TW202116805A - Claudin-6結合分子以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供了對密連蛋白-6(Claudin-6，CLDN6)顯示出結合活性的抗原結合分子、此抗原結合分子的製造方法、此抗原結合分子和包含此抗原結合分子的免疫偶聯物於治療和/或預防癌症中的用途、此抗原結合分子於檢測生物樣品中CLDN6的存在的用途、以及此抗原結合分子於診斷各種癌症中的用途。

Description

CLAUDIN-6結合分子以及其用途
本揭露有關於Claudin-6結合分子，包含抗原結合分子和抗體、及其用途等。
抗體在血漿中穩定性高且副作用少，因此作為醫藥品而受到重視。在多種治療性抗體中，一些類型的抗體需要效應細胞(effector cell)來發揮抗腫瘤反應。抗體依賴性細胞介導之細胞毒殺性(Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)為效應細胞透過抗體的Fc區與NK細胞和巨噬細胞上存在的Fc受體結合，而對抗體所結合的細胞所發揮出的細胞毒殺性。到目前為止，已開發出多種作為治療癌症的醫藥品之可誘導ADCC而發揮抗腫瘤功效的治療性抗體(非專利文獻1)。
自1980年代以來，除了藉由募集NK細胞或巨噬細胞作為效應細胞而採用ADCC的抗體之外，藉由募集T細胞作為效應細胞而採用細胞毒殺性的T細胞募集抗體(T cell-recruiting antibody，TR抗體)已為人所知(非專利文獻2至4)。TR抗體是雙特異性抗體，其辨識且結合至在T細胞上形成T細胞受體複合物的任一子單元特別是CD3ε鏈、和癌細胞上的抗原。目前正在開發幾種TR抗體。卡妥昔單抗(Catumaxomab)是抗EpCAM的TR抗體，已在歐盟批准用於治療惡性腹水(malignant ascites)。再者，最近發現一種稱為「雙特異性T細胞銜接子(bispecific T-cell engager，BiTE)」的TR抗體表現出強的抗腫瘤活性(非專利文獻5和6)。百利妥單抗(Blinatumomab)是針對CD19的BiTE分子，於2014年先獲得FDA批准。與利妥昔單抗(Rituximab)相比，百利妥單抗在體外(in vitro )對CD19/CD20陽性癌細胞表現出更強的細胞毒殺活性，誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒殺性(ADCC)和補體依賴性細胞毒殺性(CDC)(非專利7)。
然而，已知三功能抗體以癌抗原非依賴性的方式同時結合至T細胞和例如NK細胞或巨噬細胞的細胞，因此使在細胞上表現的受體交聯，且以抗原非依賴性的方式，來誘導各種細胞激素的表現。由於這種細胞激素表現的誘導，全身投予三功能抗體被認為會引起類細胞激素風暴的副作用。事實上，已有報導指出在第I期臨床試驗中，對非小細胞肺癌患者全身投予卡妥昔單抗而言，極低劑量的5 μg/公斤體重是最大耐受劑量，且投予較高劑量會導致各種嚴重的副作用(非專利文獻8)。當以如此低的劑量投予時，卡妥昔單抗永遠無法達到有效的血液水平。即，以如此低的劑量投予卡妥昔單抗不能達到預期的抗腫瘤效果。
同時，與卡妥昔單抗不同，雙特異性sc(Fv)2 型式分子(BiTE)沒有Fcγ受體結合位，因此其不會以癌抗原非依賴性的方式，與在T細胞和例如NK細胞和巨噬細胞的細胞上表現的受體交聯。然而，由於雙特異性sc(Fv)2 是沒有Fc區之經修飾的低分子量抗體分子，所以問題是在投予至患者後，其血液半衰期顯著短於常規作為治療性抗體的IgG型抗體。事實上，體內(in vivo )投予的雙特異性sc(Fv)2 的血液半衰期已被報導為約數小時(非專利文獻9和10)。百利妥單抗是一種結合至CD19和CD3的sc(Fv)2 分子，已被批准用於治療急性淋巴細胞白血病。在患者中，百利妥單抗的血清半衰期已被揭示為少於2小時(非專利文獻21)。在百利妥單抗的臨床試驗中，使用微量泵連續靜脈輸注來投予百利妥單抗。此投予方法不僅對患者極為不便，還具有由於裝置故障等所引起醫療事故的潛在風險。因此，不能說這樣的投予方法是理想的。
密連蛋白(Claudin)家族是分子量約23 kD的細胞膜蛋白家族，具有四個穿膜域且構成緊密型連接。密連蛋白家族在人類和小鼠中包含24個成員，且已知密連蛋白家族的每個成員會根據各個上皮細胞的類型(非專利11至14)表現出非常獨特的表現模式。在一片上皮細胞中，有一機制會作用以防止物質在細胞間隙中洩漏(擴散)，且在此防止洩漏的機制中，稱為緊密型連接的細胞-細胞黏著系統已顯示確實扮演作為「屏障」的核心角色。
緊密型連接分子密連蛋白6(Claudin 6，CLDN6)是密連蛋白家族蛋白的一成員，在正常成人組織(非專利文獻15和16)中顯示出轉錄沉默表現，而在多種癌症例如卵巢癌、NSCLC和胃癌(非專利文獻17至19)中，顯示出正向調控。關於抗CLDN6抗體，已有報導指出對CLDN6的單特異性抗體對CLDN6陽性癌細胞株(專利文獻1至5)具有ADCC活性或內化活性(internalization activity)。到目前為止，已使用具有抗CD3/抗CLDN6特異性的雙特異性sc(Fv)2 型式(專利文獻6至7)，來對命名為6PHU3之CLDN6靶向T細胞重定向雙特異性抗體進行改造。在臨床前評估(evaluation)中，6PHU3已被報導在體外和體內均顯示出能有效殺死癌細胞(非專利文獻20)。 [引用列表] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2009/087978 [專利文獻2]WO2011/057788 [專利文獻3]WO2012/003956 [專利文獻4]WO2012/156018 [專利文獻5]WO2015/069794 [專利文獻6]WO2014/075697 [專利文獻7]WO2014/075788 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Clin Cancer Res. 2010 Jan 1;16(1):11-20。 [非專利文獻2]Nature. 1985 Apr 18-24;314(6012):628-31。 [非專利文獻3]Int J Cancer. 1988 Apr 15;41(4):609-15。 [非專利文獻4]Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Mar;83(5):1453-7。 [非專利文獻5]Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Jul 18;92(15):7021-5。 [非專利文獻6]Drug Discov Today. 2005 Sep 15;10(18):1237-44。 [非專利文獻7]Int J Cancer. 2002 Aug 20;100(6):690-7。 [非專利文獻8]Cancer Immunol Immunother(2007)56(10), 1637-44。 [非專利文獻9]Cancer Immunol Immunother.(2006)55(5), 503-14。 [非專利文獻10]Cancer Immunol Immunother.(2009)58(1), 95-109。 [非專利文獻11]Furuse and Tsukita, TRENDS in Cell Biology 2006, 16: 181。 [非專利文獻12]Wilcox, et al., Cell 2001, 104: 165。 [非專利文獻13]Rahner, et al., GASTROENTEROLOGY 2001, 120: 411。 [非專利文獻14]Morita, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96: 511。 [非專利文獻15]Dev Dyn. 2004 Oct;231(2):425-31。 [非專利文獻16]Am J Physiol Renal Physiol. 2006 Dec;291(6):F1132-41。 [非專利文獻17]Int J Cancer. 2014 Nov 1;135(9):2206-14。 [非專利文獻18]Histopathology. 2012 Dec;61(6):1043-56。 [非專利文獻19]J Gastrointest Cancer. 2010 Mar;41(1):52-9。 [非專利文獻20]Oncoimmunology. 2015 Oct 29;5(3):e1091555。 [非專利文獻21]Nat Rev Drug Discov. 2014 Nov;13(11):799-801。
[欲解決之技術問題]
如以上所提及，雙特異性sc(Fv)2 是沒有Fc區之經修飾的低分子量抗體分子，且與IgG型抗體相比，顯示出顯著較短的血液半衰期，這會對其作為治療藥物產生不便。在使用名為6PHU3之結合至CLDN6的雙特異性sc(Fv)2 的情況下，已有報導指出6PHU3的血漿蛋白水平在6小時內急劇下降，且在24小時後幾乎檢測不到細胞毒殺活性(Nat Med. 2017 Jul;23(7):815-817.)。再者，sc(Fv)2 的型式面臨製造上的困難，包含在長期儲存的期間穩定性差。
在一面向中，本揭露的目的是提供對CLDN6和T細胞受體複合物顯示出結合活性的抗原結合分子(包含抗體)，尤其是具有高穩定性和長血清半衰期的抗原結合分子，其藉由使T細胞靠近CLDN6表現細胞且使用T細胞對CLDN6表現癌細胞的細胞毒殺性，而能夠治療癌症。提供抗原結合分子的製造方法、和包含這種抗原結合分子作為活性成分的醫藥組合物也是本揭露的目的。
在另一面向中，本揭露的目的是提供藉由靶向CLDN6表現細胞，而能夠治療癌症之對CLDN6顯示出結合活性的抗原結合分子、抗原結合分子的製造方法、和包含這種抗原結合分子作為活性成分的醫藥組合物、或包含這種抗原結合分子作為活性成分的免疫偶聯物(immunoconjugate)。在本揭露中亦提供了此抗原結合分子於檢測生物樣品中的CLDN6的存在的用途、和此抗原結合分子於各種癌症的診斷中的用途。
本揭露亦提供了用於治療或預防各種癌症的醫藥組合物和使用此醫藥組合物的治療方法，醫藥組合物包含上述作為活性成分的抗原結合分子或免疫偶聯物之其中一者。 [解決問題之技術手段]
發明人發現，包含對CLDN6顯示出結合活性的特定重鏈可變區(VH)和特定輕鏈可變區(VL)、及對T-細胞受體複合物顯示出結合活性的第二VH與第二VL的抗原結合分子可破壞表現CLDN6的細胞，且發揮優異的細胞毒殺/抗腫瘤活性。包含特定序列的抗原結合分子也顯示出優異的穩定性、安全性和可製造性。本揭露提供了可藉由包含此抗原結合分子作為活性成分，來治療各種癌症的抗原結合分子和醫藥組合物，尤其是與CLDN6相關的那些癌症，例如CLDN6陽性腫瘤。
發明人亦發現，包含特定VH和特定VL的抗原結合分子對CLDN6顯示出結合活性且對人類CLDN6顯示出優異的特異性，因此此抗原結合分子及其免疫偶聯物可用於靶向表現CLDN6的細胞、檢測生物樣品中之CLDN6的存在、及診斷各種癌症。
更具體而言，本揭露提供以下內容： [1]一種單離抗體，其包含： 第一重鏈可變區，其包含分別為序列辨識號：113、117及118的的HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3胺基酸序列； 第一輕鏈可變區，其包含分別為序列辨識號：119、120及121的HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3胺基酸序列； 第二重鏈可變區，其包含分別為序列辨識號：122、123及124的HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3胺基酸序列；以及 第二輕鏈可變區，其包含分別為序列辨識號：114、115及116的HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3胺基酸序列。 [2]一種單離抗體，其包含： 第一重鏈可變區，其包含選自序列辨識號：85、1、33和84的胺基酸序列；以及第一輕鏈可變區，其包含選自序列辨識號：87、2、43、86和88的胺基酸序列； 第二重鏈可變區，其包含選自序列辨識號：60和70的胺基酸序列；以及第二輕鏈可變區，其包含選自序列辨識號：61和71的胺基酸序列。 [3]如[1]或[2]所述的抗體，其中第一重鏈可變區連接至序列辨識號：95中所示的第一CH1域，第一輕鏈可變區連接至序列辨識號：63中所示的第一CL域，第二重鏈可變區連接至序列辨識號：97中所示的第二CH1域，且第二輕鏈可變區連接至序列辨識號：62中所示的第二CL域。 [4]如[1]至[3]中任一者所述的抗體，其中抗體更包含選自以下的Fc區組合中的任一者： (1)序列辨識號：72中所示的第一Fc區和序列辨識號：73中所示的第二Fc區； (2)序列辨識號：74中所示的第一Fc區和序列辨識號：75中所示的第二Fc區； (3)序列辨識號：76中所示的第一Fc區和序列辨識號：77中所示的第二Fc區；以及 (4)序列辨識號：78中所示的第一Fc區和序列辨識號：79中所示的第二Fc區。 [5]如[4]所述的抗體，其中第一Fc區和第一重鏈可變區在相同的多肽鏈中，且第二Fc區和第二重鏈可變區在相同的多肽鏈中。 [6]如[1]至[5]中任一者所述的抗體，其中第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區形成第一抗原結合位，且第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區形成第二抗原結合位。 [7]一種單離抗體，其包含： 第一重鏈，其包含選自序列辨識號：104、105、106和107的胺基酸序列；以及第一輕鏈，其包含序列辨識號：112中所示的胺基酸序列； 第二重鏈，其包含選自序列辨識號：108、109、110和111的胺基酸序列；以及第二輕鏈，其包含序列辨識號：98中所示的胺基酸序列。 [8]如[7]所述的抗體，其中第一重鏈和第一輕鏈的可變區形成第一抗原結合位，且第二重鏈和第二輕鏈的可變區形成第二抗原結合位。 [9]如[6]或[8]所述的抗體，其中第一抗原結合位對CLDN6具有結合活性。 [10]如[6]、[8]和[9]中任一項所述的抗體，其中第一抗原結合位對人類CLDN6具有結合活性。 [11]如[6]、[8]至[10]中任一項所述的抗體，其中第一抗原結合位對如序列辨識號：125或126中所定義之人類CLDN6具有結合活性。 [12]如[6]、[8]至[11]中任一項所述的抗體，其中第一抗原結合位實質上不結合至人類CLDN9。 [13]如[6]、[8]至[12]中任一項所述的抗體，其中第一抗原結合位實質上不結合至人類CLDN4。 [14]如[6]、[8]至[13]中任一項所述的抗體，其中第一抗原結合位實質上不結合至人類CLDN3。 [15]如[6]、[8]至[14]中任一項所述的抗體，其中第一抗原結合位實質上不結合至如序列辨識號：134中所定義之人類CLDN6突變株。 [16]如[6]、[8]至[15]中任一項所述的抗體，其中第二抗原結合位對CD3具有結合活性。 [17]如[6]、[8]至[16]中任一項所述的抗體，其中第二抗原結合位對CD3ε鏈具有結合活性。 [18]如[6]、[8]和[17]中任一項所述的抗體，其中第二抗原結合位對如序列辨識號：142中所定義之人類CD3具有結合活性。 [19]一種單離核酸，其編碼[1]至[18]中任一者所述的抗體。 [20]一種宿主細胞，其包含[19]所述的核酸。 [21]一種抗體的製造方法，其包含培養[20]所述的宿主細胞，以產生抗體。 [22]如[21]所述的方法，其更包含從宿主細胞的培養液回收抗體。 [23]一種醫藥組合物，其包含如[1]至[18]中任一者所述的抗體、以及醫藥上可接受的載體。 [24]如[23]所述的醫藥組合物，其誘導T細胞依賴性細胞毒殺性。 [25]如[23]或[24]所述的醫藥組合物，其為用於治療和/或預防癌症的醫藥組合物。 [26]如[23]至[25]中任一者所述的醫藥組合物，其為用於治療和/或預防卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的醫藥組合物。 [27]如[1]至[18]中任一者所述的抗體於藥物的製備中的用途。 [28]如[1]至[18]中任一者所述的抗體於治療和/或預防癌症的藥物的製備中的用途。 [29]如[1]至[18]中任一者所述的抗體於治療和/或預防卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的藥物的製備中的用途。 [30]一種具有癌症的個體的治療方法，其包含對個體投予有效量之如[1]至[18]中任一者所述的抗體。 [31]一種具有卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的個體的治療方法，其包含對個體投予有效量之如[1]至[18]中任一者所述的抗體。 [32]一種用於治療或預防癌症的套組(kit)，其包含至少如[1]至[18]中任一者所述的抗體、及使用指示。 [33]一種用於治療或預防卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的套組，其包含至少如[1]至[18]中任一者所述的抗體、及使用指示。
再者，本揭露亦提供以下內容： [34]一種抗原結合分子，其包含： (a)重鏈可變區，其包含選自以下的HVR組合中任一者： (a1)序列辨識號：113、117和118中分別所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3胺基酸序列；和 (a2)與序列辨識號：91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85中所示的重鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3； 以及 (b)輕鏈可變區，其包含選自以下的HVR組合中任一者： (b1)序列辨識號：119、120和121中分別所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3胺基酸序列；和 (b2)與序列辨識號：92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88和58中所示的重鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。 [35]如[34]所述的抗原結合分子，其中重鏈可變區和輕鏈可變區包含小鼠、兔、人源化或人類框架。 [36]一種抗原結合分子，其包括包含選自序列辨識號：85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83和57的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含選自序列辨識號：87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82和58的胺基酸序列的輕鏈可變區。 [37]如[34]至[36]中任一者所述的抗原結合分子，其中重鏈可變區和輕鏈可變區形成抗原結合位。 [38]如[37]所述的抗原結合分子，其中抗原結合位對CLDN6具有結合活性。 [39]如[37]或[38]所述的抗原結合分子，其中抗原結合位對如序列辨識號：125或126中所定義之人類CLDN6具有結合活性。 [40]如[37]至[39]中任一者所述的抗原結合分子，其中抗原結合位實質上不結合至人類CLDN9。 [41]如[37]至[40]中任一者所述的抗原結合分子，其中抗原結合位實質上不結合至人類CLDN4。 [42]如[37]至[41]中任一者所述的抗原結合分子，其中抗原結合位實質上不結合至人類CLDN3。 [43]如[37]至[42]中任一者所述的抗原結合分子，其中抗原結合位實質上不結合至如序列辨識號：134中所定義之人類CLDN6突變株。 [44]如[34]至[43]中任一者所述的抗原結合分子，其中抗原結合分子更包含抗體Fc區。 [45]如[44]所述的抗原結合分子，其中Fc區為在序列辨識號：143至146(IgG1至IgG4)之構成Fc區的任何胺基酸中具有至少一胺基酸突變的Fc區。 [46]如[44]或[45]所述的抗原結合分子，其中Fc區為與糖鏈連接的Fc區，且與Fc區連接的岩藻糖缺失之糖鏈的百分比高於與天然IgG Fc區連接的岩藻糖缺失之糖鏈的百分比，或添加至Fc區的平分型(bisecting)N-乙醯葡萄糖胺的百分比高於添加至天然IgG Fc區的平分型N-乙醯葡萄糖胺的百分比。 [47]如[34]至[46]中任一者所述的抗原結合分子，其中抗原結合分子具有細胞毒殺活性。 [48]如[47]所述的抗原結合分子，其中細胞毒殺活性為ADCC或CDC。 [49]如[34]至[46]中任一者所述的抗原結合分子，其中抗原結合分子具有內化活性。 [50]如[34]至[49]中任一者所述的抗原結合分子，其與細胞毒殺劑偶聯。 [51]一種免疫偶聯物，其包含如[34]至[50]中任一者所述的抗原結合分子、和細胞毒殺劑。 [52]一種醫藥組合物，其包含如[34]至[50]中任一者所述的抗原結合分子或如[50]所述的免疫偶聯物、和醫藥上可接受的載體。 [53]如[52]所述的組合物，其為用於治療和/或預防癌症的醫藥組合物。 [54]如[52]或[53]所述的組合物，其為用於治療或預防卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的醫藥組合物。 [55]如[34]至[50]中任一者所述的抗原結合分子或如[51]所述的免疫偶聯物於藥物的製造中的用途。 [56]如[34]至[50]中任一者所述的抗原結合分子或如[51]所述的免疫偶聯物於治療和/或預防癌症的藥物的製造中的用途。 [57]如[34]至[50]中任一者所述的抗原結合分子或如[51]所述的免疫偶聯物於治療和/或預防卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的藥物的製造中的用途。 [58]一種具有癌症的個體的治療方法，其包含對個體投予有效量之如[34]至[50]中任一者所述的抗原結合分子或如[51]所述的免疫偶聯物。 [59]一種具有卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的個體的治療方法，其包含對個體投予有效量之如[34]至[50]中任一者所述的抗原結合分子或如[51]所述的免疫偶聯物。 [60]一種用於治療和/或預防癌症的套組，其包含至少如[34]至[50]中任一者所述的抗原結合分子或如[51]所述的免疫偶聯物、及使用指示。 [61]一種用於治療和/或預防卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的套組，其包含至少如[34]至[50]中任一者所述的抗原結合分子或如[51]所述的免疫偶聯物、及使用指示。 [62]一種檢測生物樣品中的CLDN6的存在的方法，其包含使生物樣品接觸如[34]至[41]中任一者所述的抗原結合分子。 [63]如[62]所述的方法，其中在允許抗原結合分子結合至CLDN6的條件下，使生物樣品與抗原結合分子接觸，且檢測抗原結合分子和CLDN6之間是否形成複合物。 [64]一種診斷對象是否具有癌症的方法，其包含使來自對象的生物樣品接觸如[34]至[41]中任一者所述的抗原結合分子。 [65]如[64]所述的方法，其中在允許抗原結合分子結合至CLDN6的條件下，使生物樣品與抗原結合分子接觸，且檢測抗原結合分子和CLDN6之間是否形成複合物。 [66]如[64]或[65]所述的方法，其中癌症為卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌。 [67]一種單離核酸，其編碼如[34]至[41]中任一者所述的抗原結合分子。 [68]一種宿主細胞，其包含如[67]所述的核酸。 [69]一種抗原結合分子的製造方法，其包含培養如[68]所述的宿主細胞，以產生抗原結合分子。 [70]如[69]所述的方法，其更包含從宿主細胞的培養液回收抗原結合分子。
再者，本揭露亦提供以下內容： [71]一種抗原結合分子，其包含： 第一抗原結合位，其對CLDN6具有結合活性，和 第二抗原結合位，其對T細胞受體複合物具有結合活性， 其中第一抗原結合位藉由以下來形成 (a)重鏈可變區，其包含選自以下的HVR組合中任一者： (a1)序列辨識號：113、117和118中分別所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3胺基酸序列；和 (a2)與序列辨識號：91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85中所示的重鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3； 以及 (b)輕鏈可變區，其包含選自以下的HVR組合中任一者： (b1)序列辨識號：119、120和121中分別所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3胺基酸序列；和 (b2)與序列辨識號：92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88和58中所示的重鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。 [72]如[71]所述的抗原結合分子，其中形成第一抗原結合位的重鏈可變區和輕鏈可變區更包含小鼠、兔、人源化或人類框架。 [73]一種抗原結合分子，其包含： 第一抗原結合位，其對CLDN6具有結合活性，和 第二抗原結合位，其對T細胞受體複合物具有結合活性， 其中第一抗原結合位包括包含選自序列辨識號：85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83和57的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含選自序列辨識號：87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82和58的胺基酸序列的輕鏈可變區。 [74]如[71]至[73]中任一者所述的抗原結合分子，其中第一抗原結合位對CLDN6具有結合活性。 [75]如[71]至[74]中任一者所述的抗原結合分子，其中第一抗原結合位對如序列辨識號：125或126中所定義之人類CLDN6具有結合活性。 [76]如[71]至[75]中任一者所述的抗原結合分子，其中第一抗原結合位實質上不結合至人類CLDN9。 [77]如[71]至[76]中任一者所述的抗原結合分子，其中第一抗原結合位實質上不結合至人類CLDN4。 [78]如[71]至[77]中任一者所述的抗原結合分子，其中第一抗原結合位實質上不結合至人類CLDN3。 [79]如[71]至[78]中任一者所述的抗原結合分子，其中第一抗原結合位實質上不結合至如序列辨識號：134中所定義之人類CLDN6突變株。 [80]如[71]至[73]中任一者所述的抗原結合分子，其中第一抗原結合位點包含於單鏈Fv(scFv)、Fv或Fab中。 [81]如[71]至[80]中任一者所述的抗原結合分子，其中第二抗原結合位對CD3具有結合活性。 [82]如[71]至[80]中任一者所述的抗原結合分子，其中第二抗原結合位對CD3ε鏈具有結合活性。 [83]如[71]至[80]中任一者所述的抗原結合分子，其中第二抗原結合位對T細胞受體具有結合活性。 [84]如[71]至[82]中任一者所述的抗原結合分子，其中第二抗原結合位係由包含分別為序列辨識號：122、123及124的HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3胺基酸序列的重鏈可變區；以及包含分別為序列辨識號：114、115及116的HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3胺基酸序列的輕鏈可變區所形成。 [85]如[84]所述的抗原結合分子，其中重鏈可變區和輕鏈可變區包含小鼠、兔、人源化或人類框架。 [86]如[71]至[82]中任一者所述的抗原結合分子，其中第二抗原結合位係由包含選自序列辨識號：60和70的胺基酸序列的重鏈可變區；以及包含選自序列辨識號：61和71的胺基酸序列的輕鏈可變區所形成。 [87]如[71]至[86]中任一者所述的抗原結合分子，其中第二抗原結合位包含於單鏈Fv(scFv)、Fv或Fab中。 [88]如[71]至[87]中任一者所述的抗原結合分子，其中抗原結合分子更包含抗體Fc區。 [89]如[88]所述的抗原結合分子，其中Fc區為對Fcγ受體具有減弱的結合活性的Fc區。 [90]如[88]或[89]所述的抗原結合分子，其中Fc區為在序列辨識號：143至146(IgG1至IgG4)之構成Fc區的任何胺基酸具有至少一胺基酸突變的Fc區。 [91]如[88]至[90]中任一者所述的抗原結合分子，其中Fc區為選自於以下EU編號所指定的胺基酸位置具有至少一個胺基酸突變的Fc區： 第220位、第226位、第229位、第231位、第232位、第233位、第234位、第235位、第236位、第237位、第238位、第239位、第240位、第264位、第265位、第266位、第267位、第269位、第270位、第295位、第296位、第297位、第298位、第299位、第300位、第325位、第327位、第328位、第329位、第330位、第331位和第332位。 [92]如[88]至[91]中任一者所述的抗原結合分子，其中Fc區為包含至少一個胺基酸選自於以下EU編號所指定的胺基酸的Fc區： 位於胺基酸第234位的Arg、位於胺基酸第235位的Ala或Arg、位於胺基酸第239位的Lys和位於胺基酸第297位的Ala。 [93]如[88]至[92]中任一者所述的抗原結合分子，其中 形成第一抗原結合位的重鏈可變域透過第一CH1域連接至Fc區，形成第一抗原結合位的輕鏈可變域連接至第一CL域；且 形成第二抗原結合位的重鏈可變域透過第二CH1域連接至Fc區，形成第二抗原結合位的輕鏈可變域連接至第二CL域。 [94]如[93]所述的抗原結合分子，其中控制CH1和CL域的電荷，使得形成第一抗原結合域的重鏈可變區與形成第一抗原結合域的輕鏈可變區組裝，且/或形成第二抗原結合域的重鏈可變區與形成第二抗原結合域的輕鏈可變區組裝。 [95]如[71]至[94]中任一者所述的抗原結合分子，其中抗原結合分子具有細胞毒殺活性。 [96]如[95]所述的抗原結合分子，其中細胞毒殺活性為T細胞依賴性細胞毒殺活性。 [97]一種單離多核苷酸，其編碼如[71]至[96]中任一者所述的抗原結合分子。 [98]一種宿主細胞，其包含如[97]所述的多核苷酸。 [99]一種抗體的製造方法，其包含培養如[98]所述的宿主細胞，以產生抗原結合分子。 [100]如[99]所述的方法，其更包含從宿主細胞的培養液回收抗原結合分子。 [101]一種醫藥組合物，其包含如[71]至[96]中任一者所述的抗原結合分子和醫藥上可接受的載體。 [102]如[101]所述的醫藥組合物，其誘導T細胞依賴性細胞毒殺性。 [103]如[101]或[102]所述的組合物，其為用於治療和/或預防癌症的醫藥組合物。 [104]如[101]至[103]所述的組合物，其為用於治療和/或預防卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的醫藥組合物。 [105]如[71]至[96]中任一者所述的抗原結合分子於藥物的製造中的用途。 [106]如[71]至[96]中任一者所述的抗原結合分子於治療和/或預防癌症的藥物的製造中的用途。 [107]如[71]至[96]中任一者所述的抗原結合分子於治療和/或預防卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的藥物的製造中的用途。 [108]一種具有癌症的個體的治療方法，其包含對個體投予有效量之如[71]至[96]中任一者所述的抗原結合分子。 [109]一種具有卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的個體的治療方法，其包含對個體投予有效量之如[71]至[96]中任一者所述的抗原結合分子。 [110]一種用於治療和/或預防癌症的套組，其包含至少如[71]至[96]中任一者所述的抗原結合分子、及使用指示。 [111]一種用於治療和/或預防卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的套組，其包含至少如[71]至[96]中任一者所述的抗原結合分子、及使用指示。 [本發明之有利功效]
本揭露提供藉由使T細胞靠近CLDN6表現細胞且使用T細胞之對CLDN6表現癌細胞的細胞毒殺性，而能夠治療癌症的多特異性抗原結合分子、多特異性抗原結合分子的製造方法、以及含有這種多特異性抗原結合分子作為誘導細胞的細胞毒殺性之有效成分的醫藥組合物。本揭露的多特異性抗原結合分子具有誘導細胞的細胞毒性之強烈的抗腫瘤活性，且可靶向和破壞CLDN6表現細胞，從而能夠治療和預防各種癌症。再者，包含特定序列的抗原結合分子亦對CLDN6具有優異的特異性、於血液中的長半衰期及改善的安全性、穩定性和可製造性。
本揭露還提供了對CLDN6顯示出優異的特異性的抗原結合分子，其能夠準確檢測生物樣品中CLDN6的存在且診斷各種癌症。還能夠藉由靶向CLDN6表現細胞來治療癌症。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般很容易理解並通常使用常規方法，來利用本文所描述或參考的技術和流程，例如，Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed.(1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8)J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；和Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)中所述之廣泛使用的方法。
以下提供定義和詳細描述，以幫助理解在此說明的本揭露。
定義 胺基酸 本文中，以一個或三個字母的代碼或兩者來描述胺基酸，例如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I或Val/V。
胺基酸改變 對於抗原結合分子的胺基酸序列中的胺基酸改變(在此說明書中亦稱為「胺基酸取代」)，可適當地使用已知的方法，例如定點突變法(Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))和重疊延伸PCR (overlap extension PCR)。再者，幾種已知的方法亦可用作為取代成非天然胺基酸的胺基酸改變法(Annu Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; and Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A .(2003) 100 (11), 6353-6357)。例如，適合使用無細胞轉譯系統(Clover Direct(Protein Express))，其含有具有與終止密碼之一UAG密碼子(琥珀密碼子)的互補琥珀抑制tRNA結合的非天然胺基酸的tRNA。
在本說明書中，當描述胺基酸改變的位點時，術語「和/或(and/or)」的含義包含「和」跟「或」適當結合的每種組合。具體而言，例如「第33、55和/或96位的胺基酸被取代」包含以下胺基酸改變的變化：(a)第33位、(b)第55位、(c)第96位、(d)第33和55位、(e)第33和96位、(f)第55和96位，及(g)第33、55和96位。
再者，在本文中，作為顯示胺基酸改變的表述，可適當地使用在指示特定位置的數字之前和之後分別顯示改變之前和之後的一個或三個字母的胺基酸代碼的表述。例如，當取代抗體可變區中含有的胺基酸時，所使用的改變N100bL或Asn100bLeu表示用Leu取代第100b位(根據Kabat編號)的Asn。即，此數字表示根據Kabat編號的胺基酸位置，在此數字之前寫入的一個或三個字母的胺基酸代碼表示取代前的胺基酸，且此數字之後寫入的一個或三個字母的胺基酸代碼顯示取代後的胺基酸。類似地，當取代抗體恆定區中含有的Fc區的胺基酸時，所使用的改變P238D或Pro238Asp表示用Asp取代第238位(根據EU編號)的Pro。即，此數字表示根據EU編號的胺基酸位置，在此數字之前寫入的一個或三個字母的胺基酸代碼表示取代前的胺基酸，且此數字之後寫入的一個或三個字母的胺基酸代碼顯示取代後的胺基酸。
抗原結合分子 如本文所使用地，術語「抗原結合分子」是指包含抗原結合位的任何分子或對抗原具有結合活性的任何分子，且更可指例如長度為約五個胺基酸或更多的胜肽或蛋白質的分子。胜肽和蛋白質不限於衍生自生物的胜肽和蛋白質，例如，它們可為由人工設計的序列產生的多肽。它們亦可為天然存在的多肽、合成多肽、重組多肽等中的任何一種。支架分子也是本文所述的抗原結合分子的一實施例，其包含已知穩定構型結構例如作為支架的α/β桶，且其中部分分子被製作於抗原結合位中。
密連蛋白6(Claudin-6，CLDN6)和其他密連蛋白家族蛋白 除非另有說明，否則本文所使用的術語「 CLDN6」是指來自任何脊椎動物來源的任何天然密連蛋白6，脊椎動物包含哺乳動物例如靈長類(例如人類)和囓齒類(例如小鼠和大鼠)。人類CLDN6(hCLDN6)的胺基酸序列如序列辨識號：125或126中所示，小鼠CLDN6(mCLDN6)的胺基酸序列如序列辨識號：130中所示。
除了CLDN6之外，密連蛋白家族中還有許多其他蛋白質，例如CLDN3、CLDN4和CLDN9。人類CLDN3(hCLDN3)、人類CLDN4(hCLDN4)和人類CLDN9(hCLDN9)的胺基酸序列分別如序列辨識號：128、129和127中所示。小鼠CLDN3(mCLDN3)、小鼠CLDN4(mCLDN4)和小鼠CLDN9(mCLDN9)的胺基酸序列分別如序列辨識號：132、133和131中所示。
對CLDN6的結合活性 本文所述之對CLDN6的結合活性是指對本文所述的CLDN6蛋白或CLDN6蛋白的全部或部分胜肽的一部分的特異性結合活性。
在某些實施例中，對CLDN6的結合活性是對CLDN6的第一胞外域(序別辨識號：125或126的胺基酸29-81)或對CLDN6的第二胞外域(序別辨識號：125或126的胺基酸138-159)的結合活性。在某些實施例中，對CLDN6的結合活性是對在真核細胞表面上表現之人類CLDN6的結合活性。在某些實施例中，對CLDN6的結合活性是對在癌細胞表面表現之CLDN6蛋白的結合活性。
對T細胞受體複合物的結合活性 如本文所使用地，對T細胞受體複合物的結合活性是指對T細胞受體複合物的全部或部分胜肽的一部分的結合活性。T細胞受體複合物可為T細胞受體本身，也可為與T細胞受體一起構成T細胞受體複合物的轉接分子(adaptor molecule)。CD3適合作為轉接分子。
如本文所使用地，對T細胞受體的結合活性是指對T細胞受體的全部或部分胜肽的一部分的結合活性。T細胞受體的一部分可為T細胞受體的可變區或T細胞受體的恆定區；然而，存在於恆定區中的抗原決定基是較佳的。恆定區序列的範例包含參考序列(RefSeq)登錄號CAA26636.1(序列辨識號：135)的T細胞受體α鏈、參考序列登錄號C25777(序列辨識號：136)的T細胞受體β鏈、參考序列登錄號A26659(序列辨識號：137)的T細胞受體γ1鏈、參考序列登錄號AAB63312.1(序列辨識號：138)的T細胞受體γ2鏈和參考序列登錄號AAA61033.1(序列辨識號：139)的T細胞受體δ鏈。
如本文所使用地，對CD3的結合活性是指對CD3的全部或部分胜肽的一部分的結合活性。CD3的一部分可為存在於構成人類CD3的γ鏈、δ鏈或ε鏈序列中的任何抗原決定基。關於構成CD3的γ鏈、δ鏈或ε鏈的結構，其多核苷酸序列揭露於參考序列登錄號NM_000073.2、NM_000732.4和NM_000733.3中，且其多肽序列顯示於序列辨識號：140(NP_000064.1)、141(NP_000723.1)和142(NP_000724.1)中，其中參考序列登錄號在括號中顯示。
親和力(affinity) 「親和力」是指分子(例如抗原結合分子或抗體)與其結合同伴(binding partner)(例如抗原)的單一結合位之間非共價交互作用的總和強度。除非另有說明，否則如本文所使用的「結合親和力」是指反映結合對的成員(例如抗原結合分子和抗原、或抗體和抗原)之間的1：1交互作用的固有結合親和力。分子X對其同伴Y的親和力通常可用解離常數(Kd)表示。可藉由本發明所屬領域中已知的普通方法來測量親和力，包含本文所述的方法。以下描述測量結合親和力的具體的說明性和示例性實施例。
確定親合力的方法 在某些實施例中，本文提供的抗原結合分子或抗體對其抗原的解離常數(Kd)為1 μM或更小、120 nM或更小、100 nM或更小、80 nM或更小、70 nM或更小、50 nM或更小、40 nM或更小、30 nM或更小、20 nM或更小、10 nM或更小、2 nM或更小、1 nM或更小、0.1 nM或更小、0.01 nM或更小、或0.001 nM或更小(例如10-8 M或更小、10-8 M至10-13 M、10-9 M至10-13 M)。在某些實施例中，CLDN6的抗體/抗原結合分子的Kd值落在1-40、1-50、1-70、1-80、30-50、30-70、30-80，40-70、40-80或60-80 nM的範圍內。
在一實施例中，藉由放射性標記的抗原結合測定法(radiolabeled antigen-binding assay，RIA)來測量Kd。在一實施例中，用感興趣的抗體的Fab形式及其抗原來執行RIA。例如，藉由在未標記之抗原的滴定系列的存在下，用最低濃度的(125 I)標記之抗原來與Fab平衡，然後用抗Fab抗體塗佈的盤子來捕捉結合的抗原，以測量Fab對抗原的溶液結合親和力(參見如， Chen et al.,J. Mol. Biol. 293:865-881(1999))。為了建立測定條件，將用配在50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5 μg/ml的捕捉用抗Fab抗體(Cappel Labs)塗佈MICROTITER(註冊商標)多孔盤(Thermo Scientific)隔夜，然後在室溫下(約23度C)用配在PBS中的2%(w/v)牛血清蛋白阻斷2至5小時。在非吸附盤(Nunc＃269620)中，將100 pM或26 pM[125 I]抗原與感興趣的Fab的序列稀釋液混合(例如，與Presta et al.,Cancer Res. 57:4593-4599(1997)中之抗VEGF抗體Fab-12的評估結果(assessment)一致)。然後將感興趣的Fab培養過夜。然而，培養可持續更長的時間(例如約65小時)以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉盤，以在室溫下培養(例如一小時)。然後去除溶液，且用配在PBS中的0.1%聚山梨醇酯20(polysorbate 20)(TWEEN-20(註冊商標))洗滌盤子八次。當盤子乾燥後，添加150 μl/孔的閃爍劑(scintillant)(MICROSCINT-20TM ; Packard)，且在TOPCOUNTTM 伽瑪計數器(Packard)上將盤子計數十分鐘。選擇每個Fab得出小於或等於最大結合的20%的濃度，來用於競爭性結合測定。
根據另一實施例，使用BIACORE(註冊商標)表面電漿共振測定法，來測量Kd。例如，在25度C下，用經固定的抗原CM5晶片，以約10個反應單位( response unit，RU)來執行使用BIACORE(註冊商標)-2000或BIACORE(註冊商標)-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)的測定。在一實施例中，根據供應商的說明書，用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(N -ethyl-N’ -(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(N -hydroxysuccinimide，NHS)，來活化羧甲基化聚的葡萄醣(carboxymethylated dextran)生物感測器晶片(CM5, BIACORE, Inc.)。在以5 μl/min的流速注射之前，用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 μg/ml(約0.2 μM)，以達到約10個反應單位(RU)的耦合蛋白(coupled protein)。注射抗原後，注射1 M乙醇胺(ethanolamine)以阻斷未反應的基團。為了進行動力學測量，在25度C下以約25 μl/min的流速注入配在含有0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM )表面活性劑的PBS中(PBST)之Fab的兩倍序列稀釋液(0.78 nM至500 nM)。藉由同時擬合結合(association)和解離(dissociation)感測圖(sensorgram)，使用簡單的一對一朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)(BIACORE(註冊商標)評估軟體3.2版)，來計算結合速率(kon )和解離速率(koff )。平衡解離常數(equilibrium dissociation constant)(Kd)計算為比值koff /kon 。請參見例如，Chen et al.,J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)。如果藉由上述的表面電漿共振測定法測得的結合速率超過106 M-1 s-1 ，則可在如分光計(spectrometer)中所測量之抗原的濃度增加的情形下，於25度C下透過螢光猝滅技術測量配在pH 7.2PBS的20 nm抗抗原抗體(Fab形式)的螢光散發強度的增加或減少，來確定結合速率(激發= 295 nm；散發=340 nm，16 nm帶通)，分光計如配有停止-流動(stop-flow)的分光光度計(spectrophotometer)(Aviv Instruments)或帶攪拌比色管的8000系列SLM-AMINCOTM 分光光度計(ThermoSpectronic)。
根據上述測量抗原結合分子或抗體的親和力的方法，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可進行其他抗原結合分子或抗體對各種抗原的親和力測量。
抗體 以最廣義地方式使用本文中的術語「抗體」，且涵蓋各種抗體結構，包含但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現出所欲的抗原結合活性。
抗體的類別 抗體的「類別」是指其重鏈所擁有的恆定域或恆定區的類型。抗體有五個主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可進一步分為子類別(同型(isotype))，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應至不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。
除非另有說明，否則輕鏈恆定區中的胺基酸殘基在此根據Kabat等人來編號，而重鏈恆定區中的胺基酸殘基的編號是根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。
框架(framework) 「框架」或「FR」是指高度可變區(hypervariable region，HVR)殘基之外的可變域殘基。可變域的FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常依以下順序出現於VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
人類共有框架(Human consensus framework) 「人類共有框架」是代表在選擇的人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中，最常存在的胺基酸殘基的框架。通常，選擇的人類免疫球蛋白VL或VH序列是來自可變域序列的子群(subgroup)。通常，序列的子群是如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest , Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD(1991), vols. 1-3中的子群。在一實施例中，對於VL，子群是如上文Kaba等人中的子群κI。在一實施例中，對於VH，子群是如上文Kabat等人中的子群III。
HVR 如本文所使用地，術語「高度可變區(hypervariable region)」或「 HVR」是指抗體可變域中，序列高度可變(「互補決定區(complementarity determining regions)」或「CDRs」)和/或形成結構上定義的環(「高度可變環」)和/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸」)的每個區域。通常，抗體包含六個HVR：VH中三個(H1、H2、H3)和VL中三個(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包含： (a)出現在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)的高度可變環(Chothia and Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))； (b)出現在胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)的CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))； (c)出現在胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)的抗原接觸(MacCallum et al.J. Mol. Biol. 262: 732-745(1996))；及 (d)(a)、(b)和/或(c)的組合，包含HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有說明，否則可變域中的HVR殘基和其他殘基(例如FR殘基)在本文中是根據上述之Kabat等人來編號。
HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3亦分別被稱為「H-CDR1」、「H-CDR2」、「H-CDR3」、「L-CDR1」、「 L-CDR2」和「L-CDR3」。
可變區 術語「可變區」或「可變域」是指涉及抗體結合至抗原的抗體重或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變域(分別為VH和VL)通常具有相似的結構，其中每個結構域均包含四個保守框架區(framework region，FR)和三個高度可變區(hypervariable region，HVR)。(請參見例如，Kindt et al.Kuby Immunology , 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007).)單一VH或VL域可能足以賦予抗原結合特異性。再者，可使用來自結合抗原的抗體的VH或VL域，來單離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補的VL或VH域的分子庫(library)。請參見例如，Portolano et al.,J. Immunol. 150:880-887(1993); Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991)。
嵌合抗體 術語「嵌合(chimeric)」抗體是指其中重鏈和/或輕鏈的一部分衍生自特定來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的其餘部分衍生自不同來源或物種的抗體。類似地，術語「嵌合抗體可變域」是指其中重和/或輕鏈可變區的一部分衍生自特定來源或物種，而重和/或輕鏈可變區的其餘部分來自不同的來源或物種的抗體可變區。
人源化抗體(humanized antibody) 「人源化」抗體是指包含來自非人類HVR的胺基酸殘基和來自人類FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包含至少一個且通常是兩個可變域的實質上全部，其中所有或實質上所有的HVR(例如CDR)都對應至非人類抗體的HVR，且所有或實質上所有的FR都對應至人類抗體的FR。人源化抗體可視需要地包含衍生自人類抗體的抗體恆定區的至少一部分。抗體例如非人類抗體的「人源化形式」是指已經人源化的抗體。「人源化抗體可變區」是指人源化抗體的可變區。
人類抗體 「人類抗體」是一種擁有對應至於由人類或人類細胞所產生或由利用人類抗體庫或其他人類抗體編碼序列的非人類來源所衍生的抗體的胺基酸序列的抗體。人類抗體的此定義具體地排除了包含非人類抗原結合殘基的人源化抗體。「人類抗體可變區」是指人類抗體的可變區。
多核苷酸(核酸) 如本文可互換使用地，「多核苷酸(polynucleotide)」或「核酸(nucleic acid)」是指任何長度的核苷酸的聚合物，且包含DNA和RNA。核苷酸可為去氧核醣核苷酸(deoxyribonucleotide)、核醣核苷酸(ribonucleotide)、經修飾的核苷酸或鹼基和/或其類似物、或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應，來合併至聚合物中的任何受質。多核苷酸可包含經修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其類似物。一段核苷酸序列可被非核苷酸成分打斷。多核苷酸可包含在合成後進行的修飾，例如偶聯至標記。其他類型的修飾包含，例如「帽」、用類似物取代一或更多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾例如具有不帶電的鏈結(linkage)的核苷酸間修飾(例如甲基膦酸酯(methyl phosphonate)、磷酸三酯(phosphotriester)、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、胺基甲酸酯(carbamate))和具有帶電的鏈結(linkage)的核苷酸間修飾(例如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)等)、含有懸垂部分(pendant moiety)的核苷酸間修飾例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、訊號胜肽、聚L-離胺酸等)、具有嵌合劑(intercalator)的核苷酸間修飾(例如吖啶(acridine)、補骨脂素(psoralen)等)、含有螯合劑(chelator)的核苷酸間修飾(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、含有烷基化劑(alkylator)的核苷酸間修飾、具有經修飾之鏈結的核苷酸間修飾(例如α異頭核酸(alpha anomeric nucleic acid)等)、以及未經修飾的形式多核苷酸。再者，通常存在於糖中的任何羥基可被例如膦酸酯基團(phosphonate group)、磷酸基團(phosphate group)取代，被標準保護基團保護，或被活化以準備額外的鏈結至額外的核苷酸，或可偶聯至固體或半固體支撐體(support)。5’和3’端的OH可被磷酸化或被1至20個碳原子的胺或有機帽基團部分取代。其他羥基也可被衍生化為標準保護基。多核苷酸亦可含有本發明所屬技術領域中通常已知的核醣或去氧核醣的類似形式，包含例如2’-O-甲基-(2’-O-methyl-)、2’-O-烯丙基-(2’-O-allyl-)、2’-氟-(2’-fluoro-)或2’-疊氮基-核醣(2’-azido-ribose)、碳環醣類似物(carbocyclic sugar analog)、α-異頭醣(alpha-anomeric sugar)、差向異構醣(epimeric sugar)例如阿拉伯糖(arabinose)、木糖(xylose)或來蘇糖(lyxose)、吡喃糖(pyranose sugar)、呋喃糖(furanose sugar)、景天庚酮糖(sedoheptulose)、非環類似物(acyclic analog)和鹼性核苷類似物(basic nucleoside analog)例如甲基核醣苷(methyl riboside)。一或多個磷酸二酯(phosphodiester)鏈結可被替代的連結基團取代。這些替代的連接基團包含但不限於其中磷酸鹽被P(O)S(「硫代酸酯(thioate)」)、P(S)S(「二硫代酸酯(dithioate)」)、(O)NR2 (「醯胺基(amidate)」)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(「甲縮醛(formacetal)」)取代的實施例，其中每個R或R’獨立地為H或經取代或未經取代之視需要地含有醚(-O-)鏈結、芳基(aryl)、烯基(alkenyl)、環烷基(cycloalkyl)、環烯基(cycloalkenyl)或芳烷基(araldyl)的烷基(1至20C)。並非多核苷酸中的所有連接都需要一樣。先前的描述適用於本文所指的所有多核苷酸，包含RNA和DNA。
單離(核酸) 「單離(isolated)」核酸分子是已經從其天然環境的成分中分離的核酸分子。單離核酸分子更包含通常含有此核酸分子的細胞中所含有的核酸分子，但此核酸分子存在於染色體外或在不同於其天然染色體位置的染色體位置。
載體(vector) 如本文所使用地，術語「載體」是指能夠繁殖與其連接的另一核酸的核酸分子。此術語包含作為自我複製核酸結構的載體，以及合併至已導入至宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠引導正與其連接的核酸的表現。這樣的載體在本文中稱為「表現載體(expression vector)」。可使用病毒或電穿孔法(electroporation)將載體導入至宿主細胞中。然而，載體的導入不限於體外方法。例如，也可直接使用體內方法將載體導入至對象中。
宿主細胞 術語「宿主細胞」、「宿主細胞株(host cell line)」和「宿主細胞培養物(host cell culture)」可互換使用，且是指已將外源核酸導入至其中的細胞，包含此種細胞的後代(progency)。宿主細胞包含「轉形株(transformant)」和「轉形細胞(transformed cell)」，其包含初代轉形細胞和從其衍生的後代，而與繼代次數無關。後代的核酸含量可能不與親代細胞完全相同，但可能含有突變。具有在原始轉形細胞中所篩選或選擇的相同功能或生物學活性的突變後代包含在本文中。
特異性(specificity) 「特異性的(specific)」是指特異性結合至一或多種結合同伴的分子對其同伴以外的分子沒有顯示任何顯著的結合。再者，當抗原結合位對抗原中所含有的多個抗原決定基中的的一特定抗原決定基有特異性時，也使用「特異性」。如果抗原結合分子特異性結合至抗原，則亦稱為「抗原結合分子對/針對抗原具有/顯示特異性」。當由一抗原結合位結合的一抗原決定基被多種不同的抗原所含有時，含有此抗原結合位點的抗原結合分子可結合至具有此抗原決定基的各種抗原。
抗體片段(antibody fragment) 「抗體片段」是指包含一部分的完整抗體的分子，而非完整的抗體，其中此一部分結合至完整抗體所結合的抗原。抗體片段的範例包含但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2 ；雙抗體(diabody)；線性抗體(linear antibody)；單鏈抗體分子(single-chain antibody molecule)(例如scFv)；和由抗體片段形成的多特異性抗體。
術語「全長抗體(full length antibody)」、「完整抗體(intact antibody)」和「全抗體(whole antibody)」在本文中可互換使用，是指具有與天然抗體結構實質上相似的結構或具有含有本文定義的Fc區的重鏈的抗體。
可變片段(variable fragment)(Fv) 在本文中，術語「可變片段(Fv)」是指衍生自抗體的抗原結合位的最小單位，其係由一對抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)所構成。1988年，Skerra和Pluckthun發現，藉由在細菌訊號序列的下游插入抗體基因，且在大腸桿菌(E. coli )中誘導此基因的表現，可從大腸桿菌周質(periplasm)部分來製備均質且活性的抗體(Science(1988)240(4855), 1038-1041)。從周質部分製備的Fv中，VH以為了結合至抗原的方式與VL連接。
scFv、單鏈抗體(single-chain antibody)及sc(Fv)2 在本文中，術語「scFv」、「單鏈抗體」和「sc(Fv)2 」均是指含有衍生自重和輕鏈的可變區而不是恆定區的單一多肽鏈的抗體片段。通常，單鏈抗體亦含有VH和VL之間的多肽連接子，而得以形成被認為能造成抗原結合之所需的結構。Pluckthun在「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315(1994)」中詳細討論了單鏈抗體。亦參見國際專利公開WO 1988/001649；US專利號4,946,778和5,260,203。在特定的實施例中，單鏈抗體可為雙特異性和/或人源化。
scFv是單鏈低分子量抗體，其中形成Fv的VH和VL藉由胜肽連接子連接在一起(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988)85(16), 5879-5883)。可藉由胜肽連接子使VH和VL保持很近的距離。
sc(Fv)2 是單鏈抗體，其中兩個VL和兩個VH的四個可變區藉由連接子例如胜肽連接子連接，以形成單鏈(J Immunol. Methods(1999)231(1-2), 177-189)。兩個VH和兩個VL可衍生自不同的單株抗體。此類sc(Fv)2 較佳地包含例如辨識存在於單一抗原中的兩個抗原決定基的雙特異性sc(Fv)2 ，如Journal of Immunology (1994)152(11), 5368-5374中所揭露。可藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法，來產生sc(Fv)2 。例如，可藉由如胜肽連接子的連接子，來連接scFv以產生sc(Fv)2 。
在本文中，sc(Fv)2 包含兩個VH單元和兩個VL單元，其以VH、VL、VH和VL([VH]-連接子-[VL]-連接子-[VH]-連接子-[VL])的順序，從單鏈多肽的N端開始排列。兩個VH單元和兩個VL單元的順序不限於上述形式，且它們可以任何順序排列。以下列出了形式的範例。 [VL]-連接子-[VH]-連接子-[VH]-連接子-[VL] [VH]-連接子-[VL]-連接子-[VL]-連接子-[VH] [VH]-連接子-[VH]-連接子-[VL]-連接子-[VL] [VL]-連接子-[VL]-連接子-[VH]-連接子-[VH] [VL]-連接子-[VH]-連接子-[VL]-連接子-[VH]
亦在WO 2006/132352中詳細描述了sc(Fv)2 的分子形式。根據這些描述，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可適當地製備所欲的sc(Fv)2 ，以產生本文揭露的多肽複合物。
再者，本揭露的抗原結合分子或抗體可與例如PEG的載體聚合物或例如抗癌劑的有機化合物偶聯。或者，醣鏈添加序列較佳地插入至抗原結合分子或抗體中，使糖鏈產生所欲的效果。
用於連接抗體的可變區的連接子包含可藉由基因工程、合成連接子和例如在Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996中揭露的連接子，來導入的任意胜肽連接子。然而，在本揭露中，胜肽連接子是優選的。胜肽連接子的長度沒有特別限制，且可根據目的，由本發明所屬技術領域中具有通常知識者適當地選擇。長度較佳為五個胺基酸或更多(沒有特別限制，上限通常為30個胺基酸或更少，較佳為20個胺基酸或更少)，且更佳為15個胺基酸。當sc(Fv)2 含有三個胜肽連接子時，它們的長度可全部相同或不同。
例如，此類胜肽連接子包含： Ser Gly-Ser Gly-Gly-Ser Ser-Gly-Gly Gly-Gly-Gly-Ser(序列辨識號：147) Ser-Gly-Gly-Gly(序列辨識號：148) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列辨識號：149) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列辨識號：150) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列辨識號：151) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列辨識號：152) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列辨識號：153) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列辨識號：154) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列辨識號：149))n (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列辨識號：150))n 其中n是1或更大的整數。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可根據目的相應地選擇胜肽連接子的長度或序列。
合成連接子(化學交聯劑)常規地用於將胜肽交聯，且範例包含： N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxy succinimide，NHS)、 辛二酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl suberate，DSS)、 辛二酸雙(磺基琥珀醯亞胺基)酯(bis(sulfosuccinimidyl)suberate，BS3)、 二硫代雙(丙酸琥珀醯亞胺酯)(dithiobis(succinimidyl propionate，DSP)、 二硫代雙(丙酸磺基琥珀醯亞胺酯)(dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate，DTSSP)、 乙二醇雙(琥珀醯亞胺琥珀醯亞胺酯)(ethylene glycol bis(succinimidyl succinate，EGS)、 乙二醇雙(磺基琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate，sulfo-EGS)、 酒石酸二琥珀醯亞胺酯(DST)(disuccinimidyl tartrate(DST))、酒石酸二磺基琥珀醯亞胺酯(disulfosuccinimidyl tartrate，sulfo-DST)、 雙[2-(琥珀醯亞胺氧羰基氧基)乙基]碸(bis[2-(succinimidoxycarbonyloxy)ethyl]sulfone，BSOCOES)，和 雙[2-(磺基琥珀醯亞胺氧羰基氧基)乙基]碸(bis[2-(sulfosuccinimidoxycarbonyloxy)ethyl]sulfone，sulfo-BSOCOES)。這些交聯劑為市售的。
通常，需要三個連接子，來將四個抗體可變區連接在一起。要使用的連接子可為相同類型或不同類型。
Fab、F(ab’)2 和Fab’ 「 Fab」由單一輕鏈、和CH1域及來自單一重鏈的可變區所組成。Fab分子的重鏈無法與另一重鏈分子形成雙硫鍵(disulfide bond)。
「 F(ab’)2 」或「Fab」是藉由用例如胃蛋白酶(pepsin)和木瓜蛋白酶(papain)的蛋白酶，來處理免疫球蛋白(單株抗體)而產生的，且是指藉由消化存在於兩個H鏈中的每一者的鉸鏈區(hinge region)之間的雙硫鍵附近的免疫球蛋白(單株抗體)，而產生的抗體片段。例如，木瓜蛋白酶於存在於兩個H鏈中的每一者的鉸鏈區之間的雙硫鍵的上游處切割IgG，以產生兩個同源抗體片段，其中L鏈包含VL(L鏈可變區)且CL(L鏈恆定區)藉由在它們C端區的雙硫鍵與包含VH(H鏈可變區)和CHγ1(H鏈恆定區中的γ1區)的H鏈片段連結。這兩個同源抗體片段中的每一個都稱為Fab’。
「F(ab’)2 」由兩條輕鏈和兩條重鏈所組成，其中重鏈包含CH1域的恆定區和CH2域的一部分，如此一來在兩條重鏈之間形成雙硫鍵。可較佳地如下所述地來生產本文揭露的F(ab’)2 。用蛋白酶(例如胃蛋白酶)來部分地消化全單株抗體或包含所欲的抗原結合位的全單株抗體；且藉由吸附到Protein A管柱上，來去除Fc片段。蛋白酶沒有特別限制，只要它可在適當的設定酵素反應條件例如pH下，以選擇性方式切割全抗體，來產生F(ab’)2 即可。此類蛋白酶包含例如胃蛋白酶和無花果蛋白酶(ficin)。
Fc區(Fc region) 本文中的術語「 Fc區」或「 Fc域(Fc domain)」用於定義免疫球蛋白重鏈之含有恆定區的至少一部分的C端區。此術語包含天然序列Fc區和變異Fc區。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區從Cys226或Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，可存在或不存在Fc區的C端離胺酸(Lys447)或甘胺酸-離胺酸(殘基446-447)。除非本文另有說明，否則Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號是根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。
Fc受體(Fc receptor) 術語「Fc受體」或「 FcR」是指結合至抗體的Fc區的受體。在一些實施例中，FcR是天然人類FcR。在一些實施例中，FcR是結合IgG抗體(γ受體)的FcR且包含FcγRI、FcγRII和FcγRIII子類別的受體，其包含那些受體的等位基因變異體和選擇式剪接的形式。FcγRII受體包含FcγRIIA(「活化受體(activating receptor)」)和FcγRIIB(「抑制受體(inhibiting receptor)」)，其具有相似胺基酸序列，主要差異在於其細胞質域的。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸的活化模體(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸的抑制模體(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)。(請參見例如，Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997))。在例如Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991); Capelet al., Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haaset al., J. Lab. Clin. Med . 126:330-41(1995)中回顧了FcR。其他FcR，包含將來被鑑定出來的FcR，均被本文中的術語「 FcR」所涵蓋。
術語「 Fc受體」或「FcR」亦包含新生兒受體(neonatal receptor)FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer et al., J. Immunol. 117:587(1976)and Kim et al., J. Immunol. 24:249(1994))和免疫球蛋白恆定的調控。與FcRn結合的測量方法是已知的(請參見例如Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640(1997)；Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton et al.))。
可在例如表現人類FcRn的轉基因小鼠或經轉染的人類細胞株中，或在投予具有變異Fc區多肽的靈長類中，測定人類FcRn高親和力結合多肽對人類FcRn的體內結合和血漿半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述了與FcR結合增加或減少的抗體變異體。亦請參見例如，Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604(2001)。
Fcγ受體 Fcγ受體是指能夠結合至單株IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體的Fc域的受體，且包含所有屬於實質上由Fcγ受體基因所編碼的蛋白質家族的成員。在人類中，此家族包含FcγRI(CD64)，其包含同型異構物(isoform)FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，其包含同型異構物FcγRIIa(包含同種異型(allotype)H131和R131)、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；及FcγRIII(CD16)，其包含同型異構物FcγRIIIa(其包含同種異型V158和F158)和FcγRIIIb(其包含同種異型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)；以及所有未被鑑定出的人類Fcγ受體、Fcγ受體同型異構物及其同種異型。然而，Fcγ受體不限於這些範例。不限於此，Fcγ受體包含衍生自人類、小鼠、大鼠、兔和猴的Fcγ受體。Fcγ受體可衍生自任何生物體。小鼠Fcγ受體包含但不限於FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及所有未被鑑定出的小鼠Fcγ受體、Fcγ受體同型異構物及其同種異型。此類較佳Fcγ受體包含例如人類FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16)和/或FcγRIIIB(CD16)。FcγRI的多核苷酸序列和胺基酸序列分別顯示於參考序列登錄號NM_000566.3和參考序列登錄號NP_000557.1中； FcγRIIA的多核苷酸序列和胺基酸序列分別顯示於參考序列登錄號BC020823.1和參考序列登錄號AAH20823.1中；FcγRIIB的多核苷酸序列和胺基酸序列分別顯示於參考序列登錄號BC146678.1和參考序列登錄號AAI46679.1中；FcγRIIIA的多核苷酸序列和胺基酸序列分別顯示於參考序列登錄號BC033678.1和參考序列登錄號AAH33678.1中；FcγRIIIB的多核苷酸序列和胺基酸序列分別顯示於參考序列登錄號BC128562.1和參考序列登錄號AAI28563.1中。可藉由放大的發光鄰近均相測定(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay，ALPHA)篩選、基於表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)的BIACORE方法和除了上述的FACS和ELISA形式外的其它方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2006)103(11), 4005-4010)，來評估Fcγ受體對單株IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體的Fc域的是否具有結合活性。
同時，「 Fc配體(Fc ligand)」或「效應子配體(effector ligand)」是指結合至抗體Fc域而形成Fc/Fc配體複合物的分子，較佳為多肽。此分子可衍生自任何生物體。Fc配體與Fc的結合較佳地誘導一或多種效應子功能。此類的Fc配體包含但不限於Fc受體、Fcγ受體、Fcα受體、Fcβ受體、FcRn、C1q和C3、甘露聚醣-結合凝集素(mannan-binding lectin)、甘露糖(mannose)受體、葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus Protein A)、葡萄球菌蛋白G(Staphylococcus Protein G)和病毒Fcγ受體。Fc配體亦包含Fc受體同源物(Fc receptor homolog，FcRH)(Davis et al.,(2002)Immunological Reviews 190, 123-136)，其為與Fcγ受體同源的Fc受體家族。Fc配體亦包含未被鑑定出之結合至Fc的分子。
Fcγ受體結合活性 可藉由使用上述FACS和ELISA形式、以及ALPHA(放大的發光鄰近均相測定)的篩選和基於表面電漿共振(SPR)的BIACORE方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2006)103(11), 4005-4010)，來評估Fc域與任何Fcγ受體FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB減損的結合活性。
基於以下原理，藉由ALPHA技術使用兩種類型的珠子：供給體珠和接受體珠，來執行ALPHA篩選。只有當連接至供給體珠的分子與連接至接受體珠的分子進行生物交互作用，且當兩個珠子緊鄰時，才檢測到發光訊號。供給體珠中的感光劑被雷射光束激發，將珠子周圍的氧轉化成激發的單態氧(singlet oxygen)。當單態氧在供給體珠周圍擴散且到達緊鄰的接受體珠時，誘導接受體珠內的化學發光(chemiluminescent)反應。此反應最終導致發光。如果連接至供給體珠的分子不與連接至接受體珠的分子發生交互作用，則供給體珠產生的單態氧不會到達接受體珠，且不會發生化學發光反應。
例如，將生物素(biotin)標記的抗原結合分子或抗體固定至供給體珠，且將麩胱甘胺S-轉移酶(glutathione S-transferase，GST)標記的Fcγ受體固定至接受體珠。在包含競爭性突變Fc域的抗原結合分子或抗體不存在下，Fcγ受體與包含野生型Fc域的抗原結合分子或抗體發生交互作用，並誘導520至620 nm的訊號。具有未標記的突變Fc域的抗原結合分子或抗體與包含野生型Fc域的抗原結合分子或抗體競爭與Fcγ受體的交互作用。可藉由定量競爭引起的螢光減少，來確定相對結合親和力。使用磺基-NHS-生物素等將抗原結合分子或抗體例如抗體生物素化的方法是已知的。用於將GST標記添加至Fcγ受體的合適方法包含涉及將編碼Fcγ受體的多肽和框內的GST融合，使用導入了帶有此基因的載體的細胞來表現融合基因，然後使用麩胱甘胺管柱來純化的方法。舉例而言，較佳地可藉由使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad; San Diego)的軟體，基於非線性回歸分析，來擬合一位點競爭模型(one-site competition model)，以分析所誘導的訊號。
用於觀察其交互作用的物質之一作為配體固定至感測器晶片的金薄層上。當光照在感測器晶片的背面上，而在金薄層和玻璃之間的界面處發生全反射時，反射光的強度在某個位點會部分降低(SPR訊號)。用於觀察其交互作用的另一物質作為分析物注入至感測器晶片的表面上。當分析物結合至配體時，經固定的配體分子的質量增加。這改變了感測器晶片表面上溶劑的折射率。折射率的變化會引起SPR訊號的位置偏移(相反地，解離會使訊號偏移回到原始位置)。在Biacore系統中，上述偏移量(即，感測器晶片表面上的質量變化)繪製於縱軸上，因此質量隨時間的變化顯示為測量數據(感測圖)。由感測圖的曲線來確定動力學參數(結合速率常數(ka)和解離速率常數(kd))，且由這兩個常數之間的比值來確定親和力(KD)。較佳地在BIACORE方法中使用抑制測定法。在Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2006)103(11), 4005-4010中描述了此類抑制測定法的範例。
具有降低的Fcγ受體結合活性的Fc區 在本文中，「降低的Fcγ受體結合活性」是指，例如基於上述分析方法，測試的抗原結合分子或抗體的競爭活性為對照抗原結合分子或抗體的競爭活性的50%或更低、較佳為45%或更低、40%或更低、35%或更低、30%或更低、20%或更低、或15％以下，且特別較佳為10%或更低、9%或更低、8%或更低、7%或更低、6%或更低、5%或更低、4%或更低、3%或更低、2%或更低、或1%或更低。
包含單株IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體的Fc域的抗原結合分子或抗體可適當地作為對照抗原結合分子或抗體。Fc域結構顯示於序列辨識號：143(A添加至參考序列登錄號AAC82527.1的N端)、144(A添加至參考序列登錄號AAB59393.1的N端)、145(A添加至參考序列登錄號CAA27268.1的N端)、及146(A添加至參考序列登錄號AAB59394.1的N端)。再者，當將包含特定同型抗體的Fc域突變株的抗原結合分子或抗體作為測試物質時，可使用包含相同的同型的Fc域的抗原結合分子或抗體作為對照，來評估突變株的突變對Fcγ受體結合活性的影響。如上所述，適當地製備了包含其Fcγ受體結合活性被評斷為降低的Fc域突變株的抗原結合分子或抗體。
此類已知突變株包含例如具有胺基酸231A-238S(EU編號)的缺失的突變株(WO 2009/011941)、以及突變株C226S、C229S、P238S、(C220S)(J. Rheumatol(2007)34, 11)；C226S和C229S(Hum. Antibod. Hybridomas(1990)1(1), 47-54)；C226S、C229S、E233P、L234V和L235A(Blood(2007)109, 1185-1192)。
具體而言，較佳的抗原結合分子或抗體包括包含在形成特定同型抗體的Fc域的胺基酸中，具有至少一個胺基酸的突變(例如取代)係選自以下胺基酸位置的Fc域的抗原結合分子或抗體：220、226、229、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、264、265、266、267、269、270、295、296、297、298、299、300、325、327、328、329、330、331或332(EU編號)。Fc域所源自的抗體的同型沒有特別限制，且可能使用衍生自單株IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體的適當Fc域。使用衍生自IgG1抗體的Fc域是較佳的。
較佳的抗原結合分子或抗體包括例如包含具有以下所示之任一取代的Fc域的抗原結合分子或抗體，其位置係根據在形成IgG1抗體的Fc域的胺基酸中的EU編號來指明(每個數字代表EU編號中胺基酸殘基的位置；且數字之前的一個字母的胺基酸符號代表取代前的胺基酸殘基，而數字之後的一個字母的胺基酸符號代表取代後的胺基酸殘基)： (a)L234F、L235E、P331S； (b)C226S、C229S、P238S； (c)C226S、C229S；或 (d)C226S、C229S、E233P、L234V、L235A； 以及含有在第231至238位有胺基酸序列缺失的Fc域的抗原結合分子或抗體。
再者，較佳的抗原結合分子或抗體亦包括包含具有以下所示之任一取代的Fc域的抗原結合分子或抗體，其位置係根據在形成IgG2抗體的Fc域的胺基酸中的EU編號來指明： (e)H268Q、V309L、A330S和P331S； (f)V234A； (g)G237A； (h)V234A和G237A； (i)A235E和G237A；或 (j)V234A、A235E和G237A。每個數字代表EU編號中胺基酸殘基的位置；且數字之前的一個字母的胺基酸符號代表取代前的胺基酸殘基，而數字之後的一個字母的胺基酸符號代表取代後的胺基酸殘基。
再者，較佳的抗原結合分子或抗體亦包括包含具有以下所示之任一取代的Fc域的抗原結合分子或抗體，其位置係根據在形成IgG3抗體的Fc域的胺基酸中的EU編號來指明： (k)F241A； (l)D265A；或 (m)V264A。每個數字代表EU編號中胺基酸殘基的位置；且數字之前的一個字母的胺基酸符號代表取代前的胺基酸殘基，而數字之後的一個字母的胺基酸符號代表取代後的胺基酸殘基。
再者，較佳的抗原結合分子或抗體亦包括包含具有以下所示之任一取代的Fc域的抗原結合分子或抗體，其位置係根據在形成IgG4抗體的Fc域的胺基酸中的EU編號來指明： (n)L235A、G237A和E318A； (o)L235E；或 (p)F234A和L235A。每個數字代表EU編號中胺基酸殘基的位置；且數字之前的一個字母的胺基酸符號代表取代前的胺基酸殘基，而數字之後的一個字母的胺基酸符號代表取代後的胺基酸殘基。
其他較佳的抗原結合分子或抗體包括例如包含Fc域的抗原結合分子或抗體，其中在形成IgG1抗體的Fc域的胺基酸中，第233、234、235、236、237、327、330或331位(EU編號)的任何胺基酸用對應的IgG2或IgG4中對應EU編號位置的胺基酸來取代。
其他較佳的抗原結合分子或抗體亦包括例如包含Fc域的抗原結合分子或抗體，其中在形成IgG1抗體的Fc域的胺基酸中，第234、235與297位(EU編號)的任一或多個胺基酸用其它胺基酸來取代。取代後的胺基酸的類型沒有特別限制；然而，包含其中第234、235和297位的任一或多個胺基酸用丙胺酸(alanine)取代的Fc域的抗原結合分子或抗體是特別較佳的。
其他較佳的抗原結合分子或抗體亦包括例如包含Fc域的抗原結合分子或抗體，其中在形成IgG1抗體的Fc域的胺基酸中，第265位(EU編號)的胺基酸用另一胺基酸來取代。取代後的胺基酸的類型沒有特別限制；然而，包含其中第265位的胺基酸用丙胺酸取代的Fc域的抗原結合分子或抗體是特別較佳的。
抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 「抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺性」或「ADCC」是指細胞毒殺性的一種形式，其中結合至存在於某些細胞毒殺細胞(例如NK細胞、嗜中性球和巨噬細胞)上的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使這些細胞毒殺效應細胞特異性結合至帶有抗原的目標細胞，隨後用細胞毒素殺死目標細胞。介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII和FcγRIII。於Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)的第464頁表3中總結造血細胞(hematopoietic cell)上的FcR表現。為了評估感興趣分子的ADCC活性，可執行體外ADCC測定，例如美國專利號5,500,362或5,821,337或美國專利號6,737,056(Presta)中所述的。對此類測定有用的效應細胞包含PBMC和NK細胞。或者或此外，可在體內評估感興趣分子的ADCC活性，例如，在如Clyneset al. PNAS (USA) 95:652-656(1998)中所揭露的動物模型中評估，。
補體依賴性細胞毒殺性(complement dependent cytotoxicity) 「補體依賴性細胞毒殺性」或「CDC」是指在補體的存在下目標細胞的裂解。典型的補體路徑的活化是藉由補體系統(C1q)的第一成分結合至(適當的子類別)抗體而引發的，此抗體與其同源抗原結合。為了評估補體的活化，可執行CDC測定，例如，如Gazzano-Santoroet al .,J. Immunol. Methods 202:163(1996)中所述。例如在美國專利號6,194,551 B1和WO 1999/51642中，描述了具有改變的Fc區胺基酸序列的多肽變異株(具有變異的Fc區的多肽)和增加或降低的C1q結合能力。亦請參見，例如Idusogieet al. J. Immunol. 164: 4178-4184(2000)。
T細胞依賴性細胞毒殺性(T cell dependent cellular cytotoxicity) 「T細胞依賴性細胞毒殺性」或「TDCC」是指細胞毒性的一種形式，其中抗原結合分子既結合至目標細胞上表現的抗原，又與T細胞上表現的另一抗原結合，從而將T細胞重定向至目標細胞附近，同時對目標細胞的細胞毒殺性由T細胞誘導。在此描述的「T細胞依賴性細胞毒殺性的測定」部分中也描述了T細胞依賴性細胞毒殺性的評估方法，其為體外TDCC測定法。
等電點(isoelectric point，pI) 除非另有說明且除非上下文中有不一致，否則應理解的是等電點(pI)可為理論上或實驗上確定的等電點，且也稱為「pI」。pI值可經實驗來確定，例如藉由等電聚焦電泳(isoelectric focusing electrophoresis)。同時，可使用基因和胺基酸序列分析軟體(Genetyx等)，來計算理論pI值。
癌症(Cancer) 術語「癌症」和「癌性(cancerous)」是指或描述哺乳類中通常以失控的細胞生長/增殖為特徵的生理狀況。癌症的範例包含但不限於惡性腫瘤(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)(例如霍奇金(Hodgkin’s)淋巴瘤和非霍奇金(non-Hodgkin’s)淋巴瘤)、肧細胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)和白血病(leukemia)。此類癌症的更特定範例包含鱗狀細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌(small-cell lung cancer)、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、肺腺癌(adenocarcinoma of the lung)、肺鱗狀細胞癌(squamous carcinoma of the lung)、腹膜癌(cancer of the peritoneum)、肝細胞癌(hepatocellular cancer)、胃腸癌(gastrointestinal cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、神經膠質瘤(glioma)、子宮頸癌(cervical cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、肝癌(liver cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、肝腫瘤(hepatoma)、乳癌(breast cancer)、大腸癌(colon cancer)、大腸直腸癌(colorectal cancer)、子宮內膜(endometrial)或子宮癌(uterine carcinoma)、唾液腺癌(salivary gland carcinoma)、腎癌(kidney cancer)、肝癌(liver cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、外陰癌(vulval cancer)、甲狀腺癌(thyroid cancer)、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病(leukemia)和其他淋巴增生性失調以及各種類型的頭頸癌(head and neck cancer)。
腫瘤(tumor) 術語「腫瘤」是指所有腫瘤性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性或良性，以及所有前癌和癌性細胞和組織。術語「癌症」、「癌性」、「細胞增殖性疾病」、「增殖性疾病」和「腫瘤」在本文中並不互相排斥。
卵巢癌(ovarian cancer) 「卵巢癌」是指一群衍生自卵巢的異質群組惡性腫瘤。大約90%的惡性卵巢腫瘤起源於上皮；其餘的是生殖細胞和基質腫瘤。上皮性卵巢腫瘤分為以下組織學子類型：漿液性腺癌(serous adenocarcinoma)(構成約50%的上皮性卵巢腫瘤)；子宮內膜樣腺癌(endometrioid adenocarcinoma)(~20%)；黏液性腺癌(mucinous adenocarcinoma)(~10%)；透明細胞癌(clear cell carcinoma)(~5-10%)；布倫納(Brenner)(過渡細胞(transitional cell))腫瘤(相對不常見)。卵巢癌是女性中第六常見的癌症，其預後通常較差，五年存活率為5至30%。有關卵巢癌的回顧，請參見Fox et al.(2002)“Pathology of epithelial ovarian cancer,” inOvarian Cancer ch. 9(Jacobs et al., eds., Oxford University Press, New York)； M Morin et al.(2001)“Ovarian Cancer,” inEncyclopedic Reference of Cancer , pp.654-656(Schwab, ed., Springer-Verlag, New York)。本揭露考慮了上述任何上皮性卵巢腫瘤子類型特別是漿液性腺癌子類型的診斷或治療方法。
胃癌(gastric cancer) 術語「胃癌」或「胃腫瘤(gastric tumor)」或「胃部腫瘤(stomach tumor)」或「胃部癌(stomach cancer)」是指胃部的任何腫瘤或癌症，包含例如腺癌(例如瀰漫型(diffuse type)和腸型(intestinal type))、和較少見的形式例如淋巴瘤、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)和鱗狀細胞癌。
醫藥製劑(pharmaceutical formulation) 術語「醫藥製劑」或「醫藥組合物」是指形式為使其中所含活性成分的生物活性有效，且不含有對此製劑所投予的對象有不可接受地毒性的額外成分的配劑。
醫藥上可接受的載體 (pharmaceutically acceptable carrier) 「醫藥上可接受的載體」是指醫藥製劑中除活性成分以外，對對象無毒的成分。醫藥上可接受的載體包含但不限於緩衝劑(buffer)、賦形劑(excipient)、穩定劑(stabilizer)或防腐劑。
治療(treatment) 如本文所使用地，「治療」(及其文法變化例如「治療(treat)」或「治療(treating)」)是指試圖改變被治療個體的自然病程的臨床干預，且可為了預防而進行或在臨床病理過程中執行。理想的治療效果包含但不限於，預防疾病的發生或復發、症狀的緩和(alleviation)、疾病的任何直接或間接病理後果的減少(diminishment)、預防轉移、降低疾病進展的速度、疾病狀態的緩解(amelioration)或減輕(palliation)、和趨緩(remission)或預後(prognosis)改善。在一些實施例中，本揭露的抗原結合分子或抗體用於延遲疾病的發展或減慢疾病的進展。
藥品說明書(package insert) 術語「藥品說明書」用於指通常包含於治療產品的商業包裝中的指示，其含有關於使用此類治療產品的適應症(indication)、用法、劑量、投予、結合治療、禁忌症(contraindication)和/或警告的資訊。
本揭露的抗體(antibody of the disclosure) 在一面向中，本揭露提供單離抗體，其包含：第一重鏈可變區，其包含分別為序列辨識號：113、117及118的HVR-H1、HVR、H2及HVR-H3胺基酸序列；第一輕鏈可變區，其包含分別為序列辨識號：119、120及121的HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3胺基酸序列；第二重鏈可變區，其包含分別為序列辨識號：122、123及124的HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3胺基酸序列；以及第二輕鏈可變區，其包含分別為序列辨識號：114、115及116的HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3胺基酸序列、。
在一面向中，本揭露提供單離抗體，其包含：第一重鏈可變區，其包含選自序列辨識號：85、1、33和84的胺基酸序列；以及第一輕鏈可變區，其包含選自序列辨識號：87、2、43、86和88的胺基酸序列；第二重鏈可變區，其包含選自序列辨識號：60和70的胺基酸序列；以及第二輕鏈可變區，其包含選自序列辨識號：61和71的胺基酸序列。
在某些實施例中，第一重鏈可變區連接至序列辨識號：95中所示的第一CH1域，第一輕鏈可變區連接至序列辨識號：63中所示的第一CL域，第二重鏈可變區連接至序列辨識號：97中所示的第二CH1域，且第二輕鏈可變區連接至序列辨識號：62中所示的第二CL域。
在某些實施例中，抗體更包含選自以下的Fc區組合中的任一者： (1)序列辨識號：72中所示的第一Fc區和序列辨識號：73中所示的第二Fc區； (2)序列辨識號：74中所示的第一Fc區和序列辨識號：75中所示的第二Fc區； (3)序列辨識號：76中所示的第一Fc區和序列辨識號：77中所示的第二Fc區；以及 (4)序列辨識號：78中所示的第一Fc區和序列辨識號：79中所示的第二Fc區。 第一Fc區可和第一重鏈可變區在相同的多肽鏈中，且第二Fc區可和第二重鏈可變區在相同的多肽鏈中。在某些實施例中，可不存在Fc區的C端離胺酸(Lys447)或甘胺酸-離胺酸(殘基446-447)。
在某些實施例中，第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區形成第一抗原結合位，且第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區形成第二抗原結合位。
在一面向中，本揭露提供單離抗體，其包含：第一重鏈，其包含選自序列辨識號：104、105、106和107的胺基酸序列；以及第一輕鏈，其包含序列辨識號：112中所示的胺基酸序列；第二重鏈，其包含選自序列辨識號：108、109、110和111的胺基酸序列；以及第二輕鏈，其包含序列辨識號：98中所示的胺基酸序列。在某些實施例中，可不存在重鏈的C端離胺酸(Lys447)或甘胺酸-離胺酸(殘基446-447)。第一重鏈和第一輕鏈的可變區形成第一抗原結合位，且第二重鏈和第二輕鏈的可變區形成第二抗原結合位。
在某些實施例中，第一抗原結合位具有對CLDN6的結合活性。在某些實施例中，第一抗原結合位具有對人類CLDN6的結合活性。在某些實施例中，第一抗原結合位具有對如序列辨識號：125或126中所定義之人類CLDN6的結合活性。在某些實施例中，第一抗原結合位實質上不結合至人類CLDN9。在某些實施例中，第一抗原結合位實質上不結合至人類CLDN4。在某些實施例中，第一抗原結合位實質上不結合至人類CLDN3。在某些實施例中，第一抗原結合位實質上不結合至如序列辨識號：134中所定義之CLDN6突變株。
在某些實施例中，第二抗原結合位對CD3具有結合活性。在某些實施例中，第二抗原結合位對CD3ε鏈具有結合活性。在某些實施例中，第二抗原結合位對如序列辨識號：142中所定義之人類CD3具有結合活性。
本揭露的抗原結合分子 在一面向中，本揭露提供包含重鏈可變區的抗原結合分子，重鏈可變區包含： (a1)序列辨識號：113、117和118中分別所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3胺基酸序列；或 (a2)與序列辨識號：91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85中所示的重鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3。
在一面向中，本揭露提供包含輕鏈可變區的抗原結合分子，輕鏈可變區包含： (b1)序列辨識號：119、120和121中分別所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3胺基酸序列；或 (b2)與序列辨識號：92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88和58中所示的重鏈輕鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
在一面向中，本揭露提供包含重鏈可變區和輕鏈可變區的抗原結合分子，其中： 重鏈可變區包含選自以下的HVR組合中任一者： (a1)序列辨識號：113、117和118中分別所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3胺基酸序列；和 (a2)與序列辨識號：91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85中所示的重鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3； 且輕鏈可變區包含選自以下的HVR組合中任一者： (b1)序列辨識號：119、120和121中分別所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3胺基酸序列；和 (b2)與序列辨識號：92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88和58中所示的重鏈輕鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
在某些實施例中，抗原結合分子的重鏈可變區和輕鏈可變區包含小鼠、兔、人源化或人類框架。
在一面向中，本揭露提供抗原結合分子，其包括包含選自序列辨識號：85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83和57的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含選自序列辨識號：87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82和58的胺基酸序列的輕鏈可變區。
抗原結合分子的一條重鏈可變區和一條輕鏈可變區形成抗原結合位，其對CLDN6具有結合活性。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子對如序列辨識號：125或126中所定義之人類CLDN6具有結合活性。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子實質上不結合至人類CLDN9。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子實質上不結合至人類CLDN4。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子實質上不結合至人類CLDN3。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子實質上不結合至如序列辨識號：134中所定義之CLDN6突變株。
本揭露的抗原結合分子能夠與各種已知的醫學用途技術結合使用。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子可用於製造嵌合抗原結合受體(chimeric antigen binding receptor，CAR)和包含嵌合抗原結合受體的T細胞(CAR-T)。作為CAR的製造方法的範例，本揭露抗原結合分子的CLDN6結合位與T細胞受體(T cell receptor，TCR)的胞外域相連，而例如CD28的共刺激訊號域連接至TCR的胞內域。作為CAR-T的製造方法的範例，使用基因修飾技術，將CAR導入至例如T細胞的效應細胞中。
在一面向中，本揭露提供包含重鏈可變區的嵌合抗原結合受體，重鏈可變區包含： (a1)序列辨識號：113、117和118中分別所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3胺基酸序列；或 (a2)與序列辨識號：91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85中所示的重鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3。
在一面向中，本揭露提供包含輕鏈可變區的嵌合抗原結合受體，輕鏈可變區包含： (b1)序列辨識號：119、120和121中分別所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3胺基酸序列；或 (b2)與序列辨識號：92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88和58中所示的重鏈輕鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
在一面向中，本揭露提供包含重鏈可變區和輕鏈可變區的嵌合抗原結合受體，其中： 重鏈可變區包含選自以下的HVR組合中任一者： (a1)序列辨識號：113、117和118中分別所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3胺基酸序列；和 (a2)與序列辨識號：91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85中所示的重鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3； 且輕鏈可變區包含選自以下的HVR組合中任一者： (b1)序列辨識號：119、120和121中分別所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3胺基酸序列；和 (b2)與序列辨識號：92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88和58中所示的重鏈輕鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
在在一面向中，本揭露提供嵌合抗原結合受體，其包括包含選自序列辨識號：85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83和57的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含選自序列辨識號：87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82和58的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子是包含複數個抗原結合位的抗原結合分子。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子包含對CLDN6具有結合活性的第一抗原結合位和對T細胞受體複合物具有結合活性的第二抗原結合位，其中第一抗原結合位包含： (a)包含選自以下的HVR組合中任一者的重鏈可變區： (a1)序列辨識號：113、117和118中分別所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3胺基酸序列；和 (a2)與序列辨識號：91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57和85中所示的重鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3； 及 (b)包含選自以下的HVR組合中任一者的輕鏈可變區： (b1)序列辨識號：119、120和121中分別所示的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3胺基酸序列；和 (b2)與序列辨識號：92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88和58中所示的重鏈輕鏈可變區中任一者的序列相同的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
在某些實施例中，形成本揭露的抗原結合分子的第一抗原結合位的重鏈可變區和輕鏈可變區更包含小鼠、兔、人源化或人類框架。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子包含對CLDN6具有結合活性的第一抗原結合位和對T細胞受體複合物具有結合活性的第二抗原結合位，其中第一抗原結合位包括包含選自序列辨識號：85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83和57的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含選自序列辨識號：87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82和58的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第一抗原結合位對人類CLDN6具有結合活性。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第一抗原結合位對如序列辨識號：125或126中所定義之人類CLDN6具有結合活性。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第一抗原結合位實質上不結合至人類CLDN9。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第一抗原結合位實質上不結合至人類CLDN4。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第一抗原結合位實質上不結合至人類CLDN3。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第一抗原結合位實質上不結合至如序列辨識號：134中所定義之CLDN6突變株。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第一抗原結合位包含於單鏈Fv(single-chain Fv，scFv)、Fv或Fab中。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第二抗原結合位對CD3具有結合活性。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第二抗原結合位對CD3ε鏈具有結合活性。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第二抗原結合位對T細胞受體具有結合活性。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第二抗原結合位是由包含分別為序列辨識號：122、123及124的HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3胺基酸序列的重鏈可變區；以及包含分別為序列辨識號：114、115及116的HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3胺基酸序列的輕鏈可變區所形成。在某些實施例中，形成本揭露的抗原結合分子的第二抗原結合位的重鏈可變區和輕鏈可變區包含小鼠、兔、人源化或人類框架。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第二抗原結合位是由包含選自序列辨識號：60和70的胺基酸序列的重鏈可變區和包含選自序列辨識號：61和71的胺基酸序列的輕鏈可變區所形成。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的第二抗原結合位包含於單鏈Fv(scFv)、Fv或Fab中。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子更包含抗體Fc區。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子中所包含的Fc區是構成序列辨識號：143、144、145或146的胺基酸(IgG1至IgG4)的Fc區。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子中所包含的Fc區是在構成序列辨識號：143至146的胺基酸(IgG1至IgG4)的Fc區的任一者具有至少一個胺基酸突變的Fc區。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子中所包含的Fc區為與糖鏈連接的Fc區，且與Fc區連接的岩藻糖缺失之糖鏈的百分比高於與天然IgG Fc區連接的岩藻糖缺失之糖鏈的百分比，或添加至Fc區的平分型(bisecting)N-乙醯葡萄糖胺的百分比高於添加至天然IgG Fc區的平分型N-乙醯葡萄糖胺的百分比。
在某些實施例中，尤其在抗原結合分子包含對CLDN6具有結合活性的第一抗原結合位和對T細胞受體複合物具有結合活性的第二抗原結合位的一些實施例中，抗原結合分子中所包含的Fc區為對Fcγ受體具有減弱的結合活性的Fc區。
在某些實施例中，抗原結合分子中所包含Fc區為具有至少一個胺基酸突變選自於以下EU編號所指明的胺基酸位置的Fc區：第220位、第226位、第229位、第231位、第232位、第233位、第234位、第235位、第236位、第237位、第238位、第239位、第240位、第264位、第265位、第266位、第267位、第269位、第270位、第295位、第296位、第297位、第298位、第299位、第300位、第325位、第327位、第328位、第329位、第330位、第331位和第332位。
在某些實施例中，抗原結合分子中所包含的Fc區為包含至少一個胺基酸選自於以下EU編號所指明的胺基酸的Fc區：胺基酸第234位為Arg、胺基酸第235位為Ala或Arg、胺基酸第239位為Lys和胺基酸第297位為Ala。
在某些實施例中，形成第一抗原結合位的重鏈可變域透過第一CH1域連接至Fc區，形成第一抗原結合位的輕鏈可變域連接至第一CL域；且形成第二抗原結合位的重鏈可變域透過第二CH1域連接至Fc區，形成第二抗原結合位的輕鏈可變域連接至第二CL域。在某些實施例中，控制前述的CH1和CL域的電荷，使得形成第一抗原結合域的重鏈可變區與形成第一抗原結合域的輕鏈可變區組裝，且/或形成第二抗原結合域的重鏈可變區與形成第二抗原結合域的輕鏈可變區組裝。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子具有細胞毒殺活性。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的細胞毒殺活性為ADCC或CDC。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子的細胞毒殺活性是T細胞依賴性細胞毒殺活性。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子具有內化活性。在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子與細胞毒殺劑偶聯。
本揭露亦提供免疫偶聯物，其包含CLDN6結合分子，尤其是本文中偶聯至例如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源的酵素活性毒素或其片段)或放射性同位素的一或多種細胞毒殺劑的抗CLDN6抗體。
在一實施例中，免疫偶聯物是抗體藥物偶聯物(antibody-drug conjugate，ADC)，其中抗體偶聯至一或多種藥物，包含但不限於類美登素(maytansinoid)(參見美國專利號5,208,020、5,416,064和歐洲專利EP 0425235 B1)；澳瑞他汀(auristatin)，例如單甲基澳瑞他汀藥物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(參見美國專利5,635,483和5,780,588和7,498,298)；尾海兔素(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利號5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296； Hinman et al.,Cancer Res. 53:3336-3342(1993)；和Lode et al.,Cancer Res. 58:2925-2928(1998))；蒽環類藥物(anthracycline)如道諾黴素(daunomycin)或阿黴素(doxorubicin)(參見Kratz et al.,Current Med. Chem. 13:477-523(2006)；Jeffrey et al.,Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362(2006)；Torgov et al.,Bioconj. Chem. 16:717-721(2005)；Nagy et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834(2000); Dubowchik et al.,Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532(2002)；King et al.,J. Med. Chem. 45:4336-4343(2002)；和美國專利號6,630,579)；和胺甲喋呤(methotrexate)；長春地辛(vindesine)；紫杉醇類(taxane)例如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛紫杉醇(larotaxel)、特西紫杉醇(tesetaxel)和歐塔紫杉醇(ortataxel)；單端孢黴毒素(trichothecene)和CC1065。
在另一實施例中，免疫偶聯物包含偶聯至酵素活性毒素或其片段的本文所述的抗體，酵素活性毒素包含但不限於白喉A鏈(diphtheria A chain)、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(exotoxin A chain)(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈(ricin A chain)、相思子毒素A鏈(abrin A chain)、莫迪素毒素A鏈(modeccin A chain)、α核醣毒素(α-sarcin)、油桐樹蛋白(Aleurites fordii protein)、石竹素蛋白(dianthin protein)、美洲商陸蛋白(Phytolacca americana protein)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑(momordica charantia inhibitor)、麻瘋樹毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草抑制劑(saponaria officinalis inhibitor)、白樹毒素(gelonin)、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、 新黴素(neomycin)和單端孢黴毒素(trichothecene)。
在另一實施例中，免疫偶聯物包含如本文所述偶聯至放射性原子，以形成放射性偶聯物的抗體。多種放射性同位素可用於生產放射性偶聯物。範例包含211 At、131 I、125 I、90 Y、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi、32 P、212 Pb和Lu的放射性同位素。當放射性偶聯物用於檢測時，其可包含用於閃爍顯像(scintigraphic)研究的放射性原子，例如Tc-99m或123 I，或用於核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)成像(也稱為磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI))的自旋標記物，例如碘123、碘131、銦111、氟19、碳13、氮15、氧17、釓(gadolinium)、錳(manganese)或鐵。
可使用多種雙功能蛋白偶合劑，來製備抗體和細胞毒殺劑的偶聯物，雙功能蛋白偶合劑例如為N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate，SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸酯(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate，SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(iminothiolane，IT)、亞胺基酯(imidoester)的雙功能衍生物(例如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯(disuccinimidyl suberate))、醛(例如戊二醛(glutaraldehyde))、雙疊氮基化合物(bis-azido compound)(例如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺(bis(p-azidobenzoyl)hexanediamine))、雙重氮(bis-diazonium)衍生物(如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine))、二異氰酸酯(diisocyanate)(例如甲苯2,6-二異氰酸酯(toluene 2,6-diisocyanate))和雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene))。例如，可如Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)中所述地，來製備蓖麻毒素免疫毒素(ricin immunotoxin)。碳-14標記的1-異硫氰酸酯基苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid，MX-DTPA)是用於將放射性核種(radionuclide)偶聯至抗體的示例性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為促進細胞毒殺藥物於細胞中釋放的「可切割連接子」。例如，可使用酸不穩定(acid-labile)連接子、胜肽酶敏感連接子、光不穩定(photolabile)連接子、二甲基連接子或含二硫化物的連接子(Chari et al.,Cancer Res. 52:127-131(1992); U.S. Patent No. 5,208,020)。
本文的免疫偶聯物或ADC明確地考慮了但不限於用交聯劑製備的此類偶聯物，交聯劑包含但不限於市售(例如得自於Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基(sulfo)-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基- SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)(succinimidyl-(4-vinylsulfone)benzoate)。
在一面向中，本揭露提供了編碼本文所述的抗體或抗原結合分子的核酸。在另一實施例中，提供了包含此類核酸的一或多種載體(例如表現載體)。在另一實施方案中，提供了包含此類核酸的宿主細胞。在某些實施例中，編碼本揭露的抗體或抗原結合分子的核酸能夠併入至能夠直接投予至對象的載體中。也可能將經遺傳修飾以表現和分泌本揭露的抗體或抗原結合分子的細胞投予至對象，而使得本揭露的抗體或抗原結合分子於體內連續分泌。
本揭露亦提供了本文所述的抗體或抗原結合分子的產生方法。在另一實施例中，本文所述的抗體或抗原結合分子的產生方法包含培養包含編碼此抗原或抗原結合分子的核酸的宿主細胞。在更多實施例中，本文所述的抗體或抗原結合分子的產生方法包含培養包含編碼此抗原或抗原結合分子的核酸的宿主細胞，且從宿主細胞的培養物回收抗體或抗原結合分子。
方法和測定法 重組方法和組合物 可使用例如如美國專利號4,816,567中所述的重組方法和組合物，來生產抗體和抗原結合分子。在一實施例中，提供了編碼本文所述抗體的單離核酸。此類核酸可編碼包含抗體的VL的胺基酸序列和/或包含抗體的VH的胺基酸序列(例如，抗體的輕鏈和/或重鏈)。在更一實施例中，提供了包含此類核酸的一或多個載體(例如表現載體)。在更一實施例中，提供了包含此類核酸的宿主細胞。在一此類的實施例中，宿主細胞包括(例如已用以下所述來轉形)：(1)載體，其包括編碼包含抗體的VL的胺基酸序列和包含抗體的VH的胺基酸序列的核酸，或(2)第一載體，其包括編碼包含抗體的VL的胺基酸序列的核酸、及第二載體，其包括編碼包含抗體的VH的胺基酸序列的核酸。在一實施例中，宿主細胞是真核的，例如中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞或類淋巴細胞(lymphoid cell)(例如Y0、NS0、Sp2/0細胞)。在一實施例中，提供了抗CLDN6抗體的製造方法，其中此方法包括在適合抗體表現的條件下，培養包含如上所提供之編碼抗體的核酸的宿主細胞，且視需要地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
為了重組產生本文所述的抗體，將編碼如上所述的抗體的核酸單離，且插入至一或多個載體中，以在宿主細胞中進一步選殖(cloning)和/或表現。可使用常規流程(例如，藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)，來輕易地將此類核酸單離和定序。
適合用於選殖或表現編碼抗體的載體的宿主細胞包含本文所述的原核或真核細胞。例如，可在細菌中產生抗體，特別是在不需要糖基化(glycosylation)和Fc效應功能時。對於細菌中抗體片段和多肽的表現，請參見例如美國專利號5,648,237、5,789,199和5,840,523。(亦請參見Charlton,Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254，其描述了在大腸桿菌中表現抗體片段。)表現後，可從可溶部分中的細菌細胞糊，將抗體單離，且可進一步純化。
除了原核生物之外，例如絲狀真菌或酵母菌的真核微生物也是適合用於選殖或表現編碼抗體的載體的宿主，其包含糖基化路徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，導致產生的抗體具有部分或完全地人類糖基化模式。請參見Gerngross,Nat. Biotech. 22:1409-1414(2004)和Li et al.,Nat. Biotech. 24:210-215(2006)。
適合用於表現糖基化抗體的宿主細胞也衍生自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的範例包含植物和昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株(baculoviral strain)可與昆蟲細胞結合使用，特別是用於草地貪夜蛾(Spodoptera  frugiperda )細胞的轉染。
也可使用植物細胞培養物作為宿主。請參見例如，美國專利號5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了在轉基因植物中產生抗體的PLANTIBODIESTM 技術)。
也可使用脊椎動物細胞作為宿主。例如，適應於在懸浮液中生長的哺乳類細胞株可能是有用的。有用的哺乳動物宿主細胞株的其他範例為被SV40(COS-7)轉形的猴腎CV1株；人類胚胎腎細胞株(293或293細胞，例如如Graham et al., J. Gen Virol. 36:59(1977)中所述)；小倉鼠腎細胞(baby hamster kidney cell)(BHK)；小鼠史托利細胞(mouse sertoli cell)(TM4細胞，例如如Mather,Biol. Reprod. 23:243-251(1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(human cervical carcinoma cell)(HELA)；犬腎細胞(canine kidney cell)(MDCK)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138);人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，例如如Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci . 383:44-68(1982)中所述；MRC 5細胞；和FS4細胞。其他有用的哺乳類宿主細胞系包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，其包含DHFR- CHO細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤細胞株，例如Y0、NS0和Sp2/0。對於某些適合製造抗體的哺乳類宿主細胞系的回顧，請參見例如，Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)。
可藉由使用包括(例如已經用以下所述轉形)一或複數個載體的宿主細胞，來重組產生本文所述的抗原結合分子，此類載體包括編碼包含整個抗原結合分子或部分抗原結合分子的胺基酸序列的核酸。
雙特異性抗體的生產和純化 「多特異性抗原結合分子」是指結合至多於一種抗原的抗原結合分子。在某些實施例中，本文所述的多特異性抗原結合分子包含兩個或更多個抗原結合位，且不同的抗原結合位能夠特異性結合至不同的抗原。
在某些實施例中，本揭露的抗原結合分子是雙特異性IgG抗體。可藉由融合產生IgG抗體的兩種類型的融合瘤(hybridoma)而產生的二次雜交瘤(quadroma)，來分泌IgG型雙特異性抗體(Milstein et al., Nature(1983)305, 537-540)。
再者，藉由將構成兩種感興趣類型的IgG的L鏈和H鏈的基因(即，總共四個基因)導入至細胞中且共表現，來分泌IgG型雙特異性抗體。然而，可藉由這些方法產生的IgG的H和L鏈的組合的數量理論上為十個組合。因此，難以從十個類型的IgG中，純化出包含所欲的H鏈和L鏈組合的IgG。再者，理論上，具有所欲組合的IgG的分泌量將顯著減少，因此將需要大規模培養，且生產成本將進一步增加。
因此，用於促進具有期望的組合的H鏈之間以及L鏈和H鏈之間的結合的技術可應用於本發明的多特異性抗原結合分子。
例如，藉由在抗體H鏈的第二恆定區或第三恆定區(CH2或CH3)的界面導入靜電排斥(electrostatic repulsion)，來抑制非期望的H鏈結合的技術可應用於雙特異性抗體結合(WO2006/106905)。
在藉由於CH2或CH3的界面導入靜電排斥，來抑制非預期的H鏈結合的技術中，於H鏈的另一恆定區的界面接觸的胺基酸殘基的範例包含對應至CH3區中的EU編號第356、439、357、370、399和409位的殘基的區域。
更具體而言，範例包括包含兩種類型的H鏈CH3區的抗體，其中在第一H鏈CH3區中的一至三對胺基酸殘基攜帶相同類型的電荷，且係選自以下(1)至(3)中所指明的胺基酸殘基對：(1)H鏈CH3區中所包含之EU編號第356和439位的胺基酸殘基；(2)H鏈CH3區中所包含之EU編號第357和370位的胺基酸殘基；(3)H鏈CH3區中所包含之EU編號第399和409位的胺基酸殘基。
再者，抗體可為在不同於上述的第一H鏈CH3區的第二H鏈CH3區中的胺基酸殘基對的抗體，胺基酸殘基對係選自上述的(1)至(3)的胺基酸殘基對，其中對應至與上述第一H鏈CH3區中攜帶相同類型的電荷的前述(1)至(3)的胺基酸殘基對的一至三對的胺基酸殘基攜帶與上述第一H鏈CH3區中所對應的胺基酸相反的電荷。
上述(1)至(3)中所指明的每個胺基酸殘基在結合過程中彼此接近。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可藉由使用市售軟體進行同源性建模的方式，在所欲的H鏈CH3區或H鏈恆定區中找出與上述(1)至(3)的胺基酸殘基對應的位置，且這些位置的胺基酸殘基可適當地進行修飾。
在上述抗體中，「帶電的胺基酸殘基」較佳地選自例如以下其中一組所包含的胺基酸殘基： (a)麩胺酸(E)和天門冬胺酸(D)；和 (b)離胺酸(K)、精胺酸(R)和組胺酸(H)。
在上述抗體中，詞組「攜帶相同電荷」是指例如，兩個或更多個胺基酸殘基中的全部皆選自上述群組(a)和(b)之一中所包含的胺基酸殘基。詞組「攜帶相反電荷」是指例如，當兩個或多個胺基酸殘基中的至少一個胺基酸殘基係選自上述群組(a)和(b)之一中所包含的胺基酸殘基時，剩餘的胺基酸殘基係選自另一群組中所包含的胺基酸殘基。
在一較佳實施例中，上述抗體可藉由雙硫鍵，使第一H鏈CH3區和第二H鏈CH3區交聯。
在本發明中，進行修飾的胺基酸殘基不限於抗體可變區或抗體恆定區的上述胺基酸殘基。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可藉由同源性建模等，使用市售軟體來鑑定出在突變多肽或異源多聚體(heteromultimers)中形成界面的胺基酸殘基；而這些位置的胺基酸殘基可接著進行修飾以調控結合。
其他已知技術也可用於本發明的雙特異性抗體的結合。可藉由用較大的側鏈(杵(knob))來取代存在於抗體的H鏈Fc區之一者中的胺基酸側鏈，且用較小的側鏈(臼(hole))來取代存在於另一H鏈的對應Fc區中胺基酸側鏈，使杵得以置於臼中，進而使得包含不同胺基酸之含有Fc區的多肽可彼此有效結合(WO1996/027011; Ridgway JB et al., Protein Engineering(1996)9, 617-621；Merchant A. M. et al. Nature Biotechnology(1998)16, 677-681；和US20130336973)。
此外，其他已知技術也可用於形成本發明的雙特異性抗體。藉由CH3的互補結合可有效地誘導具有不同序列的多肽結合，而CH3的互補結合係使用藉由將抗體的H鏈CH3之一者的一部分改變為對應的IgA衍生序列，且將相應的IgA衍生序列導入至另一H鏈CH3的互補部分而產生的經股交換工程(strand-exchange engineered)的結構域CH3(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。此已知技術也可用於有效地形成感興趣的雙特異性抗體。
此外，使用抗體CH1和CL的結合以及VH和VL的結合，來產生抗體的技術，如WO 2011/028952、WO2014/018572和Nat Biotechnol. 2014 Feb; 32(2):191-8中所述；結合使用各別製備的單株抗體(Fab臂交換)，來產生雙特異性抗體的技術，如WO2008/119353和WO2011/131746中所述；調控抗體重鏈CH3之間的結合的技術，如WO2012/058768和WO2013/063702中所述；產生由兩種類型輕鏈和一種類型重鏈所構成的雙特異性抗體的技術，如WO2012/023053中所述；使用各別表現包含單一條H鏈和單一條L鏈的抗體的鏈中的其中一條的兩種細菌細胞株，來產生雙特異性抗體的技術，如Christoph等人(Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758(2013))所述，等等可用於形成雙特異性抗體。
或者，即使當不能有效地形成感興趣的雙特異性抗體時，也可藉由從產生的抗體中分離和純化出感興趣的雙特異性抗體，來獲得本發明的雙特異性抗體。例如，已報導了藉由將胺基酸取代導入至兩種類型的H鏈的可變區中，來賦予等電點差，從而能夠藉由離子交換層析法，來純化兩種類型的同源形式和感興趣的異源抗體的方法(WO2007114325)。到目前為止，作為純化異源抗體的方法，已報導了使用蛋白A來純化包含與蛋白A結合的小鼠IgG2a H鏈和不與蛋白A結合的大鼠IgG2b H鏈的異二聚抗體的方法(WO98050431和WO95033844)。再者，可使用包含胺基酸殘基取代的H鍊或使用具有不同蛋白A親和力的H鏈，來改變每個H鏈與蛋白A的交互作用，然後使用蛋白A管柱，來有效地自行純化出異二聚抗體。上述的胺基酸殘基取代係在蛋白A結合位之EU編號位置435和436處以Tyr、His進行取代。
再者，已改善了Fc區C端異質性的Fc區可適當地作為本發明的Fc區。更具體而言，本發明提供藉由從構成衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區的兩條多肽的胺基酸序列中，剔除EU編號所指明的第446位的甘胺酸和第447位的離胺酸而產生的Fc區。
T細胞依賴性細胞毒殺性的測量 在抗原結合分子同時結合至CLDN6和T細胞受體複合物兩者的實施例中，下述方法較佳地作為評估或確定由使本揭露的抗原結合分子與本揭露的抗原結合分子中的抗原結合位所結合的CLDN6表現細胞接觸所引起的T細胞依賴性細胞毒殺性(TDCC)的方法。體外評估或確定細胞毒殺活性的方法包含確定細胞毒殺T細胞等的活性的方法。可藉由已知方法(請參見例如，Current protocols in Immunology, Chapter 7Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993))，來確定本揭露的抗原結合分子是否具有誘導T細胞介導的細胞毒殺性的活性。在細胞毒殺性測定中，能夠結合至與CLDN6和T細胞受體複合物不同的抗原且在細胞中不表現的抗原結合分子作為對照抗原結合分子。以相同方式測定對照抗原結合分子。然後，藉由測試本揭露的抗原結合分子是否展現出比對照抗原結合分子更強的細胞毒殺活性，來評估活性。
同時，例如藉由以下流程來評估或確定體內抗腫瘤功效。將表現本揭露的抗原結合分子中的抗原結合位所結合的抗原的細胞皮內或皮下移植到非人類的動物對象。然後，從移植當天或那之後開始，每天或每隔幾天將測試抗原結合分子投予至靜脈或腹膜腔中。隨時間測量腫瘤尺寸。腫瘤尺寸變化的差異可定義為細胞毒殺活性。如在體外測定中，投予對照抗原結合分子。當投予本揭露的抗原結合分子的組別中的腫瘤尺寸小於投予對照抗原結合分子的組別的腫瘤尺寸時，可判斷本揭露的抗原結合分子為具有細胞毒殺活性。
較佳使用MTT方法和同位素標記的胸腺嘧啶(thymidine)汲取至細胞中的測量方法來評估或確定與本揭露的抗原結合分子接觸，以抑制表現抗原結合分子中的抗原結合位所結合的抗原的細胞的生長的效果。同時，可較佳使用上述用於評估或確定體內細胞毒殺活性的相同方法來評估或確定體內抑制細胞生長的活性。
可藉由本發明所屬技術領域中已知的任何合適的方法，來評估本揭露的抗體或抗原結合分子的TDCC。例如，可藉由乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放測定法，來測量TDCC。在此測定中，在測試抗體或抗原結合分子的存在下，將目標細胞(例如CLDN6表現細胞)與T細胞(例如PBMC)一起培養，且使用合適的試劑來測量被T細胞殺死的目標細胞所釋放的LDH活性。通常，細胞毒殺活性是以與抗體或抗原結合分子一起培養而產生的LDH活性相對於100%殺死目標細胞(例如藉由Triton-X處理而裂解)而產生的LDH活性的百分比來作計算。如果如上所述計算的細胞毒殺活性較高，則測試抗體或抗原結合分子確定具有較高的TDCC。
此外或或者，例如，也可藉由即時細胞生長抑制測定，來測量TDCC。在此測定中，在96孔盤上，於測試抗體或抗原結合分子的存在下，將目標細胞(例如CLDN6表現細胞)與T細胞(例如PBMC)一起培養，且藉由本發明所屬技術領域中已知的方法，例如藉由使用合適的分析儀器(例如xCELLigence即時細胞分析儀)，來監測目標細胞的生長。根據所給予的細胞生長抑制率(cell growth inhibition，CGI：%)= 100-(CIAb x 100 / CINoAb )的公式，從細胞指數值來確定細胞生長抑制率(CGI：%)。「CIAb 」代表在特定實驗時間有抗體或抗原結合分子的孔的細胞指數值，而「CINoAb 」代表沒有抗體或抗原結合分子的孔的平均細胞指數值。如果抗體或抗原結合分子的CGI率高，即具有顯著的正值，則可以說抗體或抗原結合分子具有TDCC活性。
在一面向中，本揭露的抗體或抗原結合分子具有T細胞活化活性。可藉由本發明所屬領域中已知的方法，例如使用經改造之回應其活化而表現報導基因(例如冷光素酶)的T細胞株的方法(例如Jurkat / NFAT-RE報導細胞株(T細胞活化生物測定法(T Cell Activation Bioassay), Promega))，來測定T細胞活化。在此方法中，在測試抗體或抗原結合分子的存在下，將目標細胞(例如CLDN6表現細胞)與T細胞一起培養，然後藉由適當的方法來測量報導基因的表現產物的程度或活性，以作為T細胞活化的指標。當報導基因是冷光素酶基因時，可測量由冷光素酶與其受質之間的反應產生的發光作為T細胞活化的指標。如果如上所述測量的T細胞活化較高，則測試抗體或抗原結合分子確定具有較高的T細胞活化活性。
用於診斷和檢測的方法和組合物 在某些實施例中，本文提供的任何抗原結合分子或抗體對於用於檢測生物樣品中CLDN6的存在是有用的。如本文所使用的術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，例如癌組織。
在一實施例中，提供了用於診斷或檢測方法的抗原結合分子或抗體。在另一面向中，提供了檢測生物樣品中CLDN6的存在的方法。在某些實施例中，此方法包含在允許抗原結合分子或抗體結合至CLDN6的條件下，使生物樣品與本文所述的抗原結合分子或抗體接觸，以及檢測抗原結合分子和CLDN6之間是否形成複合物。此類方法可為體外或體內方法。在一實施例中，抗原結合分子或抗體用於選擇適合用本文所述的抗原結合分子或抗體進行治療的對象，例如其中CLDN6是用於選擇患者的生物標記。
可使用本發明的抗體來診斷的示例性失調包含癌症，尤其是卵巢腫瘤、非小細胞肺癌、胃癌和肝癌。
在某些實施例中，提供了本文所述的標記的抗原結合分子或抗體。標記包含但不限於直接檢測的標記或部分(moiety)(例如螢光、發色、電子密集、化學發光和放射性標記)，以及例如透過酵素反應或分子交互作用，間接檢測如酵素或配體的部分。示例性標記包含但不限於放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H和131 I、螢光團(fluorophore)例如稀土螯合物或螢光素(fluorescein)及其衍生物、玫瑰紅(rhodamine)及其衍生物、丹磺醯(dansyl)、繖形酮(umbelliferone)、冷光素酶(luciferase)例如螢火蟲冷光素酶(firefly luciferase)和細菌冷光素酶(bacterial luciferase)(美國專利號4,737,456)、冷光素(luciferin)、2,3-二氫鄰苯二甲二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)、葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)、溶菌酶(lysozyme)、醣氧化酶(saccharide oxidase)例如葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)、半乳糖氧化酶(galactose oxidase)和葡萄糖6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)、雜環氧化酶(heterocyclic oxidase)例如尿酸酶(uricase)和黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)、與利用過氧化氫來氧化染劑前體之酵素偶聯的標記，如HRP、乳過氧化酶(lactoperoxidase)或微過氧化物酶(microperoxidase)、生物素(biotin)/親和素(avidin)、旋轉標記(spin label)、噬菌體標記(bacteriophage label)、穩定的自由基等等。
醫藥組合物 在一面向中，本揭露提供了包含本揭露的抗原結合分子或抗體的醫藥組合物。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物誘導T細胞依賴性細胞毒殺性，換句話說，本揭露的醫藥組合物是用於誘導細胞的細胞毒殺性的治療劑。在某些實施方案中，本揭露的醫藥組合物是用於治療和/或預防癌症的醫藥組合物。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物是用於治療和/或預防卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的醫藥組合物。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物是細胞生長抑制劑。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物是抗癌劑。
如有需要，本揭露的醫藥組合物、用於誘導細胞的細胞毒殺性的治療劑、細胞生長抑制劑或抗癌劑可與不同類型的抗原結合分子或抗體一起配製。例如，可藉由多種本揭露的抗原結合分子或抗體的混合物，來增強針對表現抗原的細胞的細胞毒殺作用。
藉由將具有所需純度的此類抗原結合分子或抗體與一或多種可選的醫藥上可接受的載體混合，以凍乾製劑或水溶液的形式來製備本文所述的抗原結合分子或抗體的醫藥組合物(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980))。醫藥上可接受的載體在所採用的劑量和濃度下通常對接受者無毒，其包含但不限於：緩衝液例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑包含抗壞血酸和甲硫胺酸(methionine)；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)；氯化六甲銨(hexamethonium chloride)；氯化芐二甲烴銨(benzalkonium chloride)；氯化苯索寧(benzethonium chloride)；酚(phenol)、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷酯(alkyl paraben)，例如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚(catechol)；間苯二酚(resorcinol)；環己醇(cyclohexanol)；3-戊醇(3-pentanol)和間甲酚(m-cresol)); 低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白(serum albumin)、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯酮(polyvinylpyrrolidone)；胺基酸，例如甘胺酸(glycine)、麩醯胺酸(glutamine)、天門冬醯胺酸(asparagine)、組胺酸(hisdtidine)、精胺酸(arginine)或離胺酸(lysine)；單醣、雙醣和其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖(mannose)或糊精(dextrin)；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇(mannitol)、海藻糖(trehalose)或山梨糖醇(sorbitol)；形成鹽的相對離子，例如鈉；金屬複合物(例如鋅蛋白複合物)；和/或非離子界面活性劑，例如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。本文中的示例性醫學上可接受的載體更包含間質性藥物分散劑(interstitial drug dispersion agents)，例如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(soluble neutral-active hyaluronidase glycoprotein，sHASEGP)，其例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，其例如rHuPH20(HYLENEX(註冊商標), Baxter International, Inc.)。在美國專利公開號2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性的sHASEGP和使用方法，包含rHuPH20。在一面向，sHASEGP與一或多種額外之例如軟骨素酶(chondroitinase)的醣胺聚醣酶(glycosaminoglycanase)結合合。
在美國專利號6,267,958中描述了示例性的凍乾抗體製劑。水性抗體製劑包含在美國專利號6,171,586和WO2006/044908中描述的水性抗體，後者的製劑包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文的製劑亦可包含超過一種對所治療的特定適應症必要的活性成分，較佳地是具有互補活性且不會互相負面影響的活性成分。此類活性成分適合以對預期目的有效的量組合存在。
如有需要，可將本揭露的抗原結合分子或抗體包覆在微膠囊中(由羥甲基纖維素(hydroxymethylcellulose)、明膠、聚[甲基丙烯酸甲酯]( poly[methylmethacrylate])等製成的微膠囊)，且製成膠體藥物遞送系統(脂質體(liposome)、白蛋白微球(albumin microsphere)、微乳液(microemulsion)、奈米顆粒和奈米膠囊)的成分(例如，請參見“Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition”, Oslo Ed.(1980)。再者，已知將試劑製備為持續釋放劑的方法，且這些可應用於本揭露的抗原結合分子(J. Biomed. Mater. Res.(1981)15, 267-277；Chemtech. (1982)12, 98-105；美國專利號3773719；歐洲專利申請(European Patent Application，EP)號EP58481和EP133988；Biopolymers(1983)22, 547-556)。
本揭露的醫藥組合物、細胞生長抑制劑或抗癌劑可口服或腸胃外投予至患者。腸胃外投予是較佳的。具體而言，此類投予方法包含注射、鼻腔投予、經肺投予(transpulmonary administration)和經皮投予(percutaneous administration)。注射包含例如靜脈注射(intravenous injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、腹腔注射(intraperitoneal injection)和皮下注射(subcutaneous injection)。例如，可藉由注射來局部或全身投予本揭露的醫藥組合物、誘導細胞毒殺性的治療劑、細胞生長抑制劑或抗癌劑。再者，可根據患者的年齡和症狀選擇適當的投予方法。每次投予的投予劑量可從例如0.0001 mg至1,000 mg/kg體重的範圍內選擇。或者，劑量可例如從每位患者0.001 mg/體重至100,000 mg/體重的範圍內選擇。然而，本揭露的醫藥組合物的劑量不限於這些劑量。
較佳地，本揭露的醫藥組合物包含本文所述的抗原結合分子或抗體。在一面向中，此組合物是用於誘導細胞的細胞毒殺性的醫藥組合物。在另一面向，此組合物是用於治療或預防癌症的醫藥組合物。較佳地，癌症是大腸直腸癌或胃癌。本揭露的醫藥組合物可用於治療或預防癌症。因此，本揭露提供了治療或預防癌症的方法，其中將本文所述的抗原結合分子或抗體投予至有其需要的患者。
本揭露亦提供了藉由使表現CLDN6的細胞與本揭露之結合至CLDN6的抗原結合分子接觸，來破壞表現CLDN6的細胞或抑制細胞生長的方法。在上文中描述了作為本揭露的抗原結合分子之結合至CLDN6的單株抗體，其包含於本揭露的誘導細胞毒殺性的治療劑、細胞生長抑制劑和抗癌劑中。沒有特別限制本揭露的抗原結合分子所結合的細胞，只要它們表現CLDN6即可。具體而言，在本揭露中，較佳的癌抗原表現細胞包含卵巢癌細胞、前列腺癌細胞、乳癌細胞、子宮癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、胰腺癌細胞、胃部癌細胞、泌尿膀胱癌細胞和大腸癌細胞。
在本揭露中，「接觸」可例如藉由將本揭露的抗原結合分子添加至體外培養之表現CLDN6的細胞的培養基中來進行。在此情況下，待添加的抗原結合分子可以適當的形式使用，例如藉由凍乾等所製備的溶液或固體。當本揭露的抗原結合分子作為水溶液添加時，此溶液可為僅包含抗原結合分子的純水溶液、或含有例如上述表面活性劑、賦形劑、著色劑(coloring agent)、調味劑(flavoring agent)、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮劑、等滲劑(isotonizing agent)、黏合劑(binder)、崩解劑(disintegrator)、潤滑劑(lubricant)、流動性促進劑(fluidity accelerator)和矯味劑(corrigent)的溶液。所添加的濃度沒有特別限制；然而，培養基中的終濃度較佳在1 pg/ml至1 g/ml的範圍內、更佳在1 ng/ml至1 mg/ml的範圍內、且更佳在1 μg/ml至1 mg/ml的範圍內。
在本揭露的另一實施例中，「接觸」也可藉由投予至體內移植了CLDN6表現細胞的非人類動物或具有內源性表現CLDN6的癌細胞的動物來進行。投予方法可為口服或腸胃外的。腸胃外投予是特別較佳的。具體而言，腸胃外投予方法包含注射、鼻腔投予、肺部投予和經皮投予。注射包含例如靜脈注射、肌肉內注射、腹腔注射和皮下注射。例如，可藉由注射，來局部或全身投予本揭露的醫藥組合物、誘導細胞毒殺性的治療劑、細胞生長抑制劑或抗癌劑。再者，可根據動物對象的年齡和症狀選擇適當的投予方法。當以水溶液來投予抗原結合分子時，此溶液可為僅包含抗原結合分子的純水溶液、或含有例如上述表面活性劑、賦形劑、著色劑、調味劑、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮劑、等滲劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑和矯味劑的溶液。每次投予的投予劑量可從例如0.0001 mg至1,000 mg/kg體重的範圍內選擇。或者，劑量可例如從每位患者0.001 mg/體重至100,000 mg/體重的範圍內選擇。然而，本揭露的投原結合分子的劑量不限於這些範例。
本揭露也提供了用於本揭露的方法的套組，其含有本揭露的抗原結合分子或藉由本揭露的方法產生的抗原結合分子。套組可與額外的醫藥上可接受的載體或介質、或與描述如何使用套組的說明手冊包裝在一起。
在本發明的另一面向中，提供了含有對上述失調的治療、預防和/或診斷有用的材料的製品。製品包含容器和在容器上的標籤或與容器有關的藥品說明書。合適的容器包含例如瓶子、小玻璃瓶(vial)、注射器(syringe)、IV溶液袋等。容器可由多種材料形成，例如玻璃或塑膠。容器可容納一種組合物本身或對治療、預防和/或診斷狀況有效的另一組合物結合的組合物，且可具有無菌進入口(例如，容器可為靜脈注射溶液袋或具有可藉由皮下注射針頭刺穿的瓶塞的玻璃瓶)。組合物中的至少一種活性成分是本發明的抗體。指示此組合物的標籤或藥品說明書係用於治療所選狀況。此外，製品可包含：(a)含有組合物於其中的第一容器，其中組合物包含本發明的抗體；(b)含有組合物於其中的第二容器，其中組合物包含另外的細胞毒殺或其它治療劑。在本發明的此實施例中的製品可更包含指示組合物可用於治療特定狀況的藥品說明書。或者或此外，製品可更包含第二(或第三)容器，其包含醫藥上可接受的緩衝液例如注射用的抑菌水(bacteriostatic water for injection，BWFI)、磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline)、林格氏溶液(Ringer's solution)和右旋糖溶液(dextrose solution)。其可更包含其他商業和用戶的所需的材料，包含其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
應理解的是，上述任何製品都可包含代替抗原結合分子或抗體之本發明的免疫偶聯物、或除抗原結合分子或抗體之外還包含本發明的免疫偶聯物。
本文引用的所有文件均藉由引用併入本文。 [實施例]
以下是本揭露的方法和組合物的範例。應理解的是，即便以上提供了大致的描述，仍可實施各種其他實施例。
實施例 1，sc(Fv)2 分子的穩定性 關於百利妥單抗(blinatumomab)的穩定性，在廠內用20mM His、150mM NaCl、pH6.0純化出3.8 mg/mL的百利妥單抗。藉由SEC分析，確定高分子量(High molecular weight，HMW)種類比例為6.4%。為了物理化學測試，以pH7.4的PBS進行透析，且將濃度調整至1 mg/mL。透析後，HMW比例變為42.6%。通常，在透析過程中，IgG抗體的HMW比例不會改變。因此，百利妥單抗在溶液中具有聚集傾向(aggregation tendency)，且與IgG抗體相比，其被認為較不穩定。使用SWXL G2000管柱(TOSOH)，以50 mM磷酸鈉、300 mM pH7.0的NaCl作為運行緩衝液，來進行SEC分析。藉由UV檢測器(280nm)來進行檢測。使用Empower 3軟體(Waters)來分析層析圖。
實施例 2，結合密連蛋白6(CLDN6)的T細胞重定向抗體的選擇 實施例 2-1，抗CLDN6的T細胞重定向抗體的生成 為了克服sc(Fv)2 形式的限制，我們以IgG形式生成了靶向CLDN6的T細胞重定向雙特異性抗體(抗CLDN6/CD3雙特異性抗體)，其使抗體能夠獲得更好的穩定性和更長的血清半衰期。
三種抗CLDN6抗體(AE3-20、AH05、CDA0013)的可變區、6PHU3的CLDN6結合可變區和一種抗CD3抗體(TR01)的可變區用來生成抗CLDN6/CD3雙特異性抗體。從用CLDN6表現載體所免疫的兔子B細胞獲得CDA0013。
使用Igawa等人(WO 2016159213)報導的Fab臂交換技術，將上述可變區用於生成抗CLDN6/CD3雙特異性抗體。抗CLDN6/CD3抗體臂中所包含的可變區顯示於表1中，且所生成的雙特異性抗體含有對Fcγ受體的親和力減弱的沉默Fc。生成了四種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01和6PHU3/TR01(表1)。
(表1)生成的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體
抗體名稱 序列辨識號
CLDN6結合重鏈可變區(VH) CLDN6結合輕鏈可變區(VL) CD3結合重鏈可變區(VH) CD3結合輕鏈可變區(VL)
AE3-20/TR01 1 2 70 71
AH05/TR01 89 90
CDA0013/TR01 91 92
6PHU3/TR01 93 94
實施例 2-2，使用Jurkat報導基因測定法的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性 藉由參考實施例3中所述的方法，在hCLDN6/BaF、hCLDN9/BaF或hCLDN6(Q156L)/BaF的存在下，檢驗實施例2-1中生成的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性。每種抗體分別在0.001、0.01、0.1、1和10nM的濃度下，來確定T細胞活化活性。
結果(圖1A、圖1B)顯示，在hCLDN6/BaF的存在下，所有抗CLDN6/CD3雙特異性抗體均誘導強烈的T細胞活化。在hCLDN9/BaF的存在下，在6PHU3/TR01中觀察到些微的T細胞活化，而在其他AE3-20/TR01、AH05/TR01和CDA0013/TR01中則沒有活化。此結果顯示，儘管6PHU3/TR01些微地結合至人類CLDN9表現細胞，但所有抗CLDN6/CD3雙特異性抗體對CLDN6均顯示出相對較高的特異性。
圖1A和圖1C顯示，與在hCLDN6/BaF的存在下的T細胞活化相比，在hCLDN6(Q156L)/BaF的存在下，所有抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化均較低，表示所有抗CLDN6/CD3雙特異性抗體均結合至包含人類CLDN6中第156位胺基酸殘基的抗原決定基。
實施例 2-3，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體對CLDN家族蛋白的抗原結合特異性 如下生成瞬時表現人類和小鼠CLDN3、4、6和9的FreeStyleTM 293-F細胞。藉由將編碼對應序列的合成cDNA插入至哺乳類表現載體pCXND3中，來建立人類和小鼠CLDN(包含CLDN6、CLDN9、CLDN3和CLDN4)的表現載體(WO2008/156083)。
使用293fectin(Invitrogen)將各個載體導入至FreeStyleTM 293-F細胞(Invitrogen)中。將細胞培養2-4天，且藉由離心來收集。立刻以3x106 個細胞/mL的濃度，將收集的細胞重新懸浮於含有0.1% BSA的D-PBS(-)中。
評估的抗體： 1)抗CLDN6/CD3雙特異性抗體：AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01、6PHU3/TR01； 2)藉由Fab臂交換，與人類CD3抗體(序列辨識號：70中所示的VH、序列辨識號：71中所示的VL)配對的抗鑰孔帽貝血藍素(keyhole limpet hemocyan，KLH)抗體(序列辨識號：68中所示的VH、序列辨識號：69中所示的VL)的雙特異性抗體：KLH/TR01(作為陰性對照)； 3)市售抗CLDN二價抗體(自R&D systems購買)：小鼠抗人類CLDN6抗體(MAB3656)、小鼠抗人類CLDN3抗體(MAB4620)、小鼠抗人類CLDN4抗體(MAB4219)。
將最終濃度為10 μg/mL的抗體與瞬時表現人類和小鼠CLDN3、4、6和9的FreeStyleTM 293-F細胞混合。培養1小時後，用含有0.1% BSA的D-PBS(-)洗滌細胞，且在5 μg/mL的山羊抗人類IgG(H+L)交叉吸附的二級抗體Alexa Fluor 647(Invitrogen，A21445)或山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二級抗體Alexa Fluor 647(Invitrogen，A21236)中培養1小時。然後用含有0.1% BSA的D-PBS(-)洗滌細胞，重新懸浮於5μL之含有0.1% BSA的D-PBS(-)中，且藉由流式細胞儀(iQue Screener，intellicyte)進行分析。
如圖2-1和2-2中所示，在所有抗CLDN6/CD3雙特異性抗體中皆觀察到對人類CLDN6的強烈結合。在所有抗CLDN6/CD3雙特異性抗體中也觀察到與小鼠CLDN6的結合，儘管它們比對人類CLDN6的結合弱。所有抗CLDN6/CD3雙特異性抗體均對人類CLDN9、人類CLDN4、人類CLDN3、小鼠CLDN9、小鼠CLDN4或小鼠CLDN3顯示出些微結合或不結合。特別是，CDA0013/TR01對CLDN6顯示出最好的特異性。
實施例 2-4，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的體內功效分析 使用帶有腫瘤的小鼠模型，來評估抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的體內抗腫瘤功效。將表現人類CLDN6的人類癌細胞株(HuH-7(Health Science Research Resources Bank)、OV-90(ATCC)或OVCAR-3(ATCC))皮下移植到NOD/ShiJic-scid小鼠中，且將人類PBMC注射至小鼠中(所謂的T細胞注射模型)。帶有腫瘤的小鼠隨機分為接受抗體投予的治療組、或接受媒液投予作為對照。
更具體而言，於功效測試中，使用HuH-7或OV-90或OVCAR-3 T細胞注射模型來進行以下測試。使用人類PBMC(AllCells)和T細胞活化/擴增套組(Miltenyi Biotec)執行T細胞擴增。將1x107 個細胞的HuH-7、5x106 個細胞的OV-90或1x107 個細胞的OVCAR-3和基質膠基底膜基質(Matrigel Basement Membrane Matrix)(BD)混合，且皮下移植到NOD/ShiJic-scid小鼠的側面區域(CLEA Japan，母鼠，6至7週大)。移植當天定義為第0天。在根據腫瘤尺寸和體重隨機分組後，每隻小鼠腹腔投予0.2 mg抗無唾液酸(asialo)GM1抗體(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)。隔天，從擴增培養物中收集T細胞，且每隻小鼠以3x107 個細胞的數量將其植入腹腔。T細胞移植後約4小時，靜脈投予抗體。僅投予抗體一次。測量每隻小鼠的腫瘤塊的長度(L)和寬度(W)及體重，且腫瘤體積(tumor volume，TV)計算為：TV =(L x W x W)/2。
圖3顯示在OV-90和HuH-7 T細胞注射模型中，AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01的體內抗腫瘤功效。以5 mg/kg的劑量注入這些抗體會強烈阻礙腫瘤的生長。特別是，在HuH-7 T細胞注射模型中，與其他兩種抗體AH05/TR01和6PHU3/TR01相比，AE3-20/TR01顯示出最佳功效(圖3a)。
使用相同的小鼠模型，來進行抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的毒性和藥物動力學(pharmacokinetics，PK)分析。儘管AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01均在OV-90和HuH-7 T細胞注射模型中顯示出抗腫瘤功效，但在用AH05/TR01和6PHU3/TR01治療的小鼠中觀察到體重驟降。在用AE3-20/TR01治療的小鼠中未觀察到體重變化(圖4)。此外，體重減輕的小鼠顯示出惡化的一般情況以及皮膚和血漿的黃變(yellow discoloration)。
安樂死後，收集血漿且進行血液生化測試。確定肝毒性標記物的血漿濃度(TBA-120FR, Canon medical system)，包含ALT、ALP、GGT、GLDH、TBIL和TBA。在用AH05/TR01和6PHU3/TR01治療的小鼠中，肝臟參數顯著升高(圖5)。這些數據指出AH05/TR01和6PHU3/TR01在小鼠中引起肝毒性。
抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的PK評估如下。將抗體以5 mg/kg的劑量靜脈注射至小鼠中。在HuH-7 T細胞注射模型中於抗體注射後第3、7、13天，和在OV-90 T細胞注射模型中於抗體注射後第3、6、14天，採三隻小鼠的血。藉由在4度C下於10,000 x g離心5分鐘，獲得肝素中的血漿樣品。如下所述藉由ELISA，來測量小鼠血漿中抗體的濃度。將抗人類IgG抗體(Sigma)分配至Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp(Thermo Fisher)上，且在室溫下保持1小時以製備抗人類IgG固定盤。濃度為8、4、2、1、0.5、0.25或0.125 ng/mL的樣品抗體用來校正，且藉由稀釋400倍或更多倍，來製備小鼠血漿樣品以進行檢驗。將每個樣品分配到抗人類IgG固定盤中，且在室溫下保持1小時。然後，添加生物素化的抗Fc特異性抗體(CHUGAI)，在室溫下反應1小時。添加鏈黴親和素(streptavidin)-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)在室溫下反應1小時，且使用ABTS(Roche)作為受質進行呈色反應。然後，藉由微盤讀取儀(microplate reader)，來測量405 nm(650 nm作為參考)的吸光值。使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)由校正曲線的吸光值計算小鼠血漿中的抗體濃度。
圖6中顯示靜脈投予後，AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01血漿濃度的時間變化。在HuH-7 T細胞注射模型的血漿中，AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01的半衰期(T1/2 )約為3.44至4.79天，而在OV-90 T細胞注射模型中約為2.77至3.22天。
最值得注意的是，與先前報導(6)中所述的雙特異性sc(Fv)2 6PHU3的血漿半衰期相比，在HuH-7模型中6PHU3/TR01的血漿半衰期延長至3.44天，而在OV-90模型中延長至2.77天。此延長很可能是由於抗體從雙特異性sc(Fv)2 轉換為IgG形式。然而，6PHU3/TR01在小鼠中引起了肝毒性，如注入後體重的顯著降低和肝標記物的增加所證實(圖4和5)。這些發現顯示抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的血漿半衰期延長可能會引起肝毒性。
也使用了OVCAR-3 T細胞注射小鼠模型，來評估於5 mg/kg的劑量的AE3-20/TR01和CDA0013/TR01的體內抗腫瘤功效和安全性。用與上述相同的流程進行實驗。
如圖7中所示，用AE3-20/TR01治療導致腫瘤體積顯著縮小，而用CDA0013/TR01的治療在帶有OVCAR-3的小鼠中顯示中等功效。抗體治療後，整體上幾乎無法檢測到體重急劇減輕，但在CDA0013/TR01治療組中發現肝臟毒性標記物明顯增加(圖8)。事實上，CDA0013/TR01治療組中五分之一的小鼠顯示微弱的體重減輕。
如下所述地使用以5 mg/kg來靜脈注射的動物，來計算AE3-20/TR01和CDA0013/TR01的PK。在注射後第3、7、14天，由從三隻動物所採的血來製備肝素中的血漿樣品，然後如此實施例先前所述，藉由ELISA來進行抗體濃度的測量。
如圖9中所示，AE3-20/TR01和CDA0013/TR01的PK特徵相當。AE3-20/TR01和CDA0013/TR01的血漿半衰期(T1/2 )為3.60和3.98天，而從零至無限大的血漿濃度-時間曲線下的面積(AUCinf )分別為138和161天*μg/mL。
根據此實施例的結果，儘管所有抗體均對CLDN6顯示相對高的特異性和類似的藥物動力學概貌，但一些IgG形式的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體易具有引起肝損傷的潛力。在測試的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體中，發現AE3-20/TR01是唯一在各種帶有腫瘤的小鼠模型中均顯示出功效和良好安全性概貌的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體。
實施例 3，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的CLDN6結合可變區的人源化 儘管在各種帶有腫瘤的小鼠模型中，AE3-20/TR01均顯示出功效和良好的安全性，但AE3-20/TR01的CLDN6結合可變區是小鼠序列，其由於免疫原性(immunogenicity)高所以不適用於患者。進行AE3-20/TR01的CLDN6結合可變區的人源化。AE3-20/TR01的CD3結合可變區是人源化序列。
根據Kabat(Kabat et al., Sequence of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))，來編號AE3-20/TR01(AE3.20H，序列辨識號：1)的CLDN6結合VH的胺基酸殘基和AE3-20/TR01(AE3.20L，序列辨識號：2)的CLDN6結合VL的胺基酸殘基。
用人類生殖系列(human germline)框架(序列辨識號：3、4、5、6、7、8或9作為FR1，序列辨識號：10作為FR2，序列辨識號：11、12、13、14、15、16或17作為FR3，序列辨識號：18作為FR4)取代AE3.20H的框架，來設計49種VH。用人類生殖系列框架(序列辨識號：19、20、21或22作為FR1，序列辨識號：23作為FR2，序列辨識號：24、25、26或27作為FR3，序列辨識號：28作為FR4)取代AE3.20L的框架，來設計16種VL。將編碼AE3.20H和設計的VH的多核苷酸分別選殖到含有編碼重鏈恆定區SG1(胺基酸序列顯示於序列辨識號：80中)的多核苷酸的表現載體中。將編碼AE3.20L和設計的VL的多核苷酸分別選殖到含有編碼輕鏈恆定區SK1(胺基酸序列顯示於序列辨識號：81中)的多核苷酸的表現載體中。在Expi 293細胞中，包含AE3.20H和設計的VH的重鏈分別與包含AE3.20L的輕鏈一起瞬時表現，且包含設計的VL的輕鏈分別與包含AE3.20H的重鏈一起瞬時表現。
藉由FCM分析，來確定包含設計的VH和AE3.20L的抗體及包含設計的VL和AE3.20H的抗體與hCLDN6/BaF的結合。每種抗體的結合活性由平均螢光強度值(Mean Fluorescence Intensity value，MFI)表示。在4度C下將抗體與hCLDN6/BaF一起培養30分鐘，且用HEPES-BSA洗滌緩衝液(Nacalai Tesque，目錄號L3P8406)洗滌。然後添加山羊F(ab’)2 抗人類IgG、小鼠ads-PE(Southern Biotech，目錄2043-09)二抗，且在黑暗中於4°C培養30分鐘，然後洗滌。使用LSR Fortessa X-20(BD Biosciences)來執行數據採集，且用FlowJo軟體(Tree Star)來分析。
在49種設計的VH中，與包含AE3.20H的抗體相比，只有兩種VH(表2中所示)能夠改善抗體對人類CLDN6的結合活性。所示的16種設計的VL均未與AE3.20L一樣地有助於抗體對人類CLDN6的結合活性。在不折衷抗體的CLDN6結合活性的情況下，似乎難以將AE3.20L人源化。
(表2)
VH的名稱 CDRs 序列辨識號：
FR1 FR2 FR3 FR4
22H 與AE3.20的相同 3 10 14 18
25H 6 10 14 18
為了實現對人類CLDN6足夠的結合活性，合理地設計CLDN6結合VL(選擇與AE3.20L的對應框架相似的人類生殖系列框架序列，且亦嘗試在框架中導入反向突變(back mutation))。設計的VL(17L、18L、19L和20L)具有與AE3.20L相同的CDR序列，且其框架序列顯示於表3中。在18L、19L和20L的框架中採用反向突變亦顯示於表3中。在Expi 293細胞中瞬時表現包含VH 25H和選自17L、18L、19L和20L的VL的二價IgG抗體。圖10顯示藉由FCM分析來確定的各種抗體對hCLDN6/BaF的結合。每個抗體的結合活性由MFI表示。圖10中橫軸上的名稱表示每個抗體中所包含的VH和VL。
所有包含設計的VL(17L、18L、19L和20L)的抗體均顯示出比包含AE3.20L作為VL的抗體還弱的對人類CLDN6的結合活性，這亦指出將AE3.20L人源化而不折衷CLDN6結合活性的難度。然而，與包含不具有G66R突變的17L的抗體相比，包含具有G66R突變的20L的抗體顯示出對人類CLDN6更強的結合活性，表示輕鏈框架中第66位胺基酸的Gly取代為Arg有助於改善抗體對人類CLDN6的結合活性。
(表3)
VL的名稱 CDRs 序列辨識號： 與17L相比之胺基酸取代(反向突變)
FR1 FR2 FR3 FR4
17L 與AE3.20L的相同 19 23 24 29 -
18L 19 30 24 29 K45Q
19L 19 31 24 29 A43S, K45Q
20L 19 23 32 29 G66R
實施例 4，抗CLDN6人源化抗體的親和力成熟 為了改善人源化CLDN6結合可變區的結合親和力，將詳盡的單個或多個突變導入至AE3.20H和AE3.20L的CDR中，且序列辨識號：6作為重鏈FR1，序列辨識號：10作為重鏈FR2，序列辨識號：14作為重鏈FR3，序列辨識號：18作為重鏈FR4，序列辨識號：22或19作為輕鏈FR1，序列辨識號：23作為輕鏈FR2，序列辨識號：24或32作為輕鏈FR3，序列辨識號：28或29作為輕鏈FR4，以製備各種抗體變異株。抗體變異株表現於Expi293(Invitrogen)，且藉由蛋白A純化來純化。
藉由檢查抗體變異株的CLDN6結合活性，表4和表5中所示的胺基酸取代顯示可能有助於改善對人類CLDN6的結合活性。
(表4)
VH名稱 與AE3.20H相比，CDR中的胺基酸取代 框架 序列辨識號
25H0021 Y32L 與25H的相同 35
25H0024 Y32V 36
25H0042 T33V 37
25H0176 G53K 38
25H0322 D61F 39
25H0562 Y102M 40
25H0581 Y32L, D61F 34
(表5)
VL名稱 與AE3.20L相比，CDR中的胺基酸取代 框架 序列辨識號
20L0072 E27Y 與20L的相同 42
20L0532 E27Y, A50Y 43
使用Igawa等人(WO 2016159213)報導的Fab臂交換技術，將表4中所述的VH和表5中所述的VL與顯示出對人類CD3的結合活性(VH序列辨識號：70；VL序列辨識號：71)的可變區用來生成抗CLDN6/CD3雙特異性的抗體。於表6中顯示抗CLDN6/CD3抗體臂中所包含的可變區，且所生成的雙特異性抗體含有對Fcγ受體的親和力減弱的沉默Fc。
(表6)
抗體名稱 CLDN6結合VH CLDN6結合VL CD3結合VH CD3結合VL
序列辨識號 名稱 序列辨識號 名稱
25H0021/20L0072//TR01 35 25H0021 42 20L0072 序列辨識號：70 序列辨識號：71
25H0024/20L0072//TR01 36 25H0024 42 20L0072
25H0042/20L0072//TR01 37 25H0042 42 20L0072
25H0176/20L0072//TR01 38 25H0176 42 20L0072
25H0322/20L0072//TR01 39 25H0322 42 20L0072
25H0562/20L0072//TR01 40 25H0562 42 20L0072
25H0581/20L0072//TR01 34 25H0581 42 20L0072
25H/20L0532//TR01 33 25H 43 20L0532
25H0021/20L0532//TR01 35 25H0021 43 20L0532
25H0024/20L0532//TR01 36 25H0024 43 20L0532
25H0042/20L0532//TR01 37 25H0042 43 20L0532
25H0176/20L0532//TR01 38 25H0176 43 20L0532
25H0322/20L0532//TR01 39 25H0322 43 20L0532
25H0562/20L0532//TR01 40 25H0562 43 20L0532
25H0581/20L0532//TR01 34 25H0581 43 20L0532
AE3-20/TR01 1 AE3.20H 2 AE3.20L
圖11顯示了在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，藉由參考實施例3中所述的方法來確定的如表6中所示的10 nM的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性。實施例2-3中生成的KLH/TR01作為陰性對照。
與AE3-20/TR01相比，在hCLDN6/BaF的存在下，一些雙特異性抗體，例如25H0322/20L0072//TR01和25H0562/20L0072//TR01顯示出較低的T細胞活化活性。
與AE3-20/TR01相比，在hCLDN9/BaF和hCLDN4/BaF的存在下，一些雙特異性抗體，例如25H0581/20L0072//TR01和25H0581/20L0532//TR01顯示出較高的T細胞活化活性。
但是與AE3-20/TR01相比，在hCLDN6/BaF的存在下，幾種雙特異性抗體顯示出類似的T細胞活化活性，而在hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，則沒有顯示較高的T細胞活化。
胞外基質(extracellular matrix，ECM)是一種胞外組成，且位於體內各個位置。因此，強烈結合至ECM的抗體已知在血液中具有較差的動力學(較短的半衰期)(WO2012093704 A1)。
評估了包含表7中所示的VH和VL的二價IgG抗體的ECM結合。每種抗體的ECM結合值(ECL反應)除以在同一盤或相同執行日期獲得的抗體MRA(VH：序列辨識號：66，VL：序列辨識號：67)的ECM結合值，且於表7中顯示所產生的值。如表7中所示，抗體的ECM結合變化很大。
(表7)ECM結合結果
抗體名稱 冷光 與MRA比較的冷光比 序列辨識號：
VH VL CH CL
MRA(negative control) 13043.5 1.00 66 67 80 81
25H0021/20L0072 32891.5 2.52 35 42
25H0024/20L0072 29640.5 2.27 36
25H0042/20L0072 40377.5 3.10 37
25H0176/20L0072 77022 5.91 38
25H0322/20L0072 70573.5 5.41 39
25H0562/20L0072 32630.5 2.50 40
上述實驗的結果指出，難以同時具有所有較佳的特性，包含對CLDN6的結合活性高、對CLDN6的結合特異性高(對CLDN3、CLDN4和CLDN9的結合活性低)和低ECM結合。例如，與彼此相比，儘管抗體中只有少數的胺基酸差異，但與包含AE3.20H作為VH的抗體相比，包含25H0322或25H0562作為VH的抗體對CLDN6顯示較差的結合活性；包含25H0581作為VH的抗體對CLDN6顯示較差的結合特異性；從ECM結合的觀點而言，包含25H0176或25H0322作為VH的抗體並不是最佳的變異株。
考慮到對人類CLDN6的結合活性和特異性，以及ECM結合，包含25H或25H0042作為VH，20L0532作為VL的抗體用於進一步的改造。
實施例 5，抗體最佳化 藉由Fab臂交換技術製備的雙特異性抗體不適合用於大規模提供化合物的純化和生產製程。為了改善雙特異性抗體的可製造性，如下進行進一步的最佳化。
實施例 5-1，去除降解熱點 為了避免化學降解例如環化、異構化、切割和甲硫胺酸氧化，換句話說，為了提高抗體的穩定性，CDR內的對應序列中的一些胺基酸殘基被取代。被發現進一步改善CLDN6結合可變區的結合親和力和特異性的胺基酸取代也被導入至CDR中。
表8中顯示VH的名稱和與25H0042相比的胺基酸取代。表9中顯示VL的名稱和與20L0532相比的胺基酸取代。使用Igawa等人(WO2016159213)報導的Fab臂交換技術，將表8中所述的VH和表9中所述的VL以及顯示出對人類CD3的結合活性的可變區(VH序列辨識號：70；VL序列辨識號：71)用來生產抗CLDN6/CD3雙特異性抗體。表10中顯示抗CLDN6/CD3抗體臂中所包含的可變區，且生產的雙特異性抗體含有對Fcγ受體的親和力減弱的沉默Fc。
(表8)
VH名稱 與25H0042相比，CDR中的胺基酸取代 序列辨識號
25H0671 M34G, G54V, S62V, Y97F 45
(表9)
VL名稱 與20L0532相比，CDR中的胺基酸取代 序列辨識號
20L0571 S31L, Y50L, D56I 46
(表10)
抗體名稱 CLDN6結合VH CLDN6結合VL CD3結合VH CD3結合VL
25H0671/20L0571//TR01 25H0671 20L0571 序列辨識號：70 序列辨識號：71
AE3-20/TR01 AE3.20H AE3.20L
CS2201 25H 20L0532
圖12顯示了在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，藉由參考實施例3中描述的方法來確定的10 nM的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性。與CS2201相比，在hCLDN6/BaF的存在下，25H0671/20L0571//TR01誘導了相當的T細胞活化，而與CS2201相比，在hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，沒有顯示出較高的T細胞活化。
實施例 5-2，pI的改造 在雙特異性抗體的製備中，當兩種類型的重鏈和兩種類型的輕鏈用於表現時，理論上會表現十種類型的重鏈和輕鏈組合。為了能夠藉由分開這十種類型的抗體輕易地純化出感興趣的雙特異性抗體，進行了胺基酸修飾以降低CLDN6結合VH和VL的等電點(isoelectric point，pI)。
為了評估各種胺基酸取代的pI降低效果，胺基酸取代導入至VH 25H0671和VL 20L0571中，以減少帶正電荷的胺基酸(如精胺酸和離胺酸)的數量，同時增加帶負電荷的胺基酸(例如天門冬胺酸和麩胺酸)。表11顯示了pI改造後的VH變異株，而表12顯示了pI改造後的VL變異株。
(表11)
VH名稱 與25H0671相比，FR中的胺基酸取代 序列辨識號
57H0671 R16D, Q43E, N73D 47
65H0671 R16G, A84D, Q105E 50
(表12)
VL名稱 與20L0571相比，FR中的胺基酸取代 序列辨識號
53L0571 K45E, S60D 53
54L0571 K45E, S60D, L104V, K107E 54
包含選自表11的VH和選自表12的VL的二價IgG抗體用於計算理論pI。產生的二價IgG抗體包含相同的IgG恆定區。藉由與先前所述相同的方法，使用GENETYX-SV/RC Ver 14.0.0(GENETYX CORPORATION)來計算抗體的理論pI。表13中顯示計算出的理論pI值。
(表13)理論pI
抗體名稱 VH VL 理論pI
25H0671/20L0571_二價 25H0671 20L0571 8.04
57H0671/20L0571_二價 57H0671 20L0571 7.54
65H0671/20L0571_二價 65H0671 20L0571 7.69
25H0671/53L0571_二價 25H0671 53L0571 7.69
25H0671/54L0571_二價 25H0671 54L0571 7.37
65H0671/53L0571_二價 65H0671 53L0571 7.19
65H0671/54L0571_二價 65H0671 54L0571 6.83
使用Igawa等人(WO2016159213)報導的Fab臂交換技術，將表14中所述的CLDN6結合可變區以及顯示出對人類CD3的結合活性的可變區(VH序列辨識號：70；VL序列辨識號：71)用來生產抗CLDN6/CD3雙特異性抗體。生產的雙特異性抗體含有對Fcγ受體的親和力減弱的沉默Fc。
(表14)
抗體名稱 CLDN6結合 VH CLDN6結合 VL CD3結合VH CD3結合VL
AE3-20/TR01 AE3.20H AE3.20L 序列辨識號：70 序列辨識號：71
57H0671/20L0571//TR01 57H0671 20L0571
65H0671/20L0571//TR01 65H0671 20L0571
25H0671/20L0571//TR01 25H0671 20L0571
25H0671/53L0571//TR01 25H0671 53L0571
25H0671/54L0571//TR01 25H0671 54L0571
圖13顯示了在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，藉由參考實施例3中描述的方法來確定在CLDN6結合VH(57H0671/20L0571//TR01和65H0671/20L0571//TR01)中經過pI改造的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性。
根據理論pI、T細胞活化活性和框架的序列，來選擇65H0671的框架進行進一步評估。
圖14顯示了在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，藉由參考實施例3中描述的方法來確定在CLDN6結合VL(25H0671/53L0571//TR01和25H0671/54L0571//TR01)中經過pI改造的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性。
根據理論pI和T細胞活化活性，來選擇54L0571的框架進行進一步評估。
使用Igawa等人(WO2016159213)報導的Fab臂交換技術，將表15中所述的CLDN6結合可變區以及顯示出對人類CD3的結合活性的可變區(VH序列辨識號：70；VL序列辨識號：71)用來生產抗CLDN6/CD3雙特異性抗體。生產的雙特異性抗體含有對Fcγ受體的親和力減弱的沉默Fc。
(表15)
抗體名稱 CLDN6結合VH CLDN6結合VL
65H0671/54L0571//TR01 65H0671 54L0571
25H0671/20L0571//TR01 25H0671 20L0571
圖15顯示了在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，藉由參考實施例3中描述的方法來確定之在CLDN結合VH和CLDN6結合VL中經pI改造的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性。結果指出65H0671/54L0571//TR01對人類CLDN6的結合活性和結合特異性與25H0671/20L0571//TR01相當。
實際上，還使用具有cIEF匣(PS-MC02-C)的Maurice(ProteinSimple)來確定包含所選框架的抗體的pI值。抗體中的恆定區與表13中所示的相同。進行樣品裝載55秒。之後，在1500V下進行聚焦1分鐘，且在3000V下進行聚焦6分鐘。螢光散發檢測於330 nm和280 nm激發，結合280 nm的標準UV吸光度。螢光曝光時間為3秒、5秒、10秒和20秒。對於陽極電解液，使用配在0.1% 甲基纖維素中的80 mM磷酸，而對於陰極電解液，使用配在0.1% 甲基纖維素中的100 mM氫氧化鈉。每個樣品溶液均含有定量的0.017 mg/ml樣品、5% Pharmalyte 3-10、0.42% 甲基纖維素、3.6M 尿素、10mM Arg、1% pI標記物4.05和1% pI標記物9.99。使用相關的軟體Compass for iCE(2.0.10)來分析數據。
(表16)
抗體名稱 pI
25H0671/20L0571_二價 9.12
65H0671/54L0571_二價 7.49
如表16中所示，測得的65H0671/54L0571_二價的pI為7.49，其低於未經pI改造胺基酸修飾的抗體25H0671/20L0571_二價的pI。
實施例 5-3，重鏈和輕鏈配對的控制 在雙特異性抗體的製備中，當兩種類型的重鏈和兩種類型的輕鏈用於表現時，理論上會表現十種類型的重鏈和輕鏈組合。由於這些組合中只有一種是感興趣的雙特異性抗體，所以獲得感興趣的雙特異性抗體需要從10種不同抗體的混合物中純化出一種感興趣的抗體，這是非常沒有效率且困難的。作為解決此問題的手段，將「杵(knob)」和「臼(hole)」修飾(KiH：杵入臼(knob into hole))導入到IgG H鏈的CH3域中，如此一來會傾向分泌結合了兩條不同H鏈的IgG，且為了更有效率地獲得感興趣的分子，在可變區和CH1-CL域界面中進行胺基酸取代及其組合以促進所欲的H鏈-L鏈結合(參見WO2013065708)。
胺基酸取代Q39K導入到序列辨識號：70所示的CD3結合VH中，且胺基酸取代Q38E導入到序列辨識號：71所示的CD3結合VL中。經胺基酸取代的CD3結合VH和VL的序列分別顯示於序列辨識號：60和序列辨識號：61中。
胺基酸取代Q39E導入到CLDN6結合VH 65H0671中，且胺基酸取代Q38K導入到CLDN6結合VL 54L0571中。經胺基酸取代的CLDN6結合VH和VL分別命名為65H0671Q39E(序列辨識號：57)和54L0571Q38K(序列辨識號：58)。
CLDN6結合VH 65H0671Q39E連接至序列辨識號：95所示的第一CH1域區，CLDN6結合VL 54L0571Q38K連接至序列辨識號：59所示的第一CL域，以製成序列辨識號：96中所示的第一輕鏈。序列辨識號：60所示的CD3結合VH連接至序列辨識號：97中所示的第二CH1域，序列辨識號：61所示的CD3結合VL連接至序列辨識號：62中所示的第二CL域，以製成序列辨識號：98中所示的第二輕鏈。與天然結構域相比，CH1域和CL域亦含有胺基酸取代，其為：第一CH1域中第147、175和213位的Glu(E)；在第一CL域中第123、131、160和180位的Lys(K)；第二CH1域中胺基酸第175位的Lys(K)；第二CL域中胺基酸第131、160和180位的Glu(E)。第一CH1域進一步連接至第一鉸鏈-CH2-CH3區，以製成序列辨識號：99所示的第一重鏈，第二CH1域進一步連接至第二鉸鏈-CH2-CH3區，以製成序列辨識號：100所示的第二重鏈。因此，生產了抗體CS2425(第一重鏈序列辨識號：99，第一輕鏈序列辨識號：96，第二重鏈序列辨識號：100，第二輕鏈序列辨識號：98)。
使用具有cIEF匣(PS-MC02-C)的Maurice(ProteinSimple)，來評估CS2425的電荷異質性。進行樣品裝載55秒。之後，在1500V下進行聚焦1分鐘，且在3000V下進行聚焦6分鐘。檢測於280 nm的UV吸光度。對於陽極電解液，使用配在0.1% 甲基纖維素中的80 mM磷酸，而對於陰極電解液，使用配在0.1% 甲基纖維素中的100 mM氫氧化鈉。每個樣品溶液均含有定量的0.085 mg/ml樣品、2% Pharmalyte 5-8、2% Pharmalyte 8-10.5、0.42% 甲基纖維素、3.6M 尿素、10mM Arg、1% pI標記物5.85和1% pI標記物10.17。使用相關的軟體Compass for iCE(2.0.10)來分析數據。
圖16(A)顯示當上述所製的第一重鏈、第一輕鏈、第二重鏈和第二輕鏈一起表現時，CS2425(65H0671Q39E-SG1189v14k/54L0571Q38K-SK1018// TR01H(Q39K)-SG1191v14h/TR01L(Q38E)-SK1017)的電荷異質性。電泳圖顯示這兩個突變都具有良好的HH和HL控制，因為除了pI 9.0附近的主峰外，沒有其他明顯的峰。
實施例 5-4，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的抗腫瘤功效和安全性分析 使用OV-90 T細胞注射模型，來確定實施例5-1中製造的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體CS2201的體內抗腫瘤功效。AE3-20/TR01作為比較。在用0.1 mg/kg的雙特異性抗體治療的小鼠中，CS2201對OV-90 T細胞注射模型的功效優於AE3-20/TR01(圖17)。另一方面，CS2201和AE3-20/TR01於5 mg/kg顯示相當的抗腫瘤功效(圖18)。關於CS2201的肝毒性，從血液測試的結果未觀察到肝毒性標記物的異常(圖19)。再者，發現CS2201和AE3-20/TR01的PK特性是相當的(圖20)。在0.1 mg/kg組中，CS2201和AE3-20/TR01的血漿半衰期(T1/2 )分別為3.64天和3.48天。在0.1 mg/kg組中，CS2201和AE3-20/TR01之從零至無限大的血漿濃度-時間曲線下的面積(AUCinf )分別為1.83和2.35天*μg/mL。
使用OV-90 T細胞注射模型，來檢驗抗CLDN6/CD3雙特異性抗體CS2425的抗腫瘤功效和毒性。用0.1 mg/kg或5 mg/kg的CS2425，來治療接種OV-90細胞的小鼠，且檢驗腫瘤體積和體重。
在給予0.1 mg/kg的CS2425的小鼠中觀察到顯著的腫瘤消退。在此治療組中，基於抗體投予後小鼠的體重變化和一般狀況的結果，未觀察到毒性跡象(圖21A)。然而，用5 mg/kg的CS2425治療的小鼠顯示出顯著的體重減輕(圖21B)。與嚴重的體重變化一致，在所有接受5 mg/kg的CS2425的動物中，肝損傷的血液標記物均急劇升高(圖22)。
亦計算CS2425的循環水平。如實施例2-4中所述，0.1 mg/kg組於注射後第4天、第13天，而5 mg/kg組於注射後第4天、第6天，將由三隻動物製備的血漿樣品用於PK分析。圖23代表投予後CS2425的血漿濃度隨時間變化的過程。
實施例 6：CLDN6結合可變區的再改造 實施例 6-1：使用人類PBMC的體外免疫原性研究及控制重鏈和輕鏈配對的胺基酸取代的再選擇 生成表17中所示的二價IgG抗體。已知抗體A具有低免疫原性，且在免疫原性研究中作為陰性對照。已知具有高免疫原性的抗hA33抗體在免疫原性研究中作為陽性對照。
(表17)
抗體名稱 重鏈 輕鏈
CS2419 序列辨識號：101(包含與CS2425的相同的CLDN6結合VH) 抗體A輕鏈
CS2421 抗體A重鏈 序列辨識號：96中所示的CS2425的CLDN6結合輕鏈
如WO/2018/124005(Kubo C.等人)中所述，在展現出主動增殖之前，藉由使用IL-2分泌CD4+ T細胞的比例作為指標，來評估抗體的免疫原性潛力。具體而言，從人類PBMC製備CD8- CD25low PBMC，且在抗體的存在下將細胞培養67小時。圖24顯示出培養的細胞群中的IL-2分泌細胞的比例的確定結果。如圖24中所示，與抗體A的頻率相比，CS2419的陽性供給體的頻率較低。另一方面，CS2421的陽性供給體頻率近似於抗hA33抗體的陽性供給體頻率。因此，使用IL-2分泌CD4+ T細胞的比例作為指標，CS2419被認為不具有高免疫原性潛力，但CS2421重組抗體具有高免疫原性潛力。根據結果，序列辨識號：96中所示的CS2425的CLDN6結合輕鏈被認為涉及潛在的T細胞抗原結合位。
為了從CS2425的CLDN6結合輕鏈中鑑定出潛在的T細胞抗原結合位，如US20050202009A1(Kropshofer H.等人)和mAbs 2018; 10: 1168-81(Sekiguchi N.等人)中所述，以CS2425進行MHC相關胜肽蛋白質體學(MHC associated peptide proteomics，MAPPs)。從人類PBMC製備單核球，且將細胞分化為樹突細胞(dendritic cell，DC)。在LPS的存在下，用抗體激發DC，且在清潔劑TX-100中溶解。在免疫沉澱過程中，使用與抗HLA-DR抗體偶聯的磁珠，從裂解的DC中獲得胜肽-MHC II複合物，且藉由LC/Orbitrap MS/MS技術來分析用0.1% TFA洗脫的HLA-DR相關胜肽。圖25中顯示CS2425的輕鏈的一部分中的MAPP的熱點圖。如圖25中所示，在胺基酸第180位含有Lys的CS2425的CLDN6結合輕鏈的區域(序列辨識號167〜184)中，許多胜肽被鑑定為潛在的T細胞抗原決定基。因此，第180位的胺基酸取代被認為可能在CS2425的CLDN6結合輕鏈中生成潛在的T細胞抗原決定基。
根據免疫原性分析的結果，與CLDN6結合VL連接的CL中的胺基酸取代T180K引起了高風險的免疫原性，因此未採用此突變來製造抗CLDN6/CD3雙特異性抗體。
CLDN6結合VH 65H0671Q39E連接至序列辨識號：95所示的第一CH1域區，CLDN6結合VL 54L0571Q38K連接至序列辨識號：63所示的第一CL域，以製成序列辨識號：102中所示的第一輕鏈。序列辨識號：60所示的CD3結合VH連接至序列辨識號：97中所示的第二CH1域，序列辨識號：61所示的CD3結合VL連接至序列辨識號：62中所示的第二CL域，以製成序列辨識號：98中所示的第二輕鏈。與天然結構域相比，CH1域和CL域亦含有胺基酸取代，其為：第一CH1域中第147、175和213位的Glu(E)；在第一CL域中第123、131和160位的Lys(K)；第二CH1域中胺基酸第175位的Lys(K)；和第二CL域中胺基酸第131、160和180位的Glu(E)。第一CH1域進一步連接至第一鉸鏈-CH2-CH3區，以製成序列辨識號：99所示的第一重鏈，第二CH1域進一步連接至第二鉸鏈-CH2-CH3區，以製成序列辨識號：100所示的第二重鏈。因此，生產了抗體65H0671Q39E-SG1189v14k/54L0571Q38K-SK1021//TR01H(Q39K)-SG1191v14h/TR01L(Q38E)-SK1017(第一重鏈序列辨識號：99，第一輕鏈序列辨識號：102，第二重鏈序列辨識號：100，第二輕鏈序列辨識號：98)。
使用具有cIEF匣(PS-MC02-C)的Maurice(ProteinSimple)，來評估電荷異質性。進行樣品裝載55秒。之後，在1500V下進行聚焦1分鐘，且在3000V下進行聚焦6分鐘。檢測於280 nm的UV吸光度。對於陽極電解液，使用配在0.1% 甲基纖維素中的80 mM磷酸，而對於陰極電解液，使用配在0.1% 甲基纖維素中的100 mM氫氧化鈉。每個樣品溶液均含有定量的0.085 mg/ml樣品、2% Pharmalyte 5-8、2% Pharmalyte 8-10.5、0.42% 甲基纖維素、3.6M 尿素、10mM Arg、1% pI標記物5.85和1% pI標記物10.17。使用相關的軟體Compass for iCE(2.0.10)來分析數據。
圖16(B)顯示當上述所製的第一重鏈、第一輕鏈、第二重鏈和第二輕鏈一起表現時，所產生的抗體的電荷異質性。電泳圖顯示這兩個突變都具有良好的HH和HL控制，因為除了pI 9.0附近的主峰外，沒有其他明顯的峰。
生產了表18中所示的二價IgG抗體。
(表18)
抗體名稱 重鏈 輕鏈
CS2652 抗體A重鏈 54L0571Q38K-SK1021
在CS2652的輕鏈中，CLDN6結合VL 54L0571Q38K連接至序列辨識號：63所示的CL域，以製成序列辨識號：102所示的輕鏈。與天然結構域相比，CL域含有胺基酸取代，其為：第123、131和160位的Lys(K)。
藉由將IL-2分泌CD4+ T細胞的比例作為指標，來評估抗體的潛在免疫原性。如圖26中所示，CS2652的陽性供給體頻率與抗體A的陽性供給體頻率類似。因此，此抗體被認為不具有高免疫原性潛力。
實施例 6-2：CLDN6結合可變區變異株的生成 儘管在小鼠中AE3-20/TR01和CS2201顯示出強大的功效而沒有任何毒性，但在小鼠中CS2425出乎意料地造成了嚴重的肝損傷。我們推測，實施例5中所述的CLDN6結合可變區中的胺基酸序列的修飾可能對抗體的性質有影響，隨後引起毒性。為了確認哪個修飾影響抗體而引起肝毒性，建構了與CS2425相比具有較少胺基酸取代的CLDN6結合可變區變異株。
使用Igawa等人(WO2016159213)報導的Fab臂交換技術，將所建構的CLDN6結合可變區變異株以及對人類CD3顯示出結合活性的可變區(VH序列辨識號：70；VL序列辨識號：71)用來生產抗CLDN6/CD3雙特異性抗體。表19和表20中顯示抗CLDN6/CD3抗體中所包含的可變區，且表21中所示的生產的雙特異性抗體含有對Fcγ受體的親和力減弱的沉默Fc。
亦藉由如實施例4中所述的方法，來評估這些抗體的ECM結合。結果，所有這些抗體均顯示出低ECM結合。
(表19)
CLDN6結合VH名稱 與25H相比，CDR中的胺基酸取代 與25H相比，FR中的胺基酸取代 序列辨識號
25H - - 33
65H 無 R16G, A84D, Q105E 84
65HQ39E 無 R16G, A84D, Q105E, Q39E 85
25HQ39E 無 Q39E 83
65H0671 T33V, M34G, G54V, S62V, Y97F R16G, A84D, Q105E 50
(表20)
CLDN6結合VL名稱 與20L0532相比，CDR中的胺基酸取代 與20L0532相比，FR中的胺基酸取代 序列辨識號
20L0532 - - 43
54L0532 無 K45E, S60D, L104V, K107E 86
54L0532Q38K 無 K45E, S60D, L104V, K107E, Q38K 87
20L0532Q38K 無 Q38K 88
54L0571 S31L, Y50L, D56I K45E, S60D, L104V, K107E 54
(表21)
抗體名稱 CLDN6結合VH CLDN6結合VL 序列辨識號：
CD3結合VH CD3結合VL 連接至CLDN6結合VH的CH1 連接至CLDN6結合VL的CL 連接至CD3結合VH的CH1 連接至CD3結合VL的CL
CS2884 65H 54L0532 70 71 103 81 103 81
CS2885 25H 54L0532 103 81 103 81
CS2886 65H 20L0532 103 81 103 81
CS2958 65HQ39E 54L0532Q38K 95 63 97 62
CS2959 25HQ39E 20L0532Q38K 95 63 97 62
CS2960 65H0671 54L0571 103 81 103 81
實施例 6-3，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的功效和毒理學評估 為了評估所生產的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的抗腫瘤功效和安全性，藉由OV-90 T細胞注射模型，如下進行體內小鼠研究。用5 mg/kg的CS2201、CS2425、CS2884、CS2885、CS2886、CS2958、CS2959和CS2960投予帶有OV-90腫瘤的小鼠，然後計算腫瘤體積和體重。治療後也收集血液，然後用於分析肝損傷標記物的血漿水盛。
圖27指出除了CS2201和CS2425之外，使用CS2884、CS2885和CS2886的體內實驗的結果。如表21中所述，這些部分最佳化的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體包含實施例5-2中所述的胺基酸取代。如圖27中所示，CS2884、CS2885和CS2886對OV-90腫瘤顯示生長抑制作用。除完全最佳化的CS2425外，接受這些抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的小鼠中，體重和肝損傷標記物均無變化。此結果指出實施例5-2中所述的胺基酸取代不是肝損傷的原因(圖28)。
圖29指出除了CS2201和CS2425之外，使用CS2958、CS2959和CS2960的體內實驗的結果。如表21中所述，CS2958包含實施例5-2和實施例5-3中所述的胺基酸取代，CS2959僅包含實施例5-3中所述的可變區胺基酸取代，CS2960包含實施例5-1和實施例5-2中所述的胺基酸取代。如圖29中所示，這些抗CLDN6/CD3雙特異性抗體降低了腫瘤生長，然而，在CS2425和CS2960治療組中觀察到體重顯著降低。與體重減輕一致，在CS2425和CS2960治療組中也發現肝毒性標記物顯著升高(圖30)。
顯示CS2425和CS2960引起肝損傷的結果表示實施例5-1中所述的胺基酸取代很有可能是造成毒性的原因。
如圖31中所示，CS2201、CS2958、CS2959和CS2960的血漿半衰期(T1/2 )分別為3.26、3.77、3.68和3.45天。CS2201、CS2958、CS2959和CS2960之從零至無限大的血漿濃度-時間曲線下的面積(AUCinf )分別為90.0、134、106和117天*μg/mL。
實施例 6-4，Fc最佳化 為了選擇Fc區，生產了如表22中所示的幾種Fc變異株。將降低Fc區對Fcγ受體的結合活性的胺基酸突變(FcgR沉默突變)、去醣基化突變和促進重鏈異質二聚化的突變導入(如WO2006106905中所述)。
(表22)
Fc名稱 FcgR沉默突變 去糖基化突變 穩定化突變 重鏈異質 序列辨識號
SG1212 L234A, L235A, A327G, A330S, P331S N297A S239K K439E 72
SG1213 L234A, L235A, A327G, A330S, P331S N297A S239K E356K 73
SG1260 L234A, L235A, A327G, A330S, P331S N297A K439E 74
SG1261 L234A, L235A, A327G, A330S, P331S N297A E356K 75
SG1323 L234A, L235A N297A S239K K439E 76
SG1324 L234A, L235A N297A S239K E356K 77
SG1325 L234A, L235A N297A K439E 78
SG1326 L234A, L235A N297A E356K 79
實施例 6-5，CS2961、CS3346、CS3347和CS3348的生產 藉由使用這些Fc變異株，建構了表23中所示的四種雙特異性抗體。
(表23)
  抗體名稱
CS2961 CS3346 CS3347 CS3348
CLDN6結合VH 65HQ39E
連接至CLDN6結合VH的第一CH1 序列辨識號：95
透過鉸鏈域連接至第一CH1的Fc區 SG1212 SG1260 SG1323 SG1325
CLDN6結合重鏈 序列辨識號：104 序列辨識號：105 序列辨識號：106 序列辨識號：107
CLDN6結合VL 54L0532Q38K
連接至CLDN6結合VL的第一CL SK1021 SK1021 SK1021 SK1021
CLDN6結合輕鏈 序列辨識號：112 序列辨識號：112 序列辨識號：112 序列辨識號：112
CD3結合VH 序列辨識號：60
連接至CD3結合VH的第二CH1 序列辨識號：97
透過鉸鏈域連接至第二CH1的Fc區 SG1213 SG1261 SG1324 SG1326
CD3結合重鏈 序列辨識號：108 序列辨識號：109 序列辨識號：110 序列辨識號：111
CD3結合VL 序列辨識號：61
連接至CLDN6結合VL的第二CL SK1017 SK1017 SK1017 SK1017
CD3結合輕鏈 序列辨識號：98 序列辨識號：98 序列辨識號：98 序列辨識號：98
實施例 7，CS2961、CS3346、CS3347和CS3348的特性化 實施例 7-1，在CLDN家族蛋白表現細胞的存在下，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性 圖32顯示在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、hCLDN9/BaF或hCLDN6(Q156L)/ BaF的存在下，藉由參考實施例3中所述方法來確定各種濃度的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體(AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425和CS2961)的T細胞活化活性。在hCLDN6/BaF的存在下，我們所有的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體均誘導T細胞活化。此外，在hCLDN4/BaF和hCLDN6(Q156L)/BaF的存在下，10 nM的AE3-20/TR01比其他抗CLDN6/CD3雙特異性抗體誘導高一點的T細胞活化，而在hCLDN9/BaF的存在下，10 nM的6PHU3/TR01誘導高一點的T細胞活化。
圖33顯示在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，藉由參考實施例3中所述方法來確定各種濃度之例如CS2201、CS2961、CS3346、CS3347和CS3348的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性。在hCLDN6/BaF的存在下，我們所有的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體均誘導T細胞活化，且在hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF和hCLDN9/BaF的存在下，我們所有的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體均未觀察到T細胞活化。
實施例 7-2，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞依賴性細胞毒殺性的測量 圖34顯示抗CLDN6/CD3雙特異性抗體(AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425、CS2961、CS3346、CS3347和CS3348)對表現CLDN6的OVCAR3卵巢癌細胞株的T細胞依賴性細胞毒殺性。使用人類PBMC(S​​temCell)並藉由LDH測定，來評估細胞的細胞毒殺性。將20,000個目標細胞和200,000個人類PBMC(E / T = 10)接種至96孔U底盤的每個孔中，且在37度C和5% CO2 下與各種濃度的抗體培養24小時。藉由LDH細胞毒殺性檢測套組(Takara Bio)，來測量目標細胞的殺死。使用以下算式來計算每種抗體的細胞毒殺活性(%)。 細胞毒殺活性(%)=(A - B - C)  x 100 /(D - C) 「A」代表用抗體和PBMC處理的孔的吸光度，「B」代表僅有效應細胞PBMC的平均吸光值，「C」代表僅未經處理的目標細胞的平均吸光值，且「D」代表用Triton-X溶解的孔的平均值。已經計算並減去了背景吸光值。我們所有的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體均對OVCAR3細胞顯示出T細胞依賴性細胞毒殺性。
實施例 7-3，CS2961對CLDN家族的特異性FACS分析 在CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9中，胺基酸序列是高度保守的。因此，我們藉由FACS分析來檢驗CLDN6結合特異性。將hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF和hCLDN9/BaF與15 μg/ml的CS2201、CS2961、AH05/TR01和6PHU3/TR01一起培養。實施例2-3中生產的KLH/TR01作為染色對照。用Alexa Fluor 488偶聯的抗人類IgG(Invitrogen)來檢測每種抗體的結合。藉由eFlour 780(Invitrogen)染色來分離死細胞。
如圖35-1和35-2中所示，所有抗CLDN6/CD3雙特異性抗體均顯示出與hCLDN6/BaF的強結合。在評估的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體中，CS2961對CLDN6顯示出最好的特異性。
實施例 7-4，穩定性 評估CS2961、CS3346、CS3347和CS3348的穩定性。每種抗體以pH 7.4的PBS進行透析，且回收後將濃度調整至1 mg/mL。於5℃和40℃儲存樣品一周，且於40℃儲存樣品兩週。儲存後，使用SWXL G3000管柱(TOSOH)，其中pH 7.0的50 mM磷酸鈉、300 mM NaCl作為運行緩衝液，來進行SEC分析。藉由UV檢測器(280nm)進行檢測。使用Empower 3軟體(Waters)來分析層析圖。
圖36中顯示的結果指出，所有抗體均顯示出良好的穩定性，這肯定比雙特異性sc(Fv)2 分子的穩定性好很多。
實施例 7-5，體內功效和安全性 為了評估CS2961的抗腫瘤功效和安全性，進行如下體內小鼠研究。以5 mg / kg的純化CS2961投予帶有OV-90腫瘤的小鼠，然後計算腫瘤體積和體重。治療後也收集血液，然後用於分析肝損傷標記物的血漿水平。
圖29顯示使用CS2961的體內實驗的結果。如圖29中所示，CS2961減少了腫瘤體積，而沒有降低經治療的小鼠的體重，也沒有增加肝臟毒性標記物(圖30)。
如圖31中所示，CS2961的血漿半衰期(T1/2 )為11.2天，CS2961之從零至無限大的血漿濃度-時間曲線下的面積(AUCinf )為486天*μg/mL。這些結果指出，與藉由Fab臂交換技術生產的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體相比，CS2961顯示較慢的清除速率。
在小鼠中，CS2961對OV-90腫瘤顯示出有潛力的抗腫瘤活性和良好的安全性與PK概貌。再者，此抗體顯示出改善的穩定性、更好的異質二聚體形成，這對於大規模生產是較佳的。由於實施例5-2中所述的胺基酸取代，CS2961也更易於純化。
實施例 7-6，劑量依賴性體內功效 如實施例2-4中所述，使用OV-90 T細胞注射模型，來比較CS3348與AE3-20/TR01的體內效力。
在小鼠中的腫瘤體積達到約200mm3 之後，將動物隨機分組並投予每種雙特異性抗體或媒液。圖37顯示用AE3-20/TR01治療的小鼠的腫瘤生長，而圖38顯示用CS3348治療的小鼠的腫瘤生長。在實驗中，癌細胞OV-90在第0天移植到小鼠中，在第14天將各種劑量的AE3-20/TR01投予至小鼠中，且在第15天將各種劑量的CS3348投予至小鼠中。所有小鼠接受一次投予。
在AE3-20/TR01和CS3348中均以劑量依賴性方式觀察到對OV-90腫瘤的顯著功效，而在所有劑量下均無觀察到體重減輕。
值得注意的是，在用0.04 mg/kg的CS3348治療的小鼠中觀察到腫瘤消退，而在用1 mg/kg的AE3-20/TR01治療的小鼠中觀察到了腫瘤消退。換句話說，CS3348的抗腫瘤功效可能是AE3-20/TR01的約25倍。
實施例 8，體內抗腫瘤功效和毒性研究 使用帶有腫瘤的小鼠模型，來評估抗體的體內功效和毒性。將表現人類密連蛋白6的人類癌細胞株OVCAR-3、NCI-H1435或NUGC-3皮下移植到NOD/ShiJic-scid小鼠中。當腫瘤尺寸達到約200 mm3 時，將帶有腫瘤的小鼠隨機分為接受媒液對照組或Ab的治療組(稱為T細胞注射模型)。即，使用T細胞注射模型，在針對OVCAR-3、NCI-H1435或NUGC-3的功效測試中進行了以下測試。使用人類PBMC(AllCells)和T細胞活化/擴增套組(Miltenyi Biotec)執行T細胞擴增。將1 x 107 個癌細胞和基質膠基底膜基質(BD)混合，且皮下移植到NOD/ShiJic scid小鼠的側面區域(CLEA Japan、母鼠、6至7週大)。將移植當天定義為第0天。根據腫瘤尺寸和體重隨機分組後，以每隻小鼠0.2 mg的劑量，腹腔投予抗無唾液酸(asialo)GM1抗體(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)。隔天，將藉由擴增培養物收集的T細胞，以3 x 107 個細胞/小鼠來腹腔植入。在表24中顯示組別的詳細訊息。T細胞移植後約4小時，靜脈投予CS3348。僅投予CS3348一次。測量腫瘤塊的長度(L)和寬度(W)和體重，且腫瘤體積(TV)計算為：TV =(L x W x W)/2。在圖40至42(圖40：帶有OVCAR-3的小鼠，圖41：帶有NCI-H1435的小鼠，和圖42：帶有NUGC-3的小鼠)中所示，CS3348對這3種癌細胞株顯示出明顯的劑量依賴性抗腫瘤活性且無任何毒性，包含體重減輕。
(表24)用於評估體內抗腫瘤療功效的研究組別詳細訊息 a. TK220001中的研究組別(帶有OVCAR-3的小鼠)
組別 抗體 劑量
1 媒液
2 CS3348 0.0008 mg/kg
3 CS3348 0.004 mg/kg
4 CS3348 0.02 mg/kg
5 CS3348 0.1 mg/kg
6 CS3348 0.5 mg/kg
7 CS3348 2.5 mg/kg
b. TK219005中的研究組別(帶有NCI-H1435的小鼠)
組別 抗體 劑量
1 媒液
2 CS3348 0.02 mg/kg
3 CS3348 0.1 mg/kg
4 CS3348 0.5 mg/kg
c. TK220003中的研究組別(帶有NUGC-3的小鼠)
組別 抗體 劑量
1 媒液
2 CS3348 0.004 mg/kg
3 CS3348 0.02 mg/kg
4 CS3348 0.1 mg/kg
參考實施例 1，抗體表現載體的製備及抗體的表現和純化 藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常已知的方法，來進行胺基酸取代或IgG轉化，使用PCR或Infusion Advantage PCR選殖套組(Takara Bio Inc.)等來建構表現載體。藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常已知的方法，來將獲得的表現載體進行定序。將製備的質體瞬時轉移至FreeStyle 293細胞(ThermoFisher Scientific)或Expi293F細胞(ThermoFisher Scientific)，以表現抗體。使用Protein A Sepharose(TM)Fast Flow(GE Healthcare Japan Corp.)，並藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常已知的方法，從獲得的培養上清液中純化每種抗體。在雙特異性抗體的情況下，需要ProteinL層析(Protenova)去除同質二聚體(WO2018159615)。至於純化的抗體的濃度，使用分光光度計在280 nm處測量吸光度，且藉由使用PACE (Protein Science 1995; 4: 2411-2423)獲得的值計算出的消光系數來計算抗體濃度。
參考實施例 2，密連蛋白表現細胞的生產 藉由分別將人類CLDN6、人類CLDN9、人類CLDN3、人類CLDN4、小鼠CLDN6、小鼠CLDN9、小鼠CLDN3和小鼠CLDN4表現載體轉染到小鼠pro B細胞株Ba/F3中，來建構表現人類CLDN6的Ba/F3細胞(hCLDN6/BaF)、表現人類CLDN9的Ba/F3細胞(hCLDN9/BaF)、表現人類CLDN3的Ba/F3細胞(hCLDN3/BaF)、表現人類CLDN4的Ba/F3細胞(hCLDN4/BaF)、表現小鼠CLDN6的Ba/F3細胞(mCLDN6/BaF)、表現小鼠CLDN9的Ba/F3細胞(mCLDN9/BaF)、表現小鼠CLDN3的Ba/F3細胞(mCLDN3/BaF)和表現小鼠CLDN4的Ba/F3細胞(mCLDN4/BaF)。
密連家族蛋白具有兩個可被抗體接近的胞外域。關於人類CLDN6和人類CLDN9的胞外域之間的胺基酸序列相似性，第一胞外域幾乎相同，且在第二胞外域中只有兩個不同的胺基酸(圖39)。將人類密連蛋白6第156位(序列識別號：125或126所示序列中的156位)的麩醯胺酸(glutamine)替換為白胺酸(leucine)，以製造包含與人類密連蛋白9的第156位相同的胺基酸的人類CLDN6突變株。此人類CLDN6突變體命名為hCLDN6(Q156L)(序列辨識號：134)。使用上述類似方法生產穩定表現hCLDN6(Q156L)的Ba/F3轉染株。建構的Ba/F3轉染株命名為hCLDN6(Q156L)/BaF。
使用293fectin(Invitrogen)，藉由將人類和小鼠CLDN(包含CLDN6、CLDN9、CLDN3和CLDN4)的表現載體導入到FreeStyleTM 293-F細胞(Invitrogen)中，來生產瞬時表現人類和小鼠CLDN3、4、6和9的FreeStyleTM 293-F轉染細胞。生產的FreeStyleTM 293-F轉染細胞分別命名為hCLDN3/FS293、hCLDN4/FS293、hCLDN6/FS293、hCLDN9/FS293、mCLDN3/FS293、mCLDN4/FS293、mCLDN6/FS293和mCLDN9/FS293。
參考實施例 3，使用Jurkat報導基因測定法的T細胞活化活性測定 使用GloResponseTM NFAT-luc2 Jurkat細胞(Promega)藉由T細胞活化生物測定法，來檢驗在木標細胞的存在下抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化。在每種測定中，一種選自參考實施例2中產生的claudin表現細胞的細胞和癌細胞株作為目標細胞。
首先，將2 x 104 個目標細胞以25μL/孔的體積接種在96孔平底盤(Corning)上。接著，在每個孔中添加1 x 105 個Jurkat/NFAT-RE報導細胞株作為效應細胞，使每個孔中效應細胞與目標細胞的比例為5：1。然後，分別將不同濃度(藉由測定法確定抗體濃度)的25 μL抗體溶液添加至孔中。在37度C下隔夜培養後，將75 μL的Bio-Glo試劑(Promega)添加至每個孔，且在室溫下培養10分鐘。藉由EnVision(PerkinElmer Japan)或GloMax® Explorer微盤讀取儀測量每個孔中活化Jurkat細胞所產生的發光(RLU)。藉由比較具有和不具有抗體的孔，來計算每個孔的發光率。
儘管出於清楚理解的目的，已經藉由圖式和範例的方式詳細地描述了前述發明，但是這些描述和範例不被視為限制本揭露的範圍。將本文所引用的所有專利和科學文獻的揭露整體通過引用方式明確地併入全文。 [產業利用性]
本揭露的抗原結合分子於治療和/或預防癌症、檢測生物樣品中CLDN6的存在和診斷各種癌症是有用的。抗原結合分子的實施例之一是對CLDN6和T細胞受體複合物顯示出結合活性的抗原結合分子，其藉由使T細胞接近CLDN6表現細胞且使用T細胞對CLDN6表現癌細胞的細胞毒殺性，而得以治療癌症。
無。
[圖1] 抗CLDN6/CD3雙特異性抗體(AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01和6PHU3/TR01)的T細胞活化活性。在hCLDN6/BaF(A)、hCLDN9/BaF(B)和hCLDN6(Q156L)/BaF(C)的存在下，檢驗各抗體的T細胞活化活性。縱軸表示與不含抗體的孔相比，含有抗體的孔的發光倍數，而橫軸表示抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的濃度。 [圖2-1] 抗CLDN6/CD3雙特異性抗體(AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01和6PHU3/TR01)之對人類和小鼠密連蛋白家族蛋白質的結合特異性。藉由流式細胞儀以10 μg/ml的濃度，來檢驗抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的相對結合活性。縱軸表示抗體結合至短暫表現人類或小鼠CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9的FreeStyleTM 293-F轉染細胞株的MFI值。KLH/TR01作為陰性對照。測試市售的人類CLDN6抗體(MAB3656)、人類CLDN3抗體(MAB4620)和人類CLDN4抗體(MAB4219)作為對照。 [圖2-2] 接續圖2-1。 [圖3] 抗CLDN6/CD3雙特異性抗體(AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01)的體內抗腫瘤功效。圖3a顯示HuH-7 T細胞注射模型的腫瘤體積變化，而圖3b顯示OV-90 T細胞注射模型的腫瘤體積變化。在此研究中，每組(n = 5)在接種腫瘤後的第14天，靜脈投予5mg/kg的抗體或媒液(vehicle)。 [圖4] 如圖3中所述，小鼠以5 mg/kg的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體(AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01)治療的體重變化。分別顯示帶有HuH-7的T細胞注射模型(a)和帶有OV-90的T細胞注射模型(b)的體重變化。縱軸表示體重，而橫軸表示腫瘤接種後的天數。 [圖5] 如圖3中所述，投予5mg/kg的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體(AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01)或媒液後，OV-90 T細胞注射模型中的血漿ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA水平)。縱軸分別表示ALT(丙胺酸轉胺酶(Alanine aminotransferase))、ALP(鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase))、GGT(γ-麩胺醯基轉胜肽酶(gamma-glutamyl transpeptidase))、GLDH(麩胺酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase))、TBIL(總膽紅素(total bilirubin))和TBA(總膽酸(total bile acid))的濃度。 [圖6] 如圖3所中所述，用5 mg/kg的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體(AE3-20/TR01、AH05/TR01和6PHU3/TR01)治療的小鼠中的抗體濃度時間變化。分別顯示了HuH-7 T細胞注射模型(上)和OV-90 T細胞注射模型(下)中抗體的血漿濃度。縱軸表示小鼠血漿中的抗體濃度(μg/mL)，而橫軸表示治療後的天數。 [圖7] 在OVCAR-3 T細胞注射模型中，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的體內抗腫瘤功效和體重變化。在腫瘤移植後的第29天，用5 mg/kg的AE3-20/TR01、CDA0013/TR01或媒液靜脈內治療小鼠。治療後檢驗腫瘤體積(上)和體重(下)。 [圖8] 在如圖7中所述的OVCAR-3 T細胞注射模型中用5 mg/kg的CDA0013/TR01治療後，血漿ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA水平。縱軸分別表示在投予CDA0013/TR01或沒有治療後的ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA的濃度。 [圖9] 在如圖7中所述的OVCAR-3 T細胞注射模型中AE3-20/TR01和CDA0013/TR01的濃度時間變化。縱軸表示小鼠血漿中的抗體濃度(μg/mL)，而橫軸表示治療後的天數。 [圖10] 各種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體對hCLDN6/BaF的結合活性。縱軸以線性方式表示抗體對hCLDN6/BaF的的MFI值，其視為結合活性。 [圖11] 在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，各種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性。橫軸表示與沒有抗體的孔相比，含有抗體的孔的發光倍數。KLH/TR01作為陰性對照。從底部開始依以下順序顯示條形：CLDN6、CLDN3、CLDN4和CLDN9。 [圖12] 接續圖11。 [圖13] 在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，各種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性。橫軸表示與沒有抗體的孔相比，含有抗體的孔的發光倍數。在hCLDN6/BaF的存在下，未測試1 nM和0.1 nM的KLH/TR01。KLH/TR01作為陰性對照。從底部開始依以下順序顯示條形：CLDN6(抗體濃度10 nM)、CLDN6(抗體濃度1 nM)、CLDN6(抗體濃度0.1 nM)、CLDN3(抗體濃度10 nM)、CLDN4(抗體濃度10 nM)和CLDN9(抗體濃度10 nM)。 [圖14] 在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，各種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性。橫軸表示與沒有抗體的孔相比，含有抗體的孔的發光倍數。在hCLDN6/BaF的存在下，未測試1 nM和0.1 nM的KLH/TR01。KLH/TR01作為陰性對照。從底部開始依以下順序顯示條形：CLDN6(抗體濃度10 nM)、CLDN6(抗體濃度1 nM)、CLDN6(抗體濃度0.1 nM)、CLDN3(抗體濃度10 nM)、CLDN4(抗體濃度10 nM)和CLDN9(抗體濃度10 nM)。 [圖15] 在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，各種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的T細胞活化活性。橫軸表示與沒有抗體的孔相比，含有抗體的孔的發光倍數。在hCLDN6/BaF的存在下，未測試1 nM和0.1 nM的KLH/TR01。KLH/TR01作為陰性對照。從底部開始依以下順序顯示條形：CLDN6(抗體濃度10 nM)、CLDN6(抗體濃度1 nM)、CLDN6(抗體濃度0.1 nM)、CLDN3(抗體濃度10 nM)、CLDN4(抗體濃度10 nM)和CLDN9(抗體濃度10 nM)。 [圖16] 65H0671Q39E-SG1189v14k/54L0571Q38K-SK1018//TR01H(Q39K)-SG1191v14h/TR01L(Q38E)-SK1017(A)和65H0671Q39E-SG1189v14k/54L0571Q38K-SK1021//TR01H(Q39K)-SG1191v14h/TR01L(Q38E)-SK1017(B)的電荷異質性。使用Maurice(ProteinSimple)以280 nm的UV吸光值，來評估電荷異質性和pI值。使用相關的軟體Compass for iCE(2.0.10)來分析數據。 [圖17] 在OV-90 T細胞注射模型中，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體AE3-20/TR01和CS2201的體內抗腫瘤功效。在腫瘤接種後第14天，靜脈內投予單一劑量之0.1 mg/kg的每種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體。分別顯示腫瘤體積變化(上)和體重(下)。 [圖18] 在OV-90 T細胞注射模型中，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體AE3-20/TR01和CS2201的體內抗腫瘤功效。在腫瘤接種後第15天，靜脈內投予單一劑量之5 mg/kg的每種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體。分別顯示腫瘤體積變化(上)和體重(下)。 [圖19] 如圖17和18中所述，在OV-90 T細胞注射模型中，用5 mg/kg的AE3-20/TR01或CS2201治療後，血漿ALT、GLDH、TBA、ALP和TBIL水平。縱軸表示在投予AE3-20/TR01、CS2201和媒液後，ALT、GLDH、TBA、ALP和TBIL的濃度。 [圖20] 如圖17和18中所述，在OV-90 T細胞注射模型中，AE3-20/TR01和CS2201的濃度時間變化。縱軸表示小鼠血漿中的抗體濃度(μg/mL)，而橫軸表示治療後的天數。 [圖21A] 在OV-90 T細胞注射模型中，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體CS2425的體內抗腫瘤功效。接種腫瘤後第15天，靜脈內投予單一劑量的0.1 mg/kg的CS2425。分別顯示腫瘤體積變化(上)和體重變化(下)。 [圖21B] 在OV-90 T細胞注射模型中，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體CS2425的體內抗腫瘤功效。接種腫瘤後第15天，靜脈內投予單一劑量的5 mg/kg的CS2425。分別顯示腫瘤體積變化(上)和體重變化(下)。 [圖22] 如圖21A和21B中所述，在OV-90 T細胞注射模型中，CS2425治療後的血漿ALT、GGT、TBA、ALP和TBIL水平。縱軸表示在投予0.1 mg/kg和5 mg/kg的CS2425或媒液後，ALT、GGT、TBA、ALP和TBIL的水平。 [圖23] 如圖21A和21B中所述，在OV-90 T細胞注射模型中，CS2425的濃度時間變化。縱軸表示小鼠血漿中的抗體濃度(μg/mL)，橫軸表示治療後的天數。 [圖24] 圖表顯示在包含陰性對照和陽性對照的每種測試物質的存在下，於培養67小時的CD8-CD25low PBMC中，分泌IL-2的CD4+ T細胞的比例的最大值。數據顯示對於各個供給者之分泌IL-2的CD4+ T細胞比例的最大值，其中所使用的PBMC是從各個供給者所衍生而來的。當不存在測試物質而進行培養時，沒有抗原顯示出來自研究對照的結果。虛線表示正閾值。 [圖25] 圖表顯示藉由MAPPs而鑑定為CS2425輕鏈的的一部分的每個胺基酸位置的胜肽數目的熱度圖(heatmap)。在熱度圖中顯示此區每個胺基酸位置所鑑定的胜肽數量，其中格子顏色代表所鑑定的胜肽數量(請見圖例)。胜肽-MHC II複合物是從單核細胞分化的CS2425-脈衝DC中所獲得。 [圖26] 圖表顯示在包含陰性對照和陽性對照的每種測試物質的存在下，於培養67小時的CD8-CD25low PBMC中，分泌IL-2的CD4+ T細胞比例的最大值。數據顯示對於各個供給體之分泌IL-2的CD4+ T細胞比例的最大值，其中所使用的PBMC是從各個供給體所衍生而來的。當不存在測試物質而進行培養時，沒有抗原顯示出來自研究對照的結果。虛線表示正閾值。 [圖27] 在OV-90 T細胞注射模型中，用抗CLDN6/CD3雙特異性抗體CS2201、CS2425、CS2884、CS2885和CS2886治療的小鼠體內的抗腫瘤功效。接種腫瘤後第15天，靜脈內投予單一劑量的5 mg/kg的每種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體。在單次投予5 mg/kg的每種抗體後，於小鼠中檢驗腫瘤體積(上)和體重(下)。 [圖28] 在如圖27所示的OV-90 T細胞注射模型中，用抗CLDN6/CD3雙特異性抗體CS2201、CS2425、CS2884、CS2885和CS2886治療的小鼠中的肝損傷標記物的血漿水平。每種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的治療後，在小鼠中評估血漿ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA水平。縱軸表示在投予5 mg/kg的每種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體或媒液後，小鼠血漿中ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA的濃度。 [圖29] 在OV-90 T細胞注射模型中，用抗CLDN6/CD3雙特異性抗體CS2201、CS2425、CS2958、CS2959、CS2960和CS2961治療的小鼠體內的抗腫瘤功效。接種腫瘤後第15天，靜脈內投予單一劑量的5 mg/kg的每種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體。在單次投予5 mg/kg的每種抗體後，於小鼠中檢驗腫瘤體積(上)和體重(下)。 [圖30] 在如圖29所示的OV-90 T細胞注射模型中，用抗CLDN6/CD3雙特異性抗體CS2201、CS2425、CS2958、CS2959、CS2960和CS2961治療的小鼠中的肝損傷標記物的血漿水平。每種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的治療後，在小鼠中評估血漿ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA水平。縱軸表示在投予5 mg/kg的每種抗CLDN6/CD3雙特異性抗體或媒液後，小鼠血漿中ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH和TBA的濃度。 [圖31] 在如圖29所述的OV-90 T細胞注射模型中，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體CS2201、CS2425、CS2958、CS2959、CS2960和CS2961的濃度時間變化。縱軸表示小鼠血漿中的抗體濃度(μg/ mL)，而橫軸表示治療後的天數。 [圖32] 使用GloResponseTM NFAT-luc2 Jurkat細胞並藉由T細胞活化生物測定法，來確定在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、hCLDN9/BaF或hCLDN6(Q156L)/Ba的存在下，各種濃度的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體(AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425和CS2961)的T細胞活化活性。縱軸表示與沒有抗體的孔相比，含有抗體的孔的發光倍數。KLH/TR01作為陰性對照。 [圖33] 使用GloResponseTM NFAT-luc2 Jurkat細胞並藉由T細胞活化生物測定法，來確定在hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF或hCLDN9/BaF的存在下，各種濃度的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體(CS2201、CS2961、CS3346、CS3347和CS3348)的T細胞活化活性。縱軸表示與沒有抗體的孔相比，含有抗體的孔的發光倍數。KLH/TR01作為陰性對照。 [圖34] 藉由LDH測定法來確定抗CLDN6/CD3雙特異性抗體(AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425、CS2961、CS3346、CS3347和CS3348)對表現CLDN6的OVCAR3卵巢癌細胞株的T細胞依賴性細胞毒殺性。縱軸表示細胞裂解的百分比，而橫軸表示抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的濃度。KLH/TR01作為陰性對照。 [圖35-1] 抗CLDN6/CD3雙特異性抗體(CS2201、CS2961、AH05/TR01和6PHU3/TR01)對人類CLDN家族蛋白(CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9)的結合活性。藉由流式細胞儀，來檢驗濃度為15 μg/ml的抗CLDN6/CD3雙特異性抗體對BaF3轉染體(hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF和hCLDN9/BaF)的結合活性，且繪製為直方圖(histogram)。KLH/TR01作為陰性對照。在測試的抗體中，CS2961對人類CLDN6的特異性最高。 [圖35-2] 接續圖35-1。 [圖36] 在40°C下儲存後，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的HMW種類形成。縱軸表示每個樣品的總峰面積中HMW種類的百分比。 [圖37] 在OV-90 T細胞注射模型中，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的體內劑量依賴性抗腫瘤功效。接種腫瘤後14天，靜脈內投予單一劑量的0.001至5 mg/kg的AE3-20/TR01。分別顯示腫瘤體積變化(上)和體重變化(下)。 [圖38] 在OV-90 T細胞注射模型中，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體的體內劑量依賴性抗腫瘤功效。接種腫瘤後15天，靜脈內投予單一劑量的0.0016至5 mg/kg的CS3348。分別顯示腫瘤體積變化(上)和體重變化(下)。 [圖39] 人類CLDN9和人類CLDN6的胺基酸序列比對。人類CLDN9和人類CLDN6在胞外域1中包含幾乎相同的序列，除了N端殘基(第29位為Met/Leu)。於人類CLDN9和人類CLDN6中的胞外域2中的兩個胺基酸不同(第145位為Arg/Leu以及第156位為Gln/Leu)。 [圖40] 在帶有OVCAR-3的T細胞注射模型(TK220001)中，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體CS3348的抗腫瘤功效。 [圖41] 在帶有OVCAR-3的T細胞注射模型(TK219005)中，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體CS3348的抗腫瘤功效。 [圖42] 在帶有NUGC-3的T細胞注射模型(TK220003)中，抗CLDN6/CD3雙特異性抗體CS3348的抗腫瘤功效。
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Claims (15)

  1. 一種單離抗體，包括： 一第一重鏈可變區，包括分別為序列辨識號：113的HVR-H1胺基酸序列、序列辨識號：117的HVR-H2胺基酸序列和序列辨識號：118的HVR-H3胺基酸序列； 一第一輕鏈可變區，包括分別為序列辨識號：119的HVR-L1胺基酸序列、序列辨識號：120的HVR-L2胺基酸序列和序列辨識號：121的HVR-L3胺基酸序列； 一第二重鏈可變區，包括分別為序列辨識號：122的HVR-H1胺基酸序列、序列辨識號：123的HVR-H2胺基酸序列和序列辨識號：124的HVR-H3胺基酸序列；以及 一第二輕鏈可變區，包括分別為序列辨識號：114的HVR-L1胺基酸序列、序列辨識號：115的HVR-L2胺基酸序列和序列辨識號：116的HVR-L3胺基酸序列。
  2. 一種單離抗體，包括： 一第一重鏈可變區，包括選自序列辨識號：85、1、33和84的一胺基酸序列；以及一第一輕鏈可變區，包括選自序列辨識號：87、2、43、86和88的一胺基酸序列； 一第二重鏈可變區，包括選自序列辨識號：60和70的一胺基酸序列；以及一第二輕鏈可變區，包括選自序列辨識號：61和71的一胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2所述之抗體，其中該第一重鏈可變區連接至序列辨識號：95中所示的一第一CH1域，該第一輕鏈可變區連接至序列辨識號：63中所示的一第一CL域，該第二重鏈可變區連接至序列辨識號：97中所示的一第二CH1域，且該第二輕鏈可變區連接至序列辨識號：62中所示的一第二CL域。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之抗體，其中該抗體更包括選自以下的Fc區組合中的任一者： (1)序列辨識號：72中所示的一第一Fc區和序列辨識號：73中所示的一第二Fc區； (2)序列辨識號：74中所示的一第一Fc區和序列辨識號：75中所示的一第二Fc區； (3)序列辨識號：76中所示的一第一Fc區和序列辨識號：77中所示的一第二Fc區；以及 (4)序列辨識號：78中所示的一第一Fc區和序列辨識號：79中所示的一第二Fc區。
  5. 如請求項4所述之抗體，其中該第一Fc區和該第一重鏈可變區在相同的多肽鏈中，且該第二Fc區和該第二重鏈可變區在相同的多肽鏈中。
  6. 一種單離抗體，包括： 一第一重鏈，包括選自序列辨識號：104、105、106和107的一胺基酸序列，以及一第一輕鏈，包括序列辨識號：112中所示的一胺基酸序列； 一第二重鏈，包括選自序列辨識號：108、109、110和111的一胺基酸序列，以及一第二輕鏈，包括序列辨識號：98中所示的一胺基酸序列。
  7. 一種單離核酸，編碼如請求項1至6中任一項所述之抗體。
  8. 一種宿主細胞，包括如請求項7所述之核酸。
  9. 一種抗體的製造方法，包括培養如請求項8所述之宿主細胞，以產生該抗體。
  10. 一種醫藥組合物，包括如請求項1至6中任一項所述之抗體，以及一醫藥上可接受的載體。
  11. 如請求項10所述之醫藥組合物，其誘導T細胞依賴性細胞毒殺性。
  12. 如請求項10或11所述之醫藥組合物，其為用於治療及/或預防癌症的一醫藥組合物。
  13. 如請求項10至12中任一項所述之醫藥組合物，其為用於治療及/或預防卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌或肝癌的一醫藥組合物。
  14. 一種如請求項1至6中任一項所述之抗體在一藥物的製備中的用途。
  15. 一種具有癌症的一個體的治療方法，包括對該個體投予一有效量之如請求項1至6中任一項所述之抗體。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11952422B2 (en) 2017-12-05 2024-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137
EP3924389A4 (en) 2019-02-15 2023-06-14 Integral Molecular, Inc. CLAUDIN-6 ANTIBODIES AND THEIR USES
CR20220540A (es) * 2020-03-31 2022-12-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Moléculas de union al antígeno multiespecíficas dirigidas a claudina-6 y sus usos
JP7470760B2 (ja) * 2021-09-29 2024-04-18 中外製薬株式会社 がんの治療に用いるための細胞傷害誘導治療剤
WO2024088325A1 (zh) * 2022-10-25 2024-05-02 科济生物医药（上海）有限公司 抗体及其应用

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773719A (en) 1966-12-06 1973-11-20 Hoffmann La Roche 2-aminoxy-2'-acyl-acetanilide
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
DE3785186T2 (de) 1986-09-02 1993-07-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）２抗体の産生のための使用
PL174494B1 (pl) 1992-11-13 1998-08-31 Idec Pharma Corp Kompozycja farmaceutyczna do leczenia chłoniaka z limfocytów B i sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chłoniaka z limfocytów B
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
DE122009000068I2 (de) 1994-06-03 2011-06-16 Ascenion Gmbh Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2386574A3 (en) 1999-01-15 2012-06-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2385347C (en) 1999-10-04 2009-12-15 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
PT1242438E (pt) 1999-12-29 2007-02-28 Immunogen Inc Agentes citotóxicos compreendendo dixorrubicinas e daunorrubicinas modificadas e seu uso terapêutico
CN101260154A (zh) 2002-10-02 2008-09-10 霍夫曼-拉罗奇有限公司 新mhc ii相关肽
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
KR101520209B1 (ko) 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP1870459B1 (en) 2005-03-31 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
CA2611726C (en) 2005-06-10 2017-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(fv)2
DK2009101T3 (en) 2006-03-31 2018-01-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody modification method for purification of a bispecific antibody
US9212230B2 (en) 2007-03-29 2015-12-15 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
US8337854B2 (en) 2007-04-04 2012-12-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Monoclonal antibodies against dengue and other viruses with deletion in Fc region
WO2008156083A1 (ja) 2007-06-18 2008-12-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体依存性細胞障害活性を模擬する抗体の結合活性測定法
US9274119B2 (en) 2008-01-11 2016-03-01 The University Of Tokyo Anti-CLDN6 antibody
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
KR102126964B1 (ko) 2009-11-11 2020-06-25 가니메드 파마슈티칼스 게엠베하 클라우딘 6 특이적 항체
CN110066339A (zh) 2010-04-20 2019-07-30 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
EP2404936A1 (en) 2010-07-06 2012-01-11 Ganymed Pharmaceuticals AG Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo
US9834615B2 (en) 2010-08-16 2017-12-05 Novimmune Sa Methods for the generation of multispecific and multivalent antibodies
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
EP2662385A4 (en) 2011-01-07 2015-11-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd METHOD FOR IMPROVING THE PHYSICAL PROPERTIES OF ANTIBODIES
AU2012258087B2 (en) 2011-05-13 2017-07-20 Astellas Pharma Inc. Antibodies for treatment of cancer expressing claudin 6
EP3892640A1 (en) * 2011-08-23 2021-10-13 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
KR102398736B1 (ko) 2011-10-31 2022-05-16 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자
CN104080811B (zh) 2011-11-04 2019-09-27 酵活有限公司 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计
ES2843054T3 (es) 2012-05-10 2021-07-15 Zymeworks Inc Construcciones heteromultiméricas de cadenas pesadas de inmunoglobulina con mutaciones en el dominio Fc
CN104640561A (zh) 2012-07-23 2015-05-20 酵活有限公司 包含轻链和重链的选择性配对的免疫球蛋白构建体
MX369276B (es) * 2012-11-13 2019-11-04 Biontech Ag Agentes para tratamiento de enfermedades cancerosas que expresan claudina.
WO2014075697A1 (en) * 2012-11-13 2014-05-22 Biontech Ag Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
WO2015014376A1 (en) * 2013-07-31 2015-02-05 Biontech Ag Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
SG11201603397QA (en) 2013-11-06 2016-05-30 Stemcentrx Inc Novel anti-claudin antibodies and methods of use
AU2015260230A1 (en) * 2014-05-13 2016-11-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
WO2018054484A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Biontech Ag Bispecific trivalent antibodies binding to claudin 6 or claudin18.2 and cd3 for treatment of claudin expressing cancer diseases
CN110214192A (zh) 2016-12-27 2019-09-06 中外制药株式会社 用于评价测试物质的免疫原性的方法
EP3589640A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROTEIN PURIFICATION WITH PROTEIN L
US20210054076A1 (en) * 2018-01-05 2021-02-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent

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