JP2022529288A - クローディン６結合分子およびその使用 - Google Patents

クローディン６結合分子およびその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、クローディン6 (CLDN6) に対する結合活性を示す抗原結合分子、該抗原結合分子を産生する方法、がんの治療および／または予防における該抗原結合分子およびそれを含むイムノコンジュゲートの使用、生体試料中のCLDN6の存在の検出における該抗原結合分子の使用、ならびに様々ながんの診断における該抗原結合分子の使用を提供する。

Description

本開示は、抗原結合分子および抗体を含むクローディン6結合分子、その使用等に関する。
抗体は血漿中での安定性が高く、かつ副作用が少ないことから、医薬品として注目されている。複数の治療用抗体の中で、いくつかの種類の抗体は、抗腫瘍応答をもたらすためにエフェクター細胞を必要とする。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害 (ADCC) は、抗体のFc領域が、NK細胞およびマクロファージ上に存在するFc受容体に結合することにより、抗体が結合した細胞に対してエフェクター細胞が示す細胞傷害である。今日までに、ADCCを誘導して抗腫瘍効果を発揮し得る複数の治療用抗体が、がんを治療するための医薬品として開発されている（非特許文献1）。
NK細胞またはマクロファージをエフェクター細胞として動員することによりADCCを採用する抗体に加えて、T細胞をエフェクター細胞として動員することにより細胞傷害を採用するT細胞動員抗体（TR抗体）が、1980年代から知られている（非特許文献2～4）。TR抗体は、T細胞上のT細胞受容体複合体を形成するサブユニットのいずれか一つ、特にCD3ε鎖、およびがん細胞上の抗原を認識し、それらに結合する二重特異性抗体である。いくつかのTR抗体が、現在開発されている。EpCAMに対するTR抗体であるカツマキソマブが、悪性腹水の治療に関してEUで認可された。さらに、「二重特異性T細胞誘導体 (bispecific T-cell engager; BiTE)」と称されるTR抗体の一種が、強力な抗腫瘍活性を示すことが最近見出された（非特許文献5および6）。CD19に対するBiTE分子であるブリナツモマブは、2014年に初めてFDAの認可を受けた。ブリナツモマブは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害 (ADCC) および補体依存性細胞傷害 (CDC) を誘導するリツキシマブと比較して、in vitroでCD19/CD20陽性がん細胞に対してはるかにより強力な細胞傷害活性を示すことが判明した（非特許文献7）。
しかしながら、三機能性 (trifunctional) 抗体は、がん抗原非依存的に、T細胞、およびNK細胞またはマクロファージなどの細胞の両方に同時に結合し、その結果、これらの細胞に発現する受容体が架橋され、抗原非依存的に様々なサイトカインの発現が誘導されることが知られている。三機能性抗体の全身投与は、こうしたサイトカイン発現の誘導の結果、サイトカインストーム様の副作用を引き起こすと考えられる。実際、第一相臨床試験においては、非小細胞肺がん患者に対するカツマキソマブの全身投与の場合、5μg/身体という極めて低い用量が最大耐量であり、それ以上の用量の投与により様々な重篤な副作用が起こることが報告されている（非特許文献8）。こうした低い用量の投与の場合、カツマキソマブはその有効血中濃度には到底達し得ない。すなわち、こうした低い用量のカツマキソマブの投与によっては期待される抗腫瘍作用が得られない。
一方、Fcγ受容体結合部位を持たない二重特異性sc（Fv）2形式の分子(BiTE)は、カツマキソマブとは異なり、T細胞およびNK細胞やマクロファージなどの細胞に発現する受容体をがん抗原非依存的に架橋することはない。しかしながら、二重特異性sc（Fv）2はFc領域を欠く低分子量の改変抗体分子であるために、治療用抗体として従来用いられるIgG型抗体と比較して、患者に投与された後の血中半減期が著しく短いという問題点が存在する。実際、生体に投与された二重特異性sc（Fv）2の血中半減期は数時間程度であることが報告されている（非特許文献9および10）。CD19およびCD3に結合するsc（Fv）2分子であるブリナツモマブは、急性リンパ芽球性白血病の治療用に承認されている。ブリナツモマブの血清半減期は、患者において2時間未満であることが明らかになっている（非特許文献21）。ブリナツモマブの臨床試験においてはミニポンプを用いた持続静脈内注入により投与が行なわれた。こうした投与方法は患者にとって著しく利便性が悪いだけでなく、機器の故障などによる医療事故のリスクも潜在する。そのため、こうした投与方法は望ましいとはいえない。
クローディンファミリーは、4つの膜貫通ドメインを有し、タイトジャンクションを構成する、分子量およそ23 kDの細胞膜タンパク質のファミリーである。クローディンファミリーは、ヒトおよびマウスにおいて24種類のメンバーを含み、クローディンファミリーの各メンバーは、各上皮細胞型に応じて非常にユニークな発現パターンを示すことが公知である（非特許文献11～14）。上皮細胞のシートにおいては、物質が細胞間隙に漏出（拡散）するのを防ぐようにある機構が働き、タイトジャンクションと称される細胞間接着システムは、この漏出を防ぐ機構において「バリア」としての中心的役割を実際に果たすことが示されている。
タイトジャンクション分子クローディン6（CLDN6）は、クローディンファミリータンパク質のメンバーであり、正常な生体組織では転写的に発現していない（非特許文献15および非特許文献16）が、卵巣がん、NSCLC、および胃がんなどの複数種類のがんでは発現上昇を示す（非特許文献17～非特許文献19）。
抗CLDN6抗体に関して、CLDN6に対する単一特異性抗体は、CLDN6陽性がん細胞株に対してADCC活性または内部移行活性を有することが報告されている（特許文献1～特許文献5）。これまでに、6PHU3と名付けられた、CLDN6を標的とするT細胞リダイレクティング二重特異性抗体が、抗CD3/抗CLDN6特異性を有する二重特異性sc(Fv)2形式を用いて作られている（特許文献6～特許文献7）。前臨床評価において、6PHU3は、in vitroおよびin vivoでがん細胞の強力な殺傷を示すことが報告されている（非特許文献20）。
WO2009/087978 WO2011/057788 WO2012/003956 WO2012/156018 WO2015/069794 WO2014/075697 WO2014/075788
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上述したように、二重特異性sc(Fv)2は、Fc領域を欠く低分子量の改変抗体分子であり、IgG型抗体と比較して著しく短い血中半減期を示し、そのため治療薬として使用するには不都合が生じる。6PHU3と命名された、CLDN6に結合する二重特異性sc(Fv)2の場合、6PHU3の血漿タンパク質レベルは6時間以内に急激に低下し、24時間後には細胞傷害活性がほとんど検出されなかったことが報告されている (Nat Med. 2017 Jul;23(7):815-817.)。さらに、sc(Fv)2の形式は、長期保存中の安定性の低さを含む製造上の課題に直面している。
1つの局面において、本開示の目的は、T細胞をCLDN6発現細胞に近接させ、CLDN6発現がん細胞に対するT細胞の細胞傷害性を用いることによってがんの治療を可能にする、CLDN6およびT細胞受容体複合体に対する結合活性を示す抗原結合分子（抗体を含む）、特に安定性が高くかつ血清半減期が長い抗原結合分子を提供することである。該抗原結合分子を産生する方法、およびそのような抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物の提供もまた、本開示の目的である。
別の局面において、本開示の目的は、CLDN6発現細胞を標的とすることによってがんの治療を可能にする、CLDN6に対する結合活性を示す抗原結合分子、該抗原結合分子を産生する方法、およびそのような抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物、またはそのような抗原結合分子を有効成分として含むイムノコンジュゲートを提供することである。生体試料中のCLDN6の存在の検出における該抗原結合分子の使用、および様々ながんの診断における該抗原結合分子の使用もまた、本開示において提供される。
本開示はまた、上述の抗原結合分子のうちの1つまたはイムノコンジュゲートを有効成分として含む、様々ながんの治療または予防において使用するための医薬組成物、および該医薬組成物を用いる治療法を提供する。
本発明者らは、CLDN6に対する結合活性を示す特定の重鎖可変領域 (VH) と特定の軽鎖可変領域 (VL)、およびT細胞受容体複合体に対する結合活性を示す第2のVHと第2のVLを含む抗原結合分子が、CLDN6を発現する細胞を損傷し、優れた細胞傷害／抗腫瘍活性を発揮し得ることを見出した。特定の配列を含む抗原結合分子はまた、優れた安定性、安全性、および製造性を示す。本開示は、該抗原結合分子、および該抗原結合分子を有効成分として含むことにより、様々ながん、特にCLDN6陽性腫瘍などのCLDN6と関連したがんを治療し得る医薬組成物を提供する。
本発明者らはまた、特定のVHと特定のVLを含む抗原結合分子が、CLDN6に対する結合活性およびヒトCLDN6に対する優れた特異性を示し、その結果として、該抗原結合分子およびそのイムノコンジュゲートを、CLDN6を発現する細胞を標的とするため、生体試料中のCLDN6の存在を検出するため、および様々ながんの診断のために使用できることを見出した。
より具体的には、本開示は以下のものを提供する：
[1] それぞれ配列番号： 113、117、および118のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む第1の重鎖可変領域；
それぞれ配列番号： 119、120、および121のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む第1の軽鎖可変領域；
それぞれ配列番号： 122、123、および124のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む第2の重鎖可変領域；ならびに
それぞれ配列番号： 114、115、および116のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む第2の軽鎖可変領域
を含む、単離された抗体。
[2] 配列番号： 85、1、33、および84より選択されるアミノ酸配列を含む第1の重鎖可変領域；ならびに配列番号： 87、2、43、86、および88より選択されるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖可変領域；
配列番号： 60および70より選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖可変領域；ならびに配列番号： 61および71より選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖可変領域
を含む、単離された抗体。
[3] 第1の重鎖可変領域が配列番号： 95に示される第1のCH1ドメインに連結され、第1の軽鎖可変領域が配列番号： 63に示される第1のCLドメインに連結され、第2の重鎖可変領域が配列番号： 97に示される第2のCH1ドメインに連結され、かつ第2の軽鎖可変領域が配列番号： 62に示される第2のCLドメインに連結されている、[1] または [2] に記載の抗体。
[4] (1) 配列番号： 72に示される第1のFc領域、および配列番号： 73に示される第2のFc領域；
(2) 配列番号： 74に示される第1のFc領域、および配列番号： 75に示される第2のFc領域；
(3) 配列番号： 76に示される第1のFc領域、および配列番号： 77に示される第2のFc領域；ならびに
(4) 配列番号： 78に示される第1のFc領域、および配列番号： 79に示される第2のFc領域
より選択されるFc領域の組み合わせのうちのいずれか1つをさらに含む、[1]～[3] のいずれか1つに記載の抗体。
[5] 第1のFc領域が第1の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖内にあり、かつ第2のFc領域が第2の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖内にある、[4] に記載の抗体。
[6] 第1の重鎖可変領域と第1の軽鎖可変領域が第1の抗原結合部位を形成し、かつ第2の重鎖可変領域と第2の軽鎖可変領域が第2の抗原結合部位を形成する、[1]～[5] のいずれか1つに記載の抗体。
[7] 配列番号： 104、105、106、および107より選択されるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、ならびに配列番号： 112に示されるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖；
配列番号： 108、109、110、および111より選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、ならびに配列番号： 98に示されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
含む、単離された抗体。
[8] 第1の重鎖と第1の軽鎖の可変領域が第1の抗原結合部位を形成し、かつ第2の重鎖と第2の軽鎖の可変領域が第2の抗原結合部位を形成する、[7] に記載の抗体。
[9] 第1の抗原結合部位がCLDN6に対する結合活性を有する、[6] または [8] に記載の抗体。
[10] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[6]、[8]、および [9] のいずれか1つに記載の抗体。
[11] 第1の抗原結合部位が、配列番号： 125または126に規定されるヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[6] および [8]～[10] のいずれか1つに記載の抗体。
[12] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN9に実質的に結合しない、[6] および [8]～[11] のいずれか1つに記載の抗体。
[13] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN4に実質的に結合しない、[6] および [8]～[12] のいずれか1つに記載の抗体。
[14] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN3に実質的に結合しない、[6] および [8]～[13] のいずれか1つに記載の抗体。
[15] 第1の抗原結合部位が、配列番号： 134に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない、[6] および [8]～[14] のいずれか1つに記載の抗体。
[16] 第2の抗原結合部位がCD3に対する結合活性を有する、[6] および [8]～[15] のいずれか1つに記載の抗体。
[17] 第2の抗原結合部位がCD3ε鎖に対する結合活性を有する、[6] および [8]～[16] のいずれか1つに記載の抗体。
[18] 第2の抗原結合部位が、配列番号：142に規定されるヒトCD3に対する結合活性を有する、[6] および [8]～[17] のいずれか1つに記載の抗体。
[19] [1]～[18] のいずれか1つに記載の抗体をコードする、単離された核酸。
[20] [19] に記載の核酸を含む宿主細胞。
[21] 抗体が産生されるように、[20] に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗体を産生する方法。
[22] 宿主細胞の培養から抗体を回収する段階をさらに含む、[21] に記載の方法。
[23] [1]～[18] のいずれか1つに記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[24] T細胞依存性細胞傷害を誘導する、[23] に記載の医薬組成物。
[25] がんの治療および／または予防のために使用される医薬組成物である、[23] または [24] に記載の組成物。
[26] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防のために使用される医薬組成物である、[23]～[25] のいずれか1つに記載の組成物。
[27] 医薬の製造における、[1]～[18] のいずれか1つに記載の抗体の使用。
[28] がんの治療および／または予防のための医薬の製造における、[1]～[18] のいずれか1つに記載の抗体の使用。
[29] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防のための医薬の製造における、[1]～[18] のいずれか1つに記載の抗体の使用。
[30] [1]～[18] のいずれか1つに記載の抗体の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を治療する方法。
[31] [1]～[18] のいずれか1つに記載の抗体の有効量を個体に投与する段階を含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんを有する個体を治療する方法。
[32] 少なくとも[1]～[18] のいずれか1つに記載の抗体と、使用説明書とを含む、がんの治療および／または予防において使用するためのキット。
[33] 少なくとも[1]～[18] のいずれか1つに記載の抗体と、使用説明書とを含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防において使用するためのキット。
さらに、本開示はまた以下を提供する：
[34] (a) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む重鎖可変領域：
(a1) それぞれ配列番号： 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列；ならびに
(a2) 配列番号： 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
ならびに
(b) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む軽鎖可変領域：
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；ならびに
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む、抗原結合分子。
[35] 重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、マウス、ウサギ、ヒト化、またはヒトフレームワークを含む、[34] に記載の抗原結合分子。
[36] 配列番号： 85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、および57より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号： 87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82 および58より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗原結合分子。
[37] 重鎖可変領域と軽鎖可変領域が抗原結合部位を形成する、[34]～[36] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[38] 抗原結合部位がCLDN6に対する結合活性を有する、[37] に記載の抗原結合分子。
[39] 抗原結合部位が、配列番号： 125または126に規定されるヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[37] または [38] に記載の抗原結合分子。
[40] 抗原結合部位がヒトCLDN9に実質的に結合しない、[37]～[39] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[41] 抗原結合部位がヒトCLDN4に実質的に結合しない、[37]～[40] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[42] 抗原結合部位がヒトCLDN3に実質的に結合しない、[37]～[41] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[43] 抗原結合部位が、配列番号： 134に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない、[37]～[42] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[44] 抗体Fc領域をさらに含む、[37]～[43] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[45] Fc領域が、配列番号： 143～146（IgG1～IgG4）のFc領域構成アミノ酸のうちのいずれかに少なくとも1つのアミノ酸変異を有するFc領域である、[44] に記載の抗原結合分子。
[46] Fc領域が、糖鎖が付加したFc領域であり、Fc領域に付加したフコース欠損糖鎖の割合が天然IgG Fc領域のものよりも高いか、またはFc領域に付加されたバイセクト(bisecting)N-アセチルグルコサミンの割合が天然IgG Fc領域のものよりも高い、[44] または [45] に記載の抗原結合分子。
[47] 細胞傷害活性を有する、[34]～[46] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[48] 細胞傷害活性がADCCまたはCDCである、[47] に記載の抗原結合分子。
[49] 内部移行活性を有する、[34]～[46] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[50] 細胞傷害剤にコンジュゲートされている、[34]～[49] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[51] [34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と、細胞傷害剤とを含む、イムノコンジュゲート。
[52] [34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[53] がんの治療および／または予防のために使用される医薬組成物である、[52] に記載の組成物。
[54] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防のために使用される医薬組成物である、[52] または [53] に記載の組成物。
[55] 医薬の製造における、[34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの使用。
[56] がんの治療および／または予防のための医薬の製造における、[34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの使用。
[57] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防のための医薬の製造における、[34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの使用。
[58] [34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を治療する方法。
[59] [34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与する段階を含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんを有する個体を治療する方法。
[60] 少なくとも[34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートと、使用説明書とを含む、がんの治療および／または予防における使用のためのキット。
[61] 少なくとも[34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートと、使用説明書とを含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防における使用のためのキット。
[62] 生体試料を、[34]～[41] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と接触させる段階を含む、生体試料中のCLDN6の存在を検出する方法。
[63] 抗原結合分子のCLDN6への結合を許容する条件下で、生体試料を抗原結合分子と接触させ、抗原結合分子とCLDN6との間で複合体が形成されるかどうかを検出する、[62] に記載の方法。
[64] 対象由来の生体試料を、[34]～[41] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と接触させる段階を含む、対象ががんを有するか否かを診断する方法。
[65] 抗原結合分子のCLDN6への結合を許容する条件下で、生体試料を抗原結合分子と接触させ、抗原結合分子とCLDN6との間で複合体が形成されるかどうかを検出する、[64] に記載の方法。
[66] がんが卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんである、[64] または [65] に記載の方法。
[67] [34]～[41] のいずれか1つに記載の抗原結合分子をコードする、単離された核酸。
[68] [67] に記載の核酸を含む宿主細胞。
[69] 抗原結合分子が産生されるように、[68] に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗原結合分子を産生する方法。
[70] 宿主細胞の培養から抗原結合分子を回収する段階をさらに含む、[69] に記載の方法。
さらに、本開示はまた以下を提供する：
[71] CLDN6に対する結合活性を有する第1の抗原結合部位、および
T細胞受容体複合体に対する結合活性を有する第2の抗原結合部位
を含む、抗原結合分子であって、
第1の抗原結合部位が、
(a) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む重鎖可変領域：
(a1) それぞれ配列番号： 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列；ならびに
(a2) 配列番号： 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
ならびに
(b) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む軽鎖可変領域：
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；ならびに
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
によって形成される、抗原結合分子。
[72] 第1の抗原結合部位を形成する重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、マウス、ウサギ、ヒト化、またはヒトフレームワークをさらに含む、[71] に記載の抗原結合分子。
[73] CLDN6に対する結合活性を有する第1の抗原結合部位、および
T細胞受容体複合体に対する結合活性を有する第2の抗原結合部位
を含む、抗原結合分子であって、
第1の抗原結合部位が、配列番号： 85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、および57より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号： 87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82 および58より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗原結合分子。
[74] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[71]～[73] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[75] 第1の抗原結合部位が、配列番号： 125または126に規定されるヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[71]～[74] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[76] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN9に実質的に結合しない、[71]～[75] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[77] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN4に実質的に結合しない、[71]～[76] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[78] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN3に実質的に結合しない、[71]～[77] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[79] 第1の抗原結合部位が、配列番号： 134に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない、[71]～[78] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[80] 第1の抗原結合部位が単鎖Fv (scFv)、Fv、またはFab中に含まれる、[71]～[73] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[81] 第2の抗原結合部位がCD3に対する結合活性を有する、[71]～[80] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[82] 第2の抗原結合部位がCD3ε鎖に対する結合活性を有する、[71]～[80] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[83] 第2の抗原結合部位がT細胞受容体に結合する活性を有する、[71]～[80] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[84] 第2の抗原結合部位が、それぞれ配列番号： 122、123、および124のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびにそれぞれ配列番号： 114、115および116のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域によって形成される、[71]～[82] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[85] 重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、マウス、ウサギ、ヒト化、またはヒトフレームワークを含む、[84] に記載の抗原結合分子。
[86] 第2の抗原結合部位が、配列番号： 60および70より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号： 61および71より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域によって形成される、[71]～[82] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[87] 第2の抗原結合部位が単鎖Fv (scFv)、Fv、またはFab中に含まれる、[71]～[86] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[88] 抗体Fc領域をさらに含む、[71]～[87] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[89] Fc領域が、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である、[88] に記載の抗原結合分子。
[90] Fc領域が、 配列番号： 143～146（IgG1～IgG4）のFc領域構成アミノ酸のうちのいずれかに少なくとも1つのアミノ酸変異を有するFc領域である、[88] または [89] に記載の抗原結合分子。
[91] Fc領域が、EUナンバリングによって特定される以下のアミノ酸位置：
220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、および332位
より選択される少なくとも1つのアミノ酸の変異を有するFc領域である、[88]～[90] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[92] Fc領域が、EUナンバリングによって特定される以下のアミノ酸：
アミノ酸234位のArg、アミノ酸235位のAlaまたはArg、アミノ酸239位のLys、およびアミノ酸297位のAla
より選択される少なくとも1つのアミノ酸を含むFc領域である、[88]～[91] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[93] 第1の抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメインが、第1のCH1ドメインを介してFc領域に連結され、第1の抗原結合部位を形成する軽鎖可変ドメインが、第1のCLドメインに連結されており；かつ
第2の抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメインが、第2のCH1ドメインを介してFc領域に連結され、第2の抗原結合部位を形成する軽鎖可変ドメインが、第2のCLドメインに連結されている、
[88]～[92] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[94] 第1の抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域が、第1の抗原結合ドメインを形成する軽鎖可変領域と会合する、および／または第2の抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域が、第2の抗原結合ドメインを形成する軽鎖可変領域と会合するように、CH1ドメインおよびCLドメインの電荷が制御されている、[93] に記載の抗原結合分子。
[95] 細胞傷害活性を有する、[71]～[94] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[96] 細胞傷害活性がT細胞依存性細胞傷害活性である、[95] に記載の抗原結合分子。
[97] [71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[98] [97] に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
[99] 抗原結合分子が産生されるように、[98] に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗体を産生する方法。
[100] 宿主細胞の培養から抗原結合分子を回収する段階をさらに含む、[99] に記載の方法。
[101] [71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[102] T細胞依存性細胞傷害を誘導する、[101] に記載の医薬組成物。
[103] がんの治療および／または予防のために使用される医薬組成物である、[101] または [102] に記載の組成物。
[104] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防のために使用される医薬組成物である、[101]～[103] のいずれか1つに記載の組成物。
[105] 医薬の製造における、[71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の使用。
[106] がんの治療および／または予防のための医薬の製造における、[71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の使用。
[107] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防のための医薬の製造における、[71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の使用。
[108] [71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を治療する方法。
[109] [71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の有効量を個体に投与する段階を含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんを有する個体を治療する方法。
[110] 少なくとも[71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と、使用説明書とを含む、がんの治療および／または予防における使用のためのキット。
[111] 少なくとも[71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と、使用説明書とを含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防における使用のためのキット。
本開示は、T細胞をCLDN6発現細胞に近接させ、CLDN6発現がん細胞に対するT細胞の細胞傷害性を用いることによってがんの治療を可能にする多重特異性抗原結合分子、該多重特異性抗原結合分子を産生する方法、およびそのような多重特異性抗原結合分子を有効成分として含有する、細胞傷害を誘導するための医薬組成物を提供する。本開示の多重特異性抗原結合分子は、強い抗腫瘍活性を有して細胞傷害を誘導し、CLDN6発現細胞を標的としかつ損傷することができ、したがって様々ながんの治療および予防を可能にする。さらに、特定の配列を含む抗原結合分子はまた、CLDN6に対する優れた特異性、長い血中半減期、ならびに向上した安全性特性、安定性、および製造性を有する。
本開示はまた、CLDN6に対する優れた特異性を示す抗原結合分子を提供し、これにより、生体試料中のCLDN6の存在の正確な検出、および様々ながんの診断が可能になる。CLDN6発現細胞を標的とすることによるがん治療もまた可能になる。
抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01、および6PHU3/TR01）のT細胞活性化活性。各抗体のT細胞活性化活性を、hCLDN6/BaF (A)、hCLDN9/BaF (B)、およびhCLDN6(Q156L)/BaF (C) の存在下で調べた。縦軸は、抗体を含まないウェルと比較した抗体を含むウェルの発光倍率を示し、横軸は抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の濃度を示す。 抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01、および 6PHU3/TR01）の、ヒトおよびマウスのクローディンファミリータンパク質に対する結合特異性。抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の相対的な結合活性を、10μg/mlの濃度でフローサイトメーターにより調べた。縦軸は、ヒトまたはマウスのCLDN3、CLDN4、CLDN6、およびCLDN9を一過性に発現するFreeStyle（商標）293-Fトランスフェクタントに対する抗体結合のMFI値を示す。KLH/TR01を陰性対照として使用した。市販のヒトCLDN6抗体 (MAB3656)、ヒトCLDN3抗体 (MAB4620)、およびヒトCLDN4抗体 (MAB4219) を対照として試験した。 図2-1の続き。 抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（AE3-20/TR01、AH05/TR01、および6PHU3/TR01）のin vivo抗腫瘍効果。図3aはHuH-7 T細胞注入モデルの腫瘍体積変化を示し、図3bはOV-90 T細胞注入モデルの腫瘍体積変化を示す。本試験では、腫瘍接種後の14日目に、各群 (n=5) に5mg/kgの抗体または溶媒を静脈内投与した。 図3に記載の、5 mg/kgの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（AE3-20/TR01、AH05/TR01、および6PHU3/TR01）で処置したマウスの体重変化。HuH-7担持T細胞注入モデル (a) およびOV-90担持T細胞注入モデル (b) の体重変化をそれぞれ示す。縦軸は体重を示し、横軸は腫瘍移植後の日数を示す。 図3に記載の、5 mg/kgの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（AE3-20/TR01、AH05/TR01、および6PHU3/TR01）または溶媒の投与後のOV-90 T細胞注入モデルにおける、血漿ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH、およびTBAレベル。縦軸は、それぞれALT（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ALP（アルカリホスファターゼ）、GGT（γ-グルタミルトランスペプチダーゼ）、GLDH（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、TBIL（総ビリルビン）、およびTBA（総胆汁酸）の濃度を示す。 図3に記載の、5mg/kgの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（AE3-20/TR01、AH05/TR01、および6PHU3/TR01）で処置したマウスにおける、抗体濃度の経時変化。HuH-7 T細胞注入モデル（上部）およびOV-90 T細胞注入モデル（下部）における抗体の血漿濃度をそれぞれ示す。縦軸はマウス血漿中の抗体濃度（μg/mL）を示し、横軸は処置後の日数を示す。 OVCAR-3 T 細胞注入モデルにおける抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のin vivo抗腫瘍効果および体重変化。腫瘍移植後の29日目に、マウスを5mg/kgのAE3-20/TR01、CDA0013/TR01、または溶媒で静脈内より処置した。処置後に、腫瘍体積（上部）および体重（下部）を調べた。 図7に記載のOVCAR-3 T細胞注入モデルにおける5 mg/kgのCDA0013/TR01による処置後の、血漿ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH、およびTBAレベル。縦軸はそれぞれ、CDA0013/TR01の投与後または未処置後のALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH、およびTBAの濃度を示す。 図7に記載のOVCAR-3 T細胞注入モデルにおける、AE3-20/TR01およびCDA0013/TR01の濃度の経時変化。縦軸はマウス血漿中の抗体濃度（μg/mL）を示し、横軸は処置後の日数を示す。 hCLDN6/BaFに対する様々な抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の結合活性。縦軸は、結合活性に比例すると捉えられる、hCLDN6/BaFに対する抗体のMFI値を示す。 hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下における、様々な抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化活性。横軸は、抗体を含まないウェルと比較した抗体を含むウェルの発光倍率を示す。KLH/TR01を陰性対照として使用した。バーは、下から以下の順序で示される：CLDN6、CLDN3、CLDN4、およびCLDN9。 図11の続き。 hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下における、様々な抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化活性。横軸は、抗体を含まないウェルと比較した抗体を含むウェルの発光倍率を示す。1 nMおよび0.1 nMのKLH/TR01は、hCLDN6/BaFの存在下では試験しなかった。KLH/TR01を陰性対照として使用した。バーは、下から以下の順序で示される：CLDN6（抗体濃度10 nM）、CLDN6（抗体濃度1 nM）、CLDN6（抗体濃度0.1 nM）、CLDN3（抗体濃度10 nM）、CLDN4（抗体濃度10 nM）、およびCLDN9（抗体濃度10 nM）。 hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下における、様々な抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化活性。横軸は、抗体を含まないウェルと比較した抗体を含むウェルの発光倍率を示す。1 nMおよび0.1 nMのKLH/TR01は、hCLDN6/BaFの存在下では試験しなかった。KLH/TR01を陰性対照として使用した。バーは、下から以下の順序で示される：CLDN6（抗体濃度10 nM）、CLDN6（抗体濃度1 nM）、CLDN6（抗体濃度0.1 nM）、CLDN3（抗体濃度10 nM）、CLDN4（抗体濃度10 nM）、およびCLDN9（抗体濃度10 nM）。 hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下における、様々な抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化活性。横軸は、抗体を含まないウェルと比較した抗体を含むウェルの発光倍率を示す。1 nMおよび0.1 nMのKLH/TR01は、hCLDN6/BaFの存在下では試験しなかった。KLH/TR01を陰性対照として使用した。バーは、下から以下の順序で示される：CLDN6（抗体濃度10 nM）、CLDN6（抗体濃度1 nM）、CLDN6（抗体濃度0.1 nM）、CLDN3（抗体濃度10 nM）、CLDN4（抗体濃度10 nM）、およびCLDN9（抗体濃度10 nM）。 65H0671Q39E-SG1189v14k/54L0571Q38K-SK1018//TR01H(Q39K)-SG1191v14h/TR01L(Q38E)-SK1017 (A) および65H0671Q39E-SG1189v14k/54L0571Q38K-SK1021//TR01H(Q39K)-SG1191v14h/TR01L(Q38E)-SK1017 (B) の電荷不均一性。電荷不均一性およびpI値は、Maurice (ProteineSimple) を用いて280 nmにおけるUV吸光度で評価した。データ解析には、関連ソフトウェアCompass for iCE (2.0.10) を使用した。 OV-90 T細胞注入モデルにおける抗CLDN6/CD3二重特異性抗体AE3-20/TR01およびCS2201のin vivo抗腫瘍効果。腫瘍移植後の14日目に、0.1 mg/kgの各抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の単一用量を静脈内投与した。腫瘍体積の変化（上部）および体重（下部）をそれぞれ示す。 OV-90 T細胞注入モデルにおける抗CLDN6/CD3二重特異性抗体AE3-20/TR01およびCS2201のin vivo抗腫瘍効果。腫瘍移植後の15日目に、5 mg/kgの各抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の単一用量を静脈内投与した。腫瘍体積の変化（上部）および体重（下部）をそれぞれ示す。 図17および図18に記載のOV-90 T細胞注入モデルにおける5 mg/kgのAE3-20/TR01またはCS2201による処置後の、血漿ALT、GLDH、TBA、ALP、およびTBILレベル。縦軸は、AE3-20/TR01、CS2201、および溶媒の投与後のALT、GLDH、TBA、ALP、およびTBILの濃度を示す。 図17および図18に記載のOV-90 T細胞注入モデルにおける、AE3-20/TR01およびCS2201の濃度の経時変化。縦軸はマウス血漿中の抗体濃度（μg/mL）を示し、横軸は処置後の日数を示す。 OV-90 T細胞注入モデルにおける抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS2425のin vivo抗腫瘍効果。腫瘍移植後の15日目に、0.1 mg/kgのCS2425の単一用量を静脈内投与した。腫瘍体積の変化（上部）および体重の変化（下部）をそれぞれ示す。 OV-90 T細胞注入モデルにおける抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS2425のin vivo抗腫瘍効果。腫瘍移植後の15日目に、5 mg/kgのCS2425の単一用量を静脈内投与した。腫瘍体積の変化（上部）および体重の変化（下部）をそれぞれ示す。 図21Aおよび図21Bに記載のOV-90 T細胞注入モデルにおけるCS2425による処置後の、血漿ALT、GGT、TBA、ALP、およびTBILレベル。縦軸は、0.1 mg/kgおよび5 mg/kgのCS2425または溶媒の投与後のALT、GGT、TBA、ALP、およびTBILの濃度を示す。 図21Aおよび図21Bに記載のOV-90 T細胞注入モデルにおける、CS2425の濃度の経時変化。縦軸はマウス血漿中の抗体濃度（μg/mL）を示し、横軸は処置後の日数を示す。 陰性対照および陽性対照を含む試験物質の各々の存在下で67時間培養したCD8-CD25low PBMCにおけるIL-2分泌CD4+ T細胞の割合の最大値を示す図。データは、使用したPBMCの由来元の各ドナーについての、IL-2分泌CD4+ T細胞の割合の最大値を示す。抗原なしは、試験物質の非存在下で培養を行った場合の試験対照の結果を示す。点線は陽性閾値を示す。 CS2425の軽鎖の一部についてMAPPsにより同定された、アミノ酸位置当たりのペプチドの数のヒートマップを示す図。その領域のアミノ酸位置ごとに同定されたペプチドの数をヒートマップで示し、セルの色は同定されたペプチドの数を表す（キーを参照のこと）。ペプチド-MHC II複合体は、単球から分化させ、CS2425でパルスしたDCから得た。 陰性対照および陽性対照を含む試験物質の各々の存在下で67時間培養したCD8-CD25low PBMCにおけるIL-2分泌CD4+ T細胞の割合の最大値を示す図。データは、使用したPBMCの由来元の各ドナーについての、IL-2分泌CD4+ T細胞の割合の最大値を示す。抗原なしは、試験物質の非存在下で培養を行った場合の試験対照の結果を示す。点線は陽性閾値を示す。 OV-90 T細胞注入モデルでの、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS2201、CS2425、CS2884、CS2885、およびCS2886で処置したマウスにおけるin vivo抗腫瘍効果。腫瘍移植後の15日目に、5 mg/kgの各抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の単一用量を静脈内投与した。5 mg/kgの各抗体の単回投与後のマウスにおいて、腫瘍体積（上部）および体重（下部）を調べた。 図27に示される、OV-90 T細胞注入モデルでの、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS2201、CS2425、CS2884、CS2885、およびCS2886で処置したマウスにおける肝損傷マーカーの血漿レベル。各抗CLDN6/CD3二重特異性抗体による処置後のマウスにおいて、血漿ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH、およびTBAレベルを評価した。縦軸は、5 mg/kgの各抗CLDN6/CD3二重特異性抗体または溶媒の投与後の、マウス血漿中のALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH、およびTBAの濃度を示す。 OV-90 T細胞注入モデルでの、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS2201、CS2425、CS2958、CS2959、CS2960、およびCS2961で処置したマウスにおけるin vivo抗腫瘍効果。腫瘍移植後の15日目に、5 mg/kgの各抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の単一用量を静脈内投与した。5 mg/kgの各抗体の単回投与後のマウスにおいて、腫瘍体積（上部）および体重（下部）を調べた。 図29に示される、OV-90 T細胞注入モデルでの、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS2201、CS2425、CS2958、CS2959、CS2960、およびCS2961で処置したマウスにおける肝損傷マーカーの血漿レベル。各抗CLDN6/CD3二重特異性抗体による処置後のマウスにおいて、血漿ALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH、およびTBAレベルを評価した。縦軸は、5 mg/kgの各抗CLDN6/CD3二重特異性抗体または溶媒の投与後の、マウス血漿中のALT、GGT、TBIL、ALP、GLDH、およびTBAの濃度を示す。 図29に記載のOV-90 T細胞注入モデルにおける、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS2201、CS2425、CS2958、CS2959、CS2960、およびCS2961の濃度の経時変化。縦軸はマウス血漿中の抗体濃度（μg/mL）を示し、横軸は処置後の日数を示す。 GloResponse（商標）NFAT-luc2 Jurkat細胞を用いるT細胞活性化バイオアッセイにより決定された、hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、hCLDN9/BaF、またはhCLDN6(Q156L)/BaFの存在下における、様々な濃度の抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425、およびCS2961）のT細胞活性化活性。縦軸は、抗体を含まないウェルと比較した抗体を含むウェルの発光倍率を示す。KLH/TR01を陰性対照として使用した。 GloResponse（商標）NFAT-luc2 Jurkat細胞を用いるT細胞活性化バイオアッセイにより決定された、hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下における、様々な濃度の抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（CS2201、CS2961、CS3346、CS3347、およびCS3348）のT細胞活性化活性。縦軸は、抗体を含まないウェルと比較した抗体を含むウェルの発光倍率を示す。KLH/TR01を陰性対照として使用した。 LDHアッセイにより決定された、CLDN6を発現するOVCAR3卵巣がん細胞株に対する抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425、CS2961、CS3346、CS3347、およびCS3348）のT細胞依存性細胞傷害。縦軸は細胞溶解の割合を示し、横軸は抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の濃度を示す。KLH/TR01を陰性対照として使用した。 ヒトCLDNファミリータンパク質（CLDN3、CLDN4、CLDN6、およびCLDN9）に対する抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（CS2201、CS2961、AH05/TR01、および6PHU3/TR01）の結合活性。BaF3トランスフェクタント（hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、およびhCLDN9/BaF）に対する抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の結合活性を、15μg/mlの濃度でフローサイトメーターにより調べ、ヒストグラムとしてプロットした。KLH/TR01を陰性対照として使用した。CS2961のヒトCLDN6に対する特異性が、試験した抗体の中で最も高かった。 図35-1の続き。 40℃での保存後の抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のHMW種形成。縦軸は、各試料の全ピーク面積に占めるHMW種の割合を示す。 OV-90 T細胞注入モデルにおける抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の、in vivoの用量依存的な抗腫瘍効果。腫瘍移植の14日後に、0.001～5 mg/kgの範囲のAE3-20/TR01の単一用量を静脈内投与した。腫瘍体積の変化（上部）および体重の変化（下部）をそれぞれ示す。 OV-90 T細胞注入モデルにおける抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の、in vivoの用量依存的な抗腫瘍効果。腫瘍移植の15日後に、0.0016～5 mg/kgの範囲のCS3348の単一用量を静脈内投与した。腫瘍体積の変化（上部）および体重の変化（下部）をそれぞれ示す。 。ヒトCLDN9とヒトCLDN6のアミノ酸配列アラインメント。ヒトCLDN9とヒトCLDN6は、N末端残基（29位のMet/Leu）を除き、細胞外ドメイン1においてほぼ同じ配列を含む。ヒトCLDN9とヒトCLDN6では、細胞外ドメイン2における2つのアミノ酸が異なる（145位のArg/Leuおよび156位のGln/Leu）。 OVCAR-3担持T細胞注入モデル（TK220001）における抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS3348の抗腫瘍効果。 NCI-H1435担持T細胞注入モデル（TK219005）における抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS3348の抗腫瘍効果。 NUGC-3担持T細胞注入モデル（TK220003）における抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS3348の抗腫瘍効果。
本明細書において記載または参照される技法および手順は、概して十分に理解されており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)：PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))、Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual、およびAnimal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；ならびにCancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993) に記載される広く利用されている方法論などの従来の方法論を使用して当業者によって一般的に用いられるものである。
以下の定義および詳細な説明は、本明細書において説明する本開示の理解を容易にするために提供される。
定義
アミノ酸
本明細書において、アミノ酸は、1文字コードもしくは3文字コードまたはその両方、例えば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、またはVal/Vによって記載される。
アミノ酸の改変
抗原結合分子のアミノ酸配列中のアミノ酸改変（本明細書内で「アミノ酸置換」とも称される）のためには、部位特異的変異誘発法（Kunkelら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））および重複伸長PCRなどの公知の方法が適宜採用され得る。さらに、非天然アミノ酸に置換するためのアミノ酸改変方法として、いくつかの公知の方法もまた採用され得る（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249；およびProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合したtRNAを含む無細胞翻訳系 (Clover Direct (Protein Express)) を用いることが適切である。
本明細書において、アミノ酸改変の部位を記載する際の用語「および／または」の意味は、「および」と「または」が適切に組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば、「33位、55位、および／または96位のアミノ酸が置換される」は、アミノ酸改変の以下のバリエーションを含む：(a) 33位、(b) 55位、(c) 96位、(d) 33位および55位、(e) 33位および96位、(f) 55位および96位、ならびに (g) 33位、55位、および96位のアミノ酸。
さらに、本明細書において、アミノ酸の改変を示す表現として、特定の位置を表す数字の前および後に、それぞれ改変前および改変後のアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードを示す表現が、適宜使用され得る。例えば、抗体可変領域中に含まれるアミノ酸を置換する際に用いられるN100bLまたはAsn100bLeuという改変は、100b位（Kabatナンバリングによる）におけるAsnの、Leuによる置換を表す。すなわち、数字はKabatナンバリングによるアミノ酸の位置を示し、数字の前に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換前のアミノ酸を示し、数字の後に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換後のアミノ酸を示す。同様に、抗体定常領域中に含まれるFc領域のアミノ酸を置換する際に用いられるP238DまたはPro238Aspという改変は、238位（EUナンバリングによる）におけるProの、Aspによる置換を表す。すなわち、数字はEUナンバリングによるアミノ酸の位置を示し、数字の前に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換前のアミノ酸を示し、数字の後に記載される1文字または3文字のアミノ酸コードは置換後のアミノ酸を示す。
抗原結合分子
本明細書で用いられる用語「抗原結合分子」は、抗原結合部位を含む任意の分子または抗原に対する結合活性を有する任意の分子のことをいい、さらに、約5アミノ酸またはそれ以上の長さを有するペプチドまたはタンパク質などの分子のことをいい得る。ペプチドおよびタンパク質は、生物由来のものに限定されず、例えば人工的に設計された配列から製造されたポリペプチドであってもよい。それらはまた、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれかであってもよい。骨格としてα/βバレルなどの公知の安定した立体構造を含み、分子の一部が抗原結合部位となる骨格分子もまた、本明細書に記載される抗原結合分子の1つの態様である。
クローディン6(CLDN6)およびその他のクローディンファミリータンパク質
本明細書で用いられる用語「CLDN6」は、別段示さない限り、霊長類（例えば、ヒト）ならびにげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然型クローディン6のことをいう。ヒトCLDN6(hCLDN6)のアミノ酸配列は配列番号： 125または126に示され、マウスCLDN6 (mCLDN6) のアミノ酸配列は配列番号： 130に示される。
クローディンファミリー内には、CLDN6以外にも、CLDN3、CLDN4、およびCLDN9などの多くの他のタンパク質が存在する。ヒトCLDN3 (hCLDN3)、ヒトCLDN4 (hCLDN4)、およびヒトCLDN9 (hCLDN9) のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号： 128、129、および127に示される。マウスCLDN3 (mCLDN3)、マウスCLDN4 (mCLDN4)、およびマウスCLDN9 (mCLDN9) のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号： 132、133、および131に示される。
CLDN6に対する結合活性
本明細書に記載されるCLDN6に対する結合活性は、本明細書に記載されるCLDN6タンパク質、またはCLDN6タンパク質の部分ペプチドの全体もしくは一部に対する特異的な結合活性のことをいう。
ある特定の態様において、CLDN6に対する結合活性は、CLDN6の第1細胞外ドメイン（SEQ ID NO :125もしくは126のアミノ酸29～81）またはCLDN6の第2細胞外ドメイン（SEQ ID NO :125もしくは126のアミノ酸138～159）に対する結合活性である。ある特定の態様において、CLDN6に対する結合活性は、真核細胞の表面上に発現されたヒトCLDN6に対する結合活性である。ある特定の態様において、CLDN6に対する結合活性は、がん細胞の表面上に発現されたCLDN6タンパク質に対する結合活性である。
T細胞受容体複合体に対する結合活性
本明細書で用いられるT細胞受容体複合体に対する結合活性は、T細胞受容体複合体の部分ペプチドの全体または一部に対する結合活性のことをいう。T細胞受容体複合体は、T細胞受容体自体であってもよいし、またはT細胞受容体と共にT細胞受容体複合体を構成するアダプター分子であってもよい。CD3はアダプター分子として適している。
本明細書で用いられるT細胞受容体に対する結合活性は、T細胞受容体の部分ペプチドの全体または一部に対する結合活性のことをいう。T細胞受容体の一部は、T細胞受容体の可変領域またはT細胞受容体の定常領域であってよい；しかしながら、定常領域に存在するエピトープが好ましい。定常領域配列の例には、RefSeq登録番号CAA26636.1のT細胞受容体α鎖 (配列番号： 135)、RefSeq登録番号C25777のT細胞受容体β鎖 (配列番号： 136)、RefSeq登録番号A26659のT細胞受容体γ1鎖 (配列番号： 137)、RefSeq登録番号AAB63312.1のT細胞受容体γ2鎖 (配列番号： 138)、およびRefSeq登録番号AAA61033.1のT細胞受容体δ鎖 (配列番号： 139) が含まれる。
本明細書で用いられるCD3に対する結合活性は、CD3の部分ペプチドの全体または一部に対する結合活性のことをいう。CD3の一部は、ヒトCD3を構成するγ鎖、δ鎖、またはε鎖配列に存在する任意のエピトープであってよい。CD3を構成するγ鎖、δ鎖、またはε鎖の構造に関して、それらのポリヌクレオチド配列は、RefSeq登録番号NM_000073.2、NM_000732.4、およびNM_000733.3に開示されており、ならびにそれらのポリペプチド配列は、配列番号： 140 (NP_000064.1)、141 (NP_000723.1)、および142 (NP_000724.1) に示されており、この場合RefSeq登録番号はカッコ内に示される。
アフィニティ
「アフィニティ」は、分子（例えば、抗原結合分子または抗体）の結合部位1個と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。別段示さない限り、本明細書で用いられる「結合アフィニティ」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗原結合分子と抗原、または抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する、固有の結合アフィニティのことをいう。分子XのそのパートナーYに対するアフィニティは、一般的に、解離定数 (Kd) により表すことができる。アフィニティは、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合アフィニティを測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。
アフィニティを決定する方法
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子または抗体は、その抗原に対して、≦1μM、≦120nM、≦100nM、≦80nM、≦70nM、≦50nM、≦40nM、≦30nM、≦20nM、≦10nM、≦2nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM（例えば、10-8M以下、10-8M～10-13M、10-9M～10-13M）の解離定数 (Kd) を有する。特定の態様において、CLDN6に対する、抗体／抗原結合分子のKd値は、1～40、1～50、1～70、1～80、30～50、30～70、30～80、40～70、40～80、または60～80nMの範囲内に入る。
一態様において、Kdは、放射性標識抗原結合測定法 (radiolabeled antigen binding assay: RIA) によって測定される。一態様において、RIAは、目的の抗体のFabバージョンおよびその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するFabの溶液中結合アフィニティは、非標識抗原の漸増量系列の存在下で最小濃度の (125I) 標識抗原によりFabを平衡化させ、次いで結合した抗原を抗Fab抗体でコーティングされたプレートにより捕捉することによって測定される。（例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) を参照のこと）。測定条件を構築するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート (Thermo Scientific) を50mM炭酸ナトリウム (pH9.6) 中5μg/mlの捕捉用抗Fab抗体 (Cappel Labs) で一晩コーティングし、その後に室温（およそ23℃）で2～5時間、PBS中2％ (w/v) ウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着プレート (Nunc #269620) において、100 pMまたは26 pMの [125I]-抗原を、（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997) における抗VEGF抗体、Fab-12の評価と同じように）目的のFabの段階希釈物と混合する。次いで、目的のFabを一晩インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡が確実に達成されるよう、より長時間（例えば、約65時間）継続され得る。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、1時間）のために捕捉プレートに移す。次いで溶液を除去し、プレートをPBS中0.1％のポリソルベート20（TWEEN-20（登録商標））で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）、Packard）を添加し、TOPCOUNT（商標）ガンマカウンター (Packard) においてプレートを10分間カウントする。最大結合の20％以下を与える各Fabの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選択する。
別の態様によれば、Kdは、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。例えば、BIACORE（登録商標）-2000またはBIACORE（登録商標）-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) を用いる測定法が、およそ10反応単位 (response unit: RU) の抗原が固定されたCM5チップを用いて25℃で実施される。一態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ (CM5、BIACORE, Inc.) は、供給元の指示にしたがいN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド (EDC) およびN-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) を用いて活性化される。抗原は、およそ10反応単位 (RU) のタンパク質の結合を達成するよう、5μl/分の流速で注入される前に、10mM酢酸ナトリウム、pH4.8を用いて5μg/ml（およそ0.2μM）に希釈される。抗原の注入後、未反応基をブロックするために1Mエタノールアミンが注入される。キネティクスの測定のために、25℃、およそ25μl/分の流速で、0.05％ポリソルベート20（TWEEN-20（商標））界面活性剤含有PBS (PBST) 中のFabの2倍段階希釈物 (0.78nM～500nM) が注入される。結合速度 (kon) および解離速度 (koff) は、単純な1対1ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）評価ソフトウェアバージョン3.2）を用いて、結合および解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって計算される。平衡解離定数 (Kd) は、koff/kon比として計算される。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) を参照のこと。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによってオン速度が106M-1s-1を超える場合、オン速度は、分光計（例えばストップフロー式分光光度計 (Aviv Instruments) または撹拌キュベットを用いる8000シリーズのSLM-AMINCO（商標）分光光度計 (ThermoSpectronic)）において測定される、漸増濃度の抗原の存在下でのPBS、pH7.2中20nMの抗抗原抗体（Fab形態）の25℃での蛍光発光強度（励起=295nm；発光=340nm、バンドパス16nm）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を用いることによって決定され得る。
上述した抗原結合分子または抗体のアフィニティを測定するための方法に従って、当業者は他の抗原結合分子または抗体の様々な種類の抗原に対するアフィニティ測定を行うことができる。
抗体
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
抗体のクラス
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
別段示さない限り、軽鎖定常領域中のアミノ酸残基は、本明細書ではKabatらに従ってナンバリングされ、重鎖定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されているような、EUインデックスとも呼ばれる、EUナンバリングシステムに従う。
フレームワーク
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
ヒトコンセンサスフレームワーク
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。一態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。
HVR
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3は、それぞれ「H-CDR1」、「H-CDR2」、「H-CDR3」、「L-CDR1」、「L-CDR2」、および「L-CDR3」ともいわれる。
可変領域
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
キメラ抗体
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体のことをいう。同様に、用語「キメラ抗体可変ドメイン」は、重鎖および／または軽鎖可変領域の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖可変領域の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体可変領域のことをいう。
ヒト化抗体
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR（例えばCDR）は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体のことをいう。「ヒト化抗体可変領域」は、ヒト化抗体の可変領域のことをいう。
ヒト抗体
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。「ヒト抗体可変領域」は、ヒト抗体の可変領域のことをいう。
ポリヌクレオチド（核酸）
本明細書でいい換え可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことをいい、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、またはDNAもしくはRNAポリメラーゼによってまたは合成反応によってポリマーに組み込まれ得る任意の物質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列に、非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、標識へのコンジュゲーションなどの、合成後になされる修飾を含み得る。他のタイプの修飾は、例えば、「キャップ」、1つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドとアナログとの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバメート等）および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を伴うもの、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等）などのペンダント部分を含むもの、インターカレート剤（例えば、アクリジン、ソラレン等）を伴うもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸等）や非修飾形態のポリヌクレオチドを伴うものを含む。さらに、通常糖に存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置換され得、標準的な保護基によって保護され得、もしくはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を生成するよう活性化され得、または固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされ得る。5’および3’末端のOHは、リン酸化またはアミンもしくは1～20炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、例えば以下のものを含む、当技術分野で一般に公知となっているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含み得る：2'-O-メチル-、2'-O-アリル-、2'-フルオロ-、または2'-アジド-リボース、炭素環式糖アナログ、α-アノマー糖、アラビノースまたはキシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、およびメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシドアナログ。1つまたは複数のホスホジエステル結合は、代替の連結基によって置き換えられ得る。これらの代替の連結基は、これらに限定されるものではないが、ホスフェートが以下のものによって置き換えられている態様を含む：P(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、(O)NR2（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、CO、またはCH2（「ホルムアセタール」）、ここで、各RまたはR'は独立してH、または、任意でエーテル（-O-）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含む置換もしくは非置換アルキル（1～20C）である。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。上記の説明は、RNAおよびDNAを含む本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
単離された（核酸）
「単離された」核酸分子は、そのもともとの環境の成分から分離されたものである。単離された核酸分子はさらに、その核酸分子を通常含む細胞中に含まれているが、染色体外にまたはその本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在する核酸分子を含む。
ベクター
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。ベクターは、ウイルスまたはエレクトロポレーションを使用して宿主細胞に導入することができる。しかしながら、ベクターの導入はin vitro法に限定されない。例えば、ベクターは、in vivo法を使用して対象に直接導入することができる。
宿主細胞
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
特異性
「特異的」とは、1つまたは複数の結合パートナーに特異的に結合する分子が、該パートナー以外の分子に対して何ら有意な結合を示さないことを意味する。さらに、「特異的」とはまた、抗原結合部位が、抗原中に含まれる複数のエピトープのうちの特定のエピトープに特異的である場合にも用いられる。抗原結合分子が抗原に特異的に結合する場合、「抗原結合分子が抗原に対する特異性を有する/示す」とも記載される。抗原結合部位が結合するエピトープが複数の異なる抗原中に含まれる場合、該抗原結合部位を含む抗原結合分子は、該エピトープを有する様々な抗原に結合し得る。
抗体断片
「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体のことをいう。
可変断片（Fv）
本明細書において、用語「可変断片（Fv）」は、抗体の軽鎖可変領域（VL）と抗体の重鎖可変領域（VH）とのペアから構成される抗体由来の抗原結合部位の最小単位のことをいう。1988年にSkerraとPluckthunは、細菌のシグナル配列の下流に抗体遺伝子を挿入し大腸菌中で当該遺伝子の発現を誘導することによって、均一でかつ活性な抗体が大腸菌のペリプラズム画分から調製され得ることを見出した（Science (1988) 240 (4855), 1038-1041）。ペリプラズム画分から調製されたFvにおいては、抗原に結合するような様式でVHとVLが会合している。
scFv、単鎖抗体、およびsc(Fv) 2
本明細書において、用語「scFv」、「単鎖抗体」、および「sc(Fv)2」はいずれも、重鎖および軽鎖に由来する可変領域を含むが、定常領域を含まない、単一ポリペプチド鎖の抗体断片のことをいう。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる所望の構造の形成を可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)」においてPluckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際公開公報WO1988/001649、米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照のこと。特定の態様において、単鎖抗体は、二重特異性でありかつ／またはヒト化され得る。
scFvはFvを形成するVHとVLとがペプチドリンカーによって連結された一本鎖低分子量抗体である（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883）。当該ペプチドリンカーによってVHとVLとが近接した状態に保持され得る。
sc(Fv)2は、2つのVLと2つのVHの4つの可変領域がペプチドリンカー等のリンカーによって連結され一本鎖を形成する単鎖抗体である（J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189）。この2つのVHと2つのVLは異なるモノクローナル抗体に由来してもよい。そのようなsc(Fv)2としては、例えば、Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374に開示されるような、単一抗原中に存在する2つのエピトープを認識する二重特異性sc(Fv)2が好適に挙げられる。sc(Fv)2は、当業者に公知の方法によって製造され得る。例えば、sc(Fv)2は、scFvをペプチドリンカー等のリンカーで連結することによって製造され得る。
本明細書において、sc(Fv)2は、一本鎖ポリペプチドのN末端を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］）の順に並んでいる2つのVH単位および2つのVL単位を含む抗体が挙げられる。2つのVH単位と2つのVL単位の順序は上記の構成に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。構成の例を以下に列挙する。
［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］
［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］
［VH］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VL］
［VL］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VH］
［VL］-リンカー-［VH］-リンカー-［VL］-リンカー-［VH］
sc(Fv)2の分子形態についてはWO2006/132352においても詳細に記載されている。当業者であればこれらの記載に従って、本明細書で開示されるポリペプチド複合体を製造するために所望のsc(Fv)2を適宜調製することが可能である。
さらに本開示の抗原結合分子または抗体に、PEG等の担体高分子や抗がん剤等の有機化合物をコンジュゲートしてもよい。あるいは、糖鎖が所望の効果をもたらすように、糖鎖付加配列が抗原結合分子または抗体に好適に挿入される。
抗体の可変領域の連結に使用するリンカーは、遺伝子工学により導入され得る任意のペプチドリンカー、合成リンカー、および例えばProtein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを含む。しかしながら、本開示においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。長さは、好ましくは5アミノ酸以上（特に限定されないが、上限は通常、30アミノ酸以下、好ましくは20アミノ酸以下）であり、特に好ましくは15アミノ酸である。sc(Fv)2に3つのペプチドリンカーが含まれる場合には、それらの長さは全て同じであってもよいし異なってもよい。
例えば、そのようなペプチドリンカーには以下のものが含まれる：
Ser
Gly Ser
Gly Gly Ser
Ser Gly Gly
Gly Gly Gly Ser（配列番号：147）
Ser Gly Gly Gly（配列番号：148）
Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号：149）
Ser Gly Gly Gly Gly（配列番号：150）
Gly Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号：151）
Ser Gly Gly Gly Gly Gly（配列番号：152）
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号：153）
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly（配列番号：154）
(Gly Gly Gly Gly Ser（配列番号：149）)n
(Ser Gly Gly Gly Gly（配列番号：150）)n
ここでnは1以上の整数である。ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
合成リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられており、例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、およびビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）が挙げられる。これらの架橋剤は市販されている。
4つの抗体可変領域を連結するには、通常、3つのリンカーが必要となる。用いられるリンカーは、同じ種類のものであっても異なる種類のものであってもよい。
Fab、F(ab') 2 、およびFab'
「Fab」は、1本の軽鎖、ならびに1本の重鎖のCH1ドメインおよび可変領域からなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
「F(ab')2」または「Fab」は、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）をペプシンおよびパパイン等のプロテアーゼで処理することにより製造され、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を2本の各H鎖のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近くで消化することによって生成される抗体断片のことをいう。例えばパパインは、IgGを、2本の各H鎖のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流で切断し、VL（L鎖可変領域）およびCL（L鎖定常領域）を含むL鎖がVH（H鎖可変領域）およびCHγ1（H鎖定常領域中のγ1領域）を含むH鎖断片とそれらのC末端領域でジスルフィド結合により連結されている、相同な2つの抗体断片を生成する。これら2つの相同な抗体断片はそれぞれFab'といわれる。
「F(ab')2」は、2本の軽鎖、ならびにジスルフィド結合が2本の重鎖間で形成されるようにCH1ドメインおよびCH2ドメインの一部分の定常領域を含む2本の重鎖からなる。本明細書において開示されるF(ab')2は、次のように好適に製造され得る。所望の抗原結合部位を含むモノクローナル全部抗体等を、ペプシン等のプロテアーゼで部分消化し、Fc断片をプロテインAカラムに吸着させることにより除去する。プロテアーゼは、pH等の適切な設定酵素反応条件下で選択的にF(ab')2を生じるように全部抗体を切断し得るものである限り、特に限定はされない。例えば、そのようなプロテアーゼにはペプシンおよびフィシンが含まれる。
Fc領域
本明細書で用語「Fc領域」または「Fcドメイン」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
Fc受容体
用語「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体のことをいう。いくつかの態様において、FcRは、天然型ヒトFcRである。いくつかの態様において、FcRは、IgG抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングによる形態を含めて、含む。FcγRII受容体は、FcγRIIA（「活性化受容体」）およびFcγRIIB（「阻害受容体」）を含み、これらは主としてその細胞質ドメインにおいて相違する類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM）を含む。（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) を参照のこと。）FcRは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)において総説されている。将来同定されるものを含む他のFcRも、本明細書の用語「FcR」に包含される。
用語「Fc受容体」または「FcR」はまた、母体のIgGの胎児への移動（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）ならびに免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う、新生児型受容体FcRnを含む。FcRnへの結合を測定する方法は公知である（例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO2004/92219 (Hinton et al.)を参照のこと）。
in vivoでのヒトFcRnへの結合およびヒトFcRn高アフィニティ結合ポリペプチドの血漿半減期は、例えばヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトされたヒト細胞株においてまたは変異Fc領域を伴うポリペプチドが投与される霊長類において測定され得る。WO2000/42072 (Presta) は、FcRに対する結合が増加したまたは減少した抗体変異体を記載している。例えば、Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001) も参照のこと。
Fcγ受容体
Fcγ受容体とは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインに結合し得る受容体のことをいい、これにはFcγ受容体遺伝子によって実質的にコードされるタンパク質のファミリーに属するすべてのメンバーが含まれる。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含むFcγRI (CD64)；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131およびR131を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）、およびFcγRIIcを含むFcγRII (CD32)；ならびにアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII (CD16)；ならびに未同定のヒトFcγ受容体、Fcγ受容体アイソフォーム、およびそれらのアロタイプのすべてが含まれる。しかしながら、Fcγ受容体はこれらの例に限定されない。これらに限定されるわけではないが、Fcγ受容体には、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルに由来するものが含まれる。Fcγ受容体は任意の生物に由来してよい。マウスFcγ受容体には、これらに限定されないが、FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、FcγRIII (CD16)、およびFcγRIII-2 (CD16-2)、ならびに未同定のマウスFcγ受容体、Fcγ受容体アイソフォーム、およびそれらのアロタイプのすべてが含まれる。そのような好ましいFcγ受容体には、例えば、ヒトFcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32)、FcγRIIB (CD32)、FcγRIIIA (CD16)、および／またはFcγRIIIB (CD16) が含まれる。FcγRIのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号NM_000566.3およびRefSeq登録番号NP_000557.1に示され；FcγRIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC020823.1およびRefSeq登録番号AAH20823.1に示され；FcγRIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC146678.1およびRefSeq登録番号AAI46679.1に示され；FcγRIIIAのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC033678.1およびRefSeq登録番号AAH33678.1に示され；ならびにFcγRIIIBのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれRefSeq登録番号BC128562.1およびRefSeq登録番号AAI28563.1に示される。Fcγ受容体がIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインに対する結合活性を有するかどうかは、上記のFACSおよびELISAフォーマットに加えて、ALPHAスクリーン（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）、表面プラズモン共鳴 (SPR) ベースのBIACORE法、およびその他によって評価することができる (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
その一方で、「Fcリガンド」または「エフェクターリガンド」とは、抗体Fcドメインに結合してFc/Fcリガンド複合体を形成する分子、および好ましくはポリペプチドのことをいう。該分子は任意の生物に由来してよい。FcリガンドのFcへの結合は、好ましくは1つまたは複数のエフェクター機能を誘導する。そのようなFcリガンドには、Fc受容体、Fcγ受容体、Fcα受容体、Fcβ受容体、FcRn、C1q、およびC3、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインA、スタフィロコッカスプロテインG、ならびにウイルスFcγ受容体が含まれるが、これらに限定されない。Fcリガンドには、Fcγ受容体と相同なFc受容体のファミリーであるFc受容体相同体 (FcRH) (Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136) もまた含まれる。Fcリガンドには、Fcに結合する未同定の分子もまた含まれる。
Fcγ受容体結合活性
FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、および／またはFcγRIIIBのいずれかのFcγ受容体に対するFcドメインの結合活性が損なわれていることは、上記のFACSおよびELISAフォーマット、ならびにALPHAスクリーン（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）および表面プラズモン共鳴 (SPR) ベースのBIACORE法を用いることによって評価することができる (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
ALPHAスクリーンは、2種類のビーズ：ドナービーズおよびアクセプタービーズを用いる、下記の原理に基づいたALPHA技術によって実施される。ドナービーズに連結された分子がアクセプタービーズに連結された分子と生物学的に相互作用し、かつ2つのビーズが近接して位置する場合にのみ、発光シグナルが検出される。ドナービーズ内の光増感剤は、レーザー光によって励起されて、ビーズ周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素がドナービーズ周辺に拡散し、近接して位置するアクセプタービーズに到達すると、アクセプタービーズ内の化学発光反応が誘導される。この反応によって最終的に光が放出される。ドナービーズに連結された分子がアクセプタービーズに連結された分子と相互作用しないのであれば、ドナービーズによって生成される一重項酸素はアクセプタービーズに到達せず、化学発光反応は起こらない。
例えば、ビオチン標識された抗原結合分子または抗体をドナービーズに固定化し、グルタチオンSトランスフェラーゼ (GST) でタグ化されたFcγ受容体をアクセプタービーズに固定化する。競合的変異Fcドメインを含む抗原結合分子または抗体の非存在下では、Fcγ受容体は、野生型Fcドメインを含む抗原結合分子または抗体と相互作用し、結果として520～620 nmのシグナルを誘導する。タグ化されていない変異Fcドメインを有する抗原結合分子または抗体は、野生型Fcドメインを含む抗原結合分子または抗体と、Fcγ受容体との相互作用に関して競合する。競合の結果としての蛍光の減少を定量化することによって、相対的結合アフィニティを決定することができる。Sulfo-NHS-ビオチンなどを用いて抗体などの抗原結合分子または抗体をビオチン化する方法は公知である。GSTタグをFcγ受容体に付加するための適切な方法には、Fcγ受容体をコードするポリペプチドとGSTをコードするポリペプチドをインフレームで融合し、該融合遺伝子を保有するベクターが導入された細胞を用いて該遺伝子を発現させ、次いでグルタチオンカラムを用いて精製することを伴う方法が含まれる。誘導されたシグナルは好ましくは、例えば、GRAPHPAD PRISM（GraphPad；San Diego）などのソフトウェアを用いて非線形回帰分析に基づく一部位競合モデルに適合させることにより、解析することができる。
相互作用を観察するための物質の一方を、リガンドとしてセンサーチップの金薄膜上に固定化する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射が起こるようにセンサーチップの裏面から光を当てると、ある特定の部位において反射光の強度が部分的に低下する（SPRシグナル）。相互作用を観察するための他方の物質を、分析物としてセンサーチップの表面上に注入する。分析物がリガンドに結合すると、固定化リガンド分子の質量が増加する。これにより、センサーチップの表面上の溶媒の屈折率が変化する。屈折率の変化は、SPRシグナルの位置のシフトを引き起こす（逆に、解離するとシグナルは元の位置にシフトして戻る）。Biacoreシステムでは、上記のシフトの量（すなわち、センサーチップ表面上での質量の変化）を縦軸にプロットし、そのようにして経時的な質量の変化を測定データとして表示する（センサーグラム）。センサーグラムの曲線から動態パラメーター（結合速度定数 (ka) および解離速度定数 (kd)）が決定され、これら2つの定数の比率からアフィニティ (KD) が決定される。BIACORE法では、阻害アッセイが好ましく用いられる。そのような阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010に記載されている。
Fcγ受容体結合活性が低下したFc領域
本明細書において、「Fcγ受容体結合活性が低下している」とは、例えば、上記の解析方法に基づいて、被験抗原結合分子または抗体の競合活性が、対照抗原結合分子または抗体の競合活性の50％以下、好ましくは45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、または15％以下、および特に好ましくは10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下であることを意味する。
IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFcドメインを含む抗原結合分子または抗体を、対照抗原結合分子または抗体として適宜用いることができる。Fcドメイン構造は、配列番号：143（RefSeq登録番号AAC82527.1のN末端にAが付加されている）、144（RefSeq登録番号AAB59393.1のN末端にAが付加されている）、145（RefSeq登録番号CAA27268.1のN末端にAが付加されている）、および146（RefSeq登録番号AAB59394.1のN末端にAが付加されている）に示されている。さらに、特定のアイソタイプの抗体のFcドメイン変異体を含む抗原結合分子または抗体が被験物質として用いられる場合には、同じアイソタイプのFcドメインを含む抗原結合分子または抗体を対照として用いて、Fcγ受容体結合活性に及ぼす該変異体の変異の影響を評価する。上記のようにして、Fcγ受容体結合活性が低下していると判断されたFcドメイン変異体を含む抗原結合分子または抗体が、適宜調製される。
そのような公知の変異体には、例えば、アミノ酸231A～238S（EUナンバリング）が欠失している変異体 (WO2009/011941)、ならびに変異体C226S、C229S、P238S、(C220S) (J. Rheumatol (2007) 34, 11)；C226SおよびC229S (Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47-54)；C226S、C229S、E233P、L234V、およびL235A (Blood (2007) 109, 1185-1192) が含まれる。
具体的には、好ましい抗原結合分子または抗体には、特定のアイソタイプの抗体のFcドメインを形成するアミノ酸において、以下のアミノ酸位置：220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、または332位（EUナンバリング）より選択される少なくとも1つのアミノ酸の変異（置換など）を有するFcドメインを含むものが含まれる。Fcドメインの起源である抗体のアイソタイプは特に限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体に由来する適切なFcドメインを用いることが可能である。IgG1抗体に由来するFcドメインを用いることが好ましい。
好ましい抗原結合分子または抗体には、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸において、その位置がEUナンバリングに従って特定される、以下に示される置換（各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前の一文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後の一文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す）のうちのいずれか1つを有するFcドメインを含むもの：
(a) L234F、L235E、P331S；
(b) C226S、C229S、P238S；
(c) C226S、C229S；または
(d) C226S、C229S、E233P、L234V、L235A；
ならびに、231～238位のアミノ酸配列が欠失しているFcドメインを有するものが含まれる。
さらに、好ましい抗原結合分子または抗体には、IgG2抗体のFcドメインを形成するアミノ酸において、その位置がEUナンバリングに従って特定される、以下に示される置換のうちのいずれか1つを有するFcドメインを含むものもまた含まれる：
(e) H268Q、V309L、A330S、およびP331S；
(f) V234A；
(g) G237A；
(h) V234AおよびG237A；
(i) A235EおよびG237A；または
(j) V234A、A235E、およびG237A。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前の一文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後の一文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
さらに、好ましい抗原結合分子または抗体には、IgG3抗体のFcドメインを形成するアミノ酸において、その位置がEUナンバリングに従って特定される、以下に示される置換のうちのいずれか1つを有するFcドメインを含むものもまた含まれる：
(k) F241A；
(l) D265A；または
(m) V264A。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前の一文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後の一文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
さらに、好ましい抗原結合分子または抗体には、IgG4抗体のFcドメインを形成するアミノ酸において、その位置がEUナンバリングに従って特定される、以下に示される置換のうちのいずれか1つを有するFcドメインを含むものもまた含まれる：
(n) L235A、G237A、およびE318A；
(o) L235E；または
(p) F234AおよびL235A。各数字はEUナンバリングでのアミノ酸残基の位置を表し；かつ数字の前の一文字アミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表し、数字の後の一文字アミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
その他の好ましい抗原結合分子または抗体には、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸における、233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、または331位（EUナンバリング）のいずれかのアミノ酸が、対応するIgG2またはIgG4における対応するEUナンバリング位置のアミノ酸に置換されたFcドメインを含むものが含まれる。
好ましい抗原結合分子または抗体には、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸における、234位、235位、および297位（EUナンバリング）のアミノ酸のうちのいずれか1つまたは複数が、他のアミノ酸に置換されたFcドメインを含むものもまた含まれる。置換後のアミノ酸の種類は特に限定されない；しかしながら、234位、235位、および297位のアミノ酸のうちのいずれか1つまたは複数がアラニンに置換されたFcドメインを含む抗原結合分子または抗体が、特に好ましい。
好ましい抗原結合分子または抗体には、例えば、IgG1抗体のFcドメインを形成するアミノ酸における265位（EUナンバリング）のアミノ酸が別のアミノ酸に置換されたFcドメインを含むものもまた含まれる。置換後のアミノ酸の種類は特に限定されない；しかしながら、265位のアミノ酸がアラニンに置換されたFcドメインを含む抗原結合分子または抗体が、特に好ましい。好ましい。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」または「ADCC」は、分泌されたIgが特定の細胞傷害性細胞（例えば、NK細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するFc受容体 (FcR) に結合しそれによってこれらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合することができそしてその後にその標的細胞を細胞毒によって殺傷することができるようになる、細胞傷害の一形態のことをいう。ADCCを媒介するプライマリ細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現し、単球はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の第464頁の表3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するために、in vitro ADCC測定法、例えば米国特許第5,500,362号もしくは第5,821,337号または米国特許第6,737,056号 (Presta) に記載のものが実施され得る。そのような測定法に有用なエフェクター細胞は、PBMCおよびNK細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のADCC活性は、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示される動物モデルのような動物モデルにおいて、in vivoで評価されてもよい。
補体依存性細胞傷害
「補体依存性細胞傷害」または「CDC」は、補体の存在下での標的細胞の溶解のことをいう。古典的補体経路の活性化は、（適切なサブクラスの）抗体（対応する抗原に結合している）への補体系の第1要素（C1q）の結合によって開始される。補体活性化を評価するため、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996) に記載のCDC測定法が実施され得る。改変されたFc領域アミノ酸配列を伴うポリペプチド変異体（変異Fc領域を伴うポリペプチド）および増加または減少したC1q結合能は、例えば、米国特許第6,194,551号B1およびWO1999/51642に記載されている。例えば、Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) も参照のこと。
T細胞依存性細胞傷害
「T細胞依存性細胞傷害」または「TDCC」は、標的細胞に対する細胞傷害性がT細胞によって誘導されるように、抗原結合分子が、標的細胞上に発現された抗原およびT細胞上に発現された別の抗原の両方に結合し、それによってT細胞を標的細胞の近くにリダイレクティングする、細胞傷害の形態のことをいう。T細胞依存性細胞傷害を評価する方法であるin vitro TDCCアッセイはまた、本説明の「T細胞依存性細胞傷害の測定」の項にも記載されている。
等電点 (pI)
別段の指定がない限り、および文脈に矛盾がない限り、等電点 (pI) は、理論的等電点または実験的に決定された等電点のいずれかであってよいことが理解され、これは「pI」とも称される。pI値は、例えば、等電点電気泳動によって実験的に決定することができる。一方、理論pI値は、遺伝子およびアミノ酸配列解析ソフトウェア（Genetyx等）を用いて算出することができる。
がん
用語「がん」および「がん性」は、調節されない細胞成長／増殖によって典型的に特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態のことをいうまたは説明するものである。がんの例は、がん腫、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むが、これらに限定されない。そのようながんのより詳細な例は、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、肺の扁平上皮がん、腹膜のがん、肝細胞がん、消化管がん、膵がん、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮がん、唾液腺がん、腎がん、肝がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝細胞がん、白血病および他のリンパ球増殖性障害、ならびに様々なタイプの頭頸部がんを含む。
腫瘍
用語「腫瘍」は、悪性か良性かによらず、すべての新生物性細胞成長および増殖ならびにすべての前がん性およびがん性細胞および組織のことをいう。用語「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」は、本明細書でいう場合、相互に排他的でない。
卵巣がん
「卵巣がん」は、卵巣に由来する悪性腫瘍の不均一性の群のことをいう。悪性卵巣腫瘍のおよそ90％は起源が上皮であり、残りは生殖細胞および間質腫瘍である。上皮性卵巣腫瘍は、以下の組織学的サブタイプに分類される：漿液性腺がん（上皮性卵巣腫瘍の約50％を構成する)；類内膜腺がん（約20％）；粘液性腺がん（約10％）；明細胞がん（約5～10％）；ブレンナー（移行細胞）腫瘍（比較的まれ）。女性で6番目に多く見られるがんである卵巣がんの予後は通常悪く、5年生存率は5～30％の範囲である。卵巣がんの総説については、Fox et al. (2002) 「Pathology of epithelial ovarian cancer」 in Ovarian Cancer ch. 9 (Jacobs et al., eds., Oxford University Press, New York)；Morin et al. (2001) 「Ovarian Cancer」 in Encyclopedic Reference of Cancer, pp.654-656 (Schwab, ed., Springer-Verlag, New York) を参照されたい。本開示は、上記の上皮性卵巣腫瘍サブタイプのいずれか、特に漿液性腺がんサブタイプを診断または治療する方法を企図する。
胃がん（gastric cancer）
用語「胃がん（gastric cancer）」または「胃腫瘍（gastric tumor）」または「胃腫瘍（stomach tumor）」または「胃がん（stomach cancer）」は、胃の任意の腫瘍またはがん（例えば腺がん（例えば、びまん型および腸型）ならびにリンパ腫、平滑筋肉腫、および扁平上皮細胞がんなどのより一般的でない形態を含む）のことをいう。
薬学的製剤
用語「薬学的製剤」または「薬学的組成物」は、その中に含まれた有効成分の生物学的活性が効果を発揮し得るような形態にある調製物であって、かつ製剤が投与される対象に許容できない程度に毒性のある追加の要素を含んでいない、調製物のことをいう。
薬学的に許容される担体
「薬学的に許容される担体」は、被験体に対して無毒な、薬学的製剤中の有効成分以外の成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、これらに限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含む。
治療
本明細書で用いられる「治療」（および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など）は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、これらに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの態様において、本開示の抗体は、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。
添付文書
用語「添付文書」は、治療用品の商用パッケージに通常含まれ、そのような治療用品の使用に関する、適応症、用法、用量、投与方法、併用療法、禁忌、および／または警告についての情報を含む使用説明書のことをいうために用いられる。
本開示の抗体
1つの局面において、本開示は、それぞれ配列番号： 113、117、および118のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む第1の重鎖可変領域；それぞれ配列番号： 119、120、および121のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む第1の軽鎖可変領域；それぞれ配列番号： 122、123、および124のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む第2の重鎖可変領域；ならびにそれぞれ配列番号： 114、115および116のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む第2の軽鎖可変領域を含む、単離された抗体を提供する。
1つの局面において、本開示は、配列番号： 85、1、33、および84より選択されるアミノ酸配列を含む第1の重鎖可変領域；ならびに配列番号： 87、2、43、86、および88より選択されるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖可変領域；配列番号： 60および70より選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖可変領域；ならびに配列番号： 61および71より選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖可変領域を含む、単離された抗体を提供する。
ある特定の態様において、第1の重鎖可変領域は、配列番号： 95に示される第1のCH1ドメインに連結され、第1の軽鎖可変領域は、配列番号： 63に示される第1のCLドメインに連結され、第2の重鎖可変領域は、配列番号： 97に示される第2のCH1ドメインに連結され、かつ第2の軽鎖可変領域は、配列番号： 62に示される第2のCLドメインに連結されている。
ある特定の態様において、抗体は、
(1) 配列番号： 72に示される第1のFc領域および配列番号： 73に示される第2のFc領域；
(2) 配列番号： 74に示される第1のFc領域、および配列番号： 75に示される第2のFc領域；
(3) 配列番号： 76に示される第1のFc領域、および配列番号： 77に示される第2のFc領域；ならびに
(4) 配列番号： 78に示される第1のFc領域、および配列番号： 79に示される第2のFc領域
より選択されるFc領域の組み合わせのうちのいずれか1つをさらに含む。
第1のFc領域は、第1の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖内にあってよく、かつ第2のFc領域は、第2の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖内にあってよい。ある特定の態様において、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン-リジン（残基446～447）は存在しなくてもよい。
ある特定の態様において、第1の重鎖可変領域と第1の軽鎖可変領域は第1の抗原結合部位を形成し、かつ第2の重鎖可変領域と第2の軽鎖可変領域は第2の抗原結合部位を形成する。
1つの局面において、本開示は、配列番号： 104、105、106、および107より選択されるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、ならびに配列番号： 112に示されるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖；配列番号： 108、109、110、および111より選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、ならびに配列番号： 98に示されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖含む、単離された抗体を提供する。ある特定の態様において、重鎖のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン-リジン（残基446～447）は存在しなくてもよい。
第1の重鎖と第1の軽鎖の可変領域は第1の抗原結合部位を形成し、かつ第2の重鎖と第2の軽鎖の可変領域が第2の抗原結合部位を形成する。
ある特定の態様において、第1の抗原結合部位は、CLDN6に対する結合活性を有する。ある特定の態様において、第1の抗原結合部位は、ヒトCLDN6に対する結合活性を有する。ある特定の態様において、第1の抗原結合部位は、配列番号： 125または126に規定されるヒトCLDN6に対する結合活性を有する。ある特定の態様において、第1の抗原結合部位はヒトCLDN9に実質的に結合しない。ある特定の態様において、第1の抗原結合部位はヒトCLDN4に実質的に結合しない。ある特定の態様において、第1の抗原結合部位はヒトCLDN3に実質的に結合しない。ある特定の態様において、第1の抗原結合部位は、配列番号： 134に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない。
ある特定の態様において、第2の抗原結合部位は、CD3に対する結合活性を有する。ある特定の態様において、第2の抗原結合部位は、CD3ε鎖に対する結合活性を有する。ある特定の態様において、第2の抗原結合部位は、配列番号：142に規定されるヒトCD3に対する結合活性を有する。
本開示の抗原結合分子
1つの局面において、本開示は、
(a1) それぞれ配列番号： 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列；または
(a2) 配列番号： 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
を含む重鎖可変領域を含む抗原結合分子を提供する。
1つの局面において、本開示は、
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；または
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子を提供する。
1つの局面において、本開示は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗原結合分子であって、
重鎖可変領域が、
(a1) それぞれ配列番号： 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列；ならびに
(a2) 配列番号： 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含み；
かつ軽鎖可変領域が、
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；ならびに
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む、抗原結合分子を提供する。
ある特定の態様において、抗原結合分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、マウス、ウサギ、ヒト化、またはヒトフレームワークを含む。
1つの局面において、本開示は、配列番号： 85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、および57より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号： 87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82 および58より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む抗原結合分子を提供する。
抗原結合分子の1つの重鎖可変領域と1つの軽鎖可変領域は抗原結合部位を形成し、それはCLDN6に対する結合活性を有する。ある特定の局面において、本開示の抗原結合分子は、配列番号： 125または126に規定されるヒトCLDN6に対する結合活性を有する。
ある特定の局面において、本開示の抗原結合分子は、ヒトCLDN9に実質的に結合しない。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、ヒトCLDN4に実質的に結合しない。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、ヒトCLDN3に実質的に結合しない。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、配列番号： 134に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない。
本開示の抗原結合分子は、様々な公知の医学用途技術と組み合わせて使用することができる。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、キメラ抗原結合受容体 (CAR) およびキメラ抗原結合受容体を含むT細胞 (CAR-T) を作製するために使用することができる。CARを作製する方法の一例としては、本開示の抗原結合分子のCLDN6結合部位をT細胞受容体 (TCR) の細胞外ドメインに連結し、CD28などの共刺激シグナル伝達ドメインをTCRの細胞内ドメインに連結する。CAR-Tを作製する方法の一例としては、CARを、遺伝子改変技術を用いてT細胞などのエフェクター細胞に導入する。
1つの局面において、本開示は、
(a1) それぞれ配列番号： 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列；または
(a2) 配列番号： 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
を含む重鎖可変領域を含むキメラ抗原結合受容体を提供する。
1つの局面において、本開示は、
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；または
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む軽鎖可変領域を含むキメラ抗原結合受容体を提供する。
1つの局面において、本開示は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むキメラ抗原結合受容体であって、
重鎖可変領域が、
(a1) それぞれ配列番号： 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列；ならびに
(a2) 配列番号： 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含み；
かつ軽鎖可変領域が、
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；ならびに
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む、キメラ抗原結合受容体を提供する。
1つの局面において、本開示は、配列番号： 85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、および57より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号： 87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82 および58より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、キメラ抗原結合受容体を提供する。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、複数の抗原結合部位を含む抗原結合分子である。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、CLDN6に対する結合活性を有する第1の抗原結合部位、およびT細胞受容体複合体に対する結合活性を有する第2の抗原結合部位を含み、ここで、第1の抗原結合部位は、
(a) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む重鎖可変領域：
(a1) それぞれ配列番号： 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列；ならびに
(a2) 配列番号： 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
ならびに
(b) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む軽鎖可変領域：
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；ならびに
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第1の抗原結合部位を形成する重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、マウス、ウサギ、ヒト化、またはヒトフレームワークをさらに含む、
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、CLDN6に対する結合活性を有する第1の抗原結合部位、およびT細胞受容体複合体に対する結合活性を有する第2の抗原結合部位を含み、ここで、第1の抗原結合部位は、配列番号： 85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、および57より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号： 87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82 および58より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第1の抗原結合部位は、ヒトCLDN6に対する結合活性を有する。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第1の抗原結合部位は、配列番号： 125または126に規定されるヒトCLDN6に対する結合活性を有する。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第1の抗原結合部位は、ヒトCLDN9に実質的に結合しない。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第1の抗原結合部位は、ヒトCLDN4に実質的に結合しない。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第1の抗原結合部位は、ヒトCLDN3に実質的に結合しない。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第1の抗原結合部位は、配列番号： 134に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第1の抗原結合部位は、単鎖Fv (scFv)、Fv、またはFab中に含まれる。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第2の抗原結合部位は、CD3に対する結合活性を有する。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第2の抗原結合部位は、CD3ε鎖に対する結合活性を有する。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第2の抗原結合部位は、T細胞受容体に対する結合活性を有する。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第2の抗原結合部位は、それぞれ配列番号： 122、123、および124のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびにそれぞれ配列番号： 114、115、および116のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域によって形成される。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第2の抗原結合部位を形成する重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、マウス、ウサギ、ヒト化、またはヒトフレームワークを含む。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第2の抗原結合部位は、配列番号： 60および70より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号： 61および71より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域によって形成される。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の第2の抗原結合部位は、単鎖Fv (scFv)、Fv、またはFab中に含まれる。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、抗体Fc領域をさらに含む。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子中に含まれるFc領域は、配列番号： 143、144、145、または146（IgG1～IgG4）のFc領域構成アミノ酸である。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子中に含まれるFc領域は、配列番号： 143～146（IgG1～IgG4）のFc領域構成アミノ酸のうちのいずれかに少なくとも1つのアミノ酸変異を有するFc領域である。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子中に含まれるFc領域は、糖鎖が付加したFc領域であり、Fc領域に付加したフコース欠損糖鎖の割合は天然IgG Fc領域のものよりも高いか、またはFc領域に付加されたバイセクト(bisecting)N-アセチルグルコサミンの割合は天然IgG Fc領域のものよりも高い。
ある特定の態様において、特に、抗原結合分子が、CLDN6に対する結合活性を有する第1の抗原結合部位およびT細胞受容体複合体に対する結合活性を有する第2の抗原結合部位を含むいくつかの態様において、抗原結合分子中に含まれるFc領域は、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である。
ある特定の態様において、抗原結合分子中に含まれるFc領域は、EUナンバリングによって特定される以下のアミノ酸位置：220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、および332位より選択される少なくとも1つのアミノ酸の変異を有するFc領域である。
ある特定の態様において、抗原結合分子中に含まれるFc領域は、EUナンバリングによって特定される以下のアミノ酸：アミノ酸234位のArg、アミノ酸235位のAlaまたはArg、アミノ酸239位のLys、およびアミノ酸297位のAlaより選択される少なくとも1つのアミノ酸を含むFc領域である。
ある特定の態様において、第1の抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメインは、第1のCH1ドメインを介してFc領域に連結され、第1の抗原結合部位を形成する軽鎖可変ドメインは、第1のCLドメインに連結されており；かつ第2の抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメインは、第2のCH1ドメインを介してFc領域に連結され、第2の抗原結合部位を形成する軽鎖可変ドメインは、第2のCLドメインに連結されている。ある特定の態様においては、第1の抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域が、第1の抗原結合ドメインを形成する軽鎖可変領域と会合する、および／または第2の抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域が、第2の抗原結合ドメインを形成する軽鎖可変領域と会合するように、上述のCH1ドメインおよびCLドメインの電荷が制御されている。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子は細胞傷害活性を有する。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の細胞傷害活性は、ADCCまたはCDCである。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子の細胞傷害活性は、T細胞依存性細胞傷害活性である。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子は内部移行活性を有する。ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、細胞傷害剤にコンジュゲートされている。
本開示はまた、1つまたは複数の細胞傷害剤、例えば、化学療法剤もしくは化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位元素などにコンジュゲートされたCLDN6結合分子、特に本明細書における抗CLDN6抗体、を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一態様において、イムノコンジュゲートは、抗体が、これらに限定されるものではないが以下を含む1つまたは複数の薬剤にコンジュゲートされた、抗体－薬剤コンジュゲート (antibody-drug conjugate: ADC) である：メイタンシノイド（米国特許第5,208,020号、第5,416,064号、および欧州特許第0,425,235号B1参照）；例えばモノメチルオーリスタチン薬剤部分DEおよびDF（MMAEおよびMMAF）（米国特許第5,635,483号および第5,780,588号および第7,498,298号参照）などのオーリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号、および第5,877,296号；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；ならびにLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998) 参照）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；および米国特許第6,630,579号参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；ならびにCC1065。
別の態様において、イムノコンジュゲートは、これらに限定されるものではないが以下を含む酵素的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗体を含む：ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖（緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) 由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ (Aleurites fordii) タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ (Phytolacca americana) タンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、ツルレイシ (momordica charantia) 阻害剤、クルシン (curcin)、クロチン、サボンソウ (saponaria officinalis) 阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン (mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、ならびにトリコテセン。
別の態様において、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの製造に利用可能である。例は、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212PbおよびLuの放射性同位体を含む。放射性コンジュゲートを検出のために使用する場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフィー検査用の放射性原子（例えばTc-99mもしくは123I）、または、核磁気共鳴 (NMR) イメージング（磁気共鳴イメージング、MRIとしても知られる）用のスピン標識（例えばここでもヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、または鉄）を含み得る。
抗体および細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質連結剤を用いて作製され得る。例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート (SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (SMCC)、イミノチオラン (IT)、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルHCl）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えば、ビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）である。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987) に記載されるようにして調製され得る。炭素-14標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸 (MX-DTPA) は、抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。WO94/11026を参照のこと。リンカーは、細胞内での細胞傷害薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第5,208,020号）が使用され得る。
本明細書のイムノコンジュゲートまたはADCは、（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから）市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、ならびにSVSB（スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に考慮するが、これらに限定されない。
1つの局面において、本開示は、本明細書に記載される抗体または抗原結合分子をコードする核酸を提供する。さらなる態様において、そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。ある特定の態様において、本開示の抗体または抗原結合分子をコードする核酸は、対象に直接投与することができるベクターに組み込むことができる。本開示の抗体または抗原結合分子を発現し分泌するように遺伝的に改変された細胞を対象に投与することも可能であり、これにより、本開示の抗体または抗原結合分子の連続的なin vivo分泌が可能になる。
本開示はまた、本明細書に記載される抗体または抗原結合分子を産生する方法を提供する。さらなる態様において、本明細書に記載される抗体または抗原結合分子を産生する方法は、抗原または抗原結合分子をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する段階を含む。さらなる態様において、本明細書に記載される抗体または抗原結合分子を産生する方法は、抗原または抗原結合分子をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する段階、および宿主細胞の培養から抗体または抗原結合分子を回収する段階を含む。
方法およびアッセイ
組換えの方法および構成
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗体および抗原結合分子は組換えの方法や構成を用いて製造することができる。1つの態様において、本明細書に記載の抗体をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。1つの態様において、宿主細胞は、真核性である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。1つの態様において、抗体の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、本開示の抗CLDN6抗体を作製する方法が提供される。
本明細書において記載される抗体の組換え製造のために、（例えば、上述したものなどの）抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定されるだろう（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合は、細菌で製造してもよい。細菌での抗体断片およびポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、および第5,840,523号を参照のこと。（加えて、大腸菌 (E. coli) における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254も参照のこと。）発現後、抗体は細菌細胞ペーストから可溶性フラクション中に単離されてもよく、またさらに精製することができる。
原核生物に加え、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを伴う抗体の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類および酵母の株を含む、糸状菌または酵母などの真核性の微生物は、抗体コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)および Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) を参照のこと。
多細胞生物（無脊椎生物および脊椎生物）に由来するものもまた、グリコシル化された抗体の発現のために好適な宿主細胞である。無脊椎生物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。昆虫細胞との接合、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質転換に用いられる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、および第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗体を産生するための、PLANTIBODIES（商標）技術を記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞もまた宿主として使用できる。例えば、浮遊状態で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であろう。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎CV1株 (COS-7)；ヒト胎児性腎株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) などに記載の293または293細胞）；仔ハムスター腎細胞 (BHK)；マウスセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) などに記載のTM4細胞）；サル腎細胞 (CV1)；アフリカミドリザル腎細胞 (VERO-76)；ヒト子宮頸部癌細胞 (HELA)；イヌ腎細胞 (MDCK)；Buffalo系ラット肝細胞 (BRL 3A)；ヒト肺細胞 (W138)；ヒト肝細胞 (Hep G2)；マウス乳癌 (MMT 060562)；TRI細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) に記載）；MRC5細胞；および、FS4細胞などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR- CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) を含むチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞；およびY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) を参照のこと。
本明細書において記載される抗原結合分子の組換え産生は、抗原結合分子全体または抗原結合分子の一部を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む1つまたは複数のベクターを含む（例えば、それによって形質転換されている）宿主細胞を用いることによって、上記に記載されたものと同様の方法で行うことができる。
二重特異性抗体の産生および精製
「多重特異性抗原結合分子」は、2種以上の抗原に特異的に結合する抗原結合分子のことをいう。ある特定の態様において、本明細書に記載される多重特異性抗原結合分子は、2つまたはそれ以上の抗原結合部位を含み、異なる抗原結合部位は異なる抗原に特異的に結合し得る。
ある態様において、本開示の抗原結合分子は、二重特異性IgG抗体である。IgG型の二重特異性抗体は、IgG抗体を産生するハイブリドーマ2種を融合することによって生成されたハイブリッドハイブリドーマ（クアドローマ）から分泌させることができる（Milstein et al., Nature (1983) 305, 537-540）。
さらに、IgG型の二重特異性抗体は、目的の2種のIgGを構成するL鎖およびH鎖の遺伝子、すなわち合計4種の遺伝子を細胞に導入しそれらを共発現させることによって分泌される。しかし、これらの方法で産生され得るIgGのH鎖とL鎖の組合せの数は、理論上10通りである。したがって、10種類のIgGから、所望の組合せのH鎖およびL鎖を含むIgGを精製することは困難である。さらに、所望の組合せを有するIgGの分泌量も理論上著しく低下するため、大規模培養が必要になり、製造上のコストはさらに増大する。
そのため、本発明の多重特異性抗原結合分子には、所望の組合せを有するH鎖間およびL鎖H鎖間の会合を促進するための技術を適用することができる。
例えば、二重特異性抗体の会合化には、抗体H鎖の第2の定常領域または第3の定常領域（CH2またはCH3）の界面に静電気的反発を導入することにより望ましくないH鎖会合を抑制する技術を適用することができる（WO2006/106905）。
CH2またはCH3の界面に静電気的反発を導入することにより意図しないH鎖会合を抑制する技術において、H鎖の他方の定常領域の界面で接触するアミノ酸残基の例には、CH3領域におけるEUナンバリング位置356位、439位、357位、370位、399位、および409位の残基に対応する領域が含まれる。
より具体的には、2種のH鎖CH3領域を含む抗体であって、第1のH鎖CH3領域における、以下の（1）～（3）に示すアミノ酸残基の対から選択される1～3対のアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗体が、例として挙げられる：（1）H鎖CH3領域に含まれる、EUナンバリング位置356位および439位のアミノ酸残基、（2）H鎖CH3領域に含まれる、EUナンバリング位置357位および370位のアミノ酸残基、ならびに（3）H鎖CH3領域に含まれる、EUナンバリング位置399位および409位のアミノ酸残基。
さらに、該抗体は、上記第1のH鎖CH3領域とは異なる第2のH鎖CH3領域におけるアミノ酸残基の対が、前記（1）～（3）のアミノ酸残基の対から選択され、前記第1のH鎖CH3領域において同種の電荷を有する前記（1）～（3）のアミノ酸残基の対に対応する1～3対のアミノ酸残基が、前記第1のH鎖CH3領域における対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有する抗体であってもよい。
上記（1）～（3）に示されるそれぞれのアミノ酸残基は、会合した際に互いに接近している。当業者であれば、所望のH鎖CH3領域またはH鎖定常領域において、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、上記（1）～（3）のアミノ酸残基に対応する位置を見出すことができ、適宜、これらの位置のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。
上記抗体において、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の群のいずれか1つに含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい：
(a) グルタミン酸（E）およびアスパラギン酸（D）、ならびに
(b) リジン（K）、アルギニン（R）、およびヒスチジン（H）。
上記抗体において、語句「同じ電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のいずれもが、上記の群(a)および(b)のうちいずれか1つに含まれるアミノ酸残基から選択されることを意味する。語句「反対の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のうちの少なくとも1つのアミノ酸残基が、上記の群(a)および(b)のうちいずれか1つに含まれるアミノ酸残基から選択される場合に、残りのアミノ酸残基が他の群に含まれるアミノ酸残基から選択されることを意味する。
好ましい態様において上記抗体は、その第1のH鎖CH3領域と第2のH鎖CH3領域がジスルフィド結合により架橋されていてもよい。
本発明において改変に供するアミノ酸残基は、上述した抗体可変領域または抗体定常領域のアミノ酸残基に限られない。当業者であれば、変異ポリペプチドまたは異種多量体において、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、界面を形成するアミノ酸残基を同定することができ、次いでこれらの位置のアミノ酸残基を、会合を制御するように改変に供することが可能である。
また、本発明の二重特異性抗体の会合化には他の公知技術を用いることもできる。抗体の一方のH鎖Fc領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(knob; 突起)に置換し、他方のH鎖の相対するFc領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖(hole; 空隙)に置換して、突起が空隙内に配置され得るようにすることにより、異なるアミノ酸を含むFc領域含有ポリペプチド同士を効率的に会合させることができる（WO1996/027011、Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621、Merchant A.M. et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681、およびUS20130336973）。
加えて、本発明の二重特異性抗体の形成には他の公知技術を用いることもできる。抗体の一方のH鎖CH3の一部を対応するIgA由来の配列に変え、対応するIgA由来の配列を他方のH鎖CH3の相補的な部分に導入することにより生成された鎖交換操作ドメインCH3（strand-exchange engineered domain CH3）を用いて、異なる配列を有するポリペプチドの会合化をCH3の相補的な会合化によって効率的に誘導することができる (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。この公知技術を用いて効率的に目的の二重特異性抗体を形成させることもできる。
加えて、二重特異性抗体の形成には、WO2011/028952、WO2014/018572およびNat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8に記載されるような抗体のCH1とCLの会合化およびVHとVLの会合化を利用した抗体製造技術、WO2008/119353およびWO2011/131746に記載されるような別々に調製したモノクローナル抗体を組み合わせて使用して二重特異性抗体を製造する技術(Fab Arm Exchange)、WO2012/058768およびWO2013/063702に記載されるような抗体重鎖CH3間の会合を制御する技術、WO2012/023053に記載されるような2種類の軽鎖と1種類の重鎖とから構成される二重特異性抗体を製造する技術、Christophら（Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013)）によって記載されるような1本のH鎖と1本のL鎖を含む抗体の片鎖をそれぞれ発現する2つの細菌細胞株を利用した二重特異性抗体を製造する技術等を用いてもよい。
あるいは、目的の二重特異性抗体を効率的に形成させることができない場合であっても、産生された抗体から目的の二重特異性抗体を分離し精製することによって、本発明の二重特異性抗体を得ることが可能である。例えば、2種類のH鎖の可変領域にアミノ酸置換を導入することにより等電点の差を付与することで、2種類のホモ体と目的のヘテロ抗体をイオン交換クロマトグラフィーで精製することを可能にする方法が報告されている（WO2007114325）。ヘテロ抗体を精製する方法として、これまでに、プロテインAに結合するマウスIgG2aのH鎖とプロテインAに結合しないラットIgG2bのH鎖とを含むヘテロ二量化抗体を、プロテインAを用いて精製する方法が報告されている（WO98050431およびWO95033844）。さらに、IgGとプロテインAの結合部位であるEUナンバリング位置435位および436位のアミノ酸残基を、異なるプロテインAアフィニティをもたらすアミノ酸であるTyr、Hisなどに置換したH鎖を用いて、あるいは、異なるプロテインAアフィニティを有するH鎖を用いて、各H鎖とプロテインAとの相互作用を変化させ、次いでプロテインAカラムを用いることにより、ヘテロ二量化抗体のみを効率的に精製することができる。
さらに、本発明のFc領域として、Fc領域のC末端のヘテロジェニティーが改善されたFc領域が適宜使用され得る。より具体的には、本発明は、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4由来のFc領域を構成する2つのポリペプチドのアミノ酸配列のうちEUナンバリングによって特定される446位のグリシンおよび447位のリジンを欠失させることにより生成されたFc領域を提供する。
T細胞依存性細胞傷害の測定
抗原結合分子がCLDN6およびT細胞受容体複合体の両方に結合する態様において、本開示の抗原結合分子を、本開示の抗原結合分子における抗原結合部位が結合するCLDN6発現細胞と接触させることによって引き起こされるT細胞依存性細胞傷害（TDCC）を評価または決定するための方法として、好ましくは、以下に記載する方法が用いられる。細胞傷害活性をin vitroで評価または決定するための方法には、細胞傷害性T細胞等の活性を決定するための方法が含まれる。T細胞媒介性細胞傷害を誘導する活性を本開示の抗原結合分子が有するかどうかは、公知の方法によって決定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)を参照）。細胞傷害アッセイにおいて、CLDN6と異なりかつ細胞において発現していない抗原と、T細胞受容体複合体とに結合することができる抗原結合分子が、対照抗原結合分子として用いられる。対照抗原結合分子は同じようにアッセイされる。次いで、活性は、本開示の抗原結合分子が、対照抗原結合分子のものより強い細胞傷害活性を示すかどうかを試験することによって評価される。
一方、in vivo抗腫瘍効果は、例えば、以下の手法によって、評価または決定される。本開示の抗原結合分子における抗原結合部位が結合する抗原を発現する細胞は、非ヒト動物対象に皮内または皮下移植される。次いで、移植の日からまたはその後、被験抗原結合分子が、静脈内または腹膜腔内に毎日または数日間隔で投与される。腫瘍サイズは経時的に測定される。腫瘍サイズの変化の差は細胞傷害活性として定義することができる。in vitroアッセイと同様に、対照抗原結合分子が投与される。腫瘍サイズが、対照抗原結合分子を投与された群のものより、本開示の抗原結合分子を投与された群で小さい場合に、本開示の抗原結合分子は、細胞傷害活性を有すると判断することができる。
抗原結合分子の抗原結合部位が結合する抗原を発現する細胞の増殖を抑制する本開示の抗原結合分子との接触の作用を評価または決定するために、好ましくは、MTT法および細胞内へのアイソトープ標識チミジン取り込みの測定が用いられる。一方、in vivoで細胞増殖を抑制する活性を評価または決定するために、好ましくは、in vivo細胞傷害活性を評価または決定するための上記に記載の同じ方法を用いることができる。
本開示の抗体または抗原結合分子のTDCCは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、TDCCは、乳酸脱水素酵素 (LDH) 放出アッセイによって測定することができる。このアッセイでは、標的細胞（例えば、CLDN6発現細胞）を被験抗体または抗原結合分子の存在下でT細胞（例えば、PBMC）と共にインキュベートし、T細胞によって殺傷された標的細胞から放出されたLDHの活性を、適切な試薬を用いて測定する。典型的には、細胞傷害活性は、（例えば、Triton-Xでの処理によって溶解された）標的細胞の100％の死滅によって生じたLDH活性に対する、抗体または抗原結合分子とのインキュベーションによって生じたLDH活性の割合として算出される。上述のように算出された細胞傷害活性がより高い場合、被験抗体または抗原結合分子は、より高いTDCCを有すると判定される。
加えてまたはその代わりに、例えば、TDCCは、リアルタイム細胞増殖阻害アッセイによって測定することもできる。このアッセイでは、96ウェルプレートにおいて、標的細胞（例えば、CLDN6発現細胞）を被験抗体または抗原結合分子の存在下でT細胞（例えば、PBMC）と共にインキュベートし、当技術分野で公知の方法によって、例えば適切な分析機器（例えば、xCELLigenceリアルタイム細胞分析装置）を用いることによって、標的細胞の増殖をモニターする。細胞増殖阻害率 (CGI：％) を、CGI (％) = 100 - (CIAb×100 / CINoAb) として与えられる式に従って、Cell Indexから決定する。「CIAb」は、特定の実験時間における、抗体または抗原結合分子ありのウェルのCell Indexを表し、「CINoAb」は、抗体または抗原結合分子なしのウェルの平均Cell Indexを表す。抗体または抗原結合分子のCGI率が高い、すなわち有意な正の値を有する場合、その抗体または抗原結合分子はTDCC活性を有するということができる。
1つの局面において、本開示の抗体または抗原結合分子はT細胞活性化活性を有する。T細胞活性化は、その活性化に応答してレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を発現する改変T細胞株（例えば、Jurkat / NFAT-REレポーター細胞株（T細胞活性化バイオアッセイ、Promega））を用いる方法などの、当技術分野で公知の方法によってアッセイすることができる。この方法では、標的細胞（例えば、CLDN6発現細胞）を被験抗体または抗原結合分子の存在下でT細胞と共に培養し、次いでレポーター遺伝子の発現産物のレベルまたは活性を、T細胞活性化の指標として適切な方法によって測定する。レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である場合、ルシフェラーゼとその基質との反応によって生じた発光を、T細胞活性化の指標として測定することができる。上記のように測定されたT細胞活性化がより高い場合、被験抗体または抗原結合分子は、より高いT細胞活性化活性を有すると判定される。
診断および検出のための方法および組成物
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子または抗体のいずれも、生物学的サンプルにおけるCLDN6の存在を検出するのに有用である。本明細書で用いられる用語「検出」は、定量的または定性的な検出を包含する。特定の態様において、生物学的サンプルは、細胞または組織、例えば、癌組織を含む。
一態様において、診断方法または検出方法において使用するための抗原結合分子または抗体が提供される。さらなる局面において、生物学的サンプル中のCLDN6の存在を検出する方法が提供される。特定の態様において、この方法は、CLDN6への抗原結合分子または抗体の結合が許容される条件下で本明細書に記載の抗原結合分子または抗体と生物学的サンプルを接触させること、および抗原結合分子または抗体とCLDN6の間で複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。そのような方法は、in vitroの方法またはin vivoの方法であり得る。一態様において、抗原結合分子または抗体は、例えばCLDN6が患者を選択するためのバイオマーカーである場合、本明細書に記載される抗原結合分子または抗体を用いる治療に適合する被験体を選択するために使用される。
本発明の抗体を用いて診断され得る例示的な障害は、がん、特に、卵巣腫瘍、非小細胞肺がん、胃がん、および肝がんを含む。
特定の態様において、標識された本明細書に記載の抗原結合分子または抗体が提供される。標識は、直接的に検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色標識、高電子密度標識、化学発光標識、および放射性標識）ならびに、例えば酵素反応または分子間相互作用を通じて間接的に検出される部分（例えば酵素またはリガンド）を含むが、これらに限定されない。例示的な標識は、これらに限定されるものではないが、以下を含む：放射性同位体32P、14C、125I、3Hおよび131I、希土類キレートなどの発蛍光団またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第4,737,456号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ (horseradish peroxidase: HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、単糖オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ）と連結されたもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル類、ならびにこれらに類するもの。
医薬組成物
1つの局面において、本開示は、本開示の抗原結合分子または抗体を含む医薬組成物を提供する。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、T細胞依存性細胞傷害を誘導し、言い換えると、本開示の医薬組成物は、細胞傷害を誘導するための治療剤である。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、がんの治療および/または予防に用いられる医薬組成物である。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および/または予防に用いられる医薬組成物である。特定の態様において、本開示の医薬組成物は、細胞増殖抑制剤である。特定の態様において、本開示の医薬組成物は抗がん剤である。
本開示の医薬組成物、本開示の細胞傷害を誘導するための治療剤、細胞増殖抑制剤、または抗がん剤は、必要に応じて、さまざまな種類の抗原結合分子または抗体と共に製剤化することができる。例えば、本開示の複数の抗原結合分子または抗体のカクテルによって、抗原を発現する細胞に対する細胞傷害作用を増強させることができる。
本明細書に記載の抗原結合分子または抗体の医薬組成物は、所望の純度を有する抗原結合分子または抗体を、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。薬学的に許容される担体は、概して、用いられる際の投与量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの、砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン系表面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、さらに、可溶性中性活性型ヒアルロニダーゼ糖タンパク質 (sHASEGP)（例えば、rHuPH20 (HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.) などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質）などの間質性薬剤分散剤を含む。特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は（rHuPH20を含む）、米国特許出願公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。1つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水溶液抗体製剤は、米国特許第6,171,586号およびWO2006/044908に記載のものを含み、後者の製剤はヒスチジン－アセテート緩衝液を含んでいる。
本明細書の製剤は、治療される特定の適応症のために必要であれば1つより多くの有効成分を含んでもよい。互いに悪影響を与えあわない相補的な活性を伴うものが好ましい。このような有効成分は、意図された目的のために有効である量で、好適に組み合わせられて存在する。
必要に応じて、本開示の抗原結合分子または抗体は、マイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリレート]などから作製されたマイクロカプセル）中に封入してもよく、コロイド薬物送達系（リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）の構成成分としてもよい（例えば、「Remington's Pharmaceutical Science 16th edition」、Oslo Ed. (1980)を参照）。さらに、薬剤を徐放性薬剤として調製するための方法も公知であり、これらは本開示の抗原結合分子に適用することができる（J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 267-277; Chemtech. (1982) 12, 98-105；米国特許第3773719号；欧州特許出願 (EP)番号EP58481およびEP133988；Biopolymers (1983) 22, 547-556）。
本開示の医薬組成物、細胞増殖抑制剤、または抗がん剤は、経口または非経口のいずれかで患者に投与され得る。非経口投与が好ましい。具体的には、そのような投与法には、注射、経鼻投与、経肺投与、および経皮投与が含まれる。注射には、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および皮下注射が含まれる。例えば、本開示の医薬組成物、細胞傷害を誘導するための治療剤、細胞増殖抑制剤、または抗がん剤は、注射により局所的にまたは全身的に投与することができる。さらに、適切な投与方法が患者の年齢および症状に応じて選択することができる。投与用量は、例えば、各投与につき体重1 kgあたり0.0001 mg～1,000 mgの範囲から選択することができる。あるいは、用量は、例えば、1患者あたり0.001 mg～100,000 mgの範囲から選択することができる。しかしながら、本開示の医薬組成物の用量は、これらの用量に限定されない。
好ましくは、本開示の医薬組成物は、本明細書において記載されるような抗原結合分子または抗体を含む。1つの局面において、組成物は、細胞傷害を誘導することにおいて使用するための医薬組成物である。別の局面において、組成物は、がんを治療または予防することにおいて使用するための医薬組成物である。好ましくは、がんは結腸直腸がんまたは胃がんである。本開示の医薬組成物は、がんを治療または予防するために用いることができる。したがって、本開示は、その必要がある患者に本願明細書に記載される抗原結合分子または抗体が投与される、がんを治療または予防するための方法を提供する。
本開示はまた、CLDN6を発現する細胞を、CLDN6に結合する本開示の抗原結合分子と接触させることにより、CLDN6を発現する細胞を損傷する、または細胞増殖を抑制する方法を提供する。CLDN6に結合するモノクローナル抗体は、本開示の抗原結合分子として上記されており、これは、本開示の、細胞傷害を誘導するための治療剤、細胞増殖抑制剤、および抗がん剤中に含まれる。本開示の抗原結合分子が結合する細胞は、それらがCLDN6を発現する限り、特に限定されない。具体的には、本開示において、好ましいがん抗原発現細胞には、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、乳がん細胞、子宮がん細胞、肝がん細胞、肺がん細胞、膵がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、および結腸がん細胞が含まれる。
本開示において、「接触」は、例えば、in vitroで培養されたCLDN6を発現する細胞の培地に本開示の抗原結合分子を添加することによって行うことができる。この場合、添加されるべき抗原結合分子は、溶液、または凍結乾燥等によって調製された固体などの適切な形態で用いることができる。本開示の抗原結合分子が水溶液として添加される場合、該溶液は、抗原結合分子を単独で含有する純粋な水溶液、または例えば上記の界面活性剤、賦形剤、着色剤、着香剤、保存剤、安定化剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、および矯味剤を含有する溶液であってよい。添加濃度は特に限定されない；しかしながら、培地中の最終濃度は、好ましくは1 pg/ml～1 g/ml、より好ましくは1 ng/ml～1 mg/ml、およびさらにより好ましくは1μg/ml～1 mg/mlの範囲内である。
本開示の別の態様において「接触」はまた、CLDN6発現細胞をin vivoに移植された非ヒト動物、または内因的にCLDN6を発現するがん細胞を有する動物に投与することによって行うこともできる。投与方法は、経口または非経口であってよい。非経口投与が特に好ましい。具体的には、非経口投与方法には、注射、経鼻投与、経肺投与、および経皮投与が含まれる。注射には、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および皮下注射が含まれる。例えば、本開示の医薬組成物、細胞傷害を誘導するための治療剤、細胞増殖抑制剤、または抗がん剤は、注射によって局所投与または全身投与することができる。さらに、適切な投与方法は、動物対象の年齢および症状に従って選択され得る。抗原結合分子が水溶液として投与される場合、該溶液は、抗原結合分子を単独で含有する純粋な水溶液、または例えば上記の界面活性剤、賦形剤、着色剤、着香剤、保存剤、安定化剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、および矯味剤を含有する溶液であってよい。投与量は、例えば、各投与につき体重1 kgあたり0.0001～1,000 mgの範囲から選択され得る。あるいは、用量は、例えば、各患者につき0.001～100,000 mg／身体の範囲から選択され得る。しかしながら、本開示の抗原結合分子の用量は、これらの例に限定されない。
本開示はまた、本開示の抗原結合分子または本開示の方法によって産生された抗原結合分子を含有する、本開示の方法において使用するためのキットも提供する。該キットは、追加の薬学的に許容される担体もしくは媒体、またはキットの使用方法を記載した取扱説明書等と共に包装され得る。
本発明の別の局面において、上述の障害の治療、予防、および／または診断に有用な器材を含んだ製品が、提供される。製品は、容器、および当該容器上のラベルまたは当該容器に付属する添付文書を含む。好ましい容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器類は、ガラスやプラスチックなどの、様々な材料から形成されていてよい。容器は組成物を単体で保持してもよいし、症状の治療、予防、および／または診断のために有効な別の組成物と組み合わせて保持してもよく、また、無菌的なアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって突き通すことのできるストッパーを有する静脈内投与用溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも1つの有効成分は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選ばれた症状を治療するために使用されるものであることを示す。さらに製品は、(a)第1の容器であって、その中に収められた本発明の抗体を含む組成物を伴う、第1の容器；および、(b)第2の容器であって、その中に収められたさらなる細胞傷害剤またはそれ以外で治療的な剤を含む組成物を伴う、第2の容器を含んでもよい。本発明のこの態様における製品は、さらに、組成物が特定の症状を治療するために使用され得ることを示す、添付文書を含んでもよい。あるいはまたは加えて、製品はさらに、注射用制菌水 (BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む、第2の（または第3の）容器を含んでもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジなどの、他の商業的観点またはユーザの立場から望ましい器材をさらに含んでもよい。
上記の任意の製造物品が、抗原結合分子もしくは抗体に代えてまたはそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含みうることが理解される。
本明細書において引用された文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
以下は、本開示の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。
実施例1. sc(Fv) 2 分子の安定性
ブリナツモマブの安定性に関して、ブリナツモマブを、自社で、20mM His、150mM NaCl, pH6.0中で3.8 mg/mLに精製した。高分子量 (HMW) 種の比率は、SEC分析により6.4%であると決定された。物理化学的試験のために、それをPBS、pH7.4に対して透析し、濃度を1mg/mLに調整した。透析後、HMW比は42.6%となった。一般に、IgG抗体のHMW比は透析中に変化しない。そのため、ブリナツモマブは溶液中で凝集傾向があり、IgG抗体と比較して安定性が低いと考えられた。SEC分析は、50 mMリン酸ナトリウム、300 mM NaCl、pH7.0をランニングバッファーとして使用して、SWXL G2000カラム (TOSOH) を用いて行った。検出はUV検出器 (280 nm) によって行った。クロマトグラムは、Empower 3ソフトウェア (Waters) を用いて分析した。
実施例2. クローディン6 (CLDN6) と結合するT細胞リダイレクティング抗体の選択
実施例2-1. 抗CLDN6 T細胞リダイレクティング抗体の作製
sc(Fv)2形式の限界を克服するために、本発明者らは、抗体がより優れた安定性およびより長い血清半減期を得られるようにする、IgG形式の、CLDN6を標的とするT細胞リダイレクティング二重特異性抗体（抗CLDN6/CD3二重特異性抗体）を作製した。
3つの抗CLDN6抗体（AE3-20、AH05、CDA0013）の可変領域、6PHU3のCLDN6結合可変領域、および1つの抗CD3抗体 (TR01) の可変領域を用いて、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体を作製した。CDA0013は、CLDN6発現ベクターで免疫したウサギのB細胞から得た。
上記の可変領域を使用して、Igawa et al. (WO 2016159213) により報告されたFabアーム交換技法を用いて、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体を作製した。抗CLDN6/CD3抗体アーム中に含まれる可変領域を表1に示し、作製された二重特異性抗体は、Fcγ受容体に対する親和性が低下したサイレントFcを含む。4つの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体、AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01、および6PHU3/TR01が作製された（表1）。
（表１）作製された抗CLDN6/CD3二重特異性抗体
Figure 2022529288000001
実施例2-2. Jurkatレポーター遺伝子アッセイを用いた抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化活性
実施例2-1で作製された抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の、hCLDN6/BaF、hCLDN9/BaF、またはhCLDN6(Q156L)/BaFの存在下におけるT細胞活性化活性を、参考実施例3に記載される方法によって調べた。それぞれ0.001、0.01、0.1、1、および10 nMの濃度下での各抗体のT細胞活性化活性を決定した。
結果（図1A、図1B）から、すべての抗CLDN6/CD3二重特異性抗体が、hCLDN6/BaFの存在下で強いT細胞活性化を誘導することが示された。hCLDN9/BaFの存在下において、6PHU3/TR01ではわずかなT細胞活性化が観察されたが、その他のAE3-20/TR01、AH05/TR01、およびCDA0013/TR01では活性化は観察されなかった。この結果により、6PHU3/TR01がヒトCLDN9発現細胞にわずかに結合したものの、すべての抗CLDN6/CD3二重特異性抗体がCLDN6に対して比較的高い特異性を示したことが示唆される。
図1Aおよび図1Cは、すべての抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化が、hCLDN6(Q156L)/BaFの存在下では、hCLDN6/BaFの存在下でのそれらのT細胞活性化と比較して低かったことを示しており、すべての抗CLDN6/CD3二重特異性抗体が、ヒトCLDN6の156位のアミノ酸残基を含むエピトープに結合することが示唆される。
実施例2-3. CLDNファミリータンパク質に対する抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の抗原結合特異性
ヒトおよびマウスのCLDN3、4、6、および9を一過性に発現するFreeStyle（商標）293-F細胞を、以下のように作製した。対応する配列をコードする合成cDNAを哺乳動物発現ベクターpCXND3 (WO2008/156083) に挿入することにより、ヒトおよびマウスCLDN（CLDN6、CLDN9、CLDN3、およびCLDN4を含む）の発現ベクターを作製した。
各ベクターを、293fectin (Invitrogen) を用いて、FreeStyle（商標）293-F細胞 (Invitrogen) に導入した。細胞を2～4日培養し、遠心分離により収集した。収集された細胞を直ちに、0.1% BSA含有D-PBS(-)中に、細胞3×106個／mLの濃度で再懸濁した。
評価した抗体：
1) 抗CLDN6/CD3二重特異性抗体：AE3-20/TR01、AH05/TR01、CDA0013/TR01、6PHU3/TR01；
2) Fabアーム交換によりヒトCD3抗体（配列番号：70に示されるVH、配列番号：71に示されるVL）と対形成された抗キーホールリンペットヘモシアン (KLH) 抗体（配列番号：68に示されるVH、配列番号：69に示されるVL）の二重特異性抗体：KLH/TR01（陰性対照として）；
3) 市販の抗CLDN二価抗体（R&D systemsから購入）：マウス抗ヒトCLDN6抗体 (MAB3656)、マウス抗ヒトCLDN3抗体 (MAB4620)、マウス抗ヒトCLDN4抗体 (MAB4219)。
抗体を、ヒトおよびマウスのCLDN3、4、6、および9を一過性に発現するFreeStyle（商標）293-F細胞と、10μg/mLの最終濃度で混合した。1時間のインキュベーション後、細胞を0.1% BSA含有D-PBS(-)で洗浄し、5μg/mLのヤギ抗ヒトIgG (H+L) 交差吸着済み二次抗体、Alexa Fluor 647（Invitrogen、A21445）またはヤギ抗マウスIgG (H+L) 高度交差吸着済み二次抗体、Alexa Fluor 647（Invitrogen、A21236）のいずれか中で1時間インキュベートした。次いで、細胞を0.1% BSA含有D-PBS(-)で洗浄し、5μLの0.1% BSA含有D-PBS(-)中に再懸濁し、フローサイトメーター（iQue Screener、intellicyte）によって解析した。
図2-1および図2-2に示されるように、ヒトCLDN6に対する強い結合が、すべての抗CLDN6/CD3二重特異性抗体において観察された。マウスCLDN6に対する結合もまた、すべての抗CLDN6/CD3二重特異性抗体において観察されたが、それらはヒトCLDN6に対する結合よりも弱かった。抗CLDN6/CD3二重特異性抗体はすべて、ヒトCLDN9、ヒトCLDN4、ヒトCLDN3、マウスCLDN9、マウスCLDN4、またはマウスCLDN3に対してわずかな結合を示すか、または結合を示さなかった。特に、CDA0013/TR01は、CLDN6に対する最も高い特異性を示した。
実施例2-4. 抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のin vivo有効性解析
抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のin vivo抗腫瘍効果を、腫瘍担持マウスモデルを用いて評価した。ヒトCLDN6を発現するヒトがん細胞株（HuH-7 (Health Science Research Resources Bank)、OV-90 (ATCC)、またはOVCAR-3 (ATCC)）をNOD/ShiJic-scidマウスの皮下に移植し、そのマウスにヒトPBMCを注入した（いわゆるT細胞注入モデル）。腫瘍担持マウスを、抗体または対照としての溶媒の投与を受ける処置群に無作為に割り付けた。
より具体的には、HuH-7またはOV-90またはOVCAR-3 T細胞注入モデルを用いる有効性試験において、以下の試験を行った。T細胞の拡大は、ヒトPBMC (AllCells) およびT細胞活性化／拡大キット (Miltenyi Biotec) を用いて行った。細胞1×107個のHuH-7、細胞5×106個のOV-90、または細胞1×107個のOVCAR-3をマトリゲル基底膜マトリックス (BD) と混合し、NOD/ShiJic-scidマウス（CLEA Japan、雌、6～7週齢）の側腹部の皮下に移植した。移植の日を0日目と規定した。腫瘍サイズおよび体重に従って無作為化および群分けした後、抗アシアロGM1抗体 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) を0.2 mg／マウスで腹腔内投与した。翌日、T細胞を拡大培養物から収集し、細胞3×107個／マウスで腹腔内の移植に使用した。T細胞移植のおよそ4時間後に、抗体を静脈内投与した。抗体は1回のみ投与した。腫瘍塊の長さ (L) および幅 (W) ならびに各マウスの体重を測定し、腫瘍体積 (TV) をTV = (L×W×W) / 2として算出した。
図3は、OV-90およびHuH-7 T細胞注入モデルにおけるAE3-20/TR01、AH05/TR01、および6PHU3/TR01のin vivo抗腫瘍効果を示す。これらの抗体を5mg/kgで注入すると、腫瘍の増殖が強く抑制された。特に、HuH-7 T 細胞注入モデルでは、AE3-20/TR01が、他の2つの抗体、AH05/TR01および6PHU3/TR01と比較して最も優れた有効性を示した（図3a）。
抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の毒性および薬物動態 (PK) 解析を、同じマウスモデルを用いて行った。AE3-20/TR01、AH05/TR01、および6PHU3/TR01はいずれも、OV-90およびHuH-7 T細胞注入モデルにおいて抗腫瘍効果を示したが、AH05/TR01および6PHU3/TR01で処置したマウスでは、劇的な体重減少が認められた。AE3-20/TR01で処置したマウスでは、体重変化は認められなかった（図4）。加えて、体重が減少したマウスは、全身状態の悪化ならびに皮膚および血漿の黄変を示した。
安楽死後、血漿を採取し、血液生化学検査を行った。ALT、ALP、GGT、GLDH、TBIL、およびTBAを含む肝毒性マーカーの血漿レベルを決定した（TBA-120FR、Canon medical system）。AH05/TR01および6PHU3/TR01で処置したマウスでは、肝臓パラメーターが有意に上昇していた（図5）。これらのデータから、AH05/TR01および6PHU3/TR01が、マウスにおいて肝毒性を引き起こすことが示された。
抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のPKを以下のように評価した。抗体を、5 mg/kgの用量でマウスに静脈内注射した。HuH-7 T細胞注入モデルにおいては抗体注射後の3、7、13日目に、およびOV-90 T細胞注入モデルにおいては抗体注射後の3、6、14日目に、3匹のマウスから血液を採取した。10,000×gで4℃にて5分間遠心分離することにより、ヘパリン血漿試料を得た。マウス血漿中の抗体の濃度を、以下に記載されるようにELISAによって測定した。抗ヒトIgG抗体 (Sigma) をNunc-ImmunoPlate MaxiSorp (Thermo Fisher) に分注し、室温で1時間静置して、抗ヒトIgG固定化プレートを調製した。8、4、2、1、0.5、0.25、または0.125 ng/mLの濃度の試料抗体を検量に使用し、検査用には、400倍またはそれ以上希釈してマウス血漿試料を調製した。各試料を抗ヒトIgG固定化プレートに分注し、室温で1時間静置した。次いで、ビオチン化抗Fc特異的抗体 (CHUGAI) を添加して、室温で1時間反応させた。ストレプトアビジン-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) を添加して、室温で1時間反応させ、基質としてABTS (Roche) を用いて発色反応を行った。次いで、405 nm（650 nmを参照とする）における吸光度を、マイクロプレートリーダーによって測定した。マウス血漿中の抗体濃度を、解析用ソフトウェアSOFTmax PRO (Molecular Devices) を用いて、検量線の吸光度から算出した。
静脈内投与後のAE3-20/TR01、AH05/TR01、および6PHU3/TR01の血漿濃度の継時変化を、図6に示す。AE3-20/TR01、AH05/TR01、および6PHU3/TR01の半減期 (T1/2) は、HuH-7 T細胞注入モデルの血漿中でおよそ3.44～4.79日であり、OV-90 T細胞注入モデルでおよそ2.77～3.22日であった。
最も注目すべきことには、6PHU3/TR01の血漿半減期が、以前の報告 (6) において記載された二重特異性sc(Fv)2 6PHU3のものと比較して、HuH-7モデルでは3.44日およびOV-90モデルでは2.77日まで延長された。この延長は、抗体が二重特異性sc(Fv)2からIgG形式へ変換されたことに起因する可能性が最も高い。しかしながら、6PHU3/TR01は、注入後の体重の有意な減少および肝臓マーカーの増加によって確認されるように、マウスにおいて肝毒性をもたらした（図4および図5）。これらの知見から、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の血漿半減期の延長が肝毒性をもたらした可能性があることが示唆される。
5 mg/kgの用量のAE3-20/TR01およびCDA0013/TR01のin vivo抗腫瘍効果および安全性も、OVCAR-3 T細胞注入マウスモデルを用いて評価した。実験は上記と同様の手順で行った。
図7に示されるように、AE3-20/TR01による処置は腫瘍体積の有意な減少をもたらしたが、CDA0013/TR01による処置は、OVCAR-3担持マウスにおいて中等度の有効性を示した。抗体処置後、全体としては劇的な体重減少はほとんど検出できなかったが、CDA0013/TR01処置群では肝毒性マーカーの明らかな増加が認められた（図8）。実際に、CDA0013/TR01処置群の5匹中1匹のマウスが、わずかな体重減少を示した。
AE3-20/TR01およびCDA0013/TR01のPKを、5 mg/kgで静脈内注射した動物を用いて、以下のように算出した。注射後の3、7、14日目に3匹の動物から採取した血液からヘパリン血漿試料を調製し、次いで本実施例において先に記載されたようにELISAによる抗体の濃度の測定に供した。
図9に示されるように、AE3-20/TR01とCDA0013/TR01のPK特性は同等であった。AE3-20/TR01およびCDA0013/TR01の血漿半減期 (T1/2) は3.60日および3.98日であり、ゼロから無限時間までの血漿濃度-時間曲線下面積 (AUCinf) はそれぞれ138日*μg/mLおよび161日*μg/mLであった。
本実施例の結果によると、IgG形式のいくつかの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体は、肝損傷を引き起こす可能性がある傾向があったが、すべての抗体が、CLDN6に対する比較的高い特異性および同様の薬物動態プロファイルを示した。試験した抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の中で、AE3-20/TR01は、様々な腫瘍担持マウスモデルにおいて有効性および良好な安全性の両方を示した唯一の抗CLDN6/CD3二重特異性抗体であることが判明した。
実施例3. 抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のためのCLDN6結合可変領域のヒト化
AE3-20/TR01は様々な腫瘍担持マウスモデルにおいて有効性および良好な安全性の両方を示したが、AE3-20/TR01のCLDN6結合可変領域はマウス配列であり、その免疫原性が高いため、この抗体を患者へ投与するために適用することはできない。AE3-20/TR01のCLDN6結合可変領域のヒト化を行った。AE3-20/TR01のCD3結合可変領域は、ヒト化配列である。
AE3-20/TR01のCLDN6結合VH（AE3.20H、配列番号： 1）およびAE3-20/TR01のCLDN6結合VL（AE3.20L、配列番号： 2）のアミノ酸残基は、Kabat (Kabat et al., Sequence of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) に従って番号付けされる。
AE3.20Hのフレームワークをヒト生殖細胞系列フレームワーク（FR1としての配列番号： 3、4、5、6、7、8、または9、FR2としての配列番号： 10、FR3としての配列番号： 11、12、13、14、15、16、または17、FR4としての配列番号： 18）で置換することにより、49種類のVHを設計した。AE3.20Lのフレームワークをヒト生殖細胞系列フレームワーク（FR1としての配列番号： 19、20、21、または 22、FR2としての配列番号： 23、FR3としての配列番号： 24、25、26、または27、FR4としての配列番号： 28）で置換することにより、16種類のVLを設計した。AE3.20Hおよび設計されたVHをコードするポリヌクレオチドを、重鎖定常領域SG1（アミノ酸配列は配列番号： 80に示される）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにそれぞれクローニングした。AE3.20Lおよび設計されたVLをコードするポリヌクレオチドを、軽鎖定常領域SK1（アミノ酸配列は配列番号： 81に示される）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにそれぞれクローニングした。AE3.20Hおよび設計されたVHを含む重鎖を、AE3.20Lを含む軽鎖と共に、Expi 293細胞においてそれぞれ一過性に発現させ、設計されたVLを含む軽鎖を、AE3.20Hを含む重鎖と共に、Expi 293細胞においてそれぞれ一過性に発現させた。
設計されたVHおよびAE3.20Lを含む抗体、ならびに設計されたVLおよびAE3.20Hを含む抗体の、hCLDN6/BaFへの結合を、FCM解析により決定した。各抗体の結合活性は、平均蛍光強度値 (MFI) によって表される。抗体をhCLDN6/BaFと共に4℃で30分間インキュベートし、HEPES-BSA洗浄緩衝液（Nacalai Tesque、Cat. L3P8406）で洗浄した。次いで、ヤギF(ab')2抗ヒトIgG、マウスads-PE（Southern Biotech、Cat. 2043-09）二次抗体を添加し、4℃の暗所で30分間インキュベートし、その後洗浄した。データ取得はLSR Fortessa X-20 (BD Biosciences) を用いて行い、FlowJoソフトウェア (Tree Star) を用いて解析した。
設計された49種類のVHの中で、2種類のVHのみ（表2に示される）が、AE3.20Hを含む抗体と比較して、ヒトCLDN6に対する抗体の結合活性を向上させることができた。設計された16種類のVLのいずれも、AE3.20Lと同程度には、ヒトCLDN6に対する抗体の結合活性への寄与を示さなかった。抗体のCLDN6結合活性を損なうことなくAE3.20Lをヒト化することは難しいと考えられる。
（表２）
Figure 2022529288000002
ヒトCLDN6に対する十分な結合活性を達成するために、CLDN6結合VLを合理的に設計した（AE3.20Lの対応するフレームワークに類似したヒト生殖細胞系列フレームワーク配列を選択し、フレームワークへの復帰変異の導入もまた試みた）。設計されたVL（17L、18L、19L、および20L）は、AE3.20Lと同じCDR配列を有し、それらのフレームワークの配列を表3に示す。18L、19L、および20Lのフレームワークにおいて復帰変異が採用され、これらもまた表3に示す。VH25H、ならびに17L、18L、19L、および20Lより選択されるVLを含む二価IgG抗体を、Expi 293細胞において一過性に発現させた。図10は、FCM解析により決定された、hCLDN6/BaFに対する様々な抗体の結合を示す。各抗体の結合活性は、MFIによって表される。図10の横軸上の名称は、各抗体に含まれるVHおよびVLを示す。
設計されたVL（17L、18L、19L、および20L）を含むすべての抗体が、AE3.20LをVLとして含む抗体よりも、ヒトCLDN6に対する弱い結合活性を示し、これによりまた、CLDN6結合活性を損なうことなくAE3.20Lをヒト化することの難しさが示された。しかしながら、G66R変異を有する20Lを含む抗体は、G66R変異を有しない17Lを含む抗体と比較して、ヒトCLDN6に対するより強い結合活性を示し、軽鎖フレームワークにおけるアミノ酸66位のGlyからArgへの置換が、ヒトCLDN6に対する抗体の結合活性を向上させるのに役立つことが示唆された。
（表３）
Figure 2022529288000003
実施例4. 抗CLDN6ヒト化抗体の親和性成熟
ヒト化CLDN6結合可変領域の結合親和性を向上させるために、網羅的に、単一または複数の変異をAE3.20HおよびAE3.20LのCDRに導入し、配列番号： 6を重鎖FR1として使用し、配列番号： 10を重鎖FR2として使用し、配列番号： 14を重鎖FR3として使用し、配列番号： 18を重鎖FR4として使用し、配列番号： 22または19を軽鎖FR1として使用し、配列番号： 23を軽鎖FR2として使用し、配列番号： 24または32を軽鎖FR3として使用し、配列番号： 28または29を軽鎖FR4として使用して、様々な改変抗体を作製した。改変抗体をExpi293 (Invitrogen) で発現させ、プロテインA精製により精製した。
改変抗体のCLDN6結合活性を確認することにより、表4および表5に示されるアミノ酸置換が、ヒトCLDN6に対する結合活性を向上させるのに役立つ可能性があることが示唆された。
（表４）
Figure 2022529288000004
（表５）
Figure 2022529288000005
表4に記載されるVHおよび表5に記載されるVLを、ヒトCD3に対する結合活性を示す可変領域（VH 配列番号： 70；VL 配列番号： 71）と共に使用して、Igawa et al. (WO 2016159213) により報告されたFabアーム交換技法を用いて、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体を作製した。抗CLDN6/CD3抗体アーム中に含まれる可変領域を表6に示し、作製された二重特異性抗体は、Fcγ受容体に対する親和性が低下したサイレントFcを含む。
（表６）
Figure 2022529288000006
図11は、参考実施例3に記載される方法によって決定された、hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下における、表6に示される10 nMの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化活性を示す。実施例2-3において作製されたKLH/TR01を陰性対照として使用した。
25H0322/20L0072//TR01および25H0562/20L0072//TR01などの二重特異性抗体のうちのいくつかは、AE3-20/TR01と比較して、hCLDN6/BaFの存在下でより低いT細胞活性化活性を示した。
25H0581/20L0072//TR01および25H0581/20L0532//TR01などの二重特異性抗体のうちのいくつかは、AE3-20/TR01と比較して、hCLDN9/BaFおよびhCLDN4/BaFの存在下でより高いT細胞活性化活性を示した。
しかし、いくつかの二重特異性抗体は、AE3-20/TR01と比較して、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下でより高いT細胞活性化を示さずに、hCLDN6/BaFの存在下で同等の類似のT細胞活性化活性を示した。
ECM（細胞外マトリックス）は細胞外の構成成分であり、in vivoの様々な部位に存在する。そのため、ECMに強く結合する抗体は、血中動態がより悪い（半減期がより短い）ことが知られている(WO2012093704 A1)。
表7に示されるVHおよびVLを含む二価IgG抗体のECM結合を評価した。各抗体のECM結合値（ECL反応）を、同一プレートまたは同一実施日に得られた抗体MRA（VH：配列番号： 66、VL：配列番号： 67）のECM結合値で除した。その結果得られた値を表7に示す。表7に示されるように、抗体のECM結合は大きく変動する。
（表７）ECM結合の結果
Figure 2022529288000007
上記の実験の結果から、CLDN6に対する高い結合活性、CLDN6に対する高い結合特異性（CLDN3、CLDN4、およびCLDN9に対する低い結合活性）、ならびに低いECM結合を含む、好ましい特性をすべて同時に有することは、非常に難しいことが示された。例えば、抗体におけるアミノ酸の違いは、互いに比較してわずかしかないが、VHとして25H0322または25H0562を含む抗体は、VHとしてAE3.20Hを含む抗体と比較して、CLDN6に対するより乏しい結合活性を示し；VHとして25H0581を含む抗体は、CLDN6に対する乏しい結合特異性を示し；VHとして25H0176または25H0322を含む抗体は、ECM結合の観点から最も好ましい改変体ではなかった。
ヒトCLDN6に対する結合活性および特異性をECM結合と共に考慮して、VHとして25Hまたは25H0042、VLとして20L0532を含む抗体を、さらなるエンジニアリングのために使用した。
実施例5. 抗体の最適化
Fabアーム交換技術によって作製された二重特異性抗体は、化合物を大規模に提供するための精製および製造工程には適していない。二重特異性抗体の製造性を向上させるために、さらなる最適化を以下のように行った。
実施例5-1. 分解ホットスポットの除去
環化、異性化、開裂、およびメチオニン酸化などの化学的分解を回避するため、言い換えると、抗体の安定性を向上させるために、CDR内の対応する配列におけるいくつかのアミノ酸残基を置換した。CLDN6結合可変領域の結合親和性および特異性をさらに向上させることが見出されているCDR内でのアミノ酸置換も導入した。
VHの名称、および25H0042と比較したアミノ酸置換を、表8に示す。VLの名称、および20L0532と比較したアミノ酸置換を、表9に示す。表8に記載されるVHおよび表9に記載されるVLを、ヒトCD3に対する結合活性を示す可変領域（VH 配列番号： 70；VL 配列番号： 71）と共に使用して、Igawa et al. (WO2016159213) により報告されたFabアーム交換技法を用いて、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体を作製した。抗CLDN6/CD3抗体アーム中に含まれる可変領域を表10に示し、作製された二重特異性抗体は、Fcγ受容体に対する親和性が低下したサイレントFcを含む。
（表８）
Figure 2022529288000008
（表９）
Figure 2022529288000009
（表１０）
Figure 2022529288000010
図12は、参考実施例3に記載される方法によって決定された、hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下における、10 nMの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化活性を示したものである。25H0671/20L0571//TR01は、CS2201と比較して、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下でより高いT細胞活性化を示さずに、CS2201と比較して、hCLDN6/BaFの存在下で同等のT細胞活性化を誘導した。
実施例5-2. pIの操作
二重特異性抗体の調製において、2種類の重鎖および2種類の軽鎖が発現に用いられる場合には、理論的には10種類の重鎖と軽鎖の組み合わせが発現される。これら10種類の抗体を分離することにより目的の二重特異性抗体を容易に精製できるようにするために、CLDN6結合VHおよびVLの等電点 (pI) を低下させるようアミノ酸改変を行った。
様々なアミノ酸置換のpI低下の効果を評価するために、VH 25H0671およびVL 20L0571にアミノ酸置換を導入して、負荷電アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸など）を増加させながら、正荷電アミノ酸（アルギニンおよびリジンなど）の数を減少させた。
表11は、pIが操作されたVH改変体を示し、表12は、pIが操作されたVL改変体を示す。
（表１１）
Figure 2022529288000011
（表１２）
Figure 2022529288000012
表11より選択されたVHおよび表12より選択されたVLを含む二価IgG抗体を、理論pIの算出に使用した。製造された二価IgG抗体は、同一のIgG定常領域を含む。抗体の理論pIは、以前に記載された方法と同様の方法により、GENETYX-SV/RC Ver 14.0.0 (GENETYX CORPORATION) を用いて算出した。
算出された理論pI値を表13に示す。
（表１３）理論pI
Figure 2022529288000013
表14に記載されるCLDN6結合可変領域を、ヒトCD3に対する結合活性を示す可変領域（VH 配列番号： 70；VL 配列番号： 71）と共に使用して、Igawa et al. (WO2016159213) により報告されたFabアーム交換技法を用いて、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体を作製した。作製された二重特異性抗体は、Fcγ受容体に対する親和性が低下したサイレントFcを含む。
（表１４）
Figure 2022529288000014
図13は、参考実施例3に記載される方法によって決定された、hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下における、CLDN6結合VHにおいてpIが操作された抗CLDN6/CD3二種特異的抗体（57H0671/20L0571//TR01および65H0671/20L0571//TR01）のT細胞活性化活性を示す。
理論pI、T細胞活性化活性、およびフレームワークの配列に従って、さらなる評価のために65H0671のフレームワークを選択した。
図14は、参考実施例3に記載される方法によって決定された、hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下における、CLDN6結合VLにおいてpIが操作された抗CLDN6/CD3二種特異的抗体（25H0671/53L0571//TR01および25H0671/54L0571//TR01）のT細胞活性化活性を示す。
理論pIおよびT細胞活性化活性に従って、54L0571のフレームワークをさらなる評価のために選択した。
表15に記載されるCLDN6結合可変領域を、ヒトCD3に対する結合活性を示す可変領域（VH 配列番号： 70；VL 配列番号： 71）と共に使用して、Igawa et al. (WO2016159213) により報告されたFabアーム交換技法を用いて、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体を作製した。作製された二重特異性抗体は、Fcγ受容体に対する親和性が低下したサイレントFcを含む。
（表１５）
Figure 2022529288000015
図15は、参考実施例3に記載される方法によって決定された、hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下における、CLDN6結合VHおよびCLDN6結合VLの両方においてpIが操作された抗CLDN6/CD3二種特異的抗体のT細胞活性化活性を示す。結果から、65H0671/54L0571//TR01のヒトCLDN6に対する結合活性および結合特異性は、25H0671/20L0571//TR01のものと同等であることが示された。
選択されたフレームワークを含む抗体のpI値はまた、Maurice (ProteineSimple) とcIEFカートリッジ (PS-MC02-C) を用いて、実際に決定した。抗体中の定常領域は、表13に示されるものと同じであった。試料添加は55秒間行った。その後、電気泳動を1500 Vで1分間および3000 Vで6分間行った。280 nmでの標準的なUV吸光度と組み合わせた、330 nmおよび280 nm励起での蛍光発光検出。蛍光曝露時間は、3秒、5秒、10秒、および20秒であった。陽極液には、0.1%メチルセルロース中の80 mMリン酸を使用し、陰極液には、0.1%メチルセルロース中の100 mM水酸化ナトリウムを使用した。各試料溶液は、0.017 mg/mlの試料、5% Pharmalyte 3-10、0.42%メチルセルロース、3.6M尿素、10mM Arg、1% pIマーカー4.05、および1% pIマーカー9.99の一定量を含有した。データ解析には、関連ソフトウェアCompass for iCE (2.0.10) を使用した。
（表１６）
Figure 2022529288000016
表16に示されるように、65H0671/54L0571_二価の測定されたpIは7.49であり、これはいかなるpI操作アミノ酸改変も行っていない抗体である25H0671/20L0571_二価のpIよりも低かった。
実施例 5-3. 重鎖と軽鎖の対形成の制御
二重特異性抗体の調製において、2種類の重鎖および2種類の軽鎖が発現に用いられる場合には、理論的には10種類の重鎖と軽鎖の組み合わせが発現される。これらの組み合わせのうちの1つだけが目的の二重特異性抗体であるため、目的の二重特異性抗体を得るには、10種類の異なる抗体の混合物から目的の1つの抗体を精製する必要があり、これは非常に非効率的であり困難である。この問題を解決する手段として、2種類の異なるH鎖が組み合わされたIgGが優先的に分泌されるように、「突起 (Knob)」および「空隙 (Hole)」の改変（KiH：Knobs into Hole）をIgG H鎖のCH3ドメインに導入し、さらに効率的に目的の分子を得るために、所望のH鎖-L鎖の会合を促進するための可変領域およびCH1-CLドメイン界面におけるアミノ酸置換およびそれらの組み合わせ（WO2013065708を参照のこと）を導入した。
アミノ酸置換Q39Kを、配列番号： 70に示されるCD3結合VHに導入し、アミノ酸置換Q38Eを、配列番号： 71に示されるCD3結合VLに導入した。アミノ酸が置換されたCD3結合VHおよびVLの配列を、それぞれ配列番号： 60および配列番号： 61に示した。
アミノ酸置換Q39EをCLDN6結合VHである65H0671に導入し、アミノ酸置換Q38KをCLDN6結合VLである54L0571に導入した。アミノ酸が置換されたCLDN6結合VHおよびVLを、それぞれ65H0671Q39E (配列番号： 57) および54L0571Q38K (配列番号： 58) と命名した。
CLDN6結合VHである65H0671Q39Eを、配列番号： 95に示される第1のCH1ドメイン領域に連結し、CLDN6結合VLである54L0571Q38Kを、配列番号： 59に示される第1のCLドメインに連結して、配列番号： 96に示される第1の軽鎖を作製した。配列番号： 60に示されるCD3結合VHを、配列番号： 97に示される第2のCH1ドメインに連結し、配列番号： 61に示されるCD3結合VLを、配列番号： 62に示される第2のCLドメインに連結して、配列番号： 98に示される第2の軽鎖を作製した。CH1ドメインおよびCLドメインはまた、天然に存在するものと比較してアミノ酸置換を含んでおり、それらは、第1のCH1ドメインにおける147位、175位、および213位のGlu (E)；第1のCLドメインにおける123位、131位、160位、および180位のLys (K)；第2のCH1ドメインにおけるアミノ酸175位のLys (K)；ならびに第2のCLドメインにおけるアミノ酸131位、160位、および180位のGlu (E) である。第1のCH1ドメインをさらに第1ヒンジ-CH2-CH3領域に連結して、配列番号： 99に示される第1の重鎖を作製し、第2のCH1ドメインをさらに第2ヒンジ-CH2-CH3領域に連結して、配列番号： 100に示される第2の重鎖を作製した。結果として、抗体CS2425（第1の重鎖配列番号： 99、第1の軽鎖配列番号： 96、第2の重鎖配列番号： 100、第2の軽鎖配列番号： 98）が作製された。
CS2425の電荷不均一性を、Maurice (ProteineSimple) とcIEFカートリッジ (PS-MC02-C) を用いて評価した。試料の添加は55秒間行った。その後、電気泳動を1500 Vで1分間および3000 Vで6分間行った。検出は、280 nmでのUV吸光度であった。陽極液には、0.1%メチルセルロース中の80 mMリン酸を使用し、陰極液には、0.1%メチルセルロース中の100 mM水酸化ナトリウムを使用した。各試料溶液は、0.085 mg/mlの試料、2% Pharmalyte 5-8、2% Pharmalyte 8-10.5、0.42%メチルセルロース、3.6M尿素、10mM Arg、1% pIマーカー5.85、および1% pIマーカー10.17の一定量を含有した。データ解析には、関連ソフトウェアCompass for iCE (2.0.10) を使用した。
図16(A)は、上記で作製された第1の重鎖、第1の軽鎖、第2の重鎖、および第2の軽鎖を共に発現させた場合の、CS2425 (65H0671Q39E-SG1189v14k/54L0571Q38K-SK1018//TR01H(Q39K)-SG1191v14h/TR01L(Q38E)-SK1017) の電荷不均一性を示したものである。pI 9.0付近の主要ピーク以外に他の明らかなピークが存在しないため、両変異が良好なHHおよびHL制御を行っていることが、電気泳動図から示唆された。
実施例5-4. 抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の抗腫瘍効果および安全性の解析
実施例5-1で作製された抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS2201のin vivo抗腫瘍効果を、OV-90 T細胞注入モデルを用いて決定した。AE3-20/TR01を比較として用いた。0.1 mg/kgの二重特異性抗体で処置したマウスでは、OV-90 T細胞注入モデルに対して、CS2201はAE3-20/TR01よりも有効であった（図17）。一方で、CS2201とAE3-20/TR01は、5 mg/kgで同等の抗腫瘍効果を示した（図18）。CS2201の肝毒性については、血液検査の結果から肝毒性マーカーの異常は認められなかった（図19）。さらに、CS2201とAE3-20/TR01のPK特性は同等であることが見出された（図20）。CS2201およびAE3-20/TR01の血漿半減期 (T1/2) は，0.1 mg/kg群でそれぞれ3.64日および3.48日であった。CS2201およびAE3-20/TR01のゼロから無限時間までの血漿濃度-時間曲線下面積 (AUCinf) は、0.1 mg/kg群でそれぞれ1.83日*μg/mLおよび2.35日*μg/mLであった。
OV-90 T細胞注入モデルを用いて、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体CS2425の抗腫瘍効果および毒性を調べた。OV-90細胞を接種したマウスを0.1 mg/kgまたは5 mg/kgのCS2425で処置し、腫瘍体積および体重を調べた。
0.1 mg/kgのCS2425を投与されたマウスにおいて、有意な腫瘍の退縮が認められた。この処置群では、抗体投与後のマウスの体重変化および全身状態の結果に基づき、毒性の徴候は認められなかった（図21A）。しかしながら、5 mg/kgのCS2425で処置したマウスは、有意な体重減少を示した（図21B）。激しい体重変化と一致して、5 mg/kg のCS2425を投与されたすべての動物で、肝損傷の血液マーカーが劇的に上昇していた（図22）。
CS2425の血中レベルも算出した。0.1 mg/kg群では注射後の4日目、13日目、および5 mg/kg群では注射後4日目、6日目に3匹の動物から調製された血漿試料を、実施例2-4に記載されるようにPK解析に使用した。図23は、投与後のCS2425の血漿濃度の時間経過を表す。
実施例6. CLDN6結合可変領域の再エンジニアリング
実施例6-1：ヒトPBMCを用いたin vitro免疫原性試験、および重鎖と軽鎖の対形成を制御するアミノ酸置換の再選択
表17に示される二価IgG抗体を作製した。抗体Aは免疫原性が低いことが知られており、免疫原性試験において陰性対照として使用した。抗hA33抗体は免疫原性が高いことが知られており、免疫原性試験において陽性対照として使用した。
（表１７）
Figure 2022529288000017
抗体の免疫原性能は、WO/2018/124005 (Kubo C. et al,.) に記載されているように、活性増殖が示される前のIL-2分泌CD4+ T細胞の割合を指標として使用することにより評価した。具体的には、CD8-CD25low PBMCをヒトPBMCから調製し、この細胞を抗体の存在下で67時間培養した。図24は、培養した細胞集団におけるIL-2分泌細胞の割合を決定した結果を示す。図24に示されるように、CS2419の陽性ドナーの頻度は、抗体Aのものと比較して低かった。一方、CS2421の陽性ドナーの頻度は、抗hA33抗体のものと同様であった。したがって、IL-2分泌CD4+ T細胞の割合を指標として使用すると、CS2419は免疫原性能が高くないが、CS2421組換え抗体は免疫原性が高いと考えられた。この結果から、配列番号： 96に示されるCS2425のCLDN6結合軽鎖は、潜在的なT細胞エピトープを伴うと考えられた。
CS2425のCLDN6結合軽鎖から潜在的なT細胞エピトープを同定するために、US20050202009A1 (Kropshofer H.et al.) およびmAbs 2018; 10: 1168-81 (Sekiguchi N. et al) に記載されているように、CS2425を用いてMHC結合ペプチドプロテオミクス (MAPPs) を行った。単球をヒトPBMCから調製し、この細胞を樹状細胞 (DC) に分化させた。LPSの存在下でDCを抗体でパルスし、DCを界面活性剤TX-100中で溶解した。抗HLA-DR抗体と結合させた磁気ビーズを免疫沈降過程において用いて、溶解したDCからペプチド-MHC II複合体を得て、0.1% TFAで溶出したHLA-DR結合ペプチドをLC/Obitrap MS/MS技術により分析した。CS2425の軽鎖の一部におけるMAPPsのヒートマップを図25に示す。図25に示されるように、アミノ酸180位のLysを含む、CS2425のCLDN6結合軽鎖の領域（配列番号167～184）において、多くのペプチドが潜在的なT細胞エピトープとして同定された。結果として、180位のこのアミノ酸置換は、CS2425のCLDN6結合軽鎖において潜在的なT細胞エピトープを生じる可能性があると考えられた。
免疫原性解析の結果によると、CLDN6結合VLに連結させたCL中のアミノ酸置換T180Kが免疫原性の高リスクをもたらし、したがって抗CLDN6/CD3二重特異性抗体を作製するためにこの変異は採用しなかった。
CLDN6結合VHである65H0671Q39Eを、配列番号： 95に示される第1のCH1ドメイン領域に連結し、CLDN6結合VLである54L0571Q38Kを、配列番号： 63に示される第1のCLドメインに連結して、配列番号： 102に示される第1の軽鎖を作製した。配列番号： 60に示されるCD3結合VHを、配列番号： 97に示される第2のCH1ドメインに連結し、配列番号： 61に示されるCD3結合VLを、配列番号： 62に示される第2のCLドメインに連結して、配列番号： 98に示される第2の軽鎖を作製した。CH1ドメインおよびCLドメインはまた、天然に存在するものと比較してアミノ酸置換を含んでおり、それらは、第1のCH1ドメインにおける147位、175位、および213位のGlu (E)；第1のCLドメインにおける123位、131位、および160位のLys (K)；第2のCH1ドメインにおけるアミノ酸175位のLys (K)；ならびに第2のCLドメインにおけるアミノ酸131位、160位、および180位のGlu (E) である。第1のCH1ドメインをさらに第1ヒンジ-CH2-CH3領域に連結して、配列番号： 99に示される第1の重鎖を作製し、第2のCH1ドメインをさらに第2ヒンジ-CH2-CH3領域に連結して、配列番号： 100に示される第2の重鎖を作製した。結果として、抗体65H0671Q39E-SG1189v14k/54L0571Q38K-SK1021//TR01H(Q39K)-SG1191v14h/TR01L(Q38E)-SK1017（第1の重鎖配列番号： 99、第1の軽鎖配列番号： 102、第2の重鎖配列番号： 100、第2の軽鎖配列番号： 98）が作製された。
電荷不均一性を、Maurice (ProteineSimple) とcIEFカートリッジ (PS-MC02-C) を用いて評価した。試料添加は55秒間行った。その後、電気泳動を1500 Vで1分間および3000 Vで6分間行った。検出は、280 nmでのUV吸光度であった。陽極液には、0.1%メチルセルロース中の80 mMリン酸を使用し、陰極液には、0.1%メチルセルロース中の100 mM水酸化ナトリウムを使用した。各試料溶液は、0.085 mg/mlの試料、2% Pharmalyte 5-8、2% Pharmalyte 8-10.5、0.42%メチルセルロース、3.6M尿素、10mM Arg、1% pIマーカー5.85、および1% pIマーカー10.17の一定量を含有した。データ解析には、関連ソフトウェアCompass for iCE (2.0.10) を使用した。
図16(B)は、上記で作製された第1の重鎖、第1の軽鎖、第2の重鎖、および第2の軽鎖を共に発現させた場合の、得られた抗体の電荷不均一性を示したものである。pI 9.0付近の主要ピーク以外に他の明らかなピークが存在しないため、両変異が良好なHHおよびHL制御を行っていることが、電気泳動図から示唆された
表18に示される二価IgG抗体を作製した。
（表１８）
Figure 2022529288000018
CS2652の軽鎖では、CLDN6結合VLである54L0571Q38Kを、配列番号： 63に示されるCLドメインに連結して、配列番号： 102に示される軽鎖を作製した。CLドメインは、天然に存在するものと比較してアミノ酸置換を含んでおり、それらは、123位、131位、および160位のLys (K)である。
IL-2分泌CD4+ T細胞の割合を指標として使用することによる、抗体の潜在的免疫原性。図26に示されるように、CS2652の陽性ドナーの頻度は抗体Aのものと同様であった。したがって、この抗体は高い免疫原性能を有していないと考えられた。
実施例6-2：CLDN6結合可変領域改変体の作製
AE3-20/TR01およびCS2201は、マウスにおいていかなる毒性も引き起こすことなく強い有効性を示すが、CS2425はマウスにおいて予想外に重篤な肝損傷を引き起こす。本発明者らは、実施例5に記載されたCLDN6結合可変領域におけるアミノ酸配列の改変が、抗体の特性に影響を及ぼした可能性があり、その後に毒性を引き起こしたと推測した。どの改変が抗体に影響を及ぼして肝毒性を引き起こすのかを確認するために、CS2425のものと比較してアミノ酸置換が少ないCLDN6結合可変領域改変体を構築した。
構築されたCLDN6結合可変領域改変体を、ヒトCD3に対する結合活性を示す可変領域（VH 配列番号： 70；VL 配列番号： 71）と共に使用して、Igawa et al. (WO 2016159213) により報告されたFabアーム交換技法を用いて、抗CLDN6/CD3二重特異性抗体を作製した。抗CLDN6/CD3抗体中に含まれる可変領域を表19および表20に示し、表21に示される作製された二重特異性抗体は、Fcγ受容体に対する親和性が低下したサイレントFcを含む。
これらの抗体のECM結合もまた、実施例4に記載される方法によって評価した。結果として、これらの抗体はいずれも低いECM結合を示した。
（表１９）
Figure 2022529288000019
（表２０）
Figure 2022529288000020
（表２１）
Figure 2022529288000021
実施例6-3. 抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の有効性および毒性の評価
作製された抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の抗腫瘍効果および安全性を評価するために、以下のようにOV-90 T細胞注入モデルによってin vivoマウス試験を行った。OV-90腫瘍を有するマウスに、5 mg/kgのCS2201、CS2425、CS2884、CS2885、CS2886、CS2958、CS2959、およびCS2960を投与し、次いで腫瘍体積および体重を算出した。処置後に血液もまた採取し、次いでこれを用いて肝損傷マーカーの血漿レベルを分析した。
図27は、CS2201およびCS2425に加えてCS2884、CS2885、およびCS2886を用いたin vivo実験の結果を示す。表21に記載されるように、部分的に最適化されたこれらの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体は、実施例5-2に記載されたアミノ酸置換を含む。図27に示されるように、CS2884、CS2885、およびCS2886は、OV-90腫瘍に対する増殖阻害効果を示した。これらの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体を投与されたマウスの中では、完全に最適化されたCS2425を除いて、体重および肝損傷マーカーの変化は見られなかった。この結果から、実施例5-2に記載されたアミノ酸置換が肝損傷の原因ではなかったことが示される（図28）。
図29は、CS2201およびCS2425に加えてCS2958、CS2959、およびCS2960を用いたin vivo実験の結果を示す。表21に記載されるように、CS2958は実施例5-2および実施例5-3に記載されたアミノ酸置換を含み、CS2959は実施例5-3に記載された可変領域のアミノ酸置換のみを含み、CS2960は実施例5-1および実施例5-2に記載されたアミノ酸置換を含む。図29に示されるように、これらの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体は腫瘍増殖を減少させたが、CS2425およびCS2960処置群では体重の有意な減少が観察された。体重減少と一致して、CS2425およびCS2960処置群では肝毒性マーカーの有意な上昇も認められた（図30）。
CS2425およびCS2960が肝損傷を起こしたことを示す結果から、実施例5-1に記載されたアミノ酸置換が毒性の原因である可能性が最も高いことが示唆された。
図31に示されるように、CS2201、CS2958、CS2959、およびCS2960の血漿半減期 (T1/2)は、それぞれ3.26日、3.77日、3.68日、および3.45日であった。CS2201、CS2958、CS2959、およびCS2960のゼロから無限時間までの血漿濃度-時間曲線下面積 (AUCinf) は、それぞれ90.0、134、106、および117日*μg/mLであった。
実施例6-4. Fcの最適化
Fc領域を選択するために、表22に示されるようにいくつかのFc改変体を作製した。Fcγ受容体に対するFc領域の結合活性を低下させるアミノ酸変異（FcgRサイレント変異）、脱グリコシル化変異、および重鎖ヘテロ二量体化を促進するための変異を導入した（WO2006106905に記載された通り）。
（表２２）
Figure 2022529288000022
実施例6-5. CS2961、CS3346、CS3347、およびCS3348の作製
これらのFc改変体を用いることにより、表23に示される4つの二重特異性抗体を構築した。
（表２３）
Figure 2022529288000023
実施例7. CS2961、CS3346、CS3347、およびCS3348の特徴づけ
実施例7-1. CLDNファミリータンパク質発現細胞の存在下における抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化活性
図32は、参考実施例3に記載される方法により決定された、hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、hCLDN9/BaF、またはhCLDN6(Q156L)/BaFの存在下における、様々な濃度の抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425、およびCS2961）のT細胞活性化活性を示す。本発明者らの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体はすべて、hCLDN6/BaFの存在下でT細胞活性化を誘導した。加えて、10 nMのAE3-20/TR01は、hCLDN4/BaFおよびhCLDN6(Q156L)/BaFの存在下で、他の抗CLDN6/CD3二重特異性抗体よりもわずかに高いT細胞活性化を誘導し、10 nMの6PHU3/TR01は、hCLDN9/BaFの存在下でわずかにより高いT細胞活性化を誘導した。
図33は、参考実施例3に記載される方法により決定された、hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、またはhCLDN9/BaFの存在下における、様々な濃度の、CS2201、CS2961、CS3346、CS3347、およびCS3348などの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化活性を示す。本発明者らの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体はすべて、hCLDN6/BaFの存在下でT細胞活性化を誘導し、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、およびhCLDN9/BaFの存在下では、T細胞活性化は、本発明者らのいずれの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体によっても観察されなかった。
実施例7-2. 抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞依存性細胞傷害の測定
図34は、CLDN6を発現するOVCAR3卵巣がん細胞株に対する抗CLDN6/CD3二重特異性抗体（AE3-20/TR01、CS2201、6PHU3/TR01、CS2425、CS2961、CS3346、CS3347、およびCS3348）のT細胞依存性細胞傷害を示す。細胞傷害は、ヒトPBMC (StemCell) を用いてLDHアッセイにより評価した。20,000個の標的細胞および200,000個のヒトPBMC (E/T = 10) を96ウェルU底プレートの各ウェルに播種し、様々な濃度の抗体と共に37℃および5% CO2で24時間インキュベートした。標的細胞の死滅を、LDH細胞傷害検出キット (Takara Bio) により測定した。各抗体の細胞傷害活性 (%) は、以下の式を用いて算出した。
細胞傷害活性 (%) = (A - B - C)×100 / (D - C)
「A」は抗体およびPBMCで処理したウェルの吸光度を表し、「B」はエフェクター細胞PBMCのみの平均吸光度値を表し、「C」は未処理の標的細胞のみの平均吸光度値を表し、「D」はTriton-Xで溶解したウェルの平均値を表す。バックグラウンドの吸光度は考慮し、減算してある。本発明者らの抗CLDN6/CD3二重特異性抗体はすべて、OVCAR3細胞に対するT細胞依存性細胞傷害を示した。
実施例7-3. CLDNファミリーに対するCS2961の特異性のFACS解析
アミノ酸配列は、CLDN3、CLDN4、CLDN6、およびCLDN9の間で高度に保存されている。したがって、本発明者らは、FACS解析によってCLDN6結合特異性を調べた。hCLDN6/BaF、hCLDN3/BaF、hCLDN4/BaF、およびhCLDN9/BaFを、15μg/mlのCS2201、CS2961、AH05/TR01、および6PHU3/TR01と共にインキュベートした。実施例2-3において作製されたKLH/TR01を、染色対照として使用した。各抗体の結合は、Alexa Fluor 488結合抗ヒトIgG (Invitrogen) を用いて検出した。死細胞は、eFlour 780 (Invitrogen) 染色により分離した。
図35-1および図35-2に示されるように、すべての抗CLDN6/CD3二重特異性抗体が、hCLDN6/BaFに対する強い結合を示した。評価した抗CLDN6/CD3二重特異性抗体の中で、CS2961が、CLDN6に対する最も高い特異性を示した。
実施例 7-4. 安定性
CS2961、CS3346、CS3347、およびCS3348の安定性を評価した。それぞれの抗体をPBS、pH7.4に対して透析し、回収時に濃度を1 mg/mLに調整した。試料を5℃および40℃で1週間、ならびに40℃で2週間保存した。保存後、50 mMリン酸Na、300mM NaCl、pH 7.0をランニングバッファーとして使用して、SWXL G3000カラム (TOSOH) を用いてSEC分析を行った。検出はUV検出器 (280 nm) によって行った。クロマトグラムは、Empower 3ソフトウェア (Waters) を用いて分析した。
図36に示される結果から、すべての抗体が良好な安定性を示し、これは確かに二重特異性sc(Fv)2分子のものよりもはるかに優れていることが示された。
実施例7-5. in vivoの有効性および安全性
CS2961の抗腫瘍効果および安全性を評価するために、以下のようにin vivoマウス試験を行った。OV-90腫瘍を有するマウスに5 mg/kgの精製CS2961を投与し、次いで腫瘍体積および体重を算出した。処置後に血液も採取し、次いでこれを用いて肝損傷マーカーの血漿レベルを分析した。
図29は、CS2961を用いたin vivo実験の結果を示す。図29に示されるように、CS2961は、処置したマウスの体重を減少させることも、肝毒性マーカーを増加させることもなく（図30）、腫瘍体積を減少させた。
図31に示されるように、CS2961の血漿半減期 (T1/2) は11.2日であり、CS2961のゼロから無限時間までの血漿濃度-時間曲線下面積 (AUCinf) は486日*μg/mLであった。これらの結果から、CS2961が、Fabアーム交換技術によって作製された抗CLDN6/CD3二重特異性抗体と比較して、より遅い消失速度を示すことが示された。
CS2961は、マウスにおいて、OV-90腫瘍に対する強力な抗腫瘍活性、ならびに優れた安全性およびPKプロファイルを示した。さらに、この抗体は、大量生産に好ましい改善された安定性、より良好なヘテロ二量体形成を示した。CS2961はまた、実施例5-2に記載されるアミノ酸置換のために、精製がより容易である。
実施例 7-6. 用量依存的なin vivo有効性
CS3348のin vivo効力を、実施例2-4に記載されたようにOV-90 T細胞注入モデルを用いてAE3-20/TR01と比較した。
マウスにおいて腫瘍体積がおよそ約200mm3に達した後、動物を無作為に割り当て、それぞれの二重特異性抗体または溶媒を投与した。図37はAE3-20/TR01で処置したマウスの腫瘍増殖を示し、図38はCS3348で処置したものを示す。実験では、がん細胞OV-90を0日目にマウスに移植し、様々な投与量のAE3-20/TR01を14日目にマウスに投与し、様々な投与量のCS3348を15日目にマウスに投与した。すべてのマウスが1回の投与を受けた。
AE3-20/TR01およびCS3348の両方において、すべての投与量で体重減少を伴うことなく、OV-90腫瘍に対する有意な有効性が用量依存的様式で認められた。
注目すべきことには、0.04 mg/kgのCS3348で処置したマウスにおいて腫瘍退縮が観察されたのに対して、1 mg/kgのAE3-20/TR01で処置したマウスにおいて腫瘍退縮が観察された。言い換えると、CS3348の抗腫瘍効果は、AE3-20/TR01の抗腫瘍効果の約25倍の強さである可能性が高い。
実施例8. in vivoの抗腫瘍効果および毒性の試験
抗体のin vivoの有効性および毒性を、腫瘍担持マウスモデルを用いて評価した。ヒトクローディン6を発現するヒトがん細胞株OVCAR-3、NCI-H1435、またはNUGC-3を、NOD/ShiJic-scidマウスの皮下に移植した。腫瘍サイズがおよそ200 mm3に達した時点で、腫瘍担持マウスを無作為に処置群に割り当てて、溶媒対照またはAbの投与を行った（T細胞注入モデルと称される）。
すなわち、T細胞注入モデルを用いたOVCAR-3、NCI-H1435、またはNUGC-3に対する有効性試験において、以下の試験を行った。T細胞の拡大は、ヒトPBMC (AllCells) およびT細胞活性化／拡大キット (Miltenyi Biotec) を用いて行った。細胞1×107個のがん細胞とマトリゲル基底膜マトリックス (BD) を混合し、NOD/ShiJic-scidマウス（CLEA Japan、雌、6～7週齢）の側腹部の皮下に移植した。移植の日を0日目と規定した。腫瘍サイズおよび体重に従って無作為化および群分けした後、抗アシアロGM1抗体 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) を0.2 mg／マウスで腹腔内投与した。翌日、拡大培養によって得られたT細胞を、細胞3×107個／マウスで腹腔内に移植した。群の詳細を表24に示す。T細胞移植のおよそ4時間後に、CS3348を静脈内投与した。CS3348の投与は1回のみ行った。腫瘍塊の長さ (L) および幅 (W) ならびに体重を測定し、腫瘍体積 (TV) をTV = (L×W×W) / 2として算出した。
図40～42（図40：OVCAR-3担持マウス、図41：NCI-H1435担持マウス、および図42：NUGC-3担持マウス）に示されるように、CS3348は、体重減少を含むいかなる毒性も伴うことなく、用量依存的にこれら3種のがん細胞株に対する明らかな抗腫瘍活性を示した。
（表２４）in vivo抗腫瘍効果評価のための試験群の詳細
Figure 2022529288000024
参考実施例1. 抗体発現ベクターの調製ならびに抗体の発現および精製
アミノ酸置換またはIgG変換を、PCRまたはIn fusion Advantage PCRクローニングキット (Takara Bio Inc.) 等を用いる当業者に一般的に公知の方法で行って、発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを、当業者に一般的に公知の方法により配列決定した。調製されたプラスミドをFreeStyle 293細胞 (ThermoFisher Scientific) またはExpi293F細胞 (ThermoFisher Scientific) に一過性に導入して、抗体を発現させた。得られた培養上清から、rProtein A Sepharose（商標）Fast Flow (GE Healthcare Japan Corp.) を用いる当業者に一般的に公知の方法により、各抗体を精製した。二重特異性抗体の場合には、ホモ二量体を除去するために、ProteinLクロマトグラフィー (Protenova) が必要である (WO2018159615)。精製抗体の濃度については、分光光度計を用いて280 nmで吸光度を測定し、得られた値からPACEにより算出された吸光係数を用いて、抗体濃度を算出した (Protein Science 1995; 4: 2411-2423)。
参考実施例2. クローディン発現細胞の作製
ヒトCLDN6、ヒトCLDN9、ヒトCLDN3、ヒトCLDN4、マウスCLDN6、マウスCLDN9、マウスCLDN3、およびマウスCLDN4発現ベクターをそれぞれマウスプロB細胞株Ba/F3にトランスフェクトすることにより、ヒトCLDN6を発現するBa/F3細胞 (hCLDN6/BaF)、ヒトCLDN9を発現するBa/F3細胞 (hCLDN9/BaF)、ヒトCLDN3を発現するBa/F3細胞 (hCLDN3/BaF)、ヒトCLDN4を発現するBa/F3細胞 (hCLDN4/BaF)、マウスCLDN6を発現するBa/F3細胞 (mCLDN6/BaF)、マウスCLDN9を発現するBa/F3細胞 (mCLDN9/BaF)、マウスCLDN3を発現するBa/F3細胞（mCLDN3/BaF）、およびマウスCLDN4を発現するBa/F3細胞（mCLDN4/BaF）を樹立した。
クローディンファミリータンパク質は、抗体がアクセス可能な2つの細胞外ドメインを有する。ヒトCLDN6とヒトCLDN9の細胞外ドメイン間のアミノ酸配列類似性に関して、第1の細胞外ドメインはほぼ同一であり、第2の細胞外ドメインでは、異なるアミノ酸が2個だけ存在する（図39）。ヒトクローディン6の156位（配列番号： 125または126に示される配列の156位）のグルタミンをロイシンに置換して、156位においてヒトクローディン9と同じアミノ酸を含むヒトCLDN6変異体を作製した。このヒトCLDN6変異体をhCLDN6(Q156L) (配列番号： 134) と命名した。hCLDN6(Q156L) を安定して発現するBa/F3トランスフェクタントを、上記と同様の方法を用いて作製した。樹立されたBa/F3トランスフェクタントをhCLDN6(Q156L)/BaFと命名した。
ヒトおよびマウスのCLDN（CLDN6、CLDN9、CLDN3、およびCLDN4を含む）の発現ベクターを、293fectin (Invitrogen) を用いてFreeStyle（商標）293-F細胞 (Invitrogen) に導入することにより、ヒトおよびマウスのCLDN3、4、6、および9を一過性に発現するFreeStyle（商標）293-Fトランスフェクタント細胞を作製した。作製されたFreeStyle（商標）293-Fトランスフェクタント細胞を、それぞれhCLDN3/FS293、hCLDN4/FS293、hCLDN6/FS293、hCLDN9/FS293、mCLDN3/FS293、mCLDN4/FS293、mCLDN6/FS293、およびmCLDN9/FS293と命名した。
参考実施例3. Jurkatレポート遺伝子アッセイを用いるT細胞活性化活性アッセイ
標的細胞の存在下における抗CLDN6/CD3二重特異性抗体のT細胞活性化は、GloResponse（商標）NFAT-luc2 Jurkat細胞 (Promega) を用いるT細胞活性化バイオアッセイにより調べた。各アッセイにおいて、参考実施例2において作製されたクローディン発現細胞およびがん細胞株より選択された1種類の細胞を、標的細胞として使用した。
最初に、2×104個の標的細胞を、96ウェル平底プレート (Corning) に25μL／ウェルで播種した。次に、1×105個のJurkat / NFAT-REレポーター細胞株をエフェクター細胞として各ウェルに添加し、各ウェル中のエフェクター細胞と標的細胞の比率が5:1になるようにした。次いで、様々な濃度（抗体濃度はアッセイごとに決定した）の25μLの抗体溶液を、それぞれウェルに添加した。37℃で一晩培養した後、75μLのBio-Glo試薬 (Promega) を各ウェルに添加し、プレートを室温で10分間インキュベートした。各ウェル内のJurkat細胞の活性化によって生じた発光 (RLU) を、EnVision (PerkinElmer Japan) またはGloMax（登録商標）Explorerマイクロプレートリーダーにより測定した。抗体ありのウェルと抗体なしのウェルを比較することにより、各ウェルの発光率を算出した。
前述の発明は、理解を明確にするために、説明および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、これらの説明および実施例は、本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書に引用されたすべての特許および科学文献の開示は、その全体が参照により明確に組み入れられる。
本開示の抗原結合分子は、がんを治療および／または予防すること、生体試料中のCLDN6の存在を検出すること、ならびに様々ながんの診断において有用である。抗原結合分子の態様の1つは、T細胞をCLDN6発現細胞に近接させ、CLDN6発現がん細胞に対するT細胞の細胞傷害性を用いることによってがんの治療を可能にする、CLDN6およびT細胞受容体複合体に対する結合活性を示す抗原結合分子である。
さらに、本開示はまた以下を提供する：
[34] (a) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む重鎖可変領域：
(a1) それぞれ配列番号： 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列；ならびに
(a2) 配列番号： 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
ならびに
(b) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む軽鎖可変領域：
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；ならびに
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む、抗原結合分子。
[35] 重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、マウス、ウサギ、ヒト化、またはヒトフレームワークを含む、[34] に記載の抗原結合分子。
[36] 配列番号： 85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、および57より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号： 87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82 および58より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗原結合分子。
[37] 重鎖可変領域と軽鎖可変領域が抗原結合部位を形成する、[34]～[36] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[38] 抗原結合部位がCLDN6に対する結合活性を有する、[37] に記載の抗原結合分子。
[39] 抗原結合部位が、配列番号： 125または126に規定されるヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[37] または [38] に記載の抗原結合分子。
[40] 抗原結合部位がヒトCLDN9に実質的に結合しない、[37]～[39] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[41] 抗原結合部位がヒトCLDN4に実質的に結合しない、[37]～[40] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[42] 抗原結合部位がヒトCLDN3に実質的に結合しない、[37]～[41] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[43] 抗原結合部位が、配列番号： 134に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない、[37]～[42] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[44] 抗体Fc領域をさらに含む、[37]～[43] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[45] Fc領域が、配列番号： 143～146（IgG1～IgG4）のFc領域構成アミノ酸のうちのいずれかに少なくとも1つのアミノ酸変異を有するFc領域である、[44] に記載の抗原結合分子。
[46] Fc領域が、糖鎖が付加したFc領域であり、Fc領域に付加したフコース欠損糖鎖の割合が天然IgG Fc領域のものよりも高いか、またはFc領域に付加されたバイセクト(bisecting)N-アセチルグルコサミンの割合が天然IgG Fc領域のものよりも高い、[44] または [45] に記載の抗原結合分子。
[47] 細胞傷害活性を有する、[34]～[46] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[48] 細胞傷害活性がADCCまたはCDCである、[47] に記載の抗原結合分子。
[49] 内部移行活性を有する、[34]～[46] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[50] 細胞傷害剤にコンジュゲートされている、[34]～[49] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[51] [34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と、細胞傷害剤とを含む、イムノコンジュゲート。
[52] [34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[53] がんの治療および／または予防のために使用される医薬組成物である、[52] に記載の組成物。
[54] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防のために使用される医薬組成物である、[52] または [53] に記載の組成物。
[55] 医薬の製造における、[34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの使用。
[56] がんの治療および／または予防のための医薬の製造における、[34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの使用。
[57] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防のための医薬の製造における、[34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの使用。
[58] [34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を治療する方法。
[59] [34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与する段階を含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんを有する個体を治療する方法。
[60] 少なくとも[34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートと、使用説明書とを含む、がんの治療および／または予防における使用のためのキット。
[61] 少なくとも[34]～[50] のいずれか1つに記載の抗原結合分子または [51] に記載のイムノコンジュゲートと、使用説明書とを含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防における使用のためのキット。
[62] 生体試料を、[34]～[41] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と接触させる段階を含む、生体試料中のCLDN6の存在を検出する方法。
[63] 抗原結合分子のCLDN6への結合を許容する条件下で、生体試料を抗原結合分子と接触させ、抗原結合分子とCLDN6との間で複合体が形成されるかどうかを検出する、[62] に記載の方法。
[64] 対象由来の生体試料を、[34]～[41] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と接触させる段階を含む、対象ががんを有するか否かを診断する方法。
[65] 抗原結合分子のCLDN6への結合を許容する条件下で、生体試料を抗原結合分子と接触させ、抗原結合分子とCLDN6との間で複合体が形成されるかどうかを検出する、[64] に記載の方法。
[66] がんが卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんである、[64] または [65] に記載の方法。
[67] [34]～[41] のいずれか1つに記載の抗原結合分子をコードする、単離された核酸。
[68] [67] に記載の核酸を含む宿主細胞。
[69] 抗原結合分子が産生されるように、[68] に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗原結合分子を産生する方法。
[70] 宿主細胞の培養から抗原結合分子を回収する段階をさらに含む、[69] に記載の方法。
さらに、本開示はまた以下を提供する：
[71] CLDN6に対する結合活性を有する第1の抗原結合部位、および
T細胞受容体複合体に対する結合活性を有する第2の抗原結合部位
を含む、抗原結合分子であって、
第1の抗原結合部位が、
(a) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む重鎖可変領域：
(a1) それぞれ配列番号： 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列；ならびに
(a2) 配列番号： 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
ならびに
(b) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む軽鎖可変領域：
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；ならびに
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
によって形成される、抗原結合分子。
[72] 第1の抗原結合部位を形成する重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、マウス、ウサギ、ヒト化、またはヒトフレームワークをさらに含む、[71] に記載の抗原結合分子。
[73] CLDN6に対する結合活性を有する第1の抗原結合部位、および
T細胞受容体複合体に対する結合活性を有する第2の抗原結合部位
を含む、抗原結合分子であって、
第1の抗原結合部位が、配列番号： 85、1、33、84、91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、および57より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号： 87、2、43、86、88、92、41、42、46、51、52、53、54、82 および58より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗原結合分子。
[74] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[71]～[73] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[75] 第1の抗原結合部位が、配列番号： 125または126に規定されるヒトCLDN6に対する結合活性を有する、[71]～[74] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[76] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN9に実質的に結合しない、[71]～[75] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[77] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN4に実質的に結合しない、[71]～[76] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[78] 第1の抗原結合部位がヒトCLDN3に実質的に結合しない、[71]～[77] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[79] 第1の抗原結合部位が、配列番号： 134に規定されるCLDN6変異体に実質的に結合しない、[71]～[78] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[80] 第1の抗原結合部位が単鎖Fv (scFv)、Fv、またはFab中に含まれる、[71]～[73] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[81] 第2の抗原結合部位がCD3に対する結合活性を有する、[71]～[80] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[82] 第2の抗原結合部位がCD3ε鎖に対する結合活性を有する、[71]～[80] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[83] 第2の抗原結合部位がT細胞受容体に結合する活性を有する、[71]～[80] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[84] 第2の抗原結合部位が、それぞれ配列番号： 122、123、および124のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびにそれぞれ配列番号： 114、115および116のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域によって形成される、[71]～[82] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[85] 重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、マウス、ウサギ、ヒト化、またはヒトフレームワークを含む、[84] に記載の抗原結合分子。
[86] 第2の抗原結合部位が、配列番号： 60および70より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号： 61および71より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域によって形成される、[71]～[82] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[87] 第2の抗原結合部位が単鎖Fv (scFv)、Fv、またはFab中に含まれる、[71]～[86] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[88] 抗体Fc領域をさらに含む、[71]～[87] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[89] Fc領域が、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である、[88] に記載の抗原結合分子。
[90] Fc領域が、 配列番号： 143～146（IgG1～IgG4）のFc領域構成アミノ酸のうちのいずれかに少なくとも1つのアミノ酸変異を有するFc領域である、[88] または [89] に記載の抗原結合分子。
[91] Fc領域が、EUナンバリングによって特定される以下のアミノ酸位置：
220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、および332位
より選択される少なくとも1つのアミノ酸の変異を有するFc領域である、[88]～[90] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[92] Fc領域が、EUナンバリングによって特定される以下のアミノ酸：
アミノ酸234位のArg、アミノ酸235位のAlaまたはArg、アミノ酸239位のLys、およびアミノ酸297位のAla
より選択される少なくとも1つのアミノ酸を含むFc領域である、[88]～[91] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[93] 第1の抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメインが、第1のCH1ドメインを介してFc領域に連結され、第1の抗原結合部位を形成する軽鎖可変ドメインが、第1のCLドメインに連結されており；かつ
第2の抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメインが、第2のCH1ドメインを介してFc領域に連結され、第2の抗原結合部位を形成する軽鎖可変ドメインが、第2のCLドメインに連結されている、
[88]～[92] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[94] 第1の抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域が、第1の抗原結合ドメインを形成する軽鎖可変領域と会合する、および／または第2の抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域が、第2の抗原結合ドメインを形成する軽鎖可変領域と会合するように、CH1ドメインおよびCLドメインの電荷が制御されている、[93] に記載の抗原結合分子。
[95] 細胞傷害活性を有する、[71]～[94] のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
[96] 細胞傷害活性がT細胞依存性細胞傷害活性である、[95] に記載の抗原結合分子。
[97] [71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[98] [97] に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
[99] 抗原結合分子が産生されるように、[98] に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗体を産生する方法。
[100] 宿主細胞の培養から抗原結合分子を回収する段階をさらに含む、[99] に記載の方法。
[101] [71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[102] T細胞依存性細胞傷害を誘導する、[101] に記載の医薬組成物。
[103] がんの治療および／または予防のために使用される医薬組成物である、[101] または [102] に記載の組成物。
[104] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防のために使用される医薬組成物である、[101]～[103] のいずれか1つに記載の組成物。
[105] 医薬の製造における、[71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の使用。
[106] がんの治療および／または予防のための医薬の製造における、[71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の使用。
[107] 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防のための医薬の製造における、[71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の使用。
[108] [71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を治療する方法。
[109] [71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子の有効量を個体に投与する段階を含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんを有する個体を治療する方法。
[110] 少なくとも[71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と、使用説明書とを含む、がんの治療および／または予防における使用のためのキット。
[111] 少なくとも[71]～[96] のいずれか1つに記載の抗原結合分子と、使用説明書とを含む、卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防における使用のためのキット。
1つの局面において、本開示は、
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；または
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む軽鎖可変領域を含む抗原結合分子を提供する。
1つの局面において、本開示は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗原結合分子であって、
重鎖可変領域が、
(a1) それぞれ配列番号： 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列；ならびに
(a2) 配列番号： 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含み；
かつ軽鎖可変領域が、
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；ならびに
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む、抗原結合分子を提供する。
1つの局面において、本開示は、
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；または
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む軽鎖可変領域を含むキメラ抗原結合受容体を提供する。
1つの局面において、本開示は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むキメラ抗原結合受容体であって、
重鎖可変領域が、
(a1) それぞれ配列番号： 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列；ならびに
(a2) 配列番号： 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含み；
かつ軽鎖可変領域が、
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；ならびに
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む、キメラ抗原結合受容体を提供する。
ある特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、CLDN6に対する結合活性を有する第1の抗原結合部位、およびT細胞受容体複合体に対する結合活性を有する第2の抗原結合部位を含み、ここで、第1の抗原結合部位は、
(a) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む重鎖可変領域：
(a1) それぞれ配列番号： 113、117、および118に示されるHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列；ならびに
(a2) 配列番号： 91、34、35、36、37、38、39、40、44、45、47、48、49、50、55、56、64、65、83、84、57、および85に示される重鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3と同じHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
ならびに
(b) 以下より選択されるHVRの組み合わせのうちのいずれか1つを含む軽鎖可変領域：
(b1) それぞれ配列番号： 119、120、および121に示されるHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列；ならびに
(b2) 配列番号： 92、41、42、43、46、51、52、53、54、82、86、88、および58に示される軽鎖可変領域のうちのいずれか1つのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3と同じHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む。
（表２３）
Figure 2022529288000070

Claims (15)

  1. それぞれ配列番号： 113、117、および118のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む第1の重鎖可変領域；
    それぞれ配列番号： 119、120、および121のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む第1の軽鎖可変領域；
    それぞれ配列番号： 122、123、および124のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3アミノ酸配列を含む第2の重鎖可変領域；ならびに
    それぞれ配列番号： 114、115、および116のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3アミノ酸配列を含む第2の軽鎖可変領域
    を含む、単離された抗体。
  2. 配列番号： 85、1、33、および84より選択されるアミノ酸配列を含む第1の重鎖可変領域；ならびに配列番号： 87、2、43、86、および88より選択されるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖可変領域；
    配列番号： 60および70より選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖可変領域；ならびに配列番号： 61および71より選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖可変領域
    を含む、単離された抗体。
  3. 第1の重鎖可変領域が配列番号： 95に示される第1のCH1ドメインに連結され、第1の軽鎖可変領域が配列番号： 63に示される第1のCLドメインに連結され、第2の重鎖可変領域が配列番号： 97に示される第2のCH1ドメインに連結され、かつ第2の軽鎖可変領域が配列番号： 62に示される第2のCLドメインに連結されている、請求項1または2に記載の抗体。
  4. (1) 配列番号： 72に示される第1のFc領域、および配列番号： 73に示される第2のFc領域；
    (2) 配列番号： 74に示される第1のFc領域、および配列番号： 75に示される第2のFc領域；
    (3) 配列番号： 76に示される第1のFc領域、および配列番号： 77に示される第2のFc領域；ならびに
    (4) 配列番号： 78に示される第1のFc領域、および配列番号： 79に示される第2のFc領域
    より選択されるFc領域の組み合わせのうちのいずれか1つをさらに含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 第1のFc領域が第1の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖内にあり、かつ第2のFc領域が第2の重鎖可変領域と同じポリペプチド鎖内にある、請求項4に記載の抗体。
  6. 配列番号： 104、105、106、および107より選択されるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、ならびに配列番号： 112に示されるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖；
    配列番号： 108、109、110、および111より選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、ならびに配列番号： 98に示されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
    を含む、単離された抗体。
  7. 請求項1～6のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
  8. 請求項7に記載の核酸を含む宿主細胞。
  9. 抗体が産生されるように、請求項8に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗体を産生する方法。
  10. 請求項1～6のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  11. T細胞依存性細胞傷害を誘導する、請求項10に記載の医薬組成物。
  12. がんの治療および／または予防のために使用される医薬組成物である、請求項10または11に記載の組成物。
  13. 卵巣がん、非小細胞肺がん、胃がん、または肝がんの治療および／または予防のために使用される医薬組成物である、請求項10～12のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 医薬の製造における、請求項1～6のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  15. 請求項1～6のいずれか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を治療する方法。
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