ES2246069T3 - Procedimiento de preparacion de anticuerpos multiespecificos que tienen componentes comunes y multimericos. - Google Patents
Procedimiento de preparacion de anticuerpos multiespecificos que tienen componentes comunes y multimericos.Info
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento para preparar polipéptidos heteromultiméricos tales como anticuerpos biespecíficos, inmunoadhesinas biespecíficas y quimeras anticuerpo-inmunoadhesinas. La invención también se refiere a los heteromultímeros preparados usando el procedimiento. Generalmente, el procedimiento proporciona un anticuerpo multiespecífico que tiene una cadena ligera común asociada con cada polipéptido heteromérico que tiene un dominio de unión a anticuerpos. Además el procedimiento implica también la introducción en el anticuerpo multiespecífico de una interacción específica y complementaria en la interfase de un primer polipéptido y la interfase de un segundo polipéptido, para promover la formación de heteromultímeros e impedir la formación de homomultímeros; y/o un resto que contiene tiol libre en la interfase de un primer polipéptido y un residuo que contiene tiol libre correspondiente en la interfase de un segundo polipéptido, de tal forma que se forme un enlace disulfuro que no se produce de forma natural entre el primer y el segundo polipéptidos. El procedimiento permite aumentar la formación del heteromultímero deseado con respecto a los heteromultímeros y homomultímetros indeseados.
Description
Procedimiento de preparación de anticuerpos
multiespecíficos que tienen componentes comunes y multiméricos.
Esta invención se refiere a un procedimiento para
construir anticuerpos multiespecíficos que tienen componentes de
cadena pesada heteromultiméricos y componentes de cadena ligera
comunes, tales como los anticuerpos biespecíficos, las
inmunoadhesinas biespecíficas, así como las quimeras
anticuerpo-inmunoadhesina y los polipéptidos
heteromultiméricos construidos usando el procedimiento.
Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) que tienen
especificidades por al menos dos antígenos diferentes tienen un
potencial significativo en un amplio rango de aplicaciones clínicas
como agentes de apuntamiento para la inmunodiagnosis y terapia in
vitro e in vivo, y para los inmunoensayos
diagnósticos.
En las áreas de diagnóstico, los anticuerpos
biespecíficos han sido muy útiles para probar las propiedades
funcionales de las moléculas de la superficie celular, y para
definir la capacidad de los diferentes receptores Fc para mediar la
citotoxicidad (Fanger et al., Crit. Rev. Immunol.,
12:101-124 (1992)). Nolan et al., Biochem.
Biophys. Acta., 1040:1-11 (1990) describen otras
aplicaciones diagnósticas para los BsAbs. En concreto, pueden
construirse BsAbs para inmovilizar enzimas para su uso en
inmunoensayos de enzimas. Para conseguir esto, puede diseñarse un
brazo del BsAb para unirse a un epítopo específico del enzima de tal
forma que la unión no cause la inhibición del enzima, el otro brazo
del BsAb se une a la matriz de inmovilización asegurando una elevada
densidad de enzima en el sitio deseado. Los ejemplos de tales BsAbs
diagnósticos incluyen el BsAb
anti-IgG/anti-ferritina descrito
por Hammerling et al., J. Exp. Med.,
128:1461-1473 (1968), el cual se usó para localizar
antígenos de superficie. También se han desarrollado BsAbs que
tienen especificidades de unión por la peroxidasa de rábano
silvestre (HRP) así como por una hormona. Otra aplicación
inmunoquímica potencial para los BsAbs implica su uso en
inmunoensayos de dos sitios. Por ejemplo, se producen dos BsAbs que
se unen a dos epítopos distintos sobre la proteína analito - un BsAb
une al complejo a una matriz insoluble, el otro une un enzima
indicador (ver Nolan et al., supra).
Los anticuerpos biespecíficos puede usarse
también para la inmunodiagnosis in vitro o in vivo de
varias enfermedades tales como el cáncer (Songsivilai et al.,
Clin. Exp. Immunol., 79:315 (1990)). Para facilitar este uso
diagnóstico de los BsAb, un brazo del BsAb puede unir un antígeno
asociado con el tumor y el otro brazo puede unir un marcador
detectable tal como un quelante que une fuertemente un radionúcleo.
Usando esta estrategia, Le Doussal et al. construyeron un
BsAb útil para la radioinmunodetección de carcinomas colorectales y
de tiroides, los cuales tenían un brazo que unía el antígeno
carcinoembrionario (CEA) y el otro brazo unía el ácido
dietilentriaminopentaacético (DPTA). Ver Le Doussal et al.,
Int. J. Cancer Suppl., 7:58-62 (1992) y Le
Doussal et al., J. Nucl. Med.,
34:1662-1671 (1993). De forma similar, Stickney
et al. describen una estrategia para detectar, usando
radioinmunodetección, cánceres colorectales que expresan el CEA.
Estos investigadores describen un BsAb que une el CEA así como el
hidroxibutiltiourea-bencil-EDTA
(EOTUBE). Ver Stickney et al., Cancer Res.
51:6650-6655 (1991).
Los anticuerpos biespecíficos pueden usarse
también para la terapia humana en la citotoxicidad redirigida
proporcionando un brazo que une una diana (por ejemplo, un patógeno
o célula tumoral) y otro brazo que une una molécula activadora
citotóxica, tal como el receptor de la célula T o el receptor
Fc\gamma. Por tanto, los anticuerpos biespecíficos pueden usarse
para dirigir los mecanismos de defensa inmune celulares de un
paciente contra la célula tumoral o agente infeccioso. Usando esta
estrategia, se ha demostrado que los anticuerpos biespecíficos que
se unen al Fc\gammaRIII (es decir, el CD16) pueden mediar la
muerte celular por parte de células asesinas naturales (NK)/células
de linfocito granular grandes (LGL) in vitro, y que son
efectivos para impedir el crecimiento tumoral in vivo. Segal
et al., Chem. Immunol., 47:179 (1989) y Segal et
al., Biologic Therapy of Cancer 2(4), eds. DeVita
et al., J. B. Lippincott, Philadelphia (1992) p. 1. De forma
similar, se han desarrollado anticuerpos biespecíficos que tienen un
brazo que une el Fc\gammaRIII y otro que se une al receptor HER2
para la terapia de tumores de ovarios y mama que sobreexpresan el
antígeno HER2. (Hseih-Ma et al., Cancer
Research 52:6832-6839 (1992) y Weiner et
al., Cancer Research 53:94-100 (1993)).
Los anticuerpos biespecíficos pueden mediar también la muerte por
parte de células T. Normalmente, los anticuerpos biespecíficos unen
el complejo CD3 sobre células T con un antígeno asociado a tumor. Se
ha usado un BsAb F(ab')_{2} completamente humanizado
consistente en un anti-CD3 unido a un to
anti-p185^{HER2} para apuntar células T para matar
células tumorales que sobreexpresan el receptor HER2. Shalaby et
al., J. Exp. Med., 175(1):217 (1992). Los
anticuerpos biespecíficos se han ensayado en varios ensayos clínicos
en fase temprana con resultados alentadores. En un ensayo, 12
pacientes con cáncer de pulmón, ovario o mama, se trataron con
infusiones de linfocitos T activados dirigidos con un anticuerpo
biespecífico anti-CD3/anti-tumor
(MOC31). deLeij et al., Bispecific Antibodies and Targeted
Cellular Cytotoxicity, Eds. Romet-Lemonne,
Fanger y Segal, Lienhart (1991) p. 249. Las células dirigidas
inducen una lisis local considerable de células tumorales, una
reacción inflamatoria suave, pero no efectos secundarios tóxicos o
respuestas de anticuerpos anti-ratón. En un ensayo
muy preliminar de un anticuerpo biespecífico
anti-CD3/anti-CD19 en un paciente
con cáncer de células B, también se consiguió una considerable
reducción en los recuentos de células tumorales periféricas. Clark
et al., Bispecific Antibodies and Targeted Cellular
Cytotoxicity, Eds. Romet-Lemonne, Fanger y
Segal, Lienhart (1991) p. 243. Ver también, Kroesen et al.,
Cancer Immunol. Immunother. 37:400-407
(1993), Kroesen et al., Br. J. Cancer,
70:652-661 (1994) y Weiner et al., J.
Immunol., 152:2385 (1994) concernientes a las aplicaciones
terapéuticas de los BsAbs.
Los anticuerpos biespecíficos podrían usarse
también como agentes fibrinolíticos o adyuvantes de vacunas. Más
aún, estos anticuerpos podrían usarse en el tratamiento de
enfermedades infecciosas (por ejemplo, para el apuntamiento de
células efectoras contra células infectadas viralmente, tales como
por el VIH o el virus de la gripe, o protozoos tales Toxoplasma
gondii, podrían usarse para suministrar inmunotoxinas a células
tumorales, o para dirigir complejos inmunes contra receptores de la
superficie celular (ver Fanger et al., supra).
El uso de los BsAbs ha sido impedido
efectivamente por la dificultad para obtener BsAbs en cantidad y
pureza suficiente. Tradicionalmente, los anticuerpos biespecíficos
se preparaban usando la tecnología del hibridoma híbrido (Millstein
y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Debido
al surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de
inmunoglobulina, estos hibridomas (quadromas) producen una mezcla
potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales
sólo una tiene la estructura biespecífica correcta (ver la Figura
1A). La purificación de la molécula correcta, que usualmente se
realiza mediante pasos de cromatografía de afinidad, es bastante
pesada, y los rendimientos de producto son bajos. Ver, por ejemplo,
(Smith, W., et al., (1992) Hybridoma,
4:87-98; y Massimo, Y. S., et al., (1997)
J. Immunol. Methods, 201:57-66). En
consecuencia, se han desarrollado técnicas para la producción de
BsAb con rendimientos más elevados. Para conseguir el acoplamiento
químico de fragmentos de anticuerpos, Brennan et al.,
Science. 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde
los anticuerpos intactos son cortados proteolíticamente para generar
fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en
presencia del agente arsenito sódico, complejador de ditiol, para
estabilizar los ditioles vecinos e impedir la formación de disulfuro
intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten a
continuación en derivados de teionitrobenzoato. Uno de los derivados
de Fab'-TNF se reconvierte al
Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y
se mezcla con una cantidad equimolar del otro
Fab'-TNB derivado
para forma el BsAb. Los BsAbs producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
para forma el BsAb. Los BsAbs producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
El progreso reciente ha facilitado la
recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir
de E. coli, los cuales se han acoplado químicamente para
formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp.
Med., 175:217-225 (1992) describen la producción
de una molécula BsAb F(ab')_{2} completamente humanizada
que tiene un brazo que une el p185^{HER2} y otro brazo que une el
CD3. Cada fragmento Fab' se secretó por separado a partir de E.
coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in
vitro para formar el BsAb. El BsAb formado de este modo fue
capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor HER2 y a
células T humanas normales, así como de disparar la actividad lítica
de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama
humanos. Ver también Rodrigues et al., Int. J. Cancers
(Suppl.), 7:45-50 (1992).
Se han descrito también varias técnicas para
construir y aislar fragmentos de BsAb directamente a partir de
cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido
heterodímeros biespecíficos de F(ab')_{2} usando
cremalleras de leucina (Kostelny et al., J. Immunol.,
148(5):1547-1553 (1992)). Los péptidos de la
cremallera de leucina procedentes de las proteínas Fos y Jun se
unieron a las porciones Fab' de anticuerpos anti-CD3
y anti-receptor de interleukina-2
(IL-2R) mediante la fusión de genes. Los homodímeros
de anticuerpo de redujeron en la región bisagra para formar
monómeros y a continuación se reoxidaron para formar los
heterodímeros de anticuerpo. Se halló que los BsAbs eran altamente
efectivos in vitro para reclutar células T citotóxicas para
lisar las células Hut-102. La llegada de la
tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger et
al., PNAS (USA), 90:6444-6448 (1993) ha
proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos
BsAb. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada
(V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L})
por un eslabón que es demasiado corto para permitir el
emparejamiento entre dos dominios sobre la misma cadena. En
consecuencia, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento están
forzados a emparejarse con los dominios V_{H} y V_{L}
complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios
de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para
construir fragmentos BsAb mediante el uso de dímeros de Fv de cadena
única (sFv). Consultar Gruber et al., J. Immunol. 152:
5368 (1994). Estos investigadores diseñaron un anticuerpo que
comprendía dominios V_{H} y V_{L} de un anticuerpo, dirigido
contra el receptor de la célula T, unidos mediante un eslabón de 25
residuos aminoácidos a los dominios V_{H} y V_{L} de un
anticuerpo anti-fluoresceína. La molécula replegada
se unía a fluoresceína y al receptor de la célula T, y redirigía la
lisis de células tumorales humanas que tenían la fluoresceína unida
covalentemente sobre su superficie.
Es evidente que se han descrito varias técnicas
para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos, los cuales
pueden recuperarse directamente a partir del cultivo de células
recombinantes. Sin embargo, los BsAbs de longitud completa podrían
ser preferibles a los fragmentos de BsAb para muchas aplicaciones
clínicas debido a su mayor vida media en suero y posibles funciones
efectoras.
Las inmunoadhesinas (Ia) son moléculas parecidas
a los anticuerpos que combinan el dominio unidor de un proteína (una
"adhesina"), tal como un receptor de superficie celular o un
ligando, con las funciones efectoras de un dominio constante de
inmunoglobulina. Las inmunoadhesinas pueden poseer muchas de las
valiosas propiedades químicas y biológicas de los anticuerpos
humanos. Puesto que las inmunoadhesinas pueden construirse a partir
de una secuencia de proteína humana con un especificidad deseada
unida a una secuencia apropiada de dominios constante y bisagra de
inmunoglobulina (Fc), la especificidad de unión de interés puede
conseguirse usando completamente componentes humanos. Tales
inmunoadhesinas son mínimamente inmunogénicas para el paciente, y
son seguras para un uso crónico o repetido.
Las inmunoadhesinas mencionadas en la literatura
incluyen las fusiones del receptor de la célula T (Gascoigne et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
84:2936-2940 (1987)); del CD4 (Capon et al.,
Nature, 337:525-531 (1989); Traunecker et
al., Nature, 339:68-70 (1989); Zettmeissl
et al., DNA Cell Biol. USA, 9:347-353
(1990); y Byrn et al., Nature,
344:667-670 (1990)); del receptor de la
L-selectin o "homing" (Watson et al.,
J. Cell. Biol., 110:2221-2229 (1990); y
Watson et al., Nature, 349:164-167
(1991)); del CD44 (Aruffo et al., Cell,
61:1303-1313 (1990)); del CD28 y B7 (Linsley et
al., J. Exp. Med., 173:721-730 (1991));
del CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp.
Med., 174:561-569 (1991)); del CD22 (Stamenkovic
et al., Cell, 66:1133-1144 (1991));
del receptor del TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et
al., Eur. J. Immunol., 27:2883-2886
(1991); y Peppel et al., J. Exp. Med.,
174:1483-1489 (1991)); de los receptores del NP
(Bennett et al., J. Biol. Chem.,
266:23060-23067 (1991)); del receptor del
interferón-\gamma (Kurschner et al., J.
Biol. Chem., 267:9354-9360 (1992)); del
4-1BB (Chalupny et al., PNAS (USA),
89:10360-10364 (1992)) y del receptor \alpha de la
IgE (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol., Vol. 115, Abstract No.
1448 (1991)).
Los ejemplos de inmunoadhesinas que se han
descrito para uso terapéutico incluyen la inmunoadhesina
CD4-IgG para bloquear la unión del VIH al CD4 de la
superficie celular. Los datos obtenidos de los ensayos clínicos de
la Fase I en los que se administró CD4-IgG a mujeres
embarazadas justo antes del parto sugieren que esta inmunoadhesina
podría ser útil en la prevención de la transferencia
materno-fetal del VIH. Ashkenazi et al.,
Intern. Rev. Immunol., 10:219-227 (1993).
También se ha desarrollado una inmunoadhesina que une el factor de
la necrosis del tumor (TNF). El TNF es una citoquina
pro-inflamatoria que se ha mostrado es una mediadora
importante del choque séptico. En base a un modelo tumoral de choque
séptico, una inmunoadhesina del receptor del TNF se ha mostrado
prometedora como candidata para su uso clínico en el tratamiento del
choque séptico (Ashkenazi et al., supra). La
inmunoadhesinas tienen también usos no terapéuticos. Por ejemplo, se
usó una inmunoadhesina del receptor de la
L-selectina como reactivo para la tinción
histoquímica de vénulas endoteliales elevadas (HEV) de nódulo
linfático periférico. Este reactivo puede usarse también para aislar
y caracterizar el ligando L-selectina (Ashkenazi
et al., supra). Si los dos brazos de la estructura de
la inmunoadhesina tienen especificidades diferentes, la
inmunoadhesina se denomina "inmunoadhesina biespecífica" por
analogía con los anticuerpos biespecíficos. Dietsch et al.,
J. Immunol. Methods 162:123 (1993) describen una
inmunoadhesina biespecífica así, que combina los dominios
extracelulares de las moléculas de adhesión,
E-selectina y P-selectina. Los
estudios de unión indicaron que la proteína de fusión de
inmunoglobulinas biespecífica formada de ese modo tenía una
capacidad potenciada para unirse a una línea celular mieloide en
comparación con las inmunoadhesinas monoespecíficas de las que se
derivaba.
Las quimeras de
anticuerpo-inmunoadhesina (Ab/Ia) también se han
descrito en la literatura. Estas moléculas combinan la región
unidora de una inmunoadhesina con el dominio unidor de un
anticuerpo.
Berg et al., PNAS (USA),
88:4723-4727 (1991) construyeron una quimera
biespecífica de anticuerpo-inmunoadhesina que
derivaba de la CD4-IgG de ratón. Estos
investigadores construyeron una molécula tetramérica que tenía dos
brazos. Un brazo estaba compuesto por CD4 fusionado con un dominio
constante de cadena pesada de anticuerpo junto con una fusión de CD4
con un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo. El otro
brazo estaba compuesto por una cadena pesada complete de un
anticuerpo anti-CD3 junto con una cadena ligera del
mismo anticuerpo. Gracias al brazo de CD4-IgG, esta
molécula biespecífica se une al CD3 la superficie de células T
citotóxicas. La yuxtaposición de células citotóxicas y de células
infectadas por el VIH resulta en la muerte específica de estas
últimas células.
Aunque Berg et al., describen una molécula
biespecífica que tiene una estructura tetramérica, es posible
producir una molécula híbrida trimérica que contiene sólo una fusión
CD4-IgG. Ver Chamow et al., J.
Immunol., 153:4268 (1994). El primer brazo de esta construcción
está formado por una cadena ligera \kappa anti-CD3
humanizada y una cadena pesada \gamma anti-CD3
humanizada. El segundo brazo es una inmunoadhesina
CD4-IgG que combina parte del dominio extracelular
del CD4, responsable de la unión del gp120, con el dominio Fc de
IgG. La quimera de Ab/Ia resultante mediaba la muerte de células
infectadas con el VIH usando, bien preparaciones puras de células T
citotóxicas, o fracciones de linfocitos de sangre periférica (PBL)
que incluían adicionalmente células efectoras de linfocitos
granulares grandes portadores del receptor de Fc.
En la fabricación de los heteromultímeros de
anticuerpo multiespecíficos, es deseable incrementar los
rendimientos de los heterodímeros deseados respecto el(los)
homomultímero(s). El procedimiento actual de elección para
obtener BsAb que contienen Fc sigue siendo el del hibridoma híbrido,
en el que dos anticuerpos se coexpresan (Milstein y Cuello,
Nature, 305:537-540 (1983)).
En los hibridomas híbridos, las cadenas
pesadas(H) típicamente forman homodímeros así como los
heterodímeros deseados. Adicionalmente, las cadenas ligeras (L)
frecuentemente se emparejan incorrectamente con cadenas pesadas no
relacionadas. Por tanto, la coexpresión de dos anticuerpos podría
expresar hasta diez emparejamientos de cadena pesada y ligera
(Suresh, M. R., et al., Methods Enzymol.,
121:210-228 (1986)). Estos emparejamientos de cadena
no deseados comprometen el rendimientos del BsAb e imponen
inevitablemente desafíos de purificación significativos y, a veces,
insuperables (Smith, et al., (1992), supra; y Massimo,
et al., (1997), supra).
Las cadenas pesadas de anticuerpo se han
manipulado previamente, para dirigir la heterodimerización,
introduciendo mutaciones estéricamente complementarias en dominios
de multimerización de la interfaz del dominio C_{H}3 (Ridgway
et al., Protein Eng., 9:617-621
(1996)), y por optimización mediante la exhibición en fagos tal como
se describe en ésta. Las cadenas que contienen los dominios C_{H}3
modificados rinden hasta aproximadamente un 90% de heterodímero,
según se juzga por la formación de un híbrido
anticuerpo/inmunoadhesina (Ab/Ia). Las cadenas pesadas
heterodimerizadas podrían aún emparejarse incorrectamente con la
cadena ligera no relacionada, dificultando la recuperación del BsAb
de interés.
Esta solicitud describe una estrategia que sirve
para potenciar la formación de un anticuerpo biespecífico
heteromultimérico deseado a partir de una mezcla de monómeros,
mediante la manipulación de una interfaz entre un primer y segundo
polipéptido para la hetero-oligomerización, y
proporcionando una cadena ligera variable común para interaccionar
con cada una de las regiones de la cadena pesada variable
heterodimérica del anticuerpo biespecífico. Hay tres posibles
hetero- y homodímeros que pueden formarse a partir de un primer y
segundo polipéptido, cada unos de los cuales está, a su vez,
asociado respectivamente con una primera y segunda cadena ligera.
Esto da lugar a un total de diez posibles emparejamientos de cadena
(Figura 1A). Un procedimiento para potenciar la formación de los
heterodímeros deseados puede potenciar enormemente el rendimiento
respecto los heteromultímeros y homomultímeros no deseados.
La interfaz preferida entre un primer y segundo
polipéptido del anticuerpo heteromultimérico comprende al menos una
parte del dominio C_{H}3 de un dominio constante de anticuerpo. El
dominio de cada uno de los primer y segundo polipéptidos que
interacciona en la interfaz se denomina dominio de multimerización.
Preferiblemente, el dominio de multimerización promueve la
interacción entre un primer polipéptido específico y un segundo
polipéptido, incrementando por tanto el rendimiento de heterodímero
deseado (Figura 1B). La interacción podría promoverse en la interfaz
mediante la formación de regiones complementarias del tipo
protuberancia-en-cavidad; mediante
la formación de puentes disulfuro que no ocurren de forma natural;
mediante cremalleras de leucina; mediante regiones hidrofóbicas; y
regiones hidrofílicas. Las "protuberancias" se construyen
remplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfaz
del primer polipéptido con cadenas laterales más grandes (por
ejemplo, tirosina y triptófano). Opcionalmente se construyen
"cavidades" compensatorias sobre la interfaz del segundo
polipéptido mediante la sustitución de cadenas laterales de
aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o
treonina). Cuando existe una protuberancia o cavidad correctamente
ubicada y dimensionada en la interfaz de cualquiera del primero o
segundo polipéptido, sólo es necesario construir respectivamente una
cavidad o protuberancia correspondiente en la interfaz adyacente.
Los puentes disulfuro que no ocurren de forma natural se construyen
remplazando sobre el primer polipéptido un aminoácido que ocurre de
forma natural con un residuo que contiene un tiol libre, tal como la
cisteína, de tal forma que el tiol libre interacciona con otro
residuo que contiene tiol en el segundo polipéptido, de tal forma
que se forma un enlace disulfuro entre el primer y segundo
polipéptidos
(Figura 1B).
(Figura 1B).
Los fragmentos Fv de cadena única procedentes de
una biblioteca de exhibición sobre fagos inmunizados (Vaughan, T.
J., et al., Nature Biotechnology
14:309-314 (1996), incorporada en ésta por
referencia en su totalidad) revelaron el uso de los genes V, en los
que predominaban las secuencias de V_{H} y V_{L} derivadas de
ciertos segmentos del gen V de la línea germinal, en el repertorio.
Se apreciaron ejemplos de promiscuidad de cadena en el repertorio,
en los que una cadena pesada o ligera determinada se halla en
combinación con diferentes cadenas relacionadas (Vaughan, T. J.,
et al., (1996), supra).
En ésta se descubre que la preparación de un
anticuerpo heterodimérico y multiespecífico está potenciada cuando
se proporciona una cadena ligera común para emparejarse con
cualquiera de los cadenas pesadas variables del anticuerpo
multiespecífico. El uso de una cadena ligera variable común reduce
el número de monómeros que deben emparejarse correctamente ara
formarse los dominios unidores de antígeno, al limitar el número de
cadenas ligeras desde dos a más cadenas ligeras (respectivamente, en
un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, antes del
descubrimiento de la presente invención) a una cadena ligera (en un
anticuerpo multiespecífico de la invención, ver Figura 1C).
En consecuencia, la invención se refiere a un
procedimiento para preparar un anticuerpo multiespecífico
heteromultimérico, comprendiendo el anticuerpo, 1) un primer
polipéptido y un segundo polipéptido (y polipéptidos adicionales de
acuerdo con la multiplicidad del anticuerpo) que se reúnen en una
interfaz, en donde los polipéptidos primero y adicionales (es decir,
un primer y segundo polipéptido) incluyen cada uno un dominio de
multimerización que forma una interfaz entre los polipéptidos
primero y segundo (o al menos uno adicional), y los dominios de
multimerización promueven la interacción estable entre el primer
polipéptido y los polipéptidos adicionales, y 2) un dominio unidor
en cada uno del primero y al menos un polipéptido adicional (es
decir, un segundo polipéptido), comprendiendo cada dominio unidor
una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, en donde la
cadena ligera variable del primer polipéptido y la cadena ligera
variable del segundo polipéptido tienen una secuencia de aminoácidos
común, la cual secuencia común tiene una identidad de secuencia con
una cadena ligera original de cada unos de los polipéptidos de al
menos el 80%, preferiblemente de al menos el 90%, más
preferiblemente de al menos el 95%, y más preferiblemente del 100%
de identidad de secuencia. El procedimiento comprende los pasos
de:
- i)
- cultivar una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica el primer polipéptido, el segundo polipéptido, y la cadena ligera común, en donde el cultivo es tal que el ácido nucleico se expresa; y
- ii)
- recuperar el anticuerpo multiespecífico del cultivo de células huésped.
En una realización relacionada de la invención,
el ácido nucleico que codifica el primer polipéptido o ácido
nucleico que codifica el segundo polipéptido, o ambos, se ha
alterado para formar respecto el ácido nucleico original para
codificar la interfaz o una porción de la misma.
En otra realización del procedimiento, la
interfaz del primer polipéptido comprende un residuo que contiene un
tiol libre, el cual está posicionado para interaccionar con un
residuo que contiene un tiol libre de la interfaz del segundo
polipéptido, de tal forma que se forma un enlace disulfuro entre el
primer y segundo polipéptidos. De acuerdo con la invención, el ácido
nucleico que codifica el primer polipéptido ha sido alterado
respecto el primer polipéptido para codificar el residuos que
contiene el tiol libre, o el ácido nucleico del segundo polipéptido
ha sido alterado respecto el ácido nucleico original para codificar
el residuo que contiene el tiol libre, o ambos.
En otra realización del procedimiento, el ácido
nucleico que codifica ambos, el primer polipéptido y al menos un
polipéptido adicional (es decir, un segundo polipéptido) se altera
para codificar respectivamente la protuberancia y la cavidad.
Preferiblemente, el primer y segundo polipéptidos comprenden cada
uno un dominio constante de anticuerpo, tal como el dominio C_{H}3
de una IgG_{1} humana.
En otro aspecto, la invención proporciona un
heteromultímero (tal como un anticuerpo biespecífico, una
inmunoadhesina biespecífica, o una quimera
anticuerpo/inmunoadhesina) que comprende un primer polipéptido y un
segundo polipéptido que se reúnen en una interfaz. La interfaz del
primer polipéptido comprende un dominio de multimerización, el cual
está posicionado para interaccionar con un dominio de
multimerización sobre el al menos un polipéptido adicional (es
decir, un segundo polipéptido) para formar una interfaz entre el
primer y segundo polipéptidos. En las realizaciones preferidas de la
invención, los dominios de multimerización se alteran para promover
la interacción entre un primer polipéptido específico y un segundo
polipéptido específico, alteraciones que incluyen, pero no se
limitan a, la generación de una protuberancia o cavidad o ambas; la
generación de enlaces disulfuro que no ocurren naturalmente; la
generación de regiones hidrofóbicas complementarias; y la generación
de regiones hidrofílicas complementarias. El anticuerpo
multiespecífico heteromultimérico podría proporcionarse en forma de
una composición que comprende además un portador farmacéuticamente
aceptable.
La invención se refiere también a una célula
huésped que comprende ácido nucleico que codifica el anticuerpo
heteromultimérico multiespecífico del parágrafo precedente, en donde
el ácido nucleico que codifica el primer polipéptido y al menos un
polipéptido adicional (es decir, un segundo polipéptido) está
presente en un único vector o en vectores distintos. La célula
huésped puede usarse en procedimientos para preparar un anticuerpo
heteromultimérico multiespecífico, el cual implica cultivar la
célula huésped de forma que el ácido nucleico se expresa, y
recuperar el anticuerpo heteromultimérico del cultivo de
células.
En aún un aspecto adicional, la invención
proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo
heteromultimérico multiespecífico que comprende:
- (a)
- seleccionar un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que comprende un residuo aminoácido, en la interfaz del primer polipéptido, que está posicionado para interaccionar con un residuo aminoácido de la interfaz de al menos un polipéptido adicional. En una realización, el ácido nucleico está alterado respecto el original para codificar los residuos aminoácidos que interaccionan. En otra realización, el primer ácido nucleico se altera para codificar un residuo aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral, generándose de ese modo una protuberancia sobre el primer polipéptido;
- (b)
- alterar un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido de forma que un residuo aminoácido en la interfaz del segundo polipéptido se remplaza con un residuo aminoácido que tiene un menor volumen de cadena lateral, generando de ese modo una cavidad en el segundo polipéptido, en donde la protuberancia está posicionada para interaccionar con la cavidad;
- (c)
- introducir en una célula huésped el primer y segundo ácidos nucleicos, y cultivar la célula huésped de forma que ocurra la expresión del primer y segundo ácidos nucleicos;
- (d)
- recuperar del cultivo celular el anticuerpo heteromultimérico formado.
Podría ser deseable también construir un
anticuerpo multiespecífico (tal como un anticuerpo biespecífico) que
incorpore un anticuerpo identificado previamente. En estas
circunstancias, es deseable identificar una cadena pesada que,
cuando se empareja con la cadena ligera original, se unirá
específicamente a un segundo antígeno de interés. Los procedimientos
de Figini et al. (Figini, M. et al., J. Mol.
Biol., 239:68-78 (1994), incorporada en ésta por
referencia en su totalidad) podrían usarse para identificar tal
cadena pesada. Primero se trataría una biblioteca de fagos con
hidrocloruro de guanidina para disociar la cadena ligera original. A
continuación, las cadenas pesadas exhibidas sobre fago se
reconstituirían con la cadena ligera de interés mediante la retirada
del desnaturalizante (tal como mediante diálisis). A continuación
podría realizarse el cribado respecto el segundo antígeno de interés
para identificar la cadena pesada deseada. La invención abarca
además un anticuerpo multiespecífico preparado mediante este
procedimiento de selección una cadena pesada para emparejarla con
una cadena ligera escogida, de ácido nucleico que codifica el
anticuerpo, y una célula huésped que comprende el ácido
nucleico.
La invención proporciona un mecanismo para
incrementar los rendimientos del heteromultímero respecto otros
productos finales no deseados, tales como los heteromultímeros no
deseados y/o los homomultímeros (ver Figuras 1A-1C).
Preferiblemente, los rendimientos del heteromultímero deseado
recuperado a partir del cultivo de células recombinantes son al
menos superiores al 80% en peso, y preferiblemente superiores al 90%
en peso, en comparación con el subproducto de heterodímero(s)
o homomultímero(s) no deseados.
Figuras 1A-1C. La Figura 1A es un
diagrama de la formación de anticuerpos biespecíficos que contienen
Fc cuando no se realiza ninguna manipulación para potenciar la
heteropolimerización respecto la homopolimerización. La Figura 1B es
un diagrama que muestra el emparejamiento que ocurre cuando se
manipulan cadenas pesadas (H) de tal forma que la
heteromultimerización está favorecida respecto la
heteromultimerización no deseada y respecto la homopolimerización.
La Figura 1C es un diagrama que ilustra el emparejamiento que ocurre
cuando se escogen anticuerpos que comparten la misma cadena ligera
(L) para evitar el problema de emparejamiento de cadenas ligeras con
cadenas pesadas no relacionadas.
Figuras. 2A-2C. La Figura 2A
ilustra un esquema de selección para un heterodímero C_{H}3 usando
el vector de exhibición en fagos, pRA2. Los fagos que exhiben
heterodímeros de C_{H}3 estables se capturan usando un anticuerpo
dirigido contra la marca gD. La Figura 2B ilustra un operón
dicistrónico en el que el C_{H}3 expresado a partir de un gen
sintético se secreta conjuntamente con una segunda copia de C_{H}3
expresado a partir del gen natural (Ellison et al.,
Nucleic Acids Res., 10:4071-4079 (1982)) como
una proteína de fusión con el de la proteína del gen III del M13. El
gen de C_{H}3 sintético está precedido por una secuencia que
codifica un péptido derivado de la glicoproteína D del virus herpes
simplex (marca gD, Lasky, L.A. y Dowbenko, D.J., DNA,
3:23-29 (1984); Berman, P.W. et al.,
Science, 227:1490-1492 (1985) y un sitio de
corte (G) para la proteasa específica de sitio Genenasa I (Carter,
P., et al., Proteins: Structure, Function and
Genetics, 6:240-248 (1989)). La Figura 2C es la
secuencia de ácido nucleico del operón dicistrónico (SEC. Nº ID.:1)
de la Figura 2B, en la cual los residuos en los genes de C_{H}3
traducidos se numeran de acuerdo con el sistema Eu de Kabat et
al., en Sequences of Proteins of Immunological Interest,
5ª edición, volumen 1, pp. 688-696, NIH, Bethesda,
MD (1991). Se muestra la mutación T366W para protuberancia, así como
los residuos apuntados para su aleatorización en el gen de C_{H}3
natural (366, 368, and 407).
Figuras 3A-3C. Las Figuras 3A y
3B son gráficas de barras de los resultados del análisis de barrido
densitométrico del SDS-PAGE de los productos
purificados con Proteína A procedentes de la cotransfección de las
cadenas pesada y ligera de anticuerpo (Ab) con inmunoadhesina (Ia).
Los datos presentados son la media de dos experimentos
independientes. El eje x indica las proporciones de ADN de entrada
en masa (Ia:H:L) y el eje y indica el porcentaje de cada tipo de
multímero del producto con respecto a la proteína total del
producto. La Figura 3C es un diagrama de los posibles multímeros del
producto.
La Figura 4 es una comparación de las secuencia
V_{L} de ocho anticuerpos diferentes con especificidades por Axl,
Rse, IgER, Ob-R, y VEGF. La posiciones de los
residuos del CDR unidores de antígeno de acuerdo con la definición
de la secuencia (Kabat et al., (1991), supra) o la
definición estructural (Chothia, C. y Lesk, A.M.J., Mol.
Biol., 196:901-917 (1987)) se muestran
respectivamente mediante subrayado y #. Los residuos que difieren de
la secuencia Axl.78 se muestran mediante subrayado doble.
La Figura 5 es una comparación de las cadenas
pesada y ligera de clones anti-Ob-R
y anti-HER3 seleccionados. Se muestran las
secuencias V_{H} y la V_{L} común del clona 26
anti-Ob-R y del clon 18
anti-HER3 usados para construir un anticuerpo
biespecífico.
Fig. 6. ELISA sándwich para la detección de la
unión simultánea a MpI-IgG y
HER3-IgG. Los anticuerpos ensayados d fueron
anti-Mp1 x anti-HER3 BsIgG que
contenían las mutaciones
Y349C:T366S:L368A:Y407V/T366'W:
S354'C junto con la correspondiente anti-MpI parental o IgG anti-HER3 con regiones Fc mutadas.
S354'C junto con la correspondiente anti-MpI parental o IgG anti-HER3 con regiones Fc mutadas.
Fig. 7 es un gráfico de barras de los resultados
de un estudio de citotoxicidad mediada por células dependiente de
anticuerpo (ADCC). La ADCC fue mediada por
huMAb4D5-5 (Carter, P. Et al. (1992) PNAS USA
89:4285-4289) que contenía o un mutante
(S354C: T366W / Y349'C : T366'S : L368'A : Y407'V) o Fc de tipo
salvaje o un anticuerpo control emparejado con un anticuerpo (E25,
Presta, L. G. et al. (1993) J. Immunol. 151:
2623-2632). Los anticuerpos (125 ng/ml) se incubaron
con células efectoras mononucleares de sangre periférica humana y
células diana SK-BR-3 en las
proporciones mostradas. Los datos presentados son la media de las
mediciones por triplicado y representativos de tres ejemplos por
separado.
La Figura 8 es una matriz que representa la
identidad de secuencia de aminoácidos entre las cadenas ligeras de
los anticuerpos generados contra el HER3 respecto las cadenas
ligeras de los anticuerpos generados contra el Ob-R.
Los anticuerpos que tienen cadenas ligeras con 100% de identidad de
secuencia se indican mediante recuadros oscurecidos. Los anticuerpos
que tienen cadenas ligeras con 98-99% de identidad
de secuencia se indican con recuadros claros. La identidad del clon
del anticuerpo se indica debajo de la matriz.
En general, las palabras o frases siguientes
tienen las definiciones indicadas cuando se usan en la descripción,
ejemplos y reivindicaciones.
Un "heteromultímero", "polipéptido
heteromultimérico", o "anticuerpo multiespecífico
heteromultimérico" es una molécula que comprende al menos un
primer polipéptido y un segundo polipéptido, en donde el segundo
polipéptido difiere en su secuencia de aminoácidos del primer
polipéptido en al menos un residuo aminoácido. Preferiblemente, el
heteromultímero tiene especificidad de unidad por al menos dos
ligandos diferentes o sitios de unión. El heteromultímero puede
comprender un "heterodímero" formado por el primer y segundo
polipéptido, o puede formar estructuras terciarias de orden superior
en donde hay presentes polipéptidos además del primer y segundo
polipéptido. Las estructuras ilustrativas para el heteromultímero
incluyen los heterodímeros (por ejemplo, la inmunoadhesina
biespecífica descrita por Dietsch et al., supra), los
heterotrímeros (por ejemplo, la quimera Ab/Ia descrita por Chamow
et al., supra), los heterotetrámeros (por ejemplo, un
anticuerpo biespecífico) y otras estructuras oligoméricas.
Tal como se usa en ésta, "dominio de
multimerización" se refiere a una región de cada uno de los
polipéptidos del heteromultímero. El "dominio de
multimerización" promueve la interacción estable de las moléculas
quiméricas dentro del complejo de heteromultímero. Preferiblemente,
el dominio de multimerización promueve la interacción entre un
primer polipéptido específico y un segundo polipéptido específico,
potenciando de ese modo la formación del heteromultímero deseado y
reduciendo sustancialmente la probabilidad de formación de
heteromultímeros no deseados o de homomultímeros. Los dominios de
multimerización podrían interactuar a través de una secuencia de
inmunoglobulina, cremallera de leucinas, una región hidrofóbica, una
región hidrofílica, o un tiol libre que forma un enlace disulfuro
intermolecular entre las moléculas quiméricas del heteromultímero
quimérico. El tiol libre podría introducirse en la interfaz de uno o
más polipéptidos interactuando mediante la sustitución de un residuo
del polipéptido, que ocurre de forma natural, con, por ejemplo, un
cisteína, en una posición que permite la formación de un enlace
disulfuro entre los polipéptidos. El dominio de multimerización
podría comprender una región constante de inmunoglobulina. Un
posible dominio de multimerización útil en la presente invención se
descubre en la PCT/US90/06849 (incorporada en ésta por referencia en
su totalidad) en la cual se describen inmunoglobulinas híbridas.
Además, podría manipularse una región de multimerización de tal
forma que las interacciones estéricas no sólo promuevan la
interacción estable, sino que además promuevan la formación de
heterodímeros respecto homodímeros a partir de una mezcla de
monómeros. Ver, por ejemplo, la PCT/US96/01598 (incorporada en ésta
por referencia en su totalidad) en la cual se descubre una
estrategia
"protuberancia-dentro-de-cavidad"
para una interfaz entre un primer y segundo polipéptidos para una
hetero-oligomerización. Las "protuberancias" se
construyen remplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de
la interfaz del primer polipéptido con cadenas laterales más grandes
(por ejemplo, tirosina o triptófano). Opcionalmente se crean
"cavidades" compensatorias, de tamaño idéntico o similar al de
las protuberancias, remplazando cadenas laterales grandes de
aminoácidos con unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o
treonina). La secuencia de inmunoglobulina, preferible pero no
necesariamente, es un dominio constante de inmunoglobulina. La
porción inmunoglobulina en las quimeras de la presente invención
podría obtenerse de subtipos IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o
IgG_{4}, de IgA, IgE, IgD o IgM, pero preferiblemente de
IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}.
Por "compuesto que contiene un tiol libre"
se quiere indicar un compuesto que puede incorporarse en, o hacerse
reaccionar con un aminoácido de una interfaz de polipéptido de la
invención, de tal forma que la porción de tiol libre del compuesto
se ubica para interaccionar con un tiol libre de una porción en la
interfaz del polipéptido adicional de la invención para formar un
enlace disulfuro. Preferiblemente, el compuesto que contiene el tiol
libre es una cisteína.
El término "marcado con epítopo" cuando se
usa en ésta se refiere a un polipéptido quimérico que comprende la
heteroadhesina quimérica entera, o un fragmento de la misma,
fusionada con un "polipéptido marca". El polipéptido marca
tiene bastantes residuos como para proporcionar un epítopo contra el
que puede prepararse un anticuerpo, aunque es lo bastante corto como
para no interferir con la actividad de la heteroadhesina quimérica.
El polipéptido marca preferible es bastante único, deforma que el
anticuerpo contra el mismo no reacciona sustancialmente de forma
cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos marca apropiados
generalmente tienen al menos 6 residuos aminoácidos, y usualmente
entre aproximadamente 8-50 residuos aminoácidos
(preferiblemente entre aproximadamente 9-30
residuos). Una realización de la invención abarca una heteroadhesina
quimérica unida a una marca de epítopo, marca que se usa para
detectar la adhesina en una muestra o recuperar la adhesina de una
muestra.
Tal como se usa en ésta, "cadena ligera
común" o "secuencia de aminoácidos común de la cadena
ligera" se refiere a la secuencia de aminoácidos de la cadena
ligera en el anticuerpo multiespecífico de la invención. Se
generaron paneles de anticuerpos contra al menos dos antígenos
diferentes mediante cribado de una biblioteca de exhibición en fago,
tal como la descrita por Vaughan, et al., (1996),
supra, incorporada en ésta por referencia en su totalidad,
con particular referencia al procedimiento de selección de la
biblioteca de fagémidos). Las secuencias de cadena ligera se
compararon con respecto las secuencias de aminoácidos de la cadena
ligera variable. Las cadenas ligeras útiles procedentes de los
paneles comparados son aquéllas que tienen una identidad de
secuencia de aminoácidos de al menos el 80%, preferiblemente de al
menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95%, y lo más
preferiblemente el 100% de identidad. Una secuencia de cadena ligera
común es una secuencia diseñada para ser una aproximación de las dos
secuencias de cadena ligera comparadas. Cuando las cadenas ligeras
comparadas son 100% idénticas en su secuencia a nivel de
aminoácidos, la cadena ligera común es idéntica a las cadenas
ligeras procedentes de los clones de la biblioteca seleccionados,
aunque la cadena ligera funciona en un dominio de unión diferente
del anticuerpo multiespecífico. Cuando las cadenas ligeras
comparadas difieren tal como se ha descrito más arriba, la cadena
ligera común podría diferir de una u otra, o de ambas, de las
cadenas ligeras comparadas procedentes de la biblioteca de clones.
En un caso, en el que la cadena ligera común difiere de uno u otro,
o de ambos de los clones de biblioteca, se prefiere que los residuos
que difieren ocurran fuera de los residuos del CDR unidor de
antígeno de la cadena ligera del anticuerpo. Por ejemplo, la
posición de los residuos del CDR unidor de antígeno podrían
determinarse de acuerdo con una definición
de secuencia (Kabat et al., (1991), supra) o definición estructural (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).
de secuencia (Kabat et al., (1991), supra) o definición estructural (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).
Tal como se usa en ésta "identidad de secuencia
de aminoácidos" se refiere al porcentaje de los aminoácidos de
una secuencia que son los mismos que los aminoácidos de una segunda
secuencia de aminoácidos. Una identidad de secuencia del 100% entre
cadenas polipeptídicas significa que las cadenas son idénticas.
Tal como se usa en ésta, "polipéptido" se
refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de
aproximadamente diez aminoácidos. Preferiblemente, se usan
polipéptidos de mamíferos (polipéptidos que originalmente se
derivaron de un organismo mamífero), más preferiblemente aquéllos
que se secretan directamente al medio. Los ejemplos de polipéptidos
bacterianos incluyen, por ejemplo, fosfatasa alcalina y
\beta-lactamasa. Los ejemplos de polipéptidos de
mamíferos incluyen las moléculas tales como la renina, una hormona
de crecimiento, incluyendo la hormona del crecimiento humana; la
hormona del crecimiento bovina; el factor liberador de la hormona
del crecimiento; la hormona paratiroidea; la hormona estimuladora de
la tiroides; las lipoproteínas; la
\alpha-1-antitripsina; la cadena A
de la insulina; la cadena B de la insulina; la proinsulina; la
hormona estimuladora del folículo; la calcitonina; la hormona
luteinizadora; el glucagón; factores coagulantes tales como el
factor VIIIC, el factor IX, el factor de tejido, y el factor de von
Willebrands; factores anti-coagulación tales como la
Proteína C; factores natriurétricos atriales; tensioactivo pulmonar;
un activador de plasminógeno, tal como la uroquinasa, o la orina
humana, o el activador de plasminógeno del tipo de tejido
(t-PA); la bombesina; la trombina; el factor de
crecimiento hemopoyético; el factor-alfa y -beta de
la necrosis del tumor; el RANTES (regulado en la activación,
normalmente expresado y secretado por células T); la proteína
inflamatoria de macrófago humano
(MIP-1-alfa); una albúmina de suero
tal como la albúmina de suero humana; la sustancia inhibidora de
Muellerian; una cadena A de relaxina; una cadena B de relaxina; la
prorelaxina; el péptido asociado a la gonadotropina del ratón; una
proteína microbiana, tal como la beta-lactamasa; la
ADNasa; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF); los receptores para hormonas o factores
del crecimiento; la integrina; la Proteína A ó D; los factores
reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico
derivado del hueso (BDNF), la neurotrofinas-3, -4,
-5 o -6 (NT-3, NT-4,
NT-5, o NT-6), o un factor de
crecimiento del nervio, tal como el NGF-f; el factor
de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); un factor de
crecimiento de fibroblastos, tal como el aFGF y bFGF; el factor de
crecimiento epidérmico (EGF); un factor de crecimiento transformante
(TGF) tal como el TGF-alfa y
TGF-beta, incluyendo el
TGF-\beta1, TGF-\beta2,
TGF-\beta3, TGF-\beta4, o
TGF-\beta5; el factor de crecimiento parecido a
la insulina I y II (IGF-I e IGF-II);
el
des(1-3)-IGF-I
(IGF-I de cerebro), las proteínas unidoras de factor
de crecimiento parecido a la insulina; proteínas CD tales como las
CD-3, CD-4, CD-8, y
CD-19; la eritropoyetina; los factores
osteoinductores; las inmunotoxinas; una proteína morfogénica de
hueso (BMP); un interferón tal como el
interferón-alfa, -beta y -gamma; los factores
estimuladores de colonias (CSF), por ejemplo, el
M-CSF, GM-CSF y
G-CSF; las interleukinas (IL), por ejemplo, de la
IL-1 a la IL-10; la superóxido
dismutasa; los receptores de células T; las proteínas de membrana de
superficie; los factor acelerador de la degradación; un antígeno
viral tal como, por ejemplo, una porción de la cápsula del SIDA; las
proteínas de transporte; los receptores de asentamiento; las
adresinas; las proteínas reguladoras; los anticuerpos; y fragmentos
de cualquiera de los polipéptidos listados más arriba.
El "primer polipéptido" es cualquier
polipéptido que va a asociarse con un segundo polipéptido. El primer
y segundo polipéptido se encuentran en una "interfaz" (definida
más abajo). Además de la interfaz, el primer polipéptido podría
comprender uno o más dominios adicionales, tales como los
"dominios unidores" (por ejemplo, un dominio variable de
anticuerpo, un dominio unidor de receptor, un dominio unidor de
ligando o un dominio enzimático), o dominios constantes de
anticuerpo (o partes de los mismos) incluyendo los dominios
C_{H}2, C_{H}1 y CL. Normalmente, el primer polipéptido
comprenderá al menos un dominio que se deriva de un anticuerpo. Este
dominio convenientemente es un dominio constante, tal como el
dominio C_{H}3 de un anticuerpo, y puede formar la interfaz del
primer polipéptido. Los polipéptidos primeros ilustrativos incluyen
los polipéptidos de cadena pesada, las quimeras que contienen un
dominio constante de anticuerpo con un dominio unidor de un
polipéptido heterólogo (es decir, una inmunoadhesina, ver la
definición más abajo), polipéptidos de receptor (especialmente
aquéllos que forman dímeros con otro polipéptido de receptor, por
ejemplo, heterodímeros del receptor de la
interleukina-8 (IL-8R) e integrina
(por ejemplo, LFA-1 o GPIIIb/IIIa)), polipéptidos de
ligando (por ejemplo, el factor de crecimiento del nervio (NGF), la
neurotrofina-3 (NT-3), y el factor
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) - - -ver
Arakawa et al., J. Biol. Chem.,
269(45):27833-27839 (1994) Y Radziejewski
et al., Biochem., 32(48):1350 (1993)), y
polipéptidos del dominio variable de anticuerpo (por ejemplo,
diacuerpos). El polipéptido primero preferido se selecciona de una
cadena pesada de anticuerpo fusionada con un dominio constante de
una inmunoglobulina, en donde el dominio constante se ha alterado en
la interfaz para promover la interacción preferencial con un
polipéptido segundo de la invención.
El "segundo polipéptido" es cualquier
polipéptido que va a asociarse con el primer polipéptido a través de
una "interfaz". Además de la interfaz, el segundo polipéptido
podría comprender dominios adicionales tales como un "dominio
unidor" (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo, un
dominio unidor de receptor, un dominio unidor de ligando o un
dominio enzimático), o dominios constantes de anticuerpo (o partes
de los mismos) incluyendo los dominios C_{H}2, C_{H}1 y CL.
Normalmente, el segundo polipéptido comprenderá al menos un dominio
que se deriva de un anticuerpo. Este dominio convenientemente es una
región constante, tal como el dominio C_{H}3 de un anticuerpo, y
puede formar la interfaz del segundo polipéptido. Los polipéptidos
segundos ilustrativos incluyen los polipéptidos de cadena pesada,
las quimeras que combinan un dominio constante de anticuerpo con un
dominio unidor de un polipéptido heterólogo (es decir, una
inmunoadhesina, ver la definición más abajo), polipéptidos de
receptor (especialmente aquéllos que forman dímeros con otro
polipéptido de receptor, por ejemplo, heterodímeros del receptor de
la interleukina-8 (IL-8R) e
integrina (por ejemplo, LFA-1 o GPIIIb/IIIa)),
polipéptidos de ligando (por ejemplo, el factor de crecimiento del
nervio (NGF), la neurotrofina-3
(NT-3), y el factor neurotrófico derivado del
cerebro (BDNF) - - -ver Arakawa et al., J.
Biol. Chem., 269(45):27833-27839 (1994) Y
Radziejewski et al., Biochem., 32(48):1350
(1993)), y polipéptidos del dominio variable de anticuerpo (por
ejemplo, diacuerpos). El polipéptido segundo preferido se selecciona
de una cadena pesada de anticuerpo fusionada con un dominio
constante de una inmunoglobulina, en donde el dominio constante se
ha alterado en la interfaz para promover la interacción preferencial
con un primer polipéptido de la invención.
Un "dominio unidor" comprende cualquier
región de un polipéptido que es responsable de la unión selectiva a
una molécula de interés (por ejemplo, un antígeno, ligando,
receptor, sustrato o inhibidor). Los dominios unidores ilustrativos
incluyen un dominio variable de anticuerpo, un dominio unidor de
receptor, un dominio unidor de ligando, y un dominio enzimático. En
las realizaciones preferidas, el dominio unidor incluye un cadena
pesada y cadena ligera de inmunoglobulina. De acuerdo con los
anticuerpos biespecíficos de la invención y el procedimiento de
prepararlos, la cadena ligera de cada dominio de unión del
anticuerpo biespecífico es una cadena ligera común, evitándose de
ese modo la formación de heteromultímeros no deseados en los que
ocurre el emparejamiento incorrecto de cadenas pesadas y
ligeras.
El término "anticuerpo" tal como se menciona
en la invención, deberá significar un polipéptido que contiene uno o
más dominios que une un epítopo sobre un antígeno de interés, en
donde tal(es) dominio(s) se deriva(n) de, o
tienen identidad de secuencia, con la región variable de un
anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos incluyen los anticuerpos de
longitud completa, los fragmentos de anticuerpo, las molécula de
cadena única, las moléculas biespecíficas o bifuncionales, los
diacuerpos, los anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos
humanizados y PRIMATIZED™), y las inmunoadhesinas. Los "fragmentos
de anticuerpo" incluyen los fragmentos Fv, Fv', Fab, Fab', y
F(ab')_{2}.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, de roedor o primate) son inmunoglobulinas
quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de
las mismas que contienen una secuencia mínima derivada de
inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos
humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en el
que residuos de una región determinante de la complementariedad
(CDR) del receptor se remplazan con residuos procedentes de una CDR
de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como el ratón,
rata, conejo o primate, que tiene la especificidad, afinidad y
capacidad deseada. En algunos casos, se remplazan residuos de la
región estructural (FR) Fv de la inmunoglobulina humana con los
correspondientes residuos no humanos. Más aún, el anticuerpo
humanizado podría comprender residuos que no se hallan ni en el
anticuerpo receptor ni en las secuencias de la CDR o estructurales
importadas. Estas modificaciones se hacen para refinar
adicionalmente y maximizar las prestaciones del anticuerpo. En
general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos
o al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales
todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de
una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las
regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El
anticuerpo humanizado preferiblemente comprenderá también al menos
una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina,
típicamente la de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo
humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZED™, en donde la región
unidora de antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo
producido mediante la inmunización de monos macacos con el antígeno
de
interés.
interés.
Un "anticuerpo multiespecífico" es una
molécula que tienen especificidades de unión por al menos dos
antígenos diferentes. Mientras que tales moléculas sólo unirán dos
antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAbs), los
anticuerpos con especificidades adicionales, tales como los
anticuerpos triespecíficos, están abarcados por esta expresión
cuando se usa en ésta. Los ejemplos de BsAbs incluyen aquéllos con
un brazo dirigido contra un antígeno de célula tumoral y el otro
brazo dirigido contra una molécula activadora citotóxica, tal como
el anti-Fc\gammaRI/anti-CD15, el
anti-p185^{HER2}/Fc\gammaRIII (CD16), el
anti-CD3/anti-célula B cancerosa
(1D10), el
anti-CD3/anti-p185^{HER2}, el
anti-CD3/anti-p97, el
anti-CD3/anti-carcinoma de célula
renal, el
anti-CD3/anti-OVCAR-3,
el anti-CD3/L-D1
(anti-carcinoma de colon), el
anti-CD3/anti-análogo de la hormona
estimuladora de melanocito, el anti-receptor del
ECG/anti-CD3, el
anti-CD3/anti-CAMA1, el
anti-CD3/anti-CD19, el
anti-CD3/MoV18, el anti-molécula de
adhesión de célula neural (NCAM)/anti-CD3, el
anti-proteína unidora de folato
(FBP)/anti-CD3, el anti-pan antígeno
asociado con carcinoma
(AMOC-31)/anti-CD3; los BsAbs con un
brazo que se une específicamente a un antígeno tumoral y un brazo
que se une a una toxina, tales como el
anti-saporina/anti-Id-1,
el anti-CD22/anti-saporina, el
anti-CD7/anti-saporina, el
anti-CD38/anti-saporina, el
anti-CEA/anti-cadena A de ricina, el
anti-interferón-\alpha
(IFN-\alpha)/anti-idiotipo de
hibridoma, el
anti-CEA/anti-alcaloide de vinca;
los BsAbs para convertir prodrogas activadas por enzima, tales como
el anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina
(el cual cataliza la conversión de la prodroga mitomicina fosfato a
mitomicina alcohol); los BsAbs que pueden usarse como agentes
fibrinolíticos, tales como el
anti-fibrina/anti-activador del
plasminógeno de tejido (tPA), el
anti-fibrina/anti-activador del
plasminógeno del tipo uroquinasa (uPA); los BsAbs para apuntar
complejos inmunes hacia receptores de la superficie celular, tales
como el anti-lipoproteína de baja
densidad (LDL)/anti-receptor de Fc (por ejemplo, Fc\gammaRI, Fc\gammaRII o Fc\gammaRIII); los BsAbs para uso en terapia de enfermedades infecciosas, tales como el anti-CD3/anti-virus del herpes simplex (HSV), anti-complejo receptor de la célula T:CD3/anti-gripe, anti-Fc\gammaR/anti-VIH; los BsAbs para la detección de tumores in vitro o in vivo, tales como el anti-CEA/anti-EOTUBE, el anti-CEA/anti-DPTA, el anti-p185^{HER2}/anti-hapteno; los BsAbs como adyuvantes de vacunas (ver Fanger et al., supra); y los BsAbs como herramientas diagnósticas, tales como el anti-IgG de conejo/anti-ferritina, el anti-peroxidasa del rábano silvestre (HRP)/anti-hormona, el anti-somatostatina/anti-sustancia
P, el anti-HRP/anti-FITC, el anti-CEA/anti-\beta-galactosidasa (ver Nolan et al., supra). Los ejemplos de anticuerpos triespecíficos incluyen el anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, el anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y el anti-CD3/anti-CD8/
anti-CD37.
densidad (LDL)/anti-receptor de Fc (por ejemplo, Fc\gammaRI, Fc\gammaRII o Fc\gammaRIII); los BsAbs para uso en terapia de enfermedades infecciosas, tales como el anti-CD3/anti-virus del herpes simplex (HSV), anti-complejo receptor de la célula T:CD3/anti-gripe, anti-Fc\gammaR/anti-VIH; los BsAbs para la detección de tumores in vitro o in vivo, tales como el anti-CEA/anti-EOTUBE, el anti-CEA/anti-DPTA, el anti-p185^{HER2}/anti-hapteno; los BsAbs como adyuvantes de vacunas (ver Fanger et al., supra); y los BsAbs como herramientas diagnósticas, tales como el anti-IgG de conejo/anti-ferritina, el anti-peroxidasa del rábano silvestre (HRP)/anti-hormona, el anti-somatostatina/anti-sustancia
P, el anti-HRP/anti-FITC, el anti-CEA/anti-\beta-galactosidasa (ver Nolan et al., supra). Los ejemplos de anticuerpos triespecíficos incluyen el anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, el anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y el anti-CD3/anti-CD8/
anti-CD37.
Tal como se usa en ésta, el término
"inmunoadhesina" designa moléculas parecidas a anticuerpos, las
cuales combinan el "dominio unidor" de una proteína heteróloga
(una "adhesina", por ejemplo, un receptor, ligando o enzima)
con las funciones efectoras del dominio constante de
inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden
una fusión de la secuencia de aminoácidos de la adhesina con la
especificidad de unión deseada, la cual es distinta de la del sitio
de reconocimiento y unión del antígeno (sitio de combinación con
antígeno) de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una
secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia del
dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina podría
obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos
IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, o IgG_{4}, la IgA, la IgE, la IgD
o la IgM.
El término "dominio unidor de ligando" tal
como se usa en ésta se refiere a cualquier receptor de superficie
celular nativo, o a cualquier región o derivado del mismo que
retiene al menos una capacidad de unión de ligando cualitativa, y
preferiblemente la actividad biológica de un receptor nativo
correspondiente. En una realización específica, el receptor procede
de un polipéptido de superficie celular que tiene un dominio
extracelular que es homólogo con un miembro de la superfamilia
inmunoglobulina. Otros receptores típicos, que no son miembros de la
superfamilia de genes de inmunoglobulina, pero que, sin embargo,
están específicamente abarcados por esta definición, son los
receptores de citoquinas, y en particular los receptores con
actividad quinasa de tirosinas (receptores quinasas de tirosina),
los miembros de las superfamilias de la hematopoyetina y del
receptor del factor de crecimiento del nervio, y las moléculas de
adhesión celular, por ejemplo, las (E-, L- y P-) selectinas.
El término "dominio unidor de receptor" se
usa para designar cualquier ligando nativo para un receptor,
incluyendo las moléculas de adhesión celular, o cualquier región o
derivado de tal ligando nativo que retiene al menos una capacidad
cualitativa de unión de receptor, y preferiblemente la actividad
biológica de un ligando nativo correspondiente. Esta definición,
entre otras, incluye específicamente las secuencias unidoras
procedentes de ligandos para los receptores antes mencionados.
Tal como se usa en ésta, la frase
"inmunoadhesina multiespecífica" designa inmunoadhesinas (tal
como se han definido en ésta más arriba) que tienen al menos dos
especificidades de unión (es decir, que combinan dos o más dominios
unidores de adhesina). Las inmunoadhesinas multiespecíficas pueden
ensamblarse como heterodímeros, heterotrímeros o heterotetrámeros,
esencialmente tal como se descubre en WO 89/02922 (publicada el 6 de
abril de 1989), en EP 314.317 (publicada el 3 de mayo de 1989), y en
la patente estadounidenses nº 5.116.964 concedida el 2 de mayo de
1992. Las inmunoadhesinas multiespecíficas preferidas son
biespecíficas. Los ejemplos de inmunoadhesinas biespecíficas
incluyen la IgG-CD4/IgG-receptor del
TNF y la
IgG-CD4/IgG-L-selectina.
La última molécula mencionada combina la función unidora de nódulo
linfático del receptor de asentamiento (LHR,
L-selectina), y la función de unión del CD4 del VIH,
y halla aplicación potencial en la prevención o tratamiento de la
infección por VIH, en condiciones relacionadas, o como un
diagnóstico.
Una "quimera de
anticuerpo-inmunoadhesina (quimera Ab/Ia)"
comprende una molécula que combina al menos un dominio unidor de un
anticuerpo (tal como se define en ésta) con al menos una
inmunoadhesina (tal como se define en esta solicitud). Las quimeras
Ab/Ia ilustrativas son las quimeras CD4-IgG
biespecíficas descritas por Berg et al., supra, y
Chamow et al., supra.
La "interfaz" comprende aquellos residuos
aminoácidos de "contacto" (u otros grupos que no son
aminoácidos, tales como los grupos carbohidratos, NADH, biotina, FAD
o grupo hemo) en el primer polipéptido que interaccionan con uno o
más residuos aminoácidos de "contacto" (u otros grupos que no
son aminoácidos) en la interfaz del segundo polipéptido. La interfaz
preferida es un dominio de una inmunoglobulina tal como un dominio
variable o dominio constante (o regiones de los mismos), sin
embargo, la interfaz entre los polipéptidos que forman un receptor
heteromultimérico o la interfaz entre dos o más ligandos tales como
el NFG, NT-3 y BDNF, se incluyen dentro del ámbito
de este término. La interfaz preferida comprende el domino C_{H}3
de una inmunoglobulina, la cual preferiblemente se deriva de un
anticuerpo IgG, y más preferible de un anticuerpo IgG humano.
Un residuo aminoácido "original" es uno que
es remplazado por un residuo "importado", el cual puede tener
un volumen de cadena lateral menor o mayor que el del residuo
original. El residuo aminoácido importado puede ser un residuo
aminoácido que ocurre de forma natural o no natural, pero
preferiblemente es el primero. Los residuos aminoácidos que
"ocurren de forma natural" son aquellos residuos codificados
por el código genético y listados en la Tabla 1 de la
PCT/US96/01598, incorporada en ésta por referencia en su totalidad.
Por residuo aminoácido "que no ocurre de forma natural" se
quiere indicar un residuo que no está codificado por el código
genético, pero que es capaz de unir covalentemente residuos
aminoácidos adyacentes en la cadena polipeptídica. Los ejemplos de
residuos aminoácidos que no ocurren de forma natural son la
norleucina, la ornitina, la norvalina, la homoserina, y otros
análogos de residuos aminoácidos, tales como los descritos en Ellman
et al., Meth. Enzym., 202:301-336
(1991), por ejemplo. Para generar tales residuos aminoácidos que no
ocurren naturalmente, pueden usarse los procedimientos de Noren
et al., Science, 244: 182 (1989) y Ellman et
al., supra. De forma resumida, esto implica activar
químicamente un ARNt supresor con un residuo aminoácido que no
ocurre de forma natural, seguida por la transcripción y traducción
del ARN in vitro. El procedimiento de la presente invención
implica remplazar al menos un residuo aminoácido original, pero se
pueden remplazar más de un residuo original. Normalmente, no más del
total de residuos en la interfaz del primer y segundo polipéptido
comprenderá residuos aminoácidos originales que se remplazan. Los
residuos originales preferidos para la sustitución están
"enterrados". Por "enterrado" se quiere indicar que el
residuo es esencialmente inaccesible al solvente. El residuo
importado preferido no es la cisteína para evitar la posible
oxidación o emparejamiento incorrecto de puentes disulfuro.
Por "ácido nucleico original" se quiere
significar el ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés,
el cual puede alterarse para codificar, dentro del dominio de
multimerización, aminoácidos cuyas cadenas laterales interaccionan
en la interfaz entre el primer y segundo polipéptidos, promoviendo
la interacción estable entre los polipéptidos. Tales alteraciones
podrían generar sin limitación interacciones estables tales como,
protuberancia-dentro-de-cavidad,
puentes disulfuro que no ocurren naturalmente, cremallera de
leucinas, interacciones hidrofóbicas, e interacciones hidrofílicas.
Preferiblemente, se escoge la alteración que promueve la interacción
específica entre un primer y segundo polipéptidos de interés, y que
excluye efectivamente las interacciones que resultan en
emparejamiento de heterómero no deseado o en la formación de
homómeros. El ácido nucleico original o de partida podría ser un
ácido nucleico que ocurre naturalmente o podría comprender un ácido
nucleico que se ha sometido a alteración previa (por ejemplo, un
fragmento de anticuerpo humanizado). Por "alterar" el ácido
nucleico se quiere indicar que el ácido nucleico original está
genéticamente manipulado o mutado mediante la inserción, supresión,
o sustitución de al menos un codón que codifica un residuo
aminoácido de interés. Normalmente, un codón que codifica un residuo
original es remplazado por un codón que codifica un residuo
importado. Las técnicas para modificar genéticamente un ADN de esta
forma han sido revisadas en Mutagenesis: a Practical
Approach, Ed. M.J. McPherson, (IRL Press, Oxford, UK. (1991), e
incluyen, por ejemplo, la mutagénesis dirigida a un sitio, la
mutagénesis en casete, y la mutagénesis mediante reacción en cadena
de la polimerasa (PCR).
La protuberancia, cavidad, o tiol libre (tal como
un residuos cisteína para la formación de enlace disulfuro) puede
"introducirse" en la interfaz del primero o segundo polipéptido
mediante medios sintéticos, por ejemplo, mediante técnicas
recombinantes, la síntesis de péptido in vitro, aquellas
técnicas para introducir residuos aminoácidos que no ocurren
naturalmente descritas previamente, mediante acoplamiento químico o
enzimático de péptidos, o mediante alguna combinación de estas
técnicas. En consecuencia, la protuberancia, cavidad o tiol libre
que se "introduce" es "no existente de forma natural" o
"no nativo", lo que significa que no existe en la naturaleza o
en el polipéptido original (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal
humanizado).
Preferiblemente, el residuo aminoácido importado
para formar la protuberancia tiene un número de "rotámeros"
relativamente pequeño (por ejemplo, aproximadamente
3-6). Un "rotámero" es una conformación
energéticamente favorable de una cadena lateral de aminoácido. El
número de rotámeros de los diversos residuos aminoácido está
revisado en Ponders y Richards, J. Mol. Biol.,
193:775-791 (1987).
Heteromultímero "aislado" significa un
heteromultímero que se ha identificado y separado y/o recuperado a
partir de un componente de su entorno de cultivo de células natural.
Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales
que interferirían con los usos diagnóstico o terapéutico del
heteromultímero, y podrían incluir enzimas, hormonas, y otros
solutos proteicos y no proteicos. En realizaciones preferidas, el
heteromultímero se purificará (1) hasta más del 95% en peso de
proteína, según se determina mediante el procedimiento de Lowry, y
más preferiblemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado
suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de
aminoácidos N-terminal o internal mediante el uso de
un secuenciador de copa rotatoria, o (3) hasta la homogeneidad
mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no
reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de
plata.
Los heteromultímeros de la presente invención
generalmente se purifican hasta una homogeneidad sustancial. Las
frases "sustancialmente homogéneo", "forma sustancialmente
homogénea", y "homogeneidad sustancial" se usan para indicar
que el producto carece sustancialmente de subproductos originados a
partir de combinaciones de polipéptidos no deseadas (por ejemplo,
los homomultímeros). Expresado en términos de pureza, homogeneidad
sustancial significa que la cantidad de subproductos no excede del
10%, y preferiblemente es inferior al 5%, más preferiblemente
inferior al 1%, y los más preferiblemente inferior al 0,5%, en donde
los porcentajes son en peso.
La expresión "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante operativamente unida, en un organismo huésped.
Las secuencias de control que son apropiadas para las procariotas
incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de
operador, un sitio de unión de ribosoma, y, posiblemente, otras
secuencias aún poco comprendidas. Se sabe que las células eucariotas
utilizan promotores, señales de poliadenilación, y
potenciadores.
Un ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando está colocado en una relación funcional
con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una
pre-secuencia o líder secretor está unido
operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una
pre-proteína que participa en la secreción del
polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a
una secuencia codificante si afecta la transcripción de la
secuencia; o un sitio de unión de ribosoma está unido operativamente
a una secuencia codificante si está posicionado con objeto de
facilitar la traducción. Generalmente, "unido operativamente"
significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas
y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura.
Sin embargo, los potenciadores no tienen porque ser contiguos. La
unión se consigue mediante ligación en los sitios de restricción
apropiados. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o
eslabones de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica
convencional.
Normalmente, el ácido nucleico que codifica estos
polipéptidos debe aislarse para que pueda alterarse para codificar
la protuberancia o cavidad, o ambas, tal como se definen en ésta.
Sin embargo, las mutaciones pueden introducirse usando medios
sintéticos, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos.
También, en el caso en que el residuo importado es un residuo que no
ocurre de forma natural, está disponible el procedimiento de Noren
et al., supra, para construir polipéptidos que tienen
tales sustituciones. Adicionalmente, parte del heteromultímero se
prepara convenientemente de forma recombinante en el cultivo de
células, y otra(s) parte(s) de la molécula se
prepara(n) mediante aquellas técnicas mencionadas más
arriba.
A continuación siguen las técnicas para aislar
anticuerpos y preparar inmunoadhesinas. Sin embargo, se apreciará
que el heteromultímero puede formarse a partir, o incorporar, otros
polipéptidos usando técnicas que son conocidas en el campo. Por
ejemplo, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés
(por ejemplo, un ligando, receptor o enzima) puede aislarse de una
biblioteca de ADNc preparada a partir de un tejido que se cree
posee el ARNm del polipéptido, y para expresarlo a un nivel
detectable. Las bibliotecas se examinan con sondas (tales como
anticuerpos u oligonucleótidos de aproximadamente
20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de
interés o la proteína codificada por éste. El examen de la
biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada podría
realizarse usando procedimientos estándares, tal como se describe en
los capítulos 10-12 de Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Se han descrito varias técnicas para la
producción de anticuerpos, las cuales incluyen el procedimiento
tradicional del hibridoma para preparar anticuerpos monoclonales,
las técnicas recombinantes para preparar anticuerpos (incluyendo los
anticuerpos quiméricos, por ejemplo, anticuerpos humanizados), la
producción de anticuerpos en animales transgénicos, y la tecnología
de exhibición en fagos recientemente descrita para preparar
anticuerpos "completamente humanos". Estas técnicas se
describirán brevemente más abajo.
Los anticuerpos policlonales contra el antígeno
de interés pueden generarse en animales mediante múltiples
inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno y
un adyuvante. Podría ser útil conjugar el antígeno (o un fragmento
que contiene la secuencia de aminoácidos diana) con una proteína que
es inmunogénica en la especie a inmunizar, por ejemplo, la
hemocianina de lapa con forma de ojo de cerradura, la albúmina de
suero, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de tripsina de soja,
usando un agente bifuncional o derivatizador, por ejemplo, el éster
maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación a
través de residuos cisteína), el anhídrido de glutaraldehído
succínico, el SOCl_{2}, o el R^{1}N=C=NR, en donde R y R^{1}
son grupos alquilo diferentes. Los animales se inmunizan contra los
conjugados o derivados inmunogénicos combinando 1 mg o 1 \mug de
conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes
de adyuvante completo de Freund, e inyectando la solución
intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde, los
animales se estimulan con de 1/5 a 1/10 de la cantidad original de
conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección
subcutánea en múltiples sitios. De 7 a 14 días más tarde, se sangran
los animales y se ensaya el título de anticuerpo en el suero. Los
animales se estimulan hasta que el título se estabiliza.
Preferiblemente, el animal se impulsa con el conjugado del mismo
antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de
reactivos de entrecruzado diferentes. Los conjugados pueden
prepararse también en cultivo de células recombinantes como
proteínas de fusión. También, se usan agentes de agregación, tales como el alum, para potenciar la respuesta inmune.
proteínas de fusión. También, se usan agentes de agregación, tales como el alum, para potenciar la respuesta inmune.
Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir
de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea usando el
procedimiento del hibridoma, descrito primero por Kohler y Milstein,
Nature, 256:495 (1975), o podrían prepararse mediante
procedimientos de ADN recombinante (Cabilly et al., patente
estadounidense nº 4.816.567). En el procedimiento del hibridoma, una
ratón, u otro animal huésped apropiado, tal como un ratón, se
inmuniza tal como se ha descrito en ésta más arriba, para elicitar
linfocitos que producen, o son capaces de producir, anticuerpos que
se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización.
Alternativamente, los linfocitos podrían inmunizarse in
vitro. Los linfocitos se fusionan a continuación con células de
mieloma usando un agente de fusión apropiado, tal como el
polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Las células de
hibridoma preparadas de este modo se siembran y cultivan en un medio
de cultivo apropiado que preferiblemente contiene una o más
sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células
de mieloma progenitoras no fusionadas. Por ejemplos, si las células
progenitoras carecen del enzima fosforibosil transferasa de
hipoxantina guanina (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los
hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina
(medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de las células
deficientes en HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquéllas
que se fusionan eficientemente, soportan una expresión de anticuerpo
estable con nivel elevado por parte de las células productoras de
anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el
medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferidas
son las líneas de mieloma de ratón, tales como las derivadas de los
tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11,
disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San
Diego, CA, EE.UU., y las células SP-2 disponibles en
la American Type Culture Collection, Rockville, MD, EE.UU. También
se han descrito líneas celulares de mieloma humanas y heteromieloma
de ratón-humanas para la producción de anticuerpos
monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y
Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques
and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc.,
Nueva York, 1987). Ver, también, Boerner et al., J.
Immunol., 147(1):86-95 (1991) y la WO
91/17769, publicada el 28 de noviembre de 1991, sobre técnicas para
la producción de anticuerpos monoclonales humanos. El medio de
cultivo en el que crecen las células de hibridoma se ensaya en busca
de producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el
antígeno de interés. Preferiblemente, la especificidad de unión de
los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma
se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de
unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el
ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). La afinidad de unión
del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante
el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem.,
107:220 (1980). Una vez se han identificado células de hibridoma que
producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad
deseada, los clones podrían subclonarse mediante procedimientos de
dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándares.
Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
pp.59-104 (Academic Press, 1986). Los medios de
cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, el
medio de Eagle modificado por Dulbecco, o el medio
RPMI-1640. Además, las células de hibridoma podrían
crecer in vivo en tumores ascites en un animal. Los
anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan
convenientemente del medio de cultivo, fluido de ascites, o suero,
mediante procedimientos convencionales de purificación de
inmunoglobulina, tales como, por ejemplo, la Proteína
A-Sepharose, la cromatografía con hidroxilapatito,
la electroforesis en gel, la diálisis, o la cromatografía de
afinidad.
Alternativamente, ahora es posible producir
animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, a
partir de su inmunización, de producir un repertorio completo de
anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de
inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión
homocigótica del gen de la región unidora de la cadena pesada
(J_{H}) de anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de la línea
germinal, resulta en la inhibición completa de la producción
endógena de anticuerpos. La transferencia del conjunto de genes de
la inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones
mutantes de la línea germinal resultará en la producción de
anticuerpos humanos a partir del desafío con antígeno. Ver, por
ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 90:2551-255 (1993); Jakobovits et
al., Nature, 362:255-258 (1993);
Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotech,
14:845-851 (1996); y Mendez, M.J., et al.,
Nat. Genetics, 15:146-156 (1997)).
En una realización adicional, los anticuerpos o
fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de bibliotecas de
anticuerpos en fagos generadas usando las técnicas descritas en
McCafferty et al., Nature, 348:552-554
(1990), usando el antígeno de interés para seleccionar un anticuerpo
o fragmento de anticuerpo apropiado. Clackson et al.,
Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et
al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)
describen el aislamiento de anticuerpos de ratón y humanos,
respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Las publicaciones
siguientes describen la producción de anticuerpos humanos de elevada
afinidad (en el rango nM) mediante reordenación de la cadena (Mark
et al., Bio/Technol., 10:779-783
(1992)), así como mediante infección combinatoria y recombinación
in vivo como una estrategia para construir bibliotecas en
fagos muy extensas (Waterhouse et al., Nuc. Acids
Res., 21:2265-2266 (1993); Griffiths, A.D.,
et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994);
y Vaughan, et al., (1996), supra). Por tanto, estas
técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales del
hibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de
anticuerpos "monoclonales" (especialmente anticuerpos humanos),
los cuales están abarcados por la presente invención.
El ADN que codifica los anticuerpos de la
invención se aisla y secuencia fácilmente usando procedimientos
convencionales (por ejemplos, usando sondas de oligonucleótidos que
son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las
cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de ratón). Las células de
hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal
ADN. Una vez aislado, el ADN podría colocarse en vectores de
expresión, los cuales se transfectan dentro de células huéspedes
tales como las células COS de simios, las células ovárica de hámster
chino (CHO), o células de mieloma que de otro modo no producen
proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos
monoclonales en las células huéspedes recombinantes. El ADN también
podría modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia
codificante de los dominios constantes de cadenas pesada y ligera
humanas en lugar las secuencias de ratón homólogas, Morrison et
al., Proc. Nat. Acad. Sci., 81:6851 (1984). De esta
manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" que tienen la
especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal
anti-antígeno en ésta.
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un
anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos
introducidos dentro de él y procedentes de una fuente que no es
humana. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el
procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al.,
Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et
al., Nature, 332:323-327 (1988);
Verhoeyen et al., Science,
239:1534-1536 (1988)), sustituyendo secuencias de
CDR o CDRs de roedor en lugar de las secuencias correspondientes de
un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, tales anticuerpos
"humanizados" son anticuerpos quiméricos (Cabilly,
supra), en donde sustancialmente menos de un dominio variable
humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente
de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos
humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos
residuos CDR, y posiblemente algunos residuos FR, se sustituyen por
residuos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedor. Es
importante que los anticuerpos se humanicen con retención de la
elevada afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas
favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un
procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan
mediante un proceso de análisis de las secuencias progenitoras y de
varios productos humanizados conceptuales usando modelos
tridimensionales de las secuencias progenitora y humanizada. Los
modelos tridimensionales de inmunoglobulina son familiares a los
especialistas en la técnica. Hay disponibles programas de ordenador
que ilustra y muestran estructuras conformacionales tridimensionales
probables de las secuencias de inmunoglobulina candidatas
seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el
análisis del probable rol de los residuos en el funcionamiento de la
secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los
residuos que influyen la capacidad de la inmunoglobulina candidata
para unirse a su antígeno. De esta forma, pueden seleccionarse y
combinarse residuos FR procedentes de la secuencia consenso e
importada, de forma que se consiga la característica del anticuerpo
deseada, tal como una afinidad incrementada
por el(los) antígeno(s) diana. Para más detalles, consultar WO 92/22653, publicada el 23 de diciembre de 1992.
por el(los) antígeno(s) diana. Para más detalles, consultar WO 92/22653, publicada el 23 de diciembre de 1992.
Las inmunoglobulinas (Ig) y ciertas variantes de
las mismas son conocidas, y muchas se han preparado en cultivos de
células recombinantes. Por ejemplo, ver la patente estadounidense nº
4.745.055; la EP-256.654; Faulkner et al.,
Nature, 298:286 (1982); EP 120,694; EP 125,023; Morrison,
J. Immun., 123:793 (1979); Kohler et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77:2197 (1980); Raso et al.,
Cancer Res., 41:2073 (1981); Morrison et al., Ann.
Rev. Immunol., 2:239 (1984); Morrison, Science, 229:1202
(1985); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81:6851 (1984); la EP-255.694; la
EP-266.663; y la WO88/03559. También se conocen las
cadenas de inmunoglobulina reordenadas. Ver, por
ejemplo, la patente estadounidense nº 4.444.878; la WO88/03565; y la EP-68.763, y las referencias citadas en éstas.
ejemplo, la patente estadounidense nº 4.444.878; la WO88/03565; y la EP-68.763, y las referencias citadas en éstas.
Las quimeras construidas a partir de una
secuencia de dominio unidor de adhesina unida a una secuencia de
dominio constante de inmunoglobulina apropiado (inmunoadhesinas) son
conocidas en la técnica. Las inmunoadhesinas mencionadas en la
literatura incluyen fusiones del receptor de la célula T (Gascoigne
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
84:2936-2940 (1987)); del CD4 (Capon et al.,
Nature, 337:525-531 (1989); Traunecker et
al., Nature, 339:68-70 (1989); Zettmeissl
et al., DNA Cell Biol. USA, 9:347-353
(1990); y Byrn et al., Nature,
344:667-670 (1990)); de L-selectina
(receptor de asentamiento) (Watson et al., J. Cell.
Biol., 110:2221-2229 (1990); y Watson et
al., Nature, 349:164-167 (1991)); del
CD44 (Aruffo et al., Cell,
61:1303-1313 (1990)); del CD28 y B7 (Linsley et
al., J. Exp. Med., 173:721-730 (1991));
del CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp.
Med., 174:561-569 (1991)); del CD22 (Stamenkovic
et al., Cell, 66:1133-1144 (1991));
del receptor del TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et
al., Eur. J. Immunol., 27:2883-2886
(1991); y Peppel et al., J. Exp. Med.,
174:1483-1489 (1991)); y del receptor \alpha de la
IgE (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol., volumen 115, resumen
nº 1448 (1991)).
El diseño de inmunoadhesina más simple y sencillo
combina el(los) dominio(s) de unión de la adhesina
(por ejemplo, el dominio extracelular (ECD) de un receptor) con las
regiones bisagra y Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina.
Ordinariamente, cuando se preparan las inmunoadhesinas de la
presente invención, el ácido nucleico que codifica el dominio unidor
de la adhesina se fusionará de forma C-terminal con
el ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal
de una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina, no
obstante, también son posibles las fusiones
N-terminales.
Típicamente, en tales fusiones, el polipéptido
quimérico codificado retendrá al menos los dominios bisagra,
C_{H}2 y C_{H}3 funcionalmente activos de la región constante de
una cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones también se hacen
con el extremo C-terminal de la porción Fc de un
dominio constante, o inmediatamente N-terminales
respecto el C_{H}1 de la cadena pesada o de la región
correspondiente en la cadena ligera. El sitio preciso en el que se
hace la fusión no es crítico; hay sitios particulares bien conocidos
y podrían seleccionarse con objeto de optimizar la actividad
biológica, la secreción, o las características unidoras de la
Ia.
En una realización preferida, la secuencia de
adhesina se fusiona al extremo N-terminal del
dominio Fc de la inmunoglobulina G (IgG_{1}). Es posible fusionar
en su totalidad la región constante de la cadena pesada. No
obstante, más preferiblemente, se usa en la fusión una secuencia que
empieza en la región bisagra, justo cadena arriba del sitio de corte
con papaína que define químicamente la Fc de la IgG (es decir, el
residuos 216, considerando que el primer residuo de la región
constante de la cadena pesada es el 114), o sitios análogos de otras
inmunoglobulinas. En una realización particularmente preferida, la
secuencia de aminoácidos de la adhesina se fusiona a (a) la región
bisagra y a los dominios C_{H}2 y C_{H}3 o (b) a los dominios
C_{H}1, bisagra, C_{H}2 y C_{H}3, de una cadena pesada de
IgG_{1}, IgG_{2}, o IgG_{3}. El sitio preciso
en el que se realiza la fusión no es crítico, y el sitio óptimo puede determinarse mediante experimentación de rutina.
en el que se realiza la fusión no es crítico, y el sitio óptimo puede determinarse mediante experimentación de rutina.
Para las inmunoadhesinas biespecíficas, las
inmunoadhesinas se ensamblan como multímeros y, particularmente,
como heterodímeros o heterotetrámeros. Generalmente, estas
inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras unidad conocidas.
Una unidad estructural básica de cuatro cadenas es la forma en que
las IgG, IgD, e IgE existen. Una unidad de cuatro cadenas se repite
en las inmunoglobulinas de peso molecular más elevado; la IgM
generalmente existe como un pentámero de cuatro unidades básicas
mantenidas juntas mediante enlaces disulfuro. La globulina IgA, y
ocasionalmente la globulina IgG, podrían existir también en forma
multimérica en el suero. En el caso del multímero, cada una de las
cuatro unidades podría ser la misma o diferente.
Más abajo se representan esquemáticamente varias
inmunoadhesinas ensambladas ilustrativas dentro del ámbito de
ésta:
- (a)
- AC_{L}-AC_{L};
- (b)
- AC_{H}-[AC_{H}, AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}];
- (c)
- AC_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, V_{L}C_{L}-AC_{H}, o V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}];
- (d)
- AC_{L}-V_{H}C_{H}-[AC_{H}, o AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}];
- (e)
- V_{L}C_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}]; y
- (f)
- [A-Y]_{n}-[V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}]_{2},
en
donde,
- cada A representa secuencias de aminoácidos de adhesinas idénticas o diferentes;
- V_{L} es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina;
- V_{H} es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina;
- C_{L} es un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina;
- C_{H} es un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina;
- n es un entero mayor que 1;
- Y designa el residuo de un agente entrecruzador covalente.
En interés de la brevedad, las estructuras
anteriores sólo muestran características clave; y no indican el
dominio de unión (J) u otros dominios de las inmunoglobulinas, ni se
muestran los enlaces disulfuro. Sin embargo, cuando tales dominios
son necesarios para la actividad de unión, debería construirse para
que estén presentes en las ubicaciones ordinarias que ocupan en las
moléculas de inmunoglobulina.
Alternativamente, las secuencias de adhesina
pueden insertarse entre secuencias de la cadena pesada de
inmunoglobulina y de la cadena ligera, de tal forma que se obtenga
una inmunoglobulina que comprende una cadena pesada quimérica. En
esta realización, las secuencias de adhesina se fusionan al extremo
3' de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de una
inmunoglobulina, bien entre la bisagra y el dominio C_{H}2, o
entre los dominios C_{H}2 y C_{H}3. Construcciones similares han
sido descritas por Hoogenboom, et al., Mol. Immunol.,
28:1027-1037
(1991).
(1991).
Una cadena ligera de inmunoglobulina podría estar
presente, bien asociada covalentemente con un polipéptido de fusión
de adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina, o
fusionada directamente a la adhesina. En el primer caso, el ADN que
codifica una cadena ligera de inmunoglobulina se expresa típicamente
con el ADN que codifica la proteína de fusión
adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina. A partir
de la secreción, la cadena pesada hídrida y la cadena ligera se
asociarán covalentemente para proporcionar una estructura similar a
inmunoglobulina que comprende dos pares de cadena
pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidos. Los
procedimientos apropiados para la preparación de tales estructuras
se descubren, por ejemplo, en la patente estadounidense nº
4.816.567, concedida el 28 de marzo de 1989.
En una realización preferida, las secuencias de
inmunoglobulina usadas en la construcción de las inmunoadhesinas de
la presente invención proceden de un dominio constante de cadena
pesada de inmunoglobulina. Para las inmunoadhesinas humanas, se
prefiere el uso de secuencias de inmunoglobulinas humanas IgG_{1}
e IgG_{3}. Una ventaja principal de usar la IgG_{1} es que las
inmunoadhesinas de IgG_{1} pueden purificarse eficientemente sobre
Proteína A inmovilizada. Por contra, la purificación de la IgG_{3}
requiere Proteína G, un medio significativamente menos versátil. Sin
embargo, deberían considerarse otras propiedades estructurales y
funcionales de las inmunoglobulinas cuando se escogen la pareja de
fusión de la Ig para una construcción de inmunoadhesina determinada.
Por ejemplo, la bisagra de IgG_{3} es más larga y flexible, de
forma que puede acomodar dominios "adhesina" mayores que
podrían no plegarse o funcionar correctamente cuando se fusionan a
IgG_{1}. Otra consideración podría ser la valencia; las
inmunoadhesinas de IgG son homodímeros bivalentes, mientras que los
subtipos de Ig como la IgA e IgM podrían dar lugar respectivamente a
estructuras diméricas o pentaméricas, de la unidad de homodímero de
Ig básica. Para las inmunoadhesinas diseñadas para una aplicación
in vivo, las propiedades farmacocinéticas y las funciones
efectoras especificadas por la región Fc son también importantes.
Aunque la IgG_{1}, IgG_{2} e IgG_{4} tiene todas vidas medias
de 21 días, sus potencias relativas para activar el sistema de
complemento son diferentes. La IgG_{4} no activa el complemento, y
la IgG_{2} es significativamente más débil en la activación del
complemento que la IgG_{1}. Más aún, a diferencia de la IgG_{1},
la IgG_{2} no se une a receptores Fc sobre células monoclonales o
neutrófilos. Mientras que la IgG_{3} es óptima para la activación
del complemento, su vida media in vivo es aproximadamente una
tercera parte de la de los otros isotipos de IgG. Otra consideración
importante, para las inmunoadhesinas diseñadas para usarse como
compuestos terapéuticos humanos, es el número de variantes
alotípicas del isotipo concreto. En general, se prefieren los
isotipos de IgG con menos alotipos definidos serológicamente. Por
ejemplo, la IgG_{1} sólo tiene cuatro sitios alotípicos definidos
serológicamente, dos de los cuales (G1m y 2) se localizan en la
región Fc; y uno de estos sitios, G1m1, no es inmunogénico. Por
contra, hay 12 alotipos definidos serológicamente en IgG3, todos los
cuales están en la región Fc; sólo tres de estos sitios (G3 m5, 11 y
21) tienen un alotipo que no es inmunogénico. Por tanto, la
inmunogenicidad potencial de una inmunoadhesina de \gamma3 es
mayor que la de una inmunoadhesina de \gamma1.
Las inmunoadhesinas se construyen de forma más
conveniente fusionando la secuencia de ADNc que codifica la porción
adhesina en pauta con una secuencia de ADNc de Ig. No obstante,
también puede usarse la fusión con fragmentos de Ig genómicos (ver,
por ejemplo, Gascoigne et al., supra; Aruffo et
al., Cell, 61:1303-1313 (1990); y
Stamenkovic et al., Cell, 66:1133-1144
(1991)). El último tipo de fusión requiere la presencia de
secuencias reguladoras de la Ig para la expresión. Los ADNc que
codifican regiones constantes de cadena pesada pueden aislarse en
base a secuencia publicadas procedentes de bibliotecas de ADNc
derivadas de bazo o de linfocitos de sangre periférico, mediante
técnicas de hibridación o de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Los ADNc que codifican la "adhesina" y las partes de Ig
de la inmunoadhesina se insertan en tándem dentro de un vector
plasmídico que dirige la expresión eficiente en las células huésped
escogidas.
Como primer paso para seleccionar residuos
originales para formar la protuberancia y/o cavidad, se obtiene la
estructura tridimensional del heteromultímero usando técnicas que
son bien conocidas en la técnica, tales como la cristalografía de
rayos X o la RMN. En base a la estructura tridimensional, aquéllos
especialistas en el campo serán capaces de identificar los residuos
de la interfaz.
La interfaz preferida es el dominio C_{H}3 de
un dominio constante de inmunoglobulina. Los residuos de la interfaz
de los dominios C_{H}3 de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM han sido
identificados (ver, por ejemplo, la PCT/US96/01598, incorporada en
ésta por referencia en su totalidad), incluyendo aquellos que son
óptimos para remplazar con residuos importados; como se
identificaron los residuos de la interfaz de varios subtipos de la
IgG y los residuos "enterrados". La base para manipular la
interfaz de C_{H}3 es que la cristalografía de rayos X ha
demostrado que la asociación intermolecular entre las cadenas
pesadas de la IgG_{1} humana en la región Fc incluye la extensa
interacción proteína/proteína entre dominios C_{H}3, mientras que
los dominios C_{H}2 interaccionan a través de sus carbohidratos
(Deisenhofer, Biochem. 20:2361-2370 (1981)).
Además, hay dos enlaces disulfuro entre cadenas pesadas que se
forman eficientemente durante la expresión del anticuerpo en células
de mamífero, a menos que se trunque la cadena pesada para suprimir
los dominios C_{H}2 y C_{H}3 domains (King et al.,
Biochem. J., 281:317 (1992)). Por tanto, el ensamblaje de la
cadena pesada parece promover la formación de enlaces disulfuro en
vez de lo contrario Considerados en conjunto, estos datos
estructurales y funcionales condujeron a la hipótesis de que la
asociación de la cadena pesada del anticuerpo está dirigida por los
dominios C_{H}3. Se especuló además, que la interfaz entre
dominios C_{H}3 podría manipularse para promover la formación de
heteromultímeros de diferentes cadenas pesada y perjudicar el
ensamblaje de los correspondientes homomultímeros. Los experimentos
descritos en ésta demostraron que era posible promover la formación
de heteromultímeros respecto los homomultímeros usando esta
estrategia. Por tanto, es posible generar un polipéptido de fusión,
que comprende un polipéptido de interés y el dominio C_{H}3 de un
anticuerpo, para formar un primer o segundo polipéptido. El dominio
C_{H}3 preferido se deriva de un anticuerpo IgG, tal como una
IgG_{1} humana.
Aquellos residuos de la interfaz que pueden
constituir potencialmente candidatos para la formación de
protuberancia o cavidad se identifican. Es preferible seleccionar
residuos "enterrados" para la sustitución. Para determinar si
un residuo está enterrado, puede usarse el programa de accesibilidad
a la superficie de Lee et al., J. Mol. Biol.,
55:379-400 (1971) para calcular la accesibilidad al
solvente (SA) de los residuos en la interfaz. Entonces, el SA para
los residuos de cada uno de los polipéptidos primero y segundo puede
calcularse por separado después de retirar el otro polipéptido. La
diferencia en SA de cada residuo entre las formas monómero y dímero
de la interfaz puede calcularse entonces usando la ecuación: SA
(dímero)-SA (monómero). Esta proporciona una lista
de residuos que pierden SA con la formación del dímero. El SA de
cada residuo en el dímero se compara con el SA teórico del mismo
aminoácido en el tripéptido
Gly-X-Gly, en donde X es el
aminoácido de interés (Rose et al., Science,
229:834-838 (1985)). Los residuos que (a) pierden SA
en el dímero en comparación con el monómero y (b) tienen un SA menor
del 26% de aquél en su correspondiente tripéptido se consideran como
residuos de la interfaz. Podrían definirse dos categorías: aquéllos
que tienen un SA < 10% en comparación con su correspondiente
tripéptido (es decir, los "enterrados"), y aquéllos que tienen
25% > SA > 10% en comparación con su correspondiente
tripéptido (es decir, los "parcialmente enterrados") (ver la
Tabla 1 siguiente).
Pérdida de SA del monómero \rightarrow dímero | % del tripéptido | |||
Residuo nº ^{+} | Polipéptido A | Polipéptido B | Polipéptido A | Polipéptido B |
Q347 | 22,1 | 31,0 | 25,0 | 26,5 |
Y349 | 79,8 | 83,9 | 5,2 | 5,7 |
L351 | 67,4 | 77,7 | 3,9 | 2,0 |
S354 | 53,4 | 52,8 | 11,3 | 11,7 |
E357 | 43,7 | 45,3 | 0,4 | 1,3 |
S364 | 21,5 | 15,1 | 0,5 | 1,4 |
T366 | 29,3 | 25,8 | 0,0 | 0,1 |
L368 | 25,5 | 29,7 | 1,0 | 1,1 |
K370 | 55,8 | 62,3 | 11,5 | 11,0 |
T394 | 64,0 | 58,5 | 0,6 | 1,4 |
V397 | 50,3 | 49,5 | 13,2 | 11,0 |
D399 | 39,7 | 33,7 | 5,7 | 5,7 |
F405 | 53,7 | 52,1 | 0,0 | 0,0 |
Y407 | 89,1 | 90,3 | 0,0 | 0,0 |
K409 | 86,8 | 92,3 | 0,7 | 0,6 |
T411 | 4,3 | 7,5 | 12,7 | 9,8 |
^{+} numeración del residuo como en la estructura del cristal de IgG (Deisenhofer, Biochemistry, 20:2361-2370 (1981)). |
El efecto de remplazar residuos en la estructura
de la cadena del polipéptido puede estudiarse usando un programa de
modelado gráfico molecular tal como el program a Insights (Biosym
Technologies). Usando el programa, aquéllos residuos enterrados en
la interfaz del primer polipéptido que tienen un volumen de cadena
lateral pequeño pueden cambiarse, por ejemplo, por residuos que
tienen un volumen de cadena lateral mayor (es decir, protuberancia).
A continuación, los residuos en la interfaz del segundo polipéptido
que están en la proximidad de la protuberancia se examinan para
hallar un residuo apropiado para formar la cavidad. Normalmente,
este residuo tendrá un volumen elevado de cadena lateral y se
sustituye con un residuo que tiene un volumen de cadena lateral
menor. En ciertas realizaciones, el examen de la estructura
tridimensional de la interfaz revelará una protuberancia
convenientemente ubicada y dimensionada sobre la interfaz del primer
polipéptido o una cavidad sobre la superficie del segundo
polipéptido. En estos casos, sólo es necesario modelar un único
mutante, es decir, con una protuberancia o cavidad introducida
sintéticamente.
Con respecto a seleccionar residuos originales
potenciales para la sustitución cuando el primero y segundo
polipéptidos comprenden cada uno un dominio C_{H}3, la interfaz
C_{H}3/C_{H}3 de la IgG_{1} humana implica dieciséis residuos
en cada dominio, ubicados en cuatro hebras-\beta
antiparalelas, las cuales entierran 1090 angstroms^{2} de cada
superficie (Deisenhofer, supra) y Miller, J., Mol.
Biol., 216:965 (1990)). Las mutaciones se dirigen
preferiblemente a residuos localizados sobre las dos
hojas-\beta antiparalelas centrales. El objetivo
es minimizar el riesgo de que las protuberancias que se crean puedan
acomodarse metiéndose dentro del solvente que las rodea en vez de
mediante cavidades compensatorias en el dominio C_{H}3 pareja.
Una vez los residuos original/importado se han
identificado mediante modelado molecular, se introducen las
sustituciones de aminoácidos en el polipéptido usando técnicas bien
conocidas en el campo. Normalmente el ADN que codifica el
polipéptido se manipula genéticamente usando las técnicas descritas
en Mutagenesis: a Practical Approach, supra.
La mutagénesis mediada por oligonucleótido es un
procedimiento preferido para preparar variantes por sustitución del
ADN que codifica el primer y segundo polipéptidos. Esta técnica es
bien conocida en el campo, tal como fue descrita por Adelman et
al., DNA, 2:183 (1983). De forma resumida, se altera el
ADN de un primer y segundo polipéptidos mediante la hibridación de
un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con una
plantilla de ADN, en donde la plantilla es la forma de hebra
sencilla de un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia de
ADN nativa o inalterada del heteromultímero. Después de la
hibridación, se usa una polimerasa de ADN para sintetizar una
segunda hebra entera complementaria de la plantilla, la cual
incorporará de ese modo el cebador oligonucleótido, y codificará la
alteración seleccionada en el ADN del heteromultímero.
La mutagénesis en casete puede realizarse tal
como describieron Wells et al., Gene, 34:315 (1985),
sustituyendo una región del ADN de interés con un fragmento mutante
sintético generado mediante hibridación de oligonucleótidos
complementarios. La mutagénesis mediante PCR es también apropiada
para construir variantes del ADN del primer y segundo polipéptido.
Mientras que la discusión siguiente se refiere al ADN, se entenderá
que la técnica halla uso también con el ARN. La técnica de la PCR
generalmente se refiere al procedimiento siguiente (ver Erlich,
Science, 252:1643-1650 (1991), el capítulo
por R. Higuchi, pp. 61-70).
Esta invención también abarca, además de las
mutaciones para protuberancia o cavidad, las variantes de secuencia
de aminoácido del heteromultímero, las cuales pueden prepararse
introduciendo los cambios de nucleótido apropiados en el ADN del
heteromultímero, o mediante la síntesis del polipéptido de
heteromultímero deseado. Tales variantes incluyen, por ejemplo, las
supresiones, o las inserciones o sustituciones de residuos dentro de
las secuencias de aminoácido de los polipéptidos primero y segundo
que forman el heteromultímero. Se hace cualquier combinación de
supresión, inserción, y sustitución para llegar a la construcción
final, a condición de que la construcción final posea las
características de unión de antígeno deseadas. Los cambios de
aminoácidos podrían alterar también los procesos
post-traducción del heteromultímero, tal como
cambiar el número o posición de los sitios de
glicosilación.
glicosilación.
Un procedimiento útil para la identificación de
ciertos residuos o regiones de los polipéptidos del heteromultímero
que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina
"mutagénesis de barrido con alanina", tal como la describieron
Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085
(1989). En ésta, se identifica un residuo, o grupo de residuos,
diana (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys,
y glu) y se remplazan con aminoácidos neutros o cargados
negativamente (más preferiblemente con alanina o polialanina) para
afectar la interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso que
los rodea dentro o fuera de la célula. Aquellos dominios que
demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinen a
continuación introduciendo variantes adicionales o distintas en o
para los sitios de sustitución. Por tanto, mientras que el sitio
para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos está
predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no tiene
porque estar
predeterminada.
predeterminada.
Normalmente las mutaciones implicarán
sustituciones conversadoras de aminoácidos en las regiones no
funcionales del heteromultímero. Las mutaciones de ejemplo se
muestran en la Tabla 2.
Residuo original | Sustituciones de ejemplo | Sustituciones preferidas |
Ala (A) | Val; Leu; Ile | Val |
Arg (R) | Lys; Gln; Asn | Lys |
Asn (N) | Gln; His; Lys; Arg | Gln |
Asp (D) | Glu | Glu |
Cys (C) | Ser | Ser |
Gln (Q) | Asn | Asn |
Glu (E) | Asp | Asp |
Gly (G) | Pro; Ala | Ala |
His (H) | Asn; Gln; Lys; Arg | Arg |
Ile (I) | Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina | Leu |
Leu (L) | Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe | Ile |
Lys (K) | Arg; Gln; Asn | Arg |
Met (M) | Leu; Phe; Ile | Leu |
Phe (F) | Leu; Val; Ile; Ala; Tyr | Leu |
Pro (P) | Ala | Ala |
Ser (S) | Thr | Thr |
Thr (T) | Ser | Ser |
Trp (W) | Tyr; Phe | Tyr |
Tyr (Y) | Trp; Phe; Thr; Ser | Phe |
Val (V) | Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina | Leu |
Las modificaciones covalentes de los polipéptidos
heteromultímeros se hallan dentro del ámbito de esta invención. Las
modificaciones covalentes del heteromultímero pueden introducirse en
la molécula haciendo reaccionar determinados residuos aminoácidos
del heteromultímero o de fragmentos del mismo con un agente orgánico
derivatizador que es capaz de reaccionar con cadenas laterales
seleccionadas o los residuos N- o C-terminales. Otro
tipo de modificación covalente del polipéptido heteromultímero
incluida dentro del ámbito de esta invención comprende alterar el
patrón de glicosilación nativo del polipéptido. Por alterar se
quiere significar suprimir uno o más grupos carbohidrato hallados en
el heteromultímero original, y/o añadir uno o más sitios de
glicosilación que no están presentes en el heteromultímero original.
La adición de sitios de glicosilación al polipéptido heteromultímero
es consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos
de tal forma que contenga uno o más sitios de glicosilación unidos a
N. La alteración podría hacerse también mediante la adición de, o
sustitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia
del heteromultímero original (para sitios de glicosilación unidos a
O). Por facilidad, la secuencia de aminoácidos del heteromultímero
se altera preferiblemente a través de cambios a nivel del ADN,
particularmente mediante mutación del ADN que codifica el
polipéptido heteromultímero en bases preseleccionadas, de tal forma
que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos
deseados. Otros medios para incrementar el número de grupos
carbohidratos en el polipéptido heteromultímero es mediante el
acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido.
Estos procedimientos se describen en WO-87/05330,
publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC
Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981). La
supresión de grupos carbohidrato presentes sobre el heteromultímero
podría conseguirse química o enzimáticamente.
Otro tipo de modificación covalente del
heteromultímero comprende enlazar el polipéptido de heteromultímero
a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo,
polietilenglicol, polipropilenglicol, o poloxialquilenos, en la
manera detallada en las patentes estadounidenses nº 4.640.835;
4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.
Puesto que a menudo es difícil predecir por
adelantado las características de un heteromultímero variante, se
apreciará que será necesario cierto examen de la variante recuperada
para seleccionar la variante óptima.
A continuación de la mutación del ADN y de la
selección de la cadena ligera común tal como se describe en ésta, el
ADN que codifica las moléculas se expresa usando técnicas
recombinantes, las cuales están ampliamente disponibles en el campo.
A menudo, el sistema de expresión escogido implicará un vector de
expresión y huésped de célula de mamífero, de forma que el
heteromultímero sea convenientemente glicosilado (por ejemplo, en el
caso de heteromultímeros que comprenden dominios de anticuerpo que
están glicosilados). Sin embargo, las moléculas pueden también
producirse en los sistemas de expresión procariotas elaborados más
abajo. Normalmente, la célula huésped se transformará con ADN que
codifica ambos, el primer polipéptido, el segundo polipéptido, el
polipéptido de la cadena ligera común, y otro(s)
polipéptido(s) requerido(s) para formar el
heteromultímero, en un único vector o en vectores independientes.
Sin embargo, es posible expresar el primer polipéptido, el segundo
polipéptido, y el polipéptido de la cadena ligera común (los
componentes del heteromultímero) en sistemas de expresión
independientes y acoplar in vitro los polipéptidos
expresados.
Los ácidos nucleicos (por ejemplo, el ADNc o ADN
genómico) que codifican el heteromultímero y la cadena ligera común
se insertan dentro de un vector replicable para su clonación
adicional (amplificación del ADN) o para su expresión. Hay muchos
vectores disponibles. Los componentes del vector incluyen
generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una
secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes
marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de
terminación de la transcripción.
Los polipéptidos de los componentes del
heteromultímero podrían producirse como polipéptidos de fusión con
una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte
específico en el extremo N-terminal de la proteína o
polipéptido maduro. En general, la secuencia señal podría ser un
componente del vector, o podría ser parte del ADN que se inserta en
el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada
preferiblemente es una que es reconocida y procesada (es decir,
cortada por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para las
células huéspedes procariotas, la secuencia señal podría sustituirse
por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del
grupo de líderes de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o
enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la
secuencia señal nativa podría sustituirse por, por ejemplo, el líder
de la invertasa de levadura, el líder del factor alfa (incluyendo
los líderes de los factores alfa de Saccharomyces y
Kluyveromyces, éste último descrito en la patente
estadounidense nº 5.010.182 concedida el 23 de abril de 1991), o el
líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C.
albicans (EP-362.179, publicada el 4 de abril de
1990), o la señal descrita en WO-90/13646, publicada
el 15 de noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero
la secuencia señal nativa (por ejemplo, la
pre-secuencia del anticuerpo o adhesina que
normalmente dirige la secreción de estas moléculas a partir de
células humanas in vivo) es satisfactoria, aunque podrían ser
apropiadas otras secuencias de señal humanas así como las líderes
secretoras virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simplex. El
ADN para tal región precursora se liga en pauta al ADN que codifica
los polipéptidos que forman el heteromultímero.
Ambos, los vectores de expresión y clonación
contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector
replicarse en una o más células huéspedes seleccionadas.
Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es una que
permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico
del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias que se
replican autónomamente. Tales secuencias son bien conocidas para una
variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación
del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de las bacterias
Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es
apropiado para levaduras, y varios orígenes virales (SV40, polioma,
adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en
células de mamífero. Generalmente, el componente origen de
replicación no es necesario para los vectores de expresión de
mamíferos (el origen del SV40 podría usarse habitualmente sólo
porque contiene el promotor temprano).
Los vectores de expresión y clonación deberían
contener un gen de selección, también denominado marcador
seleccionable. Los genes de selección típico codifican proteínas que
(a) confieren resistencia respecto antibióticos u otras toxinas, por
ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b)
complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes
críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que
codifica la racemasa de D-alanina para
Bacilli. Un ejemplo de esquema de selección utiliza una droga
para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas célula
que son transformadas exitosamente con un gen heterólogo producen
una proteína que confiere resistencia a la droga y, por tanto,
sobreviven el régimen de selección. Los ejemplos de tal selección
dominante usan las drogas neomicina (Southern et al., J.
Molec. Appl. Genet., 1:327 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan
et al., Science, 209:1422 (1980)) o higromicina
(Sugden et al., Mol. Cell. Biol.,
5:410-413 (1985)). Los tres ejemplos proporcionados
más arriba emplean genes bacterianos bajo control eucariota para
conferir resistencia a la droga apropiada, respectivamente, G418 o
neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o
higromicina.
Otro ejemplo de marcadores seleccionables
apropiados para las células de mamífero son aquellos que permiten la
identificación de células competentes para captar el ácido nucleico
del heteromultímero, tales como el DHFR o la quinasa de timidina.
Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión de
selección que sólo los transformantes están adaptados para
sobrevivir gracias a haber captado el marcador. La presión de
selección se impone cultivando los transformantes en condiciones en
las que la concentración del agente de selección en el medio se
cambia sucesivamente, conduciendo de ese modo a la amplificación de
ambos, el gen de selección y el ADN que codifica el heteromultímero.
Se sintetizan cantidades crecientes de heteromultímero a partir del
ADN amplificado. Otros ejemplos de genes amplificables incluyen los
de la metalotioneína-I y -II, preferiblemente los
genes de metalotioneína de primate, de la desaminasa de adenosina,
de las descarboxilasa de ornitina, etc.
Por ejemplo, las células transformadas con el gen
de selección de la DHFR se identifican primero cultivando todos los
transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato
(Mtx), un antagonista competitivo de la DHFR. Una célula huésped
apropiada cuando se emplea la DHFR del tipo salvaje es la línea
celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad
DHFR, preparada y propagada tal como describieron Urlaub y Chasin,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Las células
transformadas se exponen a continuación a niveles incrementados de
metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen
de la DHFR y, de forma concomitante, a múltiples copias de otro ADN
comprendido en los vectores de expresión, tal como el ADN que
codifica los componentes del heteromultímero. Esta técnica de
amplificación puede usarse con cualquier huésped de otro modo
apropiado, por ejemplo, la CHO-K1 ATCC nº CCL61, a
pesar de la presencia de DHFR endógena, si, por ejemplo, se emplea
un gen mutante de la DHFR que es altamente resistente al Mtx
(EP-117.060).
Alternativamente, las células huéspedes
(particularmente huéspedes del tipo salvaje que contienen DHFR
endógena) transformadas con secuencias de ADN que codifican el
heteromultímero, la proteína DHFR del tipo salvaje, y otro marcador
seleccionable tal como la fosfotransferasa 3' de aminoglicósido
(APH), pueden seleccionarse mediante cultivo celular en medio que
contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal
como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, la kanamicina,
neomicina, o G418. Ver la patente estadounidense nº 4.965.199.
Un gen de selección apropiado para su uso en
levadura es el gen trp1 presente en el plásmido YRp7 de
levadura (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979);
Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); o Tschemper et
al., Gene, 10:157 (1980)). El gen trp1 proporciona
un marcador seleccionable para una cepa mutante de levadura que
carezca de la capacidad de crecer en triptófano, en, por ejemplo, la
ATCC nº 44076 o en PEP4-1 (Jones, Genetics,
85:12 (1977)). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de
la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno
efectivo para detectar la transformación mediante cultivo en
ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura
deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 ó 38.626) son complementadas
por plásmidos conocidos portadores del gen Leu2.
Además, los vectores derivados del plásmido
circular pKD1 de 1,6 \mum pueden usarse para la transformación de
levaduras Kluyveromyces. Bianchi et al., Curr.
Genet. 12:185 (1987). Más recientemente, se informó sobre un
sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina
recombinante de ternera para K. lactis. Van den Berg,
Bio/Technology, 8:135 (1990). También se han descubierto
vectores de expresión multi-copia estables para la
secreción de albúmina de suero humana recombinante madura mediante
cepas industriales de Kluyveromyces (Fleer et al.,
Bio/Technology, 9:968-975 (1991)).
Los vectores de clonación y expresión usualmente
contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y
está unido operativamente al ácido nucleico del heteromultímero. Son
bien conocidos un gran número de promotores reconocidos por una
variedad de células huéspedes potenciales. Estos promotores se unen
operativamente al ADN que codifica el heteromultímero retirando el
promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de
restricción e insertando la secuencia el promotor aislado en el
vector.
Los promotores apropiados para su uso con
huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de la
\beta-lactamasa y lactosa (Chang et al.,
Nature, 275:615 (1978); y Goeddel et al.,
Nature, 281:544 (1979)), de la fosfatasa alcalina, un sistema
promotor del triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res.,
8:4057 (1980) y la EP-36.776), y promotores híbridos
tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). No obstante,
otros promotores bacterianos conocidos son apropiados. Sus
secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo, de ese
modo, que un especialista capacitado la una operativamente al ADN
que codifica el heteromultímero (Siebenlist et al.,
Cell, 20:269 (1980)) usando eslabones o adaptadores para
proporcionar cualesquier sitios de restricción requeridos. Los
promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una
secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida
operativamente al ADN que codifica el heteromultímero.
Las secuencias promotoras son conocidas para las
eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una
región rica en AT ubicada aproximadamente 25 bases cadena arriba del
sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia hallada
70 a 80 bases cadena arriba respecto el inicio de la transcripción
de muchos genes es una región CXCAAT, en donde X podría ser
cualquier nucleótidos. En el extremo 3' de la mayoría de los genes
eucariotas hay una secuencia AATAAA que podría ser la señal para la
adición de la cola poli-A al extremo 3' de la
secuencia codificante. La totalidad de estas secuencias se insertan
convenientemente en vectores de expresión en eucariotas.
Los ejemplos de secuencias promotoras apropiadas
para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para
la quinasa del 3-fosfoglicerato (Hitzeman et
al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) u otros enzimas
glicolíticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149
(1968); y Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), tales como
la enolasa, deshidrogenasa del
gliceraldehído-3-fosfato, la
hexoquinasa, la descarboxilasa del piruvato, la fosfofructoquinasa,
la isomerasa de la
glucosa-6-fosfato, la mutasa del
3-fosfoglicerato, la quinasa del piruvato, la
isomerasa de la triosafosfato, la isomerasa de la fosfoglucosa, y la
glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, los cuales son
promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una
transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son las
regiones promotoras de la deshidrogenasa 2 de alcohol, del
isocitocromo C, de la fosfatasa ácida, de los enzimas degradantes
asociados con el metabolismo del nitrógeno, de la metalotioneína, de
la deshidrogenasa del
gliceraldehído-3-fosfato, y de los
enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa.
Los vectores y promotores apropiados para su uso en la expresión en
levadura se describen adicionalmente en Hitzeman et al.,
EP-73.657A. Los potenciadores de levadura se usan
también ventajosamente con promotores de levadura.
La transcripción del heteromultímero a partir de
vectores de células huéspedes de mamíferos se controla, por ejemplo,
mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el
virus del polioma, el virus de la viruela aviar
(UK-2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), el
adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino,
el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el
virus de la hepatitis-B, y lo más preferiblemente el
virus 40 de simios (SV40), de los promotores heterólogos de
mamíferos, por ejemplo, el promotor de la activa o un promotor de
inmunoglobulina, o de los promotores del choque térmico.
Los promotores temprano y tardío de los virus
SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción
del SV40 que también contiene el origen de replicación viral del
SV40. Fiers et al., Nature, 273:113 (1978); Mulligan y
Berg, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakis
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
78:7398-7402 (1981). El promotor temprano inmediato
del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un
fragmento de restricción de HindIII E. Greenaway et
al., Gene, 18:355-360 (1982). Un sistema
para la expresión de ADN en huéspedes de mamífero usando el virus
del papiloma bovino como un vector se descubre en la patente
estadounidense nº 4.419.446. Una modificación de este sistema se
descubre en la patente estadounidense nº 4.601.978. Ver también Gray
et al., Nature, 295:503-508 (1982)
sobre la expresión de ADNc que codifica el interferón inmune en
células de mono; Reyes et al., Nature,
297:598-601 (1982) sobre la expresión del ADNc del
interferón-\beta humano en células de ratón bajo
el control de un promotor de la quinasa de timidina del virus herpes
simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
79:5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen del
interferón-\beta1 humano en células cultivadas de
ratón y conejo; y Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 79:6777-6781 (1982) sobre la expresión de
secuencias CAT bacterianas en células renales de mono
CV-1, fibroblastos embrionarios de pollo, células
ováricas de hámster chino, células HeLa, y célula
NIH-3T3 de ratón, usando como promotor la repetición
terminal larga del virus del sarcoma de Rous.
La transcripción de ADN que codifica los
componentes del heteromultímero por parte de eucariotas superiores
se incrementa a menudo insertando una secuencia potenciadora en el
vector. Los potenciadores son relativamente independientes de la
orientación y posición, habiéndose hallado 5' (Laimins et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 (1981)) y 3'
(Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3:1108 (1983)) respecto
la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji et
al., Cell, 33:729 (1983)), así como dentro de la propia
secuencia codificante (Osborne et al., Mol. Cell Bio.,
4:1293 (1984)). Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras
procedentes de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina,
\alpha-fetoproteína, e insulina). Sin embargo,
típicamente, se usará un potenciador procedente de un virus de
célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en
el lado tardío del origen de replicación (p.b.
100-270), el potenciador del promotor temprano del
citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del
origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus. Ver
también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) sobre
elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas.
El potenciador podría empalmarse en el vector en una posición 5' ó
3' respecto la secuencia codificante del heteromultímero, pero se
ubica preferiblemente en un sitio 5' respecto el promotor.
Los vectores de expresión usado en células
huéspedes eucariotas (de levaduras, hongos, insectos, plantas,
animales, humanas, o células nucleadas procedentes de otros
organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias
para la terminación de la transcripción y para la estabilización del
ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles de las regiones
no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o
virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos
transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no
traducida del ARNm que codifica el heteromultímero.
La construcción de vectores apropiados, que
contienen uno o más de los componentes listados más arriba, emplea
técnicas de ligación estándares. Los plásmidos o fragmentos de ADN
aislados se cortan, ajustan, y religan en la forma deseada para
generar los plásmidos requeridos.
Para el análisis para confirmar las secuencias
correctas en los plásmidos construidos, se usan las mezclas de
ligación para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC nº
31.446), y los transformantes exitosos se seleccionan mediante
resistencia a la ampicilina o tetraciclina según sea apropiado. Los
plásmidos procedentes de los transformantes se preparan, analizan
mediante digestión con endonucleasa de restricción, y/o se
secuencian mediante el procedimiento de Messing et al.,
Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) o mediante el procedimiento
de Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499
(1980).
Particularmente útiles en la práctica de esta
invención son los vectores de expresión que proporcionan la
expresión transitoria en células de mamífero del ADN que codifica el
heteromultímero. En general, la expresión transitoria implica el uso
de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente
en una célula huésped, de tal forma que la célula huésped acumula
muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles
elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de
expresión. Sambrook et al., supra, pp.
16.17-16.22. Los sistemas de expresión transitoria,
que comprenden un vector de expresión apropiado y una célula
huésped, permiten la identificación positiva conveniente de
polipéptidos codificados por los ADN clonados, así como el examen
rápido de los heteromultímeros que tienen las
especificidades/afinidades deseadas, o las características de
migración en gel deseadas en relación a los heteromultímeros u
homomultímeros que carecen de los enlaces disulfuro no naturales
generados de acuerdo con la presente invención.
Otros procedimientos, vectores, y células
huéspedes apropiados para la adaptación a la síntesis del
heteromultímero en cultivo de células de vertebrado recombinantes se
describen en Gething et al., Nature,
293:620-625 (1981); Mantei et al.,
Nature, 281:40-46 (1979); la
EP-117.060; y la EP-117.058. Un
plásmido particularmente útil para la expresión del heteromultímero
en cultivos de células de mamífero es el pRK5
(EP-307.247) o pSVI6B (PCT, publicación nº
WO-91/08291, publicada el 13 de junio de 1991).
La elección de la línea celular huésped para la
expresión del heteromultímero depende principalmente del vector de
expresión. Otra consideración es la cantidad de proteína que se
requiere. Las cantidades de miligramos pueden producirse a menudo
mediante transfecciones transitorias. Por ejemplo, la línea celular
embrionaria renal humana 293 transformada con el adenovirus EIA
puede transfectarse transitoriamente con vectores basados en pRJ5
mediante una modificación del procedimiento del fosfato cálcico para
permitir la expresión eficiente del heteromultímero. Los vectores
basados en CDM8 pueden usarse para transfectar células COS mediante
el procedimiento de la DEAE-dextrano (Aruffo et
al., Cell, 61:1303-1313 (1990); y
Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. (US),
9:347-353 (1990)). Si se desean cantidades de
proteína mayores, la inmunoadhesina puede expresarse después de la
transfección estable de una línea celular huésped. Por ejemplo,
puede introducirse un vector basado en pRK5 en células ováricas de
hámster chino (CHO) en presencia de un plásmido adicional que
codifica la reductasa del dihidrofolato (DHFR) y confiere
resistencia frente al G418. Los clones resistentes al G418 pueden
seleccionarse en el cultivo. Estos clones se hacen crecer en
presencia de niveles crecientes del inhibidor metotrexato de la
DHFR, y se seleccionan clones en los que el número de copias de
genes que codifican la DHFR y las secuencias del heteromultímero se
coamplifican. Si la inmunoadhesina contiene una secuencia líder
hidrofóbica en su extremo N-terminal, es probable
que sea procesada y secretada por las células transfectadas. Las
expresión de inmunoadhesinas con estructuras más complejas podría
requerir células huéspedes especialmente adaptadas. Por ejemplo, los
componentes tales como la cadena ligera o la cadena J podrían
proporcionarse mediante ciertas células huéspedes de mieloma o
hibridoma (Gascoigne et al., supra; y Martin et
al., J. Virol., 67:3561-3568 (1993)).
Otras células huéspedes apropiadas para clonar o
expresar los vectores en ésta son las células procariotas, de
levadura, u otras eucariotas superiores descritas más arriba. Las
procariotas apropiadas para este propósito incluyen las eubacterias,
tales como los organismos Gram-negativos o
Gram-positivos, por ejemplo, enterobacteriaceas
tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli,
Enterobacter, Erwinia, Klebsiella,
Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella
typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia
marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales
como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, el
B. licheniformis 41P descubierto en
DD-266.710, publicada el 12 de abril de 1989),
Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y
Streptomyces. Un huésped de clonación E. coli
preferido es la E. coli 294 (ATCC nº 31.446), aunque son
apropiadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli
X1776 (ATCC nº 31.537), y E. coli W3110 (ATCC nº 27.325).
Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes. La cepa W3110
es un huésped, o progenitor de huésped, preferido puesto que es una
cepa huésped común para las fermentaciones de productos de ADN
recombinante. Preferiblemente, la célula huésped debería secretar
cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa
W3110 podría modificarse para efectuar una mutación genética en los
genes que codifican las proteínas, los ejemplos de tales huéspedes
incluyen la cepa 27C7 de E. coli W3110. El genotipo completo
de la 27C7 es tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15
\Delta(argF-lac)169
ompT\DeltadegP41kan^{r}. La cepa 27C7 se depositó el 30 de
octubre de 1991 en la American Type Culture Collection como ATCC nº
55.244. Alternativamente, podría emplearse la cepa de E. coli
que tiene una proteasa periplásmica mutante descubierta en la
patente estadounidense nº 4.946.783 concedida el 7 de agosto de
1990. Alternativamente, son apropiados los procedimientos de
clonación, por ejemplo, la PCR u otras reacciones de polimerasa de
ácido nucleico.
Además de las procariotas, los microbios
eucariotas tal es como los hongos filamentosos o levaduras son
huéspedes de clonación o expresión apropiados para los vectores que
codifican el heteromultímero. Saccharomyces cerevisiae, o
levadura común de panadería, es el más comúnmente usado de entre los
microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, un
cierto número de otros géneros, especies y cepas están comúnmente
disponibles y son útiles en ésta, tales como Schizosaccharomyces
pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:140 (1981);
EP-139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); los
huéspedes de Kluyveromyces (patente estadounidense nº
4.943.529; Fleer et al., supra) tales como, por
ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574;
Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)), K.
fragilis (ATCC nº 12.424), K. bulgaricus (ATCC nº
16.045), K. wickeramii (ATCC nº 24.178), K. waltii
(ATCC nº 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg
et al., supra), K. thermotolerans, y K.
marxianus; yarrowia (EP-402.226);
Pichia pastoris (EP-183.070; Sreekrishna
et al., J. Basic Microbiol.,
28:265-278 (1988)); Candida; Trichoderma
reesia (EP-244.234); Neurospora crassa
(Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76:5259-5263 (1979)); Schwanniomyces tales
como Schwanniomyces occidentalis (EP-394.538
publicada el 31 de octubre de 1990); y los hongos filamentosos tales
como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium,
Tolypocladium (WO-91/00357 publicada el 10 de
enero de 1991), y huéspedes de Aspergillus tales como A.
nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et
al., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81:1470-1474 (1984)) y A. niger (Kelly y
Hynes, EMBO J. 4:475-479 (1985)).
Las células huéspedes apropiadas para la
expresión del heteromultímero glicosilado se derivan de organismos
multicelulares. Tales células huéspedes son capaces de procesado
complejo y de actividades de glicosilación. En principio, es
factible cualquier cultivo de células eucariotas superiores, proceda
de un cultivo de vertebrados o de invertebrados. Los ejemplos de
células de invertebrados incluyen las células vegetales y de
insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y
variantes, y las correspondientes células huéspedes de insecto
permisivas procedentes de huéspedes tales como Spodoptera
frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes
albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca del
vinagre), y Bombyx mori. Ver, por ejemplo, Luckow et
al., Bio/Technology, 6:47-55 (1988);
Miller et al., en Genetic Engineering, Eds. Setlow
et al., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp.
277-279; y Maeda et al., Nature,
315:592-594 (1985). Hay disponibles una variedad de
cepas virales para la transfección, por ejemplo, la variante
L-1 del NPV de Autographa californica y la
cepa Bm-5 del NPV de Bombyx mori, y tales
virus podrían usarse como los virus en ésta de acuerdo con la
presente invención, particularmente para la transfección de células
de Spodoptera frugiperda.
Los cultivos de células vegetales de algodón,
maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco pueden utilizarse como
huéspedes. Típicamente, las células vegetales se transfectan
mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria
Agrobacterium tumefaciens, las cuales se han manipulado
previamente para contener el ADN del heteromultímero. Durante la
incubación del cultivo de células vegetales con A.
tumefaciens, el ADN que codifica el heteromultímero se
transfiere a la célula planta huésped que es transfectada y, en
condiciones apropiadas, expresa el ADN del heteromultímero. Además,
hay disponibles secuencias reguladores y de señal compatibles con
las células vegetales, tales como las secuencias del promotor de la
sintasa de nopalina y la señal de poliadenilación. Depicker et
al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982). Además, los
segmentos de ADN aislados de la región cadena arriba del gen 780 del
T-ADN son capaces de activar o incrementar los
niveles de transcripción de genes expresables en plantas en tejido
vegetal que contiene ADN. EP-321.196, publicada el
21 de junio de 1989.
Los huéspedes preferidos son células de
vertebrados, y la propagación de las células de vertebrado en
cultivo (cultivo de tejidos) ha pasado a ser un procedimiento
rutinario en los últimos años (Tissue Culture, Academic
Press, editores Kruse y Patterson, (1973)). Son ejemplos de líneas
celulares de mamífero útiles la línea CV1 de riñón de mono
transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); una
línea embrionaria renal humana (células 293 o 293 subclonadas para
su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J.
Gen. Virol., 36:59 (1977)); células renales de cría de hámster
(BHK, ATCC CCL 10); células ováricas de hámster chino/-DHFR (CHO,
Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));
células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.,
23:243-251 (1980)); células renales de mono (CV1
ATCC CCL 70); células renales de mono verde africano
(VERO-76, ATCC CRL-1587); human
cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas
(MDCK, ATCC CCL 34); células hepático de hígado de rata búfalo (BRL
3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75);
células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón
(MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al.,
Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));
células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep
G2).
Las células huéspedes de transfectan con los
vectores de expresión o clonación de esta invención antes descritos,
y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea
apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o
amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
Dependiendo de la célula huésped usada, la transfección se realiza
usando técnicas estándares apropiadas para tales células. El
tratamiento con calcio que emplea cloruro cálcico, tal como se
describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., supra,
o la electroporación se usan generalmente con procariotas u otras
células que contienen barreras sustanciales en forma de pared
celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa
para transformar ciertas células vegetales, tal como describieron
Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y
WO-89/05859 publicada el 29 de junio de 1989.
Además, las plantas podrían transfectarse usando el tratamiento con
ultrasonidos tal como se describe en WO-91/00358
publicada el 10 de enero de 1991.
Para células de mamíferos sin tales paredes
celulares, se prefiere el procedimiento de la precipitación con
fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology,
52:456-457 (1978). Los aspectos generales de las
transformaciones de sistemas de células huéspedes de mamífero han
sido descritos por Axel en la patente estadounidense nº 4.399.216
concedida el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras
se realizan típicamente de acuerdo con el procedimiento de Van
Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979).
Sin embargo, también podrían usarse otros procedimientos para
introducir ADN en las células, tales como mediante microinyección
nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con
células intactas, o policationes, por ejemplo, el polibreno, la
poliornitina, etc. Ver Keown et al., Methods in
Enzymology, (1989), Keown et al., Methods in
Enzymology, 185:527-537 (1990), y Mansour et
al., Nature, 336:348-352 (1988), para
varias técnicas para transformar células de mamíferos.
Las células procariotas usadas para producir el
polipéptido heteromultímero de esta invención se cultivan en medio
apropiado tal como se describe de forma general en Sambrook et
al., supra.
Las células huéspedes de mamífero usadas para
producir el heteromultímero de esta invención podrían cultivarse en
una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente tales
como el F10 de Ham (Sigma), el medio mínimo esencial ((MEM), Sigma),
el RPMI-1640 (Sigma), y el medio de Eagle modificado
por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son apropiados para cultivar las
células huéspedes. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham
y Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes y Sato, Anal.
Biochem., 102:255 (1980), en las patentes estadounidenses nº
4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; o 4.560.655;
WO-90/03430; WO-87/00195; en la
patente estadounidense Re. 30.985; o en la patente estadounidense nº
5.122.469, los descubrimientos de todas las cuales se incorporan en
ésta por referencia, podría usarse como medio de cultivo para las
células huéspedes. Cualquiera de estos medios podría suplementarse
según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento
(tales como la insulina, transferrina, o factor de crecimiento
epidérmico), sales (tales como el cloruro sódico, calcio, magnesio,
y fosfato), tampones (tales como el HEPES), nucleósidos (tales como
la adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco
Gentamicina™), elementos traza (definidos como compuestos
inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el
rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente.
También podrían incluirse cualesquier otros suplementos en las
concentraciones apropiadas que serán conocidas por los especialistas
en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como la
temperatura, pH y similares, son aquéllas previamente usadas con la
célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes al
especialista con la formación ordinaria.
En general, los principios, protocolos, y
técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos
de células de mamífero pueden hallarse en Mammalian Cell
Biotechnology: a Practical Approach, Ed. M. Butler, IRL Press,
1991.
Las células huéspedes citadas en este
descubrimiento abarcan células en cultivo así como células que están
dentro de un animal huésped.
El heteromultímero preferiblemente se recupera de
forma general del medio de cultivo como un polipéptido secretado,
aunque también podría recuperarse de lisado de célula huésped cuando
se produce directamente sin una señal secretora. Si el
heteromultímero está unido a membrana, puede liberarse de la
membrana usando una solución detergente apropiada (por ejemplo, el
Triton-X 100).
Cuando el heteromultímero se produce en una
célula recombinante distinta de una de origen humano, está
completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano.
Sin embargo, es necesario purificar el heteromultímero de proteínas
o polipéptidos de la célula recombinante para obtener preparaciones
que son sustancialmente homogéneas como heteromultímero. Como un
primer paso, el medio de cultivo o lisado se centrifuga normalmente
para retirar restos celulares fragmentados.
Los heterodímeros que tienen dominios constantes
de anticuerpo pueden purificarse convenientemente mediante
cromatografía con hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis,
o cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la
técnica de purificación preferida. Cuando el heteromultímero
comprende un dominio C_{H}3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T.
Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras
técnicas para la purificación de proteína, tales como el
fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la
precipitación con etanol, la HPLC en fase inversa, la cromatografía
en sílice, la cromatografía en heparina-Sepharose,
la cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico
(tal como una columna de ácido poliaspártico), el cromatoenfoque, la
SDS-PAGE, y la precipitación con sulfato amónico,
están disponibles también dependiendo del polipéptido a ser
recuperado. La idoneidad de la Proteína A como un ligando de
afinidad depende de las especies e isotipo del dominio Fc de
inmunoglobulina que se usa en la quimera. La Proteína A puede usarse
para purificar inmunoadhesinas que se basan en las cadenas pesadas
\gamma1, \gamma2, o \gamma4 humanas (Lindmark et al.,
J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)). La
Proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la
\gamma3 humana (Guss et al., EMBO J.,
5:1567-1575 (1986)). La matriz a la que se une el
ligando de afinidad es habitualmente agarosa, pero hay otras
matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como
el vidrio de poro controlado o el
poli(estirendivinil)benceno permiten velocidades de
flujo más elevadas y tiempos de procesamiento más cortos que los que
pueden conseguirse con agarosa. Las condiciones para la unión de una
inmunoadhesina a la columna de afinidad de Proteína A o G están
dictadas enteramente por las características del dominio Fc; es
decir, sus especies e isotipo. Generalmente, cuando se escoge el
ligando apropiado, la unión eficiente ocurre directamente desde el
fluido de cultivo sin acondicionar. Una característica distinguida
de las inmunoadhesinas es que, para las moléculas de \gamma1
humanas, la capacidad de unión para la Proteína A está algo
disminuida en relación a un anticuerpo del mismo tipo de Fc. La
inmunoadhesina unida puede eluirse eficientemente bien a pH ácido (a
o por encima de 3,0), o en un tampón de pH neutro que contiene una
sal suavemente caotrópica. Este paso de cromatografía de afinidad
puede resultar en una preparación de heterodímero que es >95%
pura.
Se contemplan muchas aplicaciones terapéuticas
para el heteromultímero. Por ejemplo, el heteromultímero puede
usarse para la citotoxicidad redirigida (por ejemplo, para matar
células tumorales), como un adyuvante de vacuna, para suministrar
agentes trombolíticos a los coágulos, para convertir prodrogas
activadas por enzimas en un sitio diana (por ejemplo, un tumor),
para tratar enfermedades infecciosas, para apuntar complejos inmunes
hacia receptores de la superficie celular, o para suministrar
inmunotoxinas a células tumorales. Por ejemplo, el apuntamiento a la
vasculatura del tumor se ha conseguida apuntando a un antígeno
endotelial modelo, el complejo de histocompatibilidad principal de
clase II, con una inmunotoxina de anticuerpo-ricina
(Burrows, F.J. y Thorpe, P.E., Proc Natl Acad Sci USA
90:8996-9000 (1993)). Se consiguió una eficacia
significativamente mayor combinando la inmunotoxina
anti-endotelial con una segunda inmunotoxina
dirigida contra las propias células tumorales (Burrows, F.J. y
Thorpe, P.E., (1993), supra). Recientemente, el factor de
tejido se ha dirigido exitosamente hacia la vasculatura del tumor
usando un anticuerpo biespecífico, activando la trombosis local que
resultó en una eficacia anti-tumor significativa
(Huang, X., et al., Science,
275:547-550 (1997)). Además, los diacuerpos
biespecíficos se han usado exitosamente para dirigir células T
citotóxicas para matar células de tumor de mama y células de linfoma
de células B in vitro (Zhu, Z. et al.,
Bio/Technology, 14:192-196 (1996); y
Holliger, P. et al., Protein Engin.,
9:299-305 (1996)).
Las formulaciones terapéuticas del
heteromultímero se preparan para su almacenamiento mezclando el
heteromultímero que tiene el grado de pureza deseado con portadores
opcionales fisiológicamente aceptables, excipientes, o
estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª
edición, Ed. Osol, A., (1980)), en forma de pastilla liofilizada o
soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores
aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y
concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como el
fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes,
incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular
(menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la
albúmina de suero, la gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros
hidrofílicos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o
lisina, monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos,
incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales
como el EDTA; azúcares alcohol tales como el manitol o sorbitol;
contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o
tensioactivos no iónicos tales como el Tween, Pluronics o
polietilenglicol (PEG).
El heteromultímero también podría atraparse en
microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de
coacervación o mediante polimerización en la interfaz (por ejemplo,
respectivamente, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y
microcápsulas de poli-[metilmetacilato]), el los sistemas de
suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas,
microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y
nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en
Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
El heteromultímero a usarse para la
administración in vivo debe ser estéril. Esto se consigue
fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración
estéril, antes o a continuación de la liofilización y
reconstitución. El heteromultímero ordinariamente se almacenará en
forma liofilizada o en solución.
Las composiciones terapéuticas de heteromultímero
generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de
acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o
vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección
intravenosa.
La ruta de administración del heteromultímero
está de acuerdo con los procedimientos conocidos, por ejemplo,
inyección o infusión mediante rutas intravenosa, intraperitoneal,
intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, o
intralesional, o mediante sistemas de liberación continua, tal como
se menciona más abajo. El heteromultímero se administra
continuamente mediante infusión o inyección de bolo.
Los ejemplos de preparaciones de liberación
ininterrumpida incluyen las matrices semipermeables de polímeros
hidrofóbicos sólidos que contienen la proteína, matrices que están
en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o
microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación ininterrumpida
incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el
poli(2-hidroxietil-metacrilato),
tal como fue descrito por Langer et al., J. Biomed. Mater.
Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem.
Tech., 12:98-105 (1982), o el
poli(vinilalcohol)), los poliláctidos (patente estadounidense
nº 3.773.919, y la EP-58.481), los copolímeros de
ácido L-glutámico y
gamma-etil-L-glutamato
(Sidman et al., Biopolymers,
22:547-556 (1983)), el acetato de etilenvinilo no
degradable (Langer et al., supra), los copolímeros
degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como el Lupron
Depot™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido
láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y el ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico
(EP-133.988).
Mientras que los polímeros tales como el acetato
de etilenvinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la
liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles
liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando las
proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un período
prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse a resultas de la
exposición a la humedad a 37ºC, lo que resulta en una pérdida de
actividad biológica y en posibles cambios en la inmunogenicidad. Se
pueden diseñar estrategias racionales para la estabilización de la
proteína en función del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se
descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces
S-S intermoleculares a través del intercambio
tio-disulfuro, podría conseguirse la estabilización
modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de
soluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando
aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz de
polímero específicas.
Las composiciones de heteromultímero de
liberaciónininterrumpida también incluyen el heteromultímero
atrapado liposomalmente. Los liposomas que contienen heteromultímero
se preparan mediante procedimientos conocidos per se:
DE-3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:4030-4034 (1980); EP-52.322;
EP-36.676; EP-88.046;
EP-143.949; EP-142.641; la solicitud
de patente japonesa 83-118008; las patentes
estadounidenses nº 4.485.045 y 4.544.545; y la
EP-102.324. Ordinariamente, los liposomas son del
tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800
Angstroms), en los cuales el contenido de lípido es mayor de
aproximadamente 30 mol. % de colesterol, ajustándose la proporción
seleccionada para la terapia con heteromultímero óptima.
Una cantidad efectiva de heteromultímero a
emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos
terapéuticos, la ruta de administración, y de la condición del
paciente. En consecuencia, será necesario que el terapeuta valore la
dosis y modifique la ruta de administración según se requiera para
obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica podría
oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 10 mg/kg o más,
dependiendo de los factores mencionados más arriba. Típicamente, el
clínico administrará heteromultímero hasta que se alcance una dosis
que consiga el efecto deseado. El progreso de esta terapia se
monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales.
Los heteromultímeros descritos en ésta pueden
también usarse en inmunoensayos con enzimas. Para conseguir esto, un
brazo del heteromultímero puede diseñarse para que se una a un
epítopo específico sobre el enzima, de forma que la unión no cause
la inhibición del enzima, el otro brazo del heteromultímero puede
diseñarse para unirse a la matriz inmovilizadora, asegurando una
densidad elevada de enzima en el sitio deseado. Los ejemplos de
tales heteromultímeros de diagnóstico incluyen, por ejemplo,
aquellos que tienen especificidad por la IgG así como por la
ferritina, y aquellos que tienen especificidades de unión por la
peroxidasa del rábano silvestre (HRP) así como por una hormona.
Los heteromultímeros pueden diseñarse para su uso
en inmunoensayos de dos sitios. Por ejemplo, se producen dos
heteromultímeros biespecíficos uniendo dos epítopos separados sobre
la proteína analito - un heteromultímero une el complejo a una
matriz insoluble, el otro une un enzima indicador.
Los heteromultímeros pueden usarse también para
la inmunodiagnosis in vitro o in vivo de varias
enfermedades tales como el cáncer. Para facilitar el uso
diagnóstico, un brazo del heteromultímero puede diseñarse para unir
un antígeno asociado a tumor, y el otro brazo puede unir un marcador
detectable (por ejemplo, un quelante que une un radionúcleo). Por
ejemplo, un heteromultímero que tiene especificidades por el
antígeno CEA asociado a tumor, así como por un hapteno bivalente,
puede usarse para visualizar carcinomas colorectales y de la
tiroides. Otros usos diagnósticos, no terapéuticos, para el
heteromultímero serán evidentes para el especialista capacitado.
Para las aplicaciones diagnósticas, al menos un
brazo del heteromultímero típicamente estará marcado directa o
indirectamente con un grupo detectable. El grupo detectable puede
ser cualquiera que es capaz de producir, bien directa o
indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción
detectable podría ser un radioisótopo, tal como: ^{3}H, ^{14}C,
^{32}P, ^{35}S o ^{125}J; un compuesto fluorescente o
quimioluminiscente, tal como el isotiocianato de fluoresceína, la
rodamina, o luciferina; o un enzima, tal como la fosfatasa alcalina,
la beta-galactosidasa o la peroxidasa de rábano
silvestre (HRP).
Podría emplearse cualquier procedimiento conocido
en la técnica para conjugar el heteromultímero a la porción
detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter
et al., Nature, 144:945 (1962); David et al.,
Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J.
Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and
Cytochem., 30:407 (1982).
Los heteromultímeros de la presente invención
podrían usarse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal
como los ensayos de unión competitiva, los ensayos sandwich directos
e indirectos, y los ensayos de inmunoprecipitación. Zola,
Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,
pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987).
Los ensayos de unión competitiva se basan en la
capacidad de un estándar marcado para competir con el analito de la
muestra de ensayo por la unión con una cantidad limitada de
heteromultímero. La cantidad de analito en la muestra de ensayo es
inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une al
heteromultímero. Para facilitar la determinación de la cantidad de
estándar que pasa a estar unido, los heteromultímeros generalmente
se insolubilizan antes o después de la competición, de forma que el
estándar y analito que están unidos a los heteromultímeros puedan
separarse convenientemente del estándar y analito que permanecen sin
unir.
Los heteromultímeros son particularmente útiles
para los ensayos sandwich, los cuales implican el uso de dos
moléculas, cada una capaz de unirse a dos porciones inmunogénicas, o
epítopo, diferentes de la muestra a detectarse. En el ensayo
sandwich, el analito de la muestra de ensayo se une mediante un
primer brazo al heteromultímero, el cual se inmoviliza sobre un
soporte sólido, y a continuación un segundo brazo del
heteromultímero se une al analito. Ver, por ejemplo, la patente
estadounidense nº 4.376.110. El segundo brazo del heteromultímero
podría estar marcado él mismo con un grupo detectable (ensayos
sandwich directos), o podría medirse usando un anticuerpo
anti-inmunoglobulina que está marcado con un grupo
detectable (ensayo sandwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de
ensayo sandwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el grupo detectable
es un enzima.
Más abajo hay ejemplos de realizaciones
específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos
se ofrecen sólo para propósitos ilustrativos, y no se pretende que
limiten el ámbito de la presente invención en modo alguno.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes
depatentes citadas en ésta, sea más arriba o más abajo, se
incorporan en ésta por referencia en su totalidad.
Se presenta una estrategia para preparar BsAb que
contienen Fc (Figura 1C). En esta estrategia, hemos manipulado el
dominio C_{H}3 de las cadenas pesadas del anticuerpo de forma que
heterodimericen pero no homodimericen. Esto se consiguió instalando
enlaces disulfuro entre cadenas en el dominio C_{H}3 en conjunción
con mutaciones estéricamente complementarias obtenidas mediante
diseño racional (Ridgway et al., supra (1996)) y
selección mediante exhibición en fago tal como se describe en ésta.
El uso de una única cadena ligera para ambas especificidades de
unión de antígeno salva el problema de emparejamientos incorrectos
de cadena ligera (Figuras 1A-1C). Los anticuerpos
con la misma cadena ligera se aislaron fácilmente cribando una
biblioteca de scFv humana muy extensa (Vaughan, T.J., et al.,
(1996) supra).
La interfaz C_{H}3 entre la quimera
anti-CD3/CD4-IgG humanizada descrita
previamente por Chamow et al., J. Immunol., 153:4268
(1994) se manipuló para maximizar el porcentaje de heteromultímeros
que podían recuperarse. Las variantes del C_{H}3 de la
protuberancia-en-cavidad y del tipo
salvaje se compararon según su capacidad para dirigir la formación
de una quimera anticuerpo-inmunoadhesina humanizada
(Ab/Ia) anti-CD3/CD4-IgG.
Así pues, se construyeron mutaciones en el
dominio C_{H}3 de la cadena pesada del anticuerpo
anti-CD3 humanizado y en la IgG-CD4
mediante mutagénesis dirigida a un sitio usando oligonucleótidos
desemparejados (Kunkel et al., Methods Enzymol.,
154:367 (1987) y P. Carter, en Mutagenesis: a Practical
Approach, Ed. M.J. McPherson, IRL Press, Oxford, UK, pp.
1-25 (1991)), y se verificaron mediante
secuenciación del dideoxinucleótido (Sanger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463 (1977)). Ver la Tabla 3
siguiente.
Mutantes más preferidos | |
C_{H}3 de anti-CD3 | C_{H}3 de CD4-IgG |
T366Y | Y407T |
T366W | Y407A |
F405A | T394W |
Y407T | T366Y |
T366Y:F405A | T394W:Y407T |
T366W:F405W | T394S:Y407A |
F405W:Y407A | T366W:T394S |
Mutantes preferidos | |
F405W | T394S |
El residuo T366 se halla dentro de la distancia
de puente de hidrógeno del residuo Y407 en el dominio C_{H}3
pareja. Además, el principal contacto intermolecular del residuo
T366 es al residuo Y407 y viceversa. Se creo una
protuberancia-en-cavidad invirtiendo
estos residuos con las mutaciones recíprocas T366Y en un dominio
C_{H}3 y Y407T en el dominio pareja, manteniendo de ese modo el
volumen de las cadenas laterales en la interfaz. Las mutaciones se
designan mediante el residuo del tipo salvaje, seguido por la
posición usando el sistema de numeración de Kabat (Kabat et
al., (1991) supra), y a continuación el residuo de
remplazo en código de letra única. Las mutaciones múltiples se
denotan listando las mutaciones sencillas componentes separadas por
dos puntos.
Los fagémidos que codifican las variantes de la
cadena ligera (L) y pesada (H) del anti-CD3 (Shalaby
et al., J. Exp. Med., 175:217 (1992) y Rodrigues et
al., Int. J. Cancer (Suppl.), 7:45 (1992)) se
cotransfectaron en células renales embrionarias humanas, 293S, junto
con un fagémido que codificaba una variante de la
CD4-IgG (Byrn et al., Nature, 344:667
(1990)) tal como se había descrito previamente (Chamow et
al., J. Immunol., 153:4268 (1994)). La cantidad total de
ADN de fagémidos transfectados se fijo, mientras que la proporción
de diferentes ADN se varió para maximizar el rendimiento de quimera
Ab/Ia. La proporción (en masa) de Ia:cadena pesada:cadena ligera de
los ADN de partida se varió para maximizar el rendimiento de quimera
Ab/Ia. La proporción (en masa) de Ia:cadena pesada:cadena ligera de
los ADN de partida (15 \mug en total) se varió como sigue: 8:1:3;
7:1:3; 6:1:3; 5:1:3; 4:1:3; 3:1:3; 1:0:0; 0:1:3.
Los productos se purificaron por afinidad usando
la Proteína A estafilococal (ProSep A, BioProcessing Ltd, UK) antes
del análisis mediante SDS-PAGE seguido por
densitometría por barrido con láser. Se usó un exceso de luz sobre
el ADN de la cadena pesada para evitar que la cadena ligera fuera
limitante. La identidad de los productos se verificó mediante
electrotransferencia sobre membrana de PVDF (Matsudaira, J. Biol.
Chem., 262:10035 (1987)) seguida por secuenciación amino
terminal.
La cotransfección de fagémidos para la cadena
ligera junto con aquellos para la cadena pesada e Ia que
incorporaban el C_{H}3 del tipo salvaje resultó en una mezcla de
quimera Ab/Ia, productos homodímeros de IgG e Ia, tal como se
esperaba (Chamow et al., J. Immunol., 153:4268
(1994)). Cuanto mayor era la fracción de ADN de partida que codifica
las cadenas pesada y ligera del anticuerpo o la Ia, mayor era la
fracción recuperada de los correspondientes homodímeros. Una
proporción de ADN de partida de 6:1:3 de Ia:H:L rindió un 54,5% de
quimera Ab/Ia con fracciones similares de homodímero de Ia (22,5%) e
IgG (23,0%). Estas proporciones están de acuerdo con las esperadas a
partir de la expresión equimolar de cada cadena, seguida por la
colección aleatoria de las cadenas pesadas, sin introducción de
sesgo por parte del procedimiento de análisis: 50% de quimera Ab/Ia,
25% de homodímero de Ia y 25% de IgG.
En contraste con las cadenas que contenían el
C_{H}3 del tipo salvaje, la quimera Ab/Ia se recuperó con
rendimientos de hasta el 92% a partir de cotransfecciones en las que
la cadena pesada del anti-CD3 y la Ig de la
IgD-CD4 contenían respectivamente las mutaciones de
cavidad Y407T y de protuberancia T366Y. Se obtuvieron rendimientos
similares de quimera anticuerpo/inmunoadhesina si estas mutaciones
recíprocas se instalaban con la protuberancia en la cadena pesada y
la cavidad en la Ia. En ambos casos se observó monómero para la
cadena que contenía la protuberancia pero no para la cavidad. Sin
estar limitados por teoría alguna, se cree que la protuberancia
T366Y es más destructiva para la formación del homodímero que la
cavidad Y407T. La fracción de híbrido Ab/Ia no cambio
significativamente incrementando el tamaño de ambas, la
protuberancia y la cavidad (Ab T366W, Ia Y407A). Un segundo par
protuberancia y cavidad (Ab F405A, Ia T394W) rindió hasta un 71% de
quimera Ab/Ia usando una pequeña fracción de ADN de partida para Ia
para compensar la proclividad no anticipada a homodimerizar de la
variante de protuberancia T394W de la Ia. La combinación de los dos
pares de mutantes de
protuberancia-en-cavidad
independientes (Ab T366Y:F405A, Ia T394W:Y407T) no mejoró el
rendimiento de híbrido Ab/Ia respecto el par Ab T366Y, Ia Y407T.
La fracción de quimera Ab/Ia obtenida con el par
mutante T366Y y Y407T era virtualmente independiente de la
proporción de ADN de partida a lo largo del rango ensayado. Además,
las especies combinadas eran retiradas fácilmente de la quimera
Ab/Ia mediante cromatografía de intercambio iónico
(0-300 mM NaCl en 20 mM Tris-HCl, pH
8,0) en una columna mono S HR 5/5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.).
Esto proporciona esperanzas para la preparación de cantidades
mayores de quimera Ab/Ia usando líneas celulares estables, en donde
los niveles de expresión relativos de Ab e Ia se manipulan menos
fácilmente que en los sistemas de expresión transitoria.
Se anticipa que las mutaciones de
protuberancia-en-cavidad
identificadas incrementarán las aplicaciones potenciales de los
BsAb que contienen Fc, reduciendo la complejidad de la mezcla de
productos obtenidos, desde unas posibles diez especies principales
(Suresh et al., Methods Enzymol., 121:210 (1990))
hasta cuatro o menos (Figuras 1A-1B). Se espera que
el par mutante T366Y e Y407T será útil para generar heteromultímeros
de otros isotipos de IgG humana (tales como el IgG_{2}, IgG_{3}
o IgG_{4}) puesto que la T366 e Y407 están completamente
conservadas y otros residuos en el dominio C_{H}3 de la interfaz
de la IgG_{1} están altamente conservados.
Se usaron tres criterios para identificar pares
de residuos para construir un enlace disulfuro entre dominios
C_{H}3 emparejados: i) la separación entre C\alpha
preferiblemente es similar a las halladas en enlaces disulfuro
naturales (5,0 a 6,8 A) (Srinivasan, N., et al., Int. J.
Peptides Protein Res., 36:147-155 (1990)). Se
permitieron distancias de hasta 7,6 A para permitir que el
movimiento de la cadena principales y para tomar en consideración la
incertidumbre en las posiciones atómicas en la estructura del
cristal de baja resolución (Deisenhofer, Biochemistry,
20:2361-2370 (1981)). ii) Los átomos C\alpha
deberían estar en residuos diferentes en los dos dominios C_{H}3.
iii) Los residuos están ubicados para permitir los enlaces disulfuro
(Srinivasan, N., et al., (1990) supra).
Los enlaces disulfuro se modelaron en la Fc de la
IgG_{1} humana (Deisenhofer, supra) tal como se describió
para el humAb4D5-Fv (Rodrigues et al.,
Cancer Res., 55:63-70 (1995)) usando la
versión 95.0 de Insight II (Biosym/MSI).
Se introdujeron mutaciones en el dominio C_{H}3
de una cadena pesada anti-CD3 humanizada o
IgG-CD4 mediante mutagénesis dirigida contra un
sitio (Kunkel, et al., Methods Enzymol.,
154:367-382 (1987)) usando los siguientes
oligonucleótidos sintéticos:
- Y349C, 5' CTCTTCCCGAGATGGGGGCAGGGTGCACACCTGTGG 3' (SEC. Nº ID.: 1)
- S354C, 5' CTCTTCCCGACATGGGGGCAG 3' (SEC. Nº ID.: 2)
- E356C, 5' GGTCATCTCACACCGGGATGG 3' (SEC. Nº ID.: 3)
- E357C, 5' CTTGGTCATACATTCACGGGATGG 3' (SEC. Nº ID.: 4)
- L351C, 5' CTCTTCCCGAGATGGGGGACAGGTGTACAC 3' (SEC. Nº ID.: 5)
- D399C, 5' GCCGTCGGAACACAGCACGGG 3' (SEC. Nº ID.: 6)
- K392C, 5' CTGGGAGTCTAGAACGGGAGGCGTGGTACAGTAGTTGTT 3' (SEC. Nº ID.: 7)
- T394C, 5' GTCGGAGTCTAGAACGGGAGGACAGGTCTTGTA 3' (SEC. Nº ID.: 8)
- V397C, 5' GTCGGAGTCTAGACAGGGAGG 3' (SEC. Nº ID.: 9)
- D3995, 5' GCCGTCGGAGCTCAGCACGGG 3' (SEC. Nº ID.: 10)
- K3925, 5' GGGAGGCGTGGTGCTGTAGTTGTT 3' (SEC. Nº ID.: 11)
- C2315:C2345 5' GTTCAGGTGCTGGGCTCGGTGGGCTTGTGTGAGTTTTG 3' (SEC. Nº ID.: 12).
Las mutaciones se indican por el residuo
aminoácido y el número (esquema de numeración Eu de Kabat et
al., supra (1991)), seguido por el aminoácido de
remplazo. Las mutaciones múltiples se representan por las mutaciones
sencillas separadas por dos puntos. Los mutantes se verificaron
mediante la secuenciación de dideoxinucleótido (Sanger et
al., supra (1977)) usando la Sequenase versión 2.0
(United States Biochemicals, Cleveland, Ohio).
Se compararon seis pares de moléculas que
contenían enlaces disulfuro entre cadenas en el dominio C_{H}3
(variantes de "disulfuro-C_{H}3";
v1-v6, Tabla 4) con las moléculas progenitoras por
su capacidad para dirigir la formación de un híbrido Ab/Ia,
anti-CD3/CD4-IgG (Chamow et
al., supra (1994)). Los plásmidos que codificaban las
variantes de la IgG-CD4 y de la cadena pesada de
anti-CD3 se cotransfectaron en células 293S junto
con un exceso de plásmido que codificaba la cadena ligera del
anti-CD3. El rendimiento del heterodímero se
optimizó mediante transfección con un rango de proporciones de ADN
de Ia:cadena H:cadena L. Los productos heterodímero Ab/Ia y
homodímero de IgG e Ia se purificaron por afinidad usando Proteína A
estafilococal, y se cuantificaron mediante SDS-PAGE
y densitometría de barrido de láser (Ridgway et al.,
supra (1996)).
Cada part disulfuro-C_{H}3
originó tres especies principales, de forma similar a las moléculas
progenitoras. Sin embargo, el heterodímero Ab/Ia de las variantes de
disulfuro-C_{H}3 estaba desplazado en su movilidad
electroforética, de forma consistente con la formación de un
disulfuro entre cadena en el dominio C_{H}3. Los disulfuros entre
cadenas en la bisagra proporcionaron evidencia adicional de la
formación de enlace disulfuro. Los híbridos Ab/Ia unidos
covalentemente se observaron mediante SDS-PAGE para
las variantes disulfuro-C_{H}3 pero no para
moléculas con dominios C_{H}3 del tipo salvaje, en los que las
cisteínas de la bisagra están mutadas a serinas. Se prepararon las
variantes de disulfuro-C_{H}3 y se denominaron
Y349C/S354'C, Y349C/E356'C, Y349C/E357'C, L351C/E354'C,
T394C/E397'C, y D399C/K392C. Sólo una variante (D399C/K392'C)
incrementó sustancialmente el rendimiento de híbrido Ab/Ia respecto
el tipo salvaje (76% vs. 52%, respectivamente) según se determinó
mediante análisis de SDS-PAGE de las variantes. Las
mutaciones se indican mediante el residuo aminoácido y el número
(esquema de numeración Eu de Kabat et al., (1991)
supra), seguido por el aminoácido de remplazo. Las mutaciones
en las primera y segunda copias del C_{H}3 aparecen antes y
después de la barra inclinada. Los residuos en la segunda copia del
C_{H}3 se indican con una tilde ('). Esta mejora refleja
aparentemente la formación del enlace disulfuro en vez de la
sustitución de los residuos K392 y D399, puesto que las mutaciones
K392S/D399'S proporcionaron ambas un rendimiento de Ab/Ia y una
movilidad electroforética de Ab/Ia relativa al tipo salvaje
similares. Los homodímeros migraron de forma similar a aquellos con
dominios Fc del tipo salvaje, demostrando la formación preferencial
del enlace disulfuro entre cadenas construido en el dominio C_{H}3
de los heterodímeros. Todas las variantes de
disulfuro-C_{H}3 se expresaron aproximadamente con
el mismo nivel que las moléculas progenitoras en las células
293S.
El mejor par disulfuro incrementó el porcentaje
de heterodímero hasta el 87% (Tabla 4; ver también Ridgway et
al., (1996) supra). Estas dos estrategias se basan en
principios diferentes para incrementará la probabilidad de generar
heterodímero. Por tanto, combinados las dos estrategias anticipando
una mejora adicional en el rendimiento de heterodímero. Dos de los
disulfuros modelados, que contenían L351C o T394C, podían
potencialmente forma homodímeros unidos mediante disulfuro así como
heterodímeros unidos mediante disulfuro (L351C/S354'C y
T394C/V397'C), disminuyendo de ese modo su utilidad. Los cuatro
pares de disulfuro restantes se instalaron en el heterodímero
seleccionado mediante fago (variantes v9-v16) y se
ensayaron en función del rendimiento de heterodímero (Tabla 4). Se
obtuvieron rendimientos de aproximadamente el 95% de heterodímero.
De nuevo, el heterodímero presentó un desplazamiento en su movilidad
electroforética en comparación con las variantes de tipo salvaje y
v8.
Rendimientos de heterodímeros procedentes de las variantes de C_{H}3 | |||
Mutaciones | |||
Variante | Subunidad A | Subunidad B | Rendimiento de heterodímero (%) |
tipo salvaje | - - | - - | 51 \pm 1 |
v1 | Y349C | S354C | 54 \pm 4 |
v2 | Y349C | E356C | 55 \pm 6 |
v3 | Y349C | E357C | 57 \pm 4 |
v4 | L351C | E354C | 56 \pm 3 |
v5 | T394C | E397C | 57 \pm 2 |
v6 | D399C | K392C | 73 \pm 3 |
v7 | D399S | L392S | 55 \pm 1 |
v8 | T366W | T366S:L368A:Y407V | 86,7 \pm 2,3 |
v9 | T366W:D399C | T366S:L368A:K392C:Y407V | 86,5 \pm 0,5 |
v11 | S354C:T366W | Y349C:T366S:L368A:Y407V | 95 \pm 2 |
v12 | E356C:T366W | Y349C:T366S:L368A:Y407V | 94 \pm 2 |
v13 | E357C:T366W | Y349C:T366S:L368A:Y407V | 93 \pm 2 |
v14 | T366W:K392C | T366S:D399C:L368A:Y407V | 92 \pm 1 |
v15 | Y349C:T366W | S354C:T366S:L368A:Y407V | 90 \pm 1 |
v16 | Y349C:T366W | E356C:T366S:L368A:Y407V | 95,5 \pm 0,5 |
v17 | V349C:T366W | E357C:T366S:L368A:Y407V | 91,0 \pm 1,0 |
La estrategia siguiente es útil en la selección
de mutaciones complementarias en polipéptidos que interactúan en
una interfaz a través de un dominio de multimerización. La
estrategia se ilustra más abajo puesto que es aplicable a la
selección de mutaciones de
protuberancia-en-cavidad
complementarias. No obstante, no se presente que el ejemplo sea
limitante, y la estrategia podría aplicarse similarmente a la
selección de mutaciones apropiadas para la formación de enlaces
disulfuro que no ocurren de forma natural, motivos de cremallera de
leucina, interacciones hidrofóbicas, interacciones hidrofílicas, y
similares.
Se desarrolló una estrategia de exhibición en
fago para la selección de heterodímeros de C_{H}3 estables y se
esquematiza en la Figura 2. La selección usa un mutante de
protuberancia, T366W (Ridgway et al., supra (1996)),
fusionado a una marca de péptido (por ejemplo, marca de péptido gD,
Lasky, L.A. y Dowbenko, D.J., DNA, 3:23-29
(1984); y Berman, P.W., et al., Science,
227:1490-1492 (1985)) que se coexpresa con una
segunda copia de C_{H}3 fusionada a la proteína del gen III del
M13. En esta segunda copia de C_{H}3 se creo una biblioteca de
mutantes de cavidad mediante aleatorización de los residuos vecinos
más cercanos a la protuberancia sobre el primer dominio C_{H}3. A
continuación se capturaron los fagos que exhibían heterodímeros de
C_{H}3 estables usando un Ab anti-marca.
Se construyó una biblioteca de exhibición en fago
de C_{H}3 de 1,1\times10^{5} clones independientes mediante la
sustitución de un segmento del gen de C_{H}3 natural con un
fragmento de PCR. El fragmento se obtuvo mediante amplificación por
PCR usando cebadores degenerados para aleatorizar las posiciones
366, 368 y 407 usando técnicas estándares.
Después de 2 a 5 rondas de selección, la fracción
de clones de longitud completa era respectivamente del 90%, 60%, 50%
y 10%, según se juzgó por la electroforesis en gel de agarosa del
ADN hecho hebra única. Los fagémidos que contenían clones de
longitud completa se purificaron después de 5 rondas de selección.
Se obtuvieron dos mil transformantes después de transformar de
nuevos células XL1-BLUE™ cells (Stratagene).
Se usó una media de >10^{6} copias de cada
clon por ronda de criba. Por tanto, numerosas copias de cada clon en
la biblioteca estaban probablemente disponibles para la selección,
aunque algunos mutantes de supresión surgieron durante el
cribado.
Después de 7 rondas de cribado, los mutantes de
C_{H}3 obtenidos se aproximaban a una secuencia de aminoácidos
consenso en los residuos aleatorizados. Virtualmente todos los
clones tenían una serina o treonina en el residuo 366, indicando una
preferencia muy fuerte por un \beta-hidroxilo en
esta posición. Se observó una preferencia muy fuerte por residuos
hidrofóbicos para los residuos 368 y 407, con valina y alanina
predominando. Al menos dos veces se recuperaron seis combinaciones
de aminoácidos diferentes, incluyendo el mutante triple
T366S:L368A:Y407V, el cual se recuperó 11 veces. Ninguno de estos
selectores de fago tenía una secuencia idéntica a un heterodímero
previamente diseñado, T366W/Y407'A (Ridgway, J.B.B., et al.,
(1996), supra). Los selectores de fagos podrían estar menos
estrechamente empaquetados que el homodímero de C_{H}3 del tipo
salvaje a juzgar por una reducción de 40-80
angstroms^{3} en el volumen total de cadena lateral de los
residuos en la interfaz del dominio.
Las variantes de C_{H}3 codificadas en el
plásmido de expresión pAK19 (Carter et al., 1992) se
introdujeron en la cepa 33B6 de E. coli, se expresaron y
secretaron a partir de E. coli cultivada hasta densidad
celular elevada en un fermentador. El mutante T366S:L368A:Y407V
purificado mediante cromatografía con DEAD-Sepharose
FF, ABx y Resource S, rindió una única banda principal a
continuación de SDS-PAGE. Se recuperaron otras
variantes de C_{H}3 con similar pureza. Las masas moleculares del
C_{H}3 del tipo salvaje y de las variantes T366S:L368A:Y407V,
T366W e Y407A, según se determinaron mediante espectrometría de
masas con electrospray de alta resolución, eran como se
esperaba.
La estabilidad de los heterodímeros de C_{H}3
se verificó primero valorando el fago correspondiente con
hidrocloruro de guanidina, seguida por dilución y cuantificación del
heterodímero residual mediante ensayo inmunosorbente unido a enzima
(ELISA). El ensayo de desnaturalización con hidrocloruro de
guanidina con el fago-C_{H}3 proporciona un medio
par examinar selectores rápidamente.
Se prepararon fagos a partir de clones
individuales a continuación de 7 rondas de selección, y también a
partir del vector control, pRAl. De forma resumida, se usaron
fagémidos en XL1-BLUE™ para inocular 25 ml de caldo
LB que contenía 50 \mug/ml de carbenicilina y 10 \mug/ml de
tetraciclina en presencia de 10^{9} pfu/ml de M13K07, y se
incubaron durante la noche a 37ºC. Las células se apelotonaron
mediante centrifugación (6000 g, 10 minutos, 4ºC). Se recuperaron
los fagos del sobrenadante mediante precipitación con 5 ml de PEG al
20% (p/v), NaCl 2,5 M, seguida por centrifugación (12000 g, 10
minutos, 4ºC), y a continuación se resuspendieron en 1 ml de PBS. Se
añadieron 180 \mul de guanidina hidrocloruro 0-6 M
en PBS a 20 \mul de preparaciones de fagos, y se incubaron durante
5,0 minutos a aproximadamente 25ºC. A continuación se diluyeron
alícuotas (20 \mul) de cada muestra de fago 10 veces con agua. La
presencia del heterodímero de C_{H}3 se ensayó mediante ELISA,
usando placas recubiertas con 5B6 y detectando el fago con un Ab
policlonal anti-M13 conjugado con peroxidasa de
rábano silvestre, usando o-fenilendiamina como
sustrato. La reacción se atenuó mediante la adición de 50 \mul de
H_{2}SO_{4} 2,5 M y se midió la absorbancia a 492 nm. Los datos
de absorbancia se representaron frente a la concentración de
hidrocloruro de guanidina durante la fusión, y se ajustaron a un
modelo de 4 parámetros mediante un procedimiento no lineal de
mínimos cuadrados usando Kaleidagraph 3.0.5 (Synergy Software).
El heterodímero más frecuentemente recuperado, el
T366W/T366'S:L368'A:Y407'V, es similar en estabilidad a otros
heterodímeros seleccionados mediante fago. Este heterodímero
seleccionado mediante fago es significativamente más estable que el
heterodímero diseñado, T366W/Y407'A, pero menos estable que el
C_{H}3 del tipo salvaje. Se halló que todas las variantes del
C_{H}3, tanto individualmente como en combinación, eran dímeros
mediante cromatografía de exclusión de tamaño, en las condiciones en
que estas mismas moléculas se estudiaron mediante calorimetría (1,75
mg/ml, en solución salina tamponada con fosfato (PBS)). La única
excepción fue el mutante T366S:L368A:Y407V solo, el cual tenía un
tiempo de retención ligeramente más corto que los dímero de
C_{H}3.
Una mezcla 1:1 de mutantes T366W, protuberancia,
y T366S:L368A:Y407V, cavidad, fundió con una única transición a
69,4ºC, de forma consistente con el intercambio de subunidad y
formación de un heterodímero estable. Por contra, el homodímero de
la protuberancia T366W es mucho menos estable que el heterodímero de
protuberancia-en-cavidad
T366W/T366'S:L368'A:Y407'V (\DeltaT_{m} = -15,0ºC). El mutante
de cavidad T366S:L368A:Y407V por sí mismo es proclive a agregarse
cuando se caliente, y no experimenta una transición de fusión
fluida.
El mutante de cavidad diseñado, Y407A, se funde a
58,8ºC y 65,4ºC en presencia y ausencia respectivamente del mutante
de protuberancia T366W. Esto es consistente con el intercambio de
subunidad y formación de un heterodímero T366W/Y407'A que tiene una
estabilidad mayor que los homodímeros de T366W (\DeltaT_{m} =
11,0ºC) o Y407A (\DeltaT_{m} = 6,6ºC). El heterodímero
seleccionado en fago T366W/T366'S:L368'A:Y407'V es más estable que
el heterodímero diseñado T366W/Y407'A (\DeltaT_{m} = 4,0ºC),
pero es menos estable que el homodímero de C_{H}3 del tipo salvaje
(\DeltaT_{m} = -11,0ºC).
Los mutantes del C_{H}3 diseñados y
seleccionados en fagos se compararon por su capacidad para dirigir
la formación de un híbrido Ab/Ia,
anti-CD3/IgG-CD4 in vivo
(Chamow et al., (1994), supra). Esto se consiguió
mediante la coexpresión de cadenas anti-CD3 ligera
(L) y pesada (H) junto con IgG-CD4. La formación de
heterodímeros y homodímeros se verificó mediante purificación con
Proteína A seguida por SDS-PAGE y densitometría de
barrido de láser (Ridgway, et al., (1996), supra). Se
recuperaron rendimientos comparables de híbrido Ab/Ia a partir de
las cotransfecciones en las que la cadena pesada
anti-CD3 contenía la mutación de protuberancia
diseñada, T366W, y la Ia contenía, bien las mutaciones seleccionadas
en fagos, T366S:L368A:Y407V, o una mutación de cavidad diseñada,
Y407A (Figura 3).
Los mutantes de C_{H}3 diseñados y
seleccionados en fagos se evaluaron a continuación por su propensión
a formar homodímeros. La mutación de protuberancia T366W es
aparentemente bastante destructiva para la homodimerización, puesto
que la cotransfección de las correspondientes cadenas pesada y
ligera de anticuerpo conduce a un exceso de monómero HL (podría
incluir IgG no unida mediante disulfuro) respecto IgG. Por contra,
se observan monómeros de IgG pero no de HL para el mismo anticuerpo
que contiene dominios C_{H}3 del tipo salvaje. Las mutaciones de
cavidad, T366S:L368A:Y407V, son algo destructivas para la
homodimerización, puesto que la transfección de los correspondientes
fagémidos conduce a una mezcla de predominantemente dímeros de Ia
con algunos monómeros de Ia. La mutación de cavidad Y407A es
mínimamente destructiva para la homodimerización, a juzgar por la
presencia de un dímero de Ia, pero no de monómeros de Ia, a
continuación de la transfección del fagémido correspondiente.
La estrategia de selección de la exhibición en
fago descrita en ésta permite la selección en favor de mutantes del
C_{H}3 que forman heterodímeros estables, y la selección respecto
mutantes que forman homodímeros estables. La contra selección contra
homodímeros ocurre porque los mutantes de C_{H}3 "libres"
competirán con el mutante protuberancia de C_{H}3 marcado por la
unión a la proteína de fusión C_{H}3 mutante-gen
III. Los mutantes de C_{H}3 libres surgen como un resultado de la
mutación ámbar entre el gen del C_{H}3 natural y el gen III del
M13. En un huésped supresor de ámbar, tal como
XL1-Blue, ambos, la proteína de fusión
C_{H}3-gen III y el correspondiente C_{H}3 libre
serán secretados.
La desnaturalización con hidrocloruro de
guanidina ha probado ser una herramienta útil para el examen
preliminar de la estabilidad de los heterodímeros de C_{H}3 en
fagos. Los fagos mantienen la infectividad para E. coli
incluso después de la exposición de hidrocloruro de guanidina 5 M
(Figini et al., J. Mol. Biol.,
239:68-78 (1994)). Por tanto, la guanidina podría
ser útil también para incrementar la rigurosidad de la selección de
mutantes.
El diseño racional y el examen de bibliotecas de
exhibición en fagos son estrategias complementarias para remodelar
una interfaz de dominio de un homodímero para promover la
heterodimerización. En el caso de los dominios C_{H}3, los
mutantes diseñados identificaron residuos en la interfaz del dominio
que podían reclutarse para promover la heterodimerización. A
continuación se uso la exhibición en fago para buscar permutaciones
de 3 residuos vecinos a una protuberancia fijada para combinaciones
que de la forma más eficiente formaran heterodímeros. Los selectores
de fagos son útiles para facilitar el rediseño racional ulterior de
la interfaz del dominio, mientras que la estrategia de selección en
fagos descrita en ésta demuestra su utilidad para remodelar
interfaces proteína-proteína.
El ejemplo siguiente demuestra la preparación de
un anticuerpo biespecífico heteromultimérico que comparte la misma
cadena ligera de acuerdo con la invención, y la capacidad de ese
anticuerpo para unir sus antígenos diana.
Se cribó una biblioteca extensa humana de
anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv) (Vaughan et al.,
(1996), supra) en busca de anticuerpos específicos para once
antígenos, incluyendo el Axl(ECD del receptor humano quinasa
de tirosina), el GCSF-R (ECD del receptor humano del
factor estimulador de las colonias de granulocitos humano), la IgE
(IgE de ratón), el IgE-R (cadena \alpha del
receptor de la IgE humano), el MPL (ECD del receptor quinasa de
tirosina humano de la trombopoyetina), el Musk (ECD del receptor
quinasa de tirosina humano específico del músculo), el NpoR (ECD del
receptor NpoR huérfano humano), el Rse (ECD del receptor quinasa de
tirosina Rse humano), el HER3 (ECD del receptor quinasa de tirosina
humano HER3/c-erbB3), el Ob-R (ECD
del receptor de leptina humano), y el VEGF (factor de crecimiento
endotelial vascular humano), en donde ECD se refiere al dominio
extracelular. Los datos de la secuencia de nucleótidos para los
fragmentos scFv procedentes de las poblaciones de anticuerpos
generadas contra dicho antígeno se tradujeron para derivar las
correspondientes secuencias de proteína. Las secuencias de V_{L}
se compararon entonces usando el programa "align" con el
algoritmo de Feng y Doolittle (1985, 1987, 1990) para calcular el
porcentaje de identidad entre todas las combinaciones en pareja de
las cadenas (Feng, D.F. y Doolittle, R.F., J. Mol. Evol.,
21:112-123 (1985); Feng, D.F. y Doolittle, R.F.,
J. Mol. Evol., 25:351-360 (1987); y Feng,
D.F. y Doolittle, R.F., Methods Enzymol.,
183:375-387 (1990)). Los resultados del porcentaje
de identidad de secuencia de cada comparación por parejas de las
secuencias de aminoácidos de cadena ligera se dispusieron en formato
de matriz (ver Apéndice).
Para la mayoría de las comparaciones por parejas,
se halló al menos una secuencia de cadena ligera común. La Tabla 5
es una comparación de las cadenas de V_{L} mostrando las
frecuencias de scFv que comparten cadenas ligeras idénticas (100% de
identidad) determinada por el alineamiento de 117 secuencias de
aminoácidos de V_{L}. Por ejemplo, la entrada 4/9 (HER3 \times
Ob-R, destacada en un recuadro negro), denota que se
halló que 4 clones que unen el HER3 comparten su secuencia V_{L}
con uno o más clones de anti-Ob-R,
mientras que 9 clones que unen el Ob-R comparten su
secuencia V_{L} con uno o más clones anti-HER3.
Las entradas en la diagonal representan el número de clones de
anticuerpo dentro de una población que comparten una secuencia
V_{L} con uno o más clones en la población. Por ejemplo, el examen
de los clones MPL reveló 5 clones que comparten su secuencia V_{L}
con uno o más clones MPL distintos. En los casos en que no se
observó secuencia de cadena ligera en común, tales como para (IgE
\times Axl) o (NpoR \times IgE-R), el número de
fragmentos comparado para al menos una especificidad fue muy pequeño
(5 ó menos). Dado el número de cadenas ligeras comunes halladas, es
probable que puedan hallarse cadenas ligeras comunes para cualquier
comparación de V_{L} si se compara un número suficiente de
clones.
Las secuencias de aminoácidos de las cadenas
ligeras se examinaron en busca de las posiciones de diferencias en
residuos aminoácidos cuando la identidad de secuencia relativa a una
cadena ligera común escogida era del 98% y 99%. La Figura 4 es una
comparación de secuencias V_{L} de ocho anticuerpos diferentes con
especificidades por el Axl (clon Axl.78), el Rse (clones Rse.23,
Rse.04, Rse.20, y Rse.15), el IgER (clon IgER.MAT2C1G11), el
Ob-R (clon obr.4), y el VEGF (clon vegf.5). La
posición de los residuos CDR de unión al antígeno de acuerdo con una
definición de secuencia (Kabat, G. A., et al., (1991)
supra) o definición estructural (Chothia y Lesk, J. Mol.
Biol., 196:901-917 (1987)) se muestra
respectivamente mediante subrayado y #. Los residuos de la cadena
ligera que difieren de la secuencia Axl.78 se muestran mediante
subrayado doble. De las 9 cadenas ligeras comparadas, 6 son
idénticas. Las cadenas ligeras de Rse.04 y obr.4 (aproximadamente
99% de identidad de secuencia) difieren por un residuo fuera de los
CDR de unión al antígeno. La cadena ligera del Rse.20
(aproximadamente 98% de identidad de secuencia) difiere en dos
residuos fuera de los CDR de unión al antígeno. Los cambios de
residuo aminoácido podrían tener poco o ningún efecto sobre la unión
al antígeno. Por tanto, la similitud de secuencia de estas cadenas
las hace candidatas para la cadena ligera común de la invención.
Alternativamente, de acuerdo con la invención, tales cadenas ligeras
que tienen un 98-99% de identidad de secuencia con
la cadena ligera de un scFv emparejado probable (por ejemplo,
Axl.78) podrían sustituirse con la cadena ligera emparejada y
retener la especificidad de unión.
Los fragmentos scFv que unen el receptor de
leptina humano (Ob-R) o el dominio extracelular del
producto del gen HER3/c-erbB3 (HER3) se obtuvieron
mediante tres rondas de cribado usando una extensa biblioteca en
fago de scFv humana (Vaughan et al., (1996), supra).
La IgG-receptor de leptina e
IgG-HER3 (10 \mug en 1 ml de PBS) se usaron para
recubrir Immunotubos separados (Nunc; Maxisorp) durante la noche a
4ºC. A continuación se realizaron el cribado y rescate de fagos tal
como describieron Vaughan et al., (1996), supra, con
las modificaciones siguientes. En cada paso de cribado se incluyó un
anticuerpo humanizado huMAb4D5-8 (Carter, P., et
al., PNAS USA, 89:4285-4289 (1992)) o
anti-IgE humanizado (Presta, L., et al.,
J. Immunol., 151:2623-2632 (1993)) a una
concentración de 1 mg/ml para absorber fago unidor de Fc. Además,
también se uso el cribado en solución (Hawkins, R.E., et al., J.
Mol. Biol., 226:889-896 (1992)) para identificar
scFv unidores de receptor de leptina. El receptor de leptina se
separó del Fc mediante proteolisis específica del receptor de
leptina-IgG con la proteasa manipulada Genenase
(Carter, P., et al., Proteins: Structure, Function and
Genetics, 6:240-248 (1989)) seguida por
cromatografía con Proteína A-Sepharose. El receptor
de la leptina se biotiniló y usó a una concentración de 100 nM, 25
nM y 5 nM respectivamente la primera, segunda, y tercera ronda de
cribado. Los fagos que unían el antígeno biotinilado se capturaron
usando cuentas paramagnética recubiertas de estreptoavidina
(Dynabeads, Dynal, Oslo, Noruega).
Los clones procedentes de las rondas 2 y 3 de
cada cribado se examinaron mediante ELISA de fagos y scFv usando el
antígeno correspondiente y también una inmunoadhesina o anticuerpo
control. La diversidad de clones positivos para el antígeno se
analizaron mediante amplificación con PCR del inserto de scFv usando
los cebadores fdtetseq y PUC hacia atrás (Vaughan et al.,
(1996), supra) y mediante digestión con BstNI (Marks et
al., (1991) supra). A continuación, de uno a cinco clones
por huella de BstNI se secuenciaron en ciclos usando terminadores de
cadena dideoxi fluorescentes (Applied Biosystems) usando cebadores
de PCR de enlace pesado y mcy seq 10 (Vaughan et al., (1996),
supra). Las muestras se analizaron usando un secuenciador de
ADN automatizado de Applied Biosystems y las secuencias se
analizaron usando SeqEd. Se destaca también que la desnaturalización
del anticuerpo con hidrocloruro de guanidina y el procedimiento de
reorganización de cadena in vitro de Figini, combinados con
la selección por exhibición en fagos, es útil como procedimiento
para seleccionar anticuerpos que tienen la misma cadena ligera
(Figini, M., et al., (1994), supra, incorporada en
ésta por referencia en su totalidad).
Usando el procedimiento descrito más arriba, se
obtuvieron once clones anti-HER3 diferentes y 18
clones anti-Ob-R (11 a partir de
cribado usando antígeno recubierto y 7 a partir de cribado con
antígeno biotinilado). Los clones se secuenciaron mediante técnicas
estándares para determinar las secuencias de las cadenas ligeras
asociadas con cada dominio unidor (Figura 5). Las secuencias son las
secuencias V_{H} y V_{L} común del clon 26
anti-Ob-R y del clon 18
anti-HER3 usadas para construir un anticuerpo
biespecífico (ver más abajo). Los residuos se numeran de acuerdo con
(Kabat, E.A., et al., (1991) supra). La posición de
los residuos del CDR unidor de antígeno de acuerdo con una
definición de secuencia (Kabat, et al., (1991) supra)
o una definición estructural (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol.,
196:901-917 (1987)) se muestran respectivamente
mediante subrayado y rayado por encima. La identidad entre residuos
en las secuencias V_{H} se indica mediante *.
Las secuencias de las cadenas ligeras se
compararon para múltiples clones anti-HER3 en
relación a múltiples clones
anti-Ob-R (Figura 6 y Tabla 5). Se
observó que cuatro de once clones anti-HER3
comparten una V_{L} idéntica con uno o más clones
anti-receptor Ob-R. De forma
opuesta, nueve de dieciocho clones
anti-Ob-R comparten la misma V_{L}
que uno de los clones anti-HER3.
La construcción de
anti-Ob-R/anti-HER3,
un anticuerpo biespecífico que tiene una cadena ligera común se
realizó como sigue. Se usaron polipéptidos primero y segundo de
C_{H}3 alterados que tienen protuberancias y cavidades
complementarias, así como los enlaces disulfuro que no ocurren
naturalmente, para la construcción de un anticuerpo biespecífico que
contenía el Fc. La V_{L} del clon 26
anti-Ob-R y el clon 18
anti-HER3, los cuales clones comparten la misma
cadena ligera, así como las cadenas pesadas de cada anticuerpo, se
usaron para preparar el anticuerpo biespecífico de acuerdo con los
procedimientos descubiertos en ésta.
Este anticuerpo tenía un desplazamiento de
movilidad electroforética en si peso molecular aparente en relación
a un anticuerpo biespecífico que difiere sólo por una ausencia de
alteraciones para la generación de enlaces disulfuro no naturales.
Un gel de 8% SDS-PAGE de variantes del anticuerpo
heterodimérico con y sin enlaces disulfuro que no ocurren de forma
natural mostró un desplazamiento en la movilidad desde un PM
aparente de aproximadamente 230 para el heterodímero del tipo
salvaje, hasta un PM aparente de aproximadamente 200 para un
heterodímero que tiene un enlace disulfuro no natural. El
desplazamiento del PM fue suficiente para permitir la determinación
del porcentaje de cada variante que exitosamente formaba el enlace
disulfuro no natural.
La especificidad de unión para ambos, el
Ob-R y el HER3 del anticuerpo biespecífico se ensayó
mediante procedimientos ELISA estándares, tales como el
procedimiento siguiente. La unión de Ob-R se
demostró en un ensayo ELISA con Ob-R presente como
una proteína de fusión Ob-R-Ig. La
proteína de fusión Ob-R-Ig se
depositó sobre el pocillo de una placa de microvaloración de 96
pocillos, y se añadió el anticuerpo biespecífico.
El pocillo se lavó varias veces para eliminar la
unión no específica al Ob-R-Ig. Como
un segundo componente en el mismo ensayo, se añadió una proteína de
fusión HER3-Ig biotinilada y se detectó por medio de
la unión del complejo estreptoavidina-peroxidasa de
rábano silvestre a la proteína de fusión HER3-Ig
biotinilada. La unión se detecta mediante la generación de un cambio
de color a partir de la adición de peróxido de hidrógeno y sustrato
TMB de peroxidasa (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg,
MD).
En las condiciones acabadas de describir, la
unión de un anticuerpo biespecífico a ambas, a la
Ob-R-Ig y a la
HER3-Ig se observaría como marca detectable
inmovilizada sobre la superficie del pocillo de microvaloración
debido a la formación de un complejo que comprende la inmovilizada
Ob-R-Ig/anticuerpo
biespecífico/HER3-Ig biotina/estreptoavidina marcada
detectablemente. Los anticuerpos que unen la HER3-Ig
pero no la Ob-R-Ig no forman el
complejo anterior y proporcionan un resultado negativo. Por contra,
el anticuerpo biespecífico que se espera una tanto la
Ob-R-Ig como la
HER3-Ig, forma el complejo rindiendo un resultado
positivo en el ensayo, demostrando que el anticuerpo biespecífico,
que tiene una cadena ligera común, une ambos HER3 y
Ob-R.
La expresión y purificación del anticuerpo
biespecífico anti-(Ob-R/HER3) se realizó como sigue.
Se transfectaron células 293S renales embrionarias humanas con tres
ADN de plásmidos, codificando cada uno de ellos por separado la
cadena pesada anti-Ob-R, la cadena
pesada anti-HER3, o la cadena ligera del clon 26 a
18 que era común a cada uno de los anticuerpos, tal como se ha
descrito más arriba. Para cada transfección, la proporción de ADN
codificando cadena pesada respecto ADN codificando cadena ligera fue
de 1:3 de forma que la cadena ligera no fuera limitante para el
ensamblaje del anticuerpo biespecífico
anti-Ob-R/anti-HER3.
Ambas cadenas pesadas fueron transfectadas en una proporción 1:1 con
respecto la una de la otra. A continuación se cotransfectaron 12
\mug de ADN de plásmido total en células 293S por medio de la
precipitación con fosfato cálcico (Gorman, C., DNA Cloning,
volumen II., Ed. D.M. Glover, IRL Press, Oxford, p. 143 (1985)). Las
célula se lavaron con PBS antes de añadir medio de cultivo que se
pretendía potenciara la expresión de proteína. Las proteínas que
contenían Fc se purificaron de los sobrenadantes de células usando
Proteína A inmovilizada (ProSep A, BioProcessing Ltd., UK) y tampón
cambiado por PBS. Se añadió iodoacetamida a las preparaciones de
proteína hasta una concentración final de 50 mM para impedir la
reordenación de los puente disulfuro.
Como un ejemplo adicional, se realizó como sigue
la expresión y purificación de un anticuerpo/inmunoadhesina
anti-(CD3/CD4). Se transfectaron células 293S renales embrionarias
humanas con tres ADN de plásmidos, codificando cada uno de ellos por
separado la cadena pesada anti-CD3, la cadena pesada
de IgG_{1} anti-CD4, o la inmunoadhesina de
IgG_{1} anti-CD4. Para cada transfección, la
proporción de ADN codificando la cadena ligera respecto al ADN
codificando cadena la cadena pesada fue de 3:1, de forma que la
cadena ligera no fuera limitante para el ensamblaje de la IgG
anti-CD3. Adicionalmente, puesto que la
inmunoadhesina se expresa pobremente, la proporción de plásmido
codificando la inmunoadhesina se añadió en exceso respecto el
plásmido codificando la cadena pesada. Las proporciones ensayadas
oscilaban desde 3:1:3 hasta 8:1:3 para los fagémidos de
inmunoadhesina:cadena pesada:cadena ligera. A continuación se
cotransfectaron 10 \mug de ADN de plásmido total en células 293S
por medio de la precipitación con fosfato cálcico (Gorman, C.,
(1985), supra), lavándose las célula con PBS antes de la
transfección. Las proteínas que contenían Fc se purificaron de los
sobrenadantes de células usando Proteína A inmovilizada (ProSep A,
BioProcessing Ltd., UK) y tampón cambiado por PBS. Se añadió
iodoacetamida a las preparaciones de proteína hasta una
concentración final de 50 mM para impedir la reordenación de los
puentes disulfuro.
En cada una de las preparaciones anteriores, las
muestras de proteína se electroforaron en geles de poliacrilamida al
8% (Novex) y se visualizaron mediante tinción con azul Serva. Los
geles se destiñeron dejando una fondo claro en un esfuerzo para
permitir la visualización y cuantificación de los contaminantes
menores. Los geles secados se escanearon con el densitómetro de
barrido (GS-670, BioRad) y los productos de proteína
se cuantificaron con el programa Molecular Analyst.
Se ha descubierto en ésta que los puentes
disulfuro no naturales (construidos) introducidos en el dominio
C_{H}3 potencian la formación de heterodímero. Una par de
polipéptido, K292C/D399'C, potencian la formación de heterodímero
generando hasta un 76% de heterodímero (Tabla 4, variante v6). Más
aún, cuando se combinó la presencia de un enlace disulfuro entre
cadenas con la tecnología de
protuberancia-en-cavidad, se obtuvo
aproximadamente un 95% de heterodímero (Tabla 4, variantes v11, v12
y v16). Por tanto, el procedimiento de la invención para incrementar
la interacción proteína/proteína específica entre el primer y
segundo polipéptidos de un anticuerpo biespecífico incrementa el
rendimiento de heteromultímero deseado y minimiza la formación de
heteromultímero no deseado o de homomultímeros.
Además, el procedimiento de caracterizar el
producto de heteromultímeros mediante el análisis de movilidad
electroforética permite la determinación de la cantidad relativa de
heteromultímeros deseados en relación a los productos no
deseados.
La selección de una cadena ligera común, tal como
se describe en ésta, incrementa adicionalmente el rendimiento del
heteromultímero deseado al eliminar la posibilidad de emparejamiento
incorrecto entre cadenas pesadas variables y cadenas ligeras de un
anticuerpo multiespecífico.
La identificación, construcción y expresión de
otro anticuerpo específico de la invención se demuestra en ésta. Los
procedimiento descritos en las Partes A y B de este ejemplo se
utilizaron para la preparación del anticuerpo biespecífico
anti-Mpl/anti-HER3.
Usando los procedimientos descritos en la Sección
A de este ejemplo (Comparación de bibliotecas de anticuerpos
generadas contra once antígenos), supra, las secuencias de
aminoácido de V_{H} y V_{L} del scFv anti-HER3
se compararon con 23 scFv que se unían al receptor de trombopoyetina
humano, c-Mpl. Cinco de los once clones
anti-HER3 compartían una secuencia de aminoácido de
V_{L} idéntica con uno o más de los clones unidores de Mpl. A la
inversa, siete de veintitrés scFv anti-Mpl
compartían la misma V_{L} que uno de los clones
anti-HER3 (ver Tabla 5, más arriba, recuadro sin
fondo). Por contra, las secuencias de aminoácidos de V_{H} eran
mucho más diversas, con un nivel de identidad del 40 a 90% entre
cualquier clon anti-Mpl y
anti-HER3.
El scFv anti-Mpl 12B5 (nº de
acceso en Genebank AF048775; SEC. ID. Nº 27) y el clon G6 de scFv
anti-HER3 (nº de acceso en Genebank AF048774; SEC.
ID. Nº 28) utilizan secuencias V_{L} idénticas y secuencias
V_{H} sustancialmente diferentes. Estos fragmentos scFv se usaron
para construir el anticuerpo de IgG biespecífico
anti-Mpl/anti-HER3, capaz de una
heterodimerización eficiente debido a la cadena ligera compartida
así como a través del uso de mutaciones de
botones-en-agujeros (descritas en
ésta) y un enlace disulfuro construido entre los dominios C_{H}3.
Los anticuerpos que comparten la misma cadena L se escogieron para
salvar el problema de cadenas L emparejándose con cadenas H no
correspondientes. También estaban presentes dos enlaces disulfuro en
la región bisagra que ocurren naturalmente. La cadena L común se
cotransfectó con las dos cadenas H que contienen las mutaciones de
C_{H}3 de la variante v11. Los productos de IgG se purificaron
mediante cromatografía de afinidad con Proteína A y se analizaron
mediante SDS-PAGE usando técnicas estándares.
La preparación de anticuerpo IgG biespecífico
(BsIgG) proporcionó una única banda principal que mostraba una
movilidad mayor que la IgG que contenía los dominios C_{H}3 del
tipo salvaje. Este incremento en la movilidad electroforética fue
consistente con la formación de un enlace disulfuro construido en el
BsIgG, formándose una especie de proteína más compacta.
La capacidad del anticuerpo BsIgG
anti-Mpl/anti-HER3 para unir ambos
antígenos Mpl y HER3 se ensayó usando un ELISA como sigue. Usando
tampón PBS en todos los pasos, se recubrieron durante la noche
pocillos individuales en una placa de 96 pocillos (Maxisorp, Nunc)
con IgG-HER3 o IgG-Mpl a 5
\mug/ml, se lavaron, y a continuación se bloquearon durante 1 hora
con BSA al 0,5% (p/v), Los anticuerpos primarios eran el BsIgG
anti-Mpl \times anti-HER3 que
contenía las mutaciones Y349C:T366S:L368A:Y407V/T266'W:S354'C y la
correspondiente IgG anti-Mpl o
anti-HER3 con las regiones Fc mutadas. Los
anticuerpos primarios (1 \mug/ml) se incubaron individualmente
durante 2 horas a 23ºC con IgG-HER3 biotinilada y
una dilución 1:5000 de conjugado de estreptoavidina:peroxidasa de
rábano silvestre (Boehringer Mannheim), y a continuación se
añadieron a los pocillos y se incubaron durante 1 hora adicional a
23ºC. La actividad peroxidasa se detectó con reactivos TMB según
indicaba el vendedor (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.,
Gaithersburg, MD).
Tal como se anticipaba, el IgG
anti-Mpl/anti-HER3 unión eficiente y
simultáneamente cada antígeno ECD de Mpl y HER3, individualmente así
como ambos antígenos simultáneamente. Por contra, las IgG
anti-Mpl y anti-HER3 progenitoras
sólo se unían a su correspondiente antígeno relacionado (Figura
6).
Para demostrar que la región F_{c} manipulada
(mutaciones del C_{H}3, más arriba) utilizada en la generación de
los anticuerpos biespecíficos ilustrativos de la invención es capaz
de citoxoticidad mediada por célula y dependiente de anticuerpo
(ADCC), se realizó el experimento siguiente.
Las mutaciones del C_{H}3 mantienen la
capacidad de soportar una eficiente citotoxicidad mediada por célula
y dependiente de anticuerpo (ADCC) tal como se demostró usando el
procedimiento de Lewis, G.D., et al., (Lewis, G.D., et
al., Cancer Immunol. Immunother.
37:255-263 (1993)). De forma resumida, los ensayos
de citotoxicidad se realizaron con células diana
SK-BR-3 y HBL-100
marcadas con ^{51}Cr (números de acceso ATCC
HTB-30 y 45509 respectivamente), y con linfocitos de
sangre periférica humana como células efectoras. Sin embargo, a
diferencia de Lewis et al., los linfocitos no se activaron
con IL-2.
Las mutaciones del C_{H}3 S354:T366W y
Y349:T366S;L268A;Y407V se introdujeron por separado en la cadena H
del anticuerpo anti-HER2 humanizado
huMAb4D5-5 preparado por Carter et al.,
(Carter, P., et al., PNAS USA
89:4285-4289 (1992)). Los anticuerpos que contienen
regiones Fc remodeladas y del tipo salvaje tenían una potencia
similar en la ADCC a la de la línea celular de cáncer de mama
SK-BR-3 que expresa la HER2 (Figura
7). Ambos anticuerpos, el remodelado y el de tipo salvaje, mostraron
una baja actividad comparable frente a la línea celular epitelial de
mama normal. Los efectos en la cadena H son independientes de los
dominios unidores, se prediciéndose que estos BsIgG funcionarán en
la citotoxicidad mediada por célula y dependiente de anticuerpo.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: GENENTECH, INC.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA CONSTRUIR ANTICUERPOS MULTIESPECÍFICOS QUE TIENEN COMPONENTES HETEROMULTIMÉRICOS Y COMUNES
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 28
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Genentech, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 1 DNA Way
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: South San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- (ZIP): 94080
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5 pulgadas, 1,44 Mb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: WinPatin (Genentech)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US98/08762
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 30-Abril-1998
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/850058
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 02-Mayo-1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Conley, Deirdre L.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.487
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA: P1099R2PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 650/225-2066
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 650/952-9881
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCTTCCCGA GATGGGGGCA GGGTGCACAC CTGTGG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCTTCCCGA CATGGGGGCA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTCATCTCA CACCGGGATG G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTGGTCATA CATTCACGGG ATGG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCTTCCCGA GATGGGGGAC AGGTGTACAC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGTCGGAA CACAGCACGG G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGGAGTCT AGAACGGGAG CCGTGGTACA GTAGTTCTT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGGAGTCT AGAACGGGAG GACAGGTCTT GTA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGGAGTCT AGACAGGGAG G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGTCGGAG CTCAGCACGG G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGAGGCGTG GTGCTGTAGT TGTT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTCAGGTGC TGGGCTCGGT GGGCTTGTGT GAGTTTTG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 821 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 122 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 261 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 717 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 732 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (53)
1. Procedimiento para preparar un anticuerpo
multiespecífico que comprende al menos dos dominios de unión
diferentes, en donde
- un primer dominio de unión une una primera molécula y un segundo dominio de unión une una segunda molécula diferente de dicha primera molécula;
- cada dominio de unión comprende (i) un dominio variable de cadena pesada que es parte de un polipéptido que comprende además un dominio de multimerización, y (ii) un dominio variable de una cadena ligera,
- el primer dominio de unión comprende un primer dominio variable de cadena pesada de un primer polipéptido, el segundo dominio de unión comprende un segundo dominio variable de cadena pesada de un segundo polipéptido, y el primer y segundo dominios variables de cadena pesada son diferentes, y
- los polipéptidos multimerizan mediante la interacción de dichos dominios de multimerización,
y en
donde,
- o bien cada dominio variable de cadena ligera es idéntico,
- o el anticuerpo multiespecífico comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un segundo dominio variable de cadena ligera, el primer y segundo dominios variables de cadena ligera difieren el uno del otro pero tienen al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, y dicho primer dominio de unión une dicha primera molécula, si dicho primer dominio de unión comprende el primer dominio variable de cadena ligera o comprende el segundo dominio variable de cadena ligera, y dicho segundo dominio de unión une dicha segunda molécula, si dicho segundo dominio de unión comprende el segundo dominio variable de cadena ligera o el primer dominio variable de cadena ligera,
comprendiendo el procedimiento los
pasos
de:
- (i)
- cultivar una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos y la cadena ligera o cadenas ligeras, en donde el cultivo es tal que el ácido nucleico se expresa y se producen los polipéptidos y la cadena ligera o las cadenas ligeras; y
- (ii)
- recuperar el anticuerpo multiespecífico del cultivo de células hospedadoras.
2. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde
el ácido nucleico que codifica el dominio de multimerización de
dicho primer polipéptido, o el ácido nucleico que codifica el
dominio de multimerización de dicho segundo polipéptido, o ambos, se
proporcionan mediante la alteración del ácido nucleico para alterar
la secuencia de aminoácidos codificada.
3. Procedimiento de la reivindicación 2, en donde
el ácido nucleico que codifica el dominio de multimerización de
dicho primer polipéptido, de dicho segundo polipéptido, o de ambos,
se altera con el fin de que el dominio de multimerización de cada
uno de dichos primer o segundo polipéptidos comprenda un residuo que
contiene un tiol libre, el cual forma un enlace disulfuro con un
residuo que contiene un tiol libre del dominio de multimerización
del otro de dichos primer o segundo polipéptidos.
4. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde
la multimerización de dichos polipéptidos comprende una interacción
protuberancia-en-cavidad, en donde
el procedimiento comprende además, antes del paso (i):
- proporcionar el ácido nucleico que codifica el primer polipéptido mediante la alteración del ácido nucleico para generar una protuberancia en el dominio de multimerización del polipéptido codificado mediante el reemplazo de un residuo aminoacídico con un residuo importado que tiene un mayor volumen de cadena lateral, y
- proporcionar el ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido mediante la alteración del ácido nucleico para generar una cavidad compensatoria en el dominio de multimerización del polipéptido codificado mediante el reemplazo de un residuo aminoacídico con un residuo importado que tiene un menor volumen de cadena lateral.
5. Procedimiento de la reivindicación 4, en donde
se proporciona el ácido nucleico que codifica, un primer polipéptido
que comprende un dominio de multimerización que tiene una
protuberancia, un segundo polipéptido que comprende un dominio de
multimerización que tiene una cavidad, o un primer polipéptido que
comprende un dominio de multimerización que tiene una protuberancia
y un segundo polipéptido que comprende un dominio de multimerización
que tiene una cavidad, por medio de selección por exhibición en
fago.
6. Procedimiento de la reivindicación 4, en donde
el residuo importado que tiene un mayor volumen de cadena lateral se
selecciona de entre el grupo que consiste en arginina (R),
fenilalanina (F), tirosina (Y), (W), isoleucina (I) y leucina
(L).
7. Procedimiento de la reivindicación 4, en donde
el residuo importado que tiene un menor volumen de cadena lateral se
selecciona de entre el grupo que consiste en glicina (G), alanina
(A), serina (S), treonina (T), y valina (V), y en donde el residuo
importado no es cisteína (C).
8. Procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, en donde el primer y segundo
polipéptido comprenden cada uno un dominio constante de
anticuerpo.
9. Procedimiento de la reivindicación 8, en donde
el primer y segundo polipéptido comprenden cada uno un dominio
constante de anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste
en un dominio C_{H}3 y un dominio constante de IgG.
10. Procedimiento de la reivindicación 1, en
donde el anticuerpo multiespecífico es una inmunoadhesina.
11. Procedimiento de la reivindicación 1, que
además comprende un paso que precede al paso (i) en donde dicho
ácido nucleico se introduce en la célula hospedadora.
12. Procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, en donde cada dominio
variable de cadena ligera es idéntico.
13. Procedimiento de la reivindicación 1, en
donde el anticuerpo multiespecífico comprende un primer dominio
variable de cadena ligera y un segundo dominio variable de cadena
ligera, y el primer y segundo dominios variables de cadena ligera
difieren el uno del otro, pero tienen al menos un 90% de identidad
de secuencia de aminoácidos.
14. Procedimiento de la reivindicación 13, en
donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen
al menos el 95% de identidad de secuencia de aminoácidos.
15. Procedimiento de la reivindicación 14, en
donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen
al menos el 98% de identidad de secuencia de aminoácidos.
16. Procedimiento de la reivindicación 15, en
donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen
al menos el 99% de identidad de secuencia de aminoácidos.
17. Anticuerpo multiespecífico que comprende al
menos dos dominios de unión diferentes, en donde,
- un primer dominio de unión une una primera molécula y un segundo dominio unidor une una segunda molécula diferente de dicha primera molécula,
- cada dominio de unión comprende (i) un dominio variable de cadena pesada que es parte de un polipéptido que comprende además un dominio de multimerización, y (ii) un dominio variable de una cadena ligera,
- el primer dominio de unión comprende un primer dominio variable de cadena pesada de un primer polipéptido, el segundo dominio de unión comprende un segundo dominio variable de cadena pesada de un segundo polipéptido, y el primer y segundo dominios variables de cadena pesada son diferentes, y
- los polipéptidos multimerizan mediante la interacción de dichos dominios de multimerización,
y en
donde,
- o bien cada dominio variable de cadena ligera es idéntico,
- o el anticuerpo multiespecífico comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un segundo dominio variable de cadena ligera, el primer y segundo dominios variables de cadena ligera difieren el uno del otro pero tienen al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, y dicho primer dominio de unión une dicha primera molécula, si dicho primer dominio de unión comprende el primer dominio variable de cadena ligera o el segundo dominio variable de cadena ligera, y dicho segundo dominio de unión une dicha segunda molécula, si dicho segundo dominio de unión comprende el segundo dominio variable de cadena ligera o el primer dominio variable de cadena ligera.
18. Anticuerpo multiespecífico de la
reivindicación 17, en donde el dominio de multimerización del primer
polipéptido, o el dominio de multimerización del segundo
polipéptido, o ambos, se proporcionan mediante la alteración de un
aminoácido.
19. Anticuerpo multiespecífico de la
reivindicación 18, en donde el dominio de multimerización de cada
uno de dichos primer o segundo polipéptidos comprende un residuo que
contiene un tiol libre, el cual forma un enlace disulfuro con un
residuo que contiene un tiol libre del dominio de multimerización
del otro de dichos primer o segundo polipéptidos.
20. Anticuerpo multiespecífico de la
reivindicación 18, en donde la multimerización de dichos
polipéptidos comprende una interacción de
protuberancia-en-cavidad, y el
dominio de multimerización del primer polipéptido comprende una
protuberancia, y el dominio de multimerización del segundo
polipéptido comprende una cavidad compensatoria.
21. Anticuerpo multiespecífico de la
reivindicación 20, en donde la protuberancia y la cavidad se generan
mediante alteraciones en las que se importan, en el primer y segundo
polipéptidos, aminoácidos que se encuentran de manera natural.
22. Anticuerpo multiespecífico de cualquiera de
las reivindicaciones 17-21, en donde cada dominio
variable de cadena ligera es idéntico.
23. Anticuerpo multiespecífico de la
reivindicación 17, en donde el anticuerpo multiespecífico comprende
un primer dominio variable de cadena ligera y un segundo dominio
variable de cadena ligera, y el primer y segundo dominios variables
de cadena ligera difieren el uno del otro, pero tienen al menos un
90% de identidad de secuencia de aminoácidos.
24. Anticuerpo multiespecífico de la
reivindicación 23, en donde el primer y segundo dominios variables
de cadena ligera tienen al menos un 95% de identidad de secuencia de
aminoácidos.
25. Anticuerpo multiespecífico de la
reivindicación 24, en donde el primer y segundo dominios variables
de cadena ligera tienen al menos un 98% de identidad de secuencia de
aminoácidos.
26. Anticuerpo multiespecífico de la
reivindicación 25, en donde el primer y segundo dominios variables
de cadena ligera tienen al menos un 99% de identidad de secuencia de
aminoácidos.
27. Composición que comprende el anticuerpo
multiespecífico de la reivindicación 17 y un portador.
28. Célula hospedadora que comprende ácido
nucleico que codifica el anticuerpo multiespecífico de la
reivindicación 17.
29. Célula hospedadora de la reivindicación 28,
en donde la célula hospedadora es una célula de mamífero.
30. Procedimiento para preparar un anticuerpo
multiespecífico que comprende un primer dominio de unión que une
una primera molécula y un segundo dominio de unión que une una
segunda molécula diferente de dicha primera molécula, comprendiendo
el procedimiento:
- (a)
- seleccionar un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que comprende un primer dominio variable de cadena pesada y un dominio de multimerización, y seleccionar un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que comprende un segundo dominio variable de cadena pesada y un dominio de multimerización, en donde el primer y segundo dominios variables de cadena pesada son diferentes y el dominio de multimerización de cada uno de dichos primer y segundo polipéptidos comprende un residuo aminoácido que interacciona específicamente con un residuo aminoácido en el dominio de multimerización del otro de dichos primer y segundo polipéptidos, generando de esta manera una interacción estable entre el primer y segundo polipéptidos:
- (b)
- o
- (i)
- seleccionar ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena ligera, en donde la cadena ligera variable interacciona con cada primer y segunda polipéptidos para formar dichos primer y segundo dominios de unión, o
- (ii)
- seleccionar un ácido nucleico que codifica una primera cadena ligera variable y un ácido nucleico que codifica una segunda cadena ligera variable, en donde las primera y segunda cadenas ligeras variables difieren entre ellas pero tienen al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, cada una de las primera y segunda cadenas ligeras variables interacciona con uno del primer y segundo polipéptidos para formar dichos primer y segundo dominios de unión, y dicho primer dominio de unión une dicha primera molécula, si dicho primer dominio de unión está formado por la interacción del primer polipéptido con la primera cadena ligera variable o por la interacción del primer polipéptido con la segunda cadena ligera variable, y dicho segundo dominio de unión une dicha segunda molécula, si dicho segundo dominio de unión está formado por la interacción del segundo polipéptido con la segunda cadena ligera variable o por la interacción del segundo polipéptido con la primera cadena ligera variable;
- (c)
- introducir dentro de una célula hospedadora el ácido nucleico que codifica el primer y segundo polipéptidos y la cadena ligera variable o las cadenas ligeras variables, y cultivar la célula de manera que tenga lugar la expresión del ácido nucleico, y que se produzcan los polipéptidos codificados y la cadena ligera variable o cadenas ligeras variables.
- (d)
- recuperar el anticuerpo multiespecífico del cultivo celular.
31. Procedimiento de la reivindicación 30, en
donde dicho primer ácido nucleico que codifica el primer
polipéptido, dicho segundo ácido nucleico que codifica el segundo
polipéptido, o ambos, se seleccionan a partir de ácido nucleico para
alterar la secuencia de aminoácidos codificada.
32. Procedimiento de la reivindicación 31, en
donde el primer y segundo polipéptidos interaccionan mediante una
interacción de
protuberancia-en-cavidad.
33. Procedimiento de la reivindicación 31, en
donde el ácido nucleico se altera para importar un residuo que
contiene un tiol libre en la secuencia de aminoácidos
codificada.
34. Procedimiento de la reivindicación 30, en
donde el primer y segundo polipéptidos comprenden cada uno un
dominio constante de anticuerpo.
35. Procedimiento de la reivindicación 34, en
donde el dominio constante de anticuerpo es un dominio C_{H}3.
36. Procedimiento de la reivindicación 34, en
donde el dominio constante de anticuerpo procede de una IgG
humana.
37. Procedimiento de la reivindicación 30, en
donde el ácido nucleico se selecciona de acuerdo con (i).
38. Procedimiento de la reivindicación 30, en
donde el ácido nucleico se selecciona de acuerdo con (ii).
39. Procedimiento de la reivindicación 38, en
donde la primera y segunda cadenas ligeras variables difieren la una
de la otra pero tienen al menos un 90% de identidad de secuencia de
aminoácidos.
40. Procedimiento de la reivindicación 39, en
donde la primera y segunda cadenas ligeras variables tienen al menos
un 95% de identidad de secuencia.
41. Procedimiento de la reivindicación 40, en
donde la primera y segunda cadenas ligeras variables tienen al menos
un 98% de identidad de secuencia.
42. Procedimiento de la reivindicación 41, en
donde la primera y segunda cadenas ligeras variables tienen al menos
un 99% de identidad de secuencia.
43. Procedimiento para medir la formación de un
anticuerpo multiespecífico heteromultimérico a partir de una mezcla
de polipéptidos, en donde el anticuerpo multiespecífico comprende al
menos dos dominios de unión diferentes, en donde,
- un primer dominio de unión une una primera molécula y un segundo dominio de unión une una segunda molécula diferente de dicha primera molécula,
- cada dominio de unión comprende (i) un dominio variable de cadena pesada que es parte de un polipéptido que comprende además un dominio de multimerización, y (ii) un dominio variable de una cadena ligera,
- el primer dominio de unión comprende un primer dominio variable de cadena pesada de un primer polipéptido, el segundo dominio de unión comprende un segundo dominio variable de cadena pesada de un segundo polipéptido, y el primer y segundo dominios variables de cadena pesada son diferentes, y
- los polipéptidos multimerizan mediante la interacción de dichos dominios de multimerización, en donde el dominio de multimerización de cada uno de dichos primer o segundo polipéptidos comprende un residuo que contiene tiol libre, el cual forma un enlace disulfuro con un residuo que contiene tiol libre del dominio de multimerización del otro de dichos primer y segundo polipéptidos,
y en
donde,
- o bien cada dominio variable de cadena ligera es idéntico,
- o el anticuerpo multiespecífico comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un segundo dominio variable de cadena ligera, el primer y segundo dominios variables de cadena ligera difieren el uno del otro pero tienen al menos el 80% de identidad de secuencia, y dicho primer dominio de unión une dicha primera molécula, si dicho primer dominio de unión comprende el primer dominio variable de cadena ligera o el segundo dominio variable de cadena ligera, y dicho segundo dominio de unión une dicha segunda molécula, si dicho segundo dominio de unión comprende el segundo dominio variable de cadena ligera o el primer dominio variable de cadena ligera,
comprendiendo el procedimiento los
pasos
de:
- (a)
- causar que cada uno de los anticuerpos multiespecíficos migre en una matriz de gel; y
- (b)
- determinar la cantidad relativa de una banda correspondiente al anticuerpo multiespecífico que tiene un enlace disulfuro que no se encuentra de manera natural entre el primer y segundo polipéptidos, y una banda que migra más lentamente correspondiente a un heteromultímero que carece de enlaces disulfuro que no se encuentran de manera natural entre el primer y segundo polipéptidos.
44. Procedimiento de la reivindicación 43, en
donde la multimerización de dichos polipéptidos está promovida
mediante una interacción de
protuberancia-en-cavidad entre los
dominios de multimerización.
45. Procedimiento de la reivindicación 43, en
donde cada dominio variable de cadena ligera es idéntico.
46. Procedimiento de la reivindicación 43, en
donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera
difieren entre ellos pero tienen al menos un 90% de identidad de
secuencia de aminoácidos.
47. Procedimiento de la reivindicación 46, en
donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen
al menos un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos.
48. Procedimiento de la reivindicación 47, en
donde la primera y segunda cadenas ligeras variables tienen al menos
un 98% de identidad de secuencia.
49. Procedimiento de la reivindicación 48, en
donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen
al menos un 99% de identidad de secuencia.
50. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde el anticuerpo multiespecífico se
selecciona de entre el grupo que consiste en el
anti-ECD del receptor de leptina humano
(Ob-R)/anti-HER3 quinasa de tirosina
del receptor humano, y el anti-receptor quinasa de
tirosina de la trombopoyetina humano (Mpi)/anti-HER3
quinasa de tirosina del receptor humano.
51. Anticuerpo multiespecífico de la
reivindicación 17, el cual se selecciona de entre el grupo que
consiste en anti-ECD del receptor de leptina humano
(Ob-R)/anti-HER3 quinasa de tirosina
del receptor humano, y el anti-receptor quinasa de
tirosina de la trombopoyetina humano (Mpi)/anti-HER3
quinasa de tirosina del receptor humano.
52. Composición que comprende el anticuerpo
multiespecífico de la reivindicación 51 y un portador.
53. Célula hospedadora de la reivindicación 28,
en donde el anticuerpo multiespecífico se selecciona de entre el
grupo que consiste en el anti-ECD del receptor de
leptina humano (Ob-R)/anti-HER3
quinasa de tirosina del receptor humano, y el
anti-receptor quinasa de tirosina de la
trombopoyetina humano (Mpi)/anti-HER3 quinasa de
tirosina del receptor humano.
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