CN113950485A - 密蛋白-6结合分子及其用途 - Google Patents

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石井慎也
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Abstract

本公开提供了对密蛋白‑6(CLDN6)显示结合活性的抗原结合分子，用于制备抗原结合分子的方法，抗原结合分子和包含相同抗原结合分子的免疫缀合物在治疗和/或预防癌症中的用途，抗原结合分子在检测生物样品中CLDN6的存在的用途，以及抗原结合分子在多种癌症诊断中的用途。

Description

密蛋白-6结合分子及其用途
技术领域
本公开涉及(Claudin)密蛋白6结合分子，包括抗原结合分子和抗体，其用途等。
背景技术
因为抗体在血浆中的稳定性高并且副作用少，因此作为药物(pharmaceutical)备受关注。在多种治疗性抗体中，一些类型的抗体需要效应细胞来发挥抗肿瘤反应。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是效应细胞通过抗体的Fc区与NK细胞和巨噬细胞上存在的Fc受体结合而对抗体结合细胞表现出的细胞毒性。迄今为止，已开发出可诱导ADCC发挥抗肿瘤效果的多种治疗性抗体作为药物用于治疗癌症(NPL 1)。
除了通过募集NK细胞或巨噬细胞作为效应细胞而采用ADCC的抗体之外，自1980年代以来就已知通过募集T细胞作为效应细胞而采用细胞毒性的T细胞募集抗体(TR抗体)(NPL 2至4)。TR抗体是双特异性抗体，其识别并结合在T细胞上形成T细胞受体复合体的任何一个亚基，特别是CD3ε链，以及癌细胞上的抗原。目前正在开发几种TR抗体。卡妥索单抗(Catumaxomab)，其是针对EpCAM的TR抗体，已在EU批准用于治疗恶性腹水。此外，最近发现称为“双特异性T细胞engager(BiTE)”的一种类型的TR抗体表现出强的抗肿瘤活性(NPL5和6)。博纳吐单抗(Blinatumomab)，其是针对CD19的BiTE分子，于2014年首次获得FDA批准。相比于诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的利妥昔单抗(Rituximab)，博纳吐单抗已被证明在体外对CD19/CD20阳性癌细胞表现出更强的细胞毒活性(NPL 7)。
然而，已知三功能抗体以不依赖癌抗原的方式同时与T细胞和诸如NK细胞或巨噬细胞的细胞结合，因此细胞上表达的受体是交联的,并且多种细胞因子的表达以不依赖抗原的方式被诱导。由于这种细胞因子表达的诱导，三功能抗体的全身施用被认为引起细胞因子风暴样副作用。事实上，已有报道称，在I期临床试验中，对于向患有非小细胞肺癌的患者全身施用卡妥索单抗，5微克/体重的极低剂量是最大耐受剂量，施用更高的剂量引起多种严重的副作用(NPL 8)。当以如此低的剂量施用时，卡妥索单抗永远无法达到有效的血液水平。也就是说，以如此低的剂量施用卡妥索单抗无法达到预期的抗肿瘤效果。
同时，与卡妥索单抗不同，双特异性sc(Fv)2形式分子(BiTE)没有Fcγ受体结合位点，因此它不会交联以不依赖癌抗原的方式在T细胞和细胞(如NK细胞和巨噬细胞)上表达的受体。然而，由于双特异性sc(Fv)2是没有Fc区的修饰的低分子量抗体分子，问题在于向患者施用后的其血液半衰期明显短于常规用作治疗性抗体的IgG型抗体。事实上，已有报道称体内施用的双特异性sc(Fv)2的血液半衰期约为数小时(NPL 9和10)。博纳吐单抗，其是与CD19和CD3结合的sc(Fv)2分子，已被批准用于治疗急性淋巴细胞白血病。已揭示博纳吐单抗的血清半衰期在患者中小于2小时(NPL 21)。在博纳吐单抗的临床试验中，使用微型泵(minipump)通过连续静脉输注施用。这种施用方式不仅对患者而言极其不方便，而且存在因设备故障等导致医疗事故的潜在风险。因此，不能说这种施用方法是所希望的。
密蛋白家族是分子量约为23kD的细胞膜蛋白家族，其具有四个跨膜结构域并构成紧密连接。密蛋白家族在人类和小鼠中包括24个成员，并且已知密蛋白家族的每个成员根据每种上皮细胞类型表现出非常独特的表达模式(NPL 11至14)。在上皮细胞层中，存在机制可以防止物质在细胞内间隙中泄漏(扩散)，并且已显示被称为紧密连接的细胞-细胞粘附系统在该机制中作为“屏障”发挥核心作用以防止泄漏。
紧密连接分子密蛋白6(CLDN6),其是密蛋白家族蛋白的成员，在正常成人组织中显示转录沉默表达(NPL 15和16)，而在几种癌症如卵巢癌、NSCLC和胃癌中显示上调(NPL17至19)。
关于抗CLDN6抗体，据报道针对CLDN6的单特异性抗体具有针对CLDN6阳性癌细胞系的ADCC活性或内化活性(PTL 1至5)。到目前为止，已使用具有抗CD3/抗CLDN6特异性的双特异性sc(Fv)2形式改造了CLDN6靶向T细胞重定向双特异性抗体，其被命名为6PHU3(PTL 6至7)。在临床前评估中，据报道6PHU3在体外和体内均显示出对癌细胞的有效杀伤(NPL20)。
引用列表
专利文献
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[PTL 3]WO2012/003956
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[PTL 7]WO2014/075788
非专利文献
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发明概述
技术问题
如上所述，双特异性sc(Fv)2是没有Fc区的修饰的低分子量抗体分子，并且与IgG型抗体相比，其显示出明显更短的血液半衰期，这将导致其作为治疗药物的使用不便。在与CLDN6结合的双特异性sc(Fv)2，称为6PHU3的情况中，据报道，6PHU3的血浆蛋白水平在6小时内急剧下降，并且在24小时后细胞毒活性几乎检测不到(Nat Med.2017Jul；23(7):815-817.)。此外，sc(Fv)2的形式面临制造挑战，包括长期储存期间的稳定性差。
一方面，本公开的目标是提供对CLDN6和T细胞受体复合体显示结合活性的抗原结合分子(包括抗体)，其通过使T细胞接近表达CLDN6的细胞并使用针对表达CLDN6的癌细胞的T细胞的细胞毒性来实现癌症治疗，所述抗原结合分子尤其是具有高稳定性和长血清半衰期的抗原结合分子。提供用于生产抗原结合分子的方法和包含此类抗原结合分子作为活性成分的药物组合物也是本公开的目标。
在另一方面，本公开的目标是提供对CLDN6显示结合活性的抗原结合分子(其通过靶向表达CLDN6的细胞来实现治疗癌症)，产生抗原结合分子的方法，以及包含此类抗原结合分子的药物组合物，或包含此类抗原结合分子作为活性成分的免疫缀合物。本公开中还提供了抗原结合分子在检测生物样品中是否存在CLDN6中的应用，以及抗原结合分子在多种癌症诊断中的应用。
本公开还提供用于治疗或预防多种癌症的药物组合物，其包含上述抗原结合分子或免疫缀合物之一作为活性成分，以及使用该药物组合物的治疗方法。
问题解决方案
本发明人发现抗原结合分子会损伤表达CLDN6的细胞，并发挥优异的细胞毒/抗肿瘤活性，所述抗原结合分子包含对CLDN6显示结合活性的特异性重链可变区(VH)连同特异性轻链可变区(VL)，和对T细胞受体复合体显示结合活性的第二个VH连同的第二个VL。包含特异性序列的抗原结合分子还显示优异的稳定性、安全性和可制造性。本公开提供了抗原结合分子和药物组合物，其可以通过包含所述抗原结合分子作为活性成分来治疗多种癌症，尤其是与CLDN6相关的癌症，如CLDN6阳性肿瘤。
本发明人还发现，包含特异性VH连同特异性VL的抗原结合分子显示对CLDN6的结合活性以及对人CLDN6的优异特异性，因此所述抗原结合分子及其免疫缀合物可用于靶向表达CLDN6的细胞，检测生物样品中CLDN6的存在，以及多种癌症的诊断。
更具体地，本公开提供以下内容：
[1]分离的抗体，其包含：
分别包含SEQ ID NO:113、117和118的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列的第一重链可变区；
分别包含SEQ ID NO:119、120和121的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列的第一轻链可变区；
分别包含SEQ ID NO:122、123和124的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列的第二重链可变区；和
分别包含SEQ ID NO:114、115和116的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列的第二轻链可变区。
[2]分离的抗体，其包含：
包含选自SEQ ID NO:85、1、33和84的氨基酸序列的第一重链可变区；和包含选自SEQ ID NO:87、2、43、86和88的氨基酸序列的第一轻链可变区；
包含选自SEQ ID NO:60和70的氨基酸序列的第二重链可变区；和包含选自SEQ IDNO:61和71的氨基酸序列的第二轻链可变区。
[3][1]或[2]的抗体，其中第一重链可变区连接至SEQ ID NO:95所示的第一CH1结构域，第一轻链可变区连接至SEQ ID NO:63所示的第一CL结构域，第二重链可变区连接至SEQ ID NO:97所示的第二CH1结构域，并且第二轻链可变区连接至SEQ ID NO:62所示的第二CL结构域。
[4][1]至[3]任一项的抗体，其中所述抗体进一步包含选自以下的任一种Fc区组合：
(1)SEQ ID NO:72所示的第一Fc区和SEQ ID NO:73所示的第二Fc区；
(2)SEQ ID NO:74所示的第一Fc区和SEQ ID NO:75所示的第二Fc区；
(3)SEQ ID NO:76所示的第一Fc区和SEQ ID NO:77所示的第二Fc区；和
(4)SEQ ID NO:78所示的第一Fc区和SEQ ID NO:79所示的第二Fc区。
[5][4]的抗体，其中第一Fc区与第一重链可变区在同一多肽链中，并且第二Fc区与第二重链可变区在同一多肽链中。
[6][1]至[5]中任一项的抗体，其中第一重链可变区和第一轻链可变区形成第一抗原结合位点，并且第二重链可变区和第二轻链可变区形成第二抗原结合位点。
[7]分离的抗体，其包含：
包含选自SEQ ID NO:104、105、106和107的氨基酸序列的第一重链和包含SEQ IDNO:112中所示氨基酸序列的第一轻链；
包含选自SEQ ID NO:108、109、110和111的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ IDNO:98中所示氨基酸序列的第二轻链。
[8][7]的抗体，其中第一重链和第一轻链的可变区形成第一抗原结合位点，并且第二重链的可变区和第二轻链形成第二抗原结合位点。
[9][6]或[8]的抗体，其中第一抗原结合位点具有针对CLDN6的结合活性。
[10][6]、[8]和[9]中任一项的抗体，其中第一抗原结合位点对人CLDN6具有结合活性。
[11][6]和[8]至[10]中任一项的抗体，其中第一抗原结合位点对如SEQ ID NO:125或126中定义的人CLDN6具有结合活性。
[12][6]和[8]至[11]中任一项的抗体，其中第一抗原结合位点基本上不与人CLDN9结合。
[13][6]和[8]至[12]中任一项的抗体，其中第一抗原结合位点基本上不与人CLDN4结合。
[14][6]和[8]至[13]中任一项的抗体，其中第一抗原结合位点基本上不与人CLDN3结合。
[15][6]和[8]至[14]中任一项的抗体，其中第一抗原结合位点基本上不与如SEQID NO:134中定义的CLDN6突变体结合。
[16][6]和[8]至[15]中任一项的抗体，其中第二抗原结合位点对CD3具有结合活性。
[17][6]和[8]至[16]中任一项的抗体，其中第二抗原结合位点对CD3ε链具有结合活性。
[18][6]和[8]至[17]中任一项的抗体，其中第二抗原结合位点对如SEQ ID NO:142中定义的人CD3具有结合活性。
[19]编码[1]至[18]中任一项的抗体的分离的核酸。
[20]包含[19]的核酸的宿主细胞。
[21]产生抗体的方法，其包括培养[20]的宿主细胞以产生抗体。
[22][21]的方法，其进一步包括从宿主细胞的培养物中回收抗体。
[23]药物组合物，其包含[1]至[18]中任一项的抗体和药学上可接受的载体。
[24][23]的药物组合物，其诱导T细胞依赖性细胞毒性。
[25][23]或[24]的组合物，其是用于治疗和/或预防癌症的药物组合物。
[26][23]至[25]中任一项的组合物，其是用于治疗和/或预防卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的药物组合物。
[27][1]至[18]中任一项的抗体在制备药物中的用途。
[28][1]至[18]中任一项的抗体在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的用途。
[29][1]至[18]中任一项的抗体在制备用于治疗和/或预防卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的药物中的用途。
[30]治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的[1]至[18]中任一项的抗体。
[31]治疗患有卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的[1]至[18]中任一项的抗体。
[32]用于治疗和/或预防癌症的试剂盒，其至少包含[1]至[18]中任一项的抗体，和使用说明书。
[33]用于治疗和/或预防卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的试剂盒，其至少包含[1]至[18]中任一项的抗体，和使用说明书。
此外，本公开还提供以下内容：
[34]抗原结合分子，其包含：
(a)包含选自以下的任一HVR组合的重链可变区：
(a1)分别如SEQ ID NO:113、117和118所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列；和
(a2)与SEQ ID NO:91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85所示的任一重链可变区的那些相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3；
和
(b)包含选自以下的任一HVR组合的轻链可变区：
(b1)分别如SEQ ID NO:119、120和121所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列；和
(b2)与SEQ ID NO:92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88和58所示任一重链可变区的那些相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
[35][34]的抗原结合分子，其中重链可变区和轻链可变区包含小鼠、兔、人源化或人构架。
[36]包含重链可变区和轻链可变区的抗原结合分子，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83和57的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82和58的氨基酸序列。
[37][34]至[36]中任一项的抗原结合分子，其中所述重链可变区和所述轻链可变区形成抗原结合位点。
[38][37]的抗原结合分子，其中所述抗原结合位点对CLDN6具有结合活性。
[39][37]或[38]的抗原结合分子，其中所述抗原结合位点对如SEQ IDNO:125或126中定义的人CLDN6具有结合活性。
[40][37]至[39]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合位点基本上不与人CLDN9结合。
[41][37]至[40]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合位点基本上不与人CLDN4结合。
[42][37]至[41]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合位点基本上不与人CLDN3结合。
[43][37]至[42]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合位点基本上不与如SEQ ID NO:134定义的CLDN6突变体结合。
[44][34]至[43]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子进一步包含抗体Fc区。
[45][44]的抗原结合分子，其中所述Fc区是在构成SEQ ID NO:143至146(IgG1至IgG4)的氨基酸的Fc区的任何处具有至少一个氨基酸突变的Fc区。
[46][44]或[45]的抗原结合分子，其中所述Fc区是附着有糖链的Fc区，并且附着到Fc区的岩藻糖缺陷糖链的百分比高于附着到天然IgG Fc区的岩藻糖缺陷糖链的百分比，或添加到Fc区的二等分N-乙酰葡糖胺的百分比高于添加到天然IgGFc区的二等分N-乙酰葡糖胺的百分比。
[47][34]至[46]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有细胞毒活性。
[48][47]的抗原结合分子，其中所述细胞毒活性是ADCC或CDC。
[49][34]至[46]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有内化活性。
[50][34]至[49]中任一项的抗原结合分子，其与细胞毒剂缀合。
[51]免疫缀合物，其包含[34]至[50]中任一项的抗原结合分子和细胞毒剂。
[52]药物组合物，其包含[34]至[50]中任一项的抗原结合分子或[51]的免疫缀合物，以及药学上可接受的载体。
[53][52]的组合物，其是用于治疗和/或预防癌症的药物组合物。
[54][52]或[53]的组合物，其是用于治疗和/或预防卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的药物组合物。
[55][34]至[50]中任一项的抗原结合分子或[51]的免疫缀合物在制备药物中的用途。
[56][34]至[50]中任一项的抗原结合分子或[51]的免疫缀合物在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的用途。
[57][34]至[50]中任一项的抗原结合分子或[51]的免疫缀合物在制备用于治疗和/或预防卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的药物中的用途。
[58]治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的[34]至[50]中任一项的抗原结合分子或[51]的免疫缀合物。
[59]治疗患有卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的[34]至[50]中任一项的抗原结合分子或[51]的免疫缀合物。
[60]用于治疗和/或预防癌症的试剂盒，其至少包含[34]至[50]中任一项的抗原结合分子或[51]的免疫缀合物,和使用说明书。
[61]用于治疗和/或预防卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的试剂盒，其至少包含[34]至[50]中任一项的抗原结合分子或[51]的免疫缀合物，和使用说明书。
[62]检测生物样品中CLDN6的存在的方法，其包括使生物样品与[34]至[41]中任一项的抗原结合分子接触。
[63][62]的方法，其中在允许抗原结合分子与CLDN6结合的条件下使生物样品与抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子和CLDN6之间是否形成复合体。
[64]诊断受试者是否患有癌症的方法，其包括使来自受试者的生物样品与[34]至[41]中任一项的抗原结合分子接触。
[65][64]的方法，其中在允许抗原结合分子与CLDN6结合的条件下使生物样品与抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子和CLDN6之间是否形成复合体。
[66][64]或[65]的方法，其中癌症是卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌。
[67]分离的核酸，其编码[34]至[41]中任一项的抗原结合分子。
[68]包含[67]的核酸的宿主细胞。
[69]产生抗原结合分子的方法，其包括培养[68]的宿主细胞以产生抗原结合分子。
[70][69]的方法，其进一步包括从宿主细胞的培养物中回收抗原结合分子。
此外，本公开还提供以下内容：
[71]抗原结合分子，其包含：
对CLDN6具有结合活性的第一抗原结合位点，和
对T细胞受体复合体具有结合活性的第二抗原结合位点，
其中所述第一抗原结合位点由以下形成:
(a)包含选自以下的任一HVR组合的重链可变区：
(a1)分别如SEQ ID NO:113、117和118所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列；和
(a2)与SEQ ID NO:91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85所示的任一重链可变区的那些相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3；
和
(b)包含选自以下的任一HVR组合的轻链可变区：
(b1)分别如SEQ ID NO:119、120和121所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列；和
(b2)与SEQ ID NO:92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88和58所示任一重链可变区的那些相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
[72][71]的抗原结合分子，其中形成第一抗原结合位点的重链可变区和轻链可变区进一步包含小鼠、兔、人源化或人构架。
[73]抗原结合分子，其包含：
对CLDN6具有结合活性的第一抗原结合位点，和
对T细胞受体复合体具有结合活性的第二抗原结合位点，
其中第一抗原结合位点包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83和57的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82和58的氨基酸序列。
[74][71]至[73]中任一项的抗原结合分子，其中所述第一抗原结合位点对人CLDN6具有结合活性。
[75][71]至[74]中任一项的抗原结合分子，其中所述第一抗原结合位点对SEQ IDNO:125或126中定义的人CLDN6具有结合活性。
[76][71]至[75]中任一项的抗原结合分子，其中所述第一抗原结合位点基本上不与人CLDN9结合。
[77][71]至[76]中任一项的抗原结合分子，其中所述第一抗原结合位点基本上不与人CLDN4结合。
[78][71]至[77]中任一项的抗原结合分子，其中所述第一抗原结合位点基本上不与人CLDN3结合。
[79][71]至[78]中任一项的抗原结合分子，其中所述第一抗原结合位点基本上不与如SEQ ID NO:134中定义的CLDN6突变体结合。
[80][71]至[73]中任一项的抗原结合分子，其中所述第一抗原结合位点包含在单链Fv(scFv)、Fv或Fab中。
[81][71]至[80]中任一项的抗原结合分子，其中所述第二抗原结合位点对CD3具有结合活性。
[82][71]至[80]中任一项的抗原结合分子，其中所述第二抗原结合位点对CD3ε链具有结合活性。
[83][71]至[80]中任一项的抗原结合分子，其中所述第二抗原结合位点对T细胞受体具有结合活性。
[84][71]至[82]中任一项的抗原结合分子，其中所述第二抗原结合位点由分别包含SEQ ID NO:122、123和124的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列的重链可变区和分别包含SEQ ID NO:114、115和116的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列的轻链可变区形成。
[85][84]的抗原结合分子，其中所述重链可变区和轻链可变区包含小鼠、兔、人源化或人构架。
[86][71]至[82]中任一项的抗原结合分子，其中所述第二抗原结合位点由包含选自SEQ ID NO:60和70的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQ ID NO:61和71的氨基酸序列的轻链可变区形成。
[87][71]至[86]中任一项的抗原结合分子，其中所述第二抗原结合位点包含在单链Fv(scFv)、Fv或Fab中。
[88][71]至[87]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子还包含抗体Fc区。
[89][88]的抗原结合分子，其中所述Fc区是对Fcγ受体的结合活性降低的Fc区。
[90][88]或[89]的抗原结合分子，其中所述Fc区是在构成SEQ ID NO:143至146(IgG1至IgG4)的氨基酸的Fc区中的任何处具有至少一个氨基酸突变的Fc区。
[91][88]至[90]中任一项的抗原结合分子，其中所述Fc区是具有选自由EU编号指定的以下氨基酸位置的至少一个氨基酸突变的Fc区：
位置220、位置226、位置229、位置231、位置232、位置233、位置234、位置235、位置236、位置237、位置238、位置239、位置240、位置264、位置265、位置266、位置267、位置269、位置270、位置295、位置296、位置297、位置298、位置299、位置300、位置325、位置327、位置328、位置329、位置330、位置331和位置332。
[92][88]至[91]中任一项的抗原结合分子，其中所述Fc区是包含选自由EU编号指定的以下氨基酸的至少一个氨基酸的Fc区：
234位氨基酸Arg、235位氨基酸Ala或Arg、239位氨基酸Lys，和297位氨基酸Ala。
[93][88]至[92]中任一项的抗原结合分子，其中
形成第一抗原结合位点的重链可变结构域通过第一CH1结构域与Fc区连接，形成第一抗原结合位点的轻链可变结构域与第一CL结构域连接；并且
形成第二抗原结合位点的重链可变结构域通过第二CH1结构域与Fc区连接，形成第二抗原结合位点的轻链可变结构域与第二CL结构域连接。
[94][93]的抗原结合分子，其中控制CH1和CL结构域的电荷，使得形成第一抗原结合结构域的重链可变区与形成第一抗原结合结构域的轻链可变区组装，和/或形成第二抗原结合结构域的重链可变区与形成第二抗原结合结构域的轻链可变区组装。
[95][71]至[94]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有细胞毒活性。
[96][95]的抗原结合分子，其中所述细胞毒活性是T细胞依赖性细胞毒活性。
[97]分离的多核苷酸，其编码[71]至[96]中任一项的抗原结合分子。
[98]包含[97]的多核苷酸的宿主细胞。
[99]产生抗体的方法，其包括培养[98]的宿主细胞以产生抗原结合分子。
[100][99]的方法，其进一步包括从宿主细胞的培养物中回收抗原结合分子。
[101]药物组合物，其包含[71]至[96]中任一项的抗原结合分子和药学上可接受的载体。
[102][101]的药物组合物，其诱导T细胞依赖性细胞毒性。
[103][101]或[102]的组合物，其是用于治疗和/或预防癌症的药物组合物。
[104][101]至[103]中任一项的组合物，其是用于治疗和/或预防卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的药物组合物。
[105][71]至[96]中任一项的抗原结合分子在制备药物中的用途。
[106][71]至[96]中任一项的抗原结合分子在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的用途。
[107][71]至[96]中任一项的抗原结合分子在制备用于治疗和/或预防卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的药物中的用途.
[108]治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的[71]至[96]中任一项的抗原结合分子。
[109]治疗患有卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的[71]至[96]中任一项的抗原结合分子。
[110]用于治疗和/或预防癌症的试剂盒，其至少包含[71]至[96]中任一项的抗原结合分子,和使用说明书。
[111]用于治疗和/或预防卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的试剂盒，其至少包含[71]至[96]中任一项的抗原结合分子，和使用说明书。
本发明的有益效果
本公开提供了通过使T细胞靠近表达CLDN6的细胞并利用T细胞对表达CLDN6的癌细胞的细胞毒性来实现癌症治疗的多特异性抗原结合分子、产生多特异性抗原结合分子的方法，和含有此类多特异性抗原结合分子作为诱导细胞毒性的活性成分的药物组合物。本公开的多特异性抗原结合分子具有强的抗肿瘤活性，诱导细胞毒性，并且可以靶向和损伤表达CLDN6的细胞，从而能够治疗和预防多种癌症。此外，抗原结合分子包含特异性序列还对CLDN6具有优越的特异性，在血液中的半衰期长，以及改进的安全性、稳定性和可制备性。
本公开还提供了对CLDN6显示优异特异性的抗原结合分子，其能够准确检测生物样品中CLDN6的存在，以及诊断多种癌症。还可以通过靶向CLDN6表达细胞来治疗癌症。
附图简述
[图1]抗CLDN6/CD3双特异性抗体(AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01和6PHU3/TR01)的T细胞活化活性。在存在hCLDN6/BaF(A)、hCLDN9/BaF(B)和hCLDN6(Q156L)/BaF(C)的情况下检查了每种抗体的T细胞活化活性。纵轴表示含有抗体的孔与不含抗体的孔相比的发光倍数，而横轴表示抗CLDN6/CD3双特异性抗体的浓度。
[图2-1]抗CLDN6/CD3双特异性抗体(AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01和6PHU3/TR01)与人和小鼠密蛋白家族蛋白的结合特异性。通过流式细胞仪以10微克/ml的浓度检查抗CLDN6/CD3双特异性抗体的相对结合活性。纵轴表示与FreeStyleTM 293-F转染子结合的抗体的MFI值，所述转染子瞬时表达人或小鼠CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9。KLH/TR01用作阴性对照。测试市售的人CLDN6抗体(MAB3656)、人CLDN3抗体(MAB4620)和人CLDN4抗体(MAB4219)作为对照。
[图2-2]图2-1的续。
[图3]抗CLDN6/CD3双特异性抗体(AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01)的体内抗肿瘤效果。图3a显示了HuH-7T细胞注射模型的肿瘤体积变化，图3b显示了OV-90T细胞注射模型的肿瘤体积变化。在这项研究中，每组(n＝5)在肿瘤接种后第14天静脉内施用5mg/kg的抗体或运载体。
[图4]用5mg/kg抗CLDN6/CD3双特异性抗体(AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01)处理的小鼠体重变化，如图3所述。分别显示了携带HuH-7的T细胞注射模型(a)和携带OV-90的T细胞注射模型(b)的体重变化。纵轴表示体重，横轴表示接种肿瘤后的天数。
[图5]施用5mg/kg抗CLDN6/CD3双特异性抗体(AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01)或运载体后，OV-90T细胞注射模型中的血浆ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA水平，如图3所述。纵轴分别表示ALT(丙氨酸氨基转移酶)、ALP(碱性磷酸酶)、GGT(γ-谷氨酰转肽酶)、GLDH(谷氨酸脱氢酶)、TBIL(总胆红素)和TBA(总胆汁酸)。
[图6]用5mg/kg抗CLDN6/CD3双特异性抗体(AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01)处理的小鼠中抗体浓度的时间变化，如图3所述。分别显示了HuH-7T细胞注射模型(上)和OV-90T细胞注射模型(下)中抗体的血浆浓度。纵轴表示小鼠血浆中的抗体浓度(微克/毫升)，横轴表示处理后的天数。
[图7]OVCAR-3T细胞注射模型中抗CLDN6/CD3双特异性抗体的体内抗肿瘤效果和体重变化。在肿瘤移植后第29天用5mg/kg AE3-20/TR01、CDA0013/TR01或运载体静脉内处理小鼠。处理后检查肿瘤体积(上)和体重(下)。
[图8]在OVCAR-3T细胞注射模型中利用5mg/kg CDA0013/TR01处理后的血浆ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA水平，如图7所述。纵轴分别表示在施用CDA0013/TR01或不加处理后ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA的浓度。
[图9]OVCAR-3T细胞注射模型中AE3-20/TR01和CDA0013/TR01浓度的时间变化，如图7所述。纵轴表示小鼠血浆中的抗体浓度(微克/mL),横轴表示处理后的天数。
[图10]多种抗CLDN6/CD3双特异性抗体对hCLDN6/BaF的结合活性。纵轴以线性方式表示抗体对hCLDN6/BaF的MFI值，作为结合活性。
[图11]在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF存在下,多种抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化活性。横轴表示含有抗体的孔与不含抗体的孔相比的发光倍数。KLH/TR01用作阴性对照。条形从底部按以下顺序显示：CLDN6、CLDN3、CLDN4和CLDN9。
[图12]图11的续。
[图13]在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF存在下，多种抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化活性。横轴表示含有抗体的孔与不含抗体的孔相比的发光倍数。在hCLDN6/BaF存在下未测试1nM和0.1nM的KLH/TR01。KLH/TR01用作阴性对照。条形从底部按以下顺序显示：CLDN6(抗体浓度10nM)、CLDN6(抗体浓度1nM)、CLDN6(抗体浓度0.1nM)、CLDN3(抗体浓度10nM)、CLDN4(抗体浓度10nM)和CLDN9(抗体浓度10nM)。
[图14]在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF存在下，多种抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化活性。横轴表示含有抗体的孔与不含抗体的孔相比的发光倍数。在hCLDN6/BaF存在下未测试1nM和0.1nM的KLH/TR01。KLH/TR01用作阴性对照。条形从底部按以下顺序显示：CLDN6(抗体浓度10nM)、CLDN6(抗体浓度1nM)、CLDN6(抗体浓度0.1nM)、CLDN3(抗体浓度10nM)、CLDN4(抗体浓度10nM)和CLDN9(抗体浓度10nM)。
[图15]在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF存在下，多种抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化活性。横轴表示含有抗体的孔与不含抗体的孔相比的发光倍数。在hCLDN6/BaF存在下未测试1nM和0.1nM的KLH/TR01。KLH/TR01用作阴性对照。条形从底部按以下顺序显示：CLDN6(抗体浓度10nM)、CLDN6(抗体浓度1nM)、CLDN6(抗体浓度0.1nM)、CLDN3(抗体浓度10nM)、CLDN4(抗体浓度10nM)和CLDN9(抗体浓度10nM)。
[图16]65H0671Q39E-SG1189v14k/54L0571Q38K-SK1018//TR01H(Q39K)-SG1191v14h/TR01L(Q38E)-SK1017(A)和65H0671Q39E-SG1189v14k/54L0571Q38K-SK1021//TR01H(Q39K)-SG1191v14h/TR01L(Q38E)-SK1017(B)的电荷异质性。电荷异质性和pI值使用Maurice(ProteinSimple)在280nm处的UV吸光度来评估。相关软件Compass for iCE(2.0.10)用于数据分析。
[图17]抗CLDN6/CD3双特异性抗体AE3-20/TR01和CS2201在OV-90T细胞注射模型中的体内抗肿瘤效果。在肿瘤接种后第14天静脉内施用单剂量的0.1mg/kg的每种抗CLDN6/CD3双特异性抗体。分别显示了肿瘤体积变化(上)和体重(下)。
[图18]抗CLDN6/CD3双特异性抗体AE3-20/TR01和CS2201在OV-90T细胞注射模型中的体内抗肿瘤效果。在肿瘤接种后第15天静脉内施用单剂量的5mg/kg的每种抗CLDN6/CD3双特异性抗体。分别显示了肿瘤体积变化(上)和体重(下)。
[图19]在OV-90T细胞注射模型中用5mg/kg AE3-20/TR01或CS2201处理后的血浆ALT、GLDH、TBA、ALP和TBIL水平，如图17和18所述。纵轴表示施用AE3-20/TR01、CS2201和运载体后ALT、GLDH、TBA、ALP和TBIL的浓度。
[图20]OV-90T细胞注射模型中AE3-20/TR01和CS2201浓度的时间变化,如图17和18所述。纵轴表示小鼠血浆中的抗体浓度(微克/毫升)，横轴表示处理后的天数。
[图21A]抗CLDN6/CD3双特异性抗体CS2425在OV-90T细胞注射模型中的体内抗肿瘤效果。在肿瘤接种后第15天静脉内施用单剂量0.1mg/kg的CS2425。分别显示了肿瘤体积变化(上)和体重变化(下)。
[图21B]抗CLDN6/CD3双特异性抗体CS2425在OV-90T细胞注射模型中的体内抗肿瘤效果。在肿瘤接种后第15天静脉内施用单剂量5mg/kg的CS2425。分别显示了肿瘤体积变化(上)和体重变化(下)。
[图22]在OV-90T细胞注射模型中用CS2425处理后的血浆ALT、GGT、TBA、ALP和TBIL水平，如图21A和21B所述。纵轴表示施用0.1mg/kg和5mg/kg CS2425或运载体后ALT、GGT、TBA、ALP和TBIL的浓度。
[图23]OV-90T细胞注射模型中CS2425浓度的时间变化，如图21A和21B所述。纵轴表示小鼠血浆中的抗体浓度(微克/mL)，横轴表示处理后的天数。
[图24]显示在每种测试物质(包括阴性对照和阳性对照)存在下培养67小时的CD8-CD25low PBMC中分泌IL-2的CD4+ T细胞比例的最大值的图表。数据显示了所使用的PBMC来源的各个供体的分泌IL-2的CD4+T细胞比例的最大值。当在没有测试物质的情况下进行培养时，没有抗原显示来自研究对照的结果。虚线表示正阈值。
[图25]显示通过MAPP为CS2425轻链的一部分鉴定的每个氨基酸位置的肽数量的热图的图表。该区域每个氨基酸位置的所鉴定肽的数量显示在热图中，其中单元格颜色代表所鉴定肽的数量(见key)。从由单核细胞分化而来的CS2425脉冲DC中获得肽-MHC II复合体。
[图26]显示在每种测试物质(包括阴性对照和阳性对照)存在下培养67小时的CD8-CD25low PBMC中分泌IL-2的CD4+ T细胞比例的最大值的图表。数据显示了所使用的PBMC来源的各个供体的分泌IL-2的CD4+T细胞比例的最大值。当在没有测试物质的情况下进行培养时，没有抗原显示来自研究对照的结果。虚线表示正阈值。
[图27]在OV-90T细胞注射模型中，用抗CLDN6/CD3双特异性抗体CS2201、CS2425、CS2884、CS2885和CS2886处理的小鼠的体内抗肿瘤效果。在肿瘤接种后第15天静脉内施用单剂量的5mg/kg的每种抗CLDN6/CD3双特异性抗体。在单次施用5mg/kg的每种抗体后，在小鼠中检查肿瘤体积(上)和体重(下)。
[图28]在OV-90T细胞注射模型中，用抗CLDN6/CD3双特异性抗体CS2201、CS2425、CS2884、CS2885和CS2886处理的小鼠中肝损伤标志物的血浆水平，如图27所示。在每种抗CLDN6/CD3双特异性抗体处理后，在小鼠中评估血浆ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA水平。纵轴表示在施用5mg/kg的每种抗CLDN6/CD3双特异性抗体或运载体后小鼠血浆中ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA的浓度。
[图29]在OV-90T细胞注射模型中，用抗CLDN6/CD3双特异性抗体CS2201、CS2425、CS2958、CS2959、CS2960和CS2961处理的小鼠的体内抗肿瘤效果。在肿瘤接种后第15天静脉内施用单剂量的5mg/kg的每种抗CLDN6/CD3双特异性抗体。在单次施用5mg/kg的每种抗体后，在小鼠中检查肿瘤体积(上)和体重(下)
[图30]在OV-90T细胞注射模型中用抗CLDN6/CD3双特异性抗体CS2201、CS2425、CS2958、CS2959、CS2960和CS2961处理的小鼠中肝损伤标志物的血浆水平，如图29所示。在每种抗CLDN6/CD3双特异性抗体处理后，评估在小鼠中血浆ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA水平。纵轴表示在施用5mg/kg的每种抗CLDN6/CD3双特异性抗体或运载体后小鼠血浆中ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA的浓度。
[图31]在OV-90T细胞注射模型中抗CLDN6/CD3双特异性抗体CS2201、CS2425、CS2958、CS2959、CS2960和CS2961浓度的时间变化，如图29所述。纵轴表示小鼠血浆中的抗体浓度(微克/mL)，横轴表示处理后的天数。
[图32]在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、hCLDN9/BaF或hCLDN6(Q156L)/BaF存在下，通过使用GloResponseTM NFAT-luc2 Jurkat细胞的T细胞活化生物测定法(TCell Activation Bioassay)测定的多种浓度的抗CLDN6/CD3双特异性抗体(AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425和CS2961)的T细胞活化活性。纵轴表示含有抗体的孔与不含抗体的孔相比的发光倍数。KLH/TR01用作阴性对照。
[图33]在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF存在下,通过使用GloResponseTM NFAT-luc2 Jurkat细胞的T细胞活化生物测定法测定的多种浓度的抗CLDN6/CD3双特异性抗体(CS2201、CS2961、CS3346、CS3347H和CS3348)的T细胞活化活性。纵轴表示含有抗体的孔与不含抗体的孔相比的发光倍数。KLH/TR01用作阴性对照。
[图34]通过LDH测定法测定的抗CLDN6/CD3双特异性抗体(AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425、CS2961、CS3346、CS3347和CS3348)对表达CLDN6的OVCAR3卵巢癌细胞系的T细胞依赖性细胞毒性。纵轴表示细胞裂解的百分比，横轴表示抗CLDN6/CD3双特异性抗体的浓度。KLH/TR01用作阴性对照。
[图35-1]抗CLDN6/CD3双特异性抗体(CS2201、CS2961、AH05/TR01和6PHU3/TR01)与人CLDN家族蛋白(CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9)的结合活性。通过流式细胞仪以15微克/ml的浓度检查抗CLDN6/CD3双特异性抗体与BaF3转染子(hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF和hCLDN9/BaF)的结合活性，并将其绘制为直方图。KLH/TR01用作阴性对照。CS2961对人CLDN6的特异性在所测试的抗体中最高。
[图35-2]图35-1的续。
[图36]在40℃储存后，抗CLDN6/CD3双特异性抗体的HMW种类形成。纵轴表示每个样品总峰面积中HMW种类的百分比。
[图37]在OV-90T细胞注射模型中抗CLDN6/CD3双特异性抗体的体内剂量依赖性抗肿瘤效果。在肿瘤接种后14天静脉内施用0.001至5mg/kg AE3-20/TR01的单剂量。分别显示了肿瘤体积变化(上)和体重变化(下)。
[图38]在OV-90T细胞注射模型中抗CLDN6/CD3双特异性抗体的体内剂量依赖性抗肿瘤效果。在肿瘤接种后15天静脉内施用0.0016至5mg/kg CS3348的单剂量。分别显示了肿瘤体积变化(上)和体重变化(下)。
[图39]人CLDN9和人CLDN6的氨基酸序列比对。人CLDN9和人CLDN6在胞外结构域1中包含几乎相同的序列，除了N端残基(第29位的Met/Leu)。胞外结构域2中的两个氨基酸在人CLDN9和人CLDN6中不同(第145位的Arg/Leu和第156位的Gln/Leu)。
[图40]在携带OVCAR-3的T细胞注射模型(TK220001)中抗CLDN6/CD3双特异性抗体CS3348的抗肿瘤效果。
[图41]在携带NCI-H1435的T细胞注射模型(TK219005)中抗CLDN6/CD3双特异性抗体CS3348的抗肿瘤效果。
[图42]在携带NUGC-3的T细胞注射模型(TK220003)中抗CLDN6/CD3双特异性抗体CS3348的抗肿瘤效果。
[实施方案的描述]
本文描述或引用的技术和程序通常是本领域技术人员很好理解和使用常规方法学通常采用的，例如以下文献中描述的广泛利用的方法学，Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,等人编辑,(2003))；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:APractical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor编辑(1995)),Harlow和Lane,编辑(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney,编辑(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,编辑,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,编辑,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney),编辑,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather 和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell,编辑,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell,编辑)；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos,编辑,1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis等人,编辑,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人,编辑,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.,编辑,IRL Press,1988-1989)；MonoclonalAntibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean,编辑,Oxford UniversityPress,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold SpringHarbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra,编辑,Harwood Academic Publishers,1995)；和Cancer:Principles and Practice ofOncology(V.T.DeVita等人,编辑,J.B.Lippincott Company,1993)。
提供下述定义和详细描述以利于对本文所示的本公开的理解。
定义
氨基酸
在本文中，氨基酸由一或三字母代码或两者描述，例如，Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I或Val/V。
氨基酸的改变
对于抗原结合分子的氨基酸序列中的氨基酸改变(在本说明书中也称为“氨基酸取代”)，可适当使用已知方法如定点诱变方法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))和重叠延伸PCR。此外，也可以采用几种已知的方法作为用于取代非天然氨基酸的氨基酸改变方法(Annu Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249；和Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如，适合使用包含tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))，所述tRNA具有与终止密码子之一(UAG密码子，琥珀密码子)的互补琥珀抑制tRNA结合的非天然氨基酸。
在本说明书中，当描述氨基酸改变的位点时，术语“和/或”的含义包括其中“和”和“或”适当组合的每种组合。具体而言，例如，“第33、55和/或96位的氨基酸被取代”包括氨基酸改变的以下变体：(a)位置33、(b)位置55、(c)位置96、(d)位置33和55、(e)位置33和96、(f)位置55和96、以及(g)位置33、55和96上的氨基酸。
此外，在本文中，作为表示氨基酸改变的表述，可以适当地使用在指定特定位置的数字的前后分别表示改变前后的氨基酸的一字母或三字母代码的表述。例如，当取代抗体可变区中含有的氨基酸时使用的改变N100bL或Asn100bLeu表示位置100b(根据Kabat编号)上的Asn被Leu取代。即数字表示根据Kabat编号的氨基酸位置，数字前写的一字母或三字母氨基酸代码表示取代前的氨基酸，数字后写的一字母或三字母氨基酸代码表示取代后的氨基酸。类似地，当取代抗体恒定区中含有的Fc区的氨基酸时使用的改变P238D或Pro238Asp表明位置238(根据EU编号)上的Pro被Asp取代。即，数字表示根据EU编号的氨基酸位置，数字前写的一字母或三字母氨基酸代码表示取代前的氨基酸，而数字后写的一字母或三字母氨基酸代码表示取代后的氨基酸。
抗原结合分子
如本文所用，术语“抗原结合分子”是指包含抗原结合位点的任何分子或对抗原具有结合活性的任何分子，并且还可以指具有约五个氨基酸或更多长度的肽或蛋白质等分子。肽和蛋白质不限于来自生物体的那些，例如，它们可以是由人工设计的序列产生的多肽。它们也可以是天然存在的多肽、合成多肽、重组多肽等中的任一种。包含已知稳定构象结构如α/β桶作为支架，和其中分子的一部分被制成抗原结合位点的支架分子，也是本文所述的抗原结合分子的一个实施方案。
密蛋白-6(CLDN6)和其他密蛋白家族蛋白
除非另有说明，本文所用术语“CLDN6”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然密蛋白-6，包括哺乳动物，例如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人CLDN6(hCLDN6)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:125或126，小鼠CLDN6(mCLDN6)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:130。
除了CLDN6，密蛋白家族中还有许多其他蛋白质，如CLDN3、CLDN4和CLDN9。人CLDN3(hCLDN3)、人CLDN4(hCLDN4)和人CLDN9(hCLDN9)的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:128、129和127。小鼠CLDN3(mCLDN3)、小鼠CLDN4(mCLDN4)和小鼠CLDN9(mCLDN9)的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:132、133和131。
对CLDN6的结合活性
本文所述的对CLDN6的结合活性是指对本文所述的CLDN6蛋白或CLDN6蛋白的部分肽的全部或一部分的特异性结合活性。
在某些实施方案中，对CLDN6的结合活性是对CLDN6的第一胞外域(SEQ ID NO:125或126的氨基酸29-81)或CLDN6的第二胞外域(SEQ ID NO:125或126的氨基酸138-159)的结合活性。在某些实施方案中，对CLDN6的结合活性是对在真核细胞表面上表达的人CLDN6的结合活性。在某些实施方案中，对CLDN6的结合活性是对在癌细胞表面上表达的CLDN6蛋白的结合活性。
对T细胞受体复合体的结合活性
如本文所用，对T细胞受体复合体的结合活性是指对T细胞受体复合体的部分肽的全部或一部分的结合活性。T细胞受体复合体可以是T细胞受体本身，也可以是与T细胞受体一起构成T细胞受体复合体的衔接分子。CD3适合作为衔接分子。
如本文所用，对T细胞受体的结合活性是指对T细胞受体的部分肽的全部或一部分的结合活性。T细胞受体的部分可以是T细胞受体的可变区或T细胞受体的恒定区；然而，恒定区中存在的表位是优选的。恒定区序列的实例包括RefSeq登录号CAA26636.1(SEQ IDNO:135)的T细胞受体α链、RefSeq登录号C25777(SEQ ID NO:136)的T细胞受体β链、RefSeq登录号A26659(SEQ ID NO:137)的T细胞受体γ1链、RefSeq登录号AAB63312.1(SEQ ID NO:138)的T细胞受体γ2链和RefSeq登录号AAA61033.1(SEQ ID NO:139)的T细胞受体δ链。
如本文所用，对CD3的结合活性是指对CD3的部分肽的全部或一部分的结合活性。CD3的部分可以是存在于构成人CD3的γ链、δ链或ε链序列中的任何表位。关于构成CD3的γ链、δ链或ε链的结构，其多核苷酸序列公于在RefSeq登录号NM_000073.2、NM_000732.4和NM_000733.3中，并且其多肽序列示于SEQ ID NO:140(NP_000064.1)、141(NP_000723.1)和142(NP_000724.1)中，其中RefSeq登录号示于括号中。
亲和力
“亲和力”是指分子(例如，抗原结合分子或抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对成员(例如，抗原结合分子和抗原，或抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法，包括本文所述的那些方法来测量。下面描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
确定亲和力的方法
在某些实施方案中，本文提供的抗原结合分子或抗体对其抗原具有1微M或更小、120nM或更小、100nM或更小、80nM或更小、70nM或更小、50nM或更小、40nM或更小、30nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、2nM或更小、1nM或更小、0.1nM或更小、0.01nM或更小、或0.001nM或更小(例如，10-8M或更小、10-8M至10-13M,10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，CLDN6的抗体/抗原结合分子的Kd值落在1-40、1-50、1-70、1-80、30-50、30-70、30-80、40-70、40-80或60-80nM的范围内。
在一个实施方案中，Kd通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)测量。在一个实施方案中，用目的抗体的Fab版本及其抗原进行RIA。例如，Fab对抗原的溶液结合亲和力是通过在滴定系列的未标记抗原存在下用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原来测量的(参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为建立测定条件，将MICROTITER(注册商标)多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5微克/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后在室温(约23摄氏度)下用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭两到五个小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的连续稀释液混合(例如，与抗VEGF抗体Fab-12的评估一致，在Presta等人，Cancer Res.57:4593-4599(1997)中)。然后将目的Fab温育过夜；然而，温育可以持续更长的时间(例如，约65个小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板以在室温下温育(例如，一小时)。然后去除溶液并用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20(TWEEN-20(注册商标))将板洗涤八次。当板干燥后，加入150微升/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对板计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定。
根据另一个实施方案，使用BIACORE(注册商标)表面等离振子共振测定测量Kd。例如，使用BIACORE(注册商标)-2000或BIACORE(注册商标)-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的测定是在25摄氏度下利用固定抗原CM5芯片以～10个响应单位(RU)进行的。在一个实施方案中，羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)根据供应商的说明书用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。在以5微升/分钟的流速注射前，抗原用10mM醋酸钠(pH 4.8)稀释至5微克/ml(～0.2micro M)以达到大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25摄氏度下以约为25微升/分钟的流速将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)注射到含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型(BIACORE(注册商标)评估软件版本3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比值koff/kon。参见，例如，Chen等人，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离振子共振测定法的结合速率(on-rate)超过106M-1s-1，则可以使用荧光猝灭技术来确定结合速率，所述荧光淬灭技术在如在分光光度计，如装配有停流的分光光度计(Aviv Instruments)或带有搅拌比色杯的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量，在存在增加浓度抗原下，在25摄氏度下测量PBS，pH7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少。
根据测量上述抗原结合分子或抗体的亲和力的方法，本领域技术人员可以针对多种抗原对其他抗原结合分子或抗体进行亲和力测量。
抗体
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用并涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原-结合活性。
抗体类别
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。有五种主要类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中这些抗体中的几种抗体可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
除非另有说明，轻链恒定区中的氨基酸残基在本文中按照Kabat等人编号，而重链恒定区中的氨基酸残基的编号按照EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
构架
“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以下列序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
人共有构架
“人共有构架”是代表人免疫球蛋白VL或VH构架序列选择中最常出现的氨基酸残基的构架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),卷1-3的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等人，上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等人，上文中的亚组III。
HVR
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区域，其在序列上是高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL(L1、L2、L3)中。
本文的示例性HVR包括：
(a)出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)出现在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触(MacCallum等人J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有说明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中按照Kabat等人，上文进行编号。
HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3也分别被称为“H-CDR1”、“H-CDR2”、“H-CDR3”、“L-CDR1””、“L-CDR2”和“L-CDR3”。
可变区
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体VH或VL结构域来分离结合特定抗原的抗体以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
嵌合抗体
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同的来源或物种的抗体。类似地，术语“嵌合抗体可变结构域”是指抗体可变区，其中重链和/或轻链可变区的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同的来源或物种。
人源化抗体
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常为两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些FR。人源化抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”，例如非人抗体，是指经过人源化的抗体。“人源化抗体可变区”是指人源化抗体的可变区。
人抗体
“人抗体”是这样的抗体,其具有与由人或人细胞产生的或源自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列。人抗体的这一定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“人抗体可变区”是指人抗体的可变区。
多核苷酸(核酸)
如本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其类似物。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸可包含合成后的修饰，如与标记的缀合。其他类型的修饰包括例如“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸,核苷酸间修饰例如具有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、氨基甲酸酯(carbamates)等)和带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有侧基部分，例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的那些、带有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些、含有烷基化剂的那些、带有修饰的键(例如，α异头核酸等)的那些，以及未修饰形式的多核苷酸。此外，糖中通常存在的任何羟基可以被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团替换，被标准保护基团保护，或被激活以制备与额外核苷酸的额外键，或可以缀合到固体或半固体支持体。5'和3'末端OH可以被磷酸化或被胺或1至20个碳原子的有机加帽基团部分取代。其他羟基也可以衍生为标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域公知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基-、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖(lyxose)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose)、无环类似物和碱性核苷类似物如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被备选的连接基团替换。这些备选的连接基团包括但不限于，其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯(thioate)”)、P(S)S(“二硫代酸酯(dithioate)”)、(O)NR2(“酰胺酸酯(amidate)”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛(formacetal)”)取代的实施方案，其中每个R或R'独立地为H或取代或未取代的烷基(1-20C)任选地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有连接都需要相同。前述描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
分离的(核酸)
“分离的”核酸分子是已经与其自然环境的成分分离的核酸分子。分离的核酸分子还包括包含在通常含有所述核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。
载体
如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合到其已被引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。可以使用病毒或电穿孔将载体引入宿主细胞。然而，载体的引入不限于体外方法。例如，也可以直接使用体内方法将载体引入受试者。
宿主细胞
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指其中已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化子”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和由其衍生的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变体后代包括在本文中。
特异性
“特异的”表示与一个或多个结合配偶体特异性结合的分子不显示与配偶体以外的分子的任何显著结合。此外，当抗原结合位点对抗原中含有的多个表位中的特定表位具有特异性时，也使用“特异的”。如果抗原结合分子与抗原特异性结合，也描述为“所述抗原结合分子对抗原具有/显示特异性”。当在多个不同的抗原中含有由抗原结合位点结合的表位时，含有所述抗原结合位点的抗原结合分子可以与具有该表位的多种抗原结合。
抗体片段
“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含完整抗体的一部分,结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有本文定义的Fc区的重链的抗体。
可变片段(Fv)
在本文中，术语“可变片段(Fv)”是指由一对抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)构成的抗体来源的抗原结合位点的最小单位。1988年，Skerra和Pluckthun发现通过在细菌信号序列下游插入抗体基因并诱导该基因在大肠杆菌(E.coli)中的表达，可以从大肠杆菌周质(periplasm)级分制备均质和活性抗体(Science(1988)240(4855),1038-1041)。在由周质级分制备的Fv中，VH以结合抗原的方式与VL结合。
scFv、单链抗体和sc(Fv)2
在本文中，术语“scFv”、“单链抗体”和“sc(Fv)2”均指含有源自重链和轻链的可变区而非恒定区的单个多肽链的抗体片段。通常，单链抗体还在VH和VL结构域之间含有多肽接头，这使得能够形成被认为允许抗原结合的所需结构。Pluckthun在"The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,卷113,Rosenburg和Moore,编辑,Springer-Verlag,NewYork,269-315(1994)"中详细讨论了单链抗体。也参见国际专利公开WO1988/001649；美国专利号4,946,778和5,260,203。在一个特定的实施方案中，单链抗体可以是双特异性的和/或人源化的。
scFv是单链低分子量抗体，其中形成Fv的VH和VL通过肽接头连接在一起(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85(16),5879-5883)。VH和VL可以通过肽接头保持紧密接近。
sc(Fv)2是单链抗体，其中两个VL和两个VH的四个可变区通过接头如肽接头连接以形成单链(J Immunol.Methods(1999)231(1-2),177-189)。两个VH和两个VL可能来自不同的单克隆抗体。这种sc(Fv)2优选包括例如识别单一抗原中存在的两个表位的双特异性sc(Fv)2，如Journal of Immunology(1994)152(11),5368-5374中公开的。可以通过本领域技术人员已知的方法产生sc(Fv)2。例如，可以通过用接头如肽接头连接scFv来产生sc(Fv)2。
在本文中，sc(Fv)2包括从单链多肽的N端开始以VH、VL、VH和VL的顺序排列的两个VH单元和两个VL单元([VH]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VL])。两个VH单元和两个VL单元的顺序不限于上述形式，并且它们可以以任何顺序排列。下面列出了表格的实例。
[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]
[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]
[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]
[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]
[VL]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VH]
也在WO2006/132352中详细描述了sc(Fv)2的分子形式。根据这些描述，本领域技术人员可以适当地制备所需的sc(Fv)2以产生本文公开的多肽复合体。
此外，本公开的抗原结合分子或抗体可以与载体聚合物如PEG或有机化合物如抗癌剂缀合。或者，优选将糖链添加序列插入抗原结合分子或抗体中，使得所述糖链产生期望的效果。
用于连接抗体可变区的接头包含可以通过基因工程引入的任意肽接头、合成接头和例如Protein Engineering,9(3),299-305,1996中公开的接头。然而，在本公开中优选肽接头。肽接头的长度没有特别限制，并且可以根据目的由本领域技术人员适当地选择。长度优选为5个氨基酸或更多(没有特别限定，上限通常为30个氨基酸或更少，优选为20个氨基酸或更少)，特别优选为15个氨基酸。当sc(Fv)2含有三个肽接头时，它们的长度可以相同或不同。
例如，此类肽接头包括：
Ser
Gly Ser
Gly Gly Ser
Ser Gly Gly
Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:147)
Ser Gly Gly Gly(SEQ ID NO:148)
Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:149)
Ser Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:150)
Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:151)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:152)
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:153)
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:154)
(Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:149))n
(Ser Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:150))n
其中n是1或更大的整数。本领域技术人员可以根据目的相应地选择肽接头的长度或序列。
合成接头(化学交联剂)通常用于交联肽，实例包括：
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，
二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)，
双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)，
二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)，
二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)，
乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)，
乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)，
酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)，和双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)。这些交联剂是可商购的。
通常，需要三个接头才能将四个抗体可变区连接在一起。待使用的接头可以是相同类型或不同类型。
Fab、F(ab')2和Fab'
“Fab”由单条轻链、来自单条重链的CH1结构域和可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“F(ab')2”或“Fab”是通过用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等蛋白酶处理免疫球蛋白(单克隆抗体)而产生的，并且指通过消化存在于两条H链每一条中的铰链区之间的二硫键附近的免疫球蛋白(单克隆抗体)产生的抗体片段。例如，木瓜蛋白酶切割存在于两条H链的每一条中的铰链区之间的二硫键上游的IgG,以产生两个同源抗体片段,其中包含VL(L链可变区)和CL(L链恒定区)的L链与包含VH(H链可变区)和CHγ1(H链恒定区中的γ1区)的H链片段通过其C端区的二硫键连接。这两个同源抗体片段中的每一个都称为Fab'。
“F(ab')2”由两条轻链和两条重链组成，其包含CH1结构域的恒定区和CH2结构域的一部分，从而在两条重链之间形成二硫键。可以优选如下产生本文公开的F(ab')2。用蛋白酶如胃蛋白酶部分消化整个单克隆抗体或包含所需抗原结合位点的此类整个单克隆抗体；并且通过吸附到蛋白A柱上去除Fc片段。蛋白酶没有特别限制，只要它能在合适设置的酶反应条件如pH值下以选择性的方式切割整个抗体产生F(ab')2。这种蛋白酶包括例如胃蛋白酶和无花果蛋白酶(ficin)。
Fc区
本文中的术语“Fc区”或“Fc结构域”用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区域。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或甘氨酸-赖氨酸(残基446-447)可能存在，也可能不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述。
Fc受体
术语“Fc受体”或“FcR”是指与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，FcR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是这样的FcR,其结合IgG抗体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式的受体。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有主要在其细胞质结构域中不同的相似的氨基酸序列。激活受体FcγRIIA在其细胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见例如Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。例如在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中概述了FcR。其他FcR，包括将来要鉴定的那些，都包含在本文的术语“FcR”中。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))和调节免疫球蛋白的稳态。测量与FcRn结合的方法是已知的(参见，例如，Ghetie和Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等人,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。
可以在例如转基因小鼠或表达人FcRn的转染人细胞系中，或在向其施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定与人FcRn的体内结合以及人FcRn高亲和力结合多肽的血浆半衰期。WO2000/42072(Presta)描述了与FcR结合增加或减少的抗体变体。也参见，例如，Shields等人J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
Fcγ受体
Fcγ受体是指能够结合单克隆IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的Fc结构域的受体，并且包括属于基本上由Fcγ受体基因编码的蛋白质家族的所有成员。在人类中，该家族包括FcγRI(CD64)，包括同工型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同工型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同工型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)；以及所有未鉴定的人类Fcγ受体、Fcγ受体同工型及其同种异型。然而，Fcγ受体不限于这些实例。不限于此，Fcγ受体包括源自人、小鼠、大鼠、兔和猴的那些。Fcγ受体可以源自任何生物体。小鼠Fcγ受体包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)，以及所有未鉴定的小鼠Fcγ受体、Fcγ受体同工型及其同种异型。此类优选的Fcγ受体包括例如人FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16)和/或FcγRIIIB(CD16)。FcγRI的多核苷酸序列和氨基酸序列分别示于RefSeq登录号NM_000566.3和RefSeq登录号NP_000557.1；FcγRIIA的多核苷酸序列和氨基酸序列分别示于RefSeq登录号BC020823.1和RefSeq登录号AAH20823.1；FcγRIIB的多核苷酸序列和氨基酸序列分别示于RefSeq登录号BC146678.1和RefSeq登录号AAI46679.1；FcγRIIIA的多核苷酸序列和氨基酸序列分别示于RefSeq登录号BC033678.1和RefSeq登录号AAH33678.1；FcγRIIIB的多核苷酸序列和氨基酸序列分别示于RefSeq登录号BC128562.1和RefSeq登录号AAI28563.1。除了上述FACS和ELISA形式之外，可以通过ALPHA筛选(放大发光邻近均相测定(Amplified LuminescentProximity Homogeneous Assay))、基于表面等离振子共振(SPR)的BIACORE方法及其他方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)评估Fcγ受体是否对单克隆IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的Fc结构域具有结合活性。
同时，“Fc配体”或“效应配体”是指与抗体Fc结构域结合形成Fc/Fc配体复合体的分子，优选多肽。所述分子可以源自任何生物体。Fc配体与Fc的结合优选诱导一种或多种效应子功能。此类Fc配体包括但不限于Fc受体、Fcγ受体、Fcα受体、Fcβ受体、FcRn、C1q和C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白A、葡萄球菌蛋白G和病毒Fcγ受体。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)(Davis等人，(2002)ImmunologicalReviews 190,123-136，它们是与Fcγ受体同源的Fc受体家族。Fc配体还包括与Fc结合的未鉴定分子。
Fcγ受体结合活性
可以通过使用上述FACS和ELISA形式，以及ALPHA筛选(Amplified LuminescentProximity Homogeneous Assay)和基于表面等离振子共振(SPR)的BIACORE方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)来评估Fc结构域与任何Fcγ受体FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB的受损的结合活性。
通过基于下面所述原理的ALPHA技术，使用两种类型的珠子进行ALPHA筛选：供体珠和受体珠。只有当连接供体珠的分子与连接受体珠的分子发生生物学相互作用并且当两个珠子非常靠近时，才会检测到发光信号。在激光束的激发下，供体珠中的光敏剂将珠周围的氧转化为激发态的单线态氧。当单线态氧在供体珠周围扩散并到达紧邻的受体珠时，会在受体珠内引发化学发光反应。该反应最终导致光发射。如果连接供体珠的分子不与连接受体珠的分子相互作用，则供体珠产生的单线态氧不会到达受体珠并且不会发生化学发光反应。
例如，生物素标记的抗原结合分子或抗体固定在供体珠上，谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记的Fcγ受体固定在受体珠上。在不存在包含竞争性突变Fc结构域的抗原结合分子或抗体的情况下，Fcγ受体与包含野生型Fc结构域的抗原结合分子或抗体相互作用，结果诱导520至620nm的信号。具有未标记的突变体Fc结构域的抗原结合分子或抗体与包含野生型Fc结构域的抗原结合分子或抗体竞争与Fcγ受体的相互作用。相对结合亲和力可以通过量化因竞争导致的荧光减少来确定。用于生物素化抗原结合分子或抗体如使用磺基-NHS-生物素等的抗体的方法是已知的。将GST标签添加到Fcγ受体的合适方法包括涉及将编码Fcγ受体的多肽与GST框内融合，使用导入了携带该基因的载体的细胞表达融合基因，然后使用谷胱甘肽柱进行纯化的方法。可以优选地例如通过使用诸如GRAPHPAD PRISM(GraphPad；San Diego)之类的软件基于非线性回归分析拟合成单点竞争模型来分析诱导的信号。
将用于观察它们相互作用的物质之一作为配体固定在传感器芯片的金薄层上。当光线照射到传感器芯片的背面，从而在金薄层和玻璃之间的界面发生全反射时，反射光的强度在某个位置会部分减弱(SPR信号)。将用于观察它们相互作用的其他物质作为分析物注入传感器芯片的表面。当分析物与配体结合时，固定的配体分子的质量增加。这会改变传感器芯片表面上溶剂的折射率。折射率的变化引起SPR信号的位置偏移(相反，解离将信号移回原始位置)。在Biacore系统中，将上述位移量(即传感器芯片表面上的量变化)绘制在垂直轴上，因此质量随时间的变化显示为测量数据(传感图)。动力学参数(结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd))由传感图曲线确定，亲和力(KD)由这两个常数之间的比率确定。在BIACORE方法中优选使用抑制测定。在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010中描述了这种抑制试验的实例。
具有降低的Fcγ受体结合活性的Fc区
在本文中，“降低的Fcγ受体结合活性”是指，例如，基于上述分析方法，测试抗原结合分子或抗体的竞争活性比对照抗原结合分子或抗体的竞争活性少50％或更少，优选45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、20％或更少、或15％或更少，并特别优选10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少。
包含单克隆IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的Fc结构域的抗原结合分子或抗体可以适当地用作对照抗原结合分子或抗体。Fc结构域结构示于SEQ ID NO:143(A被添加到RefSeq登录号AAC82527.1的N末端)、144(A被添加到RefSeq登录号AAB59393.1的N末端)、145(A被添加到RefSeq登录号CAA27268.1的N末端)和146(A被添加到RefSeq登录号AAB59394.1的N末端)。此外，当包含特定同种型抗体的Fc结构域突变体的抗原结合分子或抗体用作测试物质时，使用包含相同同种型的Fc结构域的抗原结合分子或抗体作为对照评估突变体的突变对Fcγ受体结合活性的影响。如上所述，适当制备包含其Fcγ受体结合活性已被判断为降低的Fc结构域突变体的抗原结合分子或抗体。
此类已知突变体包括例如具有氨基酸231A-238S(EU编号)缺失的突变体(WO2009/011941)，以及突变体C226S、C229S、P238S、(C220S)(J.Rheumatol(2007)34,11)；C226S和C229S(Hum.Antibod.Hybridomas(1990)1(1),47-54)；C226S、C229S、E233P、L234V和L235A(Blood(2007)109,1185-1192)。
具体地，优选的抗原结合分子或抗体包括包含具有选自以下氨基酸位置的至少一个氨基酸的突变(例如取代)的Fc结构域的那些：在形成特定同种型抗体的Fc结构域的氨基酸中的220、226、229、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、264、265、266、267、269、270、295、296、297、298、299、300、325、327、328、329、330、331或332位(EU编号)。Fc结构域来源的抗体的同种型没有特别限制，并且可以使用源自单克隆IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的适当Fc结构域。优选使用源自IgG1抗体的Fc结构域。
优选的抗原结合分子或抗体包括，例如，包含具有以下所示的任一取代的Fc结构域的那些，其位置根据形成IgG1抗体的Fc结构域的氨基酸中的EU编号来指定(每个数字代表氨基酸残基在EU编号中的位置；数字前的一字母氨基酸符号代表取代前的氨基酸残基，而数字后的一字母氨基酸符号代表取代后的氨基酸残基)：
(a)L234F、L235E、P331S；
(b)C226S、C229S、P238S；
(c)C226S、C229S；或
(d)C226S、C229S、E233P、L234V、L235A；
以及具有在位置231至238处具有氨基酸序列缺失的Fc结构域的那些。
此外，优选的抗原结合分子或抗体还包括包含具有如下所示的任一取代的Fc结构域的那些，其位置根据形成IgG2抗体的Fc结构域的氨基酸中的EU编号来指定：
(e)H268Q、V309L、A330S和P331S；
(f)V234A；
(g)G237A；
(h)V234A和G237A；
(i)A235E和G237A；或
(j)V234A、A235E和G237A。每个数字代表氨基酸残基在EU编号中的位置；数字前的一字母氨基酸符号代表取代前的氨基酸残基，数字后的一字母氨基酸符号代表取代后的氨基酸残基。
此外，优选的抗原结合分子或抗体还包括包含具有如下所示的任一取代的Fc结构域的那些，其位置根据形成IgG3抗体的Fc结构域的氨基酸中的EU编号来指定：
(k)F241A；
(l)D265A；或
(m)V264A。每个数字代表氨基酸残基在EU编号中的位置；数字前的一字母氨基酸符号代表取代前的氨基酸残基，数字后的一字母氨基酸符号代表取代后的氨基酸残基。
此外，优选的抗原结合分子或抗体还包括包含具有如下所示的任一取代的Fc结构域的那些，其位置根据形成IgG4抗体的Fc结构域的氨基酸中的EU编号来指定：
(n)L235A、G237A和E318A；
(o)L235E；或
(p)F234A和L235A。每个数字代表氨基酸残基在EU编号中的位置；数字前的一字母氨基酸符号代表取代前的氨基酸残基，数字后的一字母氨基酸符号代表取代后的氨基酸残基。
其他优选的抗原结合分子或抗体包括，例如，包含Fc结构域的那些，在所述Fc结构域中形成IgG1抗体的Fc结构域的氨基酸中的位置233、234、235、236、237、327、330或331(EU编号)处的任何氨基酸被相应IgG2或IgG4中EU编号中相应位置的氨基酸取代。
优选的抗原结合分子或抗体还包括例如包含Fc结构域的那些，其中在形成IgG1抗体的Fc结构域的氨基酸中的位置234、235和297(EU编号)处的任何一个或多个氨基酸被其他氨基酸取代。取代后的氨基酸类型没有特别限制；然而，特别优选包含其中位置234、235和297处的任何一个或多个氨基酸被丙氨酸取代的Fc结构域的抗原结合分子或抗体。
优选的抗原结合分子或抗体还包括，例如，包含其中形成IgG1抗体的Fc结构域的氨基酸中的位置265(EU编号)处的氨基酸被另一氨基酸取代的Fc结构域的那些。取代后的氨基酸类型没有特别限制；然而，特别优选包含位置265处的氨基酸被丙氨酸取代的Fc结构域的抗原结合分子或抗体。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如美国专利号5,500,362或5,821,337或美国专利号6,737,056(Presta)中所述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者，或另外，例如在动物模型中，如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目的分子的ADCC活性。
补体依赖性细胞毒性
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活是通过补体系统的第一个成分(C1q)与(适当亚类的)抗体结合而启动的，这些抗体与其同源抗原(cognate antigen)结合。为了评估补体激活，可进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。例如在US PatentNo.6,194,551B1和WO1999/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变体Fc区的多肽)和增加或降低的C1q结合能力的多肽变体。还参见，例如，Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
T细胞依赖性细胞毒性
“T细胞依赖性细胞毒性”或“TDCC”是指这样的细胞毒性形式，其中抗原结合分子结合靶细胞上表达的抗原和T细胞上表达的另一种抗原，其将T细胞重定向到靠近靶细胞，因为T细胞诱导对靶细胞的细胞毒性。还在本说明书"测量T细胞依赖性细胞毒性"部分中描述了评估T细胞依赖性细胞毒性的方法，其为体外TDCC测定。
等电点(pI)
除非另有说明并且除非上下文中存在不一致，否则应理解等电点(pI)可以是理论的或实验确定的等电点，并且它也被称为“pI”。pI值可以例如，通过等电聚焦电泳经实验确定。同时，可以使用基因和氨基酸序列分析软件(Genetyx等)计算理论pI值。
癌症
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理状况，其通常特征在于不受调节的细胞生长/增殖。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤(例如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphoma))、胚细胞瘤(blastoma)、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病和其他淋巴组织增生性病症，以及多种类型的头颈癌。
肿瘤
术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性的”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提及时并不相互排斥。
卵巢癌
“卵巢癌”是指源自卵巢的一组异质性恶性肿瘤。大约90％的恶性卵巢肿瘤起源于上皮；其余的是生殖细胞和间质瘤。上皮性卵巢肿瘤分为以下组织学亚型：浆液性腺癌(约构成上皮性卵巢肿瘤的50％)；子宫内膜样腺癌(～20％)；粘液腺癌(～10％)；透明细胞癌(～5-10％)；Brenner(移行细胞)肿瘤(相对少见)。卵巢癌，其是女性中第六大常见癌症，其预后通常很差，五年生存率在5-30％之间。有关卵巢癌的综述，参见Fox等人(2002)"Pathology of epithelial ovarian cancer,"in Ovarian Cancer ch.9(Jacobs等人,编辑,Oxford University Press,New York)；Morin等人(2001)"Ovarian Cancer,"inEncyclopedic Reference of Cancer,pp.654-656(Schwab,编辑,Springer-Verlag,NewYork)。本公开考虑了诊断或治疗上述任何上皮性卵巢肿瘤亚型，特别是浆液性腺癌亚型的方法。
胃癌
术语“胃癌(gastric cancer)”或“胃肿瘤(gastric tumor)”或“胃肿瘤(stomachtumor)”或“胃癌(stomach cancer)”是指胃的任何肿瘤或癌，包括例如腺癌(如弥漫型和肠型)，和不太常见的形式，如淋巴瘤、平滑肌肉瘤和鳞状细胞癌。
药物制剂
术语“药物制剂”或“药物组合物”是指这样的制剂，其形式允许其中含有的活性成分的生物活性是有效的，并且其不含有对施用该制剂的受试者具有不可接受毒性的附加组分。
药学上可接受的载体
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分之外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
治疗
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变被治疗个体的自然病程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理学过程中进行。治疗的预期效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态，和缓解或改善预后。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子或抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
包装插页
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。
本公开的抗体
在一个方面，本公开提供了分离的抗体，其包含：包含分别SEQ ID NO:113、117和118的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列的第一重链可变区；包含分别SEQ ID NO:119、120和121的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列的第一轻链可变区；包含分别SEQ ID NO:122、123和124的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列的第二重链可变区；和分别包含SEQID NO:114、115和116的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列的第二轻链可变区。
在一个方面，本公开提供了分离的抗体，其包含：包含选自SEQ ID NO:85、1、33和84的氨基酸序列的第一重链可变区；以及包含选自SEQ ID NO:87、2、43、86和88的氨基酸序列的第一轻链可变区；包含选自SEQ ID NO:60和70的氨基酸序列的第二重链可变区；以及包含选自SEQ ID NO:61和71的氨基酸序列的第二轻链可变区。
在某些实施方案中，第一重链可变区连接至SEQ ID NO:95中所示的第一CH1结构域，第一轻链可变区连接至SEQ ID NO:63中所示的第一CL结构域，第二重链可变区连接至SEQ ID NO:97中所示的第二CH1结构域，并且第二轻链可变区连接至SEQ ID NO:62中所示的第二CL结构域。
在某些实施方案中，所述抗体进一步包含选自以下的任一Fc区组合：
(1)SEQ ID NO:72所示的第一Fc区和SEQ ID NO:73所示的第二Fc区；
(2)SEQ ID NO:74所示的第一Fc区和SEQ ID NO:75所示的第二Fc区；
(3)SEQ ID NO:76所示的第一Fc区和SEQ ID NO:77所示的第二Fc区；和
(4)SEQ ID NO:78所示的第一Fc区和SEQ ID NO:79所示的第二Fc区。
第一Fc区可与第一重链可变区在同一多肽链中，第二Fc区可与第二重链可变区在同一多肽链中。在某些实施方案中，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)或甘氨酸-赖氨酸(残基446-447)可能不存在。
在某些实施方案中，第一重链可变区和第一轻链可变区形成第一抗原结合位点，第二重链可变区和第二轻链可变区形成第二抗原结合位点。
在一个方面，本公开提供了分离的抗体，其包含：包含选自SEQ ID NO:104、105、106和107的氨基酸序列的第一重链和包含SEQ ID NO:112中所示氨基酸序列的第一轻链；包含选自SEQ ID NO:108、109、110和111的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:98中所示氨基酸序列的第二轻链。在某些实施方案中，重链的C末端赖氨酸(Lys447)或甘氨酸-赖氨酸(残基446-447)可能不存在。
第一重链和第一轻链的可变区形成第一抗原结合位点，第二重链和第二轻链的可变区形成第二抗原结合位点。
在某些实施方案中，第一抗原结合位点对CLDN6具有结合活性。在某些实施方案中，第一抗原结合位点对人CLDN6具有结合活性。在某些实施方案中，第一抗原结合位点对如SEQ ID NO:125或126中定义的人CLDN6具有结合活性。在某些实施方案中，第一抗原结合位点基本上不结合人CLDN9。在某些实施方案中，第一抗原结合位点基本上不结合人CLDN4。在某些实施方案中，第一抗原结合位点基本上不结合人CLDN3。在某些实施方案中，第一抗原结合位点基本上不结合如SEQ ID NO:134中定义的CLDN6突变体。
在某些实施方案中，第二抗原结合位点对CD3具有结合活性。在某些实施方案中，第二抗原结合位点对CD3ε链具有结合活性。在某些实施方案中，第二抗原结合位点对如SEQID NO:142中定义的人CD3具有结合活性。
本公开的抗原结合分子
一方面，本公开提供了包含重链可变区的抗原结合分子，所述重链可变区包含：
(a1)SEQ ID NO:113、117和118分别所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列；或者
(a2)与SEQ ID NO:91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85中所示任一重链可变区的那些相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3。
一方面，本公开提供了包含轻链可变区的抗原结合分子，所述轻链可变区包含
(b1)SEQ ID NO:119、120和121分别所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列；或者
(b2)与SEQ ID NO:92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88和58中所示的任一重链可变区的那些相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
一方面，本公开提供了包含重链可变区和轻链可变区的抗原结合分子，其中：
重链可变区包含选自以下的任一种HVR组合：
(a1)SEQ ID NO:113、117和118分别所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列；和
(a2)与SEQ ID NO:91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85中所示任一重链可变区的那些相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3；
并且所述轻链可变区包含选自以下的任一种HVR组合：
(b1)SEQ ID NO:119、120和121分别所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列；和
(b2)与SEQ ID NO:92、41、42、43、46、51、52、53、82、86、88和58中所示的任一重链可变区的那些相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
在某些实施方案中，抗原结合分子的重链可变区和轻链可变区包含小鼠、兔、人源化或人构架。
一方面，本公开提供了包含重链可变区和轻链可变区的抗原结合分子，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83和57的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82和58的氨基酸序列。
抗原结合分子的一个重链可变区和一个轻链可变区形成抗原结合位点，其对CLDN6具有结合活性。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子对如SEQ ID NO:125或126中定义的人CLDN6具有结合活性。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子基本上不结合人CLDN9。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子基本上不结合人CLDN4。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子基本上不结合人CLDN3。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子基本上不结合如SEQ ID NO:134中定义的CLDN6突变体。
本公开的抗原结合分子能够与多种已知的医用技术组合使用。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子可用于制备嵌合抗原结合受体(CAR)和包含嵌合抗原结合受体的T细胞(CAR-T)。作为制备CAR的方法的实例，本公开的抗原结合分子的CLDN6结合位点与T细胞受体(TCR)的胞外域连接，而共刺激信号传导结构域如CD28与TCR的胞内域连接。作为制备CAR-T的方法的实例，使用基因修饰技术将CAR引入到效应细胞如T细胞中。
一方面，本公开提供了包含重链可变区的嵌合抗原结合受体，所述重链可变区包含：
(a1)SEQ ID NO:113、117和118分别所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列；或者
(a2)与SEQ ID NO:91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85中所示任一重链可变区的那些相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3。
一方面，本公开提供了包含轻链可变区的嵌合抗原结合受体，所述轻链可变区包含
(b1)SEQ ID NO:119、120和121分别所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列；或者
(b2)与SEQ ID NO:92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88和58中所示的任一重链可变区的那些相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
一方面，本公开提供了包含重链可变区和轻链可变区的嵌合抗原结合受体，其中：
所述重链可变区包含选自以下的任一种HVR组合：
(a1)SEQ ID NO:113、117和118分别所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列；和
(a2)与SEQ ID NO:91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85中所示任一重链可变区的那些相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3；
并且所述轻链可变区包含选自以下的任一种HVR组合：
(b1)SEQ ID NO:119、120和121分别所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列；和
(b2)与SEQ ID NO:92、41、42、43、46、51、52、53、82、86、88和58中所示的任一重链可变区的那些相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
一方面，本公开提供了包含重链可变区和轻链可变区的嵌合抗原结合受体，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83和57的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82和58的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子是包含多个抗原结合位点的抗原结合分子。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子包含对CLDN6具有结合活性的第一抗原结合位点和对T细胞受体复合体具有结合活性的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含：
(a)重链可变区,其包含选自以下的任一HVR组合：
(a1)SEQ ID NO:113、117和118分别所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列；和
(a2)与SEQ ID NO:91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85中所示任一重链可变区的那些相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3；
和
(b)轻链可变区,其包含选自以下的任一HVR组合：
(b1)SEQ ID NO:119、120和121分别所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列；和
(b2)与SEQ ID NO:92、41、42、43、46、51、52、53、82、86、88和58中所示的任一重链可变区的那些相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
在某些实施方案中，形成本公开的抗原结合分子的第一抗原结合位点的重链可变区和轻链可变区进一步包含小鼠、兔、人源化或人构架。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子包含对CLDN6具有结合活性的第一抗原结合位点和对T细胞受体复合体具有结合活性的第二抗原结合位点，
其中所述第一抗原结合位点包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83和57的氨基酸序列,所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82和58的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的第一抗原结合位点对人CLDN6具有结合活性。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的第一抗原结合位点对如SEQ IDNO:125或126中定义的人CLDN6具有结合活性。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的的第一抗原结合位点基本上不结合人CLDN9。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的第一抗原结合位点基本上不结合人CLDN4。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的第一抗原结合位点基本上不结合人CLDN3。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的第一抗原结合位点基本上不结合如SEQ ID NO:134中定义的CLDN6突变体。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的第一抗原结合位点包括在单链Fv(scFv)、Fv或Fab中。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的第二抗原结合位点对CD3具有结合活性。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的第二抗原结合位点对CD3ε链具有结合活性。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的第二抗原结合位点对T细胞受体具有结合活性。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的第二抗原结合位点由重链可变区和轻链可变区形成，所述重链可变区分别包含SEQ ID NO:122、123和124的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列；所述轻链可变区分别包含SEQ ID NO:114、115和116的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列。在某些实施方案中，形成本公开的抗原结合分子的第二抗原结合位点的重链可变区和轻链可变区包含小鼠、兔、人源化或人构架。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的第二抗原结合位点由包含选自SEQID NO:60和70的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQ ID NO:61和71的氨基酸序列的轻链可变区形成。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的第二抗原结合位点包括在单链Fv(scFv)、Fv或Fab中。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子进一步包含抗体Fc区。在某些实施方案中，包含在本公开的抗原结合分子中的Fc区是构成SEQ ID NO:143、144、145或146(IgG1至IgG4)的氨基酸的Fc区。在某些实施方案中，包含在本公开的抗原结合分子中的Fc区是在构成SEQ ID NO:143至146(IgGl至IgG4)的氨基酸的Fc区中的任意处具有至少一个氨基酸突变的Fc区。在某些实施方案中，包含在本公开的抗原结合分子中的Fc区是附着有糖链的Fc区，并且附着至所述Fc区的岩藻糖缺陷糖链的百分比高于附着至天然IgG Fc区的岩藻糖缺陷糖链的百分比，或添加到Fc区的二等分N-乙酰葡糖胺的百分比高于添加到天然IgG Fc区的二等分N-乙酰葡糖胺的百分比。
在某些实施方案中，尤其是在抗原结合分子包含对CLDN6具有结合活性的第一抗原结合位点和对T细胞受体复合体具有结合活性的第二抗原结合位点的一些实施方案中，包含在抗原结合分子中的Fc区是对Fcγ受体具有降低的结合活性的Fc区。
在某些实施方案中，包含在抗原结合分子中的Fc区是具有选自由EU编号指定的以下氨基酸位置的至少一个氨基酸突变的Fc区：位置220、位置226、位置229、位置231、位置232、位置233、位置234、位置235、位置236、位置237、位置238、位置239、位置240、位置264、位置265、位置266、位置267、位置269、位置270、位置295、位置296、位置297、位置298、位置299、位置300、位置325、位置327、位置328、位置329、位置330、位置331和位置332。
在某些实施方案中，包含在抗原结合分子中的Fc区是包含选自由EU编号指定的以下氨基酸的至少一个氨基酸的Fc区：氨基酸位置234处的Arg、氨基酸位置235处的Ala或Arg、氨基酸位置239处的Lys,氨基酸位置297处的Ala。
在某些实施方案中，形成第一抗原结合位点的重链可变结构域通过第一CH1结构域与Fc区连接，形成第一抗原结合位点的轻链可变结构域与第一CL结构域连接；形成第二抗原结合位点的重链可变结构域通过第二CH1结构域与Fc区连接，形成第二抗原结合位点的轻链可变结构域与第二CL结构域连接。在某些实施方案中，控制上述CH1和CL结构域的电荷，使得形成第一抗原结合结构域的重链可变区与形成第一抗原结合结构域的轻链可变区组装，和/或形成第二抗原结合结构域的重链可变区与形成第二抗原结合结构域的轻链可变区组装。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子具有细胞毒活性。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的细胞毒活性是ADCC或CDC。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子的细胞毒活性是T细胞依赖性细胞毒活性。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子具有内化活性。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子与细胞毒剂缀合。
本公开还提供了免疫缀合物，其包含CLDN6结合分子,尤其是本文中与一种或多种细胞毒性剂,如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)，或放射性同位素缀合的抗CLDN6抗体。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于美登素(maytansinoid)(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1)；澳瑞他汀(auristatin)，如单甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588以及7,498,298)；多拉司他丁(dolastatin)；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等人,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环霉素(anthracycline)如柔红霉素(daunomycin)或阿霉素(doxorubicin)(参见Kratz等人,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006)；Torgov等人,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和U.S.Patent No.6,630,579)；甲氨蝶呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉罗他赛(larotaxel)、替塞他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶促活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，所述酶促活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒素(abrin)A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲霉素(α-sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、皂草(saponaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂蛋白(mitogellin)、限制菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文所述的抗体。可获得多种放射性同位素用于产生放射性缀合物。实例包括211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如Tc-99m或123I，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，如碘123、碘131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
抗体和细胞毒剂的缀合物可以使用多种双功能蛋白质偶联剂制备，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯(imidoester)的双功能衍生物(如二亚氨基己二酸二甲酯盐酸盐(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯(disuccinimidyl suberate))、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻蛋白免疫毒素。碳14标记的1-异硫氰根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992)；U.S.Patent No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，所述交联剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB，以及可商购的SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)(例如，来自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
一方面，本公开提供了编码本文所述的抗体或抗原结合分子的核酸。在进一步的实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在进一步的实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。
在某些实施方案中，编码本公开的抗体或抗原结合分子的核酸能够掺到能够直接施用于受试者的载体中。还可以向受试者施用经遗传修饰以表达和分泌本公开的抗体或抗原结合分子的细胞，从而允许本公开的抗体或抗原结合分子在体内连续分泌。
本公开还提供了产生本文所述的抗体或抗原结合分子的方法。在进一步的实施方案中，产生本文所述的抗体或抗原结合分子的方法包括培养包含编码抗原或抗原结合分子的核酸的宿主细胞。在进一步的实施方案中，产生本文所述的抗体或抗原结合分子的方法包括培养包含编码抗原或抗原结合分子的核酸的宿主细胞，并从宿主细胞的培养物中回收抗体或抗原结合分子。
方法和测定法
重组方法和组合物
可以使用例如，如美国专利号4,816,567中所述的重组方法和组合物产生抗体和抗原结合分子。在一个实施方案中，提供了编码如本文所述的抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在进一步的实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在进一步的实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已被转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp2/0细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗CLDN6抗体的方法，其中所述方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供，并任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
对于本文所述抗体的重组产生，分离编码抗体的核酸，例如，如上所述，并将其插入一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此类核酸。
用于克隆或表达抗体编码载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(另见Charlton,Methods in Molecular Biology,卷248(B.K.C.Lo,编辑,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页,描述大肠杆菌中抗体片段的表达)。表达后，可以以可溶性部分从细菌细胞沉淀物中分离抗体并且可以进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是用于抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，从而产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，它们可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了PLANTIBODIESTM技术用于在转基因植物中产生抗体)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。其他有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述的TRI细胞；MRC5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。有关适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,卷248(B.K.C.Lo,编辑,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
本文所述的抗原结合分子的重组产生可以用与上述那些类似的方法进行，通过使用包含(例如，已转化)一种或多种载体的宿主细胞进行，所述载体包含编码包含整个抗原结合分子或抗原结合分子的部分的氨基酸序列的核酸。
双特异性抗体的产生和纯化
“多特异性抗原结合分子”是指与一种以上抗原特异性结合的抗原结合分子。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗原结合分子包含两个或多个抗原结合位点，并且不同的抗原结合位点能够特异性结合不同的抗原。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子是双特异性IgG抗体。IgG型双特异性抗体可以从通过融合产生IgG抗体的两种类型的杂交瘤产生的杂合杂交瘤(四价体瘤(quadroma))分泌(Milstein等人,Nature(1983)305,537-540)。
此外，IgG型双特异性抗体通过将构成两种类型的目的IgG的L链和H链的基因，即总共四种基因引入细胞并共表达它们来分泌。然而，通过这些方法可以产生的IgG的H链和L链的组合数理论上是十种组合。因此，难以从十种类型的IgG中纯化包含所需H链和L链组合的IgG。此外，理论上，具有所需组合的IgG的分泌量会显著减少，因此大规模培养成为必需，而生产成本将进一步增加。
因此，用于促进H链之间以及具有期望组合的L和H链之间结合的技术可应用于本发明的多特异性抗原结合分子。
例如，通过在抗体H链的第二恒定区或第三恒定区的界面引入静电排斥来抑制不需要的H链结合的技术可应用于双特异性抗体结合(WO2006/106905)。
在通过在CH2或CH3的界面处引入静电排斥来抑制不想要的H链结合的技术中，在H链的其他恒定区的界面处接触的氨基酸残基的实例包括对应于CH3区中EU编号位置356、439、357、370、399和409处残基的区域。
更具体地，实例包括包含两种类型的H链CH3区的抗体，其中第一H链CH3区中的1至3对氨基酸残基选自下文(1)至(3)中所示的氨基酸残基对，其携带相同类型的电荷：(1)包含在H链CH3区中EU编号位置356和439的氨基酸残基；(2)包含在H链CH3区中EU编号位置357和370的氨基酸残基；(3)包含在H链CH3区中EU编号位置399和409的氨基酸残基。
此外，抗体可以是这样的抗体，其中与上述第一H链CH3区不同的第二H链CH3区中的氨基酸残基对选自上述(1)至(3)的氨基酸残基对，其中对应于在上述第一H链CH3区中携带相同类型电荷的上述(1)至(3)氨基酸残基对的1至3对氨基酸残基携带与上述第一H链CH3区中的对应氨基酸残基相反的电荷。
上文(1)至(3)中所示的每个氨基酸残基在结合过程中彼此接近。本领域技术人员可以使用市售软件通过同源性建模等找出在所期望H链CH3区或H链恒定区中对应于上述(1)至(3)的氨基酸残基的位置，并且可以对这些位置的氨基酸残基适当地进行修饰。
在上述抗体中，“带电氨基酸残基”优选选自，例如，包括在以下任一组中的氨基酸残基：
(a)谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)；和
(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。
在上述抗体中，短语“携带相同电荷”是指，例如，所有两个或多个氨基酸残基均选自上述组(a)和(b)中任一组中包括的氨基酸残基。短语“携带相反电荷”是指，例如，当两个或多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基选自上述(a)和(b)中任一组的氨基酸残基时，剩余的氨基酸残基选自包括在其他组中的氨基酸残基。
在优选的实施方案中，上述抗体的第一H链CH3区和第二H链CH3区可以通过二硫键交联。
本发明中，进行修饰的氨基酸残基不限于上述抗体可变区或抗体恒定区的氨基酸残基。本领域技术人员可以通过同源建模等使用市售软件鉴定在突变多肽或异源多聚体中形成界面的氨基酸残基；然后可以对这些位置的氨基酸残基进行修饰以调节结合。
其他已知技术也可用于结合本发明的双特异性抗体。可以通过用较大的侧链(旋钮(knob))取代抗体H链Fc区之一中存在的氨基酸侧链，并用较小的侧链(孔)取代其他H链的相应Fc区中存在的氨基酸侧链以允许将旋钮放置于孔中来将包含不同氨基酸的含Fc区的多肽彼此有效地结合(WO1996/027011；Ridgway JB等人,Protein Engineering(1996)9,617-621；Merchant A.M.等人Nature Biotechnology(1998)16,677-681；和US20130336973)。
此外，其他已知技术也可用于形成本发明的双特异性抗体。可以使用通过将抗体的H链CH3之一的部分变成相应的IgA来源序列并将相应的IgA来源序列引入其他H链CH3的互补部分中产生的链交换改造结构域CH3，通过CH3的互补结合有效地诱导具有不同序列的多肽的结合(Protein Engineering Design&Selection,23；195-202,2010)。该已知技术还可用于有效地形成目的双特异性抗体。
此外，如WO2011/028952、WO2014/018572和Nat Biotechnol.2014Feb；32(2):191-8中所述，使用抗体CH1和CL的结合以及VH和VL的结合产生抗体的技术；如WO2008/119353和WO2011/131746中所述，使用单独制备的单克隆抗体组合(Fab Arm Exchange)产生双特异性抗体的技术；如WO2012/058768和WO2013/063702中所述，用于调节抗体重链CH3之间结合的技术；如WO2012/023053中所述，用于产生由两种轻链和一种重链组成的双特异性抗体的技术；如Christoph等人(Nature Biotechnology卷31,753-758页(2013))所述，使用两种细菌细胞株产生双特异性抗体的技术，所述细菌细胞株单独表达包含单条H链和单条L链的抗体链之一；以及此类技术均可以用于形成双特异性抗体。
或者，即使当不能有效地形成目的双特异性抗体时，也可以通过从产生的抗体中分离和纯化目的双特异性抗体来获得本发明的双特异性抗体。例如，已经报道了通过将氨基酸取代引入两种类型的H链的可变区来赋予等电点差异，从而能够通过离子交换层析纯化两种类型的同聚(homomeric)形式和异聚(heteromeric)目的抗体的方法(WO2007114325)。迄今为止，作为纯化异聚抗体的方法，已经报道了使用蛋白A纯化包含与蛋白A结合的小鼠IgG2a H链和不与蛋白A结合的大鼠IgG2b H链的异二聚抗体的方法(WO98050431和WO95033844)。此外，通过使用包含在EU编号位置435和436处的氨基酸残基(其为IgG-蛋白A结合位点)被Tyr、His或产生不同蛋白A亲和力的氨基酸取代的H链，或使用具有不同蛋白A亲和力的H链以改变每条H链与蛋白A的相互作用,然后使用蛋白A柱单独有效地纯化异二聚抗体。
此外，其Fc区C末端异质性已得到改善的Fc区可以适当地用作本发明的Fc区。更具体地，本发明提供了通过从构成源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区的两个多肽的氨基酸序列中缺失EU编号指定的446位甘氨酸和447位赖氨酸而产生的Fc区。
测量T细胞依赖性细胞毒性
在抗原结合分子结合CLDN6和T细胞受体复合体的实施方案中，下述方法优选用作评估或确定由使本公开的抗原结合分子接触本公开的抗原结合分子中的抗原结合位点结合的CLDN6表达细胞引起的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)的方法。用于体外评估或确定细胞毒活性的方法包括测定细胞毒T细胞等的活性的方法。可以通过已知方法确定本公开的抗原结合分子是否具有诱导T细胞介导的细胞毒性的活性(参见，例如，Current protocolsin Immunology,章7.Immunologic studies in humans,编辑,John E,Coligan等人,JohnWiley&Sons,Inc.,(1993))。在细胞毒性测定中，将能够与不同于CLDN6的抗原结合并且在细胞中不表达的抗原结合分子和T细胞受体复合体用作对照抗原结合分子。以相同方式测定对照抗原结合分子。然后，通过测试本公开的抗原结合分子是否表现出比对照抗原结合分子更强的细胞毒活性来评估活性。
同时，例如通过以下程序评估或确定体内抗肿瘤效果。将表达本公开的抗原结合分子中的抗原结合位点所结合的抗原的细胞皮内或皮下移植到非人动物受试者。然后，从移植日开始或从此以后，每天或每隔几天将测试抗原结合分子向静脉或腹腔内施用。随着时间的推移测量肿瘤大小。肿瘤大小变化的差异可定义为细胞毒活性。与体外测定一样，施用对照抗原结合分子。当施用本公开的抗原结合分子的组中肿瘤大小小于施用对照抗原结合分子的组中肿瘤大小时，可以判断本公开的抗原结合分子具有细胞毒活性。
MTT方法和同位素标记的胸苷摄取到细胞中的测量优选用于评估或确定与本公开的抗原结合分子接触以抑制表达抗原结合分子中抗原结合位点结合的抗原的细胞生长的效果。同时，可以优选使用与上述评估或确定体内细胞毒活性相同的方法来评估或确定体内抑制细胞生长的活性。
本公开的抗体或抗原结合分子的TDCC可以通过本领域已知的任何合适的方法评价。例如，TDCC可以通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定来测量。在该测定中，在测试抗体或抗原结合分子存在下，将靶细胞(例如CLDN6表达细胞)与T细胞(例如，PBMC)一起温育，并使用合适的试剂测量已经从T细胞杀死的靶细胞中释放的LDH的活性。通常，细胞毒活性计算为与抗体或抗原结合分子温育获得的LDH活性相对于100％杀死靶细胞(例如通过用Triton-X处理裂解)获得的LDH活性的百分比。如果如上所述计算的细胞毒活性较高，则确定测试抗体或抗原结合分子具有较高的TDCC。
另外或备选地，例如，TDCC也可以通过实时细胞生长抑制测定来测量。在该测定中，在96孔板上测试抗体或抗原结合分子的存在下，将靶细胞(例如CLDN6表达细胞)与T细胞(例如PBMC)温育，并通过本领域已知的方法，例如，通过使用合适的分析仪器(例如xCELLigence Real-Time Cell Analyzer)监测靶细胞的生长。根据以CGI(％)＝100-(CIAbx 100/CINoAb)给出的公式，从细胞指数值确定细胞生长抑制率(CGI：％)。"CIAb"表示特定实验时间上具有抗体或抗原结合分子的孔的细胞指数值，"CINoAb"表示没有抗体或抗原结合分子的孔的平均细胞指数值。如果抗体或抗原结合分子的CGI率高，即具有显著阳性值，可以说所述抗体或抗原结合分子具有TDCC活性。
一方面，本公开的抗体或抗原结合分子具有T细胞活化活性。可以通过本领域已知的方法，如使用响应其活化表达报告基因(例如萤光素酶)的改造的T细胞系(例如Jurkat/NFAT-RE Reporter Cell Line(T Cell Activation Bioassay,Promega))的方法测定T细胞活化。在该方法中，在测试抗体或抗原结合分子的存在下，用T细胞培养靶细胞(例如CLDN6表达细胞)，然后通过适当方法测量报告基因的表达产物的水平或活性作为T细胞活化的指标。当报告基因是萤光素酶基因时，可以测量萤光素酶与其底物之间的反应产生的发光作为T细胞活化的指标。如果如上所述测量的T细胞活化较高，则确定测试抗体或抗原结合分子具有较高的T细胞活化活性。
用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任何抗原结合分子或抗体可用于检测生物样品中CLDN6的存在。如本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，如癌组织。
在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法的抗原结合分子或抗体。在另一方面，提供了检测生物样品中CLDN6的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗原结合分子或抗体在允许抗原结合分子或抗体与CLDN6结合的条件下接触，并检测在抗原结合分子或抗体与CLDN6之间是否形成复合体。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗原结合分子或抗体选择有资格用如本文所述的抗原结合分子或抗体进行治疗的受试者，例如，其中CLDN6是选择患者的生物标志物。
可以使用本发明的抗体诊断的示例性病症包括癌症，特别是卵巢肿瘤、非小细胞肺癌、胃癌和肝癌。
在某些实施方案中，提供了本文所述的标记的抗原结合分子或抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光的、发色团、电子-密集的、化学发光和放射性标记)以及例如，通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分，如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团，如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰(dansyl)、伞形酮(umbelliferone)、萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶)(美国专利号4,737,456)、荧光素(luciferin)、2,3-二氢酞嗪二酮二酮(2,3-dihydrophthalazinediones)、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与使用过氧化氢氧化染料前体的酶偶联的那些，如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记、噬菌体标记、稳定自由基等。
药物组合物
一方面，本公开提供了包含本公开的抗原结合分子或抗体的药物组合物。在某些实施方案中，本公开的药物组合物诱导T细胞依赖性细胞毒性，换言之，本公开的药物组合物是用于诱导细胞细胞毒性的治疗剂。在某些实施方案中，本公开的药物组合物是用于治疗和/或预防癌症的药物组合物。在某些实施方案中，本公开的药物组合物是用于治疗和/或预防卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的药物组合物。在某些实施方案中，本公开的药物组合物是细胞生长抑制剂。在某些实施方案中，本公开的药物组合物是抗癌剂。
如果需要，可以用不同类型的抗原结合分子或抗体配制本公开的药物组合物、本公开的用于诱导细胞细胞毒性的治疗剂、细胞生长抑制剂或抗癌剂。例如，可以通过本公开的多种抗原结合分子或抗体的混合物增强对表达抗原的细胞的细胞毒性作用。
通过混合具有所需程度纯度的此类抗原结合分子或抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.编辑(1980))来制备冻干制剂或水溶液形式的如本文所述的抗原结合分子或抗体的药物组合物。药学上可接受的载体的所用剂量和浓度通常对受者无毒，包括但不限于：缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX(注册商标)，Baxter International,Inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。一方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)，如软骨素酶(chondroitinase)组合。
在美国专利No.6,267,958中描述了示例性的冻干抗体制剂。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
如所治疗的特定指征所必需，本文的制剂还可以含有多于一种活性成分，优选具有不会彼此不利影响的互补活性的那些。这种活性成分适合以对预期目的有效的量组合存在。
如有必要，可以将本公开的抗原结合分子或抗体封装在微囊中(由羟甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙烯酸甲酯]等制成的微囊)，并制成胶体药物递送系统(脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)的组分(例如，参见"Remington's PharmaceuticalScience 16th edition",Oslo编辑(1980))。此外，用于制备试剂作为缓释试剂的方法是已知的，并且这些方法可以应用于本公开的抗原结合分子(J.Biomed.Mater.Res.(1981)15,267-277；Chemtech.(1982)12,98-105；US Patent No.3773719；European PatentApplication(EP)Nos.EP58481和EP133988；Biopolymers(1983)22,547-556)。
本公开的药物组合物、细胞生长抑制剂或抗癌剂可以口服或肠胃外施用给患者。优选肠胃外施用。具体地，这种施用方法包括注射、鼻施用、经肺施用和经皮施用。注射包括，例如，静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射和皮下注射。例如，本公开的药物组合物、用于诱导细胞细胞毒性的治疗剂、细胞生长抑制剂或抗癌剂可以通过注射局部或全身施用。此外，可以根据患者的年龄和症状选择合适的施用方法。可以选择施用剂量，例如，每次施用每千克体重为0.0001mg至1,000mg的范围。或者，可以选择剂量，例如，每位患者从0.001mg/体重到100,000mg/体重的范围。然而，本公开的药物组合物的剂量不限于这些剂量。
优选地，本公开的药物组合物包含如本文所述的抗原结合分子或抗体。一方面，所述组合物是用于诱导细胞细胞毒性的药物组合物。另一方面，该组合物是用于治疗或预防癌症的药物组合物。优选地，癌症是结直肠癌或胃癌。本公开的药物组合物可用于治疗或预防癌症。因此，本公开提供了治疗或预防癌症的方法，其中将如本文所述的抗原结合分子或抗体施用于有此需要的患者。
本公开还提供了通过使表达CLDN6的细胞与结合CLDN6的本公开的抗原结合分子接触来损害表达CLDN6的细胞或抑制细胞生长的方法。结合CLDN6的单克隆抗体在上文描述为本公开的抗原结合分子，其包括在本公开的用于诱导细胞细胞毒性的治疗剂、细胞生长抑制剂和抗癌剂中。本公开的抗原结合分子结合的细胞没有特别限制，只要它们表达CLDN6即可。具体地，在本公开中，优选的癌症抗原表达细胞包括卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、膀胱癌细胞和结肠癌细胞。
在本公开中，可以例如通过将本公开的抗原结合分子加入到体外培养的表达CLDN6的细胞的培养基中来进行“接触”。在这种情况下，待加入的抗原结合分子可以以适当的形式使用，如通过冻干等制备的溶液或固体。当作为水溶液加入本公开的抗原结合分子时，溶液可以是单独含有抗原结合分子的纯水溶液或含有例如上述表面活性剂、赋形剂、着色剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂和矫味剂的溶液。加入的浓度没有特别限制；然而，培养基中的最终浓度优选在1pg/ml至1g/ml的范围内，更优选1ng/ml至1mg/ml，还更优选为1微克/ml至1mg/ml。
在本公开的另一个实施方案中，也可以通过向体内表达CLDN6的细胞移植的非人动物或具有内源表达CLDN6的癌细胞的动物施用来进行“接触”。施用方法可以是口服或肠胃外。特别优选肠胃外施用。具体地，肠胃外施用方法包括注射、鼻施用、肺部施用和经皮施用。注射包括，例如，静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射和皮下注射。例如，可以通过注射局部或全身施用本公开的药物组合物、用于诱导细胞细胞毒性的治疗剂、细胞生长抑制剂或抗癌剂。此外，可以根据动物受试者的年龄和症状选择合适的施用方法。当抗原结合分子作为水溶液施用时，溶液可以是单独含有抗原结合分子的纯水溶液或含有例如上述表面活性剂、赋形剂、着色剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂和矫味剂的溶液。可以选择施用剂量，例如，每次施用每千克体重为0.0001至1,000mg的范围。或者，可以选择剂量，例如，每位患者从0.001到100,000mg/体重的范围。然而，本公开的抗原结合分子的剂量不限于这些实例。
本公开还提供了用于本公开的方法的试剂盒，其含有本公开的抗原结合分子或通过本公开的方法产生的抗原结合分子。试剂盒可以用另外的药学上可接受的载体或介质，或者描述如何使用所述试剂盒的使用说明书等包装。
在本发明的另一方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制成品。所述制成品包括容器和标记或与所述容器相关的包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳自身或与有效治疗、预防和/或诊断病症的另一组合物组合的组合物，并且可以具有无菌入口(例如，容器可以是具有皮下注射针可穿透的瓶塞的静脉溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性成分是本发明的抗体。标记或包装说明书指示该组合物用于治疗选择的状况。另外，制成品可包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性或其他治疗剂。本发明的该实施方案中的制成品可以进一步包含包装插页，其指示所述组合物可用于治疗特定状况。或者，或另外，制成品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，如用于注射(BWFI)的抑菌水、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户的观点想要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
应当理解，任何上述制成品中可包括代替或除抗原结合分子或抗体之外的本发明的免疫连接物。
本文引用的所有文件通过引用并入本文。
实施例
以下是本公开的方法和组合物的实施例。应了解，鉴于上面提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1.sc(Fv)2分子的稳定性
关于博纳吐单抗的稳定性，在20mM His，150mm NaCl，pH 6.0中以3.8mg/mL内部纯化博纳吐单抗。通过SEC分析确定高分子量(HMW)种类比率为6.4％。出于物理化学测试的目的，将其对PBS，pH 7.4进行透析，并将浓度调整至1mg/ml。在透析后，HMW比率变成42.6％。通常，IgG抗体的HMW比率在透析期间不会改变。因此，博纳吐单抗在溶液中具有聚集趋势，并且认为与IgG抗体相比，其稳定性较小。使用SWXL G2000柱(TOSOH)以50mM磷酸钠，300mMNaCl，pH 7.0作为运行缓冲液进行SEC分析。检测通过UV检测器(280nm)完成。使用Empower3软件(Waters)分析色谱图。
实施例2.选择结合密蛋白-6(CLDN6)的T细胞重定向抗体
实施例2-1.产生抗CLDN6T细胞重定向抗体
为了克服sc(Fv)2形式的限制，我们产生了IgG形式的靶向CLDN6的T细胞重定向双特异性抗体(抗CLDN6/CD3双特异性抗体)，其使得所述抗体能够获得更好的稳定性和更长的血清半衰期。
三种抗CLDN6抗体(AE3-20、AHO5、CDA0013)的可变区、6PHU3的CLDN6结合可变区和一个抗CD3抗体(TR01)的可变区用于产生抗CLDN6/CD3双特异性抗体。从用CLDN6表达载体免疫的兔子的B细胞获得CDA0013。
上述可变区用于使用Igawa等人(WO2016159213)报道的Fab臂交换技术产生抗CLDN6/CD3双特异性抗体。在抗CLDN6/CD3抗体臂中包含的可变区如表1所示，并且所产生的双特异性抗体含有具有对Fcγ受体的衰减亲和力的沉默Fc。产生四种抗CLDN6/CD3双特异性抗体，AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01和6PHU3/TR01(表1)。
(表1)产生的抗CLDN6/CD3双特异性抗体。
Figure BDA0003407808460000681
Figure BDA0003407808460000691
实施例2-2.使用Jurkat报告基因测定的抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化 活性
通过参考实施例3中所述的方法检查在hCLDN6/BaF、hCLDN9/BaF或hCLDN6(Q156L)/BaF存在下，实施例2-1中产生的抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化活性。确定分别在浓度为0.001、0.01、0.1、1和10nm的浓度下每种抗体的T细胞活化活性。
结果(图1A，图1B)显示，所有抗CLDN6/CD3双特异性抗体在hCLDN6/BaF存在下诱导强T细胞活化。在hCLDN9/BaF的存在下，在6PHU3/TR01中观察到轻微的T细胞活化，而在其他AE3-20/TR01、AH05/TR01和CDA0013/TR01中没有活化。该结果提示所有抗CLDN6/CD3双特异性抗体对CLDN6显示出相对高的特异性，尽管6PHU3/TR01略微结合人CLDN9表达细胞。
图1A和图1C显示在hCLDN6(Q156L)/BaF存在下，所有抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化相比于hCLDN6/BaF存在下其T细胞活化较低，提示所有抗CLDN6/CD3双特异性抗体都与包括人CLDN6中的156位处氨基酸残基的表位结合。
实施例2-3.抗CLDN6/CD3双特异性抗体对CLDN家族蛋白的抗原结合特异性
如下产生瞬时表达人和小鼠CLDN3、4、6和9的FreeStyleTM 293-F细胞。通过将编码相应序列的合成cDNA插入哺乳动物表达载体pCXND3中来建立人和小鼠CLDN(包括CLDN6、CLDN9、CLDN3和CLDN4)的表达载体(WO2008/156083)。
使用293fectin(Invitrogen)将每个载体引入FreeStyleTM 293-F细胞(Invitrogen)。将细胞培养2-4天，并通过离心收集。将收集的细胞立即以3x106个细胞/mL的浓度重悬于含有D-PBS(-)的0.1％BSA中。
评价的抗体：
1)抗CLDN6/CD3双特异性抗体：AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01、6PHU3/TR01；
2)与人CD3抗体(SEQ ID NO:70中所示的VH，SEQ ID NO:71中所示的VL)通过Fab臂交换配对的抗钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyan)(KLH)抗体(SEQ ID NO:68中所示的VH，SEQ ID NO:69中所示的VL)的双特异性抗体：KLH/TR01(作为阴性对照)；
3)市售的抗CLDN二价抗体(从R&D systems购买)：小鼠抗人CLDN6抗体(MAB3656)、小鼠抗人CLDN3抗体(MAB4620)、小鼠抗人CLDN4抗体(MAB4219)。
将抗体以10微克/mL的终浓度与瞬时表达人和小鼠CLDN3、4、6和9的FreeStyleTM293-F细胞混合。温育1小时后，将细胞用含有D-PBS(-)的0.1％BSA洗涤，并在5微克/mL的山羊抗人IgG(H+L)交叉吸附二抗Alexa Fluor 647(Invitrogen,A21445)或山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附二抗Alexa Fluor 647(Invitrogen,A21236)中温育1小时。然后用含D-PBS(-)的0.1％BSA洗涤细胞，将其重悬于含D-PBS(-)的5micro L的0.1％BSA中，并通过流式细胞仪(iQue Screener,intellicyte)进行分析。
如图2-1和2-2中所示，在所有抗CLDN6/CD3双特异性抗体中观察到了对人CLDN6的强结合。在所有抗CLDN6/CD3双特异性抗体中也观察到了与小鼠CLDN6的结合，虽然它们弱于对人CLDN6的结合。所有抗CLDN6/CD3双特异性抗体显示出对人CLDN9、人CLDN4、人CLDN3、小鼠CLDN9、小鼠CLDN4或小鼠CLDN3的轻微结合或没有结合。特别是，CDA0013/TR01对CLDN6显示出最佳特异性。
实施例2-4.抗CLDN6/CD3双特异性抗体的体内效果分析
使用肿瘤携带小鼠模型评价抗CLDN6/CD3双特异性抗体的体内抗肿瘤效果。将表达人CLDN6(HuH-7(Health Science Research Resources Bank)、OV-90(ATCC)或OVCAR-3(ATCC))的人癌细胞系皮下移植到NOD/ShiJic-scid小鼠中，并将人PBMC注射到小鼠中(所谓的T细胞注射模型)。将肿瘤携带小鼠随机化到处理组中以接受抗体，或作为对照的载体的施用。
更具体地，在效果测试中使用HuH-7或OV-90或OVCAR-3T细胞注射模型进行以下测试。使用人PBMC(AllCells)和T Cell Activation/Expansion Kit(Miltenyi Biotec)进行T细胞的扩增。将1x107个细胞的HuH-7、5x106个细胞的OV-90或1x107个细胞的OVCAR-3与Matrigel Basement Membrane Matrix(BD)混合并皮下移植到NOD/ShiJic-scid小鼠(CLEAJapan，雌性，6-7周龄)的外侧区。移植的当天定义为第0天。根据肿瘤大小和体重随机化和分组后，以0.2mg/小鼠经腹膜内施用抗asialo GM1抗体(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation)。在第二天，从扩增培养物中收集T细胞，并用于腹膜内移植3×107个细胞/小鼠。在T细胞移植后大约四小时，静脉内施用抗体。抗体仅施用一次。测量每只小鼠的肿块的长度(L)和宽度(w)和体重，并将肿瘤体积(TV)计算为：TV＝(L x W x W)/2。
图3显示了OV-90和HuH-7T细胞注射模型中AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01的体内抗肿瘤效果。以5mg/kg输注这些抗体强烈地减缓了肿瘤生长。特别是，在HuH-7T细胞注射模型中，AE3-20/TR01与其他两种抗体AH05/TR01和6PHU3/TR01相比显示了最佳效果(图3a)。
使用相同的小鼠模型进行抗CLDN6/CD3双特异性抗体的毒性和药代动力学(PK)分析。虽然AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01在OV-90和HuH-7T细胞注射模型中均显示出抗肿瘤效果，但在用AH05/TR01和6PHU3/TR01处理的小鼠中观察到显著的体重减轻。在用AE3-20/TR01处理的小鼠中没有观察到体重变化(图4)。此外，体重减轻的小鼠显示一般状况恶化并且皮肤和血浆的黄色变色。
安乐死后，收集血浆，并进行血液生化测试。确定肝毒性标志物，包括ALT、ALP、GGT、GLDH、TBIL和TBA的血浆水平(TBA-120FR,Canon medical system)。在用AH05/TR01和6PHU3/TR01处理的小鼠中，肝脏参数显著升高(图5)。这些数据表明AH05/TR01和6PHU3/TR01在小鼠中引起肝毒性。
如下评价抗CLDN6/CD3双特异性抗体的PK。以5mg/kg的剂量将抗体静脉内注射到小鼠中。在HuH-7T细胞注射模型中抗体注射后的第3、7、13天和在OV-90T细胞注射模型中抗体注射后的第3、6、14天，从三只小鼠收集血液。通过在4℃下以10,000×g离心5分钟来获得肝素中的血浆样品。如下所述，通过ELISA测量小鼠血浆中抗体的浓度。将抗人IgG抗体(Sigma)分配到Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp(Thermo Fisher)上，并在室温下保持1小时，以制备抗人IgG固定的板。使用8、4、2、1、0.5、0.25或0.125ng/mL浓度的样品抗体用于校准，并通过400倍或更高稀释来制备小鼠血浆样品用于检查。将每个样品分配到抗人IgG固定的板中，并在室温下保持1小时。然后，加入生物素化的抗Fc特异性抗体(CHUGAI)以在室温下反应1小时。加入链霉抗生物素蛋白-PolyHRP80(Stereospecific DetectionTechnologies)以在室温下反应1小时，并使用ABTS(Roche)作为底物进行发色反应。然后，通过微孔板读取器测量405nm(650nm作为参考)处的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)根据校准曲线的吸光度计算小鼠血浆中的抗体浓度。
在图6中显示了静脉施用后AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01的血浆浓度的时间变化。AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01的半衰期(T1/2)在HuH-7T细胞注射模型的血浆中约为3.44至4.79天，在OV-90T细胞注射模型中约为2.77至3.22天。
最值得注意的是，与先前报告(6)中描述的双特异性sc(Fv)2 6PHU3的血浆半衰期相比，6PHU3/TR01的血浆半衰期在HuH-7模型中延长至3.44天，在OV-90模型中延长至2.77天。这种延长最有可能是由于来自双特异性sc(Fv)2至IgG形式的抗体转化。然而，6PHU3/TR01在小鼠中导致肝毒性，如在输注后体重显著降低和肝脏标志物增加所证实(图4和5)。这些发现提示抗CLDN6/CD3双特异性抗体的血浆半衰期延长可能导致肝毒性。
还使用OVCAR-3T细胞注射小鼠模型评价5mg/kg的AE3-20/TR01和CDA0013/TR01的体内抗肿瘤效果和安全性。用如上所述的相同程序进行实验。
如图7所示，用AE3-20/TR01处理导致显著的肿瘤体积减少，而用CDA0013/TR01处理在OVCAR-3携带小鼠中显示中等效果。在抗体处理后，整体几乎检测不到显著的体重减轻，但在CDA0013/TR01处理组中发现了肝脏毒性标志物的明显增加(图8)。事实上，CDA0013/TR01处理组中五只小鼠中的一只小鼠表现出弱体重减少。
如下使用以5mg/kg静脉内注射的动物计算AE3-20/TR01和CDA0013/TR01的PK。在注射后第3、7、14天从三只动物收集的血液中制备肝素中的血浆样品，然后如先前在该实施例中所述通过ELISA进行抗体浓度的测量。
如图9所示，AE3-20/TR01和CDA0013/TR01的PK特征是可比较的。AE3-20/TR01和CDA0013/TR01的血浆半衰期(T1/2)为3.60和3.98天，并且血浆-时间曲线下从0到无穷大(AUCinf)的面积分别为138和161天*微克/mL。
根据该实施例的结果，IgG形式中的一些抗CLDN6/CD3双特异性抗体倾向于具有引起肝损伤的潜力，尽管所有抗体对CLDN6显示出相对高的特异性和类似的药代动力学谱。在测试的抗CLDN6/CD3双特异性抗体中，发现AE3-20/TR01是唯一的抗CLDN6/CD3双特异性抗体，其在多种肿瘤携带小鼠模型中显示出效果和良好的安全性谱。
实施例3.抗CLDN6/CD3双特异性抗体的CLDN6结合可变区的人源化
虽然AE3-20/TR01在多种肿瘤携带小鼠模型中显示出效果和良好的安全性谱，AE3-20/TR01的CLDN6结合可变区是小鼠序列，但由于其高免疫原性，其不适用于向患者施用该抗体。进行AE3-20/TR01的CLDN6结合可变区的人源化。AE3-20/TR01的CD3结合可变区是人源化序列。
根据Kabat(Kabat等人,Sequence of proteins of immunological interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))对AE3-20/TR01(AE3.20H,SEQ ID NO:1)的CLDN6结合VH和AE3-20/TR01(AE3.20L,SEQ ID NO:2)的CLDN6结合VL的氨基酸残基进行编号。
通过用人种系构架(SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8或9作为FR1，SEQ ID NO:10作为FR2，SEQ ID NO:11、12、13、14、15、16或17作为FR3，SEQ ID NO:18作为FR4)取代AE3.20H的构架来设计49种VH。通过用人种系构架(SEQ ID NO:19、20、21或22作为FR1，SEQ ID NO:23作为FR2，SEQ ID NO:24、25、26、或27作为FR3，SEQ ID NO:28作为FR4)取代AE3.20L的构架来设计16种VL。分别将编码AE3.20H和所设计的VH的多核苷酸克隆到含有编码重链恒定区SG1的多核苷酸的表达载体中(在SEQ ID NO:80中显示了氨基酸序列)。分别将编码AE3.20L和所设计的VL的多核苷酸克隆到含有编码轻链恒定区SK1的多核苷酸的表达载体中(在SEQ IDNO:81中显示了氨基酸序列)。包含AE3.20H和所设计的VH的重链分别与包含AE3.20L的轻链瞬时表达，并且包含所设计的VL的轻链分别与包含AE3.20H的重链在Expi293细胞中瞬时表达。
通过FCM分析确定包含所设计的VH和AE3.20L的抗体和包含所设计的VL和AE3.20H的抗体与hCLDN6/BaF的结合。每种抗体的结合活性由平均荧光强度值(MFI)表示。将抗体在4℃下与hCLDN6/BaF温育30分钟，并用HEPES-BSA洗涤缓冲液(Nacalai Tesque,Cat.L3P8406)进行洗涤。然后加入山羊F(ab')2抗人IgG、小鼠ads-PE(Southern Biotech,Cat.2043-09)二抗，并在黑暗中在4℃下温育30分钟，然后进行洗涤。使用FlowJo software(Tree Star)进行数据采集，并用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。
与包含AE3.20H的抗体相比，在49种设计的VH中，只有两种VH(表中2显示)能够改善抗体对人CLDN6的结合活性。16种设计的VL中没有一个与AE3.20L一样多地显示促进抗体对人CLDN6的结合活性。在不损害抗体的CLDN6结合活性的情况下似乎难以人源化AE3.20L。
(表2)
Figure BDA0003407808460000741
为了实现对人CLDN6足够的结合活性，合理设计CLDN6结合VL(选择类似于AE3.20L的相应构架的人种系构架序列，并且还尝试在构架中引入回复突变)。所设计的VL(17L、18L、19L和20L)具有与AE3.20L相同的CDR序列，并且其构架的序列显示再表3中。在18L、19L和20L的构架中采用回复突变，其也显示在表3中。将包含选自17L、18L、19L和20L的VH25H和VL的二价IgG抗体在Expi293细胞中瞬时表达。图10显示了通过FCM分析确定的多种抗体对hCLDN6/BaF的结合。每种抗体的结合活性由MFI表示。图10中的水平轴上的名称显示在每种抗体中包含的VH和VL。
包含所设计的VL(17L、18L、19L和20L)的所有抗体比包含AE3.20L为VL的抗体显示对人CLDN6的较弱结合活性，这也表明难以在不损害CLDN6结合活性的情况下人源化AE3.20L。然而，与不携带G66R突变的包含17L的抗体相比，携带G66R突变的包含20L的抗体显示与人CLDN6更强的结合活性，提示轻链构架中氨基酸位置66处的Gly被取代成Arg将有助于改善抗体与人CLDN6的结合活性。
(表3)
Figure BDA0003407808460000751
实施例4.抗CLDN6人源化抗体的亲和力成熟
为了改善人源化的CLDN6结合可变区的结合亲和力，将详尽的单个或多个突变引入AE3.20H和AE3.20L的CDR中，并且SEQ ID NO:6用作重链FR1，SEQ ID NO:10用作重链FR2，SEQ ID NO:14用作重链FR3，SEQ ID NO:18用作重链FR4，SEQ ID NO:22或19用作轻链FR1，SEQ ID NO:23用作轻链FR2，SEQ ID NO:24或32用作轻链FR3，SEQ ID NO:28或29用作轻链FR4，以制备多种抗体变体。抗体变体通过Expi293(Invitrogen)表达并通过蛋白质A纯化进行纯化。
通过检查抗体变体的CLDN6结合活性，提示表4和表5中所示的氨基酸取代可能有助于改善对人CLDN6的结合活性。
(表4)
Figure BDA0003407808460000761
(表5)
Figure BDA0003407808460000762
使用Igawa等人(WO2016159213)报道的Fab臂交换技术，使用与可变区一起显示对人CD3的结合活性的表4中描述的VH和表5中描述的VL(VH SEQ ID NO:70；VL SEQ ID NO:71)产生抗CLDN6/CD3双特异性抗体。包含在抗CLDN6/CD3抗体中的可变区显示于表6中，并且所产生的双特异性抗体含有对Fcγ受体亲和力衰减的沉默Fc。
(表6)
Figure BDA0003407808460000771
图11显示了在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，通过参考实施例3中所述的方法确定的显示于表6中的10nM的抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化活性。实施例2-3中产生的KLH/TR01用作阴性对照。
一些双特异性抗体，如25H0322/20L0072//TR01和25H0562/20L0072//TR01在hCLDN6/BaF的存在下与AE3-20/TR01相比显示较低的T细胞活化活性。
一些双特异性抗体，如25H0581/20L0072//TR01和25H0581/20L0532//TR01在hCLDN9/BaF和hCLDN4/BaF的存在下与AE3-20/TR01相比显示较高的T细胞活化活性。
但几种双特异性抗体在hCLDN6/BaF的存在下与AE3-20/TR01相比显示可比较的类似T细胞活化活性，但在hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下不显示较高的T细胞活化。
ECM(细胞外基质)是细胞外成分，并存在于体内的多个位点处。因此，已知强烈结合的ECM的抗体在血液中具有较弱的动力学(较短的半衰期)(WO2012093704A1)。
评价包含表7中所示的VH和VL的二价IgG抗体的ECM结合。在同一板中或在同一执行日期中获得的抗体MRA(VH：SEQ ID NO:66，VL：SEQ ID NO:67)的ECM结合值除每个抗体的ECM结合值(ECL反应)，并且所得的值显示于表7中。如表7中所示，抗体的ECM结合变化很大。
(表7)ECM结合结果
Figure BDA0003407808460000781
上述实验的结果表明，非常难以同时具有所有优选的性质，包括对CLDN6的高结合活性，对CLDN6的高结合特异性(对CLDN3、CLDN4和CLDN9的低结合活性)，以及低ECM结合。例如，虽然抗体彼此之间相比只有很少的氨基酸差异，但与包含AE3.20H作为VH的那些相比，包含25H0322或25H0562作为VH的抗体对CLDN6显示较弱的结合活性；包含25H0581作为VH的抗体对CLDN6显示弱的结合特异性；包含25H0176或25H0322作为VH的抗体从ECM结合视角不是最优选的变体。
考虑到对人CLDN6的结合活性和特异性以及ECM结合，抗体包含25H或25H0042作为VH，20L0532作为VL用于进一步的改造。
实施例5.抗体优化
Fab臂交换技术制备的双特异性抗体不适用于纯化和产生过程来大规模提供化合物。为了提高双特异性抗体的可制造性，如下进行进一步的优化。
实施例5-1.去除降解热点
为了避免化学降解，如环化、异构化、裂解和甲硫氨酸氧化，换言之，为了提高抗体的稳定性，取代CDR内的相应序列中的一些氨基酸残基。发现进一步改善CLDN6结合可变区的结合亲和力和特异性的氨基酸取代也被引入CDR中。
在表8中显示了与25H0042相比的VH和氨基酸取代的名称。在表9中显示了与20L0532相比的VL和氨基酸取代的名称。使用Igawa等人(WO2016159213)报道的Fab臂交换技术，使用与可变区一起显示对人CD3的结合活性的表8中描述的VH和表9中描述的VL(VHSEQ ID NO：70；VL SEQ ID NO：71)产生抗CLDN6/CD3双特异性抗体。包含在抗CLDN6/CD3抗体中的可变区显示于表10中，并且所产生的双特异性抗体含有对Fcγ受体亲和力衰减的沉默Fc。
(表8)
VH名称 与25H0042相比CDR中的氨基酸取代 SEQ ID NO
25H0671 M34G，G54V，S62V，Y97F 45
(表9)
VL名称 与20L0532相比CDR中的氨基酸取代 SEQ ID NO
20L0571 S31L，Y50L，D56I 46
(表10)
Figure BDA0003407808460000791
图12显示了在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，通过参考实施例3中所述的方法确定的10nM的抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化活性。25H0671/20L0571//TR01在hCLDN6/BaF的存在下与CS2201相比诱导可比较的T细胞活化，但在hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下与CS2201相比不显示较高的T细胞活化。
实施例5-2.PI改造
在双特异性抗体的制备中，当两种类型的重链和两种类型的轻链用于表达时，理论上表达十种类型的重链和轻链组合。为了使得能够通过分离这十种类型的抗体来易于纯化目的双特异性抗体，进行氨基酸修饰以降低CLDN6结合VH和VL的等电点(pI)。
为了评价多种氨基酸取代的pI降低效果，将氨基酸取代引入VH25H0671和VL20L0571中，以减少带正电荷的氨基酸(例如精氨酸和赖氨酸)的数量，同时增加带负电荷的氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)。
表11显示了pI改造的VH变体，表12显示了pI改造的VL变体。
(表11)
VH名称 与25H0671相比FR中的氨基酸取代 SEQ ID NO
57H0671 R16D，Q43E，N73D 47
65H0671 R16G，A84D，Q105E 50
(表12)
VL名称 与20L0571相比FR中的氨基酸取代 SEQ ID NO
53L0571 K45E，S60D 53
54L0571 K45E，S60D，L104V，K107E 54
包含选自表11的VH和选自表12的VL的二价IgG抗体用于计算理论pI。产生的二价IgG抗体包含相同的IgG恒定区。使用GENETYX-SV/RC Ver 14.0.0(GENETYX CORPORATION)通过类似于先前描述的方法计算抗体的理论pI。
计算的理论pI值显示于表13中。
(表13)理论pI
抗体名称 VH VL 理论pI
25H0671/20L0571_bivalent 25H0671 20L0571 8.04
57H0671/20L0571_bivalent 57H0671 20L0571 7.54
65H0671/20L0571_bivalent 65H0671 20L0571 7.69
25H0671/53L0571_bivalent 25H0671 53L0571 7.69
25H0671/54L0571_bivalent 25H0671 54L0571 7.37
65H0671/53L0571_bivalent 65H0671 53L0571 7.19
65H0671/54L0571_bivalent 65H0671 54L0571 6.83
使用Igawa等人(WO2016159213)报道的Fab臂交换技术，使用与可变区一起显示对人CD3的结合活性的表14中描述的CLDN6结合可变区(VH SEQ ID NO：70；VL SEQ ID NO：71)产生抗CLDN6/CD3双特异性抗体。所产生的双特异性抗体含有对Fcγ受体亲和力衰减的沉默Fc。
(表14)
Figure BDA0003407808460000811
图13显示了在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，通过参考实施例3中描述的方法确定的在CLDN6结合VH(57H0671/20L0571//TR01和65H0671/20L0571//TR01)中pI被改造的抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化活性。
根据理论pI、T细胞活化活性和构架的序列，选择65H0671的构架进行进一步评价。
图14显示了在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，通过参考实施例3中描述的方法确定的在CLDN6结合VL(25H0671/53L0571//TR01和25H0671/54L0571//TR01)中pI被改造的抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化活性。
根据理论pI和T细胞活化活性，选择54L0571的构架进行进一步评价。
使用Igawa等人(WO2016159213)报道的Fab臂交换技术，使用与可变区一起显示对人CD3的结合活性的表15中描述的CLDN6结合可变区(VH SEQ ID NO：70；VL SEQ ID NO：71)产生抗CLDN6/CD3双特异性抗体。所产生的双特异性抗体含有对Fcγ受体亲和力衰减的沉默Fc。
(表15)
抗体名称 CLDN6结合VH CLDN6结合VL
65H0671/54L0571//TR01 65H0671 54L0571
25H0671/20L0571//TR01 25H0671 20L0571
图15显示了在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，如通过参考实施例3中描述的方法确定的在CLDN6结合VH和CLDN6结合VL中pI被改造的抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化活性。结果表明65H0671/54L0571//TR01对人CLDN6的结合活性和结合特异性与25H0671/20L0571//TR01的相当。
实际上也使用具有cIEF cartridge(PS-MC02-C)的Maurice(ProteinSimple)确定包含所选构架的抗体的pI值。抗体中的恒定区与表13中所示的那些相同。样品载荷为55秒。随后，聚焦在1500V下进行1分钟，3000V进行6分钟。330nm和280nm激发处的荧光发射检测组合到280nm处的标准UV吸光度。荧光暴露时间是3秒钟、5秒钟、10秒钟和20秒钟。对于阳极电解液，使用0.1％甲基纤维素中的80mM磷酸，对于阴极电解液，使用0.1％甲基纤维素中的100mM氢氧化钠。每种样品溶液含有恒定量的0.017mg/ml样品、5％Pharmalyte 3-10、0.42％甲基纤维素、3.6M尿素、10mM Arg、1％pI标志物4.05和1％pI标志物9.99。相关软件Compass for iCE(2.0.10)用于数据分析。
(表16)
抗体名称 pI
25H0671/20L0571_bivalent 9.12
65H0671/54L0571_bivalent 7.49
如表16所示，测量的65H0671/54L0571_bivalent的pI为7.49，其低于25H0671/20L0571_bivalent的pI，该抗体没有任何pI改造的氨基酸修饰。
实施例5-3.控制重链和轻链配对
在双特异性抗体的制备中，当两种类型的重链和两种类型的轻链用于表达时，理论上表达十种类型重链和轻链组合。由于这些组合中的仅一种是目的双特异性抗体，因此获得目的双特异性抗体需要从10种不同抗体的混合物中纯化一种目的抗体，这是高度低效和困难的。作为解决该问题的手段，将“旋钮”和“孔”修饰(KiH：旋钮进入孔)引入IgGH链的CH3结构域中，使得具有组合的两个不同H链的IgG优先分泌，并进一步有效地在可变区内和CH1-CL结构域界面上获得目的分子、氨基酸取代及其组合用于促进想要的H链-L链结合(参考WO2013065708)。
将氨基酸取代Q39K引入SEQ ID NO:70中所示的CD3结合VH，并将氨基酸取代Q38E引入SEQ ID NO:71中所示的CD3结合VL中。分别在SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中显示氨基酸取代的CD3结合VH和VL的序列。
将氨基酸取代Q39E引入CLDN6结合VH65H0671，并将氨基酸取代Q38K引入CLDN6结合VL 54L0571中。将氨基酸取代的CLDN6结合VH和VL分别命名为65H0671Q39E(SEQ ID NO:57)和54L0571Q38K(SEQ ID NO:58)。
CLDN6结合VH 65H0671Q39E与SEQ ID NO:95中所示的第一CH1结构域区连接，CLDN6结合VL 54L0571Q38K与SEQ ID NO:59中所示的第一CL结构域连接，以制备SEQ IDNO:96中所示的第一轻链。SEQ ID NO:60中所示的CD3结合VH与SEQ ID NO:97中所示的第二CH1结构域连接，SEQ ID NO:61中所示的CD3结合VL与SEQ ID NO:62中所示的第二CL结构域连接，以制备SEQ ID NO:98中所示的第二轻链。CH1结构域和CL结构域与天然发生的相比还含有氨基酸取代，其为：第一CH1结构域中位置147、175和213处的Glu(E)；第一CL结构域中位置123、131、160和180处的Lys(K)；第二CH1结构域中氨基酸位置175处的Lys(K)；和第二CL结构域中氨基酸位置131、160和180处的Glu(E)。第一CH1结构域进一步连接第一铰链-CH2-CH3区以制备SEQ ID NO:99中所示的第一重链，第二CH1结构域进一步连接第二铰链-CH2-CH3区以制备SEQ ID NO:100中所示的第二重链。结果，产生了抗体CS2425(第一重链SEQ ID NO:99，第一轻链SEQ ID NO:96，第二重链SEQ ID NO:100，第二轻链SEQ ID NO:98)。
使用具有cIEF cartridge(PS-MC02-C)的Maurice(ProteinSimple)评价CS2425的电荷异质性。样品载荷为55秒。随后，聚焦在1500V下进行1分钟，3000V进行6分钟。检测是280nm处的UV吸光度。对于阳极电解液，使用0.1％甲基纤维素中的80mM磷酸，对于阴极电解液，使用0.1％甲基纤维素中的100mM氢氧化钠。每种样品溶液含有恒定量的0.085mg/ml样品、2％Pharmalyte 5-8、2％Pharmalyte 8-10.5、0.42％甲基纤维素、3.6M尿素、10mM Arg、1％pI标志物5.85和1％pI标志物10.17。相关软件Compass for iCE(2.0.10)用于数据分析。
图16(A)显示了当上文制备的第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链一起表达时，CS2425(65H0671Q39E-SG1189v14k/54L0571Q38K-SK1018//TR01H(Q39K)-SG1191v14h/TR01L(Q38E)-SK1017)的电荷异质性。电泳图提示两个突变都具有良好的HH和HL控制，因为除了pI 9.0周围的主峰之外没有其他明显的峰。
实施例5-4.抗CLDN6/CD3双特异性抗体的抗肿瘤效果和安全性分析
使用OV-90T细胞注射模型确定实施例5-1中制备的抗CLDN6/CD3双特异性抗体CS2201的体内抗肿瘤效果。AE3-20/TR01用作比较。在以0.1mg/kg双特异性抗体处理的小鼠中，针对OV-90T细胞注射模型，CS2201比AE3-20/TR01更有效(图17)。另一方面，CS2201和AE3-20/TR01在5mg/kg下显示出相当的抗肿瘤效果(图18)。关于CS2201的肝毒性，从血液测试的结果中没有观察到肝毒性标志物的异常(图19)。此外，发现CS2201和AE3-20/TR01的PK特征是可比较的(图20)。CS2201和AE3-20/TR01在0.1mg/kg组中的血浆半衰期(T1/2)分别为3.64和3.48天。0.1mg/kg组中CS2201和AE3-20/Tr01的血浆浓度-时间曲线下从0到无穷大(AUCinf)的面积分别为1.83和2.35天*微克/mL。
使用OV-90T细胞注射模型检查抗CLDN6/CD3双特异性抗体CS2425的抗肿瘤效果和毒性。用0.1mg/kg或5mg/kg CS2425处理用OV-90细胞接种的小鼠，并检查肿瘤体积和体重。
在给予0.1mg/kg CS2425的小鼠中观察到显著的肿瘤消退。在该处理组中，基于抗体施用后小鼠的体重变化和一般状况没有注意到任何有毒迹象(图21A)。然而，用5mg/kgCS2425处理的小鼠显示出显著的体重减轻(图21B)。与严重的体重变化一致的是，肝损伤的血液标志物在接受5mg/kg的CS2425的所有动物中急剧升高(图22)。
还计算了CS2425的循环水平。如实施例2-4中所述，从注射后第4、13天(对于0.1mg/kg组)和注射后第4、6天(对于5mg/kg组)的三只动物制备的血浆样品用于PK分析。图23表示施用后CS2425的血浆浓度的时间过程。
实施例6：重新改造CLDN6结合可变区
实施例6-1：使用人PBMC的体外免疫原性研究和控制氨基酸取代的重链和轻链配 对的重新选择
产生表17中所示的二价IgG抗体。已知抗体A具有低免疫原性，并且在免疫原性研究中用作阴性对照。已知具有高免疫原性的抗hA33抗体用作免疫原性研究中的阳性对照。
(表17)
Figure BDA0003407808460000851
如WO/2018/124005(Kubo C.等人)中所述，在显示活跃增殖之前通过使用分泌IL-2的CD4+ T细胞的比例作为指示剂来评价抗体的免疫原性潜力。具体地，从人PBMC制备CD8-CD25low PBMC，并且在抗体的存在下将细胞培养67小时。图24显示了确定培养细胞群中分泌IL-2细胞的比例的结果。如图24所示，与抗体-A相比，CS2419的阳性供体的频率低。另一方面，CS2421的阳性供体的频率类似于抗hA33抗体的频率。因此，使用分泌IL-2的CD4+T细胞的比例作为指示剂，CS2419被认为不具有高免疫原性潜力，但CS2421重组了具有高免疫原性潜力的抗体。从结果中，认为作为CS2425的CLDN6结合轻链(其示于SEQ ID NO:96中)涉及潜在的T细胞表位。
为了从CS2425的CLDN6结合轻链中鉴定潜在的T细胞表位，用CS2425进行MHC结合肽蛋白质组学(MAPP)，如US20050202009A1(Kropshofer H.等人)和mAbs 2018；10:1168-81(Sekiguchi N.等人)中所述。从人PBMC制备单核细胞，并且细胞分化成树突细胞(DC)。在LPS存在下用抗体脉冲DC，并在洗涤剂TX-100中裂解。在免疫沉淀过程中使用与抗HLA-DR抗体偶联的磁珠从裂解的DC中获得肽-MHC II复合体，并通过LC/Orbitrap MS/MS技术分析用0.1％TFA洗脱的HLA-DR结合肽。在图25中示出了CS2425的一部分轻链中的MAPP的热图。如图25所示，许多肽被鉴定为CS2425的CLDN6结合轻链的区域(序列号167～184)中的潜在T细胞表位。结果，位置180处的该氨基酸取代被认为是在CS2425的CLDN6结合轻链中产生潜在的T细胞表位的可能性。
根据免疫原性分析的结果，与CLDN6结合VL连接的CL中的氨基酸取代T180K引起了高免疫原性风险，因此不采用该突变来制备抗CLDN6/CD3双特异性抗体。
CLDN6结合VH65H0671Q39E与SEQ ID NO:95中所示的第一CH1结构域区连接，CLDN6结合VL54L0571Q38K与SEQ ID NO:63中所示的第一CL结构域连接，以制备SEQ ID NO:102中所示的第一轻链。SEQ ID NO:60中所示的CD3结合VH与SEQ ID NO:97中所示的第二CH1结构域连接，SEQ ID NO:61中所示的CD3结合VL与SEQ ID NO:62中所示的第二CL结构域连接，以制备SEQ ID NO:98中所示的第二轻链。CH1结构域和CL结构域与天然发生的相比还含有氨基酸取代，其为：第一CH1结构域中位置147、175和213处的Glu(E)；第一CL结构域中位置123、131和160处的Lys(K)；第二CH1结构域中位置175处的Lys(K)；和第二CL结构域中氨基酸位置131、160和180处的Glu(E)。第一CH1结构域进一步连接第一铰链-CH2-CH3区以制备SEQ ID NO：99中所示的第一重链，第二CH1结构域进一步连接第二铰链-CH2-CH3区以制备SEQ ID NO：100中所示的第二重链。结果，产生了抗体65H0671Q39E-SG1189v14k/54L0571Q38K-SK1021//TR01H(Q39K)-SG1191v14h/TR01L(Q38E)-SK1017(第一重链SEQ IDNO：99，第一轻链SEQ ID NO：102，第二重链SEQ ID NO：100，第二轻链SEQ ID NO：98)。
使用具有cIEF cartridge(PS-MC02-C)的Maurice(ProteinSimple)评价电荷异质性。样品载荷为55秒。随后，聚焦在1500V下进行1分钟，3000V进行6分钟。检测是280nm处的UV吸光度。对于阳极电解液，使用0.1％甲基纤维素中的80mM磷酸，对于阴极电解液，使用0.1％甲基纤维素中的100mM氢氧化钠。每种样品溶液含有恒定量的0.085mg/ml样品、2％Pharmalyte 5-8、2％Pharmalyte 8-10.5、0.42％甲基纤维素、3.6M尿素、10mM Arg、1％pI标志物5.85和1％pI标志物10.17。相关软件Compass for iCE(2.0.10)用于数据分析。
图16(B)显示了当上文制备的第一重链、第一轻链、第二重链和第二轻链一起表达时，所得抗体的电荷异质性。电泳图提示两个突变都具有良好的HH和HL控制，因为除了pI9.0周围的主峰之外没有其他明显的峰。
产生表18中所示的二价IgG抗体。
(表18)
抗体名称 重链 轻链
CS2652 抗体A重链 54L0571Q38K-SK1021
在CS2652的轻链中，CLDN6结合VL54L0571Q38K与SEQ ID NO：63中所示的CL结构域连接，以制备SEQ ID NO：102中所示的轻链。与天然发生的相比，CL结构域含有氨基酸取代，其为：位置123、131和160处的Lys(K)。
抗体的潜在免疫原性通过使用使用分泌IL-2的CD4+ T细胞的比例作为指示剂。如图26所示，CS2652的阳性供体的频率与抗体A的频率相似。因此，认为该抗体不具有高免疫原性潜力。
实施例6-2：CLDN6结合可变区变体的产生
虽然AE3-20/TR01和CS2201在小鼠中显示出强效果而没有任何毒性，但CS2425在小鼠中意外地导致严重的肝脏损伤。我们推测，实施例5中描述的CLDN6结合可变区中的氨基酸序列的修饰可能对抗体的特征具有影响，随后引起毒性。为了确认哪种修饰影响抗体引起肝脏毒性，构建了与CS2425相比具有较少氨基酸取代的CLDN6结合可变区变体。
使用Igawa等人(WO2016159213)报道的Fab臂交换技术，使用与可变区一起显示对人CD3(VH SEQ ID NO:70；VL SEQ ID NO:71)的结合活性的构建的CLDN6结合可变区变体产生抗CLDN6/CD3双特异性抗体。包含在抗CLDN6/CD3抗体中的可变区示于表19和表20中，并且示于表21中所产生的双特异性抗体含有对Fcγ受体亲和力衰减的沉默Fc。
通过如实施例4中所述的方法评价这些抗体的ECM结合。结果，所有这些抗体均显示出低ECM结合。
(表19)
Figure BDA0003407808460000881
(表20)
Figure BDA0003407808460000891
(表21)
Figure BDA0003407808460000892
实施例6-3.抗CLDN6/CD3双特异性抗体的效果和毒理学评价
为了评价所产生的抗CLDN6/CD3双特异性抗体的抗肿瘤效果和安全性，如下通过OV-90T细胞注射模型进行体内小鼠研究。用CS2201、CS2425、CS2884、CS2885、CS2886、CS2958、CS2959和CS2960以5mg/kg施用携带OV-90肿瘤的小鼠，然后计算肿瘤体积和体重。处理后也收集血液，然后用于分析肝损伤标志物的血浆水平。
图27表明除CS2201和CS2425之外使用CS2884、CS2885和CS2886的体内实验结果。如表21中所述，这些部分优化的抗CLDN6/CD3双特异性抗体包含实施例5-2中描述的氨基酸取代。如图27所示，CS2884、CS2885和CS2886显示出对OV-90肿瘤的生长抑制作用。除了完全优化的CS2425，在接受这些抗CLDN6/CD3双特异性抗体的小鼠中没有体重和肝损伤标志物的变化。该结果表明实施例5-2中描述的氨基酸取代不是肝损伤的原因(图28)。
图29表明除CS2201和CS2425之外使用CS2958、CS2959和CS2960的体内实验结果。如表21中所述，CS2958包含实施例5-2和实施例5-3中所述的氨基酸取代，CS2959仅包含实施例5-3中描述的可变区氨基酸取代，CS2960包含实施例5-1和实施例5-2中所述的氨基酸取代。如图29所示，这些抗CLDN6/CD3双特异性抗体降低了肿瘤生长，然而，在CS2425和CS2960处理组中观察到体重显著降低。与体重减轻一致，在CS2425和CS2960处理组中也发现了肝脏毒性标志物的显著升高(图30)。
结果显示CS2425和CS2960引起肝脏损伤，提示实施例5-1中描述的氨基酸取代最有可能是毒性的原因。
如图31所示，CS2201、CS2958、CS2959和CS2960的血浆半衰期(T1/2)分别为3.26、3.77、3.68和3.45天。CS2201、CS2958、CS2959和CS2960的血浆浓度-时间曲线下从零至无穷大(AUCinf)的面积分别为90.0、134、106和117天*微克/mL。
实施例6-4.FC优化
为了选择Fc区，产生了几种Fc变体，如表22所示。引入减少Fc区与Fcγ受体的结合活性的氨基酸突变(FcgR沉默突变)、脱糖基化突变和促进重链异源二聚化的突变(如WO2006106905中所述)。
(表22)
Figure BDA0003407808460000911
实施例6-5.CS2961、CS3346、CS3347和CS3348的产生
通过使用这些Fc变体，构建了表23中所示的四种双特异性抗体。
(表23)
Figure BDA0003407808460000921
实施例7.CS2961、CS3346、CS3347和CS3348的表征
实施例7-1.在CLDN家族蛋白表达细胞的存在下抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细 胞活化活性
图32显示了在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、hCLDN9/BaF或hCLDN6(Q156L)/BaF的存在下，通过参考实施例3中所述的方法确定的多种浓度的抗CLDN6/CD3双特异性抗体(AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425和CS2961)的T细胞活化活性。所有我们的抗CLDN6/CD3双特异性抗体在hCLDN6/BaF存在下均诱导T细胞活化。此外，在hCLDN4/BaF和hCLDN6(Q156L)/BaF存在下，10nM的AE3-20/TR01比其他抗CLDN6/CD3双特异性抗体诱导较高一点的T细胞活化，并且在hCLDN9/BaF存在下，10nM的6PHU3/TR01诱导较高一点的T细胞活化。
图33显示了在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，通过参考实施例3中所述的方法确定的多种浓度的抗CLDN6/CD3双特异性抗体，如CS2201、CS2961、CS3346、CS3347和CS3348的T细胞活化活性。所有我们的抗CLDN6/CD3双特异性抗体在hCLDN6/BaF存在下诱导T细胞活化，而在hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF和hCLDN9/BaF存在下，通过所有我们的抗CLDN6/CD3双特异性抗体没有观察到T细胞活化。
实施例7-2.抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞依赖性细胞细胞毒性的测量
图34显示了抗CLDN6/CD3双特异性抗体(AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425、CS2961、CS3346、CS3347和CS3348)对表达CLDN6的OVCAR3卵巢癌细胞系的T细胞依赖性细胞毒性。使用人PBMC(StemCell)通过LDH测定评价细胞细胞毒性。将20,000个靶细胞和200,000个人PBMC(E/T＝10)接种到96孔U-底板的每个孔中，并在37℃和5％CO2下与多种浓度的抗体温育24小时。通过LDH细胞毒性检测试剂盒(Takara Bio)测量靶细胞杀伤。使用以下公式计算每种抗体的细胞毒活性(％)。
细胞毒活性(％)＝(A-B-C)×100/(D-C)
“A”表示用抗体和PBMC处理的孔的吸光度，“B”表示仅效应细胞PBMC的平均吸光度值，“C”表示仅未处理的靶细胞的平均吸光度值，“D”表示Triton-X裂解的孔的平均值。背景吸光度已被说明并被扣除。所有我们的抗CLDN6/CD3双特异性抗体对OVCAR3细胞显示T细胞依赖性细胞细胞毒性。
实施例7-3.CS2961对CLDN家族的特异性的FACS分析
氨基酸序列在CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9中高度保守。因此，我们通过FACS分析检查了CLDN6结合特异性。hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF和hCLDN9/BaF与15微克/ml的CS2201、CS2961、AH05/TR01和6PHU3/TR01温育。使用实施例2-3中产生的KLH/TR01作为染色对照。用Alexa Fluor 488缀合的抗人IgG(Invitrogen)检测每种抗体的结合。通过eFlour 780(Invitrogen)染色分离死细胞。
如图35-1和35-2所示，所有抗CLDN6/CD3双特异性抗体显示与hCLDN6/BaF的强结合。在所评价的抗CLDN6/CD3双特异性抗体中，CS2961对CLDN6显示出最佳特异性。
实施例7-4.稳定性
评价CS2961、CS3346、CS3347和CS3348的稳定性。将每种抗体针对PBS，pH 7.4透析并在回收后将浓度调整至1mg/mL。将样品在5℃和40℃下储存一周，40℃下两周。在储存之后，使用SWXL G3000柱(TOSOH)，利用50mM NaPhosphate，300mM NaCl，pH 7.0作为运行缓冲液进行SEC分析。检测通过UV检测器(280nm)完成。使用Empower 3软件(Waters)分析色谱图。
图36所示的结果表明所有抗体显示出良好的稳定性，这肯定比双特异性sc(Fv)2分子的更好。
实施例7-5.体内效果和安全性
为了评价CS2961的抗肿瘤效果和安全性，如下进行体内小鼠研究。用5mg/kg纯化的CS2961施用携带OV-90肿瘤的小鼠，然后计算肿瘤体积和体重。处理后也收集血液，然后用于分析肝损伤标志物的血浆水平。
图29显示了使用CS2961的体内实验结果。如图29所示，CS2961减少了肿瘤体积，但不降低处理的小鼠的体重也不增加肝脏毒性标志物(图30)。
如图31所示，CS2961的血浆半衰期(T1/2)为11.2天，CS2961的血浆浓度-时间曲线下从零到无穷大(AUCinf)的面积为486天*微克/mL。这些结果表明，与由Fab臂交换技术产生的抗CLDN6/CD3双特异性抗体相比，CS2961显示出较慢的消除速率。
CS2961在小鼠中对OV-90肿瘤显示出有效的抗肿瘤活性和良好安全以及PK谱。此外，该抗体显示出改善的稳定性，更好的异二聚体形成，其优选用于大规模生产。由于实施例5-2中描述的氨基酸取代，CS2961也更容易纯化。
实施例7-6.剂量依赖性体内效果
使用如实施例2-4中所述的OV-90T细胞注射模型将CS3348的体内效果与AE3-20/TR01进行比较。
肿瘤体积在小鼠中达到约200mm3后，将动物随机化并施用每种双特异性抗体或运载体。图37显示了用AE3-20/TR01处理的小鼠的肿瘤生长，图38显示了用CS3348处理的小鼠的肿瘤生长。在实验中，在第0天将癌细胞OV-90移植到小鼠中，在第14天将多种剂量的AE3-20/TR01施用于小鼠，并在第15天将多种剂量的CS3348施用于小鼠。所有小鼠都接受一次施用。
在AE3-20/TR01和CS3348中以剂量依赖性方式看到针对OV-90肿瘤的显著的效果，但在所有剂量下均没有体重损失。
值得注意的是，在用0.04mg/kg CS3348处理的小鼠中观察到肿瘤消退，而在用1mg/kg AE3-20/TR01处理的小鼠中观察到了那些。换言之，CS3348的抗肿瘤效果可能是AE3-20/TR01的抗肿瘤效果的约25倍。
实施例8.体内抗肿瘤效果和毒性研究
使用肿瘤携带小鼠模型评价抗体的体内效果和毒性。将表达人密蛋白-6的人癌细胞系OVCAR-3、NCI-H1435或NUGC-3皮下移植到NOD/ShiJic-scid小鼠中。当肿瘤大小达到约200mm3时(称为T细胞注射模型)，将肿瘤携带小鼠随机化到处理组中以接受运载体对照或Ab。
也就是说，使用T细胞注射模型在效果测试中针对OVCAR-3、NCI-H1435或NUGC-3进行以下测试。使用人PBMC(AllCells)和T Cell Activation/Expansion Kit(MiltenyiBiotec)进行T细胞的扩增。将1x107个细胞的癌细胞和Matrigel Basement MembraneMatrix(BD)混合并皮下移植到NOD/ShiJic-scid小鼠(CLEA Japan，雌性，6-7周龄)的外侧区。移植的当天定义为第0天。根据肿瘤大小和体重随机化和分组后，以0.2mg/小鼠经腹膜内施用抗asialo GM1抗体(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)。在第二天，以3×107个细胞/小鼠腹膜内移植通过扩增培养获得的T细胞。在表24中显示了组的详细信息。在T细胞移植后大约四小时，静脉内施用CS3348。CS3348的施用仅进行一次。测量肿块的长度(L)和宽度(w)和体重，并将肿瘤体积(TV)计算为：TV＝(L x W x W)/2。
如图40至42所示(图40：OVCAR-3携带小鼠，图41：NCI-H1435携带小鼠，图42：NUGC-3携带小鼠)，CS3348以剂量依赖性方式对这3个癌细胞系显示出明显抗肿瘤活性，但没有任何毒性，包括体重减轻。
(表24)体内抗肿瘤效果评价的研究组的详细信息
a.TK220001(OVCAR-3携带小鼠)中的研究组
组 抗体 剂量
1 运载体
2 CS3348 0.0008mg/kg
3 CS3348 0.004mg/kg
4 CS3348 0.02mg/kg
5 CS3348 0.1mg/kg
6 CS3348 0.5mg/kg
7 CS3348 2.5mg/kg
b.TK219005(NCI-H1435携带小鼠)中的研究组
组 抗体 剂量
1 运载体
2 CS3348 0.02mg/kg
3 CS3348 0.1mg/kg
4 CS3348 0.5mg/kg
c.TK220003(NUGC-3携带小鼠)中的研究组
组 抗体 剂量
1 运载体
2 CS3348 0.004mg/kg
3 CS3348 0.02mg/kg
4 CS3348 0.1mg/kg
参考实施例1.抗体表达载体的制备以及抗体的表达和纯化
通过本领域技术人员通常已知的方法使用PCR或In fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Takara Bio Inc.)等进行氨基酸取代或IgG转化，以构建表达载体。通过本领域技术人员通常已知的方法测序所获得的表达载体。将制备的质粒瞬时转移到FreeStyle293细胞(ThermoFisher Scientific)或Expi293F细胞(ThermoFisher Scientific)中以表达抗体。通过本领域技术人员通常已知的方法使用rProtein A Sepharose(TM)Fast Flow(GEHealthcare Japan Corp.)从所得培养物上清液中纯化每种抗体。在双特异性抗体的情况下，ProteinL色谱(Protenova)是除去同型二聚体所必需(WO2018159615)。对于纯化抗体的浓度，使用分光光度计在280nm处测量吸光度，并通过使用PACE获得值计算的消光系数来计算计算抗体浓度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
参考实施例2.密蛋白表达细胞的产生
分别通过将人CLDN6、人CLDN9、人CLDN3、人CLDN4、小鼠CLDN6、小鼠CLDN9、小鼠CLDN3和小鼠CLDN4表达载体转染到小鼠proB细胞系Ba/F3中建立表达人CLDN6的Ba/F3细胞(hCLDN6/BaF)、表达人CLDN9的Ba/F3细胞(hCLDN9/BaF)、表达人CLDN3的Ba/F3细胞(hCLDN3/BaF)、表达人CLDN4的Ba/F3细胞(hCLDN4/BaF)、表达小鼠CLDN6的Ba/F3细胞(mCLDN6/BaF)、表达小鼠CLDN9的Ba/F3细胞(mCLDN9/BaF)、表达小鼠CLDN3的Ba/F3细胞(mCLDN3/BaF)和表达小鼠CLDN4的Ba/F3细胞(mCLDN4/BaF)。
密蛋白家族蛋白质具有可接近抗体的两个细胞外结构域。关于人CLDN6和人CLDN9的细胞外结构域之间的氨基酸序列相似性，第一细胞外结构域几乎相同，并且在第二细胞外结构域中只有两个不同的氨基酸(图39)。在人密蛋白6的位置156处的谷氨酰胺(SEQ IDNO:125或126中所示的序列中的位置156)被亮氨酸取代，以制备包含与位置156处的人密蛋白9相同的氨基酸的人CLDN6突变体。该人CLDN6突变体被命名为hCLDN6(Q156L)(SEQ IDNO:134)。使用上述类似方法产生Ba/F3转染体，其稳定表达hCLDN6(Q156L)。已建立的Ba/F3转染体被命名为hCLDN6(Q156L)/BaF。
通过使用293fectin(Invitrogen)将人和小鼠CLDNs(包括CLDN6、CLDN9、CLDN3和CLDN4)的表达载体引入FreeStyleTM 293-F细胞(Invitrogen)中来产生瞬时表达人和小鼠CLDN3、4、6和9的FreeStyleTM293-F转染细胞。所产生的FreeStyleTM 293-F转染细胞分别被命名为hCLDN3/FS293、hCLDN4/FS293、hCLDN6/FS293、hCLDN9/FS293、mCLDN3/FS293、mCLDN4/FS293、mCLDN6/FS293和mCLDN9/FS293。
参考实施例3.使用Jurkat报告基因测定的T细胞活化活性测定
使用GloResponseTM NFAT-luc2 Jurkat细胞(Promega)，通过T Cell ActivationBioassay检查在靶细胞存在下抗CLDN6/CD3双特异性抗体的T细胞活化。从参考实施例2产生的密蛋白表达细胞和癌细胞系中选择的一种细胞被用作每个测定中的靶细胞。
首先，将2x104个靶细胞以25micro L//孔接种在96孔平底板(Corning)上。接下来，在每个孔中加入1x105个Jurkat/NFAT-RE Reporter Cell Line作为效应细胞，使每个孔中的效应细胞和靶细胞的比率为5：1。然后将25micro L不同浓度的抗体溶液(通过测定法测定确定抗体浓度)分别加入到孔中。在37℃下培养过夜后，将75micro L的Bio-Glo试剂(Promega)加入每个孔中，并将板在室温下温育10分钟。通过EnVision(PerkinElmerJapan)或GloMax(注册商标)Explorer酶标仪来测量从每个孔中激活Jurkat细胞产生的发光(RLU)。通过在具有和不具有抗体的孔之间比较来计算每个孔的发光比率。
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实施例较为详细地描述了前述发明，但是说明书和实施例不应被解释为限制本公开的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用整体被明确地并入。
工业应用性
本公开的抗原结合分子可用于治疗和/或预防癌症，检测生物样品中CLDN6的存在，以及诊断多种癌症。抗原结合分子的一个实施方案是对CLDN6和T细胞受体复合体显示结合活性的抗原结合分子，其通过使T细胞靠近CLDN6表达细胞并使用T细胞对CLDN6-表达癌细胞的细胞毒性实现癌症治疗。
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Claims (15)

1.分离的抗体，其包含：
分别包含SEQ ID NO:113、117和118的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列的第一重链可变区；
分别包含SEQ ID NO:119、120和121的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列的第一轻链可变区；
分别包含SEQ ID NO:122、123和124的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3氨基酸序列的第二重链可变区；和
分别包含SEQ ID NO:114、115和116的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3氨基酸序列的第二轻链可变区。
2.分离的抗体，其包含：
包含选自SEQ ID NO:85、1、33和84的氨基酸序列的第一重链可变区；和包含选自SEQID NO:87、2、43、86和88的氨基酸序列的第一轻链可变区；
包含选自SEQ ID NO:60和70的氨基酸序列的第二重链可变区；和包含选自SEQ ID NO:61和71的氨基酸序列的第二轻链可变区。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述第一重链可变区连接至SEQ ID NO:95所示的第一CH1结构域，所述第一轻链可变区连接至SEQ ID NO:63所示的第一CL结构域，所述第二重链可变区连接至SEQ ID NO:97所示的第二CH1结构域，并且所述第二轻链可变区连接至SEQID NO:62所示的第二CL结构域。
4.权利要求1至3任一项的抗体，其中所述抗体进一步包含选自以下的任一种Fc区组合：
(1)SEQ ID NO:72所示的第一Fc区和SEQ ID NO:73所示的第二Fc区；
(2)SEQ ID NO:74所示的第一Fc区和SEQ ID NO:75所示的第二Fc区；
(3)SEQ ID NO:76所示的第一Fc区和SEQ ID NO:77所示的第二Fc区；和
(4)SEQ ID NO:78所示的第一Fc区和SEQ ID NO:79所示的第二Fc区。
5.权利要求4的抗体，其中所述第一Fc区与所述第一重链可变区在同一多肽链中，并且所述第二Fc区与所述第二重链可变区在同一多肽链中。
6.分离的抗体，其包含：
包含选自SEQ ID NO:104、105、106和107的氨基酸序列的第一重链和包含SEQ ID NO:112中所示氨基酸序列的第一轻链；
包含选自SEQ ID NO:108、109、110和111的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:98中所示氨基酸序列的第二轻链。
7.编码权利要求1至6任一项的抗体的分离的核酸。
8.包含权利要求7的核酸的宿主细胞。
9.产生抗体的方法，其包括培养权利要求8的宿主细胞以产生抗体。
10.药物组合物，其包含权利要求1至6任一项的抗体和药学上可接受的载体。
11.权利要求10的药物组合物，其诱导T细胞依赖性细胞毒性。
12.权利要求10或11的组合物，其是用于治疗和/或预防癌症的药物组合物。
13.权利要求10至12任一项的组合物，其是用于治疗和/或预防卵巢癌、非小细胞肺癌、胃癌或肝癌的药物组合物。
14.权利要求1至6任一项的抗体在制备药物中的用途。
15.治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的权利要求1至6任一项的抗体。
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