv-AB1424/1612-VL-VH-Fc中Fc上的S354C取代形成二硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc結構域還包括K360E和K409W取代，用於與scFv- AB1424/1612-VL-VH-Fc中的Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL（SEQ ID NO: 195）代表Fab片段的輕鏈部分，包含結合NKG2D的A49MI（SEQ ID NO: 85）的輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。
本揭露中描述的TriNKET的另一個實例係AB1424/1612-F4。AB1424/1612-F4包括 (a) 兩個衍生自表2的AB1424/1612的結合BAFF-R的Fab片段，各自包括含有重鏈可變結構域和CH1結構域的重鏈部分，以及含有輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域的輕鏈部分，其中CH1結構域與Fc結構域連接；以及(b) 衍生自A49MI的結合NKG2D的scFv序列，連接到Fc結構域的C末端，呈VH位於VL的C末端的取向。AB1424/1612-F4包括四種多肽：第一多肽包含AB1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3-A49MI-scFv（SEQ ID NO: 271），第二多肽包含AB-1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3（SEQ ID NO: 272），以及第三和第四多肽，各自包含AB1424/1612-VL-CL（SEQ ID NO: 273）。
AB1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3-A49MI-scFv（SEQ ID NO: 271）（鏈「M」）EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDASNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTHLRGQYIEDYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKCLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS
AB-1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3（SEQ ID NO: 272）（鏈「H」）EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDASNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRFTHLRGQYIEDYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
AB1424/1612-VL-CL（SEQ ID NO: 273）（鏈「L」）EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
AB1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3-A49MI-scFv（SEQ ID NO: 271）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合BAFF-R的AB1424/1612（SEQ ID NO: 250）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域，進一步連接至scFv。scFv具有SEQ ID NO: 275的胺基酸序列，其包含結合NKG2D的A49MI的重鏈可變結構域（SEQ ID NO: 95），該重鏈可變結構域藉由(G 4S) 4連接子連接到A49MI的輕鏈可變結構域（SEQ ID NO: 85）的C末端。scFv還包含VH和VL區域中在G44和G100處的Cys取代，促進在scFv的VH和VL之間形成雙硫鍵。AB1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3-A49MI-scFv的scFv藉由短SGSGGGGS（SEQ ID NO: 274）連接子連接到CH3結構域的C末端。AB1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3-A49MI-scFv中的Fc結構域包括用於異二聚化的Q347R、D399V和F405T取代以及用於與AB-1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3中的Y349C取代形成二硫鍵的S354C，如下所述。
AB1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3（SEQ ID NO: 272）代表Fab片段的重鏈部分，它包含結合BAFF-R的AB1424/1612（SEQ ID NO: 250）的重鏈可變結構域和CH1結構域，連接至Fc結構域。A49MI-VH-CH1-Fc中的Fc結構域包括CH3結構域中的Y349C取代，它與AB1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3-A49MI-scFv中Fc上的S354C取代形成二硫鍵。在AB1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3中，Fc結構域還包括用於與AB1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3-A49MI-scFv中的Fc異二聚化的K360E和K409W取代。
AB1424/1612-VL-CL（SEQ ID NO: 273）代表包含結合的BAFF-R的AB1424/1612的輕鏈可變結構域（SEQ ID NO: 251）和輕鏈恒定結構域的Fab片段的輕鏈部分。
在某些實施方式中，本揭露描述的F3' TriNKET與上述示例性TriNKET之一相同，除了 (a) 與結合NKG2D的Fab片段連接的Fc結構域包括CH3結構域中用於異二聚化的Q347R、D399V和F405T取代，以及與結合BAFF-R的scFv連接的Fc結構域包括CH3結構域中匹配的K360E和K409W取代；和/或 (b) 與結合NKG2D的Fab片段連接的Fc結構域包括CH3結構域中的S354C取代，以及與結合BAFF-R的scFv連接的Fc結構域在CH3結構域中包括匹配的Y349C取代，用於形成二硫鍵。
在某些實施方式中，本揭露描述的2-Fab TriNKET與上述示例性TriNKET之一相同，除了與結合NKG2D的Fab片段連接的Fc結構域在CH3結構域中包括用於異二聚化的F405L取代，以及與結合BAFF-R的Fab片段連接的Fc結構域在CH3結構域中包括匹配的K409R取代。
熟悉該項技術者將理解，在蛋白的生產和/或儲存過程中，N末端麩胺酸（E）或麩醯胺（Q）可以環化形成內醯胺（例如在生產和/或儲存過程中自發地或藉由存在的酶催化）。因此，在多肽的胺基酸序列的N末端殘基係E或Q的一些實施方式中，E或Q被焦麩胺酸取代的相應胺基酸序列也在本文中被考慮。
熟悉該項技術者還將理解，在蛋白的生產和/或儲存過程中，蛋白質的C末端離胺酸（K）可以被去除（例如在生產和/或儲存過程中自發地或藉由存在的酶催化）。對於在其C末端包含Fc結構域的蛋白質，經常觀察到這種K的去除。因此，在多肽的胺基酸序列（例如，Fc結構域序列）的C末端殘基為K的一些實施方式中，本文還考慮去除了K的相應胺基酸序列。
上述多特異性蛋白可以使用熟悉該項技術者熟知的重組DNA技術製備。例如，可以將編碼第一免疫球蛋白重鏈的第一核酸序列選殖到第一表現載體中；可將編碼第二免疫球蛋白重鏈的第二核酸序列選殖到第二表現載體中；可以將編碼免疫球蛋白輕鏈的第三核酸序列選殖到第三表現載體中；並且將第一、第二和第三表現載體一起穩定轉染到宿主細胞中以產生集合體蛋白。
為了實現多特異性蛋白的最高產量，可以探索第一、第二和第三表現載體的不同比例以確定轉染到宿主細胞中的最佳比例。轉染後，可以使用本領域已知的方法，例如有限稀釋、ELISA、FACS、顯微鏡檢查或Clonepix，分離單殖株用於細胞庫生成。
可以在適合生物反應器擴大和維持多特異性蛋白表現的條件下培養殖株。可以使用本領域已知的方法分離和純化多特異性蛋白，包括離心、深度過濾、細胞裂解、均質化、凍融、親和純化、凝膠過濾、離子交換層析、疏水相互作用交換層析和混合模式層析。 II. 多特異性蛋白的特徵
本文所述之多特異性蛋白包括NKG2D結合位點、BAFF-R結合位點和足以結合CD16的抗體Fc結構域或其部分，或結合CD16的抗原結合位點。在一些實施方式中，多特異性蛋白含有結合BAFF-R的另外抗原結合位點，如F4-TriNKET形式中所示例的（例如，圖2C和2D）。
在一些實施方式中，多特異性蛋白表現出與相應單株抗體（即含有與摻入多特異性蛋白中的BAFF-R結合位點相同的BAFF-R結合位點的單株抗體）相似的熱穩定性。
在一些實施方式中，多特異性蛋白同時結合表現NKG2D和/或CD16的細胞，例如NK細胞，以及表現BAFF-R的細胞，例如某些腫瘤細胞。多特異性蛋白與NK細胞的結合可以增強NK細胞破壞表現BAFF-R的細胞（例如，表現BAFF-R的腫瘤細胞）的活性。據報導，NK細胞對受應激的靶細胞表現出更強的細胞毒性（參見Chan等人, (2014) Cell Death Differ.[細胞死亡與分化] 21(1):5-14）。不希望受理論的束縛，假設當NK細胞藉由TriNKET與細胞群接合時，NK細胞可以選擇性地殺傷受應激的靶細胞（例如，惡性細胞和腫瘤微環境中的細胞）。這種機制可能有助於提高TriNKET的特異性和降低毒性，從而有可能選擇性地清除受應激的細胞，即使BAFF-R的表現不限於所期望的靶細胞。
在一些實施方式中，多特異性蛋白以與對應的抗BAFF-R單株抗體（即含有與摻入多特異性蛋白中的BAFF-R結合位點相同的BAFF-R結合位點的單株抗體）相似的親和力結合BAFF-R。在一些實施方式中，多特異性蛋白比相應的單株抗體更有效地殺傷表現BAFF-R的腫瘤細胞。
在某些實施方式中，本文所述之包括BAFF-R結合位點的多特異性蛋白在與表現BAFF-R的細胞共培養時活化原代人NK細胞。NK細胞活化的標誌係CD107a脫顆粒和IFN-γ細胞介素產生的增加。此外，與相應的抗BAFF-R單株抗體相比，多特異性蛋白可以在表現BAFF-R的細胞存在的情況下表現出對人NK細胞的卓越活化。
在一些實施方式中，本文所述之包括BAFF-R結合位點的多特異性蛋白在與表現BAFF-R的細胞共培養時增強靜止的和IL-2活化的人NK細胞的活性。
在一些實施方式中，與結合BAFF-R的相應單株抗體相比，多特異性蛋白在靶向表現中等和低水平BAFF-R的腫瘤細胞方面具有優勢。
在一些實施方式中，TriNKET的二價F4形式（即TriNKET包括另外的結合BAFF-R的抗原結合位點）提高了TriNKET結合BAFF-R的親合力，這實際上穩定了腫瘤細胞表面BAFF-R的表現並維持其高水平。在一些實施方式中，F4-TriNKET比相應的F3-TriNKET或F3'-TriNKET介導更有效的腫瘤細胞殺傷。 III. 治療應用
本申請還描述了使用本文所述之多特異性結合蛋白和/或本文所述之藥物組成物治療自體免疫性疾病或癌症的方法。該方法可用於治療多種表現BAFF-R的癌症或自體免疫性疾病。
治療方法可以根據待治療的癌症來表徵。待治療的癌症可以根據在癌細胞表面表現的特定抗原 ，例如BAFF-R的存在來表徵。
以表現BAFF-R為特徵的癌症包括但不限於B細胞非何杰金氏淋巴瘤（B-NHL）、例如慢性淋巴球白血病（CLL）、套細胞淋巴瘤（MCL）、濾泡性淋巴瘤（FL）、彌漫性大B-細胞淋巴瘤（DLBCL）、緣帶淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織（MALT）淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、急性淋巴球白血病（ALL）；和自體免疫性炎性疾病。
預期本揭露中描述的蛋白、軛合物、細胞和/或藥物組成物可用於治療多種癌症，不限於其中癌細胞或癌症微環境中的細胞表現BAFF-R的癌症。
在某些實施方式中，癌症係實性瘤。在某些其他實施方式中，癌症係腦癌、膀胱癌、乳癌、宮頸癌、大腸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、胃癌、睪丸癌或子宮癌。在仍其他實施方式中，癌症係血管化腫瘤、鱗狀細胞癌、腺癌、小細胞癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、成神經細胞瘤、肉瘤（例如，血管肉瘤或軟骨肉瘤）、喉癌、腮腺癌、膽道癌、甲狀腺癌、肢端小痣性黑色素瘤、光化性角化病、急性淋巴球白血病、急性髓性白血病、腺樣囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鱗癌、肛管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星形細胞瘤、前庭大腺癌、基底細胞癌、膽管癌、骨癌、骨髓癌、支氣管癌、支氣管腺癌、類癌、膽管癌、軟骨肉瘤、脈絡叢乳頭狀瘤/癌、慢性淋巴球性白血病、慢性髓性白血病、透明細胞癌、結締組織癌、囊腺瘤、消化系統癌症、十二指腸癌、內分泌系統癌、內胚竇瘤、子宮內膜增生、子宮內膜基質肉瘤、子宮內膜樣腺癌、內皮細胞癌、室管膜癌、上皮細胞癌、尤因氏肉瘤（Ewing's sarcoma）、眼睛和眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性結節性增生、膽囊癌、胃竇癌、胃底癌、胃泌素瘤、膠質母細胞瘤、升糖素瘤、心臟癌、血管母細胞瘤、血管內皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝膽癌、肝細胞癌、霍奇金病、回腸癌、胰島瘤、上皮內瘤變、上皮內鱗狀細胞瘤變、肝內膽管癌、浸潤性鱗狀細胞癌、空腸癌、關節癌、卡波西氏肉瘤、盆腔癌、大細胞癌、大腸癌、平滑肌肉瘤、惡性雀斑樣痣黑色素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、惡性黑色素瘤、惡性間皮腫瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、腦膜癌、間皮癌、轉移癌、口腔癌、黏液表皮樣癌、多發性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神經系統癌症、神經上皮腺癌結節性黑色素瘤、非上皮性皮膚癌、非何杰金氏淋巴瘤、燕麥細胞癌、少突膠質細胞癌、口腔癌、骨肉瘤、乳頭狀漿液性腺癌、陰莖癌、咽癌、垂體瘤、漿細胞瘤、假肉瘤、肺母細胞瘤、直腸癌、腎細胞癌、呼吸系統癌症、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、漿液性癌、竇癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑肌癌、軟組織癌、分泌生長抑素的腫瘤、脊柱癌、鱗狀細胞癌、橫紋肌癌、皮下癌、淺表擴散性黑色素瘤、T細胞白血病、舌癌、未分化癌、輸尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿系統癌、子宮頸癌、子宮體癌、葡萄膜黑色素瘤、陰道癌、疣狀癌、VIP瘤、外陰癌、高分化癌、或威爾姆斯瘤（Wilms tumor）。
在某些實施方式中，癌症係血液惡性腫瘤。在某些實施方式中，血液惡性腫瘤係白血病。在某些實施方式中，選自急性髓性白血病（AML）、急性淋巴球白血病（ALL）、骨髓增生異常、骨髓發育不良症候群、急性T淋巴球白血病或急性前骨髓細胞白血病、慢性骨髓單核球白血病或慢性髓性白血病的髓性母細胞危象。
在一些實施方式中，本申請提供了使用本文所述之多特異性結合蛋白和/或本文所述之藥物組成物治療自體免疫性炎性疾病的方法。方法可用於治療多種表現BAFF-R的B細胞相關性自體免疫性炎性疾病，包括但不限於多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡、格雷夫斯氏病（Graves’ disease）、橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis）、類風濕性關節炎、炎性腸病、I型糖尿病、格林-巴厘綜合症（Guillain-Barre syndrome）、慢性發炎去髓鞘型多發性神經病變、牛皮癬、重症肌無力和血管炎。 IV. 組合療法
本申請的另一個方面提供組合療法。本文所述之多特異性結合蛋白可以與另外的治療劑組合使用以治療自體免疫性疾病或治療癌症。
可用作治療自體免疫性炎性疾病的組合療法的一部分的示例性治療劑在Li等人 (2017) Front. Pharmacol.[免疫學前沿], 8:460中描述，並包括例如非類固醇型消炎藥物（NSAID）（例如，COX-2抑制劑）、糖皮質激素（例如,潑尼松/潑尼松龍、甲基潑尼松龍（methylprednisolone）、和含氟糖皮質激素，如迪皮質醇和貝皮質醇）、改善疾病的抗風濕藥（DMARD）（例如，胺甲喋呤、來氟米特（leflunomide）、金化合物、柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine）、硫唑嘌呤（azathioprine）、環磷醯胺、抗瘧疾藥、D-青黴胺、和環孢素）、抗TNF生物製劑（例如，英利昔單抗（infliximab）、依那西普（etanercept）、阿達木單抗（adalimumab）、戈利木單抗（golimumab）、培戈-瑟托利珠單抗（Certolizumab pegol）、和他們的生物仿製藥）、和其他靶向CTLA-4的生物製劑（例如，阿巴西普（abatacept））、IL-6受體（例如，托珠單抗）、IL-1（例如，阿那白滯素）、Th1免疫反應（IL-12/IL-23）（例如，優特吉努單抗）、Th17免疫響應（IL-17）（例如，蘇金單抗）和CD20（例如，利妥昔單抗）。
可用作治療癌症的組合療法的一部分的示例性治療劑包括例如放射、絲裂黴素、維生素A酸、ribomustin、吉西他濱、長春新鹼、依託泊苷、克拉屈濱（cladribine）、二溴甘露醇、胺甲喋呤、多柔比星、卡波醌、噴司他丁（pentostatin）、硝基胺（nitracrine）、淨司他丁、西曲瑞克、利妥唑、雷替曲塞、道諾黴素（daunorubicin）、法倔唑、福莫司汀、胸腺法新（thymalfasin）、索布佐生、奈達鉑、阿糖胞苷、比卡魯胺（bicalutamide）、長春瑞濱（vinorelbine）、維司力農（vesnarinone）、胺麩精（aminoglutethimide）、安吖啶、丙麩胺、依利醋銨（elliptinium acetate）、酮色林、去氧氟尿苷、依曲替酯、異維生素A酸（isotretinoin）、鏈脲佐菌素、尼妥珠單抗、長春地辛、氟他胺（flutamide）、氟他胺（drogenil）、butocin、卡莫氟、丙亞胺（razoxane）、sizofilan、卡鉑、二溴衛矛醇、替加氟、異環磷醯胺、潑尼氮芥、沙培林、左旋咪唑、替尼泊苷（teniposide）、英丙舒凡、依諾他濱、麥角乙脲、氧甲磺隆、它莫西芬（tamoxifen）、黃體酮、美雄烷、環硫雄醇、福美司坦、干擾素-α、干擾素-2α、干擾素-β、干擾素-γ（IFN-γ）、群落刺激因子-1、群落刺激因子-2、地托-迪尼白介素、白介素-2、黃體促素釋放因子和上述藥劑的變體（其可能表現出與其同源受體的不同結合，或增加或減少血清半衰期）。
可用作治療癌症的組合療法的一部分的另一類藥劑係免疫檢查點抑制劑。示例性免疫檢查點抑制劑包括抑制以下中之一或多種的藥劑：(i) 細胞毒性T淋巴球相關抗原4（CTLA4），(ii) 計畫性細胞死亡蛋白1（PD1），(iii) PDL1，(iv) LAG3，(v) B7-H3，(vi) B7-H4，和 (vii) TIM3。CTLA4抑制劑伊匹單抗（ipilimumab）已被美國食品和藥物管理局批准用於治療黑色素瘤。
可用作治療癌症的組合療法的一部分的其他藥劑係靶向非檢查點靶標的單株抗體藥劑（例如，赫賽汀）和非細胞毒性藥劑（例如，酪胺酸激酶抑制劑）。
再其他類別的抗癌藥劑包括，例如：(i) 選自以下的抑制劑：ALK抑制劑、ATR抑制劑、A2A拮抗劑、鹼基切除修復抑制劑、Bcr-Abl酪胺酸激酶抑制劑、布魯頓酪胺酸激酶抑制劑、CDC7抑制劑、CHK1抑制劑、細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑、DNA-PK抑制劑、DNA-PK和mTOR兩者的抑制劑、DNMT1抑制劑、DNMT1抑制劑加2-氯-去氧腺苷、HDAC抑制劑、Hedgehog傳訊通路抑制劑、IDO抑制劑、JAK抑制劑、mTOR抑制劑、MEK抑制劑、MELK抑制劑、MTH1抑制劑、PARP抑制劑、磷酸肌醇3-激酶抑制劑、PARP1和DHODH兩者的抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓撲異構酶-II抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、VEGFR抑制劑、和WEE1抑制劑；(ii) OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS的促效劑；和 (iii) 選自IL-12、IL-15、GM-CSF和G-CSF的細胞介素。
本申請的蛋白也可以用作手術切除原發性病灶的輔助手段。
可以選擇多特異性結合蛋白和另外的治療劑的量，和投與的相對時間，以實現期望的組合治療效果。例如，當向需要這種投與的患者投與組合療法時，組合中的治療劑、或包含治療劑的一或多種藥物組成物可以以任何順序投與，例如依次、並行、一起、同時等。此外，例如，多特異性結合蛋白可以在另外的一或多種治療劑發揮其預防或治療作用時的期間投與，或反之亦然。 V. 藥物組成物
本揭露還描述了包含治療有效量的本文所述蛋白的藥物組成物。可以配製組成物用於多種藥物遞送系統。一或多種生理上可接受的賦形劑或載劑也可以包含在組成物中以用於適當的配製。在Remington's Pharmaceutical Sciences [雷明頓製藥科學], Mack Publishing Company（麥克出版公司）, Philadelphia, Pa.（費城,賓夕凡尼亞州）, 第17版, 1985中找到適用於本揭露之配製物。有關藥物遞送方法的簡要回顧，參見例如，Langer（Science [科學] 249:1527-1533, 1990）。
本申請中描述的靜脈內藥物遞送配製物可以包含在袋、筆或注射器中。在某些實施方式中，袋可以連接到包括管和/或針的通道。在某些實施方式中，配製物可為冷凍乾燥配製物或液體配製物。在某些實施方式中，配製物可以被冷冷凍乾燥燥（冷凍乾燥）並包含在約12-60個小瓶中。在某些實施方式中，配製物可以被冷凍乾燥並且45 mg的冷凍乾燥配製物可以包含在一個小瓶中。在某些實施方式中，約40 mg至約100 mg的冷凍乾燥配製物可包含在一個小瓶中。在某些實施方式中，合併來自12、27或45個小瓶的冷凍乾燥配製物以獲得靜脈內藥物配製物中的治療劑量的蛋白。在某些實施方式中，配製物可為液體配製物並且以約250 mg/瓶至約1000 mg/瓶儲存。在某些實施方式中，配製物可為液體配製物並且以約600 mg/小瓶儲存。在某些實施方式中，配製物可為液體配製物並且以約250 mg/小瓶儲存。
蛋白可以存在於液體水性藥物配製物中，該液體水性藥物配製物包括在形成配製物的緩衝溶液中的治療有效量的蛋白。
該等組成物可藉由常規滅菌技術滅菌，或可無菌過濾。所得水性溶液可以包裝用於原樣使用或冷凍乾燥使用，將冷凍乾燥的製劑在投與前與無菌水性載劑組合。製劑的pH通常介於3和11之間，例如介於5和9之間或介於6和8之間，並且在某些實施方式中，介於7和8之間，例如7至7.5。所得固體形式的組成物可以包裝在多個單劑量單位中，每個單位含有固定量的上述一或多種藥劑。固體形式的組成物也可以包裝在容器中以獲得靈活的數量。
在某些實施方式中，本申請描述了具有延長儲存壽命的製劑，其包含如本文所述之多特異性結合蛋白，以及甘露醇、檸檬酸一水合物、檸檬酸鈉、磷酸二鈉二水合物、磷酸二氫鈉二水合物、氯化鈉、聚山梨醇酯80、水和氫氧化鈉。
在某些實施方式中，製備包含在pH緩衝溶液中的本揭露之蛋白的水性配製物。配製物的緩衝液可具有約4至約8的pH，例如，約4.5至約6.0，或約4.8至約5.5，或可具有約5.0至約5.2的pH。上述pH值的中間範圍也旨在成為本揭露之一部分。例如，旨在包括使用任何上述值的組合作為上限和/或下限的值範圍。控制pH在該範圍內的緩衝液的實例包括乙酸鹽（例如乙酸鈉）、琥珀酸鹽（例如琥珀酸鈉）、葡萄糖酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽和其他有機酸緩衝液。
在某些實施方式中，配製物包括緩衝系統，其含有檸檬酸鹽和磷酸鹽以將pH維持在約4至約8的範圍內。在某些實施方式中，pH範圍可為約4.5至約6.0，或約pH 4.8至約5.5，或約5.0至約5.2的pH範圍。在某些實施方式中，緩衝系統包括檸檬酸一水合物、檸檬酸鈉、磷酸二鈉二水合物和/或磷酸二氫鈉二水合物。在某些實施方式中，緩衝系統包括約1.3 mg/mL的檸檬酸（例如，1.305 mg/mL）、約0.3 mg/mL的檸檬酸鈉（例如，0.305 mg /mL）、約1.5 mg/mL磷酸二鈉二水合物（例如，1.53 mg/mL）、約0.9 mg/mL磷酸二氫鈉二水合物（例如，0.86 mg/mL），以及約6.2 mg/mL的氯化鈉（例如，6.165 mg/mL）。在某些實施方式中，緩衝系統包括約1至約1.5 mg/mL的檸檬酸、約0.25至約0.5 mg/mL的檸檬酸鈉、約1.25至約1.75 mg/mL的磷酸二鈉二水合物、約0.7至約1.1 mg/mL磷酸二氫鈉二水合物，和約6.0至約6.4 mg/mL氯化鈉。在某些實施方式中，配製物的pH用氫氧化鈉調節。
作為張度調節劑並可穩定抗體的多元醇也可包含在配製物中。多元醇以可根據配製物的所期望等滲性而變化的量添加到配製物中。在某些實施方式中，水性配製物可為等滲的。添加的多元醇的量也可以相對於該多元醇的分子量而改變。例如，與二糖（例如海藻糖）相比，可以添加較低量的單糖（例如甘露醇）。在某些實施方式中，可在配製物中用作張度劑的多元醇係甘露醇。在某些實施方式中，甘露醇濃度可為約5至約20 mg/mL。在某些實施方式中，甘露醇的濃度可為約7.5至約15 mg/mL。在某些實施方式中，甘露醇的濃度可為約10至約14 mg/mL。在某些實施方式中，甘露醇的濃度可為約12 mg/mL。在某些實施方式中，多元醇山梨糖醇可包含在配製物中。
也可以將去垢劑或界面活性劑添加到配製物中。示例性去垢劑包括非離子去垢劑，例如聚山梨醇酯（例如，聚山梨醇酯20、80等）或泊洛沙姆（例如，泊洛沙姆188）。添加的去垢劑的量使得它減少配製的抗體的聚集和/或最小化配製物中微粒的形成和/或減少吸附。在某些實施方式中，配製物可以包括界面活性劑，其係聚山梨醇酯。在某些實施方式中，配製物可含有去垢劑聚山梨醇酯80或吐溫80。吐溫80係用於描述聚氧乙烯（20）山梨糖醇酐單油酸酯的術語（參見Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf,第4版, 1996）。在某些實施方式中，配製物可含有約0.1 mg/mL至約10 mg/mL的聚山梨醇酯80，或約0.5 mg/mL至約5 mg/mL。在某些實施方式中，可以在配製物中添加約0.1%的聚山梨醇酯80。
在實施方式中，如本申請中所述之多特異性結合蛋白被配製為液體配製物。液體配製物可以10 mg/mL的濃度存在於USP/Ph Eur I型50R小瓶中，小瓶用橡皮塞封閉並用鋁卷邊密封蓋密封。塞可以由符合USP和Ph Eur的彈性體製成。在某些實施方式中，小瓶可以填充有61.2 mL的蛋白產品溶液以允許60 mL的可提取體積。在某些實施方式中，液體配製物可以用0.9%鹽水溶液稀釋。
在某些實施方式中，如本申請中所述之液體配製物可以與處於穩定水平的糖組合製備為10 mg/mL濃度的溶液。在某些實施方式中，液體配製物可以在水性載劑中製備。在某些實施方式中，穩定劑的添加量可以不大於可能導致不希望或不適合靜脈內投與的黏度的量。在某些實施方式中，糖可為二糖，例如，蔗糖。在某些實施方式中，液體配製物還可包括一或多種緩衝劑、界面活性劑和防腐劑。
在某些實施方式中，液體配製物的pH可藉由添加藥學上可接受的酸和/或鹼來設定。在某些實施方式中，藥學上可接受的酸可為鹽酸。在某些實施方式中，鹼可為氫氧化鈉。
除聚集外，脫醯胺係肽和蛋白的常見產品變體，可能發生在發酵、收穫/細胞澄清、純化、原料藥/藥物產品儲存和樣本分析過程中。脫醯胺係蛋白中NH 3的損失，形成可以進行水解的琥珀醯亞胺中間體。琥珀醯亞胺中間體導致母體肽質量減少17道爾頓。隨後的水解導致18道爾頓的質量增加。由於在水性條件下不穩定，琥珀醯亞胺中間體的分離很困難。因此，脫醯胺通常可檢測為1道爾頓質量增加。天冬醯胺的脫醯胺作用產生天冬胺酸或異天冬胺酸。影響脫醯胺速率的參數包括pH、溫度、溶劑介電常數、離子強度、一級序列、局部多肽構象和三級結構。肽鏈中與Asn相鄰的胺基酸殘基影響脫醯胺速率。蛋白序列中Asn之後的Gly和Ser導致對脫醯胺的敏感性更高。
在某些實施方式中，如本申請中所述之液體配製物可以在pH和濕度條件下保存以防止蛋白產品脫醯胺。
本文中的目的水性載劑係藥學上可接受的（對人投與安全且無毒）並且可用於製備液體配製物。示例性載劑包括無菌注射用水（SWFI）、抑菌注射用水（BWFI）、pH緩衝溶液（例如，磷酸鹽緩衝液）、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。
可以視需要地將防腐劑添加到本文所述之配製物中以減少細菌作用。添加防腐劑可以例如促進多用途（多劑量）配製物的生產。
靜脈內（IV）配製物在特定情況下可為投與途徑，例如當患者在移植後住院時藉由IV途徑接受所有藥物。在某些實施方式中，液體配製物在投與前用0.9%氯化鈉溶液稀釋。在某些實施方式中，用於注射的稀釋藥物產品係等滲的並且適合藉由靜脈內輸注投與。
在某些實施方式中，可以以10 mM-200 mM的量添加鹽或緩衝液組分。鹽和/或緩衝液係藥學上可接受的，並且衍生自各種已知的酸（無機和有機）與「鹼形成」金屬或胺。在某些實施方式中，緩衝液可為磷酸鹽緩衝液。在某些實施方式中，緩衝液可為甘胺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩衝液，在這種情況下，鈉、鉀或銨離子可以用作抗衡離子。
本申請中描述的多特異性結合蛋白可以存在於包括蛋白和冷凍乾燥保護劑的冷凍乾燥配製物中。冷凍乾燥保護劑可為糖，例如，二糖。在某些實施方式中，冷凍乾燥保護劑可為蔗糖或麥芽糖。冷凍乾燥配製物還可包含一或多種緩衝劑、界面活性劑、填充劑和/或防腐劑。
用於穩定冷凍乾燥藥物產品的蔗糖或麥芽糖的量可為蛋白比蔗糖或麥芽糖的至少1 : 2重量比。在某些實施方式中，蛋白比蔗糖或麥芽糖的重量比可為1 : 2至1 : 5。
在某些實施方式中，在冷凍乾燥之前配製物的pH可以藉由添加藥學上可接受的酸和/或鹼來設定。在某些實施方式中，藥學上可接受的酸可為鹽酸。在某些實施方式中，藥學上可接受的鹼可為氫氧化鈉。
在冷凍乾燥之前，可以將包含本揭露之蛋白的溶液的pH在6至8之間調節。在某些實施方式中，冷凍乾燥藥物產品的pH範圍可為7至8。
在某些實施方式中，可以以10 mM-200 mM的量添加鹽或緩衝液組分。鹽和/或緩衝液係藥學上可接受的，並且衍生自各種已知的酸（無機和有機）與「鹼形成」金屬或胺。在某些實施方式中，緩衝液可為磷酸鹽緩衝液。在某些實施方式中，緩衝液可為甘胺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩衝液，在這種情況下，鈉、鉀或銨離子可以用作抗衡離子。
在某些實施方式中，可以添加「填充劑」。「填充劑」係向冷凍乾燥混合物增加質量並有助於冷凍乾燥餅的物理結構的化合物（例如，有助於生產保持開孔結構的基本均勻的冷凍乾燥餅）。示例性填充劑包括甘露醇、甘胺酸、聚乙二醇和山梨糖醇。本申請中描述的多特異性結合蛋白的冷凍乾燥配製物可包含此類填充劑。
可以視需要地將防腐劑添加到本文的配製物中以減少細菌作用。添加防腐劑可以例如促進多用途（多劑量）配製物的生產。
在某些實施方式中，冷凍乾燥藥物產品可以由水性載劑構成。本文中的目的水性載劑係藥學上可接受的（例如，對人投與安全且無毒）並且在冷凍乾燥後可用於製備液體配製物。示例性稀釋劑包括無菌注射用水（SWFI）、抑菌注射用水（BWFI）、pH緩衝溶液（例如，磷酸鹽緩衝液）、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。
在某些實施方式中，冷凍乾燥藥物產品用無菌注射用水USP（SWFI）或0.9%氯化鈉注射液USP重構。在重構過程中，冷凍乾燥粉末溶解成溶液。
在某些實施方式中，冷凍乾燥蛋白產品重構成約4.5 mL注射用水並用0.9%鹽水溶液（氯化鈉溶液）稀釋。
本申請中描述的多特異性結合蛋白的藥物組成物中活性成分的實際劑量水平可以變化，以獲得有效實現特定患者、組成物以及給藥方式的所需治療響應的活性成分的量，並且對患者無毒性。
具體劑量可為每個患者的統一劑量，例如50-5000 mg蛋白。可替代地，患者的劑量可以根據患者的大致體重或表面積進行調整。確定合適劑量的其他因素可包括待治療或預防的疾病或病症、疾病的嚴重程度、投與途徑以及患者的年齡、性別和醫學病症。確定合適的治療劑量所需的計算的進一步細化由熟悉該項技術者常規地進行，尤其是根據本文公開的劑量資訊和測定。劑量也可以藉由使用已知的用以確定劑量的測定結合適當的劑量-響應數據來確定。當監測疾病的進展時，可以調整個體患者的劑量。可測量患者體內可靶向構建體或複合物的血液水平，以確定是否需要調整劑量以達到或維持有效濃度。藥物基因組學可用於確定哪些可靶向構建體和/或複合物及其劑量最有可能對特定個體有效（Schmitz等人, Clinica Chimica Acta[臨床化學學報] 308: 43-53, 2001；Steimer等人, Clinica Chimica Acta[臨床化學學報] 308: 33-41, 2001）。
總體上，基於體重的劑量係約0.01 μg至約100 mg/kg體重，例如約0.01 μg至約100 mg/kg體重、約0.01 μg至約50 mg/kg體重、約0.01 μg至約10 mg/kg體重、約0.01 μg至約1 mg/kg體重、約0.01 μg至約100 μg/kg體重、約0.01 μg至約50 μg/kg體重、約0.01 μg至約10 μg/kg體重、約0.01 μg至約1 μg/kg體重、約0.01 μg至約0.1 μg/kg體重、約0.1 μg至約100 mg/kg體重、約0.1 μg至約50 mg/kg體重、約0.1 μg至約10 mg/kg體重、約0.1 μg至約1 mg/kg體重、約0.1 μg至約100 μg/kg體重、約0.1 μg至約10 μg/kg體重、約0.1 μg至約1 μg/kg體重、約1 μg至約100 mg/kg體重、約1 μg至約50 mg/kg體重、約1 μg至約10 mg/kg體重、約1 μg至約1 mg/kg體重、約1 μg至約100 μg/kg體重、約1 μg至約50 μg/kg體重、約1 μg至約10 μg/kg體重、約10 μg至約100 mg/kg體重、約10 μg至約50 mg/kg體重、約10 μg至約10 mg/kg體重、約10 μg至約1 mg/kg體重、約10 μg至約100 μg/kg體重、約10 μg至約50 μg/kg體重、約50 μg至約100 mg/kg體重、約50 μg至約50 mg/kg體重、約50 μg至約10 mg/kg體重、約50 μg至約1 mg/kg體重、約50 μg至約100 μg/kg體重、約100 μg至約100 mg/kg體重、約100 μg至約50 mg/kg體重、約100 μg至約10 mg/kg體重、約100 μg至約1 mg/kg體重、約1 mg至約100 mg/kg體重、約1 mg至約50 mg/kg體重、約1 mg至約10 mg/kg體重、約10 mg至約100 mg/kg體重、約10 mg至約50 mg/kg體重、約50 mg至約100 mg/kg體重。
劑量可以每天、每週、每月或每年給予一次或多次，甚至每2至20年給予一次。熟悉該項技術者可以基於測量的停留時間和可靶向構建體或複合物在體液或組織中的濃度容易地估計給藥的重複率。本申請中描述的多特異性結合蛋白的投與可為靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、胸膜內、鞘內、腔內，藉由導管灌注或藉由直接病灶內注射。這可以每天一次或多次，每週一次或多次，每月一次或多次，每年一次或多次投與。
上面的描述提供了本申請中描述的多特異性結合蛋白的多個方面和實施方式。本申請確切地考慮了該等方面和實施方式的所有組合和排列。本文中使用任何和所有實例或示例性語言，例如「例如」或「包括」，僅旨在更好地說明本申請中描述的多特異性結合蛋白，並且不對本揭露之範圍構成限制，除非明確聲明。說明書中之任何語言都不應被解釋為表明任何未要求保護的要素對於本申請中描述的多特異性結合蛋白的實踐係必不可少的。 實例
以下實例僅是示例性的，並不旨在以任何方式限制本申請中描述的多特異性結合蛋白的範圍或內容。 實例 1 - TriNKET 與細胞表現的人 BAFF-R 結合的評估
BAFF-R陽性人B淋巴母細胞RAJI細胞系用於評估TriNKET與細胞表面BAFF-R的結合。如上文「示例性多特異性結合蛋白」小節所述，2-Fab和F3'形式的某些BAFF-R TriNKET被稀釋並與Raji細胞一起孵育。使用螢光團偶合的抗人IgG二抗檢測TriNKET和親代單株抗體的結合模式。然後將細胞與螢光團偶合的抗人IgG二抗一起孵育，並藉由流動式細胞分析術進行分析。將平均螢光強度（MFI）值歸一化為僅二抗對照以獲得相比於背景值的倍數（FOB）。
如 圖 18A-C所示，含有衍生自hCOH-2（ 圖 18A）、Hu9.1-73（ 圖 18B）以及基於伊利尤單抗的抗原結合位點（三個版本，F3'、2-Fab和伊利尤單抗mAb，不包含商用伊利尤單抗抗體中存在的抗體依賴性細胞毒性增強突變）（ 圖 18C）的BAFF-R結合位點的BAFF-R TriNKET以亞奈米莫耳濃度且以與相應的親代對照抗體（其不包含在伊利尤單抗中使用的ADCC增強突變）相似或更高的最大MFI結合。該等TriNKET結合BAFF-R的EC 50值顯示在 表 11中。用第二BAFF-R陽性細胞系Ramos獲得了類似的結果（數據未顯示）。 [ 表 11] .使用RAJI細胞的BAFF-R結合測定中的EC 50值
測試品 * EC50 （ nM ）
伊利尤單抗-F3’ 0.361
伊利尤單抗-2-Fab 0.115
伊利尤單抗-mAb 0.003
  
Hu9.1-73-F3’ 0.765
Hu9.1-73-2-Fab 1.054
Hu9.1-73-mAb 0.379
  
hCOH-2-F3’ 0.893
hCOH-2-2-Fab 0.942
hCOH-2-mAb 0.043
*伊利尤單抗構建體不包括商用伊利尤單抗抗體中存在的抗體依賴性細胞毒性增強突變。 實例 2 - 人 NK 細胞細胞毒性測定
藉由DELFIA細胞毒性測定法測量在存在TriNKET的情況下免疫效應細胞對表現BAFF-R的靶細胞的裂解。簡而言之，從培養物中收穫表現BAFF-R的人癌細胞系RAJI，用HBS洗滌，並以10 6/mL重懸於生長培養基中，用於用BATDA試劑（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer）AD0116）標記。遵循製造商說明來標記靶細胞。標記後，用HBS洗滌細胞3次，並以0.5-1.0 x 10 5/mL重懸於培養基中。向96孔板的每個孔中添加100 µl經BATDA標記的細胞。將針對BAFF-R的單株抗體或TriNKET在培養基中稀釋，並將50 µl的稀釋的mAb或TriNKET添加到每個孔中。
為了製備NK細胞，使用密度梯度離心法從人周圍血膚色血球層中分離出PBMC，洗滌並準備用於NK細胞分離。將NK細胞使用負選擇技術與磁珠分離。分離的NK細胞的純度通常 ＞ 90% CD3 -CD56 +。將分離的NK細胞靜置過夜並從培養物中收穫。然後將細胞洗滌並以10 5-2.0 x 10 6/mL的濃度重懸於培養基中，效應細胞與靶細胞（E : T）的比例為5 : 1。將50 µl NK細胞加入板的每個孔中，總培養體積為200 µl。將板在37°C和5% CO 2孵育2-3小時。
孵育後，將板從培養箱中取出，並藉由以200x g離心5分鐘沈澱細胞。將20 µl培養物上清液轉移到乾淨的微孔板中，並將200 µl室溫銪溶液（珀金埃爾默公司C135-100）加入每個孔中。將板避光並在板振盪器上以250 rpm孵育15分鐘，然後使用SpectraMax i3X儀器讀取。
在沒有NK細胞的情況下培養的靶細胞中測量了可與銪形成螢光螯合物的物質的自發釋放。這種物質的最大釋放係在用1% Triton-X裂解的靶細胞中測量的。%特異性裂解計算如下： %特異性裂解 = ((實驗釋放 - 自發釋放)/ (最大釋放-自發釋放))× 100%。
圖 19A-19C顯示在以下的存在下原代NK細胞對BAFF-R陽性RAJI細胞的NK細胞介導的裂解：衍生自hCOH-2（ 圖 19A）、Genentech Hu9.1-73（ 圖 19B）以及基於伊利尤單抗的抗原結合位點（三個版本，F3'、2-Fab和伊利尤單抗mAb，不包含商用伊利尤單抗抗體中存在的抗體依賴性細胞毒性增強突變）（ 圖 19C）的靶向BAFF-R的TriNKET。親代BAFF-R靶向單株抗體幾乎沒有增強NK細胞介導的RAJI靶細胞裂解。所有BAFF-R靶向型TriNKET（hCOH-2-F3'、hCOH-2-2-Fab、Hu9.1-73-F3'、Hu9.1-73-2-Fab、伊利尤單抗F3'和伊利尤單抗-2 -Fab）與相應的BAFF-R靶向型單株抗體相比，顯示出更好的靶細胞裂解。EC 50值顯示在 表 12中。 [ 表 12] .在原代NK介導的細胞毒性測定中，BAFF-R TriNKET與親代mAb的效力比較。
測試品 * EC50 （ nM ） 最大裂解（ % ）
伊利尤單抗-F3’ 0.935 64.83
伊利尤單抗-2-Fab 0.244 54.30
伊利尤單抗-mAb N/A N/A
     
Hu9.1-73-F3’ 0.417 54.16
Hu9.1-73-2-Fab 0.559 53.18
Hu9.1-73-mAb N/A N/A
     
hCOH-2-F3’ 0.725 62.59
hCOH-2-2-Fab 1.042 73.53
hCOH-2-mAb N/A N/A
*伊利尤單抗構建體不包括商用伊利尤單抗抗體中存在的抗體依賴性細胞毒性增強突變。
為了證實細胞毒性發現，NK細胞系KHYG-1-CD16aV被設計為穩定表現CD16aV和NKG2D，並如上所述進行測定。測量了衍生自hCOH-2（ 圖 20A）、Hu9.1-73（ 圖 20B）和基於伊利尤單抗的抗原結合位點（三個版本，F3'、2-Fab和伊利尤單抗mAb，不包含商用伊利尤單抗抗體中存在的抗體依賴性細胞毒性增強突變）（ 圖 20C ）的TriNKET和親代mAb 。EC 50值和最大裂解值係藉由GraphPad Prizm軟體使用四參數邏輯非線性迴歸曲線擬合模型從細胞裂解曲線得出的（ 表 13）。在KHYG-1 CD16aV介導的細胞毒性測定中，測試的所有BAFF-R TriNKET均顯示亞奈米莫耳EC50和高效最大裂解。用第二BAFF-R陽性細胞系Ramos獲得了類似的結果（數據未顯示）。 [ 表 13] .在原代KHYG-1 CD16aV介導的細胞毒性測定中，BAFF-R TriNKET與親代mAb的效力比較。
測試品 * EC50 （ nM ） 最大裂解（ % ）
伊利尤單抗-F3’ 0.515 68.35
伊利尤單抗-2-Fab 0.183 74.02
伊利尤單抗-mAb N/A 14.48
  
Hu9.1-73-F3’ 0.246 89.11
Hu9.1-73-2-Fab 0.402 92.94
Hu9.1-73-mAb N/A 19.84
  
hCOH-2-F3’ 0.448 97.52
hCOH-2-2-Fab 0.539 93.76
hCOH-2-mAb N/A 11.56
*伊利尤單抗構建體不包括商用伊利尤單抗抗體中存在的抗體依賴性細胞毒性增強突變。 實例 3 - 結合 BAFF-R 的 mAb 的生成和表徵 重組蛋白免疫方法
藉由用hBAFF-R-hFc-His融合蛋白免疫四種不同品系的小鼠（H2L2、NZBW、BALB-C和SJL/J）來產生BAFF-R特異性抗體。基於抗血清效價，從四種不同品系中選擇了總共七隻小鼠用於融合瘤融合。來自每個免疫組的小鼠亞組的脾細胞被保留用於免疫文庫生成；然而，只有來自H2L2小鼠的脾細胞被用於酵母展示mAb發現。
從五隻小鼠融合（兩隻小鼠的脾細胞被合併用於H2L2融合，兩隻小鼠的脾細胞被合併用於SJL/J融合），藉由特異性ELISA分析每個融合瘤融合體的十六個96孔板，其中比較了與人和石蟹獼猴BAFF-R-hFc-His蛋白的結合和與無關hFc-His蛋白的結合。選擇來自33個BAFF-R陽性和特異性融合瘤的上清液用於進一步分析。測試上清液與BAFF-R+等基因CHO細胞的結合，並進一步亞選殖16個陽性融合瘤。如上所述藉由特異性ELISA分析來自亞殖株的上清液，並測試20個BAFF-R陽性和特異性亞殖株與BAFF-R+細胞的結合。九個亞殖株mAb表現出與BAFF-R+細胞的強結合並被定序。獲得了六個獨特的序列，並進一步分析了相應的mAb在基於細胞的測定中阻斷BAFF-R-BAFF相互作用的能力。
在六種BAFF-R特異性mAb或同種型對照mAb存在或不存在的情況下，測試了生物素化BAFF與BAFF-R+ CHO細胞的結合。在存在抗體的情況下平均螢光強度（MFI）的降低表明mAb抑制了BAFF與BAFF-R的接合，因此被指定為阻斷性抗體。所有測試的殖株都不抑制BAFF與BAFF-R+細胞的結合，因此，所有六個都被稱為非阻斷性的（ 圖 21）。 DNA 免疫方法
分別對兩組SWR/J小鼠進行DNA免疫。一組用全長人BAFF-R cDNA構建體免疫，另一組用全長人BAFF-R和人BAFF-R胞外結構域cDNA構建體的混合物免疫。基於抗血清效價，將小鼠合併，隨後選擇用於單B細胞分選並且另一個池用於融合瘤融合。
單B細胞分選工作產生了44個人和石蟹獼猴交叉反應殖株。對該等殖株進行定序，在293細胞中暫態表現，並藉由流動式細胞分析術分析純化的mAb的特異性，其中比較與hBAFF-R +、cynoBAFF-R +等基因CHO細胞以及與親代細胞系的結合。純化了八種結合劑，並進一步分析了它們結合BAFF-R和阻斷BAFF-R-BAFF相互作用的能力。所有八個殖株都被確定為非阻斷性，並且對hBAFF-R +癌細胞表現出弱親和力。
藉由流動式細胞分析術分析藉由傳統融合瘤方法獲得的殖株的特異性。進行了以下評估：a) 將與表現全長人BAFF-R或人BAFF-R胞外結構域的細胞的結合跟與未轉染的親代細胞的結合進行比較；b) 將與hBAFF-R +和cynoBAFF-R +等基因細胞的結合跟與親代細胞的結合進行比較；c) 與hBAFF-R +癌細胞結合。鑒定了25個陽性融合瘤融合體，並基於結合強度對14個融合瘤融合體進行了定序。獲得了五個獨特的序列，並分析了它們結合BAFF-R +細胞和阻斷BAFF-R-BAFF相互作用的能力。儘管所有五個殖株都被確定為非阻斷性殖株（ 圖 22），五個殖株中的四個（殖株3A1、1B3-A7、7G4和10H7-C5）表現出對hBAFF-R的良好親和力。 從酵母文庫中發現的 BAFF-R 特異性 scFv
酵母展示用於從獲得自用如上所述之重組人hBAFF-R-hFc-His蛋白免疫的人源化H2L2小鼠的脾細胞構建scFv文庫。用5 nM的生物素化hBAFF-R-hFc-His進行三輪選擇。挑取單個酵母菌落，對其進行定序，並對序列進行分析。序列收斂表明選擇過程在增濃結合劑方面係成功的，因此係完整的。選擇獨特的序列用於進一步表徵。從一個文庫中發現了三個BAFF-R特異性scFv（ 表 14）。然而，該等序列彼此非常相似，因此僅選擇序列1129_A01（也稱為AB0369scFv）進行進一步研究。 [ 表 14]. 從酵母文庫中發現的BAFF-R結合劑的CDR序列
   1129_A01 (AB0369 scFv) 1203_A01 1203_A02
CDRH1 GFTFSSY （SEQ ID NO: 214） GFTFSSY （SEQ ID NO: 214） GFTFSTY （SEQ ID NO: 220）
CDRH2 WY DGSN （SEQ ID NO: 215） WY DGSN （SEQ ID NO: 215） WY DGSN （SEQ ID NO: 215）
CDRH3 R FT MLRG LIIEDYG MDV （SEQ ID NO: 216） R FT MLRG VFIEDYG MDV （SEQ ID NO: 219） R NT MVRG VIIEDYG MDV （SEQ ID NO: 221）
CDRL1 RASQS ISS YLN （SEQ ID NO: 217） RASQS VSS NLA （SEQ ID NO: 59） RASQS ISS YLN （SEQ ID NO: 217）
CDRL2 AAS SLQS （SEQ ID NO: 77） GAS TR AT （SEQ ID NO: 60） AAS SLQS （SEQ ID NO: 77）
CDRL3 QQSYSTPLT （SEQ ID NO: 218） QQSYSTPLT （SEQ ID NO: 218） QQSYS SPLT （SEQ ID NO: 222）
流動式細胞分析術用於評估AB0369scFv在酵母上展示時與hBAFF-R-hFc-His、hBAFF-R-GST-His和帶有hFc標籤或GST標籤的陰性對照蛋白結合的特異性。AB0369scFv對hBAFF-R表現出中等至弱的親和力；然而，它沒有顯示出與陰性對照的結合，因此表明對BAFF-R具有高特異性（ 圖 23）。
1129_A01（AB0369 scFv）被轉化為包含scFv和兩種非BAFF-R結合劑的多特異性結合蛋白，產生AB0369。進一步分析了AB0369的以下能力：結合人（hBAFF-R-CHO）和石蟹獼猴（cBAFF-R-CHO）BAFF-R +細胞（ 圖 24A， 圖 24B），藉由多特異性試劑（PSR）測定缺乏非特異性相互作用（ 圖 25A， 圖 25B），裂解BAFF-R +Ramos癌細胞（ 圖 26 和表 15）以及阻斷BAFF-BAFF-R相互作用（ 圖 27）。AB0369與人和石蟹獼猴同基因CHO細胞表面的BAFF-R結合，BAFF-R結合的EC 50約為10 nM，這使得它係進一步開發的良好選擇。 [ 表 15] .AB0369在KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定中的效力。
分子 EC 50 （ nM ） 最大裂解（ % ）
AB0369-001 0.6 73
在基於細胞的阻斷測定中測試了AB0369阻斷BAFF-R-BAFF相互作用的能力。簡而言之，收集表現人BAFF-R的CHO細胞，在冷FACS緩衝液中洗滌，並以每孔100,000個細胞的密度接種。測試品在FACS緩衝液中稀釋，並將50 μL稀釋的多特異性結合蛋白或mAb添加到細胞中，在冰上孵育60分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌。將12 nM BAFF-生物素稀釋到FACS緩衝液中，每孔加入100 μL，在冰上孵育60分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌。將細胞與在FACS緩衝液中稀釋的100 μL 1 : 200卵白素-PE一起孵育，並在冰上孵育30分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌。然後將細胞在100 μL的在PBS中稀釋的1 : 1,000活/死染料中孵育15分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌並固定。孵育後，將細胞用FACS緩衝液洗滌並重懸於FACS緩衝液中用於流動式細胞分析術分析。計算了每個樣本和僅二抗對照的中值螢光強度（MFI）。最大MFI計算為單獨的BAFF-生物素，最小MFI計算為單獨的卵白素-藻紅蛋白。使用GraphPad Prism將數據擬合至四參數非線性迴歸曲線。
該等研究表明AB0369能夠部分阻斷BAFF-R-BAFF相互作用。然而，可能是由於AB0369的低親和力，阻斷的效力明顯低於基於伊利尤單抗的基準對照，基準對照不像親代抗體那樣包含抗體依賴性細胞毒性增強突變（ 圖 27和 表 16）。由於AB0369 scFv係從上述所有發現工作中鑒定出的唯一阻斷性抗體，因此藉由CDRH3和CDRH1/CDRH2的親和力成熟，以及進一步的胺基酸變化來促進蛋白的產生和穩定性，它經歷了進一步的發展。 [ 表 16] .AB0369總結和基準mAb阻斷BAFF與細胞BAFF-R的結合。
分子 IC 50 （ nM ） 最小值（ MFI ）
AB0369-001 488 38,180
基於伊利尤單抗的工具mAb 0.5 224
人IgG1k N/A 68,050
AB0369 的親和力成熟 聚焦 CDRH3 的隨機親和力成熟
如上所述，AB0369表現出與表現BAFF-R的細胞的特異性結合。為搜索具有改進的結合親和力的變體，藉由突變AB0369的CDRH3殘基（RFTMLRGLIIEDYGMDV（SEQ ID NO: 216））創建了酵母展示親和力成熟文庫。為了增濃對hBAFF-R具有更高親和力的scFv，用1 nM的生物素化hBAFF-R-hFc-His進行了兩輪選擇（ 圖2 8A-28D）。比較了親代殖株AB0369和代表性的單個文庫殖株之間的親和力。三輪FACS分選產生了九個殖株，與親代殖株相比，它們含有一或兩個胺基酸差異（粗體）RFTMLRG WYIEDYGMDV（SEQ ID NO: 224）；RFTMLRG QYIEDYGMDV（SEQ ID NO: 223）；RFTMLRG WIIEDYGMDV（SEQ ID NO: 225）），並且使用基於伊利尤單抗的scFv作為基準對照，顯示出比親代殖株和親代衍生的scFv更高的hBAFF-R結合親和力（ 圖 29A-29D）。
具有最高hBAFF-R結合親和力的scFv被轉化為包含scFv和兩個非BAFF-R結合劑的多特異性結合蛋白，在Expi293細胞中表現，並進一步分析它們結合BAFF-R表現細胞的能力（ 圖 10A）和裂解表現BAFF-R的Ramos癌細胞的能力（ 圖 30B ，圖 30C）。所有多特異性結合蛋白在多特異性測定中均得分為負，表明改善的結合親和力係BAFF-R特異性的（ 圖 31A-31C）。進一步的研究表明BAFF-R結合方面超過三倍的改善，這轉化為效能的六到十倍改善，如藉由EC 50測量（ 表 17）。最大裂解保持不變，表明BAFF-R結合親和力的改善係這種效力改善的關鍵驅動因素。 [ 表 17]. 與親代AB0369相比，基於HCDR3親和力成熟變體的多特異性結合蛋白證明的細胞結合和細胞裂解的總結。
分子 BAFF-R-CHO 細胞結合 EC 50 （ Nm ） KHYG-A-CD16Av 介導的 Ramos 細胞的細胞裂解 EC 50 （ Nm ）
AB0605-001 5.72 0.15
AB0606-001 4.50 0.06
AB0622-001 3.45 0.09
AB0369-001 ＞ 10 0.64
聚焦 CDRH1 和 CDRH2 的組合親和力成熟
聚焦CDRH3的親和力成熟研究的結果表明親和力改善，並且非常需要進一步的改進。因此，使用成熟的CDRH3骨架，針對親和力成熟來選擇CDRH1和CDRH2序列（CDRH1：GFTFSSY（SEQ ID NO: 214）和CDRH2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215））。目標係工程改造和選擇比親代殖株（AB0369 scFv）或上述CDRH3優化變體具有更高親和力的結合劑。這創建了具有隨機CDRH1和CDRH2的文庫，同時保留了優化的CDRH3。進行兩輪FACS以增濃高親和力結合劑（ 圖 32A-32C）。
在FACS之後，鑒定了24個殖株。觀察到，與親代AB0369scFv（1129_A01）（ 圖 33A-33D）或基於伊利尤單抗的scFv基準對照（scFv包括基於伊利尤單抗的VH和VL序列的VH和VL，但不包含親代抗體中使用的ADCC增強突變）相比，在優化的CDRH3骨架上具有CDRH1變化的幾個殖株（RFTMLRGWYIEDYGMDV（SEQ ID NO: 224）；RFTMLRGQYIEDYGMDV（SEQ ID NO: 223）；RFTMLRGWIIEDYGMDV（SEQ ID NO: 225））顯示出hBAFF-R親和力的顯著改善。（ 圖 33E）。
具有最高hBAFF-R結合親和力的scFv被轉化為包含scFv和兩個非BAFF-R結合劑的多特異性結合蛋白，在Expi293細胞中表現，並進一步分析它們結合人BAFF-R表現細胞（ 圖 34A）、結合石蟹獼猴BAFF-R +細胞（ 圖 34B）以及抑制BAFF-R-BAFF相互作用（ 圖 34C和 表 18）的能力。測試的多特異性結合蛋白顯示所有這三個標準的改善，並證明在KHYG-1-CD16a介導的細胞毒性測定中有效殺傷BAFF-R +BJAB細胞（ 圖 35 ，表 19）。 [ 表 18] .基於CDRH1和CDRH2親和力成熟的多特異性結合蛋白證明的BAFF-R細胞結合和BAFF-R-BAFF阻斷的總結
分子 人 BAFF-R 細胞結合 EC 50 （ nM ） 石蟹獼猴 BAFF-R 細胞結合 EC 50 （ nM ） BAFF-BAFF-R 阻斷 IC 50 （ nM ）
AB0682-001 2.4 3.1 12.6
AB0681-001 5.1 5.6 -
AB0679-001 2.3 2.6 9.4
AB0369-001 ＞ 10 ＞ 15 -
工具-F3’ 4.3 2.9 -
工具-mAb - - 0.38
[ 表 19] .在KHYG-1-CD16V細胞裂解測定中基於CDRH1和CDRH2親和力成熟的代表性多特異性結合蛋白的效力。
分子 EC50 （ nM ） 最大裂解（ % ）
AB0679-001 0.11 83
AB0682-001 0.09 79
工具-F3’ 0.61 69
修復潛在序列傾向性
由於親和力成熟的殖株在其CDR中含有可能對蛋白表現、穩定性或免疫原性產生負面影響的胺基酸，因此構建了另外的文庫以選擇不含該等胺基酸的殖株。用1 nM生物素化的hBAFF-R-hFc-His蛋白進行三輪選擇，導致高親和力結合劑的增濃（ 圖 36A - 圖 36D）。總共鑒定了23種結合劑，其中12種被預測為不含不期望的胺基酸（「傾向性校正」）。
來自該等文庫的較佳的殖株包括AB0898（上述AB0682的傾向性校正版本）、AB0899和AB0900，它們在酵母上展示時已成功被鑒定和測試與hBAFF-R的結合。所有殖株都顯示出比親代AB0369scFv更高的對hBAFF-R的親和力（ 圖 37A - 圖 37F）。 傾向性校正的多特異性結合蛋白的表徵
三個傾向性校正的殖株被轉化為包含scFv和兩個非BAFF-R結合劑的多特異性結合蛋白，在Expi293細胞中表現，藉由兩步純化過程純化，並藉由粒徑篩析層析法（SEC）、微差掃描熱量法（DSC）、與表現BAFF-R的細胞結合以及在KHYG-1-CD16aV介導的細胞毒性測定中裂解BJAB細胞的能力進行表徵。 表 20中總結了該等殖株的特徵，並證明了傾向性修正係成功的。沒有觀察到對細胞結合的負面影響，並且所有三個殖株都表現出對表現BAFF-R的腫瘤細胞的有效殺傷（ 圖 38）。然而，分子的熱穩定性為T m1＞ 65℃，如 圖 39所示。 [ 表 20] .表現序列傾向性校正的BAFF-R結合劑的多特異性結合蛋白的特徵的總結。
測試品 SEC， 單體（%） DSC，T m1(°C) hBAFF-R +細胞結合 EC 50（nM） KHYG-A-CD16aV介導的BJAB細胞溶解， EC 50（nM）
AB0898 86.9 61.23 4.3 0.08
AB0899 96.5 58.79 4.3 0.06
AB0900 90.0 59.41 11.7 0.11
如上所述，用CDR中的某些胺基酸替換潛在的序列傾向性殘基對結合親和力的影響很小；然而，表現BAFF-R的細胞結合和熱穩定性數據表明需要進一步改進。因此，CDRH1和CDRH2序列（CDRH1：GFTFSSY（SEQ ID NO: 214）和CDRH2：WYDGSN（SEQ ID NO: 215））被親和力成熟為傾向性校正的CDRH3骨架，並施加解離速率壓力以選擇高親和力殖株。易言之，將殖株與濃度為100 pM的生物素化hBAFF-R-hFc-His預孵育，然後用1 µM非生物素化hBAFF-R-hFc-His激發2小時。分選展示抗BAFF-R ScFv的酵母，該抗BAFF-R ScFv保持與生物素化的hBAFF-R-hFc-His結合，並且重複該過程三次以增濃具有較慢解離速率的高親和力結合劑。如 圖 40所示，即使在離率壓力激發後，殖株仍然與生物素化的hBAFF-R-hFc-His結合，而基於伊利尤單抗的scFv基準對照在該等條件下失去了與生物素化的hBAFF-R-hFc-His的結合，表明較慢的解離速率。
單個殖株的分析表明對hBAFF-R-hFc-His具有高親和力（ 圖 41），重要的是，殖株仍然與生物素化的hBAFF-R-hFc-His結合。值得注意的是，基於伊利尤單抗的基準scFv在幾覅後表現出與生物素化hBAFF-R-hFc-His的結合喪失（ 圖 41）。幾個殖株被排除在進一步考慮之外，因為它們含有另外的不期望的胺基酸或特性。 表 21中顯示了從上述研究中選擇的殖株的序列。 [ 表 21] .所選殖株的CDR序列。
序列 CDRH1 CDRH2 CDRH3
AB1080scFv GFTFSSY （SEQ ID NO: 214） WYD ASN （SEQ ID NO: 233） RFT HLRG WYIEDYG LDV （SEQ ID NO: 237）
AB1081scFv GF AFSSY （SEQ ID NO: 238） WYD ESN （SEQ ID NO: 239） RFT NLRG WIIEDYG LDV （SEQ ID NO: 240）
AB1084scFv GFTFS MY （SEQ ID NO: 241） WYD ASN （SEQ ID NO: 233） RFT RLRG WYIEDYG LDV （SEQ ID NO: 242）
AB1085scFv GFTF GSY （SEQ ID NO: 243） WY DGSN （SEQ ID NO: 215） RFT HLRG QYIEDYG MDV （SEQ ID NO: 244）
潛在的序列傾向性用粗體下劃線表示，表明殖株之間多樣性的殘基用粗體表示。
從上述解離率激發研究中選擇的殖株作為多特異性結合蛋白產生，其包含相應結合劑的scFv和兩種非BAFF-R結合劑，在Expi293細胞中表現，並且特徵在於與表現hBAFF-R的細胞和表現BAFF-R的石蟹獼猴細胞結合，在KHYG-1-CD16aV介導的細胞毒性測定中裂解表現BAFF-R的癌細胞的能力，阻斷BAFF-BAFF-R相互作用的能力，熱穩定性（差示掃描螢光測定法，DSF）和疏水性（HIC）（結果總結於 表 22）。與親代殖株相比，AB1080、AB1081和AB1085對BAFF-R +細胞的結合親和力改善（ 圖 42A-42B與 表 20相比）。另外，對cynoBAFF-R的結合親和力類似於對hBAFF-R的結合親和力（ 圖 42A-42B）。多特異性的缺乏藉由PSR測定法證實（ 圖 43A-43B）。AB1084由於在HIC上的滯留時間長以及隨後可能具有更高的聚集傾向而被從進一步研究中移除。改善的多特異性結合蛋白表現出比基於伊利尤單抗序列的多特異性結合蛋白高得多的效力（ 圖 44A-44B）。此外，與最初的AB0369多特異性結合蛋白相比，觀察到效力改善了十倍以上。重要的是，與親代AB0369多特異性結合蛋白相比，阻斷BAFF-BAFF-R結合的能力顯著改善（ 圖 45）。 [ 表 22].所選多特異性結合蛋白的特徵的總結。
測試品 hBAFF-R + 細胞結合 EC 50 （ nM ） cBAFF_R + 細胞結合 EC 50 （ nM ） 細胞溶解， EC 50 （ nM ） HIC ，保留（ min ） DSF ， Tm1 （ °C ）
AB1080-002 1.97 1.36 0.03 11.40 66.3
AB1081-002 ＞ 8 ＞ 14 0.05 11.45 65.9
AB1084-001 - - 0.06 11.79 67.5
AB1085-001 5.78 4.34 0.08 9.55 68.1
與對照阿達木單抗（Humira）和派姆單抗（Keytruda）相比，該等多特異性結合蛋白滿足可接受的熱穩定性標準（ 圖 46）。HIC層析圖顯示AB1080和AB1081的滯留時間分別為11.4和11.5 min。AB1085顯示了9.5分鐘的滯留時間，這在已批准的和晚期治療性抗體中處於較低的邊緣，表明非常有利的疏水行為（ 圖 46）。
AB1080和AB1081顯示出與BAFF-R的結合得到改善，並且在CDR序列中不包含任何序列傾向性，但是，與一組基準治療性抗體相比，它們的疏水性很高。AB1085表現出所期望的疏水性和親和力，但在CDRH2和CDRH3序列中包含潛在序列傾向性（ 圖 47）。比較AB1080、AB1081和AB1085的序列，對AB1080序列進行分析和進一步校正，產生降低疏水性的W至Q突變（CDRH3：RFTMLRG WYIEDYGMDV（SEQ ID NO: 224）至RFTMLRG QYIEDYGMDV（SEQ ID NO: 223））。所得的AB1424/AB1612多特異性結合蛋白表現出良好的低疏水性，落入良好生物製品的範圍內（ 圖 48），同時保持與BAFF-R相同的高親和力（ 表 23 ，圖 49A-49B），有效的BAFF-R-BAFF結合阻斷（ 圖 50），並且包含親代AB1080特有的無傾向性序列（ 表 24）。 [ 表 23].多特異性結合蛋白AB1424/AB1612譜系對BAFF-R結合和BAFF-R-BAFF阻斷的總結。
分子 Cyno BAFF-R 細胞結合 EC 50 （ nM ） 人 BAFF-R 細胞結合 EC 50 （ Nm ） 配體阻斷 IC50 （ Nm ）
AB0369-001 7.11 6.80 ＞ 1000
AB1080-003 2.36 2.71 5.72
AB1085-001 3.29 4.48 12.67
AB1612-003 1.85 3.09 6.76
人IgG1k N/A N/A N/A
[ 表 24]. AB1424/AB1612及其祖先中結合BAFF-R的CDR的比較
TriNKET CDRH1 CDRH2 CDRH3
AB0369 GFTFSSY （SEQ ID NO: 214） WYD GSN （SEQ ID NO: 215） RFT MLRGLIIEDYG MDV （SEQ ID NO: 216）
AB1080 GFTFSSY （SEQ ID NO: 214） WYD ASN （SEQ ID NO: 233） RFT HLRG WYIEDYG LDV （SEQ ID NO: 237）
AB1085 GFTF GSY （SEQ ID NO: 243） WYD GSN （SEQ ID NO: 215） RFT HLRG QYIEDYG MDV （SEQ ID NO: 244）
AB1424/AB1612 GFTFSSY （SEQ ID NO: 214） WYD ASN （SEQ ID NO: 233） RFT HLRG QYIEDYG LDV （SEQ ID NO: 248）
總之，利用重組蛋白和DNA免疫的兩個抗體發現活動已經完成。第一個活動確定了四種中等親和力的非阻斷性抗體。從第二次活動中發現的單個結合劑AB0369scFv顯示出阻斷BAFF-R-BAFF相互作用的能力。藉由多輪親和力成熟、傾向性校正和合理序列設計對AB0396scFv的廣泛開發產生了結合劑AB1612/AB1424，它證明了治療性候選物的理想特性。 實例 4 - AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 形式的分子分析
在此示例中，分析了AB1424/AB1612 F3' TriNKET的分子形式、設計、結構和特徵。該等研究a) 提供了分子的基本生化和生物物理學特徵，b) 確定了AB1424/AB1612 F3' TriNKET對BAFF-R、NKG2D和CD16a（V和F對偶基因變體）的親和力，c) 證實了AB1424/AB1612 F3’ TriNKET與細胞表面表現的BAFF-R的結合，d) 證明了AB1424/AB1612 F3' TriNKET的選擇性，e) 並確定了AB1424/AB1612 F3' TriNKET殺傷BAFF-R+癌細胞的效力。
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET係如上所述之F3’形式的TriNKET，包含三個多肽（抗BAFF-R scFv-CH2-CH3 「鏈S,」 SEQ ID NO: 270；抗NKG2D VH-CH1-CH2-CH3，「鏈H,」SEQ ID NO: 194；和抗NKG2D VL-CL，「鏈L,」SEQ ID NO: 195）。評估了AB1424/AB1612 F3' TRINKET的一級序列在CDR中是否存在推定的序列傾向性，例如N-連接糖基化位點、Cys殘基、潛在脫醯胺位點（Asn）、氧化（Met和Trp）、異構化（Asp）和化學不穩定鍵（DP）。該等修飾會影響產品功效、安全性、穩定性、一致性或可製造性。
表 25中提供了對CDR中假定序列傾向性的分析。BAFF-R結合鏈S不包含任何預定序列傾向性。NKG2D結合鏈L不包含任何預定序列傾向性。NKG2D結合鏈H包含可能易於在CDRH3中截短的潛在序列傾向性。驗證性測試表明，AB1424/AB1612 F3' TriNKET在加速穩定或強制降解的條件（其中分子受到熱、化學和機械應激）下沒有顯示任何碎片，表明序列係穩定的。 [ 表 25] .AB1424/AB1612 F3’ TriNKET CDR序列。
鏈 可變區 框架 CDR1 CDR2 CDR3
S VH VH3-30 GFTFSSY （SEQ ID NO: 214） WYDASN （SEQ ID NO: 233） RFTHLRGQYIEDYGLDV （SEQ ID NO: 248）
S VL VK1-39 RASQSISSYLN （SEQ ID NO: 217） AASSLQS（SEQ ID NO: 77） QQSYSIPLT （SEQ ID NO: 249）
H VH VH3-21 GFTFSSY （SEQ ID NO: 214） SSSSSY （SEQ ID NO: 290） GAPIGAAAGWFDP （SEQ ID NO: 97）
L VL VK1-12 RASQGISSWLA （SEQ ID NO: 86） AASSLQS （SEQ ID NO: 77） QQGVSFPRT （SEQ ID NO: 87）
分子建模
使用SAbPred網站上提供的Therapeutic Antibody Profiler（TAP），將AB1424/AB1612 F3' TriNKET的抗BAFF-R和抗NKG2D結合臂與377種I期後生物治療性分子進行了比較。TAP使用ABodyBuilder藉由PEARS為帶有側鏈的AB1424/AB1612 F3' TriNKET生成模型。CDRH3因其多樣性而由MODELLER構建。
評估了五個不同的參數： CDR總長度 CDR附近的表面疏水性（PSH）塊 CDR附近的正電荷（PPC）斑塊 CDR附近的負電荷（PNC）斑塊 結構Fv電荷對稱參數（sFvCSP）
然後將AB1424/AB1612 F3' TriNKET的該等參數與治療性抗體的分佈譜進行比較，以預測可開發性和可能導致下游挑戰的任何潛在問題。
圖 51係AB1424/AB1612 F3' TriNKET的BAFF-R結合臂的可變片段（Fv）在三個不同取向的模型（上分圖）和在相同取向的對應表面電荷分佈（下圖）。 圖 52顯示了AB1424/AB1612 F3’ TriNKET的BAFF-R結合臂的總CDR長度和表面特徵分析。該分析係使用治療性抗體譜（TAP）進行的，並以377種晚期治療性單株抗體為基準（Raybould，2019）。AB1424/AB1612 F3' TriNKET的BAFF-R結合臂的CDR總長度與可比較的晚期治療性抗體的CDR一致（ 圖 52）。
單株抗體的疏水性係重要的生物物理特性，與其開發成治療藥物有關。AB1424/AB1612 F3' TriNKET的BAFF-R結合臂的疏水性塊分析證明該分子與絕大多數治療性mAb進行了基準對比（ 圖 52）。正電荷和負電荷的表面塊與對mAb表現的不利影響和加速的體內清除有關。對於AB1424/AB1612 F3' TriNKET的BAFF-R結合臂，帶正電的塊、帶負電的塊和電荷對稱性與大多數參考mAb一致（ 圖 52）。
結合NKG2D的Fab臂被建模並以三個不同取向描繪（ 圖 53，上分圖），並顯示相應的表面電荷分佈（ 圖 53，下分圖）。NKG2D臂的表面電荷分佈似乎跨模擬的互補位均勻分佈。 圖 54顯示了AB1424/AB1612 F3' TriNKET的NKG2D結合臂的總CDR長度和表面特徵分析。使用TAP進行分析（Raybould，2019）。CDR總長度、疏水性、正/負電荷分佈和Fv電荷對稱性均優於治療性mAb參考數據。總之，在該等分析中既沒有發現異常的表面電荷特性，也沒有發現異常的表面疏水性塊。 免疫原性評估
使用EpiVax的EpiMatrix演算法進行免疫原性評估。按照Cohen等人 (2010) A method for individualizing the prediction of immunogenicity of protein vaccines and biologic therapeutics: individualized T cell epitope measure (iTEM).[蛋白質疫苗和生物療法免疫原性預測的個體化方法：個體化T細胞表位測量(iTEM)] J.Biomed. Biotechnol.[生物醫學與生物技術雜誌] 961752中的描述進行評估。T reg調整的Epimatrix蛋白得分，範圍從-80（無免疫原性）到80（高免疫原性），對於AB1424/AB1612 F3' TriNKET的三個鏈的序列為S鏈：-15.78，L鏈：-23.49，H鏈：-33.39。因此，AB1424/AB1612 F3' TriNKET的免疫原性預測風險似乎較低。 疏水相互作用層析
疏水性預測數據藉由使用分析型疏水相互作用層析（HIC）研究AB1424/AB1612 F3' TriNKET行為得到證實，該技術依賴於具有明顯暴露的疏水塊的蛋白更易於聚集。為進行HIC，簡而言之，在高鹽緩衝液（100 mM磷酸鈉、1.8 M硫酸銨、pH 6.5）中以5 : 4的比例製備TriNKET（5 µg蛋白）注射液以進行取樣。使用配備Sepax Proteomix HIC Butyl-NP5 5uM柱的Agilent 1260 Infinity II HPLC在25°C下分析樣本。以1.0 mL/分鐘的流速在6.5分鐘內從0%低鹽緩衝液（100 mM磷酸鈉，pH 6.5）運行梯度至100%低鹽緩衝液。在280 nm處監測層析。AB1424/AB1612 F3' TriNKET在分析型HIC柱上的滯留時間如 表 26中所示並且HIC譜如 圖 55所示。商用阿達木單抗和派姆單抗被用作表現良好的生物製劑的實例，並作為測定的內部對照。AB1424/AB1612 F3' TRINKET的滯留時間為9.7分鐘，而派姆單抗為11.3分鐘，阿達木單抗為8.8分鐘。因此，實驗疏水性分析表明，AB1424/AB1612 F3' TriNKET的疏水性對於進一步開發係可接受的。 [ 表 26]. 藉由HIC評估疏水性。
測試品 HIC 滯留時間（ min ）
阿達木單抗 8.8
派姆單抗 11.3
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 9.7
毛細管等電聚焦（ cIEF ）
AB1424/AB1612 F3' TriNKET的實驗pI藉由cIEF獲得（ 圖 56）。簡而言之，用MilliQ水將樣本稀釋至1 mg/mL，將15 µL樣本添加到60 µL預混液（水、甲基纖維素、Pharmalyte 3-10、精胺酸、pI標誌物4.05和9.99）中，渦旋並簡短離心。從溶液頂部吸出60 µL樣本，加入到96孔板中，並在測試前離心。在Maurice儀器（ProteinSimple公司，聖約瑟，加利福尼亞州）上，樣本在1500伏特下分離1分鐘，然後在3000伏特下分離8分鐘。商用曲妥珠單抗作為內部對照包含在測定中。
AB1424/AB1612 F3' TriNKET的cIEF譜係單株抗體的典型特徵，主峰位於pI 9.0（ 表 27）。還觀察到少量酸性和鹼性物質的存在，如 表 28中所示。 [ 表 27] .藉由cIEF測定AB1424/AB1612 F3' TriNKET的pI。
測試品 主峰（pI）
曲妥珠單抗 8.9
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET運行1 9.0
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET運行2 9.0
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 平均值 ± StDev 9.0 ± 0.0
[ 表 28]. AB1424/AB1612 F3' TriNKET cIEF分析的總結。
測試品 pI （主） % 酸性 % 主 % 鹼性
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 9.0 41.2 53.9 4.9
熱穩定性分析
AB1424/AB1612 F3' TriNKET的熱穩定性藉由微差掃描熱量法（DSC）在PBS pH 7.4或HST中進行評估，HST包含20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.01% tween-80，pH 6.0。為進行DSC，簡而言之，用PBS將TriNKET稀釋至0.5 mg/mL。將325 µL與匹配的緩衝液空白一起加入到96孔深孔板中。使用MicroCal PEAQ DSC（瑪律文，賓夕凡尼亞州）生成熱譜圖。溫度以90°C/小時的速度從20°C升至100°C。原始熱譜圖被減去背景，基線模型被花鍵化，數據使用非雙態模型進行擬合。
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET在兩種緩衝液中均表現出高熱穩定性（ 圖 57和 表 29）。 [ 表 29] .AB1424/AB1612 F3' TriNKET的DSC熱穩定性。
測試品 緩衝液 T 開始(°C) T m1(°C) T m2(°C) T m3(°C) T m4(°C) T m5(°C)
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET PBS 61.7 68.1 69.3 76.4 81.4 83.2
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET A 61.8 67.9 69.8 79.1 84.3 86.4
二硫鍵排列
AB1424/AB1612 F3' TriNKET係基於單株IgG1抗體骨架的經工程改造的分子。雖然典型的IgG1包含16個二硫鍵，但AB1424/AB1612 F3' TriNKET的F3'形式僅包含15個二硫鍵。
AB1424/AB1612 F3' TriNKET的二硫鍵排列藉由非還原胰蛋白酶消化物的LC-MS/MS肽做圖分析得到證實。二硫鍵肽藉由MS/MS數據庫搜索鑒定，並藉由比較它們在天然和還原消化物中的強度來確認。確認了抗體結構中預期的所有標準二硫化物。在AB1424/AB1612 F3’ TriNKET中觀察到的二硫鍵連接的肽的總結顯示在表30中。所有理論二硫鍵連接的肽均以高質量準確度（＜ 2 ppm）觀察到，可還原，並藉由MS/MS碎裂進行序列確認。 [ 表 30] .AB1424/AB1612 F3' TriNKET中二硫鍵連接的肽的理論和實驗質量。
鏈 結構域 肽 理論質量（ Da ） 實驗質量（ Da ） 質量準確度（ ppm ）
L VL L2:L7 4482.0784 4482.0842 1.7
CL L12:L19 3555.7490 3555.7552 1.9
H VH H3:H10 3371.4686 3371.4737 1.8
CH1 H13:H14-15 7916.9194 7916.9297 1.6
CH2 H23:H30 2328.0977 2328.1024 2.0
CH3 H37:H41 4432.0675 4432.0797 2.8
S scFv VH S3-S11 3408.4638 3408.4620 -0.5
scFv* S9:S48*a 1011.4154 1011.4155 0.0
scFv VL S32:S46a 1316.5853 1316.5850 -0.2
CH2 S26:S33 參見H23:H30 N.A. N.A.
CH3 S42:S47 3844.8236 3844.8321 1.8
分子間 鉸鏈 H20-21:S23-24 5454.7834 5454.7890 1.6
CL-CH1 L20-21:H19 1260.4863 1260.4868 0.4
CH3-CH3* H36:S40-41* 2757.3830 2757.3888 2.5
* 表示經工程改造的二硫化物 a藉由胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化 AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 的結合特性
為了表徵AB1424/AB1612 F3' TriNKET對細胞上表現的人BAFF-R的親和力，使用了動力學排斥平臺儀器（KinExA）。 圖 58-58B表明AB1424/AB1612 F3' TriNKET以2.55 nM的親和力結合在同基因BAFF-R-CHO細胞表面表現的BAFF-R。
設計了在CHO細胞系的骨架上過表現人和石蟹獼猴BAFF-R的等基因細胞系。AB1424/AB1612 F3' TriNKET與相應的親代抗體（AB1753）進行了比較。AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1753在與人和石蟹獼猴BAFF-R的結合方面表現出相似的劑量響應（ 圖 59A-59B）。在比較與人和石蟹獼猴BAFF-R的結合時，AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1753的EC 50幾乎相同（ 表 31）。值得注意的是，在人和石蟹獼猴BAFF-R細胞中，AB1424/AB1612 F3' TriNKET的相比於背景的倍數（FOB）大於AB1753（ 圖 59A-59B和 表 31）。不希望受理論的束縛，假設這可能歸因於AB1424/AB1612 F3' TRINKET的改變形式，其中抗原結合係單價的（而不是AB1753的二價）並且有可能更高負載的TriNKET在細胞上。 [ 表 31] .AB1424/AB1612 F3' TriNKET和相應的親代mAb與同基因人和石蟹獼猴BAFF-R-CHO細胞的結合。
測試品 人 BAFF-R CHO 石蟹獼猴 BAFF-R CHO
EC 50 （ nM ） 最大 FOB EC 50 （ nM ） 最大 FOB
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.9 85 0.9 141
親代mAb（AB1753） 0.4 57 0.4 116
藉由流動式細胞分析術評估AB1424/AB1612 F3' TriNKET與多種BAFF-R+癌細胞系的結合。AB1424/AB1612 F3' TriNKET以低奈米莫耳EC 50結合到BJAB、Raji、RL、Rs4;11、Jeko-1和SUDHL-6癌細胞上的細胞表面BAFF-R。EC 50在BAFF-R+癌細胞系之間係相當的（ 圖 60A-60F）。 結合至 NKG2D
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET與人和石蟹獼猴NKG2D的結合藉由表面電漿共振（SPR）評估（ 圖 61和 圖 62）。NKG2D係天然二聚物，因此本實驗使用重組mFc標記的NKG2D二聚物。利用兩種不同的擬合來獲得平衡親和力數據：穩態親和擬合和動力學擬合。動力學常數和平衡親和常數顯示在表32和表33中。AB1424/AB1612 F3' TriNKET旨在以低親和力和快速解離速率結合人NKG2D。分別對於人NKG2D和石蟹獼猴靶標，解離速率常數為1.1 ± 0.0 x 10 -1s -1和1.1 ± 0.0 x 10 -1s -1。藉由動力學擬合和穩態親和擬合獲得的平衡親和常數（K D）對於人NKG2D（分別為455.8 ± 12.7 nM和456.4 ± 13.9 nM（ 表 32））和石蟹獼猴NKG2D（分別為517.0 ± 13.6 nM和520.5 ± 15.5 nM（ 表 33））非常相似。 [ 表 32] .藉由SPR測量的AB1424/AB1612 F3' TriNKET對人NKG2D的動力學參數和結合親和力。
測試品 k a (M -1s -1) x 10 5 k d (s -1) x 10 -1 動力學擬合 K D （ nM ） 穩態擬合 K D （ nM ）
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 2.4 1.1 439.0 438.3
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 2.4 1.1 452.9 453.0
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 2.3 1.1 466.1 468.2
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 2.4 1.1 465.1 466.3
平均值 ± StDev 2.4 ± 0.1 1.1 ± 0.0 455.8 ± 12.7 456.4 ± 13.9
[ 表 33]. 藉由SPR測量的AB1424/AB1612 F3' TriNKET對石蟹獼猴NKG2D的動力學參數和結合親和力。
測試品 k a (M -1s -1) x 10 5 k d (s -1) x 10 -1 1 : 1 動力學擬合 K D （ nM ） 穩態擬合 K D （ nM ）
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 2.1 1.1 498.2 500.6
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 2.0 1.0 515.8 516.4
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 2.0 1.0 528.4 534.9
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 2.1 1.1 525.4 530.3
平均值 ± StDev 2.0 ± 0.1 1.1 ± 0.0 517.0 ± 13.6 520.5 ± 15.5
結合至 CD16
藉由SPR評估AB1424/AB1612 F3' TriNKET與人CD16a（V158）、人CD16a（F158）和石蟹獼猴CD16的結合，並與曲妥珠單抗進行比較（ 圖 63、 圖 64和 圖 65）。人CD16a V158結合的動力學在AB1424/AB1612 F3' TriNKET和IgG1同種型實驗對照曲妥珠單抗之間係相當的（ 表 34）。同樣，AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗與人CD16a F158的穩態親和力相當（ 表 35）。對於AB1424/AB1612 F3’ TriNKET和曲妥珠單抗，與石蟹獼猴CD16的親和力跟與人CD16a V158的親和力相當（ 表 36）。因此，AB1424/AB1612 F3' TriNKET對人CD16a V158/F158和石蟹獼猴CD16表現出良好的結合特性。 [ 表 34] .AB1424/AB1612 F3' TriNKET 1對人CD16a V158的動力學參數和結合親和力。
測試品 k a (M -1s -1) k d (s -1) 動力學擬合 K D(nM)
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1.1 x 10 5 1.4 x 10 -2 130.6
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1.0 x 10 5 1.4 x 10 -2 131.3
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1.1 x 10 5 1.4 x 10 -2 133.6
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1.1 x 10 5 1.3 x 10 -2 121.7
平均值 ± StDev (1.1 ± 0.0) x 10 5 (1.4 ± 0.1) x 10 -2 129.3 ± 5.2
曲妥珠單抗 1.9 x 10 5 9.2 x 10 -3 48.9
曲妥珠單抗 1.9 x 10 5 9.2 x 10 -3 48.6
曲妥珠單抗 1.9 x 10 5 9.0 x 10 -3 47.7
曲妥珠單抗 1.6 x 10 5 8.9 x 10 -3 56.1
平均值 ± StDev (1.8 ± 0.2) x 10 5 (9.1 ± 0.2) x 10 -3 50.3 ± 3.9
[ 表 35]. AB1424/AB1612 F3' TriNKET與人CD16a F158結合的穩態親和力。
測試品 穩態K D(nM)
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1331.8
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1256.0
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1366.8
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1430.0
平均值 ± StDev 1346.2 ± 72.6
曲妥珠單抗 475.7
曲妥珠單抗 428.5
曲妥珠單抗 447.9
曲妥珠單抗 440.2
平均值 ± StDev 448.1 ± 20.1
[ 表 36]. AB1424/AB1612 F3' TriNKET對石蟹獼猴CD16的動力學參數和結合親和力。
測試品 k a (M -1s -1) k d (s -1) 動力學擬合 K D （ nM ）
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 7.8 x 10 4 2.0 x 10 -2 232.5
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 7.8 x 10 4 2.1 x 10 -2 225.4
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 7.2 x 10 4 2.0 x 10 -2 238.3
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 7.8 x 10 4 2.0 x 10 -2 239.1
平均值 ± StDev (7.6 ± 0.4) x 10 4 (2.1 ± 0.0) x 10 -2 270.8 ± 11.0
曲妥珠單抗 1.9 x 10 5 1.2 x 10 -2 66.1
曲妥珠單抗 1.6 x 10 5 1.2 x 10 -2 76.2
曲妥珠單抗 1.6 x 10 5 1.2 x 10 -2 78.9
曲妥珠單抗 1.6 x 10 5 1.3 x 10 -2 79.0
平均值 ± StDev (1.7 ± 0.2) x 105 (1.2 ± 0.0) x 10 -2 73.7 ± 6.8
抗原結合位點的共接合
為了證明人CD16a與人NKG2D結合的共接合的協同作用，進行了SPR實驗，其中對AB1424/AB1612 F3' TriNKET與NKG2D、CD16a和混合NKG2D-CD16a Biacore晶片表面的結合進行了定性評估。AB1424/AB1612 F3' TriNKET對人NKG2D和人CD16a的親和力都很低，但是，同時結合這兩個靶標會導致親合力效應，表現為較慢的解離速率。因此，AB1424/AB1612 F3' TriNKET可以積極接合CD16a和NKG2D（ 圖 66）。
為了確定一個靶標的結合是否會干擾第二靶標與AB1424/AB1612 F3' TriNKET的結合，將BAFF-R和NKG2D依次注射到捕獲在抗hFc IgG （SPR）晶片上的AB1424/AB1612 F3' TriNKET上。靶結合傳感圖表明，BAFF-R結合臂或NKG2D結合臂在飽和後的佔據狀態不干擾第二靶抗原的締合（ 圖 67A-67B）。描述每個靶標與游離AB1424/AB1612 F3' TriNKET和已被其他靶標飽和的AB1424/AB1612 F3' TriNKET的結合的各個傳感圖區段的形狀的相似性表明AB1424/AB1612 F3' TriNKET的靶標佔用狀態對運動參數沒有顯著影響。例如，兩個分圖中傳感圖的BAFF-R結合區段的形狀相似。由於該靶標的快速解離速率，必須在整個實驗過程中保持NKG2D的飽和濃度。此外，對每個靶標結合的相對化學計量沒有任何影響（與結合未佔用的AB1424/AB1612 F3' TriNKET相比）表示AB1424/AB1612 F3' TriNKET上的NKG2D和BAFF-R結合位點完全獨立（ 表 37）。因此，AB1424/AB1612 F3' TriNKET能夠成功實現BAFF-R和NKG2D靶向臂的同時共接合。 [ 表 37] .AB1424/AB1612 F3' TriNKET對BAFF-R和NKG2D的相對結合化學計量。
實驗設置 BAFF-R 相對結合化學計量 NKG2D 相對結合化學計量
靶標結合到未被另一靶標佔用的AB1424/AB1612 F3' TriNKET（首先注射） 1.0 1.0
靶標結合到被另一靶標飽和的AB1424/AB1612 F3' TriNKET（第二注射） 1.1 ± 0.1 1.0 ± 0.1
細胞結合特異性
為了評估AB1424/AB1612 F3' TriNKET對BAFF-R的特異性，測試了它與密切相關的蛋白的結合，該蛋白也結合BAFF配體。在圖68A-68B中，進行了SPR實驗並證明固定化的AB1424/AB1612 F3' TriNKET特異性結合靶標BAFF-R而不是TACI。重組人TACI的活性和正確折疊藉由與TACI特異性抗體（右側分圖）的結合得到證實。
為了進一步評估AB1424/AB1612 F3' TriNKET對BAFF-R的特異性，藉由流動式細胞分析術評估了AB1424/AB1612 F3' TriNKET與表現另一個BAFF結合家族成員BCMA（BCMA-C6）的轉基因細胞系的結合（ 圖 69A-69B）。AB1424/AB1612 F3' TriNKET未顯示與BCMA或大鼠衍生的親代細胞系C6的交叉反應。具有已知BCMA特異性的mAb（EM901）用作BCMA檢測的陽性對照。
AB1424/AB1612 F3' TriNKET的特異性和與不相關蛋白相互作用的缺乏藉由探測與經工程改造以表現人或石蟹獼猴BAFF-R細胞的ExpiCHO等基因細胞系的結合來進一步評估（ 圖 70A-70B）。
另外，進行基於流動式細胞分析術的PSR測定以測量與去垢劑溶解的CHO細胞膜蛋白製劑的結合（ 圖 71A-71B）。PSR試驗與交叉相互作用層析（抗體溶解度的替代物）以及桿狀病毒顆粒酶聯免疫吸附試驗（體內清除的替代物）密切相關（Xu等人 (2013). Addressing polyspecificity of antibodies selected from an in vitro yeast presentation system: a FACS-based, high-throughput selection and analytical tool.[解決從體外酵母展示系統中選擇的抗體的多特異性：基於FACS的高通量選擇和分析工具] Protein engineering design and selection[ 蛋白工程設計與選擇], 26, 663-670）。
在室溫，將PBSF中的50 µL的100 nM TriNKET或對照mAb與預洗的5 µL蛋白A Dynabeads™漿液（英傑公司（Invitrogen），目錄# 10001D）孵育30分鐘。允許TriNKET或mAb結合的磁珠在磁力架上靜置60秒，並棄去上清液。用100 µL PBSF洗滌結合的珠。將珠與50 µL生物素化PSR試劑一起在冰上孵育20分鐘，該試劑從原液中稀釋25倍（Xu 等人2013）。將樣本放在磁力架上，棄去上清液，並用100 µL PBSF洗滌。二抗FACS試劑用於檢測生物素化PSR試劑與TriNKET或對照mAb的結合，其製備如下：在PBSF中將1:250 µL的卵白素-PE（百進公司（Biolegend），目錄號405204）和1:100的驢抗人Fc組合。向每個樣本中加入100 µL二抗試劑，並在冰上孵育20分鐘。用100 µL PBSF洗滌珠兩次，並在FACS Celesta（BD）上分析樣本。在此測定中，曲妥珠單抗用作陰性對照。艾塞吉珠單抗作為陽性對照，藉由流動式細胞分析術顯示與PSR相互作用的傾向增加。AB1424/AB1612 F3' TriNKET與PSR的結合呈陰性，並且與PSR陰性對照曲妥珠單抗最相當。該等結果表明AB1424/AB1612 F3' TriNKET不表現出與非特異性蛋白的反應性（ 圖 71A-71B）。 KHYG1-CD16aV 介導的細胞毒性
AB1424/AB1612 F3' TriNKET在刺激KHYG-1-CD16aV介導的BAFF-R+ BJAB細胞的細胞溶解中的效力係在細胞毒性測定中使用KHYG-1-CD16a細胞進行測定的，該細胞被工程改造為除NKG2D外還表現CD16a。藉由DELFIA細胞毒性測定法測量靶細胞的裂解。簡而言之，從培養物中收穫表現BAFF-R的人癌細胞系，用HBS洗滌，並以10 6/mL重懸於生長培養基中，用於用BATDA試劑（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer）AD0116）標記。遵循製造商說明來標記靶細胞。標記後，用HBS洗滌細胞3次，並以0.5-1.0 x 10 5/mL重懸於培養基中。向96孔板的每個孔中添加100 µl經BATDA標記的細胞。將針對BAFF-R的單株抗體或TriNKET在培養基中稀釋，並將50 µl的稀釋的mAb或TriNKET添加到每個孔中。
為了製備NK細胞，使用密度梯度離心法從人周圍血膚色血球層中分離出PBMC，洗滌並準備用於NK細胞分離。將NK細胞使用負選擇技術與磁珠分離。分離的NK細胞的純度通常 ＞ 90% CD3-CD56+。將分離的NK細胞靜置過夜並從培養物中收穫。然後將細胞洗滌並以10 5-2.0 x 10 6/mL的濃度重懸於培養基中，效應細胞與靶細胞（E : T）的比例為5 : 1。將50 µl NK細胞加入板的每個孔中，總培養體積為200 µl。將板在37°C和5% CO 2孵育2-3小時。
孵育後，將板從培養箱中取出，並藉由以200 xg離心5分鐘沈澱細胞。將20 µl培養物上清液轉移到乾淨的微孔板中，並將200 µl室溫銪溶液（珀金埃爾默公司C135-100）加入每個孔中。將板避光並在板振盪器上以250 rpm孵育15分鐘，然後使用SpectraMax i3X儀器讀取。將BJAB細胞用BATDA試劑標記。標記後，洗滌細胞並重懸於原代細胞培養基中。經BATDA標記的細胞、AB1424/AB1612 F3' TRINKET和靜止的KHYG-1-CD16V細胞被添加到96孔板的孔中。藉由添加1% Triton-X，準備另外的孔以最大程度地裂解靶細胞。從只有經BATDA標記的細胞的孔中監測自發釋放。培養3小時後，沈澱細胞，將培養上清液轉移至乾淨的微孔板中，每孔加入室溫銪溶液。將板避光並在板振盪器上以250 rpm孵育15分鐘。使用SpectraMax i3X儀器讀取板。%特異性裂解計算如下： %特異性裂解 = ((實驗釋放 - 自發釋放)/(最大釋放 - 自發釋放)) * 100%
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET表現出相當的亞奈米莫耳效力和有效的最大細胞殺傷（ 表 38）。AB1424/AB1612 F3' TriNKET在驅動BJAB細胞裂解方面高度有效，並且AB1424/AB1612 F3' TriNKET生產批次之間的效力有很強的相關性。 [ 表 38] .AB1424/AB1612 F3' TriNKET在KHYG-1-CD16aV和BJAB細胞存在下的效力。呈現相對於對照的最大殺傷。
測試品 EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ）
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.13 108
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.13 105
NK 細胞介導的細胞毒性
將AB1424/AB1612 F3' TriNKET在驅動NK細胞介導的BAFF-R+腫瘤細胞系RL裂解中的效力與親代AB1753抗體進行比較（ 圖 72A-72B）。如實例2中所述進行細胞毒性測定。AB1753對BAFF-R+腫瘤細胞系的細胞溶解作用很低或檢測不到。AB1424/AB1612 F3' TriNKET展示了亞奈米莫耳EC 50，有效的最大殺傷，並超過了AB1753在RL細胞裂解中的效力（ 表 39）。 [ 表 39] .AB1424/AB1612 F3' TriNKET和親代mAb在原代NK細胞和BAFF-R+ 腫瘤細胞系存在下的效力。
細胞系 AB1424/AB1612 F3’ TriNKET AB1753
EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ） EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ）
RL 0.12 ± 0.07 44.3 ± 19.2 ND 10.7 ± 9.6
AB1424/AB1612 F3' TriNKET 的效力需要 NKG2D 和 CD16a 接合
為了評估AB1424/AB1612 F3' TriNKET介導的細胞毒性的機制，生成了一組對照TriNKET。AB1424/AB1612 F3' TRINKET NKG2Dsi係AB1424/AB1612 F3' TriNKET的變體，其中NKG2D結合臂的輕鏈被取代，使該臂無法結合NKG2D。AB1424/AB1612 F3' TriNKET FcγRsi係AB1424/AB1612 F3' TriNKET的效應子緘默化版本，帶有Fc緘默化突變：L234A、L235A和P329G（根據EU編號）。F3'同種型對照藉由用帕利珠單抗的結合非人抗原的可變結構域取代BAFF-R-結合臂來構建，格式化為二硫鍵穩定的scFv（ 圖 73A-71D）。緘默化變體表現如預期，這取決於它們的預期目的，如藉由SPR與人BAFF-R、NKG2D和CD16a V158的結合進行定性測量（ 表 40）。AB1424/AB1612 F3' TriNKET在KHYG-1-CD16a和BAFF-R+ BJAB存在的情況下表現出卓越的效力和最大殺傷；NKG2D和Fc緘默化變體顯示出最小的細胞溶解活性（ 圖 74和 表 41）。 [ 表 41]. 在KHYG-1-CD16a和BJAB細胞存在的情況下，AB1424/AB1612 F3' TriNKET和緘默化變體的效力。
測試品 EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ）
AB1424/AB1612 F3’ TRINKET 0.03 112
AB1424/AB1612 F3’ TRINKET NKG2Dsi 0.06 74
AB1424/AB1612 F3’ TRINKET FcγRsi N.D. 48
F3' 同種型對照 N.D. 48
如上所述，AB1424/AB1612 F3' TriNKET與人和石蟹獼猴BAFF-R的親和力高，與人和石蟹獼猴NKG2D的親和力低，與人和石蟹獼猴CD16a的親和力低。AB1424/AB1612 F3' TriNKET沒有顯示任何虛假的脫靶相互作用。AB1424/AB1612 F3' TriNKET與BAFF-R+細胞緊密結合並對其具有高度效力。最後，AB1424/AB1612 F3' TriNKET可以同時與BAFF-R和NKG2D結合，並在NK接合臂之間表現出穩健的協同作用，其功效需要BAFF-R、NKG2D和CD16a的三部分結合，突出了TriNKET的作用機制。 實例 5 - AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 與 CD16 受體結合的進一步分析
如實例4中所述，使用SPR進行如本實例中所述之結合分析。測量了AB1424/AB1612 F3’ TriNKET與人CD64（FcγRI）的結合，並顯示在 圖 75中。 表 42總結了從AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗的傳感圖確定的動力學速率和人CD64親和力值。 [ 表 42]. AB1424/AB1612 F3' TriNKET與人CD64結合的動力學參數和親和力值。
樣本 k a (1/Ms) k d (1/s) K D(nM)
AB1424/AB1612 F3’TRINKET 7.7 x 10 4 2.2 x 10 -4 2.9
AB1424/AB1612 F3’TRINKET 7.3 x 10 4 2.3 x 10 -4 3.1
AB1424/AB1612 F3’TRINKET 6.9 x 10 4 2.3 x 10 -4 3.4
AB1424/AB1612 F3’TRINKET 7.2 x 10 4 2.3 x 10 -4 3.2
平均值 ± SD (7.3 ± 0.3) x 10 4 (2.3 ± 0.0) x 10 -4 3.2 ± 0.2
           
曲妥珠單抗 9.9 x 10 4 2.0 x 10 -4 2.0
曲妥珠單抗 5.2 x 10 4 2.0 x 10 -4 3.9
曲妥珠單抗 9.2 x 10 4 2.1 x 10 -4 2.2
曲妥珠單抗 8.8 x 10 4 2.2 x 10 -4 2.5
平均值 ± SD (8.3 ± 2.1) x 10 5 (2.1 ± 0.1) x 10 -4 2.7 ± 0.9
測量了AB1424/AB1612 F3’ TriNKET與石蟹獼猴CD64（FcγRI）的結合，並顯示在 圖 76中。 表 43總結了從AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗的傳感圖確定的動力學速率和石蟹獼猴CD64親和力值。 [ 表 43]. AB1424/AB1612 F3' TriNKET與石蟹獼猴CD64結合的動力學參數和親和力值。
樣本 k a (1/Ms) k d (1/s) K D(nM)
AB1424/AB1612 F3’TriNKET 1.0 x 10 5 1.3 x 10 -4 1.3
AB1424/AB1612 F3’TriNKET 1.0 x 10 5 1.9 x 10 -4 1.9
AB1424/AB1612 F3’TriNKET 1.0 x 10 5 2.5 x 10 -4 2.4
AB1424/AB1612 F3’TriNKET 1.0 x 10 5 2.7 x 10 -4 2.7
平均值 ± SD (1.0 ± 0.0) x 10 5 (2.1 ± 0.7) x 10 -4 2.1 ± 0.6
           
曲妥珠單抗 1.7 x 10 5 1.4 x 10 -4 0.8
曲妥珠單抗 1.8 x 10 5 1.5 x 10 -4 0.8
曲妥珠單抗 1.8 x 10 5 1.4 x 10 -4 0.9
曲妥珠單抗 1.8 x 10 5 1.2 x 10 -4 0.9
平均值 ± SD (1.8 ± 0.0) x 10 5 (1.4 ± 0.1) x 10 -4 0.8 ± 0.1
測量了與人CD32a H131的結合，並顯示在 圖 77中。從傳感圖確定的親和力值總結在 表 44中。 [ 表 44]. AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗對人CD32a H131的親和力值。
樣本 重複 K D(μM) 重複 K D(μM) 重複 K D(μM) 重複 K D(μM) K D(μM) 平均值 ± SD
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.9 1.1 0.9 1.0 1.0 ± 0.1
曲妥珠單抗 1.4 1.1 1.3 1.3 1.3 ± 0.1
測量了AB1424/AB1612 F3’ TriNKET與人CD32a R131對偶基因（FcγRIIa R131）的結合，並顯示在 圖 78中。從傳感圖確定的所得親和力值總結在 表 45中。 [ 表 45]. AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗對人CD32a R131的親和力值。
樣本 重複K D (μM) 重複K D (μM) 重複 K D(μM) 重複K D (μM) K D(μM) 平均值 ± SD
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1.5 1.3 1.5 1.2 1.4 ± 0.1
曲妥珠單抗 1.9 1.6 1.9 1.5 1.7 ± 0.2
測量了AB1424/AB1612 F3’ TriNKET與人CD32b（FcγRIIb）的結合，並顯示在 圖 79中。從傳感圖確定的所得親和力值總結在 表 46中。 [ 表 46]. 人CD32b對AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗的親和力值。
樣本 重複K D(μM) 重複K D(μM) 重複K D(μM) 重複 K D(μM) K D(μM) 平均值 ± SD
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 5.9 5.5 5.8 6.3 5.9 ± 0.3
曲妥珠單抗 7.2 6.6 7.2 7.7 7.2 ± 0.5
測量了AB1424/AB1612 F3’ TriNKET與人CD16b（FcγRIIIb）的結合，並顯示在 圖 80中。從傳感圖確定的所得親和力值總結在 表 47中。 [ 表 47]. 人CD16b對AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗的親和力值。
樣本 重複K D(μM) 重複K D(μM) 重複K D(μM) 重複 K D(μM) K D(μM) 平均值 ± SD
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 7.0 6.3 7.9 6.4 6.9 ± 0.7
曲妥珠單抗 4.0 3.5 4.4 3.4 3.8 ± 0.5
測量了AB1424/AB1612 F3’ TriNKET與石蟹獼猴CD16的結合，並顯示在 圖 81中。從傳感圖確定的所得親和力值總結在 表 48中。 [ 表 48]. AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗對石蟹獼猴CD16的親和力值。
k a (1/Ms) k d (1/s) K D(nM)
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 7.8 x 10 4 2.0 x 10 -2 260.9
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 7.8 x 10 4 2.1 x 10 -2 268.8
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 7.2 x 10 4 2.0 x 10 -2 282.6
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 7.8 x 10 4 2.0 x 10 -2 260.4
平均值 ± SD (7.6 ± 0.4) x 10 4 (2.1 ± 0.0) x 10 -2 270.8 ± 11.0
  
曲妥珠單抗 1.9 x 10 5 1.2 x 10 -2 66.1
曲妥珠單抗 1.6 x 10 5 1.2 x 10 -2 76.2
曲妥珠單抗 1.6 x 10 5 1.2 x 10 -2 78.9
曲妥珠單抗 1.6 x 10 5 1.3 x 10 -2 79.0
平均值 ± SD (1.7 ± 0.2) x 10 5 (1.2 ± 0.0) x 10 -2 73.7 ± 6.8
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET與人FcRn的結合在pH 6.0進行測量，並顯示在 圖 82中。從傳感圖確定的所得親和力值總結在 表 49中。 [ 表 49]. AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗在pH 6.0對人FcRn的親和力值。
樣本 重複K D(μM) 重複K D(μM) 重複K D(μM) 重複K D(μM) K D(μM) 平均值 ± SD
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1.0 1.0 1.1 1.1 1.0 ± 0.0
曲妥珠單抗 1.6 1.4 1.5 1.5 1.5 ± 0.1
測量了AB1424/AB1612 F3’ TriNKET與石蟹獼猴FcRn的結合，並顯示在 圖 83中。從傳感圖確定的所得親和力值總結在 表 50中。 [ 表 50]. AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗在pH 6.0對石蟹獼猴FcRn的親和力值。
樣本 重複K D(μM) 重複K D(μM) 重複K D(μM) 重複K D(μM) K D(μM) 平均值 ± SD
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 ± 0.0
曲妥珠單抗 1.5 1.3 1.5 1.3 1.4 ± 0.1
AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗在pH 7.4與人和石蟹獼猴FcRn的可量化結合的缺乏得到證實，並顯示在 圖 84。在pH 6.0 FcRn結合實驗之前，在相同的Biacore晶片表面上運行pH 7.4結合。
AB1424/AB1612 F3' TriNKET和IgG1同種型對照曲妥珠單抗沒有表現出生理上有意義的差異（差異小於3倍），並且它們與測試的人和石蟹獼猴CD64（FcγRI）和CD16（FcγRIII）重組受體的結合相當（表50）。AB1424/AB1612 F3’ TriNKET和曲妥珠單抗在與人CD32（FcγRII）受體的結合方面相似（差異小於1.2倍）（ 表 51）。 [ 表 51]. FcγR對AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗的親和力的總結。
分析物 人 CD64 K D ， nM Cyno CD64 K D ， nM 人 CD32a K D ， μM 人 CD16a K D ， nM 人 CD32b K D ， μM 人 CD16b K D ， μM Cyno CD16 K D ， nM
H131 R131 V158 F158
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 3.2 ± 0.2 2.1 ± 0.6 1.0 ± 0.1 1.4 ± 0.1 129.3 ± 5.2 1346.2 ± 72.6 5.9 ± 0.3 6.9 ± 0.7 270.8 ± 11.0
曲妥珠單抗 2.7 ± 0.9 0.8 ± 0.1 1.3 ± 0.1 1.7 ± 0.2 50.3 ± 3.9 448.1 ± 20.1 7.2 ± 0.5 3.8 ± 0.5 73.7 ± 6.8
此外，AB1424/AB1612 F3' TriNKET在pH 6.0對人和石蟹獼猴FcRn的親和力與曲妥珠單抗相似。AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗在pH 7.4測試的濃度下未顯示任何可檢測的結合（ 表 52）。 [ 表 52]. AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗結合人和石蟹獼猴FcRn的總結。
分析物 人 FcRn ， pH 6.0 K D ， µM 人 FcRn ， pH 7.4 K D ， µM Cyno FcRn ， pH 6.0 K D ， µM Cyno FcRn ， pH 7.4 K D ， µM
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1.0 ± 0.0 沒有可量化的結合 1.0 ± 0.0 沒有可量化的結合
曲妥珠單抗 1.5 ± 0.1 沒有可量化的結合 1.4 ± 0.1 沒有可量化的結合
實例 6- 效力分析 AB1424/AB1612 F3 TriNKET
如實例4中所述進行KHYG-1 CD16V介導的細胞毒性測定。
如 圖 85所示，對AB1424/AB1612 F3' TriNKET的兩個不同生產批次進行了效力測試。將在expiCHO細胞（AB1612-002）中表現的AB1424/AB1612 F3' TriNKET與在CHO-M細胞（AB1612-003）中表現的AB1424/AB1612 F3' TriNKET批次進行比較。兩種分子都表現出相當的效力和BJAB靶細胞的最大裂解（顯示在 表 53中）。該等結果證明了AB1424/AB1612 F3' TriNKET在兩個不同生產批次和兩個不同表現系統中的效力的一致性。此外，該等數據表明，使用KHYG-1-CD16V和BJAB細胞的細胞毒性測定係穩健的，可以用作批次釋放生物測定。 [ 表 53] .KHYG-1-CD16V EC 50值
分子 EC 50 （ nM ） % 最大裂解
AB1612-002 0.13 108
AB1612-003 0.13 105
確定了KHYG-1-CD16V + BJAB測定檢測AB1424/AB1612 F3' TriNKET效力變化的靈敏度。 圖 86B顯示使用100% AB1424/AB1612 F3' TriNKET作為參考標準（EC50 = 0.03 nM）與200%標稱藥物濃度（NDC）和50% NDC下的分子相比的劑量響應曲線。200% AB1424/AB1612 F3' TriNKET和50% AB1424/AB1612 F3' TriNKET的相對效力係藉由將EC 50值歸一化為100% AB1424/AB1612 F3' TriNKET的EC 50而計算的。使用100% AB1424/AB1612 F3' TriNKET作為參考，較高濃度（200% AB1424/AB1612 F3' TriNKET）表現出相對效力為200%，而較低濃度（50% AB1424/AB1612 F3' TriNKET）表現出相對效力為65%。使用KHYG-1-CD16V效應細胞和BJAB靶細胞的AB1424/AB1612 F3' TriNKET的200%、100%和50% NDC的相對效力表明，在這種基於細胞的效力測定中觀察到的EC50值的變化係在50%-200%標稱藥物濃度範圍內幾乎呈線性（ 表 54）。 [ 表 54] .KHYG-1 CD16V EC 50值
分子 EC 50 （ nM ） % 最大裂解
50% AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.05 120
100% AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.03 119
200% AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.02 114
實例 7- 高濃度 AB1424/AB1612 F3 TriNKET 可行性和穩定性分析 PEG 沈澱
進行PEG沈澱研究以確定AB1424/AB1612 F3' TriNKET的穩定性。簡而言之，在10 mM乙酸鹽pH 5.0和20 mM組胺酸pH 6.0中評估膠體穩定性。對於每種緩衝液，製備40% w/v的PEG-6000儲備溶液，並將含乙酸鹽的溶液的pH調整為5.0，含組胺酸的溶液的pH調整為6.0。從PEG儲備液、緩衝液儲備液和蛋白儲備液（在PBS中濃度為36.9 mg/mL或34.4 mg/mL）生成了PEG-6000滴定曲線，由於稀釋係數高達1 mg/mL，因此無需更換緩衝液）。PEG滴定曲線涵蓋從0到30% w/v PEG-6000的濃度，對於每個緩衝液中的阿達木單抗對照或AB1424/AB1612 F3' TriNKET，一式三份地準備每個點。混合溶液後，將樣本在5°C下孵育過夜，並以15,000 rpm的速度離心10分鐘（在預冷的5°C離心機中）以去除沈澱的蛋白。然後去除上清液，藉由280 nm處的吸光度讀取濃度。然後將濃度對PEG濃度作圖以確定中點（C m）；C m＞ 20% PEG-6000被認為具有良好的膠體穩定性。
使用PEG沈澱法在兩種緩衝液（20 mM組胺酸，pH 6.0和10 mM乙酸鹽，pH 5.0）中研究了AB1424/AB1612 F3'TriNKET的膠體穩定性。阿達木單抗被用作性能良好的商用生物治療性抗體的基準參考。在這兩種緩衝液中，AB1424/AB1612 F3' TriNKET顯示出比阿達木單抗更高的膠體穩定性，為其濃縮至高蛋白濃度的能力提供了信心（ 圖 87A-87B， 圖 88A-88B， 表 55）。在組胺酸中，AB1424/AB1612 F3' TriNKET顯示C m18.1 ± 0.09，而在乙酸中，C m為20.6 ± 0.15，滿足高膠體穩定性標準。 [ 表 55] .PEG沈澱C m總結匯總。
C m(%PEG) 10 mM 鹽酸鹽， pH 5 20 mM 組胺酸， pH 6
阿達木單抗 AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 阿達木單抗 AB1424/AB1612 F3’ TriNKET
濃度 13.3 ± 0.5 20.6 ± 0.2 11.2 ± 0.3 18.1 ± 0.1
動態光散射（ DLS ）
AB1424/AB1612 F3' TriNKET的自相互作用傾向藉由DLS在pH範圍從5.0到7.0的三種不同緩衝液（20 mM乙酸鹽，pH 5.0；20 mM組胺酸，pH 6.0；或20 mM磷酸鹽，pH 7.0）中進行了探索。對於DLS，簡而言之，k D係使用在高靈敏度DLS模式下運行的Nanotemper Prometheus Panta確定的。簡而言之，在緩衝液中製備樣本，然後將10 μL裝入三個單獨的毛細管中以進行每種濃度的分析。結果適用於Panta分析軟體，並分別計算每個緩衝液的k D值。阿達木單抗被用作已知能夠以高濃度配製和投與的性能良好的商用生物製品的實例。
與PEG沈澱的發現一樣，當比較兩種分子的緩衝液之間的k D（藉由DLS）值時，乙酸鹽和組胺酸表現出強正值，而磷酸鹽表現出負值或輕微正值，如 圖 89A-89B， 圖 90A-90B和 表 56所示。在乙酸鹽和組胺酸中，AB1424/AB1612 F3' TriNKET與阿達木單抗相比表現出等效或更好的k D，這係根據正值的大小來判斷的。該等數據證實了PEG沈澱的發現，AB1424/AB1612 F3' TriNKET在乙酸鹽和組胺酸緩衝液中均優於阿達木單抗。PEG沈澱和DLS都強烈表明AB1424/AB1612 F3' TriNKET具有高構象和膠體穩定性，並且適用於高濃度配製物。 [ 表 56]. 自相互作用（k D）總結。
測試品 20 mM 鹽酸鹽， pH 5 20 mM 組胺酸， pH 6 20 mM 磷酸鹽， pH 7
阿達木單抗 +8.5 +5.0 +1.1
AB1424/AB1612 F3’TriNKET +25.4 +18.3 -4.9
濃縮可行性研究
小規模進行的濃縮可行性研究表明，AB1424/AB1612 F3' TriNKET可以濃縮至約150 mg/mL。總體而言，基於蛋白的起始/結束量，產率為88.5%，如表57中所示。如 表 58中的SEC-MALS所示，樣本具有高純度並匹配預期分子量。 [ 表 57]. 可行性材料濃度總結。
旋轉 ＃ 起始體積 （ mL ） 起始濃度（ mg/mL ） 蛋白 （ mg ） 最終體積（ mL ） a 最終濃度（ mg/mL ） 蛋白（ mg ） % 回收
1 8.0 12.8 102.5 3.3 31.3 101.7 99.2
2 3.1 31.3 95.4 1.5 66.2 98.6 103.4
3 1.4 66.2 92.0 0.9 101.4 95.4 103.6
4 0.8 101.4 85.2 0.7 126.1 87.0 102.1
5 0.6 126.1 80.7 0.6 146.3 86.3 107.0
最終回收（濃縮、保留、洗滌） 90.7 88.5
a中間旋轉的最終體積係藉由手動移液滲透液並從起始體積中減去體積來確定的。最終%回收藉由測量滯留物的體積來確定。 [ 表 58] : 可行性材料 SEC-MALS 分析總結。
樣本 %HMW % 單體 單體 Mw （ kDa ± 不確定性） a
起始材料 0.2 99.8 110.3 ± 0.9%
旋轉1 0.2 99.8 115.2 ± 0.8%
旋轉2 0.3 99.7 115.9 ± 0.4%
旋轉3 0.3 99.7 116.9 ± 0.7%
旋轉4 0.3 99.7 117.7 ± 0.8%
旋轉5/最終材料 0.3 99.7 117.9 ± 0.7%
a 基於序列的理論Mw約為125 kDa 批量材料濃度
將約350 mg的AB1424/AB1612 F3' TriNKET濃縮至約140 mg/mL，用於熱穩定性評估和黏度測定。用於加速穩定性和黏度的大批量高濃度材料與可行性批次分開生成。該材料係從HST中的緩衝液交換的AB1424/AB1612 F3' TriNKET生成的，與可行性研究一樣，藉由SEC產生了大量高單體含量的材料，總結在 表 59中。 [ 表 59] .批量材料濃度總結。
旋轉 ＃ 起始體積 （ mL ） 起始濃度（ mg/mL ） 蛋白 （ mg ） 最終體積（ mL ） a 最終濃度（ mg/mL ） 蛋白（ mg ） %回收 b
1 25.5 13.5 344.3 14.5 23.50 339.6 98.6
2 14.5 23.5 339.6 10.1 33.90 340.7 100.3
3 10.1 33.9 340.7 6.8 49.50 336.6 98.8
4 6.8 49.5 336.6 3.7 110.50 408.9 121.5
5 3.7 110.5 408.9 3.2 136.40 429.7 105.1
6 3.2 136.4 429.7 1.9 154.1 288.2 62.5
   最終回收（濃縮、保留、洗滌） 303.5 89.4
a中間旋轉的最終體積係藉由手動移液滲透液並從起始體積中減去體積來確定的。最終%產率藉由測量滯留物的體積來確定。 b注意：在評估濃縮過程的回收時，只應考慮最終的%回收。 [ 表 60] .批量材料濃度SEC分析總結。
樣本 濃度（ mg/mL ） %HMW % 單體
起始材料 13.5 0.3 99.7
旋轉1 23.5 0.5 99.5
旋轉2 33.9 0.3 99.7
旋轉3 49.5 0.3 99.7
旋轉4 110.5 0.3 99.7
旋轉5 136.4 0.3 99.7
旋轉6 154.1 0.4 99.6
最終材料 154.1 0.3 99.7
黏度測定
在0至140 mg/mL的AB1424/AB1612 F3' TriNKET（配製在HST緩衝液中）濃度範圍內在25°C測定配製物的黏度。濃度如下，0、5、15、25、75、100、120和140 mg/mL。使用配備B05流道（深度 = 50 μm，P max= 42 kPa）的VROC® initium高通量黏度計，藉由RheoSense（加利福尼亞州聖拉蒙）分析樣本。NIST可溯源牛頓標準油（Cannon N10 Lot 19201，25°C下15.84 cP）經過測試，以在分析樣本之前確認流道和儀器的一致性能。在22,040秒 -1的最大剪切速率下測量緩衝液和濃度5至75 mg/mL。對三個最高濃度（100、120和140 mg/mL）進行剪切速率掃描。
根據RheoSense測定，在HST緩衝液中配製的濃度範圍為5至140 mg/mL的AB1424/AB1612 F3' TriNKET的黏度在可接受的範圍內（＜ 20 cP）。最高濃度（140 mg/mL）的黏度僅為4.5 cP，完全在自動注射器溶液可接受的＜ 20 cP黏度範圍內。結果示於 圖 91和 表 61 。[ 表 61] .25°C時的黏度分析總結。
樣本 緩衝液 濃度 （ mg/mL ） 平均黏度 （ cP ） STDEV （ cP ） %RSD N
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET HST 0 1.186 0.005 0.40 11
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET HST 5 1.225 0.002 0.20 13
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET HST 15 1.326 0.004 0.27 13
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET HST 25 1.437 0.004 0.28 12
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET HST 75 2.291 0.004 0.16 12
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET HST 100 2.844 0.007 0.26 19
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET HST 120 3.524 0.008 0.22 18
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET HST 140 4.528 0.006 0.14 20
在 HST 中的高濃度加速（ 40°C ）穩定性， pH 6.0
為了探索AB1424/AB1612 F3' TriNKET在高濃度下是否穩定，藉由在HST配製物中將AB1424/AB1612 F3' TriNKET在40°C孵育4週以上並藉由以下方法評估蛋白的結構和功能穩定性進行了加速穩定性研究：A280、濁度、乳光、SEC、CE-SDS、cIEF、BAFFR+ 細胞結合、SPR和效力。4週後，AB1424/AB1612 F3' TriNKET的濃度從135 mg/mL略微增加到160 mg/mL，這與高溫下的一些蒸發一致。濁度和乳光不隨時間變化（ 表 62）。 [ 表 62] .AB1424/AB1612 F3' TriNKET UV-VIS在40°C在HST在pH 6.0孵育後結果匯總。
測試品 濃度（ mg/mL ） 濁度 （ A350 nm ） 乳光 （ A500 nm ）
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，對照 135.4 0.3 ＜ 0.1
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，1週 147.7 0.3 ＜ 0.1
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，2週 142.0 0.3 ＜ 0.1
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，3週 146.9 0.3 ＜ 0.1
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，4週 160.9 0.4 ＜ 0.1
粒徑篩析層析（ SEC ）
SEC如實例4中所述進行。高濃度AB1424/AB1612 F3' TriNKET在40°C在pH 6.0在HST中孵育4週後表現出高穩定性。4週後，HMWS從1.2%輕微增加到2.0%，LMWS從1.1%增加到1.4%，單體從99.4%減少到97.0%，表明高濃度對應激評估期間的聚集沒有有意義的影響（ 圖 92和 表 63）。 [ 表 63]. AB1424/AB1612 F3' TriNKET SEC在40°C在HST中在pH 6.0孵育後的結果匯總。
測試品 單體（ % ） HMWS （ % ） LMWS （ % ）
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，對照 99.4 0.6 0.0
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，1週 98.6 1.4 0.0
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，2週 98.5 1.5 0.0
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，3週 96.9 2.2 0.9
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，4週 97.0 2.0 1.0
CE-SDS （還原）
藉由還原的CE-SDS評估的純度顯示在40°C下4週孵育期間純度損失0.1%（ 圖 93和 表 64）。在還原條件下，觀察到三個預期鏈（LC、HC和scFv-Fc鏈）。 [ 表 64] .AB1424/AB1612 F3’ TriNKET R CE-SDS純度在40°C 在HST中在pH 6.0 4週後的總結。
測試品 R CE-SDS 純度（ % ）
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，對照 99.7
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，1週 99.8
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，2週 99.7
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，3週 99.5
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，4週 99.6
毛細管等電聚焦（ cIEF ）
如實例4中所述執行cIEF。藉由cIEF確定的電荷譜表明在40°C在HST中4週後酸從對照中的55.7%主峰變為44.3%主峰（ 圖 94和 表 65）。 [ 表 65] .AB1424/AB1612 F3’ TriNKET iCIEF結果在40°C在HST中在pH 6.0孵育後的總結。
測試品 酸性（ % ） 主（ % ） 鹼性（ % ）
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，對照 39.7 55.7 4.8
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，1週 40.2 53.7 6.1
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，2週 42.9 50.5 6.5
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，3週 47.2 46.1 6.8
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，4週 48.7 44.3 7.0
靶標結合和效力
在對照樣本和應激樣本之間，在與所有三個預期靶標（BAFF-R、NKG2D和CD16a）的結合方面沒有觀察到有意義的差異（ 圖 95A-95B和 表 66）。 [ 表 66]. 在40°C在HST中在pH 6.0 4週後高濃度AB1424/AB1612 F3' TriNKET對hNKG2D、hCD16a V158的動力學參數和結合親和力以及對於細胞表現的hBAFF-R的EC 50。
測試品 靶標 k a (M -1s -1) k d (s -1) K D(nM) K D(nM) 穩態
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET, HST, pH 6.0 對照 hNKG2D （2.2 ± 0.0）*10 5 （1.1 ± 0.0）*10 -1 502.9 ± 5.9 544.3 ± 8.3
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET, HST, pH 6.0 40°C，4週 hNKG2D （2.1 ± 0.1）*10 5 （1.0 ± 0.0）*10 -1 492.6 ± 9.7 521.9 ± 15.7
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET, HST, pH 6.0 對照 hCD16aV （1.3 ± 0.3）*10 5 （1.7 ± 0.0）*10 -2 144.8 ± 40.3 N/A
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET, HST, pH 6.0 40°C，4週 hCD16aV （1.2 ± 0.4）*10 5 （1.6 ± 0.0）*10 -2 144.7 ± 40.4 N/A
  
   EC 50 （ nM ）
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET, HST, pH 6.0 對照 hBAFF-R 0.82
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET, HST, pH 6.0 40°C，4週 hBAFF-R 0.83
n ≥ 3個重複
在對照和應激樣本之間沒有檢測到效力差異，在KHYG-1-CD16aV介導的細胞毒性測定中量化為細胞裂解百分比（圖96和表67）。 [ 表 67]: 在HST中在pH 6.0 4週後高濃度AB1424/AB1612 F3' TriNKET EC 50和最大裂解的總結。
測試品 EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ）
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，對照 0.01 94
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，1週 0.01 100
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，2週 0.01 99
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，3週 0.01 94
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，4週 0.03 92
實例 8 - AB1424/AB1612 F4 TriNKET 形式的分子分析
在此示例中，分析了AB1424/AB1612 F4 TriNKET的分子形式、設計、結構和特徵。該等研究a) 提供了分子的基本生化和生物物理學特徵，b) 確定了AB1424/AB1612 F4 TriNKET對BAFF-R、NKG2D、CD16a、一組FcγR和FcRn的親和力，c) 證實了AB1424/AB1612 F4 TriNKET對BAFF-R+ 癌細胞的結合，d) 證明了AB1424/AB1612 F4 TriNKET的選擇性，e) 確定了AB1424/AB1612 F4 TriNKET殺傷BAFF-R+癌細胞方面的效力，以及f) 評估AB1424/AB1612 F4 TriNKET在暴露於熱、化學和機械應激後的結構和功能完整性。
AB1424/AB1612 F4 TriNKET係F4形式的TriNKET。AB1424/1612 F4 TriNKET在本文中有時稱為AB1426。AB1424/1612 F4 TriNKET（AB1424/1612-F4）包括四種多肽：第一多肽包含AB1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3-A49MI-scFv（SEQ ID NO: 271）（「鏈M」），第二多肽包含AB-1424/1612-VH-CH1-CH2-CH3（SEQ ID NO: 272）（「鏈H」），以及第三和第四多肽，各自包含AB1424/1612-VL-CL（SEQ ID NO: 273）（「鏈L」）。 分子建模
使用SAbPred網站上提供的Therapeutic Antibody Profiler（TAP），將AB1424/AB1612 F4 TriNKET的抗BAFF-R和抗NKG2D結合臂與377種I期後生物治療性分子進行了比較。TAP使用ABodyBuilder藉由PEARS為帶有側鏈的AB1424/AB1612生成模型。CDRH3因其多樣性而由MODELLER構建。
評估了五個不同的參數： CDR總長度 CDR附近的表面疏水性（PSH）塊 CDR附近的正電荷（PPC）斑塊 CDR附近的負電荷（PNC）斑塊 結構Fv電荷對稱參數（sFvCSP）
然後將AB1424/AB1612 F4 TriNKET的該等參數與治療性抗體的分佈譜進行比較，以預測可開發性和可能導致下游挑戰的任何潛在問題。
圖 97係AB1424/AB1612 F4 TriNKET的BAFF-R Fab結合臂的可變結構域在三個不同取向的模型（上分圖）和在相同取向的對應表面電荷分佈（下圖）。CDR介面的表面電荷分佈主要是帶負電荷的（「頂視圖」，下分圖）和一些疏水殘基簇。BAFF-R臂的表面電荷分佈跨模擬的互補位均勻分佈。AB1424/AB1612 F4 TriNKET的BAFF-R結合臂的疏水塊分析以絕大多數治療性mAb為基準（ 圖 98）。正電荷和負電荷的表面塊與對mAb表現的不利影響和加速的體內清除有關。對於AB1424/AB1612 F4 TriNKET的BAFF-R結合臂，帶正電的塊、帶負電的塊和電荷對稱性類似於大多數參考mAb（ 圖 99）。NKG2D結合臂被建模並以三個不同的取向描繪，並且顯示了它們相應的表面電荷分佈（ 圖 99 ）。NKG2D臂的表面電荷分佈跨模擬的互補位均勻分佈。 圖 100顯示了AB1424/AB1612 F4 TriNKET的NKG2D結合臂的總CDR長度和表面特徵分析。總之，既沒有發現異常的表面電荷特性，也沒有發現異常的表面疏水性塊。 AB1424/AB1612 F4 TriNKET 表現和純化
AB1424/AB1612 F4 TriNKET在ExpiCHO細胞中表現並純化。AB1424/AB1612 F4 TriNKET的純度藉由粒徑篩析層析法（SEC）和毛細管電泳十二烷基硫酸鈉（CE-SDS）確定。AB1424/AB1612 F4 TriNKET表現出高單體含量（≥ 98.6%，如 圖 101所示），並且在CE-SDS下未觀察到主要雜質。藉由SEC和CE-SDS確定的三批AB1424/AB1612 F4 TriNKET的純度總結在 表 68中。 [ 表 68] .藉由SEC和CE-SDS對AB1424/AB1612 F4 TriNKET的純度分析。
測試品 SEC CE-SDS
% 單體 % 純度
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 99.7 99.9
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 98.6 99.7
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 98.6 99.7
cIEF 的電荷譜分析
AB1424/AB1612 F4 TriNKET的電荷分佈藉由毛細管等電聚焦（cIEF）進行分析（ 圖 102和 表 69）。AB1424/AB1612 F4 TriNKET在pI為9.3時顯示出主峰。還觀察到幾個不太豐富的重疊酸性峰和次要鹼性峰。 [ 表 69] .根據cIEF的AB1424/AB1612 F4 TriNKET的電荷譜結果。
測試品 pI % 酸性 % 主 % 鹼性
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 9.3 44.4 52.2 3.4
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 9.3 52.7 44.2 3.1
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 9.3 51.3 45.3 3.3
疏水相互作用層析
疏水性預測數據藉由使用分析型疏水相互作用層析（HIC）研究AB1424/AB1612 F4 TriNKET行為得到證實，該技術依賴於具有明顯暴露的疏水塊的蛋白更易於聚集。HIC如以上實例4中所述進行。AB1424/AB1612 F4 TriNKET在分析型HIC柱上的滯留時間如 表 70中所示並且HIC譜如 圖 103A所示。商用阿達木單抗和派姆單抗被用作表現良好的生物製劑的實例，並作為測定的內部對照。AB1424/AB1612 F4 TriNKET的滯留時間為9.7分鐘，而派姆單抗為11.2分鐘，阿達木單抗為8.7分鐘。因此，實驗疏水性分析表明，AB1424/AB1612 F4 TriNKET的疏水性對於進一步開發係可接受的。 [ 表 70] .AB1424/AB1612 F4 TriNKET的HIC分析
測試品 滯留時間（ min ） 相對於阿達木單抗 /Humira 的滯留時間（分鐘）
阿達木單抗/Humira 8.7 N/A
派姆單抗/Keytruda 11.2 +2.5
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 9.7 +1.0
熱穩定性分析
AB1424/AB1612 F4 TriNKET的熱穩定性藉由微差掃描熱量法（DSC）在PBS pH 7.4或HST中進行評估，HST包含20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.01% tween-80，pH 6.0。DSC如以上實例4中所述進行。
AB1424/AB1612 F4 TriNKET在兩種緩衝液中均表現出高熱穩定性（ 圖 103B和 表 71）。 [ 表 71] .AB1424/AB1612 F4 TriNKET的熱穩定性
測試品 緩衝液 T 開始 (°C) T m1(°C) T m2(°C) T m3(°C)
AB1424/AB1612 F4 TriNKET PBS，pH 7.4 62.5 69.3 71.2 75.4
AB1424/AB1612 F4 TriNKET HST，pH 6.0 63.3 70.3 74.2 79.4
二硫鍵排列
AB1424/AB1612 F4 TriNKET被構建為基於單株IgG1抗體骨架的經工程改造的分子。雖然典型的IgG1包含16個二硫鍵，但AB1424/AB1612 F4 TriNKET的F4形式由20個二硫鍵構建。
AB1424/AB1612 F4 TriNKET的二硫鍵排列藉由非還原胰蛋白酶消化物的LC-MS/MS肽做圖分析得到證實。二硫鍵肽藉由MS/MS數據庫搜索鑒定，並藉由比較它們在天然和還原消化物中的強度來確認。確認了抗體結構中預期的所有標準二硫化物。 圖 104顯示了Fc（未還原和還原）中經工程改造的二硫化物對的提取離子層析圖（XIC）以及該肽對的最強電荷狀態。類似地， 圖 105中的XIC證實了為穩定scFv而引入的經工程改造的雙硫鍵的存在。在AB1424/AB1612 F4 TriNKET中觀察到的二硫鍵連接的肽的總結顯示在 表 72中。所有理論二硫鍵連接的肽均以高質量準確度（＜ 2.0 ppm）觀察到，可還原，並藉由MS/MS碎裂進行序列確認。 [ 表 72] .二硫化物連接的肽理論和實驗質量。
鏈 結構域 肽 理論質量（ Da ） 實驗質量（ Da ） 質量準確度（ ppm ）
L VL L2:L7 5147.4056 5147.4132 1.4
CL L11:L18 3555.7490 3555.7490 0.4
H VH H3:H11 3408.4638 3408.4599 -1.0
CH1 H16:H17-18 7916.9194 7916.9058 -1.5
CH2 H26:H33 2328.0977 2328.0961 -0.7
CH3 H40:H44 4432.0675 4432.0636 -0.9
M VH M3:M11 非唯一，參見H3:H11
CH1 M16:M17-18 非唯一，參見H16:H17-18
CH2 M26:M33 非唯一，參見H26:H33
CH3 M42:M47 3844.8236 3844.8302 1.4
scFv VL M49:M54 4482.0784 4482.0759 -0.4
scFv穩定化* M55:M61* 3183.4417 3183.4433 0.8
scFv VH M59:M66 3371.4686 3371.4708 0.8
分子間 鉸鏈 H23-24:M23-24 5454.7834 5454.7855 0.5
CL-CH1 L19-20:H22 1260.4863 1260.4843 -1.6
CL-CH1 L19-20:M22 非唯一，參見L19-20:H22
CH3-CH3* H39:M40-41* 2757.3830 2757.3889 1.9
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 的結合特性
過表現人和石蟹獼猴BAFF-R的等基因細胞系係從CHO細胞開發的。將AB1424/AB1612 F4 TriNKET與細胞表面表現的BAFF-R的結合與親代BAFF-R特異性抗體以及不含BAFF-R結合劑的F4形式對照（F4-帕利珠單抗）進行比較。AB1424/AB1612 F4 TriNKET及其親代mAb在與人和石蟹獼猴BAFF-R的結合方面表現出相似的劑量響應（ 圖 106A-106B）。在比較與人和石蟹獼猴BAFF-R的結合時，AB1424/AB1612 F4 TriNKET和親代mAb的EC 50和最大FOB幾乎相同（ 表 73）。 [ 表 73] .AB1424/AB1612 F4 TriNKET和親代mAb與人和石蟹獼猴細胞表面表現的BAFF-R結合。
人 BAFF-R + 等基因 CHO 石蟹獼猴 BAFF-R + 等基因 CHO
測試品 EC 50 （ nM ） 最大 FOB EC 50 （ nM ） 最大 FOB
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 0.37 ±0.11 120 ±86 0.51 ±0.03 56 ±52
親代mAb 0.39 ±0.17 123 ±85 0.57 ±0.23 58 ±50
藉由流動式細胞分析術評估AB1424/AB1612 F4 TriNKET與BAFF-R+癌細胞系的子集的結合。AB1424/AB1612 F4 TriNKET以低奈米莫耳EC 50結合到BJAB、Raji、RL、Rs4;11、Jeko-1和SUDHL-6細胞上的細胞表面BAFF-R。EC 50在BAFF-R+癌細胞系之間係相當的（ 表 74）。 [ 表 74]. AB1424/AB1612 F4 TriNKET與BAFF-R +人癌細胞系的結合
細胞系 AB1424/AB1612 F4 TriNKET EC 50 （ nM ）
BJAB 0.37 ± 0.16
Raji 0.13 ± 0.02
RL 0.17 ± 0.02
Rs4;11 0.08 ± 0.03
Jeko-1 0.08 ± 0.03
SUDHL-6 0.18 ± 0.04
AB1424/AB1612 F4 TriNKET與人和石蟹獼猴NKG2D的結合藉由（SPR）評估（ 圖 107）。NKG2D係天然二聚物，因此本實驗使用重組mFc標記的NKG2D二聚物。 表 75顯示了對人和石蟹獼猴NKG2D的穩態親和力。AB1424/AB1612 F4 TriNKET對人和石蟹獼猴NKG2D的親和力相當。 [ 表 75] .藉由SPR測量的AB1424/AB1612 F4 TriNKET對人NKG2D的穩態親和力。
測試品 對人 NKG2D 的親和力 K D(µM) 對石蟹獼猴 NKG2D 的親和力 K D(µM)
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 6.9 7.0
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 6.7 7.7
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 7.0 6.9
平均值 ± StDev 6.9 ± 0.2 7.2 ± 0.5
AB1424/AB1612 F4 TriNKET係用人IgG1 Fc構建的，旨在維持與Fc受體的相互作用。CD16a的接合係TriNKET作用機制的關鍵驅動因素。如 表 76中所示，作為藉由SPR進行的完整FcR組分析的一部分對人CD16a V158和F158對偶基因以及石蟹獼猴CD16的結合進行了評估，並證明AB1424/AB1612 F4 TriNKET結合人和石蟹獼猴CD16與IgG1同種型對照曲妥珠單抗相當。 圖 108、 圖 109和 圖 110分別代表CD16a V158、F158和石蟹獼猴CD16的原始數據和擬合傳感圖。因此，AB1424/AB1612 F4 TriNKET表現出與CD16的良好結合。
AB1424/AB1612 F4 TriNKET以與曲妥珠單抗相當的親和力結合人和石蟹獼猴Fcγ受體，曲妥珠單抗係一種已上市的IgG1生物製劑，用作實驗對照。 表 76表示測試的FcγR的親和力值的總結。 圖 111、 圖 112、 圖 113、 圖 114、 圖 115 、圖 116、 圖 117和 圖 118代表原始和擬合的傳感圖。 [ 表 76]. AB1424/AB1612 F4 TriNKET和曲妥珠單抗對人和石蟹獼猴FcγR的親和力的總結。
分析物 人 CD64 K D ， nM Cyno CD64 K D ， nM 人 CD32a K D ， mM 人 CD16a K D ， nM 人 CD32b K D ， mM 人 CD16b K D ， mM Cyno CD16 K D ， nM
H131 R131 V158 F158
AB1424/AB1612 F4 TRINKET 3.4 ± 0.3 0.7 ± 0.1 1.0± 0.1 1.4± 0.2 135.0±10.0 1259.9 ± 98.5 6.1 ± 0.3 7.4 ± 1.0 232.1 ± 6.5
曲妥珠單抗 2.7 ± 0.9 0.8 ± 0.1 1.3± 0.1 1.7± 0.2 65.6 ± 8.3 448.1± 20.1 7.2 ± 0.5 3.8 ± 0.5 73.7 ±6.8
藉由SPR評估AB1424/AB1612 F4 TriNKET與人和石蟹獼猴FcRn的結合。AB1424/AB1612 F4 TriNKET對人和石蟹獼猴FcRn的親和力跨物種相似並且與曲妥珠單抗（用作實驗對照的市售IgG1生物製劑）的親和力相似（ 表 77）。 圖 116和 圖 117分別表示在pH 6.0人和石蟹獼猴FcRn結合的穩態擬合和結合傳感圖。 圖 118表明，與IgG1同種型對照曲妥珠單抗類似，AB1424/AB1612 F4 TriNKET在pH 7.4缺乏與人和石蟹獼猴FcRn的顯著結合。 [ 表 77] .AB1424/AB1612 F4 TriNKET和曲妥珠單抗與人和石蟹獼猴FcRn的結合。
分析物 人 FcRn ， pH 6.0 K D ， μM 人 FcRn ， pH 7.4 K D ， μM Cyno FcRn ， pH 6.0 K D ， μM Cyno FcRn ， pH 7.4 K D ， μM
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 1.3 ± 0.0 沒有可量化的結合 1.2 ± 0.0 沒有可量化的結合
曲妥珠單抗 1.5 ± 0.1 沒有可量化的結合 1.4 ± 0.1 沒有可量化的結合
抗原結合位點的共接合
為了證明人CD16a與人NKG2D結合的共接合的協同作用，進行了SPR實驗，其中AB1424/AB1612 F4 TriNKET分別與NKG2D和CD16a結合，與混合的NKG2D-CD16a Biacore晶片表面進行比較。AB1424/AB1612 F4 TriNKET對人NKG2D和人CD16a的親和力都很低，但是，同時結合這兩個靶標會導致親合力效應，表現為較慢的解離速率。數據表明AB1424/AB1612 F4 TriNKET可以積極接合CD16a和NKG2D（ 圖 119）。
為了確定AB1424/AB1612 F4 TriNKET與一個靶標的結合是否會干擾其與另一個靶標的結合，將BAFF-R和NKG2D依次注射到捕獲在抗hFc IgG SPR晶片上的AB1424/AB1612 F4 TriNKET上（ 圖 120A）。靶標結合傳感圖表明BAFF-R結合臂的佔用狀態不干擾NKG2D結合（ 圖 120A）。同樣，數據表明NKG2D結合臂的佔用不禁止BAFF-R結合（ 圖 120B）。描述每個靶標與游離AB1424/AB1612 F4 TriNKET和已被其他靶標飽和的AB1424/AB1612 F4 TriNKET的結合的各個傳感圖區段的形狀的相似性表明AB1424/AB1612 F4 TriNKET的靶標佔用狀態對運動參數沒有顯著影響。例如，兩個分圖中傳感圖的BAFF-R結合區段的形狀相似。由於該靶標的快速解離速率，必須在下分圖中表示的整個實驗過程中保持NKG2D的飽和濃度。此外，對每個靶標結合的相對化學計量沒有任何影響（與結合未佔用的AB1424/AB1612 F4 TriNKET相比）表示AB1424/AB1612 F4 TriNKET上的NKG2D和BAFF-R結合位點完全獨立（ 表 78）。 [ 表 78] .AB1424/AB1612 F4' TriNKET對BAFF-R和NKG2D的相對結合化學計量。
實驗設置 BAFF-R 相對結合化學計量 NKG2D 相對結合化學計量
靶標結合到未被另一靶標佔用的AB1424/AB1612 F4 TriNKET（首先注射） 1.00 1.00
靶標結合到被另一靶標飽和的AB1424/AB1612 F4 TriNKET（第二注射） 0.97 ± 0.03 1.24 ± 0.22
為評估AB1424/AB1612 F4 TriNKET的特異性，如上文實例4所述進行基於流動式細胞分析術的PSR測定。AB1424/AB1612 F4 TriNKET與PSR的結合呈陰性，並且與陰性對照曲妥珠單抗的PSR最相當（ 圖 121）。該等結果表明AB1424/AB1612 F4 TriNKET不表現出與非特異性蛋白的反應性。 AB1424/AB1612 F4 TriNKET 的效力
AB1424/AB1612 F4 TriNKET的效力藉由其刺激KHYG-1-CD16aV介導的BAFF-R +RL細胞的細胞溶解的能力來評估（ 圖 122）。AB1424/AB1612 F4 TriNKET在驅動BAFF-R+ RL細胞的裂解方面非常有效，表現出亞奈米莫耳效力和有效的最大細胞殺傷力（ 表 79）。 [ 表 79] .AB1424/AB1612 F4 TriNKET在KHYG-1-CD16aV和RL細胞存在下的效力。
測試品 EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 0.05 16
AB1424/AB1612 F4 TriNKET在原代NK細胞介導的BAFF-R +腫瘤細胞系RL的裂解中的效力進一步與親代mAb進行比較（ 圖 123）。親代mAb引起低或檢測不到BAFF-R +細胞系RL的細胞溶解。AB1424/AB1612 F4 TriNKET展示了亞奈米莫耳EC 50，有效的最大殺傷力，並且超過了親代mAb的效力（ 圖 123和 表 80）。 [ 表 80] .AB1424/AB1612 F4 TriNKET在原代NK和BAFF-R +細胞存在下的效力。
細胞系 AB1424/AB1612 F4 TriNKET 親代 mAb
EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ） EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ）
RL 0.03 ± 0.00 28 ± 15 ND ND
ND = 未確定 AB1424/AB1612 F4 TriNKET 的可開發性
AB1424/AB1612 F4 TriNKET的可開發性藉由施加一系列應激進行評估：熱應激（40°C，4週），低pH應激（pH 5，40°C，2週），高pH應激（pH 8，40°C，2週），氧化壓力（0.02%過氧化氫，25°C，24小時），攪拌，冷凍/解凍，保持低pH。
如上所述，AB1424/AB1612 F4 TriNKET在40°C在pH 6.0在HST中孵育4週後表現出高穩定性。藉由SEC觀察到非常少的聚集（+0.1%）和最小的單體損失（1.0%）（ 圖 124和 表 81）。藉由R CE-SDS檢測到2.6%的純度損失（ 圖 125和 表 82）。由cIEF監測的電荷譜表明4週後酸性轉變從對照中的52.5%主峰到29.9%主峰（ 圖 126和 表 83）。主峰的這種損失係在高溫下孵育的蛋白的典型特徵。此外，在AB1424/AB1612 F4 TriNKET與人BAFF-R +細胞的結合或對照和應激樣本之間對人CD16aV的動力學和親和力方面沒有觀察到有意義的差異（ 圖 127， 表 84， 圖 128， 表 85）。未檢測到對照樣本和應激樣本之間的效力差異（ 圖 129和 表 86）。 [ 表 81] .AB1424/AB1612 F4 TriNKET單體、HMWS和LMWS在40°C在HST中在pH 6.0孵育後的總結。
測試品 單體（ % ） HMWS （ % ） LMWS （ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET HST，pH 6.0對照* 99.5 0.5 0.0
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，4週 98.5 0.6 0.9
*HST、pH 6.0對照樣本在分期後、分析前儲存在-80°C。 [ 表 82]. AB1424/AB1612 F4 TriNKET R CE-SDS純度在40°C在HST中在pH 6.0 4週後的總結。
測試品 R CE-SDS 純度（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，HST，pH 6.0對照 99.8
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，4週 97.2
[ 表 83]. AB1424/AB1612 F4 TriNKET在40°C在HST中在pH 6.0中孵育後的酸性物質、主峰物質和鹼性物質的總結。
測試品 酸性（ % ） 主（ % ） 鹼性（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，HST，pH 6.0對照 44.1 52.5 3.5
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，4週 64.7 29.9 5.2
[ 表 84]. AB1424/AB1612 F4 TriNKET與hBAFF-R +細胞在40°C在HST中在pH 6.0 4週後的結合。
測試品 靶標 與BAFF-R +等基因CHO細胞結合 EC 50, nM
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，HST，pH 6.0對照 hBAFF-R 0.18
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，4週 hBAFF-R 0.22
結果係n = 3次重複的平均值 [ 表 85]. 在40°C在HST中在pH 6.0 4週後AB1424/AB1612 F4 TriNKET對hCD16a的動力學參數和結合親和力。
測試品 靶標 k a (M -1s -1) k d (s -1) K D(nM)
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，HST，pH 6.0對照 hCD16aV (1.2 ± 0.1) x 10 5 (1.8 ± 0.0) x 10 -2 149.8 ± 4.3
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，4週 hCD16aV (1.1 ± 0.1) x 10 5 (1.6 ± 0.0) x 10 -2 145.5 ± 16.6
結果係n = 3次重複的平均值 [ 表 86]. 在HST中在pH 6.0 4週後AB1424/AB1612 F4 TriNKET EC 50和最大裂解的總結。
測試品 EC 50（nM） 最大殺傷（%）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，HST，pH 6.0對照 0.01 91
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，HST，pH 6.0，40°C，4週 0.01 93
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 的化學穩定性
為了評估AB1424/AB1612 F4 TriNKET在氧化壓力下的穩定性，將AB1424/AB1612 F4 TriNKET與0.02%過氧化氫在PBS中於25°C孵育24小時。藉由SEC沒有觀察到單體的聚集或損失（ 圖 130和 表 87）。藉由R CE-SDS（ 圖 131和 表 88）未檢測到有意義的碎片化增加。此外，在對照和應激樣本之間，在與hBAFF-R細胞的結合或對hCD16a的動力學和親和力方面沒有觀察到有意義的差異（ 圖 132、 表 89和 圖 133、 表 90）。最後，AB1424/AB1612 F4 TriNKET在KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定中的效力在氧化壓力後沒有變化（ 圖 134和 表 91）。 [ 表 87] .AB1424/AB1612 F4 TriNKET單體、HMWS和LMWS在強制氧化後的總結。
測試品 單體（ % ） HMWS （ % ） LMWS （ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，氧化對照* 98.6 1.0 0.4
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，0.02% H 2O 2，24小時 98.8 0.8 0.4
*氧化存在樣本（用PBS代替H 2O 2類比稀釋）在分期後儲存在-80°C，然後再進行分析。 [ 表 88]. 強制氧化後AB1424/AB1612 F4 TriNKET R CE-SDS純度的總結。
測試品 R CE-SDS 純度（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，氧化對照 100.0
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 0.02% H 2O 2，24小時 100.0
[ 表 89]. 強制氧化後AB1424/AB1612 F4 TriNKET與hBAFF-R +細胞 的結合。
測試品 靶標 與表現 BAFF-R 的細胞結合 EC 50, nM
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，氧化對照 hBAFF-R 0.24
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，0.02% H 2O 2，24小時 hBAFF-R 0.21
[ 表 90]. 強制氧化後AB1424/AB1612 F4 TriNKET對hCD16a 的動力學參數和結合親和力。
測試品 靶標 k a (M -1s -1) k d (s -1) K D(nM)
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，氧化對照 hCD16aV (1.1 ± 0.0) x 10 5 (1.6 ± 0.0) x 10 -2 137.1 ± 3.2
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，0.02% H 2O 2，24小時 hCD16aV (1.2 ± 0.0) x 10 5 (1.5 ± 0.0) x 10 -2 131.1 ± 4.0
結果係n = 3次重複的平均值 [ 表 91]. 強制氧化後AB1424/AB1612 F4 TriNKET EC 50和最大裂解的總結。
測試品 EC 50（nM） 最大殺傷（%）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，氧化對照 0.02 96
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，0.02% H 2O 2，24小時 0.02 100
長期 pH 5 應激
AB1424/AB1612 F4 TriNKET的化學穩定性藉由在低pH（20 mM乙酸鈉，pH 5.0，40°C，2週）下的長期孵育進行評估。藉由SEC（ 圖 135和 表 92 ）沒有觀察到聚集和最小的單體損失（0.6%）。藉由還原型CE-SDS（ 圖 136和 表 93）沒有檢測到有意義的碎片化增加。在長期pH 5應激後，cIEF監測的電荷譜表明酸從對照中的52.9%主峰轉變為受應激樣本中的41.2%主峰（ 圖 137和 表 94）。長期pH 5應激對與hBAFF-R +細胞的結合或對hCD16aV的動力學和親和力沒有顯著影響（ 圖 138， 表 95， 圖 139、 表 96）。此外，在KHYG-1-CD16aV介導的細胞毒性測定中，在應激樣本和對照樣本之間未觀察到效力的顯著差異（ 圖 140和 表 97）。基於該等結果，可以得出結論，AB1424/AB1612 F4 TriNKET可抵抗低pH應激引起的聚集和碎片化。 [ 表 92]. 長期低pH應激後AB1424/AB1612 F4 TriINKET單體、HMWS和LMWS的總結。
測試品（ % ） 單體（ % ） HMWS （ % ） LMWS （ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET pH 5對照 99.7 0.3 0.0
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 5，40°C，2週 99.1 0.2 0.7
[ 表 93]. 長期低pH應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET R CE-SDS純度的總結。
測試品 R CE-SDS 純度（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 5 對照* 99.8
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 5，40°C，2週 99.6
*pH 5對照樣本在分期後、分析前儲存在-80°C。 [ 表 94]. 長期低pH應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET中酸性物質、主峰物質和鹼性物質的總結。
測試品 酸性（ % ） 主（ % ） 鹼性（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 5對照 44.2 52.9 2.9
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 5，40°C，2週 50.4 41.2 8.4
[ 表 95]. 長期低pH應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET與hBAFF-R +細胞的結合，
測試品 靶標 與表現 BAFF-R 的細胞的結合 EC 50 ， nM
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 5對照 hBAFF-R 0.22
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 5，40°C，2週 hBAFF-R 0.19
[ 表 96]. 長期低pH應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET對hCD16a的動力學參數和結合親和力。
測試品 靶標 k a (M -1s -1) k d (s -1) K D(nM)
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 5對照 hCD16aV (1.1 ± 0.1) x 10 5 (1.7 ± 0.1) x 10 -2 150.5 ± 11.9
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 5，40°C，2週 hCD16aV (1.1 ± 0.0) x 10 5 (1.6 ± 0.0) x 10 -2 152.6 ± 3.9
結果係n = 3次重複的平均值 [ 表 97]. 長期低pH暴露後AB1424/AB1612 F4 TriNKET EC 50和最大裂解的總結。
測試品 EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 5對照 0.07 89
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 5，40°C，2週 0.05 93
長期 pH 8 應激
AB1424/AB1612 F4 TriNKET的化學穩定性藉由在高pH（20mM Tris，pH 8.0，40°C，2週）下的長期孵育進行評估。藉由SEC（ 圖 141和 表 98）觀察到聚集的少量增加（0.2%）和單體的最小損失（1.3%）。藉由還原型CE-SDS（2.2%）檢測到碎片化的輕微增加（ 圖 142和 表 99）。在長期pH 8應激後，cIEF監測的電荷譜表明酸從對照中的49.2%主峰轉變為受應激樣本中的22.5%主峰（ 圖 143和 表 100）。這種酸性轉變可歸因於整個AB1424/AB1612 F4 TriNKET序列的脫醯胺作用。脫醯胺作用係pH升高時的主要化學降解。在相同的應激條件下，曲妥珠單抗觀察到類似的酸性轉變。長期pH 8應激對AB1424/AB1612 F4 TriNKET與hBAFF-R+ 細胞的結合或對hCD16aV的動力學和親和力沒有顯著影響（ 圖 144和 表 101，和 圖 145和 表 102）。此外，在KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定中，在長期pH 8應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET和對照樣本之間的效力方面沒有觀察到顯著差異（ 圖 146和 表 103）。基於該等結果，可以得出結論，AB1424/AB1612 F4 TRINKET可抵抗因pH升高應激引起的聚集。 [ 表 98] .長期高pH應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET單體、HMWS和LMWS的總結。
測試品 單體（ % ） HMWS （ % ） LMWS （ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 8對照* 99.7 0.3 0.0
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 8，40°C，2週 98.4 0.5 1.1
pH 8對照樣本在分期後、分析前儲存在-80°C。 [ 表 99]. 長期高pH應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET R CE-SDS純度的總結。
測試品 R CE-SDS 純度（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 8對照 99.8
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 8，40°C，2週 96.6
[ 表 100]. 長期高pH應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET中酸性物質、主峰物質和鹼性物質的總結。
測試品 酸性（ % ） 主（ % ） 鹼性（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 8對照 47.8 49.2 3.0
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 8，40°C，2週 74.5 22.5 3.0
[ 表 101]. 長期高pH應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET與hBAFF-R +細胞的結合。
測試品 靶標 與表現 BAFF-R 的細胞結合 EC 50, nM
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 8對照 hBAFF-R 0.19
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 8，40°C，2週 hBAFF-R 0.20
[ 表 102]. 長期高pH應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET對hCD16a的動力學參數和結合親和力。
測試品 靶標 k a (M -1s -1) k d (s -1) K D(nM)
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 8對照 hCD16aV (1.2 ± 0.1) x 10 5 (1.6 ± 0.0) x 10 -2 137.3 ± 17.4
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 8，40°C，2週 hCD16aV (1.0 ± 0.0) x 10 5 (1.3 ± 0.0) x 10 -2 120.7 ± 5.0
結果係n = 3次重複的平均值。 [ 表 103]. 長期高pH暴露後AB1424/AB1612 F4 TriNKET EC 50和最大裂解的總結。
測試品 EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 8對照 0.04 96
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，pH 8，40°C，2週 0.05 85
可製造性
冷凍/解凍（F/T）循環期間的穩定性對於生物治療藥物很重要，因為製程中間體和原料藥可能會被冷凍以確保製程步驟之間的穩定性。AB1424/AB1612 F4 TriNKET的冷凍/解凍穩定性在20 mg/ml 在HST中在pH 6.0進行評估。在研究完成時藉由A280評估蛋白濃度。AB1424/AB1612 F4 TriNKET濃度在對照中為21.6 mg/ml，在6次冷凍/解凍循環後為24.2 mg/ml，表明沒有因冷凍/解凍應激而造成的蛋白損失。在六次冷凍/解凍循環後，AB1424/AB1612 F4 TriNKET的純度與對照相比沒有變化，如藉由SEC（ 圖 147和 表 104 ）和還原型CE-SDS（ 圖 148和 表 105）評估。與BAFF-R+細胞的結合（ 圖 149和 表 106）和AB1424/AB1612 F4 TriNKET在KHYG-1-CD16aV介導的細胞毒性測定中的效力（ 圖 150和 表 107）與對照樣本相比在6次冷凍/解凍循環後保持不變。這表明AB1424/AB1612 F4 TriNKET在冷凍/解凍應激期間能夠抵抗聚集和碎片化。 [ 表 104].AB1424/AB1612 F4 TriNKET單體、HMWS和LMWS在6次冷凍/解凍循環後的總結。
測試品 單體（%） HMWS（%） LMWS（%）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，F/T對照* 99.6 0.4 0.0
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，6 F/T 99.6 0.4 0.0
*HST，pH 6.0 F/T對照樣本在分期後，在沒有F/T循環的情況下進行分析之前儲存在-80°C。 [ 表 1051]. 冷凍/解凍應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET R CE-SDS純度的總結。
測試品 R CE-SDS 純度（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，F/T對照 99.9
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，6 F/T 99.9
[ 表 106]. AB1424/AB1612 F4 TriNKET在6次冷凍/解凍循環後與BAFF-R+ 細胞結合的總結。
測試品 EC 50 （ nM ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET F/T對照 0.18
AB1424/AB1612 F4 TriNKET F/T應激 0.14
[ 表 107]. AB1424/AB1612 F4 TriNKET EC 50和6次冷凍/解凍循環後的最大裂解的總結。
測試品 EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，F/T對照 0.05 83
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，6 F/T 0.05 83
攪拌
AB1424/AB1612 F4 TriNKET（在HST中5 mg/ml，pH 6.0）在室溫下以1000 rpm的轉速振盪7天。在攪拌應激後，藉由SEC檢測到沒有單體損失（ 圖 151和 表 108），藉由還原型CE-SDS觀察到沒有純度損失（圖152和 表 109）並且沒有蛋白濃度損失（ 表 108）。在結合BAFF-R +細胞（ 圖 153和 表 110）或在藉由KHYG-1-CD16aV介導的細胞毒性測定評估效力時沒有觀察到應激和對照AB1424/AB1612 F4 TriNKET樣本之間的差異。（ 圖 154和 表 111）。 [ 表 108] .攪拌應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET濃度和單體含量的總結。
測試品 濃度（ mg/mL ） 單體（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET攪拌對照* 5.3 99.8
AB1424/AB1612 F4 TriNKET攪拌應激 5.5 99.8
*HST，pH 6.0攪拌對照樣本在25°C應激，應激後進行分析之前不攪拌保持1週並且儲存在-80°C。 [ 表 109]. 攪拌後AB1424/AB1612 F4 TriNKET R CE-SDS的純度的總結。
測試品 R CE-SDS 純度（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET攪拌對照 99.9
AB1424/AB1612 F4 TriNKET攪拌應激 99.9
[ 表 110]. 在攪拌應激後AB1424/AB1612 F4 TRINKET與BAFF-R+細胞結合的總結。
測試品 EC 50 （ nM ）
AB1424/AB1612 F4 TRINKET攪拌對照 0.17
AB1424/AB1612 F4 TRINKET攪拌應激 0.16
[ 表 111]. 與對照相比，在攪拌應激後AB1424/AB1612 F4 TriNKET的效力。
測試品 EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET攪拌對照 0.04 87
AB1424/AB1612 F4 TriNKET攪拌應激 0.05 83
保持低 pH
為確定AB1424/AB1612 F4 TriNKET是否適合在生物製劑生產中通常用作病毒清除步驟的低pH保持，將AB1424/AB1612 F4 TriNKET蛋白A洗脫液的pH調整至3.51，並在室溫保持1.5小時。保持期後，用1.0 M Tris，pH 8.3中和蛋白A洗脫液以達到中性pH。進行分析型SEC以確定在低pH暴露前後的譜或聚集體含量係否有任何變化（ 圖 155）。AB1424/AB1612 F4 TriNKET在低pH保持後的SEC譜顯示，與「無保持」對照樣本相比，HMW種類增加，單體相應減少（8.1%），儘管LMW種類的數量沒有變化。
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 藉由離子交換層析進一步處理，並使用一組另外的測定與未進行低pH保持的純化蛋白進行比較分析。通常可以使用cIEF在全域範圍內觀察胺基酸側鏈的化學修飾。AB1424/AB1612 F4 TriNKET對照和低pH保持的cIEF譜看起來非常相似，酸性物質、主峰物質和鹼性物質的相對定量都在彼此的5%以內（ 圖 156和 表 112）。這表明在第二步純化後，保持低pH對AB1424/AB1612 F4 TriNKET的電荷譜沒有可測量的影響。此外，根據還原型CE-SDS，在完全純化的AB1424/AB1612 F4 TriNKET（其已保持低pH）中未觀察到純度損失（ 圖 157和 表 113）。與對照相比，低pH保持對BAFF-R+ 細胞結合沒有顯著影響（ 圖 158和 表 114）。AB1424/AB1612 F4 TriNKET的完全純化的低pH保持批次的效力與對照樣本的效力保持相似，如藉由KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定評估的（ 圖 159和 表 115）。 [ 表 113] .低pH保持後完全純化的AB1424/AB1612 F4 TriNKET R CE-SDS純度的總結。
測試品 NR CE-SDS 純度（ % ） R CE-SDS 純度（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET低pH保持對照 94.5 99.7
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，低pH保持 94.8 99.7
[ 表 114]. 與對照相比，AB1424/AB1612 F4 TriNKET的低pH保持批的BAFF-R +細胞結合。
測試品 靶標 與表現 BAFF-R 的細胞的結合（ EC 50, nM ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET低pH保持對照 hBAFF-R 0.44
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，低pH保持 hBAFF-R 0.46
結果係n = 3次重複的平均值。 [ 表 115]. 與對照相比，完全純化的AB1424/AB1612 F4 TriNKET低pH保持批的效力。
測試品 EC 50 （ nM ） 最大殺傷（ % ）
AB1424/AB1612 F4 TriNKET低pH保持對照 0.03 87
AB1424/AB1612 F4 TriNKET，低pH保持 0.02 88
實例 9 - AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 和 AB1424/AB1612 F4 TriNKET 與 BAFF-R 結合的進一步分析
對AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET與原代B細胞和人癌細胞系的BAFF-R結合進行了進一步評估。如實例4中所述進行結合實驗。
使用抗BAFF-R mAb殖株1C11進行BAFF-R+ 細胞系和原代B細胞的抗體結合能力。在七種人癌細胞系以及經工程改造以表現人和石蟹獼猴BAFF-R的CHO細胞上測量BAFF-R表現，結果總結於 表 116中。也在來自三名健康供體的PBMC樣本中的CD19+原代B細胞上測量了BAFF-R。發現原代B細胞上的BAFF-R表現類似於人癌細胞系上的表現，如 表 117中總結的。 [ 表 116].細胞系上的BAFF-R定量
細胞系 抗體結合能力
CHO-hBAFF-R 239504
CHO-cBAFF-R 58922
BJAB 9806
Raji 9969
Ramos 4815
RL 8007
Rs4:11 2771
Jeko1 10438
SUDHL-6 14164
[ 表 117].原代B細胞上的BAFF-R定量
供體 ID BAFF-R ABC
55212 12253
54136 4511
21189 9564
在表現人和石蟹獼猴BAFF-R的CHO細胞上測量了AB1424/AB1612 F3' TriNKET、AB1424/AB1612 F4 TriNKET、它們的親代mAb和兩種同種型對照TriNKET的劑量響應結合。AB1424/AB1612 F3' TriNKET與在CHO細胞上表現的人BAFF-R（0.70 ± 0.33 nM）和石蟹獼猴BAFF-R（0.96 ± 0.21 nM）具有相當的亞奈米莫耳結合EC50。AB1424/AB1612 F4 TriNKET和親代mAb也顯示出與人和石蟹獼猴BAFF-R的相似結合，但與AB1424/AB1612 F3' TriNKET相比，效力高約2倍。AB1424/AB1612 F4 TriNKET結合人和石蟹獼猴BAFF-R，效力分別為0.37 ± 0.11 nM和0.51 ± 0.03 nM。親代mAb與AB1424/AB1612 F4 TriNKET的結合相似，對人和石蟹獼猴BAFF-R的結合效力分別為0.39 ± 0.17 nM和0.57 ± 0.23 nM。該等結果證明了AB1424/AB1612 F3' TriNKET、AB1424/AB1612 F4 TriNKET及其親代mAb與人和石蟹獼猴BAFF-R的交叉反應結合。
六種具有內源BAFF-R表現的人癌細胞系被用於確認與過表現BAFF-R的CHO細胞觀察到的結合。所選細胞系源自B細胞，代表各種BAFF-R+ B細胞惡性腫瘤。AB1424/AB1612 F3' TriNKET與AB1424/AB1612 F4 TriNKET及其親代mAb在測試的6個細胞系中的5個上相比，效力稍弱，但具有相比背景的高倍數（FOB）。AB1424/AB1612 F3' TriNKET、AB1424/AB1612 F4 TriNKET及其親代mAb與以等效最大FOB結合具有最低BAFF-R表現的Rs4;11細胞。 表 118中總結了所有分子和細胞系的結合EC50和最大FOB。 [ 表 118].細胞結合的總結
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET AB1424/AB1612 F4 TriNKET 親代 mAb F3'- 對照 F4- 對照
EC50 nM 最大 FOB EC50 nM 最大 FOB EC50 nM 最大 FOB EC50 nM 最大 FOB EC50 nM 最大 FOB
BJAB 0.37 ± 0.16 16 ± 8 0.21 ± 0.03 12 ± 4 0.18 ± 0.04 12 ± 4 ND ND ND ND
Raji 0.18 ± 0.01 10 ± 4 0.13 ± 0.02 7 ± 3 0.10 ± 0.01 0.10 ± 0.01 ND ND ND ND
RL 0.27 ± 0.02 8 ± 2 0.17 ± 0.02 6 ± 1 0.14 ± 0.01 6 ± 1    ND ND ND ND
Rs4;11 0.09 ± 0.02 4 ± 1 0.08 ± 0.03 4 ± 1 0.06 ± 0.02 3 ± 1    ND ND ND ND
Jeko-1 0.13 ± 0.03 7 ± 2 0.08 ± 0.03 0.08 ± 0.03 0.07 ± 0.02 5 ± 1 ND ND ND ND
SUDHL-6 0.41 ± 0.10 19 ± 3    0.18 ± 0.04 12 ± 3    0.19 ± 0.05 13 ± 3 ND ND ND ND
CHO-cBAFF-R 0.96 ± 0.21 67 ± 64 0.51 ± 0.03 56 ± 52 0.57 ± 0.23 58 ± 50 ND ND ND ND
CHO-hBAFF-R 0.70 ± 0.33 146 ± 78 0.37 ± 0.11 120 ± 86 0.39 ± 0.17 123 ± 85 ND ND ND ND
使用表現或不表現高親和力CD16V變體的NK白血病KHYG-1細胞，將AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET的結合與其親代mAb進行比較。觀察到假設的KHYG-1和KHYG-1-CD16V細胞上AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET的結合模式（ 圖 160A-160B）。對於AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET，在缺乏CD16表現的KHYG-1親代細胞上觀察到較弱的結合，並且未觀察到與其親代mAb的結合。與AB1424/AB1612 F3' TriNKET相比，AB1424/AB1612 F4 TriNKET的結合較弱係預期的，並且與該等分子與人NKG2D結合的SPR親和力相關。
與AB1424/AB1612 F3' TriNKET、AB1424/AB1612 F4 TriNKET或親代mAb孵育後，在孵育2小時或24小時後在RL和Raji細胞上測量BAFF-R的表面保留。觀察到2小時後BAFF-R表面保留增加15-35%（120% ± 8%和135% ± 20%），在與AB1424/AB1612 F3’ TriNKET孵育24小時後進一步增加到30-40%（139% ± 14%和138% ± 33%）。對於AB1424/AB1612 F4 TriNKET及其親代mAb，在2小時和24小時時觀察到類似的增加（ 圖 161A-161B）。 表 119中總結了三個獨立實驗的結果。在Raji細胞上觀察到類似的結果（ 圖 162和 表 120）。 [ 表 119]. RL細胞上BAFF-R細胞表面保留的總結
   RL 2 小時 RL 24 小時
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 120 ± 8 139 ± 14
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 116 ± 6 136 ± 16
親代 mAb 117 ± 5 139 ±16
[ 表 120]. Raji細胞上BAFF-R細胞表面保留的總結
   Raji 2 小時 Raji 24 小時
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 135 ± 20 138 ± 33
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 130 ± 7 134 ± 27
親代 mAb 126 ± 10 131 ± 35
實例 10 - AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 和 AB1424/AB1612 F4 TriNKET 與 BAFF-R 結合的進一步分析
AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET刺激BAFF-R+細胞的NK細胞裂解的能力在使用非何杰金氏淋巴瘤（NHL）細胞系RL作為靶細胞的2小時短期細胞溶解測定中進行了測試。來自三個健康供體的原代人NK細胞用作效應細胞。AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET與親代mAb相比顯示出更高的殺傷效力和RL靶細胞的最大裂解，如 圖 163所示。AB1424/AB1612 F3' TriNKET與AB1424/AB1612 F4 TriNKET相比對靶細胞的最大裂解更高（分別為44 ± 19和28 ± 15%），但殺傷效力降低（分別為0.13 ± 0.07和0.03 ± 0.00 nM）。 表 121中總結了來自三個原代NK供體的結果。 [ 表 121]. RL細胞的短期靜息NK細胞裂解的EC 50和%最大裂解值
分子 EC 50 （ nM ） % 最大裂解
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.13 ± 0.07 44 ± 19
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 0.03 ± 0.00 28 ± 15
親代 mAb ND ND
ND = 未確定
AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET在使用RL細胞作為靶細胞的長期36小時細胞溶解測定中也表現出很強的活性。來自三個健康供體的原代人NK細胞用作效應細胞。與其親代mAb相比，AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET顯示出更高的殺傷效力和最大的RL靶細胞裂解。AB1424/AB1612 F3' TriNKET與AB1424/AB1612 F4 TriNKET相比對靶細胞的最大裂解更高（分別為44 ± 7和32 ± 13%），但殺傷效力降低（分別為0.06 ± 0.04和0.05 ± 0.04 nM）。 表 122中總結了來自兩個原代NK供體的結果。 [ 表 122]. RL細胞的長期靜息NK細胞裂解的EC 50和%最大裂解值
分子 EC 50 （ nM ） % 最大裂解
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.06 ± 0.04 44 ± 7
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 0.04 ± 0.04 32 ± 13
親代 mAb ND ND
ND = 未確定
AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET還增強了IL-2活化的原代人NK細胞對RL靶細胞的細胞溶解作用。來自同一供體的人NK細胞靜息過夜或藉由與IL-2一起培養而活化過夜。在沒有TriNKET的情況下，用IL-2活化的NK細胞顯示RL靶細胞的背景殺傷增加。AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET增強靜息和IL-2活化的NK細胞的活性，但在活化的人NK細胞情況下表現出更高的最大裂解和更有效的EC 50值（ 圖 164A-164B）。 表 123中總結了來自三個健康供體的數據。 [ 表 123].活化的NK細胞對RL靶細胞的EC50和%最大裂解值
   靜息的 hNK IL-2 活化的 hNK
分子 EC50 （ nM ） % 最大裂解 EC50 （ nM ） % 最大裂解
AB1424/AB1612 F3’ TRINKET 0.07 ± 0.03 45 ± 17 0.02 ± 0.01 79 ± 8
AB1424/AB1612 F4 TRINKET 0.02 ± 0.01 29 ± 16 0.01 ± 0.01 76 ± 13
為了瞭解每個TriNKET臂對分子整體活性的貢獻，產生了在分子的各種結合臂中具有突變的AB1424/AB1612 F3' TriNKET的多個變體。在一種變體中，突變被引入恒定區的CH2結構域以取消FcγR結合；該分子稱為AB1424/AB1612 F3' TriNKET-Fc-si。產生了第二功能喪失分子，它可以消除NKG2D受體結合；該分子稱為AB1424/AB1612 F3' TriNKET-Dead-NKG2D。最後，生成了不能結合BAFF-R的TriNKET分子；該分子稱為F3'-帕利珠單抗。這四種分子首先使用KHYG-1-CD16V效應細胞在靶細胞裂解測定中進行了測試。AB1424/AB1612 F3' TriNKET能夠以劑量響應方式調節BAFF-R+靶細胞的特異性裂解（EC50 = 0.05 nM）。然而，在AB1424/AB1612 F3' TriNKET功能喪失變體F3'-帕利珠單抗或AB1424/AB1612 F3' TriNKET-Fc-si的劑量滴定中，沒有觀察到KHYG-1-CD16V效應細胞的活性。AB1424/AB1612 F3’ TriNKET-死-NKG2D能夠誘導BJAB靶細胞的裂解，與AB1424/AB1612 F3’ TriNKET相比，具有降低的效力和最大裂解（EC 50= 0.93 nM）（ 圖 165）。
AB1424/AB1612 F3' TriNKET及其功能缺失變體也在第二測定系統中進行了評估，其中來自健康供體的靜息原代人NK細胞被用作效應細胞。與KHYG-1-CD16V細胞的結果類似，原代NK細胞顯示AB1424/AB1612 F3' TriNKET對CD16、NKG2D和BAFF-R的接合係實現針對BJAB靶細胞的最大NK細胞響應所必需的（EC 50= 0.06 nM）（ 圖 166）。
在可溶性NKG2D配體存在的情況下測試了AB1424/AB1612 F3' TriNKET的活性。對於該等測定，使用了NKG2D配體MICA的重組版本。MICA在癌症適應症中具有廣泛的表現，並且已知會從細胞表面脫落，從而導致患者血清中的積累。將20 ng/mL（這係在癌症患者中發現的生理相關血清濃度）的可溶性MICA-Fc添加到NK細胞細胞溶解測定系統中。 圖 167顯示了在不存在和存在可溶性MICA的情況下，AB1424/AB1612 F3' TriNKET在針對BJAB靶細胞的原代NK細胞溶解測定中的劑量響應曲線。添加MICA對AB1424/AB1612 F3' TriNKET達到的效力或最大裂解沒有影響。正如預期的那樣，可溶性MICA對AB1424/AB1612 F4 TriNKET的活性也沒有影響。 表 124總結了EC 50和最大裂解值。 [ 表 124].使用sMIC-A-Fc藉由NK細胞裂解BJAB細胞的EC 50和%最大裂解值
分子 EC 50 （ nM ） % 最大裂解
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.17 ± 0.24 49 ± 24
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 0.04 ± 0.02 44 ± 27
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET + MIC-A-Fc 0.07 ± 0.08 47 ± 28
AB1424/AB1612 F4 TriNKET + MIC-A-Fc 0.05 ± 0.05 46 ± 27
AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET展示了如上所述阻斷BAFF與BAFF-R結合的能力。為了瞭解可溶性BAFF二聚物在人NK細胞溶解測定中的作用，使用了生理相關濃度的可溶性BAFF，20 ng/mL。在存在可溶性BAFF的情況下，觀察到AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET的效力有微小變化，但實現了相同的最大裂解（ 圖 168）。 表 125中總結了來自三個供體樣本的數據。 [ 表 125].使用可溶性BAFF藉由NK細胞裂解BJAB細胞的EC 50和%最大裂解值
分子 EC 50 （ nM ） % 最大裂解
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.02 ± 0.02 62 ± 12
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 0.01 ± 0.00 56 ± 12
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET + MIC-A-Fcc 0.21 ± 0.15 64 ± 11
AB1424/AB1612 F4 TriNKET + MIC-A-Fc 0.04 ± 0.01 51 ± 15
除了直接裂解靶細胞外，NK細胞在活化後也會產生細胞介素。因此，評估了在存在AB1424/AB1612 F3' TriNKET、AB1424/AB1612 F4 TriNKET或其親代mAb的情況下與BAFF-R+靶細胞共培養的NK細胞的IFNγ產生和CD107a去顆粒。與BJAB靶細胞共培養的靜息NK細胞在四小時後顯示出很少的CD107a去顆粒或細胞內IFNγ積累的基礎誘導（ 圖 169）。將AB1424/AB1612 F3' TriNKET添加到共培養物中，以劑量響應方式穩健誘導去顆粒和IFNγ產生。相比之下，親代mAb和非BAFF-R靶向型TriNKET F3'-帕利珠單抗和F4-帕利珠單抗均未顯示CD107a+IFNγ+ NK細胞的穩健增加。在與BJAB靶細胞的共培養中，對三個獨立的NK細胞供體進行了測定；結果總結在 表 126中。 [ 表 126].與BJAB細胞共培養時NK細胞誘導IFNγ 和CD107a的總結
分子 EC 50 （ nM ） % Max
AB1424/AB1612 F3’ TRINKET 0.03 ± 0.02 35 ± 26
AB1424/AB1612 F4 TRINKET 0.03 ± 0.01 32 ± 23
親代 mAb 0.07 ± 0.05 23 ± 16
評估了AB1424/AB1612 F3' TriNKET誘導細胞介素刺激的CD8+ T細胞殺傷BAFF-R+癌細胞的能力。活化的T細胞未顯示靶細胞的基礎裂解，添加AB1424/AB1612 F3' TriNKET、AB1424/AB1612 F3' TriNKET-死-NKG2D或F3'-帕利珠單抗均未顯示任何CD8+ T細胞活性的觸發。相比之下，CD20靶向工具TriNKET顯示了RL靶細胞的CD8+ T細胞裂解的劑量依賴性誘導，證明了該等CD8+細胞對NKG2D刺激作出響應的能力。
人IgG1抗體的Fc結構域可以介導三種不同類型的效應子功能。一個類型Fc介導的效應子功能係抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC），這係藉由CD16與NK細胞的結合來實現的；NK細胞刺激已針對AB1424/AB1612 F3' TriNKET進行了廣泛表徵。Fc介導的第二效應子功能係抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP），其中巨噬細胞攻擊並吞噬包被有抗體的細胞。對於AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET，為了評估它們誘導經調理的靶細胞的ADCP的能力，利用M0巨噬細胞作為效應細胞的體外分析系統，該巨噬細胞來源於用M-CSF培養純化的CD14+單核細胞。將BAFF-R+靶細胞用細胞追蹤CFSE染料標記，用測試品調理並與經細胞跟蹤紫標記的M 0巨噬細胞共培養。吞噬作用藉由流動式細胞分析術分析為細胞跟蹤紫+細胞追蹤CFSE+（雙陽性）事件。
AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TRINKET增強了M 0巨噬細胞對BJAB靶細胞的吞噬作用。親代mAb也顯示出誘導M 0巨噬細胞吞噬經調理的靶細胞的能力，類似於AB1424/AB1612 F4 TriNKET（ 圖 170）。AB1424/AB1612 F3' TriNKET-Fc-si在CH2結構域中帶有突變以緘默化Fcγ受體結合，用作陰性對照。AB1424/AB1612 F3' TriNKET-Fc-si未能介導經調理的靶細胞的ADCP。 表 127中總結了使用衍生自三個不同供體的M 0巨噬細胞的結果。 [ 表 127].ADCP活性的EC 50和%最大值的總結
分子 EC 50 （ nM ） % 最大裂解
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.03 ± 0.02 57 ± 7
AB1424/AB1612 F4 TriNKET 0.01 ± 0.00 53 ± 6
親代 mAb 0.09 ± 0.00 54 ± 6
人IgG1同種型抗體的第三效應子功能係活化補體級聯，導致補體依賴性細胞毒性（CDC）。AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TRINKET係使用人IgG1 Fc結構域構建的；因此，為了瞭解AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET刺激CDC活性的能力，Raji細胞被用於細胞毒性測定。AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET都不刺激補體介導的Raji靶細胞殺傷（ 圖 171）。相反，針對CD20的陽性對照抗體（利妥昔單抗）顯示在人血清存在下Raji靶細胞的劑量依賴性裂解，證實血清具有活性補體因數。 實例 11 - AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 和 AB1424/AB1612 F4 TriNKET 在人血中的安全性
使用健康供體周邊血單核細胞（PBMC）評估AB1424/AB1612 F3' TriNKET結合。類似於用商用抗體11C1獲得的結果，AB1424/AB1612 F3' TriNKET結合BAFF-R+ B細胞，但不結合來自三個健康供體的PBMC中的其他細胞亞群（ 圖 172）。
評估了AB1424/AB1612 F3' TriNKET在人全血樣本中孵育後的結合。免疫表現型分析抗體用於定義人血液中之每個細胞群，並評估了每種細胞類型的AB1424/AB1612 F3' TriNKET結合。與人PBMC樣本中BAFF-R表現的殖株11C1染色模式一致，在全血中的B細胞上觀察到AB1424/AB1612 F3' TriNKET染色（ 圖 173）。未觀察到與其他已鑒定細胞類型的明顯結合，包括NKG2D陽性細胞群，如NK細胞和CD8+ T細胞；與該等亞群缺乏明顯的結合與AB1424/AB1612 F3' TriNKET對NKG2D結合的低親和力設計一致。
分析了AB1424/AB1612 F3' TriNKET與RBC的結合。紅血球藉由FACS使用前向和側向散點圖、表面CD235a的表現和CD41的缺乏進行鑒定。對於AB1424/AB1612 F3' TriNKET（ 圖 174）和AB1424/AB1612 F4 TriNKET，在紅血球上未觀察到結合。該等結果與RBC上缺乏BAFF-R、NKG2D和CD16表現一致。
AB1424/AB1612 F3' TriNKET顯示在人全血中的結合與BAFF-R表現一致。為了進一步研究AB1424/AB1612 F3' TriNKET在全血樣本中的作用，檢測了用AB1424/AB1612 F3' TriNKET、AB1424/AB1612 F4 TriNKET、F3'-帕利珠單抗、F4-帕利珠單抗或利妥昔單抗處理的樣本中的免疫細胞頻率。在製備用於FACS分析的樣本之前，將全血暴露於100 μg/mL的每種測試品並孵育四小時。
利妥昔單抗靶向細胞表面抗原CD20，並已被批准用於治療CD20+淋巴瘤。利妥昔單抗在體外和體內都得到了很好的表徵，並且已知會導致人和石蟹獼猴全血樣本中CD20+細胞的耗竭（Vugmeyster 等人, 2003）。因此，利妥昔單抗在基於全血的檢測中用作陽性對照，以評估暴露於AB1424/AB1612 F3' TriNKET後的細胞耗竭。利妥昔單抗跨所測試的三個供體耗竭約50% B細胞。對於與利妥昔單抗一起孵育的樣本中的其他亞群，未觀察到細胞頻率的變化。在三個健康供體中，AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET分別與對照F3'-帕利珠單抗和F4-帕利珠單抗相比沒有引起細胞頻率的減少（ 圖 175）。 實例 12 - AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 和 AB1424/AB1612 F4 TriNKET 與石蟹獼猴蛋白結合的分析
在AB1424/AB1612 F3' TriNKET和對照hIgG1曲妥珠單抗之間觀察到針對FcγRI（分別為2.1 ± 0.6 nM和0.8 ± 0.1 nM）和FcγRIII（分別為270.8 ± 11.0 nM和73.7 ± 6.8 nM）的相當的結合親和力（參見 表 128）。AB1424/AB1612 F3' TriNKET和曲妥珠單抗在pH 6.0時針對FcRn的結合親和力方面沒有明顯差異（分別為1.0 ± 0.0 µM和1.4 ± 0.1 µM），並且在pH 7.4時沒有檢測到針對FcRn的結合。 [ 表 128].藉由SPR包含針對各種石蟹獼猴FcR的親和力的總結表
靶標 AB1424/AB1612 F3’ TriNKET K D 曲妥珠單抗， hIgG1 對照 K D
FcγR FcγRI 2.1 ± 0.6 nM 0.8 ± 0.1 nM
FcγRIII 270.8 ± 11.0 nM 73.7 ± 6.8 nM
FcRn FcRn，pH 6.0 1.0 ± 0.0 µM 1.4 ± 0.1 µM
FcRn，pH 7.4 沒有可量化的結合 沒有可量化的結合
藉由SPR評估AB1424/AB1612 F3 TriNKET與人和石蟹獼猴NKG2D的結合。利用兩種不同的擬合來獲得平衡親和力數據：穩態親和擬合和動力學擬合。動力學常數和平衡親和常數顯示在 表 129中。AB1424/AB1612 F3' TriNKET旨在以低親和力和快速解離速率結合石蟹獼猴NKG2D。對於石蟹獼猴NKG2D的解離速率常數為1.1 ± 0.1 x 10 -1s -1。藉由動力學擬合和穩態親和擬合獲得的平衡親和常數（K D）對於石蟹獼猴NKG2D非常相似：分別係596.5 ± 20.5 nM和609.3 ± 18.3 nM，表明測量參數的信賴度較高。總之，AB1424/AB1612 F3' TriNKET對石蟹獼猴NKG2D、FcγR和BAFF-R的動力學相當，驗證了石蟹獼猴用於測試AB1424/AB1612 F3' TriNKET之用途。 [ 表 129].藉由SPR包含針對石蟹獼猴NKG2D的親和力的總結表
測試品 k a (M -1s -1) k d (s -1) 動力學擬合 K D （ nM ） 穩態擬合 K D （ nM ）
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1.8 x 10 5 1.1 x 10 -1 609.1 618.4
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1.9 x 10 5 1.2 x 10 -1 617.3 630.0
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1.8 x 10 5 1.1 x 10 -1 572.4 589.3
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 1.9 x 10 5 1.1 x 10 -1 587.2 599.6
平均值 ± StDev (1.9 ± 0.1) x10 5 (1.1 ± 0.1) x10 -1 596.5 ± 20.5 609.3 ± 18.3
在所有免疫細胞亞群上測量了在石蟹獼猴全血中用AF647軛合的AB1424/AB1612 F3' TriNKET、AB1424/AB1612 F4 TriNKET和各自的對照分子F3'-帕利珠單抗和F4-帕利珠單抗進行染色的情況（代表性樣本在 圖 176中顯示為長條圖）。非BAFF-R靶向型F3'-帕利珠單抗和F4-帕利珠單抗對照均具有與AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET在所有非B細胞亞群上所見相似的染色模式。AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET的顯著且劑量依賴性結合僅在鑒定的B細胞群中觀察到。
AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET顯示在石蟹獼猴PBMC和全血中與BAFF-R+ B細胞結合。為了進一步研究AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET在全血樣本中的作用，檢測了用AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET處理的樣本中的免疫細胞頻率。非BAFF-R靶向型對照TriNKET、F3'-帕利珠單抗和F4-帕利珠單抗用作陰性對照。在製備用於FACS分析的樣本之前，將全血暴露於100 μg/mL的每種測試品並孵育四小時。
利妥昔單抗靶向細胞表面抗原CD20，並已被批准用於治療CD20+ 淋巴瘤。利妥昔單抗在體外和體內都得到了很好的表徵，並且已知會導致人和石蟹獼猴全血樣本中CD20+細胞的耗竭（Vugmeyster 等人, 2003）。因此，利妥昔單抗在基於全血的檢測中用作陽性對照，以評估暴露於AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET後的B細胞耗竭。利妥昔單抗顯示跨所測試的三個供體耗竭約50% B細胞。在與利妥昔單抗一起孵育的樣本中，沒有觀察到其他亞群的細胞頻率發生變化，這表明耗竭的靶標特異性。AB1424/AB1612 F3' TriNKET和AB1424/AB1612 F4 TriNKET在來自三隻健康動物的任何樣本中與F3'-帕利珠單抗和F4-帕利珠單抗對照相比未引起細胞頻率變化（ 圖 177）。
在與內源性表現BAFF-R的人淋巴瘤細胞系BJAB的共培養試驗中評估了AB1424/AB1612 F3' TriNKET增強石蟹獼猴NK細胞活化的能力。在CD8+ NK細胞上始終發現NKG2D表現，但在CD8-NK細胞上未發現。染色和門控策略與CD45+CD14-CD20-CD3-CD8+CD16+ 一起使用來定義CD8+ NK細胞，其中預測了對靶向TriNKET的BAFF-R的響應。與F3'-帕利珠單抗相比，AB1424/AB1612 F3' TriNKET在增強來自兩個測試的石蟹獼猴PBMC樣本的CD8+ NK細胞去顆粒方面表現出優異的活性（代表性圖顯示在 圖 178中； 表 130中的總結）。
總體而言，AB1424/AB1612 F3' TriNKET在刺激NK細胞去顆粒（CD107a+）方面的效力在石蟹獼猴和人活化測定之間相當（石蟹獼猴NK細胞EC 50= 0.19 ± 0.16 nM和人NK細胞EC 50= 0.03 ± 0.02 nM）。 [ 表 130].與BJAB靶細胞共培養時石蟹獼猴NK細胞去顆粒的EC50值
分子 EC 50 （ nM ） Max %CD107a
F3`- 帕利珠單抗 N/D N/D
AB1424/AB1612 F3’ TriNKET 0.19 ± 0.16 23 ± 9
N/D = 未確定 *     *     *     *     * 藉由引用併入
除非另有說明，否則每份專利文件的全部揭露內容以及本文提及的科學文章出於所有目的藉由引用併入。 等效內容
在不脫離本申請的精神或基本特徵的情況下，本發明可以以其他特定形式實施。因此，前述實施方式在所有方面都被認為是說明性的而不是限制本文描述的申請。因此，本申請的範圍由所附申請專利範圍而不是由前述說明書來指示，並且在申請專利範圍的等效含義和範圍內的所有變化旨在包含在其中。
無
[ 圖 1]係異二聚物多特異性抗體的代表，例如，三特異性結合蛋白（TriNKET）。每個臂可以代表NKG2D結合結構域或BAFF-R結合結構域。在一些實施方式中，NKG2D結合結構域和BAFF-R結合結構域可以共用共同的輕鏈。
[ 圖 2A-2E]舉例說明了多特異性結合蛋白（例如三特異性結合蛋白（TriNKET））的五種示例性形式。如 圖 2A所示，NKG2D結合結構域或BAFF-R結合結構域都可採用scFv形式（左臂）。包含靶向NKG2D的scFv、靶向BAFF-R的Fab片段和異二聚化抗體恒定區的抗體在本文中稱為F3-TriNKET。包含靶向BAFF-R的scFv、靶向NKG2D的Fab片段和結合CD16的異二聚化抗體恒定區/結構域的抗體在本文中稱為F3’-TriNKET（ 圖 2E）。如圖 2B 所示，NKG2D結合結構域和BAFF-R結合結構域都可採用scFv形式。 圖 2C 至 2D係具有三個抗原結合位點（包括兩個結合BAFF-R的抗原結合位點，以及與異二聚化抗體恒定區融合的NKG2D結合位點）的抗體的圖示。該等抗體形式在本文中稱為F4-TriNKET。 圖 2C說明兩個BAFF-R結合位點係呈Fab片段形式，NKG2D結合位點係呈scFv形式。 圖 2D說明BAFF-R結合位點係呈scFv形式，NKG2D結合位點係呈scFv形式。 圖 2E代表三特異性抗體（TriNKET），其包含靶向BAFF-R的scFv、靶向NKG2D的Fab片段和結合CD16的異二聚化抗體恒定區/結構域（「CD結構域」）。該抗體形式在本文中稱為F3'-TriNKET。在某些示例性多特異性結合蛋白中，抗體恒定區上的異二聚化突變包括一個恒定區上的K360E和K409W；和相對的恒定結構域上的Q347R、D399V和F405T在（在CD結構域中顯示為三角形鎖匙形狀）。Fab片段的重鏈和輕鏈可變結構域之間的粗線表示二硫鍵。
[ 圖 3]係三功能抗體（Triomab）形式的TriNKET的代表，它係保持IgG樣形狀的三功能雙特異性抗體。這種嵌合體由兩個半抗體組成，每個半抗體具有一個輕鏈和一個重鏈，它們源自兩個親代抗體。三功能抗體形式可為含有1/2大鼠抗體和1/2小鼠抗體的異二聚物構建體。
[ 圖 4]係呈KiH共同輕鏈形式的TriNKET的代表，它涉及杵-臼（KIH）技術。KiH係異二聚物，包含2個與靶標1和2結合的Fab片段，以及藉由異二聚化突變穩定的Fc。呈KiH形式的TriNKET可為異二聚物構建體，有2個與靶標1和2結合的Fab片段，包含兩條不同的重鏈和與兩條重鏈配對的共同輕鏈。
[ 圖 5]係呈雙可變結構域免疫球蛋白（DVD-Ig™）形式的TriNKET的代表，其藉由柔性的天然存在的連接子組合兩個單株抗體的靶結合結構域，並產生四價IgG樣分子。DVD-Ig™係同二聚物構建體，其中靶向抗原2的可變結構域融合到靶向抗原1的Fab片段可變結構域的N末端。DVD-Ig™形式包含正常Fc。
[ 圖 6]係呈正交Fab片段介面（Ortho-Fab）形式的TriNKET的代表，它係異二聚物構建體，包含2個與靶標1和靶標2結合的Fab片段融合到Fc。正交介面確保了輕鏈（LC）-重鏈（HC）配對。Fc中的突變確保了異二聚化。
[ 圖 7]係二合一Ig形式的TriNKET的代表。
[ 圖 8]係呈ES形式的TriNKET的代表，它係異二聚物構建體，包含兩個與靶標1和靶標2結合的不同Fab片段融合到Fc。Fc中的靜電引導突變確保異二聚化。
[ 圖 9]係呈Fab臂交換形式的TriNKET的代表：抗體，其藉由將重鏈和附著的輕鏈（半分子）與另一分子的重-輕鏈對交換來交換Fab片段臂，產生雙特異性抗體。Fab臂交換形式（cFae）係異二聚物，包含2個與靶標1和2結合的Fab片段，以及藉由異二聚化突變穩定的Fc。
[ 圖 10]係呈SEED體形式的TriNKET的代表，它係異二聚物，包含2個與靶標1和2結合的Fab片段，以及藉由異二聚化突變穩定的Fc。
[ 圖 11]係呈LuZ-Y形式的TriNKET的代表，其中白胺酸拉鍊用於誘導兩種不同HC的異二聚化。LuZ-Y形式係異二聚物，包含兩個與靶標1和2結合的不同scFab，融合到Fc。藉由融合到Fc的C末端的白胺酸拉鍊模體確保異二聚化。
[ 圖 12]係呈Cov-X-體形式的TriNKET的代表。
[ 圖 13A-13B]係呈ĸλ體形式的TriNKET的代表，它們係異二聚物構建體，具有兩個不同的Fab片段融合到藉由異二聚化突變穩定的Fc：一個靶向抗原1的Fab片段包含κLC，並且靶向抗原2的第二Fab片段包含λLC。 圖 13A係一種形式的ĸλ體的示例性代表； 圖 13B 係另一個ĸλ體的示例性代表。
[ 圖 14]係OAsc-Fab異二聚物構建體的代表，其包括與靶標1結合的Fab片段和與靶標2結合的scFab，兩者均與Fc結構域融合。Fc結構域中的突變確保了異二聚化。
[ 圖 15]係DuetMab的代表，它係異二聚物構建體，含有兩個與抗原1和2結合的不同Fab片段，以及藉由異二聚化突變穩定的Fc。Fab片段1和2包含差異S-S橋，可確保正確的輕鏈和重鏈配對。
[ 圖 16]係CrossmAb的代表，它係異二聚物構建體，具有兩個與靶標1和2結合的不同Fab片段，以及藉由異二聚化突變穩定的Fc。CL和CH1結構域以及VH和VL結構域被交換，例如，CH1與VL串聯融合，並且CL與VH串聯融合。
[ 圖 17]係Fit-Ig的代表，它係同二聚物構建體，其中結合抗原2的Fab片段融合到結合抗原1的Fab片段的HC的N末端。該構建體包含野生型Fc。
[ 圖 18A-C]的線圖顯示衍生自hCOH-2（ 圖 18A）、Genentech Hu9.1-73（ 圖 18B）以及基於伊利尤單抗的抗原結合位點（三個版本，F3'、2-Fab和伊利尤單抗mAb，不包含商用伊利尤單抗抗體中存在的抗體依賴性細胞毒性增強突變）（ 圖 18C）的靶向BAFF-R的TriNKET與BAFF-R陽性RAJI細胞的結合。
[ 圖 19A-C]的線圖顯示在以下的存在下原代NK細胞對BAFF-R陽性RAJI細胞的NK細胞介導的裂解：衍生自hCOH-2（ 圖 19A）、Genentech Hu9.1-73（ 圖 19B）以及基於伊利尤單抗的抗原結合位點（三個版本，F3'、2-Fab和伊利尤單抗mAb，不包含商用伊利尤單抗抗體中存在的抗體依賴性細胞毒性增強突變）（ 圖 19C）的靶向BAFF-R的TriNKET。
[ 圖 20A-C]的線圖顯示在以下的存在下KHYG-CD16V細胞對BAFF-R陽性RAJI細胞的NK細胞介導的裂解：衍生自hCOH-2（ 圖 20A）、Genentech Hu9.1-73（ 圖 20B）以及基於伊利尤單抗的抗原結合位點（三個版本，F3'、2-Fab和伊利尤單抗mAb，不包含商用伊利尤單抗抗體中存在的抗體依賴性細胞毒性增強突變）（ 圖 20C）的靶向BAFF-R的TriNKET。
[ 圖 21]的圖顯示藉由指定抗體來自BAFF-生物素結合到在CHO細胞上表現的hBAFF-R的阻斷測定的螢光輸出。
[ 圖 22]係來自CHO細胞結合測定的螢光輸出圖，顯示指定抗體與hBAFF-R的結合（ 圖 22A ，圖 22B）或BAFF-生物素結合BAFF-R的由指定的抗體的阻斷測定（ 圖 22C ，圖 22D）。
[ 圖 23A-23E]係流動式細胞分析術圖，顯示在酵母上表現的AB0369scFv與無抗原對照（ 圖 23A）、h-BAFF-R-hFc（ 圖 23B）、無關-hFc（ 圖 23C）、hBAFF-R-GST（ 圖 23D）或無關-GST（ 圖 23E）的結合。縱軸表示藉由檢測Flag表位標籤測量的scFv表現；橫軸表示BAFF-R構建體的生物素化對照與scFv的結合，如藉由檢測卵白素-PE所測量的。
[ 圖 24]的圖顯示AB0369或指定對照與人（ 圖 24A）或石蟹獼猴（ 圖 24B）BAFF-R的結合。
[ 圖 25A和 25B]詳細說明了具有衍生自AB0369的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白的多特異性測定。 圖 25A係該測定的示意圖。 圖 25B顯示了在不存在（上分圖）或存在（下分圖）多特異性試劑（PSR）的情況下AB0369（左分圖）、曲妥珠單抗陰性對照（中分圖）或依奇珠單抗（ixekizumab）陽性對照（右分圖）的圖。
[ 圖 26]的圖顯示由具有衍生自AB0369的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白誘導的Ramos細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 27]係顯示來自結合測定的螢光輸出的圖，該結合測定顯示了BAFF-生物素與CHO細胞上表現的人BAFF-R的結合被AB0369或指示抗體的阻斷。
[ 圖 28A-28D]係流動式細胞分析術圖，其顯示hBAFF-R-hFc-His與親代AB0369scFv或選自連續幾輪選擇後藉由在酵母上表現的親和力成熟產生的文庫的殖株的結合。 圖 28A顯示與親代AB0369scFv的結合； 圖 28B顯示與來自第一輪殖株選擇的樣本的結合； 圖 28C顯示與來自第二輪殖株選擇的樣本的結合； 圖 28D顯示與來自第二輪殖株選擇的輸出的結合。
[ 圖 29A-29E]的流動式細胞分析術圖顯示hBAFF-R-hFc-His與AB0369和在酵母上表現的親和力成熟的scFv殖株的結合。 圖 29A顯示與親代AB0369的結合； 圖 29B顯示與AB0605的結合； 圖 29C顯示與AB0622的結合； 圖 29D顯示與AB0622的結合；並且 圖 29E顯示與基於伊利尤單抗的抗原結合位點的結合。
[ 圖 30A-30C]的圖證明由AB0369的親和力成熟開發的多特異性結合蛋白的BAFF-R結合和細胞毒性。 圖 30A的圖顯示具有衍生自指定殖株的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白與在CHO細胞上表現的人BAFF-R的結合。 圖 30B的圖顯示Ramos細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定，該細胞毒性由具有衍生自指定殖株的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白誘導。 圖 30C的圖顯示Ramos細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定，該細胞毒性由具有衍生自AB0622的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白誘導。
[ 圖 31A和 31B]詳細說明了具有衍生自AB00605和AB0606的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白的多特異性測定。 圖 31A係該測定的示意圖。 圖 31B顯示了在不存在（上分圖）或存在（下分圖）多特異性試劑（PSR）的情況下AB0605（左分圖）或AB0606（右分圖）的圖。
[ 圖 32A-32C]係流動式細胞分析術圖，其顯示hBAFF-R-hFc-His與親代AB0369scFv或選自連續幾輪選擇後藉由親和力成熟並且在酵母上表現產生的文庫的殖株的結合。 圖 32A顯示與親代AB0369scFv的結合； 圖 32B顯示與來自第一輪殖株選擇的樣本的結合； 圖 32C顯示與來自第二輪殖株選擇的樣本的結合。
[ 圖 33A-33E]的流動式細胞分析術圖顯示hBAFF-R-hFc-His與AB0369和在酵母上表現的親和力成熟的scFv殖株的結合。 圖 33A顯示與親代AB0369的結合； 圖 33B顯示與AB0679的結合； 圖 33C顯示與AB0681的結合； 圖 33D顯示與AB0682的結合；並且 圖 33E顯示與基於伊利尤單抗的抗原結合位點的結合。
[ 圖 34A-34C]的圖證明由AB0369的親和力成熟開發的多特異性結合蛋白的BAFF-R結合。 圖 34A的圖顯示具有衍生自指定殖株的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白與在CHO細胞上表現的人BAFF-R的結合。 圖 34B的圖顯示具有衍生自指定殖株的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白與在CHO細胞上表現的人BAFF-R的結合。 圖 34C係顯示來自結合測定的螢光輸出的圖，該結合測定顯示了BAFF-生物素與CHO細胞上表現的BAFF-R的結合被指示抗體的阻斷。
[ 圖 35]的圖顯示BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定，該細胞毒性由具有衍生自AB0679、AB0568或工具-F3’陽性對照的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白誘導。
[ 圖 36A-36D]係流動式細胞分析術圖，其顯示hBAFF-R-hFc-His與選自連續幾輪選擇後藉由在酵母上表現的親和力成熟產生的文庫的親代AB0369scFv殖株的結合。 圖 36A顯示與親代AB0369scFv的結合； 圖 36B顯示與來自第一輪殖株選擇的樣本的結合； 圖 36C顯示與來自第二輪殖株選擇的樣本的結合；並且 圖 36D顯示與來自第三輪殖株選擇的樣本的結合。
[ 圖 37A-37F]的流動式細胞分析術圖顯示hBAFF-R-hFc-His與AB0369和在酵母上表現的親和力成熟的scFv殖株的結合。 圖 37A顯示與親代AB0369的結合； 圖 37B顯示與AB0682的結合； 圖 37C顯示與AB0898的結合； 圖 37D顯示與AB0899的結合； 圖 37E顯示與AB0900的結合；並且 圖 37F顯示與基於伊利尤單抗的抗原結合位點的結合。
[ 圖 38]的圖顯示BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定，該細胞毒性由具有衍生自AB0898、AB0899或AB0900的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白誘導。
[ 圖 39]顯示了AB0898（上分圖）、AB0899（中分圖）和AB0900（下分圖）的微差掃描熱量法（DSC）譜。
[ 圖 40]的流動式細胞分析術圖顯示在藉由與1 mM非生物素化hBAFFR-Fc孵育進行激發之前（左）和之後（右）在酵母上表現的scFv殖株與生物素化hBAFFR-Fc的結合。
[ 圖 41]的流動式細胞分析術圖顯示在藉由與1 mM非生物素化hBAFFR-Fc孵育進行激發之前（上）和之後（下）在酵母上表現的scFv殖株與生物素化hBAFFR-Fc結合。測試的殖株係（從左到右）AB1080、AB1081、AB1084、AB1085和伊利尤單抗。
[ 圖 42]的圖顯示指定抗體殖株與人（ 圖 42A）或石蟹獼猴（ 圖 42B）BAFF-R的結合。
[ 圖 43A和 43B]詳細說明了具有衍生自AB1080或AB1081的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白的多特異性測定。 圖 43A係該測定的示意圖。 圖 43B顯示了在不存在（上分圖）或存在（下分圖）多特異性試劑（PSR）的情況下AB1080（左分圖）、AB1081（左中分圖）、曲妥珠單抗陰性對照（右中分圖）或伊克珠單抗陽性對照（右分圖）的圖。
[ 圖 44A和 44B]的圖顯示與Tool陽性對照相比BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定，該細胞毒性由具有衍生自AB1080（ 圖 44A）或AB1085（ 圖 44B）的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白誘導。
[ 圖 45]的圖顯示來自指定抗體殖株對BAFF-生物素結合到在CHO細胞上表現的人BAFF-R的阻斷測定的螢光輸出。
[ 圖 46]的圖顯示了具有衍生自AB1080（左分圖）、AB1081（中左分圖）、AB1084（中右分圖）和AB1085（右分圖）的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白的奈米雙掃描螢光法（nanoDSF）分析。
[ 圖 47]的圖顯示了具有衍生自指定抗體的BAFF-R結合位點的多特異性結合蛋白的疏水相互作用層析（HIC）分析。
[ 圖 48]的圖顯示了AB1612與指定基準生物製劑相比的HIC分析。
[ 圖 49A和 49B]的圖顯示指定抗體殖株與人（ 圖 49B）或石蟹獼猴（ 圖 49A）BAFF-R的結合。
[ 圖 50]係顯示來自結合測定的螢光輸出的圖，該結合測定顯示了BAFF-生物素與CHO細胞上表現的人BAFF-R的結合被指示抗體的阻斷。
[ 圖 51]顯示了AB1424/1612 F3' TriNKET的BAFF-R結合臂的表面電荷分佈。顯示了三個取向：兩個正面（左分圖：前視圖；中心分圖：後視圖）和抗原接合表面（右分圖：頂視圖）。帶正電的區域為藍色，帶負電的區域為紅色，疏水表面為白色。
[ 圖 52]的圖顯示對AB1424/1612 F3’ TriNKET的BAFF-R結合臂的表面塊和CDR長度的評估。綠色實線和相應的綠色箭頭表示AB1424/1612 F3' TriNKET的BAFF-R結合臂參考377種後期治療性抗體的數據庫的評分。黃色虛線表示2個標準差（該區域內 ＞ 95%的參考分子），而紅色虛線表示3個標準差（該區域內 ＞ 99.7%的參考分子）。
[ 圖 53]顯示了AB1424/1612 F3' TriNKET的NKG2D結合臂的表面電荷分佈。顯示了三個取向：兩個正面（左分圖：前視圖；中心分圖：後視圖）和抗原接合表面（右分圖：頂視圖）。帶正電的區域為藍色，帶負電的區域為紅色，疏水表面為白色。
[ 圖 54]的圖顯示對AB1424/1612 F3’ TriNKET的NKG2D-R結合臂的表面塊和CDR長度的評估。綠色實線和相應的綠色箭頭表示AB1424/1612 F3' TriNKET的BAFF-R結合臂參考377種後期治療性抗體的數據庫的評分。黃色虛線表示2個標準差（該區域內 ＞ 95%的參考分子），而紅色虛線表示3個標準差（該區域內 ＞ 99.7%的參考分子）。
[ 圖 55]係顯示AB1424/1612 F3' TriNKET的HIC分析的層析圖（ 圖 55A）以及與阿達木單抗和派姆單抗的比較（ 圖 55B）。
[ 圖 56]的圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET的毛細管等電聚焦（cIEF）分析。
[ 圖 57]的圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET在PBS pH 7.4（上分圖）和HST pH 6.0（下分圖）中的DSC分析。
[ 圖 58]的圖顯示使用Kinexa對基於AB1424/1612 F3’ TriNKET結合細胞的BAFF-R進行的n曲線分析（ 圖 58A）和信賴區間（ 圖 58B）。
[ 圖 59]的圖顯示AB1424/1612 F3' TriNKET和相應親代mAb與同基因人（ 圖 59A）和石蟹獼猴（ 圖 59B）BAFF-R-CHO細胞的結合。
[ 圖 60A-60F]的圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET與BAFF-R+ 腫瘤細胞系結合。在存在BJAB（ 圖 60A）、Raji（ 圖 60B）、RL（ 圖 60C）、Rs4;11（ 圖 60D）、Jeko-1（ 圖 60E）、SUDHL-6細胞（ 圖 60F）的情況下進行滴定。FOB = 染色相比於未染色樣本的相比背景的倍數。
[ 圖 61]的圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET與人NKG2D的表面電漿共振（SPR）結合。彩色線代表原始數據，黑色跡線代表1 : 1結合擬合（上分圖）。相應的穩態擬合（下分圖）。垂直線表示穩態K D。
[ 圖 62]的圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET與石蟹獼猴NKG2D的SPR結合。彩色線代表原始數據，黑色跡線代表1 : 1結合擬合（上分圖）。相應的穩態擬合（下分圖）。垂直線表示穩態K D。
[ 圖 63]的圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET與人CD16a V158（上分圖）或曲妥珠單抗（下分圖）的SPR結合。彩色線代表原始數據，黑色跡線代表1 : 1結合擬合。
[ 圖 64]的圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET（上分圖）或曲妥珠單抗（下分圖）與人CD16a F158的SPR結合。彩色線代表原始數據，黑色跡線代表1 : 1結合擬合（上分圖）。
[ 圖 65]的圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET與石蟹獼猴CD16的SPR結合。彩色線代表原始數據，黑色跡線代表1 : 1結合擬合（上分圖）。相應的穩態擬合（下分圖）。垂直線表示穩態K D。
[ 圖 66]的圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET與NKG2D（棕色）、CD16a（紫色）或混合的CD16a和NKG2D（藍色）表面的SPR結合。
[ 圖 67]係傳感圖，表示BAFF-R（800 nM）的結合，然後是hNKG2D（7 μM）與捕獲的AB1424/1612 F3' TriNKET的結合（ 圖 67A）或相反順序的靶標與人NKG2D（7μM）結合，然後與BAFF-R（800 nM）結合（ 圖 67B）。
[ 圖68]的圖顯示BAFF-R和TACI與固定化AB1424/1612 F3' TriNKET（ 圖 68A）和特異性抗TACI mAb（ 圖 68B）結合的SPR分析。
[ 圖 69]的圖顯示AB1424/1612 F3' TriNKET與不表現BCMA的親代細胞（ 圖 69A）和同基因BCMA+細胞的結合與對照mAb特異性抗BCMA（ 圖 69B ）相比較。
[ 圖 70]的圖顯示AB1424/1612 F3' TriNKET與等基因BAFFR+ CHO細胞結合（ 圖 70A）和與親代CHO細胞系缺乏反應性（ 圖 70B）。
[ 圖 71A和 71B]詳細介紹了AB1424/1612 F3' TriNKET的多特異性測定。 圖 71A係該測定的示意圖。 圖 71B顯示了在不存在（上分圖）或存在（下分圖）多特異性試劑（PSR）的情況下 AB1424/1612 F3’ TriNKET（左分圖）、曲妥珠單抗陰性對照（中分圖）或伊克珠單抗陽性對照（右分圖）的圖。
[ 圖 72A-72C]的圖顯示了使用來自三個供體的NK細胞由AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）或親代單株抗體（紅色）誘導的RL細胞的細胞毒性測定。
[ 圖 73A-73D]顯示了AB1424/1612 F3' TriNKET的示意圖和用於闡明作用機制的對照。
[ 圖 74]的圖顯示了由AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）、缺乏NKG2D結合的AB1424/1612 F3' TriNKET（黑色）或AB1424/1612 F3' TriNKET- Fc緘默化（紅色）或帕利珠單抗F3' TriNKET（灰色）誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 75]的傳感圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與人CD64的結合。原始傳感圖（彩色）與1 : 1擬合曲線疊加（黑色）。
[ 圖 76]的傳感圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與石蟹獼猴CD64的結合。原始傳感圖（彩色）與1 : 1擬合曲線疊加（黑色）。
[ 圖 77]的傳感圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與人CD32a H131的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 78]的傳感圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與人CD32a R131的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 79]的傳感圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與人CD32b的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 80]的傳感圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與人CD16b的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 81]的傳感圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與石蟹獼猴CD16的結合。
[ 圖 82]的傳感圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）在pH 6.0與人FcRn的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 83]的傳感圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）在pH 6.0與石蟹獼猴FcRn的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 84]係原始傳感圖，顯示AB1424/1612 F3' TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）在pH 7.4與人（左分圖）和石蟹獼猴（右分圖）FcRn的結合。
[ 圖 85]的圖顯示了由兩批AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色和紅色）或人IgG1k（灰色）誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 86A]的圖顯示了由兩批AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色和紅色）或人IgG1k（灰色）誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 86B]的圖顯示了由AB1424/1612 F3' TriNKET在50%（紅色）、100%（藍色）和200%（綠色）的標稱藥物濃度（NDC）下誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 87]顯示AB1424/1612 F3' TriNKET在組胺酸（ 圖 87A）和乙酸鹽（ 圖 87B）中的PEG沈澱C m圖。
[ 圖 88]顯示阿達木單抗在組胺酸（ 圖 88A）和乙酸鹽（ 圖 88B）中的PEG沈澱C m圖。
[ 圖 89]顯示阿達木單抗在乙酸鹽（ 圖 89A）、組胺酸（ 圖 89B）和磷酸鹽（ 圖 89C）中的k D圖。
[ 圖 90]顯示AB1424/1612 F3' TriNKET在乙酸鹽（ 圖 90A）、組胺酸（ 圖 90B）和磷酸鹽（ 圖 90C）中的k D圖。
[ 圖 91]係AB1424/1612 F3' TriNKET在25°C時的黏度相比於濃度。
[ 圖 92]係AB1424/1612 F3' TriNKET在40°C在HST中在pH 6.0 4週後與對照相比的粒徑篩析層析（SEC）分析的層析圖。
[ 圖 93]的圖顯示AB1424/1612 F3’ TriNKET在40°C在HST中在pH 6.0 4週後與對照相比的毛細管電泳十二烷基硫酸鈉（CE-SDS）分析。
[ 圖 94]的圖顯示AB1424/1612 F3' TriNKET在HST中在pH 6.0與對照相比的cIEF分析。
[ 圖 95A-95C]顯示與對照相比，在40°C在HST中在pH 6.0 4週後AB1424/1 612 F3' TriNKET與hBAFF-R、hNKG2D和hCD16aV的結合。 圖 95A的圖顯示與BJAB細胞（BAFF-R）的結合； 圖 95B的傳感圖藉由SPR顯示與hNKG2D的結合。 圖 95C的傳感圖藉由SPR顯示與hCD16a V158的結合。彩色傳感圖代表原始數據，黑色疊加圖代表原始數據的動力學擬合。
[ 圖 96]的圖顯示了與對照（藍色）相比在40°C在HST中在pH 6.0 1週（紅色）、2週（綠色）、3週（紫色）後由AB1424/1612 F3' TriNKET誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 97]顯示了AB1424/1612 F4 TriNKET的BAFF-R結合臂的表面電荷分佈。顯示了三個取向：兩個正面（左分圖：前視圖；中心分圖：後視圖）和抗原接合表面（右分圖：頂視圖）。帶正電的區域為藍色，帶負電的區域為紅色，疏水表面為白色。
[ 圖 98]的圖顯示對AB1424/1612 F4 TriNKET的BAFF-R結合臂的表面塊和CDR長度的評估。綠色實線和相應的綠色箭頭表示AB1424/1612 F4 TriNKET的BAFF-R結合臂參考377種後期治療性抗體的數據庫的評分。黃色虛線表示2個標準差（該區域內 ＞ 95%的參考分子），而紅色虛線表示3個標準差（該區域內 ＞ 99.7%的參考分子）。
[ 圖 99]顯示了AB1424/1612 F4 TriNKET的NKG2D結合臂的表面電荷分佈。顯示了三個取向：兩個正面（左分圖：前視圖；中心分圖：後視圖）和抗原接合表面（右分圖：頂視圖）。帶正電的區域為藍色，帶負電的區域為紅色，疏水表面為白色。
[ 圖 100]的圖顯示對AB1424/1612 F4 TriNKET的NKG2D-R結合臂的表面塊和CDR長度的評估。綠色實線和相應的綠色箭頭表示AB1424/1612 F3' TriNKET的BAFF-R結合臂參考377種後期治療性抗體的數據庫的評分。黃色虛線表示2個標準差（該區域內 ＞ 95%的參考分子），而紅色虛線表示3個標準差（該區域內 ＞ 99.7%的參考分子）。
[ 圖 101] 係三批AB1424/1612 F4 TriNKET的SEC分析層析圖。
[ 圖 102]的圖顯示三批AB1424/1612 F4 TriNKET的cIEF分析。
[ 圖 103A和 103B]。 圖 103A的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET與所示基準商用抗體相比的HIC分析。 圖 103B的圖顯示藉由DSC對AB1424/1612 F4 TriNKET的熱穩定性分析。
[ 圖 104]顯示了Fc（未還原和還原）中經工程改造的二硫化物對的提取離子層析圖（XIC）以及該肽對的最強電荷狀態。
[ 圖 105]顯示了scFv（未還原和還原）中經工程改造的二硫化物對的XIC以及該肽對的最強電荷狀態。
[ 圖 106A和 圖 106B]的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET、親代mAb和F4-帕利珠單抗與人（ 圖 106A）和石蟹獼猴（ 圖 106B）BAFF-R+等基因CHO細胞的結合。
[ 圖 107]係AB1424/1612 F4 TriNKET與人NKG2D的SPR結合的傳感圖。
[ 圖 108]的傳感圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與人CD32a R131的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 109]的傳感圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與人CD16a V158的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 110]的傳感圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與人CD16a V158的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 111]的傳感圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與人CD64的結合。原始傳感圖（彩色）與1:1擬合曲線疊加（黑色）。
[ 圖 112]的傳感圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與石蟹獼猴CD64的結合。原始傳感圖（彩色）與1:1擬合曲線疊加（黑色）。
[ 圖 113]的傳感圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與人CD32a H131的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 114]的傳感圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與人CD32b的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 115]的傳感圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）與人CD16b的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 116]的傳感圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）在pH 6.0與人FcRn的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 117]的傳感圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）在pH 6.0與石蟹獼猴FcRn的結合。對於每個分子，上分圖代表原始傳感圖，下分圖代表穩態親和擬合。
[ 圖 118]係原始傳感圖，顯示AB1424/1612 F4 TriNKET（上分圖）和曲妥珠單抗（下分圖）在pH 7.4與人（左分圖）和石蟹獼猴（右分圖）FcRn的結合。
[ 圖 119]的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET與NKG2D（棕色）、CD16a（紫色）或混合的CD16a和NKG2D（藍色）表面的SPR結合。
[ 圖 120A和 圖 120B]的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET對BAFF-R和NKG2D的順序飽和。
[ 圖 121A和 121B]詳細介紹了AB1424/1612 F4 TriNKET的多特異性測定。 圖 121A係該測定的示意圖。 圖 121B顯示了在不存在（上分圖）或存在（下分圖）多特異性試劑（PSR）的情況下AB1424/1612 F4 TriNKET（左分圖）、曲妥珠單抗（中左分圖）、利妥昔單抗（中右分圖）或伊克珠單抗（右分圖）的圖。
[ 圖 122]圖顯示了由AB1424/1612 F4 TriNKET（藍色）和人IgG1k（灰色）誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 123]的圖顯示了由AB1424/1612 F4 TriNKET（藍色）和親代mAb（紅色）誘導的BJAB細胞的靜息hNK誘導細胞毒性測定。
[ 圖 124] 係AB1424/1612 F4 TriNKET在40°C在HST中在pH 6.0 4週後與對照相比的SEC分析的層析圖。
[ 圖 125]的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET在40°C在HST中在pH 6.0 4週後與對照相比的還原型CE-SDS分析。
[ 圖 126]的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET在40°C在HST中在pH 6.0 4週後與對照相比的cIEF分析。
[ 圖 127]的圖顯示在40°C在HST中在pH 6.0 4週後與對照相比AB1424/1612 F4 TriNKET與hBAFF-R+細胞的結合。
[ 圖 128]的傳感圖顯示與對照（ 圖 128A）相比，在40°C在HST中在pH 6.0 4週後hCD16aV與AB1424/1612 F4 TriNKET的SPR結合（ 圖 128B）。
[ 圖 129]的圖顯示與對照（藍色）相比，在40°C在HST中在pH 6.0 4週後AB1424/1612 F4 TriNKET誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定（紅色）。
[ 圖 130]係AB1424/1612 F4 TriNKET在強制氧化後與對照相比的SEC分析的層析圖。
[ 圖 131]的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET在強制氧化後與對照相比的還原型CE-SDS分析。
[ 圖 132]的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET在強制氧化後與hBAFF-R+ 細胞結合。
[ 圖 133]的傳感圖顯示hCD16aV與AB1424/1612 F4 TriNKET對照（ 圖 133A）和強制氧化後（ 圖 133B）的SPR結合。
[ 圖 134]係由AB1424/1612 F4 TriNKET在強制氧化後（紅色）和由對照（藍色）誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 135]係AB1424/1612 F4 TriNKET在長期低pH應激後與對照相比的SEC分析的層析圖。
[ 圖 136]的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET在長期低pH應激後與對照相比的還原型CE-SDS分析。
[ 圖 137]的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET在長期低pH應激後與對照相比的cIEF分析。
[ 圖 138]的圖顯示在長期低pH應激後與對照相比AB1424/1612 F4 TriNKET與hBAFF-R+細胞的結合。
[ 圖 139]的傳感圖顯示與對照（ 圖 139A）相比，在長期低pH應激後hCD16aV與AB1424/1612 F4 TriNKET的SPR結合（ 圖 139B）。
[ 圖 140]係由AB1424/1612 F4 TriNKET在長期低pH應激後（紅色）和由對照（藍色）誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 141]係AB1424/1612 F4 TriNKET在長期高pH應激後與對照相比的SEC分析的層析圖。
[ 圖 142]的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET在長期高pH應激後與對照相比的還原型CE-SDS分析。
[ 圖 143]的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET在長期高pH應激後與對照相比的cIEF分析。
[ 圖 144]的圖顯示與對照（藍色）相比在長期高pH應激後AB1424/1612 F4 TriNKET與hBAFF-R+細胞的結合（紅色）。
[ 圖 145]的傳感圖顯示與對照（左分圖）相比，在長期高pH應激後hCD16aV與AB1424/1612 F4 TriNKET的SPR結合（右分圖）。
[ 圖 146]係由AB1424/1612 F4 TriNKET在長期高pH應激後（紅色）和由對照（藍色）誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 147]係AB1424/1612 F4 TriNKET在6次冷凍/解凍循環後與對照相比的SEC分析的層析圖。
[ 圖 148]的圖顯示與AB1424/1612 F4 TriNKET在6次冷凍/解凍循環後對照相比的還原型CE-SDS分析。
[ 圖 149]的圖顯示與對照（藍色）相比在6次冷凍/解凍循環後AB1424/1612 F4 TriNKET與hBAFF-R+細胞的結合（紅色）。
[ 圖 150]係由AB1424/1612 F4 TriNKET在6次冷凍/解凍循環後（紅色）和由對照（藍色）誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 151]係AB1424/1612 F4 TriNKET在攪拌應激後與對照相比的SEC分析的層析圖。
[ 圖 152]的圖顯示與AB1424/1612 F4 TriNKET在攪拌應激後對照相比的還原型CE-SDS分析。
[ 圖 153]的圖顯示與對照（藍色）相比在攪拌應激後AB1424/1612 F4 TriNKET與hBAFF-R+細胞的結合（紅色）。
[ 圖 154]係由AB1424/1612 F4 TriNKET在攪拌應激後（紅色）和由對照（藍色）誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 155]的層析圖顯示在低pH保持前（上分圖）和後（下分圖）AB1424/1612 F4 TriNKET蛋白A洗脫物的SEC分析。
[ 圖 156]的圖顯示AB1424/1612 F4 TriNKET在低pH保持後與對照相比的cIEF分析。
[ 圖 157]的圖顯示與AB1424/1612 F4 TriNKET在低pH保持後對照相比的還原型CE-SDS分析。
[ 圖 158]的圖顯示與對照（紅色）相比在低pH保持後AB1424/1612 F4 TriNKET與hBAFF-R+細胞的結合（藍色）。
[ 圖 159]係由AB1424/1612 F4 TriNKET在低pH保持後（藍色）和由對照（紅色）誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 160]的圖顯示AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）、AB1424/1612 F4 TriNKET（紅色）和親代mAb（黑色）與KHYG-1（ 圖 160A）和KHYG-1-CD16V（ 圖 160B）細胞系的結合。
[ 圖 161]的圖顯示BAFF-R在暴露於AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）、AB1424/1612 F4 TriNKET（紅色）和親代mAb（黑色）（ 圖 161A）以及用IL-2活化（ 圖 161B）的RL細胞上的表面保留百分比。
[ 圖 162]的圖顯示BAFF-R在暴露於AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）、AB1424/1612 F4 TriNKET（紅色）和親代mAb（黑色）的Raji細胞上的表面保留百分比。
[ 圖 163]的圖顯示RL細胞在與AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）、AB1424/1612 F4 TriNKET（紅色）、親代mAb（黑色）和人IgG1k（灰色）孵育後的靜息人NK細胞誘導細胞毒性測定。
[ 圖 164]係RL細胞在與AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）、AB1424/1612 F4 TriNKET（紅色）、F3'對照（黑色）和F4對照（灰色）孵育後的靜息人NK細胞誘導細胞毒性測定。細胞與對照（ 圖 164A）或IL-2（ 圖 164B）共培養。
[ 圖 165]的圖顯示了由AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）、缺乏NKG2D結合的AB1424/1612 F3' TriNKET（黑色）或AB1424/1612 F3' TriNKET- Fc緘默化（紅色）或帕利珠單抗F3' TriNKET（灰色）誘導的BJAB細胞的KHYG-1-CD16aV細胞毒性測定。
[ 圖 166]的圖顯示了由AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）、缺乏NKG2D結合的AB1424/1612 F3' TriNKET（黑色）或AB1424/1612 F3' TriNKET- Fc緘默化（紅色）或帕利珠單抗F3' TriNKET（灰色）誘導的BJAB細胞的靜息人NK細胞誘導細胞毒性測定。
[ 圖 167]的圖顯示RL細胞在與AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）、AB1424/1612 F4 TriNKET（紅色）、AB1424/1612 F3' TriNKET加可溶性MICA（黑色）和AB1424/1612 F4 TriNKET加可溶性MICA（灰色）孵育後的靜息人NK細胞誘導細胞毒性測定。
[ 圖 168]的圖顯示RL細胞在與AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）、AB1424/1612 F4 TriNKET（紅色）、AB1424/1612 F3' TriNKET加BAFF（黑色）和AB1424/1612 F4 TriNKET加BAFF（灰色）孵育後的靜息人NK細胞誘導細胞毒性測定。
[ 圖 169]的圖顯示BJAB細胞在與AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）、AB1424/1612 F4 TriNKET（紅色）、親代mAb（黑色）、F3'-帕利珠單抗（淺灰色）和F4-帕利珠單抗（深灰色）孵育後的干擾素γ（IFNγ）和CD107a的產生。
[ 圖 170]的圖顯示與AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）、AB1424/1612 F4 TriNKET（紅色）、親代mAb（黑色）和Fc緘默化的AB1424/1612 F3' TriNKET（粉紅色）孵育後M0巨噬細胞吞噬BJAB細胞。
[ 圖 171]的圖顯示Raji細胞在與利妥昔單抗（黑色）、AB1424/1612 F3’ TriNKET（藍色）或AB1424/1612 F3’ TriNKET孵育後的人血清誘導細胞毒性測定。
[ 圖 172]的長條圖顯示AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）和F3'-帕利珠單抗（紅色）與PBMC中指定BAFF-R+ 細胞結合的流動式細胞分析術分析。
[ 圖 173]的長條圖顯示AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）和F3'-帕利珠單抗（紅色）與人血液中指定細胞類型結合的流動式細胞分析術分析。
[ 圖 174]的長條圖顯示AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）和F3'-帕利珠單抗（紅色）與人紅血球結合的流動式細胞分析術分析。
[ 圖 175]的圖顯示（從左到右）AB1424/1612 F3’ TriNKET、F3’-帕利珠單抗、AB1424/1612 F4 TriNKET、F4-帕利珠單抗和利妥昔單抗與指定人供體PBMC結合的流動式細胞分析術分析。
[ 圖 176]的長條圖顯示AB1424/1612 F3' TriNKET（藍色）和F3'-帕利珠單抗（紅色）與來自石蟹獼猴全血供體CYN317060的指定PBMC結合的流動式細胞分析術分析。
[ 圖 177]的圖顯示（從左到右）AB1424/1612 F3’ TriNKET、F3’-帕利珠單抗、AB1424/1612 F4 TriNKET、F4-帕利珠單抗和利妥昔單抗與指定人供體PBMC結合的流動式細胞分析術分析。
[ 圖 178]的圖顯示BJAB細胞與來自石蟹獼猴全血供體CYN317060的PBMC的共培養物中CD16+CD8+ NK細胞的CD107a陽性。
無
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Claims (67)

  1. 一種蛋白，其包含： (a)   結合NKG2D的第一抗原結合位點； (b)   結合B細胞活化因子受體（BAFF-R）的第二抗原結合位點；以及 (c)   足以結合CD16的抗體Fc結構域或其部分，或結合CD16的第三抗原結合位點。
  2. 如請求項1所述之蛋白，其中結合NKG2D的該第一抗原結合位點係Fab片段，並且結合BAFF-R的該第二抗原結合位點係scFv。
  3. 如請求項1所述之蛋白，其中結合NKG2D的該第一抗原結合位點係scFv，並且結合BAFF-R的該第二抗原結合位點係Fab片段。
  4. 如請求項1所述之蛋白，其進一步包含結合BAFF-R的另外的抗原結合位點。
  5. 如請求項4所述之蛋白，其中結合NKG2D的該第一抗原結合位點係scFv，並且結合BAFF-R的該第二抗原結合位點和該另外的抗原結合位點各自是Fab片段。
  6. 如請求項4所述之蛋白，其中結合NKG2D的該第一抗原結合位點係scFv，並且結合BAFF-R的該第二抗原結合位點和該另外的抗原結合位點各自是scFv。
  7. 如請求項4-6中任一項所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點和該另外的抗原結合位點的胺基酸序列係相同的。
  8. 如請求項3和6-7中任一項所述之蛋白，其中結合NKG2D的該scFv經由包含Ala-Ser或Gly-Ser的鉸鏈連接至足以結合CD16的抗體恒定結構域或其部分，並且其中該scFv包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域。
  9. 如請求項2和6-8中任一項所述之蛋白，其中每個結合BAFF-R的scFv經由包含Ala-Ser或Gly-Ser的鉸鏈連接至足以結合CD16的抗體恒定結構域或其部分，並且其中該scFv包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域。
  10. 如請求項8或9所述之蛋白，其中該鉸鏈進一步包含胺基酸序列Thr-Lys-Gly。
  11. 如請求項3和5-10中任一項所述之蛋白，其中在結合NKG2D的該scFv中，該scFv的該重鏈可變結構域與該scFv的該輕鏈可變結構域形成雙硫鍵。
  12. 如請求項2和6-11中任一項所述之蛋白，其中在每個結合BAFF-R的scFv中，該scFv的該重鏈可變結構域與該scFv的該輕鏈可變結構域形成雙硫鍵。
  13. 如請求項11或12所述之蛋白，其中該雙硫鍵在該重鏈可變結構域的C44和該輕鏈可變結構域的C100之間形成，按照Kabat編號方案編號。
  14. 如請求項3和5-13中任一項所述之蛋白，其中在結合NKG2D的該scFv中，該重鏈可變結構域藉由柔性連接子連接至該輕鏈可變結構域。
  15. 如請求項2和6-14中任一項所述之蛋白，其中在每個結合BAFF-R的scFv中，該重鏈可變結構域藉由柔性連接子連接至該輕鏈可變結構域。
  16. 如請求項14或15所述之蛋白，其中該柔性連接子包含(G 4S) 4（SEQ ID NO: 119）。
  17. 如請求項3和5-16中任一項所述之蛋白，其中在結合NKG2D的該scFv中，該重鏈可變結構域位於該輕鏈可變結構域的C末端。
  18. 如請求項2和6-17中任一項所述之蛋白，其中在每個結合BAFF-R的scFv中，該重鏈可變結構域位於該輕鏈可變結構域的C末端。
  19. 如請求項3和5-16中任一項所述之蛋白，其中在結合NKG2D的該scFv中，該重鏈可變結構域位於該輕鏈可變結構域的N末端。
  20. 如請求項2、6-17和19中任一項所述之蛋白，其中在每個結合BAFF-R的scFv中，該重鏈可變結構域位於該輕鏈可變結構域的N末端。
  21. 如請求項2、9-10、12-13、15-16、18和20中任一項所述之蛋白，其中結合NKG2D的該Fab片段不位於抗原結合位點和該Fc或其部分之間。
  22. 如請求項3、5、7-8、10-11、13-14、16-17和19中任一項所述之蛋白，其中結合BAFF-R的Fab片段不位於抗原結合位點和該Fc或其部分之間。
  23. 一種蛋白，其包含： (a) 包含結合NKG2D的Fab片段的第一抗原結合位點； (b) 第二抗原結合位點，其包含結合B細胞活化因子受體（BAFF-R）的單鏈可變片段（scFv）；以及 (c) Fc結構域，其包含形成結合CD16的異二聚物的第一抗體恒定結構域和第二抗體恒定結構域， 其中該scFv藉由鉸鏈連接至該第一抗體恒定結構域的N末端，並且該Fab連接至該第二抗體恒定結構域的N末端。
  24. 如請求項23所述之蛋白，其中該鉸鏈包含Gly-Ser。
  25. 如請求項1-24中任一項所述之蛋白，其中該第一抗原結合位點結合人NKG2D。
  26. 如請求項1-25中任一項所述之蛋白，其中結合NKG2D的該第一抗原結合位點包含以下：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 81、82和112的胺基酸序列的互補決定區1（CDR1）、互補決定區2（CDR2）和互補決定區3（CDR3）；和VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
  27. 如請求項1-26中任一項所述之蛋白，其中結合NKG2D的該第一抗原結合位點包含以下：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 81、82和97的胺基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列；和VL，其包含分別由SEQ ID NO: 86、77和87的胺基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。
  28. 如請求項1-27中任一項所述之蛋白，其中結合NKG2D的該第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含與SEQ ID NO: 95至少90%相同的胺基酸序列，並且該VL包含與SEQ ID NO: 85至少90%相同的胺基酸序列。
  29. 如請求項1-28中任一項所述之蛋白，其中結合NKG2D的該第一抗原結合位點包含VH和VL，該VH包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列並且該VL包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列。
  30. 如請求項1-29中任一項所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點包含以下：重鏈可變結構域，其包含分別為SEQ ID NO: 260、249和261的CDR1、CDR2和CDR3序列；和輕鏈可變結構域，其包含分別為SEQ ID NO: 217、77和259的CDR1、CDR2和CDR3序列。
  31. 如請求項1-30中任一項所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點包含以下：重鏈可變結構域，其包含分別為SEQ ID NO: 214、233和248的CDR1、CDR2和CDR3序列；和輕鏈可變結構域，其包含分別為SEQ ID NO: 217、77和249的CDR1、CDR2和CDR3序列。
  32. 如請求項31所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點包含與SEQ ID NO: 250至少90%相同的重鏈可變結構域和與SEQ ID NO: 251至少90%相同的輕鏈可變結構域。
  33. 如請求項32所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點包含相對於SEQ ID NO: 250具有G44C取代的VH，和相對於SEQ ID NO: 251具有G100C取代的VL。
  34. 如請求項1-33中任一項所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點包含含有SEQ ID NO: 252的胺基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 253的胺基酸序列的VL，或含有SEQ ID NO: 250的胺基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 251的胺基酸序列的VL。
  35. 如請求項1-34中任一項所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點包含含有SEQ ID NO: 252的胺基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 253的胺基酸序列的VL。
  36. 如請求項1-32或34中任一項所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點包含含有SEQ ID NO: 250的胺基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 251的胺基酸序列的VL。
  37. 如請求項1-35中任一項所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點包含單鏈可變片段（scFv），並且其中該scFv包含含有SEQ ID NO: 252的胺基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 253的胺基酸序列的VL。
  38. 如請求項1、2、9-10、12-13、15-16、18、20-21、23-35和37中任一項所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點包含單鏈可變片段（scFv），並且其中該scFv包含與選自由SEQ ID NO: 254和255組成之群組的序列至少90%相同的胺基酸序列。
  39. 如請求項1、2、9-10、12-13、15-16、18、20-21、23-35和37-38中任一項所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點包含scFv，並且該scFv包含與SEQ ID NO: 254至少90%相同的胺基酸序列。
  40. 如請求項1、2、9-10、12-13、15-16、18、20-21、23-35和37-38中任一項所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點包含scFv並且該scFv包含SEQ ID NO: 254的胺基酸序列。
  41. 如請求項1、2、9-10、12-13、15-16、18、20-21、23-35和37-40中任一項所述之蛋白，其中該蛋白包含與SEQ ID NO: 270至少90%相同的胺基酸序列。
  42. 如請求項1、2、9-10、12-13、15-16、18、20-21、23-35和37-41中任一項所述之蛋白，其中該蛋白包含SEQ ID NO: 270的胺基酸序列。
  43. 如請求項1-3、5、7-8、10-11、13-14、16-17、19、24-34和36中任一項所述之蛋白，其中該蛋白包含與SEQ ID NO: 271至少90%相同的胺基酸序列。
  44. 如請求項1-3、5、7-8、10-11、13-14、16-17、19、24-34、36和43中任一項所述之蛋白，其中該蛋白包含SEQ ID NO: 271的胺基酸序列。
  45. 如請求項1-44中任一項所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點以小於或等於5 nM的解離常數（K D）結合人BAFF-R，如藉由表面電漿共振（SPR）測量。
  46. 如請求項1-45中任一項所述之蛋白，其中該第二抗原結合位點抑制BAFF-R與BAFF的結合。
  47. 一種蛋白，其包含： (a)   第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體的VH和VL，其中該VH包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列，並且該VL包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗BAFF-R抗體的VH和VL，其中該VH包含SEQ ID NO: 252的胺基酸序列，並且該VL包含SEQ ID NO: 253的胺基酸序列；以及 (c)   足以結合CD16的抗體Fc結構域或其部分，或結合CD16的第三抗原結合位點。
  48. 一種蛋白，其包含： (a)   第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體的VH和VL，其中該VH包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列，並且該VL包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含SEQ ID NO: 254的胺基酸序列；以及 (c)   足以結合CD16的抗體Fc結構域或其部分，或結合CD16的第三抗原結合位點。
  49. 如請求項1-48中任一項所述之蛋白，其中該抗體Fc結構域係人IgG1抗體Fc結構域。
  50. 如請求項49所述之蛋白，其中該抗體Fc結構域或其部分包含與SEQ ID NO: 118至少90%相同的胺基酸序列。
  51. 如請求項49或50所述之蛋白，其中該抗體Fc結構域的至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO: 118在選自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、和K439的一或多個位置處包含一或多個突變，根據EU編號系統進行編號。
  52. 如請求項49-51中任一項所述之蛋白，其中該抗體Fc結構域的至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO: 118包含選自Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、F405L、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、K409R、T411D、T411E、K439D、和K439E的一或多個突變，根據EU編號系統進行編號。
  53. 如請求項49-52中任一項所述之蛋白，其中該抗體重鏈恒定區的一個多肽鏈相對於SEQ ID NO: 118在選自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439的一或多個位置處包含一或多個突變；並且該抗體重鏈恒定區的另一個多肽鏈相對於SEQ ID NO: 118在選自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、D401、F405、Y407、K409、T411、和K439的一或多個位置處包含一或多個突變，根據EU編號系統進行編號。
  54. 如請求項53所述之蛋白，其中該抗體重鏈恒定區的一個多肽鏈包含相對於SEQ ID NO: 118的K360E和K409W取代；並且該抗體重鏈恒定區的另一個多肽鏈包含相對於SEQ ID NO: 118的Q347R、D399V和F405T取代，根據EU編號系統進行編號。
  55. 如請求項53所述之蛋白，其中該抗體重鏈恒定區的一個多肽鏈包含相對於SEQ ID NO: 118的F405L取代；並且該抗體重鏈恒定區的另一個多肽鏈包含相對於SEQ ID NO: 118的K409R取代，根據EU編號系統進行編號。
  56. 如請求項53-55中任一項所述之蛋白，其中該抗體重鏈恒定區的一個多肽鏈包含相對於SEQ ID NO: 118的Y349C取代；並且該抗體重鏈恒定區的另一個多肽鏈包含相對於SEQ ID NO: 118的S354C取代，根據EU編號系統進行編號。
  57. 一種蛋白，其包含： (a) 包含SEQ ID NO: 270的胺基酸序列的第一多肽； (b) 包含SEQ ID NO: 194的胺基酸序列的第二多肽；以及 (c) 包含SEQ ID NO: 195的胺基酸序列的第三多肽。
  58. 一種蛋白，其包含： (a) 包含SEQ ID NO: 271的胺基酸序列的第一多肽； (b) 包含SEQ ID NO: 272的胺基酸序列的第二多肽；以及 (c) 包含SEQ ID NO: 273的胺基酸序列的第三多肽。
  59. 一種藥物組成物，其包含如請求項1至58中任一項所述之蛋白和藥學上可接受的載劑。
  60. 一種細胞，其包含一或多種編碼如請求項1至58中任一項所述之蛋白的核酸。
  61. 一種增強腫瘤細胞死亡的方法，該方法包括將腫瘤細胞和自然殺傷細胞暴露於有效量的如請求項1至58中任一項所述之蛋白或如請求項59中所述之藥物組成物。
  62. 一種治療癌症的方法，該方法包括向有需要的受試者投與有效量的如請求項1-58中任一項所述之蛋白或如請求項59所述之藥物組成物。
  63. 如請求項62所述之方法，其中該癌症選自由以下組成之群組：B細胞非何杰金氏淋巴瘤（B-NHL）、慢性淋巴球白血病（CLL）、套細胞淋巴瘤（MCL）、濾泡性淋巴瘤（FL）、彌漫性大B-細胞淋巴瘤（DLBCL）、緣帶淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織（MALT）淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤和急性淋巴球白血病（ALL）。
  64. 一種增強B細胞死亡的方法，該方法包括將B細胞和自然殺傷細胞暴露於有效量的如請求項1至58中任一項所述之蛋白或如請求項59中所述之藥物組成物。
  65. 一種治療自體免疫性炎性疾病的方法，該方法包括向有需要的受試者投與有效量的如請求項1至54中任一項所述之蛋白或如請求項59中所述之藥物組成物。
  66. 如請求項1-58中任一項所述之蛋白，其中該蛋白係純化的蛋白。
  67. 如請求項66所述之蛋白，其中使用選自由以下組成的方法純化該蛋白：離心、深度過濾、細胞裂解、均質化、凍融、親和純化、凝膠過濾、離子交換層析、疏水相互作用交換層析和混合模式層析。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9458240B2 (en) * 2010-12-10 2016-10-04 Novartis Pharma Ag Anti-BAFFR antibody formulations
EP3610924B1 (en) * 2014-06-06 2021-11-03 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
TWI717375B (zh) * 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
CN113004417A (zh) * 2017-09-07 2021-06-22 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和肿瘤相关抗原的蛋白质
EA202091976A1 (ru) * 2018-02-20 2021-07-06 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на cd33, и их применение
US20240117054A1 (en) * 2019-10-15 2024-04-11 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and flt3
CA3163104A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Chimeric antigen receptors and uses thereof

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