JP7359864B2 - クローディン6結合分子およびその使用 - Google Patents
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Description
抗CLDN6抗体に関して、CLDN6に対する単一特異性抗体は、CLDN6陽性がん細胞株に対してADCC活性または内部移行活性を有することが報告されている(特許文献1~特許文献5)。これまでに、6PHU3と名付けられた、CLDN6を標的とするT細胞リダイレクティング二重特異性抗体が、抗CD3/抗CLDN6特異性を有する二重特異性sc(Fv)2形式を用いて作られている(特許文献6~特許文献7)。前臨床評価において、6PHU3は、in vitroおよびin vivoでがん細胞の強力な殺傷を示すことが報告されている(非特許文献20)。
[1] それぞれ配列番号: 113、117、および118のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む第1の重鎖可変領域;
それぞれ配列番号: 119、120、および121のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む第1の軽鎖可変領域;
それぞれ配列番号: 122、123、および124のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む第2の重鎖可変領域;ならびに
それぞれ配列番号: 114、115、および116のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む第2の軽鎖可変領域
を含む、単離された抗体。
[2] 配列番号: 85、1、33、および84より選択されるアミノ酸配列を含む第1の重鎖可変領域;ならびに配列番号: 87、2、43、86、および88より選択されるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖可変領域;
配列番号: 60および70より選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖可変領域;ならびに配列番号: 61および71より選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖可変領域
を含む、単離された抗体。
[3] 第1の重鎖可変領域が配列番号: 95に示される第1のCH1ドメインに連結され、第1の軽鎖可変領域が配列番号: 63に示される第1のCLドメインに連結され、第2の重鎖可変領域が配列番号: 97に示される第2のCH1ドメインに連結され、かつ第2の軽鎖可変領域が配列番号: 62に示される第2のCLドメインに連結されている、[1] または [2] に記載の抗体。
[4] (1) 配列番号: 72に示される第1のFc領域、および配列番号: 73に示される第2のFc領域;
(2) 配列番号: 74に示される第1のFc領域、および配列番号: 75に示される第2のFc領域;
(3) 配列番号: 76に示される第1のFc領域、および配列番号: 77に示される第2のFc領域;ならびに
(4) 配列番号: 78に示される第1のFc領域、および配列番号: 79に示される第2のFc領域
より選択されるFc領域の組み合わせのうちのいずれか1つをさらに含む、[1]~[3] のいずれか1つに記載の抗体。
[5] 第1のFc領域が第1の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖内にあり、かつ第2のFc領域が第2の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖内にある、[4] に記載の抗体。
[6] 第1の重鎖可変領域と第1の軽鎖可変領域が第1の抗原結合部位を形成し、かつ第2の重鎖可変領域と第2の軽鎖可変領域が第2の抗原結合部位を形成する、[1]~[5] のいずれか1つに記載の抗体。
[7] 配列番号: 104、105、106、および107より選択されるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、ならびに配列番号: 112に示されるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖;
配列番号: 108、109、110、および111より選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、ならびに配列番号: 98に示されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
含む、単離された抗体。
[8] 第1の重鎖と第1の軽鎖の可変領域が第1の抗原結合部位を形成し、かつ第2の重鎖と第2の軽鎖の可変領域が第2の抗原結合部位を形成する、[7] に記載の抗体。
[9] 第1の抗原結合部位がCLDN6に対する結合活性を有する、[6] または [8] に記載の抗体。
[10] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[6]、[8]、および [9] のいずれか1つに記載の抗体。
[11] 第1の抗原結合部位が、配列番号: 125または126に規定されるヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[6] および [8]~[10] のいずれか1つに記載の抗体。
[12] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN9に実質的に結合しない、[6] および [8]~[11] のいずれか1つに記載の抗体。
[13] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN4に実質的に結合しない、[6] および [8]~[12] のいずれか1つに記載の抗体。
[14] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN3に実質的に結合しない、[6] および [8]~[13] のいずれか1つに記載の抗体。
[15] 第1の抗原結合部位が、配列番号: 134に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない、[6] および [8]~[14] のいずれか1つに記載の抗体。
[16] 第2の抗原結合部位がCD3に対する結合活性を有する、[6] および [8]~[15] のいずれか1つに記載の抗体。
[17] 第2の抗原結合部位がCD3ε鎖に対する結合活性を有する、[6] および [8]~[16] のいずれか1つに記載の抗体。
[18] 第2の抗原結合部位が、配列番号:142に規定されるヒトCD3に対する結合活性を有する、[6] および [8]~[17] のいずれか1つに記載の抗体。
[19] [1]~[18] のいずれか1つに記載の抗体をコードする、単離された核酸。
[20] [19] に記載の核酸を含む宿主細胞。
[21] 抗体が産生されるように、[20] に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗体を産生する方法。
[22] 宿主細胞の培養から抗体を回収する段階をさらに含む、[21] に記載の方法。
[23] [1]~[18] のいずれか1つに記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[24] T細胞依存性細胞傷害を誘導する、[23] に記載の医薬組成物。
[25] がんの治療および/または予防のために使用される医薬組成物である、[23] または [24] に記載の組成物。
[26] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および/または予防のために使用される医薬組成物である、[23]~[25] のいずれか1つに記載の組成物。
[27] 医薬の製造における、[1]~[18] のいずれか1つに記載の抗体の使用。
[28] がんの治療および/または予防のための医薬の製造における、[1]~[18] のいずれか1つに記載の抗体の使用。
[29] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および/または予防のための医薬の製造における、[1]~[18] のいずれか1つに記載の抗体の使用。
[30] [1]~[18] のいずれか1つに記載の抗体の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を治療する方法。
[31] [1]~[18] のいずれか1つに記載の抗体の有効量を個体に投与する段階を含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんを有する個体を治療する方法。
[32] 少なくとも[1]~[18] のいずれか1つに記載の抗体と、使用説明書とを含む、がんの治療および/または予防において使用するためのキット。
[33] 少なくとも[1]~[18] のいずれか1つに記載の抗体と、使用説明書とを含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および/または予防において使用するためのキット。
[34] (a) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む重鎖可変領域:
(a1) それぞれ配列番号: 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列;ならびに
(a2) 配列番号: 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3;
ならびに
(b) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む軽鎖可変領域:
(b1) それぞれ配列番号: 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列;ならびに
(b2) 配列番号: 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む、抗原結合分子。
[35] 重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、マウス、ウサギ、ヒト化、またはヒトフレームワークを含む、[34] に記載の抗原結合分子。
[36] 配列番号: 85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、および57より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号: 87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82 および58より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗原結合分子。
[37] 重鎖可変領域と軽鎖可変領域が抗原結合部位を形成する、[34]~[36] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[38] 抗原結合部位がCLDN6に対する結合活性を有する、[37] に記載の抗原結合分子。
[39] 抗原結合部位が、配列番号: 125または126に規定されるヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[37] または [38] に記載の抗原結合分子。
[40] 抗原結合部位がヒトCLDN9に実質的に結合しない、[37]~[39] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[41] 抗原結合部位がヒトCLDN4に実質的に結合しない、[37]~[40] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[42] 抗原結合部位がヒトCLDN3に実質的に結合しない、[37]~[41] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[43] 抗原結合部位が、配列番号: 134に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない、[37]~[42] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[44] 抗体Fc領域をさらに含む、[37]~[43] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[45] Fc領域が、配列番号: 143~146(IgG1~IgG4)のFc領域構成アミノ酸のうちのいずれかに少なくとも1つのアミノ酸変異を有するFc領域である、[44] に記載の抗原結合分子。
[46] Fc領域が、糖鎖が付加したFc領域であり、Fc領域に付加したフコース欠損糖鎖の割合が天然IgG Fc領域のものよりも高いか、またはFc領域に付加されたバイセクト(bisecting)N-アセチルグルコサミンの割合が天然IgG Fc領域のものよりも高い、[44] または [45] に記載の抗原結合分子。
[47] 細胞傷害活性を有する、[34]~[46] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[48] 細胞傷害活性がADCCまたはCDCである、[47] に記載の抗原結合分子。
[49] 内部移行活性を有する、[34]~[46] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[50] 細胞傷害剤にコンジュゲートされている、[34]~[49] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[51] [34]~[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と、細胞傷害剤とを含む、イムノコンジュゲート。
[52] [34]~[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[53] がんの治療および/または予防のために使用される医薬組成物である、[52] に記載の組成物。
[54] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および/または予防のために使用される医薬組成物である、[52] または [53] に記載の組成物。
[55] 医薬の製造における、[34]~[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの使用。
[56] がんの治療および/または予防のための医薬の製造における、[34]~[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの使用。
[57] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および/または予防のための医薬の製造における、[34]~[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの使用。
[58] [34]~[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を治療する方法。
[59] [34]~[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与する段階を含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんを有する個体を治療する方法。
[60] 少なくとも[34]~[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートと、使用説明書とを含む、がんの治療および/または予防における使用のためのキット。
[61] 少なくとも[34]~[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートと、使用説明書とを含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および/または予防における使用のためのキット。
[62] 生体試料を、[34]~[41] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と接触させる段階を含む、生体試料中のCLDN6の存在を検出する方法。
[63] 抗原結合分子のCLDN6への結合を許容する条件下で、生体試料を抗原結合分子と接触させ、抗原結合分子とCLDN6との間で複合体が形成されるかどうかを検出する、[62] に記載の方法。
[64] 対象由来の生体試料を、[34]~[41] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と接触させる段階を含む、対象ががんを有するか否かを診断する方法。
[65] 抗原結合分子のCLDN6への結合を許容する条件下で、生体試料を抗原結合分子と接触させ、抗原結合分子とCLDN6との間で複合体が形成されるかどうかを検出する、[64] に記載の方法。
[66] がんが卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんである、[64] または [65] に記載の方法。
[67] [34]~[41] のいずれか1つに記載の抗原結合分子をコードする、単離された核酸。
[68] [67] に記載の核酸を含む宿主細胞。
[69] 抗原結合分子が産生されるように、[68] に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗原結合分子を産生する方法。
[70] 宿主細胞の培養から抗原結合分子を回収する段階をさらに含む、[69] に記載の方法。
[71] CLDN6に対する結合活性を有する第1の抗原結合部位、および
T細胞受容体複合体に対する結合活性を有する第2の抗原結合部位
を含む、抗原結合分子であって、
第1の抗原結合部位が、
(a) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む重鎖可変領域:
(a1) それぞれ配列番号: 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列;ならびに
(a2) 配列番号: 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3;
ならびに
(b) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む軽鎖可変領域:
(b1) それぞれ配列番号: 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列;ならびに
(b2) 配列番号: 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
によって形成される、抗原結合分子。
[72] 第1の抗原結合部位を形成する重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、マウス、ウサギ、ヒト化、またはヒトフレームワークをさらに含む、[71] に記載の抗原結合分子。
[73] CLDN6に対する結合活性を有する第1の抗原結合部位、および
T細胞受容体複合体に対する結合活性を有する第2の抗原結合部位
を含む、抗原結合分子であって、
第1の抗原結合部位が、配列番号: 85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、および57より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号: 87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82 および58より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗原結合分子。
[74] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[71]~[73] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[75] 第1の抗原結合部位が、配列番号: 125または126に規定されるヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[71]~[74] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[76] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN9に実質的に結合しない、[71]~[75] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[77] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN4に実質的に結合しない、[71]~[76] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[78] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN3に実質的に結合しない、[71]~[77] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[79] 第1の抗原結合部位が、配列番号: 134に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない、[71]~[78] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[80] 第1の抗原結合部位が単鎖Fv (scFv)、Fv、またはFab中に含まれる、[71]~[73] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[81] 第2の抗原結合部位がCD3に対する結合活性を有する、[71]~[80] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[82] 第2の抗原結合部位がCD3ε鎖に対する結合活性を有する、[71]~[80] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[83] 第2の抗原結合部位がT細胞受容体に結合する活性を有する、[71]~[80] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[84] 第2の抗原結合部位が、それぞれ配列番号: 122、123、および124のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域;ならびにそれぞれ配列番号: 114、115および116のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域によって形成される、[71]~[82] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[85] 重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、マウス、ウサギ、ヒト化、またはヒトフレームワークを含む、[84] に記載の抗原結合分子。
[86] 第2の抗原結合部位が、配列番号: 60および70より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号: 61および71より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域によって形成される、[71]~[82] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[87] 第2の抗原結合部位が単鎖Fv (scFv)、Fv、またはFab中に含まれる、[71]~[86] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[88] 抗体Fc領域をさらに含む、[71]~[87] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[89] Fc領域が、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である、[88] に記載の抗原結合分子。
[90] Fc領域が、 配列番号: 143~146(IgG1~IgG4)のFc領域構成アミノ酸のうちのいずれかに少なくとも1つのアミノ酸変異を有するFc領域である、[88] または [89] に記載の抗原結合分子。
[91] Fc領域が、EUナンバリングによって特定される以下のアミノ酸位置:
220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、および332位
より選択される少なくとも1つのアミノ酸の変異を有するFc領域である、[88]~[90] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[92] Fc領域が、EUナンバリングによって特定される以下のアミノ酸:
アミノ酸234位のArg、アミノ酸235位のAlaまたはArg、アミノ酸239位のLys、およびアミノ酸297位のAla
より選択される少なくとも1つのアミノ酸を含むFc領域である、[88]~[91] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[93] 第1の抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメインが、第1のCH1ドメインを介してFc領域に連結され、第1の抗原結合部位を形成する軽鎖可変ドメインが、第1のCLドメインに連結されており;かつ
第2の抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメインが、第2のCH1ドメインを介してFc領域に連結され、第2の抗原結合部位を形成する軽鎖可変ドメインが、第2のCLドメインに連結されている、
[88]~[92] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[94] 第1の抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域が、第1の抗原結合ドメインを形成する軽鎖可変領域と会合する、および/または第2の抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域が、第2の抗原結合ドメインを形成する軽鎖可変領域と会合するように、CH1ドメインおよびCLドメインの電荷が制御されている、[93] に記載の抗原結合分子。
[95] 細胞傷害活性を有する、[71]~[94] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[96] 細胞傷害活性がT細胞依存性細胞傷害活性である、[95] に記載の抗原結合分子。
[97] [71]~[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[98] [97] に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
[99] 抗原結合分子が産生されるように、[98] に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗体を産生する方法。
[100] 宿主細胞の培養から抗原結合分子を回収する段階をさらに含む、[99] に記載の方法。
[101] [71]~[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[102] T細胞依存性細胞傷害を誘導する、[101] に記載の医薬組成物。
[103] がんの治療および/または予防のために使用される医薬組成物である、[101] または [102] に記載の組成物。
[104] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および/または予防のために使用される医薬組成物である、[101]~[103] のいずれか1つに記載の組成物。
[105] 医薬の製造における、[71]~[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の使用。
[106] がんの治療および/または予防のための医薬の製造における、[71]~[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の使用。
[107] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および/または予防のための医薬の製造における、[71]~[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の使用。
[108] [71]~[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を治療する方法。
[109] [71]~[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の有効量を個体に投与する段階を含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんを有する個体を治療する方法。
[110] 少なくとも[71]~[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と、使用説明書とを含む、がんの治療および/または予防における使用のためのキット。
[111] 少なくとも[71]~[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と、使用説明書とを含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および/または予防における使用のためのキット。
アミノ酸
本明細書において、アミノ酸は、1文字コードもしくは3文字コードまたはその両方、例えば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、またはVal/Vによって記載される。
抗原結合分子のアミノ酸配列中のアミノ酸改変(本明細書内で「アミノ酸置換」とも称される)のためには、部位特異的変異誘発法(Kunkelら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))および重複伸長PCRなどの公知の方法が適宜採用され得る。さらに、非天然アミノ酸に置換するためのアミノ酸改変方法として、いくつかの公知の方法もまた採用され得る(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249;およびProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357)。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン(アンバーコドン)の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合したtRNAを含む無細胞翻訳系 (Clover Direct (Protein Express)) を用いることが適切である。
本明細書で用いられる用語「抗原結合分子」は、抗原結合部位を含む任意の分子または抗原に対する結合活性を有する任意の分子のことをいい、さらに、約5アミノ酸またはそれ以上の長さを有するペプチドまたはタンパク質などの分子のことをいい得る。ペプチドおよびタンパク質は、生物由来のものに限定されず、例えば人工的に設計された配列から製造されたポリペプチドであってもよい。それらはまた、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれかであってもよい。骨格としてα/βバレルなどの公知の安定した立体構造を含み、分子の一部が抗原結合部位となる骨格分子もまた、本明細書に記載される抗原結合分子の1つの態様である。
本明細書で用いられる用語「CLDN6」は、別段示さない限り、霊長類(例えば、ヒト)ならびにげっ歯類(例えば、マウスおよびラット)などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然型クローディン6のことをいう。ヒトCLDN6(hCLDN6)のアミノ酸配列は配列番号: 125または126に示され、マウスCLDN6 (mCLDN6) のアミノ酸配列は配列番号: 130に示される。
本明細書に記載されるCLDN6に対する結合活性は、本明細書に記載されるCLDN6タンパク質、またはCLDN6タンパク質の部分ペプチドの全体もしくは一部に対する特異的な結合活性のことをいう。
本明細書で用いられるT細胞受容体複合体に対する結合活性は、T細胞受容体複合体の部分ペプチドの全体または一部に対する結合活性のことをいう。T細胞受容体複合体は、T細胞受容体自体であってもよいし、またはT細胞受容体と共にT細胞受容体複合体を構成するアダプター分子であってもよい。CD3はアダプター分子として適している。
「アフィニティ」は、分子(例えば、抗原結合分子または抗体)の結合部位1個と、分子の結合パートナー(例えば、抗原)との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。別段示さない限り、本明細書で用いられる「結合アフィニティ」は、ある結合対のメンバー(例えば、抗原結合分子と抗原、または抗体と抗原)の間の1:1相互作用を反映する、固有の結合アフィニティのことをいう。分子XのそのパートナーYに対するアフィニティは、一般的に、解離定数 (Kd) により表すことができる。アフィニティは、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合アフィニティを測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子または抗体は、その抗原に対して、≦1μM、≦120nM、≦100nM、≦80nM、≦70nM、≦50nM、≦40nM、≦30nM、≦20nM、≦10nM、≦2nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM(例えば、10-8M以下、10-8M~10-13M、10-9M~10-13M)の解離定数 (Kd) を有する。特定の態様において、CLDN6に対する、抗体/抗原結合分子のKd値は、1~40、1~50、1~70、1~80、30~50、30~70、30~80、40~70、40~80、または60~80nMの範囲内に入る。
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス(アイソタイプ)に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン:FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH(またはVL)に現れる:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。一態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり(「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region))、および/または構造的に定まったループ(「超可変ループ」)を形成し、および/または抗原接触残基(「抗原接触」)を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのHVRを含む:VHに3つ(H1、H2、H3)、およびVLに3つ(L1、L2、L3)である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む:
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(それぞれVHおよびVL)は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。(例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。)1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
用語「キメラ」抗体は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体のことをいう。同様に、用語「キメラ抗体可変ドメイン」は、重鎖および/または軽鎖可変領域の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および/または軽鎖可変領域の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体可変領域のことをいう。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR(例えばCDR)は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体(例えば、非ヒト抗体)の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体のことをいう。「ヒト化抗体可変領域」は、ヒト化抗体の可変領域のことをいう。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。「ヒト抗体可変領域」は、ヒト抗体の可変領域のことをいう。
本明細書でいい換え可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことをいい、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および/またはそれらのアナログ、またはDNAもしくはRNAポリメラーゼによってまたは合成反応によってポリマーに組み込まれ得る任意の物質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列に、非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、標識へのコンジュゲーションなどの、合成後になされる修飾を含み得る。他のタイプの修飾は、例えば、「キャップ」、1つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドとアナログとの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバメート等)および荷電連結(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等)を伴うもの、例えばタンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等)などのペンダント部分を含むもの、インターカレート剤(例えば、アクリジン、ソラレン等)を伴うもの、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾連結(例えば、アルファアノマー核酸等)や非修飾形態のポリヌクレオチドを伴うものを含む。さらに、通常糖に存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置換され得、標準的な保護基によって保護され得、もしくはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を生成するよう活性化され得、または固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされ得る。5’および3’末端のOHは、リン酸化またはアミンもしくは1~20炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、例えば以下のものを含む、当技術分野で一般に公知となっているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含み得る:2'-O-メチル-、2'-O-アリル-、2'-フルオロ-、または2'-アジド-リボース、炭素環式糖アナログ、α-アノマー糖、アラビノースまたはキシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、およびメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシドアナログ。1つまたは複数のホスホジエステル結合は、代替の連結基によって置き換えられ得る。これらの代替の連結基は、これらに限定されるものではないが、ホスフェートが以下のものによって置き換えられている態様を含む:P(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR'、CO、またはCH2(「ホルムアセタール」)、ここで、各RまたはR'は独立してH、または、任意でエーテル(-O-)連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含む置換もしくは非置換アルキル(1~20C)である。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。上記の説明は、RNAおよびDNAを含む本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
「単離された」核酸分子は、そのもともとの環境の成分から分離されたものである。単離された核酸分子はさらに、その核酸分子を通常含む細胞中に含まれているが、染色体外にまたはその本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在する核酸分子を含む。
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。ベクターは、ウイルスまたはエレクトロポレーションを使用して宿主細胞に導入することができる。しかしながら、ベクターの導入はin vitro法に限定されない。例えば、ベクターは、in vivo法を使用して対象に直接導入することができる。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞(そのような細胞の子孫を含む)のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
「特異的」とは、1つまたは複数の結合パートナーに特異的に結合する分子が、該パートナー以外の分子に対して何ら有意な結合を示さないことを意味する。さらに、「特異的」とはまた、抗原結合部位が、抗原中に含まれる複数のエピトープのうちの特定のエピトープに特異的である場合にも用いられる。抗原結合分子が抗原に特異的に結合する場合、「抗原結合分子が抗原に対する特異性を有する/示す」とも記載される。抗原結合部位が結合するエピトープが複数の異なる抗原中に含まれる場合、該抗原結合部位を含む抗原結合分子は、該エピトープを有する様々な抗原に結合し得る。
「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ダイアボディ;線状抗体;単鎖抗体分子(例えば、scFv);および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
本明細書において、用語「可変断片(Fv)」は、抗体の軽鎖可変領域(VL)と抗体の重鎖可変領域(VH)とのペアから構成される抗体由来の抗原結合部位の最小単位のことをいう。1988年にSkerraとPluckthunは、細菌のシグナル配列の下流に抗体遺伝子を挿入し大腸菌中で当該遺伝子の発現を誘導することによって、均一でかつ活性な抗体が大腸菌のペリプラズム画分から調製され得ることを見出した(Science (1988) 240 (4855), 1038-1041)。ペリプラズム画分から調製されたFvにおいては、抗原に結合するような様式でVHとVLが会合している。
本明細書において、用語「scFv」、「単鎖抗体」、および「sc(Fv)2」はいずれも、重鎖および軽鎖に由来する可変領域を含むが、定常領域を含まない、単一ポリペプチド鎖の抗体断片のことをいう。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる所望の構造の形成を可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)」においてPluckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際公開公報WO1988/001649、米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照のこと。特定の態様において、単鎖抗体は、二重特異性でありかつ/またはヒト化され得る。
[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]
[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]
[VH]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VL]
[VL]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VH]
[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]
Ser
Gly Ser
Gly Gly Ser
Ser Gly Gly
Gly Gly Gly Ser(配列番号:147)
Ser Gly Gly Gly(配列番号:148)
Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号:149)
Ser Gly Gly Gly Gly(配列番号:150)
Gly Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号:151)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly(配列番号:152)
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号:153)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(配列番号:154)
(Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号:149))n
(Ser Gly Gly Gly Gly(配列番号:150))n
ここでnは1以上の整数である。ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
「Fab」は、1本の軽鎖、ならびに1本の重鎖のCH1ドメインおよび可変領域からなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
本明細書で用語「Fc領域」または「Fcドメイン」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン(Gly446-Lys447)は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム(EUインデックスとも呼ばれる)にしたがう。
用語「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体のことをいう。いくつかの態様において、FcRは、天然型ヒトFcRである。いくつかの態様において、FcRは、IgG抗体に結合するもの(ガンマ受容体)であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングによる形態を含めて、含む。FcγRII受容体は、FcγRIIA(「活性化受容体」)およびFcγRIIB(「阻害受容体」)を含み、これらは主としてその細胞質ドメインにおいて相違する類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM)を含む。(例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) を参照のこと。)FcRは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991);Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994);およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)において総説されている。将来同定されるものを含む他のFcRも、本明細書の用語「FcR」に包含される。
Fcγ受容体とは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインに結合し得る受容体のことをいい、これにはFcγ受容体遺伝子によって実質的にコードされるタンパク質のファミリーに属するすべてのメンバーが含まれる。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含むFcγRI (CD64);アイソフォームFcγRIIa(アロタイプH131およびR131を含む)、FcγRIIb(FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む)、およびFcγRIIcを含むFcγRII (CD32);ならびにアイソフォームFcγRIIIa(アロタイプV158およびF158を含む)およびFcγRIIIb(アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む)を含むFcγRIII (CD16);ならびに未同定のヒトFcγ受容体、Fcγ受容体アイソフォーム、およびそれらのアロタイプのすべてが含まれる。しかしながら、Fcγ受容体はこれらの例に限定されない。これらに限定されるわけではないが、Fcγ受容体には、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルに由来するものが含まれる。Fcγ受容体は任意の生物に由来してよい。マウスFcγ受容体には、これらに限定されないが、FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、FcγRIII (CD16)、およびFcγRIII-2 (CD16-2)、ならびに未同定のマウスFcγ受容体、Fcγ受容体アイソフォーム、およびそれらのアロタイプのすべてが含まれる。そのような好ましいFcγ受容体には、例えば、ヒトFcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32)、FcγRIIB (CD32)、FcγRIIIA (CD16)、および/またはFcγRIIIB (CD16) が含まれる。FcγRIのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号NM_000566.3およびRefSeq登録番号NP_000557.1に示され;FcγRIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC020823.1およびRefSeq登録番号AAH20823.1に示され;FcγRIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC146678.1およびRefSeq登録番号AAI46679.1に示され;FcγRIIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC033678.1およびRefSeq登録番号AAH33678.1に示され;ならびにFcγRIIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC128562.1およびRefSeq登録番号AAI28563.1に示される。Fcγ受容体がIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインに対する結合活性を有するかどうかは、上記のFACSおよびELISAフォーマットに加えて、ALPHAスクリーン(増幅発光近接ホモジニアスアッセイ)、表面プラズモン共鳴 (SPR) ベースのBIACORE法、およびその他によって評価することができる (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、および/またはFcγRIIIBのいずれかのFcγ受容体に対するFcドメインの結合活性が損なわれていることは、上記のFACSおよびELISAフォーマット、ならびにALPHAスクリーン(増幅発光近接ホモジニアスアッセイ)および表面プラズモン共鳴 (SPR) ベースのBIACORE法を用いることによって評価することができる (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
本明細書において、「Fcγ受容体結合活性が低下している」とは、例えば、上記の解析方法に基づいて、被験抗原結合分子または抗体の競合活性が、対照抗原結合分子または抗体の競合活性の50%以下、好ましくは45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、20%以下、または15%以下、および特に好ましくは10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、または1%以下であることを意味する。
(a) L234F、L235E、P331S;
(b) C226S、C229S、P238S;
(c) C226S、C229S;または
(d) C226S、C229S、E233P、L234V、L235A;
ならびに、231~238位のアミノ酸配列が欠失しているFcドメインを有するものが含まれる。
(e) H268Q、V309L、A330S、およびP331S;
(f) V234A;
(g) G237A;
(h) V234AおよびG237A;
(i) A235EおよびG237A;または
(j) V234A、A235E、およびG237A。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し;かつ数字の前の一文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後の一文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
(k) F241A;
(l) D265A;または
(m) V264A。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し;かつ数字の前の一文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後の一文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
(n) L235A、G237A、およびE318A;
(o) L235E;または
(p) F234AおよびL235A。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し;かつ数字の前の一文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後の一文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」または「ADCC」は、分泌されたIgが特定の細胞傷害性細胞(例えば、NK細胞、好中球およびマクロファージ)上に存在するFc受容体 (FcR) に結合しそれによってこれらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合することができそしてその後にその標的細胞を細胞毒によって殺傷することができるようになる、細胞傷害の一形態のことをいう。ADCCを媒介するプライマリ細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現し、単球はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の第464頁の表3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するために、in vitro ADCC測定法、例えば米国特許第5,500,362号もしくは第5,821,337号または米国特許第6,737,056号 (Presta) に記載のものが実施され得る。そのような測定法に有用なエフェクター細胞は、PBMCおよびNK細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のADCC活性は、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示される動物モデルのような動物モデルにおいて、in vivoで評価されてもよい。
「補体依存性細胞傷害」または「CDC」は、補体の存在下での標的細胞の溶解のことをいう。古典的補体経路の活性化は、(適切なサブクラスの)抗体(対応する抗原に結合している)への補体系の第1要素(C1q)の結合によって開始される。補体活性化を評価するため、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996) に記載のCDC測定法が実施され得る。改変されたFc領域アミノ酸配列を伴うポリペプチド変異体(変異Fc領域を伴うポリペプチド)および増加または減少したC1q結合能は、例えば、米国特許第6,194,551号B1およびWO1999/51642に記載されている。例えば、Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) も参照のこと。
「T細胞依存性細胞傷害」または「TDCC」は、標的細胞に対する細胞傷害性がT細胞によって誘導されるように、抗原結合分子が、標的細胞上に発現された抗原およびT細胞上に発現された別の抗原の両方に結合し、それによってT細胞を標的細胞の近くにリダイレクティングする、細胞傷害の形態のことをいう。T細胞依存性細胞傷害を評価する方法であるin vitro TDCCアッセイはまた、本説明の「T細胞依存性細胞傷害の測定」の項にも記載されている。
別段の指定がない限り、および文脈に矛盾がない限り、等電点 (pI) は、理論的等電点または実験的に決定された等電点のいずれかであってよいことが理解され、これは「pI」とも称される。pI値は、例えば、等電点電気泳動によって実験的に決定することができる。一方、理論pI値は、遺伝子およびアミノ酸配列解析ソフトウェア(Genetyx等)を用いて算出することができる。
用語「がん」および「がん性」は、調節されない細胞成長/増殖によって典型的に特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態のことをいうまたは説明するものである。がんの例は、がん腫、リンパ腫(例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むが、これらに限定されない。そのようながんのより詳細な例は、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、肺の扁平上皮がん、腹膜のがん、肝細胞がん、消化管がん、膵がん、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮がん、唾液腺がん、腎がん、肝がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝細胞がん、白血病および他のリンパ球増殖性障害、ならびに様々なタイプの頭頸部がんを含む。
用語「腫瘍」は、悪性か良性かによらず、すべての新生物性細胞成長および増殖ならびにすべての前がん性およびがん性細胞および組織のことをいう。用語「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」は、本明細書でいう場合、相互に排他的でない。
「卵巣がん」は、卵巣に由来する悪性腫瘍の不均一性の群のことをいう。悪性卵巣腫瘍のおよそ90%は起源が上皮であり、残りは生殖細胞および間質腫瘍である。上皮性卵巣腫瘍は、以下の組織学的サブタイプに分類される:漿液性腺がん(上皮性卵巣腫瘍の約50%を構成する);類内膜腺がん(約20%);粘液性腺がん(約10%);明細胞がん(約5~10%);ブレンナー(移行細胞)腫瘍(比較的まれ)。女性で6番目に多く見られるがんである卵巣がんの予後は通常悪く、5年生存率は5~30%の範囲である。卵巣がんの総説については、Fox et al. (2002) 「Pathology of epithelial ovarian cancer」 in Ovarian Cancer ch. 9 (Jacobs et al., eds., Oxford University Press, New York);Morin et al. (2001) 「Ovarian Cancer」 in Encyclopedic Reference of Cancer, pp.654-656 (Schwab, ed., Springer-Verlag, New York) を参照されたい。本開示は、上記の上皮性卵巣腫瘍サブタイプのいずれか、特に漿液性腺がんサブタイプを診断または治療する方法を企図する。
用語「胃がん(gastric cancer)」または「胃腫瘍(gastric tumor)」または「胃腫瘍(stomach tumor)」または「胃がん(stomach cancer)」は、胃の任意の腫瘍またはがん(例えば腺がん(例えば、びまん型および腸型)ならびにリンパ腫、平滑筋肉腫、および扁平上皮細胞がんなどのより一般的でない形態を含む)のことをいう。
用語「薬学的製剤」または「薬学的組成物」は、その中に含まれた有効成分の生物学的活性が効果を発揮し得るような形態にある調製物であって、かつ製剤が投与される対象に許容できない程度に毒性のある追加の要素を含んでいない、調製物のことをいう。
「薬学的に許容される担体」は、被験体に対して無毒な、薬学的製剤中の有効成分以外の成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、これらに限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含む。
本明細書で用いられる「治療」(および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など)は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、これらに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの態様において、本開示の抗体は、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。
用語「添付文書」は、治療用品の商用パッケージに通常含まれ、そのような治療用品の使用に関する、適応症、用法、用量、投与方法、併用療法、禁忌、および/または警告についての情報を含む使用説明書のことをいうために用いられる。
1つの局面において、本開示は、それぞれ配列番号: 113、117、および118のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む第1の重鎖可変領域;それぞれ配列番号: 119、120、および121のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む第1の軽鎖可変領域;それぞれ配列番号: 122、123、および124のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む第2の重鎖可変領域;ならびにそれぞれ配列番号: 114、115および116のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む第2の軽鎖可変領域を含む、単離された抗体を提供する。
(1) 配列番号: 72に示される第1のFc領域および配列番号: 73に示される第2のFc領域;
(2) 配列番号: 74に示される第1のFc領域、および配列番号: 75に示される第2のFc領域;
(3) 配列番号: 76に示される第1のFc領域、および配列番号: 77に示される第2のFc領域;ならびに
(4) 配列番号: 78に示される第1のFc領域、および配列番号: 79に示される第2のFc領域
より選択されるFc領域の組み合わせのうちのいずれか1つをさらに含む。
第1のFc領域は、第1の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖内にあってよく、かつ第2のFc領域は、第2の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖内にあってよい。ある特定の態様において、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン-リジン(残基446~447)は存在しなくてもよい。
第1の重鎖と第1の軽鎖の可変領域は第1の抗原結合部位を形成し、かつ第2の重鎖と第2の軽鎖の可変領域が第2の抗原結合部位を形成する。
1つの局面において、本開示は、
(a1) それぞれ配列番号: 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列;または
(a2) 配列番号: 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
を含む重鎖可変領域を含む抗原結合分子を提供する。
(b1) それぞれ配列番号: 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列;または
(b2) 配列番号: 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子を提供する。
重鎖可変領域が、
(a1) それぞれ配列番号: 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列;ならびに
(a2) 配列番号: 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含み;
かつ軽鎖可変領域が、
(b1) それぞれ配列番号: 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列;ならびに
(b2) 配列番号: 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む、抗原結合分子を提供する。
(a1) それぞれ配列番号: 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列;または
(a2) 配列番号: 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
を含む重鎖可変領域を含むキメラ抗原結合受容体を提供する。
(b1) それぞれ配列番号: 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列;または
(b2) 配列番号: 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む軽鎖可変領域を含むキメラ抗原結合受容体を提供する。
重鎖可変領域が、
(a1) それぞれ配列番号: 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列;ならびに
(a2) 配列番号: 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含み;
かつ軽鎖可変領域が、
(b1) それぞれ配列番号: 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列;ならびに
(b2) 配列番号: 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む、キメラ抗原結合受容体を提供する。
(a) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む重鎖可変領域:
(a1) それぞれ配列番号: 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列;ならびに
(a2) 配列番号: 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3;
ならびに
(b) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む軽鎖可変領域:
(b1) それぞれ配列番号: 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列;ならびに
(b2) 配列番号: 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む。
組換えの方法および構成
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗体および抗原結合分子は組換えの方法や構成を用いて製造することができる。1つの態様において、本明細書に記載の抗体をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、形質転換されている)。1つの態様において、宿主細胞は、真核性である(例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞)またはリンパ系の細胞(例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞))。1つの態様において、抗体の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗体を宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から回収することを含む、本開示の抗CLDN6抗体を作製する方法が提供される。
「多重特異性抗原結合分子」は、2種以上の抗原に特異的に結合する抗原結合分子のことをいう。ある特定の態様において、本明細書に記載される多重特異性抗原結合分子は、2つまたはそれ以上の抗原結合部位を含み、異なる抗原結合部位は異なる抗原に特異的に結合し得る。
(a) グルタミン酸(E)およびアスパラギン酸(D)、ならびに
(b) リジン(K)、アルギニン(R)、およびヒスチジン(H)。
抗原結合分子がCLDN6およびT細胞受容体複合体の両方に結合する態様において、本開示の抗原結合分子を、本開示の抗原結合分子における抗原結合部位が結合するCLDN6発現細胞と接触させることによって引き起こされるT細胞依存性細胞傷害(TDCC)を評価または決定するための方法として、好ましくは、以下に記載する方法が用いられる。細胞傷害活性をin vitroで評価または決定するための方法には、細胞傷害性T細胞等の活性を決定するための方法が含まれる。T細胞媒介性細胞傷害を誘導する活性を本開示の抗原結合分子が有するかどうかは、公知の方法によって決定することができる(例えば、Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)を参照)。細胞傷害アッセイにおいて、CLDN6と異なりかつ細胞において発現していない抗原と、T細胞受容体複合体とに結合することができる抗原結合分子が、対照抗原結合分子として用いられる。対照抗原結合分子は同じようにアッセイされる。次いで、活性は、本開示の抗原結合分子が、対照抗原結合分子のものより強い細胞傷害活性を示すかどうかを試験することによって評価される。
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子または抗体のいずれも、生物学的サンプルにおけるCLDN6の存在を検出するのに有用である。本明細書で用いられる用語「検出」は、定量的または定性的な検出を包含する。特定の態様において、生物学的サンプルは、細胞または組織、例えば、癌組織を含む。
1つの局面において、本開示は、本開示の抗原結合分子または抗体を含む医薬組成物を提供する。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、T細胞依存性細胞傷害を誘導し、言い換えると、本開示の医薬組成物は、細胞傷害を誘導するための治療剤である。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、がんの治療および/または予防に用いられる医薬組成物である。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および/または予防に用いられる医薬組成物である。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、細胞増殖抑制剤である。特定の態様において、本開示の医薬組成物は抗がん剤である。
ブリナツモマブの安定性に関して、ブリナツモマブを、自社で、20mM His、150mM NaCl, pH6.0中で3.8 mg/mLに精製した。高分子量 (HMW) 種の比率は、SEC分析により6.4%であると決定された。物理化学的試験のために、それをPBS、pH7.4に対して透析し、濃度を1mg/mLに調整した。透析後、HMW比は42.6%となった。一般に、IgG抗体のHMW比は透析中に変化しない。そのため、ブリナツモマブは溶液中で凝集傾向があり、IgG抗体と比較して安定性が低いと考えられた。SEC分析は、50 mMリン酸ナトリウム、300 mM NaCl、pH7.0をランニングバッファーとして使用して、SWXL G2000カラム (TOSOH) を用いて行った。検出はUV検出器 (280 nm) によって行った。クロマトグラムは、Empower 3ソフトウェア (Waters) を用いて分析した。
実施例2-1. 抗CLDN6 T細胞リダイレクティング抗体の作製
sc(Fv)2形式の限界を克服するために、本発明者らは、抗体がより優れた安定性およびより長い血清半減期を得られるようにする、IgG形式の、CLDN6を標的とするT細胞リダイレクティング二重特異性抗体(抗CLDN6/CD3二重特異性抗体)を作製した。
実施例2-1で作製された抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の、hCLDN6/BaF、hCLDN9/BaF、またはhCLDN6(Q156L)/BaFの存在下におけるT細胞活性化活性を、参考実施例3に記載される方法によって調べた。それぞれ0.001、0.01、0.1、1、および10 nMの濃度下での各抗体のT細胞活性化活性を決定した。
ヒトおよびマウスのCLDN3、4、6、および9を一過性に発現するFreeStyle(商標)293-F細胞を、以下のように作製した。対応する配列をコードする合成cDNAを哺乳動物発現ベクターpCXND3 (WO2008/156083) に挿入することにより、ヒトおよびマウスCLDN(CLDN6、CLDN9、CLDN3、およびCLDN4を含む)の発現ベクターを作製した。
1) 抗CLDN6/CD3二重特異性抗体:AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01、6PHU3/TR01;
2) Fabアーム交換によりヒトCD3抗体(配列番号:70に示されるVH、配列番号:71に示されるVL)と対形成された抗キーホールリンペットヘモシアン (KLH) 抗体(配列番号:68に示されるVH、配列番号:69に示されるVL)の二重特異性抗体:KLH/TR01(陰性対照として);
3) 市販の抗CLDN二価抗体(R&D systemsから購入):マウス抗ヒトCLDN6抗体 (MAB3656)、マウス抗ヒトCLDN3抗体 (MAB4620)、マウス抗ヒトCLDN4抗体 (MAB4219)。
抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のin vivo抗腫瘍効果を、腫瘍担持マウスモデルを用いて評価した。ヒトCLDN6を発現するヒトがん細胞株(HuH-7 (Health Science Research Resources Bank)、OV-90 (ATCC)、またはOVCAR-3 (ATCC))をNOD/ShiJic-scidマウスの皮下に移植し、そのマウスにヒトPBMCを注入した(いわゆるT細胞注入モデル)。腫瘍担持マウスを、抗体または対照としての溶媒の投与を受ける処置群に無作為に割り付けた。
AE3-20/TR01は様々な腫瘍担持マウスモデルにおいて有効性および良好な安全性の両方を示したが、AE3-20/TR01のCLDN6結合可変領域はマウス配列であり、その免疫原性が高いため、この抗体を患者へ投与するために適用することはできない。AE3-20/TR01のCLDN6結合可変領域のヒト化を行った。AE3-20/TR01のCD3結合可変領域は、ヒト化配列である。
ヒト化CLDN6結合可変領域の結合親和性を向上させるために、網羅的に、単一または複数の変異をAE3.20HおよびAE3.20LのCDRに導入し、配列番号: 6を重鎖FR1として使用し、配列番号: 10を重鎖FR2として使用し、配列番号: 14を重鎖FR3として使用し、配列番号: 18を重鎖FR4として使用し、配列番号: 22または19を軽鎖FR1として使用し、配列番号: 23を軽鎖FR2として使用し、配列番号: 24または32を軽鎖FR3として使用し、配列番号: 28または29を軽鎖FR4として使用して、様々な改変抗体を作製した。改変抗体をExpi293 (Invitrogen) で発現させ、プロテインA精製により精製した。
Fabアーム交換技術によって作製された二重特異性抗体は、化合物を大規模に提供するための精製および製造工程には適していない。二重特異性抗体の製造性を向上させるために、さらなる最適化を以下のように行った。
環化、異性化、開裂、およびメチオニン酸化などの化学的分解を回避するため、言い換えると、抗体の安定性を向上させるために、CDR内の対応する配列におけるいくつかのアミノ酸残基を置換した。CLDN6結合可変領域の結合親和性および特異性をさらに向上させることが見出されているCDR内でのアミノ酸置換も導入した。
二重特異性抗体の調製において、2種類の重鎖および2種類の軽鎖が発現に用いられる場合には、理論的には10種類の重鎖と軽鎖の組み合わせが発現される。これら10種類の抗体を分離することにより目的の二重特異性抗体を容易に精製できるようにするために、CLDN6結合VHおよびVLの等電点 (pI) を低下させるようアミノ酸改変を行った。
表11は、pIが操作されたVH改変体を示し、表12は、pIが操作されたVL改変体を示す。
算出された理論pI値を表13に示す。
二重特異性抗体の調製において、2種類の重鎖および2種類の軽鎖が発現に用いられる場合には、理論的には10種類の重鎖と軽鎖の組み合わせが発現される。これらの組み合わせのうちの1つだけが目的の二重特異性抗体であるため、目的の二重特異性抗体を得るには、10種類の異なる抗体の混合物から目的の1つの抗体を精製する必要があり、これは非常に非効率的であり困難である。この問題を解決する手段として、2種類の異なるH鎖が組み合わされたIgGが優先的に分泌されるように、「突起 (Knob)」および「空隙 (Hole)」の改変(KiH:Knobs into Hole)をIgG H鎖のCH3ドメインに導入し、さらに効率的に目的の分子を得るために、所望のH鎖-L鎖の会合を促進するための可変領域およびCH1-CLドメイン界面におけるアミノ酸置換およびそれらの組み合わせ(WO2013065708を参照のこと)を導入した。
実施例5-1で作製された抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS2201のin vivo抗腫瘍効果を、OV-90 T細胞注入モデルを用いて決定した。AE3-20/TR01を比較として用いた。0.1 mg/kgの二重特異性抗体で処置したマウスでは、OV-90 T細胞注入モデルに対して、CS2201はAE3-20/TR01よりも有効であった(図17)。一方で、CS2201とAE3-20/TR01は、5 mg/kgで同等の抗腫瘍効果を示した(図18)。CS2201の肝毒性については、血液検査の結果から肝毒性マーカーの異常は認められなかった(図19)。さらに、CS2201とAE3-20/TR01のPK特性は同等であることが見出された(図20)。CS2201およびAE3-20/TR01の血漿半減期 (T1/2) は,0.1 mg/kg群でそれぞれ3.64日および3.48日であった。CS2201およびAE3-20/TR01のゼロから無限時間までの血漿濃度-時間曲線下面積 (AUCinf) は、0.1 mg/kg群でそれぞれ1.83日*μg/mLおよび2.35日*μg/mLであった。
実施例6-1:ヒトPBMCを用いたin vitro免疫原性試験、および重鎖と軽鎖の対形成を制御するアミノ酸置換の再選択
表17に示される二価IgG抗体を作製した。抗体Aは免疫原性が低いことが知られており、免疫原性試験において陰性対照として使用した。抗hA33抗体は免疫原性が高いことが知られており、免疫原性試験において陽性対照として使用した。
AE3-20/TR01およびCS2201は、マウスにおいていかなる毒性も引き起こすことなく強い有効性を示すが、CS2425はマウスにおいて予想外に重篤な肝損傷を引き起こす。本発明者らは、実施例5に記載されたCLDN6結合可変領域におけるアミノ酸配列の改変が、抗体の特性に影響を及ぼした可能性があり、その後に毒性を引き起こしたと推測した。どの改変が抗体に影響を及ぼして肝毒性を引き起こすのかを確認するために、CS2425のものと比較してアミノ酸置換が少ないCLDN6結合可変領域改変体を構築した。
作製された抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の抗腫瘍効果および安全性を評価するために、以下のようにOV-90 T細胞注入モデルによってin vivoマウス試験を行った。OV-90腫瘍を有するマウスに、5 mg/kgのCS2201、CS2425、CS2884、CS2885、CS2886、CS2958、CS2959、およびCS2960を投与し、次いで腫瘍体積および体重を算出した。処置後に血液もまた採取し、次いでこれを用いて肝損傷マーカーの血漿レベルを分析した。
Fc領域を選択するために、表22に示されるようにいくつかのFc改変体を作製した。Fcγ受容体に対するFc領域の結合活性を低下させるアミノ酸変異(FcgRサイレント変異)、脱グリコシル化変異、および重鎖ヘテロ二量体化を促進するための変異を導入した(WO2006106905に記載された通り)。
これらのFc改変体を用いることにより、表23に示される4つの二重特異性抗体を構築した。
実施例7-1. CLDNファミリータンパク質発現細胞の存在下における抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化活性
図32は、参考実施例3に記載される方法により決定された、hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、hCLDN9/BaF、またはhCLDN6(Q156L)/BaFの存在下における、様々な濃度の抗CLDN6/CD3二重特異性抗体(AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425、およびCS2961)のT細胞活性化活性を示す。本発明者らの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体はすべて、hCLDN6/BaFの存在下でT細胞活性化を誘導した。加えて、10 nMのAE3-20/TR01は、hCLDN4/BaFおよびhCLDN6(Q156L)/BaFの存在下で、他の抗CLDN6/CD3二重特異性抗体よりもわずかに高いT細胞活性化を誘導し、10 nMの6PHU3/TR01は、hCLDN9/BaFの存在下でわずかにより高いT細胞活性化を誘導した。
図34は、CLDN6を発現するOVCAR3卵巣がん細胞株に対する抗CLDN6/CD3二重特異性抗体(AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425、CS2961、CS3346、CS3347、およびCS3348)のT細胞依存性細胞傷害を示す。細胞傷害は、ヒトPBMC (StemCell) を用いてLDHアッセイにより評価した。20,000個の標的細胞および200,000個のヒトPBMC (E/T = 10) を96ウェルU底プレートの各ウェルに播種し、様々な濃度の抗体と共に37℃および5% CO2で24時間インキュベートした。標的細胞の死滅を、LDH細胞傷害検出キット (Takara Bio) により測定した。各抗体の細胞傷害活性 (%) は、以下の式を用いて算出した。
細胞傷害活性 (%) = (A - B - C)×100 / (D - C)
「A」は抗体およびPBMCで処理したウェルの吸光度を表し、「B」はエフェクター細胞PBMCのみの平均吸光度値を表し、「C」は未処理の標的細胞のみの平均吸光度値を表し、「D」はTriton-Xで溶解したウェルの平均値を表す。バックグラウンドの吸光度は考慮し、減算してある。本発明者らの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体はすべて、OVCAR3細胞に対するT細胞依存性細胞傷害を示した。
アミノ酸配列は、CLDN3、CLDN4、CLDN6、およびCLDN9の間で高度に保存されている。したがって、本発明者らは、FACS解析によってCLDN6結合特異性を調べた。hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、およびhCLDN9/BaFを、15μg/mlのCS2201、CS2961、AH05/TR01、および6PHU3/TR01と共にインキュベートした。実施例2-3において作製されたKLH/TR01を、染色対照として使用した。各抗体の結合は、Alexa Fluor 488結合抗ヒトIgG (Invitrogen) を用いて検出した。死細胞は、eFlour 780 (Invitrogen) 染色により分離した。
CS2961、CS3346、CS3347、およびCS3348の安定性を評価した。それぞれの抗体をPBS、pH7.4に対して透析し、回収時に濃度を1 mg/mLに調整した。試料を5℃および40℃で1週間、ならびに40℃で2週間保存した。保存後、50 mMリン酸Na、300mM NaCl、pH 7.0をランニングバッファーとして使用して、SWXL G3000カラム (TOSOH) を用いてSEC分析を行った。検出はUV検出器 (280 nm) によって行った。クロマトグラムは、Empower 3ソフトウェア (Waters) を用いて分析した。
CS2961の抗腫瘍効果および安全性を評価するために、以下のようにin vivoマウス試験を行った。OV-90腫瘍を有するマウスに5 mg/kgの精製CS2961を投与し、次いで腫瘍体積および体重を算出した。処置後に血液も採取し、次いでこれを用いて肝損傷マーカーの血漿レベルを分析した。
CS3348のin vivo効力を、実施例2-4に記載されたようにOV-90 T細胞注入モデルを用いてAE3-20/TR01と比較した。
抗体のin vivoの有効性および毒性を、腫瘍担持マウスモデルを用いて評価した。ヒトクローディン6を発現するヒトがん細胞株OVCAR-3、NCI-H1435、またはNUGC-3を、NOD/ShiJic-scidマウスの皮下に移植した。腫瘍サイズがおよそ200 mm3に達した時点で、腫瘍担持マウスを無作為に処置群に割り当てて、溶媒対照またはAbの投与を行った(T細胞注入モデルと称される)。
すなわち、T細胞注入モデルを用いたOVCAR-3、NCI-H1435、またはNUGC-3に対する有効性試験において、以下の試験を行った。T細胞の拡大は、ヒトPBMC (AllCells) およびT細胞活性化/拡大キット (Miltenyi Biotec) を用いて行った。細胞1×107個のがん細胞とマトリゲル基底膜マトリックス (BD) を混合し、NOD/ShiJic-scidマウス(CLEA Japan、雌、6~7週齢)の側腹部の皮下に移植した。移植の日を0日目と規定した。腫瘍サイズおよび体重に従って無作為化および群分けした後、抗アシアロGM1抗体 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) を0.2 mg/マウスで腹腔内投与した。翌日、拡大培養によって得られたT細胞を、細胞3×107個/マウスで腹腔内に移植した。群の詳細を表24に示す。T細胞移植のおよそ4時間後に、CS3348を静脈内投与した。CS3348の投与は1回のみ行った。腫瘍塊の長さ (L) および幅 (W) ならびに体重を測定し、腫瘍体積 (TV) をTV = (L×W×W) / 2として算出した。
図40~42(図40:OVCAR-3担持マウス、図41:NCI-H1435担持マウス、および図42:NUGC-3担持マウス)に示されるように、CS3348は、体重減少を含むいかなる毒性も伴うことなく、用量依存的にこれら3種のがん細胞株に対する明らかな抗腫瘍活性を示した。
アミノ酸置換またはIgG変換を、PCRまたはIn fusion Advantage PCRクローニングキット (Takara Bio Inc.) 等を用いる当業者に一般的に公知の方法で行って、発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを、当業者に一般的に公知の方法により配列決定した。調製されたプラスミドをFreeStyle 293細胞 (ThermoFisher Scientific) またはExpi293F細胞 (ThermoFisher Scientific) に一過性に導入して、抗体を発現させた。得られた培養上清から、rProtein A Sepharose(商標)Fast Flow (GE Healthcare Japan Corp.) を用いる当業者に一般的に公知の方法により、各抗体を精製した。二重特異性抗体の場合には、ホモ二量体を除去するために、ProteinLクロマトグラフィー (Protenova) が必要である (WO2018159615)。精製抗体の濃度については、分光光度計を用いて280 nmで吸光度を測定し、得られた値からPACEにより算出された吸光係数を用いて、抗体濃度を算出した (Protein Science 1995; 4: 2411-2423)。
ヒトCLDN6、ヒトCLDN9、ヒトCLDN3、ヒトCLDN4、マウスCLDN6、マウスCLDN9、マウスCLDN3、およびマウスCLDN4発現ベクターをそれぞれマウスプロB細胞株Ba/F3にトランスフェクトすることにより、ヒトCLDN6を発現するBa/F3細胞 (hCLDN6/BaF)、ヒトCLDN9を発現するBa/F3細胞 (hCLDN9/BaF)、ヒトCLDN3を発現するBa/F3細胞 (hCLDN3/BaF)、ヒトCLDN4を発現するBa/F3細胞 (hCLDN4/BaF)、マウスCLDN6を発現するBa/F3細胞 (mCLDN6/BaF)、マウスCLDN9を発現するBa/F3細胞 (mCLDN9/BaF)、マウスCLDN3を発現するBa/F3細胞(mCLDN3/BaF)、およびマウスCLDN4を発現するBa/F3細胞(mCLDN4/BaF)を樹立した。
標的細胞の存在下における抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化は、GloResponse(商標)NFAT-luc2 Jurkat細胞 (Promega) を用いるT細胞活性化バイオアッセイにより調べた。各アッセイにおいて、参考実施例2において作製されたクローディン発現細胞およびがん細胞株より選択された1種類の細胞を、標的細胞として使用した。
Claims (21)
- ヒトCLDN6に結合することができる第1の抗原結合部位、およびT細胞受容体複合体に結合することができる第2の抗原結合部位を含む、抗原結合分子であって、
前記第1の抗原結合部位は、
配列番号: 85、33、84、および83より選択されるアミノ酸配列を含む第1の重鎖可変領域、ならびに配列番号: 87、43、86、および88より選択されるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖可変領域
を含む、抗原結合分子。 - 前記第2の抗原結合部位は、CD3に結合することができる、請求項1に記載の抗原結合分子。
- 前記第1の抗原結合部位が、単鎖Fv (scFv)、Fv、またはFab中に含まれる、請求項1または2に記載の抗原結合分子。
- 前記第1の重鎖可変領域が第1のCH1ドメインに連結されており、前記第1のCH1ドメインは147位および175位のアミノ酸置換を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
- 第1の重鎖可変領域が配列番号: 95に示される第1のCH1ドメインに連結されている、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
- 抗体Fc領域をさらに含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
- 前記第1の重鎖可変領域は、第1のCH1ドメインおよびヒンジドメインを介して第1のFc領域に結合しており、前記第1のFc領域は以下(a)~(d)より選択されるアミノ酸改変を少なくとも1つ含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の抗原結合分子:
(a)L234A、L235A、A327G、A330S、および、P331S;またはL234AおよびL235A;
(b)N297A;
(c)S239K;
(d)K439E、または、E356K。 - 前記第2の抗原結合部位は第2の重鎖可変領域および第2の軽鎖可変領域を含み、
前記第2の重鎖可変領域は第2のCH1ドメインおよびヒンジドメインを介して第2のFc領域に結合しており、前記第2のFc領域は以下(a)~(d)より選択されるアミノ酸改変を少なくとも1つ含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の抗原結合分子:
(a)L234A、L235A、A327G、A330S、および、P331S;またはL234AおよびL235A;
(b)N297A;
(c)S239K;
(d)K439E、または、E356K。 - 前記第1の重鎖可変領域は、第1のCH1ドメインおよびヒンジドメインを介して、配列番号: 72、74、76、および78より選択されるアミノ酸配列を含む第1のFc領域に結合している、請求項1~8のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
- (1) 配列番号: 72に示される第1のFc領域、および配列番号: 73に示される第2のFc領域;
(2) 配列番号: 74に示される第1のFc領域、および配列番号: 75に示される第2のFc領域;
(3) 配列番号: 76に示される第1のFc領域、および配列番号: 77に示される第2のFc領域;ならびに
(4) 配列番号: 78に示される第1のFc領域、および配列番号: 79に示される第2のFc領域
より選択されるFc領域の組み合わせのうちのいずれか1つをさらに含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の抗原結合分子。 - 前記第1のFc領域が前記第1の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖内にあり、かつ
前記第2の抗原結合部位は第2の重鎖可変領域および第2の軽鎖可変領域を含み、前記第2のFc領域が前記第2の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖内にある、請求項10に記載の抗原結合分子。 - ヒトCLDN6に結合することができる第1の抗原結合部位、およびT細胞受容体複合体に結合することができる第2の抗原結合部位を含む、抗原結合分子であって、
前記第1の抗原結合部位は、
配列番号: 104、105、106、および107より選択されるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、ならびに配列番号: 112に示されるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖
を含む、抗原結合分子。 - 請求項1~12のいずれか一項に記載の抗原結合分子をコードする、単離された核酸。
- 請求項13に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 抗原結合分子が産生されるように、請求項14に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗原結合分子を産生する方法。
- 請求項1~12のいずれか一項に記載の抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- T細胞依存性細胞傷害を誘導する、請求項16に記載の医薬組成物。
- がんの治療および/または予防のために使用される医薬組成物である、請求項16または17に記載の組成物。
- 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および/または予防のために使用される医薬組成物である、請求項16~18のいずれか一項に記載の組成物。
- 医薬の製造における、請求項1~12のいずれか一項に記載の抗原結合分子の使用。
- 少なくとも請求項1~12のいずれか一項に記載の抗原結合分子と、使用説明書とを含む、がんの治療および/または予防における使用のためのキット。
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