BR112020015568A2

BR112020015568A2 - Agonista de 4-1bb (cd137), produto farmacêutico, composição farmacêutica, uso de uma combinação de um agonista de 4-1bb e método para tratar ou retardar a progressão do câncer

Info

Publication number: BR112020015568A2
Application number: BR112020015568-3A
Authority: BR
Inventors: Claudia Ferrara Koller; Christian Klein; Johannes Sam; Pablo Umaña; Wei Xu
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2019-03-11
Publication date: 2020-12-29
Also published as: TWI828662B; IL277174A; JP2021515782A; AU2019236372B2; CA3092002A1; US20210163617A1; KR20200132913A; TW202003552A; WO2019175071A1; EP3765489A1; JP7159332B2; AU2019236372A1; MX2020009468A; CN111683961A

Abstract

a presente invenção refere-se a terapias combinadas que empregam um agonista de 4-1bb, compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em combinação com anticorpos específicos que se ligam ao cd20 humano, e ao uso de tais terapias combinadas no tratamento do câncer.

Description

“AGONISTA DE 4-1BB (CD137), PRODUTO FARMACÊUTICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UMA COMBINAÇÃO DE UM AGONISTA DE 4-1BB E MÉTODO PARA TRATAR OU RETARDAR A PROGRESSÃO DO CÂNCER”

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção diz respeito a terapias combinadas que empregam um agonista de 4-1BB (CD137), compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular, uma molécula de ligação ao antígeno 4-1BBL direcionada ao CD19, e anticorpos específicos que se ligam ao CD20 humano, ao uso de tais terapias combinadas para o tratamento do câncer e métodos de uso das terapias combinadas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os distúrbios proliferativos de células B descrevem um grupo heterogêneo de neoplasias que inclui leucemias e linfomas. Os linfomas se desenvolvem a partir de células linfáticas e compreendem duas categorias principais: linfomas de Hodgkin (HL) e linfomas não-Hodgkin (NHL). Nos Estados Unidos, os linfomas originados de células B constituem aproximadamente 80-85% de todos os casos de linfoma não-Hodgkin, e há considerável heterogeneidade no subconjunto de células B, com base em padrões de expressão genotípicos e fenotípicos na célula B de origem. Por exemplo, os subconjuntos de linfoma de células B incluem doenças incuráveis e indolentes de crescimento lento, como linfoma folicular (FL) ou leucemia linfocítica crônica (CLL), bem como os subtipos mais agressivos, como o linfoma de células do manto (MCL) e linfoma difuso de grandes células B (DLBCL). Apesar da disponibilidade de diversos agentes para o tratamento de distúrbios proliferativos de células B, existe a necessidade contínua do desenvolvimento de terapias seguras e eficazes para prolongar a remissão e melhorar as taxas de cura nos pacientes.

[003] Uma estratégia atualmente investigada é o envolvimento de células T contra células B malignas. A fim de envolver efetivamente as células T contra células B malignas, duas abordagens recentes foram desenvolvidas.

Essas duas abordagens são: 1) a administração de células T manipuladas ex vivo para reconhecer células tumorais (também conhecida como terapia com células T modificadas com receptor de antígeno quimérico ou células CAR-T) (Maude et al., N Engl J Med (2014)) 371,1507-1517); e 2) a administração de agentes que ativam células T endógenas, como anticorpos biespecíficos (Oak e Bartlett, Expert Opin Investig Drugs (2015) 24, 715-724). Um exemplo da primeira abordagem foi divulgado no estudo de Maude et al., no qual 30 pacientes adultos e pediátricos foram tratados com células T autólogas transduzidas com um vetor lentiviral com o receptor de antígeno quimérico de células T direcionadas contra CD19 (células CTL019 CAR-T). O resultado foi uma remissão prolongada com base em uma taxa de sobrevida sem eventos em 6 meses de 67% e uma taxa de sobrevida global de 78%. Entretanto, todos os pacientes apresentavam síndrome de liberação de citocinas (CRS - Cytokine Release Syndrome) (associada à carga tumoral), com 27% dos pacientes possuindo CRS grave. Também foram observadas altas frequências de toxicidades do sistema nervoso central de causa desconhecida. A segunda abordagem, que envolve a ativação de células T endógenas para reconhecer alvos tumorais, contorna esse obstáculo de escalabilidade e também pode fornecer eficácia competitiva, dados de segurança e respostas com durações potencialmente de longo prazo. Em diferentes neoplasias hematológicas CD20+, essa abordagem é mais bem exemplificada pela terapia com blinatumomabe, uma molécula biespecífica de células T direcionada ao CD19 CD3 (Bargou et al., Science (2008) 321, 974-977) que foi recentemente aprovada para pacientes com leucemia linfocítica aguda (ALL) positivos para a doença residual mínima. Este composto, que é composto por dois fragmentos Fv de cadeia única (o então chamado formato BiTE ®), direciona a lise de células CD19+ pelas células T citolíticas. A principal restrição do blinatumomabe é sua meia-vida curta (aproximadamente 2 horas), que requer infusão contínua por bomba durante 4-8 semanas. Além disso, também foram observadas CRS graves e toxicidades do CNS de modo frequente (Klinger et al., Blood. 2012; 119 (26): 6226-6233). Em pacientes que receberam blinatumomabe em todos os ensaios clínicos, ocorreram toxicidades neurológicas em aproximadamente 50% dos pacientes, e os tipos de toxicidade observados estão bem definidos na bula.

[004] O 4-1BB (CD137), um membro da superfamília de receptores de TNF, foi identificado pela primeira vez como uma molécula induzível expressa por células T ativadas (Kwon e Weissman, Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86, 1963-1967). Estudos subsequentes demonstraram que muitas outras células imunológicas também expressam 4-1BB, incluindo células NK, células B, células NKT, monócitos, neutrófilos, mastócitos, células dendríticas (DCs) e células de origem não hematopoiética, como células endoteliais e musculares lisas (Vinay e Kwon, Cell Mol Immunol. (2011) 8, 281- 284). A expressão de 4-1BB em diferentes tipos de células é principalmente induzível e impulsionada por vários sinais estimuladores, tal como pela ativação do receptor de células T (TCR) ou receptor de célula B, bem como pela sinalização induzida por meio de moléculas coestimulatórias ou receptores de citocinas pró-inflamatórias (Diehl et al., J Immunol (2002) 168, 3755-3762; Zhang et al., J Immunol (2010) 184, 787-795).

[005] O ligante de 4-1BB (4-1BBL ou CD137L) foi identificado em 1993 (Goodwin et al., Eur J. Immunol. (1993) 23, 2631-2641). Foi demonstrado que a expressão de 4-1BBL era restrita às células apresentadoras de antígeno (APC) profissionais, como células B, DCs e macrófagos. A expressão induzível de 4-1BBL é característica de células T, incluindo os subconjuntos γδ de células T, e células endoteliais (revisto em Shao e Schwarz, J Leukoc Biol (2011) 89, 21-29).

[006] A coestimulação através do receptor 4-1BB (por exemplo, pela ligação de 4-1BBL) ativa várias cascatas de sinalização na célula T (subconjuntos CD4+ e CD8+), aumentando poderosamente a ativação das células T (Bartkowiak e Curran, Front Oncol (2015) 5, 117). Em combinação com a ativação do TCR, anticorpos agonistas específicos para 4-1BB aumentam a proliferação de células T, estimulam a secreção de linfocinas e diminuem a sensibilidade dos linfócitos T para as células de morte induzidas pela ativação (Snell L.M. et al. Immunol. Rev. (2011) 244, 197-217). Esse mecanismo foi ainda mais avançado como a primeira prova de conceito em imunoterapia contra o câncer. Em um modelo pré-clínico a administração de um anticorpo agonista contra 4-1BB em camundongos com tumor levou a potentes efeito antitumorais (Melero et al., Nature Med (1997) 3, 682-685).

Posteriormente, evidências acumuladas indicaram que 4-1BB geralmente exibe sua potência como agente antitumoral somente quando administrado em combinação com outros compostos imunomoduladores, reagentes quimioterápicos, vacinação tumor-específica ou radioterapia (Bartkowiak e Curran, Front Oncol (2015) 5, 117).

[007] A sinalização da superfamília de TNFR precisa de ligação cruzada dos ligantes trimerizados de interagir com os receptores, o mesmo acontece com anticorpos agonistas 4-1BB que requerem ligação de Fc tipo selvagem (Li e Ravetch, Science (2011) 333, 1030-1034). Entretanto, a administração sistêmica de anticorpos agonistas específicos para 4-1BB com o domínio Fc funcionalmente ativo resultou em um influxo de células T CD8 + associada com a toxicidade hepática (Dubrot et al., Cancer Immunol Immunother (2010) 59, 1223-1233), que é diminuída ou significativamente melhorada na ausência de receptores Fc funcionais em camundongos. Na clínica, um anticorpo (Ab) agonista de 4-1BB Fc-competente (BMS-663513) (NCT00612664) causou hepatite de grau 4 levando ao término do estudo clínico (Simeone e Ascierto, J. Immunotoxicol (2012) 9, 241-247). Portanto, há a necessidade de agonistas 4-1BB eficazes e mais seguros.

[008] Foram produzidas proteínas de fusão compostas de um domínio extracelular de um ligante de 4-1BB e um fragmento de anticorpo de cadeia única (Hornig et al., J Immunother (2012) 35, 418-429; Müller et al,. J Immunother (2008) 31, 714-722) ou um único ligante de 4-1BB fundido ao C- terminal de uma cadeia pesada (Zhang et al., Clin Cancer Res (2007) 13, 2758- 2767). O documento WO 2010/010051 descreve a geração de proteínas de fusão que consistem em três ectodomínios de ligantes TNF ligados entre si e fundidos a uma parte de anticorpo. Na presente invenção, as moléculas de ligação ao antígeno compostas por um ligante de 4-1BB trimérico e, portanto, biologicamente ativo, e um domínio de ligação ao antígeno específico para o antígeno tumoral CD19 e uma região Fc desprovida de ligação ao FcγR, são particularmente estáveis e robustas (denominadas no presente pedido como CD19-4-1BBL). Estas construções estão divulgadas no documento WO 2016/075278 e substituem a ligação cruzada inespecífica mediada por FcγR responsável pela toxicidade mediada por Fc, pela reticulação específica de células B que visam CD19.

[009] O CD19 é um alvo ideal para imunoterapia de malignidades de células B, uma vez que é expresso na superfície das células B e é quase que específico para essas células. O CD19 é expresso de maneira mais ampla do que o CD20 em células B durante o desenvolvimento da célula B, de modo que uma célula CD20 positiva também expressará CD19. Durante a diferenciação de células B em relação às células plasmáticas (células secretoras de anticorpos), as células B regulam negativamente a expressão de

CD20. Por vezes, os linfomas de células B também regulam negativamente a expressão de CD20, mas permanecem positivos para CD19. Portanto, o direcionamento para CD19 e CD20 cobriria amplamente as células B doentes nos linfomas, o que também pode desviar a pressão de seleção de CD20 para CD19 e CD20. Embora não se saiba se o CD19 contribui diretamente para a carcinogênese das células B, sua expressão é altamente conservada na maioria dos tumores de células B, como leucemias linfoblásticas agudas (LLA), leucemias linfocíticas crônicas (LLC) e linfomas de células B. Nas leucemias agudas, o CD19 é expresso de forma constante e contínua em quase todos os subtipos, enquanto apenas um pequeno número de leucemias expressa CD20.

[010] Portanto, ainda há a necessidade de novos compostos e combinações que tenham o potencial de contribuir significativamente para o tratamento de pacientes com distúrbios proliferativos de células B, tal como o NHL e a LLC. Verificou-se que um excelente efeito antitumoral é obtido quando a molécula de ligação ao antígeno 4-1BBL direcionada ao CD19 é combinada com anticorpos específicos que se ligam ao CD20 humano. Assim, descrevemos aqui uma nova terapia combinada para o câncer com malignidade de células B.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[011] A presente invenção refere-se a um agonista de 4-1BB (CD137), compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL, e seu uso em combinação com anticorpos que se ligam ao CD20 humano, particularmente o rituximabe ou obinutuzumabe, em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, mais particularmente para tratar ou retardar a progressão de distúrbios proliferativos de células B. Verificou-se que a terapia combinada descrita na presente invenção é mais eficaz na inibição do crescimento tumoral e na eliminação de células tumorais do que o tratamento apenas com anticorpos anti-CD20.

[012] Em um aspecto, a invenção provê o agonista de 4-1BB (CD137) para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um anticorpo anti-CD20, e em que o agonista de 4-1BB compreende pelo menos um domínio de ligação a um antígeno capaz de ligar-se especificamente um antígeno associado a tumor, em particular o agonista de 4-1BB compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou os seus fragmentos e, pelo menos, um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar de maneira específica a um antígeno associado a tumor.

[013] Em particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19. Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc. Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo um domínio Fc com modificações que reduzem ou preferencialmente eliminam a ligação ao receptor Fcγ e/ou a função efetora.

[014] Em um aspecto, o agonista de 4-1BB e o anticorpo anti- CD20 são administrados concomitantemente ou simultaneamente. Em um aspecto adicional, é fornecido um agonista de 4-1BB usado em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, em que o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente ao CD19 e o anticorpo anti-CD20 são administrados em conjunto em uma única composição ou eles são administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

[015] Em um aspecto, a invenção fornece um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-

se especificamente a um antígeno associado a tumor para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos. Em um aspecto adicional, é fornecido um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula compreendendo três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5. Mais particularmente, os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[016] Em um aspecto, a invenção provê o agonista de 4-1BB (CD137) para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um anticorpo anti-CD20 e em que o agonista de 4-1BB compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CD19.

[017] Em um aspecto, a molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a CD19 e três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos não serão internalizados pelas células B que expressam CD19. Em outro aspecto, é fornecido um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao CD19 e três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende; (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (V LCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

20.

[018] Em um aspecto particular, é fornecido um agonista de 4- 1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 e três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos, em que o domínio de ligação a antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo um aminoácido sequência da SEQ ID NO: 23 e uma região variável da cadeia leve (VLCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. Em um aspecto particular, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

24.

[019] Em outro aspecto, é fornecido um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente ao CD19 é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável. Em particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, especificamente um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4. De modo mais específico, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ou a função efetora. Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB compreende um domínio Fc de IgG1 compreendendo as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G.

[020] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende; (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[021] Em outro aspecto, a invenção provê um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo; (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19; e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo fato de que (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CL e o segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto entre os domínios CH1 e CL, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BB ou fragmentos destes, que estão ligados uns aos outros e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-

1BB ou um fragmento deste ligado por um ligante peptídico ao domínio CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou

(ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3,

respectivamente, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BB ou fragmentos destes que estão ligados entre si e com a extremidade C-

terminal do domínio CH3 por um ligante peptídico, e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por meio de um ligante peptídico ao C-terminal do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou

(iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL-

CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou VH-CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto entre o domínio CH1 e CL, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-

1BB ou fragmentos destes, que estão ligados uns aos outros e ao domínio VH ou VL por um ligante peptídico, e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[022] Em um aspecto, é fornecido um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo; (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32; e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[023] Em um aspecto específico, é fornecido um agonista de 4- 1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em;

a) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

33, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

35 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36;

b) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

37 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38;

c) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

34, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 40;

d) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

33, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42;

e) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44;

f) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

34, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 46;

g) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

47, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

h) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

i) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; j) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; k) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; e l) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[024] Em outro aspecto, a invenção provê um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo; (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um polipeptídeo compreendendo três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos.

[025] Em um aspecto específico, é fornecido um agonista de 4- 1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em; (a) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (c) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e (d) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

55.

[026] Em outro aspecto, a invenção provê um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-CD19/anti-4-1BB.

[027] Em um aspecto adicional, a invenção provê o agonista de 4-1BB (CD137) para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um anticorpo anti-CD20 e em que o agonista de 4-1BB compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente à FAP.

[028] Em um aspecto, é fornecido um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente à FAP e três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente à FAP compreende; (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, e (iii) CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 e (vi) CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107.

[029] Em um aspecto particular, é fornecido um agonista de 4- 1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente à FAP e três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos, em que o domínio de ligação a antígeno capaz de ligar-se especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 e uma região variável de cadeia leve (V LFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (V HFAP) compreendendo um aminoácido sequência da SEQ ID NO: 110 e uma região variável da cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

111. Em um aspecto específico, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se de maneira específica à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112.

[030] Em outro aspecto, é fornecido um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente à FAP é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável. Em particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, especificamente um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4. De modo mais específico, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ou a função efetora. Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB compreende um domínio Fc de IgG1 compreendendo as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G.

[031] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um agonista de

4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende; (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente à FAP, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[032] Em outro aspecto, a invenção provê um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo; (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente à FAP; e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo fato de que (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CL e o segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto entre os domínios CH1 e CL, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BB ou fragmentos destes, que estão ligados uns aos outros e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BB ou um fragmento deste ligado por um ligante peptídico ao domínio CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou (ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3, respectivamente, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BB ou fragmentos destes que estão ligados entre si e com a extremidade C- terminal do domínio CH3 por um ligante peptídico, e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por meio de um ligante peptídico ao C-terminal do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou (iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL- CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou VH-CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto entre o domínio CH1 e CL, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4- 1BB ou fragmentos destes, que estão ligados uns aos outros e ao domínio VH ou VL por um ligante peptídico, e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[033] Em um aspecto, é fornecido um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo; (a) pelo menos uma domínio Fab capaz de ligar-se especificamente à FAP, compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32; e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[034] Em um aspecto específico, é fornecido um agonista de 4- 1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em;

112, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 35 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36;

ID NO: 37 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38;

c) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

ID NO: 41 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42;

112, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44;

114, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

f) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

114, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44;

ID NO: 46;

i) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

113, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 116 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; e j) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

115, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 118 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 119.

[035] Em outro aspecto, a invenção provê um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo; (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente à FAP, (b) um polipeptídeo compreendendo três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos.

[036] Em outro aspecto, a invenção provê um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-FAP/anti-4-1BB.

[037] Em todos esses aspectos, a invenção fornece ainda um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o anticorpo anti-CD20 compreende um anticorpo anti-CD20 Tipo I. Em particular, o anticorpo anti-CD20 é rituximabe. Em outro aspecto, a invenção fornece ainda um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o anticorpo anti-CD20 é um anticorpo anti-CD20 tipo II. Em particular, o anticorpo anti-CD20 é obinutuzumabe. Em um aspecto, o anticorpo anti-CD20 é um anticorpo anti-CD20 afucosilado. Em um aspecto adicional, o anticorpo anti- CD20 é o rituximabe ou o obinutuzumabe.

[038] Em outro aspecto, é fornecido um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, conforme definido anteriormente na presente invenção, em que o agonista de 4-1BB é um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular ao CD19 ou à FAP, e em que a combinação é administrada em intervalos de cerca de uma semana a três semanas.

[039] Em outro aspecto, é fornecido um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular ao CD19 ou à FAP, e em que um pré-tratamento com um anticorpo anti-CD20 Tipo II, preferencialmente obinutuzumabe, é realizado antes do tratamento combinado, em que o período de tempo entre o pré- tratamento e o tratamento combinado são suficientes para a redução de células B no indivíduo em resposta ao anticorpo anti-CD20 Tipo II, preferencialmente, obinutuzumabe.

[040] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um produto farmacêutico compreendendo (A) uma primeira composição compreendendo como ingrediente ativo um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou FAP, e um excipiente farmaceuticamente aceitável; e (B) uma segunda composição compreendendo como ingrediente ativo um anticorpo anti-CD20 e um excipiente farmaceuticamente aceitável, para uso no tratamento combinado ou simultâneo de uma doença, especialmente o câncer.

[041] Em outro aspecto, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, e um excipiente farmaceuticamente aceitável, e um segundo medicamento compreendendo um anticorpo anti-CD20. Em um aspecto, a composição farmacêutica é para uso como medicamento. Em particular, a composição farmacêutica é para uso no tratamento de distúrbios proliferativos de células B, particularmente doenças selecionadas a partir do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de zona marginal (MZL), mieloma múltiplo (MM) ou linfoma de Hodgkin (HL).

[042] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um kit para tratar ou retardar a progressão do câncer em um sujeito, compreendendo uma embalagem compreendendo (A) uma primeira composição compreendendo como ingrediente ativo um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, e um excipiente farmaceuticamente aceitável; e (B) uma segunda composição compreendendo como ingrediente ativo um anticorpo anti-CD20 e um excipiente farmaceuticamente aceitável e (C) instruções para o uso das composições em uma terapia combinada.

[043] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se ao uso de uma combinação de um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, e um anticorpo anti- CD20 na fabricação de um medicamento para tratar ou retardar a progressão de uma doença proliferativa, particularmente o câncer.

[044] Em particular, é fornecido o uso de uma combinação de um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, e um anticorpo anti-CD20 na fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em linfoma não Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma da zona marginal (MZL), mieloma múltiplo (MM) e linfoma de Hodgkin (HL).

[045] Em outro aspecto, a invenção provê um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um sujeito que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou FAP, e uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD20. Em particular, a invenção diz respeito a um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um sujeito, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou FAP. Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc. Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo um domínio Fc com modificações que reduzem a ligação ao receptor Fcγ e/ou a função efetora. Em um aspecto específico, o agonista de 4- 1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou FAP, é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos destes. De modo mais particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos destes e um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou FAP.

[046] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um sujeito que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente a um tumor associado antígeno, particularmente CD19 ou FAP, e uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou FAP, e o anticorpo anti-CD20 é administrado em conjunto em uma composição única ou administrado separadamente em duas ou mais composições diferentes. Em particular, o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, e o anticorpo anti-CD20 são administrados por via intravenosa ou subcutânea. Em um aspecto adicional, o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou FAP, é administrado concomitante com o anticorpo anti-CD20.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[047] A Figura 1 exibe moléculas de ligação ao antígeno CD19- 4-1BBL específicas usadas nos Exemplos. Essas moléculas são descritas em mais detalhes nos Exemplos 1 e 2, respectivamente. O ponto preto espesso representa a modificação knob-into-hole. A Figura 1A mostra uma molécula de ligação ao antígeno contendo o CD19 monovalente - trímero-4-1BBL, com modificações de aminoácidos no domínio CH1 e CL adjacente ao dímero 4- 1BBL e monômero 4-1BBL. Como ele compreende o ligante de CD19 8B8- 018, foi denominado de mono CD19(018)-4-1BBL no presente documento. A construção mostrada na Figura 1B difere de 1A na medida em que compreende o ligante CD19 8B8-2B11 e, desse modo, foi denominada mono CD19(2B11)-4-1BBL. A Figura 1D mostra a construção bivalente com o ligante CD19(018), denominada bi CD19(018)-4-1BBL. As Figuras 1C e 1E mostram moléculas de controle não direcionadas (sem alvos) (o ligante CD19 foi substituído por um Fab DP47 sem ligação). A Figura 1F mostra uma molécula de ligação ao antígeno contendo ‘CD19 monovalente - trímero 4- 1BBL’, compreendendo um dímero 4-1BBL murino e um monômero 4-1BBL murino, denominada no presente documento de híbrido CD19-4-1BBL ou CD19-mu4-1BBL.

[048] A Figura 2A ilustra a configuração do ensaio de medição da ligação simultânea da construção para CD19 dividida trimérica direcionada para 4-1BB e CD19 humano (Exemplo 2). O gráfico na Figura 2B mostra a ligação simultânea do substituto híbrido CD19-mu4-1BBL (Analito 1) a 4-1BB murino imobilizado e CD19 humano (Analito 2).

[049] Nas Figuras 3A a 3C é demonstrado que CD19-4-1BBL poderia aumentar a ativação de células NK (liberação de IFNγ) que foram ativadas por rituximabe ou obinutuzumabe (Gazyva) quando se envolvem com a linhagem de células de NHL, ou seja, WSU-DLCL2 (CD19+ CD20alto) (Fig. 3A), SU-DHL-8 (CD19+ CD20baixo) (Fig. 3B) ou Naml-6 (CD19+ CD20baixo) (Fig. 3C).

[050] As Figuras 4A a 4C mostram que pela combinação de CD19-4-1BBL com rituximabe ou obinutuzumabe (Gazyva), a ativação de células NK (regulação positiva de CD25) é impulsionada ao se acoplar com a linhagem de células NHL, ou seja, com WSU-DLCL2 (CD19+ CD20alto) (Fig.

4A), SU-DHL-8 (CD19+ CD20baixo) (Fig. 4B) ou Naml-6 (CD19+ CD20baixo) (Fig. 4C).

[051] Nas Figuras 5A a 5C, é mostrado que a combinação de CD19-4-1BBL e obinutuzumabe (Gazyva) aumenta a ativação de células NK (regulação positiva de CD25) ao se envolver com as linhagens de células de NHL, WSU-DLCL2 (Fig. 5A), SU-DHL-8 (Fig. 5B) ou Naml-6 (Fig. 5C), enquanto a combinação de urelumabe com obinutuzumabe não.

[052] A Figura 6 mostra o protocolo do estudo de eficácia in vivo da molécula híbrida CD19 monovalente –4-1BBL (CD19 mono-mu4-1BBL) em combinação com o rituximabe em camundongos Scid huCD16Tg. Na tabela abaixo, são definidos os subgrupos de camundongos que recebem diferentes combinações e doses. O experimento é descrito no Exemplo 4 e os resultados são mostrados nas Figuras 7A e 7B. A combinação de CD19 mono-mu4-1BBL em combinação com rituximabe induziu uma inibição do crescimento tumoral mais forte e mais rápida em comparação com a monoterapia com rituximabe ou monoterapia com CD19mono-mu4-1BBL em todas as doses testadas. Conforme mostrado na Figura 7B, os pesos dos tumores no final do estudo confirmaram esses achados.

[053] A Figura 8 mostra o protocolo de estudo in vivo de eficácia da construção CD19(2B11) monovalente–4-1BBL em combinação com obinutuzumabe (Gazyva) em camundongos NSG totalmente humanizados com tumores de WSU-DLCL2. Na tabela abaixo, são definidos os subgrupos de camundongos que recebem diferentes combinações e doses. O experimento é descrito no Exemplo 5 e os resultados são mostrados na Figura 9. A combinação de CD19 (2B11) mono – 4-1BBL com Gazyva induziu uma inibição do crescimento tumoral muito mais forte em comparação com a monoterapia com Gazyva.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[054] A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos utilizados no presente têm o mesmo significado como comumente utilizado no estado da técnica ao qual esta invenção pertence. Para os propósitos de interpretação deste relatório descritivo, as seguintes definições serão aplicadas e, sempre que necessário, os termos usados na forma singular também incluirão o plural e vice-versa.

[055] Conforme utilizado no presente, o termo “molécula de ligação ao antígeno” é utilizado no sentido mais amplo para se referir a uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigênico. Exemplos de moléculas de ligação ao antígeno são anticorpos, fragmentos de anticorpos e proteínas de ligação ao antígeno de andaime (scaffold).

[056] O termo “anticorpo” na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange diferentes estruturas de anticorpo, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos monoespecíficos e multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.

[057] O termo “anticorpo monoclonal” conforme utilizado no presente refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao(s) mesmo(s) epítopo(s), exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estão presentes em pequenas quantidades. Ao contrário das preparações com anticorpo policlonal, que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre um antígeno.

[058] O termo anticorpo “monoespecífico” conforme utilizado no presente denota um anticorpo que tem um ou mais sítios de ligação, em que cada um deles se liga ao mesmo epítopo do mesmo antígeno. O termo “biespecífico” significa que a molécula de ligação ao antígeno é capaz de ligar- se especificamente a, pelo menos, dois determinantes antigênicos distintos.

Normalmente, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende dois sítios de ligação ao antígeno, cada um deles é específico para um determinante antigênico diferente. Em determinados exemplos de realização a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de ligar-se, simultaneamente, a dois determinantes antigênicos, em particular dois determinantes antigênicos expressos em duas células distintas.

[059] O termo “valente”, usado no presente pedido denota a presença de um determinado número de sítios de ligação em uma molécula de ligação ao antígeno. Como tal, os termos “bivalente”, “tetravalentes”, e “hexavalentes” denotam a presença de dois sítios de ligação, quatro sítios de ligação e seis sítios de ligação, respectivamente, em uma molécula de ligação ao antígeno. “Monovalente” denota a presença de apenas um domínio de ligação para um alvo específico na molécula de ligação ao antígeno.

[060] As expressões “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo inteiro”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são utilizadas no presente pedido de forma alternada para se referirem a um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativa. Os “anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobulinas de ocorrência natural com estruturas variáveis. Por exemplo, anticorpos da classe IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que são ligadas por ligações de bissulfeto. A partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também denominada de domínio pesado variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), também denominados de região constante da cadeia pesada. Do mesmo modo, a partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também denominada de domínio leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante de cadeia leve (CL), também denominado de região constante da cadeia leve. A cadeia pesada de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre cinco tipos, denominados de α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), ou μ (IgM), alguns dos quais podem ser ainda divididos em subtipos, por exemplo, γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) e α2 (IgA2). A “cadeia leve” de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

[061] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a Fv, Fab, Fab’, Fab’- SH, F(ab’)2, diabodies (diacorpos), triabodies, tetrabodies, fragmentos cross- Fab, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv) e anticorpos de domínio único. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, vide Hudson et al. Nat. Med. 9:129- 134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, vide, por exemplo, Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Eds Rosenburg & Moore., (Springer-Verlag, Nova Iorque), págs. 269-315 (1994); vide também o WO 93/16185; e as Patentes US 5.571.894 e US 5.587.458.

Para uma discussão sobre os fragmentos Fab e F(ab’)2 que compreendem resíduos de epítopo que se ligam a receptores de resgate (salvage) e têm meia vida in vivo aumentada, consulte patente US 5.869.046. Diacorpos são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos, consulte, por exemplo, a Patente EP 404,097; documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129- 134 (2003); e Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Triacorpos (triabodies) e tetracorpos (tetrabodies) também estão descritos em Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em determinados exemplos de realização, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA, vide, por exemplo, Patente US 6.248.516 B1). Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por diversas técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, Escherichia coli ou fagos), conforme descrito na presente invenção.

[062] A digestão de anticorpos intactos pela papaína produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, denominados de fragmentos “Fab”, cada um contendo domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve, e também o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) de cadeia pesada. Conforme utilizado na presente invenção, o termo “fragmento Fab” refere-se a um fragmento de anticorpo compreendendo um fragmento da cadeia leve que compreende um domínio VL e um domínio constante de uma cadeia leve (LC), e um domínio VH e um primeiro domínio constante (CH1) de uma cadeia pesada. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxi-terminal do domínio

CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab’-SH são fragmentos Fab’ no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carrega(m) um grupo tiol livre. O tratamento com a pepsina gera um fragmento F(ab’)2 que contém dois sítios de ligação a antígenos (dois fragmentos Fab) e uma parte da região Fc.

[063] O termo “fragmento cross-Fab” ou “fragmento xFab” ou “fragmento Fab crossover” (ou ainda Fab cruzado) refere-se a um fragmento Fab em que as regiões variáveis e regiões constantes da cadeia pesada e leve estão trocadas. Duas composições de cadeia diferentes de uma molécula Fab crossover são possíveis e compreendidas nos anticorpos biespecíficos da invenção: Por um lado, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve do Fab estão trocadas, ou seja, a molécula Fab crossover compreende uma cadeia peptídica composta da região variável de cadeia leve (VL) e a região constante de cadeia pesada (CH1), e uma cadeia peptídica composta pela região variável de cadeia pesada (VH) e região constante de cadeia leve (CL). Esta molécula de Fab crossover também é referida como “CrossFab (VLVH)”. Por outro lado, quando as regiões constantes da cadeia pesada e leve do Fab são trocadas, a molécula de Fab crossover compreende uma cadeia peptídica constituída pela região variável de cadeia pesada (VH) e região constante de cadeia leve (CL), e uma cadeia peptídica constituída pela região variável de cadeia leve (VL) e região constante de cadeia pesada (CH1). Esta molécula de Fab crossover também é referida como “CrossFab (CLCH1)”.

[064] Um “fragmento Fab de cadeia única” ou “scFab” é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH), um domínio constante 1 de anticorpo (CH1), um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante tem uma das seguintes ordens na direção N-terminal para C-

terminal: a) VH-CH1-ligante-VL-CL, b) VL-CL-ligante-VH-CH1, c) VH-CL- ligante-VL-CH1 ou d) VL-CH1-ligante-VH-CL; e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, de preferência entre 32 e 50 aminoácidos. Os referidos fragmentos Fab de cadeia única são estabilizados pela ligação de bissulfeto natural entre o domínio CL e o domínio CH1. Além disso, estas moléculas Fab de cadeia única podem ser ainda mais estabilizadas pela geração de ligações de bissulfeto intercadeias por meio da inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, na posição 44 da cadeia pesada variável e posição 100 da cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat).

[065] Um “fragmento Fab de cadeia única crossover” (cruzado) ou “x-scFab” é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH), um domínio constante 1 de anticorpo (CH1), um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante tem uma das seguintes ordens na direção N- terminal para C-terminal: a) VH-CL-ligante-VL-CH1 e b) VL-CH1-ligante-VH-CL; em que o VH e VL formam em conjunto um sítio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um antígeno e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos. Além disso, estas moléculas x- scFab podem ser ainda mais estabilizadas pela geração de ligações de bissulfeto intercadeias por meio da inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, na posição 44 da cadeia pesada variável e posição 100 da cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat).

[066] Um “fragmento variável de cadeia única (scFv)” é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de um anticorpo, ligados por um ligante peptídico curto de cerca de dez a 25 aminoácidos. O ligante é geralmente rico em glicina para flexibilidade, bem como resíduos de serina ou treonina para solubilidade, e podem conectar a extremidade N-terminal do VH, com a extremidade C-terminal do VL, ou vice- versa. Esta proteína retém a especificidade do anticorpo original, apesar da remoção das regiões constantes e a introdução do ligante. Os anticorpos scFv estão descritos, por exemplo, em Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96). Além disso, os fragmentos de anticorpos podem compreender polipeptídeos de cadeia única possuindo as características de um domínio V H, ou seja, que são capazes de montar juntamente com um domínio V L, ou características de um domínio VL, ou seja, que são capazes de montar juntamente com um domínio VH, para um sítio de ligação ao antígeno funcional, fornecendo desse modo a propriedade de ligação ao antígeno de um anticorpo completo (de comprimento total).

[067] As proteínas de ligação ao antígeno de andaime (scaffold) são conhecidas no estado da técnica, por exemplo, fibronectina, e proteínas de repetição de anquirina (DARPins) concebidas têm sido utilizadas como suportes alternativos para domínios de ligação ao antígeno, vide, por exemplo, Gebauer e Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13: 245-255 (2009) e Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008). Em um aspecto da invenção, uma proteína de ligação ao antígeno andaime é selecionada a partir do grupo que consiste em CTLA-4 (Evibody), lipocalinas (Anticalin), molécula derivada da proteína A, tal como domínio Z da proteína A (Affibody), domínio-A (Avimer/Maxibody), transferrina sérica (trans- body); proteína de repetição de anquirina modificada (DARPin), domínio variável de cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo (anticorpo de domínio único, sdAb), domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (nanocorpo, aVH), fragmentos VNAR, fibronectina (AdNectin), domínio lectina tipo C (tetranectina); domínio variável de um novo receptor do antígeno beta-

lactamase (fragmentos VNAR), gama-cristalina ou ubiquitina humanas (moléculas Affilin); domínio tipo Kunitz de inibidores de proteases humanas, microcorpos, como proteínas da família knottin, aptâmeros peptídicos e fibronectina (adnectina).

[068] As lipocalinas são uma família de proteínas extracelulares que transportam pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como esteroides, bilinas, retinoides e lipídeos. Eles possuem estrutura em folha-beta rígida com um número de alças na extremidade aberta da estrutura cônica que pode ser manipulada para ligar-se a diferentes antígenos-alvo. Anticalinas são de 160- 180 aminoácidos de tamanho, e são derivadas de lipocalinas. Para mais detalhes veja Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 e US20070224633.

[069] As proteínas de repetição de anquirina (DARPins) desenvolvidas são derivadas da Anquirina que é uma família de proteínas que medeia a ligação de proteínas de membrana integral ao citoesqueleto. Uma repetição de anquirina única é um motivo de 33 resíduos composta por duas alfa hélices e uma alça beta (beta turn). Elas podem ser concebidas para ligar a diferentes antígenos-alvo pela randomização de resíduos na primeira alfa hélice e volta beta de cada repetição. A sua interface de ligação pode ser aumentada pelo aumento do número de módulos (um método de maturação de afinidade). Para mais detalhes veja J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) e J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) e US20040132028A1.

[070] Um anticorpo de domínio único é um fragmento de anticorpo consistindo em um único domínio de anticorpo variável monomérico.

Os primeiros domínios únicos foram derivados do domínio variável da cadeia pesada de anticorpo a partir de camelídeos (nanocorpos (nanobodies) ou fragmentos VHH). Além disso, o termo anticorpo de domínio único inclui um domínio variável de cadeia pesada autônomo humano (aVH) ou fragmentos VNAR derivados de tubarões.

[071] Uma “molécula de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo epítopo” como uma molécula de referência refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno que bloqueia em 50% ou mais a ligação da molécula de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição, e inversamente, a molécula de referência bloqueia a ligação da molécula de ligação ao antígeno ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais.

[072] O termo “domínio de ligação ao antígeno” refere-se à parte de uma molécula de ligação ao antígeno que compreende a área que se liga especificamente e é complementar a parte ou a todo o antígeno. Quando um antígeno é grande, uma molécula de ligação ao antígeno pode ligar-se apenas a uma porção específica do antígeno, cuja porção é denominada de epítopo.

Um domínio de ligação ao antígeno pode ser fornecido, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis (também denominados de regiões variáveis).

Preferencialmente, um domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH).

[073] Conforme utilizado no presente, o termo “determinante antigênico” é sinônimo de “antígeno” e “epítopo”, e refere-se a um local (por exemplo, um trecho contíguo de aminoácidos ou uma configuração conformacional composta de diferentes regiões de aminoácidos não contíguos) em uma macromolécula polipeptídica ao qual se liga uma porção de ligação ao antígeno, formando um complexo “molécula de ligação ao antígeno–antígeno”.

Os determinantes antigênicos úteis podem ser encontrados, por exemplo, sobre as superfícies de células tumorais, sobre as superfícies de células infectadas por vírus, sobre as superfícies de outras células doentes, sobre as superfícies de células do sistema imunológico, livres no soro sanguíneo, e/ou na matriz extracelular (ECM). O termo “proteínas úteis como antígenos” utilizado na presente invenção pode ser qualquer forma nativa de proteína a partir de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tal como os primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo quando indicado de outra forma. Em um exemplo de realização específico, o antígeno é uma proteína humana. Sempre que se faça referência a uma proteína específica na presente invenção, o termo abrange a referida proteína “completa” ou “de comprimento total”, não processada, bem como qualquer forma da proteína resultante do processamento na célula. O termo também abrange variantes que ocorrem naturalmente da proteína, por exemplo, as variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas.

[074] O termo “ligação específica” significa que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser discriminada a partir de interações não desejadas ou não específicas. A capacidade de uma molécula de ligação ao antígeno ligar-se a um antígeno específico pode ser mensurada por meio de um ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA) ou por outras técnicas familiares para um técnico hábil no assunto, por exemplo, a técnica de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (analisada em um instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glico J 17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Em um exemplo de realização, o grau de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a uma proteína não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação da molécula de ligação ao antígeno ao antígeno, conforme mensurado, por exemplo, por SPR.

Em determinados exemplos de realização, uma molécula que se liga ao antígeno tem uma constante de dissociação (Kd) ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ou ≤ 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 a 10-13, por exemplo, de 10-9 a 10-13 M).

[075] “Afinidade” ou “afinidade de ligação” refere-se, em geral, à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A “afinidade de ligação” a menos que indicado de outro modo, refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros do par ligante (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para o seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd), que é a relação entre a velocidade de dissociação e de associação (koff e kon, respectivamente). Deste modo, as afinidades equivalentes podem compreender diferentes constantes de velocidade, desde que a razão entre as constantes de velocidade continue a ser a mesma. A afinidade pode ser medida através de métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo os métodos descritos na presente invenção. Um método particular para mensurar a afinidade é a ressonância plasmônica de superfície (SPR).

[076] Um “antígeno de célula B”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um determinante antigênico apresentado na superfície de um linfócito B, particularmente um linfócito B maligno (nesse caso, o antígeno também é referido como “antígeno de célula B maligna”).

[077] O termo “antígeno associado a tumor” significa qualquer antígeno que é altamente expresso por células tumorais ou estroma tumoral.

Antígenos associados a tumores particulares são CD19 ou FAP.

[078] O termo “CD19” refere-se ao antígeno CD19 de linfócitos B, também conhecido como antígeno B4 da superfície de linfócitos B ou antígeno Leu-12 da superfície de linfócitos T e inclui a qualquer CD19 nativo a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do CD19 humano é exibida na UniProt sob o número de acesso P15391 (versão 160, SEQ ID NO: 62). O termo abrange o CD19 humano completo (de comprimento total) não transformado, bem como qualquer forma de CD19 humano que resulte do processamento na célula, desde que o anticorpo divulgado na presente invenção se ligue ao mesmo. O CD19 é um receptor da superfície celular estruturalmente distinto expresso na superfície de células B humanas, incluindo, mas não se limitando a, células pré-B, células B em desenvolvimento precoce (ou seja, células B imaturas), células B maduras através de diferenciação terminal em células plasmáticas, e células B malignas. O CD19 é expresso pela maioria das leucemias linfoblástica agudas pré-B (ALL), linfomas não-Hodgkin, leucemias linfocíticas crônicas de células B (LLC), leucemias pró- linfocíticas, leucemias de células pilosas, leucemias linfocíticas agudas comuns, e algumas leucemias linfoblásticas agudas tipo Null. A expressão de CD19 nas células plasmáticas sugere ainda que ele pode ser expresso em tumores de células B diferenciadas, tais como mieloma múltiplo. Portanto, o antígeno CD19 é um alvo para a imunoterapia no tratamento do linfoma não- Hodgkin, leucemia linfocítica crônica e/ou leucemia linfoblástica aguda.

[079] O termo “CD20” refere-se ao antígeno CD20 de linfócitos B, também conhecido como antígeno B1 da superfície de linfócitos B ou antígeno Leu-16 da superfície de leucócitos e inclui a qualquer CD20 nativo a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do CD20 humano é exibida na UniProt sob o número de acesso P11836 (versão 149, SEQ ID NO: 63). CD20 é uma proteína transmembranar hidrofóbica com um peso molecular de aproximadamente 35 kD expressa em linfócitos pré-B e B maduros. O gene humano correspondente é o “4 domínios que cobrem a membrana, subfamília

A, membro 1, também conhecido como MS4A1 (membrane-spanning 4- domains, subfamily A, member 1). Este gene codifica um membro da família de genes integral de membrana 4A. Os membros desta família de proteínas nascentes são caracterizados por características estruturais comuns e limites de splicing íntron/éxon similares e exibem padrões de expressão únicos entre células hematopoiéticas e tecidos não linfoides. Este gene codifica a molécula de superfície de linfócitos B, que desempenha um papel no desenvolvimento e diferenciação das células B em células plasmáticas. Este membro da família está localizado no 11q12, entre um grupo de membros da família. O splicing alternativo deste gene resulta em duas variantes de transcrição que codificam a mesma proteína. O termo “CD20” abrange as formas não processadas de CD20 “completas” ou “de comprimento total”, bem como qualquer forma de CD20 que resulte da transformação/processamento na célula. O termo também abrange formas variantes de CD20 que ocorrem naturalmente, por exemplo, as variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas.

[080] As expressões “anticorpo anti-CD20” e “um anticorpo que se liga ao CD20” referem-se a um anticorpo que é capaz de ligar-se ao CD20 com afinidade suficiente para que o anticorpo se torne útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico direcionado contra CD20. Em uma realização, a extensão de ligação de um anticorpo anti-CD20 a uma proteína não relacionada, não CD20, é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo para a CD20 mensurada, por exemplo, por um teste de radioimunoensaio (RIA). Em determinados exemplos de realização, um anticorpo que se liga ao CD20 tem uma constante de dissociação (Kd) ≤ 1 μM, ≤ 100nM, ≤ 10nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ou ≤ 0,001 nM (por exemplo, 10 -8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 a 10-13, por exemplo, 10-9 a 10-13 M). Em determinados exemplos de realização, um anticorpo anti-CD20 se liga a um epítopo de CD20 que é conservado entre os CD20s de diferentes espécies.

[081] Por “anticorpo anti-CD20 Tipo II” entende-se um anticorpo anti-CD20 com propriedades de ligação e atividades biológicas dos anticorpos anti-CD20 Tipo II, conforme descrito em Cragg et al., Blood 103 (2004) 2738- 2743; Cragg et al., Blood 101 (2003) 1045-1052, Klein et al., MAbs 5 (2013), 22-33, e conforme resumido na Tabela 1 abaixo.

TABELA A PROPRIEDADES DE ANTICORPOS ANTI-CD20 TIPO I E TIPO II Anticorpos anti-CD20 tipo I Anticorpos anti-CD20 tipo II Liga ao epítopo CD20 de classe Liga ao epítopo CD20 de classe

I II Localiza o CD20 em Não localiza o CD20 em microdomínios lipídicos de microdomínios lipídicos de membrana (lipid rafts) membrana (lipid rafts) CDC alta* CDC baixa* Atividade de ADCC* Atividade de ADCC* Aproximadamente metade da Capacidade total de ligação às capacidade de ligação às células células B

B Agregação homotípica fraca Agregação homotípica Baixa indução da morte celular Forte indução da morte celular * se do isotipo IgG1.

[082] Exemplos de anticorpos anti-CD20 tipo II incluem, por exemplo, o obinutuzumabe (GA101), tositumumabe (B1), anticorpo B-Ly1 humanizado IgG1 (um anticorpo IgG1 humanizado quimérico conforme divulgado no documento WO 2005/044859), 11B8 IgG1 (conforme divulgado no documento WO 2004/035607), e AT80 IgG1.

[083] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD20 tipo II compreende uma sequência da região variável de cadeia pesada (V HCD20) compreendendo a CDR de cadeia pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 73, a HCDR2 de SEQ ID NO: 74 e a HCDR3 de SEQ ID NO: 75; e/ou uma sequência da região variável de cadeia leve (VLCD20) compreendendo a CDR de cadeia leve (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 76, a LCDR2 de SEQ ID NO: 77 e a LCDR3 de SEQ ID NO: 78.

Em outro aspecto, o anticorpo anti-CD20 Tipo II é manipulado/modificado para ter uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc em comparação com um anticorpo não manipulado. Em um aspecto, pelo menos cerca de 40% dos oligossacarídeos N-ligados na região Fc do anticorpo anti-CD20 Tipo II são não fucosilados. Em um aspecto mais específico, o anticorpo anti-CD20 Tipo II é o obinutuzumabe (obinutuzumab) (denominação comum internacional recomendada pela Organização Mundial de Saúde, WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012, pág. 453). Tal como utilizado na presente invenção, o obinutuzumabe é sinônimo de GA101. O nome comercial é GAZYVA® ou GAZYVARO®. Este substitui todas as versões anteriores (por exemplo, Vol. 25, No. 1, 2011, págs.75-76), e anteriormente era conhecido como afutuzumab (denominação comum internacional recomendada, WHO Drug Information, Vol. 23, No. 2, 2009, p. 176; Vol. 22, nº 2, 2008, p. 124). Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-CD20 Tipo II compreende a sequência da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:79 e a sequência da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO:80. Em um exemplo aspecto, o anticorpo anti-CD20 tipo II é tositumomabe.

[084] Por “anticorpo anti-CD20 tipo I” entende-se um anticorpo anti-CD20 selecionado a partir do grupo que consiste em rituximabe, ofatumumabe, veltuzumabe, ocaratuzumabe, ocrelizumabe, PRO131921, ublituximabe, HI47 IgG3 (ECACC, hibridoma), 2C6 IgG1 (conforme divulgado no documento WO2005/103081), 2F2 IgG1 (conforme divulgado nos documentos WO 2004/035607 e WO 2005/103081) e 2H7 IgG1 (conforme divulgado no documento WO 2004/056312). Um anticorpo anti-CD20 tipo I particular é o rituximabe.

[085] O “Rituximabe” é um domínio constante murino quimérico humano, gama 1, geneticamente modificado, contendo anticorpo monoclonal direcionado contra o antígeno CD20 humano. Este anticorpo quimérico humano contém um domínio constante gama 1 humano e é identificado pelo nome “C2B8” na Patente US 5.736.137 (Andersen, et. al.) publicada em 17 de abril de 1998, atribuída a IDEC Pharmaceuticals Corporation. O Rituximabe é aprovado para o tratamento de pacientes com linfoma não-Hodgkin de células B, CD20-positivos, recidivado ou refratário de baixo grau ou foliculares.

Estudos in vitro do mecanismo de ação têm mostrado que o rituximabe exibe citotoxicidade dependente de complemento humano - (CDC) (Reff, ME, et al, Blood 83(1994) 435-445). Além disso, ele exibe atividade significativa em testes que mensuram a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). O rituximabe não é afucosilado.

[086] O termo “anticorpo B-Ly1 humanizado” refere-se ao anticorpo B-Ly1 humanizado conforme divulgado no documento WO 2005/044859 e documento WO 2007/031875, que foi obtido a partir do anticorpo anti-CD20 monoclonal B-Ly1 murino (região variável da cadeia pesada (VH) murina: SEQ ID NO: 64; região variável da cadeia leve (VL) murina: SEQ ID NO: 65 – vide, Poppema, S. e Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139) por meio da quimerização com um domínio constante humano a partir do IgG1 e posterior humanização (vide os documentos WO 2005/044859 e WO 2007/031875). Estes “anticorpos B-Ly1 humanizado” são divulgados em detalhes no WO 2005/044859 e WO 2007/031875.

[087] O termo “Proteína Ativadora de Fibroblastos”, também conhecida como Prolil endopeptidase FAP ou Seprase (EC 3.4.21), refere-se a qualquer FAP nativa a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, seres humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cinomolgos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo abrange FAPs não processadas “de comprimento total”, bem como qualquer forma de FAP que resulte da transformação na célula. O termo também abrange formas variantes de FAP que ocorrem naturalmente, por exemplo, as variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas. Em um exemplo de realização, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é capaz de ligar-se especificamente à FAP humana, de camundongo e/ou de cinomolgos. A sequência de aminoácidos da FAP humana é exibida na UniProt (www.uniprot.org) sob o nº de acesso Q12884 (versão 149, SEQ ID NO: 120), ou no NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq.: NP_004451.2. O domínio extracelular (ECD) da FAP humana se estende desde a posição de aminoácido 26 até a posição 760. A sequência de aminoácidos de um ECD de FAP humana marcado com His (His tagged) é exibida na SEQ ID NO: 121. A sequência de aminoácidos da FAP de camundongo é exibida na UniProt sob o número de acesso P97321 (versão 126, SEQ ID NO: 122), ou no NCBI com a RefSeq NP_032012.1. O domínio extracelular (ECD) da FAP de camundongo se estende desde a posição de aminoácido 26 até a posição 761. A SEQ ID NO: 123 exibe a sequência de aminoácidos de um ECD de FAP de camundongo marcado com His (His tagged). A SEQ ID NO: 124 exibe a sequência de aminoácidos de um ECD de FAP de cinomolgo marcado com His. Preferencialmente, uma molécula de ligação à FAP da invenção se liga ao domínio extracelular da FAP. Exemplos de moléculas de ligação anti-FAP estão descritos no Pedido Internacional WO 2012/020006 A2.

[088] O termo “redução” (e variações gramaticais como “reduzida” ou “reduzindo”), por exemplo, redução do número de células B ou da liberação de citocinas, refere-se a uma diminuição na respectiva quantidade,

medida por métodos adequados conhecidos no estado da técnica. Para maior clareza, o termo inclui também a redução para zero (ou abaixo do limite de detecção do método analítico), ou seja, a abolição completa ou eliminação. Por outro lado, “aumento” refere-se a um aumento na quantidade respectiva.

[089] Um “antígeno de célula T”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um determinante antigênico apresentado na superfície de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico.

[090] Um “agente terapêutico de ativação de células T”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um agente terapêutico capaz de induzir a ativação de células T em um sujeito, particularmente um agente terapêutico projetado para induzir a ativação de células T em um sujeito.

Exemplos de agentes terapêuticos de ativação de células T incluem anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente a um antígeno de célula T de ativação, como CD3, e um antígeno da célula alvo, como CD20 ou CD19.

Outros exemplos incluem receptores de antígeno quiméricos (CARs) que compreendem um domínio de ativação de células T e uma porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um antígeno da célula alvo, como o CD20 ou CD19.

[091] Um “antígeno de ativação de célula T”, conforme utilizado na presente invenção refere-se a um determinante antigênico expresso por um linfócito T, particularmente, um linfócito T citotóxico, que é capaz de induzir ou aumentar a ativação de células T mediante a interação com uma molécula de ligação ao antígeno. Especificamente, a interação de uma molécula de ligação ao antígeno com um antígeno de ativação de célula T pode induzir a ativação das células T, desencadeando a cascata de sinalização do complexo ‘receptor de células T’. Um antígeno de ativação de célula T exemplar é o CD3.

[092] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação da molécula de ligação ao antígeno ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões conservadas denominadas regiões estruturais ou arcabouços (frameworks - FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6ª ed., W.H. Freeman & Co., página 91 (2007)). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno.

[093] O termo “região hipervariável” ou “HVR” conforme utilizado no presente refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que é hipervariável na sequência e/ou forma alças estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”). Geralmente, os anticorpos nativos de quatro cadeias compreendem seis HVRs; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). As HVRs geralmente compreendem resíduos de aminoácidos das alças hipervariáveis e/ou das “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), sendo esta última de maior variabilidade de sequência e/ou estando envolvida no reconhecimento do antígeno. Alças hipervariáveis exemplares ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3). (Chothia e Lesk, J. Mol.Biol.196:901-917 (1987)) As CDRs exemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89- 97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 e 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). As regiões hipervariáveis (HVRs) também são referidas como “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), e estes termos são utilizados na presente invenção de modo alternado, e se referem às porções da região variável que formam as regiões de ligação ao antígeno. Esta região foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of

Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), de modo que as definições incluem a sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados entre si. No entanto, pretende-se que o uso de qualquer uma das definições para se referir a uma CDR de um anticorpo ou as formas variantes do mesmo esteja dentro do escopo do termo conforme definido e usado no presente. Os resíduos de aminoácidos adequados que compreendem as CDR tal como definido por cada uma das referências citadas acima são apresentados abaixo na Tabela B como uma comparação. O número exato de resíduos que abrangem uma CDR em particular irá variar dependendo do tamanho da sequência e da CDR. Os técnicos hábeis no assunto podem determinar quais os resíduos que rotineiramente compreendem uma CDR em particular, dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo.

TABELA B DEFINIÇÕES DE CDR1 CDR Kabat Chothia AbM2 VH CDR1 31-35 26-32 26-35 VH CDR2 50-65 52-58 50-58 VH CDR3 95-102 95-102 95-102 VL CDR1 24-34 26-32 24-34 VL CDR2 50-56 50-52 50-56 VL CDR3 89-97 91-96 89-97 1 A numeração de todas as definições CDR da Tabela A é de acordo com as convenções de numeração estabelecidas por Kabat et al. (vide abaixo) 2 “AbM”, com “b” em letra minúscula, conforme utilizado na

Tabela A, refere-se as CDRs conforme definido pelo software de modelagem de anticorpos Oxford Molecular's “AbM”.

[094] Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para as sequências da região variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Um técnico no assunto pode atribuir inequivocamente o sistema de “numeração de Kabat” para qualquer sequência da região variável, sem depender de quaisquer dados experimentais além da própria sequência. Tal como utilizado no presente, a expressão “numeração de Kabat” refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983). Salvo quando indicado de outra forma, referências feitas à numeração de posições de resíduos de aminoácidos específicas em uma região variável de anticorpo estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[095] Com exceção da CDR1 no VH, as CDRs geralmente compreendem os resíduos de aminoácidos que formam as alças hipervariáveis.

As CDRs também compreendem “resíduos determinantes da especificidade”, ou “SDRs”, que são os resíduos que fazem contato com o antígeno. As SDRs estão contidas dentro de regiões das CDRs denominadas de CDRs- abreviadas, ou “a-CDRs”. As a-CDRs exemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a- CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 e a-CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 e 95-102 de H3. (Vide Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)). Salvo quando indicado de outra forma, os resíduos HVR e outros resíduos do domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados na presente invenção de acordo com Kabat et al., Supra.

[096] Conforme utilizado no presente, o termo “de afinidade maturada” no contexto de moléculas que se ligam a antígenos (por exemplo, anticorpos) refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno que é derivada de uma molécula de ligação ao antígeno de referência, por exemplo, por mutação, e que se liga ao mesmo antígeno, preferencialmente, se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e possui uma maior afinidade para o antígeno do que a molécula de ligação ao antígeno de referência. A maturação de afinidade geralmente envolve a modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos de uma ou mais CDRs da molécula de ligação ao antígeno. Normalmente, a molécula de ligação ao antígeno de afinidade maturada se liga ao mesmo epítopo que a molécula de ligação ao antígeno de referência.

[097] As expressões “região de arcabouço”, “região estrutural” ou “FR” (de framework) referem-se aos resíduos de domínios variáveis que não são resíduos da região hipervariável (HVR) A FR de um domínio variável consiste geralmente em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Assim, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência na VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)-FR3-H3 (L3)-FR4.

[098] Uma “região estrutural aceptora humana” (acceptor human framework) para os propósitos da presente invenção é uma região estrutural ou arcabouço (framework) que compreende a sequência de aminoácidos de uma região estrutural do domínio variável de cadeia leve (VL) ou uma região estrutural do domínio variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma região estrutural de imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano, tal como definido abaixo. Uma região estrutural ou região de arcabouço (framework) aceptora humana “derivada de” uma região estrutural de uma imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácido destas ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em alguns exemplos de realização, o número de alterações de aminoácidos é de 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em alguns exemplos de realização, a região de arcabouço humana aceptora VL é idêntica em sua sequência com a sequência da região de arcabouço da imunoglobulina humana VL ou sequência da região estrutural de consenso humano.

[099] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma determinada fonte ou espécie, enquanto que o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[100] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante presente em sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados de , , ,  e , respectivamente.

[101] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos a partir de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado compreenderá de substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivado de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere- se a um anticorpo que foi submetido à humanização. Outras formas de “anticorpos humanizados” abrangidas pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi adicionalmente modificada ou alterada a partir do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação à ligação ao C1q e/ou ligação ao receptor Fc (FcR).

[102] Um anticorpo “humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde ao de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificantes de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado, que compreende resíduos não humanos de ligação ao antígeno.

[103] O termo “domínio Fc” ou “região Fc” é usado no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de anticorpo contendo pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões de Fc de sequências nativas e regiões Fc variantes. Uma região Fc de IgG compreende um domínio CH2 da IgG e um CH3 da IgG. O “domínio CH2” de uma região Fc da IgG humana normalmente se estende a partir de um resíduo de aminoácido que está aproximadamente na posição 231 até um resíduo do aminoácido que está aproximadamente na posição 340. Em um exemplo de realização, uma cadeia de carboidrato está anexada ao domínio CH2. O domínio CH2 na presente invenção pode ser um domínio CH2 de sequência nativa ou domínio CH2 variante. O “domínio CH3” compreende o alongamento dos resíduos C-terminais até um domínio CH2 em uma região Fc (ou seja, a partir de um resíduo de aminoácido na posição 341 até cerca de um resíduo de aminoácido na posição 447 de uma IgG). A região CH3 pode ser uma sequência nativa do domínio CH3 ou um domínio CH3 variante (por exemplo, um domínio CH3 com uma “protuberância” (“knob”) introduzida em uma cadeia deste e uma “cavidade” (“hole”) correspondente introduzida na outra cadeia do mesmo; vide a Patente US 5.821.333, incorporada ao presente pela referência). Tais domínios CH3 variantes podem ser utilizados para promover a heterodimerização de duas cadeias pesadas de anticorpo não idênticas, tal como descrito na presente invenção. Em um exemplo de realização, uma região Fc de cadeia pesada da IgG humana estende-se desde da Cis226, ou desde a Pro230, até a extremidade carboxi-terminal da cadeia pesada.

Entretanto, a lisina C-terminal (Lis447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra maneira, a numeração dos resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado o índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[104] A tecnologia “knob-into-hole” (protuberância–em– cavidades) está descrita, por exemplo, nas Patentes US 5.731.168; US

7.695.936; e em Ridgway et al, Prot Eng. 9, 617-621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). De modo geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“knob”) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade/orifício (“hole“) correspondente na interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância pode ser posicionada na cavidade a fim de promover a formação de heterodímero e impedir a formação de homodímero. As protuberâncias são construídas pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais pequenas na interface do primeiro polipeptídeo por aminoácidos com cadeias laterais maiores (por exemplo, a tirosina ou triptofano). As “cavidades” (hole) compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao das protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais grandes por aminoácidos com cadeias laterais menores (por exemplo, alanina ou treonina). A protuberância e a cavidade podem ser feitas através da alteração de ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese sítio-específica, ou por síntese peptídica. Um exemplo de realização específico de uma modificação knob compreende a substituição de aminoácidos T366W em uma das duas subunidades do domínio Fc, e a modificação hole compreende as substituições de aminoácidos T366S, L368A e Y407V na outra dentre as duas subunidades do domínio Fc. Em outro exemplo de realização específico, a subunidade do domínio Fc compreendendo a modificação knob compreende adicionalmente a substituição de aminoácido S354C, e a subunidade do domínio Fc compreendendo a modificação hole compreende adicionalmente a substituição de aminoácidos Y349C. A introdução destes dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ponte de bissulfeto entre as duas subunidades da região Fc, estabilizando adicionalmente o dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

[105] Uma “região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina” significa pretende incluir variantes alélicas de ocorrência natural da região Fc de uma imunoglobulina, bem como variantes com alterações que produzem substituições, adições ou deleções, mas que não diminuem substancialmente a capacidade da imunoglobulina de mediar funções efetoras (tais como citotoxicidade celular dependente de anticorpo).

Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser excluídos da extremidade N- terminal ou C-terminal da região Fc de uma imunoglobulina sem haver perda significativa da função biológica. Tais variantes podem ser selecionadas de acordo com regras gerais conhecidas no estado da técnica, de modo a ter um efeito mínimo sobre a atividade (vide, por exemplo, Bowie, J. U. et al., Science 247, 1306-1310 (1990)).

[106] O termo “funções efetoras” refere-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação de C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo

(ADCC); fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP); secreção de citocina; captação de antígeno mediada pelo complexo imune pelas células apresentadoras de antígeno; regulação negativa dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B) e ativação de célula B.

[107] Um “receptor Fc de ativação” é um receptor Fc que, após o acoplamento por uma região Fc de um anticorpo, desencadeia eventos de sinalização que estimulam as células que carregam o receptor a executarem funções efetoras. Receptores Fc de ativação incluem FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), e FcαRI (CD89). Um receptor Fc de ativação particular é o FcγRIIIa humano (vide o nº de acesso UniProt: P08637, versão 141).

[108] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “células efetoras” refere-se a uma população de linfócitos que exibem receptores com unidades efetoras, por exemplo, receptores de citocinas e/ou receptores de Fc em suas superfícies através dos quais uma porção efetora se liga, por exemplo, uma citocina e/ou uma região Fc de um anticorpo e contribui para a destruição das células alvo, por exemplo, células tumorais. As células efetoras podem, por exemplo, mediar efeitos citotóxicos ou fagocitários. As células efetoras incluem, mas não estão limitadas a, células T efetoras, como células T citotóxicas CD8+, células T auxiliares CD4+, células T γδ, células NK, células assassinas ativadas por linfocinas (LAK) e macrófagos/monócitos.

[109] Um “ectodomínio” é o domínio de uma proteína de membrana que se estende para o espaço extracelular (ou seja, o espaço do lado de fora da célula alvo). Ectodomínios são geralmente as partes de proteínas que iniciam contato com superfícies, que levam a transdução de sinal. O ectodomínio de 4-1BB, tal como definido na presente invenção, portanto, refere-se à parte do 4-1BB que se estende para o espaço extracelular (domínio extracelular), mas também inclui partes ou fragmentos mais curtos dos mesmos, que são responsáveis pela trimerização e ligação ao receptor de 4-1BB correspondente. O termo “ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste” refere-se desse modo ao domínio extracelular de 4-1BB que constitui o domínio extracelular ou partes deste que ainda são capazes de ligar ao receptor (domínio de ligação ao receptor).

[110] O “4-1BBL” (ou “ligante de 4-1BB” ou “CD137L”) é um coestimulador membro da família de ligante TNF, que é capaz de coestimular a proliferação e produção de citocinas de células T. Os ligantes da família de TNF coestimulatórios podem coestimular os sinais de TCR após a interação com seus receptores de TNF correspondentes e a interação com seus receptores leva ao recrutamento de fatores associados ao TNFR (TRAF), que iniciam cascatas de sinalização que resultam na ativação de células T. 4-1BBL é uma proteína transmembranar tipo II. O 4-1BBL completo ou de comprimento total, possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, foi descrito por formar trímeros sobre a superfície das células. A formação de trímeros é ativada por motivos específicos do ectodomínio do 4-1BBL. Os referidos motivos são designados no presente documento como “região de trimerização”.

Os aminoácidos 50-254 na sequência do 4-1BBL humano (SEQ ID NO: 67) formam o domínio extracelular do 4-1BBL, mas mesmo os fragmentos dele são capazes de formar trímeros. Em exemplos de realização específicos da invenção, o termo “ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento deste” refere-se a um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 4 (aminoácidos 52-254 do 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 71-254 do 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 3 (aminoácidos 80-254 do 4-1BBL humano) e SEQ ID NO: 2 (aminoácidos 85-254 do 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 5 (aminoácidos 71-248 do 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 6 (aminoácidos 52-248 do 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 7 (aminoácidos 80-248 do 4-1BBL humano) e SEQ ID NO: 8 (aminoácidos 85-248 do 4-1BBL humano), mas outros fragmentos do ectodomínio capazes de desempenhar a trimerização também são incluídos no presente pedido.

[111] O termo “4-1BB” ou “CD137”, como utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer 4-1BB nativo a partir de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo quando indicado de outra forma. O termo abrange 4-1BB não processado “inteiro”, “de comprimento total” ou “completo”, bem como qualquer forma de 4-1BB que resulta do processamento na célula. O termo também abrange 4–1BB variantes que ocorrem naturalmente, por exemplo, as formas variantes por splicing alternativo ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de um 4-1BB humano exemplar é mostrada na SEQ ID NO: 68 (número de acesso Uniprot Q07011), a sequência de aminoácidos de um 4-1BB murino exemplar é mostrada na SEQ ID NO: 69 (número de acesso Uniprot P20334) e a sequência de aminoácidos de um 4- 1BB de cinomolgo (de Macaca mulatta) exemplar é mostrada na SEQ ID NO: 70 (número de acesso Uniprot F6W5G6).

[112] Os termos “anticorpo anti-4-1BB”, “anti-4-1BB”, “anticorpo 4-1BB” e “um anticorpo que se liga especificamente ao 4-1BB” referem-se a um anticorpo que é capaz de ligar-se ao 4-1BB com afinidade suficiente, de modo que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico no direcionamento ao 4-1BB. Em uma realização, o grau de ligação de um anticorpo anti-4-1BB a uma proteína não 4-1BB não relacionada é menor que cerca de 10% da ligação do anticorpo a 4-1BB conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA) ou citometria de fluxo (FACS). Em determinados exemplos de realização, um anticorpo que se liga a 4-1BB tem uma constante de dissociação (KD) ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ou ≤ 0,001 nM (por exemplo, 10 -6 M ou menos, por exemplo, de 10-68 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-8 M a 10-10 M). Por exemplo, o urelumabe é um anticorpo anti-4-1BB derivado do anticorpo 20H4.9.

[113] O termo “ligante peptídico” refere-se a um peptídeo que compreende um ou mais aminoácidos, tipicamente cerca de 2 a 20 aminoácidos. Os ligantes peptídicos são conhecidos no estado da técnica ou estão descritos na presente invenção. Os ligantes peptídicos não imunogênicos adequados incluem, por exemplo, os ligantes peptídicos (G 4S)n, (SG4)n, ou G4(SG4)n, em que “n” é geralmente um número entre 1 e 10, e tipicamente entre 2 e 4, e particularmente 2; ou seja, os peptídeos selecionados a partir do grupo que consiste em GGGGS (SEQ ID NO: 81) GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:82), SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:83) e GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:84), mas também inclui as sequências GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:85), (G4S)3 (SEQ ID NO:86), (G4S)4 (SEQ ID NO:87), GSGSGSGS (SEQ ID NO:88), GSGSGNGS (SEQ ID NO:89), GGSGSGSG (SEQ ID NO:90), GGSGSG (SEQ ID NO:91), GGSG (SEQ ID NO:92), GGSGNGSG (SEQ ID NO:93), GGNGSGSG (SEQ ID NO:94) e GGNGSG (SEQ ID NO:95). Ligantes peptídicos de particular interesse são (G4S) (SEQ ID NO: 81) e (G4S)2 (SEQ ID NO: 82).

[114] O termo “aminoácido” tal como utilizando neste no presente pedido, indica o grupo de α-aminoácidos carboxi de ocorrência natural compreendendo alanina (código de três letras: ala, código de uma letra: A), arginina (Arg, R), asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), cisteína (Cis ou Cys, C), glutamina (Gln, Q), ácido glutâmico (Glu, E), glicina (Gli ou Gly, G), histidina (His, H), isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L), lisina (Lis ou Lys, K), metionina (Met, M), fenilalanina (Fen ou Phe, F), prolina (Pro, P), serina (Ser, S), treonina (Tre ou Thr, T ), triptofano (Trp, W), tirosina (Tir ou Tyr, Y) e valina (Val, V).

[115] Por “fundido” ou “conectado” entende-se que os componentes (por exemplo, um polipeptídeo e um ectodomínio de 4-1BBL)

estão ligados por meio de ligações peptídicas, seja diretamente ou através de um ou mais ligantes peptídicos.

[116] O “percentual (%) de identidade da sequência de aminoácidos” com relação a uma sequencia polipeptídica (proteína) é definido no presente como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos (gaps), se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para propósitos da determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser obtido de várias formas que estão dentro do conhecimento da técnica, por exemplo, o uso de softwares de computador publicamente disponíveis, tais como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, SAWI ou Megalign (DNASTAR).

Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. Para os propósitos da presente invenção, no entanto, os valores da % de identidade da sequência de aminoácido são gerados usando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador para comparação de sequências ALIGN- 2 é de autoria da Genentech, Inc. e o código fonte foi apresentado com a documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington, DC, 20559, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível pela Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o UNIX digital

V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam. Em situações onde o ALIGN-2 é empregado para a comparação de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma determinado sequência de aminoácido A que contenha uma certa % de identidade de sequência de aminoácidos com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B ) é calculado da seguinte forma: 100 vezes a fração X/Y em que, X é a quantidade de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondentes idênticos pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento A e B do programa e em que Y é a quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Será compreendido que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos de A para B não é igual ao percentual de identidade de sequências de aminoácidos de B para A. A menos que especificamente indicado em contrário, todos os valores percentuais de identidade de sequências de aminoácidos utilizados no presente são obtidos, tal como descrito no parágrafo anterior, pelo uso do programa ALIGN-2.

[117] Em determinados exemplos, sequências de aminoácidos variantes das moléculas de ligação ao antígeno são contempladas na presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas das moléculas de ligação ao antígeno. As sequências de aminoácidos variantes das moléculas de ligação ao antígeno podem ser preparadas pela introdução de modificações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica as moléculas ou pela síntese de peptídeos.

Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo.

Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para se chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno. Os sítios de interesse para mutagênese de substituição incluem as HVRs e arcabouços (frameworks - FRs). As substituições conservadoras são apresentadas na Tabela C sob o título “substituições preferidas” e adicionalmente descritas adiante em referência a classes de aminoácidos de cadeia lateral (1) a (6). As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas na molécula de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, uma ligação ao antígeno melhorada/mantida, diminuição da imunogenicidade, ou ADCC ou CDC melhorada.

TABELA C Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr

Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

[118] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades comuns da cadeia lateral: (1) Hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) Hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) Ácido: Asp, Glu (4) Básico: His, Lys, Arg; (5) Resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gly, Pro; (6) Aromático: Trp, Tyr, Phe.

[119] As substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[120] O termo “sequências de aminoácidos variantes” inclui variantes substanciais em que há substituições de aminoácidos em um ou mais resíduos da região hipervariável de uma molécula de ligação ao antígeno original (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para um estudo mais aprofundado terá(ão) modificações (por exemplo, melhorias) em certas propriedades biológicas (por exemplo, aumento da afinidade, imunogenicidade reduzida) em relação à molécula de ligação ao antígeno parental e/ou terá(ão) certas propriedades biológicas da molécula de ligação ao antígeno parental substancialmente retidas. Uma variante de substituição exemplar é um anticorpo de afinidade maturada que pode ser facilmente gerado, por exemplo,

usando técnicas de maturação de afinidade baseadas na exibição por fagos, tal como aquelas descritas no presente. Resumidamente, um ou mais resíduos da CDR está mutado e as moléculas de ligação ao antígeno variantes são apresentadas no fago e rastreadas por uma atividade biológica específica (por exemplo, a afinidade de ligação). Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais CDRs contanto que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade de ligação das moléculas de ligação ao antígeno ao antígeno. Por exemplo, podem ser feitas alterações conservadoras (por exemplo, substituições conservadoras conforme previsto na presente invenção) nas CDRs que não reduzam substancialmente a afinidade de ligação. Um método útil para a identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser direcionados para mutagênese é denominado de “mutagênese de varredura de alanina”, conforme descrito por Cunningham e Wells, (1989) Science, 244: 1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvos (por exemplo, resíduos carregados, tais como Arg, Asp, His, Lis e Glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Outras substituições podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativamente ou adicionalmente, pode ser analisada uma estrutura cristalina de um complexo ‘molécula de ligação ao antígeno – antígeno’ para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser selecionados ou eliminados como candidatos a substituição. As variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

[121] As inserções de sequências de aminoácidos incluem: fusões carbóxi- e/ou amino-terminais que variam de comprimento desde um resíduo, até polipeptídeos que possuem cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequências de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos.

Exemplos de inserções terminais incluem moléculas de ligação ao antígeno com um resíduo de metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula incluem a fusão do N- ou C-terminal a um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica das moléculas de ligação ao antígeno.

[122] Em determinados exemplos de realização, a moléculas de ligação ao antígeno fornecidas na presente invenção são alteradas para aumentar ou diminuir o grau em que o anticorpo é glicosilado. As formas variantes de glicosilação das moléculas podem ser convenientemente obtidas pela alteração da sequência de aminoácidos de modo que um ou mais sítios de glicosilação são criados ou removidos. Quando a molécula de ligação ao antígeno compreende uma região Fc, os carboidratos ligados a ela podem ser alterados. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos geralmente compreendem um oligossacarídeo ramificado, biantenário que geralmente está ligado por uma ligação N a um Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Os oligossacarídeos podem incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetilglicosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em alguns exemplos de realização, as modificações dos oligossacarídeos em moléculas de ligação ao antígeno podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas. Em um aspecto, são fornecidos variantes de moléculas de ligação ao antígeno possuindo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose anexada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Essas variantes de fucosilação podem ter a função ADCC melhorada; vide, por exemplo, as Publicações de Patentes US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). As moléculas de ligação ao antígeno variantes da presente invenção incluem aquelas com oligossacarídeos biantenários, por exemplo, em que um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc é bisseccionado por GlcNAc. Tais variantes podem possuir fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada. Vide, por exemplo, o documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al); a Patente US

6.602.684 (Umana et al), e US 2005/0123546 (Umana et al.). Também são fornecidas formas variantes com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Tais variantes de anticorpos que podem ter função CDC melhorada estão descritas, por exemplo, no documento WO 1997/30087 (Patel et al.); documento WO 1998/58964 (Raju, S.) e documento WO 1999/22764 (Raju, S.).

[123] Os termos “manipulação ou modificação” particularmente quando utilizados com prefixo “glico-”, bem como o termo “modificação (ou manipulação) por glicoengenharia” (termos como “glicomanipulação ou glicomodificação”) incluem a manipulação metabólica da maquinaria de glicosilação de uma célula, incluindo as manipulações genéticas das vias de síntese de oligossacarídeos para conseguir a glicosilação alterada de glicoproteínas expressas nas células. Além disso, a engenharia de glicosilação inclui os efeitos de mutações e de ambiente da célula em glicosilação. Em um exemplo de realização, a engenharia de glicosilação é uma alteração na atividade da glicosiltransferase. Em um exemplo de realização particular, a modificação resulta em atividade alterada da glicosaminiltransferase e/ou atividade de fucosiltransferase. A manipulação da glicosilação pode ser usada para se obter uma “célula hospedeira com um aumento da atividade de GnTIII” (por exemplo, uma célula hospedeira que foi manipulada para expressar níveis aumentados de um ou mais polipeptídeos possuindo atividade β-(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)), uma “célula hospedeira com aumento da atividade ManII” (por exemplo, uma célula hospedeira que foi manipulada para expressar níveis aumentados de um ou mais polipeptídeos com atividade α-manosidase II (ManII)), ou uma “célula hospedeira possuindo atividade de α(1,6) fucosiltransferase diminuída” (por exemplo, uma célula hospedeira que foi manipulada para expressar níveis diminuídos de α(1,6)-fucosiltransferase).

[124] Conforme utilizado no presente, o termo “polipeptídeo com atividade GnTIII” refere-se a polipeptídeos que são capazes de catalisar a adição de um resíduo de N-acetilglucosamina (GlcNAc) em ligação β-1,4 ao manosídeo β-ligado do núcleo trimanosil de oligossacarídeos N-ligados. Isso inclui polipeptídeos de fusão que exibem atividade enzimática semelhante, mas não necessariamente idêntica a, uma atividade de β(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferase III, também conhecida como β-1,4-manosil- glicoproteína 4-beta-N-acetilglucosaminil-transferase (EC 2.4.1.144), de acordo com o Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (NC-IUBMB), conforme mensurado em um ensaio biológico específico, com ou sem dependência da dose. No caso em que não existe dependência de dose, ele não precisa ser idêntico ao GnTIII, mas sim substancialmente semelhante à dose-dependência de uma determinada atividade quando comparado com o GnTIII (ou seja, o polipeptídeo candidato irá apresentar uma atividade maior ou a não menos do que cerca de 25 vezes e, preferencialmente, não menos do que cerca de dez vezes a atividade e, mais preferivelmente, não menos do que cerca de três vezes a atividade em relação ao GnTIII.).

[125] A citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) é um mecanismo imune que conduz à lise de células-alvo revestidas com anticorpo pelas células efetoras do sistema imune. As células alvo são células às quais os anticorpos ou seus fragmentos compreendendo uma região Fc são capazes de ligar-se especificamente, em geral, através da parte da proteína que é N-terminal para a região Fc. Conforme utilizado no presente, o termo “ADCC aumentada/reduzida” é definido como qualquer aumento/redução no número de células-alvo que são lisadas em um determinado tempo, em uma dada concentração de anticorpo no meio que circunda as células-alvo por meio do mecanismo ADCC definido acima, e/ou uma redução/aumento na concentração de anticorpo no meio que circunda as células-alvo necessária para atingir a lise de um determinado número de células-alvo em um dado momento pelo mecanismo de ADCC. O aumento/redução na ADCC é relativo à ADCC mediada pelo mesmo anticorpo produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras, usando os mesmos métodos-padrão de produção, purificação, formulação e armazenamento (que são conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto), mas que não foram mas que não foram modificadas por engenharia genética. Por exemplo, o aumento da ADCC mediada por um anticorpo produzido pelas células hospedeiras manipuladas que possuem um padrão alterado de glicosilação (por exemplo, para expressar a glicosiltransferase, GnTIII, ou outras glicosiltransferases) pelos métodos descritos na presente invenção, é relativo à ADCC mediada pelo mesmo anticorpo produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras não modificadas.

[126] Em determinados aspectos, a invenção contempla um anticorpo variante que possuí algumas, mas não todas, das funções efetoras, que o torna um candidato desejável para muitas aplicações no qual a meia vida do anticorpo in vivo é importante, ainda que certas funções efetoras (tal como a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e citotoxicidade mediada por célula dependente de complemento (ADCC)) sejam desnecessárias ou prejudiciais. Um ensaio de citotoxicidade in vitro ou in vivo pode ser conduzido para confirmar a redução / depleção dos CDC e/ou atividades ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação com o receptor Fc (FcR) podem ser realizados a fim de garantir que o anticorpo não tenha ligação ao FcγR (e portanto carece da atividade ADCC), mas mantém a capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para a mediação de ADCC, as células NK, expressam unicamente FcγRIII, enquanto monócitos expressam FcγRI, FcγRII e FcγRIII. A expressão FcR em células hematopoiéticas está resumida na tabela 3, página 464 de Ravetch et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse estão descritos na Patente US 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, I., et al.

Proc. Nat Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) e Hellstrom, I et al., Proc. Nat Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); US 5.821.337 (vide Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, métodos de ensaio não radioativo podem ser utilizados (vide, por exemplo, ACTI™ ensaio de citotoxicidade não radioativo por citometria de fluxo (CellTechnology, Inc., Mountain View, CA, e CyTotox 96® ensaio de citotoxicidade não radioativo (Promega, Madison, WI). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (Natural Killer ou NK). Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como descrito em Clynes et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de ligar-se à C1q e, portanto, carece de atividade CDC. Vide, por exemplo, o ensaio ELISA de ligação C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio CDC (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); e Cragg, M.S. e M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int’l.

Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929 A1).

[127] Os anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com a substituição de um ou mais dos seguintes resíduos da região Fc: 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US 6.737.056). Tais Fc mutantes incluem Fc mutantes com substituições em duas ou mais das seguintes posições de aminoácidos: 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o Fc mutante então denominado de “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US 7.332.581). Certos variantes de anticorpos com ligação a FCRs melhorada ou diminuída são descritos. (vide, por exemplo, a Patente US 6.737.056; WO 2004/056312, e Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)). Em determinados exemplos de realização, um anticorpo variante compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram ainda mais a função ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos EU).

[128] Em determinados aspectos, um anticorpo variante compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que diminuem a ligação ao FcγR, por exemplo, substituições nas posições 234 e 235 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em um aspecto, as substituições são L234A e L235A (LALA). Em certos aspectos, o anticorpo variante compreende ainda D265A e/ou P329G em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana. Em um aspecto, as substituições são L234A, L235A e P329G (LALA-PG) em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana. (Vide, por exemplo, o documento WO 2012/130831). Em outro aspecto, as substituições são L234A, L235A e D265A (LALA-DA) em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana.

[129] Em alguns exemplos de realização, as alterações são feitas na região Fc, que resultam na alteração da ligação ao C1q (isto é, melhorada ou diminuída) e/ou da Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na Patente US 6.194.551, WO 99/51642, e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

[130] Anticorpos com a meia-vida aumentada e ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) melhorada, que são responsáveis pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593 e Kim, J. K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), estão descritos na US 2005/0014934 (Hinton et al.). Tais anticorpos compreendem uma região Fc, com uma ou mais substituições neste local que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Tais variantes de Fc incluem aquelas com substituições de um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição da região Fc no resíduo 434 (Consulte, por exemplo, a patente US 7.371.826; Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol.

Chem. 281 (2006) 23514-23524).

[131] Em determinados aspectos, um anticorpo variante compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação ao FcγR, por exemplo, substituições nas posições 253 e/ou 310, e/ou 435 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em certos aspectos, o anticorpo variante compreende uma região Fc com as substituições de aminoácidos nas posições 253, 310 e 435. Em um aspecto, as substituições são I253A, H310A e H435A em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana. Vide, por exemplo, Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508.

[132] Em outro aspectos, um anticorpo variante compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação ao FcRn, por exemplo, substituições nas posições 310 e/ou 433, e/ou 436 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em certos aspectos, o anticorpo variante compreende uma região Fc com as substituições de aminoácidos nas posições 310, 433 e 436. Em um aspecto, as substituições são H310A, H433A e Y436A em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana. (Vide, por exemplo, o documento WO 2014/177460 A1).

[133] Em determinados aspectos, um anticorpo variante compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam a ligação ao FcRn, por exemplo, substituições nas posições 252 e/ou 254, e/ou 256 da região Fc (numeração EU de resíduos). Em certos exemplos de realização, o anticorpo variante compreende uma região Fc com as substituições de aminoácidos nas posições 252, 254 e 256. Em um exemplo de realização, as substituições são M252Y, S254T e T256E em uma região Fc derivada de uma região Fc de IgG1 humana (consulte também Duncan&Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente US 5.648.260; Patente US US 5.624.821; e documento WO 94/29351 referente a outros exemplos de variantes da região Fc.

[134] Em certos exemplos de realização, pode ser desejável criar variantes geneticamente modificadas com cisteína das moléculas de ligação ao antígeno da invenção, por exemplo, “thioMAbs”, em que um ou mais resíduos de molécula são substituídos por resíduos de cisteína. Em exemplos de realização específicos, os resíduos substituídos ocorrer em sítios acessíveis da molécula. Pela substituição de tais resíduos com cisteína, os grupos tióis reativos são assim posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras moléculas, tais como moléculas de drogas ou moléculas ligantes de drogas, para criar um imunoconjugado. Em determinados exemplos de realização, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc da cadeia pesada. As moléculas de ligação ao antígeno modificadas com cisteína podem ser geradas conforme descrito, por exemplo, na Patente US 7.521.541.

[135] Em determinados aspectos, as moléculas de ligação ao antígeno fornecidas na presente invenção podem ser adicionalmente modificadas para conter moléculas adicionais não proteináceas que são conhecidas no estado da técnica e prontamente disponíveis. As moléculas adequadas para a derivatização do anticorpo incluem, mas não estão limitadas a polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não se limitando a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero etileno/maleico anidrido, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli (n-vinil pirrolidona) polietileno-glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de prolipropileno óxido de etileno, poliálcool polióis (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. O propionaldeído polietilenoglicol pode ter vantagens no processo de fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros acoplados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se acoplado, os polímeros podem ser da mesma molécula ou de moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando a, propriedades específicas ou funções do anticorpo a ser melhorado, se o anticorpo biespecífico derivado será utilizado em uma terapia sob condições definidas, etc. Em outro aspecto, são fornecidos conjugados de anticorpo e porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecida por exposição à radiação. Em um exemplo de realização, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam, N.W.,

et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não se limita a, comprimento de ondas que não prejudicam células normais, mas que aquece a porção não proteinácea a uma temperatura no qual as células próximas ao anticorpo–porção não proteinácea são mortas. Em outro aspecto, podem ser obtidos imunoconjugados das moléculas de ligação ao antígeno contendo 4- 1BB fornecidas na presente invenção. Um “imunoconjugado” é um anticorpo conjugado com uma ou mais molécula(s) heteróloga(s), incluindo, mas não se limitando a um agente citotóxico.

[136] O termo “polinucleotídeo” refere-se a uma molécula isolada de ácido nucleico ou a construção, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA), RNA derivado de vírus, ou DNA plasmidial (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, tal como encontrado nos ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). O termo “molécula de ácido nucleico” refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, DNA ou fragmentos de RNA, presente em um polinucleotídeo.

[137] Por molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo “isolado” entende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA que tenha sido removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo contido em um vetor é considerado isolado para os propósitos da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo isolado inclui um polinucleotídeo contido em células que normalmente expressam o polinucleotídeo, mas o polinucleotídeo está presente extracromossomalmente ou em um local cromossômico que é diferente de sua localização cromossômica natural. Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro da presente invenção, bem como formas de fita positiva e negativa, e as formas de dupla fita. Polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados de acordo com a presente invenção incluem ainda estas moléculas produzidas de maneira sintética. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico que pode ser ou pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo, ou de terminador da transcrição.

[138] Por um ácido nucleico ou polinucleotídeo que possui uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos, por exemplo, 95% “idêntica” a uma sequência de nucleotídeos de referência da presente invenção, pretende- se dizer que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo é idêntica à sequência de referência exceto que a sequência de polinucleotídeo pode incluir até cinco mutações pontuais para cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por outro nucleotídeo, ou um número de nucleotídeos de até 5% dos nucleotídeos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência.

Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições 5’ ou 3’ terminal da sequência de nucleotídeos de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posições terminais, intercaladas individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Como uma questão prática, se qualquer sequência polinucleotídica particular, é, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeos da presente invenção, isto pode ser determinado convencionalmente pelo uso de programas de computador conhecidos, tal como os discutidos acima para polipeptídeos (por exemplo, ALIGN-2).

[139] O termo “cassete de expressão” refere-se a um polinucleotídeo gerado de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permite a transcrição de um ácido nucleico específico em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA plastidial, vírus, ou fragmento de ácido nucleico.

Normalmente, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em determinados exemplos de realização, o cassete de expressão da presente invenção compreende sequências de polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, ou fragmentos de ligação das mesmas.

[140] O termo “vetor” ou “vetor de expressão” é sinônimo de “construção de expressão” e refere-se a uma molécula de DNA que é usada para introduzir e direcionar a expressão de um gene específico ao qual está operacionalmente ligada em uma célula alvo. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual ele foi introduzido. O vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão. Os vetores de expressão permitem a transcrição de grandes quantidades de mRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão está dentro da célula-alvo, a molécula de ácido ribonucleico ou proteína que é codificada pelo gene é produzida pela transcrição celular e/ou maquinário de tradução. Em um exemplo de realização, o vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão que compreende sequências de polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, ou fragmentos de ligação das mesmas.

[141] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem de célula hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são utilizados de maneira alternada e referem-se a células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e progênie dela derivada sem levar em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica quanto a conteúdo de ácido nucleico em relação à célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológica, conforme triado ou selecionado na célula transformada inicial, é abrangida pela presente invenção. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser utilizada para gerar as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção. As células hospedeiras incluem células de cultura, por exemplo, células de mamíferos cultivadas, tais como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongos P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura , células de inseto e células vegetais, para citar apenas algumas, como também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou tecido vegetal ou animal cultivado.

[142] Uma “quantidade eficaz” de um agente refere-se à quantidade que é necessária para provocar uma alteração do estado fisiológico da célula ou do tecido ao qual é administrado.

[143] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um agente, por exemplo, uma composição farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático ou terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente, por exemplo, elimina, diminui, atrasa, minimiza ou evita os efeitos adversos de uma doença.

[144] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cachorros e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Particularmente, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.

[145] O termo “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo contida nela seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação deveria ser administrada.

[146] Um “excipiente farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma composição farmacêutica que não seja um ingrediente ativo e que não seja tóxico para um sujeito. Um excipiente farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, estabilizante ou conservante.

[147] O termo “bula” da forma como é utilizado no presente refere-se a instruções habitualmente incluídas nos recipientes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, posologia, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas à utilização de tais produtos terapêuticos.

[148] Conforme utilizado no presente, o termo “tratamento” (e variações gramaticais deste como “tratar” ou “tratando”) refere-se a intervenções clínicas em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo que está sendo tratado, e pode ser realizado para profilaxia ou durante o desenvolvimento da patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquer consequência patológica direta ou indireta da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença, e remissão ou prognóstico melhorado. Em alguns exemplos de realização, as moléculas da presente invenção são usadas para retardar o desenvolvimento de uma doença, ou para retardar a progressão de uma doença.

[149] O termo “câncer”, conforme usado na presente invenção, refere-se a doenças proliferativas, como linfomas ou leucemias linfocíticas ou melanoma.

[150] Por “distúrbio proliferativo de células B”, entende-se uma doença em que o número de células B em um paciente está aumentado em comparação com o número de células B em um indivíduo saudável, e particularmente o aumento no número de células B é a causa ou a marca registrada da doença. Um “distúrbio proliferativo de células B CD20-positivas” é um distúrbio proliferativo de células B em que as células B, particularmente as células B malignas (além das células B normais), expressam CD20. Exemplos de distúrbios proliferativos de células B incluem o linfoma não Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de zona marginal (MZL), bem como alguns tipos de mieloma múltiplo (MM) e linfoma de Hodgkin (HL).

AGONISTAS DE 4-1BB EXEMPLARES PARA USO NA INVENÇÃO

[151] Em particular, os agonistas de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a CD19, quando usado em combinação com o anticorpo anti-CD20, são moléculas compreendendo 4-1BBL. Em particular, o agonista de 4-1BB utilizado na invenção compreende três ectodomínios do 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos.

[152] Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula compreendendo três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos, e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, particularmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

[153] Foi demonstrado na presente invenção, que o agonista de 4-1BB é especialmente útil se ele compreende um domínio de ligação ao antígeno que é específico para um tumor alvo, em particular para um alvo em células B. Assim, em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a CD19.

[154] Foi ainda de demonstrado na presente invenção, que um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 não foi internalizado por CD19 em células B e, assim, não perde sua capacidade de interagir com o microambiente tumoral. Em um aspecto adicional, é fornecido um agonista de 4-1BB que não será internalizado em células B, mantendo assim sua atividade.

[155] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos uma porção capaz de ligar-se especificamente ao CD19, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 reage cruzadamente com cyno (de cinomolgo), isto é, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 se liga especificamente ao CD19 humano e ao C19 de cinomolgo.

[156] Em um aspecto adicional, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos uma porção capaz de ligar-se especificamente ao CD19, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se ao CD19 compreende; (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) um domínio VH compreendendo (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e um domínio VL compreendendo (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e (vi) CDR- L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[157] Em um aspecto particular, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende um domínio VH compreendendo (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e um domínio VL compreendendo (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e (vi) CDR- L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[158] Em um aspecto adicional, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável da cadeia leve (VLCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (V HCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. De modo mais específico, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[159] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende adicionalmente um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de realizar associação estável. Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, especificamente um domínio

Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4. Particularmente, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ou a função efetora. Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo um domínio Fc de IgG1 que compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G.

[160] Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende; (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo.

[161] Em um aspecto específico, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19; e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo fato de que (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CL e o segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1,

respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto entre os domínios CH1 e CL, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BB ou fragmentos destes, que estão ligados uns aos outros e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-

(iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL-

[162] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende; (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32; e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[163] Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação a antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em; a) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

ID NO: 40;

41 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42;

ID NO: 46;

[164] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende; (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um polipeptídeo compreendendo três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos.

[165] Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um polipeptídeo compreendendo três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos; e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o polipeptídeo compreendendo os três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos é fundido ao aminoácido N- ou C-terminal de uma das duas subunidades do domínio Fc, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[166] Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação a antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em; (a) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (c) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e (d) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

55.

[167] Em um aspecto adicional, o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-CD19/anti-4-1BB.

[168] Em um aspecto adicional, o agonista do 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente à FAP, em que o domínio de ligação ao antígeno é capaz de ligar-se especificamente à FAP compreende; (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, e (iii) CDR-

H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 e (vi) CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107.

[169] Em outro aspecto específico, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se de maneira específica à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103, e (iii) CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 e (vi) CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107.

[170] Em um aspecto adicional, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente à FAP, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 e uma região variável da cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (V HFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111. Em um aspecto mais específico, o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se de maneira específica à FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111.

[171] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende adicionalmente um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de realizar associação estável. Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, especificamente um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4. De modo particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ou a função efetora. Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo um domínio Fc de IgG1 que compreende as substituições de aminoácidos L234A,

L235A e P329G.

[172] Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende; (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente à FAP, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[173] Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende; (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente à FAP; e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo fato de que (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CL e o segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto entre os domínios CH1 e CL, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BB ou fragmentos destes, que estão ligados uns aos outros e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-

1BB ou um fragmento deste ligado por um ligante peptídico ao domínio CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou (ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3, respectivamente, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BB ou fragmentos destes que estão ligados entre si e com a extremidade C- terminal do domínio CH3 por um ligante peptídico, e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por meio de um ligante peptídico ao C-terminal do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou (iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL- CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou VH-CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto entre o domínio CH1 e CL, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4- 1BB ou fragmentos destes, que estão ligados uns aos outros e ao domínio VH ou VL por um ligante peptídico, e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[174] Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em uma molécula compreendendo uma primeira cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112, uma primeira cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113, uma segunda cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e uma segunda cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.

[175] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo; (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente à FAP, (b) um polipeptídeo compreendendo três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos.

[176] Os anticorpos biespecíficos específicos são descritos na publicação PCT WO 2016/075278 A1 ou na publicação PCT WO 2016/156291A1.

[177] Em um aspecto adicional, o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-FAP/anti-4-1BB.

PREPARAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO PARA USO NA INVENÇÃO

[178] Em determinados aspectos, os agentes terapêuticos utilizados na combinação compreendem anticorpos multiespecíficos, por exemplo, anticorpos biespecíficos. Anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Em determinados aspectos, as especificidades de ligação são para diferentes antígenos. Em determinados aspectos, as especificidades de ligação são para diferentes epítopos em um mesmo antígeno. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento completo total ou fragmentos de anticorpo.

[179] As técnicas para produzir anticorpos multiespecífico incluem, mas não estão limitadas a, coexpressão recombinante de dois pares cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina possuindo diferentes especificidades (vide Milstein e Cuello, Nature 305:537(1983)), documento WO 93/08829, e Traunecker et al, EMBO J. 10:. 3655 (1991)), e a engenharia “knob-in-hole” (vide, por exemplo, a Patente US 5.731.168). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos pela manipulação de efeitos de orientação eletrostática para a produção de moléculas heterodiméricas de Fc- anticorpo (WO 2009/089004A1); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (vide, por exemplo, Patente US 4.676.980, e Brennan et al, Science, 229: 81(1985)); utilizando zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Kostelny. et al., J. Immunol, 148 (5) :1547- 1553 (1992)); e usando a tecnologia de “diacorpo” (diabody) para a produção de fragmentos de anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Hollinger et al,.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)) e a utilização de dímeros Fv de cadeia única (sFv) (vide, por exemplo, Gruber et al,. J. Immunol., 152:5368 (1994)); e preparação de anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al.J. Immunol. 147: 60 (1991).

[180] Anticorpos manipulados com três ou mais sítios de ligação ao antígenos funcionais, incluindo anticorpos “octopus”, também estão incluídos no presente (vide, por exemplo, US 2006/0025576A1).

[181] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos da presente invenção incluem também um “Fab de dupla atuação” (Dual Acting Fab) ou “DAF” compreendendo um sítio de ligação que se liga a dois antígenos diferentes (vide, por exemplo, a publicação US 2008/0069820). Os anticorpos “CrossMab” também estão incluídos no presente documento (consulte, por exemplo, os documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO2009/080253 ou WO2009/080254).

[182] Outra técnica para preparar fragmentos de anticorpo biespecíficos é a abordagem “acoplador biespecífico de célula T” ou BiTE® (do inglês bispecific T cell engager)(vide, por exemplo, os documentos

WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261 e WO2008/119567). Esta abordagem utiliza dois domínios variáveis de anticorpo dispostos em um único polipeptídeo. Por exemplo, uma única cadeia polipeptídica inclui dois fragmentos Fv de cadeia única (scFv), cada um possuindo um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) separados por um ligante polipeptídico de um comprimento suficiente para permitir a associação intramolecular entre os dois domínios. Este polipeptídeo único inclui ainda uma sequência polipeptídica espaçadora entre os dois fragmentos scFv.

Cada scFv reconhece um epítopo diferente e estes epítopos podem ser específicos para diferentes tipos de células, de tal modo que células de dois tipos celulares diferentes são colocadas em proximidade ou presas quando cada scFv é acoplado por seu epítopo cognato. Um exemplo de realização específico de tal abordagem inclui um scFv que reconhece um antígeno da superfície celular expresso por uma célula imune, por exemplo, um polipeptídeo CD3 em uma célula T, ligado a outro scFv que reconhece um antígeno de superfície celular expresso por uma célula alvo, tal como uma célula maligna ou tumoral.

[183] Como é um polipeptídeo único, o acoplador biespecífico de células T pode ser expresso utilizando qualquer sistema de expressão de células procarióticas ou eucarióticas conhecidas no estado da técnica, por exemplo, uma linhagem de células CHO. Entretanto, podem ser necessárias técnicas de purificação específicas (vide, por exemplo, EP1691833) para separar os acopladores biespecíficos de células T monoméricos a partir de outras espécies multiméricas, que podem ter atividades biológicas diferentes da atividade pretendida do monômero. Em um esquema de purificação exemplar, uma solução contendo polipeptídeos excretados é primeiramente submetida a uma cromatografia de afinidade com metal, e os polipeptídeos são eluídos com um gradiente de concentração de imidazol. Este eluato é adicionalmente purificado utilizando cromatografia de troca aniônica e os polipeptídeos são eluídos utilizando um gradiente de concentrações de cloreto de sódio. Finalmente, este eluato é submetido a cromatografia de exclusão por tamanho para separar os monômeros das espécies multiméricas. Em um aspecto, os anticorpos biespecíficos utilizados na invenção são compostos por uma única cadeia polipeptídica compreendendo dois fragmentos FV de cadeia única (scFV) fundidos entre si por um ligante peptídico.

MODIFICAÇÕES DO DOMÍNIO FC QUE REDUZEM A LIGAÇÃO AO RECEPTOR FC E/OU A FUNÇÃO EFETORA

[184] O domínio Fc dos moléculas de ligação ao antígeno da invenção consiste em um par de cadeias polipeptídicas que compreendem domínios de cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina. Por exemplo, o domínio de Fc de uma molécula de imunoglobulina G (IgG) é um dímero, e cada subunidade compreende domínios constantes de cadeia pesada de IgG - CH2 e CH3. As duas subunidades do domínio de Fc são capazes de realizar associação estável entre si.

[185] O domínio Fc confere propriedades farmacocinéticas favoráveis à molécula de ligação ao antígeno da presente invenção, incluindo uma meia-vida sérica longa que contribui para a boa acumulação no tecido alvo e uma relação de distribuição tecido/sangue favorável. Ao mesmo tempo, ele pode, no entanto, levar ao direcionamento indesejável dos anticorpos biespecíficos da invenção para células que expressam receptores Fc ao invés de direcionar para as células contendo antígenos preferenciais.

Consequentemente, em aspectos específicos, o domínio Fc da molécula de ligação ao antígeno da invenção exibe afinidade de ligação reduzida para um receptor Fc e/ou uma função efetora reduzida, em comparação com um domínio Fc de IgG1 nativo. Em um aspecto, o Fc não se liga substancialmente a um receptor de Fc e/ou não induz a função efetora. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fcγ. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fcγ humano de ativação, mais especificamente FcγRIIIa, FcγRI ou FcγRIIa humanos, mais especificamente FcγRIIIa humano. Em um aspecto, o domínio Fc não induz função efetora. A função efetora reduzida pode incluir, mas não está limitada a, uma ou mais das seguintes: redução da citotoxicidade dependente de complemento (CDC), redução da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), redução da fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP), redução da secreção de citocinas, redução da captação de antígeno mediada por complexo imune pelas células apresentadoras de antígeno, redução da ligação de células NK, redução da ligação aos macrófagos, redução da ligação aos monócitos, redução da ligação as células polimorfonucleares, redução do sinal de indução de apoptose direta, redução da maturação de células dendríticas, ou redução do priming (ativação da célula naïve no primeiro encontro com o antígeno na superfície de uma APC) de células T.

[186] Em certos aspectos, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido na presente invenção, gerando assim um variante da região Fc. A região Fc variante humana pode compreender uma sequência da região Fc (por exemplo, sequência da região Fc da IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em um ou mais posições de aminoácidos.

[187] Em um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo em que o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc, em particular ao receptor Fcγ.

[188] Em um aspecto, o domínio Fc do anticorpo da presente invenção compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor de Fc e/ou a função efetora.

Normalmente, a mesma uma ou mais mutações de aminoácidos está presente em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. De modo específico, o domínio Fc compreende uma substituição de um aminoácido em uma posição de E233, L234, L235, N297, P331 e P329 (numeração EU). Em particular, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos nas posições 234 e 235 (numeração EU) e/ou 329 (numeração EU) das cadeias pesadas de IgG.

Mais particularmente, é fornecido um anticorpo de acordo com a invenção que compreende um domínio Fc de IgG1 com as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“P329G LALA” sistema de numeração EU) nas cadeias pesadas de IgG. As substituições de aminoácidos L234A e L235A referem-se à denominada mutação LALA. A combinação “P329G LALA” de substituições de aminoácidos abole quase que completamente a ligação ao receptor Fcγ de um domínio Fc de IgG1 humana e ela está descrita na Publicação Internacional WO 2012/130831 A1, que também descreve métodos de preparação de tais domínios Fc mutantes e métodos para a determinação de suas propriedades, tais como ligação ao receptor Fc ou funções efetoras.

[189] Os domínios Fc ligação ou receptor Fc reduzida e/ou com função efetora reduzida também incluem aqueles com a substituição de um ou mais dos seguintes resíduos no domínio Fc: 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US 6.737.056). Tais Fc mutantes incluem Fc mutantes com substituições em duas ou mais das seguintes posições de aminoácidos: 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o Fc mutante então denominado de “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US 7.332.581).

[190] Em outro aspecto, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG 4.

Anticorpos IgG4 exibem afinidade de ligação aos receptores Fc reduzida e funções efetoras reduzidas, em comparação com os anticorpos IgG 1. Em um aspecto mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4 que compreende uma substituição de aminoácido na posição S228 (numeração de Kabat), particularmente a substituição de aminoácido S228P. Em um aspecto mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4 compreendendo as substituições de aminoácidos L235E e S228P e P329G (numeração EU). Tais formas mutantes do domínio Fc de IgG4 e as suas propriedades de ligação aos receptores Fcγ também estão descritas no documento WO 2012/130831.

[191] Os domínios Fc mutantes podem ser preparados por deleção, substituição, inserção ou modificação de aminoácidos usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos no estado da técnica. Os métodos genéticos podem incluir a mutagênese sítio-especifica da sequência de DNA codificante, PCR, síntese gênica, e similares. As alterações de nucleotídeos corretas podem ser verificadas, por exemplo, por sequenciamento.

[192] A ligação aos receptores Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por ELISA, ou por ressonância plasmônica de superfície (SPR), utilizando instrumentos convencionais, tais como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e os receptores Fc podem ser obtidos por expressão recombinante. Alternativamente, a afinidade de ligação dos domínios Fc ou dos anticorpos de ativação de células compreendendo um domínio Fc para receptores de Fc pode ser avaliada utilizando linhagens de células que expressam receptores de Fc específicos, tais como as células NK humanas que expressam o receptor FcγIIIa.

[193] A função efetora de um domínio Fc, ou dos anticorpos da invenção compreendendo um domínio Fc, pode ser mensurada por métodos conhecidos no estado da técnica. Um ensaio adequado para mensurar a ADCC é descrito na presente invenção. Outros exemplos de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse encontram-se descritos na Patente US 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83,

7059-7063 (1986) e Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); Patente US 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativamente, podem ser utilizados métodos de ensaios não radioativos (vide, por exemplo, o ensaio de citotoxicidade não radioativo ACTI ® para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA), e o ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (Natural Killer ou NK).

Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como divulgado em Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

[194] Em alguns aspectos, a ligação do domínio Fc a um componente do sistema complemento, especificamente a ligação ao C1q, é reduzida. Assim, em alguns exemplos de realização, quando o domínio Fc é projetado para ter função efetora reduzida, a referida função efetora reduzida inclui redução da CDC. Também podem ser realizados ensaios de ligação ao componente C1q para confirmar se a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção é capaz de ligar-se ao C1q e, portanto, ter atividade CDC (vide, por exemplo, ELISA para ligação ao C1q e C3c no documento WO 2006/029879 e WO 2005/100402). Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio CDC pode ser executado (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al, J Immunol Methods 202, 163 (1996), Cragg et al, Blood 101, 1045-1052 (2003); e Cragg e Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

MODIFICAÇÕES DO DOMÍNIO FC PARA PROMOÇÃO DA HETERODIMERIZAÇÃO

[195] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção compreendem diferentes sítios de ligação ao antígeno, fundidos a uma ou outra das duas subunidades do domínio Fc, assim, as duas subunidades do domínio Fc são tipicamente compostas por duas cadeias polipeptídicas não idênticas. A coexpressão recombinante desses polipeptídeos e a subsequente dimerização conduzem a várias combinações possíveis dos dois polipeptídeos. Para melhorar o rendimento e pureza dos anticorpos biespecíficos da invenção na produção recombinante, será, portanto, vantajoso introduzir no domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção uma modificação para promover a associação dos polipeptídeos desejados.

[196] Consequentemente, em aspectos específicos, a invenção se refere à molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende (a) pelo menos uma porção capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação dissulfídica, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de um membro da família do ligante de TNF ou dois fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e pelo fato de que o segundo o polipeptídeo compreende apenas um ectodomínio do referido membro da família do ligante de TNF ou um fragmento do mesmo e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o domínio Fc compreende uma modificação que promove a associação da primeira e segunda subunidades do domínio Fc. O sítio de interação proteína- proteína mais amplo entre as duas subunidades de um domínio Fc da IgG humana está no domínio CH3 do domínio Fc. Assim, em um aspecto, a referida modificação é no domínio CH3 do domínio Fc.

[197] Em um aspecto específico, a referida modificação é uma modificação denominada “knob-into-hole”, que compreende uma modificação formando uma protuberância (knob) em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação formando uma cavidade (hole) na outra das duas subunidades do domínio Fc. Assim, a invenção refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo (a) pelo menos uma porção capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou dois fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si através de um peptídeo ligante e em que o segundo polipeptídeo compreende apenas um ectodomínio do referido 4-1BBL ou fragmento deste, e (c) um domínio Fc constituído por uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável, em que a primeira subunidade do domínio Fc compreende modificações knob e a segunda subunidade do domínio Fc compreende modificações hole de acordo com o método knob-into-holes. Em um aspecto específico, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração EU), e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[198] A tecnologia knob-into-hole está descrita, por exemplo, nas Patentes US 5.731.168; US 7.695.936; e em Ridgway et al, Prot Eng. 9, 617- 621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). De modo geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“knob”) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade/orifício (“hole“) correspondente na interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância pode ser posicionada na cavidade a fim de promover a formação de heterodímero e impedir a formação de homodímero. As protuberâncias são construídas pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais pequenas na interface do primeiro polipeptídeo por aminoácidos com cadeias laterais maiores (por exemplo, a tirosina ou triptofano). As “cavidades” (hole) compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao das protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais grandes por aminoácidos com cadeias laterais menores (por exemplo, alanina ou treonina).

[199] Consequentemente, em um aspecto, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, um resíduo aminoácido é substituído por um resíduo aminoácido que possui um volume de cadeia lateral maior, gerando, assim, uma protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade que pode ser posicionada dentro de uma cavidade no interior do domínio CH3 da segunda subunidade; e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo aminoácido que possui um volume de cadeia lateral menor, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade pode ser posicionada. A protuberância e a cavidade podem ser feitas através da alteração de ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese sítio- específica, ou por síntese peptídica. Em um aspecto, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W), e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc o resíduo tirosina na posição 407 é substituído por um resíduo de valina (Y407V). Em um aspecto, na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo treonina na posição 366 é substituído por um resíduo serina (T366S) e o resíduo leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A).

[200] Em um aspecto adicional, na primeira subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C), e na segunda subunidade do domínio Fc, adicionalmente, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteína (Y349C). A introdução destes dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ligação dissulfídica (ponte de bissulfeto) entre as duas subunidades do domínio Fc, que estabiliza adicionalmente o dímero (Carter, (2001) J Immunol Methods 248, 7-15). Em um aspecto específico, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração EU), e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S e Y407V (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[201] Em um aspecto uma associação promove a modificação da primeira e da segunda subunidade do domínio Fc compreende uma modificação que medeia efeitos de direcionamento eletrostático, por exemplo, conforme descrito na publicação PCT WO 2009/089004. Em geral, este método envolve a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das duas subunidades do domínio Fc por resíduos de aminoácidos carregados de modo que a formação de homodímeros se torna eletrostaticamente desfavorável, mas a heterodimerização eletrostaticamente favorável.

[202] A porção C-terminal da cadeia pesada do anticorpo biespecífico, como divulgado na presente invenção, pode ser um porção C- terminal completa terminando com os resíduos de aminoácidos PGK. O C- terminal da cadeia pesada pode ser um C-terminal encurtado no qual um ou dois dos resíduos de aminoácido do C-terminal foram removidos. Em um aspecto preferido, o C-terminal da cadeia pesada é uma porção C-terminal encurtada que termina em PG. Em um aspecto de todos os aspectos aqui divulgados, um anticorpo biespecífico compreendendo uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 C-terminal tal como especificado na presente invenção, compreende o dipeptídeo glicina-lisina C-terminal (G446 e K447,

numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Em um aspecto de todos os aspectos divulgados na presente invenção, um anticorpo biespecífico compreendendo uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 C-terminal tal como especificado na presente invenção, compreende o resíduo glicina C- terminal (G446, numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

MODIFICAÇÕES NOS DOMÍNIOS FAB

[203] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno contendo 4-1BBL, compreendendo (a) um fragmento Fab capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação dissulfídica, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo primeiro polipeptídeo compreender dois ectodomínios de 4-1BBL ou dois fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende apenas um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo; e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que em um dos fragmentos Fab os domínios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL são trocados.

Os anticorpos biespecíficos são preparados de acordo com a tecnologia Crossmab.

[204] Os anticorpos multiespecíficos com uma substituição/troca de domínio em um braço de ligação (CrossMabVH-VL ou CrossMabCH-CL) são descritos em detalhes no documento WO2009/080252 e em Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191. Eles claramente reduzem os subprodutos causados pelo pareamento incorreto de uma cadeia leve contra um primeiro antígeno com a cadeia pesada contra o segundo antígeno (em comparação com abordagens sem essa troca de domínio).

[205] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação a antígeno biespecífica que compreende (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação dissulfídica, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo primeiro polipeptídeo compreender dois ectodomínios de 4-1BBL ou dois fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende apenas um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo, e em que cada um deles está ligado a um domínio CH1 ou CL e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que os domínios constantes CL e CH1 adjacentes ao 4-1BBL são substituídos entre si para que o domínio CH1 faça parte da cadeia leve e o domínio CL faça parte da cadeia pesada.

[206] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, compreendendo (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo compreendendo dois fragmentos Fab capazes de ligar-se especificamente a um membro da família do receptor de TNF coestimulador e o domínio Fc e (b) dois fragmentos Fab adicionais capazes de ligar-se especificamente a um antígeno da célula alvo, em que os referidos fragmentos Fab adicionais estão conectados, cada um, por um ligante peptídico ao C-terminal das cadeias pesadas de (a). Em um aspecto específico, os fragmentos Fab adicionais são fragmentos Fab em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos entre si, de modo que o domínio VH é parte da cadeia leve e o domínio VL é parte da cadeia pesada.

[207] Em outro aspecto, e para melhorar ainda mais o pareamento correto, a molécula de ligação a antígeno biespecífica compreendendo (a) um primeiro fragmento Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação dissulfídica, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo primeiro polipeptídeo compreender dois ectodomínios de 4-1BBL ou dois fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende apenas um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo e em que cada um deles está ligado a um domínio CH1 ou CL e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, pode conter diferentes substituições de aminoácidos carregadas (os denominados “resíduos carregados”). Estas modificações são introduzidas nos domínios CH1 e CL cruzados ou não cruzados. Em um aspecto específico, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que em um domínio CL o aminoácido na posição 123 (numeração EU) foi substituído por arginina (R) e o aminoácido na posição 124 (numeração EU) foi substituído por lisina (K), e em que em um domínio CH1 os aminoácidos na posição 147 (numeração EU) e posição 213 (numeração EU) foram substituídos por ácido glutâmico (E).

[208] Mas especificamente, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um Fab, em que no domínio CL adjacente ao membro da família de ligantes do TNF o aminoácido na posição 123 (numeração EU) foi substituído por arginina (R) e o aminoácido na posição 124 (numeração EU) foi substituído por lisina (K), e em que o domínio CH1 adjacente ao membro da família de ligantes do TNF, os aminoácidos na posição 147 (numeração EU) e na posição 213 (numeração EU) foram substituídos por ácido glutâmico (E).

POLINUCLEOTÍDEOS

[209] A invenção fornece ainda polinucleotídeos isolados que codificam um anticorpo biespecífico, tal como descrito na presente invenção ou um fragmento do mesmo.

[210] Os polinucleotídeos isolados que codificam os anticorpos da invenção podem ser expressos como um polinucleotídeo único que codifica toda a molécula de ligação ao antígeno ou como múltiplos polinucleotídeos (por exemplo, dois ou mais) que são coexpressos. Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que são coexpressos podem associar-se por meio de, por exemplo, pontes de bissulfeto ou outros meios para formar uma molécula de ligação ao antígeno funcional. Por exemplo, a porção da cadeia leve de uma imunoglobulina pode ser codificada por um polinucleotídeo separado a partir da porção da cadeia pesada da imunoglobulina. Quando coexpressos, os polipeptídeos de cadeia pesada irão se associar com os polipeptídeos de cadeia leve de modo a formar a imunoglobulina.

[211] Em alguns aspectos, o polinucleotídeo isolado codifica todo o anticorpo de acordo com a invenção conforme descrito na presente invenção.

Em outros exemplos de realização, o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo compreendido no anticorpo de acordo com a invenção conforme descrito no presente.

[212] Em determinados exemplos de realização, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. Em outros exemplos de realização, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, sob a forma de RNA mensageiro (mRNA). O RNA da presente invenção pode ser de fita simples ou de fita dupla.

MÉTODOS RECOMBINANTES

[213] Os anticorpos biespecíficos conforme usados na invenção podem ser obtidos, por exemplo, pela síntese peptídica em estado sólido (por exemplo, pela síntese em fase sólida de Merrifield) ou pela produção recombinante. Para a produção recombinante um ou mais polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmentos polipeptídicos do mesmo, por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem adicional e/ou para a expressão em uma célula hospedeira. Tal polinucleotídeo pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais. Em um aspecto da invenção é fornecido um vetor, de preferência um vetor de expressão, compreendendo um ou mais polinucleotídeos da invenção. Os métodos que são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto podem ser usados para construir vetores de expressão contendo a sequência codificante do anticorpo (fragmento) juntamente com os sinais de controle transcricional/traducional apropriados.

Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação in vivo/recombinação genética. Vide, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, NY. (1989) e Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY (1989). O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus, ou pode ser um fragmento de ácido nucleico. O vetor de expressão inclui um cassete de expressão no qual o polinucleotídeo codificante do anticorpo ou fragmentos do mesmo (ou seja, a região codificante) é clonado em associação operável com um promotor e/ou outros elementos de controle da transcrição ou tradução. Conforme utilizado na presente invenção, uma “região codificante” ou “região de codificação” é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons que são traduzidos em aminoácidos. Embora um “códon de parada” ou “códon de terminação” (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região codificante, se presente, mas quaisquer sequências flanqueadoras, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossomo, terminadores da transcrição, íntrons, regiões 5' e 3' não traduzidas, e similares, não são parte de uma ‘região codificante’. Duas ou mais regiões codificantes podem estar presentes em uma única construção de polinucleotídeos, por exemplo, em um único vetor, ou em construções polinucleotídicas separadas,

por exemplo, em (diferentes) vetores separados.

Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região codificante, ou pode compreender duas ou mais regiões codificantes, por exemplo, um vetor da presente invenção pode codificar um ou mais polipeptídeos, que são pós- ou cotraducionalmente separados nas proteínas finais pela clivagem proteolítica.

Além disso, um vetor,

polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões codificantes heterólogas, fundidas ou não fundidas com um polinucleotídeo que codifica o anticorpo da invenção ou fragmentos polipeptídicos dos mesmos, ou formas variantes ou derivadas da mesma.

As regiões codificantes heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados tal como um peptídeo sinal de secreção ou um domínio funcional heterólogo.

Uma associação operável é quando uma região codificante de um produto gênico,

por exemplo, um polipeptídeo, é associado a uma ou mais sequências reguladoras, de tal maneira que coloca a expressão do produto do gene sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de

DNA (tal como uma região codificante do polipeptídeo e um promotor associado a esta) estão “operacionalmente associados”, se a indução da função promotora resulta na transcrição de mRNA que codifica o produto do gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências reguladoras de expressão no controle da expressão do produto do gene, ou não interfere com a capacidade do DNA molde de ser transcrito.

Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição do referido ácido nucleico.

O promotor pode ser um promotor ‘célula-específico’, que controla a transcrição substancial do DNA apenas em células pré- determinadas.

Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, facilitadores/acentuadores (enhancers), operadores,

repressores, e sinais de terminação da transcrição, podem estar operacionalmente associados com o polinucleotídeo para controlar a transcrição célula-específica.

[214] Os promotores adequados e outras regiões de controle da transcrição são divulgados na presente invenção. Diversas regiões de controle da transcrição são conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto. Dentre estas podemos citar, sem se limitar, as regiões de controle da transcrição que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não se limitando a, promotor e segmentos acentuadores (enhancers) de citomegalovírus (por exemplo, o promotor precoce imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (por exemplo, o promotor precoce), e retrovírus (por exemplo, vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle da transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados como a actina, proteína de choque térmico, hormônio do crescimento bovino e α-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão de genes em células eucarióticas. Regiões de controle da transcrição adequadas adicionais incluem promotores e facilitadores tecido-específicos, bem como promotores indutíveis (por exemplo, promotores indutíveis por tetraciclinas). De forma similar, uma variedade de elementos de controle da tradução é conhecida pelos técnicos hábeis no assunto. Estes incluem, mas não se limitam a, sítios de ligação ao ribossomo e de início da tradução, códons de terminação e elementos derivados de sistemas virais (em particular, um sítio interno de entrada de ribossomo, ou IRES, também referido como sequência CITE). O cassete de expressão também pode incluir outros recursos, como uma origem de replicação, e/ou elementos de integração cromossômica, tal como as repetições terminais longas retrovirais (LTRs) ou repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV).

[215] O polinucleotídeo e as regiões codificantes de ácido nucleico da presente invenção podem ser associados com regiões codificantes adicionais que codificam peptídeos de secreção ou de sinal, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, se é desejada a secreção do anticorpo ou fragmentos polipeptídicos do mesmo, o DNA que codifica uma sequência sinal pode ser colocado a montante do ácido nucleico que codifica o anticorpo da presente invenção ou de fragmentos deste. De acordo com a hipótese de sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos têm um peptídeo sinal ou sequência de comando de secreção, que é clivada a partir da proteína madura, quando a exportação da cadeia de proteína em crescimento através do retículo endoplasmático rugoso é iniciada. Os técnicos hábeis estão cientes de que polipeptídeos secretados por células de vertebrados têm, em geral, um peptídeo de sinal fundido com a extremidade N- terminal do polipeptídeo, e que é clivado a partir do polipeptídeo traduzido para produzir uma forma secretada ou “madura” do polipeptídeo. Em determinados exemplos de realização, o peptídeo de sinal nativo, por exemplo, um peptídeo de sinal da cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina é utilizado, ou um derivado funcional desta sequência que retenha a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo ao qual está operacionalmente associada. Alternativamente, um peptídeo sinal heterólogo de mamífero, ou um derivado funcional do mesmo, pode ser utilizado. Por exemplo, a sequência líder tipo-selvagem pode ser substituída pela sequência líder do ativador de plasminogênio tecidual humano (TPA) ou o β-glucuronidase de camundongo.

[216] Um DNA codificante de uma sequência de proteína curta que pode ser utilizado para facilitar a posterior purificação (por exemplo, um marcador histidina) ou auxiliar na marcação da proteína de fusão pode ser incluído dentro ou nas extremidades do polinucleotídeo codificante de um anticorpo da invenção ou fragmentos polipeptídicos do mesmo.

[217] Em aspecto adicional, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais polinucleotídeos da invenção. Em determinados exemplos de realização, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais vetores da invenção. Os polinucleotídeos e vetores podem incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, descritas na presente invenção em relação aos polinucleotídeos e vetores, respectivamente. Em tal aspecto, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada ou transfectada com) um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica (parte de) um anticorpo biespecífico da invenção.

Conforme utilizado no presente, o termo “célula hospedeira” refere-se a qualquer tipo de sistema celular que pode ser manipulada para gerar as proteínas de fusão da presente invenção ou fragmentos das mesmas. As células hospedeiras adequadas para a replicação e para suportar a expressão das moléculas de ligação ao antígeno são bem conhecidas no estado da técnica. Tais células podem ser transfectadas ou transduzidas, conforme apropriado, com o vetor de expressão particular, e grandes quantidades de células contendo vetor podem ser cultivadas em fermentadores de larga escala para se obter quantidades suficientes das moléculas de ligação ao antígeno para aplicações clínicas. As células hospedeiras adequadas incluem micro- organismos procarióticos, como E. coli, ou várias células eucarióticas, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de insetos, ou similares. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser produzidos em bactérias, em particular, quando a glicosilação não é necessária. Após a expressão, o polipeptídeo pode ser isolado a partir da pasta celular de bactérias em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado. Além dos procariotos, os micróbios eucariotos como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão de vetores codificantes de polipeptídeos, incluindo as cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um polipeptídeo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Vide, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), e Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

[218] Células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos (glicosilados) podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas cepas de baculovirus que podem ser utilizadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Culturas de células vegetais podem também ser utilizadas como hospedeiros. Consulte, por exemplo, as Patentes US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US

7.125.978 e US 6.417.429 (que descrevem a tecnologia PLANTIBODIES ® para produção de anticorpos em plantas transgênicas). As células de vertebrados também podem ser utilizadas como hospedeiros. Por exemplo, a linhagem de células de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão pode ser útil. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são; linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 conforme descrito em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células rim de hamster neonato (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células humanas de carcinoma cervical (HeLa); células de rim de cão (MDCK); células do fígado de rato búfalo (BRL 3A); células pulmonares humanas (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562);. células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al, Annals NY Acad.Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem a célula de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR- (Urlaub et al, Proc Acad Nat. Sci USA 77:4216 (1980)) e linhagem de células de mieloma, como a NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de proteína, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, Ed., Humana Press, Fairfield, NJ, págs 255-268 (2003). As células hospedeiras incluem células de cultura, por exemplo, células de mamíferos cultivadas, células de leveduras, células de insetos, células bacterianas e células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, ou planta transgênica ou cultura ou tecido de planta ou animal. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, de preferência uma célula de mamífero, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), célula de rim embrionário humano (HEK) ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0, SP20). As tecnologias-padrão para expressar genes exógenos em tais sistemas são conhecidas no estado da técnica. As células que expressam um polipeptídeo compreendendo a cadeia pesada ou leve de uma imunoglobulina podem ser manipuladas de modo a expressarem também as outras cadeias de imunoglobulina de tal modo que o produto expresso é uma imunoglobulina que tem tanto a cadeia pesada quanto a cadeia leve.

[219] Em um aspecto, é fornecido um método de produção de um anticorpo ou fragmentos polipeptídicos do mesmo, em que o método compreende a cultura de uma célula hospedeira que compreende polinucleotídeos que codificam o anticorpo da invenção ou fragmentos polipeptídicos do mesmo, sob condições adequadas para expressão do anticorpo da invenção ou fragmentos polipeptídicos do mesmo, e a recuperação do anticorpo da invenção ou fragmentos polipeptídicos do mesmo (ou meio de cultura da célula hospedeira).

[220] Em determinados exemplos de realização das porções capazes de ligar-se especificamente a um antígeno da célula alvo (por exemplo, fragmentos Fab), que formam parte da molécula de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma região variável de imunoglobulina capaz de ligar-se a um antígeno. As regiões variáveis podem formar parte de, e serem derivadas de anticorpos de ocorrência natural ou de anticorpos que não ocorrem naturalmente e fragmentos dos mesmos. Os métodos para produzir anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais são bem conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Harlow e Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Os anticorpos de ocorrência não natural podem ser construídos utilizando a síntese de peptídeo em fase- sólida, podem ser produzidos de forma recombinante (por exemplo, conforme descrito na Patente US 4.186.567) ou podem ser obtidos, por exemplo, por rastreio de bibliotecas combinatórias que compreendem cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis (vide, por exemplo, a Patente US 5.969.108 de McCafferty).

[221] Uma imunoglobulina a partir de qualquer espécie de animal pode ser utilizada na invenção. Imunoglobulinas úteis não limitantes na presente invenção podem ser de murinos, primata, ou de origem humana. Se a proteína de fusão é para uso humano, uma forma quimérica de imunoglobulina pode ser utilizada onde as regiões constantes da imunoglobulina são de humanos. A forma humanizada ou totalmente humana da imunoglobulina também pode ser preparada de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, a Patente US 5.565.332 de Winter). A humanização pode ser obtida por meio de vários métodos, incluindo, mas não se limitando a: (a) enxertar CDRs não humanas (por exemplo, anticorpo doador) na região de arcabouço (framework) humana (por exemplo, anticorpo receptor) e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos da estrutura central críticos (por exemplo, aqueles que são importantes para manter boa afinidade de ligação ao antígeno ou funções do anticorpo), (b) enxertar apenas as regiões determinantes de especificidade não humanas (SDRs ou a-CDRs, os resíduos críticos para a interação anticorpo-antígeno) na região do arcabouço (framework) humana e regiões constantes, ou (c) transplantando os domínios variáveis não humanos inteiros, mas “camuflando” eles com uma seção semelhante à humana pela substituição de resíduos de superfície. Os anticorpos humanizados e métodos para a preparação dos mesmos são revistos, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), e encontram-se descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988);. Queen et al, Proc Natl Acad Sci USA 86, 10.029-10.033 (1989), Patente US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321, e US 7.087.409;.

Jones et al, Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al, Proc Natl Acad Sci USA 81, 6851-6855 (1984);. Morrison e Oi, Adv. Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al, Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31 (3), 169-217 (1994);. Kashmiri et al, Methods 36, 25-34 (2005) (descrevendo enxerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28, 489-498 (1991) (descrevendo o técnica de “resurfacing”);. Dall'Acqua et al, Methods 36, 43-60 (2005) (descrevendo “FR shuffling”); e Osbourn et al, Methods 36, 61-68 (2005) e Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (descrevendo a abordagem de “seleção orientada” para o shuffling de FR). Imunoglobulinas particulares de acordo com a invenção são imunoglobulinas humanas. Os anticorpos humanos e regiões variáveis humanas podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas no estado da técnica. Anticorpos humanos estão descritos de modo geral em van Dijk e van Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008). As regiões variáveis humanas podem formar parte de, e serem derivadas de anticorpos monoclonais humanos criados pelo método do hibridoma (vide, por exemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs 51-63

(Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)). Os anticorpos e regiões variáveis de humanos podem ser preparados pela administração de um imunógeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico (vide, por exemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005). Os anticorpos humanos e regiões variáveis humanas podem também ser gerados isolando as sequências da região variável do clone Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição em fagos de origem humana (vide, por exemplo, Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed, Human Press, Totowa, NJ, 2001);. e McCafferty et al, Nature 348, 552-554, Clackson et al, Nature 352, 624-628 (1991)). O fago normalmente exibe fragmentos de anticorpo, como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab.

[222] Em certos aspectos, os anticorpos são manipulados para terem afinidade de ligação aprimorada de acordo, por exemplo, com os métodos divulgados na publicação PCT WO 2012/020006 (consulte os Exemplos relacionados à maturação por afinidade) ou Pedido de Patente Norte-Americano US 2004/0132066. A capacidade das moléculas de ligação ao antígeno em ligar a um determinante antigênico específico pode ser mensurada por meio de um ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA) ou outras técnicas familiares para um técnico hábil no assunto, por exemplo, a técnica de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (Liljeblad et al., Glico J 17, 323- 329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley., Endocr Res 28, 217- 229 (2002)). Os ensaios de competição podem ser usados para identificar uma molécula de ligação ao antígeno que compete com um anticorpo de referência pela ligação a um determinado antígeno. Em determinados exemplos de realização, tal molécula de ligação ao antígeno competidora se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) ao qual a molécula de ligação ao antígeno de referência se liga. Métodos exemplares detalhados para o mapeamento de um epítopo ao qual uma molécula de ligação ao antígeno se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” Em Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Em um ensaio de competição exemplar, o antígeno imobilizado é incubado com uma solução compreendendo uma primeira molécula de ligação ao antígeno marcada que se liga ao antígeno e uma segunda molécula de ligação ao antígeno não marcada que está sendo testado quanto à sua capacidade de competir com a primeira molécula de ligação ao antígeno para ligar-se ao antígeno. A segunda molécula de ligação ao antígeno pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, o antígeno imobilizado é incubado com uma solução compreendendo a primeira molécula de ligação ao antígeno marcada, mas não a segunda molécula de ligação ao antígeno não marcada. Após a incubação, sob condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo ao antígeno, o excesso de anticorpo não ligado é removido, e a quantidade de marcador associada com antígeno imobilizado é mensurada.

Se a quantidade de marcador associado com antígeno imobilizado for substancialmente reduzida na amostra teste em relação à amostra controle, então isso indica que a segunda molécula de ligação ao antígeno compete com a primeira molécula de ligação ao antígeno pela ligação ao antígeno. Vide Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

[223] Os anticorpos da invenção preparados conforme descrito no presente podem ser purificados por técnicas conhecidas pelos especialistas no assunto, tal como a cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão por tamanho, e técnicas similares. As condições reais utilizadas para purificar uma proteína particular dependerão, em parte, de fatores como a carga líquida, a hidrofobicidade, a hidrofilicidade, e etc, e serão evidentes para os especialistas no assunto. Para a purificação usando a cromatografia de afinidade, pode ser usado um anticorpo, ligante, receptor ou antígeno ao qual a molécula de ligação ao antígeno se liga. Por exemplo, para a purificação da proteína de fusão da invenção por cromatografia de afinidade, pode ser usada uma matriz com a proteína A ou proteína G. A cromatografia de afinidade em Proteína A ou G sequencial e a cromatografia de exclusão por tamanho podem ser usadas para isolar a molécula de ligação ao antígeno essencialmente conforme descrito nos Exemplos. A pureza da molécula de ligação ao antígeno ou fragmentos da mesma pode ser determinada por qualquer um dentre uma variedade de métodos bem conhecidos, incluindo a análise por eletroforese em gel, cromatografia líquida de alta pressão, e similares. Por exemplo, as moléculas de ligação ao antígeno contendo 4-1BB expressas como descrito nos Exemplos mostraram-se intactas e devidamente montadas, conforme demonstrado por SDS-PAGE redutor e não redutor.

ENSAIOS

[224] As moléculas de ligação ao antígeno fornecidas na presente invenção podem ser identificadas, rastreadas, ou caracterizadas por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos no estado da técnica.

1. ENSAIOS DE AFINIDADE

[225] A afinidade das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecida na presente invenção para o receptor correspondente pode ser determinada de acordo com os métodos descritos nos Exemplos por ressonância plasmônica de superfície (SPR), utilizando instrumentos convencionais, como um instrumento BIAcore (GE Heathcare), e receptores ou proteínas alvo, que podem ser obtidos por expressão recombinante. A afinidade da molécula de ligação ao antígeno biespecífica para o antígeno da célula alvo também pode ser determinada por ressonância plasmônica de superfície (SPR), utilizando a instrumentação convencional, tal como um instrumento BIAcore (GE Healthcare), e receptores ou proteínas alvo, como pode ser obtido pela expressão recombinante. Para as moléculas de ligação ao antígeno CD19-4-1BBL, os métodos foram descritos em mais detalhes no pedido de Patente Internacional publicado WO 2016/075278 A1. De acordo com um aspecto, a KD é mensurada pela ressonância plasmônica de superfície utilizando um dispositivo BIACORE® T100 (GE Healthcare), a 25ºC.

2. ENSAIOS DE LIGAÇÃO E OUTROS ENSAIOS

[226] Em um aspecto, as moléculas de ligação ao antígeno CD19-4-1BBL, conforme relatadas no presente documento, são testadas quanto à sua atividade de ligação ao antígeno, conforme descrito em mais detalhes no Exemplo 2.

3. ENSAIOS DE ATIVIDADE

[227] Em um aspecto, são fornecidos ensaios para identificar a atividade biológica das moléculas de ligação ao antígeno CD19-4-1BBL. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, inibição da proliferação de células B ou morte de células B. Anticorpos possuindo tal atividade biológica, in vivo e/ou in vitro também são fornecidos. Para as moléculas de ligação ao antígeno CD19-4-1BBL, alguns métodos foram descritos em mais detalhes no pedido de Patente Internacional publicado WO 2016/075278 A1.

[228] Em certos exemplos de realização, um anticorpo como divulgado na presente invenção é testado para essa atividade biológica.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, FORMULAÇÕES E MODO DE ADMINISTRAÇÃO

[229] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo os agonistas de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, e os anticorpos anti-CD20 fornecidos na presente invenção, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos abaixo. Em um aspecto, a composição farmacêutica compreende um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, fornecido na presente invenção e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável e um segundo medicamento compreendendo um anticorpo anti-CD20. Em outro exemplo de realização, uma composição farmacêutica compreende um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, fornecido na presente invenção, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável, um segundo medicamento compreendendo um anticorpo anti-CD20 e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo.

[230] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais molécula de ligação ao antígeno descritas na presente invenção dissolvida ou dispersa em um excipiente farmaceuticamente aceitável. As frases “farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitáveis” refere-se a entidades moleculares e composições que são geralmente atóxicas para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas, ou seja, não produzem uma reação adversa nociva, alérgica ou outra quando administrada a um animal, por exemplo, um humano, quando apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém pelo menos um anticorpo e, opcionalmente, um ingrediente ativo adicional será do conhecimento dos técnicos hábeis no assunto à luz da presente divulgação, conforme exemplificado em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado ao presente pela referência. Especificamente, as composições são formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Conforme utilizado na presente invenção, “excipiente farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer e todos os solventes, tampões, meios de dispersão, revestimentos, agentes tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, sais, estabilizantes e combinações dos mesmos, como do conhecimento de um técnico hábil no assunto.

[231] As composições parenterais incluem aquelas que foram concebidas para a administração por injeção, por exemplo, por via subcutânea, intradérmica, intralesional, administração intravenosa, intramuscular, intra- arterial, intratecal ou intraperitoneal. Para injeção, a molécula de ligação ao antígeno da invenção pode ser formulada em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tal como a solução de Hanks, solução de Ringer, ou tampão salino fisiológico. A solução pode conter agentes de formulação, tais como suspensões, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, as proteínas de fusão podem estar na forma de pó para a constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril livre de pirogênicos, antes da utilização. As soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporação das proteínas de fusão da invenção na quantidade requerida em solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados a seguir, se necessário. A esterilização pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio da filtragem através de membranas de filtração estéreis. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação dos diversos ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ou outros ingredientes. No caso de pó estéril para a preparação de soluções injetáveis estéreis, suspensões ou emulsões, os métodos preferidos de preparação são secagem à vácuo ou técnicas de liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de um meio líquido previamente esterilizado por filtração.

O meio líquido deve ser adequadamente tamponado se necessário e o diluente líquido de primeiro ser tornado isotônico antes da injeção com solução salina ou glicose suficiente.

A composição deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento, e protegida contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos.

Será apreciado que a contaminação com endotoxinas deve ser mantida minimamente a um nível seguro, por exemplo, menos que 0,5 ng/mg de proteína.

Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem,

mas não estão limitados a: tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes

(tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio;

cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzilíco;

alquil parabenos tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol;

ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular

(menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro,

gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina,

histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo a glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açucares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol;

contraíons formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (tal como,

complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos como polietileno glicol

(PEG). As suspensões para injeção aquosas podem conter compostos que aumentam a viscosidade da suspensão, como a carboximetilcelulose de sódio,

sorbitol, dextrano, ou outros compostos similares.

Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas de modo adequado.

Além disso, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, tal como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como cleats de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas.

[232] Os ingredientes ativos podem ser retidos (encapsulados) em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de coacervação ou por meio de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, (18ª Edição, Mack Printing Company 1990). Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada.

Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o polipeptídeo, que se encontram na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Em exemplos de realização específicos, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser provocada pela utilização de agentes que atrasam a absorção nas composições, tais como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou combinações dos mesmos.

[233] Exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem ainda agentes de dispersão intersticial de fármacos, tais como glicoproteínas hialuronidase neutro-ativas solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH-20 humana solúvel, como a rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e métodos de utilização, incluindo a rHuPH20, estão descritos nas Publicações de Patente US 2005/0260186 e US 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais,

tais como condroitinases.

[234] Formulações de anticorpos liofilizados exemplares estão descritas na Patente US 6.267.958. As formulações aquosas de anticorpos incluem as descritas na Patente US 6.171.586 e no documento WO 2006/044908, sendo que as formulações deste último incluem um tampão histidina-acetato.

[235] Além das composições descritas anteriormente, os anticorpos também podem ser formulados como uma preparação de depósito (depot). Tais formulações de ação prolongada podem ser administradas pela implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou pela injeção intramuscular. Assim, por exemplo, a proteínas de fusão podem ser formuladas com materiais poliméricos apropriados ou materiais hidrofóbicos (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados fracamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.

[236] As composições farmacêuticas que compreendem as moléculas de ligação ao antígeno da invenção podem ser produzidas por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, emulsão, encapsulação, aprisionamento ou liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de modo convencional usando um ou mais veículos, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis que facilitem o processamento das proteínas em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada é dependente da via de administração escolhida.

[237] O agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 fornecido na presente invenção pode ser formulado em uma composição de uma foram de base ou ácido livre, neutra ou na forma sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são sais que retêm substancialmente a atividade biológica do ácido ou base livre. Estes incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como o ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Os sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, ou de bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína. Os sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e solventes próticos do que as formas de base livre correspondentes.

[238] A presente composição também pode conter mais de um ingrediente ativo de acordo com a necessidade para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não sejam prejudiciais entre si. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

[239] Em um aspecto, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 e um excipiente farmaceuticamente aceitável, e um segundo medicamento compreendendo um anticorpo anti-CD20 tal como descrito na presente invenção. Em um aspecto particular, a composição farmacêutica é para uso no tratamento de distúrbios proliferativos de células B, particularmente doenças selecionadas a partir do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de zona marginal (MZL), mieloma múltiplo (MM) ou linfoma de Hodgkin (HL).

[240] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilização pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio da filtragem através de membranas de filtração estéreis.

ADMINISTRAÇÃO DO AGONISTA DE 4-1BB COMPREENDENDO PELO MENOS UM DOMÍNIO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CAPAZ DE LIGAR-SE ESPECIFICAMENTE AO CD19 FORNECIDO NA PRESENTE INVENÇÃO E O ANTICORPO ANTI-CD20

[241] O agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 e o anticorpo anti-CD20 (ambos denominados de substância na presente invenção) podem ser administrados por qualquer meio adequado, incluindo por administração parenteral, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para o tratamento local, administração intralesional. Entretanto, os métodos da presente invenção são particularmente úteis em relação a agentes terapêuticos administrados por infusão parenteral, particularmente por infusão intravenosa.

[242] As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A administração pode ser feita por qualquer via de administração adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem, incluindo, mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas ao longo do tempo, em vários pontos de tempo, administração em bolus, e infusão pulsada são contempladas pela presente invenção. Em um exemplo de realização, o agente terapêutico é administrado por via parental, particularmente por via intravenosa. Em um exemplo de realização particular, a substância é administrada por infusão intravenosa. Em outro aspecto, a substância é administrada subcutaneamente.

[243] O agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou FAP, e o anticorpo anti- CD20 seriam formulados, dosados, e administrados de um modo consistente com as boas práticas médicas. Os fatores que devem ser considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. Tanto o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, quanto o anticorpo anti-CD20 não precisam ser, mas opcionalmente são formulados com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de agente terapêutico presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos anteriormente. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descritas acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer via de administração descrita que é empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.

[244] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, fornecido na presente invenção e o anticorpo anti-CD20 (quando utilizado em sua combinação ou com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo de agente 4-1BB, da gravidade e curso da doença, se ambos os agentes são administrados para o tratamento preventivo ou fins terapêuticos, da terapia anterior, do histórico clínico do paciente e da resposta ao agente terapêutico, e a critério do médico atendente. Cada substância é adequadamente administrada ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 µg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg – 10 mg/kg) da substância pode ser uma dose candidata inicial para administração ao sujeito, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderá variar em cerca de 1 µg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima.

Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode ser mantido até que ocorra supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar de cada substância estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg (ou qualquer combinação destas dosagens) podem ser coadministradas ao sujeito.

Essas doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, semanalmente, a cada duas semanas, ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, ou, por exemplo, cerca de seis doses do agente terapêutico). Pode ser administrada uma dose inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas, ou uma dose inicial mais baixa, seguida por uma ou mais doses mais altas. Um regime de dosagem exemplar compreende a administração de uma dose de ataque inicial de cerca de 10 mg, seguida por doses bissemanais de cerca de 20 mg do agente terapêutico. Entretanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e ensaios convencionais.

[245] Em um aspecto, a administração do agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou

FAP, e do anticorpo anti-CD20 é feita em uma única administração.

Em determinados aspectos, a administração da substância é feita em duas ou mais administrações.

Em um destes aspectos, as substâncias são administrados a cada semana, a cada duas semanas ou a cada três semanas, particularmente a cada duas semanas.

Em um aspecto, a substância é administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

Em um aspecto, a substância é administrada a uma dose de cerca de 50 µg/kg, cerca de 100 µg/kg, cerca de

200 µg/kg, cerca de 300 µg/kg, cerca de 300 µg/kg, cerca de 400 µg/kg, cerca de 500 µg/kg, cerca de 600 µg/kg, cerca de 700 µg/kg, cerca de 800 µg/kg,

cerca de 900 µg/kg ou cerca de 1000 µg/kg.

Em um exemplo de realização, o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor,

em particular CD19 ou FAP, é administrado em uma dose que é maior que a dose do agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, em um regime de tratamento correspondente sem a administração do anticorpo anti-CD20. Em um aspecto,

a administração do agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, fornecida na presente invenção compreende uma administração inicial de uma primeira dose do anticorpo anti-CD20, e uma ou mais administrações subsequentes de uma segunda dose do anticorpo anti-CD20, em que a segunda dose é mais elevada do que a primeira dose.

Em um aspecto, a administração do agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-

se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, fornecida na presente invenção compreende uma administração inicial de uma primeira dose do anticorpo anti-CD20, e uma ou mais administrações subsequentes de uma segunda dose do anticorpo anti-CD20, em que a primeira dose não é menor que a segunda dose.

[246] Em um aspecto, a administração do agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, no regime de tratamento de acordo com a invenção, é a primeira administração do agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 ao sujeito (pelo menos dentro do mesmo curso de tratamento). Em um aspecto, nenhuma administração do anticorpo anti-CD20 é feita ao sujeito antes da administração do agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou FAP. Em outro aspecto, o anticorpo anti-CD20 é administrado antes da administração do agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP.

[247] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, é para uso em combinação com um anticorpo anti-CD20, em que um pré- tratamento com um anticorpo anti-CD20 tipo II, preferencialmente obinutuzumabe, é realizado antes do tratamento combinado, em que o período de tempo entre o pré-tratamento e o tratamento combinado é suficiente para a redução das células B no indivíduo em resposta ao anticorpo anti-CD20 tipo II, preferencialmente obinutuzumabe.

[248] A ativação de células T pode levar à síndrome de liberação de citocinas grave (CRS). Em um estudo de fase 1 conduzido pela TeGenero (Suntharalingam et al., N Engl J Med (2006) 355,1018-1028), todos os 6 voluntários saudáveis experenciaram uma síndrome de liberação de citocinas grave (CRS, do inglês cytokine release syndrome), quase fatal, logo após a infusão inadequada de um anticorpo monoclonal superagonista anti-CD28 estimulador de células T. A liberação de citocinas associada à administração de um agente terapêutico ativador de células T, como o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, a um sujeito pode ser significativamente reduzida pelo pré-tratamento do referido sujeito com um anticorpo anti-CD20 Tipo II, tal como o obinutuzumabe.

O uso do pré-tratamento com GAZYVA® (Gpt) deve auxiliar na rápida depleção de células B, tanto no sangue periférico quanto nos órgãos linfoides secundários, de modo que o risco de eventos adversos (EAs) altamente relevantes da forte ativação sistêmica de células T pelos agentes terapêuticos de ativação de células T (por exemplo, CRS) é reduzido, enquanto suporta níveis de exposição de agentes terapêuticos de ativação de células T que são altos o suficiente desde o início da administração para mediar a eliminação das células tumorais. Até a presente data, o perfil de segurança do obinutuzumabe (incluindo a liberação de citocinas) foi avaliado e gerenciado em centenas de pacientes em ensaios clínicos em andamento com obinutuzumabe. Finalmente, além de apoiar o perfil de segurança do agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, fornecido na presente invenção, o Gpt também deve auxiliar a impedir a formação de anticorpos antifármacos (ADAs, do inglês anti-drug antibodies) contra essas moléculas únicas.

[249] Na presente invenção, a combinação do agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular, CD19 ou

FAP, e o anticorpo anti-CD20 pode ser utilizada em combinação com um ou mais agentes adicionais em uma terapia. Por exemplo, pelo menos um agente terapêutico adicional pode ser coadministrado. Em certos aspectos, um agente terapêutico adicional é um agente imunoterápico.

[250] Tais terapias combinadas referidas acima abrangem a administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma formulação ou em formulações distintas), e a administração separada, nesse caso a administração do agente terapêutico pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após, administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em um exemplo de realização, a administração do agente terapêutico e a administração de um agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de um mês, ou dentro de uma, duas ou três semanas, ou dentro de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias.

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[251] CD20 e CD19 são expressos na maioria das células B (marcador de células B-pan), com exceção das células-tronco e células plasmáticas (plasmócitos), e são frequentemente expressas na maioria das doenças malignas de células B humanas (antígeno associado a tumores), como linfoma e leucemias, exceto mieloma múltiplo, por exemplo, no linfoma não-Hodgkin e leucemia linfoblástica aguda.

[252] As moléculas biespecíficas que reconhecem duas proteínas da superfície celular em diferentes populações celulares têm a promessa de redirecionar células imunes citotóxicas para a destruição de células alvo patogênicas.

[253] Em um aspecto, a invenção provê um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um sujeito que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19, e um anticorpo anti-CD20.

[254] Neste aspecto, o método compreende ainda a administração de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional ao sujeito. Em aspectos adicionais, a invenção provê um método para depletar células B que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 fornecido na presente invenção e um anticorpo anti-CD20. Um “indivíduo” ou “sujeito”, de acordo com qualquer um dos aspectos acima, é preferencialmente um ser humano.

[255] Em outros aspectos, é fornecida uma composição para uso na imunoterapia contra o câncer compreendendo um agonista de 4-1BB que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 fornecido na presente invenção e um anticorpo anti- CD20. Em determinados aspectos, é fornecida uma composição compreendendo um agonista de 4-1BB que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 fornecido na presente invenção e um anticorpo anti-CD20 para uso em um método de imunoterapia contra o câncer.

[256] Em um aspecto adicional, é fornecido o uso de uma composição compreendendo um agonista de 4-1BB que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 fornecido na presente invenção e um anticorpo anti-CD20 na fabricação ou preparação de um medicamento. Em um exemplo de realização, o medicamento é para o tratamento de um distúrbio proliferativo de células B.

Em um exemplo de realização adicional, o medicamento é para uso em um método de tratamento de um distúrbio proliferativo de células B, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do medicamento a um indivíduo com o distúrbio proliferativo de células B. Neste exemplo de realização, o método compreende ainda a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Em um exemplo de realização adicional, o medicamento é para a depleção de células B. Os distúrbios proliferativos de células B são selecionados a partir do grupo que consiste em linfoma não Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de zona marginal (MZL), mieloma múltiplo (MM) ou linfoma de Hodgkin (HL). Em um aspecto particular, o câncer de células B é linfoma não Hodgkin ou leucemia linfoblástica aguda.

[257] Em um aspecto adicional, é fornecido um método para o tratamento de um câncer de células B. Em um exemplo de realização, o método compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD20 humano ao indivíduo com tal câncer de células B. Neste exemplo de realização, o método compreende ainda a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito abaixo. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode ser um humano. O câncer de células B é, em um exemplo de realização, um linfoma de células B ou leucemia de células B. Em um exemplo de realização, o câncer de células B é linfoma não Hodgkin ou leucemia linfoblástica aguda.

[258] As terapias combinadas referidas acima abrangem a administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma formulação ou em formulações distintas), e a administração separada, nesse caso a administração do anticorpo divulgado na presente invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração dos agentes terapêuticos adicionais. Em um exemplo de realização, a administração do anticorpo anti-CD20 humano e a administração de um agente terapêutico adicional ocorre dentro de cerca de um mês, ou dentro de cerca de uma, duas ou três semanas, ou dentro de cerca de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias, entre elas.

[259] O agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 e o anticorpo anti-CD20 (e qualquer agente terapêutico adicional) podem ser administrados por qualquer meio adequado, incluindo a administração parenteral, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para o tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A administração pode ser feita por qualquer via de administração adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem, incluindo, mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas ao longo do tempo, em vários pontos de tempo, administração em bolus, e infusão pulsada são contempladas pela presente invenção.

[260] Tanto o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19, quanto o anticorpo anti-CD20 divulgado na presente invenção seriam formulados, dosados, e administrados de um modo consistente com as boas práticas médicas. Os fatores que devem ser considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. Os anticorpos não precisam ser, mas opcionalmente são formulados com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar os distúrbios em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpos presentes na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e de outros fatores discutidos anteriormente.

Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descritas acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer via de administração descrita que é empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.

OUTROS AGENTES E TRATAMENTOS

[261] As moléculas de ligação ao antígeno da invenção podem ser administradas em combinação com um ou mais de agentes diferentes em terapia. Por exemplo, uma proteína de fusão da invenção pode ser coadministrada com pelo menos um agente terapêutico adicional. O termo “agente terapêutico” abrange qualquer agente que possa ser administrado para tratar um sintoma ou doença em um indivíduo com necessidade de tal tratamento. Tal agente terapêutico adicional pode compreender quaisquer ingredientes ativos adequados para a indicação particular a ser tratada, de preferência aqueles que têm atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Em alguns exemplos de realização, um agente terapêutico adicional é outro agente anticâncer.

[262] Tais outros agentes estão adequadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de proteína de fusão usada, o tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos anteriormente. As moléculas de ligação ao antígeno são geralmente utilizadas nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer via de administração descrita que é empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.

[263] Tais terapias combinadas referidas acima abrangem a administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma composição ou em composições distintas), e a administração separada, nesse caso a administração das moléculas de ligação ao antígeno da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante.

ARTIGOS DE MANUFATURA (KITS)

[264] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um kit contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos anteriormente. O kit compreende pelo menos um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou associado a ele. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de soluções para administração I.V. e etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda uma composição que é por si só, ou em combinação com outra composição, eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou uma ampola que contém uma tampa que é perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos dois agentes ativos no kit são um anticorpo biespecífico anti-CD20/anti-CD3 e um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, de acordo com a invenção.

[265] Em um aspecto específico, é fornecido um kit para tratar ou retardar a progressão do câncer em um sujeito, compreendendo uma embalagem que compreende (A) uma primeira composição compreendendo como ingrediente ativo um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, e um excipiente farmaceuticamente aceitável; e (B) uma segunda composição compreendendo como ingrediente ativo um anticorpo anti-CD20 e um excipiente farmaceuticamente aceitável e (C) instruções para o uso das composições em uma terapia combinada.

[266] O rótulo ou bula indica como a composição é usada para tratar a condição de escolha e fornece as instruções para o uso das composições em uma terapia combinada. Além disso, o kit pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida nele, em que a composição compreende um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo anti-CD20. Além disso, o kit pode compreender um ou mais recipientes adicionais compreendendo outros ingredientes ativos que podem ser utilizados em combinação. O artigo de manufatura neste exemplo de realização pode compreender ainda uma bula indicando que a composição pode ser usada para tratar uma condição específica.

[267] Alternativamente ou adicionalmente, o kit pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

TABELA D (SEQUÊNCIAS) SEQ ID Nome Sequência NO: 1 4-1BBL humano (hu 4- REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL

SEQ ID Nome Sequência NO: 1BBL) (71-254) SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF

FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT

EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 2 hu 4-1BBL (85-254) LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLT

GGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGS GSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS AFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQG

ATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 3 hu 4-1BBL (80-254) DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLA

GVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVV AGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASS EARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW

QLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 4 hu 4-1BBL (52-254) PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDL

RQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAF GFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT

VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 5 4-1BBL humano (hu 4- REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL 1BBL) (71-248) SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF

FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT

EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 6 hu 4-1BBL (85-248) LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLT

ATVLGLFRVTPEIPAGL 7 hu 4-1BBL (80-248) DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLA

QLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 8 hu 4-1BBL (52-248) PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDL

VLGLFRVTPEIPAGL 9 CD19 (8B8-018) CDR-H1 DYIMH 10 CD19 (8B8-018) CDR-H2 YINPYNDGSKYTEKFQG 11 CD19 (8B8-018) CDR-H3 GTYYYGSALFDY 12 CD19 (8B8-018) CDR-L1 KSSQSLENPNGNTYLN 13 CD19 (8B8-018) CDR-L2 RVSKRFS 14 CD19 (8B8-018) CDR-L3 LQLTHVPYT 15 CD19 (8B8-2B11) CDR- DYIMH H1 16 CD19 (8B8-2B11) CDR- YINPYNDGSKYTEKFQG H2

SEQ ID Nome Sequência NO: 17 CD19 (8B8-2B11) CDR- GTYYYGPQLFDY H3 18 CD19 (8B8-2B11) CDR- KSSQSLETSTGTTYLN L1 19 CD19 (8B8-2B11) CDR- RVSKRFS L2 20 CD19 (8B8-2B11) CDR- LQLLEDPYT L3 21 CD19 (8B8-018) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW

VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALF

DYWGQGTTVTVSS 22 CD19 (8B8-018) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLENPNGNTYL

NWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGT

DFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGTKLEIK 23 CD19 (8B8-2B11) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW

VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLF

DYWGQGTTVTVSS 24 CD19 (8B8-2B11) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGTTYL

NWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGT

DFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDPYTFGQGTKLEIK 25 hu 4-1BBL dimérico (71- REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL 254) conectado pelo SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF ligante (G4S)2 FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL

TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEG GGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLV AQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKEL VVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPL RSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLS AGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEI

PAGLPSPRSE 26 hu 4-1BBL dimérico (85- LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLT 254) conectado pelo GGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGS ligante (G4S)2 GSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS

AFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQG ATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSLDLR QGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLS YKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVS LALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGF QGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVL

GLFRVTPEIPAGLPSPRSE 27 hu 4-1BBL dimérico (80- DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLA 254) conectado pelo GVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVV ligante (G4S)2 AGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASS

EARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW QLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGG GSDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDP GLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELR RVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPP ASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARAR HAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE

SEQ ID Nome Sequência NO: 28 hu 4-1BBL dimérico (52- PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDL 254) conectado pelo RQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG ligante (G4S)2 LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS

VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAF GFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSPWAVS GARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMF AQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKED TKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALH LQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRL LHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFR

VTPEIPAGLPSPRSE 29 hu 4-1BBL dimérico (71- REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL 248) conectado pelo SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF ligante (G4S)2 FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL

TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSG GGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLI DGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAG VYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGA AALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLG

VHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 30 hu 4-1BBL dimérico (85- LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLT 248) conectado pelo GGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGS ligante (G4S)2 GSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS

AFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQG ATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSLDLRQGMFA QLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDT KELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHL QPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLL HLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRV

TPEIPAGL 31 hu 4-1BBL dimérico (80- DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLA 248) conectado pelo GVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVV ligante (G4S)2 AGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASS

EARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW QLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSDPAG LLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEG SGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARN SAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQ

GATVLGLFRVTPEIPAGL 32 hu 4-1BBL dimérico (52- PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDL 248) conectado pelo RQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG ligante (G4S)2 LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS

VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAF GFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSPWAVSGARASP GSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQ NVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVV AKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRS AAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAG QRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPA GL

SEQ ID Nome Sequência NO: 33 anti-CD19(8B8-018) Fc QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW cadeia hole VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT

SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALF DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSPGK 34 cadeia leve do anti- DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLENPNGNTYL CD19(8B8-018) NWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGT

DFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL

SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 35 hu 4-1BBL dimérico (71- REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL 254)-CL* cadeia knob Fc SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF

FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEG GGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLV AQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKEL VVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPL RSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLS AGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEI PAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDR KLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 36 hu 4-1BBL monomérico REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL (71-254)-CH1* SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF

FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEG GGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPK

SC 37 hu 4-1BBL dimérico (71- REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL 254)-CL cadeia knob Fc SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF

FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEG GGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLV

SEQ ID Nome Sequência NO:

AQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKEL VVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPL RSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLS AGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEI PAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 38 hu 4-1BBL monomérico REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL (71-254)-CH1 SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF

FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEG GGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK

SC 39 anti-CD19(8B8-018), QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW cadeia do ligante dimérico VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT hole Fc SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALF

DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAG LLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEG SGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARN SAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQ GATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRE GPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSW YSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQ LELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTV DLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEA

RARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 40 anti-CD19(8B8-018), QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW cadeia do ligante VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT monomérico knob Fc SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALF

DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV

SEQ ID Nome Sequência NO:

SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVS LTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLT

QGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 41 hu 4-1BBL dimérico (71- REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL 248)-CL* cadeia knob Fc SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF

FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSG GGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLI DGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAG VYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGA AALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLG VHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGG GGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTQKSLSLSPGK 42 hu 4-1BBL monomérico REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL (71-248)-CH1* SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF

FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSG GGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT

VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSC 43 hu 4-1BBL dimérico (71- REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL 248) – CL cadeia knob Fc SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF

FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSG GGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLI DGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAG VYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGA AALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLG VHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGG GGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV

SEQ ID Nome Sequência NO:

LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTQKSLSLSPGK 44 hu 4-1BBL (71-248) – REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL CH1 monomérico SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF

FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSG GGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT

VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 45 anti-CD19(8B8-018), QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW cadeia do ligante dimérico VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT Fc hole (71-248) SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALF

DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAG LLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEG SGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARN SAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQ GATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSP DDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGL AGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPAS SEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHA

WQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 46 anti-CD19(8B8-018), QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW ligante monomérico Fc VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT knob (71-248) SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALF

DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVS LTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLT

QGATVLGLFRVTPEIPAGL 47 anti-CD19(8B8-2B11), QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW cadeia hole Fc VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT

SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLF

SEQ ID Nome Sequência NO:

DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSPGK 48 CD19 (8B8-2B11), cadeia DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGTTYL leve NWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGT

DFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDPYTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL

SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 49 anti-CD19(8B8-2B11), QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW cadeia do ligante dimérico VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT Fc (71-254) SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLF

RARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 50 anti-CD19(8B8-2B11), QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW ligante monomérico knob VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT Fc (71-254) SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLF

DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVS LTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR

SEQ ID Nome Sequência NO:

NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLT

QGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 51 anti-CD19(8B8-2B11), QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW cadeia do ligante dimérico VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT Fc (71-248) SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLF

WQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 52 anti-CD19(8B8-2B11), QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW ligante monomérico knob VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT Fc (71-248) SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLF

QGATVLGLFRVTPEIPAGL 53 hu 4-1BBL trimérico (71- REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL 254) cadeia knob Fc SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF

FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALAL TVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHT EARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEG GGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLV AQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKEL VVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPL RSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLS AGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEI PAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLL DLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTG

SEQ ID Nome Sequência NO:

GLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSG SVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAF GFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGSPGSSSSGSDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

K 54 anti- CD19(8B8-018) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW cadeia knob Fc fundida VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT ao hu 4-1BBL trimérico SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALF (71-254) DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA

ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVS LTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLT QGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSR EGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLS WYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFF QLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALT VDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTE ARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGG GGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVA QNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELV VAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLR SAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSA GQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIP

AGLPSPRSE 55 anti- CD19(8B8-2B11) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW cadeia knob Fc fundida VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMT ao hu 4-1BBL trimérico SDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLF (71-254) DYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA

ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVS LTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE

SEQ ID Nome Sequência NO:

GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLT QGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSR EGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLS WYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFF QLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALT VDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTE ARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGG GGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVA QNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELV VAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLR SAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSA GQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIP

AGLPSPRSE 56 DP47, cadeia hole Fc EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW

VRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIE KTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLV SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL

SPGK 57 DP47, cadeia leve EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWY

QQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTL TISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD

YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 58 DP47, cadeia hole Fc EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW fundida ao hu 4-1BBL VRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRD dimérico (71-254) NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWG

QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLR QGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLS YKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVS LALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGF QGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVL GLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELS PDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDP GLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELR RVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPP ASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARAR

SEQ ID Nome Sequência NO:

HAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 59 DP47, cadeia knob Fc EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW fundida ao hu 4-1BBL VRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRD monomérico (71-254) NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWG

QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDL RQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAF GFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT

VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 60 di-mu4-1BBL-CL, cadeia consulte a Tabela 5 knob Fc 61 cadeia mono-mu4-1BBL- consulte a Tabela 5 CH1 62 CD19 Acesso UniProt Nº:. P15391 63 CD20 Acesso UniProt Nº:. P11836 64 anti-CD20 murino B-Ly1 GPELVKPGASVKISCKASGYAFSYSWMNWVKLRPGQ

VH GLEWIGRIFPGDGDTDYNGKFKGKATLTADKSSNTAY MQLTSLTSVDSAVYLCARNVFDGYWLVYWGQGTLVT

VSA 65 anti-CD20 murino B-Ly1 NPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQS

VL PQLLIYQMSNLVSGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAE

DVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKR 66 4-1BBL completo (compr. UniProt Nº: P41273 total) 67 4-1BBL (50-254) ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLL

DLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTG GLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSG SVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAF GFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT

VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 68 4-1BB humano Acesso UniProt Nº:. Q07011 69 4-1BB murino Acesso UniProt Nº:. P20334 70 4-1BB de ciomolgo Acesso UniProt Nº: F6W5G6 71 4-1BB (20H4.9) VH QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWS

WIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDT SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFD

LWGRGTLVTVSS 72 4-1BB (20H4.9) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQ

QKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTI

SSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIK 73 CD20-HCDR1 YSWIN

SEQ ID Nome Sequência NO: 74 CD20-HCDR2 RIFPGDGDTDYNGKFK 75 CD20-HCDR3 NVFDGYWLVY 76 CD20-LCDR1 RSSKSLLHSNGITYLY 77 CD20-LCDR2 QMSNLVS 78 CD20-LCDR3 AQNLELPYT 79 CD20 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINW

VRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITA DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVY

WGQGTLVTVSS 80 CD20 VL DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLY

WYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTD FTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKR

TV 81 peptídeo ligante G4S GGGGS 82 (G4S)2 GGGGSGGGGS 83 (SG4)2 SGGGGSGGGG 84 peptídeo ligante GGGGSGGGGSGGGG 85 peptídeo ligante GSPGSSSSGS 86 peptídeo ligante (G4S)3 GGGGSGGGGSGGGGS3 87 peptídeo ligante (G4S)4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 88 peptídeo ligante GSGSGSGS 89 peptídeo ligante GSGSGNGS 90 peptídeo ligante GGSGSGSG 91 peptídeo ligante GGSGSG 92 peptídeo ligante GGSG 93 peptídeo ligante GGSGNGSG 94 peptídeo ligante GGNGSGSG 95 peptídeo ligante GGNGSG 96 FAP (28H1), CDR-H1 SHAMS 97 FAP (28H1), CDR-H2 AIWASGEQYYADSVKG 98 FAP (28H1) ,CDR-H3 GWLGNFDY 99 FAP (28H1), CDR-L1 RASQSVSRSYLA 100 FAP (28H1), CDR-L2 GASTRAT 101 FAP (28H1), CDR-L3 QQGQVIPPT 102 FAP(4B9), CDR-H1 SYAMS 103 FAP(4B9), CDR-H2 AIIGSGASTYYADSVKG 104 FAP(4B9), CDR-H3 GWFGGFNY 105 FAP(4B9), CDR-L1 RASQSVTSSYLA 106 FAP(4B9), CDR-L2 VGSRRAT

SEQ ID Nome Sequência NO: 107 FAP(4B9), CDR-L3 QQGIMLPPT 108 FAP(28H1) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSW

VRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWG

QGTLVTVSS 109 FAP(28H1) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWY

QQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTI

SRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK 110 FAP(4B9) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW

VRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWG

QGTLVTVSS 111 FAP(4B9) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWY

QQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTL

TISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK 112 Cadeia hole Fc de anti- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW FAP (4B9) VRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRD (Construção 2.4) NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWG

QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK 113 anti-FAP (4B9), cadeia EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWY leve QQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTL (Construção 2.4) TISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKRTVA

APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD

YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 114 anti-FAP(28H1), cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSW hole Fc VRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRD

NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK 115 anti-FAP (28H1), cadeia EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWY leve QQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTI

SRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID Nome Sequência NO: 116 anti-FAP (4B9), cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW hole Fc fundida ao hu 4- VRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRD 1BBL dimérico (71-254) NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWG

HAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 117 anti-FAP (4B9), cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW knob Fc fundida ao hu 4- VRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRD 1BBL monomérico (71- NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWG 254) QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL

VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDL RQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAF GFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT

VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 118 anti-FAP (28H1), cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSW hole Fc fundida ao hu 4- VRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRD 1BBL dimérico (71-254) NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWG

QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLR QGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLS

SEQ ID Nome Sequência NO:

YKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVS LALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGF QGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVL GLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELS PDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDP GLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELR RVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPP ASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARAR

HAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 119 anti-FAP (28H1), cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSW knob Fc fundida ao hu 4- VRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRD 1BBL monomérico (71- NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWG 254) QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL

VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 120 FAP humana (hu FAP) UniProt nº: Q12884 121 hu FAP, RPSRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISG ectodomínio+poly-lys- QEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASN tag+his6-tag YGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGE

FVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRP GDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALW WSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIP YPKAGAKNPVVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSD YYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFRED WQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAI SYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFR VTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVT CHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHD GRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITL WYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAV NWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKL GVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVS SLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGL PTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDN VHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLS

TNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH 122 FAP de camundongo UniProt nº. P97321 123 FAP murina, RPSRVYKPEGNTKRALTLKDILNGTFSYKTYFPNWISE ectodomínio+poly-lys- QEYLHQSEDDNIVFYNIETRESYIILSNSTMKSVNATDY tag+his6-tag GLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLQNGEF

VRGYELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPG DPPFQITYTGRENRIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWW

SEQ ID Nome Sequência NO:

SPDGKFLAYVEFNDSDIPIIAYSYYGDGQYPRTINIPYP KAGAKNPVVRVFIVDTTYPHHVGPMEVPVPEMIASSD YYFSWLTWVSSERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFRED WHAWECPKNQEHVEESRTGWAGGFFVSTPAFSQDA TSYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAIYIF RVTQDSLFYSSNEFEGYPGRRNIYRISIGNSPPSKKCV TCHLRKERCQYYTASFSYKAKYYALVCYGPGLPISTLH DGRTDQEIQVLEENKELENSLRNIQLPKVEIKKLKDGG LTFWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVKSV FAVNWITYLASKEGIVIALVDGRGTAFQGDKFLHAVYR KLGVYEVEDQLTAVRKFIEMGFIDEERIAIWGWSYGGY VSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASIYSERFM GLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTAD DNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGILS GRSQNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHH

H 124 FAP de cinomolgos, RPPRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISG ectodomínio+poly-lys- QEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASN tag+his6-tag YGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGE

FVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRP GDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALW WSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIP YPKAGAKNPFVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSD YYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFRED WQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAI SYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFR VTQDSLFYSSNEFEDYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVT CHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHD GRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITL WYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAV NWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKL GVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVS SLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGL PTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDN VHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLS TNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH

[268] Informações gerais sobre as sequências nucleotídicas de cadeias leves e pesadas de imunoglobulinas humanas são fornecidas em: Kabat, E.A., et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Os aminoácidos de cadeias de anticorpo são numerados e referidos de acordo com os sistemas de numeração de acordo com Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)), tal como definido acima.

ASPECTOS DA INVENÇÃO

[269] A seguir, são listados alguns dos aspetos da invenção.

[270] 1. Um agonista de 4-1BB (CD137) para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um anticorpo anti-CD20 e em que o agonista de 4- 1BB compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou FAP.

[271] 2. O agonista de 4-1BB para uso em um método do aspecto 1, em que o agonista de 4-1BB e o anticorpo anti-CD20 são administrados concomitantemente.

[272] 3. O agonista de 4-1BB para uso em um método de acordo com o aspecto 1 ou 2, em que o agonista de 4-1BB e o anticorpo anti-CD20 são administrados juntos em uma composição única ou administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

[273] 4. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é administrado simultaneamente, antes ou subsequentemente ao agonista de 4-1BB.

[274] 5. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos.

[275] 6. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula compreendendo três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

[276] 7. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19.

[277] 8. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que a molécula de ligação ao antígeno compreendendo três ectodomínios do 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 não será internalizada por células B que expressam CD19.

[278] 9. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos uma porção capaz de ligar-se especificamente ao CD19, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

14, ou (b) um domínio VH compreendendo (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e um domínio VL compreendendo (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e (vi) CDR- L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[279] 10. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (V LCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (V HCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[280] 11. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.

[281] 12. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, especificamente um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4.

[282] 13. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação a um receptor de Fc e/ou função efetora.

[283] 14. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo um domínio Fc de IgG 1 que compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G.

[284] 15. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[285] 16. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo:

(a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19; e

(b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto,

em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo fato de que

(i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CL e o segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1,

(iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL- CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou VH-CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto entre o domínio CH1 e CL, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4- 1BB ou fragmentos destes, que estão ligados uns aos outros e ao domínio VH ou VL por um ligante peptídico, e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[286] 17. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo: (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32; e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[287] 18. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; b) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; c) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 40;

ID NO: 46;

48, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 50;

j) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

k) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

47, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; e l) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[288] 19. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um polipeptídeo compreendendo três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos.

[289] 20. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um polipeptídeo compreendendo três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos; e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o polipeptídeo compreendendo os três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos é fundido ao aminoácido N- ou C-terminal de uma das duas subunidades do domínio Fc, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[290] 21. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (c) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e (d) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

55.

[291] 22. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos de 1 a 3, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-CD19/anti-4-1BB.

[292] 23. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos de 1 a 14, em que o anticorpo anti-CD20 é um anticorpo anti-CD20 tipo I.

[293] 24. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o anticorpo anti-CD20 é rituximabe.

[294] 25. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o anticorpo anti-CD20 é um anticorpo anti-CD20 tipo II.

[295] 26. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o anticorpo anti-CD20 é um anticorpo anti-CD20 afucosilado.

[296] 27. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos de 1 a 14 ou 17 ou 18, em que o anticorpo anti- CD20 é obinutuzumabe.

[297] 28. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos de 1 a 14, em que o anticorpo anti-CD20 é rituximabe ou obinutuzumabe.

[298] 29. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o anticorpo anti-CD20 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD20) compreendendo a sequência CDR-H1 de SEQ ID NO: 73, a sequência CDR-H2 de SEQ ID NO: 74 e a sequência CDR-H3 de SEQ ID NO: 75 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD20) compreendendo a sequência CDR-L1 de SEQ ID NO: 76, sequência CDR-L2 de SEQ ID NO: 77 e sequência CDR-L3 de SEQ ID NO:

78.

[299] 30. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (V HCD20) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD20) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80.

[300] 31. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB compreende um domínio Fc compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ou a função efetora.

[301] 32. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB compreende um domínio Fc de IgG1 compreendendo as substituições de aminoácido L234A, L235A e P329G.

[302] 33. Um agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um anticorpo anti-CD20 e em que a combinação é administrada em intervalos de cerca de uma semana a três semanas.

[303] 34. Um produto farmacêutico compreendendo (A) uma primeira composição compreendendo como ingrediente ativo um agonista de 4- 1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou FAP, e um excipiente farmaceuticamente aceitável; e (B) uma segunda composição compreendendo como ingrediente ativo um anticorpo anti-CD20 e um excipiente farmaceuticamente aceitável, para uso no tratamento combinado, sequencial ou simultâneo de uma doença, especialmente o câncer.

[304] 35. O produto farmacêutico de acordo com o aspecto 34, para uso no tratamento de distúrbios proliferativos de células B, particularmente doenças selecionadas a partir do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de zona marginal (MZL), mieloma múltiplo (MM) ou linfoma de Hodgkin (HL).

[305] 36. Uma composição farmacêutica compreendendo um agonista de 4-1BB que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, e um anticorpo anti-CD20.

[306] 37. A composição farmacêutica do aspecto 36, em que o agonista de 4-1BB que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, e o anticorpo anti-CD20 são administrados juntos em uma composição única ou são administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

[307] 38. A composição farmacêutica do aspecto 36 ou 37, em que o agonista de 4-1BB compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, e é administrado simultaneamente, antes, ou subsequentemente ao anticorpo anti-CD20.

[308] 39. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 38, em que o agonista de 4-1BB compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos.

[309] 40. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 39, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula compreendendo três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, particularmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

[310] 41. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 40, em que o agonista do 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular ao CD19.

[311] 42. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 41, em que o agonista de 4-1BB não será internalizado nas células B.

[312] 43. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 42, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos uma porção capaz de ligar-se especificamente ao CD19, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se ao CD19 compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

11 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou (b) um domínio VH compreendendo (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e um domínio VL compreendendo (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e (vi) CDR- L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[313] 44. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 43, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (V LCD19)

compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[314] 45. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 44, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende adicionalmente um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de realizar associação estável.

[315] 46. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 44, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, especificamente um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4.

[316] 47. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 46, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ou a função efetora.

[317] 48. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 47, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG 1 compreendendo as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G.

[318] 49. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 48, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[319] 50. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 49, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19; e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo fato de que (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CL e o segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto entre os domínios CH1 e CL, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BB ou fragmentos destes, que estão ligados uns aos outros e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por um ligante peptídico ao domínio CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou (ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3, respectivamente, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BB ou fragmentos destes que estão ligados entre si e com a extremidade C-terminal do domínio CH3 por um ligante peptídico, e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por meio de um ligante peptídico ao C-terminal do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou (iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL-CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou VH- CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto entre o domínio CH1 e CL, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BB ou fragmentos destes, que estão ligados uns aos outros e ao domínio VH ou VL por um ligante peptídico, e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[320] 51. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 50, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32; e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[321] 52. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 51, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; b) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; c) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 40;

ID NO: 46;

ID NO: 50;

[322] 53. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 48, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um polipeptídeo compreendendo ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos.

[323] 54. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 48 ou 53, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um polipeptídeo compreendendo três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos; e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o polipeptídeo compreendendo os três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos é fundido ao aminoácido N- ou C-terminal de uma das duas subunidades do domínio Fc, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[324] 55. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 48 ou 53 ou 54, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em:

(a) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

53;

(b) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

53;

(c) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

54: e

(d) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

55.

[325] 56. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 38, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-CD19/anti-4-1BB.

[326] 57. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 56, em que o anticorpo anti-CD20 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD20) compreendendo a sequência CDR-H1 de SEQ ID NO: 73, a sequência CDR-H2 de SEQ ID NO: 74 e a sequência CDR- H3 de SEQ ID NO: 75 e/ou uma região variável de cadeia leve (V LCD20) compreendendo a sequência CDR-L1 de SEQ ID NO: 76, sequência CDR-L2 de SEQ ID NO: 77 e sequência CDR-L3 de SEQ ID NO: 78.

[327] 58. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 57, em que o anticorpo anti-CD20 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD20) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD20) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80.

[328] 59. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 58, em que o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 é usado em combinação com um anticorpo anti-CD20, e em que a combinação é administrada em intervalos de cerca de uma semana a três semanas.

[329] 60. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 59 para uso no tratamento ou no atraso da progressão de uma doença proliferativa, particularmente do câncer.

[330] 61. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos de 36 a 60 para uso no tratamento de distúrbios proliferativos de células B, particularmente doenças selecionadas a partir do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de zona marginal (MZL), mieloma múltiplo (MM) ou linfoma de Hodgkin (HL).

[331] 62. Um kit para tratar ou retardar a progressão do câncer em um sujeito, compreendendo uma embalagem compreendendo (A) uma primeira composição compreendendo como ingrediente ativo um agonista de 4- 1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19, e um excipiente farmaceuticamente aceitável; e (B) uma segunda composição compreendendo como ingrediente ativo um anticorpo anti-CD20 e um excipiente farmaceuticamente aceitável e (C) instruções para o uso das composições em uma terapia combinada.

[332] 63. O uso de uma combinação de um agonista de 4-1BB que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 e um anticorpo anti-CD20 na fabricação de um medicamento para tratar ou retardar a progressão de uma doença proliferativa, particularmente o câncer.

[333] 64. O uso de uma combinação de um agonista de 4-1BB que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 e um anticorpo anti-CD20 na fabricação de um medicamento, em que o medicamento é para o tratamento de distúrbios proliferativos de células B, particularmente doenças selecionadas a partir do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de zona marginal (MZL), mieloma múltiplo (MM) ou linfoma de Hodgkin (HL).

[334] 65. Um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um sujeito compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, particularmente CD19 ou FAP, e um anticorpo anti-CD20.

[335] 66. Um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um sujeito compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19, e um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno.

[336] 67. O método dos aspectos 65 ou 66, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc.

[337] 68. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 67, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc com modificações que reduzem a ligação ao receptor Fc e/ou a função efetora.

[338] 69. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 68, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos.

[339] 70. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 69, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19.

[340] 71. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 70, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula compreendendo três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

[341] 72. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 71, em que o agonista de 4-1BB não será internalizado em células B.

[342] 73. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 72, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos uma porção capaz de ligar-se especificamente ao CD19, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se ao CD19 compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou (b) um domínio VH compreendendo (i) CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e um domínio VL compreendendo (iv) CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, e (vi) CDR- L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[343] 74. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 73, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (V LCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[344] 75. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 74, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende adicionalmente um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de realizar associação estável.

[345] 76. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 75, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, especificamente um domínio Fc de IgG 1 ou um domínio Fc de IgG4.

[346] 77. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 76, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ou a função efetora.

[347] 78. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 77, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG1 compreendendo as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G.

[348] 79. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 78, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[349] 80. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 79, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19; e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo fato de que (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CL e o segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto entre os domínios CH1 e CL, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BB ou fragmentos destes, que estão ligados uns aos outros e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por um ligante peptídico ao domínio

CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou

(ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3, respectivamente, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de

4-1BB ou fragmentos destes que estão ligados entre si e com a extremidade C-terminal do domínio CH3 por um ligante peptídico, e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por meio de um ligante peptídico ao C-terminal do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou

(iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL-CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou VH-

CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação de bissulfeto entre o domínio CH1 e CL, e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BB ou fragmentos destes, que estão ligados uns aos outros e ao domínio VH ou

VL por um ligante peptídico, e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BB ou um fragmento deste ligado por um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[350] 81. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 80, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32; e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[351] 82. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 81, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

ID NO: 40;

ID NO: 46;

ID NO: 50;

j) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; k) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; e l) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[352] 83. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 82, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um polipeptídeo compreendendo três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos.

[353] 84. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 83, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um polipeptídeo compreendendo três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos; e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o polipeptídeo compreendendo os três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por ligantes peptídicos é fundido ao aminoácido N- ou C-terminal de uma das duas subunidades do domínio Fc, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[354] 85. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 84, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (c) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; e (d) uma molécula compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, e uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

55.

[355] 86. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 68, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-CD19/anti-4-1BB.

[356] 87. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 86, em que o anticorpo anti-CD20 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD20) compreendendo a sequência CDR-H1 de SEQ ID NO: 73, a sequência CDR-H2 de SEQ ID NO: 74 e a sequência CDR-H3 de SEQ ID NO: 75 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD20) compreendendo a sequência CDR-L1 de SEQ ID NO: 76, sequência CDR-L2 de SEQ ID NO: 77 e sequência CDR-L3 de SEQ ID NO: 78.

[357] 88. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 87, em que o anticorpo anti-CD20 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD20) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e/ou uma região variável de cadeia leve (VLCD20) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80.

[358] 89. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 86, em que o anticorpo anti-CD20 compreende rituximabe.

[359] 90. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 89, em que o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 é usado em combinação com um anticorpo anti-CD20, e em que a combinação é administrada em intervalos de cerca de uma semana a três semanas.

[360] 91. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 90, em que o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor, em particular CD19 ou FAP, e o anticorpo anti-CD20 são administrados juntos em uma composição única ou são administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

[361] 92. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 91, em que o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 e o anticorpo anti- CD20 são administrados por via intravenosa ou por via subcutânea.

[362] 93. O método de qualquer um dos aspectos de 65 a 92, em que o agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 é administrado de maneira concomitante, antes ou após o anticorpo anti-CD20.

[363] 94. Uma combinação compreendendo um agonista de 4- 1BB (CD137) e um anticorpo anti-CD20, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor.

[364] 95. A combinação de acordo com o aspecto 94, em que o agonista de 4-1BB e o anticorpo de anti-CD20 são administrados de maneira concomitante.

[365] 96. A combinação de acordo com os aspectos 94 ou 95, em que o agonista de 4-1BB e o anticorpo anti-CD20 são administrados juntos em uma composição única ou são administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

[366] 97. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 96, em que o agonista de 4-1BB compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19.

[367] 98. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 97, em que o agonista de 4-1BB compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos.

[368] 99. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 98, em que o agonista de 4-1BB compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

[369] 100. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 99, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 e três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se ao CD19 compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (V LCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

20.

[370] 101. A combinação de acordo com de qualquer um dos aspectos de 94 a 100, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 e três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (V LCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[371] 102. A combinação de qualquer um dos aspectos de 94 a 101, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, especificamente um domínio Fc de IgG 1 ou um domínio Fc de IgG4.

[372] 103. A combinação de qualquer um dos aspectos de 94 a 102, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo.

[373] 104. A combinação de qualquer um dos aspectos de 94 a 103, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32; e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[374] 105. A combinação de qualquer um dos aspectos de 94 a 104, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36;

ID NO: 40;

ID NO: 46;

ID NO: 50;

47, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; k) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; e l) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[375] 106. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 105, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19.

[376] 107. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 97, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-CD19/anti-4-1BB.

[377] 108. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 107, em que o anticorpo anti-CD20 é um anticorpo anti-CD20 tipo I.

[378] 109. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 108, em que o anticorpo anti-CD20 é rituximabe.

[379] 110. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 107, em que o anticorpo anti-CD20 é um anticorpo anti-CD20 tipo II.

[380] 111. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 107 ou 110, em que o anticorpo anti-CD20 é um anticorpo anti-CD20 afucosilado.

[381] 112. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 107 ou 111 ou 112, em que o anticorpo anti-CD20 é obinutuzumabe.

[382] 113. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 107, em que o anticorpo anti-CD20 é rituximabe ou obinutuzumabe.

[383] 114. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 113, para uso como medicamento.

[384] 115. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 ou 114, em que o agonista de 4-1BB e o anticorpo anti-CD20 são administrados juntos em uma composição única ou são administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

[385] 116. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 115, em que o agonista de 4-1BB e o anticorpo anti-CD20 são para a administração simultânea ou para a administração sequencial.

[386] 117. A combinação de acordo com qualquer um dos aspectos de 94 a 116 para uso no tratamento de distúrbios proliferativos de células B, particularmente doenças selecionadas a partir do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de zona marginal

(MZL), mieloma múltiplo (MM) ou linfoma de Hodgkin (HL).

EXEMPLOS

[387] A seguir são fornecidos exemplos de métodos e composições da presente invenção. Entende-se que diversas outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.

TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE

[388] Foram usados métodos padronizados para manipular o DNA conforme descrito em Sambrook, J. et al, “Molecular cloning: A laboratory manual”; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989. Os reagentes para a biologia molecular foram utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes. Informações gerais sobre as sequências nucleotídicas de cadeias leve e pesada de imunoglobulinas humanas são fornecidas em: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., Publicação NIH Nº 91-3242.

SEQUENCIAMENTO DE DNA

[389] As sequências de DNA foram determinadas pelo sequenciamento de dupla-fita.

SÍNTESE DE GENES

[390] Segmentos de genes desejados foram gerados por PCR utilizando moldes adequados, ou foram sintetizados pela Geneart AG (Regensburg, Alemanha) a partir de oligonucleotídeos sintéticos e produtos da PCR por síntese gênica automatizada. Nos casos em que nenhuma sequência exata do gene estava disponível, os iniciadores (primers) de oligonucleotídeos foram desenvolvidos com base em sequências homólogas mais próximas e os genes foram isolados por meio da RT-PCR a partir do RNA proveniente de tecido apropriado. Os segmentos gênicos flanqueados por sítios de clivagem por endonuclease de restrição únicos foram clonados em vetores de clonagem/sequenciamento convencionais. O DNA plasmidial foi purificado a partir de bactérias transformadas e a concentração foi determinada por espectroscopia UV. A sequência de DNA dos fragmentos do gene subclonado foi confirmada pelo sequenciamento do DNA. Segmentos do gene foram concebidos com sítios de restrição apropriados para permitir a subclonagem nos respectivos vetores de expressão. Todas as construções foram concebidas com uma extremidade 5' na sequência de DNA codificante de um peptídeo líder, que direciona as proteínas para a secreção em células eucarióticas.

TÉCNICAS DE CULTURA DE CÉLULAS

[391] As técnicas de cultura de células estabelecidas foram usadas conforme descritas em “Current Protocols in Cell Biology”, Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. e Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. (2000).

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

[392] As proteínas foram purificadas a partir dos sobrenadantes de cultura celulares de acordo com protocolos estabelecidos. Resumidamente, os anticorpos foram submetidos a uma coluna Sepharose Proteína A (GE Healthcare) e lavados com PBS. A eluição dos anticorpos foi obtida em pH 2,8 seguido pela neutralização imediata da amostra. A proteína agregada foi separada a partir dos anticorpos monoméricos por cromatografia por exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em PBS ou em Histidina 20 mM, NaCl 150 mM pH 6,0. As frações de anticorpo monoméricas foram reunidas, concentradas (se necessário) usando, por exemplo, um concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), congeladas e armazenadas a -20 ºC ou -80 ºC. Parte das amostras foi fornecida para a subsequente análise de proteínas e caracterização analítica, por exemplo, por SDS-PAGE, cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) ou espectrometria de massa. SDS-PAGE

[393] O sistema “NuPAGE® Pre-Cast gel system” (Invitrogen) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Especificamente, 10% ou 4- 12% de gel “NuPAGE ® Novex ® Bis-TRIS Pre Cast-gel” (pH 6,4) e foi utilizado um “NuPAGE ® MES” (géis reduzidos, com a adição de tampão de corrida antioxidante NuPAGE®) ou tampão de corrida MOPS (géis não reduzidos).

CROMATOGRAFIA ANALÍTICA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO

[394] A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para a determinação da agregação e estado oligomérico de anticorpos foi realizada por cromatografia HPLC. Resumidamente, anticorpos purificados por Proteína A foram submetidos a uma coluna “Tosoh TSKgel G3000SW” em 300 mM de NaCl, 50 mM de KH2PO4/K2HPO4, pH 7,5 em um sistema de HPLC “Agilent 1100” ou a uma coluna “Superdex 200” (GE Healthcare) em PBS 2x em um sistema de HPLC “Dionex HPLC-System”. A proteína eluída foi quantificada pela absorbância UV e integração das áreas de pico. O Padrão de filtração “BioRad Gel Filtration” 151-1901 serviu como padrão.

DETERMINAÇÃO DA LIGAÇÃO E AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS PARA OS RESPECTIVOS ANTÍGENOS UTILIZANDO A RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE (SPR) (BIACORE)

[395] A ligação dos anticorpos gerados aos respectivos antígenos é investigada por ressonância plasmônica de superfície usando um instrumento BIACORE T100 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia).

Resumidamente, para medições de afinidade, anticorpos de cabra anti-IgG humana JIR 109-005-098 são imobilizados em um chip CM5 por acoplamento de amina para a apresentação dos anticorpos contra o respectivo antígeno. A ligação é mensurada em tampão HBS (HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 a 0,005%, pH 7,4), 25 ºC (ou alternativamente a 37 ºC). O antígeno (R&D Systems ou purificado no próprio laboratório) foi adicionado em várias concentrações em solução. A associação foi mensurada por uma injeção de antígeno de 80 segundos a 3 minutos; a dissociação foi mensurada pela lavagem da superfície do chip com tampão HBS por 3 - 10 minutos e um valor KD foi estimado usando o modelo de ligação 1:1 de Langmuir. Dados do controle negativo (por exemplo, curvas do tampão) são subtraídos das curvas da amostra para a correção da variação dos valores basais intrínsecos do sistema e para a redução de sinal de ruído. O software de avaliação do teste Biacore é utilizado para a análise dos sensogramas e para o cálculo dos dados de afinidade.

EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO 4-1BBL COMPREENDENDO PELO MENOS UM DOMÍNIO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CAPAZ DE LIGAR-SE ESPECIFICAMENTE A UM ANTÍGENO ASSOCIADO A

TUMOR

[396] As moléculas de ligação ao antígeno de fusão Fc contendo o trímero ligante de 4-1BB direcionadas a CD19 foram preparadas conforme descrito no Pedido de Patente Internacional Publicado WO 2016/075278 A1.

[397] Em particular, as seguintes moléculas foram feitas.

[398] a) Moléculas de ligação ao antígeno de fusão Fc contendo trímero ligante de 4-1BB não direcionadas e direcionadas ao CD19 monovalentes.

[399] Uma sequência de DNA que codifica o ligante de 4-1BB dimérico fundido ao domínio CL humano foi subclonado nas posições corretas de leitura (in frame) com os domínios CH2 e CH3 da cadeia pesada da lgG1 humana na cadeia knob (Merchant, Zhu et al. 1998). Um polipeptídeo contendo um ectodomínio do ligante de 4-1BB foi fundido com o domínio CH1 de IgG1 humana. No Construção 3.4, para melhorar o pareamento correto, as seguintes mutações foram introduzidas adicionalmente no CH-CL cruzado (variante carregada). No ligante de 4-1BB dimérico fundido ao CL humano, E123R e Q124K, e no ligante de 4-1BB monomérico fundido ao CH1 humano, K147E e

K213E.

[400] As sequências de DNA da região variável de cadeia pesada e leve que codificam um ligante específico para CD19, clone 8B8-018 ou clone 8B8-2B11, foram subclonadas in frame com a cadeia pesada constante hole ou com a cadeia leve constante da IgG1 humana. As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no documento WO 2012/130831. A combinação da cadeia knob Fc-ligante dimérico contendo as mutações S354C/T366W, a fusão CH1 monomérica, a cadeia hole Fc- anti-CD19 contendo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V e a cadeia leve anti-CD19 permite a geração de um heterodímero que inclui um ligante de 4-1BB trimérico montado e um Fab de ligação ao CD19 (Figuras 1A e 1B). Uma versão não direcionada (sem alvo) foi preparada de acordo com a substituição do ligante CD19 por DP47 de linhagem germinativa (Figura 1C).

TABELA 1 CONSTRUÇÕES DE CD19-4-1BBL MONOVALENTES USADAS NOS EXPERIMENTOS Exemplo no WO composto de 2016/075278 mono CD19(018)-4-1BBL Exemplo 7.1.6 SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 (variante carregada) (Construção 3.4) SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42 mono CD19(2B11)-4-1BBL Exemplo 7.2.6 SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 (variante carregada) (Construção 4.4) SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42 mono CD19(2B11)-4-1BBL Exemplo 7.2.7 SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 (Construção 4.5) SEQ ID NO:43 e SEQ ID NO:44 mono DP47-4-1BBL não Exemplo 7.3.12 (Controle SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 direcionada D) SEQ ID NO:43 e SEQ ID NO:44

[401] b) Moléculas de ligação ao antígeno de fusão Fc contendo trímero ligante de 4-1BB não direcionadas e direcionadas ao CD19 bivalentes.

[402] As sequências de DNA que codificam as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um ligante específico de cadeia pesada e leve, específico para CD19, clone 8B8-018 ou 8B8-2B11, foram subclonadas in frame com a cadeia pesada constante contendo a modificação hole, a modificação knob ou a cadeia leve constante da IgG1 humana. As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no documento WO 2012/130831. Além disso, um polipeptídeo compreendendo dois ectodomínios do ligante de 4-1BB foi fundido ao C-terminal da cadeia hole Fc da IgG1 humana e um polipeptídeo compreendendo um ectodomínio do ligante de 4-1BB foi fundido ao C-terminal da cadeia knob Fc da IgG1 humana. A combinação da cadeia pesada do ligante dimérico anti-CD19 huIgG1 hole contendo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V, a cadeia pesada do ligante monomérico anti- CD19 huIgG1 knob contendo as mutações S354C/T366W e as cadeias leves do anti-CD19 permitem a geração de um heterodímero, que inclui ligante de 4- 1BB trimérico montado e dois Fabs que se ligam a CD19 (Figura 1D). Uma versão não direcionada (sem alvo) foi preparada de acordo com a substituição do ligante CD19 por DP47 de linhagem germinativa (Figura 1E).

TABELA 2 CONSTRUÇÕES DE CD19-4-1BBL BIVALENTES USADAS NOS EXPERIMENTOS Exemplo no WO composto de 2016/075278 bi CD19(018)-4-1BBL Exemplo 7.1.8 2 x SEQ ID NO:34, (Construção 3.6) SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:46 bi CD19(2B11)-4-1BBL Exemplo 7.2.8 2 x SEQ ID NO:48 (Construção 4.6) SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:52 bi DP47-4-1BBL não Exemplo 7.3.12 (Controle 2 x SEQ ID NO:57 direcionado C) SEQ ID NO:58 e SEQ ID NO:59

[403] A produção e caracterização das moléculas de ligação ao antígeno de fusão Fc contendo trímeros de ligantes de 4-1BB direcionadas ao CD19 ou não direcionadas estão descritas em detalhes no documento WO 2016/075278, Exemplo 7.4 e Exemplos 8 a 11, respectivamente.

[404] As moléculas de ligação ao antígeno de fusão Fc contendo o trímero ligante de 4-1BB direcionadas à FAP foram preparadas conforme descrito no Pedido de Patente Internacional Publicado WO 2016/075278 A1.

[405] Em particular, as seguintes moléculas foram feitas.

[406] c) Moléculas de ligação ao antígeno fusão fc contendo trímero ligante de 4-1bb direcionadas à FAP monovalentes

[407] As sequências de DNA da região variável de cadeia pesada e leve que codificam um ligante específico para FAP, clone 28H1 ou clone 4B9, foram subclonadas in frame com a cadeia pesada constante hole ou com a cadeia leve constante da IgG1 humana. As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no documento WO 2012/130831. A combinação da cadeia knob Fc-ligante dimérico contendo as mutações S354C/T366W, a fusão CH1 monomérica, a cadeia hole Fc- anti-FAP contendo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V e a cadeia leve anti-FAP permite a geração de um heterodímero que inclui um ligante de 4-1BB trimérico montado e um Fab de ligação à FAP (em analogia à Fig. 1A).

TABELA 3 CONSTRUÇÕES FAP-4-1BBL MONOVALENTES Exemplo no WO composto de 2016/075278 mono FAP(4B9)-4-1BBL Exemplo 2.1.4 SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113 (variante carregada) (Construção 2.4) SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42 mono FAP(28H1)-4-1BBL Exemplo 1.1 (Construção SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115

1.2) SEQ ID NO:43 e SEQ ID NO:44

[408] d) Moléculas de ligação ao antígeno fusão fc contendo trímero ligante de 4-1bb direcionadas à FAP bivalentes.

[409] As sequências de DNA que codificam as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um ligante específico de cadeia pesada e leve, específico para FAP, clone 28H1 ou clone 4B9, foram subclonadas in frame com a cadeia pesada constante contendo a modificação hole, a modificação knob ou a cadeia leve constante da IgG1 humana. As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no documento WO 2012/130831. Além disso, um polipeptídeo compreendendo dois ectodomínios do ligante de 4-1BB foi fundido ao C-terminal da cadeia hole Fc da IgG1 humana e um polipeptídeo compreendendo um ectodomínio do ligante de 4-1BB foi fundido ao C-terminal da cadeia knob Fc da IgG1 humana. A combinação da cadeia pesada do ligante dimérico anti-FAP huIgG1 hole contendo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V, a cadeia pesada do ligante monomérico anti-FAP huIgG1 knob contendo as mutações S354C/T366W e as cadeias leves do anti- FAP permitem a geração de um heterodímero, que inclui ligante de 4-1BB trimérico montado e dois Fabs que se ligam a FAP (Figura 1D).

TABELA 4 CONSTRUÇÕES FAP-4-1BBL BIVALENTES Exemplo no WO composto de 2016/075278 bi FAP(4B9)-4-1BBL Exemplo 2.1.3 2 x SEQ ID NO:113, (Construção 2.3) SEQ ID NO:116 e SEQ ID NO:117 bi FAP(28H1)-4-1BBL Exemplo 1.1 (Construção 2 x SEQ ID NO:115

1.5) SEQ ID NO:118 e SEQ ID NO:119

[410] A produção e caracterização das moléculas de ligação ao antígeno de fusão Fc contendo o trímero do ligante de 4-1BB direcionadas à FAP é descrita em detalhes no documento WO 2016/075278, Exemplos 1 a 6, respectivamente.

EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CD19-MU4-1BBL MONOVALENTES(SUBSTITUTO HÍBRIDO)

[411] Uma molécula de ligação ao antígeno de fusão Fc contendo o trímero de ligante de 4-1BB murino direcionadas a CD19 foi preparada conforme descrito no Pedido de Patente Internacional Publicado WO 2016/075278 A1. A parte codificante da sequência de DNA do ectodomínio (aminoácidos 104-309, incluindo a mutação C160S) do ligante de 4-1BB de camundongo foi sintetizada de acordo com a sequência Q3U1Z9-1 da base de dados UniProt.

[412] Uma sequência de DNA que codifica o ligante de 4-1BB murino dimérico fundido ao domínio CL humano foi subclonado nas posições corretas de leitura (in frame) com os domínios CH2 e CH3 da cadeia pesada da lgG1 humana na cadeia knob (Merchant, Zhu et al. 1998). Um polipeptídeo contendo um ectodomínio do ligante de 4-1BB murino foi fundido com o domínio CH1 de IgG1 humana. As sequências de DNA da região variável de cadeia pesada e leve que codificam um ligante específico para CD19, clone 8B8-018, foram subclonadas in frame com a cadeia pesada constante hole ou com a cadeia leve constante da IgG1 humana. As mutações Pro329Gli, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas knob e hole para abolir a ligação aos receptores Fc gama de acordo com o método descrito no documento WO 2012/130831. A combinação da cadeia knob Fc-ligante dimérico contendo as mutações S354C/T366W, a fusão CH1 monomérica, a cadeia hole Fc- anti-CD19 contendo as mutações Y349C/T366S/L368A/Y407V e a cadeia leve anti-CD19 permite a geração de um heterodímero que inclui um ligante de 4-1BB trimérico murino montado e um Fab de ligação ao CD19 (Figura 1F).

[413] As sequências de aminoácidos para o substituto híbrido CD19-mu4-1BBL podem ser encontradas na Tabela 5.

TABELA 5 SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DO SUBSTITUTO HÍBRIDO MADURO CD19-MU4-1BBL SEQ ID NO: Descrição Sequência

SEQ ID NO: Descrição Sequência 60 di-mu4-1BBL-CL, RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQ cadeia knob Fc QGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQ

GLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQ GWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRS WSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPN TTSFGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSRTEPRPALTITT SPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSPVFAKLLA KNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKEL VVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAK PQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAG HRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKP DNPWEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVS LWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPGK 61 mono-mu4-1BBL- RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQ cadeia CH1 QGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQ

GLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQ GWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRS WSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPN TTSFGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK

PSNTKVDEKVEPKSC 33 anti-CD19(8B8-018), QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWV cadeia hole Fc RQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDT

SISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISK AKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDK

SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 34 anti-CD19(8B8-018), DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLENPNGNTYLN cadeia leve WYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFT

LKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGTKLEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[414] O substituto híbrido CD19-mu4-1BBL foi produzido pela cotransfecção de células CHO-K1 cultivadas em suspensão com os vetores de expressão em mamíferos usando eviFect (Evitria AG). As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes em uma proporção de 1:1:1:1 (“vetor de cadeia pesada Fc hole” : “vetor de cadeia leve de CD19” : “vetor de cadeia pesada Fc knob de 4-1BBL” : “vetor de cadeia leve de mu4-1BBL”). Para a transfecção as células CHO-K1 são cultivadas em suspensão em meio de cultura eviMake (Evitria AG) sem soro. Depois de 7 dias a 37ºC em uma incubadora em ambiente de 5% de CO 2, o sobrenadante do cultivo é coletado para purificação por centrifugação e a solução é esterilizada por filtração (filtro de 0,22 μm) e mantida a 4ºC. As proteínas secretadas foram purificadas a partir dos sobrenadantes da cultura de células por cromatografia de afinidade utilizando Proteína A, seguido pela cromatografia de exclusão por tamanho. Para a cromatografia por afinidade o sobrenadante foi carregado sobre uma coluna de Proteína A MabSelectSure (GE Healthcare), equilibrada com fosfato de sódio a 20 mM, citrato de sódio a 20 mM, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida pela lavagem com fosfato de sódio a 20 mM, tampão contendo citrato de sódio a 20 mM (pH 7,5). A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de pH linear em cloreto de sódio de citrato de sódio a 20 mM, NaCl a 100 mM, glicina a 100 mM, 0,01% de Tween20, pH 3,0. A coluna foi então lavada com citrato de sódio a 20 mM, NaCl a 100 mM, Glicina a 100 mM, 0,01% de Tween-20, pH 3,0. O pH das frações coletadas foi ajustado pela adição de 1/40 (v/v) de 2M de Tris, pH 8,0.

A proteína foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna Hiload Superdex (GE Healthcare), equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, 0,01% de Tween20 em pH 6,0.

[415] A concentração de proteína das construções biespecíficas purificadas foi determinada por medição da Densidade Óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. A pureza e o peso molecular das construções biespecíficas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor

(Invitrogen, EUA) utilizando um instrumento LabChipGXII (Caliper). O teor agregado das construções biespecíficas foi analisado utilizando uma coluna analítica de exclusão por tamanho analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada em 25 mM de K2HPO4, 125 mM de NaCl, 200 mM de monocloridrato de L-arginina, 0,02% (p/v) de NaN3, tampão de corrida pH 6,7 a 25ºC.

TABELA 6 ANÁLISE BIOQUÍMICA DO SUBSTITUTO HÍBRIDO CD19-MU4-1BBL Rendimento (CE-SDS não red.) Molécula Monômero [%] [mg/L] CD19-mu4-1BBL 99 3,5 92

[416] Caracterização funcional do substituto híbrido CD19-mu4- 1BBL por ressonância plasmônica de superfície: A capacidade de ligar-se simultaneamente a Fc (kih) 4-1BB murino e CD19 humano foi avaliada por ressonância plasmônica de superfície (SPR). Todos os experimentos SPR foram realizados em um sistema Biacore T200 a 25ºC com HBS-EP como tampão de corrida (0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, Tensoativo P20 a 0,005%, Biacore, Freiburg/Alemanha ). O 4-1BB Fc (kih) murino biotinilado foi diretamente acoplado a uma célula de fluxo de um chip sensor de estreptavidina (SA).

Foram utilizados níveis de imobilização de até 600 unidades de ressonância (RU). A construção mu4-1BBL direcionada a CD19 foi passada em um intervalo de concentração de 200 nM e em uma velocidade de fluxo de 30 μL/minuto através das células de fluxo durante 90 segundos e a dissociação foi estabelecida em zero segundo. O CD19-Fc(kih) humano monomérico foi injetado como o segundo analito a uma velocidade de fluxo de 30 μL/minuto através das células de fluxo durante 90 segundos a uma concentração de 500 nM (Figura 2A). A dissociação foi monitorada durante 120 segundos. As diferenças no índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida em uma célula de fluxo de referência, onde nenhuma proteína foi imobilizada. Como pode ser visto no gráfico da Figura 2B, o substituto híbrido CD19-mu4-1BBL pode ligar-se simultaneamente ao 4-1BB murino e ao CD19 humano.

EXEMPLO 3 TERAPIA COMBINADA DE CD19-4-1BBL E RITUXIMABE OU OBINUTUZUMABE, IN

VITRO

[417] Ativação de células NK.

[418] CD19-4-1BBL é ativo quando ele pode reticular com células NHL que expressam CD19. Anticorpos como o rituximabe ou obinituzumabe (Gazyva) se ligam ao CD20 nas células NHL e podem, desse modo, ativar as células NK para mediar a ADCC. As células NK ativadas expressam 4-1BB.

Nossa hipótese é que CD19-4-1BBL pode sinergizar com anticorpos anti-CD20 mediadores de ADCC para a ativação de células NK. Para testar essa hipótese, usamos três linhagens de células NHL diferentes, por exemplo, WSU- DLCL2 (CD19+ CD20alto), SU-DHL-8 (CD19+, CD20baixo) e Naml-6 (CD19+, CD20baixo). Para medir a atividade biológica das células NK ativadas, incubamos as respectivas células NHL com PBMCs purificadas a partir de sangue fresco de sujeitos saudáveis a uma proporção de 1:25 por 24 horas, na presença de rituximabe ou obinutuzumabe titulado pela dose sozinhos, ou adicionando CD19-4-1BBL titulado pela dose em cima da concentração EC 50 de rituximabe ou obinutuzumabe, em meio IMDM (Gibco, Cat. 31980-048) + 10% de Soro Bovino Fetal (SBF) (Gibco, Cat. 16140-071) e 1% de penicilina- estreptomicina (Gibco, Cat No. 15070-063). Os sobrenadantes foram coletados para a medição de IFN-γ por ELISA (kit DuoSet Human IFN-γ ELISA kit, R&D Systems, Cat. DY285). A Figura 3 mostra que nas três linhas de células NHL testadas, o CD19-4-1BBL poderia aumentar a função efetora de células NK para a produção de IFN-γ que foram ativadas pelo rituximabe ou obinutuzumabe (Gazyva). Nas células CD20baixo, como SU-DHL-8 e Nalm-6, a combinação com obinutuzumabe induziu maior produção de IFN-γ do que a combinação com rituximabe.

[419] Para confirmar que o CD19-4-1BBL só é capaz de ativar células NK após a adição de anticorpos mediadores de ADCC, medimos os marcadores de ativação, como o CD25, em células NK (com gates realizados em células CD3- CD56dim). De maneira consistente com a produção de IFN-γ, o CD19-4-1BBL pôde apenas aumentar a ativação de células NK pela regulação positiva de CD25 que já estavam ativadas pelo rituximabe ou obinutuzumabe (Figura 4). Em contraste, as células T (CD4 e CD8) não mostraram ativação em termos de CD25 ou CD69 nesta cocultura (dados não mostrados).

[420] Também estudamos se CD19-4-1BBL direcionado é superior ao anticorpo agonista de 4-1BB urelumabe em sinergizar a função de ADCC das células NK com obinutuzumabe. Em um experimento semelhante ao descrito acima, observamos que apenas a combinação de CD19-4-1BBL com obinutuzumabe aumentou a ativação das células NK (regulação positiva de CD25), mas não a combinação de urelumabe com obinutuzumabe (Figura 5).

EXEMPLO 4 TERAPIA COMBINADA COM CD19-4-1BBL HÍBRIDO E RITUXIMABE IN VIVO

[421] A primeira prova de conceito para a combinação de CD19- 4-1BBL híbrido (CD19-mu4-1BBL monovalente) e rituximabe foi realizada em camundongos huCD16tgScid portadores de tumor.

[422] As células WSU-DLCL2 (células de linfoma difuso de grandes células B humanas) foram originalmente obtidas da ECACC (Coleção Europeia de Cultura Celular) e expandidas no banco de células interno da Roche Glycart AG. As células foram cultivadas em meio RPMI contendo 10% de SBF e 1x Glutamax. As células foram cultivadas a 37 ºC em atmosfera saturada de água com 5% de CO2. 1,5 x 106 células por animal foram injetadas subcutaneamente (s.c.) no flanco direito dos animais em meio de cultura celular RPMI (Gibco) e Matrigel GFR (1:1, volume total de 100 μL) a uma viabilidade > 95,0%.

[423] Camundongos SCID FcγRIIIa humano-transgênicos (CD16) (que expressam macrófagos positivos para FcγRIV murino e células NK murinas transgênicas positivas para FcγRIIIa humano como efetores) na idade de 8 a 10 semanas no início do experimento (Charles River, França) foram mantidos em condições livres de patógenos específicos, com ciclos diários de 12 horas de luz/12 horas de escuro, de acordo com as diretrizes adotadas (GV- Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi analisado e aprovado pelo governo local. Após a chegada os animais foram mantidos por uma semana para se habituarem ao novo ambiente e para a observação. Foi realizado o monitoramento contínuo da saúde regularmente.

[424] De acordo com o protocolo (Figura 6), camundongos huCD16TgScid fêmeas receberam injeções s.c. de células tumorais tal como descrito acima e foram tratados uma vez por semana com os compostos ou com PBS (Veículo) quando o tamanho do tumor atingiu aproximadamente 200 mm3 (dia 13). Todos os camundongos receberam injeções i.v. de 200 μL da solução apropriada por semana. Para a obtenção da quantidade adequada de compostos por 200 μL, as soluções de estoque (Tabela 5 7?) foram diluídas com PBS quando necessário. Para a terapia combinada (Grupo D, Figura 6) com rituximabe e construção híbrida CD19-4-1BBL, as terapias foram injetadas com um intervalo de um dia. O crescimento tumoral foi medido duas vezes por semana usando um paquímetro e o volume tumoral foi calculado da seguinte forma: Tv: (L2/2) x C (L: largura, C: comprimento)

[425] O estudo foi finalizado e todos os camundongos foram sacrificados após oito injeções dos compostos (dia 64 após a injeção de células tumorais) e os tumores foram explantados e pesados. As Figuras 7A e 7B mostram a cinética do crescimento do tumor (média ± EPM) em todos os grupos de tratamento, bem como os pesos dos tumores no final do estudo. A monoterapia com o híbrido CD19-4-1BBL não revelou qualquer inibição do crescimento tumoral. A monoterapia com rituximabe induziu um crescimento tumoral mais lento em comparação com o veículo. Entretanto, a combinação de rituximabe e CD19-4-1BBL híbrido induziu uma inibição estatisticamente significativa do crescimento tumoral e revelou um peso tumoral significativamente menor ao final do estudo quando comparada com todos os outros grupos de tratamento.

TABELA 7

COMPOSIÇÕES UTILIZADAS NO EXPERIMENTO IN VIVO Composto Tampão de Formulação Concentração(mg/mL) 20 mM de Histidina, 4,11 CD19-4-1BBL híbrido 140 mM de NaCl, (= solução estoque) pH6,0 20mM de Histidina, 10 Rituximabe 140mM de NaCl, (= solução estoque) pH6,0 EXEMPLO 5 TERAPIA COMBINADA DE CD19(2B11)-4-1BBL MONOVALENTE E OBINUTUZUMABE (GAZYVA) IN VIVO

[426] A prova de conceito para a combinação de CD19(2B11)-4- 1BBL mono e GAZYVA foi realizada em camundongos NSG totalmente humanizados.

[427] As células WSU-DLCL2 (células de linfoma difuso de grandes células B humanas) foram originalmente obtidas da ECACC (Coleção Europeia de Cultura Celular) e, em seguida, expandidas no banco de células interno da Roche Glycart AG. As células foram cultivadas em meio RPMI contendo 10% de SBF e 1x Glutamax. As células foram cultivadas a 37 ºC em atmosfera saturada de água com 5% de CO2. 1,5 x 106 células (18 passagens in vitro) foram injetadas subcutaneamente (s.c.) por animal no flanco direito dos animais em meio de cultura celular RPMI (Gibco) e Matrigel GFR (1:1, volume total de 100 μL) a uma viabilidade > 95,0%.

[428] Camundongos NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NSG) fêmeas com 4-5 semanas de idade no início do experimento (criados na Taconic, Dinamarca) foram mantidos sob condições livres de patógenos-específicos com ciclos diários de 12 h luz/12 h escuro de acordo com as diretrizes compromissadas (GV-Solas ; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi analisado e aprovado pelo governo local (ZH193/2014). Após a chegada os animais foram mantidos por uma semana para se habituarem ao novo ambiente e para a observação. Foi realizado o monitoramento contínuo da saúde regularmente.

[429] De acordo com o protocolo (Figura 8), os camundongos NSG fêmeas receberam injeções i.p. com 15 mg/kg de bussulfano seguido um dia mais tarde por uma injeção i.v. de 1x105 células-tronco hematopoiéticas humanas isoladas a partir de sangue do cordão umbilical. Na semana 14-16 após a injeção das células-tronco, os camundongos foram sangrados pelo vaso sublingual e o sangue foi analisado por citometria de fluxo para humanização bem-sucedida. Os camundongos eficientemente enxertados foram randomizados de acordo com suas frequências de células T humanas nos diferentes grupos de tratamento (Figura 8, n=10/grupo). Nesse momento, os camundongos foram injetados com células tumorais por via s.c., tal como descrito acima, e foram tratados uma vez por semana com os compostos ou PBS (veículo), quando o tamanho do tumor atingiu aproximadamente 450 mm3 (dia 11). Todos os camundongos receberam injeções i.v. de 200 μL da solução apropriada. Para se obter a quantidade adequada de compostos por 200 μL, as soluções de estoque (Tabela 6 8?) foram diluídas com PBS quando necessário.

Para as terapias combinadas (Grupo D, Figura 8) com GAZYVA, a construção

CD19-4-1BBL foi injetada concomitantemente. O crescimento tumoral foi medido duas vezes por semana usando um paquímetro e o volume tumoral foi calculado da seguinte forma: Tv: (L2/2) x C (L: largura, C: comprimento)

[430] A Figura 9 mostra a cinética do crescimento tumoral (Média ± EPM) em todos os grupos de tratamento. Não foram detectados efeitos do CD19-4-1BBL como monoterapia. O obinutuzumabe, como agente único, induziu pouca inibição do crescimento tumoral, entretanto, a combinação com CD19-4-1BBL induziu a completa regressão do tumor em todos os animais (Figura 9).

TABELA 8

COMPOSIÇÕES UTILIZADAS NESTE EXPERIMENTO Composto Tampão de Formulação Concentração(mg/mL) 20mM de Histidina, 5,16 mono CD19 (2B11)-4-1BBL 140mM de NaCl, (= solução estoque) pH6,0 20mM de Histidina, 25 obinutuzumabe (Gazyva) 140mM de NaCl, (= solução estoque) pH6,0

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. AGONISTA DE 4-1BB (CD137) para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser usado em combinação com um anticorpo anti-CD20, e em que o agonista de 4-1BB compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor.

2. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo agonista de 4-1BB e o anticorpo anti- CD20 serem administrados concomitantemente.

3. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo agonista de 4-1BB e o anticorpo anti-CD20 serem administrados juntos em uma composição única ou serem administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

4. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo agonista de 4-1BB compreender pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19.

5. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo agonista de 4-1BB compreender três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos.

6. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo agonista de 4-1BB compreender três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos; e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, particularmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

7. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19, e três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) que compreende a (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e (iii) CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (V LCD19) que compreende a (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

20.

8. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 e três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (V HCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

9. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo um domínio Fc de IgG, especificamente um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4.

10. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação a um receptor de Fc e/ou a função efetora.

11. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo;

(a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19; (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados entre si por um ligante peptídico e o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo.

12. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo; (a) pelo menos um domínio Fab capaz de ligar-se especificamente ao CD19 compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; ou uma região variável de cadeia pesada (VHCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLCD19) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados entre si por uma ligação de bissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno ser primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32; e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

13. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em; a) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; b) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; c) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; d) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

33, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

41 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42;

e) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

33, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44;

f) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

34, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 46;

g) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

47, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

35 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; h) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

47, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

37 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38;

i) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

48, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 50;

j) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

47, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

41 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42;

k) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

47, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; e l) uma molécula que compreende duas cadeias leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

48, uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

14. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao CD19.

15. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser um anticorpo biespecífico anti-CD19/anti-4-1BB.

16. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo anticorpo anti-CD20 ser um anticorpo anti-CD20 tipo I.

17. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, caracterizado pelo anticorpo anti-CD20 ser o rituximabe;

18. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo anticorpo anti-CD20 ser um anticorpo anti-CD20 tipo II.

19. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizado pelo anticorpo anti-CD20 ser um anticorpo anti-CD20 afucosilado.

20. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15 ou 18, caracterizado pelo anticorpo anti-CD20 ser o obinutuzumabe.

21. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo anticorpo anti-CD20 ser rituximabe ou obinutuzumabe.

22. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser usado em combinação com um anticorpo anti-CD20, e em que a combinação é administrada em intervalos de cerca de uma semana a três semanas.

23. AGONISTA DE 4-1BB para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22, caracterizado pelo pré- tratamento com um anticorpo anti-CD20 tipo II, preferencialmente com obinutuzumabe, ser realizado antes do tratamento combinado, em que o período de tempo entre o pré-tratamento e o tratamento combinado é suficiente para a redução de células B no indivíduo em resposta ao anticorpo anti-CD20 Tipo II, preferencialmente o obinutuzumabe.

24. PRODUTO FARMACÊUTICO, caracterizado por compreender (A) uma primeira composição compreendendo como ingrediente ativo um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor e um excipiente farmaceuticamente aceitável; e (B) uma segunda composição compreendendo como ingrediente ativo um anticorpo anti-CD20 e um excipiente farmaceuticamente aceitável, para uso no tratamento combinado ou simultâneo de uma doença, particularmente o câncer.

25. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente ao antígeno associado a tumor e um excipiente farmaceuticamente aceitável, e um segundo medicamento compreendendo um anticorpo anti-CD20.

26. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por ser para uso como medicamento.

27. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizada por ser usada no tratamento de distúrbios proliferativos de células B, particularmente doenças selecionadas a partir do grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de zona marginal (MZL), mieloma múltiplo (MM) ou linfoma de Hodgkin (HL).

28. USO DE UMA COMBINAÇÃO DE UM AGONISTA DE 4- 1BB caracterizado por compreender pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar-se especificamente a um antígeno associado a tumor e um anticorpo anti-CD20 na fabricação de um medicamento para tratar uma doença proliferativa ou retardar a progressão de uma doença proliferativa, particularmente o câncer.

29. MÉTODO PARA TRATAR OU RETARDAR A PROGRESSÃO DO CÂNCER em um sujeito, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar- se especificamente a um antígeno associado a tumor e uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD20 ao sujeito.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo agonista de 4-1BB compreendendo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de ligar especificamente ao antígeno associado a tumor ser administrado concomitante com o anticorpo anti-CD20.