JP2023542079A - 多重特異性抗体の精製 - Google Patents

Abstract

本開示は、マルチモードクロマトグラフィーを実施することにより、誤対合バリアントから多重特異性抗体を精製するための方法を提供する。【選択図】図４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０８０，９５０号に対する優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が援用されており、それに対して優先権が主張される。

多重特異性抗体と、少なくとも１つの産物特異的不純物を含む少なくとも１つの不純物とを含む組成物から、多重特異性抗体を精製するための方法が提供される。いくつかの実施態様では、産物特異的不純物は、例えば、多重特異性抗体の誤対合バリアントである。また、本方法に従って精製された多重特異性抗体、並びにそのような多重特異性抗体を含む組成物及び製剤も提供される。

ヒト患者への投与に許容される組換え生物薬剤学的タンパク質の場合、製造及び精製プロセスによって生じる残留不純物が最終生物学的産物から除去されることが重要である。これらのプロセス成分としては、培養培地タンパク質、免疫グロブリン親和性リガンド、ウイルス、内毒素、ＤＮＡ、及び宿主細胞タンパク質が挙げられる。多重特異性抗体などの新しい抗体フォーマットの開発では、従来の製造及び精製プロセスでは、対になっていない抗体アーム及び誤って組み立てられた抗体を含む産物特異的不純物を十分に除去することができないため、新たな課題がある。

標準的な抗体の精製と比較して、生産培地からの多重特異性抗体の精製は、独自の課題を提起する。標準的な単一特異性の二価抗体は、同一の重鎖／軽鎖サブユニットの二量化によって生じるが、多重特異性抗体を生成するには、それぞれが異なる重鎖と異なる軽鎖とを含む少なくとも２つの重鎖／軽鎖サブユニットの二量化が必要である。最終的に、誤対合の分子、誤って組み立てられた分子、又は不完全な分子を最小限に抑えた、正しく完全な多重特異性抗体を生成及び精製することには、さまざまな課題がある。鎖の誤対合（例えば、同一の重鎖ペプチドのホモ二量化、又は重鎖／軽鎖の不適切な会合）がしばしば観察される。一般的に観察される産物特異的不純物には、半（１／２）抗体（単一の重鎖／軽鎖のペアを含む）、スリークォーター（３／４）抗体（単一の軽鎖を欠く完全な抗体を含む）、及びホモ二量体が含まれる。使用する多重特異性フォーマットに応じて、産物特異的不純物が追加で観察される場合がある。例えば、多重特異性抗体の１つの可変ドメインが単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）として構築される場合、５／４抗体副産物（追加の重鎖又は軽鎖可変ドメインを含む）が観察される場合がある。このような対応する産物特異的不純物は、標準的な抗体生成では発生しないであろう。

ＨＣＰ、ＤＮＡ、エンドトキシン、及び抗体とは全く異なる特性や性質を有する他の材料などのプロセス関連不純物を除去するために設計された従来の精製技術は、多重特異性抗体により近い不純物を除去するために実施すると、不十分な場合があり得る。そのため、産物特異的不純物及び軽鎖の誤対合抗体を効果的に除去し、十分な量の正しく完全な多重特異性抗体を得るための製造及び精製スキームの開発が必要とされる。

特許出願及び刊行物を含め、本明細書に引用される参考文献は全て、あらゆる目的のために、参照によりそれらの全体が援用される。

本開示は、多重特異性抗体を精製するための方法であって、ａ）多重特異性抗体及びその誤対合バリアントを含む組成物を、誤対合バリアントが多重特異性抗体と比べてマルチモードクロマトグラフィー材料に優先的に結合する条件下で、マルチモードクロマトグラフィー材料と接触させることであって、多重特異性抗体が、第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合領域であって、第１の抗原に結合する抗体の軽鎖及び重鎖を含む、第１の抗原結合領域と、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合領域であって、第２の抗原に結合する抗体の軽鎖及び重鎖を含み、第２の抗原結合領域において可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、第２の抗原結合領域とを含み；その誤対合バリアントが、第１の抗原に結合する抗体の重鎖と、第２の抗原に結合する抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むペプチドとを含む、第１の抗原結合領域と、第２の抗原に結合する抗体の軽鎖及び重鎖を含む第２の抗原結合領域であって、第２の抗原結合領域において可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、第２の抗原結合領域とを含み；マルチモードクロマトグラフィー材料が、アニオン交換が可能な官能基と、疎水性相互作用が可能な官能基とを含む、組成物をマルチモードクロマトグラフィー材料と接触させることと；ｂ）多重特異性抗体及び減少した量のその誤対合バリアントを含む溶出物を回収することとを含む、方法を提供する。

特定の実施態様では、疎水性相互作用が可能な官能基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基、ベンジル基、又はそれらの任意の組み合わせを含む。特定の実施態様では、官能基はベンジル基を含む。特定の実施態様では、アニオン交換が可能な官能基は、正に帯電した基を含む。特定の実施態様では、正に帯電した基は、四級アンモニウムイオンである。特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィー材料は、Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミンを含む。特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィー材料は、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＡｄｈｅｒｅ樹脂を含む。特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィー材料は、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＡｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ樹脂を含む。

特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィーの溶出は、勾配溶出である。特定の実施態様では、勾配溶出はｐＨ勾配を含む。

特定の実施態様では、本方法は、捕捉クロマトグラフィー工程を含む。特定の実施態様では、捕捉クロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィー工程である。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程は、プロテインＡクロマトグラフィー工程、プロテインＬクロマトグラフィー工程、プロテインＧクロマトグラフィー工程、及びプロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー工程である。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程は、プロテインＡクロマトグラフィー工程である。特定の実施態様では、プロテインＡクロマトグラフィー材料は、アガロースに結合したプロテインＡを含む。

特定の実施態様では、捕捉クロマトグラフィー工程及びマルチモードクロマトグラフィー工程は連続する。特定の実施態様では、本方法は、マルチモードクロマトグラフィーの後に精製工程をさらに含む。特定の実施態様では、本方法は、多重特異性抗体の濃縮を含む。

特定の実施態様では、多重特異性抗体は、ノブ・イン・ホール修飾を含む。

特定の実施態様では、多重特異性抗体及びその誤対合バリアントは、同一の宿主細胞で生成される。特定の実施態様では、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞である。特定の実施態様では、宿主細胞は真核細胞である。特定の実施態様では、真核細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞である。特定の実施態様では、真核細胞はＣＨＯ細胞である。

本開示は、本明細書に開示される方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物を提供する。特定の実施態様では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。

本開示は、本明細書に開示される方法によって精製された多重特異性抗体を含む製造物品を提供する。本開示はまた、本明細書に開示される組成物を含む製造物品を提供する。

多重特異性抗体を産生するための方法の概略図を示す。図１Ａは、２細胞アプローチを使用することによる多重特異性抗体の産生の概要を示す。図１Ｂは、単一細胞アプローチを使用することによる多重特異性抗体産生の概要を示す。 多重特異性抗体のバリアントを表す。図２Ａは、異なる共有結合二量体と軽鎖誤対合バリアントの概略的な表を示す。図２Ｂは、正しく形成された二重特異性抗体（左図）と、交差した軽鎖誤対合バリアント（右図）を示す。 二重特異性抗体の結合が最小となる条件下で、共通の交差したＬＣ誤対合バリアントが樹脂によく結合することを示した等高線図を示す。 ｐＨ、ＵＶ吸光度、溶出混合勾配、及び導電率を示すクロマトグラムを示す。 ロード原料組成物と多重特異性抗体及びＬＣ誤対合バリアントを表す画分を比較した質量分析データである。 回収及び測定した画分の組成と濃度とを示す疑似クロマトグラムを示す。メインピークが主に二重特異性抗体を含むことを示す。 回収及び測定した画分の組成と濃度とを示す疑似クロマトグラムを示す。二重特異性及びＬＣ誤対合バリアントの正規化された疑似クロマトグラムを示す。 正しい対の多重特異性抗体及びＬＣ誤対合バリアントのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ構造分析を示す。

本開示は、少なくとも部分的には、マルチモードクロマトグラフィーを実施することにより、同一細胞によって産生される多重特異性抗体の誤対合バリアントを除去することが可能であるという知見に基づいている。本開示は、驚くべきことに、マルチモードクロマトグラフィーが、所望の多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体をその不要なバリアントから分離できることを示す。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． １９９４）、及びＭａｒｃｈ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈ ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． １９９２）は、本出願で使用される用語の多くに関する一般的指針を当業者に提供する。

定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数形で使用される用語は、単数形も含む。以下に記載されるいずれかの定義が、参照により本明細書に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合には、以下に記載される定義が優先するものとする。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数形の参照対象を含む。したがって、例えば、「ａ ｐｒｏｔｅｉｎ（タンパク質）」又はａｎ 「ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗体）」への言及は、複数のタンパク質又は抗体を含み、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」への言及は、細胞の混合物を含み、その他も同様である。

本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容され得る誤差範囲内を意味し、これは、その値がどのように測定又は決定されるか、即ち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、３以内又は３を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、さらに好ましくは５％まで、さらになお好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁違い以内、好ましくは５倍以内、さらに好ましくは２倍以内を意味し得る。本明細書における「約」値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータ自体を対象とする実施態様を含む（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」について言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で同義に使用される。ポリマーは、直鎖状又は分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、また非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然に、又は介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、若しくは任意の他の操作又は改変、例えば、標識成分とのコンジュゲートにより改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。また、例えば、アミノ酸の１つ又は複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、並びに当該技術分野において既知の他の修飾を含有するポリペプチドも、この定義の範囲内に含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗体を具体的に包含する。

「精製された」ポリペプチド（例えば、抗体又はイムノアドヘシン）とは、ポリペプチドがその天然環境下で存在するよりもさらに純粋な形態で存在するように、並びに／又は実験室条件下で最初に合成及び／若しくは増幅されたときにポリペプチドの純度が増加することを意味する。純度は相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度を意味するわけではない。本明細書で互換的に使用される「精製」、「分離」又は「単離」という用語は、所望の分子（多重特異性抗体など、例えば二重特異性抗体など）及び１つ又は複数の不純物を含む組成物又はサンプルから所望の分子の純度の程度を高めることを指す。典型的には、組成物から少なくとも１つの不純物を（完全に又は部分的に）除去することによって、所望の分子の純度の程度が高められる。

「目的の抗原と結合する」多重特異性抗体は、タンパク質又はタンパク質を発現する細胞若しくは組織を標的とする診断薬及び／又は治療薬として有用であるように、抗原、例えばタンパク質と十分な親和性をもって結合し、他のタンパク質と有意に交差反応しないものである。そのような実施態様では、「非標的」タンパク質への多重特異性抗体の結合の程度は、例えば、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析、放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）、又はＥＬＩＳＡなどによって決定される、その特定の標的タンパク質への多重特異性抗体の結合の約１０％未満となる。多重特異性抗体の標的分子への結合に関して、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的に結合する」又は「特異的である」という用語は、非特異的相互作用（例えば、非特異的相互作用はウシ血清アルブミン又はカゼインへの結合であり得る）と明らかに異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、分子の結合を対照分子の結合と比較して判定することによって測定され得る。例えば、特異的結合は、標的に類似している対照分子、例えば、過剰な非標識標的との競合によって決定し得る。この場合、標識した標的のプローブに対する結合が、過剰な非標識標的によって競合的に阻害される場合に、特異的結合が示される。本明細書で使用される、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的（な）結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的」という用語は、例えば、標的に対するＫｄが少なくとも約２００ｎｍ、あるいは少なくとも約１５０ｎｍ、あるいは少なくとも約１００ｎｍ、あるいは少なくとも約６０ｎｍ、あるいは少なくとも約５０ｎｍ、あるいは少なくとも約４０ｎｍ、あるいは少なくとも約３０ｎｍ、あるいは少なくとも約２０ｎｍ、あるいは少なくとも約１０ｎｍ、あるいは少なくとも約８ｎｍ、あるいは少なくとも約６ｎｍ、あるいは少なくとも約４ｎｍ、あるいは少なくとも約２ｎｍ、あるいは少なくとも約１ｎｍ、又はそれを超える親和性を有する分子によって、示され得る。一実施態様では、「特異的結合」という用語は、多重特異性抗原結合タンパク質が、いずれの他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合する場合の結合を指す。

「結合親和性」は、概して、分子（例えば、多重特異性抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映する、固有結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。例えば、Ｋｄは、約２００ｎＭ以下、約１５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約６０ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約８ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、又は約１ｎＭ以下であり得る。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般に、抗原とゆっくり結合し、容易に解離する傾向にあるが、高親和性抗体は、一般に、抗原と迅速に結合し、より長く結合したままの傾向にある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で知られており、これらのいずれも、本明細書で提供される方法及び組成物の目的に使用することができる。

本明細書の目的についての「活性な」又は「活性」とは、天然の又は天然に存在するポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するポリペプチド（多重特異性抗体など）の形態（複数可）を指し、「生物学的」活性とは、天然の又は天然に存在するポリペプチドが有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の天然の又は天然に存在するポリペプチドによって引き起こされる生物学的機能（阻害又は刺激のいずれか）を指し、「免疫学的」活性とは、天然の又は天然に存在するポリペプチドが有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力を指す。

抗体、断片、又はその誘導体など、本明細書で提供される多重特異性抗原結合タンパク質に関する「生物学的に活性な」及び「生物学的活性」及び「生物学的特性」は、他に規定される場合を除き、生体分子に結合する能力を有することを意味する。

本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を具体的に包含するが、これは、それらが所望の生物学的活性を示す場合に限る。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書で抗体と交換可能に使用される。

抗体は、種々の構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子であり、それらの構造は全て免疫グロブリン折り畳みに基づく。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合して機能的抗体を形成する２つの「重」鎖及び２つの「軽」鎖を有する。各重鎖及び軽鎖はそれ自体、「定常」（Ｃ）領域及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域が抗体の抗原結合特異性を決定する一方で、Ｃ領域は、構造的支持を提供し、免疫エフェクタとの非抗原特異的相互作用において機能する。抗体又は抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性は、抗体が特定の抗原に特異的に結合する能力である。

抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特徴によって決定される。可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸長にわたって均等に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、各々９～１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極端に可変性の短い領域によって分離されている、１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の伸長部からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用する４つのＦＲを含み、これらは、３つの超可変領域により連結され、これらは、βシート構造を連結し、いくつかの場合にはその一部を形成するループを形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって共に近接近して保持されており、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への寄与等の種々のエフェクタ機能を呈する。

各Ｖ領域は、典型的には、３つの相補性決定領域（各々が「超可変ループ」を含む「ＣＤＲ」）、及び４つのフレームワーク領域を含む。したがって、特定の所望の抗原に対して実質的な親和性で結合するために必要とされる最小の構造単位である抗体結合部位は、典型的には、３つのＣＤＲと、適切な立体構造でＣＤＲを保持及び提示するためにそれらの間に散在する少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域とを含む。古典的な４鎖抗体は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインによって協働して決定される抗原結合部位を有する。ラクダ抗体及びサメ抗体等の特定の抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成される結合部位に依存する。単一ドメイン操作免疫グロブリンは、ＶＨとＶＬとの間に協働がない場合、結合部位が重鎖又は軽鎖のみによって形成されるように調製され得る。

「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分の配列が抗体間で大きく異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。これは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方において超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβ３シート構成を採用する４つのＦＲを含み、これらは、３つの超可変領域により連結され、これらは、βシート構造を連結し、いくつかの場合にはその一部を形成するループを形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって共に近接近して保持されており、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ． （１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への寄与等の種々のエフェクタ機能を呈する。

「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬのおよそ２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７（Ｌ３）残基の周辺、並びにＶＨのおよそ３１～３５Ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）残基の周辺（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））、及び／又は「超可変ループ」からのそれらの残基（例えば、ＶＬの残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）及び９１～９６（Ｌ３）、並びにＶＨの２６～３２（Ｈ１）、５２Ａ～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７ （１９８７））を含み得る。

「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

抗体又は半抗体との関連での「ヒンジ領域」は、概して、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までの伸長と定義される（Ｂｕｒｔｏｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６ （１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖内Ｓ－Ｓ結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に入れることによってＩｇＧ１配列と整列し得る。

Ｆｃ領域の「下部ヒンジ領域」は、通常、ヒンジ領域のすぐＣ末端にある残基の伸長、すなわち、Ｆｃ領域の残基２３３～２３９と定義される。本出願の前は、ＦｃγＲ結合は、概して、ＩｇＧ Ｆｃ領域の下部ヒンジ領域におけるアミノ酸残基に起因するものであった。

ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、ＩｇＧの残基約２３１から約３４０まで延びる。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接に対になっていないという点で特有である。むしろ、２つのＮ結合分岐状炭水化物鎖がインタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に介在する。炭水化物がドメイン－ドメイン対合の代替を提供し、ＣＨ２ドメインを安定させるのに役立ち得ることが推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６ （１９８５）。

「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまで（すなわち、ＩｇＧのアミノ酸残基約３４１からアミノ酸残基約４４７）の残基の伸長を含む。

「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、直鎖状抗体（例えば、米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）：１０５７－１０６２ （１９９５））；１アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、一本鎖抗体分子；抗体断片から形成される多重特異性抗体（例えば、限定されるものではないが、Ｄｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４－Ｆｃ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｂｉ－ｓｃＦｖ又はタンデム（ｄｉ、ｔｒｉ）－ｓｃＦｖ）；及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）が挙げられる。

抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して名付けられた残留「Ｆｃ」断片とが生じる。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）とともに全Ｌ鎖、及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が生じ、これは、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片にほぼ対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加のいくつかの残基を有している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして産生されたものであった。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用してＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのは、この構成においてである。まとめると、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識してそれに結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性が低い。

Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されているという点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する、本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。

任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（Ｋ）及びラムダ（２）と呼ばれる２つの明らかに異なる型のうちの１つに割り当てられ得る。

抗体は、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当て得る。インタクトな抗体には５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、さらに「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分けることができる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、ａ、６、ｃ、ｙ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元配置は周知である。

「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。いくつかの実施態様では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖに関する概説については、例えば、Ｐｌｉｉｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９－３１５ （１９９４）を参照のこと。

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ第４０４０９７号； 国際公開第９３／１１１６１号；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４－６４４８ （１９９３）にさらに詳細に記載されている。

本明細書で使用される「半抗体」又は「ヘミマー」という用語は、一価の抗原結合ポリペプチドを指す。特定の実施態様では、半抗体又はヘミマーは、ＶＨ／ＶＬ単位及び任意選択的に免疫グロブリン定常ドメインの少なくとも一部を含む。特定の実施態様では、半抗体又はヘミマーは、１つの免疫グロブリン軽鎖に関連する１つの免疫グロブリン重鎖、又はその抗原結合断片を含む。特定の実施態様では、半抗体又はヘミマーは、単一特異的であり、すなわち、単一の抗原又はエピトープに結合する。当業者であれば、半抗体が、例えばラクダ科に由来する単一の可変ドメインからなる抗原結合ドメインを有し得ることを容易に理解するであろう。

「ＶＨ／ＶＬ単位」という用語は、少なくとも１つのＶＨ ＨＶＲと少なくとも１つのＶＬ ＨＶＲとを含む抗体の抗原結合領域を指す。特定の実施態様では、ＶＨ／ＶＬ単位は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つすべてのＶＨ ＨＶＲと、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つすべてのＶＬ ＨＶＲとを含む。特定の実施態様では、ＶＨ／ＶＬ単位は、フレームワーク領域（ＦＲ）の少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施態様では、ＶＨ／ＶＬ単位は、３つのＶＨ ＨＶＲと３つのＶＬ ＨＶＲとを含む。いくつかの実施態様では、ＶＨ／ＶＬ単位は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つすべてのＶＨ ＨＶＲと、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つすべてのＶＬ ＨＶＲとを含む。

「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、多重エピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つ若しくはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができるか、又は２つ若しくはそれ以上の異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる）抗原結合ドメインを含む抗体を具体的に網羅する。いくつかの実施態様では、多重特異性抗体（二重特異性抗体又は二価Ｆ（ａｂ’）２など）の抗原結合ドメインは、２つのＶＨ／ＶＬ単位を含み、第１のＶＨ／ＶＬ単位は、第１のエピトープに特異的に結合し、第２のＶＨ／ＶＬ単位は、第２のエピトープに特異的に結合し、各ＶＨ／ＶＬ単位は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。そのような多重特異性抗体としては、完全長抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、及びトリアボディなど）、共有結合又は非共有結合で連結されている抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。重鎖定常領域の少なくとも一部及び／又は軽鎖定常領域の少なくとも一部をさらに含むＶＨ／ＶＬ単位は、「ヘミマー」又は「半抗体」とも称され得る。いくつかの実施態様では、半抗体は、単一の重鎖可変領域の少なくとも一部及び単一の軽鎖可変領域の少なくとも一部を含む。いくつかのそのような実施態様では、２つの半抗体を含み、かつ２つの抗原に結合する二重特異性抗体は、第１の抗原又は第１のエピトープに結合するが、第２の抗原又は第２のエピトープには結合しない第１の半抗体、及び第２の抗原又は第２のエピトープに結合するが、第１の抗原又は第１のエピトープには結合しない第２の半抗体を含む。いくつかの実施態様によれば、多重特異性抗体は、５Ｍ～０．００１ｐＭ、３Ｍ～０．００１ｐＭ、１Ｍ～０．００１ｐＭ、０．５Ｍ～０．００１ｐＭ、又は０．１Ｍ～０．００１ｐＭの親和性で各抗原又はエピトープに結合するＩｇＧ抗体である。いくつかの実施態様において、ヘミマーは、第２のヘミマーとの分子内ジスルフィド結合が形成されることを可能にするのに十分な重鎖可変領域の一部分を含む。いくつかの実施態様において、ヘミマーは、例えば、相補的ホール変異又はノブ変異を含む第２のヘミマー又は半抗体とのヘテロ二量体化を可能にする、ノブ変異又はホール変異を含む。ノブ変異及びホール変異は、以下でさらに論じられる。

「二重特異性抗体」は、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することができるか、又は２つの異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体である。二重特異性抗体は、本明細書において「二重特異性（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」を有する、又は「二重特異性（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」であると呼ばれることがある。別途指示されない限り、二重特異性抗体によって結合される抗原が二重特異性抗体名で列記される順序は無作為である。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び任意選択的に重鎖定常領域の少なくとも一部、並びに単一の軽鎖可変領域及び任意選択的に軽鎖定常領域の少なくとも一部を含む。ある特定の実施態様では、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、１つよりも多くの単一の重鎖可変領域を含まず、１つよりも多くの単一の軽鎖可変領域を含まない。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、第１の半抗体は、第１の抗原に結合し、第２の抗原には結合せず、第２の半抗体は、第２の抗原に結合し、第１の抗原には結合しない。

本明細書で使用される場合、「ノブ・イントゥ・ホール」又は「ＫｉＨ」技術という用語は、２つのポリペプチドを、それらが相互作用する接触面で一方のポリペプチド中に隆起（ノブ）を導入し、他方のポリペプチド中に空洞（ホール）を導入することによって、インビトロ又はインビボでの対合を指向する技術を指す。例えば、ＫｉＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合接触面、ＣＬ：ＣＨ１接触面、又はＶＨ／ＶＬ接触面に導入されている（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２８７００９号、同第２００７／０１７８５５２号、国際公開第９６／０２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、及びＺｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ６：７８１－７８８を参照）。いくつかの実施態様では、ＫｉＨにより、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖の対合が一緒にもたらされる。例えば、それらのＦｃ領域内にＫｉＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインをさらに含み得るか、又は類似の若しくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインをさらに含み得る。ＫｉＨ技術を使用して、２つの異なる受容体細胞外ドメインを一緒に、又は異なる標的認識配列（例えば、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、及び他のＦｃ融合物を含む）を含む任意の他のポリペプチド配列を対合することもできる。

本明細書で使用される「ノブ変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する接触面で隆起（ノブ）をポリペプチド中に導入する変異を指す。いくつかの実施態様では、他方のポリペプチドは、ホール変異を有する（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、同第５，８０７，７０６号、同第５，８２１，３３３号、同第７，６９５，９３６号、同第８，２１６，８０５号を参照。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

本明細書で使用される「ホール変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する接触面で空洞（ホール）をポリペプチド中に導入する変異を指す。いくつかの実施態様では、他方のポリペプチドは、ノブ変異を有する（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、同第５，８０７，７０６号、同第５，８２１，３３３号、同第７，６９５，９３６号、同第８，２１６，８０５号を参照。これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に援用される）。

「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」という表現は、概して、単一可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）が抗原結合を付与し得る抗体を指す。言い換えれば、単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために他の可変ドメインと相互作用する必要はない。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科動物（ラマ及びラクダ）並びに軟骨魚類（例えば、テンジクザメ）由来の抗体、並びにヒト及びマウス抗体由来の組換え方法から得られる抗体が挙げられる（Ｎａｔｕｒｅ （１９８９） ３４１：５４４－５４６； Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ （２００６） ３０：４３－５６； Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ （２００１） ２６：２３０－２３５； Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２００３）：２１：４８４－４９０；国際公開第２００５／０３５５７２号；同第０３／０３５６９４号； ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ （１９９４） ３３９：２８５－２９０；国際公開第００／２９００４号；同第０２／０５１８７０号）。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る想定されるバリアントは除外され、そのようなバリアントは、概して、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の免疫グロブリンによって汚染されない点でも有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈すべきではない。例えば、本明細書で提供される方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８ （１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１－５９７ （１９９１）に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離され得る。

本明細書におけるモノクローナル抗体には、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一又は相同である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにそれらが所望の生物学的活性を呈する限りはそのような抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５ （１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル、又はカニクイザルなどの旧世界ザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む、「霊長類化」抗体が含まれる（米国特許第５，６９３，７８０号）。

「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、若しくは非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、上述のＦＲ置換（複数可）を除いて、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、かつＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリンの定常領域、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２￢５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９ （１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９３－５９６ （１９９２）を参照のこと。

本明細書において「インタクトな抗体」は、重及び軽可変ドメイン、並びにＦｃ領域を含むものである。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列バリアントであり得る。好ましくは、インタクトな抗体は、１つ又は複数のエフェクタ機能を有する。

「天然抗体」とは、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖が１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結される一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。

「ネイキッド抗体」は、細胞傷害性部分又は放射性標識などの異種分子とコンジュゲートされない、（本明細書において定義する）抗体である。

本明細書において使用される用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドへシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組合わせる分子を意味する。構造的に、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を有するアミノ酸配列（このアミノ酸配列は、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（すなわち、抗体の定常領域と比較して「異種」である））と、免疫グロブリン定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧのＣＨ２及び／又はＣＨ３配列）との融合を含む。例示的アドヘシン配列には、対象のタンパク質に結合する受容体又はリガンドの一部を含む近接するアミノ酸配列が含まれる。アドヘシン配列は、対象のタンパク質に結合するが、受容体又はリガンド配列（例えば、ペプチボディ中のアドヘシン配列）には結合しない配列でもあり得る。このようなポリペプチド配列は、ファージディスプレイ技術及びハイッスループット選別方法を含む様々な方法により選択又は同定することができる。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、又はＩｇＧ－４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ－１及びＩｇＡ－２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用される。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、これらの受容体の対立遺伝子及び選択的スプライシング形態を含む、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、及びＦｃｙＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃｙＲＩＩ受容体には、ＦｃｙＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃｙＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃｙＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃｙＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５：２０３－２３４ （１９９７）を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２ （１９９１）； Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５￢３４ （１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｈｎ． Ｍｅｄ． １２６：３３０－４１ （１９９５）に概説されている。今後同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書において「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語には、胎児への母親のＩｇＧの移行を担う新生児の受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７：５８７ （１９７６） ａｎｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：２４９ （１９９４））。

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞は「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と完全に同一の核酸含量でない場合があるが、変異を含んでもよい。本明細書では、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体の子孫が、含まれる。

「不純物」とは、所望のポリペプチド産物とは異なる物質を指す。不純物は、ワンアーム抗体及び誤って組み立てられた抗体などの産物特異的なポリペプチド、塩基性バリアント及び酸性バリアントを含む抗体バリアント、並びに凝集体を指し得る。その他の不純物には、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）などの宿主細胞物質；浸出プロテインＡ；核酸；別のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス混入物；細胞培地成分等が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの例においては、不純物は、細菌細胞、例えば、大腸菌細胞、昆虫細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞からのＨＣＰであり得るが、これらに限定されない。いくつかの例では、不純物は、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞からのＨＣＰ、すなわち、ＣＨＯ細胞タンパク質（ＣＨＯＰ）であり得る。不純物は、多重特異性抗体の発現、折り畳み、又は組み立てを促進するために使用されるアクセサリータンパク質；例えば、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣなどの原核生物シャペロンなどを指す場合がある。

本明細書で使用される「複合体」又は「複合した」は、ペプチド結合でない結合及び／又は力（例えば、ファンデルワールス、疎水性、親水性の力）により互いに相互作用する２つ以上の分子の会合を指す。一実施態様では、複合体はヘテロ多量体である。本明細書において使用される「タンパク質複合体」又は「ポリペプチド複合体」という用語は、タンパク質複合体中のタンパク質にコンジュゲートした非タンパク質物（例えば、限定しないが、毒素又は検出剤といった化学分子を含む）を有する複合体を含むことを理解されたい。

「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、又は天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。ある特定の実施態様では、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルし得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２ プログラムによって設定され、変化しない。

ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、ある特定のアミノ酸配列同一性％を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
［式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によってそのプログラムのＡとＢとのアラインメントにおいて完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解される。別途具体的に示されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して得られる］。

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖又は抗体軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は一般に、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含んでいる、類似の構造を有する。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ ｅｄ．， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， ９１頁 （２００７）を参照のこと。）単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨ又はＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：８８０－８８７ （１９９３）； Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８ （１９９１）を参照のこと。

「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それが連結している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造体としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある特定のベクターは、作用可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。

クロマトグラフィーに関して本明細書で使用される「逐次的」という用語は、特定の順序でのクロマトグラフィー工程を指す；例えば、第１のクロマトグラフィー工程に続いて第２のクロマトグラフィー工程があり、それに続いて第３のクロマトグラフィー工程がある、等である。逐次的なクロマトグラフィー工程間に追加の工程が含まれてもよい。

クロマトグラフィーに関して本明細書で使用される「継続的」という用語は、直接接続されているか、又は２つのクロマトグラフィー材料の間の継続流を可能にする何らかの他の機構を介して接続された第１のクロマトグラフィー材料と第２のクロマトグラフィーとを有することを指す。

「ローディング密度」は、クロマトグラフィー材料の体積（例えば、リットル）と接触した組成物の量（例えば、グラム）を指す。いくつかの例では、ローディング密度は、ｇ／Ｌで表される。

「試料」とは、より大量の材料のわずか一部を指す。一般に、本明細書に記載の方法による試験は、試料に対して実行される。試料は、典型的には、例えば、培養された組換えポリペプチド発現細胞株（本明細書で「産物細胞株」とも称される）から、又は培養された宿主細胞から得られる組換えポリペプチド調製物から得られる。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、目的とする組換えポリペプチド又は産物の発現のための遺伝子を含有しない。試料は、例えば限定されないが、採取された細胞培養液から、精製方法の特定の工程の工程中プールから、又は最終的な精製産物から得られる。試料は、希釈剤、緩衝剤、洗浄剤、及び所望の分子（多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体など）と混合して見出される汚染種、残屑などを含み得る。

「薬学的製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象に許容できないほどに有毒な更なる成分を含有しない調製物を指す。そのような製剤は無菌である。「薬学的に許容され得る」賦形剤（ビヒクル、添加物）は、対象哺乳動物に適度に投与されて、用いられる有効用量の活性成分を提供することができるものである。

多重特異性抗体の精製方法
抗体製造プロセスの信頼性は、「ノブ・イントゥ・ホール」多重特異性抗体の発現及びＣｒｏｓｓＭａｂ抗体の開発など、さまざまな戦略によって向上してきた。しかし、このような戦略を用いて単一細胞内で多重特異性抗体を製造する場合、誤対合ポリペプチドを含む抗体バリアントを排除するために、下流の精製工程に依存することになる。

ある特定の非限定的な実施態様では、本開示は、多重特異性抗体を精製するための方法を提供する。ある特定の実施態様では、多重特異性抗体は、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。ある特定の実施態様では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。ある特定の実施態様では、多重特異性抗体は、第１の標的と結合する第１のＦ（ａｂ）と、第２の標的と結合する第２のＦ（ａｂ）と、を含む二価のＦ（ａｂ’）_２である。ある特定の実施態様では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体、すなわち、アミノ酸配列が同一である２つの抗原結合アームを有する抗体であり、各Ｆａｂアームが２つの抗原を認識することができる（二重作用Ｆａｂ抗体など）。

ある特定の実施態様では、多重特異性抗体の精製は、マルチモードクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施態様では、多重特異性抗体は、捕捉クロマトグラフィーの前に組み立てられる。いくつかの実施態様では、多重特異性抗体は、捕捉クロマトグラフィーの前に組み立てられる。

特定の実施態様では、多重特異性抗体（二重特異性抗体又は二価のＦ（ａｂ’）_２など）は、異なる抗体アームが異なるエピトープを結合する、２つ以上の抗体アームを含む。特定の実施態様では、異なるエピトープが同じ抗原上にある。特定の実施態様では、異なるエピトープが異なる抗原上にある。特定の実施態様では、抗体アームは、ＶＨ／ＶＬ単位を含む。特定の実施態様では、抗体アームは、半抗体としても知られるヘミマーを含む。特定の実施態様では、１つの抗体アームの重鎖は「ノブ」を含むように修飾され、別の抗体アームの重鎖は「ホール」を含み、第１の重鎖のノブが第２の重鎖のホールに適合するようになっている。

特定の実施態様では、多重特異性抗体は、同一の宿主細胞内で産生される。例えば、以下のリストは、多重特異性抗体が同じ宿主細胞で産生され、収穫物がプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製される、ＣｒｏｓｓＭａｂ二特異性抗体培養収穫物中で同定された産物関連バリアントを含む。

自動液体処理システムを使用して、さまざまなｐＨ及びバッファー強度の条件下で、５つの異なるクロマトグラフィー樹脂への原料の結合を試験した。インキュベーション後、未結合画分を分析したところ、驚くべきことに、図３に示したアニオン交換挙動（高ｐＨ）及び疎水性結合（高塩濃度）を同時に促進する条件下でのみ、ＬＣ誤対合バリアント（図２Ａ及び２Ｂに記載）の枯渇が生じることが確認された。

特定の実施態様では、細胞培地は回収され、抗体はマルチモードクロマトグラフィーに供される。特定の実施態様では、マルチモード材料は、以下の機能性：アニオン交換、カチオン交換、水素結合、π－π結合相互作用、親水性相互作用、チオフィリック相互作用、及び疎水性相互作用のうちの１つ又は複数が可能な官能基を含む。いくつかの実施態様では、マルチモード材料は、アニオン交換及び疎水性相互作用が可能な官能基を含む。

特定の実施態様では、マルチモード材料は、正に帯電した基と芳香環構造体とを含む。特定の実施態様では、正に帯電した基は、アミン又は四級アンモニウムイオンである。特定の実施態様では、芳香環構造体はベンジル基である。特定の実施態様では、マルチモード材料は、Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルベンジルアミン、４－メルカプト－エチル－ピリジン、２－ベンズアミド－４－メルカプトブタン酸、ヘキシルアミン、フェニルプロピルアミン、架橋ポリアリルアミン、又はそれらの組み合わせを含む。例えば、限定されないが、マルチモード材料には、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＡｄｈｅｒｅ樹脂、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＭＭＣ樹脂、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ^ＴＭ樹脂、ＨＥＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ^ＴＭ樹脂、ＰＰＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ^ＴＭ樹脂、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＨＣＸ、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＡｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＭＭＣ Ｉｍｐｒｅｓ、Ｎｕｖｉａ^ＴＭｃＰｒｉｍｅ^ＴＭ膜が含まれる。特定の実施態様では、マルチモード材料は、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＡｄｈｅｒｅ樹脂である。特定の実施態様では、マルチモード材料は、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＭＭＣである。特定の実施態様では、マルチモード材料は、カラム内にある。特定の実施態様では、マルチモード材料は、膜内にある。特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モードで実施される。特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィーは、「フロースルー」モードで実施される。

特定の実施態様では、溶出は段階溶出である。特定の実施態様では、溶出は勾配溶出である。

特定の実施態様では、本明細書で開示される方法は、捕捉クロマトグラフィーをさらに含む。特定の実施態様では、捕捉クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィーである。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡクロマトグラフィーである。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＧクロマトグラフィーである。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡ／Ｇクロマトグラフィーである。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＬクロマトグラフィーである。捕捉クロマトグラフィーに続いて、精製された抗体アームが、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥＣクロマトグラフィー、質量分析などによって、分析され得る。

特定の実施態様では、細胞培地は回収され、捕捉クロマトグラフィーに供される。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程からの溶出物は、その後、本明細書に開示されるマルチモードクロマトグラフィーに適用される。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、プロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー、又はプロテインＬクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィー材料は、例えば、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）－ｖＡ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭＦａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＴＭＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ^ＴＭ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ^ＴＭＬＸ、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ、及びＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ^ＴＭＦｃＸＬを含むが、これらに限定されない。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィー材料は、カラム内にある。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、「結合及び溶出モード」（あるいは、「結合及び溶出プロセス」と称される）で実施される。「結合及び溶出モード」は、試料中の産物（多重特異性抗体など）がアフィニティークロマトグラフィー材料に結合し、その後アフィニティークロマトグラフィー材料から溶出される、産物分離技術である。特定の実施態様では、溶出は、溶出プロセス中に、１回又は数回の機会に、移動相の組成を段階的に変化させる、段階溶出である。特定の実施態様では、溶出は、溶出プロセス中に移動相の組成を継続的に変化させる、勾配溶出である。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィー材料は、膜内にある。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡクロマトグラフィーである。特定の実施態様では、プロテインＡクロマトグラフィーは、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ^ＴＭＳｕＲｅクロマトグラフィーである。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ^ＴＭクロマトグラフィーである。特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィーは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ^ＴＭＦｃＸＬクロマトグラフィーである。

特定の実施態様では、捕捉クロマトグラフィー及びマルチモードクロマトグラフィーは継続的であり、例えば、捕捉クロマトグラフィー材料及びマルチモード材料は、直接接続されているか、又は捕捉クロマトグラフィー材料とマルチモード材料との間の継続的な流れを可能にする何らかの他の機構により接続されている。特定の実施態様では、捕捉クロマトグラフィー及びマルチモードクロマトグラフィーは連続的であり、マルチモードクロマトグラフィーは捕捉クロマトグラフィーの後に直接実施される。

特定の実施態様では、捕捉クロマトグラフィーからの溶出物は、マルチモード樹脂に適用される前に、１つ又は複数の追加のクロマトグラフィー工程に供される。特定の非限定的な実施態様では、例えば、捕捉クロマトグラフィーからの溶出物は、マルチモードクロマトグラフィーに供される前に、任意の順序及び／又は任意の組み合わせで、以下：疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）などのクロマトグラフィー工程のうちの任意の１つ又は複数に供することができる。

疎水性相互作用クロマトグラフィーは、疎水性に応じて生体分子を分離する液体クロマトグラフィー技術である。例えば、限定されないが、ＨＩＣクロマトグラフィー材料は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ^ＴＭＨｅｘｙｌ－６５０、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＴＭＢｕｔｙｌ－６５０、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＴＭＰｈｅｎｙｌ－６５０、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＴＭＥｔｈｅｒ－６５０、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭ、又はＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭを含む。特定の実施態様では、ＨＩＣクロマトグラフィー材料は、フェニルセファロースを含む。特定の実施態様では、ＨＩＣクロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モードで実施される。特定の実施態様では、ＨＩＣクロマトグラフィーは、「フロースルー」モードで実施される。特定の実施態様では、ＨＩＣクロマトグラフィー材料は、カラム内にある。特定の実施態様では、ＨＩＣクロマトグラフィー材料は、膜内にある。

アニオン交換クロマトグラフィー材料は、正に帯電した固体相であり、この固体相の上方又は中を通過する水溶液（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）中のアニオンと交換される遊離アニオンを有する。特定の実施態様では、アニオン交換材料は、膜、モノリス、又は樹脂であり得る。特定の実施態様では、アニオン交換材料は、樹脂であり得る。いくつかの実施態様では、アニオン交換材料は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、若しくは第四級アンモニウムイオン官能基、ポリアミン官能基、又はジエチルアミノエチル官能基を含み得る。例えば、限定されないが、アニオン交換材料は、Ｐｏｒｏｓ^ＴＭＨＱ ５０、Ｐｏｒｏｓ^ＴＭＰＩ ５０、Ｐｏｒｏｓ^ＴＭＤ、Ｍｕｓｔａｎｇ^ＴＭＱ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＱＳＦＦ）、Ａｃｃｅｌｌ^ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ Ｍｅｔｈｙｌ Ａｍｉｎｅ（ＱＭＡ）樹脂、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣ（登録商標）、及びＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭを含む。特定の実施態様では、アニオン交換クロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モードで実施される。特定の実施態様では、アニオン交換クロマトグラフィーは、「フロースルー」モードで実施される。特定の実施態様では、アニオン交換クロマトグラフィー材料は、カラム内にある。特定の実施態様では、アニオン交換クロマトグラフィー材料は、膜内にある。

カチオン交換クロマトグラフィー材料は、負に帯電した固体相であり、この固体相の上方又は中を通過する水溶液（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）中のカチオンと交換される遊離カチオンを有する。特定の実施態様では、カチオン交換材料は、膜、モノリス、又は樹脂であり得る。いくつかの実施態様では、カチオン交換材料は、樹脂であり得る。カチオン交換材料は、カルボン酸官能基又はスルホン酸官能基を含み得る。例えば、限定するものではないが、カチオン交換材料は、スルホン酸塩、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチル、又はオルトリン酸塩を含み得る。いくつかの実施態様では、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、カチオン交換クロマトグラフィーカラムである。上述の特定の実施態様では、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、カチオン交換クロマトグラフィー膜である。例えば、限定されないが、カチオン交換材料は、Ｍｕｓｔａｎｇ^ＴＭＳ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｓ、ＳＯ３ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ（例えば、ＣＩＭ（登録商標）、ＣｌＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）及びＣＩＭａｃ（登録商標）ＳＯ３など）、Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）、Ｐｏｒｏｓ^ＴＭＸＳ、Ｐｏｒｏｓ^ＴＭＨＳ ５０、ＰｏｒｏｓＴＭＨＳ ２０、スルホプロピル－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標） Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （ＳＰＳＦＦ）、ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標） ＸＬ （ＳＰＸＬ）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭＦａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＳ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^ＴＭＥＭＤ Ｓｅ Ｈｉｃａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^ＴＭＥＭＤ Ｓ０３、又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ^ＴＭＥＭＤ ＣＯＯを含む。特定の実施態様では、カチオン交換クロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モードで実施される。特定の実施態様では、カチオン交換クロマトグラフィーは、「フロースルー」モードで実施される。上述の特定の実施態様では、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、カラム内にある。上述の特定の実施態様では、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、膜内にある。

特定の実施態様では、本開示は、多重特異性抗体、すなわち、二重特異性抗体を、前記多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から分離する方法を提供し、この方法は、組成物をマルチモードクロマトグラフィーに供することと、多重特異性抗体を含む画分を回収することとを含み、多重特異性抗体は、同じ宿主細胞によって産生される。特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モードで実施される。

特定の実施態様では、本方法は、組成物を捕捉クロマトグラフィーに供して第１の溶出物を生成することと、第１の溶出物をマルチモードクロマトグラフィーに供することと、多特異性抗体を含む画分を回収することとを含む。特定の実施態様では、捕捉クロマトグラフィーは、プロテインＡクロマトグラフィーである。

特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィーからの溶出物は、１つ又は複数の追加のクロマトグラフィー工程に供される。例えば、限定されないが、マルチモードクロマトグラフィーからの溶出物は、任意の順序及び／又は任意の組み合わせで、以下：疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、マルチモードクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程のうちの任意の１つ又は複数に供することができる。

特定の実施態様では、方法は、バッファーを使用することを含む。多重特異性抗体の精製中に、様々なバッファーが用いられ得る。例えば、バッファーは、多重特異性抗体の特性に基づいて、異なるｐＨ及び／又は導電性を有し得る。特定の実施態様では、バッファーは、ローディングバッファー、平衡バッファー、又は洗浄バッファーであり得る。特定の実施態様では、ローディングバッファー、平衡バッファー、及び／又は洗浄バッファーのうちの１つ又は複数は同じである。特定の実施態様では、ローディングバッファー、平衡バッファー、及び／又は洗浄バッファーは異なる。特定の実施態様では、バッファーは塩を含む。特定の実施態様では、バッファーは、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ ＨＣ１、Ｔｒｉｓアセテート、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＭＥＳ、ＣＨＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢｉｓＴｒｉｓ、アルギニン、アルギニンＨＣ１、又はそれらの混合物を含む。特定の実施態様では、バッファーは塩化ナトリウムバッファーである。いくつかの実施態様では、バッファーは酢酸ナトリウムバッファーである。特定の実施態様では、バッファーは、Ｔｒｉｓ、アルギニン、リン酸塩、ＭＥＳ、ＣＨＥＳ、又はＭＯＰＳバッファーである。

「ロード」とは、組成物がクロマトグラフィー材料に担持されることを指す。ローディングバッファーは、組成物（例えば、多重特異性抗体及び不純物を含む組成物）をクロマトグラフィー材料（本明細書に記載のクロマトグラフィー材料のうちのいずれか１つなど）にロードするために使用されるバッファーである。クロマトグラフィー材料は、精製される組成物のロード前に平衡バッファーを用いて平衡化され得る。洗浄バッファーは、組成物をクロマトグラフィー材料にロードした後に使用される。溶出バッファーは、目的のポリペプチドを固体相から溶出するために使用される。

本明細書に記載のいずれかのクロマトグラフィー材料への多重特異性抗体を含む組成物（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）のローディングは、多重特異性抗体と不純物の分離のために最適化され得る。特定の実施態様では、クロマトグラフィーが結合及び溶出モード（例えばマルチモードクロマトグラフィー）で実施される場合、多重特異性抗体を含む組成物（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）のクロマトグラフィー材料へのローディングは、多重特異性抗体のクロマトグラフィー材料への結合のために最適化されている。

伝導度とは、２つの電極間に電流を伝導する水溶液の能力を指す。溶液中で、電流は、イオン輸送により流れる。したがって、水溶液中に存在するイオンの量が増加すると、溶液は、より高い伝導度を有するようになる。伝導度の尺度の基本単位は、ジーメンス（Ｓｉｅｍｅｎ）（ｍＳ／ｃｍ）又はオーム（ｍｈｏ）であり、様々なモデルのＯｒｉｏｎ伝導度計などの伝導度計を使用して測定され得る。電解質伝導度は溶液中のイオンの電流を流す能力であるため、溶液の伝導度は、その中のイオンの濃度を変化させることによって変更され得る。特定の非限定的な実施態様では、、例えば、溶液中のバッファー剤の濃度及び／又は塩（例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、又は塩化カリウム）の濃度は、所望の伝導度を達成するために変更され得る。特定の実施態様では、様々なバッファーの塩濃度は、所望の伝導度を達成するために改変される。

特定の非限定的な実施態様では、例えば、多重特異性抗体を含む組成物（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）は、ローディングバッファーの伝導度が一定である間、多くの異なるｐＨ値でローディングバッファー中でクロマトグラフィー材料にロードされる。特定の実施態様では、多重特異性抗体を含む溶液は、ローディングバッファーのｐＨが一定である間、多くの異なる伝導度でローディングバッファー中でクロマトグラフィー材料にロードされる。多重特異性抗体を含む組成物（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）のクロマトグラフィー材料へのローディングと、クロマトグラフィー材料からの多重特異性抗体のプール画分への溶出とが完了した時点で、プール画分中に残存する不純物の量は、所与のｐＨ又は伝導度での不純物からの多重特異性抗体の分離に関する情報を提供する。同様に、多重特異性抗体がクロマトグラフィー材料中を流れるクロマトグラフィーでは、多重特異性抗体がクロマトグラフィー中を流れるのに対して、不純物はクロマトグラフィー材料によって保持されるか又は多重特異性抗体とは異なる速度でクロマトグラフィー材料中を流れるように、ローディングバッファーは、ｐＨ及び伝導度が最適化される。

特定の実施態様では、多重特異性を含む溶液のローディング密度は、アフィニティークロマトグラフィー材料の約１ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１１０ｇ／Ｌ、約１２０ｇ／Ｌ、約１３０ｇ／Ｌ、約１４０ｇ／Ｌ、又は約１５０ｇ／Ｌのうちのいずれかよりも大きい。特定の実施態様では、多重特異性抗体を含む溶液のローディング密度は、捕捉クロマトグラフィー材料の約１ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌと２０ｇ／Ｌの間、約２０ｇ／Ｌと３０ｇ／Ｌの間、約３０ｇ／Ｌと４０ｇ／Ｌの間、約４０ｇ／Ｌと５０ｇ／Ｌの間、約５０ｇ／Ｌと６０ｇ／Ｌの間、約６０ｇ／Ｌと７０ｇ／Ｌの間、約７０ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌの間、約８０ｇ／Ｌと９０ｇ／Ｌの間、約９０ｇ／Ｌと１００ｇ／Ｌの間のうちのいずれかである。

特定の実施態様では、捕捉クロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、マルチモードクロマトグラフィー材料（例えば、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＡｄｈｅｒｅ）にロードされる。特定の実施態様では、捕捉クロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、マルチモードクロマトグラフィー材料の約１０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１１０ｇ／Ｌ、約１２０ｇ／Ｌ、約１３０ｇ／Ｌ、約１４０ｇ／Ｌ、又は約１５０ｇ／Ｌのうちのいずれかよりも大きい多重特異性抗体のローディング密度でマルチモードクロマトグラフィー材料にロードされる。特定の実施態様では、捕捉クロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、マルチモードクロマトグラフィー材料の約１ｇ／Ｌと約５ｇ／Ｌの間、約５ｇ／Ｌと約１０ｇ／Ｌの間、約１０ｇ／Ｌと約２０ｇ／Ｌの間、約２０ｇ／Ｌと約３０ｇ／Ｌの間、約３０ｇ／Ｌと約４０ｇ／Ｌの間、約４０ｇ／Ｌと約５０ｇ／Ｌの間、約５０ｇ／Ｌと約６０ｇ／Ｌの間、約６０ｇ／Ｌと約７０ｇ／Ｌの間、約７０ｇ／Ｌと約８０ｇ／Ｌの間、約８０ｇ／Ｌと約９０ｇ／Ｌの間、約９０ｇ／Ｌと約１００ｇ／Ｌの間のうちのいずれかの多重特異性抗体のローディング密度でマルチモードクロマトグラフィー材料にロードされる。

特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、後続のクロマトグラフィー材料（疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィー材料、アニオン交換クロマトグラフィー材料、カチオン交換クロマトグラフィー材料、サイズ排除クロマトグラフィー材料、アフィニティークロマトグラフィー材料、又は追加のマルチモードクロマトグラフィー材料など）の約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１１０ｇ／Ｌ、約１２０ｇ／Ｌ、約１３０ｇ／Ｌ、約１４０ｇ／Ｌ、又は約１５０ｇ／Ｌのうちのいずれかよりも大きい多重特異的抗体のローディング密度で、後続のクロマトグラフィー材料にロードされる。いくつかの実施態様では、マルチモードクロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、後続のクロマトグラフィー材料（疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィー材料、アニオン交換クロマトグラフィー材料、カチオン交換クロマトグラフィー材料、サイズ排除クロマトグラフィー材料、アフィニティークロマトグラフィー材料、又は追加のマルチモードクロマトグラフィー材料など）の約１０ｇ／Ｌと２０ｇ／Ｌの間、約２０ｇ／Ｌと３０ｇ／Ｌの間、約３０ｇ／Ｌと４０ｇ／Ｌの間、約４０ｇ／Ｌと５０ｇ／Ｌの間、約５０ｇ／Ｌと６０ｇ／Ｌの間、約６０ｇ／Ｌと７０ｇ／Ｌの間、約７０ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌの間、約８０ｇ／Ｌと９０ｇ／Ｌの間、約９０ｇ／Ｌと１００ｇ／Ｌの間のいずれかの多重特異性抗体のローディング密度で、後続のクロマトグラフィー材料にロードされる。

本明細書で使用される溶出は、クロマトグラフィー材料からの産物、例えば多重特異性抗体、の除去である。溶出バッファーは、クロマトグラフィー材料から多重特異性抗体を溶出するために使用されるバッファーである。特定の実施態様では、溶出バッファーは、ローディングバッファーよりも低い伝導度を有する。特定の実施態様では、溶出バッファーは、ローディングバッファーよりも高い伝導度を有する。特定の実施態様では、溶出バッファーは、ローディングバッファーよりも低いｐＨを有する。特定の実施態様では、溶出バッファーは、ローディングバッファーよりも高いｐＨを有する。特定の実施態様では、溶出バッファーは、ローディングバッファーとは異なる伝導度及び異なるｐＨを有する。

特定の実施態様では、クロマトグラフィー材料からの多重特異性抗体の溶出は、不純物を最小限に抑え、最小限の溶出量又はプール量で、生成物の収量が得られるように最適化される。特定の非限定的な実施態様では、例えば、多重特異性抗体を含む組成物は、ローディングバッファー中でクロマトグラフィー材料にロードされ得る。ローディングが完了した時点で、多重特異性抗体は、溶出バッファーの伝導度が一定である間に、多くの異なるｐＨ値のバッファーを用いて溶出される。あるいは、多重特異性抗体は、溶出バッファーのｐＨが一定である間に、多くの異なる伝導度の溶出バッファー中のクロマトグラフィー材料から溶出され得る。クロマトグラフィー材料からの多重特異性抗体の溶出が完了した時点で、プール画分中の不純物の量は、所与のｐＨ又は伝導度についての不純物からの多重特異性抗体又は抗体アームの分離に関する情報を提供する。大きなカラム容積（例えば、８カラム容積）における多重特異性抗体の溶出は、溶出プロファイルの「テーリング」を示す。

特定の実施態様では、本明細書で開示される方法は、バッファーの使用を含む。バッファーの所望のｐＨ、バッファーの所望の伝導度、目的のタンパク質の特性、クロマトグラフィー材料、及び精製プロセス（例えば、「結合及び溶出」モード又は「フロースルー」モード）に基づいて、様々なバッファーが用いられ得る。特定の実施態様では、方法は、少なくとも１つのバッファーの使用を含む。特定の実施態様では、バッファーは、ローディングバッファー、平衡バッファー、溶出バッファー、又は洗浄バッファーであり得る。特定の実施態様では、ローディングバッファー、平衡バッファー、溶出バッファー、及び／又は洗浄バッファーのうちの１つ又は複数は同じである。特定の実施態様では、ローディングバッファー、平衡バッファー、及び／又は洗浄バッファーは異なる。特定の実施態様では、バッファーは塩を含む。特定の実施態様では、ローディングバッファーは、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ、アルギニン、リン酸塩、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＣＨＥＳ、ＢｉｓＴｒｉｓ、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、クエン酸塩、コハク酸塩、又はそれらの混合物を含み得る。特定の実施態様では、バッファーは塩化ナトリウムバッファーである。特定の実施態様では、バッファーは酢酸ナトリウムバッファーである。特定の実施態様では、バッファーは、Ｔｒｉｓ、アルギニン、リン酸塩、ＭＥＳ、ＣＨＥＳ、又はＭＯＰＳバッファーである。特定の実施態様では、バッファーはＴｒｉｓを含む。特定の実施態様では、バッファーはアルギニンを含む。

特定の実施態様では、ローディングバッファーは、約１．０ｍＳ／ｃｍ、約１．５ｍＳ／ｃｍ、約２．０ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ、約３．０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ、約４．０ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、又は約２０ｍＳ／ｃｍのいずれかよりも大きい伝導度を有する。特定の実施態様では、伝導度は、約１ｍＳ／ｃｍと約２０ｍＳ／ｃｍの間、約４ｍＳ／ｃｍと約１０ｍＳ／ｃｍの間、約４ｍＳ／ｃｍと約７ｍＳ／ｃｍの間、約５ｍＳ／ｃｍと約１７ｍＳ／ｃｍの間、約５ｍＳ／ｃｍと約１０ｍＳ／ｃｍの間、又は約５ｍＳ／ｃｍと約７ｍＳ／ｃｍの間のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、伝導度は、約１．０ｍＳ／ｃｍ、約１．５ｍＳ／ｃｍ、約２．０ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ、約３．０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、又は約２０ｍＳ／ｃｍのいずれかである。特定の実施態様では、伝導度は、ローディングバッファー、平衡バッファー、及び／又は洗浄バッファーの伝導度である。特定の実施態様では、ローディングバッファー、平衡バッファー、及び洗浄バッファーのうちの１つ又は複数の伝導度は同じである。いくつかの実施態様では、ローディングバッファーの伝導度は、洗浄バッファー及び／又は平衡バッファーの伝導度とは異なる。

いくつかの実施態様では、溶出バッファーは、ローディングバッファーの伝導度よりも小さい伝導度を有する。特定の実施態様では、溶出バッファーは、約０ｍＳ／ｃｍ、約０．５ｍＳ／ｃｍ、約１．０ｍＳ／ｃｍ、約１．５ｍＳ／ｃｍ、約２．０ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ、約３．０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ、約４．０ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、又は７．０ｍＳ／ｃｍのいずれかよりも小さい伝導度を有する。いくつかの実施態様では、伝導度は、約０ｍＳ／ｃｍと約７ｍＳ／ｃｍの間、約１ｍＳ／ｃｍと約７ｍＳ／ｃｍの間、約２ｍＳ／ｃｍと約７ｍＳ／ｃｍの間、約３ｍＳ／ｃｍと約７ｍＳ／ｃｍの間、又は４ｍＳ／ｃｍと約７ｍＳ／ｃｍの間、約０ｍＳ／ｃｍと約５．０ｍＳ／ｃｍの間、約１ｍＳ／ｃｍと約５ｍＳ／ｃｍの間、約２ｍＳ／ｃｍと約５ｍＳ／ｃｍの間、約３ｍＳ／ｃｍと約５ｍＳ／ｃｍの間、又は約４ｍＳ／ｃｍと約５ｍＳ／ｃｍの間のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、溶出バッファーの伝導度は、約０ｍＳ／ｃｍ、約０．５ｍＳ／ｃｍ、約１．０ｍＳ／ｃｍ、約１．５ｍＳ／ｃｍ、約２．０ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ、約３．０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、又は約７．０ｍＳ／ｃｍのいずれかである。

いくつかの実施態様では、溶出バッファーは、ローディングバッファーの伝導度よりも大きい伝導度を有する。特定の実施態様では、溶出バッファーは、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍ、約１２ｍＳ／ｃｍ、約１３ｍＳ／ｃｍ、約１４ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ、約１６ｍＳ／ｃｍ、約１７．０ｍＳ／ｃｍ、約１８．０ｍＳ／ｃｍ、約１９．０ｍＳ／ｃｍ、約２０．０ｍＳ／ｃｍ、約２１．０ｍＳ／ｃｍ、約２２．０ｍＳ／ｃｍ、約２３．０ｍＳ／ｃｍ、約２４．０ｍＳ／ｃｍ、約２５．０ｍＳ／ｃｍ、約２６．０ｍＳ／ｃｍ、約２７．０ｍＳ／ｃｍ、約２８．０ｍＳ／ｃｍ、約２９．０ｍＳ／ｃｍ、又は約３０．０ｍＳ／ｃｍのいずれかよりも大きい伝導度を有する。特定の実施態様では、伝導度は、約５．５ｍＳ／ｃｍと約３０ｍＳ／ｃｍの間、約６．０ｍＳ／ｃｍと約３０ｍＳ／ｃｍの間、約７ｍＳ／ｃｍと約３０ｍＳ／ｃｍの間、約８ｍＳ／ｃｍと約３０ｍＳ／ｃｍの間、約９ｍＳ／ｃｍと約３０ｍＳ／ｃｍの間、又は約１０ｍＳ／ｃｍと約３０ｍＳ／ｃｍの間のいずれかであり得る。特定の実施態様では、溶出バッファーの伝導度は、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍ、約１２ｍＳ／ｃｍ、約１３ｍＳ／ｃｍ、約１４ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ、約１６ｍＳ／ｃｍ、約１７．０ｍＳ／ｃｍ、１８．０ｍＳ／ｃｍ、約１９．０ｍＳ／ｃｍ、約２０．０ｍＳ／ｃｍ、約２１．０ｍＳ／ｃｍ、約２２．０ｍＳ／ｃｍ、約２３．０ｍＳ／ｃｍ、約２４．０ｍＳ／ｃｍ、約２５．０ｍＳ／ｃｍ、約２６．０ｍＳ／ｃｍ、約２７．０ｍＳ／ｃｍ、約２８．０ｍＳ／ｃｍ、約２９．０ｍＳ／ｃｍ、又は約３０．０ｍＳ／ｃｍのいずれかである。特定の実施態様では、溶出バッファーの伝導度は、段階勾配又は線形勾配によって、ローディングバッファー及び／又は洗浄バッファーから変化する。

特定の実施態様では、多重特異性抗体を含む組成物は、約１００ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有するローディングバッファー中でマルチモードクロマトグラフィー材料にロードされ、ポリペプチドは、約１００ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有する溶出バッファー中で混合クロマトグラフィー材料から溶出される。特定の実施態様では、ローディングバッファーは約１００ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有し、溶出バッファーは、約１００ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有する。特定の実施態様では、ローディングバッファーは約１００ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有し、溶出バッファーは、約１００ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有する。特定の実施態様では、ローディングバッファーは約１００ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度を有し、溶出バッファーは、約ｘｘｘｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィー材料は、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＡｄｈｅｒｅ樹脂である。特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィー材料は、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＭＭＣ樹脂である。

特定の実施態様では、溶出バッファーの伝導度は、段階勾配又は線形勾配によって、ローディングバッファー及び／又は洗浄バッファーから変化する。

特定の実施態様では、ローディングバッファーは、約１０、約９、約８、約７、約６、又は約５のいずれかよりも小さいｐＨを有し、これらの値の間の任意の範囲を含む。特定の実施態様では、ローディングバッファーは、約４、約５、約６、約７、約８、又は約９のいずれかよりも大きいｐＨを有し、これらの値の間の任意の範囲を含む。特定の実施態様では、ローディングバッファーは、約４と約９、約４と約８、約４と約７、約５と約９、約５と約８、約５と約７、約５と約６の間のいずれかのｐＨを有し、これらの値の間の任意の範囲を含む。特定の実施態様では、ローディングバッファーのｐＨは、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、又は約８．５のいずれかのｐＨを有し、これらの値の間の任意の範囲を含む。

いくつかの実施態様では、溶出は、ローディングバッファーのｐＨよりも小さいｐＨを有する。特定の実施態様では、溶出バッファーは、約８、約７、約６、約５、約４、約３、又は約２のいずれかよりも小さいｐＨを有し、これらの値の間の任意の範囲を含む。特定の実施態様では、溶出バッファーのｐＨは、約４と約９、約４と約８、約４と約７、約４と約６、約４と約５、約５と約９、約５と約８、約５と約７、約５と約６、約６と約９、約６と約８、約６と約７の間のいずれかであってよく、これらの値の間の任意の範囲を含む。特定の実施態様では、溶出バッファーのｐＨは、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、又は約９．０のいずれかであり、これらの値の間の任意の範囲を含む。

いくつかの実施態様では、溶出バッファーは、ローディングバッファーのｐＨよりも大きいｐＨを有する。特定の実施態様では、溶出バッファーは、約５、約６、約７、約８、又は約９のいずれかよりも大きいｐＨを有し、これらの値の間の任意の範囲を含む。特定の実施態様では、溶出バッファーは、約２、約４、又は約４のいずれかよりも大きいｐＨを有し、これらの値の間の任意の範囲を含む。特定の実施態様では、溶出バッファーのｐＨは、約２と約９、約３と約９、約４と約９、約２と約８、約３と約８、約４と約８、約２と約７、約３と約７、約４と約７、約２と約６、約３と約６、約４と約６の間のいずれかであり得、これらの値の間の任意の範囲を含む。いくつかの実施態様では、溶出バッファーのｐＨは、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０のいずれかであり、これらの値の間の任意の範囲を含む。

特定の実施態様では、多重特異性抗体を含む溶液は、約ｐＨ７でアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー）にロードされ、多重特異性抗体又は抗体アームは、約２．９のｐＨへの段階勾配によってアフィニティークロマトグラフィーから溶出される。

特定の実施態様では、溶出バッファーのｐＨは、段階勾配又は線形勾配によって、ローディングバッファー及び／又は洗浄バッファーから変化する。

特定の実施態様では、流量は、約５０ＣＶ／時間未満、約４０ＣＶ／時間未満、又は約３０ＣＶ／時間未満である。流量は、約５ＣＶ／時間と５０ＣＶ／時間の間、約１０ＣＶ／時間と４０ＣＶ／時間の間、又は１８ＣＶ／時間と３６ＣＶ／時間の間であり得る。特定の実施態様では、流量は、約９ＣＶ／時間、約１８ＣＶ／時間、約２５ＣＶ／時間、約３０ＣＶ／時間、約３６ＣＶ／時間、又は約４０ＣＶ／時間のいずれかである。特定の実施態様では、流量は、約１００ｃｍ／時間未満、約７５ｃｍ／時間未満、又は約５０ｃｍ／時間未満のいずれかである。特定の実施態様では、流量は、約２５ｃｍ／時間と約１５０ｃｍ／時間の間、約２５ｃｍ／時間と約１００ｃｍ／時間の間、約５０ｃｍ／時間と約１００ｃｍ／時間の間、又は約６５ｃｍ／時間と約８５ｃｍ／時間の間のうちのいずれかであり得る。

床高さとは、使用されるクロマトグラフィー材料の高さである。特定の実施態様では、床高さは、約５ｃｍ、約１０ｃｍ、約１５ｃｍ、約２０ｃｍ、約２５ｃｍ、約３０ｃｍ、約３５ｃｍ、約４０ｃｍ、約４５ｃｍ、又は約５０ｃｍのうちのいずれかよりも大きい。特定の実施態様では、床高さは、約５ｃｍと約５０ｃｍの間である。特定の実施態様では、床高さは、ロード中のポリペプチド又は汚染物質の量に基づいて決定される。

特定の実施態様では、クロマトグラフィーは、約１ｍＬ、約２ｍＬ、約３ｍＬ、約４ｍＬ、約５ｍＬ、約６ｍＬ、約７ｍＬ、約８ｍＬ、約９ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬ、約５０ｍＬ、約７５ｍＬ、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約２５Ｌ、約５０Ｌ、約１００Ｌ、約２００Ｌ、約３００Ｌ、約４００Ｌ、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌ、又は約１０００Ｌよりも大きい容量を有するカラム又は容器内にある。

特定の実施態様では、画分がクロマトグラフィーから回収される。特定の実施態様では、回収される画分は、約０．０１ＣＶ、約０．０２ＣＶ、約０．０３ＣＶ、約０．０４ＣＶ、約０．０５ＣＶ、約０．０６ＣＶ、約０．０７ＣＶ、約０．０８ＣＶ、約０．０９ＣＶ、約０．１ＣＶ、約０．２ＣＶ、約０．３ＣＶ、約０．４ＣＶ、約０．５ＣＶ、約０．６ＣＶ、約０．７ＣＶ、約０．８ＣＶ、０．９ＣＶ、約１．０ＣＶ、２．０ＣＶ、約３．０ＣＶ、約４．０ＣＶ、５．０ＣＶ、約６．０ＣＶ、約７．０ＣＶ、約８．０ＣＶ、約９．０ＣＶ、又は１０．０ＣＶよりも大きい。

特定の実施態様では、精製物、例えば、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）を含有する画分は、プールされる、特定の非限定的な実施態様では、画分中のポリペプチドの量は、当業者によって決定することができる。例えば、限定されるものではないが、画分中のポリペプチドの量は、ＵＶ分光法によって決定することができる。特定の実施態様では、ＯＤ２８０が、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９及び約１．０のいずれかよりも大きいときに画分が回収される。特定の実施態様では、ＯＤ２８０が、約０．５と約１．０の間、約０．６と約１．０の間、約０．７と約１．０の間、約０．８と約１．０の間、又は約０．９と約１．０の間であるときに画分が回収される。特定の実施態様では、検出可能な多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む画分がプールされる。

特定の実施態様では、不純物は産物特異的不純物である。例えば、限定するものではないが、産物特異的不純物には、対になっていない半抗体、対になっていない抗体軽鎖、対になっていない重鎖、誤対合抗体、抗体断片、ホモ二量体（例えば、同じ重鎖及び軽鎖を含む、二重特異性抗体の対になった半二量体）、凝集体、高分子量種（ＭＨＷＳ）（超高分子量種（ｖＨＭＷＳ）等）、誤対合ジスルフィドを有する多重特異性抗体、軽鎖二量体、重鎖二量体、低分子量種（ＬＭＷＳ）、及び他のバリアントが含まれる。図２Ａ及び２Ｂは、産物特異的不純物の図式的な例を示す。

特定の実施態様では、本開示は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び不純物を含む組成物から、軽鎖誤対合多重特異性抗体のレベルを除去又は低減するための方法を提供する。特定の実施態様では、本開示は、組成物中の軽鎖誤対合抗体の存在又はレベルを測定する方法を提供する。例えば、限定するものではないが、軽鎖誤対合抗体は、質量分析、ＣＥ－ＳＤＳ、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ ＨＰＬＣによって測定することができる。特定の実施態様では、１つ又は複数の精製工程から回収された組成物中の軽鎖誤対合抗体の量は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれかよりも低減される。特定の実施態様では、１つ又は複数の精製工程から回収された組成物中の軽鎖誤対合抗体の量は、約１０と約９５％の間；約１０％と約９９％の間；約２０％と約９５％の間；約２０％と約９９％の間；約３０％と約９５％の間；約３０％と約９９％の間；約４０％と約９５％の間；約４０％と約９９％の間；約５０％と約９５％の間；約５０％と約９９％の間；約６０％と約９５％の間；約６０％と約９９％の間；約７０％と約９５％の間；約７０％と約９９％の間；約８０％と約９５％の間；約８０％と約９９％の間；約９０％と約９５％の間；又は約９０％と約９９％の間のいずれか低減される。

特定の実施態様では、多重特異性抗体は、クロマトグラフィーの後（例えば、マルチモードクロマトグラフィーの後）に濃縮される。特定の非限定的な実施態様では、例えば、濃縮方法は、限外ろ過及び透析ろ過（ＵＦＤＦ）を含む。特定の実施態様では、濃縮後の多重特異性抗体の濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、又は約３００ｍｇ／ｍＬのいずれかである。特定の実施態様では、多重特異性抗体の濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬと約２０ｍｇ／ｍＬの間、約２０ｍｇ／ｍＬと約３０ｍｇ／ｍＬの間、約３０ｍｇ／ｍＬと約４０ｍｇ／ｍＬの間、約４０ｍｇ／ｍＬと約５０ｍｇ／ｍＬの間、約５０ｍｇ／ｍＬと約６０ｍｇ／ｍＬの間、約６０ｍｇ／ｍＬと約７０ｍｇ／ｍＬの間、約７０ｍｇ／ｍＬと約８０ｍｇ／ｍＬの間、約８０ｍｇ／ｍＬと約９０ｍｇ／ｍＬの間、約９０ｍｇ／ｍＬと約１００ｍｇ／ｍＬの間、約１００ｍｇ／ｍＬと約１１０ｍｇ／ｍＬの間、約１１０ｍｇ／ｍＬと約１２０ｍｇ／ｍＬの間、約１２０ｍｇ／ｍＬと約１３０ｍｇ／ｍＬの間、約１３０ｍｇ／ｍＬと約１４０ｍｇ／ｍＬの間、約１４０ｍｇ／ｍＬと約１５０ｍｇ／ｍＬの間、約１５０ｍｇ／ｍＬと約１６０ｍｇ／ｍＬの間、約１６０ｍｇ／ｍＬと約１７０ｍｇ／ｍＬの間、約１７０ｍｇ／ｍＬと約１８０ｍｇ／ｍＬの間、約１８０ｍｇ／ｍＬと約１９０ｍｇ／ｍＬの間、約１９０ｍｇ／ｍＬと約２００ｍｇ／ｍＬの間、約２００ｍｇ／ｍＬ、又は３００ｍｇ／ｍＬの間のいずれかである。

特定の実施態様では、本明細書に記載の方法は、精製されたポリペプチドと薬学的に許容される担体を組み合わせることをさらに含む。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、限外濾過／透析濾過によって医薬製剤に製剤化される。

特定の実施態様では、本明細書で提供される方法は、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％のいずれかの純度を超える多重特異性抗体を含む組成物を生成する。特定の実施態様では、組成物中の多重特異性抗体は、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のいずれかの純度より高い。

特定の実施態様では、本明細書で提供される方法は、約０．１％以下、約０．２％以下、約０．３％以下、約０．４％以下、約０．５％以下、約０．６％以下、約０．７％以下、約０．８％以下、約０．９％以下、約１％以下、約１．５％以下、約２％以下、約２．５％以下、約３％以下、約３．５％以下、約４％以下、約４．５％以下、約５％以下、約５．５％以下、約６％以下、約６．５％以下、約７％以下、約７．５％以下、約８％以下、約８．５％以下、約９％以下、約９．５％以下、又は約１０％以下のいずれかの誤対合抗体を含有する多重特異性抗体を含む組成物を生成する。

特定の実施態様では、本開示は、本明細書で開示される方法のいずれか１つによって精製された多重特異性抗体を含む組成物を提供する。特定の実施態様では、組成物中の多重特異性抗体は、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％のいずれかの純度より高い。特定の実施態様では、組成物中の多重特異性抗体は、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のいずれかの純度より高い。特定の実施態様では、多重特異性抗体を含む組成物は、約０．１％、約０．２％、約０．３％， ０．４％、約０．５％以下、約０．６％以下、約０．７％以下、約０．８％以下、約０．９％以下、約１％以下、約１．５％以下、約２％以下、約２．５％以下、約３％以下、約３．５％以下、約４％以下、約４．５％以下、約５％以下、約５．５％以下、約６％以下、約６．５％以下、約７％以下、約７．５％以下、約８％以下、約８．５％以下、約９％以下、約９．５％以下、約１０％以下のいずれかの誤対合抗体を含有する。

特定の実施態様では、本開示は、本明細書で開示される方法のいずれか１つによって精製された多重特異性抗体を含む組成物を提供する。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体であり、ノブ・イン・ホール（ＫｉＨ）抗体、例えば、ＫｉＨ二重特異性抗体である。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体、例えば二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。

特定の実施態様では、本明細書で開示される方法は、組成物中の、宿主細胞タンパク質、浸出プロテインＡ、核酸、細胞培地成分、又はウイルス不純物の除去を含む。

多重特異性抗体
特定の非限定的な実施態様では、本開示は、多重特異性抗体、例えば多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体を精製するための方法を提供する。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、同じ宿主細胞によって産生される。

特定の実施態様では、本開示は、多重特異性抗体を作製するための方法を含む。例えば、限定されないが、これらの技術は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ ３０５： ５３７ （１９８３）、国際公開第９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １０： ３６５５ （１９９１）を参照）、「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号）、及び「ＣｒｏｓｓＭａｂ」抗体（例えば、欧州特許第３１２６３９５Ｂ１号）を含む。多重特異抗体は、抗体のＦｃ－ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９： ８１ （１９８５）を参照）；二重特異性抗体を産生するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８（５）：１５４７－１５５３ （１９９２）を参照）；二重特異性抗体断片を作製するために 「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４－６４４８ （１９９３）を参照）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３６８ （１９９４）を参照）；及び三重特異性抗体を調製すること（例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７： ６０ （１９９１）を参照）によって作製することができる。

特定の実施態様では、多重特異性抗体は、国際公開第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０８０２５２号、同第２００９／０８０２５３号、同第２００９／０８０２５４号、同第２０１０／１１２１９３号、同第２０１０／１１５５８９号、同第２０１０／１３６１７２号、同第２０１０／１４５７９２号、同第２０１０／１４５７９３号に記載されている。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、「オクトパス抗体」（例えば、米国特許公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）などの３つ以上の機能的抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、第１のエピトープ（例えば、第１の抗原上）だけでなく、別の異なるエピトープ（例えば、第１の抗原上又は第２の異なる抗原上）に結合する抗原結合部位を含む「Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ Ｆａｂ」又は「Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｏｎ Ｆａｂ」（ＤＡＦ）である（例えば、米国特許公開第２００８／００６９８２０号；Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ５９２１， １６１０－１６１４を参照）。

従来、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づいていてもよく、その場合、２つ以上の重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５： ５３７ （１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな分類のために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、少なくとも１０個の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、これらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は面倒であり、生成物収率は低い。同様の手順が、１９９３年５月１３日公開の国際公開第９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １０： ３６５５ （１９９１）に開示されている。

さらに、多重特異性抗体の産生には特有の課題がある。例えば、二重特異性抗体の産生には、それぞれ異なる重鎖及び異なる軽鎖を含む、２つの異なる重鎖／軽鎖サブユニットの二量体化が必要である。このように、二重特異性抗体の産生には、最大４本のペプチド鎖が適切に相互作用することが必要である。したがって、鎖の誤対合（例えば、同一の重鎖ペプチドのホモ二量化、又は重鎖／軽鎖の不適切な会合）がしばしば観察される。多重特異性抗体の誤対合バリアントは、誤った重鎖同士の対合、及び軽鎖と誤った対応部分の重鎖との対合、又は軽鎖の望ましくない対合を含む。

ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体
本開示は、多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体を精製するための方法を提供する。ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体は、軽鎖とその同種の重鎖の正しい会合が多重特異性抗体の少なくとも１つの抗原結合領域（Ｆａｂ）のＦａｂ内の重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインの交換によって達成される多重特異性（すなわち、少なくとも二重特異性）抗体であり、これらの少なくとも２つのＦａｂ断片において誤対合が回避されるように、少なくとも１つの他のＦａｂ断片においてそのような交換は行われない。二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体の場合、軽鎖とその同種の重鎖との正しい会合は、二重特異性抗体の一方の半分のＦａｂ断片内で重鎖と軽鎖のドメインを交換し、他方の半分は未結合のままであるか又は異なる交換を行うことにより達成される。

本明細書では、「ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域及び／又は定常領域のいずれかが交換された多重特異性抗体（又はその適切な多重特異性断片）を指す。例えば、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体は、国際公開第２００９／０８０２５２号、同第２００９／０８０２５３号、同第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０８０２５４号、同第２０１０／１３６１７２号、同第２０１０／１４５７９２号、及び同第２０１３／０２６８３１号で記載又は特許請求されているＣｒｏｓｓＭａｂ抗体のうちのいずれかであり得る。「ＣｒｏｓｓＭａｂ」抗体という用語は、一般的に、当該技術分野で認識されている。例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ， Ｕ． ＆ Ｋｏｎｔｅｎｎａｎｎ， Ｒ．， ＭＡｂｓ ９（２）： １８２－２１２ （２０１７）； Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ， Ｒ． ＆ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ， Ｕ．， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０（７）：８３８－８４６ （２０１５）； Ｓｃｈａｅｆｅｒ， Ｗ． ｅｔ ａ ， ＰＮＡＳ， １０８ （２０１ １） １１１８７－１ １９１； Ｋｌｅｉｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， ＭＡｂｓ ８（６）：１０ｌ０－ｌ０２０ （２０１６）； Ｋｌｅｉｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， ＭＡｂｓ ４（６）：６５３－６６３ （２０１２）を参照のこと。

特定の実施態様では、多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体は、二重特異性二価ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体である。二重特異性二価ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体は、３つの異なる鎖組成のクロスオーバー抗体を含む。第１の組成では、抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインが交換される。すなわち、抗体は、１つのＦａｂ領域に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖とを含む。第２の組成では、１つのＦａｂ領域における抗体の重鎖及び軽鎖の定常ドメインが交換され、抗体は、このＦａｂ領域に、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖とを含む。第３の組成では、定常ドメイン及び可変ドメインを含む抗体の重鎖と、定数ドメイン及び可変ドメインを含む抗体の軽鎖とが交換されている。すなわち、抗体は、軽鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定数ドメイン（ＶＬ）で構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定数ドメイン（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖とを含む。

特定の実施態様では、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体はモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体は、その機能的断片、すなわちその多重特異性を保持する断片を含む。

特定の実施態様では、本開示は、多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体をその誤対合バリアントから精製するための方法を提供する。本明細書で使用する場合、「その誤対合バリアント」という用語は、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体に関して上述したように、ドメインを交換した重鎖と少なくとも１つの誤った軽鎖が対合している多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体を指す。例えば、限定されないが、前記バリアントの少なくとも１つの軽鎖は、その相補的な重鎖と対合しない。例えば、ＣＬ及びＶＬを含む「非修飾」軽鎖は、ＣＨ１及びＶＬを有する「非修飾」重鎖と誤対合するか、又はＣＨ１及びＶＬを含む「非修飾」軽鎖は、ＣＨ１及びＶＨを有する「非修飾」重鎖と誤対合する、などである。ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体に関して使用される場合、「相補的」ドメインとは、通常対になっている重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインのことである。また「非相補的」ドメインとは、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとが誤って対になっていることである。例えば、限定されないが、重鎖ドメインと軽鎖のドメインの対の誤った軽鎖は、軽鎖の可変ドメイン及び／又は定常ドメインが交換されているのに対して重鎖では重鎖の可変ドメイン及び／又は定常が交換されていない軽鎖を指す場合がある。別の例として、重鎖ドメインと軽鎖ドメインの誤対合は、軽鎖の可変ドメイン及び／又は定常ドメインが交換されておらず、重鎖の可変ドメイン及び／又は定常ドメインが交換されている状況を指す場合がある。本明細書で使用する場合、「非相補的」という用語は、１つの軽鎖又はその断片が欠落している抗体など（これに限定されない）、不完全に組み立てられた抗体を意味しない。特定の非限定的な実施態様では、例えば、その誤対合バリアントは、１つ又は複数の軽鎖が非相補的な重鎖と対合している、多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体のバリアントである。

特定の実施態様では、多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体は、二重特異性、三重特異性、又は四重特異性抗体である。特定の実施態様では、多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体は、２つ、３つ、又は４つの特異的抗原結合部位を有する。特定の実施態様では、多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体は一価である。特定の実施態様では、多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体は二価である。

特定の実施態様では、多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体は、Ｆｃ断片を含む。Ｆｃ断片の存在は、限定されるものではないが、プロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＡ／ＧなどのＦｃ結合部位を使用して、多重特異性抗体の精製を可能にする。特定の実施態様では、多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＹであり得る。特定の実施態様では、多重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体はＩｇＧである。特定の実施態様では、多重特異性抗体のＦｃ断片は、第１のＦｃ断片サブユニットと第２のＦｃ断片サブユニットの会合を促進する修飾を含む。特定の実施態様では、修飾は、第１のＦｃ断片サブユニットにおけるものである。特定の実施態様では、修飾は、第２のＦｃ断片サブユニットにおけるものである。特定の実施態様では、修飾は、第１のＦｃ断片サブユニット及び第２のＦｃ断片サブユニットにおけるものである。特定の実施態様では、修飾は、Ｆｃ断片のＣＨ３ドメインにおけるものである。特定の非限定的な実施態様では、第１及び第２のＣＨ３ドメインの修飾は、Ｆｃ断片の正しいヘテロ二量化を可能にする。特定の実施態様では、修飾された第１のＣＨ３ドメインは、立体的相補性によって、修飾された第２のＣＨ３ドメインとヘテロ二量化する。

特定の実施態様では、修飾は、「ノブ・イントゥ・ホール」修飾である。特定の実施態様では、第１のＦｃ断片はノブ変異を含み、第２のＦｃ断片はホール変異を含む。特定の実施態様では、第１のＦｃ断片はホール変異を含み、第２のＦｃ断片はノブ変異を含む。

宿主細胞
本開示は、宿主細胞で発現した多重特異性抗体を精製するための方法を提供する。特定の実施態様では、宿主細胞は、細菌、酵母、若しくは他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は哺乳動物細胞である。特定の実施態様では、宿主細胞は、多重特異性抗体を産生するように遺伝的に改変された。

特定の実施態様では、宿主細胞は、原核生物（例えば、グラム陰性又はグラム陽性微生物）である。例えば、限定されるものではないが、宿主細胞は、大腸菌、枯草菌、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、又は緑膿菌である。特定の実施態様では、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。特定の実施態様では、宿主細胞（例えば、大腸菌宿主細胞）は、抗体の折り畳み及び組み立てを促進するために、１つ又は複数のシャペロンを発現する。特定の実施態様では、シャペロンは、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、又はＤｓｂＣのうちの１つ又は複数である。特定の実施態様では、シャペロンは、内因性シャペロン遺伝子から発現する。特定の実施態様では、シャペロンは、外来性シャペロン遺伝子から発現する。特定の実施態様では、シャペロン遺伝子は、大腸菌シャペロン遺伝子（例えば、大腸菌ＦｋｐＡ遺伝子、大腸菌ＤｓｂＡ遺伝子及び／又は大腸菌ＤｓｂＣ遺伝子）である。

特定の実施態様では、原核生物宿主細胞は、発現ベクターで形質転換され、多重特異性抗体の発現を促進するために培養される。

特定の実施態様では、宿主細胞は真核生物である。例えば、限定されないが、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、又はクロコウジカビ（Ａ． ｎｉｇｅｒ）である。特定の実施態様では、真核宿主細胞は、哺乳動物細胞である。特定の非限定的な実施態様では、哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ－７６細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、又はＷ１３８細胞である。特定の実施態様では、真核生物宿主細胞は、発現ベクターで形質転換され、多重特異性抗体の発現を促進するために培養される。特定の非限定的な実施態様では、本開示は、多重特異性抗体を産生及び精製するための方法を提供する。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、半抗体を別々に産生することによって産生され、各半抗体は、特定のエピトープ（例えば、単一の標的上の異なるエピトープ、又は２つ以上の標的上の異なるエピトープ）を結合するＶＨ／ＶＬ単位を含む。特定の実施態様では、各半抗体は、宿主細胞中で別々に産生される。特定の実施態様では、半抗体のそれぞれは、同じ宿主細胞中で産生される。特定の実施態様では、半抗体のそれぞれは、同じ宿主細胞中で一緒に産生される。

抗原／標的分子
本開示は、様々な分子を標的とすることができる多重特異性抗体を精製するための方法を提供する。特定の実施態様では、本明細書に開示される方法によって精製された多重特異性抗体は、サイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、又はサイトカイン受容体を標的化することができる。例えば、限定されないが、多重特異性抗体は、８ＭＰＩ、８ＭＰ２、８ＭＰ３８（ＧＤＦＩＯ）、８ＭＰ４、８ＭＰ６、８ＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ２（（ＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦＳ、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１ ０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮ８１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬ１、ＦＥＬ１（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１ ０、ＩＬ １１、ＩＬ １２Ａ、ＩＬ １２Ｂ、ＩＬ １３、ＩＬ １４、ＩＬ １５、ＩＬ １６、ＩＬ １７、ＩＬ １７Ｂ、ＩＬ １８、ＩＬ １９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３３、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢｂ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ－（）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ－ａ）、ＴＮＦＳＦ４（０Ｘ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ １１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ， ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、及びＴＨＰＯを標的化することができる。

特定の実施態様では、本明細書に開示される方法によって精製された多重特異性抗体は、ケモカイン、ケモカイン受容体、又はケモカイン関連タンパク質を標的化することができる。例えば、限定されないが、多重特異性抗体は、ＣＣＬ１（１－３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ －１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１ａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－１（３）、ＣＣＬＳ（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－ＩＳ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３ａ）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス－２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２ ／エオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２？（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬＳ（ＥＮＡ－７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ １０）、ＣＸＣＬ１１（１－ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－Ｉ（３）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１ ）、ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲＢ ＩＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲＳ（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲＩ（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲＵＣＫＲ－ Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒａ）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒ（）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦＳ、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦＳ、ＨＤＦ１、ＨＤＦｌａ、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、及びＶＨＬを標的化することができる。

特定の非限定的な実施態様では、例えば、本明細書で開示される方法によって精製された多重特異性抗体は、ＡＢＣＦ１、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、Ａｇｇｒｅｃａｎ、ＡＧＲ２、ＡＩＣＤＡ、ＡＩＦ１、ＡＩＧ１、ＡＫＡＰ１、ＡＫＡＰ２、ＡＭＨ、ＡＭＨＲ２、ＡＮＧＰＴＬ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＰＥＰ、ＡＰＣ、ＡＰＯＣ１、ＡＲ、ＡＺＧＰ１（亜鉛－ａ－糖タンパク質）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＢＡＤ、ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）、ＢＡＧ１、ＢＡＩｌ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＤＮＦ、ＢＬＮＫ、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２、ＢＰＡＧ１（プレクチン）、ＢＲＣＡｌ、Ｃｌ９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）、Ｃ３、Ｃ４Ａ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡＮＴ１、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ４、ＣＡＶ１、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＬ１（１－３０９）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ１８）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３（３）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＭＣＡＦ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３ａ）、ＣＣＬ２１（ＭＴＰ－２）、ＳＬＣ、エクソダス－２、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２？（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３（ＭＴＰ－Ｉａ）、ＣＣＬ４（ＭＤＰ－Ｉ（３）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＮＡｌ、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲ（３／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ／ ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＢＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲＵＣＫＲ－Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１３、ＣＤ１６４、ＣＤ１９、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＬＣＡ／ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０６、ＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリン）、ＣＤ９／ｐ２４、ＣＤＨ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１８、ＣＤＨ１９、ＣＤＨ２Ｏ、ＣＤＨ５、ＣＤＨ７、ＣＤＨ８、ＣＤＨ９、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐｌ）、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７／Ｋｉｐｌ）、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＣＥＡ、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＲ１、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ、ＣＨＳＴ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ７（クローディン－７）、ＣＬＮ３、ＣＬＵ（クラステリン）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＮＲ１、ＣＯＬ １８Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＲ２、ＣＲＰ、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＣＴＬＡ４、ＣＴＮＮＢ１（ｂ－カテニン）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＣＴＳＤ（カテプシンＤ）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ／ＩＰ－９）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８／ＬＩＸ）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＣＹＢ５、ＣＹＣｌ、ＣＹＳＬＴＲ１、サイトケラチン、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＥＳ、ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８、ＤＮＣＬＩ、ＤＰＰ４、Ｅ２Ｆ１、ＥＣＧＦ１、ＥＤＧ１、ＥＦＮＡｌ、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＬＡＣ２、ＥＮＧ、ＥＮＯ１、ＥＮＯ２、ＥＮＯ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ－２）、ＥＲＥＧ、ＥＲＫ８、ＥＳＲ１、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＥＳＲ２、Ｆ３（ＴＦ）、ＦＡＤＤ、ＦａｓＬ、ＦＡＳＮ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦ、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＦＥＬＬ（ＥＰＳＩＬＯＮ）、フィブリン、ＦＩＬ１（ＺＥＴＡ）、ＦＬＪ１２５８４、ＦＬＪ２５５３０、ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）、ＦＬＴ１、ＦＯＳ、ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ－１）、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）、ＧＡＧＥＢ１、ＧＡＧＥＣ１、ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ－６ＳＴ、ＧＡＴＡ３、ＧＤＦ５、ＧＦＩｌ、ＧＧＴ１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＮＡＳＩ、ＧＮＲＨＩ、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ４４、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＧＲＣＣＩＯ（Ｃ１０）、ＧＲＰ、ＧＳＮ（ゲルソリン）、ＧＳＴＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ＨＧＦ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＯＰＩ、ヒスタミン及びヒスタミン受容体、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＭ７４、ＨＭＯＸＩ、ＨＰＶタンパク質、ＨＵＭＣＹＴ２Ａ、ＩＣＥＢＥＲＧ、ＩＣＯＳＬ、１Ｄ２、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮガンマ、ＩＴＧＢ７、ＤＦＮＷ１、ＩＧＢＰ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＩＬ－１、ＩＬ１Ｏ、ＩＬ１ＯＲＡ、ＩＬ１ＯＲＢ、ＩＬ１１、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ－１２、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３、ＩＬ１３ＲＡｌ、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ１９、ＩＬＩＡ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１Ｏ、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬＩＲＮ、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１ Ｒ、ＩＬ２２、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３、ＩＬ３０、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ３３、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）、Ｐ－糖タンパク質、ＥＬ７、ＥＬ７Ｒ、ＥＬ８、ＩＬ８ＲＡ、ＤＬ８ＲＢ、ＩＬ８ＲＢ、ＤＬ９、ＤＬ９Ｒ、ＤＬＫ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＲＡＫ１、ＥＲＡＫ２、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）、ＪＡＧ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、Ｋ６ＨＦ、ＫＡＩＩ、ＫＤＲ、ケラチン、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＦ５（ＧＣ Ｂｏｘ ＢＰ）、ＫＬＦ６、ＫＬＫＩＯ、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１９（Ｋｅｒａｔｉｎ １９）、ＫＲＴ２Ａ、ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異型Ｈケラチン）、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖、ＬＡＭＡＳ、ＬＥＰ（レプチン）、Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５、Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ、ＬＰＳ、ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）、ＬＴＢ、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ、ＬＥＷＩＳ－ｘＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＧ又はＯｍｇｐ、ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）、ＭＤＫ、ＭＩＢ１、メラノソームタンパク質、ミッドカイン、ＭＥＦ、ＭＩＰ－２、ＭＫＩ６７、（Ｋｉ－６７）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＭＢ、ＭＴ３（メタロチオネクチン－１１１）、ＭＴＳＳ１、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＹＣ、ＭＹ０８８、ＮＣＫ２、ニューロカン、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ、ＮｇＲ－ Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）、ＮｇＲ－ｐ７５、ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ、ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）、ＮＯＸ５、ＮＰＰＢ、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲＯＢ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１１２、ＮＲ１１３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＮＴ５Ｅ、ＮＴＮ４、ＯＤＺＩ、ＯＰＲＤ１、Ｐ２ＲＸ７、ＰＡＰ、ＰＡＲＴ１、ＰＡＴＥ、ＰＡＷＲ、ＰＣＡ３、ＰＣＮＡ、ＰＯＧＦＡ、ＰＯＧＦＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ホスファカン、ＰＩＡＳ２、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＰＬＧ、ＰＬＸＤＣ１、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＰＰＩＤ、ＰＲＩ、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤＩ、ＰＲＬ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、ＰＳＡ、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）、ＰＴＮ、ｐ５３、ＲＡＣ２（ｐ２１ Ｒａｃ２）、ＲＡＳ、Ｒｂ、ＲＡＲＢ、ＲＧＳＩ、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ３、ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）、ＲＯＢＯ２、Ｓ１００Ａ２、ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）、ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）、ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）、ＳＣＹＥＩ（内皮性単球活性化サイトカイン）、Ｓ－１００ ＳＤＦ２、ＳＥＲＰＩＮＡｌ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ－１）、ＳＥＲＰＤＭＦ１、ＳＨＢＧ、ＳＬＡ２、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＩＴ２、ＳＰＰＩ、ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴＡＢＩ、ＳＴＡＴＥ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ２、ＴＢ４Ｒ２、ＴＢＸ２１、ＴＣＰＩＯ、ＴＯＧＦＩ、ＴＥＫ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢＩ、膜貫通又は細胞表面腫瘍特異的抗原（ＴＡＡ）、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載のＴＡＡ、ＴＡＵ、ＴＧＦＢ１ＩＩ、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＩＬ、ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン－１ ）、ＴＨＢＳ２、ＴＨＢＳ４、ＴＨＰＯ、ＴＩＥ（Ｔｉｅ－１ ）、ＴＭＰ３、組織因子、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、Ｔｎ抗原ＴＮＦ、ＴＮＦ－ａ、ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４ ）、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、
ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４（０Ｘ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（Ｆａｓｔ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ ＢＢリガンド）、ＴＯＬＬＩＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）、ＴＰ５３、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦＳ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、ＴＲＰＣ６、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、ユビキチン、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ベルシカン、ＶＨＬ Ｃ５、ビメンチン、ＶＬＡ－４、ＸＣＬ１（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－１ｂ）、ＸＣＲＩ（ＧＰＲＳ／ ＣＣＸＣＲＩ）、Ｙｙ１、及びＺＦＰＭ２を標的化することができる。

特定の非限定的な実施態様では、例えば、本明細書で開示される方法によって精製された多重特異性抗体は、ＣＤタンパク質、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体などのＥｒｂＢ受容体ファミリーのＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ６４、ＣＤ２００メンバー、細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ－１、Ｍａｃｌ、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン、及びアルファｖ／ベータ３インテグリン（それらのアルファ又はベータサブユニットを含む）（例えば、抗ＣＤ１１、抗ＣＤ１８、又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）、増殖因子、例えば、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ－Ａ）、ＦＧＦＲ、Ａｎｇｌ、ＫＬＢ、ＶＥＧＦ－Ｃ、組織因子（ＴＦ）、アルファインターフェロン（アルファＩＦＮ）、ＴＮＦアルファ、インターロイキン、例えば、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－Ｓ、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ １７ ＡＦ、ＩＬ－１Ｓ、ＩＬ１３、ＩＬ－１３Ｒアルファｌ、ＩＬ１３Ｒアルファ２、ＩＬ１４ ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－９Ｒ、ＩｇＥ、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ｍｐｌ受容体、ＣＴＬＡ－４、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ Ｆタンパク質、プロテインＣ、ＢＲ３等を標的化することができる。

特定の非限定的な実施態様では、例えば、本明細書で開示される方法によって精製された多重特異性抗体は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）－１又はＬＲＰ－８又はトランスフェリン受容体、及び１） ベータ－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１又はＢＡＣＥ２）、２） アルファ－セクレターゼ、３） ガンマ－セクレターゼ、４） タウ－セクレターゼ、５） アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、６） デスレセプター６（ＤＲ６）、７） アミロイドベータペプチド、８） α－シヌクレイン、９） パーキン、１０） ハンチンチン、１１）ｐ７５ ＮＴＲ、及び１２） カスパーゼ－６からなる群より選択される少なくとも一つの標的を標的化することができる。

特定の非限定的な実施態様では、例えば、本明細書で開示される方法によって精製された多重特異性抗体は、以下からなる群より選択される少なくとも２つの標的分子を標的化することができる：ＩＬ－１アルファ及びＩＬ－ １ベータ、ＩＬ－１２及びＩＬ－１Ｓ、ＩＬ－１３及びＩＬ－９、ＩＬ－１３及びＩＬ－４、ＩＬ－１３及びＩＬ－５、ＩＬ－５及びＩＬ－４、ＩＬ－１３及びＩＬ－ｌベータ、ＩＬ－１３及びＩＬ－ ２５、ＩＬ－１３及びＴＡＲＣ、ＩＬ－１３及びＭＤＣ、ＩＬ－１３及びＭＥＦ、ＩＬ－１３及びＴＧＦ、ＩＬ－１３及びＬＨＲアゴニスト、ＩＬ－１２及びＴＷＥＡＫ、ＩＬ－１３及びＣＬ２５、ＩＬ－１３及びＳＰＲＲ２ａ、ＩＬ－１３及びＳＰＲＲ２ｂ、ＩＬ－１３及びＡＤＡＭＳ、ＩＬ－１３及びＰＥＤ２、ＩＬ１３及びＩＬ１７、ＩＬ１３及びＩＬ４、ＩＬ１３及びＩＬ３３、ＩＬ１７Ａ及びＩＬ １７Ｆ、ＣＤ３及びＣＤ１９、ＣＤ１３８及びＣＤ２０、ＣＤ１３８及びＣＤ４０、ＣＤ１９及びＣＤ２０、ＣＤ２０及びＣＤ３、ＣＤ３Ｓ及びＣＤ１３Ｓ、ＣＤ３Ｓ及びＣＤ２０、ＣＤ３Ｓ及びＣＤ４０、ＣＤ４０及びＣＤ２０、ＣＤ－Ｓ及びＩＬ－６、ＣＤ２０及びＢＲ３、ＴＮＦアルファ及びＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１ベータ、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１１、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１７、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２３、ＴＮＦアルファ及びＩＦＮアルファ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ４、ＴＮＦアルファ及びＶＥＧＦ、ＴＮＦアルファ及びＭＩＦ、ＴＮＦアルファ及びＩＣＡＭ－１、ＴＮＦアルファ及びＰＧＥ４、ＴＮＦアルファ及びＰＥＧ２、ＴＮＦアルファ及びＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦアルファ及びＴｅ３８、ＴＮＦアルファ及びＢＡＦＦ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ２２、ＴＮＦアルファ及びＣＴＬＡ－４、ＴＮＦアルファ及びＧＰ１３０、ＴＮＦ ａ及びＩＬ－１２ｐ４０、ＦＧＦＲ１及びＫＬＢ，ＶＥＧＦ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＰＤＧＦ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦＡ及びＡＮＧ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｃ及びＶＥＧＦ－Ｄ、ＨＥＲ２及びＤＲＳ、ＶＥＧＦ及びＩＬ－８、ＶＥＧＦ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＭＥＴ受容体、ＥＧＦＲ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＣＤ６４、ＨＥＲ２及びＣＤ３、ＨＥＲ２及びＣＤ１６、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）及びＨＥＲ２、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４、ＩＬ－１４及びＩＬ－１３、ＩＬ－１３及びＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４及びＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ－１ Ｒ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ－６Ｒ及びＴＮＦＲ１及びＩＬ－１８Ｒ、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３、ＭＡＰＧ及びＣＤ２８、ＥＧＦＲ及びＣＤ６４、ＣＳＰＧｓ及びＲＧＭ Ａ、ＣＴＬＡ－４及びＢＴＮ０２、ＩＧＦ１及びＩＧＦ２、ＩＧＦ１／２及びＥｒｂ２Ｂ、ＭＡＧ及びＲＧＭ Ａ、ＮｇＲ及びＲＧＭ Ａ、ＮｏｇｏＡ及びＲＧＭ Ａ、ＯＭＧｐ及びＲＧＭ Ａ、ＰＯＬ－１及びＣＴＬＡ－４、及びＲＧＭ Ａ及びＲＧＭ Ｂ。

製剤及び製剤の作製方法
本開示は、本明細書に記載される方法によって精製された多重特異性抗体を含む製剤、及びその製剤の製造方法を作製する方法を提供する。例えば、精製されたポリペプチド（例えば、多重特異性抗体）は、薬学的に許容される担体と組み合わせることができる。

いくつかの実施態様では、ポリペプチド製剤は、所望の純度を有するポリペプチドを、任意の薬学的に許容される担体、添加物、又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で保存用に調製され得る。

本明細書で使用される「担体」には、薬学的に許容可される担体、添加物、又は安定剤が含まれ、それらは、用いられる投与量及び濃度でそれらに曝露されている細胞又は哺乳動物にとって無毒である。多くの場合、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。

許容される担体、添加物、又は安定剤には、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルバラベンなどのアルキルパラべン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ^ＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^ＴＭ若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

いくつかの実施態様では、ポリペプチド製剤中のポリペプチドは、機能的活性を維持する。

インビボ投与のために使用される製剤は、滅菌性である必要がある。これは、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。

本明細書の製剤は、治療されている特定の適応症に対して必要な２つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する活性化合物を含有してもよい。例えば、ポリペプチドに加えて、一つの製剤に別のポリペプチド（例えば、抗体）を含めることが望ましい。代替的に、又は追加的に、組成物は、化学治療剤、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤をさらに含み得る。そのような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。

製造品
本開示は、本明細書に記載される方法によって精製された多重特異性抗体及び／又は本明細書に記載される方法によって精製されたポリペプチドを含む製剤を含む製造品を提供する。製品は、ポリペプチド及び／又はポリペプチド製剤を含む容器を含み得る。特定の実施態様では、製造品は、（ａ）本明細書に記載のポリペプチド及び／又はポリペプチド製剤を含む組成物を容器内に含む容器と、（ｂ）対象に製剤を投与するための指示を有する添付文書と含む。

特定の実施態様では、製造品は、容器、及び容器についての又は容器に関連するラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、製剤を保持又は収容し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈用溶液袋又はバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性物質はポリペプチドである。ラベル又は添付文書は、提供されているポリペプチド及び任意の他の薬物の投与量及び間隔についての具体的な指示により、本組成物が対象において使用されることを示す。製品は、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。いくつかの実施態様では、容器は、シリンジである。いくつかの実施態様では、シリンジは、注入デバイス内にさらに収容される。いくつかの実施態様では、注入デバイスは、自己注入器である。

「添付文書」は、治療薬の市販のパッケージに通例含まれる指示書を指すように使用され、指示書には、適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌、パッケージ製品と組み合わされる他の治療薬、及び／又はそのような治療薬の使用に関する警告についての情報が含まれる。

本書で開示される主題の例示的な実施態様
特定の実施態様では、本開示は、多重特異性抗体を精製するための方法であって：多重特異性抗体及びその誤対合バリアントを含む組成物を、誤対合バリアントが多重特異性抗体と比べてマルチモードクロマトグラフィー材料に優先的に結合する条件下で、マルチモードクロマトグラフィー材料と接触させることであって、多重特異性抗体が：第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合領域であって、第１の抗原に結合する抗体の軽鎖及び重鎖を含む、第１の抗原結合領域と、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合領域であって、第２の抗原に結合する抗体の軽鎖及び重鎖を含み、第２の抗原結合領域において可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、第２の抗原結合領域とを含み；その誤対合バリアントが：第１の抗原に結合する抗体の重鎖と、第２の抗原に結合する抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むペプチドとを含む、第１の抗原結合領域と、第２の抗原に結合する抗体の軽鎖及び重鎖を含む第２の抗原結合領域であって、第２の抗原結合領域において可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、第２の抗原結合領域とを含み；マルチモードクロマトグラフィー材料が：アニオン交換が可能な官能基と、疎水性相互作用が可能な官能基とを含む、組成物をマルチモードクロマトグラフィー材料と接触させることと；多重特異性抗体及び減少した量のその誤対合バリアントを含む溶出物を回収することとを含む、方法を対象とする。

本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、疎水性相互作用が可能な官能基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基、ベンジル基、又はそれらの任意の組み合わせを含む。

本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、疎水性相互作用が可能な官能基はベンジル基を含む。

本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、アニオン交換が可能な官能基は、正に帯電した基を含む。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、正に帯電した基は、四級アンモニウムイオンである。

本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィー材料は、Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミンを含む。

本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィー材料は、ＣａｐｔｏＴＭＡｄｈｅｒｅ樹脂を含む。

本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィー材料は、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＡｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ樹脂を含む。

本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、マルチモードクロマトグラフィーの溶出は、勾配溶出である。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、勾配溶出はｐＨ勾配を含む。

本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、方法は、捕捉クロマトグラフィー工程を含む。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、捕捉クロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィー工程である。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程は、プロテインＡクロマトグラフィー工程、プロテインＬクロマトグラフィー工程、プロテインＧクロマトグラフィー工程、及びプロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー工程である。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程は、プロテインＡクロマトグラフィー工程である。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、プロテインＡクロマトグラフィー工程は、アガロースに結合したプロテインＡを含むクロマトグラフィー材料を含む。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、捕捉クロマトグラフィー工程及びマルチモードクロマトグラフィー工程は連続する。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、方法は、マルチモードクロマトグラフィー工程の後に精製工程を含む。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、多重特異性抗体が濃縮される濃縮工程。

本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、多重特異性抗体は、ノブ・イン・ホール修飾を含む。

本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、多重特異性抗体及びその誤対合バリアントは、同じ宿主細胞培養物中で産生される。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、宿主細胞培養物の宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞である。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、宿主細胞は真核細胞である。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、真核細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞である。本明細書に記載される方法の特定の実施態様では、真核細胞はＣＨＯ細胞である。

特定の実施態様では、本開示は、本明細書に開示される方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物を対象とする。本明細書に記載される組成物の特定の実施態様では、多重特異性抗体を含む組成物は、薬学的に許容される担体を含む。

特定の実施態様では、本開示は、本明細書に開示される方法によって精製された多重特異性抗体を含む製造品に関する。

上記の説明から、ここで開示されている主題に対して、様々な用途や条件に採用するための変形や修正がなされ得ることが明らかであろう。このような実施態様も以下の特許請求の範囲内である。

本明細書における変数の任意の定義における要素の列挙の記載は、任意の単一要素又は列挙された要素の組み合わせ（又はサブコンビネーション）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施態様の記載は、任意の単一の実施態様としての実施態様、又は任意の他の実施態様若しくはその一部と組み合わせた実施態様を含む。

本明細書で言及される全ての特許出願及び刊行物は、それぞれの独立した特許出願及び刊行物が参照により援用されることが具体的且つ個別に示されるかのように同程度に参照により本明細書に援用される。

本明細書に開示される特徴は全て、任意の組み合わせで組み合わせられてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等、又は同様の目的を果たす代替の特徴に置き換えられてもよい。したがって、別途明確に示されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等又は同様の特徴の一例にすぎない。

上述の説明は、当業者が本明細書に記載される方法を実施すること及び／又は本明細書に記載される組成物を得ることを可能にするのに十分であると考えられる。以下の実施例及び詳細な説明は、限定するものではなく、例証として提供されている。

本明細書における全ての参考文献の開示は、参照により本明細書に明示的に援用される。

上記の実施例は、説明を目的として提供されているものにすぎず、いかなる点においても本発明の範囲を限定するように意図されていない。実際、本明細書において提示及び記述された変更形態以外の様々な変更形態は上記の記述から当業者には明らかとなり、添付した特許請求の範囲に含まれる。

先に与えた一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施態様が実施されてもよいことは理解される。

実施例１
単細胞二重特異性設計の一種は「ＣｒｏｓｓＭａｂ ｖ２」であり、これは、Ｆａｂドメインのクロスオーバーを使用した設計により、軽鎖と重鎖の対合を改善する。軽鎖（ＬＣ）誤対合の可能性の１つは、２つの可変重鎖（ＶＨ）ドメインが近接していることにある。一般的に、抗体ではＶＨドメインは可変軽（ＶＬ）とのみ対合すると理解されているが、このＬＣ誤対合における２つのＶＨドメインは変性し、ＬＣ誤対合に構造歪みを生じさせる場合がある。さらに、重鎖上の３つの負電荷変異（ＨＣ、Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ）及びＬＣ（Ｑ１２４Ｅ）の共位置は、このＬＣ誤対合Ｆａｂに負電荷パッチを付与する場合がある。

本実施例では、アニオン交換成分が定常ドメインの負電荷パッチと相互作用し、疎水性相互作用成分が可変ドメインの構造変性により明らかになった疎水性残基と結合するため、マルチモードクロマトグラフィー樹脂（例えば、アニオン交換及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＭＭＡＥＸ））がこのＬＣ誤対合種と結合して下流のプロセスでそれをクリアできることを説明する。全体として、このマルチモードクロマトグラフィーは、多重特異性抗体の精製を向上させる。

原料
抗抗原Ａ／抗原Ｂ二重特異性抗体（ａＡｇＡ／ａＡｇＢ）を、ａＡｇＢアームにドメインクロスオーバーを有するＣｒｏｓｓＭａｂ ｖ２として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させた。得られた収穫細胞培養液をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製し、二重特異性抗体及びその産物関連バリアント（例えば、組み立てられていない半抗体、ホモ二量体、及びＬＣ誤対合）を捕捉した。混合物の組成を逆相ＨＰＬＣ及び質量分析により分析し、下表に示すように決定した。

ハイスループット・スクリーニング
自動液体処理システムを使用して、さまざまなｐＨ及びバッファー強度の条件下で、５つの異なるクロマトグラフィー樹脂（Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ（ＭＭＡＥＸ樹脂）を含む）への原料の結合を試験した。インキュベーション後、未結合画分を分析したところ、図３に示したアニオン交換挙動（高ｐＨ）及び疎水性結合（高塩濃度）を促進する条件下で、ＬＣ誤対合バリアントの枯渇を確認した。驚くべきことに、アニオン交換樹脂及び疎水性相互作用マルチモードクロマトグラフィー樹脂のみが、このＬＣ誤対合種を結合することができた。

確認用カラムクロマトグラフィーの実行
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ樹脂の充填ベッドを有するクロマトグラフィーカラムに接続したＡｅｋｔａクロマトグラフィーシステムを使用して、ｐＨ調整した原料を強結合条件下で樹脂にロードし、その後、高ｐＨ（ｐＨ８．６）から低ｐＨ（ｐＨ５．５）までｐＨ勾配を使用して溶出させた。タンパク質の溶出は、ロングテールを有するメインピークとして観察された（図４）。ピーク及びテールを画分として回収し、組成を分析した。

回収した画分の組成を分析したところ、メイン溶出ピークでは二重特異性抗体に富み、ポストピークテールではＬＣ誤対合に富んでいることが明らかになった。図５は、ロード原料組成（ロード）と、二重特異性に富むメインピークを表す画分（画分３）及びＬＣ誤対合に富むポストピークテールを表す画分（画分９）とを比較するマススペクトルを示している。

本明細書で開示される方法の役割をさらに評価するために、回収及び測定した画分の組成及び濃度を示す疑似クロマトグラムを分析した。図６Ａに示すように、メインピークは主に二重特異性抗体を含んでいたが、ポストピークテールは主にＬＣ誤対合バリアントを含んでいた。その他の産物関連バリアントがマイナーレベルで存在した。二重特異性及びＬＣ誤対合の擬似クロマトグラムを正規化（例えば、同じ高さにスケーリング）して重ね合わせると、本明細書に開示される方法は、二重特異性抗体とＬＣ誤対合バリアントを分離することがより明らかになった（図６Ｂ）。

分子構造研究
次に、実験結果を裏付けるために、この分子のＦａｂの３Ｄ相同性モデルを、正しく対合したＨＣとＬＣの組み合わせと、誤って対合したＨＣとＬＣの組み合わせの両方について作成した。ＬＣ誤対合Ｆａｂは、（ＶＨドメインは他のＶＨドメインと親和性を有しないとされているため）緩く変性した可変ドメイン構造を示していることが確認された。さらに、３つの負に帯電したアミノ酸はタンパク質の表面に位置しているため、定常ドメインでタンパク質の表面上に負電荷のパッチを作成することができる。

正しく対合した種（図７Ａ及び７Ｂ）とＬＣ誤対合種（図７Ｃ及び７Ｄ）のシミュレーション構造。最も高い構造歪み及び負電荷クラスターを示すＬＣ誤対合種を除去した（図７Ｃ）。

結論
単細胞の二重特異性設計では、ある程度のＬＣ誤対合は避けられない。ＬＣ誤対合を正しく形成された二重特異性から除去することは非常に困難であるが、ＬＣとＨＣの特定の組み合わせにより、リスク（例えば、患者へのリスク）を示すことが疑われる産物関連バリアントが生じる場合、特定のＬＣ誤対合の除去能力を向上させる方法で単細胞二重特異性を設計することが可能である。本明細書に開示される方法は、誤対合が交差したＬＣと交差していないＨＣとの間にある限り、Ｃｒｏｓｓｍａｂ ｖ２二重特異性からＬＣ誤対合を除去することができる。

Claims (27)

1. 多重特異性抗体を精製するための方法であって、
   ａ）多重特異性抗体及びその誤対合バリアントを含む組成物を、誤対合バリアントが多重特異性抗体と比べてマルチモードクロマトグラフィー材料に優先的に結合する条件下で、マルチモードクロマトグラフィー材料と接触させることであって、
   ｉ）多重特異性抗体が、
   １）第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合領域であって、第１の抗原に結合する抗体の軽鎖及び重鎖を含む、第１の抗原結合領域と、
   ２）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合領域であって、第２の抗原に結合する抗体の軽鎖及び重鎖を含み、第２の抗原結合領域において可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、第２の抗原結合領域と
   を含み、
   ｉｉ）その誤対合バリアントが、
   １）第１の抗原に結合する抗体の重鎖と、第２の抗原に結合する抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むペプチドとを含む、第１の抗原結合領域と、
   ２）第２の抗原に結合する抗体の軽鎖及び重鎖を含む第２の抗原結合領域であって、第２の抗原結合領域において可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、第２の抗原結合領域と
   を含み、
   ｉｉｉ）マルチモードクロマトグラフィー材料が、
   １）アニオン交換が可能な官能基と、
   ２）疎水性相互作用が可能な官能基と
   を含む、
   組成物をマルチモードクロマトグラフィー材料と接触させることと、
   ｂ）多重特異性抗体及び減少した量のその誤対合バリアントを含む溶出物を回収することと
   を含む、方法。
2. 疎水性相互作用が可能な官能基が、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基、ベンジル基、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
3. 疎水性相互作用が可能な官能基が、ベンジル基を含む、請求項２に記載の方法。
4. アニオン交換が可能な官能基が正に帯電した基を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 正に帯電した基が四級アンモニウムイオンである、請求項４に記載の方法。
6. マルチモードクロマトグラフィー材料が、Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミンを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. マルチモードクロマトグラフィー材料が、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＡｄｈｅｒｅ樹脂を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. マルチモードクロマトグラフィー材料が、Ｃａｐｔｏ^ＴＭＡｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ樹脂を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
9. マルチモードクロマトグラフィーの溶出が勾配溶出である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 勾配溶出がｐＨ勾配を含む、請求項９に記載の方法。
11. 捕捉クロマトグラフィー工程を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 捕捉クロマトグラフィー工程が、アフィニティークロマトグラフィー工程である、請求項１１に記載の方法。
13. アフィニティークロマトグラフィー工程が、プロテインＡクロマトグラフィー工程、プロテインＬクロマトグラフィー工程、プロテインＧクロマトグラフィー工程、及びプロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー工程である、請求項１２に記載の方法。
14. アフィニティークロマトグラフィー工程が、プロテインＡクロマトグラフィーで工程である、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. プロテインＡクロマトグラフィー工程が、アガロースに結合したプロテインＡを含むクロマトグラフィー材料を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 捕捉クロマトグラフィー工程及びマルチモードクロマトグラフィー工程が連続的である、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. マルチモードクロマトグラフィー工程の後に精製工程を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 多重特異性抗体の濃縮を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 多重特異性抗体が、ノブ・イントゥ・ホール修飾を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 多重特異性抗体及びその誤対合バリアントが、同じ宿主細胞培養物中で産生される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 宿主細胞培養物の宿主細胞が、原核細胞又は真核細胞である、請求項２０に記載の方法。
22. 宿主細胞が真核細胞である、請求項２０又は２１に記載の方法。
23. 真核細胞が、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞である、請求項２２に記載の方法。
24. 真核細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２２又は２３に記載の方法。
25. 請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物。
26. 薬学的に許容される担体を含む、請求項２５に記載の組成物。
27. 請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法によって精製された多重特異性抗体、又は請求項２５若しくは２６に記載の組成物を含む、製造品。