KR20160044598A - 항체 Fc 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Fc 변이체를 포함하는 조작된 폴리펩티드 및 그의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, Fc 변이체는 감소된 효과기 기능을 나타내는 것으로 기재되어 있다. 이러한 변이체는 항체에 의해 유발되는 효과기 기능을 감소시키는 것이 바람직한 항체로 치료될 수 있는 질환을 앓는 환자에 유익하다.

Description

항체 Fc 변이체 {ANTIBODY FC VARIANTS}
본 발명은 Fc 영역의 변이체를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 폴리펩티드의 Fc 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환의 결과로서 변경된 효과기 기능을 갖는 Fc 영역-함유 폴리펩티드에 관한 것이다.
배경
모노클로날 항체는 큰 치료적 효능을 갖고, 오늘날의 의학적 포트폴리오에서 중요한 역할을 수행한다. 지난 10 년 동안, 제약 산업에서의 큰 트렌드는 다수의 질환, 예컨대 암, 천식, 관절염, 다발성 경화증 등의 치료를 위한 치료제로서의 모노클로날 항체 (mAb) 의 개발이었다. 모노클로날 항체는 대개 유전적으로 조작된 포유류 세포 배양물 중 재조합 단백질로서 제조된다.
항체의 Fc 영역, 즉, 항체 스패닝 (spanning) 도메인 CH2, CH3 및 힌지 영역의 부분의 중쇄의 말단부는 가변성이 제한되고, 항체가 발휘하는 생리적 역할을 실행하는데 관여된다. 항체의 Fc 영역에서 기인하는 효과기 기능은 항체의 클래스 및 서브클래스에 따라 다르고, 다양한 생물학적 반응을 유발하는 세포 상의 특이적 Fc 수용체 ("FcR") 에 대한 Fc 영역을 통한 항체의 결합을 포함한다.
이러한 수용체는 전형적으로 Fc 에 대한 결합을 매개하는 세포외 도메인, 막 스패닝 영역, 및 세포 내부에서의 일부 신호전달 사건을 매개할 수 있는 세포내 도메인을 갖는다. 이러한 수용체는 단핵구, 마크로파지, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, B 세포, 대형 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 및 T 세포를 포함하는 다양한 면역 세포에서 발현된다. Fc/FcγR 복합체의 형성은 결합된 항원의 자리로 이러한 효과기 세포를 동원하여, 전형적으로 세포 내부에서의 신호전달 사건 및 중요한 후속 면역 반응 예컨대 염증 매개체의 방출, B 세포 활성화, 엔도사이토시스, 식세포작용, 및 세포독성 공격을 초래한다. 세포독성 및 식세포 효과기 기능을 매개하는 능력은 항체가 표적 세포를 파괴하는 잠재적 메카니즘이다. FcγR 을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인지하고, 그 후 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개성 반응은 항체 의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC) 으로 언급된다 (Ravetch, et al., Annu Rev Immunol 19 (2001) 275-290). FcγR 을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인지하고, 그 후 표적 세포의 식세포작용을 야기하는 세포-매개성 반응은 항체 의존성 세포-매개성 식세포작용 (ADCP) 으로 언급된다. 또한, 분자의 Fc 영역 상의 중첩 자리는 또한, 다른 경우에 보체 의존성 세포독성 (CDC) 으로서 공지된, 보체에 의해 매개되는 세포 비의존성 세포독성 기능의 활성화를 제어한다.
Ab 의 IgG 클래스의 경우, ADCC 및 ADCP 는 Fc 영역과 Fcγ 수용체 (FcγR) 로서 언급되는 수용체의 패밀리의 맞물림 (engagement) 에 의해 지배된다. 인간에서, 이러한 단백질 패밀리는 FcγRI (CD64); FcγRII (CD32), 예를 들어 아이소형 (isoform) FcγRIIA, FcγRIIB, 및 FcγRIIC; 및 FcγRIII (CD16), 예를 들어 아이소형 FcγRIIIA 및 FcγRIIIB 를 포함한다 (Raghavan, and Bjorkman, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12 (1996) 181?220; Abes, et al., Expert Reviews VOL 5(6), (2009) 735-747). FcγR 는 다양한 면역 세포 상에서 발현되고, Fc/FcγR 복합체의 형성은 이러한 세포를 결합된 항원의 자리로 동원하여, 전형적으로 신호전달 및 후속 면역 반응 예컨대 염증 매개체의 방출, B 세포 활성화, 엔도사이토시스, 식세포작용, 및 세포독성 공격을 초래한다. 게다가, FcγRI, FcγRIIA/c, 및 FcγRIIIA 는 세포내 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 를 특징으로 하는 활성화 수용체인 반면에, FcγRIIB 는 저해 모티프 (ITIM) 를 가지므로, 저해성이다. 더욱이, de Reys, et al., Blood, 81, (1993) 1792-1800 은 모노클로날 항체, 예컨대 예를 들어 CD9 에 의해 유도되는 혈소판 활성화 및 응집은 항원 인식에 의해 개시된 후, FcγRII-수용체를 관여시키는 Fc 도메인 의존성 단계가 뒤따른다고 결론을 내렸다 (또한 참고: Taylor, et al., Blood 96 (2000) 4254-4260). FcγRI 은 단량체성 IgG 와 높은 친화도로 결합하지만, FcγRIII 및 FcγRII 은 낮은-친화도 수용체이고, 복합체화된 또는 응집된 IgG 와 상호작용한다.
보체 염증 캐스케이드는 선천적 면역 반응의 일부이고, 개체가 염증을 물리치는 능력에 필수적이다. 또다른 중요한 Fc 리간드는 보체 단백질 C1q 이다. C1q 에 대한 Fc 결합은 보체 의존성 세포독성 (CDC) 으로 호칭되는 과정을 매개한다. C1q 는 6 개의 항체에 결합하는 능력을 갖지만, 2 개의 IgG 에 대한 결합으로도 보체 캐스케이드를 활성화시키기에 충분하다. C1q 는 C1r 및 C1s 세린 프로테아제와 복합체를 형성하여, 보체 경로의 Cl 복합체를 형성한다.
많은 상황에서, 면역글로불린의 Fc 영역에 의해 매개되는 효과기 기능의 자극 및 결합은, 예를 들어 CD20 항체에, 매우 유익하나, 어떤 경우에는 효과기 기능을 감소시키거나 또는 심지어는 제거하는 것이 더욱 유리할 수 있다. 이것은 특히 표적 세포에 약물 (예를 들어, 독소 및 동위원소) 을 전달하도록 디자인된 항체의 경우에, 즉 Fc/FcγR 매개성 효과기 기능이 건강한 면역 세포를 치명적 탑재물 (deadly payload) 의 근처로 데려와서, 표적 세포와 함께 정상적 림프양 조직의 고갈을 초래하는 경우에 그러하다 (Hutchins, et al., PNAS USA 92 (1995) 11980-11984; White, et al., Annu Rev Med 52 (2001) 125-145). 이러한 경우에 보체 또는 효과기 세포를 불량하게 동원하는 항체의 사용이 굉장히 유익할 것이다 (또한, Wu, et al., Cell Immunol 200 (2000) 16-26; Shields, et al., J. Biol Chem 276(9) (2001) 6591-6604; US 6,194,551; US 5,885,573 및 PCT 공개 WO 04/029207 참조).
다른 경우에, 예를 들어, 광범위하게 발현되는 수용체와 그것의 코그네이트 (cognate) 리간드의 상호작용을 차단하는 것이 목적인 경우에, 모든 항체 효과기 기능을 감소시키거나 또는 제거하여 원치 않는 독성을 감소시키는 것이 유리할 것이다. 또한, 치료적 항체가 다수의 인간 조직에 걸쳐 무차별적 결합을 나타내는 경우에, 다양한 집합의 조직에 대한 효과기 기능의 표적화를 제한하여 독성을 제한하는 것이 신중할 것이다. 마지막이지만 역시 중요한 것은, FcγRII 수용체에 대한 항체의 감소된 친화도가 특히, 그러한 항체의 심각한 부작용일 수 있는, 항체가 FcγRII 수용체 결합을 통해 혈소판 활성화 및 응집을 유도하는 경우에 유리할 것이다.
특이적 효과기 기능을 결여하는 인간 면역글로불린의 특정 서브클래스는 존재하지만, 모든 효과기 기능을 결여하는 자연 발생적 면역글로불린은 알려져 있지 않다. 대안적 접근은 효과기 기능을 책임지는 Fc 영역 내의 필수적 잔기를 조작하거나 돌연변이시키는 것일 수 있다. 예로서 PCT 공개 WO 2009/100309 (Medimmune), WO 2006/076594 (Xencor), WO 1999/58572 (Univ. Cambridge), US 2006/0134709 (Macrogenics), WO 2006/047350 (Xencor), WO 2006/053301 (Xencor), US 6,737,056 (Genentech), US 5,624,821 (Scotgen Pharmaceuticals), 및 US 2010/0166740 (Roche) 을 참조.
활성화 및 저해성 Fcγ 수용체 또는 보체의 제 1 성분 (C1q) 에 대한 IgG 의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 위치하는 잔기에 의존한다. CH2 도메인의 2 개의 영역이 FcγR 및 보체 C1q 결합에 필수적이고, 고유의 서열을 갖는다. 위치 233-236 에서 인간 IgG1 및 IgG2 잔기 및 위치 327, 330 및 331 에서 IgG4 잔기의 치환은 ADCC 및 CDC 를 크게 감소시켰다 (Armour, et al., Eur. J. Immunol. 29(8) (1999) 2613-2624; Shields, et al., J. Biol. Chem. 276(9) (2001) 6591-6604). Idusogie, et al., J. Immunol 166 (2000) 2571-2575) 은 리툭산에 대한 C1q 결합 자리를 지도화했고, Pro329Ala 가 리툭시맙이 C1q 에 결합하여 보체를 활성화시키는 능력을 감소시켰음을 보였다. Ala 에 의한 Pro329 의 치환은 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIA 수용체에 대한 감소된 결합을 초래하는 것으로 보고된 바 있으나 (Shields, et al., J. Biol. Chem. 276(9) (2001) 6591-6604), 이러한 돌연변이는 또한 FcγRI 및 FcγRII 에 대한 야생형-비슷한 결합을 나타내고, FcγRIIIA 수용체에 대한 결합에서 오직 매우 작은 감소를 나타내는 것으로 기재된 바 있다 (EP 1 068 241 에서 표 1 및 표 2, Genentech).
Oganesyan, et al., Acta Cristallographica D64 (2008) 700-704 는 하위 (lower) 힌지 및 C2H 도메인 내로 3중 (triple) 돌연변이 L234F/L235E/P331S 를 도입했고, 인간 C1q 수용체, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIA 에 대한 인간 IgG1 분자의 결합 활성의 감소를 보여줬다.
여전히, ADCC 및/또는 ADCP 및/또는 CDC 가 크게 감소된 항체에 대한 필요가 충족되지 않았다. 그러므로, 본 발명의 목적은 그러한 항체를 동정하는 것이었다. 놀랍게도, Pro329 에서의 프롤린 잔기를 글리신으로 돌연변이시키는 경우 FcγRIIIA 및 FcγRIIA 수용체의 예상 밖의 강한 저해 및 ADCC 및 CDC 의 강한 저해가 초래됨이 밝혀졌다. 더욱이, Pro329 및 예를 들어 L234A 및 L235A (LALA) 의 조합된 돌연변이는 C1q, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIA 의 예상 밖의 강한 저해를 초래했다. 이와 같이, Fc/Fcγ 수용체 경계면 내의 프롤린 샌드위치를 파괴시킴에 있어서, 글리신 잔기는 다른 아미노산 치환, 예컨대 알라닌보다, 예를 들어, 위치 329 에서, 예상외로 우수해 보인다.
요약
본 발명은 항체 변이체의 분야에 관한 것이고, 효과기 기능이 감소된, 예컨대 ADCC 및/또는 C1q 결합이 감소된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
특히 본 발명은 야생형 인간 IgG Fc 영역의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Fc 변이체는 위치 Pro329 에서의 아미노산 치환 및 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 포함하고, 잔기는 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 번호지정되고, 상기 폴리펩티드는 야생형 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 인간 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA 및/또는 FcγRI 에 대한 감소된 친화도를 나타내고, 상기 폴리펩티드에 의해 유도되는 ADCC 는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 ADCC 의 20% 이상까지 감소되는 폴리펩티드를 제공한다.
구체적 구현예에서 상기 폴리펩티드 내의 야생형 인간 Fc 영역의 Pro329 는 글리신 또는 아르기닌 또는, Fc 의 프롤린329 및 FcγRIII 의 트립토판 잔기 Trp 87 및 Trp 110 사이에 형성되어 있는, Fc/Fcγ 수용체 경계면 내의 프롤린 샌드위치를 파괴하기에 충분히 큰 아미노산 잔기로 치환된다 (Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 July 2000)). 본 발명의 추가의 양상에서 Fc 변이체 내의 하나 이상의 추가의 아미노산 치환은 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, 또는 P331S 이고, 또다른 구현예에서 상기 하나 이상의 추가의 아미노산 치환은 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A 또는 인간 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E 이다.
발명의 또다른 양상에서 제공되는 폴리펩티드는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 인간 수용체 FcγI, FcγIIA 및 C1q 를 포함하는 군의 하나 이상의 추가의 수용체에 대한 감소된 친화도를 나타낸다. 발명의 또다른 양상에서 폴리펩티드는 인간 IgG1 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 발명의 또다른 양상에서 폴리펩티드는 항체 또는 Fc 융합 단백질이다.
추가의 구현예에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 혈소판 응집은 야생형 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 혈소판 응집에 비해 감소된다. 추가의 구현예에서, 발명에 따른 폴리펩티드는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 CDC 에 비해 크게 감소된 CDC 를 나타낸다.
발명의 또다른 구현예에서 약제로서 사용하기 위한 상기 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 구체적 구현예에서 폴리펩티드는 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드가 중쇄 가변 영역으로서 SEQ ID NO:9 및 가변 경쇄 영역으로서 SEQ ID NO:8 을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-CD9 항체이다.
발명의 또다른 양상에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 효과기 기능이 야생형 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 효과기 기능에 비해 크게 감소되는 것이 유리한 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 폴리펩티드가 제공된다.
또다른 구현예에서 야생형 인간 IgG Fc 영역의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 효과기 기능이 야생형 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 효과기 기능에 비해 크게 감소되는 것이 유리한 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 폴리펩티드의 용도가 제공된다.
발명의 또다른 양상에서 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 야생형 인간 IgG Fc 영역의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 효과기 기능이 야생형 인간 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 효과기 기능에 비해 크게 감소되는 것이 유리한 질환을 갖는 개체의 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 양상은 야생형 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 ADCC 의 20% 이상까지 ADCC 의 하향-조정을 위한, 및/또는 ADCP 의 하향-조정을 위한, 야생형 인간 IgG Fc 영역의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 용도로서, 상기 폴리펩티드는 인간 IgG Fc 영역의 Pro329 가 글리신으로 치환되어 있고, 잔기는 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 번호지정되고, 상기 폴리펩티드는 인간 FcγRIIIA 및 FcγRIIA 에 대한 감소된 친화도를 나타내는 용도이다.
발명의 또다른 양상은 야생형 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 ADCC 의 20% 이상까지 ADCC 의 하향-조정을 위한, 및/또는 ADCP 의 하향-조정을 위한, 야생형 인간 IgG Fc 영역의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 용도로서, 상기 폴리펩티드는 인간 IgG Fc 영역의 Pro329 가 글리신으로 치환되어 있고, Fc 변이체는 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A 또는 인간 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E 에서 2 개 이상의 추가의 아미노산 치환을 포함하고, 잔기는 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 번호지정되고, 상기 폴리펩티드는 인간 FcγRIIIA 및 FcγRIIA 에 대한 감소된 친화도를 나타내는 용도이다.
발명의 또다른 양상은 상기 폴리펩티드에 의해 유도되는 혈소판 응집이 야생형 인간 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 혈소판 응집에 비해 감소되고, 폴리펩티드가 혈소판 활성화 항체인 상기 폴리펩티드의 용도이다.
발명의 또다른 양상에서 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환을 갖는 개체의 치료 방법으로서, 상기 개체는 폴리펩티드로 치료되고, 상기 폴리펩티드는 인간 IgG Fc 영역의 Pro329 가 글리신으로 치환되어 있고, 잔기는 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 번호지정되고, 상기 폴리펩티드는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA 에 대한 크게 감소된 결합을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
발명의 또다른 양상에서 상기 방법에서 사용되는 폴리펩티드는 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A 또는 인간 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E 에서 2 개 이상의 추가의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명은 항체 변이체의 분야에 관한 것이고, 효과기 기능이 감소된, 예컨대 ADCC 및/또는 C1q 결합이 감소된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
도 1
면역글로불린을 향하는 상이한 FcγR 들의 결합 친화도가 25℃ 에서 Biacore T100 기구 (GE Healthcare) 를 사용하여 표면 플라스몬 공명 (표면 Plasmon Resonance: SPR) 에 의해 측정되었다.
a) FcγRI 결합 친화도가 GA101 (GA) 항체 변이체 (IgG1-P329G, IgG4-SPLE 및 IgG1-LALA 돌연변이) 에 대해 및 P-셀렉틴 (PS) 항체 변이체 (IgG1-P329G, IgG1-LALA 및 IgG4-SPLE) 에 대해 뿐만 아니라 야생형 항체에 대해 시험되었다.
b) FcγRI 결합 친화도가 CD9 항체 변이체 (IgG1-야생형, IgG1-P329G, IgG1-LALA, IgG4-SPLE, IgG1-P329G / LALA, IgG4-SPLE / P329G) 에 대해 뿐만 아니라 야생형 항체에 대해 시험되었다.
c) FcγRIIA(R131) 결합 친화도가 CD9 항체 변이체 (IgG1-야생형, IgG1-P329G, IgG1-LALA, IgG4-SPLE, IgG1-P329G/ LALA, IgG4-SPLE / P329G) 에 대해 뿐만 아니라 야생형 항체에 대해 시험되었다. 표준화된 (normalized) 반응이 수용체의 농도의 함수로서 나타나 있다.
d) FcγRIIB 결합 친화도가 CD9 (본원에서 "TA" 로 명명됨) 항체 변이체 (IgG1-야생형, IgG4-SPLE / P329G, IgG1-LALA, IgG1-LALA / P329G) 및 P-셀렉틴 (pSel) 항체 변이체 (IgG4-야생형, IgG4-SPLE) 에 대해 뿐만 아니라 야생형 항체에 대해 시험되었다.
e) FcγRIIIA-V158 결합 친화도가 CD9 항체 변이체 (IgG1-야생형, IgG4-SPLE, IgG1-LALA, IgG4-SPLE / P329G, IgG1-P329G, IgG1-LALA / P329G) 에 대해 뿐만 아니라 야생형 항체에 대해 시험되었다. 표준화된 반응이 수용체의 농도의 함수로서 나타나 있다.
도 2
C1q 결합이 P-셀렉틴 (PS) 항체 변이체 (IgG1 야생형, P329G, IgG4-SPLE) 및 CD20 (GA) 항체 변이체 (IgG1-야생형, P329G 및 IgG4-SPLE) 에 대해 시험되었다.
도 3
면역-효과기 세포를 동원하는 잠재능력은 Fc 변이체의 유형에 의존한다. Fc 변이체가 ELISA 플레이트 위에 코팅되었고, 인간 FcγRIIIA 로 트랜스펙션된 인간 NK92 효과기 세포가 첨가되었다. 활성화된 NK 세포의 세포용해 활성의 유도가 에스테라제 검정을 사용하여 측정되었다.
a) CD20 (GA101) 항체 변이체 (야생형, LALA, P329G, P329G / LALA) 가 분석되었다. b) CD20 (GA101) 항체 변이체 (P329R 또는 P329G 돌연변이가 도입됨) 가 분석되었다. 임의의 효과기 세포 동원 기능에 대한 더 강한 신호를 갖기 위해 모든 변이체가 글리코엔지니어드 버전으로 생성되었다.
도 4
면역-효과기 세포를 동원하는 잠재능력은 Fc 변이체의 유형에 의존하며, 전통적 ADCC 검정에 의해 측정되었다. 인간 FcγRIIIA 로 트랜스펙션된 인간 NK92 세포주가 효과기로서 사용되었고, CD20 양성 Raji 세포가 표적 세포로서 사용되었다. 상이한 글리코엔지니어드 CD20 항체 (GA101 G(2) 및 비-글리코엔지니어드 CD20 항체 (GA101) 변이체 (P329G, P329A 또는 LALA 돌연변이가 도입됨) 가 시험되었다.
a) 비-글리코엔지니어드 CD20 항체 : P329G, LALA 및 P329G/LALA 돌연변이가 각각 항체 내로 각각 도입되었다.
b) 글리코엔지니어드 CD20 항체: P329G, P329A 및 LALA 돌연변이가 각각 항체 내로 각각 도입되었다.
도 5
보체 의존성 세포독성 (CDC) 검정. 비-글리코엔지니어드 및 글리코엔지니어드 CD20 (GA101) 항체의 상이한 Fc 변이체가 SUDH-L4 표적 세포에 대한 CDC 를 매개하는 효능에 대해 분석되었다.
a) 비-글리코엔지니어드 CD20: P329G, LALA 및 P329G/LALA 돌연변이가 각각 항체 내로 각각 도입되었다.
b) 글리코엔지니어드 CD20: P329G, P329A 및 LALA 돌연변이가 각각 항체 내로 각각 도입되었다.
도 6
a) 인간 IgG1 변이체의 Fc-연합된 글리칸의 탄수화물 프로파일. LALA, P329G, P329A 또는 P329G / LALA 돌연변이를 함유하는 hIgG1 의 Fc-연합된 올리고당 상의 갈락토실화의 백분율은 야생형 항체의 그것과 오직 최소한도로 상이하다.
b) 상대적 갈락토실화: IgG1 P329G / LALA 돌연변이가 도입된 4 개의 상이한 IgG. 4 개의 상이한 V-도메인이 Hek293 EBNA 세포에서 발현되었을 때 그들의 갈락토실화의 양에 대해 비교되었다.
도 7
전혈 검정에서의 항체-유도성 혈소판 응집. 쥐 (murine) IgG1 은 혈소판 응집을 유도했으며, 항체 농도에 의존적으로 반응에 차이를 보이는 2 개의 공여체에 대해 측정되었다.
a) 공여체 A, b) 공여체 B.
정의
본 명세서 및 청구항에서, 면역글로불린 중쇄 내의 잔기의 번호지정 (numbering) 은 본원에 참조로 명백히 포함되는 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) 에서와 같은 EU 인덱스에 따른다. "Kabat 에서와 같은 EU 인덱스" 는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호지정을 언급한다.
"친화도" 는 분자 (예를 들어, 항체) 의 단일 결합 자리와 그것의 결합 파트너 (예를 들어, 항원 또는 Fc 수용체) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 언급한다. 다르게 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 "결합 친화도" 는 결합 쌍 (예를 들어, 항체/Fc 수용체 또는 항체와 항원) 의 일원들 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 언급한다. 분자 X 의 그 파트너 Y 에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd) 로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 포함하여, 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 설명적이고 예시적인 구현예들이 하기에 기재된다.
"친화도 성숙된" 항체는, 변경을 보유하지 않는 부모 항체와 비교되게, 하나 이상의 과가변 영역 (HVR) 내에 하나 이상의 변경이 있는 항체를 언급하며, 그러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화도에 개선을 초래한다.
"아미노산 수식" 은 소정의 아미노산 서열의 아미노산 서열에서의 변화를 언급한다. 예시적 수식은 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 본원에서 바람직한 아미노산 수식은 치환이다. 예를 들어 Fc 영역의, 명시된 위치에서의 "아미노산 수식" 은 명시된 잔기의 치환 또는 결실, 또는 명시된 잔기에 인접한 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 언급한다. 명시된 잔기에 "인접한" 삽입은 그것의 하나 내지 두 개의 잔기 내에의 삽입을 의미한다. 삽입은 명시된 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.
"아미노산 치환" 은 소정의 아미노산 서열 내에서 하나 이상의 기존 아미노산 잔기의 또다른 상이한 "대체" 아미노산 잔기에 의한 대체를 언급한다. 대체 잔기 또는 잔기들은 "자연 발생적 아미노산 잔기" 일 (즉 유전 부호에 의해 인코딩될) 수 있고, 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 라이신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val) 으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 대체 잔기는 시스테인이 아니다. 하나 이상의 비-자연 발생적 아미노산 잔기에 의한 치환이 또한 본원에서의 아미노산 치환의 정의에 포괄된다. "비-자연 발생적 아미노산 잔기" 는, 폴리펩티드 사슬 내의 인접 아미노산 잔기(들)에 공유 결합할 수 있는, 위에 열거된 자연 발생적 아미노산 잔기 이외의 잔기를 언급한다. 비-자연 발생적 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 ? 기타 아미노산 잔기 유사체 예컨대 Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336 에 기재된 것을 포함한다. 그러한 비-자연 발생적 아미노산 잔기를 생성하기 위해, 상기 Noren, et al., Science 244 (1989) 182 및 Ellman, et al. 의 절차가 사용될 수 있다. 간략히, 이러한 절차는 비-자연 발생적 아미노산 잔기에 의한 억제인자 tRNA 의 화학적 활성화 및 그 후 그 RNA 의 시험관내 전사 및 번역을 수반한다.
"아미노산 삽입" 은 하나 이상의 아미노산의 소정의 아미노산 서열 내로의 통합을 언급한다. 삽입은 통상적으로 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어질 것이지만, 본 출원은 더 큰 "펩티드 삽입", 예를 들어 약 3 개 ~ 약 5 개 또는 심지어는 약 10 개 이하의 아미노산 잔기의 삽입을 고려한다. 삽입된 잔기(들)은 상기와 같이 자연 발생적 또는 비-자연 발생적일 수 있다.
"아미노산 결실" 은 하나 이상의 아미노산 잔기의 소정의 아미노산 서열로부터의 제거를 언급힌다.
본원에서 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 조각 (원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 변이체" 는, 예를 들어 야생형 항체에서 특정 아미노산 잔기의 돌연변이에 의해 도입되는, 야생형 항체와 비교되는 아미노산 서열의 변경이 항체 변이체에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 야생형 항체의 변이체를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 효과기 기능(들)" 또는 "효과기 기능" 은 IgG 의 Fc 효과기 도메인(들) (예를 들어, 면역글로불린의 Fc 영역) 이 기여하는 기능을 언급한다. 그러한 기능은, 예를 들어, 식세포 또는 용해 활성이 있는 면역 세포 상의 Fc 수용체에 대한 Fc 효과기 도메인(들)의 결합에 의해 또는 보체계의 성분에 대한 Fc 효과기 도메인(들)의 결합에 의해 발휘될 수 있다. 전형적 효과기 기능은 ADCC, ADCP 및 CDC 이다.
"항체 조각" 은 온전한 (intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 다른 분자를 언급한다. 항체 조각의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디 (diabodies); 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들어 scFv); 및 항체 조각으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
참조 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체" 는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그것의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 언급하고, 역으로, 참조 항체는 경쟁 검정에서 항체의 그것의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단한다. 예시적 경쟁 검정이 본원에서 제공된다.
"항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)" 및 "ADCC" 는 FcR 을 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어 자연 살해 (NK) 세포, 호중구, 및 마크로파지) 가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인지하고, 그 후 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개성 반응을 언급한다. ADCC 를 매개하는 주요 세포인, NK 세포는 오직 FcγRIII 을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 Ravetch, and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492 의 페이지 464 의 표 3 에 요약되어 있다.
용어 "항체-의존성 세포성 식세포작용 (Antibody-dependent cellular phagocytosis)" 및 "ADCP" 은 면역글로불린 Fc 영역에 결합하는 식세포작용 면역 세포 (예를 들어, 마크로파지, 호중구 및 수지상 세포) 에 의해 항체로 싸인 (coated) 세포가 전체적으로 또는 부분적으로 내부화되는 과정을 언급한다.
용어 "결합 도메인" 은 또다른 분자에 결합하는 폴리펩티드의 영역을 언급한다. FcR 의 경우에, 결합 도메인은 Fc 영역의 결합을 책임지는 그의 폴리펩티드 사슬 (예를 들어 그의 α 사슬) 의 일부를 포함할 수 있다. 하나의 유용한 결합 도메인은 FcR α 사슬의 세포외 도메인이다.
본원에서 사용되는 용어 Fc 수용체에 대한 "결합" 은 예를 들어 BIAcore(R) 검정 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 에서 Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 의미한다.
BIAcore(R) 검정에서 Fc 수용체는 표면에 결합되고, 변이체, 예를 들어 돌연변이가 도입된 항체 변이체의 결합이 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 측정된다. 결합의 친화도는 용어 ka (항체/Fc 수용체 복합체로부터 항체의 연합에 대한 속도 상수), kd (해리 상수), 및 KD (kd/ka) 에 의해 정의된다. 대안적으로, SPR 센소그램 상의 결합 신호가 참조의 반응 신호와, 공명 신호 높이 및 해리 거동에 대해, 직접 비교될 수 있다.
"C1q" 는 면역글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 자리를 포함하는 폴리펩티드이다. C1q 는 2 개의 세린 프로테아제, C1r 및 C1s 와 함께, 보체 의존성 세포독성 (CDC) 경로의 제 1 성분인 복합체 C1 을 형성한다. 인간 C1q 는, 예를 들어 Quidel, San Diego, Calif. 에서 구입할 수 있다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" (또한 "Cγ2" 도메인으로 언급됨) 은 통상적으로 약 아미노산 231 에서부터 약 아미노산 340 까지 걸쳐 있다. CH2 도메인은 그것이 또다른 도메인과 밀접하게 짝을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2 개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬이 온전한 천연 IgG 분자의 2 개의 CH2 도메인 사이에 개재되어 있다. 탄수화물이 도메인-도메인 쌍형성에 대한 대체물을 제공하고 CH2 도메인을 안정화시키는 것을 도울 수 있다고 추측되어 왔다 (Burton, Molec. Immunol. 22 (1985) 161-206).
"CH3 도메인" 은 Fc 영역에서 CH2 도메인의 C-말단에 있는 잔기들의 스트레치 (stretch) 를 포함한다 (즉 IgG 의 약 아미노산 잔기 341 에서부터 약 아미노산 잔기 447 까지).
용어 "암" 및 "암성" 은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리적 상태를 언급하거나 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 그러한 암의 더욱 특별한 예는 편평세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평 암종, 복막의 암, 간세포 암, 위장관 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포 선종 (hepatoma), 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
본원에서 사용되는 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물" 은 호환되게 사용되고, 모든 그러한 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 는 1차 대상 세포 및 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 모든 자손이 인위적 또는 비인위적 돌연변이로 인해 DNA 내용에서 정확히 일치하지는 않을 수 있다는 것이 또한 이해된다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 구별되는 명칭이 의도되는 경우에, 그것은 문맥으로부터 명백할 것이다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 출처 또는 종에서 유래하지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종에서 유래하는 항체를 언급한다.
항체의 "클래스" 는 그것의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 언급한다. 항체의 5 가지 주요 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 이 존재하고, 이들 중 여럿은 서브클래스 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 호칭된다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제" 는 세포 기능을 저해 또는 방지하고/거나 세포 죽음 또는 파괴를 야기하는 물질을 언급한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu 의 방사성 동위원소); 화학치료적 작용제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 중격제); 성장 저해제; 효소 및 그의 조각 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소 예컨대 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적으로 활성인 독소 (그의 조각 및/또는 변이체를 포함); 및 다양한 하기 항종양 또는 항암제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "보체-의존성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity)" 또는 CDC 는 표적-결합된 항체의 Fc 효과기 도메인(들)이 표적 세포 막에서의 구멍의 형성으로 끝이 나는 일련의 효소 반응을 활성화시키는 세포 사망을 유도하는 메카니즘을 언급한다. 전형적으로, 항원-항체 복합체 예컨대 항체로 싸인 표적 세포 상에서의 것은 보체 성분 C1q 에 결합하여 이를 활성화시키고, 결국 보체 캐스케이드를 활성화시켜 표적 세포 사망을 초래한다. 보체의 활성화는 또한 백혈구 상의 보체 수용체 (예를 들어, CR3) 에 결합함으로써 ADCC 를 촉진하는 표적 세포 표면 상에의 보체 성분의 침적을 초래할 수 있다.
"장애" 는 폴리펩티드, 예컨대 Fc 변이체를 포함하는 항체를 이용하는 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 상태이다. 이는 포유류를 문제의 장애에 취약하게 만드는 병적 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 하나의 구현예에서, 장애는 암이다.
"효과기 기능" 은, 항체 아이소타입에 따라 다른, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 언급한다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC); 식세포작용 (ADCP); 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체) 의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
본원에서 사용되는 "감소된 효과기 기능" 은 특정 효과기 기능, 예컨대 예를 들어 ADCC 또는 CDC 의, 대조군 (예를 들어 야생형 Fc 영역이 있는 폴리펩티드) 과 비교시, 20% 이상의 감소를 언급하고, 본원에서 사용되는 "크게 감소된 효과기 기능" 은 특정 효과기 기능, 예컨대 예를 들어 ADCC 또는 CDC 의, 대조군과 비교시, 50% 이상의 감소를 언급한다.
약제, 예를 들어, 약학적 제형의 "유효량" 은 필수적인 투여량에서 및 시간 동안 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 성취하기에 효과적인 양을 언급한다.
본원에서 용어 "Fc 영역" 은 불변 영역의 일부 이상을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 그 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 에서부터, 또는 Pro230 에서부터, 중쇄의 카르복시-말단까지 이른다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 다르게 명시되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 번호지정은, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 에 기재된, EU 인덱스로도 호칭되는, EU 번호지정 시스템에 따른다.
"변이체 Fc 영역" 은 본원에 정의된 하나 이상의 "아미노산 수식" 으로 인해 "선천" 또는 "야생형" 서열 Fc 영역과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교시 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역에서 또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 개 ~ 약 10 개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 개 ~ 약 5 개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역과 및/또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역과 약 80% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 그들과 약 90% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 그들과 약 95% 이상의 상동성을 보유할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "Fc-변이체" 는 Fc 도메인에 수식을 포함하는 폴리펩티드를 언급한다. 본 발명의 Fc 변이체는 그것을 구성하는 아미노산 수식에 따라 정의된다. 따라서, 예를 들어, P329G 는 부모 Fc 폴리펩티드와 비교시 위치 329 에서 프롤린이 글리신으로 치환된 Fc 변이체이며, 이 경우 번호지정은 EU 인덱스에 따른다. 야생형 아미노산의 정체가 명시될 수 없는 경우에, 앞서 언급된 변이체는 P329G 로 언급된다. 본 발명에서 논의되는 모든 위치에 관하여, 번호지정은 EU 인덱스에 따른다. EU 인덱스 또는 Kabat 에서와 같은 EU 인덱스 또는 EU 번호지정 책략 (scheme) 은 EU 항체의 번호지정 (본원에서 전문이 참조로 포함되는, Edelman, et al., Proc Natl Acad Sci USA 63 (1969) 78-85) 을 언급한다. 수식은 부가, 결실, 또는 치환일 수 있다. 치환은 자연 발생적 아미노산 및 비-자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있다. 변이체는 비-자연적 아미노산을 포함할 수 있다. 예는 모두 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 6,586,207; WO 98/48032; WO 03/073238; US 2004/0214988 A1; WO 05/35727 A2; WO 05/74524 A2; Chin, J.W., et al., Journal of the American Chemical Society 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W., and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024; 및, Wang, L., and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10 을 포함한다.
용어 "Fc 영역-함유 폴리펩티드" 는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 면역부착소 (immunoadhesin) (하기 정의 참조) 를 언급한다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR" 은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하는데 사용된다. 바람직한 FcR 은 천연 서열 인간 FcR 이다. 더욱이, 바람직한 FcR 은 IgG 항체에 결합하는 것 (감마 수용체) 이고, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하며, 이러한 수용체의 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해성 수용체") 를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA 는 그것의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 를 함유한다. 저해성 수용체 FcγRIIB 는 그것의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 저해 모티프 (ITIM) 를 함유한다 (Daeron, M., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234 에서의 리뷰를 참고). FcR 은 Ravetch, and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492; Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; 및 de Haas, et al., J. Lab. Clin. MEd. 126 (1995) 330-41 에서 리뷰되어 있다. 장래에 동정될 것들을 포함하여, 기타 FcR 도 본원에서의 용어 "FcR" 에 포괄된다. 그 용어는 또한 어머니 IgG 의 태아로의 전달을 책임지는 신생아 수용체, FcRn 을 포함한다 (Guyer, et al., J. Immunol. 117 (1976) 587 and Kim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249).
본원에서 사용되는 "IgG Fc 리간드" 는 IgG 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 의미한다. Fc 리간드는 FcγR, FcγR, FcγR, FcRn, C1q, C3, 만난 결합 렉틴, 만노스 수용체, 포도상구균 단백질 A, 연쇄상구균 단백질 G, 및 바이러스 FcγR 을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. Fc 리간드는 FcγR 에 상동인 Fc 수용체의 패밀리인 Fc 수용체 동족체 (FcRH) 를 또한 포함한다 (전문이 참조로 포함되는, Davis, et al., Immunological Reviews 190 (2002) 123-136). Fc 리간드는 Fc 에 결합하는 발견되지 않은 분자를 포함할 수 있다. 특별한 IgG Fc 리간드는 FcRn 및 Fc 감마 수용체이다. 본원에서 사용되는 "Fc 리간드" 는 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 "Fc 감마 수용체", "FcγR" 또는 "Fcg감마R" 은 IgG 항체 Fc 영역에 결합하는 단백질의 패밀리의 임의의 일원을 의미하며, FcγR 유전자에 의해 인코딩된다. 인간에서 이러한 패밀리는 FcγRI (CD64), 예를 들어 아이소형 FcγRIA, FcγRIB, 및 FcγRIC; FcγRII (CD32), 예를 들어 아이소형 FcγRIIA (동종이형 H131 및 R131 을 포함함), FcγRIIB (FcγRIIB-1 및 FcγRIIB-2 을 포함함), 및 FcγRIIc; 및 FcγRIII (CD16), 예를 들어 아이소형 FcγRIIIA (동종이형 V158 및 F158 을 포함함) 및 FcγRIIIb (동종이형 FcγRIIB-NA1 및 FcγRIIB-NA2 을 포함함) (전문이 참조로 포함되는, Jefferis, et al., Immunol Lett 82 (2002) 57-65), 뿐만 아니라 임의의 미발견 인간 FcγR 또는 FcγR 아이소형 또는 동종이형을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. FcγR 은 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 및 원숭이를 포함하나 이에 제한되지 않는 임이의 유기체로부터일 수 있다. 마우스 FcγR 은 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16), 및 FcγRIII-2 (CD16-2), 뿐만 아니라 임의의 미발견 마우스 FcγR 또는 FcγR 아이소형 또는 동종이형을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 "FcRn" 또는 "신생아 Fc 수용체" 는 IgG 항체 Fc 영역에 결합하는 단백질을 의미하고, 일부 이상이 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. FcRn 은 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 및 원숭이를 포함하나 이에 제한되지 않는 임이의 유기체로부터일 수 있다. 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 기능성 FcRn 단백질은 종종 중쇄 및 경쇄로 언급되는 2 개의 폴리펩티드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. 본원에서 다르게 언급되지 않으면, FcRn 또는 FcRn 단백질은 FcRn 중쇄와 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 언급한다.
본원에서 사용되는 "야생형 또는 부모 폴리펩티드" 는 나중에 수식되어 변이체를 생성하는 미수식 폴리펩티드를 의미한다. 야생형 폴리펩티드는 자연 발생적 폴리펩티드, 또는 자연 발생적 폴리펩티드의 변이체 또는 조작된 버전일 수 있다. 야생형 폴리펩티드는 폴리펩티드 자체, 부모 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 그것을 인코딩하는 아미노산 서열을 언급할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 "야생형 면역글로불린" 은 수식되어 변이체를 생성하는 미수식 면역글로불린 폴리펩티드를 의미하고, 본원에서 사용되는 "야생형 항체" 는 수식되어 변이체를 생성하는 미수식 항체를 의미한다. "야생형 항체" 가 아래 개요가 서술된 공지된 시판, 재조합적으로 생산된 항체를 포함한다는 점에 유의해야 한다.
용어 "조각 결정화가능 (Fc) 폴리펩티드 (fragment crystallizable polypeptide)" 는 효과기 분자 및 세포와 상호작용하는 항체 분자의 부분이다. 그것은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 부분을 포함한다.
용어 "골격" 또는 "FR" 은 과가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 언급한다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4 개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4 로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 에서 다음 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 및 "전체 항체" 는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 언급할 때 호환되게 사용된다.
"기능적 Fc 영역" 은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능" 을 보유한다. 예시적 "효과기 기능" 은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체; BCR) 의 하향 조절 등을 포함한다. 그러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어 항체 가변 도메인) 과 조합될 것을 요구하고, 예를 들어 본원에 개시된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"힌지 영역" 은 일반적으로 인간 IgG1 의 Glu216 에서부터 Pro230 까지 이르는 것으로 정의된다 (Burton, Molec. Immunol. 22 (1985) 161-206). 다른 IgG 아이소타입의 힌지 영역은 동일한 위치에 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫번째 및 마지막 시스테인 잔기를 배치함으로써 IgG1 서열에 맞춰 정렬될 수 있다.
Fc 영역의 "하위 힌지 영역" 은 보통 힌지 영역의 C-말단 가까이에 있는 잔기들의 스트레치, 즉 Fc 영역의 잔기 233 내지 239 로서 정의된다.
"상동성" 은 최대 백분 상동성을 달성하기 위해, 필요한 경우, 서열을 정렬하고 공백 (gap) 을 도입한 후, 일치하는 아미노산 서열 변이체 내의 잔기의 백분율로서 정의된다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 하나의 그러한 컴퓨터 프로그램은 1991 년 12 월 10 일에 미국 저작권청 (Washington, D.C. 20559) 에 사용자 문서와 함께 제출된 저작자가 Genentech, Inc. 인 "Align 2" 이다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물" 은 호환되게 사용되고, 그러한 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 내부에 도입된 세포를 언급한다. 숙주 세포는, 1차 형질전환된 세포 및 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함하여, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 를 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 내용에서 완전히 일치하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선별된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다.
"인간 항체" 는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 출처에서 유래하는 항체의 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"인간 효과기 세포" 는 하나 이상의 FcR 을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 인간 효과기 세포는 적어도 FcγRIII 을 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC 를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하며; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 상기 효과기 세포는 그의 천연 출처로부터, 예를 들어 혈액 또는 본원에 기재된 PBMC 로부터 단리될 수 있다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 언급한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 실질적으로 모든 하나 이상, 전형적으로 2 개의, 가변 도메인을 포함할 것이다, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR) 은 비-인간 항체의 그것에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 그것에 해당한다. 인간화 항체는 인간 항체에서 유래하는 항체 불변 영역의 일부 이상을 임의로 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태" 는 인간화를 겪은 항체를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "과가변 영역" 또는 "HVR" 은 서열에서 과가변이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("과가변 루프") 를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 각각 언급한다. 일반적으로, 천연 4-사슬 항체는 6 개의 HVR 을 포함한다; VH 에 3 개 (H1, H2, H3), 및 VL 에 3 개 (L1, L2, L3). HVR 은 일반적으로 과가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역 영역" (CDR) 으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 촤고 서열 가변성을 갖고/거나 항원 인식에 관여한다. 예시적 과가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) 에서 발생한다 (Chothia, and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). 예시적 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 24-34, L2 의 50-56, L3 의 89-97, H1 의 31-35B, H2 의 50-65, 및 H3 의 95-102 에서 발생한다 (Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). VH 에서의 CDR1 을 제외하고, CDR 은 과가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 일반적으로 포함한다. CDR 은 항원과 접촉하는 "특이성 결정 잔기", 또는 "SDR" 을 또한 포함한다. SDR 은 단축된-CDR, 또는 a-CDR 로 호칭되는 CDR 의 영역 내부에 함유되어 있다. 예시적 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 31-34, L2 의 50-55, L3 의 89-96, H1 의 31-35B, H2 의 50-58, 및 H3 의 95-102 에서 발생한다 (참조, Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). 다르게 언급되지 않으면, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 본원에서 상기 Kabat 등에 따라 번호지정된다.
"면역 복합체" 는 하나 이상의 표적 분자 및 하나 이상의 이종 Fc 영역-함유 폴리펩티드가 서로 결합하여 더 큰 분자량 복합체를 형성할 때 형성하는 상대적으로 안정적인 구조를 언급한다. 면역 복합체의 예는 항원-항체 응집체 및 표적 분자-면역부착소 응집체이다. 본원에서 사용되는 용어 "면역 복합체" 는, 다르게 언급되지 않으면, 생체외 복합체 (즉 자연에서 발견될 수 있는 설정 또는 형태 이외의) 를 언급한다. 그러나, 예를 들어 포유류에서 면역 복합체의 청소를 평가하기 위해, 면역 복합체가 포유류에 투여될 수 있다.
"면역접합체" 는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상" 은 포유류이다. 포유류는 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말) , 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트) 를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 그것의 자연 환경의 한 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는, 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의해 측정할 때 95% 또는 99% 이상의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 리뷰에 대해, 예를 들어, Flatman, et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87 참조.
"단리된" 폴리펩티드는 그것의 자연 환경의 한 구성요소로부터 동정 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그것의 자연 환경의 오염물질 구성요소는 폴리펩티드에 대한 진단적 또는 치료적 사용을 간섭할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 (1) Lowry 방법에 의해 측정될 때 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 폴리펩티드로, (2) 회전 컵 서열분석기 (spinning cup sequenator) 를 사용하여 15 개 잔기 이상의 N-말단 또는 내부 아미노산 서열을 수득하기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는, 바람직하게는, 실버 스테인을 사용하는 환원 또는 비환원 조건 하의 SDS-PAGE 에 의한 균질성까지 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 자연 환경의 하나 이상의 구성요소가 존재하지 않을 것이므로 재조합 세포 내부의 제자리 폴리펩티드를 포함한다. 보통, 그러나, 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"단리된" 핵산은 그것의 자연 환경의 한 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 언급한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항체를 인코딩하는 단리된 핵산" 은 단일 벡터 또는 별도의 벡터들 내의 상기 핵산 분자(들), 및 숙주 세포내 하나 이상의 위치에 존재하는 상기 핵산 분자 (들)을 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (또는 그의 조각) 을 언급한다.
본원에서 사용되는 단어 "표지" 는 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 접합되는 탐지가능한 화합물 또는 조성물을 언급한다. 표지는 그 자체로 탐지가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지) 또는, 효소 표지의 경우에, 탐지가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉진할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "리간드 결합 도메인" 은 임의의 천연 세포-표면 수용체 또는 적어도 상응하는 천연 수용체의 정성적 리간드 결합 능력을 보유하는 임의의 영역 또는 그의 유도체를 언급한다. 구체적 구현예에서, 수용체는 면역글로불린 슈퍼유전자패밀리의 일원에 상동인 세포외 도메인을 갖는 세포-표면 폴리펩티드로부터이다. 면역글로불린 슈퍼유전자패밀리의 일원이 아님에도 불구하고 구체적으로 이러한 정의에 포함되는, 기타 수용체는 사이토카인에 대한 수용체, 특히 티로신 키나제 활성을 갖는 수용체 (수용체 티로신 키나제), 조혈소 및 신경 성장 인자 수용체 슈퍼패밀리의 일원, 및 세포 부착 분자, 예를 들어 (E-, L- 및 P-) 셀렉틴이다.
본원에 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 언급하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체들은 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합하며, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생하는 일반적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이체 항체는 제외한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프) 로 향해지는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자로 향해진다. 따라서, "모노클로날" 이란 수식어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득되는 항체의 특질을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 (transgenic) 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 모노클로날 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 기타 예시적 방법들은 본원에 기재되어 있다.
"네이키드 (naked) 항체" 는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 언급한다. 네이키드 항체는 약학적 제형 중에 존재할 수 있다.
"천연 항체" 는 다양한 구조를 갖는 자연 발생적 면역글로불린 분자를 언급한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는, 다이설파이드-결합된 2 개의 동일한 경쇄 및 2 개의 동일한 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종사합체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 호칭되는 가변 영역 (VH), 및 그 뒤에 3 개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3) 을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 호칭되는 가변 영역 (VL), 및 그 뒤에 불변 경 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그것의 불변 및 가변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 호칭되는 2 가지 유형중 하나로 지정될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역" 은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 자연 발생적 변이체를 포함한다.
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 위치할 때 "작동적으로 연결" 되어 있다. 예를 들어, 프리서열 (presequence) 또는 분비성 리더에 대한 DNA 는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질 (preprotein) 로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA 에 작동적으로 연결되어 있고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있고; 또는 리보솜 결합 자리는 번역을 촉진하도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 일반적으로, "작동적으로 연결된" 은 연결될 DNA 서열이 연속적이고, 분비성 리더의 경우 연속적이고 번역 프레임 내에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적이어야 하는 것은 아니다. 연결은 가까운 제한 자리에서의 결찰에 의해 달성된다. 그러한 자리가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 종래의 관습에 따라 사용된다.
용어 "패키지 삽입물" 은, 치료용 제품의 사용에 관한 지시, 용법, 투여량, 투여법, 병용 요법, 금기사항 및/또는 주의사항에 관한 정보를 함유하는, 치료용 제물의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 칭하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 "위치" 는 단백질의 서열에서의 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로, 또는 확립된 포맷, 예를 들어 항체 번호지정에 대한 EU 인덱스에 따라 번호지정될 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" 은 자연 또는 비-자연 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 잔기의 중합체를 언급하는데 호환되게 사용되고, 최소 길이에 제한되지 않는다.
따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 다량체 등은 정의에 포함되지 않는다. 전장 단백질 및 그의 조각 둘다가 정의에 포괄된다. 용어는 또한 폴리펩티드의 번역후 수식, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 및 인산화를 포함한다.
게다가, 본원에서 "폴리펩티드" 는 또한, 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 수식된 단백질 예컨대 천연 서열에 대한 단일 또는 다중 아미노산 잔기 결실, 부가, 및 치환을 언급한다. 예를 들어, 세린 잔기가 치환되어 단일 반응성 시스테인을 제거하거나 또는 다이설파이드 결합을 제거할 수 있거나 또는 보존적 아미노산 치환이 이루어져 절단 자리를 제거할 수 있다. 이러한 수식은, 자리지정 돌연변이유발을 통해서와 같이, 의도적일 수 있거나 또는, 예컨대 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭으로 인한 오류를 통해, 우발적일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "야생형 폴리펩티드" 및 "야생형 (인간) Fc 영역" 은 본원에 개시된 하나 이상의 Fc 영역 수식을 그들이 도입되지 않았기 때문에 결여하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 Fc 영역을 각각 언급하고, 예를 들어 대조군으로서의 역할을 한다. 야생형 폴리펩티드는 천연 서열 Fc 영역 또는 기존 아미노산 서열 수식 (예컨대 부가, 결실 및/또는 치환) 이 있는 Fc 영역을 포함할 수 있다.
용어 "약학적 제형" 은 그안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이 되도록 하는 형태이고, 제형이 투여될 대상에게 용납될 수 없을 정도로 독성인 부가적 성분을 함유하지 않는 제제를 언급한다.
"약학적으로 허용가능한 담체" 는, 대상에게 무독성인, 약학적 제형 내의 활성 성분 이외의 기타 성분을 언급한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
"변경된" FcR 결합 친화도 또는 ADCC 활성을 갖는 폴리펩티드는 부모 폴리펩티드 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교시 증강된 또는 감소된 FcR 결합 활성 및/또는 ADCC 활성을 갖는 것이다. FcR 에 대한 "증가된 결합을 나타내는" 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 FcR 에 부모 폴리펩티드보다 양호한 친화도로 결합한다. FcR 에 대한 "감소된 결합을 나타내는" 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 FcR 에 부모 폴리펩티드보다 불량한 친화도로 결합한다. FcR 에 대한 감소된 결합을 나타내는 그러한 변이체는 FcR 에 대한 주목할 만한 결합을 거의 또는 전혀 보유하지 않을 수 있으며, 예를 들어, 본원의 실시예에서 측정된 천연 서열 IgG Fc 영역의 FcR 에 대한 결합과 비교시 0-20% 일 수 있다.
FcR 에 부모 폴리펩티드보다 "감소된 친화도" 로 결합하는 폴리펩티드는 결합 검정에서 폴리펩티드 변이체 및 부모 폴리펩티드의 양이 본질적으로 동일할 때 임의의 하나 이상의 상기 식별된 FcR 에 부모 항체보다 실질적으로 감소된 결합 친화도로 결합하는 것이다. 예를 들어, 감소된 FcR 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드 변이체는 부모 폴리펩티드와 비교시 FcR 결합 친화도에서 약 1.15 배 ~ 약 100 배, 예를 들어 약 1.2 배 ~ 약 50 배 감소를 나타낼 수 있으며, 여기서 FcR 결합 친화도는, 예를 들어, 본원의 실시예에 개시된 바와 같이 측정된다.
부모 또는 야생형 폴리펩티드보다 "덜 효과적으로 인간 효과기 세포의 존재시 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC) 을 매개하는" Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 검정에서 사용되는 폴리펩티드 변이체 및 부모 항체의 양이 본질적으로 동일할 때 시험관내 또는 생체내에서 ADCC 를 매개함에 있어서 실질적으로 덜 효과적인 것이다. 일반적으로, 그러한 변이체는 본원에 개시된 시험관내 ADCC 검정을 사용하여 동정될 것이나, 예를 들어 동물 모델 등에서 ADCC 활성을 측정하기 위한 기타 검정 또는 방법이 고려된다. 바람직한 변이체는, 예를 들어 본원에 개시된 시험관내 검정에서, 부모보다 ADCC 를 매개함에 있어서 약 1.5 배 ~ 약 100 배, 예를 들어 약 2 배 ~ 약 50 배 덜 효과적이다.
"수용체" 는 하나 이상의 리간드에 결합할 수 있는 폴리펩티드이다. 바람직한 수용체는 세포외 리간드-결합 도메인 및, 임의로, 기타 도메인 (예를 들어 막관통 도메인, 세포내 도메인 및/또는 막 앵커 (anchor)) 을 갖는 세포-표면 수용체이다. 본원에 기재된 검정에서 평가되는 수용체는 온전한 수용체 또는 그의 조각 또는 유도체 (예를 들어 하나 이상의 이종 폴리펩티드에 융합된 수용체의 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질) 일 수 있다. 더욱이, 그것의 결합 특성에 대해 평가되는 수용체는 세포 중에 존재하거나, 또는 단리되어 검정 플레이트 또는 일정한 다른 고체상 위에 코팅될 수 있다.
용어 "수용체 결합 도메인" 은 수용체에 대한 임의의 천연 리간드를 지명하는데 사용되며, 세포 부착 분자, 또는 적어도 상응하는 천연 리간드의 정성적 수용체 결합 능력을 보유하는 그러한 천연 리간드의 임의의 영역 또는 유도체를 포함한다. 이러한 정의는, 특히, 구체적으로 위에서 언급된 수용체에 대한 리간드로부터의 결합 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는" 과 같은 그의 문법적 변형) 는 치료되는 개인의 자연적 경과를 변경시키기 위한 시도에서의 임상적 개입을 언급하고, 예방을 위해 또는 임상 병리의 과정 동안 실시될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리 결과의 감소, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키기 위해 또는 질환의 진행을 둔화시키기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 "변이체 단백질" 또는 "단백질 변이체", 또는 "변이체" 는 하나 이상의 아미노산 수식에 의해 부모 단백질과 상이한 단백질을 의미한다. 단백질 변이체는 단백질 자체, 단백질을 포함하는 조성물, 또는 그것을 인코딩하는 아미노 서열을 언급할 수 있다. 바람직하게는, 단백질 변이체는 부모 단백질과 비교시 하나 이상의 아미노산 수식, 예를 들어 약 1 개 ~ 약 70 개의 아미노산 수식, 바람직하게는 부모와 비교시 약 1 개 ~ 약 5 개의 아미노산 수식을 갖는다. 본원에서 단백질 변이체 서열은 바람직하게는 부모 단백질 서열과 약 80% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 보유할 것이다. 변이체 단백질은 변이체 단백질 자체, 단백질 변이체를 포함하는 조성물, 또는 그것을 인코딩하는 DNA 서열을 언급할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 "항체 변이체" 또는 "변이체 항체" 는 하나 이상의 아미노산 수식에 의해 부모 항체와 상이한 항체를 의미하고, 본원에서 사용되는 "IgG 변이체" 또는 "변이체 IgG" 는 하나 이상의 아미노산 수식에 의해 부모 IgG 와 상이한 항체를 의미하고, 본원에서 사용되는 "면역글로불린 변이체" 또는 "변이체 면역글로불린" 은 하나 이상의 아미노산 수식에 의해 부모 면역글로불린 서열과 상이한 면역글로불린 서열을 의미한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 언급한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 골격 영역 (FR) 및 3개의 과가변 영역 (HVR) 을 포함한다 (예를 들어, Kindt, et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co. (2007) 페이지 91 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원과 결합하는 항체는, 상보성 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원과 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, Portolano, et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, et al., Nature 352 (1991) 624-628 참조.
본원에서 사용되는 용어 "벡터" 는 그것이 연결되어 있는 또다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 언급한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라, 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 작동가능하게 연결되어 있는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터" 로 언급된다.
본 출원은 Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 조정하는 아미노산 수식을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
상세한 설명
본원의 발명은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체를 생성하기 위해 당 기술분야에서 이용가능한 기술을 사용하여 "부모", "출발", "비변이체" 또는 야생형 폴리펩티드가 제조된다. 발명의 바람직한 구현예에서, 부모 폴리펩티드는 항체이고, 예시적 항체 생성 방법이 하기 섹션에 더욱 상세히 기재되어 있다. 부모 폴리펩티드는, 그러나, Fc 영역을 포함하는 임의의 기타 폴리펩티드, 예를 들어 면역부착소일 수 있다. 면역부착소의 제조 방법이 본원에서 하기에 더욱 상세히 설명되어 있다.
대안적 구현예에서, 변이체 Fc 영역 (Fc 변이체) 은 본원에 개시된 방법에 따라 생성될 수 있고, 이러한 Fc 변이체는 선택된 이종 폴리펩티드, 예컨대 항체 가변 도메인 또는 수용체 또는 리간드의 결합 도메인에 융합될 수 있다.
야생형 폴리펩티드는 Fc 영역을 포함한다. 일반적으로 야생형 폴리펩티드의 Fc 영역은 천연 또는 야생형 서열 Fc 영역, 바람직하게는 인간 천연 서열 Fc 영역 (인간 Fc 영역) 을 포함할 것이다. 그러나, 야생형 폴리펩티드의 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역으로부터의 하나 이상의 기존 아미노산 서열 변경 또는 수식을 가질 수 있다. 예를 들어, Fc 영역의 C1q 또는 Fcγ 결합 활성은 이전에 변경되었을 수 있다 (다른 유형의 Fc 영역 수식이 아래 더욱 상세히 기재되어 있다). 추가의 구현예에서 부모 폴리펩티드 Fc 영역은 "개념적 (conceptual)" 이고, 그것이 물리적으로 존재하지 않지만, 항체 공학자 (engineer) 는 원하는 변이체 Fc 영역 아미노산 서열을 결정하여 그 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 원하는 변이체 Fc 영역 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 를 생성할 수 있다.
발명의 바람직한 구현예에서, 그러나, 야생형 폴리펩티드의 Fc 영역을 인코딩하는 핵산이 입수가능하고, 이러한 핵산 서열이 변경되어 Fc 영역 변이체를 인코딩하는 변이체 핵산 서열을 생성한다.
출발 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 인코딩하는 DNA 는 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법은 폴리펩티드를 인코딩하는 더욱 조기에 제조된 DNA 의 자리지정 (또는 올리고뉴클레오티드-매개성) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
자리지정 돌연변이유발은 치환 변이체의 바람직한 제조 방법이다. 이러한 기술은 당 기술분야에 잘 알려져 있다 (참조, 예를 들어, Carter, et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985) 4431-4443 and Kunkel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 488). 간략히, DNA 의 자리지정 돌연변이유발을 실시함에 있어서, 출발 DNA 가 먼저 원하는 돌연변이를 인코딩하는 올리고뉴클레오티드를 그러한 출발 DNA 의 단일 가닥에 혼성화시킴으로써 변경된다. 혼성화 후, DNA 폴리머라제가 사용되어 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하고, 출발 DNA 의 단일 가닥을 주형으로서 사용하여 전체 두번째 가닥을 합성한다. 따라서, 원하는 돌연변이를 인코딩하는 올리고뉴클레오티드가 결과로서 얻어지는 이중 가닥 DNA 에 통합된다.
PCR 돌연변이유발이 출발 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체의 제조에 또한 적합하다. Higuchi, in PCR Protocols, Academic Press (1990) pp. 177-183; 및 Vallette, et al., Nuc. Acids Res. 17 (1989) 723-733 참조. 간략히, PCR 에서 소량의 주형 DNA 가 출발 물질로서 사용될 때, 주형 DNA 내의 상응하는 영역과 서열이 약간 상이한 프라이머가 사용되어 오직 프라이머가 주형과 상이한 위치에서만 주형 서열과 상이한 특이적 DNA 조각을 비교적 대량으로 생성할 수 있다.
변이체의 또다른 제조 방법인, 카세트 돌연변이유발은 Wells, et al., Gene 34 (1985) 315-323 에 기재된 기술에 기초한다.
발명의 하나의 구현예는 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 감소된 또는 소멸된 친화도를 초래하는, Fc 영역에 대한 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 치환, 또는 결실을 포함하는 항체의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포괄한다. Fc 영역은 Fc 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA), 보체 단백질 C1q, 및 기타 분자 예컨대 단백질 A 및 G 를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 수용체 또는 리간드와 상호작용한다. 이러한 상호작용은 항체 의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포성 식세포작용 (ADCP) 및 보체 의존성 세포독성 (CDC) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 효과기 기능 및 하류 신호전달 사건에 본질적이다. 따라서, 특정 구현예에서 발명의 변이체는 발명의 Fc 변이체를 포함하나 Fc 영역에 대한 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가, 치환, 또는 결실을 포함하지 않는 폴리펩티드 (또한 본원에서 "야생형 폴리펩티드" 로 언급됨) 와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 비교시 효과기 기능을 책임지는 Fc 수용체에 대한 감소된 또는 소멸된 친화도를 갖는다. 특정 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 하나 이상의 하기 특성을 포함한다: 감소된 또는 소멸된 효과기 (ADCC 및/또는 CDC 및/또는 ADCP) 기능, Fc 수용체에 대한 감소된 또는 소멸된 결합, C1q 에 대한 감소된 또는 소멸된 결합 또는 감소된 또는 소멸된 독성. 더욱 구체적으로, 발명의 구현예는 Fc 수용체 (예를 들어 FcγRI, FcγRII, FcγRIIIA) 및/또는 보체 단백질 C1q 에 대한 감소된 친화도를 갖는 항-CD20 (GA101 또는 GA 와 동일), 항-CD9 (TA 와 동일) 및 항-셀렉틴 (pSel) 항체를 제공한다.
하나의 구현예에서, 발명의 항체는 위치 P329 에서 아미노산 잔기의 하나 이상의 부가, 치환, 또는 결실을 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 불변 영역의 번호지정 시스템은 Kabat, et al., NIH Publication 91 (1991) 3242, National Technical Information Service, Springfield, VA 에 제시된 EU 인덱스에 따른다.
구체적 구현예에서, 발명의 폴리펩티드는 야생형 인간 Fc 폴리펩티드의 Fc 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 위치 Pro329 에서 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 IgG Fc 영역 내의 잔기의 번호지정은 Kabat 에서와 같은 EU 인덱스에 따른다. 또다른 구현예에서, 상기 변이체는 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 포함한다.
또다른 구현예에서 야생형 인간 Fc 폴리펩티드의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 Fc 감마 수용체와의 Fc 폴리펩티드의 영역 및/또는 경계면 내의 프롤린 샌드위치의 기능을 파괴 또는 감소시키는 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는다.
또다른 구현예에서 Pro329 는 프롤린보다 작은 또는 큰 아미노산으로 치환된다. 또다른 구현예에서 치환된 아미노산은 Gly, Ala 또는 Arg 이다. 본 발명의 추가의 양상에서 Fc 폴리펩티드의 Pro329 는 글리신으로 치환된다.
또다른 구현예에서 Fc 변이체를 포함하는 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 추가의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 갖는다. 또다른 구현예에서, 상기 변이체는 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 비교시 인간 Fc 수용체 (FcγR) 및/또는 인간 보체 수용체에 대한 감소된 친화도를 나타낸다.
또다른 구현예에서 Fc 변이체를 포함하는 상기 폴리펩티드는 야생형 인간 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교시 인간 Fc 수용체 (FcγR) 및/또는 인간 보체 수용체에 대한 감소된 친화도를 나타낸다. 추가의 구현예에서 하나 이상의 FcγRI, FcγRII, FcγRIIIA 에 대한 친화도가 감소되고, 추가의 구현예에서 FcγRI 및 FcγRIIIA 에 대한 친화도가 감소되고, 추가의 구현예에서 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIA 에 대한 친화도가 감소되고, 본 발명의 추가의 양상에서 FcγRI 수용체, FcγRIIIA 수용체 및 C1q 에 대한 친화도가 감소되고, 본 발명의 추가의 양상에서 FcγRI, FcγRII, FcγRIIIA 및 C1q 수용체에 대한 친화도가 감소된다.
추가의 구현예에서 Fc 변이체를 포함하는 상기 폴리펩티드에 의해 유도되는 ADCC 는 감소되고, 바람직한 구현예에서 ADCC 는 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 ADCC 의 20% 이상까지 감소된다. 본 발명의 추가의 양상에서, 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 ADCC 및 CDC 는 감소 또는 제거되고, 추가의 양상에서 상기 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 비교시 감소된 ADCC, CDC 및 ADCP 를 나타낸다.
하나의 구현예에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드에서 하나 이상의 추가의 아미노산 치환은 하기 군으로부터 선택된다: S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, 또는 P331S.
발명의 특정 양상에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 항체를 포함한다. 발명의 또다른 양상에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 인간 IgG1 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 본 발명의 추가의 양상에서 변이체는 IgG1 또는 IgG4 항체이다.
발명의 또다른 구현예에서, Pro329 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 항체의 증가된 안정성과 상관관계가 있는 Fc 영역 내의 아미노산 잔기의 하나 이상의 부가, 치환, 또는 결실을 추가로 포함한다. 본 발명의 추가의 양상에서 Fcn 수용체에 대한 상기 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 친화도는 오직 약간이며, 예를 들어 변경된 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 친화도의 10-20% 이하이다.
하나의 구현예에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드에서 아미노산 잔기의 부가, 치환, 또는 결실은 Fc 영역의 위치 228 및/또는 235 에서이며, 여기서 불변 영역의 번호지정 시스템은 Kabat 등에 제시된 EU 인덱스에 따른다.
구체적 구현예에서 Fc 변이체를 포함하는 상기 폴리펩티드에서 위치 228 에서의 세린 및/또는 위치 235 에서의 류신은 또다른 아미노산으로 치환된다.
구체적 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 위치 228 에서 아미노산 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 세린 잔기는 프롤린으로 치환된다.
구체적 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 위치 235 에서의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 류신 잔기는 글루탐산으로 치환된다.
구체적 구현예에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 3중 돌연변이를 포함한다: 위치 P329 에서의 아미노산 치환, S228P 및 L235E 돌연변이 (P329 / SPLE).
추가의 구체적 구현예에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 인간 IgG4 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 아미노산 잔기의 부가, 치환, 또는 결실은 Fc 영역의 위치 234 및/또는 235 에서이며, 여기서 불변 영역의 번호지정 시스템은 Kabat 등에 제시된 EU 인덱스에 따른다.
구체적 구현예에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드에서 위치 234 에서의 류신 및/또는 위치 235 에서의 류신은 또다른 아미노산으로 치환된다.
구체적 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 위치 234 에서의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 류신 잔기는 알라닌으로 치환된다.
구체적 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 위치 235 에서의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 류신 잔기는 세린으로 치환된다.
구체적 구현예에서 야생형 인간 Fc 폴리펩티드의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 3중 돌연변이를 포함한다: 위치 Pro329 에서의 아미노산 치환, L234A 및 L235A 돌연변이 (P329 / LALA).
추가의 구체적 구현예에서 위에서 언급된 폴리펩티드는 인간 IgG1 영역을 포함한다.
FcγR 에 대한 결합을 변경하는 것이 바람직하지만, 신생아 수용체 (FcRn) 에 대한 변경된 결합 친화도를 갖는 Fc 영역 변이체가 본원에서 또한 고려된다. FcRn 에 대한 개선된 친화도를 갖는 Fc 영역 변이체는 더 긴 혈청 반감기를 가질 것으로 예상되고, 그러한 분자는 투여된 폴리펩티드의 긴 반감기가 바람직한 포유류의 치료 방법에서, 예를 들어, 만성 질환 또는 장애의 치료에서 유용한 적용을 가질 것이다. 감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 Fc 영역 변이체는, 그와 반대로, 더 짧은 반감기를 가질 것으로 예상되고, 그러한 분자는, 예를 들어, 더 짧아진 순환 시간이 유리할 수 있는 경우에, 예를 들어 생체내 진단적 영상화의 경우에 또는 연장된 기간 동안 혈류 중에 순환하도록 남겨졌을 때 독성 부작용을 갖는 폴리펩티드 등의 경우에 포유류에게 투여될 수 있다. 감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 Fc 영역 변이체는 태반을 통과할 가능성이 낮을 것으로 예상되고, 따라서 임신한 여성의 질환 또는 장애의 치료에 이용될 수 있다.
FcRn 에 대한 변경된 결합 친화도를 갖는 Fc 영역 변이체는 임의의 하나 이상의 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 또는 447 에서 Fc 영역 아미노산 수식을 포함하는 것을 포함한다. FcRn 에 대한 감소된 결합을 나타내는 것은 일반적으로 임의의 하나 이상의 아미노산 위치 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 또는 447 에서 Fc 영역 아미노산 수식을 포함할 것이고; FcRn 에 대한 증가된 결합을 나타내는 것은 통상적으로 임의의 하나 이상의 아미노산 위치 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 에서 Fc 영역 아미노산 수식을 포함할 것이다.
또다른 구현예에서, 발명의 항체는 임의의 클래스 (예를 들어, IgG, IgM, 및 IgE 그러나 이에 제한되지는 않음) 에 속할 수 있다. 특정 구현예에서, 발명의 항체는 항체의 IgG 클래스의 일원이다. 구체적 구현예에서, 발명의 항체는 IgGl, IgG2 또는 IgG4 서브클래스에 속한다. 또다른 특정 구현예에서, 발명의 항체는 IgGl 서브클래스에 속하고, 하기 아미노산 치환을 포함한다: Fc 영역의 P329G 및/또는 L234A 및 L235A. 대안적 구현예에서, 발명의 항체는 IgG4 서브클래스에 속한다. 구체적 구현예에서, 발명의 항체는 IgG4 서브클래스에 속하고, 하기 아미노산 치환을 포함한다: Fc 영역의 P329G 및/또는 S228P 및 L235E. 특정 구현예에서, 본 발명의 수식된 항체는 가변 도메인, 또는 그의 조각과, 본원에 개시된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 조합함으로써 제조될 수 있다. 다른 구현예에서 수식된 발명의 항체는 하나 이상의 아미노산 치환 잔기를 Fc 도메인 내로 도입하여 Fc 도메인-함유 항체를 수식함으로써 제조될 수 있다.
Fc 리간드에 대한 감소된 결합
당업자는 발명의 항체가 변경된 (미수식 항체에 비해) FcγR 및/또는 C1q 결합 특성 (결합 특성의 예는 결합 특이성, 평형 해리 상수 (KD), 해리 및 연합 속도 (각각 koff 및 kon) 결합 친화도 및/또는 결합활성을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다) 을 가질 수 있고, 특정 변경이 다소 바람직하다는 것을 이해할 것이다. 평형 해리 상수 (KD) 가 koff/kon 로서 정의된다는 것이 당해 분야에 알려져 있다. 당업자는 소정의 항체 적용물에 어떠한 동력학적 파라미터가 가장 중요한지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 양성 조절인자 (예를 들어, FcγRIIIA) 에 대한 결합을 감소시키고/거나 저해성 Fc 수용체 (예를 들어, FcγRIIB) 에 대한 결합을 증강시키는 수식이 ADCC 활성을 감소시키는데 적합할 것이다. 따라서, 결합 친화도의 비 (예를 들어, 평형 해리 상수 (KD)) 는 발명의 항체의 ADCC 활성이 증강되는지 또는 감소되는지 여부를 지시할 수 있다. 부가적으로, C1q 에 대한 결합을 감소시키는 수식이 CDC 활성을 감소시키거나 제거하는데 적합할 것이다. Fc 영역의 그것의 리간드에 대한 친화도 및 결합 특성은, 평형 방법 (예를 들어, 효소-결합 면역 흡착제 검정 (ELISA) 또는 방사면역검정 (RIA)), 또는 동역학 (예를 들어, BIACORE® 분석), 및 기타 방법 예컨대 간접 결합 검정, 경쟁적 저해 검정, 형광 공명 에너지 전이 (FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피 (예를 들어, 겔여과) 를 포함하나 이에 제한되지 않는, Fc-FcγR 상호작용, 즉, FcγR 에 대한 Fc 영역의 특이적 결합을 측정하기 위한 당해 분야에 공지된 다양한 시험관내 검정 방법 (생화학적 또는 면역학적 기반 검정) 에 의해 측정될 수 있다. 이러한 및 기타 방법은 검사되는 하나 이상의 성분 상의 표지를 이용하고/거나, 발색, 형광, 발광, 또는 동위원소 표지를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 탐지 방법을 이용할 수 있다. 결합 친화도 및 동역학의 상세한 설명은 Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999) 에서 찾을 수 있다.
발명의 하나의 양상에서 야생형 인간 Fc 영역의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 변이체가 위치 Pro329 에서의 아미노산 치환 및 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드는 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 비교시 인간 Fc 수용체 (FcγR) 및/또는 인간 보체 수용체에 대한 감소된 친화도를 나타낸다. 하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 Fc 폴리펩티드보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상, 또는 7 배 이상, 또는 10 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 30 배 이상, 또는 40 배 이상, 또는 50 배 이상, 또는 60 배 이상, 또는 70 배 이상, 또는 80 배 이상, 또는 90 배 이상, 또는 100 배 이상, 또는 200 배 이상 작은 Fc 수용체에 대한 친화도를 나타낸다.
하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 미수식 항체와 비교시 아이소형 FcγRIA 를 포함하는 FcγRI (CD64), FcγRII 및 FcγRIII (CD 16, 아이소형 FcγRIIIA 를 포함함) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도를 나타낸다.
하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 미수식 항체와 비교시 FcγRI (CD64), FcγRIIA 및 FcγRIIIA 에 대한 감소된 결합 친화도를 나타낸다.
하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 미수식 항체와 비교시 FcγRIIA 및 FcγRIIIA 에 대한 감소된 결합 친화도를 나타낸다.
하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 미수식 항체와 비교시 FcγRI (CD64) 및 FcγRIIIA 에 대한 감소된 결합 친화도를 나타낸다.
발명의 하나의 양상에서 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도를 나타내는 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 또한 C1q 수용체에 대한 감소된 친화도를 나타낸다.
특정 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교시 FcγRIIB 수용체에 대한 결합에서의 수반 (concomitant) 증가를 포함하지 않는다. 발명의 특정 양상에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 비교시 인간 수용체 FcγIIIA 에 대한, 및 인간 수용체 FcγIIA, FcγIIIB, 및 C1q 를 포함하는 군의 하나 이상의 추가의 수용체에 대한 감소된 친화도를 갖는다. 발명의 추가의 양상에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 비교시 인간 수용체 FcγIIIA 에 대한, 및 인간 수용체 FcγIIA, FcγIIIB, 및 C1q 를 포함하는 군의 2 개의 추가의 수용체에 대한 감소된 친화도를 갖는다. 발명의 추가의 양상에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 비교시 인간 FcγRIA, FcγIIIA, FcγIIA, FcγIIIB, 및 C1q 에 대한 감소된 친화도를 갖는다. 발명의 또다른 양상에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 비교시 인간 수용체 FcγRIA, FcγIIIA, FcγIIA, FcγIIIB, 및 C1q 에 대한 감소된 친화도를 갖는다.
발명의 하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 미수식 항체에 비해 FcγRI 또는 FcγRIIA 에 대한 감소된 친화도를 나타낸다. 발명의 하나의 양상에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상, 또는 7 배 이상, 또는 10 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 30 배 이상, 또는 40 배 이상, 또는 50 배 이상, 또는 60 배 이상, 또는 70 배 이상, 또는 80 배 이상, 또는 90 배 이상, 또는 100 배 이상, 또는 200 배 이상 작은 FcγRI 또는 FcγRIIA 에 대한 친화도를 나타낸다. 발명의 하나의 양상에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 40% 이상, 30% 이상, 20% 이상, 10% 이상, 또는 5% 이상 작은 FcγRI 또는 FcγRIIA 에 대한 친화도를 나타낸다.
발명의 하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 미수식 항체에 비해 FcγRIIIA 에 대한 감소된 친화도를 나타낸다. 하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상, 또는 7 배 이상, 또는 10 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 30 배 이상, 또는 40 배 이상, 또는 50 배 이상, 또는 60 배 이상, 또는 70 배 이상, 또는 80 배 이상, 또는 90 배 이상, 또는 100 배 이상, 또는 200 배 이상 작은 FcγRIIIA 에 대한 친화도를 나타낸다.
발명의 하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 40% 이상, 30% 이상, 20% 이상, 10% 이상, 또는 5% 이상 작은 FcγRIIIA 에 대한 친화도를 나타낸다.
FcγRIIIA 의 F1-58V 대립형질 변이체가 항체에 대한 변경된 결합 특성을 갖는다고 당해 분야에서 이해된다. 하나의 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드에 비해 감소된 친화도로 FcγRIIIA 수용체에 결합한다. 하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상, 또는 7 배 이상, 또는 10 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 30 배 이상, 또는 40 배 이상, 또는 50 배 이상, 또는 60 배 이상, 또는 70 배 이상, 또는 80 배 이상, 또는 90 배 이상, 또는 100 배 이상, 또는 200 배 이상 작은 FcγRIIIA (Fl 58V) 에 대한 친화도를 나타낸다.
발명의 하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 미수식 항체에 비해 C1q 수용체에 대한 감소된 친화도를 나타낸다. 하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상, 또는 7 배 이상, 또는 10 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 30 배 이상, 또는 40 배 이상, 또는 50 배 이상, 또는 60 배 이상, 또는 70 배 이상, 또는 80 배 이상, 또는 90 배 이상, 또는 100 배 이상, 또는 200 배 이상 작은 C1q 수용체에 대한 친화도를 나타낸다.
발명의 하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 40% 이상, 30% 이상, 20% 이상, 10% 이상, 또는 5% 이상 작은 C1q 에 대한 친화도를 나타낸다.
발명의 하나의 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 40% 이상, 30% 이상, 20% 이상, 10% 이상, 또는 5% 이상 작은 인간 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRIIIA (Fl 58V) 또는 C1q 수용체에 대한 친화도를 나타낸다.
발명의 또다른 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는, 각각, 약 10 nM ~ 100 nM, 10 nM ~ 1 μM, 100 nM ~ 약 100 μM, 또는 약 100 nM ~ 약 10 μM, 또는 약 100 nM ~ 약 1 μM, 또는 약 1 nM ~ 약 100 μM, 또는 약 10 nM ~ 약 100 μM, 또는 약 1 μM ~ 약 100 μM, 또는 약 10 μM ~ 약 100 μM 인 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRIIIA (Fl 58V) 및/또는 C1q 수용체에 대한 친화도를 나타낸다. 특정 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 100 nM 초과, 500 nM, 1 μM, 5 μM 초과, 10 μM 초과, 25 μM 초과, 50 μM 초과, 또는 100 μM 초과인 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRIIIA (Fl-58V) 또는 C1q 수용체에 대한 친화도를 나타낸다.
발명의 또다른 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교시 FcγRIIB 에 대한 증가된 친화도를 나타낸다. 또다른 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 변화되지 않거나 미수식 항체보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상, 또는 7 배 이상, 또는 10 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 30 배 이상, 또는 40 배 이상, 또는 50 배 이상, 또는 60 배 이상, 또는 70 배 이상, 또는 80 배 이상, 또는 90 배 이상, 또는 100 배 이상, 또는 200 배 이상 증가된 FcγRIIB 에 대한 친화도를 나타낸다. 또다른 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 증가된 FcγRIIB 수용체에 대한 친화도를 나타낸다.
발명의 또다른 양상에서 발명의 변이체는 100 μM 미만, 50 μM 미만, 10 μM 미만, 5 μM 미만, 2.5 μM 미만, 1 μM 미만, 또는 100 nM 미만, 또는 10 nM 미만인 FcγRI, FcγRIIA FcγRIIIA, 또는 FcγRIIIA (Fl 58V) 또는 C1q 수용체에 대한 친화도를 나타낸다.
감소된 효과기 기능
발명의 특정 양상에서 발명에 따른 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 비교시 효과기 기능을 조정한다.
발명의 또다른 양상에서 이러한 조정은 ADCC 및/또는 ADCP 및/또는 CDC 의 조정이다. 본 발명의 추가의 양상에서 이러한 조정은 효과가 있는 하향-조정 또는 감소이다. 발명의 또다른 양상에서 이것은 ADCC 의 조정이고, 발명의 또다른 양상에서 이러한 조정은 ADCC 의 하향-조정이다. 또다른 양상에서 이러한 조정은 ADCC 및 CDC 의 하향-조정이고, 또다른 구현예에서 이것은 오직 ADCC 의 하향-조정이고, 또다른 구현예에서 이것은 ADCC 및 CDC 및/또는 ADCP 의 하향-조정이다. 발명의 또다른 양상에서 발명에 따른 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 ADCC / CDC 및 ADCP 를 하향-조정하거나 또는 감소시킨다.
본 발명의 추가의 양상에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 ADCC 또는 CDC 또는 ADCP 의 감소 또는 하향-조정은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의한 각각 ADCC, 또는 CDC 또는 ADCP 의 유도에 대해 관찰된 값의 0, 2.5, 5, 10, 20, 50 또는 75% 까지의 감소이다.
발명의 추가의 양상에서 발명에 따른 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 ADCC 의 조정은 상기 Fc 변이체의 EC50 이 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 비교시 대략 > 10-배 감소되도록 하는 효능 (potency) 의 감소이다.
또다른 양상에서 발명에 따른 변이체는 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 비교시 인간 효과기 세포의 존재시 임의의 실질적 ADCC 및/또는 CDC 및/또는 ADCP 가 없다.
발명의 또다른 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 감소된, 예를 들어 20% 이상 감소된, 또는 크게 감소된, 예를 들어 50% 이상 감소된, 효과기 기능을 나타내며, 이는 ADCC (하향-조정), CDC 및/또는 ADCP 의 감소일 수 있다.
감소된 ADCC 활성
시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행되어 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행되어 항체가 FcγR 결합을 결여하지만 (따라서 아마도 ADCC 활성을 결여함), FcRn 결합 능력을 보유함을 확인할 수 있다. ADCC 를 매개하는 일차 세포인, NK 세포는 오직 FcγRIII 을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, RII 및 RIII 을 발현하다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현이 Ravetch, and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492 의 페이지 464 에서 표 3 에 요약되어 있다. 관심의 분자의 ADCC 활성을 평가하는 시험관내 검정의 비-제한적 예가 미국 특허 번호 5,500,362 (참조, 예를 들어 Hellstrom, I., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063) 및 Hellstrom, I., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502; US 5,821,337 (참조, Bruggemann, M., et al., J. Exp. MEd. 166 (1987) 1351-1361) 에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (참조, 예를 들어, 유동세포분석용 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI)). 그러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심의 분자의 ADCC 활성이 생체내에서, 예를 들어, Clynes, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656 에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. C1q 결합 검정이 또한 실시되어 항체가 C1q 에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성을 결여함을 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402 의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 실시될 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro, et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; 및 Cragg, M.S., and Glennie, M.J., Blood 103 (2004) 2738-2743 참조). FcRn 결합 및 생체내 청소/반감기 측정이 또한 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, Petkova, S.B., et al., Int'l. Immunol. 18(12) (2006) 1759-1769 참조).
발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 하나 이상의 FcγR 매개성 효과기 세포 기능을 확인하기 위한 시험관내 기능 검정에 의해 특징지어진다고 고찰된다. 특정 구현예에서, 발명의 항체는 생체내 모델 (예컨대 본원에서 기재 및 개시된 것) 에서 시험관내 기반 검정에서와 유사한 결합 특성 및 효과기 세포 기능을 갖는다. 그러나, 본 발명은 시험관내 기반 검정에서는 원하는 표현형을 나타내지 않으나 생체내에서는 원하는 표현형을 나타내는 발명의 변이체를 배제하지 않는다. 하나의 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 미수식 야생형 Fc 폴리펩티드와 비교시 감소된 ADCC 활성을 나타낸다. 또다른 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 미수식 항체보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상 또는 10 배 이상 또는 50 배 이상 또는 100 배 이상 작은 ADCC 활성을 나타낸다. 또다른 구현예에서, 발명의 항체는 미수식 항체에 비해 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상 감소된 ADCC 활성을 나타낸다. 본 발명의 추가의 양상에서 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 ADCC 의 감소 또는 하향-조정은 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의한 각각 ADCC, 또는 CDC 또는 ADCP 의 유도에 대해 관찰된 값의 0, 2.5, 5, 10, 20, 50 또는 75% 까지의 감소이다. 특정 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 탐지가능한 ADCC 활성을 갖지 않는다. 특정 구현예에서, ADCC 활성의 감소 및/또는 제거는 Fc 리간드 및/또는 수용체에 대한 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 감소된 친화도에 기인할 수 있다. 발명의 구체적 구현예에서 ADCC 의 하향-조정은 Fc 변이체를 포함하는 상기 폴리펩티드의 EC50 가 야생형 Fc 폴리펩티드와 비교시 대략 10-배 이상 감소되도록 하는 효능의 감소이다.
또다른 양상에서 발명에 따른 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 ADCC 및/또는 CDC 및/또는 ADCP 를 조정한다. 특정 양상에서 발명에 따른 변이체는 감소된 CDC 및 ADCC 및/또는 ADCP 활성을 보인다.
감소된 CDC 활성
보체 활성화 경로는 분자, 예를 들어, 코그네이트 항원과 복합체화된, 항체에 대한 보체계의 제 1 성분 (C1q) 의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 Gazzano-Santoro, et al, J. Immunol. Methods 202 (1996) 163 에 기재된, CDC 검정이 수행될 수 있다.
C1q 에 대한 상이한 변이체의 결합 특성이 ELISA 샌드위치 유형 면역검정 에 의해 분석될 수 있다. 반 최대 반응에서의 항체 농도는 EC50 값을 결정한다. 이러한 판독은 샘플 및 참조의 변동 계수와 함께 동일한 플레이트 상에서 측정된 참조 표준에 대한 상대 오차로서 보고된다.
하나의 구현예에서, 발명에 따른 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드에 비해 C1q 에 대한 감소된 친화도를 나타낸다. 또다른 구현예에서, 발명에 따른 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상, 또는 7 배 이상, 또는 10 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 30 배 이상, 또는 40 배 이상, 또는 50 배 이상, 또는 60 배 이상, 또는 70 배 이상, 또는 80 배 이상, 또는 90 배 이상, 또는 100 배 이상, 또는 200 배 이상 작은 C1q 수용체에 대한 친화도를 나타낸다.
또다른 구현예에서, 발명에 따른 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 40% 이상, 30% 이상, 20% 이상, 10% 이상, 또는 5% 이상 작은 C1q 에 대한 친화도를 나타낸다. 또다른 구현예에서, 발명에 따른 변이체는 약 100 nM ~ 약 100 μM, 또는 약 100 nM ~ 약 10 μM, 또는 약 100 nM ~ 약 1 μM, 또는 약 1 nM ~ 약 100 μM, 또는 약 10 nM ~ 약 100 μM, 또는 약 1 μM ~ 약 100 μM, 또는 약 10 μM ~ 약 100 μM 인 C1q 에 대한 친화도를 나타낸다. 특정 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 1 μM 초과, 5 μM 초과, 10 μM 초과, 25 μM 초과, 50 μM 초과, 또는 100 μM 초과인 C1q 에 대한 친화도를 나타낸다.
하나의 구현예에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 Fc 폴리펩티드와 비교시 감소된 CDC 활성을 나타낸다. 또다른 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상 또는 10 배 이상 또는 50 배 이상 또는 100 배 이상 작은 CDC 활성을 나타낸다. 또다른 구현예에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드에 비해 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상, 또는 200% 이상, 또는 300% 이상, 또는 400% 이상, 또는 500% 이상 감소된 CDC 활성을 나타낸다. 특정 양상에서 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 탐지가능한 CDC 활성을 나타내지 않는다. 특정 구현예에서, CDC 활성의 감소 및/또는 제거는 Fc 리간드 및/또는 수용체에 대한 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 감소된 친화도에 기인할 수 있다.
감소된 항체 관련 독성
생물학적 요법은 면역계가 원치 않는 세포 및/또는 표적을 인지하고 공격하는 것을 지도하는 복합체 성질과 연관되는 유해한 독성 문제를 가질 수 있다고 당해 분야에서 이해된다. 치료가 요구되는 경우 공격을 위한 인식 및/또는 표적화가 일어나지 않을 때, 유해한 독성과 같은 결과가 발생할 수 있다. 예를 들어, 비-표적 (non-targeted) 조직의 항체 염색은 잠재적 독성 문제의 지표일 수 있다.
하나의 양상에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교시 비-표적 조직의 감소된 염색을 나타낸다. 또다른 양상에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 Fc 폴리펩티드보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상, 또는 7 배 이상, 또는 10 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 30 배 이상, 또는 40 배 이상, 또는 50 배 이상, 또는 60 배 이상, 또는 70 배 이상, 또는 80 배 이상, 또는 90 배 이상, 또는 100 배 이상, 또는 200 배 이상 작은 비-표적 조직의 감소된 염색을 나타낸다. 또다른 구현예에서, 발명의 변이체는 야생형 Fc 폴리펩티드에 비해 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상, 또는 200% 이상, 또는 300% 이상, 또는 400% 이상, 또는 500% 이상 감소된 비-표적 조직의 감소된 염색을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교시 감소된 항체 관련 독성을 나타낸다. 또다른 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상, 또는 7 배 이상, 또는 10 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 30 배 이상, 또는 40 배 이상, 또는 50 배 이상, 또는 60 배 이상, 또는 70 배 이상, 또는 80 배 이상, 또는 90 배 이상, 또는 100 배 이상, 또는 200 배 이상 작은 독성을 나타낸다. 또다른 양상에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드에 비해 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상, 또는 200% 이상, 또는 300% 이상, 또는 400% 이상, 또는 500% 이상 감소된 독성을 나타낸다.
혈소판 응집
발명의 하나의 양상에서 야생형 폴리펩티드는 혈소판 활성화 및/또는 혈소판 응집을 유도하고, 그의 변이체, 즉 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 감소된 또는 심지어는 소멸된 혈소판 활성화 및/또는 응집을 보인다. 발명의 또다른 양상에서 이러한 야생형 폴리펩티드는 혈소판 단백질을 표적화하는 항체이다. 또다른 양상에서 항체는 CD9 항체이다. 또다른 구현예에서 이러한 CD9 항체는 위치 P329G 에서 및/또는 위치 L234A / L235A 또는 S228P / L235E 에서 (P329G/LALA, P329G/SPLE) 돌연변이를 갖는다. 추가의 구체적 구현예에서 항체는 SEQ ID NOs: 8-14 로 특징지어진다.
생물학적 요법은 유해 효과 혈소판 응집을 가질 수 있다고 당해 분야에서 이해된다. 시험관내 및 생체내 검정이 혈소판 응집을 측정하기 위해 사용될 수 있을 것이다. 시험관내 검정은 생체내 상황을 반영한다고 추정된다.
하나의 양상에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 시험관내 검정에서 야생형 폴리펩티드와 비교시 감소된 혈소판 응집을 나타낸다. 또다른 양상에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 시험관내 검정에서 야생형 폴리펩티드보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상, 또는 7 배 이상, 또는 10 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 30 배 이상, 또는 40 배 이상, 또는 50 배 이상, 또는 60 배 이상, 또는 70 배 이상, 또는 80 배 이상, 또는 90 배 이상, 또는 100 배 이상, 또는 200 배 이상 작은 감소된 혈소판 응집을 나타낸다. 또다른 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 시험관내 검정에서 야생형 폴리펩티드에 비해 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상, 또는 200% 이상, 또는 300% 이상, 또는 400% 이상, 또는 500% 이상 감소된 감소된 혈소판 응집을 나타낸다.
또다른 양상에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교시 감소된 생체내 혈소판 응집을 나타낸다. 또다른 양상에서, 발명의 변이체는 생체내 검정에서 야생형 Fc 폴리펩티드보다 2 배 이상, 또는 3 배 이상, 또는 5 배 이상, 또는 7 배 이상, 또는 10 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 30 배 이상, 또는 40 배 이상, 또는 50 배 이상, 또는 60 배 이상, 또는 70 배 이상, 또는 80 배 이상, 또는 90 배 이상, 또는 100 배 이상, 또는 200 배 이상 작은 감소된 혈소판 응집을 나타낸다. 또다른 구현예에서, 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 생체내 검정에서 야생형 폴리펩티드에 비해 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상, 또는 200% 이상, 또는 300% 이상, 또는 400% 이상, 또는 500% 이상 감소된 감소된 혈소판 응집을 나타낸다.
내부화 항체
발명의 변이체는 내부화하여 항체를 세포 내로 운반할 수 있는 세포-표면 항원에 결합할 수 있다. 일단 세포 내부에 들어오면, 변이체는 세포질 내로 방출되거나, 특정 구역으로 표적화되거나, 또는 세포 표면으로 재순환된다. 일부 구현예에서, 발명의 변이체는 내부화하는 세포-표면 항원에 결합한다. 다른 구현예에서, 발명의 항체는 세포의 특정 세포소기관 또는 구역으로 표적화될 수 있다. 또다른 구현예에서, 발명의 변이체는 내부화 후에 세포 표면 또는 주변부로 재순환될 수 있다.
구체적 구현예에서, 발명의 항체는 p-셀렉틴, CD9, CD19, CD81, CCR5 또는 CXCR5, IL17a 또는 Il-33 에 특이적이다.
항체 제조
발명의 바람직한 구현예에서, 본원의 교시에 따라 수식되는 Fc 영역-함유 폴리펩티드는 항체이다. 항체 생산 기술은 다음과 같다:
항원 선별 및 제조
폴리펩티드가 항체인 경우, 그것은 관심의 항원으로 향해진다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 질환 또는 장애를 앓는 포유류에 대한 항체의 투여는 그 포유류에서 치료적 유익을 초래할 수 있다. 그러나, 비폴리펩티드 항원 (예컨대 종양-연합된 당지질 항원; 미국 특허 번호 5,091,178 참조) 으로 향해지는 항체가 또한 고려된다.
항원이 폴리펩티드인 경우, 그것은 막관통 분자 (예를 들어 수용체) 또는 리간드 예컨대 성장 인자일 수 있다. 예시적 항원은 분자 예컨대 레닌; 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지방단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 (TF), 및 폰빌레브란트 인자; 항-응고 인자 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화인자, 예컨대 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화인자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나아제; RANTES (활성화시 조절됨 정상적으로 T-세포 발현되고 분비됨); 인간 마크로파지 염증 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민 예컨대 인간 혈청 알부민; 무엘레리안 (Muellerian)-저해 물질; 릴랙신 A-사슬; 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 마우스 성선자극호르몬-연합된 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 연합성 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자용 수용체; 단백질 A 또는 D; 류머티스성 인자; 신경영양 인자 예컨대 뼈-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자 예컨대 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 예를 들어 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5; 인슐린-비슷한 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-비슷한 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질 예컨대 CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포에틴; 뼈유도성 인자; 면역독소; 뼈 형성 단백질 (BMP); 인터페론 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예를 들어, IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥사이드 불균등화효소; 표면 막 단백질; 분해 촉진 인자; 바이러스 항원 예컨대, 예를 들어, AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절인자 단백질; 인테그린 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 연관 항원 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 위에 열거된 임의의 폴리펩티드의 조각을 포함한다.
본 발명에 포괄되는 항체에 대한 바람직한 분자 표적은 CD 단백질 예컨대 CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD34; ErbB 수용체 패밀리의 일원 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자 예컨대 LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, α4/β7 인테그린, 및 αv/β3 인테그린, 그의 α 또는 β 서브유닛 중 하나를 포함 (예를 들어 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자 예컨대 VEGF; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (α-IFN); 인터루킨, 예컨대 IL-8; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C 등을 포함한다.
임의로 다른 분자에 접합된, 가용성 항원 또는 그의 조각이 항체 생성을 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 막관통 분자, 예컨대 수용체의 경우, 이의 조각 (예를 들어 수용체의 세포외 도메인) 이 면역원으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 막관통 분자를 발현하는 세포가 면역원으로서 사용될 수 있다. 그러한 세포는 자연 출처 (예를 들어 암 세포주) 에서 유래할 수 있거나 또는 막관통 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체 제조에 유용한 기타 항원 및 그의 형태는 당업자에게 명백할 것이다.
폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 바람직하게는 동물에서 관련 항원 및 아주반트의 다수의 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 생성된다. 이관능성 또는 유도체화 물질, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 카르보디이미드 (여기서, R 및 R1 은 상이한 알킬 기임) 를 사용하여 면역화되는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 저해인자에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
동물은, 예를 들어, 100 ㎍ 또는 5 ㎍ 의 단백질 또는 접합체 (각각 토끼 또는 마우스에 대한) 와 3 부피의 프로인트 (Freund) 의 완전 아주반트를 조합시키고, 그 용액을 피내에 여러 자리에서 주사함으로써, 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1 달 후 동물은 예를 들어 여러 자리에서 피하 주사에 의해 원래의 양의 1/10 의 프로인트의 완전 아주반트 중 펩티드 또는 접합체로 부스팅된다. 7 ~ 14 일 후 동물은 채혈되고, 혈청이 항체 역가에 대해 검정된다. 동물은 역가 플래토 (titer plateau) 까지 부스팅된다. 바람직하게는, 동물은 동일한 항원의, 그러나 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교 시약을 통해 접합된, 접합체로 부스팅된다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물 중에서 단백질 융합물로서 제조되될 수 있다. 또한, 응집화제 예컨대 alum 이 면역 반응을 증강시키기 위해 적합하게 사용된다.
모노클로날 항체
모노클로날 항체는 Kohler, et al., Nature, 256 (1975) 495 에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567) 에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 기타 적당한 숙주 동물, 예컨대 햄스터 또는 짧은꼬리 원숭이가 위에 기재된 바와 같이 면역화되어, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산하는 능력이 있는 림프구를 유발한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 림프구는 그 후 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 미엘로마 세포와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986) pp. 59-103).
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 미융합, 부모 미엘로마 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에 파종되고 성장된다. 예를 들어, 부모 미엘로마 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 를 결여하는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 포함할 것이다 (HAT 배지).
바람직한 미엘로마 세포는 효율적으로 융합하고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적 높은-수준 생산을 지지하고, 배지 예컨대 HAT 배지에 민감성인 것이다. 이들 중에서, 바람직한 미엘로마 세포주는 쥐 미엘로마 세포주, 예컨대 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA 로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA 로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포에서 유도된 것이다. 인간 미엘로마 및 마우스-인간 헤테로미엘로마 세포주가 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기재된 바 있다 (Kozbor, J., Immunol. 133 (1984) 3001; Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987) pp. 51-63).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원으로 향해지는 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성이 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사면역검정 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착제 검정 (ELISA) 에 의해 측정된다.
원하는 특이성, 친화도, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 식별된 후, 클론은 희석 절차를 제한함으로써 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986) pp. 59-103). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 부가적으로, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 적합하게는 배양 배지, 복수 유체, 또는 혈청으로부터 종래의 면역글로불린 정제 절차 예컨대, 예를 들어, 단백질 A-세파로오스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 분리된다.
모노클로날 항체를 인코딩하는 DNA 는 종래의 절차를 사용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 능력이 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA 의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA 는 발현 벡터 내로 배치될 수 있고, 그 발현 벡터는 그 후 숙주 세포 예컨대 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 다른 경우에는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 미엘로마 세포 내로 트랜스펙션되어, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성이 일어난다. 항체의 재조합적 생산은 아래에서 더욱 상세히 기재될 것이다.
추가의 구현예에서에서, 항체 또는 항체 조각은 McCafferty, J., et al., Nature 348 (1990) 552-554 에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. Clackson, et al., Nature 352 (1991) 624-628 및 Marks, et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597 은 각각 파지 라이브러리를 사용하는 쥐 및 인간 항체의 단리를 기술한다. 후속 공개물은 사슬 셔플링에 의한 높은 친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (Marks, et al., Bio/Technology 10 (1992) 779-783), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리 구축을 위한 전략으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse, et al., Nuc. Acids. Res. 21 (1993) 2265-2266) 을 기술한다. 따라서, 이러한 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대에 대한 실행가능한 대안이다.
DNA 는 또한, 예를 들어, 동종 쥐 서열 대신에 인간 중- 및 경-쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (미국 특허 번호 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855), 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유적으로 연결함으로써 수식될 수 있다.
전형적으로 항체의 불변 도메인이 그러한 비-면역글로불린 폴리펩티드로 치환되거나, 또는 항체의 하나의 항원-조합 자리의 가변 도메인이 그것으로 치환되어, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-조합 자리 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또다른 항원-조합 자리를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.
항체 친화도
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 해리 상수 (Kd) 는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M) 이다.
하나의 구현예에서, Kd 는 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심의 항체의 Fab 버전 및 그것의 항원을 이용하여 수행되는 방사성표지된 항원 또는 Fc 수용체 결합 검정 (RIA) 에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab 의 용액 결합 친화도는 표지되지 않은 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab 를 평형시킨 후, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (참조, 예를 들어, Chen, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). 검정을 위한 상태를 확립하기 위해, MICROTITER® 멀티-웰 플레이트 (Thermo Scientific) 가 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 ㎍/㎖ 의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs) 로 밤새 코팅된 후, 실온 (대략 23℃) 에서 2 ~ 5 시간 동안 PBS 중 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620) 에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원이 관심의 Fab 의 연속 희석물과 혼합된다 (예를 들어, Presta, et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599 에서의, 항-VEGF 항체, Fab-12 의 평가와 일치함). 관심의 Fab 는 그 후 밤새 인큐베이션된다; 그러나, 인큐베이션은 더 긴 시간 (예를 들어, 약 65 시간) 동안 지속되어 평형에 도달하는 것이 보장될 수 있다. 그 후, 혼합물이 실온에서의 인큐베이션 (예를 들어, 1 시간 동안) 을 위해 포획 플레이트로 옮겨진다. 용액이 그 후 제거되고, 플레이트가 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®) 으로 8 회 세정된다. 플레이트가 건조되었을 때, 150 ㎕/웰 의 신틸런트 (scintillant) (MICROSCINT-20 ™; Packard) 가 첨가되고, 플레이트가 10 분 동안 TOPCOUNT ™ 감마 계수기 (Packard) 에서 계수된다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab 의 농축물이 경쟁적 결합 검정에서 사용하기 위해 선택된다.
또다른 구현예에 따르면, Kd 는 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 을 사용하여 25℃ 에서 고정된 항원 또는 Fc 수용체 CM5 칩으로 ~10 반응 유닛 (RU) 에서 측정된다. 간략히, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.) 이 공급사의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 로 활성화된다. 항원이 5 ㎕/분 의 유속에서의 주사 전에 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8 로, 5 ㎍/㎖ (~0.2 μM) 까지 희석되어 대략 10 반응 유닛 (RU) 의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원의 주사 후에, 1 M 에탄올아민이 주사되어 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab 의 2-배 연속 희석물 (0.78 nM ~ 500 nM) 이 대략 25 ㎕/분 의 유속으로 25℃ 에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제 (PBST) 함유 PBS 중에서 주사된다. 연합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff) 가 단순한 일대일 랭뮤어 결합 모델 (BIACORE ® Evaluation Software version 3.2) 을 사용하여 연합 및 해리 센소그램을 동시에 적합 (fitting) 시킴으로써 계산된다. 평형 해리 상수 (Kd) 는 비 koff/kon 로서 계산된다. 예를 들어, Chen, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881 참조. 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의한 온-속도 (on-rate) 가 106 M- 1 s- 1 을 초과하는 경우, 이때 분광계, 예컨대 정지-유동 장비를 갖춘 분광광도계 (stop-flow equipped spectrophotometer) (Aviv Instruments) 또는 교반되는 큐벳이 달린 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광광도계 (ThermoSpectronic) 에서 측정되는 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS, pH 7.2 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태) 의 25℃ 에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 ㎚; 방출 = 340 ㎚, 16 ㎚ 대역 (band-pass)) 의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 (quenching) 기술을 사용함으로써 온-속도가 측정될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 항체 조각이다. 항체 조각은 아래 기재된 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 조각, 및 기타 조각을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 항체 조각의 리뷰에 대해, Hudson, et al., Nat. MEd. 9 (2003) 129-134 를 참조. scFv 조각의 리뷰에 대해, 예를 들어, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994) 참조; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 US 5,571,894 및 US 5,587,458 참조. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 조각의 논의에 대해, 미국 특허 번호 US 5,869,046 참조.
다이아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2 개의 항원-결합 자리를 갖는 항체 조각이다. 예를 들어, EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, et al., Nat. MEd. 9 (2003) 129-134; 및 Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참조. 트리아바디 (triabody) 및 테트라바디 (tetrabody) 가 또한 Hudson, et al., Nat. MEd. 9 (2003) 129-134 에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 조각이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 번호 US 6,248,516 B1 참조).
항체 조각은, 본원에 기재된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질가수분해 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어 대장균 또는 파지) 에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지 않는, 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
키메라 및 인간화 항체
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체가, 예를 들어, 미국 특허 번호 US 4,816,567; 및 Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855) 에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 유래하는 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 부모 항체의 그것으로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 조각을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성은 감소되지만, 여전히 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 보유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 내부의 HVR, 예를 들어, CDR (또는 그의 일부) 은 비-인간 항체에서 유래하고, FR (또는 그의 일부) 은 인간 항체 서열에서 유래하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의로 인간 불변 영역의 일부 이상을 또한 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 회복 또는 개선하도록, 인간화 항체 내의 일부 FR 잔기가 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체) 로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법이, 예를 들어, Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 에서 리뷰되어 있고, 예를 들어, Riechmann, et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri, et al., Methods 36 (2005) 25-34 (SDR (a-CDR) 그래프팅을 기재함); Padlan, Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 ("재포장 (resurfacing)" 을 기재함); Dall'Acqua, et al., Methods 36 (2005) 43-60 ("FR 셔플링" 을 기재함); 및 Osbourn, et al., Methods 36 (2005)61-68 및 Klimka, et al., Br. J. Cancer, 83 (2000) 252-260 (FR 셔플링에 대한 "인도되는 선별 (guided selection)" 접근을 기재함) 에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 골격 영역은 하기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: "최적-적합 (best-fit)" 방법을 사용하여 선별된 골격 영역 (예를 들어, Sims, et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브그룹의 인간 항체의 공통 서열에서 유래하는 골격 영역 (예를 들어, Carter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 4285; 및 Presta, et al., J. Immunol., 151 (1993) 2623 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 골격 영역 또는 인간 생식선 골격 영역 (예를 들어, Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝에서 유래하는 골격 영역 (예를 들어, Baca, et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 및 Rosok, et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618 참조).
인간 항체
특정 구현예에서 본원에서 제공되는 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk, and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-74 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459 에 일반적으로 기술되어 있다.
인간 항체는 항원 공격에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 온전한 인간 항체 또는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 그러한 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대신하거나 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 그러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 리뷰에 대해, Lonberg, Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125 참조. 또한, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (XENOMOUSETM 기술을 기재함); 미국 특허 번호 5,770,429 (HUMAB® 기술을 기재함); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스® 기술을 기재함), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (VELOCIMOUSE® 기술을 기재함) 참조. 그러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과의 조합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 미엘로마 및 마우스-인간 헤테로미엘로마 세포주가 기재된 바 있다 (예를 들어, Kozbor, J. Immunol., 133 (1984) 3001; Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63; 및 Boerner, et al., J. Immunol., 147 (1991) 86 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술에 의해 생성된 인간 항체도 또한 Li, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 (2006) 3557-3562 에 기술되어 있다. 부가적 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기재함) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4) (2006) 265-268 (인간-인간 하이브리도마를 기재함) 에 기재된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology) 은 또한 Vollmers, and Brandlein, Histology and Histopathology 20(3) (2005) 927-937 및 Vollmers, and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3) (2005) 185-91 에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 그러한 가변 도메인 서열은 그 후 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술이 아래 기재되어 있다.
라이브러리-유래 항체
본 발명의 융합 단백질에 포함된 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 상기 라이브러리를 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 방법은, 예를 들어, Hoogenboom, H.R., et al., in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) 에서 리뷰되어 있고, 예를 들어, McCafferty, J., et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu, et al., J. Mol. Biol. 338(2) (2004) 299-310; Lee, et al., J. Mol. Biol. 340(5) (2004) 1073-1093; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34) (2004) 12467-12472; 및 Lee, et al., J. Immunol. Methods 284(1-2) (2004) 119-132 에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 별도로 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 이것이 그 후 Winter, et al., Ann. Rev. Immunol., 12 (1994) 433-455 에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 조각을 단일-사슬 Fv (scFv) 조각으로서 또는 Fab 조각으로서 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터 얻은 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 높은-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, Griffiths, et al., EMBO J, 12 (1993) 725-734 에 기재된 바와 같이 나이브 (naive) 레퍼토리를 클로닝하여 (예를 들어, 인간으로부터) 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, Hoogenboom, and Winter, J. Mol. Biol., 227 (1992) 381-388 에 기재된 바와 같이 나이브 라이브러리도 또한 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 고도 가변 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내 재배열을 달성하기 위해 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공개공보는, 예를 들어: 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360 을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 조각은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 조각으로 간주된다.
다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 자리에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 특정 항원에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 항원의 2 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포로 세포독성제를 국소화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 조각으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현 (Milstein, and Cuello, Nature 305 (1983) 537, WO 93/08829, 및 Traunecker, et al., EMBO J. 10 (1991) 3655 참조), 및 "놉-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168) 을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-헤테로이량체 분자를 제조하기 위한 정전 스티어링 (steering) 효과를 조작하고 (WO 2009/089004 A1); 2 개 이상의 항체 또는 조각을 가교결합시키고 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 Brennan, et al., Science, 229 (1985) 81 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 생성하고 (예를 들어, Kostelny, et al., J. Immunol., 148(5) (1992) 1547-1553 참조); 이중특이적 항체 조각을 제조하기 위해 "다이아바디" 기술을 사용하고 (참조, 예를 들어, Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1993) 6444-6448); 단일-사슬 Fv (sFv) 이량체를 사용하고 (예를 들어 Gruber, et al., J. Immunol., 152 (1994) 5368 참조); 예를 들어, Tutt, et al., J. Immunol. 147 (1991) 60 에 기재된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 (Octopus) 항체" 를 포함하여, 3 개 이상의 기능성 항원 결합 자리를 갖는 조작된 항체도 또한 본원에 포함된다 (예를 들어 US 2006/0025576 A1 참조).
본원에서 항체 또는 조각은 특정 항원 뿐만 아니라 또다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 자리를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF" 를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
항원에 대한 변경된 결합 친화도를 갖는 항체 변이체
특정 구현예에서, 항체의 항원에 대한 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 적절한 수식을 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 수식은 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 상기 서열 내로의 삽입, 및/또는 상기 서열 내의 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구축물에 도달할 수 있으나, 단, 최종 구축물은 원하는 특성, 예를 들어, 항원-결합 특성을 보유해야 한다.
치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 구현예에서, Fc 부분 이외의 다른 부분에서 하나 이상의 아미노산 치환을 부가적으로 갖는 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심의 자리는 HVR 및 FR 을 포함한다. 보존적 치환은 표 1 에서 "보존적 치환" 의 제목 하에 제시되어 있다. 더 많은 실질적 변화들이 표 1 에서 "예시적 치환" 의 제목 하에 제공되어 있고, 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 아래 추가로 기재되어 있다. 아미노산 치환이 관심의 항체 내로 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합, 또는 감소된 면역원성에 대해 스크리닝될 수 있다.
표 1:
Figure pat00001
통상적인 측쇄 특성에 따라 분류된다:
(1) 소수성: Ile, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 일원을 또다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 부모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체) 의 하나 이상의 과가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선별된 결과로서 얻어지는 변이체(들)은 부모 항체에 대해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성) 에서 변화 (예를 들어, 개선) 을 갖고/갖거나 부모 항체의 실질적으로 유지된 특정 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적 치환 변이체는 친화도 성숙된 항체이며, 이것은, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 파지-디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략히, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고 특정 생물 활성 (예를 들어, 결합 친화도) 에 대해 스크리닝된다.
예를 들어, 항체 친화도를 개선하기 위해, HVR 에서 변경 (예를 들어, 치환) 이 일어날 수 있다. 그러한 변경은 HVR "핫스팟 (hotspot)", 즉, 체세포 돌연변이 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기 (예를 들어, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) 에서 일어날 수 있으며, 결과로서 얻어지는 변이체 VH 또는 VL 은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리의 구축 및 그로부터의 재선별에 의하는 친화도 성숙이, 예를 들어, Hoogenboom, et al., in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)) 에서 기재된 바 있다. 친화도 성숙의 일부 구현예에서, 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발) 에 의해 성숙을 위해 선택된 다양한 유전자 내로 다양성이 도입된다. 그 후, 2차 라이브러리가 생성된다. 그 후, 상기 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하기 위한 또다른 방법은 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한번에 4 내지 6 개의 잔기) 가 무작위화되는 HVR-지정 접근방법을 포함한다. 항원 결합에 관여되는 HVR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모형화를 사용하여 특이적으로 식별될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3 이 특히 흔히 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은, 그러한 변경이 그 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환) 이 HVR 에서 일어날 수 있다. 그러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR 바깥에서 일어날 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR 은 변경되지 않거나, 1, 2 또는 3 개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역들을 식별하기에 유용한 방법은 Cunningham, and Wells, Science 244 (1989) 1081-1085 에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발" 로 호칭된다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 그룹 (예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu 와 같은 하전된 잔기들) 이 식별되고, 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 확인하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌) 으로 대체된다. 추가의 치환이 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치들에서 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 식별하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환에 대한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 특성을 갖는지 여부를 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1 개의 잔기로부터 100 개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합물, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 기타 삽입 변이체는 효소 (예를 들어 ADEPT 을 위한) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
글리코실화 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 자리의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 자리가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc-영역을 포함하는 경우, 그에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로, 일반적으로 Fc-영역의 CH2 도메인의 Asn297 에 N-연결에 의해 부착되는 분지형 바이안테너리 (biantennary) 올리고당을 포함한다. 예를 들어, Wright, et al., TIBTECH 15 (1997) 26-32 참조. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라, 바이안테너리 올리고당 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc 에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발명의 항체 중 올리고당의 변형은 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 수행될 수 있다.
예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 Fc 코어 (core) 올리고당이 차등적으로 시알릴화되어 있는 시알릴화된 올리고당을 갖는 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 추가로 제공된다. 그러한 폴리펩티드는 증가된 시알릴화 및/또는 감소된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체의 예가 예를 들어 Kaneko, et al., Science 313 (2006) 670-673 에 기재되어 있다.
시스테인 조작된 항체 변이체
특정 구현예에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있는 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, "thioMAb" 를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 자리에서 발생한다. 그러한 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 그에 의해 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 자리에 위치하고, 항체를 다른 모이어티 (moiety), 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 면역접합체를 생성하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 임의의 하나 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 번호지정); 중쇄의 A118 (EU 번호지정); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 번호지정). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,521,541 에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
항체 유도체
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 당해 분야에서 공지되어 있고 용이하게 입수가능한 부가적 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 수용성 중합체의 비-제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그것의 물 중에서의 안정성으로 인해 제조시 유리할 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 다양할 수 있고, 1 개 초과의 중합체가 부착되는 경우, 그들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특별한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 제한된 조건 하의 요법에서 사용될지 여부 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려에 기초하여 결정될 수 있다.
또다른 구현예에서, 방사선에의 노출에 의해 선별적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티와 항체의 접합체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고, 보통의 (ordinary) 세포는 해치지 않지만, 항체-비단백질성 모이어티 가까이에 있는 세포는 죽게 되는 온도까지 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
재조합 방법 및 조성물
예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 에 기재된 바와 같은, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 항체가 제조될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 항체 변이체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 그러한 핵산은 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH 을 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄) 을 인코딩할 수 있다. 추가의 구현예에서에서, 그러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다. 추가의 구현예에서에서, 그러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 그러한 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들어, 하기로 형질전환되었다): (1) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프양 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 하나의 구현예에서, 상기 제공되는 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 임의로 항체를 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 회수하는 것을 포함하는, 항체 변이체의 제조 방법이 제공된다.
항체 변이체의 재조합 생성을 위해, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 그러한 핵산은 종래의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 능력이 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 세균에서 생성될 수 있다. 세균에서의 항체 조각 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523 참조 (또한 대장균에서의 항체 조각의 발현을 기재하는 Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ) 참조). 발현 후에, 항체는 가용성 분획중 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵세포 뿐만 아니라, 글리코실화 경로가 "인간화" 되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 초래하는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414, and Li, et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 참조.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물도 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생성하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기재함) 참조.
척추동물 세포도 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응시킨 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 태아 신장 세포주 (293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251 에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부암 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 랫트 간세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방암 세포 (MMT 060562); 예를 들어, Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는, DHFR- CHO 세포 (Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216) 를 포함하여, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 미엘로마 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 를 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 리뷰에 대해, 예를 들어, Yazaki, and Wu, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 255-268 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ) 참조.
검정
본원에서 제공되는 항체는 당해 분야에서 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 스크리닝, 또는 특성분석될 수 있다.
결합 검정 및 기타 검정
하나의 양상에서, 발명의 항체는, 예를 들어, 공지된 방법 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 (Western blot) 등에 의해 그것의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
예시적 경쟁 검정에서, 고정된 항원은 항원 (예를 들어,) 에 결합하는 제 1 표지된 항체 및, 항원에 대한 결합에 있어서 제 1 항체와 경쟁하는 그것의 능력에 대해 시험되고 있는 제 2 표지되지 않은 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션된다. 제 2 항체는 하이브리도마 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 항원은 제 1 표지된 항체를 포함하나 제 2 표지되지 않은 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 인큐베이션된다. 항원에 대한 제 1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서의 인큐베이션 후에, 과잉의 미결합 항체가 제거되고, 고정된 항원과 연합된 표지의 양이 측정된다. 시험 샘플 중 고정된 항원과 연합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 실질적으로 감소된 경우, 이때 그것은 제 2 항체가 항원에 대한 결합에 있어서 제 1 항체와 경쟁함을 시사한다 (Harlow, and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 참조).
면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 저해제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적 활성인 독소, 또는 그의 조각), 또는 방사성 동위원소와 접합된 본원의 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
하나의 구현예에서, 면역접합체는 그 안의 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; Hinman, et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; 및 Lode, et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928 참조); 안트라사이클릭 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (Kratz, et al., Current MEd. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, et al., Bioorganic & MEd. Chem. Letters 16 (2006) 358-362; Torgov, et al., BioconJ. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, et al., Bioorg. & MEd. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, et al., J. MEd. Chem. 45 (2002) 4336-4343; 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065 를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 약물에 접합되어 있는 항체-약물 접합체 (ADC) 이다.
또다른 구현예에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 조각, 엑소톡신 A 사슬 (녹농균에서 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 저해인자, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 저해인자, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지 않는 효소적 활성 독소 또는 그의 조각에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
또다른 구현예에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사접합체 (radioconjugate) 를 형성하고 있는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사접합체의 제조에 이용가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu 의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사접합체가 탐지에 사용될 때, 그것은 신티그래피 연구용 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri 로도 알려짐) 용 스핀 표지 (spin label), 예컨대 요오드-123 다시, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠) 을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta, et al., Science 238 (1987) 1098 에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 항체에 대한 라디오뉴클레오티드 (radionucleotide) 의 접합을 위한 예시적 킬레이트화제이다. WO 94/11026 참조. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단가능 링커" 일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커 (Chari, et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; 미국 특허 번호 5,208,020) 가 사용될 수 있다.
본원에서 면역접합체 또는 ADC 는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (이들은, 예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A 에서 상업적으로 입수가능함) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 가교결합제 시약으로 제조된 그러한 접합체를 명백히 고려하나 그에 한정되지 않는다.
진단 및 탐지를 위한 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 임의의 항체 변이체는 생물학적 샘플 중 그 항체에 대한 항원 결합의 존재를 탐지하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "탐지" 는 정량적 또는 정성적 탐지를 포괄한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
하나의 구현예에서, 진단 또는 탐지 방법에 사용하기 위한 항체 변이체가 제공된다. 추가의 양상에서, 생물학적 샘플 중 상기 항체 변이체가 결합하는 항원의 존재를 탐지하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 항원에 대한 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플과 본원에 기재된 바와 같은 항체를 접촉시키고 항체와 항원 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 탐지하는 것을 포함한다. 그러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체 변이체는 항체를 이용한 요법에 적격인 대상을 선별하기 위해 사용되며, 예를 들어 이 경우 상기 항체가 결합하는 항원은 환자의 선별을 위한 바이오마커이다.
발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적 장애는 암, 심혈관 질환, 신경 장애 및 당뇨병을 포함한다.
특정 구현예에서, 표지된 항체 변이체가 제공된다. 표지는 직접적으로 탐지되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 발색, 전자-밀도, 화학발광, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해, 간접적으로 탐지되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그것의 유도체, 로다민 및 그것의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들어, 반딧불 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 헤테로시클릭 옥시다제 예컨대 유리카제 및 잔틴 옥시다제 (수소 퍼옥시다제를 이용하여 염료 전구체를 산화시키는 효소 예컨대 HRP 와 커플링됨), 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로과옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정적 자유 라디칼 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
약학적 제형
본원에 기재된 바와 같은 항체 변이체의 약학적 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 그러한 항체를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성이며, 하기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 겔라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 간질성 (intersitial) 약물 분산제 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 을 추가로 포함한다. rhuPH20 을 포함하여, 특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968 에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP 는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
예시적 동결건조된 항체 제형이 미국 특허 번호 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원에서의 제형은 치료되는 특정한 적응증 (indication) 에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로에게 유해하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 성분들을 또한 함유할 수 있다. 상기 활성 성분들은 적합하게는 의도되는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다.
활성 성분은, 예를 들어, 코아세르베이션 (coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸 셀룰로스 또는 겔라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀전, 나노-입자 및 나노캡슐) 에 또는 마크로에멀전에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) 에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과 막을 통하는 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공되는 임의의 폴리펩티드는 치료 방법에 사용될 수 있다.
발명의 특정 양상에서 발명에 따른 폴리펩티드는 질환의 치료에 사용된다. 더욱 구체적인 양상에서, 질환은 변이체의 효과기 기능이 야생형 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드와 비교시 크게, 50% 이상, 감소되는 것이 유리한 질환이다.
특정 양상에서 발명에 따른 폴리펩티드는 폴리펩티드의 효과기 기능이 야생형 Fc 폴리펩티드와 비교시 크게 감소되는 것이 유리한 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용된다. 추가의 구체적 양상에서 발명에 따른 폴리펩티드는 폴리펩티드의 효과기 기능이 야생형 Fc 폴리펩티드와 비교시 20% 이상 감소되는 것이 유리한 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용된다.
추가의 양상은 발명에 따른 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 변이체의 효과기 기능이 야생형 Fc 폴리펩티드와 비교시 크게 감소되는 것이 유리한 질환을 갖는 개체의 치료 방법이다.
효과기 기능의 큰 감소는 효과기 기능의 야생형 폴리펩티드에 의해 유도되는 효과기 기능의 50 % 이상의 감소이다.
그러한 질환은 예를 들어 표적화되는 세포가 예를 들어 ADCC, ADCP 또는 CDC 에 의해 파괴되어서는 안되는 모든 질환이다. 더욱이, 이것은 표적 세포에 약물 (예를 들어, 독소 및 동위원소) 을 전달하도록 디자인되는 항체의 경우에, 즉 Fc/FcγR 매개성 효과기 기능이 건강한 면역 세포를 치명적 탑재물의 근처로 데려와서, 표적 세포와 함께 정상적 림프양 조직의 고갈을 초래하는 경우에 그러하다 (Hutchins, et al, PNAS USA 92 (1995) 11980-11984; White, et al, Annu Rev Med 52 (2001) 125-145). 이러한 경우에 보체 또는 효과기 세포를 불량하게 동원하는 항체의 사용이 굉장히 유익할 것이다 (예를 들어, Wu, et al., Cell Immunol 200 (2000) 16-26; Shields, et al., J. Biol Chem 276(9) (2001) 6591-6604; US 6,194,551; US 5,885,573 및 PCT 공개 WO 04/029207 참조).
다른 경우에, 예를 들어, 광범위하게 발현되는 수용체와 그것의 코그네이트 리간드의 상호작용을 차단하는 것이 목적인 경우에, 모든 항체 효과기 기능을 감소시키거나 또는 제거하여 원치 않는 독성을 감소시키는 것이 유리할 것이다. 또한, 치료적 항체가 다수의 인간 조직에 걸쳐 무차별적 결합을 나타내는 경우에, 다양한 집합의 조직에 대한 효과기 기능의 표적화를 제한하여 독성을 제한하는 것이 신중할 것이다.
또한 아고니스트 항체의 경우, 이러한 항체가 감소된 효과기 기능을 나타내는 경우에 매우 도움이 될 것이다.
폴리펩티드 변이체로 치료될 수 있는 상태는 많고 암 (예를 들어 항체 변이체가 HER2 수용체, 안지오포이에틴 수용체 또는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 에 결합하는 경우); 알레르기성 상태 예컨대 천식 (항-IgE 항체를 이용함); 및 LFA-1-매개성 장애 (예를 들어 폴리펩티드 변이체가 항-LFA-1 또는 항-ICAM-1 항체인 경우), 신경 및 대사 장애를 포함한다.
항체가 HER2 수용체에 결합하는 경우, 장애는 바람직하게는 HER2-발현 암, 예를 들어 HER2 수용체의 과발현을 특징으로 하는 양성 또는 악성 종양이다. 그러한 암은 유방암, 편평세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위장관 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 방광암, 간세포 선종, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
폴리펩티드 또는 항체 변이체는 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 및 비강내, 및, 국소 면역억제 치료를 위해 바람직한 경우, 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체 변이체는 적합하게는 펄스 주입에 의해, 특히 폴리펩티드 변이체의 감소하는 투여량으로, 투여된다. 바람직하게는 투약은 부분적으로 투여가 단기인지 또는 장기인지 여부에 따라, 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 폴리펩티드 또는 항체 변이체의 적당한 투여량은 치료되는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 폴리펩티드 변이체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상적 병력 및 폴리펩티드 변이체에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 따라 달라질 것이다. 폴리펩티드 변이체는 한번에 또는 일련의 치료 과정 동안 환자에게 적절히 투여된다.
질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/㎏ ~ 15 ㎎/㎏ (예를 들어, 0.1-20 ㎎/㎏) 의 폴리펩티드 또는 항체 변이체가, 예를 들어, 한번 이상의 별도의 투여에 의하든지 또는 연속적 주입에 의하든지 간에, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 일일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라서 약 1 ㎍/㎏ ~ 100 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복된 투여 동안, 상태에 따라서, 치료는 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여량 섭생법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 과정은 종래의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
특정 구현예에서, 발명은 항체 변이체의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암을 갖는 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 항체 변이체 또는 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 그러한 구현예에서, 방법은, 예를 들어, 아래 기재된 바와 같은, 하나 이상의 부가적 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항체 변이체를 투여하여 혈관생성을 저해, 세포 증식을 저해 또는 B-세포를 고갈시키는 것을 포함하는, 개체에서 혈관생성의 저해, 세포 증식의 저해 또는 B-세포의 고갈에 사용하기 위한 항체 변이체를 제공한다. 임의의 상기 구현예에 따른 "개체" 는 바람직하게는 인간이다.
추가의 양상에서, 발명은 약제의 제조 또는 준비에 있어서의 항체 변이체 또는 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 하나의 구현예에서, 약제는 암 또는 염증성 질환의 치료용이다. 추가의 구현예에서에서, 약제는 암, 당뇨병, 신경 장애 또는 염증성 질환을 갖는 개체에게 유효량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 암, 당뇨병, 신경 장애 또는 염증성 질환의 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 그러한 구현예에서, 방법은, 예를 들어, 아래 기재된 바와 같은, 하나 이상의 부가적 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서에서, 약제는 혈관생성을 저해, 세포 증식을 저해 또는 B-세포를 고갈시키기 위한 것이다.
추가의 구현예에서에서, 약제는 개체에게 유효량의 약제를 투여하여 혈관생성을 저해, 세포 증식을 저해 또는 B-세포를 고갈시키는 것을 포함하는, 개체에서 혈관생성을 저해, 세포 증식을 저해 또는 B-세포를 고갈시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 구현예에 따른 "개체" 는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 발명은, 예를 들어, 임의의 상기 치료 방법에서 사용하기 위한, 본원에서 제공되는 임의의 항체 변이체를 포함하는 약학적 제형을 제공한다. 하나의 구현예에서, 약학적 제형은 본원에서 제공되는 임의의 항체 변이체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또다른 구현예에서, 약학적 제형은 본원에서 제공되는 임의의 항체 변이체 및, 예를 들어, 아래 기재된 바와 같은, 하나 이상의 부가적 치료제를 포함한다.
발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 약제와의 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 발명의 항체는 하나 이상의 부가적 치료제와 동시-투여될 수 있다.
상기 조합 요법은 조합된 투여 (이 경우, 2 개 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제형에 포함됨), 및 별도의 투여 (이 경우, 발명의 항체의 투여는 부가적 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에, 및/또는 후에 실시될 수 있음) 를 포괄한다. 발명의 항체는 또한 방사선 요법과의 조합으로 사용될 수 있다.
발명의 항체 (및 임의의 부가적 치료제) 는 비경구, 폐내, 및 비강내, 및 비강내, 및, 국소 치료를 위해 바람직한 경우, 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 부분적으로 투여가 단기인지 또는 장기인지 여부에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 일시 (bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 우수한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제형화되고 투약되고 투여된다. 이와 관련하여 고려할 요인들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 약제의 전달 자리, 투여 방법, 투여 일정, 및 의사에게 알려진 기타 요인들을 포함한다. 항체는 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제형화될 필요는 없지만 임의로 함께 제형화된다. 상기 다른 약제의 유효량은 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 다른 요인들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량으로 및 동일한 투여 경로에 의해, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 ~ 99% 의 양으로, 또는 실험적/임상적으로 적절하다고 확인된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 부가적 치료제와의 조합으로 사용될 때) 은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 요법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료과정 동안 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/㎏ ~ 15 ㎎/㎏ (예를 들어 0.1 ㎎/㎏ ~ 10 ㎎/㎏) 의 항체가, 예를 들어, 한번 이상의 별도의 투여에 의하든지, 또는 연속적 주입에 의하든지간에, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 하나의 전형적인 일일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라서 약 1 ㎍/㎏ ~ 100 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복된 투여 동안, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 항체의 하나의 예시적 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ ~ 약 10 ㎎/㎏ 의 범위일 수 있다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏ (또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주마다 (예를 들어, 환자가 약 2 개 ~ 약 20 개, 또는 예를 들어, 약 6 개 용량의 항체를 투여받도록) 투여될 수 있다. 초기의 더 많은 투입 용량에 이어, 하나 이상의 더 적은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 섭생법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 과정은 종래의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 발명에 따른 항체 대신에 또는 그에 더하여 발명의 면역접합체를 사용하여 실시될 수 있다고 이해된다.
제품
발명의 또다른 양상에서, 전술한 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 연합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는, 단독으로 존재하거나 또는 증상의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또다른 조성물과 조합되고, 멸균 진입 포트를 가질 수 있는 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있음) 조성물을 보유한다. 조성물 중 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택의 상태를 치료하기 위해 사용되는 것을 지시한다. 더욱이, 제품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제 1 용기, 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 경우에는 치료제를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 구현예에서 제품은 조성물이 특정 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 제품은 약학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질들을 추가로 포함할 수 있다.
항체 변이체 대신에 또는 그에 더하여 발명의 면역접합체를 포함할 수 있다고 이해된다.
폴리펩티드의 비치료적 용도
발명의 항체 변이체는 친화도 정제 물질로서 사용될 수 있다. 이러한 과정에서, 항체 변이체는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 세파덱스 (Sephadex) 수지 또는 여과지와 같은 고체상에 고정된다. 고정된 폴리펩티드 변이체가 정제될 항원을 함유하는 샘플과 접촉된 후, 고정된 항체 변이체에 결합되어 있는, 정제될 항원을 제외한 샘플 중의 물질을 실질적으로 전부 제거할 적합한 용매로 지지체가 세정된다. 마지막으로, 지지체가 또다른 적합한 용매, 예컨대, 폴리펩티드 변이체로부터 항원을 방출시킬, 글리신 완충제, pH 5.0 로 세정된다.
항체 변이체는 또한, 예를 들어, 특이적 세포, 조직, 또는 혈청 중 관심의 항원의 발현을 탐지하기 위한, 진단적 검정에서 유용할 수 있다.
진단적 적용을 위해, 항체 변이체는 전형적으로 탐지가능한 모이어티로 표지될 것이다. 일반적으로 하기 범주로 분류될 수 있는 다수의 표지가 이용가능하다:
(a) 방사성동위원소, 예컨대 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I. 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 Coligen, et al., Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991) 에 기재된 기술을 사용하여 방사성동위원소로 표지될 수 있고, 방사능은 섬광 계수를 사용하여 측정될 수 있다.
(b) 형광 표지 예컨대 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그것의 유도체, 로다민 및 그것의 유도체, 단실, 리사민 (Lissamine), 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red) 가 이용가능하다. 형광 표지는 예를 들어 상기 Current Protocols in Immunology 에 개시된 기술을 사용하여 폴리펩티드 변이체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량화될 수 있다.
(c) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 번호 4,275,149 는 이들의 일부에 대한 개요를 제공한다. 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉진한다. 예를 들어, 효소는 분광광도법으로 측정될 수 있는 기질에서의 색 변화를 촉진한다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경할 수 있다. 형광의 변화를 정량화하기 위한 기술이 상기 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되고, 그 후 측정될 수 있는 (예를 들어, 화학광도계를 사용하여) 빛을 방출하거나 또는 에너지를 형광 수용체에 공여한다. 효소 표지의 예는 루시퍼라제 (예를 들어, 반딧불 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; 미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 탈수소효소, 우레아제, 퍼옥시다제 예컨대 고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로과옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기술이 O'Sullivan, et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981) 에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는, 예를 들어, 하기를 포함한다:
(i) 기질로서 수소 퍼옥시다제를 갖는 고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO) (여기서, 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예를 들어 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드 (TMB)) 를 산화시킴);
(ii) 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 갖는 알칼리성 포스파타제 (AP); 및
(iii) 발색 기질 (예를 들어 p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광발생 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제를 갖는 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal).
다수의 다른 효소-기질 조합이 당해 분야의 기술자에게 이용가능하다. 이들의 일반적인 개요에 대해 미국 특허 번호 4,275,149 및 4,318,980 참조.
때때로, 표지는 폴리펩티드 변이체와 간접적으로 접합된다. 기술자라면 이를 달성하기 위한 다양한 기술을 인식할 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드 변이체는 비오틴과 접합될 수 있고, 위에 언급된 표지의 임의의 3 개의 넓은 카테고리는 아비딘과 접합될 수 있거나, 그 반대일 수 있다. 비오틴은 선택적으로 아비딘에 결합하고, 따라서 표지는 이러한 간접적인 방식으로 폴리펩티드 변이체와 접합될 수 있다. 대안적으로, 표지와 폴리펩티드 변이체의 간접적인 접합을 달성하기 위해, 폴리펩티드 변이체는 작은 합텐 (예를 들어, 디그옥신) 과 접합되고, 위에 언급된 표지의 상이한 유형 중 하나는 항-합텐 폴리펩티드 변이체 (예를 들어, 항-디그옥신 항체) 와 접합된다. 이와 같이, 표지와 폴리펩티드 변이체의 간접적인 접합이 달성될 수 있다.
발명의 또다른 구현예에서, 항체 변이체는 표지될 필요가 없고, 그것의 존재는 폴리펩티드 변이체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 탐지될 수 있다.
본 발명의 항체 변이체는 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역침전 검정에서 이용될 수 있다. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, (1987) pp. 147-158, CRC Press, Inc..
항체 변이체는 또한 생체내 진단적 검정을 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드 변이체가 방사성핵종 (예컨대 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S) 으로 표지되어, 항원 또는 그것을 발현하는 세포가 면역신티그라피 (immunoscintiography) 를 사용하여 위치확인될 수 있다. 전술한 발명은 명확한 이해를 목적으로 설명 및 예를 이용하여 얼마간 상세히 기술되었지만, 설명 및 예는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되면 안된다.
서열 목록의 설명:
SEQ ID NO:1 인간 카파 경쇄
SEQ ID NO:2 인간 람다 경쇄
SEQ ID NO:3 인간 IgG1 (코카시안 동종이형)
SEQ ID NO:4 인간 IgG1 (아프로아메리칸 동종이형)
SEQ ID NO:5 인간 IgG1 LALA-돌연변이체 (코카시안 동종이형)
SEQ ID NO:6 인간 IgG4
SEQ ID NO:7 인간 IgG4 SPLE-돌연변이체 (이는 발명에 따른 변이체를 생성하기 위한 기초로서의 역할을 할 수 있는 카파 경쇄, 람다 경쇄, IgG1 및 IgG4 에 대한 예시적 인간 서열을 나타냄).
서열 Id Nos 3-5, 인간 IgG1 동종이형의 서열에서, Kabat EU 인덱스에 따른 P329 영역은 위치 212 에 위치하지만, 서열 Id Nos 6 및 7 에서 상기 P329 영역은 위치 209 에서 찾을 수 있다.
SEQ ID NO:8 mAb 40A746.2.3 의 카파 경쇄
SEQ ID NO:9 mAb 40A746.2.3 의 야생형 IgG1 의 중쇄
SEQ ID NO:10 mAb 40A746.2.3 의 IgG1 P329G 의 중쇄
SEQ ID NO:11 mAb 40A746.2.3 의 IgG1 LALA / P329G 의 중쇄
SEQ ID NO:12 mAb 40A746.2.3 의 IgG4 SPLE 의 중쇄
SEQ ID NO:13 mAb 40A746.2.3 의 IgG4 SPLE / P329G 의 중쇄
SEQ ID NO:14 mAb 40A746.2.3 의 IgG1 LALA 의 중쇄
실시예
하기 7 개의 실시예는 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 위에 제공된 일반적 설명을 고려하여, 다양한 다른 구현예들이 실시될 수 있다고 이해된다.
전술한 발명은 명확한 이해를 목적으로 설명 및 예를 이용하여 얼마간 상세히 기술되었지만, 설명 및 예는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되면 안된다. 본원에서 언급된 모든 특허 및 과학 문헌의 공개물은 그의 전문이 본원에 참조로 명백히 포함된다.
실시예 1
항체
하기 실험에 CD9 (SEQ IDs 8-14 참조), P-셀렉틴 (WO 2005/100402 에 기재된 서열) 및 CD20 (동의어: GA101, EP 1 692 182 에 기재된 서열) 에 대한 항체를 사용했다.
본원에 기재된 모든 변이체, 예를 들어 셀렉틴의 P329G, P329A, P329R SPLE, LALA, P329G/LALA, P329G/SPLE 변이체, CD9, CD20 (GA101) 및 CD20 (GA101)-글리코엔지니어드 결합 항체 (EU 명명법에 따른 번호지정) 를 PCR 기반 돌연변이유발을 사용하여 생성했다. IgG 분자를 HEK-EBNA 또는 HEK293 (CD9 Fc 변이체) 시스템에서 발현시키고, 단백질 A 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제했다.
실시예 2
면역글로불린에 대한 상이한 Fcγ 수용체의 결합 친화도의 측정
면역글로불린을 향한 상이한 FcγR 의 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 Biacore T100 기구 (GE Healthcare) 를 사용하여 25℃ 에서 측정했다.
BIAcore® 시스템은 분자 상호작용의 연구에 대해 잘 확립되어 있다. 그것은 리간드/분석물 결합의 연속적 실시간 모니터링 및 이에 따른 연합 속도 상수 (ka), 해리 속도 상수 (kd), 및 평형 상수 (KD) 의 측정을 허용한다. 굴절률의 변화는 고정된 리간드와 용액 중에 주사된 분석물의 상호작용에 의해 야기되는 표면 상의 질량 변화를 나타낸다. 분자가 표면 상의 고정된 리간드에 결합하는 경우 질량이 증가하고, 해리의 경우에 질량이 감소한다.
1:1 상호작용에 대해, 결합 분자가 표면 위에 주사되거나 또는 표면 위로 고정되는 경우에 결과에서 차이가 보이면 안된다. 그러므로 리간드 또는 상응하는 분석물의 용해도 및 이용가능성에 따라, 상이한 설정을 사용했다 (각각 분석물 또는 리간드로서 Fcγ 수용체를 사용).
FcγRI 의 경우, 10000 공명 유닛 (RU) 의, 폴리히스티딘 서열을 인지하는 포획 시스템 (pentaHis 모노클로날 항체, Qiagen Hilden, cat. no. 34660) 을 GE Healthcare 사제 아민 커플링 키트 및 CM5 칩을 pH 4.5 에서 사용하여 고정시켰다. FcγRI 은 5 ㎕/분 의 유동에서 60 초 의 펄스에 의해 5 ㎍/㎖ 의 농도로 포획되었다. 0 ~ 100 nM 범위의 상이한 농도의 항체를 30 ㎕/분 의 유속으로 유동 셀 (flow cell) 을 통해 298 K 에서 120 초 동안 통과시켜 연합 상을 기록했다. 해리 상을 240 초 이하 동안 모니터링하고, 샘플 용액으로부터 영동 완충제로 스윗칭하여 트리거링 (trigger) 했다. 표면을 글리신 pH 2 용액으로 30 ㎖/분 의 유속에서 2 분 세정하여 표면을 재생했다. 모든 실험에서 GE Healthcare 사제 HBS-P+ 완충제를 선택했다 (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) 계면활성제 P20). 포획된 FcγRI 이 없는 표면으로부터 수득된 반응을 뺄셈하여 벌크 (Bulk) 굴절률 차이를 보정했다. 블랭크 (Blank) 주사를 또한 뺄셈했다 (=이중 참조 (double referencing)).
BIA 평가 소프트웨어 패키지를 사용하여, 여러 상이한 농도로 수득된 센소그램 곡선을 분석함으로써, ka/kd 로서 정의되는, 평형 해리 상수 (KD) 를 결정했다. 데이타의 적합 (fitting) 은 적합한 결합 모델을 따랐다.
FcγRIIA 및 FcγRIIIAV158 의 경우, 10000 공명 유닛 (RU) 의 시험되는 모노클로날 항체를 GE 사제 아민 커플링 키트를 사용하여 CM5 칩 위에 고정시켰다 (pH 4.5, 10 ㎍/㎖ 의 농도로).
0 ~ 12800 nM 범위의 상이한 농도의 FcγRIIA 및 IIIA 를 5 ㎕/분 의 유속으로 유동 셀을 통해 298 K 에서 120 초 동안 통과시켜 연합 상을 기록했다. 해리 상을 240 초 이하 동안 모니터링하고, 샘플 용액으로부터 영동 완충제로 스윗칭하여 트리거링했다. 3 mM NaOH/1M NaCl 용액으로 30 ㎖/분 의 유속에서 0,5 분 세정하여 표면을 재생했다. 모든 실험에서 GE Healthcare 사제 HBS-P+ 완충제를 선택했다 (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) 계면활성제 P20).
포획된 항체가 없는 표면으로부터 수득된 반응을 뺄셈하여 벌크 굴절률 차이를 보정했다. 블랭크 주사를 또한 뺄셈했다 (=이중 참조).
BIA 평가 소프트웨어 패키지를 사용하여, 여러 상이한 농도로 수득된 센소그램 곡선을 분석함으로써, 평형 해리 상수 (KD) 를 결정했다. 데이타의 적합은 정상 상태 적합 (steady state fitting) 을 사용하는 적합한 결합 모델을 따랐다.
FcγRIIB 의 경우, 10000 공명 유닛 (RU) 의 폴리히스티딘 서열을 인지하는 포획 시스템 (pentaHis 모노클로날 항체, Qiagen Hilden, cat. no. 34660) 을 GE Healthcare 사제 아민 커플링 키트 및 CM5 칩을 pH 4.5 에서 사용하여 고정시켰다. FcγRIIB 가 5 ㎕/분 의 유속에서 120 초 의 펄스로 5 ㎍/㎖ 의 농도로 포획되었다. 상이한 항체를 1340 nM 의 농도에서 5 ㎕/분 의 유속으로 유동 셀을 통해 298 K 에서 60 초 동안 통과시켜 연합 상을 기록했다. 해리 상을 120 초 이하 동안 모니터링하고, 샘플 용액으로부터 영동 완충제로 스윗칭하여 트리거링했다. 글리신 pH2.5 용액으로 30 ㎖/분 의 유속에서 0,5 분 세정하여 표면을 재생했다. 모든 실험에서 GE Healthcare 사제 HBS-P+ 완충제를 선택했다 (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) 계면활성제 P20).
포획된 FcγRIIB 가 없는 표면으로부터 수득된 반응을 뺄셈하여 벌크 굴절률 차이를 보정했다. 블랭크 주사를 또한 뺄셈했다 (=이중 참조).
야생형 IgG1 에 대한 FcγRIIB 의 매우 낮은 고유 친화도로 인해 친화도가 계산되지 않았고, 대신에 정성적 결합이 평가되었다.
하기 표는 Fc 부분 내로 돌연변이를 도입한 것이, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, 및 FcγRIIIAV1-58 에 대한 결합에 미친 효과 (A), 뿐만 아니라 ADCC (표적 세포를 사용하지 않고 측정함 (BLT), 표적 세포를 사용하여 측정함 (ADCC)) 및 C1q 결합에 미친 효과 (B) 를 요약한다.
표 2A:
Figure pat00002
표 2B:
Figure pat00003
더욱 상세히 하기 결과가 수득되었다:
FcγRI 수용체에 대한 친화도
P329G, P329A, SPLE 및 LALA 돌연변이를 P-셀렉틴, CD20 및 CD9 항체의 Fc 폴리펩티드 내로 도입하고, FcγRI 에 대한 결합 친화도를 Biacore 시스템으로 측정했다. P329G 돌연변이를 갖는 항체는 여전히 FcγR1 에 결합하지만 (도 1a 및 1b), 3중 돌연변이 P329G / LALA 및 P329G / SPLE 의 도입은, 각각, 결합이 거의 탐지될 수 없었던 항체를 초래했다 (도 1b). LALA 또는 SPLE 돌연변이는 수용체에 대한 결합을 P329G 단독보다는 크게, 그러나 P329G 와의 조합보다는 적게 감소시켰다 (도 1a 및 1b). 따라서, P329G 와 LALA 또는 SPLE 돌연변이 중 하나의 조합은 P329G 돌연변이 또는 이중 돌연변이 LALA 또는 SPLE 단독보다 훨씬 더 효과적이다. CD20 IgG1 야생형 항체에 대한 kd 값은 4.6 nM 였고, 동일한 항체의 P329G 돌연변이체에 대한 kd 값은 5.7 nM 였으나, 3중 돌연변이체 P329G/LALA 에 대해서는 FcγRI 수용체에 대한 항체의 결합이 거의 탐지불가능했기 때문에 kd 값이 측정될 수 없었다. 항체 자체는, 즉 CD9 또는 CD20 또는 P-셀렉틴 중 어느 것이 시험되었든지 간에, 결합 친화도에 대한 효과가 작다.
FcγRIIA 수용체에 대한 친화도
P329G, SPLE 및 LALA 돌연변이를 각각 CD9 항체의 Fc 폴리펩티드 내로 도입하고, FcγRIIA-R131 수용체에 대한 결합 친화도를 Biacore 시스템으로 측정했다. 예컨대 포획된 mAb 가 100 RU 을 나타내도록 결합 수준을 표준화시켰다. 따라서 1:1 화학량론에 대해 대략 20 RU 이하가 예상되었다. 도 1c 는 LALA, SPLE/P329G, P329G 및 LALA/P329G 돌연변이를 Fc 변이체 내로 도입함으로써 FcγRIIA 수용체에 대한 결합이 크게 감소됨을 보여준다. FcγR1 수용체에 대한 결합과 대조적으로, P329G 돌연변이 단독의 도입은, 3중 돌연변이 P329G / LALA 와 다소 유사한 정도로, 상기 수용체에 대한 결합을 매우 크게 차단할 수 있었다 (도 1c).
FcγRIIB 수용체에 대한 친화도
SPLE, LALA, SPLE/P329G 및 LALA/P329G 돌연변이를 각각 CD9 및 P-셀렉틴 항체의 Fc 폴리펩티드 내로 도입하고, FcγRIIB 수용체에 대한 결합 친화도를 Biacore 시스템으로 측정했다. 도 1d 는 FcγRIIB 수용체에 대한 결합이 LALA 및 3중 돌연변이체 P329G/LALA, P329G / SPLE 에서 크게 감소됨을 보여준다.
FcγRIIIA 수용체에 대한 친화도
P329G,LALA, SPLE, P329G / LALA, 및 SPLE / P329G 돌연변이를 CD9 의 Fc 폴리펩티드 내로 도입하고, FcγRIIIA-V158 수용체에 대한 결합 친화도를 Biacore 시스템으로 측정했다. P329G 돌연변이 및 3중 돌연변이 P329G / LALA 는 FcγRIIIA 수용체에 대한 결합을 가장 크게, 거의 탐지불가능한 수준으로 감소시켰다. P329G/SPLE 도 또한 크게 감소된 결합 친화도를 초래했고, 돌연변이 SPLE 및 LALA 는 각각 FcγRIIIA 수용체에 대한 결합 친화도를 오직 약간 감소시켰다 (도 1e).
실시예 3
C1Q ELISA
C1q 에 대한 상이한 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 결합 특성을 ELISA 샌드위치 유형 면역검정에 의해 분석했다. 각각의 변이체를 소수성 Maxisorp 96 웰 플레이트에 10 ㎍/㎖ 와 0 ㎍/㎖ 사이의 8 가지 농도로 커플링시킨다. 이러한 커플링은 C1q 분자의 높은 친화도 결합의 전제조건인 항체의 복합체를 시뮬레이션한다. 세정 후, 샘플을 인큐베이션하여 C1q 결합을 허용한다. 추가의 세정 후 결합된 C1q 분자를 폴리클로날 토끼 항-hC1q 항체로 탐지한다. 다음 세정 단계 후에, 효소 표지된 항-토끼-Fcγ 특이적 항체를 첨가한다. 효소에 의해 유색 생성물로 전환되는 기질을 첨가하여 면역 반응을 가시화한다. 광도계로 측정된, 결과로서 얻어지는 흡광도는 조사되는 항체에 결합된 C1q 의 양에 비례한다. 변이체- C1q 상호작용의 EC50 값을 계산했다. 착색 반응으로부터 초래되는 흡수 유닛 (absorption unit) 을 항체의 농도에 대해 도표를 그린다. 반 최대 반응에서의 항체 농도가 EC50 값을 결정한다. 이러한 판독 (read-out) 이 샘플 및 참조의 변동 계수와 함께 동일한 플레이트 상에서 측정된 참조 표준에 대한 상대 오차로서 보고되어 있다.
P-셀렉틴 또는 CD20 항체 내로 도입된 P329G 돌연변이는 SPLE 돌연변이와 유사하게 C1q 에 대한 결합을 크게 감소시켰다 (도 2). 표 3 은 C1q 수용체에 대한 변이체의 결합에 대해 계산된 EC 50 값을 요약한다. C1q 는 보체 활성화 단백질에 속하고, 막 공격 복합체의 형성을 초래하는 보체의 고전적 경로의 활성화에서 중요한 역할을 수행한다. C1q 는 또한 다른 면역 반응 예컨대 식세포작용의 증강, 사멸 세포의 청소 또는 바이러스의 중화에 관여한다. 따라서, 본원에서 C1q 에 대한 결합을 감소시키는 것으로 보여진 돌연변이체, 예를 들어 P329G 및 SPLE, 뿐만 아니라 매우 틀림없이 또한 위에서 언급된 단일 돌연변이를 포함하는 3중 돌연변이는 C1q 의 위에서 언급된 기능을 크게 감소시킬 것으로 예상될 수 있다.
표 3:
Figure pat00004
실시예 4
표적 세포를 사용하지 않는 ADCC, BLT 검정
시험되는 항체 (CD20 (GA101) 및 CD9) 를 적합한 96-넓적 바닥 웰 플레이트 내에서 4℃ 에서 밤새 PBS 중에서 코팅했다. 플레이트를 PBS 로 세정한 후, 남은 결합 자리를 PBS/1 % BSA 용액으로 1 h 동안 RT 에서 차단했다. 그 동안, 효과기 세포 (낮은 또는 높은 아핀 (affine) 인간 FcγRIII 을 발현하도록 트랜스펙션된 NK-92 세포주) 를 수확하고, 차단 완충제를 폐기한 후 웰 내로 100 ㎕/웰 AIM V 배지 중에 200 000 개 생 세포/웰 을 파종했다. 100 ㎕/웰 사포닌 완충제 (PBS 중 0.5 % 사포닌 + 1 % BSA) 를 사용하여 효과기 세포에 의한 최대 에스테라제 방출을 측정했다. 세포를 인큐베이터 내에서 3 h 동안 37℃, 5 % CO2 에서 인큐베이션했다. 3 h 후, 20 ㎕/웰 의 상청액을 180 ㎕/웰 BLT 기질 (0.1 M Tris-HCL, pH 8.0 중 0.2 mM BLT + 0.11 mM DTNB) 과 혼합하고, 마이크로플레이트 판독기에서 405 ㎚ 에서 플레이트를 판독하기 전에 30 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. 최대 방출 (사포닌-처리된 세포) 을 100 % 로 그리고 미자극 세포 (ab 코팅되지 않음) 를 0 % 방출로 설정하여 에스테라제 방출의 백분율을 확인했다.
야생형 CD20 항체 (GA101 wt (1)) 는 세포용해 활성의 강한 유도를 보인다. LALA 변이체는 에스테라제 방출에서 현저한 감소를 보이지만, P329G 및 P329G / LALA 변이체는 어떠한 ADCC 활성도 보이지 않는다 (도 3a). 도 3b 는 위치 P329 에서의 G 의 교환 뿐만 아니라 P329 의 R329 로의 교환 (CD20 항체) 도 현저히 감소된 세포기질 활성을 초래함을 보여준다. 따라서 아르기닌은 글리신과 유사하게 항체 내에서 프롤린 샌드위치의 기능을 파괴하는 것으로 보인다. 여기서 P329G 돌연변이체에 대해 관찰된 크게 감소된 ADCC 는 아마도 FcγRIIA 및 FcγRIIIA 수용체에 대한 크게 감소된 결합으로부터 초래되었을 것이다 (도 1c 및 도 1e 참조).
실시예 5
표적 세포를 사용하는 ADCC
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 효과기 세포로서 사용했고, Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO63178 USA) 를 기본적으로 제조사의 지침에 따라 사용하여 제조했다. 간략히, 정맥 혈액을 헤파린처리된 주사기로 자원자로부터 채취했다. 혈액을 PBS (Ca++ 또는 Mg++ 을 함유하지 않음) 로 1:0.75-1.3 희석하고, Histopaque-1077 위에 층을 만들었다. 그래디언트 (gradient) 를 400 x g 에서 30 분 동안 실온 (RT) 에서 중단 없이 원심분리했다. PBMC 를 함유하는 중간상 (interphase) 을 수집하고, PBS (2 개의 그래디언트로부터의 세포 당 50 ㎖) 로 세정하고, 300 x g 에서 10 분 동안 RT 에서 원심분리에 의해 수확했다. 펠렛을 PBS 로 재현탁시킨 후, PBMC 를 계수하고, 두번째 세정하고, 200 x g 에서 10 분 동안 RT 에서 원심분리했다. 그 후 후속 절차를 위해 세포를 적당한 배지에 재현탁시켰다. ADCC 검정에 사용된 효과기 대 표적 비는 PBMC 및 NK 세포에 대해 각각 25:1 및 10:1 이었다. 둥근 바닥 96 웰 플레이트의 웰 당 50 ㎖ 를 첨가하기 위해, 효과기 세포를 AIM-V 배지 중에 적당한 농도로 준비했다. 표적 세포는 10% FCS 를 함유하는 DMEM 에서 성장시킨 인간 B 림프종 세포 (예를 들어, Raji 세포) 였다. 표적 세포를 PBS 중에서 세정하고, 계수하고, 마이크로웰 당 100 ㎖ 중 30'000 세포를 첨가하기 위해 0.3 백만/㎖ 으로 AIM-V 에 재현탁시켰다. 항체를 AIM-V 중에 희석하고, 미리 플레이팅한 (pre-plated) 표적 50 ㎖ 중에 세포에 첨가하고, 10 분 동안 RT 에서 표적에 결합하도록 놔두었다. 그 후 효과기 세포를 첨가하고, 플레이트를 5% CO2 를 함유하는 가습된 분위기 중에 37℃ 에서 4 시간 동안 인큐베이션했다. 세포독성 탐지 키트 (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland) 를 사용하여 손상된 세포로부터 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 방출을 측정하여 표적 세포의 사멸을 평가했다. 4-시간 인큐베이션 후 플레이트를 800 x g 에서 원심분리했다. 각각의 웰로부터의 100 ㎖ 상청액을 새로운 투명 넓적 바닥 96 웰 플레이트로 옮겼다. 웰 1 개 당 100 ㎖ 의 색 기질 완충제를 첨가했다. 색 반응의 Vmax 값을 ELISA 판독기에서 490 ㎚ 에서 10 분 이상 동안 SOFTmax PRO 소프트웨어 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA) 를 사용하여 측정했다. 오직 표적 및 효과기 세포만을 함유하고 항체는 함유하지 않는 웰로부터 자발적 LDH 방출이 측정되었다. 오직 표적 세포 및 1% Triton X-100 만을 함유하는 웰로부터 최대 방출이 측정되었다. 특이적 항체-매개성 사멸의 백분율을 다음과 같이 계산했다: ((x-SR)/(MR - SR)*100 [식 중, x 는 특이적 항체 농도에서의 Vmax 의 평균이고, SR 은 자발적 방출의 Vmax 의 평균이고, MR 은 최대 방출의 Vmax 의 평균임].
면역-효과기 세포를 동원하는 효능은 Fc 변이체의 유형에 의존하며, 이는 고전적 ADCC 검정에 의해 측정된다. 여기에서, 인간 FcγRIIIA 로 트랜스펙션된 인간 NK92 세포주를 효과기로서 사용했고, CD20 양성 Raji 세포를 표적 세포로서 사용했다. 도 4a 에서 알 수 있는 바와 같이 ADCC 는 글리신이 프롤린을 대체하는 GA101 (CD20) Fc 변이체 (P329G) 에서, 그리고 또한 이중 돌연변이체 P329G / LALA 에서도 유사한 정도로 크게 감소된다. 대조적으로 ADCC 감소는 LALA 돌연변이의 경우에 더 작았다. 상이한 변이체 사이를 더 잘 구별하기 위해, 변이체를 또한 글리코엔지니어드 버전으로도 생성하여 ADCC 효능을 증가시켰다. 예상된 바와 같이 부모 분자 (GA101 (CD20)) 가 큰 ADCC 를 보이는 것이 관찰될 수 있다. LALA 버전은 그것의 ADCC 효능이 크게 손상되어 있다. P329G 돌연변이체는 ADCC 를 매우 크게 감소시켰고; GA101 (CD20) 항체의 P329A 변이체보다 훨씬 더 많이 감소시켰다 (도 4b).
실시예 6
보체 활성
표적 세포를 계수하고, PBS 로 세정하고, AIM-V (Invitrogen) 에 1 백만 세포/㎖ 로 재현탁시켰다. 넓적 바닥 96 웰 플레이트 내에 웰 당 50 ㎖ 세포를 플레이팅했다. 항체 희석물을 AIM-V 중에 제조하고, 50 ㎖ 중에 세포에 첨가했다. 항체가 10 분 동안 실온에서 세포와 결합되게 놔두었다. 인간 혈청 보체 (Quidel) 를 새로이 해동하고, AIM-V 로 3-배 희석하고, 50 ㎖ 중에 웰에 첨가했다. 토끼 보체 (Cedarlane Laboratories) 를 제조사에 의해 기재된 바와 같이 제조하고, AIM-V 로 3-배 희석하고, 50 ㎖ 중에 웰에 첨가했다. 대조군으로서, 보체 공급원을 검정에 첨가하기 전에 30 분 동안 56℃ 에서 가열했다. 검정 플레이트를 2 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. LDH 방출을 측정함으로써 세포의 사멸을 확인했다. 간략히, 플레이트를 300 x g 에서 3 분 동안 원심분리했다. 웰 당 50 ㎖ 상청액을 새로운 96 웰 플레이트로 옮기고, 50 ㎖ 의 세포독성 키트 (Roche) 로부터의 검정 시약을 첨가했다. ELISA 판독기에 의한 동역학적 측정 (kinetic measurement) 으로 상청액 중 LDH 농도에 부합하는 Vmax 를 확인했다. 1% Triton X-100 의 존재 하에 세포를 인큐베이션하여 최대 방출을 측정했다.
상이한 Fc 변이체가 SUDH-L4 표적 세포에서 CDC 를 유도하는 것에 대해 분석되었다. 비-글리코엔지니어드 GA101 분자는 CDC 의 명백한 유도를 나타냈다. LALA 변이체는 오직 최고 농도에서만 활성을 나타내지만, P329G 및 P329G/LALA 변이체는 어떠한 CDC 활성도 나타내지 않는다 (도 5a). 더욱이, 글리코엔지니어드 GA101 분자의 LALA 변이체 뿐만 아니라 P329G 및 P329A 변이체는 어떠한 CDC 활성도 나타내지 않는다 (도 5b).
실시예 7
인간 IgG1 의 탄수화물 프로파일
Fcγ 수용체에 대한 결합을 소멸시키는 것을 목표로 하는, Fc 내에 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 항체의 탄수화물 프로파일을 MALDI/TOF-MS 에 의해 양이온 모드 (중성 올리고당) 에서 분석했다.
인간 (h) IgG1 변이체를 시알리다제 (QA-Bio) 로 제조사의 지침에 따라 처리하여 말단 시알산을 제거했다. 그 후 이전에 기재된 바와 같이 (Ferrara, C. et al., Biotech. Bioeng. 93 (2006) 851-861) PNGase F (QA-Bio) 소화에 의해 hIgG1 의 중성 올리고당을 방출시켰다. 이전에 기재된 바와 같이 (Ferrara, C. et al., Biotech. Bioeng. 93 (2006) 851-861) 질량 분석기 (Autoflex, Bruker Daltonics GmbH) 에 의해 양이온 모드에서 탄수화물 프로파일이 분석되었다.
인간 IgG1 의 중성 Fc-연합된 글리칸의 탄수화물 프로파일은, 0 개 (G0), 1 개 (G1) 또는 2 개 (G2) 의 말단 갈락토스 잔기를 갖는 푸코실화된 복합체 올리고당에 배정될 수 있는, 3 개의 주된 m/z 피크에 의해 특징지어진다.
Fc 수용체에 대한 결합을 소멸시키는 것을 목표로 하는, Fc 내에 돌연변이를 함유하는 hIgG1 의 탄수화물 프로파일을 분석했고, 야생형 항체에 대해 수득된 값과 비교했다. Fc 내에 하나의 돌연변이를 함유하는 IgG 변이체 (P329G, LALA, P329A, P329G/LALA) 는 야생형 항체와 유사한 탄수화물 프로파일을 보이며, Fc-연합된 글리칸이 푸코실화된 복합체 올리고당이다 (데이타는 제시되지 않음). 위치 241, 243, 263, 265, 또는 301 에서의 아미노산을 알라닌으로 대체함으로써 관찰되는 바와 같이, Fc 내의 돌연변이는 말단 갈락토실화 및 말단 시알릴화의 수준에 영향을 미칠 수 있다 (Lund, J. et al., J. Immunol. 157 (1996) 4963-4969).
도 6a 는 본원에 기재된 상이한 hIgG1 Fc-변이체에 대한 갈락토실화의 상대적 백분율을 보여준다. 항체가 상이한 숙주에서 발현될 때 약간의 차이가 관찰될 수 있으나, 말단 갈락토실화에서 유의한 차이는 관찰할 수 없었다.
도 6b 는 4 개의 상이한 항체에 대한 야생형 및 IgG1-P329G / LALA 에 대한 갈락토실화 함량의 변이를 나타내며, 이 경우 4 개의 상이한 V-도메인이 Hek293 EBNA 세포에서 발현되었을 때 그들의 갈락토실화의 양에 관해 비교되었다.
실시예 8
전혈 검정에서의 항체-유도성 혈소판 응집.
Dynabyte 사제 멀티플레이트 (Multiplate) 기구를 사용하는 전혈 혈소판 응집 분석. 먼저, 정상 인간 공여체로부터 20 ㎖ 혈액을 채취하고, 히루이딘 (hiruidin) 튜브 내로 옮겼다 (Dynabyte Medical, # MP0601). 검정을 위해 멀티플레이트 기구 내에 플러그 미니 셀 임피던스 장치 (Plug minicell impedance device) (Dynabead #MP0021) 를 사용했다. 그 후, 175 ㎕ 0.9 % NaCl 을 미니셀에 첨가했다. 항체를 미니셀에 첨가하여 최종 시험 농도를 수득했다. 그 후, 175 ㎕ 인간 혈액을 첨가하고, 3 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. 부가적 6 분 동안 37℃ 에서 임피던스 분석의 자동화된 시작. 데이타가 혈소판 응집의 측정으로서 곡선하면적의 정량화에 의해 분석되었다.
CD9 항체는 혈소판 활성화 및 혈소판 응집을 유도하는 것으로 밝혀졌다 (Worthington, et al., Br. J. Hematol. 74(2) (1990) 216-222). 혈소판에 대한 항체 결합에 의해 유도되는 혈소판 응집은 FcγRIIA 에 대한 결합을 수반하는 것으로 이전에 밝혀졌다 (de Reys, et al., Blood 81 (1993) 1792-1800). 위에 제시된 바와 같이 CD9 항체 내로 도입된 돌연변이 LALA, P329G, P329G/LALA 및 P329G/SPLE 는 FcγRIIA 수용체에 대한 CD9 항체의 결합을 크게 감소시켰다 (도 1c).
항체 내로 P329G 및 LALA 3중 돌연변이를 도입하여 FcγRIIA 결합이 야생형 항체 크게 감소되게 함으로써, CD9 항체에 의해 유도되는 활성화 (Ca 유출에 의해 측정됨 데이타는 제시되지 않음) 뿐만 아니라 혈소판 응집이 소멸되었다 (도 7a 및 7b 참조). 쥐 IgG1 은 낮은 항체 농도 (0.1-1 μ/㎖) 에서 혈소판 응집을 유도했다. 더 높은 농도에서 혈소판의 과자극운 응집 반응의 침묵을 초래한다 (3-30 ㎍/㎖). chim-hu-IgG4-SPLE 의 경우 공여체 변이성이 관찰되었다. 도 6a 에는 더 높은 항체 농도에서의 chim-hu-IgG4-SPLE 반응자에 대한 데이타가, 도 6b 에는 chim-hu-IgG4-SPLE 비-반응자에 대한 데이타가 제시되어 있다. 어떠한 혈액 샘플도 항체 변이체 chim-hu-IgG1-LALA, chim-hu-IgG-WT-P329G, chim-hu-IgG1-LALA-P329G, chim-hu-IgG4-SPLE-P329G, chim-hu-IgG4-SPLE-N297Q 와 응집 반응을 보이지 않았다. 대조군: 미처리 혈액 샘플 중 자발적 응집 (배경); ADP-유도성 (ADP) 및 트롬빈 아날로곤-유도성 (TRAP6) 혈소판 응집. 아이소타입 대조군: 쥐 IgG1 (쥐 아이소타입) 및 인간 IgG4-SPLE (hu-IgG4-SPLE 아이소타입).
이러한 데이타의 하나의 가능한 해석은 3중 돌연변이를 갖는 CD9 항체의 FcγRIIA 수용체에 대한 감소된 결합이, 이러한 종류의 돌연변이체 항체에서 관찰되는 감소된 혈소판 응집의 원인이라는 것이다. 원칙적으로, FcγRIIA 수용체에 대한 결합을 감소시킬 수 있는 위에서 언급된 돌연변이를 항체의 Fc 부분 내로 도입함으로써, 항체 치료의 독성 부작용인 혈소판 응집을 방지하는 것이 가능할 것이다.
<110> Roche Glycart AG <120> Antibody Fc Variants <130> 27397 WO <150> EP11160251 <151> 2011-03-29 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 2 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser 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Claims (11)

  1. 야생형 인간 IgG1 Fc 영역의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Fc 변이체는, 야생형 인간 Fc 영역의 Pro329 가 글리신으로 치환되는 위치 Pro329 에서의 아미노산 치환, 및 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A 인 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 포함하고, 잔기는 Kabat 의 EU 인덱스에 따라 번호지정되는 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 야생형 인간 IgG1 폴리펩티드가 ADCC 를 유도하고, 상기 IgG1 Fc 변이체 폴리펩티드에 의해 유도되는 ADCC 가, 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 ADCC 의 0 - 20 % 까지 감소되는 폴리펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드가, 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해, 효과기 기능을 책임지는 Fc 수용체에 대해 감소 또는 제거된 친화도를 나타내는 폴리펩티드.
  4. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 Fc 융합 단백질인 폴리펩티드.
  5. 제 1 항에 있어서, 야생형 인간 IgG1 폴리펩티드가 혈소판 응집을 유도하고, 상기 IgG1 Fc 변이체 폴리펩티드에 의해 유도되는 혈소판 응집이, 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 혈소판 응집에 비해 감소되는 폴리펩티드.
  6. 제 1 항에 있어서, 야생형 인간 IgG1 폴리펩티드가 CDC 를 유도하고, 상기 IgG1 Fc 변이체 폴리펩티드에 의해 유도되는 CDC 가, 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도되는 CDC 에 비해 크게 감소되는 폴리펩티드.
  7. 제 1 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 폴리펩티드.
  8. 제 1 항에 있어서, 암, 염증성 질환, 당뇨병 및 신경 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료에 사용하기 위한 폴리펩티드.
  9. 제 7 항에 있어서, FcγRIIIA, FcγRIIA 및 FcγRI 수용체를 하향 조절하는데 유리하고, 질환의 치료에 사용하기 위한 폴리펩티드.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암, 염증성 질환, 당뇨병 및 신경 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료에 사용하기 위한 약학적 제형.
  11. 제 10 항에 있어서, FcγRIIIA, FcγRIIA 및 FcγRI 수용체를 하향 조절하기 위한 약학적 제형.
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