JP2022551969A - Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６およびｆｌｔ３に結合するタンパク質 - Google Patents

Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６およびｆｌｔ３に結合するタンパク質 Download PDF

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Abstract

ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６およびＦＬＴ３に結合する多重特異性結合タンパク質、ならびに自己免疫疾患またはがんの処置にとって有用な医薬組成物および治療方法が記載されている。

Description

本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１０月１５日に出願された米国仮出願第６２／９１５，１２３号の優先権を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩテキスト書式の配列表のコンピュータ読み取り可能形式（ＣＲＦ）を参照によりその全体で組み込んでいる。配列表テキストファイルは、「１４２４７－４７４－８８８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ」と題され、２０２０年１０月５日に作成され、３１７，５７２バイトの大きさである。
本発明は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６およびＦＬＴ３に結合する多重特異性結合タンパク質に関する。
がんは、この疾患を処置するための文献で報告されている実質的な研究努力と科学的進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫を含む血液および骨髄のがんは、頻繁に診断されるがんの種類である。これらのがんのための現在の処置の選択肢は、すべての患者にとって有効ではなく、および／または実質的に有害な副作用を有する場合もある。がんの他の種類もまた、既存の治療選択肢を使用して処置することは難しいままである。
がん免疫療法は、高度に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進できるので望ましいものである。腫瘍細胞およびＴ細胞に結合して、腫瘍細胞の破壊を促進する、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融合タンパク質は、文献に記載されるがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原に、およびある特定の免疫細胞に結合する抗体が、文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１およびＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の成分であり、循環リンパ球のおよそ１５％を構成する。ＮＫ細胞は、実質的にすべての組織に浸潤し、元々は、事前の感作を必要とすることなく腫瘍細胞を効果的に殺滅するその能力を特徴とする。活性化されたＮＫ細胞は、細胞傷害性細胞と同様の手段によって、－すなわち、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒を介して、ならびに細胞死受容体経路を介して標的細胞を殺滅する。活性化されたＮＫ細胞はまた、ＩＦＮ－γなどの炎症性サイトカインおよび他の白血球の標的組織への動員を促進するケモカインを分泌する。
ＮＫ細胞は、その表面上の種々の活性化受容体および阻害性受容体を介してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健常な自己細胞に遭遇すると、その活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化によって阻害される。あるいは、ＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇すると、それらはその活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲｓ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、その表面上のＣＤ１６受容体を介していくつかの免疫グロブリンの定常領域によって活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感受性は、刺激性および阻害性シグナルの合計に応じて変わる。ＮＫＧ２Ｄは、本質的にすべてのナチュラルキラー細胞によって発現されるＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＮＫＧ２Ｄは、活性化受容体として働く。ＮＫＧ２Ｄはまた、Ｔ細胞上でも見出され、この場合は、共刺激性受容体として作用する。ＮＫＧ２Ｄを介してＮＫ細胞機能をモジュレートする能力は、悪性腫瘍を含む種々の治療状況において有用である。
ＦＬＫ２、ＳＴＫ１またはＣＤ１３５とも呼ばれるＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）は、クラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼである。ＦＬＴ３は、細胞外領域中に複数の免疫グロブリン様ドメインを含む膜貫通タンパク質である。ＦＬＴ３は、ＦＬＴ３ホモ二量体化および自己リン酸化を誘導するＦＬＴ３ＬＧの結合によって活性化できる。活性化されたＦＬＴ３は、その後、複数の細胞質エフェクター分子、例えば、Ａｋｔ、ＥｒｋおよびｍＴＯＲをリン酸化し、活性化し、それによって、細胞増殖を促進し、アポトーシスを低減する。ＦＬＴ３の構成的活性化をもたらす突然変異が、急性骨髄性白血病および急性リンパ性白血病において観察されている。
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体ならびに腫瘍関連抗原ＦＬＴ３に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、２種以上のＮＫ活性化受容体に関与することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断する可能性がある。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトにおいてＮＫ細胞を刺激できる。一部の実施形態では、タンパク質は、ヒトならびにげっ歯類およびカニクイザルなどの他の種においてＮＫ細胞を刺激できる。本明細書において記載されるタンパク質のうちいずれか１つを含有する製剤、タンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含有する細胞およびタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法も提供される。
したがって、本発明の一態様は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位、
（ｂ）ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位、および
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位
を含むタンパク質を提供し、
ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、
（ｉ）それぞれ配列番号１１、４および５５のアミノ酸配列を含む、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ならびにそれぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｉｉ）それぞれ配列番号５９、６３および５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号８６、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号８７、８８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号９１、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
（ｉｖ）それぞれ配列番号９７、９９および１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１０１、１０２および１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
（ｖ）それぞれ配列番号８７、９８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１０６、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
（ｖｉ）それぞれ配列番号１０９、１１０および１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１１２、１１３および１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号１１７、１１８および１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１２０、１２１および１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号８７、９８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１０６、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
（ｉｘ）それぞれ配列番号６２、３３および１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１２８、１２９および１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、または
（ｘ）それぞれ配列番号１３２、１３３および１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号６５、６６および４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む。
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号１１、４および５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号１１、４および５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列３７を含み、ＶＬは、配列番号３８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号９および１０、１３および１０、１７および１０、９および２２、９および２６、９および３０、９および３４、３７および３８、４１および４２、４５および４２または４９および４２のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）として存在し、ｓｃＦｖは、配列番号３、１２、１５、１６、１９、２０、２３、２４、２７、２８、３１、３２、３５、３６、３９、４０、４３、４４、４７、４８、５１および５２から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号５９、６３および５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号８６、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号７８、６３、７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号８０、６６、６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号６２、６３、６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号６５、６６、６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号７６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、それぞれ配列番号６８および６９、７２および７３または７６および７７のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号７０、７１、７４、７５、８１および８２から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号８７、８８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号９１、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号９７、９９および１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１０１、１０２および１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号８７、９８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１０６、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号１０９、１１０および１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１１２、１１３および１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号１１７、１１８および１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１２０、１２１および１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号８７、９８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１０６、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号６２、３３および１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１２８、１２９および１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、それぞれ配列番号１３２、１３３および１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号６５、６６および４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される２０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でヒトＦＬＴ３に結合する。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＳＰＲによって測定される１０ｎＭ以下のＫＤでヒトＦＬＴ３に結合する。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、カニクイザルＦＬＴ３に結合する。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＦＬＴ３への結合についてＦＬＴ３Ｌと競合しない。
ある特定の実施形態では、タンパク質は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインまたはその一部分を含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、Ｆａｂ断片であり、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、Ｆａｂ断片である。
ある特定の実施形態では、タンパク質は、ＦＬＴ３に結合する追加の抗原結合部位をさらに含む。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、ＦＬＴ３に結合する第２のおよび追加の抗原結合部位は、各々Ｆａｂ断片である。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、ＦＬＴ３に結合する第２のおよび追加の抗原結合部位は、各々ｓｃＦｖである。
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合するｓｃＦｖおよび／またはＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその一部分に連結される。ある特定の実施形態では、ヒンジは、アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する。ある特定の実施形態では、ジスルフィド架橋は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームの下で番号付けられた、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ１００の間に形成される。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、可動性リンカーを介してｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインに連結される。ある特定の実施形態では、可動性リンカーは、（Ｇ４Ｓ）４を含む。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインが軽鎖可変ドメインのＣ末端に配置される。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインが、軽鎖可変ドメインのＮ末端に配置される。
ある特定の実施形態では、Ｆａｂは、抗原結合部位とＦｃまたはその一部分との間に配置されない。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２７０または２７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、
（ｉ）それぞれ配列番号２４０もしくは２４１、２４２および２５５もしくは２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、または
（ｉｉ）それぞれ配列番号２４０もしくは２４１、２４２および２４３もしくは２４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む。
ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位のＶＨは、配列番号２５４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部位のＶＬは、配列番号２３９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位のＶＨは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部位のＶＬは、配列番号２３９のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインである。ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインまたはその一部分は、配列番号１３６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１つまたは複数の位置に、配列番号１３６に対する１つまたは複数の突然変異を含む。ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅから選択される、配列番号１３６に対する１つまたは複数の突然変異を含む。ある特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域の一方のポリペプチド鎖は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１つまたは複数の位置に、配列番号１３６に対する１つまたは複数の突然変異を含み、抗体重鎖定常領域の他方のポリペプチド鎖は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、およびＫ４３９から選択される１つまたは複数の位置に、配列番号１３６に対する１つまたは複数の突然変異を含む。ある特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域の一方のポリペプチド鎖は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、配列番号１３６に対するＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含み、抗体重鎖定常領域の他方のポリペプチド鎖は、配列番号１３６に対するＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含む。ある特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域の一方のポリペプチド鎖は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、配列番号１３６に対するＹ３４９Ｃ置換を含み、抗体重鎖定常領域の他方のポリペプチド鎖は、配列番号１３６に対するＳ３５４Ｃ置換を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書において開示されるタンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書において開示されるタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍細胞およびナチュラルキラー細胞を、本明細書において開示されるタンパク質または医薬組成物の有効量に曝露することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、がんを処置する方法であって、本明細書において開示されるタンパク質または医薬組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、がんは、血液悪性腫瘍である。ある特定の実施形態では、血液悪性腫瘍は、白血病である。ある特定の実施形態では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成、急性Ｔリンパ性白血病および急性前骨髄球性白血病からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、がんは、ＦＬＴ３を発現する。
本発明の種々の態様および実施形態を、以下にさらに詳細に記載する。
図１は、ヘテロ二量体、多重特異性抗体、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）を表すものである。各アームは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたはＦＬＴ３に対応する結合ドメインのいずれかを表すことができる。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよびＦＬＴ３結合ドメインは、共通の軽鎖を共有し得る。
図２Ａ～２Ｅは、多重特異性結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の５つの例示的形式を例示する。図２Ａに示されるように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたはＦＬＴ３結合ドメインのいずれかは、ｓｃＦｖ形式（左のアーム）をとることができる。ＮＫＧ２Ｄ標的化ｓｃＦｖ、ＦＬＴ３標的化Ｆａｂ断片およびヘテロ二量体化抗体定常領域を含有する抗体は、本明細書においてＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。ＦＬＴ３標的化ｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄ標的化Ｆａｂ断片およびＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメインを含有する抗体は、本明細書においてＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる（図２Ｅ）。図２Ｂに示されるように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよびＦＬＴ３結合ドメインは両方ともｓｃＦｖ形式をとることができる。図２Ｃ～２Ｄは、ＦＬＴ３に結合する２つの抗原結合部位およびヘテロ二量体化抗体定常領域に融合されたＮＫＧ２Ｄ結合部位を含む３つの抗原結合部位を有する抗体の例示である。これらの抗体形式は、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴと本明細書において呼ばれる。図２Ｃは、２つのＦＬＴ３結合部位が、Ｆａｂ断片形式にあり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖ形式にあることを例示する。図２Ｄは、ＦＬＴ３結合部位がｓｃＦｖ形式にあり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖ形式にあることを例示する。図２Ｅは、腫瘍標的化ｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄ標的化Ｆａｂ断片およびＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメイン（「ＣＤドメイン」）を含有する三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を表す。抗体形式は、Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと本明細書において呼ばれる。ある特定の例示的多重特異性結合タンパク質では、抗体定常領域上のヘテロ二量体化突然変異は、１つの定常ドメイン上のＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗならびに対向する定常ドメイン上のＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ（ＣＤドメイン中の三角形の鍵と鍵穴の形状として示される）を含む。Ｆａｂ断片の重鎖および軽鎖可変ドメインの間の太字のバーは、ジスルフィド結合を表す。 同上。 同上。 同上。 同上。
図３は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体である、Ｔｒｉｏｍａｂ型のＴｒｉＮＫＥＴを表すものである。このキメラは、２種の親抗体に起因する、各々が１つの軽鎖および１つの重鎖を有する２つの半抗体からなる。Ｔｒｉｏｍａｂ型は、ラット抗体の１／２およびマウス抗体の１／２を含有するヘテロ二量体コンストラクトであり得る。
図４は、ノブ－イントゥ－ホール（ＫＩＨ）技術を含むＫｉＨ共通軽鎖型のＴｒｉＮＫＥＴを表すものである。ＫｉＨは、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片およびヘテロ二量体化突然変異によって安定化されるＦｃを含有するヘテロ二量体である。ＫｉＨ形式のＴｒｉＮＫＥＴは、標的１および標的２に結合する２つのＦａｂ断片を有するヘテロ二量体コンストラクトである場合があり、２つの異なる重鎖および両重鎖と対形成する共通軽鎖を含有する。
図５は、可動性の天然に存在するリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせて、四価ＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））型のＴｒｉＮＫＥＴを表すものである。ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）は、抗原２を標的化する可変ドメインが、抗原１を標的化するＦａｂ断片の可変ドメインのＮ末端に融合されているホモ二量体コンストラクトである。ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）型は、正常なＦｃを含有する。
図６は、Ｆｃに融合された、標的１および標的２に結合する２つのＦａｂ断片を含有する、ヘテロ二量体コンストラクトである、直交性Ｆａｂ断片インターフェース（Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ）型のＴｒｉＮＫＥＴを表すものである。軽鎖（ＬＣ）－重鎖（ＨＣ）対形成は、直交性インターフェースによって確実にされる。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ中の突然変異によって確実にされる。
図７は、２－イン－１のＩｇ形式のＴｒｉＮＫＥＴを表すものである。
図８は、Ｆｃに融合された、標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体コンストラクトである、ＥＳ型のＴｒｉＮＫＥＴを表すものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ中の静電ステアリング突然変異によって確実にされる。
図９は、Ｆａｂアーム交換型：重鎖および付着している軽鎖（半分の分子）を、別の分子に由来する重鎖－軽鎖対と取り換えることによってＦａｂ断片アームを交換して、二重特異性抗体をもたらす抗体のＴｒｉＮＫＥＴを表すものである。Ｆａｂアーム交換型（ｃＦａｅ）は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。
図１０は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されるＦｃを含有するヘテロ二量体である、ＳＥＥＤボディ型のＴｒｉＮＫＥＴを表すものである。
図１１は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーが使用される、ＬｕＺ－Ｙ型のＴｒｉＮＫＥＴを表すものである。ＬｕＺ－Ｙ型は、Ｆｃに融合された、標的１および２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合されたロイシンジッパーモチーフによって確実にされる。
図１２は、Ｃｏｖ－Ｘ－ボディ型のＴｒｉＮＫＥＴを表すものである。
図１３Ａ～１３Ｂは、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃに融合された２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体コンストラクトである、κλ－ボディ型のＴｒｉＮＫＥＴを表すものである：抗原１を標的化する１つのＦａｂ断片はカッパＬＣを含有し、抗原２を標的化する第２のＦａｂ断片は、ラムダＬＣを含有する。図１３Ａは、κλ－ボディの１つの型の例示的表現であり、図１３Ｂは、別のκλ－ボディの例示的表現である。 同上。
図１４は、標的１に結合するＦａｂ断片および標的２に結合するｓｃＦａｂを含み、それらの両方ともＦｃドメインに融合されている、Ｏａｓｃ－Ｆａｂヘテロ二量体コンストラクトである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメイン中の突然変異によって確実にされる。
図１５は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されるＦｃを含有するヘテロ二量体コンストラクトである、ＤｕｅｔＭａｂである。Ｆａｂ断片１および２は、正しい軽鎖および重鎖対形成を確実にする差次的Ｓ－Ｓ架橋を含有する。
図１６は、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを有するヘテロ二量体コンストラクトである、ＣｒｏｓｓｍＡｂである。ＣＬおよびＣＨ１ドメインならびにＶＨおよびＶＬドメインは、取り換えられる、例えば、ＣＨ１は、ＶＬと直列に融合され、ＣＬは、ＶＨと直列に融合される。
図１７は、抗原２に結合するＦａｂ断片が、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端に融合されている、ホモ二量体コンストラクトである、Ｆｉｔ－Ｉｇである。コンストラクトは、野生型Ｆｃを含有する。
図１８は、ｈＦＬＴ３に結合するマウスハイブリドーマ上清から収集された抗体のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンソグラムである。
図１９は、ｈＦＬＴ３に結合するマウスｍＡｂサブクローンから収集された抗体のＳＰＲプロファイルを示す一連のセンソグラムである。
図２０は、可溶性ＦＬＴ３－リガンドの濃度を飽和することによる、ＦＬＴ３を発現するＥＯＬ－１がん細胞に結合する候補抗体の能力の低減を表す棒グラフである。
図２１Ａ～２１Ｃは、ＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴ Ｆ３’－１１５８およびその親モノクローナル抗体の、ＦＬＴ３を発現する細胞株ＲＭＡ－ｈＦＬＴ３（図２１Ａ）、ＲＭＡ－ｃＦＬＴ３（図２１Ｂ）およびＲＥＨ（図２１Ｃ）への結合を示す線グラフである。 同上。 同上。
図２２Ａ～２２Ｂは、ＦＬＴ３によって標的化されるＴｒｉＮＫＥＴ Ｆ３’－１１５８およびその親モノクローナル抗体の、Ｔ２２７Ｍ突然変異（図２２Ａ）を有するＦＬＴ３を発現したＭＯＬＭ－１３細胞への、およびＩＴＤ突然変異を有するＦＬＴ２を発現したＭＶ４－１１細胞への結合を示す線グラフである。 同上。
図２３Ａ～２３Ｂは、ＦＬＴ３によって標的化されるＴｒｉＮＫＥＴ Ｆ３’－１１５８およびその親モノクローナル抗体の、ＦＬＴ３を発現する細胞株ＲＥＨ（図２３Ａ）およびＥＯＬ－１（図２３Ｂ）への内部移行を示す線グラフである。 同上。
図２４Ａ～２４Ｄは、ＴｒｉＮＫＥＴ Ｆ３’－１１５８およびその親モノクローナル抗体の存在下での、ＦＬＴ３を発現するがん細胞株ＥＯＬ－１（図２４Ａ）、ＲＥＨ（図２４Ｂ）、ＲＳ４－１１（図２４Ｃ）およびＭＶ４－１１（図２４Ｄ）のＮＫ細胞媒介性溶解を示す棒グラフである。 同上。 同上。 同上。
図２５は、ＴｒｉＮＫＥＴ Ｆ３’－１１５８、そのＮＫＧ２Ｄ－死滅変異体（「Ｆ３’－１１５８死滅－２Ｄ」）、そのＦｃ－サイレント変異体（「Ｆ３’－１１５８ｓｉ」）またはその親モノクローナル抗体１１５８ ｍＡｂの存在下での、ＦＬＴ３を発現するがん細胞株ＲＥＨのＮＫ細胞媒介性溶解を表す線グラフである。
図２６は、ＴｒｉＮＫＥＴ Ｆ３’－１１５８およびその親モノクローナル抗体の存在下での、ＦＬＴ３を発現する急性リンパ性白血病細胞株ＲＳ４－１１のＣＤ８ Ｔ細胞媒介性溶解を示す線グラフである。
図２７は、ＴｒｉＮＫＥＴ Ｆ３’－１１５８およびその親モノクローナル抗体の、血液細胞への結合を示す一連のヒストグラムである。
図２８Ａ～２８Ｂは、ＦＬＴ３－リガンドの不在下（図２８Ａ）または存在下（図２８Ｂ）での、ＴｒｉＮＫＥＴ Ｆ３’－１１５８およびその親モノクローナル抗体によるＦＬＴ３リン酸化を示す棒グラフである。図７ＡにおけるＦＬＴ３－リガンド試料は、陽性対照として働く。 同上。
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体ならびに腫瘍関連抗原ＦＬＴ３に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＦＬＴ３に結合する追加の抗原結合部位をさらに含む。本発明はまた、このような多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物ならびに自己免疫疾患およびがんを処置することなどを目的としてこのような多重特異性タンパク質および医薬組成物を使用する治療方法を提供する。本発明の種々の態様は、以下に節において示されるが、１つの特定の節に記載される本発明の態様は、任意の特定の節に限定されない。
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。
「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」という用語は、本明細書で使用される場合、「１つまたは複数の」を意味し、文脈が不適当でない限り複数を含む。
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を指す。ヒト抗体では、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様なストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られるより保存された隣接するストレッチの間に挿入されている「超可変領域」と呼ばれる。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリン中の超可変領域の間に、隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合面を形成するように３次元空間中に互いに対して配置される。抗原結合面は、結合している抗原の３次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ラクダおよび軟骨魚類などのある特定の動物では、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、無傷の抗体中に、抗原結合面を保持する抗体の抗原結合性断片中に、または単一ポリペプチド中でペプチドリンカーを使用して重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに接続するｓｃＦｖなどの組換えポリペプチド中に存在し得る。
「腫瘍関連抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、それだけには限らないが、がんと関連する、タンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含む任意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞上に、または腫瘍微小環境中に、例えば、腫瘍関連血管上、細胞外マトリックス、間葉系間質または免疫浸潤物に発現され得る。
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書において記載される方法および組成物によって処置されるべき生物を指す。このような生物には、好ましくは、それだけには限らないが、哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれ、より好ましくは、ヒトが含まれる。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投与量で投与でき、特定の製剤または投与経路に限定されるものではない。本明細書で使用される場合、「処置すること」という用語は、任意の効果、例えば、状態、疾患、障害などの改善をもたらすこと、減少させること、低減すること、モジュレートすること、寛解することもしくは排除すること、またはその症状を寛解することを含む。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性薬剤の、組成物をインビボまたはエキソビボでの診断的または治療的使用に特に適したものにする不活性または活性の担体との組合せを指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、標準医薬品担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョンなど）のいずれかおよび種々の種類の湿潤剤を指す。組成物はまた、安定剤および保存料を含み得る。担体、安定剤およびアジュバントの例については、例えば、Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象へ投与すると、本発明の化合物またはその活性代謝物もしくは残渣を提供可能である、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者には公知であろうが、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機酸および塩基から導くことができる。例示的酸として、それだけには限らないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。シュウ酸などの他の酸も、それ自身は薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびその薬学的に許容される酸付加塩を得る中間体として有用である塩の調製において使用できる。
例示的塩基として、それだけには限らないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニアおよび式ＮＷ４＋（式中、Ｗは、Ｃ１－４アルキルである）の化合物などが挙げられる。
例示的塩として、それだけには限らないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩（ｆｌｕｃｏｈｅｐｔａｎｏａｔｅ）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモエート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレート、ウンデカン酸塩などが挙げられる。塩の他の例として、適したカチオン、例えば、Ｎａ＋、ＮＨ４＋およびＮＷ４＋（式中、Ｗは、Ｃ１－４アルキル基である）と化合された本発明の化合物のアニオンなどが挙げられる。
治療的使用のために、本発明の化合物の塩が薬学的に許容されると考えられる。しかし、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において使用できる。
本明細書で使用される場合、「ＦＬＴ３」（ＦＬＫ２、ＳＴＫ１またはＣＤ１３５としても知られる）とは、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ３６８８８のタンパク質および関連アイソフォームを指す。
本明細書で使用される場合、「ＦＬＴ３Ｌ」（ＦＬＴ３－リガンドとしても知られる）とは、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ４９７７１のタンパク質および関連アイソフォームを指す。
説明を通じて、組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載される場合には、またはプロセスおよび方法が、特定の工程を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載される場合には、さらに、列挙された成分から本質的になる、またはからなる本発明の組成物があるということ、ならびに列挙された処理工程から本質的になる、またはからなる本発明によるプロセスおよび方法があるということが考えられる。
一般的な問題として、特に断りのない限り、パーセンテージを指定する組成物は重量によるものである。さらに、変数が定義を伴わない場合には、変数のこれまでの定義が支配する。
Ｉ．タンパク質
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体ならびに腫瘍関連抗原ＦＬＴ３に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書において記載される医薬組成物および治療的方法において有用である。多重特異性結合タンパク質の、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体への結合は、ＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞の破壊に向けたナチュラルキラー細胞の活性を増強する。多重特異性結合タンパク質の、ＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞への結合は、これらの細胞をナチュラルキラー細胞と近接させ、これがナチュラルキラー細胞による腫瘍細胞の直接的および間接的破壊を促進する。ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６および別の標的に結合する多重特異性結合タンパク質が、参照により本明細書に組み込まれない国際出願公開番号ＷＯ２０１８１４８４４５およびＷＯ２０１９１５７３６６に開示されている。いくつかの例示的多重特異性結合タンパク質のさらなる説明を以下に提供する。
多重特異性結合タンパク質の第１の成分は、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合する抗原結合部位であり、これとして、それだけには限らないが、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８＋αβＴ細胞を挙げることができる。ＮＫＧ２Ｄ結合の際、多重特異性結合タンパク質は、ＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡなどの天然リガンドが、ＮＫＧ２Ｄへ結合して、ＮＫ細胞を活性化するのをブロックし得る。
多重特異性結合タンパク質の第２の成分は、ＦＬＴ３に結合する抗原結合部位である。ＦＬＴ３発現細胞は、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）において見出される場合がある。ＦＬＴ３発現細胞は、他のがんおよび腫瘍の種類、例えば、血液悪性腫瘍、白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成、急性Ｔリンパ性白血病および急性前骨髄球性白血病と関連して見出される場合がある。
多重特異性結合タンパク質の第３の成分は、ＣＤ１６を発現する細胞に結合する抗体Ｆｃドメインまたはその一部分または抗原結合部位、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞および濾胞性樹状細胞を含む白血球の表面上のＦｃ受容体である。
多重特異性結合タンパク質の追加の抗原結合部位は、ＦＬＴ３に結合し得る。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、第２のおよび追加の抗原結合部位は、ＦＬＴ３に結合し、それらは各々Ｆａｂ断片である。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、第２のおよび追加の抗原結合部位は、ＦＬＴ３に結合し、それらは各々ｓｃＦｖである。
抗原結合部位は各々、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインを組み込むことができる（例えば、抗体中のように配置されて、またはｓｃＦｖを形成するように一緒に融合されて）、または抗原結合部位のうち１つもしくは数は、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ類抗体のようなＶＨＨ抗体もしくは軟骨魚類において見出されるもののようなＶＮＡＲ抗体であり得る。
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位中に存在する軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。
本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、種々の形式をとり得る。例えば、ある形式は、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体の多重特異性抗体である（図１）。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン、第１の重鎖可変ドメインおよび適宜、第１のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の軽鎖可変ドメインおよび適宜、第１の軽鎖定常ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒に、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメインおよび適宜、第２のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の軽鎖可変ドメインおよび適宜、第２の軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と一緒に、ＦＬＴ３に結合する抗原結合部位を形成する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒に、ＣＤ１６に結合可能である（図１）。一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン軽鎖と同一である。
別の例示的形式は、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体の多重特異性抗体を含む（図２Ａ）。第１の免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、対形成し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＦＬＴ３に結合する、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成される一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合された第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメインおよびＣＨ１重鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対形成し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＦＬＴ３に結合する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒に、ＣＤ１６に結合可能である（図２Ａ）。
別の例示的形式は、第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖を含むヘテロ二量体の多重特異性抗体を含む（図２Ｂ）。第１の免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、対形成し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＦＬＴ３に結合する、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成される一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合された第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、対形成し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＦＬＴ３に結合する、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成される一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合された第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインを含む（図２Ｂ）。
一部の実施形態では、上記の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、ヒンジ配列を介して抗体定常ドメインに連結される。一部の実施形態では、ヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含む。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖと、抗体重鎖定常ドメインを接続するヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－Ｓｅｒを含む。一部の実施形態では、ＦＬＴ３に結合するｓｃＦｖと、抗体重鎖定常ドメインを接続するヒンジは、アミノ酸Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含む。一部の他の実施形態では、ヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－ＳｅｒおよびＴｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙを含む。ヒンジ配列は、標的抗原への結合の可動性および可動性と最適な幾何学の間のバランスを提供し得る。
一部の実施形態では、上記の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成して、ｓｃＦｖの安定性を増強する。例えば、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４残基と、軽鎖可変ドメインのＣ１００残基の間に形成される場合があり、アミノ酸配置はＫａｂａｔの下で番号付けられている。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、可動性リンカーを介して軽鎖可変ドメインに連結される。任意の適したリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）４リンカーを使用できる。ｓｃＦｖの一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＮ末端に配置される。ｓｃＦｖの一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＣ末端に配置される。
本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、１つまたは複数の追加の抗原結合部位をさらに含み得る。追加の抗原結合部位（複数可）を、適宜、リンカー配列を介して定常領域ＣＨ２ドメインのＮ末端に、または定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合できる。ある特定の実施形態では、追加の抗原結合部位（複数可）は、ジスルフィド安定化されて、四価または三価多重特異性結合タンパク質をもたらしてもよい一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）の型をとる。例えば、多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位、ＦＬＴ３に結合する追加の抗原結合部位およびＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域またはその一部分またはＣＤ１６に結合する第４の抗原結合部位を含む。これらの抗原結合部位のうちいずれか１つは、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ、例えば、上記のｓｃＦｖの型をとり得る。
一部の実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位に由来するＦＬＴ３の異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位と同一エピトープに結合する。一部の実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位と同一の重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位と同一の重鎖および軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、追加の抗原結合部位は、第２の抗原結合部位と同一のアミノ酸配列（複数可）を有する。例示的形式は、図２Ｃおよび２Ｄに示されている。したがって、多重特異性結合タンパク質は、ＦＬＴ３の二価会合を提供し得る。多重特異性タンパク質によるＦＬＴ３の二価会合は、腫瘍細胞表面上のＦＬＴ３を安定化でき、腫瘍細胞に向けたＮＫ細胞の細胞傷害性を増強できる。多重特異性タンパク質によるＦＬＴ３の二価会合は、多重特異性タンパク質の腫瘍細胞へのより強力な結合を与え、それによって、腫瘍細胞に向けた、特に、低レベルのＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞へ向けたＮＫ細胞のより強力な細胞傷害性応答を促進できる。
多重特異性結合タンパク質は、追加の形式をとることができる。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体である、Ｔｒｉｏｍａｂ型である。このキメラは、２種の親抗体に起因する、各々が１つの軽鎖および１つの重鎖を有する２つの半抗体からなる。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ノブ－イントゥ－ホール（ＫｉＨ）技術を含むＫｉＨ型である。ＫｉＨは、ＣＨ３ドメインを操作して、各重鎖中に「ノブ」または「ホール」のいずれかを作出して、ヘテロ二量体化を促進することを含む。「ノブ－イントゥ－ホール（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の背後の概念は、小さい残基の嵩高いものでの置換（例えば、ＥＵ番号付けでのＴ３６６ＷＣＨ３Ａ）によって、「ノブ」を一方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）中に導入することであった。「ノブ」を収容するために、ノブに最も近い隣接する残基を、より小さいものと置き換えること（例えば、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶＣＨ３Ｂ）によって、他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）上に相補的な「ホール」表面を作出した。「ホール」突然変異は、構造化ガイドファージライブラリースクリーニングによって最適化した(Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library, J. Mol. Biol. (1997)270(1):26-35)。ＫｉＨ Ｆｃ変異体のＸ線結晶構造(Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, et al., Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobicinteraction. J. Mol. Biol. (2014) 426(9):1947-57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcγRs. Mol. Immunol. (2014) 58(1):132-8)によって、ヘテロ二量体化は、ＣＨ３ドメイン間コアインターフェースでの立体的相補性によって駆動される疎水性相互作用によって熱力学的に支持されるが、ノブ－ノブおよびホール－ホールインターフェースは、それぞれ、立体障害および好都合な相互作用の破壊のためにホモ二量体化を支持しないということが実証された。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、可動性の天然に存在するリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせて、四価ＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））型である。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、直交性Ｆａｂインターフェース（Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ）型である。ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ ＩｇＧアプローチ(Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al., Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32(2):191-8)では、構造ベースの領域設計によって、一方のＦａｂ断片のみにおいてＬＣおよびＨＣＶＨ－ＣＨ１インターフェースで相補的突然変異が導入され、他方のＦａｂ断片には変化は全く行われない。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２－イン－１のＩｇ形式である。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合された、標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体コンストラクトである、ＥＳ型である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ中の静電ステアリング突然変異によって確実にされる。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃに融合された２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体コンストラクトである、κλ－ボディ型である：抗原１を標的化する１つのＦａｂ断片はカッパＬＣを含有し、抗原２を標的化する第２のＦａｂ断片は、ラムダＬＣを含有する。図１３Ａは、κλ－ボディの１つの型の例示的表現であり、図１３Ｂは、別のκλ－ボディの例示的表現である。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆａｂアーム交換型（重鎖および付着している軽鎖（半分の分子）を、別の分子に由来する重鎖－軽鎖対と取り換えることによってＦａｂ断片アームを交換して、二重特異性抗体をもたらす抗体）である。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＳＥＥＤボディ型である。鎖交換操作されたドメイン（ＳＥＥＤ）プラットフォームを、非対称の二重特異性抗体様分子、天然抗体の治療適用を拡大する能力を生成するように設計した。このタンパク質工学プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメイン内の免疫グロブリンの構造的に関連する配列を交換することに基づいている。ＳＥＥＤ設計によって、ＡＧおよびＧＡ ＳＥＥＤ ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を支持しない、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効率的な生成が可能となる(Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54))。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーが使用される、ＬｕＺ－Ｙ型である(Wranik, BJ. et al., J. Biol. Chem. (2012), 287:43331-9)。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｃｏｖ－Ｘ－ボディ型である。二重特異性ＣｏｖＸ－ボディでは、２つの異なるペプチドが、分岐アゼチジノンリンカーを使用して一緒に繋げられ、穏やかな条件下で、部位特異的に足場抗体に融合される。ファルマコフォアは、機能的活性に関与するが、抗体足場は、長い半減期およびＩｇ様分布を与える。ファルマコフォアは、最適化されたまたは独特の二重特異性抗体を生成するように、化学的に最適化できる、または他のファルマコフォアと置き換えることができる(Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52);22611-22616)。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合された、標的１に結合するＦａｂ断片および標的２に結合するｓｃＦａｂを含む、Ｏａｓｃ－Ｆａｂヘテロ二量体型である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ中の突然変異によって確実にされる。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されるＦｃを含有するヘテロ二量体コンストラクトである、ＤｕｅｔＭａｂ型である。Ｆａｂ断片１および２は、正しいＬＣおよびＨＣ対形成を確実にする差次的Ｓ－Ｓ架橋を含有する。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、二量体化によって安定化されたＦｃに融合された、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体コンストラクトである、ＣｒｏｓｓｍＡｂ型である。ＣＬおよびＣＨ１ドメインならびにＶＨおよびＶＬドメインは、取り換えられ、例えば、ＣＨ１は、ＶＬとインフレームで融合され、ＣＬは、ＶＨとインフレームで融合される。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂ断片が、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端に融合されている、ホモ二量体コンストラクトである、Ｆｉｔ－Ｉｇ型である。コンストラクトは、野生型Ｆｃを含有する。
多重特異性結合タンパク質の個々の成分は、以下により詳細に記載されている。
ＮＫＧ２Ｄ－結合部位
ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体ならびにがん細胞上の腫瘍関連抗原に結合すると、多重特異性結合タンパク質は、２種類以上のＮＫ活性化受容体と会合でき、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断する場合がある。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトにおいてＮＫ細胞を刺激できる。一部の実施形態では、タンパク質は、ヒトにおいて、ならびにげっ歯類およびカニクイザルなどの他の種においてＮＫ細胞を刺激できる。
表１には、組み合わせて、ＮＫＧ２Ｄに結合できる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列が列挙されている。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、Ｆａｂ形式で配置される。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、一緒に融合されて、ｓｃＦｖを形成する。
表１に列挙されるＮＫＧ２Ｄ結合部位は、ＮＫＧ２Ｄへのその結合親和性が変わり得るが、それにもかかわらず、それらはすべてヒトＮＫ細胞を活性化する。
別に示されない限り、表１に提供されるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔの下で決定されている。
Figure 2022551969000002
Figure 2022551969000003
Figure 2022551969000004
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Figure 2022551969000012
Figure 2022551969000013
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ（例えば、ヒトＮＫＧ２Ｄ）に結合する第１の抗原結合部位は、表１に開示される抗体のＶＨに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および表１に開示される同一抗体のＶＨに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、表１に開示される抗体のＶＨおよびＶＬ配列の、Ｋａｂａｔ（Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, Bethesdaを参照されたい）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Chothia C & Lesk A M, (1987), J Mol Biol 196: 901-917を参照されたい）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（MacCallum R M et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745を参照されたい）または当技術分野で公知の任意の他のＣＤＲ決定法の下で決定された、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、表１に開示される抗体の、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１３８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を有すること、ならびに／または配列番号１３８のＣＤＲ１（配列番号１４０）、ＣＤＲ２（配列番号１４１）およびＣＤＲ３（配列番号１４２）配列に対して同一のアミノ酸配列を組み込むことなどによって、配列番号１３８と関連する重鎖可変ドメインを含む。配列番号１３８と関連する重鎖可変ドメインは、種々の軽鎖可変ドメインとカップリングして、ＮＫＧ２Ｄ結合部位を形成できる。例えば、配列番号１３８と関連する重鎖可変ドメインを組み込んでいる第１の抗原結合部位は、配列番号１３９、１４４、１４６、１４８、１５０、１５４、１５６、１５８、１６０、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９および１８１と関連する配列のうちいずれか１つから選択される軽鎖可変ドメインをさらに組み込むことができる。例えば、第１の抗原結合部位は、配列番号１３８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインならびに配列番号１３９、１４４、１４６、１４８、１５０、１５４、１５６、１５８、１６０、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９および１８１から選択される配列のうちいずれか１つに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１８２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号１８３に対して少なくとも９０％、（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１８４または１８５、１８６および１８９または１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１８７、１８８および１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１８４または１８５、１８６および１８９または１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号１８７、１８８および１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号１９２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号１６１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１９３または１９４、１９５および１９６または１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１９８、１９９および２００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１９３または１９４、１９５および１９６または１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号１９８、１９９および２００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２０１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２０２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２０３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２０４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１８４、２０５および２０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２０７、１８８および２０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１８４、２０５および２０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号２０７、１８８および２０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２０９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２１０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２１１または２１２、２１３および２１４または２１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２１６、２１７および２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２１１または２１２、２１３および２１４または２１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号２１６、２１７および２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２２０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２２１または２２２、２２３および２２４または２２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２２６、２１７および２２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２２１または２２２、２２３および２２４または２２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号２２６、２１７および２２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２４８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２１１または２１２、２４９および２５０または２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２５２、１９９および２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）配列番号２１１または２１２、２４９および２５０または２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号２５２、１９９および２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２２８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２２９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２３０または２３１、２３２および２３３または２３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２３５、２３６および２３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２３０または２３１、２３２および２３３または２３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号２３５、２３６および２３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２３９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２４３または２４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２４３または２４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２５４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２３９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２５５または２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）配列番号２４０または２４１、２４２および２５５または２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２５７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２３９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２５８または２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２５８または２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２６０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２３９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２６１または２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２６１または２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２６３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２３９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２６４または２６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２６４または２６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２６６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２３９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２６７または２６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２６７または２６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２６９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２３９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２７０または２７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２７０または２７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２７２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２７３に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号２７４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２７５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
多重特異性結合タンパク質は、それだけには限らないが、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８αβＴ細胞を含むＮＫＧ２Ｄ発現細胞に結合できる。ＮＫＧ２Ｄ結合の際、多重特異性結合タンパク質は、天然リガンド、例えば、ＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡが、ＮＫＧ２Ｄに結合し、ＮＫ細胞を活性化するのを遮断する場合がある。
多重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１６を発現する細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞および濾胞性樹状細胞を含む白血球の表面上のＦｃ受容体に結合する。本開示のタンパク質は、２ｎＭ～１２０ｎＭ、例えば、２ｎＭ～１１０ｎＭ、２ｎＭ～１００ｎＭ、２ｎＭ～９０ｎＭ、２ｎＭ～８０ｎＭ、２ｎＭ～７０ｎＭ、２ｎＭ～６０ｎＭ、２ｎＭ～５０ｎＭ、２ｎＭ～４０ｎＭ、２ｎＭ～３０ｎＭ、２ｎＭ～２０ｎＭ、２ｎＭ～１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１３ｎＭ、約１２ｎＭ、約１１ｎＭ、約１０ｎＭ、約９ｎＭ、約８ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４．５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～３ｎＭ、約３ｎＭ～４ｎＭ、約４ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約６ｎＭ、約６ｎＭ～約７ｎＭ、約７ｎＭ～約８ｎＭ、約８ｎＭ～約９ｎＭ、約９ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約２ｎＭ～約１０ｎＭ、約３ｎＭ～約１０ｎＭ、約４ｎＭ～約１０ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約６ｎＭ～約１０ｎＭ、約７ｎＭ～約１０ｎＭまたは約８ｎＭ～約１０ｎＭの間のＫＤの親和性でＮＫＧ２Ｄに結合する。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ－結合部位は、１０～６２ｎＭのＫＤでＮＫＧ２Ｄに結合する。
ＦＬＴ３－結合性部位
本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質のＦＬＴ３－結合性部位は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。表２には、組み合わせて、ＦＬＴ３に結合できる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのいくつかの例示的配列が列挙されている。ＣＤＲ配列は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けの下で同定されている。
Figure 2022551969000014
Figure 2022551969000015
Figure 2022551969000016
Figure 2022551969000017
Figure 2022551969000018
Figure 2022551969000019
Figure 2022551969000020
Figure 2022551969000021
Figure 2022551969000022
Figure 2022551969000023
Figure 2022551969000024
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あるいは、ＦＬＴ３に結合できる新規抗原結合部位は、配列番号１３５によって定義されるアミノ酸配列、その成熟細胞外断片またはＦＬＴ３のドメインを含有する断片（例えば、国際出願公開番号ＷＯ２０１８／２２０５８４を参照されたい）への結合についてのスクリーニングによって同定できる。

配列番号１３５（成熟ヒトＦＬＴ３細胞外ドメイン）
NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNIS
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位（例えば、ヒトＦＬＴ３）は、表２において開示される抗体のＶＨに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ならびに表２において開示される同一抗体のＶＨに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、表２に開示される抗体のＶＨおよびＶＬ配列の、Ｋａｂａｔ（Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, Bethesdaを参照されたい）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えば、Chothia C & Lesk A M, (1987), J Mol Biol 196: 901-917を参照されたい）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（MacCallum R M et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745を参照されたい）または当技術分野で公知の任意の他のＣＤＲ決定法の下で決定された、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、表２に開示される抗体の、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、１２Ｈ１０．Ｇ７に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＧＢ８７またはＧＢ９５に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号１０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号３または１２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＧＢ８８またはＧＢ９６に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号１０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１５または１６に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＧＢ８９またはＧＢ９７に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号１０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号１９または２０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＧＢ９０およびＧＢ９８に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号２３または２４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＧＢ９１およびＧＢ９９に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号２６に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号２７または２８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＧＢ９２またはＧＢ１００に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号３０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号３１または３２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＧＢ９３またはＧＢ１０１に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号３４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号３５または３６に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＧＢ９４またはＧＢ１０２に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号３７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号３８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号３９または４０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＧＢ１０２ Ｄ１０１Ｅに関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号４１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号４２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号４３または４４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＧＢ１０２ Ｍ３４Ｉに関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号４２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号４７または４８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＧＢ１０２ Ｍ３４Ｉ／Ｄ１０１Ｅに関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号４９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号４２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号５１または５２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ヒト化１２Ｈ１０．Ｇ７に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号４２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ヒト化１２Ｈ１０．Ｇ７に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号５６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号５７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ヒト化１２Ｈ１０．Ｇ７に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号４２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、４および５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、４および５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、１４Ａ５．Ｅ８に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号６０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号６１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号６２、６３および６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６５、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号６２、６３および６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６５、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｍＡｂ １５５１または１５５２に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号６９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号６２、６３および６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６５、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号６２、６３および６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６５、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号７０または７１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｍＡｂ １５５３または１５５４に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号７３に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号６２、６３および６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６５、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号６２、６３および６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６５、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号７４または７５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｍＡｂ １６８９に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号７６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号７７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号７８、６３および７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号８０、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号７８、６３および７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号８０、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖは、配列番号８１または８２に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ヒト化１４Ａ５．Ｅ８に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号８４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号５９、６３および５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号８６、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号５９、６３および５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号８６、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、１１Ｆ４．Ｂ９に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号９０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号８７、８８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号９１、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号８７、８８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号９１、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ヒト化１１Ｆ４．Ｂ９に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号９４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号８７、８８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号９１、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号８７、８８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号９１、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、４Ａ４．Ａ３に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号９５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号９６に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号９７、９９および１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１０１、１０２および１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号９７、９９および１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号１０１、１０２および１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、４Ａ４．Ｈ７に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１０４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号１０５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号８７、９８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１０６、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号８７、９８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号１０６、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、１５Ａ１１．Ｃ８に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１０７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号１０８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１０９、１１０および１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１１２、１１３および１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１０９、１１０および１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号１１２、１１３および１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、１２Ｃ９．Ｅ５に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列ならびに配列番号１１６に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１７、１１８および１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１２０、１２１および１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１７、１１８および１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号１２０、１２１および１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、１Ａ２．Ａ３に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号１２４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号８７、９８、８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１０６、９２、９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号８７、９８、８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号１０６、９２、９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、４Ｈ２．Ｅ３に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１２５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号１２６に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号６２、３３および１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１２８、１２９および１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号６２、３３および１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号１２８、１２９および１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、１４Ｈ８．Ｅ７に関する。例えば、ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、配列番号１３１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨならびに配列番号８３に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１３２、１３３および１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６５、６６および４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１３２、１３３および１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびに（ｂ）それぞれ配列番号６５、６６および４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
前述の実施形態の各々において、本明細書において、一緒にＦＬＴ３に結合するＶＨおよび／またはＶＬ配列は、ＦＬＴ３に結合するその能力に大幅に影響を及ぼすことなく、ＶＨおよび／またはＶＬのフレームワーク領域中にアミノ酸変更（例えば、少なくとも１、２、３、４、５または１０のアミノ酸置換、欠失または付加）を含有し得るということが企図される。
ある特定の実施形態では、本明細書において開示される第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって（例えば、以下の実施例１において記載される方法を使用して）もしくはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって測定される、１ｎＭ以下、５ｎＭ以下もしくは１０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下もしくは２０ｎＭ以下のＫＤ（すなわち、解離定数）でＦＬＴ３（例えば、ヒトＦＬＴ３）に結合する、ならびに／または対象の体液、組織および／もしくは細胞に由来するＦＬＴ３に結合する。ある特定の実施形態では、前述の単離抗体のいずれかは、ＳＰＲによって（例えば、以下の実施例１において記載される方法を使用して）またはＢＬＩによって測定される、１×１０－５、１×１０－４、１×１０－３、５×１０－３、０．０１、０．０２または０．０５１／ｓ以下のＫｄ（すなわち、解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）、Ｋｏｆｆとも呼ばれる）を有する。
ある特定の実施形態では、本明細書において開示される第２の抗原結合部位、例えば、上記で開示される１２Ｈ１０．Ｇ７、ＧＢ８７、ＧＢ８８、ＧＢ８９、ＧＢ９０、ＧＢ９１、ＧＢ９２、ＧＢ９３、ＧＢ９４、ＧＢ９５、ＧＢ９６、ＧＢ９７、ＧＢ９８、ＧＢ９９、ＧＢ１００、ＧＢ１０１、ＧＢ１０２、ＧＢ１０２ Ｍ３４Ｉ、ＧＢ１０２ Ｄ１０１Ｅ、ＧＢ１０２ Ｍ３４Ｉ／Ｄ１０１Ｅまたはヒト化１２Ｈ１０．Ｇ７と関連する抗原結合部位は、Ｔ２２７Ｍ突然変異を有するヒトＦＬＴ３変異体またはその細胞外領域に結合する。ｈＦＬＴ３－Ｔ２２７Ｍの細胞外領域のアミノ酸配列は、NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGMDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNIS（配列番号３１８）である。
ある特定の実施形態では、本明細書において開示される第２の抗原結合部位、例えば、上記で開示される１２Ｈ１０．Ｇ７、ＧＢ８７、ＧＢ８８、ＧＢ８９、ＧＢ９０、ＧＢ９１、ＧＢ９２、ＧＢ９３、ＧＢ９４、ＧＢ９５、ＧＢ９６、ＧＢ９７、ＧＢ９８、ＧＢ９９、ＧＢ１００、ＧＢ１０１、ＧＢ１０２、ＧＢ１０２ Ｍ３４Ｉ、ＧＢ１０２ Ｄ１０１Ｅ、ＧＢ１０２ Ｍ３４Ｉ／Ｄ１０１Ｅまたはヒト化１２Ｈ１０．Ｇ７と関連する抗原結合部位は、ＩＴＤ突然変異を有するヒトＦＬＴ３変異体またはその細胞外領域に結合する。ｈＦＬＴ３－ＩＴＤの細胞外領域のアミノ酸配列は、NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNIS（配列番号３１９）である。
ある特定の実施形態では、本明細書において開示される第２の抗原結合部位、例えば、上記で開示される１２Ｈ１０．Ｇ７、ＧＢ８７、ＧＢ８８、ＧＢ８９、ＧＢ９０、ＧＢ９１、ＧＢ９２、ＧＢ９３、ＧＢ９４、ＧＢ９５、ＧＢ９６、ＧＢ９７、ＧＢ９８、ＧＢ９９、ＧＢ１００、ＧＢ１０１、ＧＢ１０２、ＧＢ１０２ Ｍ３４Ｉ、ＧＢ１０２ Ｄ１０１Ｅ、ＧＢ１０２ Ｍ３４Ｉ／Ｄ１０１Ｅ、ヒト化１２Ｈ１０．Ｇ７、１４Ａ５．Ｅ８、１５５１、１５５２、１５５３、１５５４、１６８９、ヒト化１４Ａ５．Ｅ８、１１Ｆ４．Ｂ９、４Ａ４．Ａ３、４Ａ４．Ｈ７、１５Ａ１１．Ｃ８、１Ａ２．Ａ３、４Ｈ２．Ｅ３または１４Ｈ８．Ｅ７と関連する抗原結合部位は、カニクイザルＦＬＴ３に結合する。
ある特定の実施形態では、本明細書において開示される第２の抗原結合部位、例えば、上記で開示される１２Ｈ１０．Ｇ７、ＧＢ８７、ＧＢ８８、ＧＢ８９、ＧＢ９０、ＧＢ９１、ＧＢ９２、ＧＢ９３、ＧＢ９４、ＧＢ９５、ＧＢ９６、ＧＢ９７、ＧＢ９８、ＧＢ９９、ＧＢ１００、ＧＢ１０１、ＧＢ１０２、ＧＢ１０２ Ｍ３４Ｉ、ＧＢ１０２ Ｄ１０１Ｅ、ＧＢ１０２ Ｍ３４Ｉ／Ｄ１０１Ｅ、ヒト化１２Ｈ１０．Ｇ７、１４Ａ５．Ｅ８、１５５１、１５５２、１５５３、１５５４、１６８９、ヒト化１４Ａ５．Ｅ８、１１Ｆ４．Ｂ９、４Ａ４．Ａ３、４Ａ４．Ｈ７、１２Ｃ９．Ｅ５、１Ａ２．Ａ３、４Ｈ２．Ｅ３または１４Ｈ８．Ｅ７と関連する抗原結合部位は、ＦＬＴ３への結合についてＦＬＴ３Ｌと競合しない。
ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＦＬＴ３（例えば、ヒトＦＬＴ３、カニクイザルＦＬＴ３）への結合について、上記の抗原結合部位と競合する。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＦＬＴ３への結合について、上記で開示される１Ａ２．Ａ３と関連する抗原結合部位と競合する、一実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＦＬＴ３への結合について１Ａ２．Ａ３と競合する。ある特定の実施形態では、本発明の第２の抗原結合部位は、ＦＬＴ３への結合について、上記で開示される４Ａ４．Ａ３と関連する抗原結合部位と競合する。一実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＦＬＴ３への結合について、４Ａ４．Ａ３と競合する。ある特定の実施形態では、本発明の第２の抗原結合部位は、ＦＬＴ３への結合について、上記で開示される４Ｈ２．Ｅ３と関連する抗原結合部位と競合する。一実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＦＬＴ３への結合について、４Ｈ２．Ｅ３と競合する。ある特定の実施形態では、本発明の第２の抗原結合部位は、ＦＬＴ３への結合について、上記で開示される１１Ｆ４．Ｂ９と関連する抗原結合部位と競合する。一実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＦＬＴ３への結合について、１１Ｆ４．Ｂ９と競合する。
Ｆｃドメイン
Ｆｃドメイン内で、ＣＤ１６結合は、ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内で、ＣＤ１６との相互作用は、主にＣＨ２ドメイン中のアミノ酸残基Ａｓｐ ２６５－Ｇｌｕ ２６９、Ａｓｎ ２９７－Ｔｈｒ ２９９、Ａｌａ ３２７－Ｉｌｅ ３３２、Ｌｅｕ ２３４－Ｓｅｒ ２３９および炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに集中している（Sondermann et al., Nature, 406 (6793):267-273を参照されたい）。既知ドメインに基づいて、突然変異を、ＣＤ１６への結合親和性をＣＤ１６への結合親和性を増強または低減するように、ファージディスプレイされたライブラリーまたは酵母表面ディスプレイされたｃＤＮＡライブラリーを使用することなどによって選択できる、または相互作用の既知３次元構造に基づいて設計できる。したがって、ある特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインまたはその一部分は、ヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む。
ヘテロ二量体抗体重鎖のアセンブリーは、同一細胞において２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることによって達成でき、これは、各抗体重鎖のホモ二量体のアセンブリーならびにヘテロ二量体のアセンブリーにつながる可能性がある。ヘテロ二量体の優先的なアセンブリーを促進することは、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０およびＵＳ１４／８３０３３６において示されるように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン中に種々の突然変異を組み込むことによって達成できる。例えば、突然変異は、ヒトＩｇＧ１ならびに第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド内に、これら２つの鎖が互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にするアミノ酸置換の別個の対を組み込むことに基づいてＣＨ３ドメインにおいて行うことができる。以下に例示されるアミノ酸置換の配置は、ＫａｂａｔにおいてのようにＥＵインデックスに従ってすべて番号付けられる。
１つのシナリオでは、第１のポリペプチドにおけるアミノ酸置換が、元のアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択されるより大きなアミノ酸と置き換え、第２のポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、元のアミノ酸（複数可）を、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）またはバリン（Ｖ）から選択されるより小さいアミノ酸（複数可）と置き換え、その結果、より大きなアミノ酸置換（隆起）が、より小さいアミノ酸置換（空洞）の表面に適合する。例えば、一方のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他方はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込むことができる。
本発明の抗体重鎖可変ドメインは、抗体定常領域、例えば、ＣＨ１ドメインの有無に関わらず、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列にカップリングできてもよい。一部の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒト抗体定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域またはＩｇＧ４定常領域に対して少なくとも９０％同一である。一実施形態では、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインまたはその一部分は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号１３６）に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。一部の他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、別の哺乳動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスまたはウマに由来する抗体定常領域に対して少なくとも９０％同一である。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片に連結された抗体定常ドメインは、ＣＤ１６に結合可能である。一部の実施形態では、タンパク質は、抗体Ｆｃドメインの一部分（例えば、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部分）を組み込み、抗体Ｆｃドメインは、ヒンジおよびＣＨ２ドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメイン）、および／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４～３３２に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、１つまたは複数の突然変異を、定常領域中に、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９で組み込むことができる。例示的置換として、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｒ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅが挙げられる。
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込むことができる突然変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１および／またはＶ１７３でであり得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込むことができる突然変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４および／またはＴ１６４でであり得る。
あるいは、アミノ酸置換は、以下の表３に示される置換のセットから選択できる。
Figure 2022551969000028
あるいは、アミノ酸置換は、以下の表４に示される置換のセットから選択できる。選択できる。
Figure 2022551969000029
あるいは、アミノ酸置換は、以下の表５に示される置換のセットから選択できる。選択できる。
Figure 2022551969000030
あるいは、各ポリペプチド鎖中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、表６から選択できる。
Figure 2022551969000031
あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、以下の表７における置換のセットから選択でき、第１のポリペプチドの列において示された位置（複数可）は、任意の公知の負電荷を有するアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列において示された位置（複数可）は、任意の公知の正電荷を有するアミノ酸によって置き換えられる。
Figure 2022551969000032
あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、以下の表８におけるセットから選択でき、第１のポリペプチドの列において示された位置（複数可）は、任意の公知の正電荷を有するアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列において示された位置（複数可）は、任意の公知の負電荷を有するアミノ酸によって置き換えられる。
Figure 2022551969000033
あるいは、アミノ酸置換は、以下の表９におけるセットから選択できる。
Figure 2022551969000034
あるいは、またはさらに、ヘテロ多量体タンパク質の構造的安定性は、第１のまたは第２のポリペプチド鎖のいずれかでＳ３５４Ｃを、対向するポリペプチド鎖でＹ３４９Ｃを導入し、それらが２つのポリペプチドのインターフェース内で人工ジスルフィド架橋を形成することによって増大できる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６位でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６位でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
例示的多重特異性結合タンパク質
各々抗体定常領域に連結された、ＦＬＴ３に結合する抗原結合部位およびＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を含むＴｒｉＮＫＥＴの例が、以下に列挙され、抗体定常領域は、２つのＦｃ鎖のヘテロ二量体化を可能にする突然変異を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ下でのＣＤＲ配列に下線が引かれている。Ｆ３－ＧＢ１０２は、Ｆ３形式である、すなわち、ＦＬＴ３に結合する抗原結合部位は、Ｆａｂであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位は、ｓｃＦｖである。他のＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’形式である、すなわち、ＦＬＴ３に結合する抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位は、Ｆａｂである。各ＴｒｉＮＫＥＴでは、ｓｃＦｖは、Ｃｙｓの、ＶＬの１００位およびＶＨの４４位のアミノ酸残基との置換を含み、それによって、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ間のジスルフィド架橋の形式を促進する。
ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬは、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを介して接続できる。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、可動性リンカーである。リンカーのアミノ酸組成物に関して、可動性を与え、本発明のタンパク質の他のドメインの構造および機能に干渉せず、プロテアーゼからの切断に抵抗する特性を有するペプチドが選択される。例えば、グリシンおよびセリン残基は、一般に、プロテアーゼ抵抗性を提供する。ある特定の実施形態では、ＶＬは、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（（Ｇ４Ｓ）４）リンカー（配列番号１３７）を介してＶＨのＮ末端またはＣ末端に連結される。
リンカー（例えば、可動性リンカー）の長さは、「短い」例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２個のアミノ酸残基または「長い」、例えば、少なくとも１３個アミノ酸残基であり得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、１５～２０、２０～５０、２０～４０、２０～３０または２０～２５個のアミノ酸残基の長さである。
ある特定の実施形態では、リンカーは、（ＧＳ）ｎ（配列番号２９０）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号２９１）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２９２）、（ＧＧＳＧ）ｎ（配列番号２９３）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（配列番号２９４）および（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２９５）配列（ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である）を含む、またはからなる。ある特定の実施形態では、リンカーは、表１０において列挙される、配列番号１３７、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号８３、配列番号８４、配列番号１５０、配列番号１５２および配列番号１５４から選択されるアミノ酸配列を含む、またはからなる。
Figure 2022551969000035
Ｆ３－ＧＢ１０２では、ＮＫＧ２Ｄ－結合性ｓｃＦｖは、Ａｌａ－Ｓｅｒリンカーを介してＦｃのＮ末端に連結されている。Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴでは、ＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーを介してＦｃのＮ末端に連結されている。Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、可動性および最適幾何学の間のバランスをとるようにエルボーヒンジ領域配列に含まれる。ある特定の実施形態では、追加の配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙが、ヒンジでＡｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒ配列のＮ末端またはＣ末端に付加される場合もある。
これらの例示的ＴｒｉＮＫＥＴを説明するために本明細書で使用される場合、Ｆｃは、抗体ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各例示的ＴｒｉＮＫＥＴでは、ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの突然変異を含み、Ｆａｂに連結されたＦｃドメインは、ヘテロ二量体を形成するための適合する突然変異Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含む。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインは、ＣＨ３ドメイン中にＳ３５４Ｃ置換をさらに含み、これは、Ｆａｂに連結されたＦｃ上のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。これらの置換は、この小区分において記載される配列中で太字である。
例えば、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’－ＧＢ１０２である。Ｆ３’－ＧＢ１０２は、（ａ）Ｆｃドメインに連結されたＧＢ１０２に由来するＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖ配列ならびに（ｂ）重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分と、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインとを含む軽鎖部分を含むＡ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ－結合性Ｆａｂ断片を含み、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続されている。Ｆ３’－ＧＢ１０２は、以下に示される３つのポリペプチドを含む。
Figure 2022551969000036
Figure 2022551969000037
Figure 2022551969000038
ＧＢ１０２－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結されたＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖの完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を、ならびに以下に記載されるようにＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためにＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号４０）は、（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介してＧＢ１０２の軽鎖可変ドメインのＣ末端に接続されたＧＢ１０２の重鎖可変ドメインを含む。ｓｃＦｖの重および軽可変ドメインはまた、それぞれＶＬおよびＶＨ中のＲ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果としてＶＬのＣ１００とＶＨのＣ４４の間のジスルフィド架橋によって接続される。
Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃは、Ｆｃドメインに接続された、ＮＫＧ２Ｄ－結合性Ａ４９ＭＩの重鎖可変ドメイン（配列番号２５４）およびＣＨ１ドメインを含むＦａｂ断片の重鎖部分を表す。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ置換を含み、これは、ＧＢ１０２－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ中のＦｃ上のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃでは、Ｆｃドメインはまた、ＧＢ１０２－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ中のＦｃとのヘテロ二量体化のためのＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換も含む。
Ａ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬは、ＮＫＧ２Ｄ－結合性Ａ４９ＭＩ（配列番号２３９）の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むＦａｂ断片の軽鎖部分を表す。
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３－ＧＢ１０２である。Ｆ３－ＧＢ１０２は、（ａ）Ｆｃドメインに連結されたＡ４９に由来するＮＫＧ２Ｄ－結合性ｓｃＦｖ配列ならびに（ｂ）重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分と、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインとを含む軽鎖部分を含むＧＢ１０２に由来するＦＬＴ３－結合性Ｆａｂ断片を含み、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続されている。Ｆ３－ＧＢ１０２は、以下に示される３つのポリペプチドを含む。
Figure 2022551969000039
Figure 2022551969000040
Figure 2022551969000041
Ａ４９－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結されたＮＫＧ２Ｄ－結合性ｓｃＦｖの完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を、ならびに以下に記載されるようにＧＢ１０２－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためにＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号２４６）は、（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介してＡ４９の軽鎖可変ドメインのＣ末端に接続されたＡ４９の重鎖可変ドメインを含む。ｓｃＦｖの重および軽可変ドメインはまた、それぞれＶＬおよびＶＨ中のＱ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果としてＶＬのＣ１００とＶＨのＣ４４の間のジスルフィド架橋によって接続される。
ＧＢ１０２－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃは、Ｆｃドメインに接続された、ＦＬＴ３－結合性ＧＢ１０２の重鎖可変ドメイン（配列番号３７）およびＣＨ１ドメインを含む、Ｆａｂ断片の重鎖部分を表す。ＧＢ１０２－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ置換を含み、これは、Ａ４９－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ中のＦｃ上のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。ＧＢ１０２－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃでは、Ｆｃドメインはまた、Ａ４９－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ中のＦｃとのヘテロ二量体化のためのＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む。
ＧＢ１０２－ＶＬ－ＣＬは、ＦＬＴ３－結合性ＧＢ１０２（配列番号３８）の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むＦａｂ断片の軽鎖部分を表す。
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’－１５５３である。Ｆ３’－１５５３は、（ａ）Ｆｃドメインに連結されたｍＡｂ １５５３に由来するＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖ配列ならびに（ｂ）重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分と、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインとを含む軽鎖部分を含むＡ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ－結合性Ｆａｂ断片を含み、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続されている。Ｆ３’－１５５３は、３つのポリペプチド：１５５３－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃおよびＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬは、Ｆ３’－ＧＢ１０２との関連で上記に記載されている。１５５３－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃのポリペプチドは、以下に示されている。
Figure 2022551969000042
１５５３－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結されたＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖの完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を、ならびに以下に記載されるＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためにＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号７４）は、（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して１５５３の軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続された、１５５３の重鎖可変ドメインを含む。ｓｃＦｖの重および軽可変ドメインはまた、それぞれＶＬおよびＶＨ中のＱ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果としてＶＬのＣ１００とＶＨのＣ４４の間のジスルフィド架橋によって接続される。
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’－１６８９である。Ｆ３’－１６８９は、（ａ）Ｆｃドメインに連結されたｍＡｂ １６８９に由来するＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖ配列ならびに（ｂ）重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分と、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインとを含む軽鎖部分を含むＡ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ－結合性Ｆａｂ断片を含み、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続されている。Ｆ３’－１６８９は、３つのポリペプチド：１６８９－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃおよびＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬは、Ｆ３’－ＧＢ１０２との関連で上記に記載されている。１６８９－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃのポリペプチドは、以下に示されている。
Figure 2022551969000043
１６８９－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結されたＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖの完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換ならびに以下に記載されるＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためにＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号８１）は、ＦＬＴ３に対する結合親和性を増大する可能性がある１５５３－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ中のｓｃＦｖに対して一連の突然変異を含む。
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’－ＧＢ１０２＿Ｍ３４Ｉである。Ｆ３’－ＧＢ１０２＿Ｍ３４Ｉは、（ａ）Ｆｃドメインに連結されたＧＢ１０２ Ｍ３４Ｉに由来するＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖ配列ならびに（ｂ）重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分と、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインとを含む軽鎖部分を含むＡ４９ＭＩに由来する ＮＫＧ２Ｄ－結合性Ｆａｂ断片を含み、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続される。Ｆ３’－ＧＢ１０２＿Ｍ３４Ｉは、３つのポリペプチド：ＧＢ１０２＿Ｍ３４Ｉ－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃおよびＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬは、Ｆ３’－ＧＢ１０２との関連で上記に記載されている。ＧＢ１０２＿Ｍ３４Ｉ－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃのポリペプチドは、以下に示されている。
Figure 2022551969000044
ＧＢ１０２＿Ｍ３４Ｉ－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結されたＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖの完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を、ならびに以下に記載されるようにＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためにＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号４８）は、ＧＢ１０２－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ中のＶＨに対してＭ３４Ｉ置換を含み、推定上の配列の傾向を除去する。
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’－ＧＢ１０２＿Ｄ１０１Ｅである。Ｆ３’－ＧＢ１０２＿Ｄ１０１Ｅは、（ａ）Ｆｃドメインに連結されたＧＢ１０２ Ｄ１０１Ｅに由来するＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖ配列ならびに（ｂ）重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分と、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインとを含む軽鎖部分とを含むＡ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ－結合性Ｆａｂ断片を含み、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続される。Ｆ３’－ＧＢ１０２＿Ｄ１０１Ｅは、３つのポリペプチド：ＧＢ１０２＿Ｄ１０１Ｅ－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃおよびＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬは、Ｆ３’－ＧＢ１０２との関連で上記に記載されている。ＧＢ１０２＿Ｄ１０１Ｅ－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃのポリペプチドは、以下に示されている。
Figure 2022551969000045
ＧＢ１０２＿Ｄ１０１Ｅ－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結されたＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖの完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を、ならびに以下に記載されるようにＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためにＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号４４）は、ＧＢ１０２－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ中のＶＨに対してＤ１０１Ｅ置換を含み、推定上の配列の傾向を除去する。
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’－ＧＢ１０２＿Ｍ３４Ｉ＿Ｄ１０１Ｅである。Ｆ３’－ＧＢ１０２＿Ｍ３４Ｉ＿Ｄ１０１Ｅは、（ａ）Ｆｃドメインに連結されたＧＢ１０２ Ｍ３４Ｉ／Ｄ１０１Ｅに由来するＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖ配列ならびに（ｂ）重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分と、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分とを含むＡ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ－結合性Ｆａｂ断片を含み、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続されている。Ｆ３’－ＧＢ１０２＿Ｍ３４Ｉ＿Ｄ１０１Ｅは、３つのポリペプチド：ＧＢ１０２＿Ｍ３４Ｉ＿Ｄ１０１Ｅ－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃおよびＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬは、Ｆ３’－ＧＢ１０２との関連で上記に記載されている。ＧＢ１０２＿Ｍ３４Ｉ＿Ｄ１０１Ｅ－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃのポリペプチドは、以下に示されている。
Figure 2022551969000046
ＧＢ１０２＿Ｍ３４Ｉ＿Ｄ１０１Ｅ－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結されたＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖの完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を、ならびに以下に記載されるようにＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためにＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号５２）は、ＧＢ１０２－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ中のＶＨに対してＭ３４ＩおよびＤ１０１Ｅ置換を含み、推定上の配列の傾向を除去する。
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’－ＧＢ９９である。Ｆ３’－ＧＢ９９は、（ａ）Ｆｃドメインに連結されたＧＢ９９に由来するＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖ配列ならびに（ｂ）重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分と、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分とを含むＡ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ－結合性Ｆａｂ断片を含み、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続されている。Ｆ３’－ＧＢ９９は、３つのポリペプチド：ＧＢ９９－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃおよびＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬは、Ｆ３’－ＧＢ１０２との関連で上記に記載されている。ＧＢ９９－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃのポリペプチドは、以下に示されている。
Figure 2022551969000047
ＧＢ９９－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結されたＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖの完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を、ならびに以下に記載されるようにＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためにＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号２８）は、ＧＢ１０２－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ中のｓｃＦｖに対してフレームワーク領域中に一連の逆突然変異を含み、抗体構造および活性を改善する可能性がある。
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、Ｆ３’－ＧＢ８９である。Ｆ３’－ＧＢ８９は、（ａ）Ｆｃドメインに連結されたＧＢ８９に由来するＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖ配列ならびに（ｂ）重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分と、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分とを含むＡ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ－結合性Ｆａｂ断片を含み、ＣＨ１ドメインは、Ｆｃドメインに接続されている。Ｆ３’－ＧＢ８９は、３つのポリペプチド：ＧＢ８９－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、Ａ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬを含む。Ａ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－ＦｃおよびＡ４９ＭＩ－ＶＬ－ＣＬは、Ｆ３’－ＧＢ１０２との関連で上記に記載されている。ＧＢ８９－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃのポリペプチドは、以下に示されている。
Figure 2022551969000048
ＧＢ８９－ＶＨ－ＶＬ－Ｆｃは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結されたＦＬＴ３－結合性ｓｃＦｖの完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインは、ヘテロ二量体化のためにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を、ならびに以下に記載されるＡ４９ＭＩ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ中のＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成するためにＳ３５４Ｃ置換を含む。ｓｃＦｖ（配列番号１９）は、（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介してＧＢ８９の軽鎖可変ドメインのＮ末端に接続された、ＧＢ８９の重鎖可変ドメインを含む。ｓｃＦｖの重および軽可変ドメインはまた、それぞれＶＬおよびＶＨ中のＲ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果としてＶＬのＣ１００とＶＨのＣ４４の間のジスルフィド架橋によって接続される。ｓｃＦｖはまた、ＧＢ１０２－ＶＬ－ＶＨ－Ｆｃ中のＶＨおよびＶＬに対してフレームワーク領域中に一連の逆突然変異を含み、抗体構造および活性を改善する可能性がある。
ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ－結合性Ｆａｂ断片に連結されたＦｃドメインが、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの置換を含み、ＨＥＲ２－結合性ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインが、ヘテロ二量体を形成するために適合する置換Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含むという点を除いて、ＥＷ－ＲＶＴ Ｆｃ突然変異を含む上記の例示的ＴｒｉＮＫＥＴの１つと同一である。ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ－結合性Ｆａｂ断片に連結されたＦｃドメインが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの「ホール」置換を含み、ＨＥＲ２－結合性ｓｃＦｖに連結されたドメインが、ヘテロ二量体を形成するためにＴ３６６Ｗの「ノブ」置換を含むという点を除いて、ＫｉＨ Ｆｃ突然変異を含む上記の例示的ＴｒｉＮＫＥＴの１つと同一である。
ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ－結合性Ｆａｂ断片に連結されたＦｃドメインが、ＣＨ３ドメイン中にＳ３５４Ｃ置換を含み、ＨＥＲ２－結合性ｓｃＦｖに連結されたＦｃドメインが、ジスルフィド結合を形成するためにＣＨ３ドメイン中に適合するＹ３４９Ｃ置換を含むという点を除いて、上記の例示的ＴｒｉＮＫＥＴの１つと同一である。
当業者ならば、タンパク質の生成および／または保存の際に、Ｎ末端グルタミン酸（Ｅ）またはグルタミン（Ｑ）は環化されて、ラクタムを形成する場合がある（例えば、自発的にまたは生成および／または保存の際に存在する触媒によって触媒されて）ということは理解するであろう。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端残基がＥまたはＱである一部の実施形態では、ＥまたはＱがピログルタミン酸で置き換えられた対応するアミノ酸配列も本明細書において企図される。
当業者ならばまた、タンパク質生成および／または保存の際に、タンパク質のＣ末端リシン（Ｋ）は除去される場合がある（例えば、自発的にまたは生成および／または保存の際に存在する触媒によって触媒されて）ということは理解するであろう。Ｋのこのような除去は、そのＣ末端にＦｃドメインを含むタンパク質を用いた場合に観察されることが多い。したがって、ポリペプチド（例えば、Ｆｃドメイン配列）のアミノ酸配列のＣ末端残基がＫである一部の実施形態では、Ｋが除去された対応するアミノ酸配列もまた本明細書において企図される。
上記の多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製できる。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列は、第１の発現ベクターにクローニングでき、第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列は、第２の発現ベクターにクローニングでき、免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列は、第３の発現ベクターにクローニングでき、第１、第２および第３の発現ベクターを、宿主細胞中に一緒に安定にトランスフェクトして、多量体タンパク質を生成できる。
多重特異性タンパク質の最高収率を達成するために、第１、第２および第３の発現ベクターの種々の比を調査して、宿主細胞へのトランスフェクションのための最適比を決定できる。トランスフェクション後、当技術分野で公知の方法、例えば、制限希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡観察またはＣｌｏｎｅｐｉｘを使用して細胞バンク作製のために、単一クローンを単離できる。
クローンを、バイオリアクタースケールアップに適した条件下で培養し、多重特異性タンパク質の発現を維持できる。多重特異性タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、ホモジナイゼーション、凍結融解、アフィニティー精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィーおよび混合様式クロマトグラフィーを含む当技術分野で公知の方法を使用して単離および精製できる。
ＩＩ．多重特異性タンパク質の特徴
本明細書において記載される多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ－結合部位、ＦＬＴ３に結合するＦＬＴ３－結合性部位およびＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインまたはその一部分またはＣＤ１６に結合する抗原結合部位を含む。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ形式で例示されるように、ＦＬＴ３に結合する追加の抗原結合部位を含有する。
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するモノクローナル抗体、すなわち、多重特異性タンパク質に組み込まれるものと同一のＦＬＴ３－結合性部位を含有するモノクローナル抗体と同様の熱安定性を示す。
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６を発現する細胞、例えば、ＮＫ細胞およびＦＬＴ３を発現する細胞、例えば、ある特定の腫瘍細胞に同時に結合する。多重特異性タンパク質の、ＮＫ細胞への結合は、ＮＫ細胞の、ＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞の破壊に向けた活性を増強し得る。
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応する抗ＦＬＴ３モノクローナル抗体（すなわち、多重特異性タンパク質に組み込まれるものと同一のＦＬＴ３－結合性部位を含有するモノクローナル抗体）に対して同様の親和性でＦＬＴ３に結合する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するモノクローナル抗体よりも、ＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞の死滅においてより効果的である。
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される多重特異性タンパク質は、ＦＬＴ３に対する結合部位を含み、ＦＬＴ３を発現する細胞と同時培養すると一次ヒトＮＫ細胞を活性化する。ＮＫ細胞活性化は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ－γサイトカイン産生の増大によって示される。さらに、対応する抗ＦＬＴ３モノクローナル 抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、ＦＬＴ３を発現する細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示し得る。
一部の実施形態では、ＦＬＴ３に対する結合部位を含む本明細書において記載される多重特異性タンパク質は、ＦＬＴ３を発現する細胞と同時培養された場合に、休止およびＩＬ－２によって活性化されたヒトＮＫ細胞の活性を増強する。
一部の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する対応するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、中および低レベルのＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞の標的化において利点を提供する。
一部の実施形態では、ＴｒｉＮＫＥＴの二価Ｆ４形式（すなわち、ＴｒｉＮＫＥＴは、ＦＬＴ３に結合する追加の抗原結合部位を含む）は、ＴｒｉＮＫＥＴがＦＬＴ３に結合するアビディティーを改善し、これは、事実上、腫瘍細胞の表面上の高レベルのＦＬＴ３の発現および維持を安定化する。一部の実施形態では、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴは、対応するＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴまたはＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴよりも腫瘍細胞のより強力な死滅を媒介する。
ＩＩＩ．治療適用
本発明は、本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質および／または本明細書において記載される医薬組成物を使用して自己免疫疾患またはがんを処置する方法を提供する。方法はＦＬＴ３を発現する種々のがんを処置するために使用できる。
治療方法は、処置されるべきがんによって特徴づけることができる。例えば、ある特定の実施形態では、がんは、血液悪性腫瘍または白血病である。ある特定の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、急性Ｔリンパ性白血病または急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄単球性白血病または慢性骨髄性白血病の骨髄性急性転化である。
ＦＬＴ３標的化多重特異性結合タンパク質によって処置されるべき他の例示的がんとして、乳がん、卵巣がん、食道がん、膀胱または胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がん、唾液管癌腫、唾液管癌腫、肺の腺癌または子宮がんの高悪性度形態、例えば、子宮血清子宮内膜癌腫が挙げられる。一部の他の実施形態では、がんは、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、白血病、肺がん、肝臓がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、直腸がん、腎がん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、精巣がんまたは子宮がんである。さらに他の実施形態では、がんは、扁平細胞癌腫、腺癌、小細胞癌腫、黒色腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭がん、耳下腺がん、胆道がん、甲状腺がん、末端黒子型黒色腫、日光角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管がん、肛門がん、肛門直腸がん、星細胞系腫瘍、バルトリン腺癌腫、基底細胞癌腫、胆道がん、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌腫、カルチノイド、胆管癌、軟骨肉腫（ｃｈｏｎｄｏｓａｒｃｏｍａ）、脈絡膜叢乳頭腫／癌腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌腫、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器系がん、十二指腸がん、内分泌系がん、卵黄嚢腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞がん、上衣がん、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼および眼窩がん、女性性器がん、限局性結節性過形成、胆嚢がん、幽門洞がん、胃底部がん、ガストリン産生腫瘍、神経膠芽腫、グルカゴン産生腫瘍、心臓がん、血管芽腫（ｈｅｍａｎｇｉｂｌａｓｔｏｍａｓ）、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌腫、ホジキン疾患、回腸がん、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平細胞新生物、肝内胆管がん、浸潤性扁平細胞癌腫、空腸がん、関節がん、カポジ肉腫、骨盤がん、大細胞癌腫、大腸がん、平滑筋肉腫、悪性黒子由来黒色腫、リンパ腫、男性性器がん、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、髄膜がん、中皮腫、転移性癌腫、口腔がん、粘膜表皮癌腫、多発性骨髄腫、筋肉がん、鼻腔がん、神経系がん、神経上皮腺癌結節性黒色腫、非上皮性皮膚がん、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞がん、口腔がん、骨肉腫、乳頭状漿液性腺癌、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、直腸がん、腎細胞癌腫、呼吸器系がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌腫、副鼻腔がん、皮膚 がん、小細胞癌腫、小腸がん、平滑筋がん、柔組織がん、ソマトスタチン分泌性腫瘍、脊椎がん、扁平細胞癌腫、横紋筋がん、中皮下がん、表在性黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌がん、未分化癌腫、尿管がん、尿道がん、膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸部がん、子宮体がん、ぶどう膜黒色腫、膣がん、いぼ状癌腫、ＶＩＰ産生腫瘍、外陰部がん、高分化型癌腫またはウィルムス腫瘍である。
一部の他の実施形態では、処置されるべきがんは、非ホジキンリンパ腫、例えば、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫である。ある特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小さいリンパ性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、へアリー細胞白血病または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫である。ある特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｔ細胞リンパ腫、例えば、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫または末梢Ｔ細胞リンパ腫である。
ＩＶ．併用療法
本発明の別の態様は、併用療法を提供する。本明細書において記載される多重特異性結合タンパク質は、自己免疫疾患を処置するために、またはがんを処置するために追加の治療薬と組み合わせて使用できる。
自己免疫炎症性疾患の処置において併用療法の一部として使用できる例示的治療薬は、Li et al. (2017) Front. Pharmacol., 8:460に記載され、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、ＣＯＸ－２阻害剤）、グルココルチコイド（例えば、プレドニゾン／プレドニゾロン、メチルプレドニゾロンおよびフッ素化グルココルチコイド、例えば、デキサメタゾンおよびベタメタゾン）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（例えば、メトトレキサート、レフルノミド、金化合物、スルファサラジン、アザチオプリン、シクロホスファミド、抗マラリア薬、Ｄ－ペニシラミンおよびシクロスポリン）、抗ＴＮＦ生物製剤（例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブペゴールおよびそのバイオシミラー）ならびにＣＴＬＡ－４（例えば、アバタセプト）、ＩＬ－６受容体（例えば、トシリズマブ）、ＩＬ－１（例えば、アナキンラ）、Ｔｈ１免疫応答（ＩＬ－１２／ＩＬ－２３）（例えば、ウステキヌマブ）、Ｔｈ１７免疫応答（ＩＬ－１７）（例えば、セクキヌマブ）およびＣＤ２０（例えば、リツキシマブ）を標的化する他の生物製剤が挙げられる。
がんの処置において併用療法の一部として使用できる例示的治療薬として、例えば、放射線照射、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、ホテムスチン、サイマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミソール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－２アルファ、インターフェロン－ベータ、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、コロニー刺激因子－１、コロニー刺激因子－２、デニロイキンジフチトクス、インターロイキン－２、黄体化ホルモン放出因子ならびにその同族受容体への差次的結合または血清半減期の増大もしくは減少を示し得る前記の薬剤の変形形態が挙げられる。
がんの処置において併用療法の一部として使用できる薬剤の追加のクラスとして、免疫チェックポイント阻害剤がある。例示的免疫チェックポイント阻害剤には、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７－Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７－Ｈ４および（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうち１つまたは複数を阻害する薬剤が含まれる。ＣＴＬＡ４阻害剤イピリムマブは、米国食品医薬品局によって黒色腫の処置のための承認されている。
がんの処置において併用療法の一部として使用できるさらに他の薬剤として、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体剤（例えば、ハーセプチン）および非細胞傷害性薬剤（例えば、チロシン－キナーゼ阻害剤）がある。
抗がん剤のさらに他のカテゴリーとして、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトンチロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫおよびｍＴＯＲ両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤および２－クロロ－デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１およびＤＨＯＤＨ両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ－ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤およびＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤、（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５またはＩＣＯＳのアゴニストならびに（ｉｉｉ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦおよびＧ－ＣＳＦから選択されるサイトカインが挙げられる。
本発明のタンパク質はまた、病変原発の外科的除去の補助剤としても使用できる。
多重特異性結合タンパク質および追加の治療薬の量ならびに投与の相対的タイミングは、所望の組み合わされた治療効果を達成するように選択できる。例えば、併用療法をこのような投与を必要とする患者に投与する場合には、組み合わせた治療薬または治療薬を含む医薬組成物もしくは組成物を、任意の順序で、例えば、逐次、同時的に、一緒に、同時になどで投与できる。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、追加の治療薬（複数可）がその予防的または治療的効果を発揮する時間の間投与できる、または逆もまた同じである。
Ｖ．医薬組成物
本開示はまた、本明細書において記載されるタンパク質の治療有効量を含有する医薬組成物を特徴とする。組成物は、種々の薬物送達システムにおいて使用するために製剤化できる。適切な製剤のために１種または複数の生理学的に許容される賦形剤または担体を、組成物に含めることができる。本開示において使用するための適した製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985に見出される。薬物送達のための方法の簡単な概説については、例えば、Langer (Science 249:1527-1533, 1990)を参照されたい。
本開示の静脈内薬物送達製剤を、バッグ、ペンまたはシリンジ中に含有することができる。ある特定の実施形態では、バッグをチューブおよび／またはニードルを含むチャネルに接続することができる。ある特定の実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤または液体製剤であり得る。ある特定の実施形態では、製剤を、凍結－乾燥（凍結乾燥）し、約１２～６０のバイアル中に含有することができる。ある特定の実施形態では、製剤を凍結－乾燥することができ、４５ｍｇの凍結－乾燥された製剤を１バイアル中に含有することができる。ある特定の実施形態では、約４０ｍｇ～約１００ｍｇの凍結－乾燥された製剤を、１バイアル中に含有することができる。ある特定の実施形態では、静脈内薬物製剤中のタンパク質の治療用量を得るために、１２、２７または４５バイアルからの凍結－乾燥された製剤が合わせられる。ある特定の実施形態では、製剤は、液体製剤であり、約２５０ｍｇ／バイアル～約１０００ｍｇ／バイアルとして保存することができる。ある特定の実施形態では、製剤は、液体製剤であり、約６００ｍｇ／バイアルとして保存することができる。ある特定の実施形態では、液体製剤であり、約２５０ｍｇ／バイアルとして保存することができる。
タンパク質は、製剤を形成する緩衝溶液中にタンパク質の治療有効量を含む液体水性医薬品製剤中に存在し得る。
これらの組成物を、従来の滅菌技術によって滅菌することができる、または滅菌濾過できる。得られた水溶液をそのままで使用するためにパッケージングする、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥薬調製物は、投与の前に滅菌水性担体と組み合わせる。調製物のｐＨは、通常、３から１１の間、より好ましくは、５から９の間または６から８の間、最も好ましくは、７から８の間、例えば、７～７．５となる。固体形態の得られた組成物を、各々、固定量の上記の薬剤（単数または複数）を含有する、複数の単回用量ユニットにパッケージングできる。固体形態の組成物をまた、柔軟な量のための容器にパッケージングすることもできる。
ある特定の実施形態では、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸トリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水および水酸化ナトリウムと組み合わせて本開示のタンパク質を含む、長期の有効期間を有する製剤を提供する。
ある特定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本開示のバッファーは、約４～約８、例えば、約４．５～約６．０もしくは約４．８～約５．５の範囲のｐＨを有する場合がある、または約５．０～約５．２のｐＨを有する場合がある。上記で列挙されたｐＨの中間の範囲も、本開示の一部であるものとする。例えば、上限および／または下限として上記で列挙された値のいずれかの組合せを使用する値の範囲は、含まれるものとする。この範囲内のｐＨを制御するであろうバッファーの例として、酢酸（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸、ヒスチジン、クエン酸および他の有機酸バッファーが挙げられる。
ある特定の実施形態では、製剤は、約４～約８の範囲のｐＨを維持するためにクエン酸およびリン酸を含有するバッファー系を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨ範囲は、約４．５～約６．０もしくは約ｐＨ４．８～約５．５であり得る、または約５．０～約５．２のｐＨ範囲にあり得る。ある特定の実施形態では、バッファー系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物および／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。ある特定の実施形態では、バッファー系は、約１．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約１．５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍＬ）、約０．９ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６ｍｇ／ｍＬ）および約６．２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍＬ）を含む。ある特定の実施形態では、バッファー系は、約１～約１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、約０．２５～約０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、約１．２５～約１．７５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物、約０．７～約１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物および約６．０～約６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは、水酸化ナトリウムで調整される。
等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）として作用し、抗体を安定化できるポリオールも、製剤中に含めることができる。ポリオールは、製剤の所望の等張性に応じて変わり得る量で製剤に添加される。ある特定の実施形態では、水性製剤は、等張性であり得る。添加されるポリオールの量はまた、ポリオールの分子量に応じて変更され得る。例えば、二糖（例えば、トレハロース）と比較して、より少ない量の単糖（例えば、マンニトール）が添加され得る。ある特定の実施形態では、等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ａｇｅｎｔ）として製剤において使用できるポリオールは、マンニトールである。ある特定の実施形態では、マンニトール濃度は、約５～約２０ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約７．５～約１５ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１０～約１４ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１２ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、ポリオールソルビトールを製剤中に含めることができる。
界面活性剤または表面活性物質も、製剤に添加できる。例示的界面活性剤として、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）が挙げられる。添加される界面活性剤の量は、製剤化される抗体の凝集を低減する、および／または製剤における粒子の形成を最小化する、および／または吸着を低減するようなものである。ある特定の実施形態では、製剤は、ポリソルベートである表面活性物質を含み得る。ある特定の実施形態では、製剤は、界面活性剤ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを説明するために使用される用語である（Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, ditio Cantor Verlag Aulendorf, 4th ed., 1996を参照されたい）。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの間のポリソルベート８０または約０．５ｍｇ／ｍＬから約５ｍｇ／ｍＬの間を含有し得る。ある特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０を製剤中に添加できる。
実施形態では、本開示のタンパク質生成物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉じられ、アルミニウムクリンプシールクロージャーで密閉されたＵＳＰ／Ｐｈ ＥｕｒいずれかのタイプＩ ５０Ｒバイアル中、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提示され得る。栓は、ＵＳＰおよびＰｈ Ｅｕｒに準拠したエラストマー製であり得る。ある特定の実施形態では、バイアルに、６０ｍＬの抽出可能な容量を可能にするために６１．２ｍＬのタンパク質生成物溶液で充填することができる。ある特定の実施形態では、液体製剤は、０．９％の生理食塩水溶液で希釈できる。
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、安定化レベルの糖と組み合わせて１０ｍｇ／ｍＬ濃度溶液として調製できる。ある特定の実施形態では、液体製剤は、水性担体中で調製できる。ある特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与にとって望ましくないまたは適していない粘度をもたらし得るもの以下の量で添加できる。ある特定の実施形態では、糖は、二糖、例えば、スクロースであり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤はまた、緩衝化剤、表面活性物質および保存料のうち１種または複数を含み得る。
ある特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって設定できる。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は、塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、塩基は、水酸化ナトリウムであり得る。
凝集に加えて、脱アミド化は、発酵、回収／細胞清澄化、精製、薬物物質／薬物生成物保存の際に、ならびに試料分析の際に生じ得るペプチドおよびタンパク質の一般的な生成物変異体である。脱アミド化は、タンパク質からのＮＨ３の喪失であり、スクシンイミド中間体を形成し、これは加水分解を受ける可能性がある。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。その後の加水分解は、１８ダルトンの質量増加をもたらす。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性のために困難である。そのようなものとして、脱アミド化は、通常、１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミド化は、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかをもたらす。脱アミド化の速度に影響を及ぼすパラメータとして、ｐＨ、温度、溶媒比誘電率、イオン強度、一次配列、局所ポリペプチドコンホメーションおよび三次構造が挙げられる。ペプチド鎖中でＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化速度に影響を及ぼす。タンパク質配列中のＡｓｎに続くＧｌｙおよびＳｅｒは、脱アミド化に対してより高い感受性をもたらす。
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質生成物の脱アミノ化を防ぐｐＨおよび湿度の条件下で保存できる。
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与のために安全で、非毒性である）、液体製剤の調製のために有用であるものである。例示的担体として、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。
細菌作用を低減するために、保存料を本明細書における製剤に添加してもよい。保存料の添加は、例えば、複数可使用（複数回用量）製剤の生成を容易にし得る。
静脈内（ＩＶ）製剤は、患者がすべての薬物をＩＶ経路によって受け取っている移植後の入院中である場合など、特定の場合には好ましい投与経路であり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、投与の前に０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈される。ある特定の実施形態では、注射用の希釈された薬物生成物は、等張性であり、静脈内注入による投与に適している。
ある特定の実施形態では、塩またはバッファー成分を１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加できる。塩および／またはバッファーは、薬学的に許容され、「塩基形成性」金属またはアミンとともの、種々の公知の酸（無機および有機）に由来する。ある特定の実施形態では、バッファーは、リン酸バッファーであり得る。ある特定の実施形態では、バッファーは、グリシン酸、炭酸、クエン酸バッファーである場合があり、この場合には、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが、対イオンとして働くことができる。
細菌作用を低減するために、保存料を本明細書における製剤に添加してもよい。保存料の添加は、例えば、複数可使用（複数回用量）製剤の生成を容易にし得る。
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与のために安全で、非毒性である）、液体製剤の調製のために有用であるものである。例示的担体として、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。
本開示のタンパク質は、タンパク質および凍結保護剤を含む凍結乾燥製剤中に存在し得る。凍結保護剤は、糖、例えば、二糖であり得る。ある特定の実施形態では、凍結保護剤は、スクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤はまた、緩衝化剤、表面活性物質、増量剤および／または保存料のうち１種または複数を含み得る。
凍結乾燥薬物生成物の安定化にとって有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２のタンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比であり得る。ある特定の実施形態では、タンパク質対スクロースまたはマルトース重量比は、１：２～１：５のものであり得る。
ある特定の実施形態では、凍結乾燥前の製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって設定できる。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は、塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は、水酸化ナトリウムであり得る。
凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは、６から８の間で調整できる。ある特定の実施形態では、凍結乾燥薬物生成物のｐＨ範囲は、７～８であり得る。
ある特定の実施形態では、塩またはバッファー成分は、１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加できる。塩および／またはバッファーは、薬学的に許容され、「塩基形成性」金属またはアミンとともの、種々の公知の酸（無機および有機）に由来する。ある特定の実施形態では、バッファーは、リン酸バッファーであり得る。ある特定の実施形態では、バッファーは、グリシン酸、炭酸、クエン酸バッファーである場合があり、この場合には、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが、対イオンとして働くことができる。
ある特定の実施形態では、「増量剤」を添加できる。「増量剤」は、凍結乾燥薬混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、オープンポア構造を維持する本質的に均一の凍結乾燥ケーキの生成を容易にする）化合物である。例示的増量剤として、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが挙げられる。本発明の凍結乾燥製剤は、このような増量剤を含有し得る。
細菌作用を低減するために、保存料を本明細書における製剤に添加してもよい。保存料の添加は、例えば、複数可使用（複数回用量）製剤の生成を容易にし得る。
ある特定の実施形態では、凍結乾燥薬物生成物は、水性担体で構成され得る。本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与のために安全で、非毒性である）、凍結乾燥後に液体製剤の調製のために有用であるものである。例示的希釈剤として、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥薬物生成物は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％の塩化ナトリウム注射、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構成の際に、凍結乾燥散剤は、溶液中に溶解する。
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質生成物は、約４．５ｍＬの注射水に構成され、０．９％生理食塩水溶液（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。
本開示の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性ではない、特定の患者、組成物および投与様式の所望の治療応答を達成するために有効である有効成分の量を得るために変わり得る。
各患者の特定の用量は、均一な用量、例えば、５０～５０００ｍｇのタンパク質であり得る。あるいは、患者の用量は、患者のおよその体重または表面積にあわせて調製できる。適切な投与量の決定における他の因子として、処置または予防されるべき疾患または状態、疾患の重症度、投与経路ならびに患者の年齢、性別および医学的状態を挙げることができる。処置のための適切な投与量を決定するために必要な算出のさらなる精緻化は、投与量情報および本明細書において開示されるアッセイを考慮して当業者によって日常的に行われる。投与量はまた、適切な用量－応答データと併せて使用される投与量を決定するための公知のアッセイの使用によって決定できる。個々の患者の投与量は、疾患の進行がモニタリングされるのにつれて調整できる。患者における標的化可能なコンストラクトまたは複合体の血液レベルを測定して、有効な濃度に到達する、または維持するために、投与量が調整される必要があるか否かを確かめることができる。薬理ゲノミクスを使用して、どの標的化可能なコンストラクトおよび／または複合体ならびにその投与量が、所与の個体にとって有効である可能性が最も高いかを決定できる（Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001）。
一般に、体重に基づく投与量は、体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ～約１００ｍｇ、例えば、約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／体重１ｋｇ、約０．０１μｇ～約５０ｍｇ／体重１ｋｇ、約０．０１μｇ～約１０ｍｇ／体重１ｋｇ、約０．０１μｇ～約１ｍｇ／体重１ｋｇ、約０．０１μｇ～約１００μｇ／体重１ｋｇ、約０．０１μｇ～約５０μｇ／体重１ｋｇ、約０．０１μｇ～約１０μｇ／体重１ｋｇ、約０．０１μｇ～約１μｇ／体重１ｋｇ、約０．０１μｇ～約０．１μｇ／体重１ｋｇ、約０．１μｇ～約１００ｍｇ／体重１ｋｇ、約０．１μｇ～約５０ｍｇ／体重１ｋｇ、約０．１μｇ～約１０ｍｇ／体重１ｋｇ、約０．１μｇ～約１ｍｇ／体重１ｋｇ、約０．１μｇ～約１００μｇ／体重１ｋｇ、約０．１μｇ～約１０μｇ／体重１ｋｇ、約０．１μｇ～約１μｇ／体重１ｋｇ、約１μｇ～約１００ｍｇ／体重１ｋｇ、約１μｇ～約５０ｍｇ／体重１ｋｇ、約１μｇ～約１０ｍｇ／体重１ｋｇ、約１μｇ～約１ｍｇ／体重１ｋｇ、約１μｇ～約１００μｇ／体重１ｋｇ、約１μｇ～約５０μｇ／体重１ｋｇ、約１μｇ～約１０μｇ／体重１ｋｇ、約１０μｇ～約１００ｍｇ／体重１ｋｇ、約１０μｇ～約５０ｍｇ／体重１ｋｇ、約１０μｇ～約１０ｍｇ／体重１ｋｇ、約１０μｇ～約１ｍｇ／体重１ｋｇ、約１０μｇ～約１００μｇ／体重１ｋｇ、約１０μｇ～約５０μｇ／体重１ｋｇ、約５０μｇ～約１００ｍｇ／体重１ｋｇ、約５０μｇ～約５０ｍｇ／体重１ｋｇ、約５０μｇ～約１０ｍｇ／体重１ｋｇ、約５０μｇ～約１ｍｇ／体重１ｋｇ、約５０μｇ～約１００μｇ／体重１ｋｇ、約１００μｇ～約１００ｍｇ／体重１ｋｇ、約１００μｇ～約５０ｍｇ／体重１ｋｇ、約１００μｇ～約１０ｍｇ／体重１ｋｇ、約１００μｇ～約１ｍｇ／体重１ｋｇ、約１ｍｇ～約１００ｍｇ／体重１ｋｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ／体重１ｋｇ、約１ｍｇ～約１０ｍｇ／体重１ｋｇ、約１０ｍｇ～約１００ｍｇ／体重１ｋｇ、約１０ｍｇ～約５０ｍｇ／体重１ｋｇ、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ／体重１ｋｇである。
用量は、１日に、１週間に、１カ月にまたは１年に１回または複数回、またはさらに２～２０年毎に１回与えることができる。当業者ならば、体液または組織における標的化可能なコンストラクトまたは複合体の測定された滞留時間および濃度に基づいて、投薬の反復速度を容易に推定できる。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、くも膜下腔内、腔内、カテーテルを介して灌流によって、または直接病巣内注射によってであり得る。これは、１日に１回または複数回、１週間に１回または複数回、１カ月に１回または複数回および１年に１回または複数回投与できる。
上記の説明は、本発明の複数の態様および実施形態を説明する。本特許出願は、態様および実施形態のすべての組合せおよび順列を具体的に企図する。
ここで一般的に説明されている本発明は、単に本発明のある特定の態様および実施形態の例示を目的として含まれ、本発明を限定するように意図されない、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
［実施例１］
選択されたハイブリドーマクローンの上清の特性決定
ＦＬＴ３特異的抗体を、マウスをｈＦＬＴ３－Ｈｉｓ融合タンパク質で免疫化することによって生成した。２２８のハイブリドーマの上清を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってＦＬＴ３結合について評価し、９６のハイブリドーマがｈＦＬＴ３－Ｈｉｓタンパク質に非共有結合的に結合した。予備的バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結合親和性推定、ＦＬＴ３を発現するヒトおよびカニクイザル細胞への結合ならびにエピトープの多様性に基づいて１１のクローンを選択した。これら１１クローンの、ｈＦＬＴ３－Ｈｉｓに結合する能力を高分解能表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってさらに分析した。実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器を使用して生理的温度を模倣するために３７℃で実施した。Ｂｉａｃｏｒｅセンソグラムおよび動態パラメータは、表１２に提示されており、生データおよび適合は、図１８に示されている。１１ハイブリドーマのうち７つが、１０ｎＭ未満のＫＤで結合し、５つが遅い解離速度定数（ｋｄ＜５×１０－４ｓ－１）を示す。
ＯｃｔｅｔＲｅｄ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用するＢＬＩによって、参照ｍＡｂを用いてハイブリドーマ融合物のビニングを実施した。手短には、ハイブリドーマ上清を抗マウスＩｇＧ捕捉センサーチップ上に１５分間ロードし、ＰＢＳＦ中で５分間平衡化した。センサーを２００ｎＭ ｈＦＬＴ３－Ｈｉｓ中に浸漬し、１８０秒間会合させ、続いて、１００ｎＭの対照ＩｇＧまたは２００ｎＭのＦＴＬ３－リガンド溶液中に浸漬した。応答単位の増大は、ハイブリドーマが参照ｍＡｂに対して非競合者であることを示し、一方で、シグナルの増大がないことは、ハイブリドーマが参照ｍＡｂと競合したことを示した。ＦＬ２３（Ａｍｇｅｎ）およびＦＬ３９（Ａｍｇｅｎ）は、ドメイン１に結合する。ＥＢ１０（ＩｍＣｌｏｎｅ）、公知のＦＬＴ３－リガンドブロッカーは、ドメイン３に結合する。ＦＬ６１（Ａｍｇｅｎ）もまた、ドメイン３に結合するが、ＦＬＴ３－リガンドブロッカーではない。４Ｇ８（Ｓｙｎｉｍｍｕｎｅ）は、ドメイン４に結合する。ＮＣ７（Ｉｍｃｌｏｎｅ）は、ドメイン５に結合する。これらの参照抗体のＶＨおよびＶＬ配列は、表１１に提供される。
Figure 2022551969000049
ハイブリドーマのうち５つ、すなわち、４Ａ４、１１Ｆ４、１Ａ２、４Ｈ２および１３Ｃ９から産生された抗体は、参照抗体のいずれかと、ｈＦＬＴ３－Ｈｉｓへの結合について競合しなかったということが観察された。カニクイザルＦＬＴ３（ｃＦＬＴ３）との交差反応性を、抗体の、ｃＦＬＴ３を発現する同質遺伝子のＲＭＡ細胞への結合を測定することによって評価した。
手短には、ＲＭＡ細胞に、ｃＦＬＴ３またはヒトＦＬＴ３（ｈＦＬＴ３）をコードするレトロウイルスベクターを形質導入した。粗ハイブリドーマ回収物由来のα－ＦＬＴ３ ｍＡｂの、ｈＦＬＴ３またはｃＦＬＴ３同質遺伝子細胞株ならびにＦＬＴ３＋がん細胞株への結合を、以下のとおりに実施した。９６ウェル丸底プレートのウェルあたり１００，０００個のＲＭＡ、ＲＥＨまたはＳＥＭ細胞を添加した。細胞を遠心沈殿させ、ボルテックス処理によってペレットを穏やかに分離した。ウェルあたり５０μＬのＺｏｍｂｉｅ生存／死滅色素（ＰＢＳ＋１：２０００色素）を添加し、室温、暗所で２０分間インキュベートした。２００μＬのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ）を用いて細胞を洗浄した。洗浄した細胞に５０μＬのハイブリドーマ上清を添加し、混合物を暗所、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、次いで、５０μＬの抗マウスＦｃ－ＰＥ二次試薬（１：２００希釈）を添加し、暗所、氷上で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、５０μＬの４％パラホルムアルデヒドを用いて、氷上で１５分間固定した。細胞を再度洗浄し、次いで、２００μＬのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、獲得のための準備ができるまで４℃で保存した。試料をＨＴＳ（ハイスループットサンプラー）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａで流した。
ハイブリドーマ上清の、ＲＥＨがん細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－８２８６）、ＦＬＴ３を発現すると報告されたヒトＡＬＬ細胞株に対する結合親和性も測定した。表１２に示されるように、クローンのほとんどは、ｈＦＬＴ３を発現するがん細胞に対する結合親和性およびｃＦＬＴ３との交差反応性を示した。１４Ａ５および１５Ａ１１のカニクイザルＦＬＴ３結合データは収集しなかった。
Figure 2022551969000050
［実施例２］
精製抗ＦＬＴ３マウス抗体の分析
実施例１に記載された分析に基づいて、サブクローニングおよびシーケンシングのために８つのハイブリドーマ（４Ａ４、１１Ｆ４、１２Ｈ１０、１５Ａ１１、１２Ｃ０９、１Ａ２、１４Ａ５、４Ｈ２）を選択した。各親ハイブリドーマから２つのサブクローンを生成し、分析した。各ハイブリドーマから得た配列を、ユニークであると決定した。ハイブリドーマ培養物から各サブクローンを精製し、ｈＦＬＴ３－Ｈｉｓへの結合を図１９に示されるようにＳＰＲによって確認した。ｈＦＬＴ３の、精製マウスサブクローニングｍＡｂへの動態定数および結合親和性は、表１３に示されている。参照抗体を用いるビニングは、実施例１に記載される方法を使用して実施し、４つの抗体、すなわち、４Ａ４．Ａ３、１１Ｆ４．Ｂ９、１Ａ２．Ａ３および４Ｈ２．Ｅ３は、ｈＦＬＴ３－Ｈｉｓへの結合について参照抗体のいずれとも競合しなかった。
Figure 2022551969000051
同質遺伝子のヒトおよびカニクイザルＦＬＴ３発現性ＲＭＡ細胞株を用いて、精製サブクローニングｍＡｂの細胞結合を実施した。１２Ｃ９．Ｅ５を除くすべてのクローンが、細胞表面に発現されたヒトおよびカニクイザルＦＬＴ３に結合した（表１４）。同様に、すべてのサブクローンが、高親和性でＳＥＭ（ＤＳＭＺカタログ番号ＡＣＣ ５４６）、ＦＬＴ３を発現すると報告されたヒトＡＬＬ細胞株に結合した。
Figure 2022551969000052
［実施例３］
選択された抗ＦＬＴ３マウス抗体のリガンド遮断特性
この実施例は、選択された抗ＦＬＴ３マウス抗体の、ＦＬＴ３－リガンドとのＦＬＴ３相互作用を遮断する能力を特徴づけるために設計された実験を説明する。α－ＦＬＴ３ ｍＡｂの、ＦＬＴ３発現性ＥＯＬ－１がん細胞（ＤＳＭＺカタログ番号ＡＣＣ ３８６）に結合する能力を、飽和濃度の可溶性ＦＬＴ３－リガンドの添加の前後で試験した。各抗体について、そのリガンド遮断値のパーセンテージを、示されたＦＬＴ３－リガンドの不在下で得られたものに対する、ＦＬＴ３－リガンドの存在下において得られたｍＡｂ結合シグナルの減少として算出した。公知のＦＬＴ３－リガンド遮断薬ＥＢ１０ ｍＡｂを陽性対照として使用した。図２０に示されるように、１２Ｈ１０．Ｇ７、１１Ｆ４．Ｂ９および４Ａ４．Ａ３、１４Ａ５．Ｅ８抗体は、ＦＬＴ３の、ＦＬＴ３－リガンドへの結合を干渉しなかったが、１５Ａ１１．Ｃ８抗体は、ＦＬＴ３－リガンドの、ＦＬＴ３への結合を遮断した。
［実施例４］
推定配列傾向分析
この実施例は、１２Ｈ１０．Ｇ７、１１Ｆ４．Ｂ９および４Ａ４．Ａ３、１４Ａ５．Ｅ８抗体のＣＤＲ（Ｃｈｏｔｈｉａの下で同定された）における潜在的な配列傾向を調べるために設計された実験を説明する。以下の潜在的傾向が考慮された：Ｍ（潜在的酸化部位）；ＮＧ、ＮＳおよびＮＴ配列モチーフ（潜在的脱アミド化部位）；ＤＧ、ＤＳおよびＤＴ配列モチーフ（潜在的異性化部位）；ＤＰ配列モチーフ（化学的加水分解の潜在的部位）。結果は、表１５にまとめられている。
Figure 2022551969000053
さらに、Ｋａｂａｔ下で１２Ｈ１０．Ｇ７のＣＤＲＨ１内に入るＭ３４での推定配列傾向も、同定した。これらの抗体の変異体は、推定配列傾向モチーフを除去するように設計した。
［実施例５］
ヒト化および親和性成熟
組換えｈＦＬＴ３タンパク質の動態学および親和性、ヒトおよびカニクイザルＦＬＴ３を発現する細胞株への結合、種々のＡＭＬおよびＡＬＬがん細胞への結合、ビニングプロファイルならびにヒトＦＬＴ３－リガンド結合を阻害しないことに関して収集されたデータに基づいて、４つのマウスハイブリドーマサブクローン、すなわち、１２Ｈ１０．Ｇ７、１１Ｆ４．Ｂ９、４Ａ４．Ａ３および１４Ａ５．Ｅ８をヒト化のために選択した。４Ａ４．Ａ３および１４Ａ５．Ｅ８は、１２Ｈ１０．Ｇ７および１１Ｆ４．Ｂ９よりも、ｈＦＬＴ３に対してわずかに低い親和性を示したが、これらの抗体は、それぞれユニークなエピトープ（参照抗体と交差遮断しない）およびＦＬＴ３のドメイン１に結合すると思われ、したがって、それぞれエピトープ多様性の調査のためにさらに分析した。
１２Ｈ１０．Ｇ７抗体をヒト化して、上記に記載されるＧＢ９４およびＧＢ１０２を作出し、それらは、同一ＶＨおよびＶＬ配列を共有していた。フレームワーク領域中に逆突然変異を導入して、変異体ＧＢ８７～ＧＢ９３およびＧＢ９５～ＧＢ１０１を作出した。
１１Ｆ４．Ｂ９抗体をヒト化して、上記に記載される１１５３および１１５４を作出し、それらは、同一ＶＨおよびＶＬ配列を共有していた。フレームワーク領域中に逆突然変異を導入して、変異体１１５１および１１５２を作出した。１１５３抗体はまた、親和性成熟に付した。手短には、１５５３ ＦＬＴ３ ｓｃＦｖのＣＤＲに焦点を当てたライブラリーを設計し、酵母の表面にディスプレイした。酵母をビオチン化ヒトＦＬＴ３－Ｈｉｓ抗原とともにインキュベートすることによってＦＡＣＳ選択を２回実施した。ＦＡＣＳ濃縮されたアウトプット試料を、追加のＣＤＲ突然変異体と組み合わせて、第２のライブラリーを作製した。１００ｎＭ～１ｎＭのビオチン化ヒトＦＬＴ３－Ｈｉｓを用いて滴定することによって２ラウンドの追加のＦＡＣＳ選択を実施した。１０ｎＭで選別を実施し、ライブラリーについて、親と比較してシグナルの明確な増加が観察された。選別された酵母クローンをプレーティングし、スクリーニングした。
［実施例６］
細胞によって発現されたヒトがん抗原へのＴｒｉＮＫＥＴ結合の評価
ヒトおよびカニクイザルＦＬＴ３を異所性に発現する同質遺伝子細胞株を使用して、ヒトおよびカニクイザルＦＬＴ３間の交差反応性を評価した。ｈＦＬＴ３またはｃＦＬＴ３を発現するヒトがん細胞株ＲＭＡを使用して、ＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴおよび親ｍＡｂの腫瘍抗原結合を評価した。ヒトＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ－１３およびＭＶ４－１１およびヒトＡＬＬ細胞株ＲＥＨを使用して、ＴｒｉＮＫＥＴまたは親ｍＡｂの結合能を評価した。特に、それぞれＦＬＴ３－Ｔ２２７ＭおよびＦＬＴ３－ＩＴＤを発現したＭＯＬＭ－１３細胞およびＭＶ４－１１細胞を使用して、ＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴおよび親ｍＡｂの、突然変異体ＦＬＴ３に結合する能力を評価した。
ヒトＩｇＧ１形式の、１１５８ ｍＡｂとも呼ばれる、ＧＢ１０２モノクローナル抗体および上記に記載される、Ｆ３’－１１５８とも呼ばれる、その対応するＴｒｉＮＫＥＴ Ｆ３’－ＧＢ１０２を希釈し、それぞれの細胞とともにインキュベートした。次いで、細胞をフルオロフォアがコンジュゲートしている抗ヒトＩｇＧ二次抗体とともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を二次抗体のみの対照に対して正規化して、バックグラウンドを上回る倍数（ＦＯＢ）値を得た。
図２１Ａおよび図２１Ｂに示されるように、Ｆ３’－１１５８および１１５８ ｍＡｂは各々、同等の効力でヒトおよびカニクイザルＦＬＴ３を異所性に発現するＲＭＡ細胞に結合した。図２１Ｃに示されるように、Ｆ３’－１１５８および１１５８ ｍＡｂは、ヒトＡＬＬ細胞であるＲＥＨ細胞に結合した。図２２Ａおよび２２Ｂに示されるように、Ｆ３’－１１５８および１１５８ ｍＡｂは各々、それぞれＦＬＴ３－Ｔ２２７ＭおよびＦＬＴ３－ＩＴＤを発現したＭＯＬＭ－１３細胞およびＭＶ４－１１細胞に結合した。
［実施例７］
ＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂ内部移行の評価
好酸球性白血病に由来するＥＯＬ－１ヒトがん細胞株を使用して、Ｆ３’－１１５８または１１５８ ｍＡｂとともにインキュベーションした後のＦＬＴ３の内部移行を評価した。２連のＥＯＬ－１細胞プレートを、Ｆ３’－１１５８、１１５８ ｍＡｂまたはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体とともに３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、非競合抗ＦＬＴ３抗体を使用して総ＦＬＴ３を染色した。ＦＬＴ３の内部移行は以下のとおりに算出した：
内部移行％＝（１－（試料ＭＦＩ ２時間／ｈＩｇＧ１アイソタイプＭＦＩ ２時間））×１００％
図２３Ａ～２３Ｂは、ＲＥＨ（図２３Ａ）およびＥＯＬ－１（図２３Ｂ）におけるＦ３’－１１５８および１１５８ ｍＡｂとともにインキュベートした後のＦＬＴ３の内部移行を示す。親ｍＡｂは、ＦＬＴ３の１０％未満の内部移行を誘導したが、ＦＬＴ３によって標的化されたＴｒｉＮＫＥＴは、ＦＬＴ３の５％未満の内部移行を誘導した。
［実施例８］
一次ヒトＮＫ細胞細胞傷害性アッセイ
標的細胞の溶解を、ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイによって測定した。手短には、ＦＬＴ３を発現するヒトがん細胞株を培養物から回収し、ＨＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ１３６－１００）で標識するために成長培地に１０６／ｍＬで再懸濁した。標的細胞の標識のために製造業者の使用説明書に従った。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、０．５～１．０×１０５／ｍＬで培養培地に再懸濁した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識された細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＦＬＴ３に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地で希釈し、５０μｌの希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを、各ウェルに添加した。
ＮＫ細胞を調製するために、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートからＰＢＭＣを単離し、洗浄し、ＮＫ細胞単離のために調製した。磁性ビーズを用いる陰性選択技術を使用してＮＫ細胞を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は、通常、＞９０％のＣＤ３－ＣＤ５６＋であった。単離されたＮＫ細胞を一晩休止させ、培養物から回収した。次いで、細胞を洗浄し、５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比のために、培養培地に１０５～２．０×１０６／ｍＬの濃度で再懸濁した。合計２００μｌの培養物容量のために、プレートの各ウェルに５０μｌのＮＫ細胞を添加した。プレートを３７℃で５％ ＣＯ２とともに２～３時間インキュベートした。
インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、２００×ｇで５分間の遠心分離によって細胞をペレットにした。２０μｌの培養上清を、清潔なマイクロプレートに移し、各ウェルに２００μｌの室温ユウロピウム溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ１３５－１００）を添加した。プレートを光から保護し、２５０ｒｐｍで１５分間、プレートシェーカー上でインキュベートし、次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘ機器を使用して読み取った。
ＮＫ細胞の不在下でインキュベートされた標的細胞において、ユウロピウムと蛍光キレートを形成できる物質の自然放出が測定された。このような物質の最大放出は、１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを用いて溶解された標的細胞において測定された。比溶解％は以下のとおりに算出した：
比溶解％＝（（実験による放出－自然放出）／（最大放出－自然放出））＊１００％．
図２４Ａ～２４Ｄは、ヒトＡＭＬまたはＡＬＬ細胞株ＥＯＬ－１（図２４Ａ）、Ｒｅｈ（図２４Ｂ）、ＲＳ４－１１（図２４Ｃ）およびＭＶ４－１１（図２４Ｄ）の一次ＮＫ細胞媒介性死滅の増強におけるＦ３’－１１５８または１１５８ ｍＡｂの活性を示す。Ｆ３’－１１５８は、その親ｍＡｂ １１５８ ｍＡｂと比較してより強力な死滅を実証した。
ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位およびＦｃのエフェクター機能が、Ｆ３’－１１５８の細胞傷害性に寄与したか否かを評価するために、２種のＴｒｉＮＫＥＴ変異体を構築した。第１の変異体は、ＮＫＧ２Ｄに結合するＡ４９抗原結合部位の軽鎖可変ドメイン中に突然変異を含有する。結果として、この変異体は、ヒトＮＫＧ２Ｄに結合しない。突然変異体軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列はDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASNSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSTKSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDDLPTFGGGTKVEIK（配列番号３０５）である。この第１の変異体のアミノ酸配列は、そうでなければＦ３’－１１５８のものと同一である。第２の変異体は、Ｆｃドメイン中に突然変異を含有する。具体的には、Ｆｃドメインの各ポリペプチド鎖は、ＦｃのＦｃγ受容体への結合を低減すると報告されたＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ置換（ＥＵ番号付けシステムの下で番号付けられた）を含有する。この第２の変異体のアミノ酸配列は、そうでなければＦ３’－１１５８のものと同一である。
これらの変異体の、標的細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を誘導する能力を、上記のＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイを使用して評価した。図２５に示されるように、ＮＫＧ２Ｄ標的化ドメイン中の、およびＦｃドメイン中の突然変異は、細胞傷害性を実質的に低減した。この結果は、ＮＫＧ２Ｄへの結合およびＦｃγ受容体への結合は両方とも、Ｆ３’－１１５８の細胞傷害性活性に寄与したことを示唆した。
［実施例９］
一次ヒトＴ細胞細胞傷害性アッセイ
標的細胞の溶解は、免疫エフェクター細胞としてＣＤ８＋Ｔ細胞が使用された点を除いて実施例８に記載されるＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイによって測定した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は以下のとおりに調製した：ヒトＰＢＭＣを、ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐおよびＳｅｐＭａｔｅ ５０を用いる密度勾配遠心分離を、製造業者の使用説明書に従って使用してヒト末梢血バフィーコートから単離した。単離されたＰＢＭＣを、培養培地において１μｇ／ｍＬのＣｏｎＡ（ＩＬ－２培養サプリメント）を用いて３７℃で１８時間刺激した。次いで、ＣｏｎＡを除去し、ＰＢＭＣを２５ユニット／ｍＬのＩＬ－２とともに３７℃で４日間培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁性ビーズを用いる陰性選択技術（ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット）を、製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含有する培地で３７℃で６～１３日間培養し、その後、細胞溶解アッセイにおいて使用した。
図２６に示されるように、Ｆ３’－１１５８は、ＣＤ８Ｔ細胞の、ＲＳ４－１１標的細胞を溶解する能力を有意に増強したが、１１５８ ｍＡｂはそうではなかった。Ｆ３’－１１５８は、ＲＳ４－１１細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性溶解を用量依存性に増大した。
［実施例１０］
全ヒト血液へのＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂ結合の評価
Ｆ３’－１１５８および１１５８ ｍＡｂの、種々の種類の血液細胞に結合する能力を評価した。手短には、ヒト全血を、Ｆ３’－１１５８、１１５８ ｍＡｂまたはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体とともにインキュベートした。血液細胞をフローサイトメトリーによって分析し、Ｆ３’－１１５８、１１５８ ｍＡｂまたはアイソタイプ対照抗体の結合を、フルオロフォアがコンジュゲートしている抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。
図２７に示されるように、Ｆ３’－１１５８および１１５８ ｍＡｂは、血液中の顆粒球、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞に対して有意な結合を示さなかった。
［実施例１１］
ＦＬＴ３シグナル伝達の活性化
ＦＬＴ３のリン酸化、ＦＬＴ３シグナル伝達のマーカーを、ｐＦＬＴ３ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＹＣ３６８）によって測定した。ＥＯＬ－１細胞を、９６ウェル丸底プレートにプレーティングした。Ｆ３’－１１５８、１１５８ ｍＡｂおよび／またはＦＬＴ３Ｌを添加した。試料を室温で５分間インキュベートし、３００×ｇで５分間直ちにペレットにした。細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを、２００μＬの溶解バッファー９番に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。試料を２０００×ｇで５分間ペレットにし、上清を清潔な試験管に移した。ＢＣＡ総タンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を定量化した。試料を、必要に応じてＩＣ希釈剤１２番に希釈した。溶解物を、製造業者の使用説明書に従って測定した。導かれた標準曲線からの値の内挿によって、各試料においてｐＦＬＴ３濃度を決定した。既知標準の光学濃度値を、そのそれぞれの濃度に対してプロットし、データを線形回帰モデルに適合させた。
図２８Ａに示されるように、ＦＬＴ３Ｌは、ｐＦＬＴ３レベルの３倍の増大につながったが、Ｆ３’－１１５８および１１５８ ｍＡｂは、有意なＦＬＴ３リン酸化を誘導しなかった。図２８Ｂは、細胞がＦＬＴ３Ｌと組み合わせてＦ３’－１１５８または１１５８ ｍＡｂとともにインキュベートされた場合に、Ｆ３’－１１５８も１１５８ ｍＡｂもＦＬＴ３Ｌ誘導性ＦＬＴ３リン酸化を阻害しなかったことを示す。これらの結果は、１１５８ ｍＡｂがＦＬＴ３に結合することについてＦＬＴ３Ｌと競合しなかったという観察結果と一致した。
参照による組み込み
反対の記載がない限り、本明細書で参照される各特許文書および科学論文の全開示内容は、すべての目的のために参照により組み込まれる。
等価物
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具体化できる。したがって、前述の実施形態は、本明細書において記載される本発明を制限するものではなく、すべての点で例示的と考えられるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および同等の範囲内にあるすべての変更が、本明細書に包含されるように意図される。
配列表
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Figure 2022551969000055
Figure 2022551969000056
Figure 2022551969000057
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Claims (66)

  1. （ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位、
    （ｂ）ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位、および
    （ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位
    を含むタンパク質であって、
    ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位は、
    （ｉ）それぞれ配列番号１１、４および５５のアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ならびにそれぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
    （ｉｉ）それぞれ配列番号５９、６３および５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号８６、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （ｉｉｉ）それぞれ配列番号８７、８８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号９１、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （ｉｖ）それぞれ配列番号９７、９９および１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１０１、１０２および１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （ｖ）それぞれ配列番号８７、９８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１０６、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （ｖｉ）それぞれ配列番号１０９、１１０および１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１１２、１１３および１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （ｖｉｉ）それぞれ配列番号１１７、１１８および１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１２０、１２１および１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号８７、９８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１０６、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （ｉｘ）それぞれ配列番号６２、３３および１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１２８、１２９および１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、または
    （ｘ）それぞれ配列番号１３２、１３３および１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号６５、６６および４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ
    を含む、タンパク質。
  2. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号１１、４および５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  3. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号１１、４および５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項２に記載のタンパク質。
  4. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号１１、４および５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項２に記載のタンパク質。
  5. ＶＨが、配列番号３７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号３８に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２から４のいずれか一項に記載のタンパク質。
  6. ＶＨが、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号４２のアミノ酸配列を含む、請求項２から５のいずれか一項に記載のタンパク質。
  7. ＶＨおよびＶＬが、それぞれ配列番号９および１０、１３および１０、１７および１０、９および２２、９および２６、９および３０、９および３４、３７および３８、４１および４２、４５および４２または４９および４２のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のタンパク質。
  8. 第２の抗原結合部位が、一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）として存在し、ｓｃＦｖが、配列番号３、１２、１５、１６、１９、２０、２３、２４、２７、２８、３１、３２、３５、３６、３９、４０、４３、４４、４７、４８、５１および５２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２から７のいずれか一項に記載のタンパク質。
  9. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号５９、６３および５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号８６、６６および６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  10. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号７８、６３、７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号８０、６６、６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項９に記載のタンパク質。
  11. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号６２、６３、６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号６５、６６、６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項９に記載のタンパク質。
  12. ＶＨが、配列番号７６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号７７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
  13. ＶＨが、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号８４のアミノ酸配列を含む、請求項９から１２のいずれか一項に記載のタンパク質。
  14. ＶＨおよびＶＬが、それぞれ配列番号６８および６９、７２および７３または７６および７７のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のタンパク質。
  15. 第２の抗原結合部位が、ｓｃＦｖとして存在し、ｓｃＦｖが、配列番号７０、７１、７４、７５、８１および８２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９から１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
  16. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号８７、８８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号９１、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  17. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号９７、９９および１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１０１、１０２および１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  18. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号８７、９８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１０６、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  19. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号１０９、１１０および１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１１２、１１３および１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  20. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号１１７、１１８および１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１２０、１２１および１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  21. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号８７、９８および８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１０６、９２および９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  22. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号６２、３３および１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号１２８、１２９および１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  23. ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、それぞれ配列番号１３２、１３３および１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号６５、６６および４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  24. 第２の抗原結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される２０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でヒトＦＬＴ３に結合する、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  25. 第２の抗原結合部位が、ＳＰＲによって測定される１０ｎＭ以下のＫＤでヒトＦＬＴ３に結合する、請求項２から８、１６、１７および２１のいずれか一項に記載のタンパク質。
  26. 配列番号３１８のアミノ酸配列を含むヒトＦＬＴ３変異体に結合する、請求項２から８のいずれか一項に記載の抗原結合部位。
  27. 配列番号３１９のアミノ酸配列を含むヒトＦＬＴ３変異体に結合する、請求項２から８のいずれか一項に記載の抗原結合部位。
  28. 抗原結合部位が、カニクイザルＦＬＴ３に結合する、請求項２から２１および２３から２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
  29. 抗原結合部位が、ＦＬＴ３への結合についてＦＬＴ３Ｌと競合しない、請求項２から２０および２２から２８のいずれか一項に記載のタンパク質。
  30. ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインまたはその一部分を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  31. ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、Ｆａｂ断片であり、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、ｓｃＦｖである、請求項１から３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
  32. ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、ｓｃＦｖであり、ＦＬＴ３に結合する第２の抗原結合部位が、Ｆａｂ断片である、請求項１から３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
  33. ＦＬＴ３に結合する追加の抗原結合部位をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  34. ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、ｓｃＦｖであり、ＦＬＴ３に結合する第２のおよび追加の抗原結合部位が、各々Ｆａｂ断片である、請求項１から３０および３２から３３のいずれか一項に記載のタンパク質。
  35. ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、ｓｃＦｖであり、ＦＬＴ３に結合する第２のおよび追加の抗原結合部位が、各々ｓｃＦｖである、請求項１から３０および３３のいずれか一項に記載のタンパク質。
  36. ＦＬＴ３に結合するｓｃＦｖおよび／またはＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖが、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項３１、３２、３４または３５に記載のタンパク質。
  37. ｓｃＦｖが、Ａｌａ－ＳｅｒまたはＧｌｙ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその一部分に連結される、請求項３６に記載のタンパク質。
  38. ヒンジが、アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む、請求項３７に記載のタンパク質。
  39. ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインが、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、請求項３６から３８のいずれか一項に記載のタンパク質。
  40. ジスルフィド架橋が、Ｋａｂａｔ番号付けスキームの下で番号付けられた、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ１００の間に形成される、請求項３９に記載のタンパク質。
  41. ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインが、可動性リンカーを介してｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインに連結される、請求項３６から４０のいずれか一項に記載のタンパク質。
  42. 可動性リンカーが、（Ｇ４Ｓ）４を含む、請求項４１に記載のタンパク質。
  43. ｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインが、軽鎖可変ドメインのＣ末端に配置される、請求項３６から４２のいずれか一項に記載のタンパク質。
  44. ｓｃＦｖ内で、重鎖可変ドメインが、軽鎖可変ドメインのＮ末端に配置される、請求項３６から４２のいずれか一項に記載のタンパク質。
  45. Ｆａｂが、抗原結合部位とＦｃまたはその一部分との間に配置されない、請求項３１から３４および３６から４４のいずれか一項に記載のタンパク質。
  46. ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、それぞれ配列番号２４０または２４１、２４２および２７０または２７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  47. ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が、
    （ｉ）それぞれ配列番号２４０もしくは２４１、２４２および２５５もしくは２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ、または
    （ｉｉ）それぞれ配列番号２４０もしくは２４１、２４２および２４３もしくは２４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨならびにそれぞれ配列番号２７６、２３６および２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＬ
    を含む、請求項４６に記載のタンパク質。
  48. 第１の抗原結合部位のＶＨが、配列番号２５４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部位のＶＬが、配列番号２３９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４６または４７に記載のタンパク質。
  49. 第１の抗原結合部位のＶＨが、配列番号２５４のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部位のＶＬが、配列番号２３９のアミノ酸配列を含む、請求項４６から４８のいずれか一項に記載のタンパク質。
  50. 抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインである、前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
  51. 抗体Ｆｃドメインまたはその一部分が、配列番号１３６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５０に記載のタンパク質。
  52. 抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１つまたは複数の位置に、配列番号１３６に対する１つまたは複数の突然変異を含む、請求項５０または５１に記載のタンパク質。
  53. 抗体Ｆｃドメインの少なくとも１つのポリペプチド鎖が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅから選択される、配列番号１３６に対する１つまたは複数の突然変異を含む、請求項５０から５２のいずれか一項に記載のタンパク質。
  54. 抗体重鎖定常領域の一方のポリペプチド鎖が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１つまたは複数の位置に、配列番号１３６に対する１つまたは複数の突然変異を含み、抗体重鎖定常領域の他方のポリペプチド鎖が、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９から選択される１つまたは複数の位置に、配列番号１３６に対する１つまたは複数の突然変異を含む、請求項５０から５３のいずれか一項に記載のタンパク質。
  55. 抗体重鎖定常領域の一方のポリペプチド鎖が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、配列番号１３６に対するＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含み、抗体重鎖定常領域の他方のポリペプチド鎖が、配列番号１３６に対するＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含む、請求項５４に記載のタンパク質。
  56. 抗体重鎖定常領域の一方のポリペプチド鎖が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、配列番号１３６に対するＹ３４９Ｃ置換を含み、抗体重鎖定常領域の他方のポリペプチド鎖が、配列番号１３６に対するＳ３５４Ｃ置換を含む、請求項５４または５５に記載のタンパク質。
  57. （ａ）配列番号２７８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、
    （ｂ）配列番号２７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、ならびに
    （ｃ）配列番号２７７、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８および２８９から選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
    を含むタンパク質。
  58. （ａ）配列番号２８０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、
    （ｂ）配列番号２８１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、および
    （ｃ）配列番号２８２のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
    を含むタンパク質。
  59. 前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  60. 請求項１から５８のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞。
  61. 腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍細胞およびナチュラルキラー細胞を、請求項１から５８のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項５９に記載の医薬組成物の有効量に曝露することを含む、方法。
  62. がんを処置する方法であって、請求項１から５８のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項５９に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
  63. がんが、血液悪性腫瘍である、請求項６２に記載の方法。
  64. 血液悪性腫瘍が、白血病である、請求項６３に記載の方法。
  65. 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成、急性Ｔリンパ性白血病および急性前骨髄球性白血病からなる群から選択される、請求項６３または６４に記載の方法。
  66. がんが、ＦＬＴ３を発現する、請求項６２から６５のいずれか一項に記載の方法。
JP2022522657A 2019-10-15 2020-10-14 Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６およびｆｌｔ３に結合するタンパク質 Pending JP2022551969A (ja)

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