CN1845938B - 多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明包括含有一个或多个抗体结构域的天然发生的，或合成的聚合物连接的多肽。

Description

多肽
背景
常规的抗体是包含至少四条多肽链的大的多亚基蛋白质分子。例如，人IgG具有两条重链和两条轻链，其通过二硫键连接以形成功能性的抗体。常规IgG的大小约为150kD。由于它们相对大的大小，完整抗体(例如，IgG，IgA，IgM等)的治疗用途有限，这归因于在例如组织穿透中的问题。很多努力集中于鉴定和生产保留抗原结合功能和溶解性的较小抗体片段。
抗体重链和轻链多肽链包含直接参与抗原相互作用的可变(V)区，和在与免疫效应剂的非抗原特异性相互作用中提供结构支持和功能的恒定(C)区。常规抗体的抗原结合结构域包含两个分离的结构域：一个重链可变结构域(VH)和一个轻链可变结构域(VL：它可以是Vκ或Vλ)。抗原结合位点本身是由六个多肽环形成的：三个来自VH结构域(HI，H2和H3)，三个来自VL结构域(LI，L2和L3)。在体内，编码VH和VL结构域的V基因的各种主要库是由基因片段的组合重排产生的。C区包括轻链C区(称作CL区)和重链C区(称作CH1，CH2和CH3区)。
在蛋白酶消化之后已经鉴定了多种天然发生抗体的较小抗原结合片段。这些包括，例如，″Fab片段″(VL-CL-CH1-VH)，″Fab′片段″(具有重链铰链区的Fab)和″F(ab′)2片段″(由重链铰链区接合的Fab′片段的二聚体)。已经使用重组方法生成甚至更小的抗原结合片段，称作″单链Fv″(可变片段)或″scFv″，由合成的肽连接体接合的VL和VH所组成。
尽管通常知道天然发生抗体(例如，在人和大多数其它哺乳动物中)的抗原结合单位包含一对V区(VL/VH)，但骆驼科动物物种表达大比例的全功能的高度特异性抗体，所述抗体缺乏轻链序列。骆驼科动物重链抗体被发现为单一重链的同源二聚体，通过它们的恒定区进行二聚体化。这些骆驼科动物重链抗体的可变结构域称为VHH结构域并且当作为VH链的片段分离时保留以高度特异性结合抗原的能力((Hamers-Casterman et al.，1993，Nature 363：446-448；Gahroudi etal.，1997，FEBS Lett.414：521-526)。抗原结合性单一VH结构域也已从，例如，来自免疫小鼠的脾的基因组DNA扩增的鼠VH基因文库中鉴定出来，并且在大肠杆菌(E.coli)中表达(Ward et al.，1989，Nature341：544-546)。Ward等命名所述分离的单一VH结构域为″dAbs，″意即″结构域抗体。″术语″dAb″在本文中将指特异性结合抗原的抗体单一可变结构域(VH或VL)多肽。″dAb″独立于其它V结构域结合抗原；不过，当在本文中使用该术语时，″dAb″可以存在于具有其它VH或VL结构域的同源或异源多聚体中，其中所述其它结构域并非由dAb所进行的抗原结合所必需的，即，其中dAb独立于其它VH或VL结构域结合抗原。
抗体单一可变结构域，例如，VHH，是已知的最小抗原结合抗体单位。对于治疗中的应用，人抗体是优选的，主要是因为当给药于患者时它们不太会激发免疫反应。如上所注，分离的非骆驼科动物VH结构域趋于相对不可溶并且通常是微弱表达的。骆驼科动物VHH与人抗体的VH结构域的比较显示了相应于人VH结构域VH/VL界面的骆驼科动物VHH结构域的框架区的几个关键的差异。已经实施了这些人VH3的残基的突变以更加接近地类似VHH序列(特别是Gly44→Glu，Leu45→Arg和Trp47→Gly)从而产生保留抗原结合活性的″骆驼化(camelized)″人VH结构域(Davies&Riechmann，1994，FEBS Lett.339：285-290)，其还具有提高的表达和溶解性。(本文所用的可变结构域氨基酸编号与Kabat编号协议一致(Kabat et al.，1991，Sequencesof Immunological Interest，5th ed.U.S.Dept.Health&HumanServices，Washington，D.C.))WO 03/035694(Muyldermans)报道Trp103→Arg突变提高了非骆驼科动物VH结构域的溶解性。Davies&Riechmann(1995，Biotechnology N.Y.13：475-479)也报道了骆驼化的人VH结构域的噬菌体展示库(repertoire)的产生以及以100-400nM的亲和力结合半抗原的克隆的选择，但是选择的结合蛋白质抗原的克隆具有更弱的亲和力。
WO 00/29004(Plaskin et al.)和Reiter等(1999，J.Mol.Biol.290：685-698)描述了在大肠杆菌中表达的小鼠抗体的分离的VH结构域，它非常稳定并且以纳摩尔浓度范围的亲和力结合蛋白质抗原。WO90/05144(Winter et al.)描述了以19nM的解离常数结合实验抗原溶菌酶的小鼠VH结构域抗体片段。
WO 02/051870(Entwistle et al.)描述了结合实验抗原的人VH单一结构域抗体片段，包括以117nM的亲和力结合布鲁氏菌(Brucella)抗原特异性scFv的VH结构域，以及结合抗-FLAG IgG的VH结构域。
Tanha等(2001，J.Biol.Chem.276：24774-24780)描述了结合用作实验抗原的两个单克隆抗体并且具有微摩尔浓度范围的解离常数的骆驼化的人VH结构域的选择。
U.S.6,090,382(Salfeld et al.)描述了以10-8M或更低的亲和力结合人TNF-α的人抗体，具有10-3秒-1或更小的人TNF-α解离off-rate(Koff)并且在标准的L929细胞分析中中和人TNF-α的活性。
尽管许多抗体及其衍生物对于诊断和治疗有用，但对于特定应用经常未达到理想的抗体药物动力学。为了改进抗体分子的药物动力学，本发明提供连接于多聚体上的单一结构域可变区多肽，所述多聚体提供增强的稳定性和半寿期。将多聚体分子(例如，聚乙二醇；PEG)附于蛋白质上是非常成熟的并且已经显示调节被修饰蛋白质的药物动力学特性。例如，已经显示蛋白质的PEG修饰改变蛋白质的体内循环半寿期、抗原性、溶解性和对蛋白质水解的耐受性
(Abuchowski et al.，J.Biol.Chem.1977，252：3578；Nucci et al.，Adv.Drug Delivery Reviews 1991，6：133；Francis et al.，PharmaceuticalBiotechnology Vol.3(Borchardt，R.T.ed.)；and Stability ofProtein Pharmaceuticals：in vivoPathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991 pp235-263，Plenum，NY).
蛋白质分子的位点特异性和随机PEG化都是本领域已知的(见例如
Zalipsky and Lee，Poly(ethylene glycol)Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications 1992，pp 347-370，Plenum，NY；Goodson and Katre，1990，Bio/Technology，8：343；Hershfield et al.，1991，PNAS 88：7185).
更具体地，已经描述过在赖氨酸残基和硫化衍生物上的抗体分子的随机PEG化作用(见
(Ling and Mattiasson，1983，Immunol.Methods 59：327；Wilkinson et al.，1987，Immunol.Letters，15：17；Kitamura et al.，1991，CancerRes.51：4310；Delgado et al.，1996Br.J.Cancer，73：175；Pedley et al.，1994，Br.J.Cancer，70：1126).
发明概述
本发明是基于这样的发现上的，即多聚体部分(moiety)如PEG附着于抗体单一可变结构域多肽(结构域抗体；dAb)上提供更长的体内半寿期以及对于蛋白质水解增强的耐受性，而不丧失dAb活性或靶结合亲和力。本发明还提供各种形式(formats)的dAb分子，包括二聚体、三聚体和四聚体，其连接于一种或多种聚合物分子如PEG上。
在一个实施方案中本发明包括含有一个或两个抗体单一可变结构域多肽的PEG连接的多肽，其中所述多肽具有至少24kDa的流体动力学大小以及至少1.3小时的半寿期，并且其中每个可变结构域都具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为多肽中的单一抗体可变结构域结合抗原。
在另一个实施方案中本发明包括含有一个或两个抗体单一可变结构域的PEG连接的多肽，其中所述多肽具有至少200kDa的流体动力学大小以及20-60kDa的总PEG大小，并且其中每个可变结构域都具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为多肽中的单一抗体可变结构域结合抗原。
本发明还包括具有至少24kDa流体动力学大小的抗体单一可变结构域的PEG连接的多聚体，其中总PEG大小为20-60kDa，并且其中每个可变结构域都具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为多肽中的单一抗体可变结构域结合抗原。
在一个实施方案中，所述PEG连接的多肽相对于未连接于PEG上的相同多肽保留至少90％的活性，其中通过PEG连接的或非PEG  连接的多肽对靶配体的亲和力来测量活性。
在一个实施方案中，每个可变结构域都包含通用的框架(universalframework)。
在另一个实施方案中，所述通用框架包含选自DP47，DP45和DP38的VH框架；和/或VL框架为DPK9。
本发明还包括含有对于TNF-α特异的抗原结合位点的PEG连接的多肽，所述多肽具有一个或两个抗体可变结构域，每个可变结构域都具有TNF-α结合位点，其中所述多肽具有至少200kDa的流体动力学大小以及20-60kDa的总PEG大小。
在一个实施方案中，所述多肽具有对于TNFα的特异性。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述多肽以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。
在一个实施方案中，所述多肽在标准细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα。
在一个实施方案中，所述PEG连接的多肽包含通用框架，其中所述通用框架包含选自DP47，DP45和DP38的VH框架；和/或VL框架为DPK9。
本发明还包括具有至少1.3小时半寿期的聚合物连接的抗体单一可变结构域，其中所述聚合物直接或间接地在单一抗体可变结构域的半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于所述抗体单一可变结构域。
在一个实施方案中，所述聚合物连接的抗体单一可变结构域具有至少24kDa的流体动力学大小。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸或赖氨酸残基在所述抗体单一可变结构域的预定位置上。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸或赖氨酸残基存在于所述抗体单一可变结构域的C末端上。
在一个实施方案中，所述聚合物在半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于抗体单一可变结构域，所述半胱氨酸或赖氨酸残基不存在于所述抗体单一可变结构域的C末端或N末端上。
在一个实施方案中，所述聚合物在半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于抗体单一可变结构域，所述半胱氨酸或赖氨酸残基距离C末端和/或N末端至少两个残基。
在一个实施方案中，所述聚合物连接于重链可变结构域上，所述重链可变结构域在选自Glnl3，Pro41，或Leu115的位置上包含取代的半胱氨酸或赖氨酸残基。
在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域包含C末端铰链区并且其中所述聚合物附着于该铰链区。
在一个实施方案中，所述聚合物选自直链或支链聚(乙二醇)(PEG)，聚(丙二醇)，聚(乙烯醇)，甲氧基(聚乙二醇)，乳糖，直链淀粉，葡聚糖和糖原。
在一个实施方案中，所述聚合物是PEG。
在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域的一个或多个预定的残基突变为半胱氨酸或赖氨酸残基，其中所述PEG连接于所述突变的残基上。
在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域是量链可变结构域。
在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域是轻链可变结构域(VL)。
在一个实施方案中，所述半寿期在1.3和170小时之间。
在一个实施方案中，所述聚合物连接的抗体单一可变结构域具有在0.25和6小时之间的t1/2α。
在一个实施方案中，所述聚合物连接的抗体单一可变结构域具有在2和40小时之间的t1/2β。
本发明还包括具有至少1.3小时半寿期的PEG连接的抗体单一可变结构域的多聚体，其中所述PEG在所述多聚体的半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于所述多聚体，并且其中每个可变结构域都具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为所述多肽中的单一抗体可变结构域结合抗原。
在一个实施方案中，所述多聚体是抗体单一可变结构域的二聚体。
在一个实施方案中，所述多聚体是抗体单一可变结构域的三聚体。
在一个实施方案中，所述多聚体是抗体单一可变结构域的四聚体。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸或赖氨酸残基存在于所述多聚体所包含的抗体单一可变结构域的C末端或N末端上。
在一个实施方案中，至少一个所述抗体单一可变结构域的一个或多个预定的残基突变为半胱氨酸或赖氨酸残基，其中所述PEG连接于所述突变的残基上。
在一个实施方案中，所述突变的残基不在所述抗体单一可变结构域的C末端或N末端上。
在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域多肽是重链可变结构域，并且所述突变的残基选自Glnl3，Pro41或Leu115。
在一个实施方案中，所述PEG在半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于抗体单一可变结构域，所述半胱氨酸或赖氨酸残基距离C末端和/或N末端至少两个残基。
在一个实施方案中，所述半寿期在1.3和170小时之间。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有在0.25和5.8小时之间的t1/2α。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有在2和40小时之间的t1/2β。
本发明还包括包含三个或更多个抗体单一可变结构域的PEG连接的多聚体抗体单一可变结构域，其中所述可变结构域具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为单一抗体可变结构域结合抗原。
在一个实施方案中，所述多聚体具有至少24kDa的流体动力学大小。
在一个实施方案中，所述多聚体具有至少200kDa的流体动力学大小。
在一个实施方案中，所述多聚体具有3，4，5，6，7，或8个抗体单一可变结构域。
在一个实施方案中，权利要求40的PEG连接的多聚体具有至少1.3小时的半寿期。
在一个实施方案中，所述半寿期在1.3和170小时之间。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有在0.55和6小时之间的t1/2α。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有在2和40小时之间的t1/2β。
在一个实施方案中，所述PEG在所述多聚体的可变结构域所提供的预定半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于所述抗体单一可变结构域三聚体或四聚体。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸或赖氨酸残基存在于所述多聚体的抗体单一可变结构域的C末端或N末端上。
在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域的一个或多个预定的残基突变为半胱氨酸或赖氨酸残基，其中所述PEG连接于所述突变的残基上。
在一个实施方案中，所述突变的残基不在所述抗体单一可变结构域的C末端或N末端上。
在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域是重链可变结构域并且所述突变的残基选自Glnl3，Pro41或Leu115。
在一个实施方案中，所述PEG在半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于抗体单一可变结构域，所述半胱氨酸或赖氨酸残基距离C末端或N末端至少两个残基。
本发明还进一步包括含有抗原结合位点的多肽，所述多肽包含一个或两个抗体可变结构域，其中所述多肽具有至少24kDa的流体动力学大小和至少1.3小时的半寿期，其中每个可变结构域都具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为多肽中的抗体单一可变结构域结合抗原。
本发明还包括含有对TNFα特异的结合位点的多肽，所述多肽包含一个或两个抗体可变结构域，其中所述多肽具有至少24kDa的流体动力学大小和至少1.3小时的半寿期。
在一个实施方案中，每个可变结构域都具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为多肽中的抗体单一可变结构域结合抗原。
在一个实施方案中，所述多肽连接于具有在20和60kDa之间大小的PEG聚合物。
在一个实施方案中，所述多肽具有至少200kDa的流体动力学大小。
在一个实施方案中，所述半寿期在1.3和170小时之间。
在一个实施方案中，所述多肽具有在0.25和6小时之间的t1/2α。
在一个实施方案中，所述多肽具有在2和40小时之间的t1/2β。
在一个实施方案中，所述多肽包含在所述可变结构域的半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于PEG部分上的可变结构域。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸或赖氨酸残基存在于所述抗体单一可变结构域的C末端或N末端上。
在一个实施方案中，所述可变结构域的一个或多个预定的残基突变为半胱氨酸或赖氨酸残基，其中所述PEG连接于所述突变的残基上。
在一个实施方案中，所述突变的残基不在所述抗体单一可变结构域的C末端或N末端上。
在一个实施方案中，所述可变结构域是重链可变结构域并且所述突变的残基选自Glnl3，Pro41或Leu115。
本发明包括抗体单一可变结构域的同源多聚体，其中所述同源多聚体具有至少24kDa的流体动力学大小和至少1.3小时的半寿期。
在一个实施方案中，每个可变结构域都具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为同源多聚体中的单一抗体可变结构域结合抗原。
在一个实施方案中，所述同源多聚体连接于至少一个PEG聚合物上。
在一个实施方案中，所述半寿期在1.3和170小时之间。
在一个实施方案中，所述同源多聚体具有在0.25和6小时之间的t1/2α。
在一个实施方案中，所述同源多聚体具有在1和40小时之间的t1/2β。
在一个实施方案中，所述同源多聚体的每个抗体单一可变结构域都包含量链可变结构域或VL。
在一个实施方案中，将所述同源多聚体的每个抗体单一可变结构域都进行工程改造以便在所述抗体单一可变结构域的C末端包含额外的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述同源多聚体的抗体单一可变结构域通过肽连接体彼此连接。
在一个实施方案中，所述同源多聚体只包含第一和第二抗体单一可变结构域，其中同源二聚体的所述第一抗体单一可变结构域包含抗体单一可变结构域和重链(CH1)恒定区，并且其中所述同源二聚体的第二抗体单一可变结构域包含抗体单一可变结构域和轻链(CL)恒定区。
在一个实施方案中，所述同源多聚体具有对于TNFα的特异性。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述同源多聚体以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。
在一个实施方案中，所述同源多聚体在标准细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα。
在一个实施方案中，所述同源多聚体的抗体单一可变结构域结合TNFα。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述同源多聚体的每个抗体单一可变结构域以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。在一个实施方案中，所述同源多聚体以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10- 1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。
在一个实施方案中，所述同源多聚体的抗体单一可变结构域在标准细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα。
本发明进一步包含抗体单一可变结构域的异源多聚体，其中所述异源多聚体具有至少24kDa的流体动力学大小和至少1.3小时的半寿期，其中每个可变结构域都具有抗原结合位点，并且每个抗体单一可变结构域都作为所述异源多聚体中的单一抗体可变结构域结合抗原。
在一个实施方案中，所述异源多聚体连接于至少一个PEG聚合物上。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的半寿期在1.3和170小时之间。
在一个实施方案中，所述异源多聚体具有在0.25和6小时之间的t1/2α。
在一个实施方案中，所述异源多聚体具有在2和40小时之间的t1/2β。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的每个抗体单一可变结构域都包含重链可变结构域或VL。
在一个实施方案中，将所述异源多聚体的每个抗体单一可变结构域都进行工程改造以便在所述抗体单一可变结构域的C末端或N末端包含额外的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的抗体单一可变结构域通过肽连接体彼此连接。
在一个实施方案中，所述异源多聚体只包含第一和第二抗体单一可变结构域，其中所述异源多聚体的所述第一抗体单一可变结构域包含抗体单一可变结构域和重链(CH1)恒定区，并且其中所述异源多聚体的所述第二抗体单一可变结构域包含抗体单一可变结构域和轻链(CL)恒定区。
在一个实施方案中，所述异源多聚体具有对于TNFα的特异性。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述异源多聚体以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。
在一个实施方案中，所述异源多聚体在标准细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的每个抗体单一可变结构域都具有对于TNFα的特异性。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述异源多聚体的每个抗体单一可变结构域以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的每个抗体单一可变结构域都在标准细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα。
本发明还包括对于靶配体特异的PEG连接的抗体单一可变结构域，其相对于与所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有相同抗体单一可变结构域的非PEG连接的抗体单一可变结构域保留活性，其中活性通过所述PEG连接的或非PEG连接的抗体单一可变结构域对靶配体的亲和力进行测量。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域保留了未连接到PEG上的相同抗体单一可变结构域的90％的活性。
在一个实施方案中，通过表面等离子共振将活性测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域对TNFα的结合。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述PEG连接的抗体单一可变结构域以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。
在一个实施方案中，所述活性被测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域在标准的细胞分析中中和人TNFα或TNF受体1的能力。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域在标准的细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα或TNF受体1。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有分别比非PEG连接的抗体可变结构域的IC50或ND50大不超过10％的IC50或ND50，所述非PEG连接的抗体可变结构域与所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有相同的抗体单一可变结构域。
本发明还包括对靶抗原特异的PEG连接的抗体单一可变结构域，其以80nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明还包括PEG连接的抗体单一可变结构域，其以3nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明还包括PEG连接的抗体单一可变结构域，其以100pM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
在一个实施方案中，权利要求105的所述PEG连接的抗体单一可变结构域，其中如通过表面等离子共振所测定的，所述PEG连接的抗体单一可变结构域以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数结合TNFα。
在一个实施方案中，所述结合被测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域在标准的细胞分析中中和人TNFα或TNF受体1的能力。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域在标准的细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα或TNF受体1。
本发明还进一步包括PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体，其相对于非PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体保留活性，所述非PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体具有与所述PEG连接的抗体单一可变结构域相同的抗体单一可变结构域，其中活性通过所述PEG连接的或非PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体对靶配体的亲和力进行测量。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域保留了未连接到PEG上的相同抗体单一可变结构域同源多聚体的90％的活性。
在一个实施方案中，所述活性被测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体对TNFα的结合。
在一个实施方案中，所述活性被测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体抑制响应TNFα的细胞毒性的能力。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有比非PEG连接的抗体可变结构域同源多聚体的IC50大不超过10％的IC50。
在一个实施方案中，所述同源多聚体的每个成员都包含重链可变结构域或VL。
在一个实施方案中，所述同源多聚体包含抗体单一可变结构域，其被工程改造以便在所述抗体单一可变结构域的C末端或N末端包含额外的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述同源多聚体的成员通过肽连接体彼此连接。
在一个实施方案中，当所述多聚体只包含第一和第二成员时，所述同源二聚体的所述第一成员包含抗体单一可变结构域和重链(CH1)恒定区，并且其中所述同源二聚体的所述第二成员包含抗体单一可变结构域和轻链(CL)恒定区。
本发明还进一步包括PEG连接的抗体单一可变结构域异源多聚体，其相对于未连接于PEG上的相同抗体单一可变结构域异源多聚体保留活性，其中活性通过所述PEG连接的抗体单一可变结构域异源多聚体或未连接于PEG上的抗体单一可变结构域异源多聚体对靶配体的亲和力进行测量。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域保留了未连接到PEG上的相同抗体单一可变结构域异源多聚体的90％的活性。
在一个实施方案中，所述活性被测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域异源多聚体对TNFα的结合。
在一个实施方案中，所述活性被测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域异源多聚体抑制响应TNFα的细胞毒性的能力。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有比非PEG连接的抗体可变结构域异源多聚体的IC50大不超过10％的IC50，所述非PEG连接的抗体可变结构域异源多聚体具有与PEG连接的抗体单一可变结构域相同的抗体单一可变结构域。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的每个成员都包含重链可变结构域或VL。
在一个实施方案中，对每种所述抗体单一可变结构域进行工程改造以便在所述抗体单一可变结构域的C末端或N末端包含额外的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的成员通过肽连接体彼此连接。
在一个实施方案中，当所述多聚体只包含第一和第二成员时，所述异源二聚体的所述第一成员包含抗体单一可变结构域和重链(CH1)恒定区，并且其中所述异源二聚体的所述第二成员包含抗体单一可变结构域和轻链(CL)恒定区。
在一个实施方案中，以上同源或异源多聚体选自二聚体、三聚体和四聚体。
在一个实施方案中，以上同源或异源多聚体的PEG部分是分枝的PEG。
本发明还包括PEG连接的抗体单一可变结构域的同源多聚体，其以80nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述PEG连接的同源多聚体以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数结合TNFα。
在一个实施方案中，所述结合被测量为所述PEG连接的同源多聚体在标准的细胞分析中中和人TNFα或TNF受体1的能力。
在一个实施方案中，所述PEG连接的同源多聚体在标准的细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα或TNF受体1。
本发明包括PEG连接的抗体单一可变结构域的同源多聚体，其以3nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明包括PEG连接的抗体单一可变结构域的同源多聚体，其以100pM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明包括PEG连接的抗体单一可变结构域的异源多聚体，其以80nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明还进一步包括PEG连接的抗体单一可变结构域的异源多聚体，其以3nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明还包括PEG连接的抗体单一可变结构域的异源多聚体，其以100pM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明包括在所述抗体单一可变结构域中预定位置上含有至少一个溶剂可接近的(solvent-accessible)赖氨酸残基的抗体单一可变结构域，所述抗体单一可变结构域连接于PEG分子上。
在一个实施方案中，所述PEG以PEG连接的N-羟基琥珀酰亚胺活性酯的形式连接于所述溶剂可接近的赖氨酸上。
在一个实施方案中，所述N-羟基琥珀酰亚胺活性酯选自
PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS；PEG-O-CH2-NHS；PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS；PEG-S-CH2CH2-CO-NHS；PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS；PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS；和PEG-O-CH2-CO2-NHS；其中R是(CH2)4)NHCO2(mPEG).
在一个实施方案中，所述PEG是分枝的PEG。
本发明包括抗体单一可变结构域多聚体，所述多聚体的每个成员都包含至少一个连接于PEG分子上的溶剂可接近的赖氨酸残基。
在一个实施方案中，所述溶剂可接近的赖氨酸残基来自在选自Glnl3，Pro41或Leu115的一个或多个残基上的突变。
在一个实施方案中，所述多聚体是同源多聚体。
在一个实施方案中，所述多聚体是异源多聚体。
在一个实施方案中，所述多聚体是异源或同源三聚体。
在一个实施方案中，所述多聚体是异源或同源四聚体。
本发明还包括抗体单一可变结构域同源或异源三聚体或四聚体，其包含至少一个连接于PEG分子上的溶剂可接近的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述PEG通过选自顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜和硫醇的巯基选择性试剂连接于所述溶剂可接近的半胱氨酸上。
在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域是重链可变结构域并且所述溶剂可接近的半胱氨酸来自选自Glnl3，Pro41或Leu115的一个或多个残基的突变。
本发明还包括PEG连接的抗体可变区多肽，其具有比未连接于PEG上的相同抗体可变区的半寿期至少大六倍的半寿期。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体可变区具有至少24kDa的流体动力学大小。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体可变区具有在24kDa和500kDa之间的流体动力学大小。
本发明包括含有具有至少1.3小时半寿期的PEG连接的抗体单一可变结构域；和载体的药物制剂。
本发明还包括含有具有至少1.3小时半寿期并且具有至少24kDa的流体动力学大小的PEG连接的抗体单一可变结构域二聚体；和载体的药物制剂。
本发明还进一步包括含有PEG连接的抗体单一可变结构域异源三聚体或同源三聚体或异源四聚体或同源四聚体的药物制剂，其中每个可变结构域都具有抗原结合位点，并且每个可变结构域都作为单一可变结构域结合抗原。
本发明还包括含有PEG连接的抗体单一可变结构域的药物制剂，其中所述PEG连接的抗体单一可变结构域在所述药物制剂给药于动物胃部后被降解不超过10％。
本发明包括含有PEG连接的抗体单一可变结构域的药物制剂，其中暴露于选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶和羧肽酶的蛋白酶后，所述PEG连接的抗体单一可变结构域在体外降解不超过10％，其中如果所述蛋白酶是胃蛋白酶，那么所述PEG连接的抗体单一可变结构域在胃蛋白酶存在时于pH 2.030分钟被降解不超过10％，并且其中如果所述蛋白酶是胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶，那么所述PEG连接的抗体单一可变结构域在胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶存在时于pH 8.030分钟被降解不超过10％。
在一个实施方案中，所述药物制剂适于口服或适于通过选自静脉内、肌内或腹膜内注射、植入、直肠和经皮给药的途径进行肠胃外给药。
在一个实施方案中，所述药物制剂是延长释放肠胃外或口服剂型(dosage formulation)。
本发明包括减少抗体单一可变单体或多聚体结构域被选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶和羧肽酶的蛋白酶降解的方法，包含将所述单一可变结构域连接到至少一个PEG聚合物上。
在一个实施方案中，所述降解在动物的胃中得到减弱。
在一个实施方案中，当所述抗体单一可变结构域于pH 2.0暴露于胃蛋白酶30分钟时，降解在体外被减少至少10％，并且其中当所述抗体可变结构域于pH 8.0暴露于蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶和羧肽酶30分钟时所述降解在体外被减少至少10％。
在一个实施方案中，所述聚合物选自直链或支链聚(乙二醇)(PEG)，聚(丙二醇)，聚(乙烯醇)，甲氧基(聚乙二醇)，乳糖，直链淀粉，葡聚糖和糖原。
在一个实施方案中，所述聚合物是PEG。
在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域的一个或多个预定的残基突变为半胱氨酸或赖氨酸残基，其中所述PEG连接于所述突变的残基上。
在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域是重链可变结构域(VH)。
在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域是轻链可变结构域(VL)。
在一个实施方案中，所述半寿期在0.25和170小时之间。
在一个实施方案中，所述聚合物连接的抗体单一可变结构域具有在0.25和6小时之间的t1/2α。
在一个实施方案中，所述聚合物连接的抗体单一可变结构域具有在2和40小时之间的t1/2β。
本发明还包括具有至少0.25小时半寿期的PEG连接的抗体单一可变结构域的多聚体，其中所述PEG在所述多聚体的半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于所述多聚体，并且其中每个可变结构域都具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为多聚体中的单一抗体可变结构域结合抗原。
在一个实施方案中，所述多聚体是抗体单一可变结构域的二聚体。
在一个实施方案中，所述多聚体是抗体单一可变结构域的三聚体。
在另一个实施方案中，所述多聚体是抗体单一可变结构域的四聚体。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸或赖氨酸残基存在于所述多聚体所包含的抗体单一可变结构域的C末端上。
在一个实施方案中，至少一个所述抗体单一可变结构域的一个或多个预定的残基突变为半胱氨酸或赖氨酸残基，其中所述PEG连接于所述突变的残基上。
在一个实施方案中，所述半寿期在0.25和170小时之间。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有在0.25和5.8小时之间的t1/2α。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有在2和40小时之间的t1/2β。
本发明还包括含有三个或更多个抗体单一可变结构域的PEG连接的多聚体抗体单一可变结构域，其中所述可变结构域具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为单一抗体可变结构域结合抗原。
在一个实施方案中，所述PEG连接的多聚体具有至少24kDa的流体动力学大小。
在一个实施方案中，所述PEG连接的多聚体具有至少200kDa的流体动力学大小。
在一个实施方案中，所述多聚体具有3，4，5，6，7，或8个抗体单一可变结构域。
在一个实施方案中，所述PEG连接的多聚体具有至少0.25小时的半寿期。
在一个实施方案中，所述半寿期介0.25和170小时之间。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有在0.55和6小时之间的t1/2α。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有在2和40小时之间的t1/2β。
在一个实施方案中，所述PEG在多聚体的可变结构域所提供的预定半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于所述抗体单一可变结构域三聚体或四聚体。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸或赖氨酸残基存在于所述多聚体的抗体单一可变结构域的C末端上。
在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域的一个或多个预定的残基突变为半胱氨酸或赖氨酸残基，其中所述PEG连接于所述突变的残基上。
本发明进一步包括含有抗原结合位点的多肽，所述多肽包含一个或两个抗体可变结构域，其中所述多肽具有至少24kDa的流体动力学大小和至少0.25小时的半寿期，其中每个可变结构域都具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为多肽中的抗体单一可变结构域结合抗原。
本发明还进一步包括含有对TNFα特异的结合位点的多肽，所述多肽包含一个或两个抗体可变结构域，其中所述多肽具有至少24kDa的流体动力学大小和至少0.25小时的半寿期。
在一个实施方案中，每个可变结构域都具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为多肽中的抗体可变结构域结合抗原。
在一个实施方案中，所述多肽连接于具有在20和60kDa之间大小的PEG聚合物。
在一个实施方案中，所述多肽具有至少200kDa的流体动力学大小。
在一个实施方案中，所述半寿期在0.25和170小时之间。
在一个实施方案中，所述多肽具有在0.25和6小时之间的t1/2α。
在一个实施方案中，所述多肽具有在2和40小时之间的t1/2β。
在一个实施方案中，所述多肽包含在所述可变结构域的半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于PEG部分上的可变结构域。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸或赖氨酸残基存在于所述抗体单一可变结构域的C末端上。
在一个实施方案中，所述可变结构域的一个或多个预定的残基突变为半胱氨酸或赖氨酸残基，其中所述PEG连接于所述突变的残基上。
本发明包括抗体单一可变结构域的同源多聚体，其中所述同源多聚体具有至少24kDa的流体动力学大小和至少0.25小时的半寿期。
在一个实施方案中，每个可变结构域都具有抗原结合位点，每个可变结构域都作为同源多聚体中的单一抗体可变结构域结合抗原。
在一个实施方案中，所述同源多聚体连接于至少一个PEG聚合物上。
在一个实施方案中，所述半寿期在0.25和170小时之间。
在一个实施方案中，所述同源多聚体具有在0.25和6小时之间的t1/2α。
在一个实施方案中，所述同源多聚体具有在2和40小时之间的t1/2β。
在一个实施方案中，所述同源多聚体的每个抗体单一可变结构域都包含VH或VL。
在一个实施方案中，将所述同源多聚体的每个抗体单一可变结构域都进行工程改造以便在所述抗体单一可变结构域的C末端包含额外的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述同源多聚体的抗体单一可变结构域通过肽连接体彼此连接。
在一个实施方案中，所述同源多聚体只包含第一和第二抗体单一可变结构域，其中同源二聚体的第一抗体单一可变结构域包含抗体单一可变结构域和重链(CH1)恒定区，并且其中所述同源二聚体的第二抗体单一可变结构域包含抗体单一可变结构域和轻链(CL)恒定区。
在一个实施方案中，所述同源多聚体具有对于TNFα的特异性。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述同源多聚体以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。
在一个实施方案中，所述同源多聚体在标准细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα。
在一个实施方案中，所述同源多聚体的每个抗体单一可变结构域都结合TNFα。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述同源多聚体的每个抗体单一可变结构域以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。在一个实施方案中，所述同源多聚体以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10- 1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。
在一个实施方案中，所述同源多聚体的每个抗体单一可变结构域都在标准细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα。
本发明进一步包括抗体单一可变结构域的异源多聚体，其中所述异源多聚体具有至少24kDa的流体动力学大小和至少0.25小时的半寿期，其中每个可变结构域都具有抗原结合位点，并且每个可变结构域都作为异源多聚体中的单一抗体可变结构域结合抗原。
在一个实施方案中，所述异源多聚体连接于至少一个PEG聚合物上。
在一个实施方案中，所述半寿期在0.25和170小时之间。
在一个实施方案中，所述异源多聚体具有在0.25和6小时之间的t1/2α。
在一个实施方案中，所述异源多聚体具有在2和40小时之间的t1/2β。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的每个抗体单一可变结构域都包含VH或VL。
在一个实施方案中，将所述异源多聚体的抗体单一可变结构域进行工程改造以便在所述抗体单一可变结构域的C末端包含额外的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的抗体单一可变结构域通过肽连接体彼此连接。
在一个实施方案中，所述异源多聚体只包含第一和第二抗体单一可变结构域，其中所述异源多聚体的所述第一抗体单一可变结构域包含抗体单一可变结构域和重链(CH1)恒定区，并且其中所述异源多聚体的所述第二抗体单一可变结构域包含抗体单一可变结构域和轻链(CL)恒定区。
在一个实施方案中，所述异源多聚体具有对于TNFα的特异性。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述异源多聚体以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。
在一个实施方案中，所述异源多聚体在标准细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的每个抗体单一可变结构域都具有对于TNFα的特异性。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述异源多聚体的每个抗体单一可变结构域以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的每个抗体单一可变结构域都在标准细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα。
本发明还包括对于靶配体特异性的PEG连接的抗体单一可变结构域，其相对于与所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有相同抗体单一可变结构域的非PEG连接的抗体单一可变结构域保留活性，其中活性通过所述PEG连接的或非PEG连接的抗体单一可变结构域对靶配体的亲和力进行测量。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域保留了非PEG连接的抗体单一可变结构域的至少90％的活性。
在一个实施方案中，通过表面等离子共振将活性测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域对TNFα的结合。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述PEG连接的抗体单一可变结构域以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。
在一个实施方案中，所述活性被测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域在标准的细胞分析中中和人TNFα或TNF受体1的能力。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域在标准的细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα或TNF受体1。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有分别比非PEG连接的抗体可变结构域的IC50或ND50大不超过10％的IC50或ND50，所述非PEG连接的抗体可变结构域具有与所述PEG连接的抗体单一可变结构域相同的抗体单一可变结构域。
本发明还包括对靶抗原特异性的PEG连接的抗体单一可变结构域，其以80nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明还包括以3nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原的PEG连接的抗体单一可变结构域。
本发明还包括以100pM-30pM的Kd特异性结合靶抗原的PEG连接的抗体单一可变结构域。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述PEG连接的抗体单一可变结构域以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数结合TNFα。
在一个实施方案中，所述结合被测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域在标准的细胞分析中中和人TNFα或TNF受体1的能力。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域在标准的细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα或TNF受体1。
本发明还包括PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体，其相对于非PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体保留活性，所述非PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体具有与所述PEG连接的抗体单一可变结构域相同的抗体单一可变结构域，其中活性通过所述PEG连接的或非PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体对靶配体的亲和力进行测量。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域保留了非PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体的90％的活性。
在一个实施方案中，所述活性被测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体对TNFα的结合。
在一个实施方案中，所述活性被测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域同源多聚体抑制响应TNFα的细胞毒性的能力。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有比非PEG连接的抗体可变结构域同源多聚体的IC50大不超过10％的IC50。
在一个实施方案中，所述同源多聚体的每个成员都包含VH或VL。
在一个实施方案中，所述同源多聚体包含抗体单一可变结构域，对其进行工程改造以便在所述抗体单一可变结构域的C末端包含额外的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述同源多聚体的成员通过肽连接体彼此连接。
在一个实施方案中，所述多聚体只包含第一和第二成员，同源二聚体的第一成员包含抗体单一可变结构域和重链(CH1)恒定区，并且其中同源二聚体的第二成员包含抗体单一可变结构域和轻链(CL)恒定区。
本发明还进一步包括PEG连接的抗体单一可变结构域异源多聚体，其相对于非PEG连接的抗体单一可变结构域异源多聚体保留活性，所述非PEG连接的抗体单一可变结构域异源多聚体具有与PEG连接的抗体单一可变结构域相同的抗体单一可变结构域，其中活性通过所述PEG连接的或非PEG连接的抗体单一可变结构域异源多聚体对靶配体的亲和力进行测量。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域保留了非PEG连接的抗体单一可变结构域异源多聚体的90％的活性。
在一个实施方案中，所述活性被测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域异源多聚体对TNFα的结合。
在一个实施方案中，所述活性被测量为所述PEG连接的抗体单一可变结构域异源多聚体抑制响应TNFα的细胞毒性的能力。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体单一可变结构域具有比非PEG连接的抗体可变结构域异源多聚体的IC50大不超过10％的IC50，所述非PEG连接的抗体可变结构域异源多聚体具有与PEG连接的抗体可变结构域相同的抗体单一可变结构域。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的每个成员都包含VH或VL。
在一个实施方案中，对每个所述抗体单一可变结构域进行工程改造以便在所述抗体单一可变结构域的C末端包含额外的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述异源多聚体的成员通过肽连接体彼此连接。
在一个实施方案中，所述多聚体只包含第一和第二成员，异源多聚体的第一成员包含抗体单一可变结构域和重链(CH1)恒定区，并且同源二聚体的第二成员包含抗体单一可变结构域和轻链(CL)恒定区。
本发明还包括PEG连接的抗体单一可变结构域的同源多聚体，其以80nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测定的，所述PEG连接的同源多聚体以50nM-20pM的解离常数(Kd)，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数结合TNFα。
在一个实施方案中，所述结合被测量为所述PEG连接的同源多聚体在标准的细胞分析中中和人TNFα或TNF受体1的能力。
在一个实施方案中，所述PEG连接的同源多聚体在标准的细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα或TNF受体1。
本发明还包括PEG连接的抗体单一可变结构域的同源多聚体，其以3nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明还包括PEG连接的抗体单一可变结构域的同源多聚体，其以100pM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明还包括PEG连接的抗体单一可变结构域的异源多聚体，其以80nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明还包括PEG连接的抗体单一可变结构域的异源多聚体，其以3nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明还包括PEG连接的抗体单一可变结构域的异源多聚体，其以100pM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
本发明包括在所述抗体单一可变结构域中预定位置上含有至少一个溶剂可接近的赖氨酸残基的抗体单一可变结构域，所述抗体单一可变结构域连接于PEG分子上。
在一个实施方案中，所述PEG以PEG连接的N-羟基琥珀酰亚胺活性酯的形式连接于所述溶剂可接近的赖氨酸上。
在一个实施方案中，所述N-羟基琥珀酰亚胺活性酯选自
PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS；PEG-O-CH2-NHS；PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS；PEG-S-CH2CH2-CO-NHS；PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS；PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS；和PEG-O-CH2-CO2-NHS；其中R是(CH2)4)NHCO2(mPEG).
在一个实施方案中，所述PEG是分枝的PEG。
本发明包括抗体单一可变结构域多聚体，所述多聚体的每个成员都包含至少一个连接于PEG分子上的溶剂可接近的赖氨酸残基。
在一个实施方案中，所述多聚体是同源多聚体。
在一个实施方案中，所述多聚体是异源多聚体。
在一个实施方案中，所述多聚体是异源或同源三聚体。
在一个实施方案中，所述多聚体是异源或同源四聚体。
本发明还包括抗体单一可变结构域同源或异源三聚体或四聚体，其包含至少一个连接于PEG分子上的溶剂可接近的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述PEG通过选自顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜和硫醇的巯基选择性试剂连接于所述溶剂可接近的半胱氨酸上。
本发明还包括PEG连接的抗体可变区多肽，其具有比未连接于PEG上的相同抗体可变区的半寿期至少大六倍的半寿期。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体可变区具有至少24kDa的流体动力学大小。
在一个实施方案中，所述PEG连接的抗体可变区具有在24kDa和500kDa之间的流体动力学大小。
本发明还进一步包括含有具有至少0.25小时半寿期的PEG连接的抗体单一可变结构域；和载体的药物制剂。
本发明还包括含有具有至少0.25小时半寿期并且具有至少24kDa的流体动力学大小的PEG连接的抗体单一可变结构域二聚体；和载体的药物制剂。
本发明还包括含有PEG连接的抗体单一可变结构域异源三聚体或同源三聚体或异源四聚体或同源四聚体的药物制剂，其中每个可变结构域都具有抗原结合位点，并且每个可变结构域都作为单一可变结构域结合抗原。
本发明还包括含有PEG连接的抗体单一可变结构域的药物制剂，其中所述PEG连接的抗体单一可变结构域在所述药物制剂给药于动物胃部后被降解不超过10％。
本发明还进一步包括含有PEG连接的抗体单一可变结构域的药物制剂，其中于Ph 2.0暴露于胃蛋白酶30分钟后所述PEG连接的抗体单一可变结构域在体外降解不超过10％。
在一个实施方案中，所述药物制剂适于口服或适于通过选自静脉内、肌内或腹膜内注射的途径进行肠胃外给药，通过吸入、植入、直肠、阴道、皮下和经皮给药，口服，舌下，局部地施用。本发明的另一方面是提供递送治疗性多肽和/或试剂穿越天然屏障如血-脑屏障、肺-血屏障的方法和分子。
本发明还包括减弱胃蛋白酶对抗体单一可变结构域单体或多聚体的降解的方法，包括将所述抗体单一可变结构域连接到至少一个PEG聚合物上。
在一个实施方案中，降解在动物的胃中得到减弱。
在一个实施方案中，当所述抗体单一可变结构域于pH2.0暴露于胃蛋白酶30分钟时，降解在体外被减弱至少10％。
定义
如本文所用的，术语″结构域″指折叠的蛋白质结构，它独立于蛋白质的其余部分保留其三级结构。通常，结构域负责蛋白质不同的功能特性，并且在许多情况下可以被添加、去除或转移给其它蛋白质，而不会丧失蛋白质其余部分和/或所述结构域的功能。
″抗体单一可变结构域(antibody single variable domain)″意为折叠的多肽结构域，它包含免疫球蛋白可变结构域的特征性序列并且它特异性地结合抗原(即，1μM或更小的解离常数)，并且它作为单一可变结构域结合抗原；即，没有任何互补的可变结构域。所以″抗体单一可变结构域″包括完整的抗体可变结构域以及经过修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环被并非抗体可变结构域特征性的序列所替代的结构域，或已被截短或包含N或C末端延伸的抗体可变结构域，以及可变结构域的折叠片段，所述折叠片段保留500nM或更小的解离常数(例如，450nM或更小，400nM或更小，350nM或更小，300nM或更小，250nM或更小，200nM或更小，150nM或更小，100nM或更小)以及全长结构域的靶抗原特异性。优选地可用于本发明的抗体单一可变结构域选自VH和VL，包括Vκ和Vλ。根据本发明，这里所述的利用VH结构域的方法和组合物还可以利用骆驼科动物VHH结构域。抗体单一可变结构域是本领域已知的，并且在例如Ward等，Nature.1989Oct 12；341(6242)：544-6中进行过描述，这里将其全部内容并入作为参考。
短语″抗体单一可变结构域″不仅包括分离的抗体单一可变结构域多肽，还包括含有一个或多个抗体单一可变结构域多肽序列单体的更大的多肽。″结构域抗体″或″dAb″等同于本文所用的″抗体单一可变结构域″多肽。如本文所用的抗体单一可变结构域多肽指哺乳类单一免疫球蛋白可变结构域多肽，优选人，还包括啮齿动物(例如，如在WO00/29004中所描述的，在此将其全部内容并入)或骆驼科动物VHHdAbs。骆驼科动物dAbs是源自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼(guanaco)的物种的抗体单一可变结构域多肽，并且包含天然缺少轻链的重链抗体：VHH。VHH分子比IgG分子大约小10倍，并且作为单一多肽，它们非常稳定，耐受极端pH和温度条件。而且，骆驼科动物抗体单一可变结构域多肽耐受蛋白酶的作用。骆驼科动物抗体在例如，美国专利号5,759,808；5,800,988；5,840,526；5,874,541；6,005,079；和6,015,695中进行过描述，在此将它们的全部内容并入。根据本发明有用的骆驼科动物VHH抗体单一可变结构域多肽包括一类具有似人序列的骆驼科动物抗体单一可变结构域多肽，其中该类别的特征是VHH结构域根据Kabat编号法在位置45上携带选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬酰胺或谷氨酰胺的氨基酸，如例如L45，并且进一步在位置103上包含色氨酸。在例如WO04/041862中教示了人源化的骆驼科动物VHH多肽，在此将教示的全部内容并入。本领域技术人员会理解天然发生的骆驼科动物抗体单一可变结构域多肽可以根据WO 04/041862的教示(例如，在位置45和103上的氨基酸取代)而进行修饰，以产生人源化的骆驼科动物VHH多肽。
根据本发明，术语″抗体单一可变结构域多肽″，″抗体单一可变结构域″，″单一抗体可变结构域″，和″免疫球蛋白单一可变结构域″被理解为是等同的。
如本文所用的，短语″免疫球蛋白可变结构域的特征性序列″指与免疫球蛋白可变结构域序列所含序列具有超过20或更多，25或更多，30或更多，35或更多，40或更多，45或更多，或甚至50或更多的连续氨基酸同源的氨基酸序列。
如本文所用的，″连接的″指多肽部分，如PEG附着于本发明的抗体单一可变结构域或多肽的氨基酸残基上。PEG聚合物附着于dAb或多肽的氨基酸残基上被称为″PEG化作用″并且可以利用几种PEG附着部分来实现，所述PEG附着部分包括，但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯，琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)，顺丁烯二酰亚胺(MAL)，乙烯砜(VS)，或硫醇。PEG聚合物，或其它聚合物可以在预定的位置上连接于dAb或多肽，或者可以随机地连接于dAb分子。不过，优选PEG聚合物在预定的位置上连接于dAb或多肽。PEG聚合物可以连接于dAb或多肽中的任何残基，不过，优选所述聚合物连接于赖氨酸或半胱氨酸，它们是在dAb或多肽中天然发生的，或是被工程设计入dAb或多肽中的，例如，通过将dAb中天然发生的残基突变为半胱氨酸或赖氨酸。如本文所用的，″连接的″还可以指两个或多个抗体单一可变结构域多肽单体的缔合以形成二聚体、三聚体、四聚体或其它的多聚体。dAb单体可以通过本领域已知的几种方法进行连接以形成多聚体，所述方法包括，但不限于dAb单体作为融合蛋白进行表达，两个或多个单体通过单体间的肽连接体进行连接，或通过翻译后将单体彼此直接地或通过二硫键的连接体进行化学接合，或通过二、三或多价连接部分的连接(例如，多臂PEG)。
如本文所用的，关于聚合物″直接地连接″于抗体单一可变结构域多肽的短语″直接地连接″指这样的情况，即其中所述聚合物附着于作为可变结构域的一部分的残基(天然发生的或工程设计的)上，例如，未包含在恒定区、铰链区或连接肽中的残基。相反地，如本文所用的，短语″间接地连接″抗体单一可变结构域指聚合物分子连接抗体单一可变结构域，其中所述聚合物未附着于作为所述可变结构域的部分的氨基酸残基上(例如，可以附着于铰链区)。如果聚合物通过连接肽连接到单一可变结构域上则它是″间接地连接的″，即所述聚合物未附着于作为所述抗体单一可变结构域的部分的氨基酸残基本身上。或者如果聚合物连接到单一可变结构域的C末端铰链区，或附着于恒定区的任何残基上，则它是″间接地连接″于抗体单一可变结构域上的，所述恒定区可以作为所述抗体单一可变结构域多肽的部分而存在。
如本文所用的，术语″同源性″或″相似性″或″同一性″指两个核苷酸或氨基酸序列结构上彼此相似的程度。根据本发明的同源性序列可以是通过氨基酸的添加、删除或取代而修饰的多肽，与未修饰的多肽相比，所述修饰基本上不改变功能特性。当本发明的抗体单一可变结构域多肽是骆驼科动物多肽时，根据本发明的同源性序列可以是存在于其它骆驼科动物(Camelidae)物种中的序列，如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和原驼。如本文所用的，序列″相似性″是在序列的比对中氨基酸序列在相应的位置上共有相似氨基酸残基的程度的测量。当氨基酸的侧链相似时它们彼此相似。具体地，″相似性″包括对于彼此是保守性取代的氨基酸。″保守性″取代是任何在blosum62取代矩阵中具有正分值的取代(Hentikoff and Hentikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)。描述″序列A n％相似于序列B″意即在序列A和序列B之间的最优全局比对位置的n％由相同氨基酸或保守性取代所组成。最优全局比对可以利用Needleman-Wunsch比对算法中的下列参数来进行：
对于多肽：
取代矩阵：blosum62。
缺口评分函数：-A-B＊LG，其中A＝11(缺口罚分)，B＝1(缺口长度罚分)而LG是缺口长度。
对于核苷酸序列：
取代矩阵：匹配为10，错配为0。
缺口评分函数：-A-B＊LG，其中A＝50(缺口罚分)，B＝3(缺口长度罚分)而LG是缺口长度。
典型的保守性取代是在Met，Val，Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在残基Asp，Glu和Asn之间；在残基Gln，Lys和Arg之间；或芳族残基Phe和Tyr之间。
当利用Needleman-Wunsch算法或Tatusova&Madden，1999，FEMS Microbiol Lett.174：247-250描述的″BLAST 2序列″算法进行比对时，当两个序列彼此具有至少85％的序列相似性时，如本文所用的，它们是″同源的″或″相似的″。当利用″BLAST 2序列″算法对氨基酸序列进行比对时，Blosum 62矩阵是默认的矩阵。
如本文所用的，术语″低严谨性，″″中严谨性，″″高严谨性，″或″极高严谨性条件″描述核酸杂交和洗涤的条件。对于进行杂交反应的指导可见于Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中，在此并入其全部内容作为参考。在该参考文献中描述了水性和非水性方法并且二者都可以使用。本文所用的具体的杂交条件如下：(1)低严谨杂交条件，于大约45℃的6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，接着在0.2X SSC，0.1％SDS于至少50℃洗涤两次(对于低严谨条件洗涤温度可以升至55℃)；(2)中严谨杂交条件，于大约45℃的6X SSC中，接着在0.2X SSC，0.1％SDS于60℃洗涤一次或多次；(3)高严谨杂交条件，于大约45℃的6X SSC中，接着在0.2X SSC，0.1％SDS于65℃洗涤一次或多次；和优选地(4)极高严谨杂交条件是0.5M磷酸钠，7％SDS，65℃，接着在0.2XSSC，0.1％SDS于65℃洗涤一次或多次。
如本文所用的，短语″特异性结合″指如通过利用，例如，BIAcoreTM表面等离子共振系统和BIAcoreTM动力学评估软件(例如，2.1版)的表面等离子共振分析所测量的，抗体单一可变结构域以1μM或更低的解离常数(Kd)结合抗原。特异性结合相互作用的亲和力或Kd优选是大约500nM或更低，优选是大约300nM，优选是大约100nM或更低，更加优选是大约80nM或更低，优选低至10pM。
如本文所用的，术语″高亲和力结合″指以小于或等于100nM的Kd进行的结合。
如本文所用的，短语″在......浓度上″意为将给定的多肽以所述的质量或摩尔量/单位体积溶于溶液中(优选水性溶液)，因而包括摩尔浓度和重量/体积百分比。所以″以X的浓度″或″以至少X的浓度″存在的多肽不包括多肽的干燥和结晶制品。
如如本文所用的，术语″库(repertoire)″指不同变异体的集合，例如核苷酸序列不同的核酸变异体或氨基酸序列不同的多肽变异体。根据本发明的文库将包括多肽或核酸的库。根据本发明，将多肽的库设计来具有普通配体(generic ligand)的结合位点和靶配体的结合位点。所述结合位点可以重叠，或位于分子的相同区域，但是它们的特异性不同。用于本发明的文库将包括含有至少1000个成员的多肽库。
如本文所用的，术语″文库(library)″指异源多肽或核酸的混合物。文库由成员组成，每个所述成员都具有单一的多肽或核酸序列。在此程度上，文库与库同义。文库成员之间的序列差异对存在于文库中的多样性负责。文库可以采取肽或核酸简单混合物的形式，或可以是生物或细胞的形式，例如用核酸文库转化的细菌、病毒、动物或植物细胞等。优选地，每个各别生物或细胞都只包含一个或有限数目的文库成员。有益地，将核酸并入表达载体中，以便允许表达由所述核酸编码的多肽。所以在一个优选的方面，文库可以采取一群宿主生物的形式，每个生物都包含一个或多个拷贝的表达载体，其含有以核酸形式存在的文库的单一成员，它能够进行表达以产生其相应的多肽成员。因而，宿主生物群具有编码大量遗传上不同的多肽变异体的较大库的潜力。
如本文所用的，″聚合物″指由重复性单体单元所组成的大分子，并且可以指合成的或天然发生的聚合物，如任选地取代的直链或支链聚亚烷基(polyalkylene)，聚亚烯基(polyalkenylene)，或聚氧亚烷基(polyoxyalkylene)聚合物或分支的或未分枝的多糖。如本文所用的，″聚合物″优选指任选地取代的或分枝的链聚(乙二醇)，聚(丙二醇)，或聚(乙烯醇)及其衍生物。
如本文所用的，″PEG″或″PEG聚合物″指聚乙二醇，更具体地可以指PEG的衍生形式，包括，但不限于PEG的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯，如琥珀酰亚胺基丙酸酯，苯并三唑活性酯，顺丁烯二酰亚胺衍生的PEG，乙烯砜，或巯基基团。特定的PEG形式可以包括PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS；PEG-O-CH2-NHS；PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS；PEG-S-CH2CH2-CO-NHS；PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS；PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS；和PEG-O-CH2-CO2-NHS；其中R是(CH2)4)NHCO2(mPEG)。可用于本发明的PEG聚合物可以是线性分子，或者可以是分枝的，其中多个PEG部分存在于单一聚合物中。某些特别优选的可用于本发明的PEG构象包括，但不限于下列：
如本文所用的，″巯基选择性试剂″是可用于将PEG聚合物附着于含巯基氨基酸的试剂。氨基酸残基半胱氨酸上的巯基基团对于与巯基选择性试剂的相互作用是特别有用的。可用于本发明的巯基选择性试剂包括，但不限于顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜和硫醇。使用巯基选择性试剂偶合半胱氨酸残基是本领域已知的并且可以按照本发明根据需要来适用
(见Eg，Zalipsky，1995，Bioconjug.Chem.6：150；Greenwald et al.，2000，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17：101；Herman et al.，1994，Macromol.Chem.Phys.195：203).
如本文所用的，″抗原″被抗体或抗体的结合区(例如，可变结构域)结合。一般，抗原能够引发体内抗体反应。抗原可以是肽、多肽、蛋白质、核酸、脂类、糖类或其它分子，并且包括多亚基分子。一般，根据抗特定抗原的靶特异性来选择免疫球蛋白可变结构域。
如本文所用的，术语″表位″指被抗体单一可变结构域VH/VL对常规结合的结构单位。表位定义抗体的最小结合位点，并且因而代表抗体特异性的靶。对于抗体单一可变结构域来说，表位代表被分离的可变结构域结合的结构单位。
如本文所用的，当相关于如本文所述的抗体单一可变结构域使用时，术语″中和″意为多肽干扰(例如，完全或至少部分地抑制或消除)靶抗原的可测量的活性或功能。如果一种多肽减弱靶抗原的可测量的活性或功能至少50％，优选地至少60％，70％，80％，90％，95％或更多，高达并且包括100％的抑制(即，没有靶抗原的可测量的作用或功能)。靶抗原的可测量的活性或功能的这种减弱可以由本领域技术人员利用测量这种活性或功能的一种或多种指示物的标准方法来进行评估。作为一个例子，当所述靶为TNF-α时，中和活性可以利用标准的L929细胞杀伤测试或通过在HUVEC上测量抗体单一可变结构域多肽抑制TNF-α诱导的ELAM-1表达的能力而进行评估，所述HUVEC测量TNF-α诱导的细胞激活。类似于如本文所用的″中和″，如本文所用的″抑制细胞细胞毒性″指测量的细胞死亡的减少，例如，利用标准的L929细胞杀伤测试，其中当细胞死亡减少了至少10％或更多时，细胞细胞毒性(cell cytotoxicity)得到抑制。
如本文所用的，″靶抗原的可测量的活性或功能″包括，但不限于，例如，细胞信号、酶学活性、结合活性、配体依赖性内化作用、细胞杀伤、细胞激活、细胞存活的促进和基因表达。本领域技术人员可以进行分析，对给定的靶抗原测量这种活性。优选地，如本文所用的，″活性″由(1)基于细胞的测试中的ND50；(2)对靶配体的亲和力，(3)ELISA结合，或(4)受体结合测试所定义。进行这些试验的方法是本领域技术人员已知的并且在下面作进一步详细地描述。
如本文所用的，″dAb活性″或″抗体单一可变结构域活性″指抗体单一可变结构域或多肽结合抗原的能力。如本文所用的，″保留活性″指PEG连接的抗体单一可变结构域或多肽的活性水平，其是非PEG连接的抗体单一可变结构域或多肽的活性水平的至少10％，优选至少是非PEG连接的抗体单一可变结构域或多肽的活性的20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％和高达90％，优选高达95％，98％，和高达100％，所述非PEG连接的抗体单一可变结构域或多肽包含与PEG连接的抗体单一可变结构域或多肽相同的可变结构域，其中活性如上所述进行确定。更具体地，与非PEG连接的抗体单一可变结构域或多肽相比，PEG连接的抗体单一可变结构域或多肽的活性应当在单一抗体可变结构域或多肽的摩尔基础上进行确定；即在每次试验中应当使用相等摩尔数的每种PEG连接的和非PEG连接的抗体单一可变结构域，其中在各试验之间的所有其它条件都等同。在确定特定PEG连接的抗体单一可变结构域是否″保留活性″中，优选将PEG连接的抗体单一可变结构域的活性与缺失PEG的相同抗体单一可变结构域的活性相比。
如本文所用的，短语″特异性结合″指如通过利用BIAcoreTM表面等离子共振系统和BIAcoreTM动力学评估软件(例如，2.1版)的表面等离子共振分析所测量的，免疫球蛋白可变结构域或多肽以1μM或更低的解离常数(Kd)结合抗原。特异性结合相互作用的亲和力或Kd优选是大约1μM或更低，优选500nM或更低，更加优选100nM或更低，更加优选大约80nM或更低，优选低至10pM。
如本文所用的，术语″异源二聚体，″″异源三聚体″，″异源四聚体″，和″异源多聚体″分别指包含两个、三个或更多个(例如，四、五、六、七和高达八个或更多)单体的分子，所述单体具有两个或多个不同的单一免疫球蛋白可变结构域多肽序列。例如，异源二聚体包括两个VH序列，如VH1和VH2，或VHH1和VHH2，或者可以包括VH和VL的组合。与同源二聚体、三聚体或四聚体相似，在异源二聚体、异源三聚体、异源四聚体或异源多聚体中的单体可以通过表达为融合多肽进行连接，例如，用单体间的肽连接体，或者通过翻译后将单体彼此直接地或通过二硫键的连接体进行化学接合，或通过二、三或多价连接部分的连接。在一个实施方案中，在异源二聚体、异源三聚体、异源四聚体或异源多聚体中的单体可以通过多臂PEG聚合物进行连接，其中如上所述将所述二聚体、三聚体、四聚体或多聚体的每个单体都连接到多臂PEG聚合物的PEG部分上。
如本文所用的，术语″半寿期″指配体(例如，单一免疫球蛋白可变结构域)的血清浓度，例如由于配体的降解和/或配体被天然机制清除或隔离(sequestration)而在体内减小50％所需的时间。通过结合到被假定来抵抗降解和/或清除或隔离的分子，如PEG上而在体内使本发明的抗体单一可变结构域稳定化并提高其半寿期。如果dAb或多肽的功能性活性比未连接到PEG聚合物上的相似dAb在体内保留(在某一程度上)更长的时期，则它的半寿期得到提高。一般，相对于非PEG化的dAb或多肽，PEG化的dAb或多肽的半寿期提高了10％，20％，30％，40％，50％或更多。在2x，3x，4x，5x，l0x，20x，30x，40x，50x或更多倍范围内的半寿期的提高是可能的。或者，或此外，在高达30x，40x，50x，60x，70x，80x，90x，100x，150x范围内的半寿期的提高是可能的。根据本发明，PEG连接的抗体单一可变结构域或多肽具有在0.25和170小时之间的半寿期，优选在1和100小时之间，更加优选在30和100小时之间，还要更加优选在50和100小时之间，以及高达170，180，190和200小时或更多。
如本文所用的，关于PEG或其它聚合物连接的dAb单体或多聚体，″耐受降解″或″抵抗降解″意为当于pH 2.0暴露于胃蛋白酶30分钟时，PEG或其它聚合物连接的dAb单体或多聚体被降解不超过10％，并且优选完全不被降解。具体提及本发明的PEG或其它聚合物连接的dAb多聚物时(例如，异源或同源二聚体、三聚体、四聚体等)，这种多聚体于pH 2.0存在胃蛋白酶30分钟时被降解小于5％，优选完全不被降解。
如本文所用的，″流体动力学大小″指基于分子(例如，蛋白质分子)经过水溶液的扩散的分子表观大小。可以对蛋白质经过溶液的扩散或运动进行处理以取得所述蛋白质的表观大小，其中所述大小以蛋白质颗粒的″Stokes半径″或″流体动力学半径″给出。蛋白质的″流体动力学大小″依赖于质量和形状(构象)，从而两种具有相同分子质量的蛋白质可以根据蛋白质的整体构象而具有不同的流体动力学大小。PEG连接的抗体单一可变结构域(包括如本文所述的抗体可变结构域多聚体)的流体动力学大小可以是在24kDa-500kDa；30-500kDa；40-500kDa；50-500kDa；100-500kDa；150-500kDa；200-500kDa；250-500kDa；300-500kDa；350-500kDa；400-500kDa和450-500kDa的范围内。优选本发明的PEG化的dAb的流体动力学大小是30-40kDa；70-80kDa或200-300kDa。当需要将一种抗体可变结构域多聚体用于成像用途时，所述多聚体应当具有在50-100kDa之间的流体动力学大小。或者，当需要将一种抗体单一结构域多聚体用于治疗性用途时，所述多聚体应当具有大于200kDa的流体动力学大小。
如本文所用的″TAR1″指靶抗原为TNFα的dAb。
如本文所用的″TAR2″指靶抗原为人p55-TNFα受体的dAb。
附图简述
图1显示受体结合测试的结果，表明PEG化形式的TAR1-5-19的亲和力范围。
图2显示细胞毒性测试的结果，表明PEG化形式的TAR1-5-19的亲和力范围。
图3显示SDS-PAGE凝胶，表明各种形式的PEG化的HEL4dAb亲和性结合溶菌酶的结果。
图4显示受体结合测量的结果，表明TAR2-10-27和40K PEG化单体的亲和力。
图5显示TAR1-5-19和PEG化的变异体于pH 2.0对抗胃蛋白酶作用的蛋白酶稳定性。
图6显示dAb的单体PEG化作用的图示。图6-1显示未修饰的VH或VL dAb。图6-2显示具有表面PEG化作用的VH或VL。图6-3显示具有连接于PEG上的C末端半胱氨酸的VH或VL dAb。
图7显示PEG化的VH或VL异源或同源dAbs的图示。图7-4显示由C末端二硫键形成的VH或VL二硫二聚体。图7-5显示在一个亚基上PEG化的VH或VL二硫二聚体。图7-6显示在两个亚基上都PEG化的VH或VL二硫二聚体。图7-7显示通过C末端半胱氨酸由分枝的/分叉的/多臂的PEG形成的VH或VL二聚体。图7-8显示由表面二硫键形成的VH或VL二硫二聚体。图7-9显示在一个亚基上PEG化的VH或VL二硫二聚体。图7-10显示在两个亚基上都PEG化的VH或VL二聚体。图7-11显示通过表面半胱氨酸由分枝的/分叉的/多臂的PEG形成的VH或VL二聚体。
图8显示本发明的PEG化的VH或VL异源或同源二聚体的其它图示。图8-12显示由(Gly4Ser)n连接体(n＝0-10)形成的VH或VL连接的二聚体。图8-13显示在一个亚基上PEG化的VH或VL连接体二聚体。。图8-14显示在两个亚基上都PEG化的VH或VL连接体二聚体。图8-15显示通过连接体PEG化的VH或VL连接体二聚体。图8-16显示具有C末端半胱氨酸残基的VH或VL连接体二聚体。图8-17显示由二硫键二聚体化的两个VH或VL连接体二聚体。
图9显示PEG化的连接体dAb二聚体的图示。图9-18和9-19显示通过在一个亚基上的C末端半胱氨酸残基PEG化的VH或VL连接体二聚体。图9-20显示通过存在于连接体中的半胱氨酸PEG化的VH或VL连接体二聚体。图9-21显示通过存在于一个亚基上的半胱氨酸PEG化的VH或VL连接体二聚体。图9-22显示通过过存在于两个亚基上的半胱氨酸PEG化的VH或VL连接体二聚体。
图10显示VH或VL异源或同源三聚dAbs的PEG化作用的图示。图10-23和10-24显示利用3臂PEG通过C末端氨基酸共价三聚体化的dAb三聚体的PEG化作用和形成。图10-25显示其中一种dAb单体的表面PEG化作用，其中通过连接体肽形成dAb三聚体。图10-26显示dAb三聚体的其中一种单体的C末端PEG化作用。图10-27显示双特异性dAb三聚体，其中两种dAb单体具有对于TNFα的结合亲和力而第三种单体具有对于血清白蛋白的结合亲和力。这种格式也能够如在图10-25或10-26中所示的进行PEG化。
图11显示VH或VL异源或同源dAbs的图示。图11-28显示通过将4臂PEG连接到每个dAb单体的C末端半胱氨酸上而形成的dAb四聚体。图11-29和11-31显示通过由分枝的/多臂PEG连接两个dAb连接体二聚体而形成dAb四聚体，其中PEG连接于C末端半胱氨酸(11-29)上或连接于连接肽(11-31)上。图11-30显示一种dAb四聚体，其中所述四聚体的每个单体都通过单一分枝的PEG连接于每个单体的C末端半胱氨酸残基上。图11-32显示一个dAb四聚体，其中每个单体都通过连接肽连接到另一个上。这种构型可以利用图10-25或10-26中所示的任何策略进行PEG化。
图12显示可用于本发明的其它多聚PEG连接的dAb形式。图12-31显示dAb连接体二聚体的四聚体，它们自己通过多臂PEG连接形成四聚体，其中PEG连接到存在于每个二聚体其中一个单体中的C末端半胱氨酸上。图32显示dAb连接体二聚体的四聚体，它们自己通过多臂PEG连接形成四聚体，其中每个PEG都连接到存在于每个二聚体对的连接体中的半胱氨酸上。
图13显示基于种系序列DP47-JH4b(SEQ ID NO：1，2)的VH框架。HCDRs 1-3通过下划线进行指示。
图14显示基于种系序列DPκ9-Jκ1(SEQ ID NO：3，4)的Vκ框架。LCDRs 1-3通过下划线进行指示。
图15显示表明dAb原生流体动力学大小与小鼠体内血清半寿期的关系的曲线。
图16显示单体的和40KPEG化TAR1-5-19的蛋白酶稳定性模式曲线。相对活性为无蛋白酶对照的百分比。所用的蛋白酶是胃蛋白酶、猪肠粘膜肽酶、弹性蛋白酶、精制牛胰蛋白酶(CBP)和大鼠肠粉(RatIn)。
详述
本发明提供相对于非聚合物连接的dAbs具有提高的半寿期和对蛋白水解性降解的耐受性的聚合物连接的dAbs和dAb同源和异源多聚体。在一个实施方案中，本涉及PEG连接的dAbs和dAb多聚体，并且还进一步涉及PEG连接的dAb单体、二聚体、三聚体和四聚体，其具有至少0.25小时的半寿期，并且进一步具有至少24kDa的流体动力学大小。本发明还涉及PEG连接的抗体单一可变结构域，它相对于非PEG连接的抗体单一可变结构域保留其活性，所述非PEG连接的抗体单一可变结构域具有与PEG连接的抗体单一可变结构域相同的抗体可变结构域。这提供了具有提高的治疗效力的dAb分子，这归因于它们的延长的循环时间和有力而有效的活性。
在一个实施方案中，本发明提供PEG连接的dAb多聚体，它包含至少两个非互补性可变结构域。例如，dAbs可以包含一对VH结构域或一对VL结构域。有利地，所述结构域是非骆驼科动物来源的；优选地它们是人结构域或包含人框架区(FWs)和一个或多个异源CDRs。CDRs和框架区是在Kabat database of Sequences of Proteins ofImmunological Interest中定义的免疫球蛋白可变结构域的那些区域。在一个实施方案中，所述dAb结构域是骆驼科动物来源的。
优选的人框架区是由种系基因片段DP47和DPK9编码的那些。有利地，VH或VL结构域的FW1，FW2和FW3具有来自DP47或DPK9的FW1，FW2或FW3。人框架可以任选地包含突变，例如在用于本发明的dAbs的人框架中总共有高达大约5个氨基酸改变或高达大约10个氨基酸改变。
单一免疫球蛋白可变结构域的制备：
本发明的抗体单一可变结构域(或dAbs)是折叠的多肽结构域，它包含免疫球蛋白可变结构域的特征性序列，并且它特异性结合抗原(即，解离常数为500nM或更小)，它作为单一可变结构域结合抗原；即，没有任何互补的可变结构域。所以抗体单一可变结构域包括完整的抗体可变结构域以及经过修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环被并非抗体可变结构域特征性的序列所替代的结构域，或已被截短或包含N或C末端延伸的抗体可变结构域，以及可变结构域的折叠片段，所述折叠片段保留500nM或更小的解离常数(例如，450nM或更小，400nM或更小，350nM或更小，300nM或更小，250nM或更小，200nM或更小，150nM或更小，100nM或更小)以及全长结构域的靶抗原特异性。优选地可用于本发明的抗体单一可变结构域选自VHH、VH和VL，包括Vκ和Vλ。
以多种方式制备单一免疫球蛋白可变结构域。对于这些方法的每一种来说，制备(例如，扩增、突变等)和操作核酸序列的公知方法都是可用的。
一种方式是扩增和表达已知结合期望的抗原的克隆抗体的重链或轻链基因的VH或VL区。VH和VL结构域的边界由Kabat等(1991，同上)给出。将关于重链和轻链基因的VH和VL结构域边界的信息用来设计PCR引物，其由编码已知结合给定抗原的抗体的克隆重链或轻链编码序列而扩增V结构域。将扩增的V结构域插入合适的表达载体，例如，pHEN-1(Hoogenboom et al.，1991，Nucleic Acids Res.19：4133-4137)并单独或作为与另一种多肽序列的融合而表达。随后在与剩余的重或轻链多肽相分离的情况下，对表达的VH或VL结构域筛选结合期望抗原的高亲和力。对于本发明的所有方面来说，对结合的筛选都如本领域已知的或如下文所述的来实施。
通过，例如，针对期望抗原的噬菌体展示来筛选VH或VL结构域的库。构建噬菌体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法是本领域公知的，并且由，例如：
McCafferty et al.，1990，Nature 348：552；Kang et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson et al.，1991，Nature 352：624；Lowman et al.，1991，Biochemistry 30：10832；Burton et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.88：10134；Hoogenboom et al.，1991，Nucleic Acids Res.19：4133；Chang et al.，1991，J.Immunol.147：3610；Breitliug etal.，1991，Gene 104：147；Marks et al.，1991，J.Mol.Biol.222：581；Barbas et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.89：4457；Hawkins and Winter(1992)J.Immunol.，22：867；Marks etal.(1992)J.Biol.Chem.，267：16007；and Lerner et al.(1992)Science，258：1313所教示。scFv噬菌体文库由，例如：
Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.85：5879-5883；Chaudhary et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.87：1066-1070；McCafferty et al.，1990，supra；Clackson et al.，1991，supra；Marks et al.，1991，supra；Chiswell et al.，1992，Trends Biotech.10：80；and Marks et al.，1992，supra.
所教示。已经描述过多种在噬菌体外壳蛋白上展示的scFv文库的实施方案。噬菌体展示技术的改进也是已知的，例如在W096/06213和W092/01047(Medical Research Council et al.)以及W097/08320(Morphosys，同上)中所述的。
VH或VL结构域的库可以是免疫球蛋白序列的天然发生的库或合成的库。天然发生的库是由例如获自一种或多种动物，包括人的表达免疫球蛋白的细胞制备的库。这种库可以是″幼稚的(naive)″，即，例如，由人胎儿或新生儿表达免疫球蛋白的细胞制备的，或重排的，即，例如，由成人B细胞制备的。天然库由，例如，Marks et al.，1991，J.Mol.Biol.222：581和Vaughan et al.，1996，Nature Biotech.14：309所描述。如果需要，随后将鉴定自天然库或任何其它相关(for thatmatter)库的结合靶抗原的克隆进行突变并进一步筛选以产生并选择具有增强的结合特性的变异体。
通过向克隆的V结构域中人工导入多样性来制备单一免疫球蛋白可变结构域的合成性库。合成性库由，例如，
Hoogenboom&Winter，1992，J.Mol.Biol.227：381；Barbas et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4457；Nissim et al.，1994，EMBO J.13：692；Griffiths et al.，1994，EMBO J.13：3245；DeKriuf et al.，1995，J.Mol.Biol.248：97；and WO 99/20749.所描述。
传统抗体的抗原结合结构域包含两个分离的区域：重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL：其可以是Vκ或Vλ)。这种抗体的抗原结合位点由六个多肽环形成：三个来自VH结构域(H1，H2和H3)，三个来自VL结构域(L1，L2和L3)。这些环的边界在，例如Kabat等(1991，同上)中进行描述。编码VH和VL结构域的V基因的各种主要库是由基因片段的组合重排在体内产生的。VH基因是由三种基因片段VH，D和JH的重组产生的。在人类中，根据单倍型，大约有51种功能性VH片段(Cook和Tomlinson(1995)Immunol Today16：237)，25种功能性D片段(Corbett et al.(1997)J.Mol.Biol.268：69)和6种功能性JH片段(Ravetch et al.(1981)Cell 27：583)。VH片段编码形成VH结构域的第一和第二抗原结合环(H1和H2)的多肽链的区域，而VH，D和JH片段联合形成VH结构域的第三抗原结合环(H3)。
仅通过两种基因片段，VL和JL的重组产生VL基因。在人中，根据单倍型，大约有40个功能性Vκ片段(和Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler 374：1001)，31个功能性Vλ片段(Williamset al.(1996)J.Mol.Biol.264：220；Kawasaki et al.(1997)Genome Res.7：250)，5个功能性Jκ片段(Hieter et al.(1982)J.Biol.Chem.257：1516)和4个功能性Jλ片段(Vasicek和Leder(1990)J.Exp.Med.172：609)。VL片段编码形成VL结构域的第一和第二抗原结合环(L1和L2)的多肽链区域，而VL和JL片段联合形成VL结构域的第三抗原结合环(L3)。据信选自这一原始库的抗体足够多样从而以至少中等的亲和力结合几乎全部抗原。高亲和力抗体在体内通过重排基因的″亲和力成熟″而产生，其中点突变在提高的结合的基础上通过免疫系统而产生和选择。
抗体结构和序列的分析显示六种抗原结合环的五种(H1，H2，LI，L2，L3)具有有限数目的主链构象或标准结构(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901；Chothia et al.(1989)Nature 342：877)。所述主链构象由(i)抗原结合环的长度，和(ii)抗原结合环和抗体框架中的某一关键位置上的特定残基，或残基类型来决定。环长度和关键残基的分析使得能够预测由大多数人抗体序列编码的H1，H2，LI，L2和L3的主链构象(Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.227：799；Tomlinsonet al.(1995)EMBO J.14：4628；Williams et al.(1996)J.Mol.Biol.264：220)。尽管H3区在序列、长度和结构方面的多样性要多得多(归因于D片段的使用)，它对于短环长度也形成有限数目的主链构象，这依赖于在环和抗体框架中的关键位置上的特定残基的存在，或残基类型(Martin et al.(1996)J.Mol.Biol.263：800；Shirai et al.(1996)FEBS Letters399：1)。
尽管根据本发明的一个实施方案，可以将多样性在各种抗原结合环的CDRs中的任何位点上添加到合成性库中，这种方法导致更大比例的未正确折叠的V结构域并且因此促成更低比例的具有结合抗原潜力的分子。对抗原结合环的主链构象有贡献的残基的理解允许鉴定特定残基以在VH或VL结构域的合成性库中多样化。即，多样性最好导入在对于维持主链构象非必需的残基中。作为一个例子，对于环L2的多样化，传统的方法将把在如Kabat等(1991，同上)所定义的相应CDR(CDR2)中的全部残基，某七个残基多样化。然而，对于L2，已知位置50和53在天然发生的抗体中是多样化的并且被观察到与抗原相接触。优选的方法是只将此环中的那两个残基多样化。这代表了有关功能多样性的显著改进，所述功能多样性是产生一组抗原结合特异性所必需的。
在一方面，于VH或Vκ背景中，基于人工多样化的种系VH或Vκ序列来制备合成性可变结构域库。例如，VH结构域库基于克隆的种系VH基因片段V3-23/DP47(Tomlinson et al.，1992，J.Mol.Biol.227：7768)和JH4b。Vκ结构域库基于，例如，种系Vκ基因片段O2/O12/DPK9(Cox et al.，1994，Eur.J.Immunol.24：827)和Jκl。例如通过PCR诱变将多样性引入这些或其它的基因片段中。可以例如通过致错PCR(error-prone PCR)(Hawkins，et al.，1992，J.Mol.Biol.226：889)或化学诱变随机引入多样性。但是，如以上所讨论的，优选多样性的引入靶向于特定残基。进一步优选通过利用诱变引物导入密码子NNK(利用IUPAC命名法，其中N＝G，A，T或C，K＝G或T)来靶向所期望的残基，所述密码子编码全部氨基酸和TAG终止密码子。还可以使用其它获得相似结果的密码子，包括NNN密码子(其导致产生额外的终止密码子TGA和TAA)，DVT密码子((A/G/T)(A/G/C)T)，DVC密码子((A/G/T)(A/G/C)C)，和DVY密码子((A/G/T)(A/G/C)(C/T)。所述DVT密码子编码22％的丝氨酸，和11％的酪氨酸，天冬酰胺，甘氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，苏氨酸和半胱氨酸，这最近似于天然人抗体的抗原结合位点的氨基酸残基分布。利用在每个有待多样化的位点上具有经选择的简并密码子的PCR引物来制备库。PCR诱变是本领域所公知的；不过，在下面标题为″PCR诱变″的小节中讨论了对于可用于本发明方法的引物设计和PCR诱变的考虑。
如本领域已知的并且如在，例如WO 99/20749中所描述的将多样化的库克隆入噬菌体展示载体中。通常，实施本发明所需要的核酸分子和载体构建体是本领域现有的并且如标准实验手册，例如Sambrooket al.(1989).Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，USA中所述的进行构建和操作。
本发明中核酸的操作一般在重组载体中进行。如本文所用的，″载体″指用来将异源DNA导入细胞进行表达和/或其复制的分离的元件。选择或构建以及随后使用这些载体的方法是本领域技术人员所公知的。很多载体是公众可以获得的，包括细菌质粒、噬菌体、人工染色体和附加型载体。这些载体可以用于简单的克隆和诱变；或者，作为其中携带本发明库(或pre-repertoire)成员的载体所典型具有的特征，使用基因表达载体。选择根据本发明使用的载体以容纳所需大小的多肽编码序列，一般长0.25千碱基(kb)至40kb。在体外克隆操作后用载体转化合适的宿主细胞。每个载体都包含多种功能性组分，其一般包括克隆(或″多接头″)位点，复制起点和至少一个可选择的标记基因。如果一种给定的载体是表达载体，它另外具有下列的一种或多种：增强子元件、启动子、转录终止和信号序列，每个都位于克隆位点附近，从而使它们能够可操作地连接到根据本发明的编码多肽库成员的基因上。
克隆和表达载体一般都包含能够使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。一般在克隆载体中，这种序列是能够使载体独立于宿主染色体DNA进行复制的序列并且包括复制起点或自主复制序列。对于多种细菌、酵母和病毒来说，这些序列是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌，2micron质粒起点适于酵母，而多种病毒起点(例如SV40，腺病毒)可用于在哺乳动物细胞中的克隆载体。一般，复制起点并不是哺乳动物表达载体所需的，除非这些被用于能够复制高水平DNA的哺乳动物细胞中，如COS细胞。
有利地，克隆或表达载体还包含选择基因，也称作可选择的标记。这种基因编码生长在选择性培养基中的转化宿主细胞的存活和生长所必需的蛋白质。所以未用包含所述选择基因的载体转化的宿主细胞将不在培养基中存活。典型的选择基因编码赋予抗生素和其它毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素的耐受性，补充营养缺陷，或提供生长培养基中没有的关键营养物质的蛋白质。
因为根据本发明的载体的复制在大肠杆菌(E.coli)中最方便进行，所以可以使用大肠杆菌可选择标记，例如，赋予抗生素氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶。这些可以获自大肠杆菌质粒，如pBR322或pUC质粒如pUC18或pUC19。
表达载体通常包含被宿主生物识别并且可操作地连接于目标编码序列上的启动子。这种启动子可以是诱导型的或组成型的。术语″可操作地连接″指一种毗连，其中所述的组分处于这样一种关系，即使得它们以它们计划中的方式起作用。以这样一种方式连接″可操作地连接″到编码序列上的控制序列，使得在与所述控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
适用于原核宿主的启动子包括，例如，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂交启动子如tac启动子。一般用于细菌系统的启动子还将包含可操作地连接于编码序列上的Shine-Dalgarno序列。
在本文所述的文库或库中，优选的载体是能够表达相应于多肽文库成员的核苷酸序列的表达载体。因而，通过表达多肽文库成员的单个克隆的单独增殖和表达或者通过使用任何选择展示系统进行选择。如上所述，优选的选择展示系统使用噬菌体展示。因而，可以使用噬菌体或噬菌粒载体。优选的载体是具有大肠杆菌复制起点(进行双链复制)并且还具有噬菌体复制起点(进行单链DNA的生产)的噬菌粒载体。这些载体的操作和表达是本领域公知的(Hoogenboom andWinter(1992)同上，Nissim et aL.(1994)同上)。简言之，所述载体包含β-内酰胺酶或其它可选择的标记基因以赋予噬菌粒选择性，以及由引导序列(将表达的多肽指引到周质空间中)，多克隆位点(克隆文库成员的核苷酸版本)，任选地，一个或多个肽标签(用于检测)，任选地，一个或多个TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII组成(N至C末端)的表达盒上游的lac启动子。可用于细菌表达和/或噬菌体或噬菌粒展示中的引导序列，包括pelB，stII，ompA，phoA，bla和pelA。利用各种大肠杆菌的抑制性或非抑制性菌株并加入葡萄糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体，如VCS M13，所述载体能够作为无表达的质粒进行复制，只产生大量的多肽文库成员，或产生噬菌体，其中一些在其表面包含至少一个拷贝的多肽-pIII融合体。
优选的载体的一个例子是pHEN1噬菌粒载体(Hoogenboom etal.，1991，Nucl.Acids Res.19：4133-4137；序列是现有的，例如，为WO 03/031611中的SEQ ID NO：7)，其中pIII融合蛋白的生产是在LacZ启动子的控制之下的，它在存在葡萄糖的情况下受到抑制并由IPTG进行诱导。当生长于B.coli抑制性菌株(suppressor strains)例如，TG1中时，基因III融合蛋白被生产并包装入噬菌体中，而在非抑制性菌株，例如HB2151中的生长则允许可溶性融合蛋白分泌入周质中并分泌入培养基中。因为基因III的表达预防随后辅助噬菌体的感染，在VCSM13辅助噬菌体感染以进行噬菌体援救前，具有噬菌粒载体的细菌在存在葡萄糖的情况下得到增殖。
根据本发明的载体的构建采用传统的连接技术。将分离的载体或DNA片段进行剪切、修改，并以所需的形式进行重新连接以生成所需的载体。如果需要，利用标准方法进行序列分析以确认正确的序列存在于所构建的载体中。用来构建表达载体、制备体外转录物、将DNA导入宿主细胞中和进行分析以评估表达和功能的适当方法是本领域技术人员已知的。通过传统方法，如DNA印迹或RNA印迹分析，蛋白质印迹，DNA、RNA或蛋白质的斑点印迹，原位杂交，免疫细胞化学或核酸或蛋白质分子的序列分析来检测样品中基因序列的存在，或对其扩增和/或表达进行量化。如果需要，本领域技术人员会轻易地想到可以如何将这些方法进行改进。
用于构建抗体单一可变结构域的构架(scaffolds)
i.主链构象的选择
免疫球蛋白超家族的成员对于其多肽链全都共有相似的折叠。例如，尽管抗体对于其一级序列是高度多样化的，但序列和结晶学结构的比较显示，与预期相反，抗体的六种抗原结合环中的五种(H1，H2，L1，L2，L3)采用有限数目的主链构象，或标准结构(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196：901；Chothia et al.(1989)Nature，342：877)。因此环长度和关键残基的分析使得能够预测在大多数人抗体中发现的H1，H2，LI，L2和L3的主链构象(Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.227：799；Tomlinson et al.(1995)EMBO J.14：4628；Williams et al.(1996)J.Mol.Biol.264：220)。尽管H3区在序列、长度和结构方面的多样性要多得多(归因于D片段的使用)，它对于短环长度也形成有限数目的主链构象，这依赖于长度以及在环和抗体框架中的关键位置上特定残基，或残基类型的存在(Martin et al.(1996)J.Mol.Biol.263：800；Shirai et al.(1996)FEBS Letters399：1)。
本发明的PEG连接的抗体单一可变结构域单体和多聚体被有利地由结构域的文库进行装配，如VH结构域的文库和/或VL结构域的文库。而且，本发明的PEG连接的dAbs自身可以以文库的形式提供。在本发明的一个方面，抗体单一可变结构域的文库被设计为其中某些环长度和关键残基被选择来确保成员的主链构象是已知的。有利地，这些是自然中发现的免疫球蛋白超家族分子的真实构象，以便使得它们是如上所讨论的非功能性的机会最小化。种系V基因片段作为一种合适的用于构建抗体或T细胞受体文库的基础框架(frame work)而起作用；也可以使用其它的序列。变异可以以低频率发生，从而使得少数的功能性成员可以具有改变的主链构象，而并不影响其功能。
标准结构(canonical structure)理论也可以用于评估由配体编码的不同主链构象的数目，以预测基于配体序列的主链构象并且选择不影响标准结构的进行多样化的残基。已知在人Vκ结构域中，L1环能够采用四种标准结构中的一种，L2环具有单一的标准结构，而且90％的人Vκ结构域采用L3环的四或五种标准结构中的一种(Tomlinson et al.(1995)同上)；因而，在单独的Vκ结构域中，不同的标准结构可以联合产生一组不同的主链构象。假如Vλ结构域编码不同组的L1、L2和L3环的标准结构并且Vκ和Vλ结构域能够与任何编码H1和H2环的几种标准结构的VH结构域进行配对，则对于这五种环观察到的标准结构组合的数目是非常大的。这提示主链构象的多样性的生成可能是产生广泛的结合特异性所必需的。不过，通过基于单个已知的主链构象构建抗体文库已经发现，与预期相反，主链构象的多样性并不是生成足够的多样性以基本上靶向全部抗原所需要的。甚至更令人惊奇的是，单一的主链构象不一定是共有结构-单个天然发生的构象可以用作整个文库的基础。因而，在一个方面，本发明的聚合物连接的抗体单一可变结构域具有单一的已知主链构象。
所选择的单一的主链构象优选是研究中的免疫球蛋白超家族类型的分子之间的常见构象。当相当大数目的天然发生的分子被观察到采用一种构象时，则它是常见构象。因此，在本发明的一个优选的方面，免疫球蛋白结构域每个结合环的不同主链构象的天然发生被独立地考虑并且随后选择一种天然发生的可变结构域，其具有不同环的主链构象的所需组合。如果没有可用的，可以选择最接近的等同物。优选通过选择编码所需主链构象的种系基因片段来生成不同环的主链构象的所需组合。更优选所选择的种系基因片段在自然中经常表达，并且最优选它们在所有天然种系基因片段中是最经常表达的。
在设计抗体单一可变结构域或其文库中可以独立地考虑六种抗原结合环的每一种的不同主链构象的发生率。对于H1，H2，LI，L2和L3，选择被20％到100％之间的天然发生分子的抗原结合环所采用的给定构象。一般，其观察到的发生率高于35％(即在35％和100％之间)，并且理想地，高于50％或甚至高于65％。由于绝大多数的H3环并不具有标准结构，优选选择一种主链构象，其是在那些环之间的常见构象，所述环确实展示标准结构。对于每种环来说，因此选择在天然库中最常观察到的构象。在人抗体中，每种环最常见的标准结构(CS)如下：H1-CS1(79％的表达的库)，H2-CS3(46％)，Vκ的L1-CS2(39％)，L2-CS 1(100％)，Vκ的L3-CS 1(36％)(计算假定κ∶λ比率为70∶30，Hood et al.(1967)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，48：133)。对于具有标准结构的H3环来说，具有从残基94到残基101的盐桥的七个残基的CDR3长度(Kabat et al.(1991)Sequencesof proteins of immunological interest，U.S.Department of Health andHuman Services)似乎是最常见的。在EMBL数据库中至少有16种人抗体序列具有所需的H3长度和关键残基以形成这种构象并且在蛋白质数据库中至少有两种标准结构，其可以用作抗体建模的基础(2cgr和ltet)。最经常表达的种系基因片段，标准结构的这种组合是VH片段3-23(DP-47)，JH片段JH4b，Vκ片段O2/O12(DPK9)和Jκ片段Jκ1。VH片段DP45和DP38也是合适的。所以这些片段可以组合使用，作为构建具有所需单一主链构象的文库的基础。
或者，将主链构象的组合的天然发生用作选择单一主链构象的基础，而不是基于分离的每个结合环的不同主链构象的天然发生来选择单一主链构象。对于抗体而言，例如，可以测定任何两个、三个、四个、五个或全部六个抗原结合环的标准结构组合的天然发生。这里，优选所选择的构象是天然发生的抗体中常见的构象，最优选它是在天然库中最常观察到的。因而，在人抗体中，例如，当考虑五种抗原结合环，H1，H2，L1，L2和L3的天然组合时，确定最经常的标准结构组合并且随后与最常见的H3环构象组合，作为选择单一的主链构象的基础。
标准序列的多样化
选择了几种已知的主链构象，或优选一种单一的已知的主链构象之后，可以通过变化分子的结合位点来构建根据本发明的抗体单一可变结构域或用于本发明的文库，从而生成具有结构和/或功能多样性的库。这意即生成变异体，从而使它们在其结构和/或其功能上具有足够的多样性以便使它们能够提供多种活性。
一般通过在一个或多个位置上变化选择的分子来生成所需的活性。改变的位置可以随机选择或优选地进行选择。随后，可以通过随机化作用，其间所存在的氨基酸被任何天然的或合成的氨基酸或其类似物所替代，产生极大量的变异体，或通过用一种或多种限定的氨基酸亚组替代所存在的氨基酸，产生有限数目的变异体，来获得变异。
已经报道过多种方法引入这种多样性。致错PCR(Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.，226：889)，化学诱变(Deng et al.(1994)J.Biol.Chem.，269：9533)或细菌增变菌株(Low et al.(1996)J Mol.Biol.，260：359)可以被用来将随机突变引入编码分子的基因中。将选定位置突变的方法也是本领域公知的并且包括使用错配寡核苷酸或简并寡核苷酸，使用或不使用PCR。例如，通过将突变靶向抗原结合环已经生成了几种合成的抗体文库。已将人破伤风类毒素结合Fab的H3区随机化以生成多种新的结合特异性(Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457)。已将随机或半随机的H3和L3区添加到种系V基因片段上以产生具有未突变框架区的大文库(Hoogenboom&Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381；Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457；Nissim et al.(1994)EMBOJ.，13：692；Griffiths etal.(1994)EMBO J，13：3245；De Kruif et al.(1995)J.Mol.Biol.，248：97)。已经将这种多样化作用拓展为包括一些或全部的其它抗原结合环(Crameri et al.(1996)Nature Med.，2：100；Riechmann etal.(1995)Bio/Technology，13：475；Morphosys，W097/08320，同上)。
由于环随机化作用具有对于H3单独生成大于大约1015种结构和对于其它五种环生成类似大量的变异体的潜力，所以利用目前的转化技术或甚至通过利用无细胞系统生产代表全部可能组合的文库是不可行的。例如，在到目前为止所构建的最大文库之一中，生成了6x1010种不同的抗体，这只是这一设计的文库的潜在多样性的一部分。(Griffithset al.(1994)同上)。
在一个优选的实施方案中，只有那些直接涉及产生或改进分子的所需功能的残基被多样化。对于许多分子而言，功能是结合一种靶，所以多样性应当集中于靶结合位点上，同时避免改变对于分子的整体包装或保持选定的主链构象关键的残基。
当标准序列应用到抗体结构域时它的多样化
对于抗体单一可变结构域来说，对于靶的结合位点最经常是抗原结合位点。因而，在高度优选的实施方案中，本发明提供抗体单一可变结构域文库或其装配体的文库，其中只有在抗原结合位点中的那些残基被改变。这些残基在人抗体库中极端多样化并且已知在高分辨率抗体/抗原复合物中进行接触。例如，在L2中已知位置50和53在天然发生的抗体中多样化并且被观察到与抗原相接触。相反，传统的方法会将如Kabat等(1991，同上)定义的相应互补决定区(CDR1)中的所有残基多样化，某七个残基，与根据本发明使用的文库中两个被多样化的残基相比。这代表了有关产生一组抗原结合特异性所需的功能多样性的显著提高。
在自然中，抗体多样性是两种过程的结果：种系V，D和J基因的体细胞重组以产生幼稚的原始库(naive primary repertoire)(所谓的种系和连接多样性)，以及得到的重排V基因的体细胞高变。人抗体序列的分析已经显示原始库中的多样性集中于抗原结合位点的中心，而体细胞高变将多样性扩散到抗原结合位点的外周区，其在原始库中是高度保守的(见Tomlinson et al.(1996)J.Mol.Biol.，256：813)。这种互补性或许是作为搜索序列空间的有效策略而进化的，并且尽管对于抗体明显是特有的，它仍然可以容易地应用到其它多肽库中。变化的残基是形成靶结合位点的残基的一个亚组。如果需要，靶结合位点中不同(包括重叠的)亚组的残基在选择的不同阶段被多样化。
对于抗体库来说，当一些，但不是全部抗原结合位点中的残基被多样化时，起始的″幼稚(naive)″库得以产生。如本文所用的，术语″幼稚″指没有预定靶的抗体分子。这些分子类似于被一个未经历过免疫多样化作用的个体的免疫球蛋白基因所编码的分子，如胎儿和新生个体，它们的免疫系统尚未受到众多抗原性刺激的攻击(challenge)。随后相对于多种抗原或抗原表位选择这种库。如果需要，可以随后在起始库的多样化区之外导入另外的多样性。可以选择这种成熟的库实现改进的功能、特异性或亲和性。
在用于本发明的文库的构建中，选定位置的多样化作用一般是通过改变确定多肽序列的编码序列而在核酸水平上实现的，从而可以在该位置上并入多种可能的氨基酸(全部20种或其一部分)。利用IUPAC命名法，最多变(versatile)的密码子是NNK，它编码全部氨基酸以及TAG终止密码子。优选使用NNK密码子以便导入所需的多样性。也可以使用其它获得相同结果的密码子，包括NNN密码子，其导致产生额外的终止密码子TGA和TAA。
人抗体的抗原结合位点的侧链多样性的特征是显著的偏爱性，其偏爱某些氨基酸残基。如果总计每个VH，Vκ和Vλ区中十个最多样化的位置的氨基酸组成，超过76％的侧链多样性只来自七种不同的残基，这些是丝氨酸(24％)，酪氨酸(14％)，天冬酰胺(11％)，甘氨酸(9％)，丙氨酸(7％)，天冬氨酸(6％)和苏氨酸(6％)。这种对于可提供主链弹性的小残基和亲水性残基的偏爱性或许反映了倾向于结合广泛抗原或抗原表位的表面的进化，并且可以有助于解释在原始库中所需的抗体杂乱性(promiscuity)。
由于优选模仿氨基酸的这种分布，因此在待变化位置上的氨基酸分布优选模仿在抗体的抗原结合位点上见到的分布。这种允许相对于多种靶抗原选择某些多肽(不只是抗体多肽)的氨基酸取代的偏爱性容易被应用到任何多肽库上。有多种方法用于在待变化的位置上使氨基酸分布产生偏向(包括使用三核苷酸诱变法，见W097/08320)，其中由于合成的容易性，优选的方法是使用传统的简并密码子。通过将简并密码子所有组合(在每个位置上以相等的比率具有单重、两重、三重和四重简并性)所编码的氨基酸模式(profile)与所用的天然氨基酸相比有可能计算出最具代表性的密码子。密码子(AGT)(AGC)T，(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)-即，分别使用IUPAC命名法的DVT，DVC和DVY，是与所需氨基酸模式最接近的密码子：它们编码22％的丝氨酸和11％的酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。所以，优选地，在每个被多样化的位置上使用DVT，DVC或DVY密码子来构建文库。
PCR诱变：
引物与核酸分子集合体中的靶分子的一部分互补，所述核酸分子用于制备多组编码多肽库成员的核酸库成员。最经常地，通过化学或酶学的合成方法制备引物。诱变性寡核苷酸引物一般长15-100个核苷酸，理想地为20-40个核苷酸，尽管可以使用不同长度的寡核苷酸。
一般，当两种核酸序列基本上互补时(在至少14-25个核苷酸的长度上至少大约65％互补，优选地至少大约75％互补，更加优选地至少大约85％或90％互补)，发生选择性杂交。见Kanehisa，1984，NucleicAcids Res.12：203，并入本文作为参考。作为结果，预期容许在引物位点上某种程度的错配。这种错配可能是小的，如单-，双-或三-核苷酸。或者，它可能包含核苷酸环，其在本文被定义为这样的区域，其中错配包括未被中断的连续的四个或更多的核苷酸。
总之，五种因素影响引物与第二种核酸分子的杂交的效率和选择性。当设计非随机性引物序列时，这些因素，它们是(i)引物长度，(ii)核苷酸序列和/或组成，(iii)杂交温度，(iv)缓冲液化学成分和(v)在引物需要杂交的区域中的位阻的可能，是重要的考虑因素。
在引物长度与引物退火到靶序列上的效率和精确性之间有正相关；较长的序列比较短的序列具有更高的熔解温度(TM)，并且在给定的靶序列中更少可能地被重复，由此使得杂乱杂交最小化。具有高G-C含量或包含回文序列的引物趋向于自身杂交，与它们的预定靶序列一样因为单分子，而非双分子杂交动力学一般在溶液中有利；同时设计包含足够数目的G-C核苷酸配对的引物是重要的，以紧密结合靶序列，因为每个这种配对都被三个氢键所结合，而不是当A和T碱基配对时所发现的两个。杂交温度与引物退火效率相反地变化，就像可能包括在杂交混合物中的有机溶剂，例如甲酰胺的浓度一样，而盐浓度的提高促进结合。在严谨杂交条件下，较长的探针比较短的探针更有效地杂交，所述较短的探针在更加宽容的条件下是足够的。引物的严谨杂交条件一般包括小于大约1M的盐浓度，更经常小于大约500mM并且优选小于大约200mM。杂交温度从低至0℃到高于22℃，高于约30℃，和(最经常)超过大约37℃。较长的片段可能需要更高的杂交温度以便进行特异性杂交。由于几种因素影响杂交的严谨性，参数的组合比任何一个参数单独的绝对度量更重要。
考虑这些因素来设计引物。尽管本领域技术人员可以用脑筋评估许多种序列的相对优点，但已经设计了计算机程序辅助评估这几种参数以及优化引物序列。这些程序的例子为DNAStarTM软件包(DNAStar，Inc.9Madison，WI)的″PrimerSelect″以及OLIGO 4.0(National Biosciences，Inc.)。一旦设计好，就通过合适的方法，例如Beaucage和Carruthers，1981，Tetrahedron Lett.22：1859)所述的phosphoramidite法或根据Matteucci和Caruthers，1981，J.Am.Chem.Soc.103：3185的三酯法制备合适的寡核苷酸，两篇文献均并入本文作为参考，或通过利用商业自动寡核苷酸合成仪或，例如VLSIPSTM技术的其它化学方法进行制备。
使用模板DNA(至少1fg；更经常地，1-1000ng)和至少25pmol的寡核苷酸引物进行PCR；当引物集合体严重不均一时使用大量引物可能是有益的，因为每个序列只被集合体的一小部分分子所代表，并且在后面的扩增循环中量变得具有限制性。典型的反应混合物包括：2μl的DNA，25pmol的寡核苷酸引物，2.5μl的10X PCR缓冲液1(Perkin-Elmer)，0.4μl的1.25μM dNTP，0.15μl(或2.5单位)的TaqDNA聚合酶(Perkin Elmer)和去离子水至总体积25μl。覆盖矿物油并利用可设定程序的热循环仪进行PCR。
根据有效的严谨性需要来调整PCR循环每个步骤的长度和温度，以及循环数。退火温度和时间由希望引物退火到模板上的效率以及容许的错配程度所决定；显而易见，当核酸分子同时进行扩增和诱变时，错配是必需的，至少在合成的第一轮。在利用诱变引物混合集合体尝试扩增一组分子时，在严谨(高温)退火条件下潜在突变产物的损失的重要性超过了引物向目标位点以外的序列杂乱退火，所述潜在突变产物只能产生于低熔解温度。优化引物退火条件的严谨性的能力在本领域技术人员的知识范围之内。使用在30℃和72℃之间的退火温度。模板分子的起始变性一般发生在92℃和99℃4分钟，随后是20-40个由下列步骤组成的循环：变性(94-99℃15秒到1分钟)，退火(如上面所讨论的那样确定温度；1-2分钟)，和延伸(72℃1-5分钟，根据扩增产物的长度)。最后的延伸通常在72℃4分钟，可以后跟一个4℃不确定的(0-24小时)步骤。
筛选单一免疫球蛋白可变结构域的抗原结合：
单一免疫球蛋白可变结构域库在噬菌体表面表达之后，通过将噬菌体库与固定的靶抗原接触，洗去未结合的噬菌体以及增殖结合的噬菌体来进行选择，整个过程称作″淘洗(panning)″。或者，通过相对于固定的只被折叠成员结合的一般配体(例如，蛋白A或蛋白L)进行淘洗来预选噬菌体的正确折叠的成员变异体的表达。这具有减少非功能性成员的比例的优点，由此提高了可能结合靶抗原的成员比例。在WO 99/20749中教示了用一般性配体进行预选。噬菌体抗体文库的筛选被，例如Harrison等，1996，Meth.Enzymol.267：83-109进行了一般性描述。
筛选一般利用固定在固体支持物，例如塑料管或孔上，或层析基质，例如SepharoseTM(Pharmacia)上的纯化抗原来实施。筛选或选择还可以在复合抗原上进行，如细胞的表面(Marks et al.，1993，BioTechnology 11：1145；de Kruifet al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：3938)。另一种方式包括通过结合溶液中生物素标记的抗原，随后捕获在链霉抗生物素涂布的珠上而进行的选择。
在一个优选的方面，通过将抗原(一般的或特异性的)固定在试管或板中的孔上，例如Nunc MAXISORPTM免疫管8孔板来实施淘洗。以150μl的抗原(PBS中100μg/ml)涂布孔并温育过夜。随后用PBS将孔洗涤3次并用400μl PBS-2％脱脂牛奶(2％MPBS)于37℃封闭2小时。用PBS将孔漂洗3次并加入2％MPBS中的噬菌体。将混合物在室温温育90分钟并去除含有未结合噬菌体的液体。用PBS-0.1％tween 20将孔漂洗10次，随后用PBS漂洗10次以去除去污剂。通过加入200μl新鲜制备的100mM三乙胺，充分混合并于室温温育10分钟来洗脱结合的噬菌体。将洗脱的噬菌体转移到含有100μl1MTris-HCl，pH 7.4的试管中并进行涡旋振荡以中和三乙胺。通过于37℃温育30分钟，用例如150ml洗脱的噬菌体感染指数生长的大肠杆菌(E.coli)宿主细胞(例如，TG1)。将感染的细胞离心下来，重悬于新鲜培养基中并铺在上层琼脂糖中。洗脱噬菌体斑或挑入宿主细胞的新鲜培养物中以便增殖进行分析或进行另外轮次的选择。如果必要进行一轮或多轮的噬菌斑纯化以确保所选噬菌体的纯种群。Harrison等，1996，同上对其它的筛选方法进行了描述。
在鉴定了表达结合所期望的靶的单一免疫球蛋白可变结构域的噬菌体之后，如果使用了噬菌粒载体如pHENI，容易通过感染允许分泌可溶性基因III融合蛋白的非抑制性细菌菌株，例如HB2151来以可溶形式生产可变结构域融合蛋白。或者，能够根据本领域已知的方法将V结构域序列亚克隆入合适的表达载体中以生产可溶性蛋白。
单一免疫球蛋白可变结构域的纯化和浓缩：
根据已知的方法对分泌入周质空间或分泌入细菌培养基中的单一免疫球蛋白可变结构域多肽进行收集和纯化(Harrison等，1996，同上)。Skerra&Pluckthun(1988，Science 240：1038)和Breitling等(1991，Gene 104：147)描述了从周质中收集抗体多肽，而Better等(1988，Science 240：1041)描述了从培养物上清液中收集。还可以通过结合一般性配体，如蛋白A或蛋白L来实现纯化。或者，可以将可变结构域表达为具有肽标签，例如Myc，HA或6X-His标签，其有助于通过亲和层析的纯化。
通过几种本领域公知的方法对多肽进行浓缩，包括，例如，超滤、渗滤和切向流动过滤。超滤的方法在大小和形状的基础上利用半透膜和压力分离分子物。压力通过气体压力或通过离心作用提供。商业性的超滤产品非常多，例如，来自Millipore(Bedford，MA；例子包括CentriconTM和MicroconTM浓缩器)和Vivascience(Hannover，Germany；例子包括VivaspinTM浓缩器)。通过选择小于靶多肽的分子量截止(通常1/3到1/6靶多肽的分子量，尽管能够成功地利用小至10kD的差异)，当溶剂和更小的溶质穿过膜时多肽得以保留。因而，大约5kD的分子量截止可用于本文所述的单一免疫球蛋白可变结构域多肽的浓缩。
当希望去除或交换多肽制品中的盐或缓冲液时，利用带有″洗涤″过程的使用超滤膜的渗滤。通过将溶剂和小的溶质穿过膜，多肽得以被浓缩，根据需要，通过用新缓冲液或盐溶液或水对保留的多肽进行稀释，伴随着持续超滤来去除剩余的盐或缓冲液。在持续的渗滤中，以滤液穿过膜的相同速率加入新缓冲液。在渗滤起始之前渗滤体积是多肽溶液的体积-利用持续的渗滤，通过用新缓冲液洗过六倍渗滤体积可以去除大于99.5％的完全可渗透溶质。或者，该过程能够以不连续的方式进行，其中样品被反复稀释并且随后过滤回其原始体积以去除或交换盐或缓冲液并且最终将多肽浓缩。渗滤的设备及其使用的详细方法是现有的，例如，来自Pall Life Sciences(Ann Arbor，MI)和Sartorius AG/Vivascience(Hannover，Germany)。
切向流动过滤(TFF)，也叫作″交叉流过滤″，也使用超滤膜。将含有靶多肽的流体沿着膜的表面切向泵注。压力引起一部分流体穿过膜同时靶多肽保留在过滤器之上。不过与标准的超滤相反，留下的分子并不积聚在膜的表面上，而是被切向流体携带走。可以将没有穿过过滤器的溶液(含有靶多肽)反复循环穿过膜以达到所需的浓缩程度。TFF的设备及其使用的详细方法是现有的，例如，来自Millipore(例如，ProFlux M12TM Benchtop TFF系统和PelliconTM系统)，PallLife Sciences(例如，Minim Tangential Flow Filtration系统)。
以多种本领域公知的方式测量蛋白质浓度。这些包括，例如，氨基酸分析、于280nm上的吸光度、″Bradford″和″Lowry″法，以及SDS-PAGE。最精确的方法是完全水解，随后通过HPLC进行氨基酸分析，然后通过与单一免疫球蛋白可变结构域多肽的已知序列比较来确定浓度。尽管这种方法是最精确的，但它昂贵且费时。通过测量280nm上的UV吸光度进行的蛋白质测定更快且便宜得多，然而是相对精确的，优选作为对氨基酸分析的折衷方案。利用280nm上的吸光度确定本文所述实施例中报告的蛋白质浓度。
″Bradford″和″Lowry″蛋白质分析(Bradford，1976，Anal.Biochem.72：248-254；Lowry et al.，1951，J.Biol.Chem.193：265-275)将样品蛋白质浓度与最经常基于牛血清白蛋白(BSA)的标准曲线相比。这些方法较不精确，趋向于低估单一免疫球蛋白可变结构域的浓度。然而它们的精确性可以通过利用VH或Vκ单一结构域多肽作为标准而得以提高。
另一种蛋白质分析方法是美国专利号4,839,295(并入本文作为参考)所述的bicinchoninic酸分析，被Pierce Biotechnology(Rockford，IL)上市售卖为″BCA Protein Assay″(例如，Pierce Catalog No.23227)。
SDS-PAGE法使用凝胶电泳和与已知浓度的标准，例如，已知量的单一免疫球蛋白可变结构域多肽进行比较的考马斯兰染色。通过目测或通过密度测定法可以进行量化。
本文所述的单一人免疫球蛋白可变结构域抗原结合多肽保留了高浓度时的溶解性(例如，在水性溶液(例如，PBS)中至少4.8mg(～400μM)，优选至少5mg/ml(～417μM)，10mg/ml(～833μM)，20mg/ml(～1.7mM)，25mg/ml(～2.1mM)，30mg/ml(～2.5mM)，35mg/ml(～2.9mM)，40mg/ml(～3.3mM)，45mg/ml(～3.75mM)，50mg/ml(～4.2mM)，55mg/ml(～4.6mM)，60mg/ml(～5.0mM)，65mg/ml(～5.4mM)，70mg/ml(～5.8mM)，75mg/ml(～6.3mM)，100mg/ml(～8.33mM)，150mg/ml(～12.5mM)，200mg/ml(～16.7mM)，240mg/ml(～20mM)或更高)。促进高度溶解性的一个结构特征是单一免疫球蛋白可变结构域多肽的相对小的大小。全长的传统四链抗体，例如，IgG的大小大约是150kD。相反，全都具有包含4个框架(FW)区和3个CDRs的一般结构的单一免疫球蛋白可变结构域具有大约12kD的大小，或小于传统抗体的1/10大小。类似地，单一免疫球蛋白可变结构域大约是scFv分子(～26kD)大小的1/2，大约是Fab分子(～60kD)大小的1/5。优选本文所公开的含有单～免疫球蛋白可变结构域的结构的大小为100kD或更小，包括，例如大约90kD或更小，80kD或更小，70kD或更小，60kD或更小，50kD或更小，40kD或更小，30kD或更小，20kD或更小的结构，低至并且包括大约12kD，或分离的单一免疫球蛋白可变结构域。
多肽的溶解性主要由氨基酸侧链与周围溶剂的相互作用决定。疏水性侧链在多肽折叠时趋向于定位在内部，远离多肽的溶剂-相互作用表面。相反地，亲水性残基趋向于定位在多肽的溶剂-相互作用表面上。一般，具有允许分子折叠而将更多亲水性残基暴露于水性环境的一级结构的多肽比折叠而将较少的亲水性残基暴露于表面的多肽更加可溶。因而，疏水性和亲水性残基的排列与数目是溶解性的重要决定因素。其它决定多肽溶解性的参数包括溶剂pH，温度和离子强度。在普遍的实践中，通过向溶液中加入甘油(例如，～10％v/v)可以保持或提高多肽的溶解性。
如以上所讨论的，特定的氨基酸残基已经在人VH结构域的保守性残基中得到鉴定，所述残基在一般比人VH结构域更可溶的骆驼科物种的VH结构域中有所改变。这些包括，例如，Gly 44(在骆驼科动物中为Glu)，Leu 45(在骆驼科动物中为Arg)和Trp 47(在骆驼科动物中为Gly)。VH的氨基酸残基103也与溶解性有关，由Trp向Arg的突变趋向于赋予提高的VH溶解性。
在本发明的优选方面，单一免疫球蛋白可变结构域多肽是基于DP47种系VH基因片段或DPK9种系Vκ基因片段。因而，特别是当在本文所述的选定的结构位置上分化(diversified)时，这些种系基因片段能够产生高度可溶的特定结合性单一免疫球蛋白可变结构域多肽。特别地，优选不分化的四个框架区能够促成所得蛋白质的高溶解性。
预期与具有已知高溶解性的结构域高度同源的单一人免疫球蛋白可变结构域也趋向于高度可溶。因而，作为一种预测或认识给定的单一免疫球蛋白可变结构域将会具有本文所述的高度溶解性，可以将单一免疫球蛋白可变结构域多肽的序列与一种或多种具有已知溶解性的单一免疫球蛋白可变结构域多肽相比较。因而，当一种单一免疫球蛋白可变结构域多肽被鉴定为具有高度结合亲和性但具有未知的溶解性时，它的氨基酸序列与已知具有高度溶解性的一种或多种(优选为多种)人单一免疫球蛋白可变结构域多肽(例如，本文所述的dAb序列)的比较能够允许对其溶解性进行预测。尽管它不是一种绝对的预测，但是当与已知高度可溶的序列具有高度相似性，例如，90-95％或更大的相似性时，特别是当有关亲水性氨基酸残基，或可能暴露于溶剂界面上的残基具有高度相似性时，新鉴定的结合性多肽更有可能将会具有与已知高度可溶序列类似的溶解性。
还可以利用分子建模软件相对于已知溶解性的多肽的溶解性来预测多肽序列的溶解性。例如，相对于具有暴露于溶剂暴露表面上的疏水性更低或甚至是亲水性残基的已知溶解性的分子，预期在该位置上疏水性残基的取代或添加会降低多肽的相对溶解性。类似地，预期在这种位置上亲水性更强的残基的取代或添加会提高相对溶解性。即，相对于具有已知溶解性的单一免疫球蛋白可变结构域多肽结构，位于分子表面上的亲水性或疏水性残基净数目(或表面暴露残基的总体亲水或疏水性质)的变化能够预测单一免疫球蛋白可变结构域多肽的相对溶解性。
或者，联合这种预测，通过简单地将多肽浓缩可以确定单一免疫球蛋白可变结构域多肽溶解性的限制。
亲和性/活性测定：
如本文所述的分离的含有单一人免疫球蛋白可变结构域的多肽具有至少300nM或更小的亲和性(解离常数，Kd，＝Koff/Kon)，优选至少300nM-50pM，200nM-50pM，更加优选至少100nM-50pM，75nM-50pM，50nM-50pM，25nM-50pM，10nM-50pM，5nM-50pM，1nM-50pM，950pM-50pM，900pM-50pM，850pM-50pM，800pM-50pM，750pM-50pM，700pM-50pM，650pM-50pM，600pM-50pM，550pM-50pM，500pM-50pM，450pM-50pM，400pM-50pM，350pM-50pM，300pM-50pM，250pM-50pM，200pM-50pM，150pM-50pM，100pM-50pM，90pM-50pM，80pM-50pM，70pM-50pM，60pM-50pM，
或甚至低至50pM。
可变结构域多肽的抗原结合亲合性可以利用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor，Piscataway，N.J.)通过表面等离子共振(SPR)方便地进行测量。在此方法中，抗原以已知浓度偶联到Biocore芯片上，并导入可变结构域多肽。在可变结构域多肽和固定的抗原之间的特异性结合导致芯片基质上蛋白质浓度提高和SPR信号的变化。SPR信号的变化被记录为共振单位(RU)并相对于传感器记录(sensorgram)的Y轴上的时间而显示。基线信号利用单独通过芯片上的溶剂(例如，PBS)取得。基线信号与完成可变结构域多肽注射后的信号之间的净差异代表给定样品的结合值。为了测定off速率(Koff))、on速率(κon)和解离速率(Kd)常数，使用BIAcore动力学评估软件(例如，2.1版)。
高亲和性依赖于抗原表面和抗体或抗体片段的CDRs之间的互补性。互补性由靶的部分和CDR之间可能的分子相互作用的类型和强度所决定，例如，可能的离子相互作用、范德华引力、氢键或能够发生的其它相互作用。CDR3往往比CDRs1和2更有助于抗原结合相互作用，可能是因为其一般更大的大小，这为有利的表面相互作用提供了更多机会。(见，例如，Padlan et al.，1994，Mol.Immunol.31：169-217；Chothia&Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：904-917；和Chothia et al.，1985，J.Mol.Biol.186：651-663.)。高亲和性指示具有高度互补性的单一免疫球蛋白可变结构域/抗原配对，这与可变结构域和靶的结构直接相关。
利用允许抗原与多肽结构对接的分子建模软件可以突出赋予单一免疫球蛋白可变结构域多肽对于给定抗原高亲合性的结构。一般，已知亲和性的单一免疫球蛋白可变结构域的结构的计算机模型可以与已知结构的多肽或其它靶抗原的计算机模型对接以确定相互作用表面。给定了这种已知相互作用的相互作用表面的结构，随后就可以预测在可变结构域序列中保守性或较低保守性取代对于相互作用强度的影响，正面或负面，由此允许合理设计改进的结合性分子。
抗体单一可变结构域的多聚体形式：
在一方面，本文所述的单一免疫球蛋白可变结构域是多聚体化的，例如，异源或同源二聚体、异源或同源三聚体、异源或同源四聚体或更高级的异源或同源多聚体(例如，异源或同源五聚体以及高达八聚体)。多聚体化作用可以通过亲和力效应(avidity effect)提高抗原结合的强度，其中所述结合的强度与多个结合位点的结合亲和性之和有关。
通过单一免疫球蛋白可变结构域的表达制备异源和同源多聚体，所述单一免疫球蛋白可变结构域通过例如肽连接体进行融合，导致构型dAb-连接体-dAb或这种排列的更高多倍体。所述多聚体还可以连接到其它部分，例如，提高血清半寿期的多肽序列或另一种效应物部分，例如毒素或打靶部分(targeting moiety)，例如，PEG。任何连接体肽序列都可以用来生成异源和同源多聚体，例如本领域中会用到的连接体肽序列来生成scFv。一种普遍有用的连接体包含肽序列(Gly4Ser)n的重复，其中n＝1到大约10(例如，n＝1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)。例如，所述连接体可以是(Gly4Ser)3，(Gly4Ser)5，(Gly4Ser)7或另一种(Gly4Ser)序列的多倍体(multiple)。
作为将多聚体表达为由肽序列连接的单体的另一种选择，是翻译后通过例如二硫键或其它的化学键连接单体性单一免疫球蛋白可变结构域。例如，将游离的半胱氨酸工程化设计于，例如单体性多肽的C末端上，允许单体之间的二硫键。在这一方面或其它需要游离半胱氨酸的方面，通过将半胱氨酸密码子(TGT，TGC)包括入PCR引物中而引入半胱氨酸，所述引物邻近dAb序列最后的密码子(对于C末端半胱氨酸来说，引物中的序列事实上将会是反向互补体，即，ACA或GCA，因为它将掺入PCR引物的下游)并且在一个或多个终止密码子紧前面。如果需要，将连接体肽序列，例如(Gly4Ser)n置于dAb序列和游离的半胱氨酸之间。具有游离半胱氨酸的单体的表达导致了以大约1∶1混合物形成的单体和二聚体的混合物。利用凝胶层析，例如用盐梯度洗脱进行离子交换层析将二聚体与单体中分离开。
或者，利用工程化改造的游离半胱氨酸将单体通过巯基键偶联到多价化学连接体上，如三聚的顺丁烯二酰亚胺分子(例如，Tris[2-顺丁烯二酰亚胺基乙基]胺，TMEA)或二-顺丁烯二酰亚胺PEG分子(例如，可由Nektar(Shearwater)购得)。
在一个实施方案中，本发明的同源二聚体或异源二聚体包括分别在C末端氨基酸上共价附着于免疫球蛋白CH1结构域或Cκ结构域上的VH或VL结构域。因而异源或同源二聚体可以是Fab样的分子，其中抗原结合结构域包含分别在其C末端上共价连接于CH1和Cκ结构域上的缔合的VH和/或VL结构域。此外，或可选择地，可以在骆驼科物种上建模本发明的dAb多聚体，所述物种表达大比例的全功能、高特异性的缺少轻链序列的抗体。骆驼科动物重链抗体被发现为单一重链的同源二聚体，通过它们的恒定区二聚体化。这些骆驼科动物重链抗体的可变结构域称为VHH结构域，并且当作为VH链的片段分离时，保留以高度特异性结合抗原的能力((Hamers-Casterman et al.，1993，Nature 363：446-448；Gahroudi et al.，1997，FEBS Lett.414：521-526)。因而，可以利用本领域已知的以及上述的方法构建本发明的抗体单一可变结构域多聚体，以具有骆驼科动物重链抗体的VHH构象。
靶抗原
本文所述的抗体单一可变结构域多肽的靶抗原是与疾病或病症相关的人抗原。即，本文所述的靶抗原是治疗上相关的靶。″治疗上相关的靶″是当被单一免疫球蛋白可变结构域或其它结合靶抗原并作为该靶活性的拮抗剂或激动剂而起作用的抗体多肽结合时，对其中结合了靶的个体(优选哺乳动物，优选人)具有有益效果的靶。″有益效果″由疾病或病症的一种或多种临床征候改善了至少10％来表明，或者，当需要单一免疫球蛋白可变结构域多肽的预防用途时，由相对于未用所述单一免疫球蛋白可变结构域多肽制品治疗的个体，观察到所针对的疾病或病症的症状之前的时间增加了至少10％来表明。本文所述的单一免疫球蛋白可变结构域多肽的合适靶抗原的非限制性例子包括细胞因子、细胞因子受体、酶、酶辅因子或DNA结合蛋白。合适的细胞因子和生长因子包括但不限于：ApoE，Apo-SAA，BDNF，Cardiotrophin-1，EGF，EGF受体，ENA-78，Eotaxin，Eotaxin-2，Exodus-2，FGF-酸性，FGF-碱性，成纤维细胞生长因子-10，FLT3配体，Fractalkine(CX3C)，GDNF，G-CSF，GM-CSF，GF-β1，胰岛素，IFN-g，IGF-I，IGF-II，IL-lα，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8(72a.a.)，IL-8(77a.a.)，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18(IGIF)，Inhibinα，Inhibinβ，IP-10，角质细胞生长因子-2(KGF-2)，KGF，Leptin，LIF，Lymphotactin，Mullerian抑制性物质，单核细胞集落抑制因子，单核细胞引诱剂蛋白，M-CSF，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MCP-1(MCAF)，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MIG，MIP-lα，MIP-lβ，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，脊髓祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)，NAP-2，Neurturin，神经生长因子，β-NGF，NT-3，NT-4，Oncostatin M，PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，PF-4，RANTES，SDFlα，SDFlβ，SCF，SCGF，干细胞因子(SCF)，TARC，TACE识别位点，TGF-α，TGF-β，TGF-β2，TGF-β3，肿瘤坏死因子(TNF)，TNF-α，TNF-β，TNF受体I(p55)，TNF受体II，TNIL-1，TPO，VEGF，VEGF受体1，VEGF受体2，VEGF受体3，GCP-2，GRO/MGSA，GRO-β，GRO-γ，HCC1，1-309，HER1，HER2，HER3和HER4。细胞因子受体包括每种前述细胞因子的受体，例如，IL-1R，IL-6R，IL-1OR，IL-18R等。应当理解这一列举并不是穷举的。根据本发明的抗原单一可变结构域多肽的优选的靶公开于W004/041867中(将其全部内容并入本文)并且包括，但不限于TNFα，IgE，IFNγ，MMP-12，EGFR，CEA，H.pylori，TB，流感，PDK-1，GSK1，Bad，caspase，Forkhead和VonWillebrand因子(vWF)。靶还可以是以上靶的片段。因而靶还是能够诱发免疫反应的以上靶的片段。靶还是以上靶的片段，能够结合相对于全长靶而生成的抗体单一可变结构域多肽。
在一方面，单一免疫球蛋白可变结构域连接到另一个单一免疫球蛋白可变结构域上以形成同源二聚体或异源二聚体，其中每个单个结构域能够结合其同源(cognate)抗原。作为同源二聚体的融合性单一免疫球蛋白可变结构域能够例如，通过亲和力效应提高靶结合的效率。作为异源二聚体的融合性单一免疫球蛋白可变结构域，其中每个单体结合不同的靶抗原，可以产生例如，能够连接各个靶抗原的双特异性配体。这种双特异性配体可以用来靶向细胞因子和其它在生物体中于治疗性环境下协同作用的分子。因而，提供了协同两种或多种细胞因子活性的方法，包括施用能够结合两种或多种细胞因子的双特异性单一免疫球蛋白可变结构域异源二聚体。在这一方面，双特异性配体可以是任何双特异性配体，包括由互补的和/或非互补的结构域组成的配体。例如，这一方面涉及VH结构域和VL结构域的组合，仅VH结构域和仅VL结构域。
优选地，由本发明这一方面的双特异性单一免疫球蛋白可变结构域异源二聚体结合的细胞因子选自下面的列表：
  配对   治疗效果的证据
  TNF/TGF-β   当注射入小鼠胶原蛋白诱发的关节炎模型的踝关节时，TGF-β和TNF显著增强关节炎症。在非胶原蛋白攻击小鼠中没有效果。
  TNF/IL-1   TNF和IL-1在色素层炎的病理中协同作用。TNF和IL-1在疟疾(低血糖，NO)的病理中协同作用。TNF和IL-1在炎症多形核(PMN)细胞移行的诱导中协同作用。IL-1和TNF协同诱导PMN渗入小鼠腹膜。IL-1和TNF协同诱导内皮细胞分泌IL-1。在炎症中重要。IL-1或TNF单独诱导某些细胞渗入兔膝滑膜。IL-1诱导PMNs，TNF-单核细胞。它们一起诱导由于增加的PMNs而产生的更加严重的浸润作用。循环性的心肌镇静物质(存在于败血症中)是低水平的协同作用IL-1和TNF。
  TNF/IL-2   涉及杀伤T细胞的协同激活的参考文献。
  TNF/IL-3
  TNF/IL-4   IL-4和TNF协同诱导内皮细胞上的VCAM表达。暗示在哮喘中具有作用。对于滑膜具有相同作用-与RA相关联。TNF和IL-4协同诱导角质细胞中的IL-6表达。
  TNF/IL-6
  配对   治疗效果的证据
  TNF/IL-8   TNF和IL-8与PMNs协同激活血小板。与急性呼吸窘迫综合征相关联。
  TNF/IL-10   IL-10诱导以及与TNF协同诱导慢性感染T细胞中HIV表达。
  TNF/IL-12
  TNF/IFN-γ   在脑中的MHC诱导。在抗病毒反应/IFN-b诱导中协同。嗜中性粒细胞激活/呼吸爆发。内皮细胞激活。当用TNF/IFN-γ作为抗病毒疗法治疗患者时注意到的毒性(将发现更多)。人星形胶质细胞的fractalkine表达。关于炎性反应的许多论文-即LPS，还有巨噬细胞激活。抗TNF和抗IFN-γ协同保护小鼠免受致死内毒素血症。
  TGF-β/IL-1   成骨细胞的Prostaglndin合成
  小肠内皮细胞(炎症模型)的IL-6生产在肺成纤维细胞(炎症模型)中刺激IL-1和IL-6在视网膜中IL-6和IL-8生产
  TGF-β/IL-6   Chondrocarcoma增殖
  IL-1/IL-2   B细胞激活LAK细胞激活
  T细胞激活
  IL-1/IL-3
  IL-1/IL-4   B细胞激活在内皮细胞激活中IL-4诱导IL-1表达。
  配对   治疗效果的证据
  IL-1/IL-6   B细胞激活T细胞激活(可以代替附属细胞)IL-1诱导IL-6表达C3和血清淀粉样蛋白表达(急性期反应)HIV表达软骨胶原蛋白裂解。
  IL-1/IL-8
  IL-1/IL-10
  IL-1/IFN-g
  IL-2/IL-3  T细胞增殖B细胞增殖
  IL-2/IL-4  B细胞增殖
 T细胞增殖
  IL-2/IL-5  B细胞增殖/Ig分泌IL-5诱导B细胞上的IL-2受体
  IL-2/IL-6  细胞毒性T细胞的发育
  IL-2/IL-7
  IL-2/IL-10  B细胞激活
  IL-2/IL-12
  IL-2/IL-15
  IL-2/IFN-γ  B细胞的Ig分泌IL-2诱导T细胞的IFN-g表达
  IL-2/IFN-α/β
  IL-3/IL-4  在肥大细胞生长中协同
  配对   治疗效果的证据
  IL-3/IL-5
  IL-3/IL-6
  IL-3/IFN-γ
  IL-4/IL-5  响应于IgE的增强的肥大细胞组氨酸等分泌
  IL-4/IL-6
  IL-4/IL-10
  IL-4/IL-12
  IL-4/IL-13
  IL-4/IFN-γ
  IL-4/IL-SCF  肥大细胞增殖
  IL-5/IL-6
  IL-5/IFN-γ
  IL-6/IL-10
  IL-6/IL-11
  IL-6/IFN-γ
  IL-10/IL-12
  IL-10/IFN-γ
  IL-12/IL-18
  IL-12/IFN-γ  作为免疫刺激的一部分IL-12诱导B和T细胞的IFN-g表达
  配对   治疗效果的证据
  IL-18/IFN-γ
  抗TNF/抗CD4  在DBA/1关节炎小鼠中的协同性治疗作用
以上所列的靶抗原以及其它抗原的氨基酸和核苷酸序列是本领域技术人员已知的和可以获得的。必要时本领域技术人员利用重组蛋白表达的标准方法表达和纯化这些和其它的抗原，例如以淘选结合靶抗原的单一免疫球蛋白可变结构域。
功能性分析
在一个实施方案中，本文所述的抗体单一可变结构域(以及单一结构域多聚体)具有相对于其靶抗原的中和性活性(例如，对抗性活性)或激动性活性。在任何可接受的对于这种活性的测试中相对于在缺失所述多肽的情况下靶抗原的活性来测量本文所述的单一免疫球蛋白可变结构域多肽的活性(不管是中和性的或激动性的)。例如，如果所述靶抗原是酶，则利用监测该酶活性的体内或体外功能性分析来监测抗体单一可变结构域多肽的活性或效果。
当，例如，所述靶抗原是受体时，例如，细胞因子受体，相对于配体结合受体的提高或降低或相对于受体在存在单一免疫球蛋白可变结构域多肽的情况下发出信号的活性的提高或降低来测量活性。通过监测，例如，受体构象，辅因子或配偶体多肽结合，GDP交换GTP，被激活受体所具有的激酶、磷酸酶或其它酶学活性，或通过监测这种活性的下游结果，如基因(包括报告基因)的表达或其它效应，包括，例如，细胞死亡，DNA复制，细胞粘附或一种或多种正常情况下作为受体激活的结果而发生的分子的分泌，来测量受体发出信号(signaling)的活性。
当所述靶抗原是，例如，细胞因子或生长因子时，通过测试所述细胞因子与其受体的结合或通过监测所述受体的激活，例如，通过监测如以上所讨论的受体发出信号的活性，来监测活性。一种测量细胞因子下游效应的功能性分析的例子是对于TNF-α活性的L929细胞杀伤测试，所述测试是本领域公知的(见，例如，U.S.6,090,382)。下面的L929细胞毒性测试文本称为″标准″L929细胞毒性测试。测试抗TNF单一免疫球蛋白可变结构域(″抗-TNFdAbs″)中和TNF对于小鼠L929成纤维细胞的细胞毒活性的能力(Evans，T.(2000)MolecularBiotechnology 15，243-248)。简言之，用抗TNFdAbs，100pg/ml TNF和lmg/ml放线菌素D(Sigma，Poole，UK)过夜温育铺于微滴定板中的L929细胞。在用3-(4，5-二甲噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓(Promega，Madison，USA)温育后通过读取490nm上的吸光率来测量细胞生活力。抗TNF dAb活性导致TNF细胞毒性的降低并因此导致与只有TNF的对照相比吸光率的提高。对于TNF-α或TNF-α受体有特异性的本文所述的单一免疫球蛋白可变结构域多肽在这种标准L929细胞测试中具有500nM或更小的IC50，优选50nM或更小，5nM或更小，500pM或更小，200pM或更小，100pM或更小或甚至是50pM。
配体，例如，细胞因子对受体的结合的测试方法是本领域已知的。作为一个例子，可以测试抗TNF dAbs抑制TNF结合重组的TNF受体1(p55)的能力。简言之，用30mg/ml抗人Fc小鼠单克隆抗体(Zymed，San Francisco，USA)将Maxisorp板温育过夜。用含有0.05％Tween-20的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤孔，随后在用100ng/mlTNF受体1Fc融合蛋白(R&DSystems，Minneapolis，USA)温育之前，用PBS中的1％BSA进行封闭。将抗TNF dAb与以10ng/ml的终浓度加入到洗涤过的孔的TNF相混合。用0.2mg/ml生物素化的抗-TNF抗体(HyCult biotechnology，Uben，Netherlands)检测TNF结合，随后以1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素(Amersham Biosciences，UK)进行检测，并与TMB底物一起进行温育(KPL，Gaithersburg，MD)。通过添加HCl终止反应并于450nm读取吸光率。抗TNF dAb抑制性活性导致TNF结合的降低并因此导致与只有TNF的对照相比吸光率的降低。
测量受体被配体，例如，细胞因子结合的测试是本领域已知的。作为一个例子，可以测试抗TNF受体I dAbs抑制TNF结合重组的TNF受体1(p55)的能力。简言之，用30mg/ml抗人Fc小鼠单克隆抗体(Zymed，San Francisco，USA)将Maxisorp板温育过夜。用含有0.05％Tween-20的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤孔，随后在用100ng/mlTNF受体1Fc融合蛋白(R&D Systems，Minneapolis，USA)温育之前，用PBS中的1％BSA进行封闭。加入TNF之前，将抗TNF受体I dAb在板上温育30分钟，所述TNF是以3ng/ml的终浓度加入并再温育60分钟。在检测步骤之前洗涤板以去除任何未结合的蛋白质。用0.2mg/ml生物素化的抗-TNF抗体(HyCult biotechnology，Uben，Netherlands)检测TNF结合，随后以1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素(Amersham Biosciences，UK)进行检测，并与TMB底物(KPL，Gaithersburg，MD)一起进行温育。通过添加HCl终止反应并于450nm读取吸光率。抗TNF dAb抑制性活性导致TNF结合的降低并因此导致与只有TNF的对照相比吸光率的降低。
作为选择，当评估单一免疫球蛋白可变结构域多肽对p55TNF-α受体的作用时，可以利用下列HeLa细胞测试，所述测试是基于在HeLa细胞中TNF诱导IL-8分泌(方法改编自Alceson，L.et al(1996)Journal of Biological Chemistry 271，30517-30523的方法，其描述了在HUVEC中IL-1诱导IL-8；在此我们关注人TNF-α的诱导并且我们使用HeLa细胞而非HUVEC细胞系)。简言之，用dAb和300pg/ml TNF将铺于微滴定板中的HeLa细胞温育过夜。温育后，将上清液吸出细胞并通过夹心ELISA(R&D Systems)测量IL-8的浓度。抗TNFR1dAb活性导致与只有TNF的对照相比分泌入上清液的IL-8减少。
作为选择，当评估单一免疫球蛋白可变结构域多肽对p55TNF-α受体的作用时，可以利用下列MRC-5细胞测试，所述测试是基于在MRC-5细胞中TNF诱导IL-8分泌(方法改编自Alceson，L.et al(1996)Journal of Biological Chemistry 271，30517-30523的方法，其描述了在HUVEC中IL-1诱导IL-8；在此我们关注人TNF-α的诱导并且我们使用MRC-5细胞而非HUVEC细胞系)。简言之，用dAb和300pg/ml TNF将铺于微滴定板中的MRC-5细胞温育过夜。温育后，将上清液吸出细胞并通过夹心ELISA(R&D Systems)测量IL-8的浓度。抗TNFR1dAb活性导致与只有TNF的对照相比分泌入上清液的IL-8减少。
对于其它配体(细胞因子、生长因子等)或其受体的活性的类似的功能性分析是本领域技术人员已知的并且可以用来评估单一免疫球蛋白可变结构域多肽的拮抗或激动效应。
本发明的一个实施方案中，PEG化的dAb多肽(单体和/或多聚体)相对于非PEG化的单体或多聚体保留活性，其中活性如上所述进行测量；即，通过PEG化的dAb对于靶分子的亲和性来测量。本发明的PEG化的dAb单体或多聚体将会保留一定水平的活性(例如靶亲和性)，其至少是非PEG连接的抗体单一可变结构域活性水平的10％，优选至少是非PEG连接的抗体单一可变结构域活性的20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％和高达90％或更高。在一个优选的实施方案中，PEG化的dAb单体或多聚体至少保留非PEG化的dAb单体或多聚体活性的90％，还要更加优选地，保留非PEG化的dAb单体或多聚体的全部(100％)活性。
同源性序列
本发明包括抗体单一可变结构域克隆以及具有与其显著的序列相似性或同源性的克隆，其也以高度亲和性结合靶抗原并且于高浓度时可溶(以及并入多聚体的这些抗体单一可变结构域克隆)。如本文所用的，″显著的″序列相似性或同源性是至少85％的相似性或同源性。
如下进行两种序列之间″同源性″或″序列同一性″的计算(所述术语在本文可交换使用)。为了最佳比较的目的对序列进行比对(例如，可以将缺口导入第一和第二氨基酸或核酸序列的其中之一或二者用于最佳比对，并且为了比较的目的可以不管非同源的序列)。在一个优选的实施方案中，为了比较的目的而对比的参照序列的长度至少是参照序列长度的30％，优选至少40％，更加优选至少50％，甚至更加优选至少60％，并且甚至更加优选至少70％，80％，90％，100％。随后对相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的一个位置被与第二序列中相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么所述分子在该位置上是相同的(如本文所用的，氨基酸或核酸″同源性″等同于氨基酸或核酸″同一性″)。两个序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置数目的函数，这考虑了为了进行两序列的最佳比对而需要引入的缺口数目和每个缺口的长度。
如本文所用的，序列″相似性″是氨基酸序列在序列比对中的相应位置上共有相似氨基酸残基的程度。当氨基酸的侧链相似时它们就是相似的。具体地，″相似性″包括对于彼此是保守性取代的氨基酸。″保守性″取代是在blosum62取代矩阵中具有正分值的任何取代(Hentikoff和Hentikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)。声称″序列A与序列B n％相似″意指序列A和B之间的最佳全局比对的n％位置由相同的氨基酸或保守性取代所组成。最佳全局比对可以利用Needleman-Wunsch比对算法采用下列参数来进行：
对于多肽：
取代矩阵：biosum62.
缺口评分函数：-A-B＊LG，其中A＝11(缺口罚分)，B＝1(缺口长度罚分)而LG是缺口长度。
对于核苷酸序列：
取代矩阵：匹配为10，错配为0。
缺口评分函数：-A-B＊LG，其中A＝50(缺口罚分)，B＝3(缺口长度罚分)而LG是缺口长度。
典型的保守性取代是在Met，Val，Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在残基Asp，Glu和Asn之间；在残基Gin，Lys和Arg之间；或芳族残基Phe和Tyr之间。在计算两种多肽序列之间的相似性程度(最常作为百分比)时，考虑与被比较的两种分子完整长度有关的两种多肽序列中相应氨基酸残基之间观察到同一性或相似性的位置的数目。
或者，采用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)算法进行序列比对，参数设置为默认值。BLAST算法″BLAST 2Sequences″可在美国政府(″.gov″)的国立卫生研究院(″nih″)的国家医学实验室(″.nlm″)的国家生物技术信息中心(″.ncbi″)的全球网站点(″www″)上，在″/blast/″目录，子目录″bl2seq/bl2.html.″中获得。这种算法比对两种序列进行比较并且被Tatusova&Madden，1999，FEMS Microbiol Lett.174：247-250所描述。
同源性或相似性的另一种测量是在高度严谨条件下杂交的能力。因而，如果第一序列在高度严谨条件(如Sambrook et al.，MolecularCloning，Laboratory Manual，Cold Spring，Harbor Laboratory Press，NewYork所述的条件)下与第二序列(或其互补体)杂交，则编码单一免疫球蛋白可变结构域多肽的第一序列基本上与第二编码序列相似。″高度严谨杂交条件″指于大约45℃在6X SSC中杂交，随后在于65℃在0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。″极高严谨杂交条件″是于0.5M磷酸钠，7％SDS，65℃中杂交，接着于65℃在0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。
dAhs的PEG化作用
本发明提供PEG化的dAb单体和多聚体，其提供提高的半寿期和对降解的耐受性而无相对于非PEG化的dAbs的活性(例如结合亲合性)丧失。
利用本领域已知的方法，可以将本发明的dAb分子偶联到聚合物分子(优选PEG)上，所述聚合物分子可用来获得本发明所包括的提高的半寿期和降解耐受性特性。可用于本发明的聚合物部分可以是合成的或天然发生的，包括，但不限于，直链或支链聚亚烷基，聚亚烯基(polyalkenylenes)，聚氧亚烷基聚合物，或分枝或未分枝的多糖，如同型或异型多糖。可用于本发明的合成的聚合物的优选的例子包括直链或支链的聚(乙二醇)(PEG)，聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)及其衍生物或取代形式。用于本发明的特别优选的取代聚合物包括取代的PEG，包括甲氧基(聚乙二醇)。除了或替代PEG的可以根据本发明使用的天然发生的聚合物部分包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖或糖原，及其本领域技术人员可以识别的衍生物。本发明的聚合物分子的衍生形式包括，例如，具有存在于其中的额外部分或反应性基团的衍生物，以便允许与本文所述的dAb多肽的氨基酸残基相互反应。这些衍生物包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯，琥珀酰亚胺基丙酸酯聚合物和巯基选择性活性试剂如，顺丁烯二酰亚胺，乙烯砜，和硫醇。特别优选的衍生化聚合物包括，但不限于，具有下列化学式的PEG聚合物：PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS；PEG-O-CH2-NHS，PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS；PEG-S-CH2CH2-CO-NHS；PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS；PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS；和PEG-O-CH2-CO2-NHS；其中R是(CH2)4)NHCO2(mPEG)。可用于本发明的PEG聚合物可以是线性分子，或可以是分枝的，其中多个PEG部分存在于单个聚合物中。可用于本发明的一些特别优选的PEG衍生物包括，但不限于下列：
Figure G2004800249396D00721
反应性基团(例如，MAL，NHS，SPA，VS或巯基)可以直接附着于PEG聚合物上或者可以通过连接体分子附着于PEG上。
可用于本发明的聚合物的大小可以是在500Da-60kDa之间，例如，在1000Da和60kDa，10kDa和60kDa，20kDa和60kDa，30kDa和60kDa，40kDa和60kDa之间，并且可以高达50kDa和60kDa之间。用于本发明的聚合物，特别是PEG，可以是直链聚合物或可以具有分枝的构象。根据分子量和构象的组合，当附着于dAb单体或多聚体上时，可用于本发明的聚合物分子将产生具有在24和500kDa之间的平均流体动力学大小的分子。本文所用的聚合物分子的流体动力学大小指基于分子穿过溶液扩散的分子(例如，蛋白质分子)表观大小。可以对蛋白质穿过溶液的扩散或运动进行处理以衍生出蛋白质的表观大小，其中所述大小通过Stokes半径或蛋白质颗粒的流体动力学半径给出。蛋白质的″流体动力学大小″依赖于质量和形状(构象)，从而具有相同分子质量的两种蛋白质基于蛋白质的整体构象可以具有不同的流体动力学大小。PEG连接的抗体单一可变结构域(包括本文所述的抗体可变结构域多聚体)的流体动力学大小可以是24kDa-500kDa；30-500kDa；40-500kDa；50-500kDa；100-500kDa；150-500kDa；200-500kDa；250-500kDa；300-500kDa；350-500kDa；400-500kDa和450-500kDa。优选地，本发明的PEG化的dAb的流体动力学大小是30-40kDa；70-80kDa或200-300kDa。
可以利用本领域公知的方法确定本发明的PEG连接的dAb单体和多聚体的流体动力学大小。例如，可以使用凝胶过滤确定PEG-或非PEG连接的dAb单体或多聚体的流体动力学大小，其中将凝胶上的dAb带的大小与分子量标准相比较。确定流体动力学大小的其它方法包括，但不限于，SDS-PAGE大小排除层析柱，如，例如，Superose 12HR(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)。本领域技术人员会轻易理解确定本发明的PEG或非PEG连接的dAb单体或多聚体的流体动力学大小的其它方法。在一个实施方案中，可以利用凝胶过滤矩阵确定本发明的PEG或其它聚合物连接的抗体单一可变结构域多肽的流体动力学大小。用来确定各种PEG连接的抗体单一可变结构域多肽的流体动力学大小的凝胶过滤矩阵(gel filtration matricieS)可以基于高度交联的琼脂糖。例如，对于球状蛋白的两种柱的分级范围可以是：Superose12HR 1000-3x105Mr和Superose 6HR5000-5x106Mr。Superose 12HR的球状蛋白质大小排除限制是～2x106而Superose6HR是～4x107Mr。
因而附着于本发明的dAb或dAb多聚体上的聚合物的大小可以根据所需的用途而变化。例如，当希望PEG化的dAb离开循环并进入外周组织中时，需要将附着的聚合物的大小保持低以促进从血流中渗出。或者，当希望将PEG化的dAb保留在循环中较长的时期时，可以使用较高分子量的聚合物(例如，30-60kDa的聚合物)。
利用本领域公知的方法，可以将可用于本发明的聚合物(PEG)分子附着于dAb多肽(以及多肽聚合物)上。在PEG或其它聚合物部分附着于本发明的dAb单体或多聚体中的第一步是通过包含亲电体的官能团取代PEG聚合物的羟基末端基团。具体地，将PEG聚合物附着到存在于本发明的dAb单体或多聚体中的半胱氨酸或赖氨酸残基上。所述半胱氨酸或赖氨酸残基可以是天然发生的，或者可以被工程化改造入dAb分子中。例如，可以将半胱氨酸重组改造到dAb多肽的C末端上，或者可以用半胱氨酸或赖氨酸取代dAb中特定溶剂可接近位置上的残基。在一个优选的实施方案中，将PEG部分附着到存在于本发明的dAb单体或多聚体中的C末端上的铰链区中的半胱氨酸残基上，在另一个优选的实施方案中，将PEG部分或其它聚合物附着于半胱氨酸或赖氨酸残基上，所述半胱氨酸或赖氨酸残基是天然发生于或工程化改造入本发明的抗体单一可变结构域多肽的N末端上。在又一个优选的实施方案中，将PEG部分或其它聚合物在半胱氨酸或赖氨酸残基(天然发生的或工程化改造的)上附着于根据本发明的抗体单一可变结构域，所述半胱氨酸或赖氨酸残基距离抗体单一可变结构域多肽的C和/或N末端至少2个残基(例如，在内部)。
在一个实施方案中，将PEG聚合物附着到存在于框架区(FWs)中的一个或多个半胱氨酸或赖氨酸残基和本发明的抗体单一可变结构域的一个或多个异源CDRs上。CDRs和框架区是如在Sequences ofProteins of Immunological Interest的Kabat数据库中所定义的免疫球蛋白可变区的那些区域(Kabat et al.(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest，U.S.Department of Health and HumanServices)。在一个优选的实施方案中，将PEG聚合物附着于VH框架片段DP47，或Vk框架片段DPK9中的半胱氨酸或赖氨酸残基上。可以连接到根据本发明的PEG上的DP47的半胱氨酸和/或赖氨酸残基包括SEQ ID NO：2的位置22，或96上的半胱氨酸以及位置43，65，76或98上的赖氨酸(图13)。可以连接到根据本发明的PEG上的DPK9的半胱氨酸和/或赖氨酸残基包括SEQ ID NO：4的位置23，或88上的半胱氨酸残基以及位置39，42，45，103或107上的赖氨酸残基(图14)。此外，特定的半胱氨酸或赖氨酸残基可以连接到VH标准框架区DP38或DP45中的PEG上。
此外，dAb分子中的特定溶剂可接近位点可以突变为半胱氨酸或赖氨酸以便进行PEG聚合物的附着，所述特异性溶剂可接近位点不是天然发生的半胱氨酸或赖氨酸。利用本领域已知的方法如给定dAb的晶体结构分析可以确定任何给定的dAb单体或多聚体中的溶剂可接近残基。例如，利用VH dAb HEL4(SEQ ID NO：5)的解析出的晶体结构，已经将残基Gln-13，Pro-14，Gly-15，Pro-41，Gly-42，Lys-43，Asp-62，Lys-65，Arg-87，Ala-88，Glu-89，Gln-112，Leu-115，Thr-117，Ser-119和Ser-120鉴定为溶剂可接近的，并且根据本发明将是有吸引力的候选残基，以突变为半胱氨酸或赖氨酸残基进行PEG聚合物的附着。此外，利用Vk dummy dAb(SEQ ID NO：6)的解析出的晶体结构，已经将残基Val-15，Pro-40，Gly-41，Ser-56，Gly-57，Ser-60，Pro-80，Glu-81，Gln-100，Lys-107和Arg-108鉴定为溶剂可接近的，并且根据本发明将是有吸引力的候选残基，以突变为半胱氨酸或赖氨酸残基进行PEG聚合物的附着。优选地，将PEG部分或其它的聚合物附着于取代为位置Glnl3，Pro41或Leul 15中的一个或多个的半胱氨酸或赖氨酸残基上，或附着于根据本发明的其它抗体单一可变结构域多肽中具有类似溶剂可接近性的残基上。在本发明的一个实施方案中，将PEG聚合物连接于多个溶剂可接近的半胱氨酸或赖氨酸残基上，或连接于已经突变为半胱氨酸或赖氨酸残基的溶剂可接近残基上。或者，只将一个溶剂可接近的残基连接于PEG上，其中特定的dAb只具有一个溶剂可接近的半胱氨酸或赖氨酸(或修饰为半胱氨酸或赖氨酸的残基)，或者其中特定的溶剂可接近残基选自几个这些残基之中以进行PEG化作用。
HEL4(SEQ ID NO：3)的一级氨基酸序列。
1      EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFRIS DEDMGWVRQA PGKGLEWVSS
51     IYGPSGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASAL
101    EPLSEPLGFW GQGTLVTVSS
Vk模型(SEQ ID NO：4)的一级氨基酸序列。
1      DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA
51     ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPNTFGQ
101    GTKVEIKR
Nektar公司(San Carlos，CA)提供几种可用于本发明的附着方案。例如，当希望将PEG或其它聚合物附着于赖氨酸残基上时，可以使用以N-羟基琥珀酰亚胺衍生化的PEG聚合物的活性酯，如琥珀酰亚胺丙酸酯。当希望附着到半胱氨酸残基上时，可以使用以巯基选择性试剂衍生的PEG聚合物如顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜或硫醇。可以根据本发明用来生成PEG化dAbs的PEG衍生物的特定实施方案的其它例子可以见于Nektar Catalog(在全球网nektar.com上可获得)。此外，可以根据本发明使用几种PEG的衍生形式以促进PEG聚合物附着于本发明的dAb单体或多聚体上。可用于本发明的PEG衍生物包括，但不限于Zalipsky和Lee，(1992)(″Use of functionalized poly(ethyleneglycol)s for modification of peptides″in Poly(Ethylene Glycol)Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications，J.MiltonHarris，Ed.，Plenum Press，NY)所述的PEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸、氨基甲酸乙酯连接的PEG、PEG苯基碳酸酯、PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯、PEG-羧甲基叠氮化物、二甲基马来酸酐PEG、PEG二硫代碳酸酯衍生物、PEG-tresylates(2，2，2-三氟乙烷磺酸酯)、mPEG亚氨酸酯及其它。
图6-11显示本发明的PEG化dAb和dAb多聚体的几种实施方案。在每个图中″X″代表以化学活化的PEG，例如，PEG-NHS，SPA，MAL，VS，硫醇等进行的dAb中氨基酸的化学修饰。修饰的氨基酸可以是dAb中的任何残基，但优选是半胱氨酸或赖氨酸，更优选是溶剂可接近的残基。图中所用的″PEG″代表线性的、分枝的、分叉的和/或多臂PEG。″S″代表氨基酸半胱氨酸。
图7显示各种二聚体化的dAb形式，其中所述二聚体由dAb结构内部的半胱氨酸残基之间的二硫键形成，或所述半胱氨酸残基位于dAb的C端。在一个实施方案中，C末端半胱氨酸残基存在于铰链区。在dAb单体之一或二者上都可以将所述dAb二聚体在内部位点上PEG化(见图7-5)。或者，可以通过分枝的、分叉的或多臂PEG聚合物的附着形成所述dAb二聚体，所述PEG聚合物连接于每个dAb单体的C末端半胱氨酸上(图7-7)，或连接于每个dAb单体内部的氨基酸残基上(图7-11)。
图8显示dAb同源或异源二聚体的各种实施方案，其中通过连接性肽如(Gly4Ser)n接头的方式连接dAb单体以形成二聚体，其中n＝1到大约10。一旦将dAb单体连接形成二聚体，随后就可以在半胱氨酸或赖氨酸残基上将衍生的PEG聚合物随机地附着于二聚体，或可以利用本文所述的任何PEG连接部分(例如，MAL，NHS，SPA，VS或硫醇)在dAb单体之一或二者的C末端或内部残基上特异性地靶向于半胱氨酸残基。或者，可以将PEG聚合物附着到存在于连接体多肽中的硫醇基反应性残基上，所述连接体多肽用来连接dAb单体(图8-15)。此外，如图8-17中所示，可以通过C末端二硫键将两个或多个dAb二聚体偶联，每个二聚体都是利用连接体肽形成的。图9具体地显示了PEG附着到特定半胱酸残基上的各种实施方案，所述半胱氨酸存在于内部位点上、连接体肽中或在dAb单体之一或二者的C末端上。
如由图10可见，通过利用一系列连接体肽(例如，Gly Ser连接体；图10-25，26或27)，或利用多臂PEG聚合物(图10-23，24)，从而使多臂聚合物的每个PEG聚合物连接(通过半胱氨酸、赖氨酸或其它溶剂可接近残基)到每个dAb单体的C末端上，将三个dAb单体连接在一起，可以形成同源或异源三聚体dAbs。当dAb单体通过连接体肽彼此连接时，可以将PEG聚合物在C末端半胱氨酸上附着于三聚体dAb上，或如上所述的，可以通过MAL，NETS，SPA，VS或硫醇部分附着于dAb单体之一、之二或全部三个中的任何其它溶剂可接近残基上。图10-27显示本发明的一个实施方案，包括具有双特异性的dAb三聚体。在这一实施方案中，dAb单体的一个或多个(但不是全部)相对于剩余的dAb单体具有对于不同抗原的结合特异性。这种类型的双特异性实施方案中的dAb单体可以通过如图10-27所示的连接性肽进行连接，或者可以通过分枝的或多臂PEG进行连接，其中三聚体的每个单体都连接到PEG部分上。当图10-27中所示的双特异性三聚体的单体通过连接体肽的方式进行连接时，所述三聚体可以通过上述任何机制连接到一个或多个PEG聚合物上。即，PEG可以连接到半胱氨酸或赖氨酸残基上，所述半胱氨酸或赖氨酸残基在一个或多个dAb单体中或存在于一个或多个单体的C末端上，或者还要进一步地，工程化到组成所述三聚体的dAb单体中。在上述的以及图6-11中所示的任何单体、二聚体或三聚体dAbs中，可以将PEG聚合物附着于既有的半胱氨酸或赖氨酸残基上，或者可以附着于被工程化设计入一个或多个所述dAb单体中或者被工程化设计入一个或多个所述连接肽中的半胱氨酸或赖氨酸残基上。
图11显示本发明的dAb异源或同源四聚体的PEG化作用的各种实施方案。dAb单体可以通过一个或多个连接肽进行连接(图11-29)，或者可以利用多臂或分枝的PEG聚合物进行连接以形成四聚体(图11-28，30)。或者，随后可以将通过连接体肽连接两个单体形成的两个或多个dAb二聚体通过分枝的或多臂PEG聚合物进行连接以形成四聚体(图11-29，31)，其中将所述PEG聚合物附着到存在于dAb单体中，在dAb单体C末端上的(图11-29)，或存在于连接体肽上(图11-31)的半胱氨酸或赖氨酸残基上。如上文对于dAb单体、二聚体和三聚体所述的，可以将一个或多个PEG聚合物附着在本发明的dAb四聚体中任何希望的位置上。例如，可以将PEG聚合物附着在C末端半胱氨酸或其它残基上，或者可以附着于连接肽中的一个或多个残基上，或还要进一步地可以附着到既有的或工程化设计入组成四聚体的dAb单体中的半胱氨酸或赖氨酸残基上。
图12显示可以根据本发明生成的较高级的PEG连接的dAb多聚体的例子。例如，通过连接体肽的方式连接的(如图12-31中所示)或者通过每个二聚体的单体之间的二硫键连接的多个dAb二聚体，其自身通过多臂PEG聚合物进行连接以形成二聚体的四聚体，其中所述多臂PEG聚合物的每个PEG都连接到存在于每个二聚体配对的一个单体中的C末端半胱氨酸残基上。图12-32显示，在另一个实施方案中，所述多臂PEG的PEG聚合物可以连接到存在于每个二聚体的连接体肽中的半胱氨酸残基上。二聚体、三聚体和四聚体形成的方式(例如，利用连接体肽或二硫键)，以及如上所述的PEG附着的位置和方式可以根据本发明而变化以产生大的PEG连接的dAb多聚体，如八聚体、十聚体等。例如，与图12中所示的生成大的PEG连接的dAb多聚体的策略相似，dAbs的三聚体或四聚体可以通过，例如，多臂PEG、连接体肽或二硫键自身连接在一起，以产生大的PEG连接的dAb多聚体。当多个dAb二聚体、三聚体、四聚体等通过连接肽或二硫键的方式连接在一起时(例如，不是利用如图12中所示的多臂PEG)，随后可以通过本文所述的任何方式将PEG聚合物连接到得到的多聚体上。例如，可以将PEG聚合物连接到组成多聚体的一个或多个dAb单体表面上的半胱氨酸或赖氨酸残基上，可以将PEG聚合物连接到存在于组成多聚体的一个或多个dAb单体中的C末端半胱氨酸上，或者可以将PEG聚合物连接到存在于任何连接肽中的半胱氨酸或赖氨酸残基上，所述连接肽将多聚体的组分连接在一起(即，连接各个单体的连接肽，和/或将二聚体、三聚体或四聚体连接在一起的连接肽)。
在每一种以上实施方案中，可以将PEG聚合物附着到存在于dAb肽中的任何会接纳的(amenable)残基上，或者，优选地，可以将dAb的一个或多个残基修饰或突变为半胱氨酸或赖氨酸残基，随后可以将其用作对于PEG聚合物的附着点。优选地，以此方式被修饰的残基是溶剂可接近的残基；即，当dAb处于其天然折叠构型时可以接触水性环境并且可以接近衍生化的PEG聚合物的残基。一旦一个或多个这些残基根据本发明突变为半胱氨酸残基，就可以利用线性或分枝的MAL衍生的PEG进行PEG附着(MAL-PEG)。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗体单一可变结构域组合物，其包含抗体单一可变结构域和PEG聚合物，其中PEG聚合物与抗体单一可变结构域的比例是至少0.25∶1的摩尔比。在另一个实施方案中，PEG聚合物与抗体单一可变结构域的摩尔比是0.33∶1或更大。仍然在另一个实施方案中，PEG聚合物与抗体单一可变结构域的摩尔比是0.5∶1或更大。
提高的半寿期
本发明的PEG化dAb单体和多聚体赋予超越本领域所教示的那些dAb分子的优点，即本发明的PEG化dAb分子具有很大程度上延长的半寿期。不受特定理论所限，据信本发明的dAb分子的提高的半寿期是由提高的dAb流体动力学大小所赋予的，所述提高的dAb流体动力学大小得自PEG聚合物的附着。更具体地，据信两种参数在确定PEG化的dAbs和dAb多聚体的血清半寿期中发挥重要作用。第一种标准是PEG附着的性质和大小，即，如果所用的聚合物只是线性链或分枝的/分叉的链，其中所述分枝的/分叉的链引起更长的半寿期。第二种是dAb在最终形式上的定位以及所述分子具有多少″游离的″未修饰PEG臂。如，例如通过大小排除层析估计的PEG化dAb的所得流体动力学大小反映所述分子的血清半寿期。因此，所述PEG化分子的流体动力学大小越大，则血清半寿期就越长。
提高的半寿期在免疫球蛋白的体内应用中是有用的，特别是抗体并且最特别是小的抗体片段。这些片段(Fvs，Fabs，scFvs，dAbs)遭受身体的快速清除，因而尽管它们能够快速地到达身体的大多数部分，并且迅速产生而且易于控制，但它们的体内应用受到其仅仅是短暂的体内存留所限制。
在一个方面，本文所述的抗体单一可变结构域多肽通过与一种诸如PEG的部分融合而在体内稳定化，所述融合提高了dAb多肽的流体动力学大小。药物动力学分析和确定dAb半寿期的方法将会是本领域技术人员所熟悉的。细节可见于Kenneth，A et al.，Chemical Stabilityof Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists并且可见于Peters etal.，Pharmacokinetic analysis：A Practical Approach(1996)。还可参见″Pharmacokinetics″，M Gibaldi&D Perron，published byMarcelDekker，2nd Rev.ex edition(1982)，其描述了药物动力学参数，如tα和t β半寿期以及曲线下的区域(AUC)。
典型地，相对于非PEG化dAb，本发明的PEG化dAb单体或多聚体的半寿期提高了10％，20％，30％，40％，50％或更多(其中PEG化dAb和非PEG化dAb的dAb是相同的)。2x，3x，4x，5x，7x，l0x，20x，30x，40x以及高达50x或更多的半寿期范围的提高是可能的。或者，或此外，高达30x，40x，50x，60x，70x，80x，90x，100x，150x范围内的半寿期增加是可能的。
半寿期(tl/2α和t1/2β)和AUC可以由相对于时间的配体的血清浓度曲线而确定。可以利用WinNonlin分析包(可获自PharsightCorp.，Mountain View，CA 94040，USA)，以便，例如，对曲线进行建模。在第一阶段(α期)配体主要在患者体内进行分布，伴有一些消除。第二阶段(β期)是末期，此时配体已经分布并且血清浓度正在下降，因为配体被由患者体内清除。tα半寿期是第一阶段的半寿期而tβ半寿期是第二阶段的半寿期。如本文所用的″半寿期″，除非另外注明，指通过无间隔建模(例如，与双相建模相反)确定的本发明的抗体单一可变结构域的总体半寿期。β半寿期是dAb单体或多聚体的量从它施用的哺乳动物中被清除所用的时间的测量。因而，有益地，本发明提供含有dAb的组合物，例如，具有0.25小时到6小时或更多的tα半寿期的dAb-效应物组组合物。在一个实施方案中，所述范围的下端为30分钟，45分钟，1小时，1.3小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，10小时，11小时或12小时。此外或可选择地，含有dAb的组合物将具有高达并且包括12小时的t α半寿期范围。在一个实施方案中，所述范围的上端是11，10，9，8，7，6，或5小时。合适范围的例子是1.3-6小时，2-5小时或3-4小时。
有益地，本发明提供含有dAb的组合物，其中包含根据本发明的具有1-170小时或更长的tβ半寿期的配体。在一个实施方案中，所述范围的下端为2.5小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时，11小时或12小时。此外或选择性地，含有dAb的组合物，例如dAb-效应组组合物具有高达并且包括21天的tβ半寿期范围。在一个实施方案中，所述范围的上端是12小时，24小时，2天，3天，5天，10天，15天或20天。有益地，根据本发明的含有dAb的组合物将具有2-100小时，4-80小时以及10-40小时的tβ半寿期范围。在另一个实施方案中，它将为12-48小时。仍在另一个实施方案中，它将为12-26小时。本发明提供包含根据本发明的配体的含有dAb的组合物，其具有1-170小时或更大的半寿期。在一个实施方案中，所述范围的下端为1.3小时，2.5小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时，11小时或12小时。此外或可选择地，含有dAb的组合物，例如dAb-效应物组组合物(dAb-effector groupcomposition)具有高达并且包括21天的半寿期范围。在一个实施方案中，所述范围的上端是12小时，24小时，2天，3天，5天，10天，15天或20天。
除了上述标准之外或可选择地，本发明提供包含根据本发明的配体的含有dAb的组合物，其具有1mg.min/ml或更大的AUC值(曲线下区域)范围。在一个实施方案中，所述范围的下端是5，10，15，20，30，100，200或300mg.min/ml。此外或可选择地，根据本发明的配体或组合物具有高达600mg.min/ml的AUC范围。在一个实施方案中，所述范围的上端是500，400，300，200，150，100，75或50mg.min/ml.有益地，根据本发明的配体将具有选自下列范围的AUC：15-150mg.min/ml，15-100mg.min/ml，15-75mg.min/ml，以及15-50mg.min/ml。
增强的蛋白酶稳定性
本发明的另一个优点是本文所述的PEG化的dAbs和dAb 5多聚体具有增强的对于蛋白酶作用的稳定性。根据分析条件，dAbs一般对于蛋白酶作用固有地稳定。不过，在胃蛋白存在的情况下，许多dAbs于pH2被完全降解，因为蛋白质在酸性条件下解折叠，因而使得蛋白质更易于接近蛋白酶。本发明提供PEG化的dAb分子，包括dAb多聚体，其中据信由于PEG聚合物对主链的物理覆盖，PEG聚合物提供多肽主链的保护作用，由此阻止蛋白酶接近多肽主链并将它剪切。在一个优选的实施方案中，根据本发明生成具有更大流体动力学大小(例如，200-500kDa)的PEG化的dAb，因此与具有更小的流体动力学大小的PEG化的dAb相比，更大的流体动力学大小将确保对蛋白酶降解的更高水平的保护。在一个实施方案中，当暴露于胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶的一种或多种时，PEG或其它聚合物连接的抗体单一可变结构域单体或多聚体被降解不超过10％，其中如果所述蛋白酶是胃蛋白酶那么所述暴露于pH 2.0进行30分钟，如果所述蛋白酶是胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶的一种或多种时，那么所述暴露于pH 8.0进行30分钟。在一个优选的实施方案中，当于pH 2.0暴露于胃蛋白酶30分钟时，PEG或其它聚合物连接的单体或多聚体被降解不超过10％，优选不超过5％，并且优选完全不被降解。在另一个优选的实施方案中，在胃蛋白酶于pH 2.0存在30分钟时，本发明的PEG或其它聚合物连接的dAb多聚体(例如，异源或同源二聚体，三聚体，四聚体，八聚体等)被降解不超过5％，优选完全不被降解。在一个优选的实施方案中，当于pH 8.0暴露于胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶30分钟时，PEG或其它聚合物连接的dAb单体或多聚体被降解不超过10％，优选不超过5％，并且优选完全不被降解。在另一个优选的实施方案中，在胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶于pH 8.0存在30分钟时，本发明的PEG或其它聚合物连接的dAb多聚体(例如，异源或同源二聚体，三聚体，四聚体，八聚体等)被降解不超过5％，优选完全不被降解。
蛋白酶：抗体单一可变结构域多肽的相对比例可以根据本发明变化以实现如上所述所希望的降解水平。例如蛋白酶与抗体单一可变结构域多肽的比例可以从大约1∶30，到大约10∶40，到大约20∶50，到大约30∶50，大约40∶50，大约50∶50，大约50∶40，大约50∶30，大约50∶20，大约50∶10，大约50∶1，大约40∶1，和大约30∶1。
因此，本发明提供减少抗体单一可变结构域降解的方法，包括将抗体单一可变结构域单体或多聚体连接到根据本文所述的任何实施方案的PEG聚合物上。根据本发明的这一方面，在胃蛋白酶于pH 2.0存在30分钟时，抗体单一可变结构域被降解不超过10％。特别地，在胃蛋白酶于pH 2.0存在30分钟时，PEG连接的dAb多聚体被降解不超过5％，并且优选完全不被降解。在另一个实施方案中，当于pH 8.0暴露于胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶30分钟时，抗体单一可变结构域被降解不超过10％，优选不超过5％，并且优选完全不被降解。
利用本领域技术人员公知的方法可以测量根据本发明的PEG连接的dAb单体和多聚体的降解。例如，在将PEG连接的dAb用胃蛋白酶于pH 2.0温育30分钟，或用胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶于pH 8.0温育30分钟后，可以通过凝胶过滤对dAb样品进行分析，其中dAb单体或多聚体的降解通过比未降解的(即，未用胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶处理的对照dAb)dAb更小的分子量的凝胶带来证明。通过将所述带的迁移与分子量梯度(ladder)的迁移比较可以确定凝胶上dAb带的分子量(见图5)。测量蛋白质降解的其它方法是本领域已知的并且可以改编用来评估本发明的PEG连接的dAb单体和多聚体。
单一免疫球蛋白可变结构域多肽的用途：
本文所述的PEG化的抗体单一可变结构域多肽可用于多种体内和体外诊断性，和治疗性以及预防性应用。例如，可以将所述多肽并入免疫分析(如，ELISAs，RIA等)以检测它们在生物学样品中的靶抗原。单一免疫球蛋白可变结构域多肽还可以用于，例如，蛋白质印迹应用和亲和层析法中。这些技术是本领域技术人员公知的。
单一免疫球蛋白可变结构域多肽的一个非常重要的应用领域是与靶抗原相关的疾病或病症的治疗或预防。
基本上任何用抗体制品进行的治疗或预防的候选疾病或病症都是用本文所述的单一免疫球蛋白可变结构域多肽进行的治疗或预防的候选。本文所述的单一免疫球蛋白可变结构域多肽的高度亲和性、人序列来源、小的尺度和高度溶解性使得它们在用于治疗或预防人类疾病方面优于，例如，全长抗体，或者甚至优于，例如scFv。
利用本文所述的单一免疫球蛋白可变结构域多肽可治疗或预防的疾病或病症是，例如炎症、败血症(包括，例如，脓毒性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性败血症和中毒性休克综合症)、变应性过敏症、癌症或其他的高增生性病症、自身免疫病症(包括，例如，糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、红斑狼疮、重症肌无力、硬皮病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、Hashimoto病、Graves病、综合征、多内分泌障碍、白斑病、周围神经病、移植物对抗宿主疾病、自身免疫多腺综合症I型、急性肾小球肾炎、阿狄森氏病、成年发作的先天性甲状旁腺机能减退(AOIH)、全秃、肌萎缩性侧索硬化、关节强硬性脊椎炎、自身免疫再生障碍性贫血、自体免疫性溶血性贫血、Behcet病、Celiac病、慢性活动型肝炎、CREST综合征、皮肌炎、扩张型心肌病、嗜曙红细胞增多肌痛综合症、epidermolisis bullosa acquisita(EBA)、巨细胞性动脉炎、Goodpasture综合征、Guillain-Barré综合症、血色素沉着症、过敏性紫癜、自发免疫球蛋白A肾病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、幼年型类风湿关节炎、Lambert-Eaton综合症、线性IgG皮肤病、心肌炎、发作性睡病、坏死性脉管炎、新生性狼疮综合症(NLE)、肾病综合征、类天疱疮、天疱疮、多肌炎、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、快速进行性肾小球肾炎(RPGN)、莱特尔氏综合征、Stiff-man综合征和甲状腺炎)，传染病效应(例如，通过限制炎症、恶病质或细胞因子介导的组织损伤)、移植排斥和和移植物抗宿主病、肺部病症(例如，呼吸窘迫综合征、休克肺、慢性肺炎性疾病、肺结节病、肺纤维化和硅肺)、心脏病(例如，心脏缺血和心功能不全)、炎症性骨病症和骨吸收疾病、肝炎(包括酒精性肝炎和病毒性肝炎)、凝结障碍、再灌注损伤、瘢痕瘤形成、瘢痕组织形成和发热。
可以通过，例如靶向对于肿瘤的生长和/或代谢活性必需的一种或多种分子，例如，细胞因子或生长因子，细胞表面受体或抗原，或酶，或者，例如，通过利用对于肿瘤特异性或肿瘤富集的抗原具有特异性的单一免疫球蛋白可变结构域多肽以便将可能的(liked)细胞毒性剂或凋亡诱导剂靶向到肿瘤细胞上而治疗癌症。通过用本文所述的中和性单一免疫球蛋白可变结构域多肽靶向一种或多种病理介体，能够以类似的方式治疗其它疾病或病症，例如，炎性或自身免疫病症。最普遍地，这些介体将是，例如，内源性细胞因子(例如，TNF-α)或其介导炎症或其它组织损伤的受体。
药物组合物，剂量和给药
可以将本发明的单一免疫球蛋白可变结构域多肽掺入到适于向受试者给药的药物组合物中。
典型地，所述药物组合物包含单一免疫球蛋白可变结构域多肽和可药用的载体。如本文所用的，″可药用的载体″或″载体″包括任何和全部生理相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。术语″可药用的载体″不包括含有牛或马血清的组织培养基。可药用的载体的例子包括水、盐溶液、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合中的一种或多种。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇比如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠。可药用的物质包括少量的辅助性物质如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其提高所述单一免疫球蛋白可变结构域多肽的保存期或效力。
本文所述的组合物可以多种形式存在。这些包括，例如，液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如，可注射和可灌注的溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选的形式依赖于所希望的给药模式和治疗应用。一般优选的组合物是可注射或可灌注溶液的形式，如类似于那些用于和其它抗体一起进行人的被动免疫的组合物。优选的给药模式是肠胃外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。
治疗性组合物典型地必须是无菌的并且在生产和保存条件下稳定。组合物可以配制成溶液、微乳剂、分散液、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的活性化合物与一种或组合的以上列举的成分一起掺入适当的溶剂中可以制备无菌的可注射溶液，根据需要，随后进行滤器除菌。一般，分散液是通过将活性化合物掺入无菌媒介物而制备的，所述媒介物包含基本的分散介质和所需的其它以上列举的成分。对于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冻干，由其预先无菌过滤的溶液产生活性成分加任何其它所需成分的粉末。例如，通过使用包衣如卵磷脂，对于分散液通过保持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂能够保持溶液的适当流动性。
本文所述的单一免疫球蛋白可变结构域多肽可以通过多种本领域已知的方法进行给药，尽管对于许多治疗性应用来说，优选的给药途径/模式是静脉内注射或灌注。所述多肽还可以通过肌内或皮下注射进行给药。可选择地或除了上述的之外，本发明的PEG化的免疫球蛋白可变区肽可以通过延缓释放机制进行给药。所述延迟释放机制可以包括本领域技术人员已知的适当的基于纤维素的聚合物，并且可以进一步包括可以移植入个体哺乳动物中并且将随着时间缓慢地释放PEG化的可变区多肽的渗透泵。根据本发明的渗透泵的释放速率包括从六周时间0.5ml到2周时间0.1ml。释放速率优选大约是4周时间0.2ml。本领域技术人员可以理解具体的释放速率可以根据所需的特定结果，或所用的PEG化可变区多肽而变化。根据本发明的制品包括PEG化抗体单一可变结构域(或PEG化的多聚体)的浓缩溶液，例如，水性溶液(例如，PBS)中至少5mg/ml(～417μM)的溶液，优选至少10mg/ml～833mM)，20mg/ml(～1.7mM)，25mg/ml(～2.1mM)，30mg/ml(～2.5mM)，35mg/ml(～2.9mM)，40mg/ml(～3.3mM)，45mg/ml(～3.75mM)，50mg/ml(～4.2mM)，55mg/ml(～4.6mM)，60mg/ml(～5.0mM)，65mg/ml(～5.4mM)，70mg/ml(～5.8mM)，75mg/ml(～6.3mM)，100mg/ml(～8.33mM)，150mg/ml(～12.5mM)，200mg/ml(～16.7mM)或更高。在某些实施方案中，制品可以是例如，250mg/ml(～20.8mM)，300mg/ml(～25mM)，350mg/m(～29.2mM)或甚至更高，但在使用前稀释到200mg/ml或更低。
如技术人员将会理解的，给药的途径和/或方式将会根据所需的结果而变化。在某些实施方案中，活性化合物可以与将会保护所述化合物免于迅速释放的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物，经皮贴剂和微囊化递送系统。单一免疫球蛋白可变结构域非常适于作为延长释放的制品的制剂，部分归因于其小的大小-每剂量的摩尔数可以显著高于例如，完整大小抗体的剂量。可以使用可生物降解的生物相客性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚羟乙酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸盐和明胶可以引起可注射组合物的延长吸收。许多制备这些制品的方法被授以专利权或一般是本领域技术人员已知的。见，例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，MarcelDekker，Inc.，New York，1978。可用于多肽试剂如本文所述的单一免疫球蛋白可变结构域多肽的控释或延长释放的其它方法在，例如，美国专利号6,306,406和6,346,274，以及，例如，在美国专利申请号US20020182254和US20020051808中进行了描述，将其全部并入本文作为参考。
在某些实施方案中，单一免疫球蛋白可变结构域多肽可以，例如，与惰性diligent或可同化的食用载体一起口服。所述化合物(以及其它成分，如果需要的话)可以封闭在硬的或软的壳明胶胶囊中，压缩成片剂或直接掺入个体的膳食中。对于治疗性口服来说，可以将所述化合物与赋型剂掺合并以可摄取的片剂、颊片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、干胶片等的形式使用。为了通过胃肠外给药之外的方式给药本发明的化合物，可能必需用防止其灭活的物质涂布所述化合物，或共给药所述化合物。
本发明的另一个实施方案是通过共价地或非共价地附着到一种多肽构建体上而穿过天然屏障递送治疗性多肽、试剂或抗原的方法，所述多肽构建体包含至少一种针对内化细胞受体的单一结构域抗体，其中所述构建体在结合到所述受体上之后内化。根据本发明，天然的屏障包括，但不限于，血-脑，肺-血，肠-血、阴道-血、直肠-血和鼻-血屏障。例如，通过上呼吸道和肺递送的肽构建体可以用于从肺内腔到血液运输治疗性多肽或试剂。所述构建体特异性地结合存在于粘膜(支气管上皮细胞)表面上的受体，通过细胞内化作用导致对于血流靶标特异性的治疗性多肽或试剂从肺内腔到血液进行运输。在另一个实施例中，将治疗性多肽或试剂连接到包含至少一种单一结构域抗体的多肽构建体上，所述抗体针对存在于小肠壁上进入血流中的内化性细胞受体。所述构建体诱导所述治疗性多肽或试剂通过细胞内化作用穿过壁的传递。
递送和给药化合物如本发明的抗体单一可变结构域的方法是本领域已知的并且可以见于，例如，WO04/041867的教示，将其全部内容并入本文。
本发明还涉及一种确定哪种抗体单一可变结构域多肽(例如，dAbs；VHH)在利用例如，口、鼻、肺、皮肤给药后穿过天然屏障进入血流的方法。在一个非限制性的实施例中，所述方法包括向小动物，如小鼠给药原生的(native)、合成的或免疫抗体单一可变结构域噬菌体文库。在给药后的不同时间点，回收(retrieve)血液以援救已经主动传递到血流中的噬菌体。此外，给药后，可以分离器官并且可以清除结合的噬菌体。从肺内腔到血液主动运输的受体的非限制性例子是Fc受体N(FcRn)。因而本发明的方法鉴定不仅主动运输到血液中还能够靶向特异性器官的单一结构域抗体。所述方法可以鉴定哪种抗体单一可变结构域多肽穿过肠运输到血液中；穿过舌(或舌下)进入血液；穿过皮肤进入血液等。本发明的一方面是通过利用所述方法获得的单一结构域抗体。在W004/041867中描述了确定哪种抗体单一可变结构域多肽可以最佳地适于在根据本发明的药物制剂中给药的方法，将其全部内容并入本文。
还可以将其它活性化合物掺入所述组合物中。在某些实施方案中，将单一免疫球蛋白可变结构域多肽与一种或多种其它治疗性试剂一起共配剂和/或共给药。例如，可以将单一免疫球蛋白可变结构域多肽与一种或多种结合其它靶标的其它抗体(例如，结合其它细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)，或例如，一种或多种细胞因子一起共配剂和/或共给药。这种联合治疗可以采用更低剂量的给药治疗剂，因而避免了与各种单一治疗相关联的可能性毒性或并发症。
本发明的药物组合物可以包括″治疗上有效的量″或″预防上有效的量″的单一免疫球蛋白可变结构域多肽。″治疗上有效的量″指在必需的剂量和时间下，有效获得希望的治疗结果的量。单一免疫球蛋白可变结构域多肽的治疗上有效量可以根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体体重，以及所述单一免疫球蛋白可变结构域多肽在个体中诱发所需反应的能力而变化。治疗上有效量还是这样一种量，其中抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用都被治疗上有益的作用所胜过。″预防上有效的量″指在必需的剂量和时间下，有效获得希望的预防结果的量。典型地，因为预防性剂量是在疾病之前或疾病早期使用的，所以预防上有效的量将比治疗上有效的量更小。
可以对剂量方案进行调节以提供最优的所期望的反应(例如，预防性或治疗性反应)。例如，可以给药单个弹丸剂(bolus)，可以随着时间给药几个分开的剂量，或者可以如治疗情况的紧急性所显示的那样按比例减少或增加剂量。以给药方便和剂量一致的单位剂型配剂肠胃外组合物是有益的。如本文所用的单位剂型指适合作为待治疗哺乳动物受试者的单位剂量的物理上分离的单位；每个单位包含计算来产生所需治疗效果的与所需药物载体相关联的预定量活性化合物。
单一免疫球蛋白可变结构域多肽的治疗上或预防上有效的量的非限制性范围是0.1-20mg/kg，更加优选1-10mg/kg。应当注意剂量值可以随着要减轻的状况的类型和严重性而变化。应当进一步理解对于任何特定的受试者，应当根据个体需要和给药医生的专业判断随着时间来调整具体剂量方案。
如本文所述的用单一免疫球蛋白可变结构域多肽进行治疗的效力可以由有经验的临床医师根据被治疗疾病状态或病症的一种或多种症状或指征的改善来进行判断。一种或多种临床指征的至少10％的改善(提高或降低，根据被测量的指征)被认为是″有效的治疗″，尽管优选更大的改善，如20％，30％，40％，50％，75％，90％或者甚至100％，或者，根据被测量的指征，超过100％(例如，两倍、三倍、十倍等，高达并且包括达到无疾病状态)。指征可以是物理性测量，例如，酶、细胞因子或代谢物水平、细胞生长或细胞死亡速率，或异常细胞的存在或量。还可以测量，例如疾病或病症症状的骤发之间时间量的差异(例如，对于缓解性/复发性病毒，如多发性硬化症)。或者，可以根据非物理性测量，如报告的疼痛或不适或疾病状态的其它指征的减少来估计治疗的效果。当进行非物理性测量时，可以使用各种临床上可接受度量或指数，例如，Crohn病活性指数或CDAI(Best et al.，1976，Gastroenterology 70：439)，其联合了物理指征，如血细胞比容以及液体和极软粪便的次数等，和患者报告的因素，如腹痛或痉摩的严重性和一般性健康状态，以赋予疾病分值。
如本文所用的术语，如果一种或多种症状的发作或严重性相对未用所述组合物治疗的类似个体(人或动物模型)被延迟或减弱至少10％，或消失，则利用本文所述的组合物进行的″预防″是″有效的″。
可以利用人疾病公认的动物模型评定本文所述的单一免疫球蛋白可变结构域多肽治疗或预防疾病或病症的效力。这些疾病模型的例子包括，例如：Savoie等，1995，Am.J.Respir.Cell Biol.13：133-143所述的变应性哮喘豚鼠模型；可以在多种物种中诱导的多发性硬化、实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)动物模型，例如，豚鼠(Suckling et al.，1984，Lab.Anim.18：36-39)，Lewis大鼠(Feurer et al.，1985，J.Neuroimmunol.10：159-166)，兔(Brenner et al.，1985，Isr.J.Med.Sci.21：945-949)，和小鼠(Zamvil et al.，1985，Nature 317：355-358)；本领域已知的糖尿病动物模型，包括胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的模型-例子包括非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠(例如，Li et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：11128-11132)，BB/DP大鼠(Okwueze et al.，1994，Am.J.Physiol.266：R572-R577)，Wistar肥胖大鼠(Jiao et al.，1991，Int.J.Obesity15：487-495)，和Zucker糖尿病肥胖大嫌(Lee et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：10878-10882)；前列腺疾病的动物模型(Lowethet al.，1990，Vet.Pathol.27：347-353)，动脉硬化症的模型(多种模型，包括Chao et al.，1994，J.Lipid Res.35：71-83；Yoshida et al.，1990，Lab.Anim.Sci.40：486-489；和Hara et al.，1990，Jpn.J.Exp.Med.60：315-318所描述的模型)；肾病综合症(Ogura et al.，1989，Lab.Anim.23：169-174)；自身免疫性甲状腺炎(Dietrich et al.，1989，Lab.Anim.23：345-352)；高尿酸血症/痛风(Wu et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：742-746)，胃炎(Engstrand et al.，1990，Infect.Immunity58：1763-1768)；蛋白尿/肾小球缺陷(Hyun et al.，1991，Lab.Anim.Sci.41：442-446)；食物过敏症(例如，Ermel et al.，1997，Lab.Anim.Sci.47：40-49；Knippels et al.，1998，Clin.Exp.Allergy 28：368-375；Adel-Patient et al.，2000，J.Immunol.Meth.235：21-32；Kitagawa etal.，1995，Am.J.Med.Sci.310：183-187；Panush et al.，1990，J.Rheumatol.17：285-290)；类风湿病(Mauri et al.，1997，J.Immunol.159：5032-5041；Saegusa et al.，1997，J.Vet.Med.Sci.59：897-903；Takeshita etal.，1997，Exp.Anim.46：165-169)；骨关节炎(Rothschild et al.，1997，Clin.Exp.Rheumatol.15：45-51；Matyas et al.，1995，Arthritis Rheum.38：420-425)；狼疮(Walker et al.，1983，Vet.Immunol.Immunopathol.15：97-104；Walker et al.，1978，J.Lab.Clin.Med.92：932-943)；和Crohn病(Dieleman et al.，1997，Scand.J.Gastroenterol.Supp.223：99-104；Anthony et al.，1995，Int.J.Exp.Pathol.76：215-224；Osborne et al.，1993，Br.J.Surg.80：226-229)。其它的动物模型是本领域技术人员已知的。
尽管本文所述的单一免疫球蛋白可变结构域多肽必须以高亲和性结合人抗原，当在动物模型系统中评估其效果时，所述多肽必须与所述动物模型系统中的一种或多种抗原交叉反应，优选以高亲和性交叉反应。本领域技术人员可以轻易地确定这种条件对于给定的动物模型系统和给定的单一免疫球蛋白可变结构域多肽是否得到满足。如果这种条件得到满足，单一免疫球蛋白可变结构域多肽的效力可以通过在模拟疾病状态的条件下将它向动物模型给药并且监测该疾病状态的一种或多种指征的至少10％的改善来进行检测。
实施例
特此将本文所引用的所有专利、专利申请和公开的参考文献的全部内容并入作为参考。尽管已经对本发明结合其优选的实施方案进行显示和描述，本领域技术人员会理解可以在其中进行各种形式和细节的改变而不背离随附的权利要求所包括的发明范围。
概述
VH和Vk dAbs的位点特异性顺丁烯二酰亚胺-PEG化作用需要在蛋白质的表面上提供溶剂可接近的半胱氨酸，在此实施例中是在C末端。一旦半胱氨酸残基被还原给出游离的巯基，随后就可以被用来特异性地将蛋白质偶联到顺丁烯二酰亚胺或巯基-PEG dAb上。广泛的不同大小和分枝形式的化学修饰的PEGs可获自Nektar(正式称为Shearwater Corp)。这允许以多种形式形成基本的dAb-cys单体，例如作为PEG化的单体、二聚体、三聚体、四聚体等。PEGs的大小以kDa给出但是也称作K(即″40K PEG″＝40kDa PEG)。
1.0实施例1：Vk dAb TAR1-5-19的PEG化作用
1.1TAR1-5-19cys的PCR构建
TAR1-5-19将被用作一个例子，涉及将C末端的cys工程设计到Vk cLAb上(图6-3)。PEG的附着位点可以置于dAb表面上的其他位置，只要靶向的氨基酸是溶剂可接近的并且得到的PEG化的蛋白质仍然保持抗原结合。因而还可能将cys工程设计到dAb的框架1-4的任何一个中以进行PEG化作用并且仍然保持一些抗原结合。将下列寡核苷酸用来特异性PCR具有SalI和BamHI位点的TAR1-5-19以进行克隆并且还导入C末端半胱氨酸残基。下列序列是TAR1-5-19cys的DNA序列以及用来扩增工程化改造的dAb的PCR引物。
                                         SalI
       Trp Ser Ala Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1      TGG AGC GCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA
       ACC TCG CGC AGC TGC CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT
       Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp
61     GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG
       CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACC
       Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln
121    TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA
       ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT
       Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
181    AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC
       TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG
       Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro
241    AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT
       TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA
                                       BamHI
       Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Cys *** *** Gly Ser Gly
301    TTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG TGC TAA TAA GGA TCC GGC
       AAA TGC AAG CCG GTT CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCC ACG ATT ATT CCT AGG CCG
       (SEQ ID NO：9)
       (SEQ ID NO：8)
       (SEQ ID NO：7)
正向引物(SEQ ID NO：10)
5’-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3’
反向引物(SEQ ID NO：11)
5’-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3’
PCR反应(50μL体积)设定如下：200μM dNTP′s，每种引物0.4μM，5μL 10xPfuTurbo缓冲液(Stratagene)，100ng模板质粒(TAR1-5-19)，1μL Pfu Turbo醇(Stratagene)并用灭菌水将体积调节到50μL。使用下列PCR条件：初始变性步骤94℃2分钟，随后25个循环的94℃30秒，64℃30秒和72℃30秒。最后的延伸步骤也包括72℃5分钟。将PCR产物纯化并用SalI和BamHI进行消化，并连接到也已经用相同的限制性酶剪切过的载体中。通过DNA测序确证正确的克隆。
1.2TAR1-5-19cys的表达和纯化
按照生产商的方案将TAR1-5-19cys载体转化入BL21(DE3)pLysS化学感受态细胞(Novagen)中。利用100μg/mL羧苄青霉素和37μg/mL氯霉素选择携带dAb质粒的细胞。将培养物设定于2L的折流烧瓶(baffled flask)中，其包含500mL的terrific broth(Sigma-Aldrich)，100μg/mL羧苄青霉素和37μg/mL氯霉素。将培养物于30℃200rpm生长至O.D.6001-1.5并随后用1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，来自Melford Laboratories)进行诱导。允许dAb的表达于30℃持续12-16小时。发现大多数dAb存在于培养基中。所以，通过离心将细胞从培养基中分离(8,000xg 30分钟)，将上清液用来纯化dAb。向每升上清液中加入30mL Protein L琼脂糖(Affitech)并让dAb搅拌下批次结合2小时。随后在吸出上清液之前，允许树脂在重力下再沉降1小时。随后将琼脂糖装入XK 50柱(Amersham Pharmacia)并用10柱体积的2xPBS进行洗涤。用100mM甘氨酸pH 2.0洗脱结合的dAb并随后通过加入1/5体积的1M Tris pH8.0来中和含有蛋白质的级分。每升培养物上清液分离20-30mg的纯蛋白质，其含有50∶50比例的单体对TAR1-5-19二硫化物二聚体[图7-4]。
1.3利用MAL活化的PEG进行TAR1-5-19cys的PEG化作用
1.3.1单体PEG化作用
可以用单一线性或分枝的PEG-MAL对被工程化改造到VH或VkdAb表面上的半胱氨酸残基进行特异性修饰以给出单体修饰蛋白质。下面显示两种mPEG-MAL形式，其可以用来对单体VH或Vk dAb进行PEG化。所述PEGs的分子量可以是500-60,000(例如，2,000-40,000)大小。
用5mM二硫苏糖醇还原2.5ml的500μM TAR1-5-19cys并置于室温20分钟。随后利用PD-10柱(Amersham Pharmacia)对样品进行缓冲液交换。所述柱已经用5mM EDTA，20mM磷酸钠pH 6.5，10％甘油进行预平衡，并按照生产商的指导应用和洗脱样品。将样品(3.5ml的约360μM dAb)置于冰上待用。称出四倍过量摩尔数的40KPEG-MAL(约200mgs)并在与还原的dAb溶液混合之前溶解于100％甲醇中。将反应置于室温进行3小时。
1.3.2PEG化的TAR1-5-19cys单体的纯化
在此实施例中利用阳离子交换层析纯化Vk dAb，因为所述蛋白质的等电点(pI)是～8.8。如果所述蛋白质的pI是低的，例如4.0，那么将会使用阴离子交换层析。每mL的40K PEG TAR1-5-19cys反应物加入40μL的40％冰醋酸以将pH降至～4。随后将样品应用到1mLResource 5阳离子交换柱(Amersham Pharmacia)，其已经用50mM醋酸钠pH 4.0进行了预平衡。通过在20个柱体积上实施0-500mM的线性氯化钠梯度而将PEG化物质与未修饰的dAb分离开来。利用SDS-PAGE仅对含有PEG化dAb的级分进行鉴定并且随后进行合并，通过加入1/5体积的1M Tris pH 8.0将pH升至8。
1.3.3利用mPEG-MALs进行TA1-5-19cys的多聚体化
通过利用广泛的分叉/分枝的PEGs可以实现dAbs的多聚体化，所述PEGs已经用可以共价附着dAb的多种反应性基团进行修饰[见，例如，图7和10]。已经显示对于多亚基靶如TNF，dAb的多聚体化(成为二聚体、三聚体和四聚体)在其对抗原的活性方面具有显著的提高(见表1)。
以上结构显示可以用于使VH和Vk dAbs多聚体化的mPEG-MAL形式。mPEG分子量大小为500-60,000(例如，2,000-40,000)。利用mPEG(MAL)2或mPEG2(MAL)2生产dAb二聚体；分别利用3或4臂PEGs生产三聚体和四聚体。所示的多臂PEG需要用MAL进行修饰以允许dAbs的附着。
为了产生多聚体化的dAb形式(format)，实验方法与用来产生单体的方法相同，除了PEG-MAL∶dAb的摩尔比根据所用PEG-MAL的形式而变化。例如，为了利用mPEG2-(MAL)2生产TAR1-5-19二聚体[显示于图7-7中]，所用的PEG-MAL∶dAb的摩尔比为0.5∶1。为了纯化PEG化的二聚体，如对于PEG化单体所述的那样再次使用阳离子交换层析，伴随着下列改变。所用的氯化钠梯度为30个柱体积上的0-250mM盐。为了利用3臂PEG-MAL生产TAR1-5-19三聚体[显示于图10-23中]，所用的PEG-MAL∶dAb的摩尔比为0.33∶1。为了纯化PEG化的三聚体，如对于PEG化单体所述的那样再次使用阳离子交换层析，伴随着下列改变。所用的氯化钠梯度为30个柱体积上的0-250mM盐。为了利用4臂PEG-MAL生产TAR1-5-19四聚体[显示于图11-28中]，所用的PEG-MAL∶dAb的摩尔比为0.25∶1。为了纯化PEG化的四聚体，如对于PEG化单体所述的那样再次使用阳离子交换层析，伴随着下列改变。所用的氯化钠梯度为30个柱体积上的0-250mM盐。对于TAR1-5-19PEG三聚体和四聚体，如果需要，利用大小排除层析进一步纯化样品。在加样前用磷酸盐缓冲溶液(PBS)对Superose 6HR柱(Amersham Pharmacia)进行平衡。所述柱以0.5ml/min运行并且通过追踪280nm上的吸光度对蛋白质洗脱液进行监测。利用SDS-PAGE鉴定只含有PEG化dAb的级分并且随后进行合并。
2.0实施例2：VH dAb TAR2-10-27的MAL-PEG化
2.1TAR2-10-27cys的PCR构建
TAR2-10-27将被用作一个例子，将C末端cys工程化改造到VHdAb上。对于Vk dAbs来说，PEG附着位点可以置于dAb表面的其他地方，只要靶向氨基酸是溶剂可接近的并且得到的PEG化蛋白质仍然保持抗原结合。下列寡核苷酸被用来特异性PCR具有SalI和BamHI位点的TAR1-5-19以进行克隆并且也导入C末端半胱氨酸残基。PCR反应条件和克隆如1.1节中所列出的那样进行，唯一的变化是所用的模板是含有TAR2-10-27的质粒DNA。
                                 SalI
       Ala Ser Thr Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
1      GCG TCG ACG GAG GTC CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA
       CGC AGC TGC CTC CAC GTC GAC AAC CTC AGA CCC CCT CCG AAC CAT
       Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
46     CAG CCT GGG GGG TCC CTG CGT CTC TCC TGT GCA GCC TCC GGA TTC
       GTC GGA CCC CCC AGG GAC GCA GAG AGG ACA CGT CGG AGG CCT AAG
       Thr Phe Glu Trp Tyr Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
91     ACC TTT GAG TGG TAT TGG ATG GGT TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG
       TGG AAA CTC ACC ATA ACC TAC CCA ACC CAG GCG GTC CGA GGT CCC
       Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser
136    AAG GGT CTA GAG TGG GTC TCA GCT ATC AGT GGT AGT GGT GGT AGC
       TTC CCA GAT CTC ACC CAG AGT CGA TAG TCA CCA TCA CCA CCA TCG
       Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
181    ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC CGC
       TGT ATG ATG CGT CTG AGG CAC TTC CCG GCC AAG TGG TAG AGG GCG
       Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
226    GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG CGT
       CTG TTA AGG TTC TTG TGC GAC ATA GAC GTT TAC TTG TCG GAC GCA
       Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Lys Leu Gly
271    GCC GAG GAC GCC GCG GTA TAT TAC TGT GCG AAA GTT AAG TTG GGG
       CGG CTC CTG CGG CGC CAT ATA ATG ACA CGC TTT CAA TTC AAC CCC
       Gly Gly Pro Asn Phe Gly Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
316    GGG GGG CCT AAT TTT GGC TAC CGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC
       CCC CCC GGA TTA AAA CCG ATG GCC CCG GTC CCT TGG GAC CAG TGG
                              BamHI
       Val Ser Cys *** *** Gly Ser  (SEQ ID NO：14)
361    GTC TCG TGC TAA TAA GGA TCC  (SEQ ID NO：12)
       CAG AGC ACG ATT ATT CCT AGG  (SEQ ID NO：13)
正向引物(SEQIDNO：15)
5’-AGTGCGTCGACGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCT-3’
反向引物(SEQ ID NO：16)
5’-AAAGGATCCTTATTAGCACGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG-3’
图2.1：TAR2-10-27cys的DNA序列和用来扩增工程化dAb的PCR引物
2.2TAR2-10-27cys的表达和纯化
DOMlh-10-27cys的表达和纯化如在1.2节中所述的那样，但有下列改进。由于dAb是VH，将Streamline Protein A用来纯化来自培养物上清液的蛋白质。还利用100mM甘氨酸pH 3.0而非pH 2.0缓冲液将蛋白质从树脂上洗脱下来。
2.3TAR2-10-27cys的PEG化
TAR2-10-27cys的单体PEG化作用在1.3.1节中列出。如1.3.3节中列出的那样同样可以利用PEG将VH dAbs进行多聚体化。利用阳离子交换层析于pH 4.0进行PEG化的TAR2-10-27cys的纯化(如1.3.2节中列出的那样)，因为所述蛋白质的pI为～8.5。
3.0利用NHS和SPA修饰的mPEG进行VH和Vk dAbs的PEG化
除了利用PEG化作用的位点特异性方法之外，还可以利用更加随机的方法共价修饰蛋白质。这包括使用NHS或SPA修饰的PEGs，其与dAb上的暴露于溶剂的表面赖氨酸残基反应[图6-2]。这具有益处，即dAb不需要任何蛋白质工程化，因为有几个赖氨酸残基已经存在于VH和VkdAbs的表面上。还可以将任何dAb形式进行PEG化，而不用任何提前修饰，例如TAR1-5-19二硫化物二聚体[图7-5，6]或超亲和力二聚体[图8-13，8-14，8-15](见3.3节和5.0节)。对于MAL-PEGs有多种线性/分叉和分枝的SPA和NHS-PEG形式显示如下。
实施例3：Vk dAbTAR1-5-19的NHS和SPA-PEG化作用
3.1TAR1-5-19的PCR构建
TAR1-5-19将被用作Vk dAb的一个例子，其已经利用NHS和SPA-PEGs进行了PEG化。利用下面的以及如1.1节中所列出的引物对TAR1-5-19进行PCR扩增和克隆。
                                   SalI
     Trp Ser Ala Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1    TGG AGG GCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA
     ACC TCG CGC AGC TGC CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT
       Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp
61     GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT GAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG
       CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACC
       Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln
121    TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA
       ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT
       Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
181    AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC
       TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG
       Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro
241    AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT
       TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA
                                   BamHI
       Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg *** *** Gly Ser Gly
301    TTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG TAA TAA GGA TCC GGC
       AAA TGC AAG CCG GTT CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCC ATT ATT CCT AGG CCG
       (SEQ ID NO：19)
       (SEQ ID NO：17)
       (SEQ ID NO：18)
正向引物(SEQ ID NO：20)
5’-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3’
反向引物(SEQ ID NO：21)
5’-AAAGGATCCTTATTACCGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3’
3.2TAR1-5-19的表达和纯化
TAR1-5-19的表达和纯化如1.2节中所列出的那样。唯一的改进是纯化后将蛋白质相对于PBS进行透析或交换缓冲液(PD10)以除去存在的tris/甘氨酸缓冲液。
3.3以NHS或SPA-PEG进行单体和TAR1-5-19二硫化物二聚体的PEG化作用
在PBS缓冲液或50mM磷酸钠pH7.0中进行PEG化反应。将400μM的TAR1-5-19单体与5-10摩尔过量的活化的PEG(溶于100％甲醇中的NHS或SPA)混合。让反应在室温进行2-4小时随后通过加入1M甘氨酸pH 3.0至终浓度20mM进行终止。发现在表达过程中(1.2节)产生的TAR1-5-19二硫化物二聚体也可以利用以上方法进行PEG化。这允许二硫化物二聚体形式被PEG化而不需要用DTT进行还原，随后用PEG2-(MAL)2进行修饰。对所述方案的唯一改进是向dAb二聚体中加入10％的甘油以预防在任何浓缩步骤中的沉淀。
3.4PEG化Vk dAbs的纯化
如1.3.3节中所列出的那样利用阳离子交换层析对单体和二硫化物二聚体PEG化的dAb进行纯化。
实施例4：VH dAb HEL4的NHS和SPA-PEG化作用
4.1HEL4的PCR构建
HEL4将被用作VH dAb的一个例子，其已经利用NHS和SPA-PEGs进行了PEG化。利用下面的引物以及在如1.1节中列出的条件下对HEL4进行PCR扩增和克隆，唯一的改进是模板DNA为含有HEL4DNA序列的质粒载体。
                                         SalI
       Ala Ser Thr Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1      GCG TCG ACG GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC
       CGC AGC TGC CTC CAC GTC GAC AAC CTC AGA CCC CCT CCG AAC CAT GTC GGA CCC CCC AGG
       Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Ile Ser Asp Glu Asp Met Gly Trp Val
61     CTG CGT CTC TCC TGT GCA GCC TCC GGA TTT AGG ATT AGC GAT GAG GAT ATG GGC TGG GTC
       GAC GCA GAG AGG ACA CGT CGG AGG CCT AAA TCC TAA TCG CTA CTC CTA TAC CCG ACC GAG
       Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Tyr Gly Pro Ser Gly Ser
121    CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGT CTA GAG TGG GTA TCA AGC ATT TAT GGC CCT AGC GGT AGC
       GCG GTC CGA GGT CCC TTC CCA GAT CTC ACC CAT AGT TCG TAA ATA CCG GGA TCG CCA TCG
       Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
181    ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC CGT GAC AAT TCC AAG AAC
       TGT ATG ATG CGT CTG AGG CAC TTC CCG GCC AAG TGG TAG AGG GCA CTG TTA AGG TTC TTG
       Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
241    ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG CGT GCC GAG GAC ACC GCG GTA TAT TAT TGC GCG
       TGC GAC ATA GAC GTT TAC TTG TCG GAC GCA CGG CTC CTG TGG CGC CAT ATA ATA ACG CGC
       Ser Ala Leu Glu Pro Leu Ser Glu Pro Leu Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
301    AGT GCT TTG GAG CCG CTT TCG GAG CCC CTG GGC TTT TGG GGT CAG GGA ACC CTG GTC ACC
       TCA CGA AAC CTC GGC GAA AGC CTC GGG GAC CCG AAA ACC CCA GTC CCT TGG GAC CAG TGG
                              BamHI
       Val Ser Ser *** *** Gly Ser
361    GTC TCG AGC TAA TAA GGA TCC
       CAG AGG TCG ATT ATT CCT AGG
       (SEQ ID NO：24)
       (SEQ ID NO：22)
       (SEQ ID NO：23)
正向引物(SEQ ID NO：25)
5’-AGTGCGTCGACGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCT-3’
反向引物(SEQ ID NO：26)
5’-AAAGGATCCTTATTAGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG-3’
4.2HEL4的表达和纯化
如2.2节所列出的那样对VHdAb进行表达和纯化。
4.3HEL4的NHS和SPA PEG化作用
利用NHS和SPA活化的PEGs修饰表面赖氨酸残基的方法如3.3节所描述的那样。对所述方法唯一的改进是通过加入1M Tris缓冲液pH 8.0至终浓度20mM来终止反应。
4.4NHS或SPA PEG化HEL4的纯化
利用阴离子交换层析进行PEG化蛋白质的纯化，因为HEL4的pI是～4。所用的柱是1ml Resource Q柱(Amersham Pharmacia)，其已经用50mM Tris pH 8.0进行平衡。在加载到柱上之前将样品的pH变为8。利用50mM Tris pH8.0中的0-500mM氯化钠线性梯度将PEG化的蛋白质与未修饰的dAb分离开来。
4.5PEG化的HEL4的亲和性结合
生产一种基于HEL4亲和性的树脂(基于抗原，鸡蛋白溶菌酶)来测试PEG化dAb的功能性。按照生产商的说明书将溶菌酶偶联到NETS活化的Sepharose 4B树脂(Amersham Pharmacia)上。随后将PEG化的样品(5μg)与亲和性树脂(100μl)相混合并且使其于室温在PBS中结合30分钟。随后用PBS(3xlml)对树脂进行充分洗涤以除去未结合的蛋白质。随后将亲和性树脂运行于SDS-PAGE上以确定PEG化的HEL4是否已结合到基质上(见8.3节)。
实施例5：利用SPA和NHS活化的PEGs进行超亲和性二聚体的PEG化作用
可以利用(Gly4Ser)n连接体(n＝0-7)对VH和VκdAbs进行多聚体化以形成单一多肽链(例如两个dAbs以给出一个超亲和性二聚体；图8-12)。所以可能形成具有双特异性的同源二聚体(VH1-VH1和VL1-VL1)或异源二聚体(VH1-VH2和VL1-VL2)配对。除了形成二聚体之外，还可以添加额外的dAbs以制成更大的蛋白质如三聚体[图10-27]或四聚体[图11-32]。再一次由于VH和VκdAbs的组合可以用来制成这些更大的形式，有可能制成双特异性分子。例如具有延长的血清半寿期并针对(engage)TNFα的能力的dAbs三聚体；一种具有结合连接到两个TAR1-5-19dAbs上的血清白蛋白的能力的一个dAb，所述两个TAR1-5-19dAbs作为二聚体结合TNF。超亲和性二聚体已经利用NHS和SPA-PEGs进行了PEG化[图8-13，8-14和8-15]，并且被特异性工程化改造来在蛋白质的C末端上接受MAL-PEGs(实施例6a和6b)[图8-16]。在此实施例中用20K-SPA或40K-NHS对超亲和性二聚体TAR1-5-19-二聚体4进行修饰。下面显示超亲和性二聚体TAR1-5-19-二聚体4的DNA序列。
       Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
1      GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC CGT GTC ACC
       CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT CCT CTG GCA CAG TGG
                                         KpnI
       Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
61     ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG TAC CAG CAG AAA CCA
       TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACC ATG GTC GTC TTT GGT
       Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
121    GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA
       CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT TCA CCC CAG GGT AGT
       Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
181    CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT
       GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG TGG TCA GAC GTT GGA
                                        HindII
       Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln
241    GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TTT ACG TTC GGC CAA
       CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA AAA TGC AAG CCG GTT
                                        XhoI
      Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
301   GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGC TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC
      CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCG AGC TCG CCA CCT CCG CCA AGT CCG CCT CCA CCG TCG
                                        SalI
                                       HindII
      Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met
361   GGC GGT GGC GGG TCA GGT GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC GGG TCG ACG GAC ATC CAG ATG
      CCG CCA CCG CCC AGT CCA CCA CCG CCT TCG CCG CCA CCG CCC AGC TGC CTG TAG GTC TAC
      Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
421   ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG
      TGG GTC AGA GGT AGG AGG GAC AGA CGT AGA CAT CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC
                                       KpnI
      Ala Ser Gln Ser Val Lys Glu Phe Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
481   GCA AGT CAG AGC GTT AAG GAG TTT TTA TGG TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT
      CGT TCA GTC TCG CAA TTC CTC AAA AAT ACC ACC ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA
      Lys Leu Leu Ile Tyr Met Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
541   AAG CTC CTG ATC TAT ATG GCA TCC AAT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC
      TTC GAG GAC TAG ATA TAC CGT AGG TTA AAC GTT TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG
      Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
601   AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT
      TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA
                                       HindII
      Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Phe Lys Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
661   ACG TAC TAC TGT CAA CAG AAG TTT AAG CTG CCT CGT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG
      TGC ATG ATG ACA GTT GTC TTC AAA TTC GAC GGA GCA TGC AAG CCG GTT CCC TGG TTC CAC
                                        NotI
      Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu
721   GAA ATC AAA CGG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG GCC GCA GAA CAA AAA CTC
      CTT TAG TTT GCC CGC CGG CGT GTA GTA GTA GTG GTA GTG CCC CGG CGT CTT GTT TTT GAG
      Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
781   ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA
      TAG AGT CTT CTC CTA GAC TTA CCC CGG CGT
      (SEQ ID NO：29)
      (SEQ ID NO：27)
      (SEQ ID NO：28)
5.1超亲和性二聚体TAR1-5-19-二聚体4的表达和纯化
所述二聚体的表达如1.2节中所述的那样，在方案中唯一的改进是将构建体转化入TOP10F′细胞(InVitrogen)中以及以100μg/ml的浓度使用羧苄青霉素。
5.2超亲和性二聚体TAR1-5-19-二聚体4的20K SPA和40K NHSPEG化作用以及纯化
如3.3节所列出的那样用20K SPA PEG或40K NHS PEG将所述二聚体PEG化。20K SPA和40K NHS PEG化的二聚体都如实施例1a1.3.3节中所述的那样通过阳离子交换层析进行纯化。
实施例6a：利用MAL活化的PEGs进行超亲和性二聚体的位点特异性PEG化作用
对于工程化的具有C末端cys的dAbs而言，还可以用类似的方式对超亲和性dAb二聚体进行修饰[图8-16]。再一次cys-二聚体可以用作基本构件来生成更大的多dAb PEG化形式[图8-17，和11-29，11-31]。具有(Gly4Ser)5连接体cys的TAR1-5-19同源二聚体(见图8-16)将被用作一个例子。对于TAR1-5-19cys单体而言，单聚物(即二聚体；图8-16)和二聚物(即四聚体；图8-17)将在表达期间于溶液中产生。超亲和性二聚体TAR1-5-19同源二聚体cys的DNA序列显示于下。
     Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
1    GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC CGT GTC ACC
     CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT CCT CTG GCA CAG TGG
                                      KpnI
     Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
61   ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG TAC CAG CAG AAA CCA
     TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACC ATG GTC GTC TTT GGT
     Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
121  GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA
     CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT TCA CCC CAG GGT AGT
     Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
181  CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT
     GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG TCG TCA GAC GTT GGA
                                     HindII
     Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln
241  GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TTT ACG TTC GGC CAA
     CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA AAA TGC AAG CCG GTT
                                     XhoI
     Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
301  GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGC TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC
     CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCG AGC TCG CCA CCT CCG CCA AGT CCG CCT CCA CCG TCG
                                     SalI
                                     HindII
     Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met
361  GGC GGT GGC GGG TCA GGT GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC GGG TCG ACG GAC ATC CAG ATG
     CCG CCA CCG CCC AGT CCA CCA CCG CCT TCG CCG CCA CCG CCC AGC TGC CTG TAG GTC TAC
     Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
421  ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG
     TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC
                                     KpnI
     Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
481  GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT
     CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACC ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA
     Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
541  AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC
     TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG
     Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
601  AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT
     TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA
                                     HindII
     Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
661  ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG
     TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA AAA TGC AAG CCG GTT CCC TGG TTC CAC
     Glu Ile Lys Arg Cys
721  GAA ATC AAA CGC TGC
     CTT TAG TTT GCG ACG
     (SEQ ID NO：32)
     (SEQ ID NO：30)
     (SEQ ID NO：31)
6.1超亲和性二聚体TAR1-5-19同源二聚体cys的表达和纯化
所述二聚体的表达如1.2节中所述的那样，在方案中唯一的改进是将构建体转化入TOP10F′细胞(InVitrogen)中以及以100μg/ml的浓度使用羧苄青霉素。
6.2用40K PEG2-(MAL)2进行TAR1-5-19同源二聚体cys的二聚体化作用和纯化
用40K PEG2-(MAL)2将TAR1-5-19同源二聚体cys进行PEG化以形成二聚体(即总共具有4个dAbs的2x连接体二聚体；图11-29)。反应和纯化条件如1.3.1节中所述的那样并且如实施例1a中所列出的那样进行改进。
实施例6b：用40K PEG2-(MAL)2进行TAR1-5-19同源二聚体cys的四聚体化作用和纯化
用4臂20K PEG MAL将TAR1-5-19同源二聚体cys进行PEG化以形成二聚体四聚体(即总共具有8个dAbs的4x连接体二聚体；图11-31)).反应和纯化条件如1.3.1节中所述的那样并且如实施例1c中所列出的那样进行改进。
实施例7：低亲和力结合性dAb(VH或Vκ)的多聚体化以生成更高亲和性的形式
TAR1-5将被用作VκdAb的一个例子，其作为单体具有对于TNF相对低的结合亲和力，但是能够改变所述dAb以通过多聚体化作用提高其亲和力。C末端半胱氨酸再次被用来通过4臂20K PEG MAL使得dAb多聚体化。
7.1TAR1-5cys的PCR构建
使用下列寡核苷酸特异性PCR具有SalI和BamHI位点的TAR1-5以进行克隆并且还引入一个C末端半胱氨酸残基。TAR1-5cys的DNA序列和用来扩增工程化改造的dAb的PCR引物显示于下。
                                     SalI
   Trp Ser Ala Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1  TGG AGC GCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA
   ACC TCG CGC AGC TGC CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGG GAC AGA CGT AGA CAT
                                      KpnI
    Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Met Asn Leu Leu Trp
61  GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT TTT ATG AAT TTA TTG TGG
    CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA AAA TAC TTA AAT AAC ACC
                                      KpnI
    Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Val Leu Gln
121 TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AAT GCA TCC GTG TTG CAA
    ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TTA CGT AGG CAC AAC GTT
    Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
181 AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC
    TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG
                                      HindII
    Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro
241 AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT
    TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA
                                      BamHI
    Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Cys *** *** Gly Ser Phe
301 TTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG TGC TAA TAA GGA TCC TTT
    AAA TGC AAG CCG GTT CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCC ACG ATT ATT CCT AGG AAA
    (SEQ ID NO：35)
    (SEQ ID NO：33)
    (SEQ ID NO：34)
正向引物(SEQ ID NO：36)
5’-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3’
反向引物(SEQIDNO：37)
5’-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3’
所用的反应条件如1.1节所述。
7.2TAR1-5cys的表达和纯化
所述dAb的表达和纯化如1.2节中所列出的。再次形成50∶50单体和TAR1-5二硫化物二聚体的混合物。
7.3通过4-臂20K PEG-MAL TAR1-5的PEG化作用和纯化进行的多聚体化作用
PEG化作用和纯化的条件如实施例lc 1.3.3节中所述。细胞毒性测试的结果显示于表1中。
实施例8：体外功能性结合测试：TNF受体测试和细胞测试
8.1PEG化的TAR1-5-19单体和TAR1-5-19cys的测试数据
利用TNF受体结合(RBA)和细胞毒性测试对PEG化的dAb对于人TNFα的亲和性进行测定(总结于表1中)。图1显示来自几个选定的PEG化VκdAbs的RBA测试的结果，由曲线图测定IC50并总结于表1中。可见在RBA中的单体和二聚体的PEG化和未修饰形式之间只有细微的差异。即使是用更大的40K PEG-MAL，IC 50也不受影响。对于40K-NHS观察到细微提高，但这可能归因于PEG化作用位点离CDRs更近，而对于40K-MAL则位于dAb的C末端。这显示PEG化作用对于抗原结合具有无关紧要的作用，只要它被置于远离CDRs处。还可见利用单体dAb的3和4臂PEG化的形式在RBA中具有对于TNF提高的亲和力。图2显示在细胞毒性测试中的相同样品。再一次在PEG化的和非修饰样品之间有少许差异，显示dAb的能力得以保留。最显著的差异是3和4臂PEG样品，其分别显示ND50降低到100和30pM。在细胞测试中对于TAR1-5可见低亲和力结合性单体具有～10μm的ND 50。二聚体化作用后，亲和力降低到～3μM，并且当利用4臂PEG进行四聚体化时，降至200nM的ND 50。所以即使是低亲和性的dAb也可以利用多臂PEG进行多聚体化以生成对于其抗原具有更大亲和力的形式。
8.2对于PEG化的超亲和性二聚体TAR1-5-19二聚体4和TAR1-5-19同源二聚体cys的测试数据
TAR1-5-19二聚体4的SPA和NHS PEG化作用再一次显示随机表面修饰仅仅稍微影响了二聚体的能力(potency)(见表1)。对于TAR1-5-19同源二聚体cys发现将二聚体二聚化形成四聚体保持～3nM的ND 50。当利用4臂MAL-PEG将二聚体进一步多聚化以产生八聚体时，见到ND 50的显著降低，ND 50变为～100pM。
这反映了这样的事实，即RBA测试的敏感性相对高并且具有高亲和性的形式似乎全部是～100pM。
表1：来自基于TAR1-5-19的dAb形式的受体和细胞毒性测试的结果总结
dAb形式   受体测试IC50(nM)   细胞毒性测试ND50(nM)
  未修饰的TAR1-5-19单体20K SPA TAR1-5-19单体40K NHS TAR1-5-19单体20K MAL TAR1-5-19单体40K MAL TAR1-5-19单体   3045453030   7070907080
  未修饰的TAR1-5-19二硫化物二聚体1×20K SPA TAR1-5-19二硫化物二聚体1×40K NHSTAR1-5-19二硫化物二聚体40K PEG2-(MAL2)TAR1-5-19二硫化物二聚体   0.8131   33103
  TAR1-5-19D4超亲和性二聚体   -   10
  20K SPA PEG TAR1-5-19D4超亲和性二聚体   -   30
  40K NHS PEG TAR1-5-19D4超亲和性二聚体   -   25
  TAR1-5-19同源二聚体cys超亲和性二聚体   -   3
  TAR1-5-19同源二聚体cys超亲和性二硫化物二聚体   -   3
  40K PEG2-(MAL)2TAR1-5-19同源二聚体cys超亲和性   -   3
dAb形式   受体测试IC50(nM)   细胞毒性测试ND50(nM)
  4臂PEG-MAL TAR1-5-19同源二聚体cys超亲和性二聚体四聚体(5K每臂)   - 0.1
  3臂PEG-MAL TAR1-5-19三聚体(5K每臂)   0.2   0.1
  4臂PEG-MAL TAR1-5-19四聚体(5K每臂)   0.1   0.03
  4臂PEG-MAL TAR1-5-19四聚体(10K每臂)   -   0.02
  TAR1-5单体   -   10,000
  TAR1-5二硫化物二聚体   -   3000
  4臂PEG-MAL TAR1-5四聚体(5K每臂)   -   200
8.3PEG化的HEL4结合溶菌酶亲和性基质
对各种PEG化的HEL4形式进行试验来看它们在被修饰后是否保留结合抗原的能力。图3显示结合测试的结果。具体地，SDS PAGE凝胶显示亲和性结合溶菌酶，泳道如下：1，4，7，10，13，16和19显示批次结合30分钟后保留在上清液中的蛋白质；泳道2，5，8，11，14，17和20显示可以在PBS洗涤步骤中洗脱的蛋白质；而泳道3，6，9，12，15，18和21显示结合到溶菌酶亲和性树脂上的蛋白质。
由凝胶可以清楚地看到PEG化的蛋白质被有效地从上清液中去除并且保持结合树指，即使是在用PBS洗涤几次之后。因而显示PEG化的dAb保持对于其抗原的特异性，不管是用THIOL或MAL-PEG进行特异性PEG化，或是通过利用SPA或NHS-PEGs的表面赖氨酸残基。
8.4TAR2-1O-27的PEG化作用
可以利用TNF受体结合测试来确定TAR2-1O-27的结合能力。在测试中未修饰的单体具有～3nM的IC50，这可由图4中看出。40K PEG化的单体具有～20nM的IC 50。
实施例9：与VH和Vk PEG化dAbs的血清体内半寿期相关的流体动力学大小
已用蛋白质的PEG化作用提高它们的体内血清半寿期。肾过滤截止大小是大约70kDa，这意味着对于具有未修饰dAb的大小(VH～13-14kDa和Vk～12kDa)的蛋白质来说，血清半寿期将会相对低(～10-30分钟的t1/2β)。对于dAbs的PEG化作用所进行的工作显示dAb(VH或Vk)的血清半寿期能够通过所用PEG的大小和分枝性质进行调节。这具有重要的应用，例如在需要数十小时(例如＞30小时)的延长的半寿期的药物治疗中；而如果要对dAb进行标记并用作诊断目的的体内成像试剂则需要几小时(3-6小时)的显著更短的驻留时间。
我们已经显示两种参数在确定PEG化的dAbs的血清半寿期中发挥重要作用。第一种是PEG附着的性质和大小，即如果所用的聚合物在性质上单纯地是线性链或分枝的/分叉的。第二种是dAb在最终形式上的定位以及所述分子具有多少″游离的″未修饰PEG臂。如由大小排除层析法所评估的，PEG化形式得到的流体动力学大小反映了所述分子的血清半寿期。因而PEG化分子的流体动力学大小越大则血清半寿期越大，如表2中所示。
用来确定各种PEG化蛋白质的流体动力学大小的凝胶过滤基质是基于高度交联的琼脂糖的。对于球状蛋白质的两个柱的级分范围是：Superose 12HR1000-3x105Mr和Superose 6HR 5000-5x106Mr。球状蛋白质大小排除限制对于Superose 12为～2x106而对于Superose 6HR为～4x107。
表2
  形式   PEG的大小线性/分枝   估计的大小(kDa)<sup>a</sup>   流体动力学大小(kDa)<sup>b</sup>   体内血清半寿期(t<sub>1/2</sub>β小时)
  Vk dAbs
  TAR1-5-19单体   na   12   14   0.5
  TAR1-5-19二硫化物二聚体   na   24   30   2.5
  TAR1-5-19二硫化物二聚体20K PEG-SPA   20K线性   60   280<sup>c</sup>   16
  TAR1-5-19Pc融合   na   80   na   ＞24
  TAR1-5-19单体40K PEG-MAL   40K分枝的(2×20K)   95   550<sup>c</sup>   ＞36
  TAR1-5-19二聚体40K PEG   40K分枝的(2×20K)   110   580<sup>c</sup>   ～51.6
  形式   PEG的大小线性/分枝   估计的大小(kDa)<sup>a</sup>   流体动力学大小(kDa)<sup>b</sup>   体内血清半寿期(t<sub>1/2</sub>β小时)
  TAR1-5-19三聚体PEG-MAL   15K 3臂分枝的(3×5K)   52   130<sup>c</sup>   na
  TAR1-5-19四聚体PEG-MAL   20K 4臂分枝的(4×5K)   90   150<sup>c</sup>   ～12.7
  VH dAbs
  HEL4   na   14   16   na
  HEL45K PEG-MAL   5K线性   24   70   na
  HEL420KPEG-MAL   20K线性   55   275   na
  HEL430KPEG-THIOL   30K线性   84   310   na
  HEL440KPEG-NHS   40K分枝的(2×20K)   95   544   na
注：a通过SDS-PAGE确定的估计大小。b通过Superose 12HR(Amersham Pharmacia)大小排除层析法确定的流体动力学大小。c对大小的评估。
因而，由表2可见即使TARI-5-19的4臂PEG形式由20K的PEG组成并且其分子量比20K SPA TAR1-5-19二硫化物二聚体的分子量更大(95kDa比60kDa)，鉴于肾截止为70kDa，它们具有相似的半寿期。这可能归因于这样的事实，即在4臂形式中dAbs连接于每个PEG分子的末端并且因而整体上分子更加紧凑(更小的流体动力学大小)；即与只具有单一线性20K链的形式相比在这种形式中分子的核心上有极高密度的PEG。与二聚体分子相比使用4臂形式的益处是对TNF的亲和性显著提高(分别是30pM比3nM)。因而在某些需要高亲和性结合物但具有短的血清半寿期的应用中，通过变化存在的dAbs的数目以及所用PEG的大小，分子可以被设计为具有两种所需的特性。
实施例10：PEG化dAbs的蛋白酶稳定性
PEG化dAbs的另一个关键特征是它们对于蛋白酶作用的提高的稳定性。依赖于测试条件，dAbs在本质上对于蛋白酶的作用是相对稳定的。例如TAR1-5-19即使在存在5M尿素的情况下也不被胰蛋白酶降解。这是因为TAR1-5-19在存在变性剂的情况下并不解折叠，而它在pH 2则被胃蛋白酶完全降解，因为所述蛋白质在酸性条件下被解折叠。PEG化作用具有这样的益处，即聚合物链极可能覆盖dAb的表面，因而阻止蛋白酶接近多肽主链并将它剪切。即使在蛋白质于低pH上被部分变性时，PEG在dAb上的存在也显著地提高了其对于胃蛋白作用的耐受性(图5)。
图5显示TAR1-5-19和其它PEG化变异体的胃蛋白酶降解结果。反应于pH 2.0，37℃在存在250μg胃蛋白酶的情况下进行高达30分钟。泳道标号如下：1：分子量梯度；2：单体(0分钟)；3：单体(15分钟)；4：单体(30分钟)；5：40K MAL2二聚体(0分钟)；6：40K MAL2二聚体(15分钟)；7：40K MAL2二聚体(30分钟)；8：20K MAL单体(0分钟)；9：20K MAL单体(15分钟)；10：20K MAL单体。凝胶显示未修饰的dAb于低pH被极快地降解。图5也显示存在于dAb表面上的PEG类型也可以对于其对蛋白酶作用的耐受性具有显著作用。线性20K PEG确实在某种程度上保护dAb，但即使在30分钟后还观察到一些降解(在3kDa的带上，由凝胶估计-15-20％的降解)。而对于40K PEG MAL2二聚体，即使在30分钟后也只见到极少的降解(由凝胶至多＜5％降解)。这最可能归因为2x20K形式的PEG，它提供对于胃蛋白酶作用的更大保护。这提示PEG化的dAb将耐受人消化道中所发现的广泛蛋白酶的作用并且还可以经过胃的低pH环境而保持功能性。所以PEG化的dAb可以作为治疗性药物口服给药而无需复杂的配剂以避免降解或功能性的丧失。PEG化的dAb提供相对其它形式的明显益处，所述其它形式如IgG，scFv或Fabs，其可能在消化过程中于极端pHs下更易受蛋白酶的作用和更易变性(因而可能丧失功能性)
实施例11：利用NHS或SPA活化的PEGs进行VH或Vk dAbs的位点特异性PEG化作用
由于几个赖氨酸残基存在于dAb(VH或Vk)表面上，试图将单一NHS/SPA-PEG偶联到蛋白质上是相对低效的，因为只使用低比率的PEGs:dAb。尽管可以产生单一PEG化的种类，通常只有～10-20％之间的总蛋白将会被PEG化。提高活化的PEG的比率一定会导致过度PEG化作用。这可能导致抗原结合的丧失，因为CDRs被PEG所遮蔽。该问题的一个解决方法是用也存在于其它人抗体框架中的氨基酸取代这些表面赖氨酸。例如，VkI(DPK9)在框架2中具有3个赖氨酸残基。可以将这些残基改变为在VkII(DPK18)中发现的残基(精氨酸和谷氨酰胺残基)。用另一种已在人框架中发现的残基来取代所述残基也会减弱免疫原性的可能效应。Vk dAbs还具有一个C末端赖氨酸残基，其将被保留以进行位点特异性PEG化作用。对于VH dAbs也将进行特异性赖氨酸工程化改造。同样地，可以将表面赖氨酸取代为在其它相应人VH框架中发现的残基，但在此情况下C末端的丝氨酸还需要取代为赖氨酸。随后这将允许单个赖氨酸位点特异性工程化改造入dAb(用已经用半胱氨酸进行的相同方式)。唯一的要求是所述赖氨酸需要是溶剂可接近的并被这样放置，使得PEG化作用后它不会显著减弱对抗原的结合。
实施例12：鉴定在VH和Vk dAb上的潜在PEG化作用位点
为了将半胱氨酸残基特异性工程化改造入VH或Vk dAbs的框架中以进行PEG化作用，必须考虑几种因素。它们包括：
·导入残基的溶剂可接近性，其需要它被放置在蛋白质的表面上
·导入位点与CDR′s的接近性，以及在PEG化作用后这将如何影响抗原结合
·天然有利相互作用(如氢键)的破坏，其在取代为半胱氨酸后可以使蛋白质去稳定或影响折叠途径，从而使得到的dAb不能有效表达。
所以为了研究表面半胱氨酸最合适的位点，进行了蛋白质表达、PEG化作用和亲和性结合分析的直接比较。这将确定一个C末端位置上的半胱氨酸残基(Serl20cys)是否确实比内部的蛋白质表达偶联位点更好，同时保持抗原亲和性。
利用Swiss PDB Viewer计算表面氨基酸残基的溶剂可接近性，由此鉴定在半胱氨酸残基上进行工程化设计的潜在位点。还由于这些残基距离CDRS的距离而选择它们。将大的PEG分子导入靠近CDRs处将肯定会对抗原结合具有影响。表3显示利用HEL4和Vk dummy(下面显示的序列)的结构鉴定的最合适位点。可以看到PEG化作用的潜在位点一起聚类到dAb表面上的区域中。所以在每组中(除了V组)只选择一个突变体进行表达(以粗体显示)。这些位点最有可能能够容纳工程化设计的半胱氨酸残基而不会显著丧失抗原结合。
表3：利用HEL4晶体结构坐标以及Vk dummy的模型结构鉴定位点。所用的氨基酸编号反映了每种dAb的一级氨基酸序列(显示如下)。
 dAb   鉴定的适于工程改造的氨基酸残基
 VH组I组II组III组IV组V Gln-13，Pro-14，Gly-15Pro-41，Gly-42，Lys-43Asp-62，Lys-65Arg-87，Ala-88，Glu-89Gln-112，Leu-115，Thr-117，Ser-119，Ser-120
 Vk组I组II组III组IV组V Val-15，Pro-40，Gly-41Ser-56，Gly-57，Ser-60Pro-80，Glu-81Gln-100，Lys-107，Arg-108
VH dAb HEL4的一级氨基酸序列(SEQ ID NO：5)
1    EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFRIS DEDMGWVRQA PGKGLEWVSS
51   IYGPSGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASAL
101  EPLSEPLGFW GQGTLVTVSS
Vk dummy的一级氨基酸序列(SEQ ID NO：6)
1    DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA
51   ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPNTFGQ
101  GTKVEIKR
12.1TAR2-10-27的Quick-change诱变以导入表面半胱氨酸进行位点特异性PEG化作用
利用Quick-change诱变(Stratagene)以单个半胱氨酸取代表面残基以便进行位点特异性PEG化作用。利用野生型TAR2-10-27DNA作为模板以及适合的引物对(表4)，按照生产商的方案实施Quick-change诱变。通过DNA测序鉴定阳性克隆，并如2.2节中所述的那样对每个突变体dAb进行表达和纯化。如2.3节中所述的那样对格式化的(formatted)蛋白质实施PEG化作用和纯化。
表4：用来进行TAR2-10-27的Quick-change诱变的寡核苷酸对
  点突变  SEQIDNO   寡核苷酸序列5’至3’
  Gln13cys正向引物反向引物 3839 TCTGGGGGAGGCTTGGTATGCCCTGGGGGGTCCCTGCGTACGCAGGGACCCCCCAGGGCATACCAAGCCTCCCCCAGA
  Pro41cys正向引物反向引物 4041 ATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTTGCGGGAAGGGTCTAGAGTGGCCACTCTAGACCCTTCCCGCAAGCCTGGCGGACCCAACCCAT
  Asp62cys正向引物反向引物 4243 GGTAGCACATACTACGCATGCTCCGTGAAGGGCCGGTTCGAACCGGCCCTTCACGGAGCATGCGTAGTATGTGCTACC
  Glu89cys正向引物反向引物 4445 ATGAACAGCCTGCGTGCCTGCGACGCCGCGGTATATTACGTAATATACCGCGGCGTCGCAGGCACGCAGGCTGTTCAT
  Gln112cys正向引物反向引物 4647 CCTAATTTTGGCTACCGGGGCTGCGGAACCCTGGTCACCGTCGACGGTGACCAGGGTTCCGCAGCCCCGGTAGCCAAAATTAGG
  Leu115cys正向引物反向引物 4849 GGCTACCGGGGCCAGGGAACCTGCGTCACCGTCTCGAGCTAATTAGCTCGAGACGGTGACGCAGGTTCCCTGGCCCCGGTAGCC
  Thr117cys正向引物反向引物 5051 CGGGGCCAGGGAACCCTGGTCTGCGTCTCGAGCTAATAAGGATCCTTATTAGCTCGAGACGCAGACCAGGGTTCCCTGGCCCCG
对每一种TAR2-10-27cys突变体进行表达和纯化并将蛋白质的最终产量显示于表5中。
表5：TAR2-10-27的表面cys突变体的最终纯化产量
由表5可见每种突变体dAb的表达水平确实依赖于半胱氨酸在蛋白质表面上的位置而显著变化。例如，突变体Leu115cys具有比Serl20cys～5.3倍大的表达水平。所以PEG化作用位点的位置可以对体内表达水平有显著的影响。为了了解PEG化作用位点的位置是否影响了dAb对其抗原的亲和性，用30K-MAL PEG对每种突变体进行PEG化并通过离子交换层析进行纯化。作为对照，每种突变体都具有用N-乙基顺丁烯二酰亚胺封闭的表面半胱氨酸以产生单体蛋白质。将所有蛋白质进行DOM1受体结合分析(RBA)以及MRC-5细胞分析并将结合显示于表6中。
表6：TAR210-27cys表面突变体的RBA和细胞分析数据总结。
利用N-乙基顺丁烯二酰亚胺生成封闭的蛋白质
  TAR2-10-27突变体   受体分析   MRC5细胞分析
  IC50(nM)   ND50(nM)
  TAR2-10-27突变体   受体分析   MRC5细胞分析
  野生型TAR2-10-27Gln13cys封闭的Pro41cys封闭的Asp62cys封闭的Glu89cys封闭的Gln112cys封闭的Leu115cys封闭的Thr117cys封闭的Ser120cys封闭的Gln13cys 30K MAL PEGPro41cys 30K MAL PEGAsp62cys 30K MAL PEGGlu89cys 30K MAL PEGGln112cys 30K MAL PEGLeu115cys 30K MAL PEGThr117cys 30K MAL PEGSer120cys 30K MAL PEG   321153233388＞300201510810   30304543070153030302002001000100650300700600
显而易见PEG化作用位点的定位确实对于dAb对其抗原的亲和性具有显著影响。PEG化作用的最佳位点好象是在位置Gln13，Pro41或Leu115(～200-300nM的ND 50)。与Serl20cys上的直接C末端PEG化作用(600nM的ND 50)相比，所有这些构建体似乎都保持了对抗原的相对高的亲和性。所以选择内部PEG化作用位点而非C末端位点可以更加有利，这是基于(i)蛋白质表达显著更高和(ii)抗原结合更少受影响。
实施例13：流体动力学大小与VH和Vk PEG化dAbs的血清体内半寿期的相关性
利用凝胶过滤层析确定各种PEG化VH和VL dAbs的天然分子量。利用AKTA 100系统(Amersham Biosciences)以5柱体积的PBS平衡Superose 6HR柱(Amersham Biosciences)。按照生产商的说明书，利用高和低分子量蛋白质标定试剂盒(Amersham Biosciences)对柱进行标定。以0.5ml/min的流速将100μl的PEG化蛋白质(1.5mg/ml)应用到柱上。通过追踪280nm上的吸光度确定蛋白质的洗脱体积。对每种PEG化的dAb重复该步骤以确定它们各自的洗脱体积。通过将分子量的对数对Kav绘图而生成柱的标定曲线，其中Kav为：
Kav＝(Ve-V0)/(Vt-V0)
Ve＝蛋白质的洗脱体积(ml)
V0＝空隙体积(蓝色葡聚糖洗脱体积[7.7ml])
Vt＝总柱体积(丙酮洗脱体积22ml)
通过将洗脱体积转变为Kav来确定每种PEG化的dAb的天然分子量。利用Kav’s对分子量标准的对数的标定曲线图推断PEG化蛋白质的质量。
由凝胶过滤柱的标定曲线，对各种PEG化dAbs的估计大小进行评估并显示于表7中。所有形式的体内血清半寿期也在小鼠中进行测定。
表7：Vk dAbs的流体动力学大小和体内血清半寿期的评估。注：a通过SDS-PAGE确定的估计大小。b通过Superose 6HR(AmershamBiosciences)大小排除层析确定的流体动力学大小。
  Vk dAb的形式   PEG的大小线性/分枝   估计的大小(kDa)<sup>a</sup>   流体动力学大小(kDa)<sup>b</sup>   体内血清半寿期(t<sub>1/2</sub>β小时)
  TAR1-5-19单体   na   12   19.5   0.5
  TAR1-5-19二硫化物二聚体   na   24   22   1.2
  TAR1-5-19Fc融合   na   80   na   ＞24
  TAR1-5-19单体30KPEG-MAL   30K线性   70   1100   38.5
  TAR1-5-19单体40KPEG-MAL   40K分枝的(2×20K)   95   1700   ＞36
  TAR1-5-19二聚体40KPEG   40K分枝的(2×20K)   110   1990   39.5
  TAR1-5-19四聚体PEG-MAL   20K 4臂分枝的(4×5K)   90   200   12.7
  TAR1-5-19四聚体PEG-MAL   40K 4臂分枝的(4×10K)   ＞110   570   26.4
由表7可以清楚地看到dAb的流体动力学大小可以通过加入pEG而得以显著提高。另外，不仅PEG的大小，而且聚合物的结构也能够很大地影响流体动力学大小。例如，2x20K和4x10K具有相同的PEG含量，但2x20K的流体动力学大小是4x10K的3倍。这能够归因于这样的事实，即4x10K形式中的PEG比2x20K PEG在分子核心处更加密集地装配，因而显著地减小了它的流体动力学大小。蛋白质的天然流体动力学质量与体内血清半寿期之间有关系，这也是显而易见的(见图15)。因而可以将凝胶过滤层析确定的流体动力学大小用来给出估计的血清半寿期。不管用来修饰dAb的PEG的形式和大小(即线性的对分枝的)如何，可以看到流体动力学大小比用来修饰蛋白质的聚合物的总质量是更好的血清半寿期指征。
因而利用图15可以将凝胶过滤层析确定的流体动力学大小用来给出估计的血清半寿期。
实施例14：PEG化dAbs的蛋白酶稳定性
通过ELISA追踪抗原结合研究未修饰的和PEG化蛋白质的蛋白酶稳定性。由于ELISA中PEG化蛋白质所生成的更低信号，必须使用显著更高浓度的dAb。用250μg/ml的蛋白酶对0.4μM(5μg/ml)单体和25μM(300μg/ml)40K PEG化TAR1-5-19进行消化，对所有蛋白酶来说消化都在100μl的最终体积中进行。所用的蛋白酶是猪胃蛋白酶、牛粗制粘膜层肽酶、猪胰弹性蛋白酶、粗制牛胰蛋白酶(I型)和大鼠肠粉(Sigma)。所有的消化都在50mM Tris缓冲液pH 8.0中进行，除了胃蛋白酶在20mM HCl pH 2中进行。每次消化都在37℃温育30分钟并且随后通过加入10μl完全蛋白酶抑制剂的10x母液(Roche)来终止反应。随后将样品置于冰上待用。将已经预先用1μg/ml的PBS中的TNF于4℃涂布过夜的Maxisorb板，以2％PBS中的Tween-20(2％TPBS)于室温封闭一小时。利用2％TPBS将20μl每种蛋白酶试验样品稀释到200μl。随后将样品转移到抗原涂布的板上并于室温温育一小时。随后在加入100μl/孔的Protein L-HRP溶液(Sigma)(在2％TPBS中稀释1∶2000)之前用0.1％TPBS洗涤板并温育一小时。在对板进行显影之前用0.1％TPBS再次洗涤板并且随后用PBS溶液进行洗涤。在加入100μl的1M HCl以终止反应之前，加入100μl的TMB溶液/孔并让其显影。通过利用Versamax plate-reader(Molecular devices)测量450nm上的吸光度来间接确定存在的结合dAb水平。由相对于无蛋白酶对照的A450nm测量确定蛋白酶处理后剩余功能蛋白的百分比。
将单体和40K PEG TAR1-5-19相对于各种蛋白酶的蛋白酶稳定性显示于图16中。可以看到甚至未修饰的单体dAb也确实显示了一定程度的蛋白酶耐受性，对于肽酶、弹性蛋白酶和大鼠肠粉只显示～50-70％抗原结合的丧失，对于CBP显示90％的丧失，而对于胃蛋白酶和CBP则显示活性完全丧失。所述蛋白酶耐受性可能归因于dAb的紧凑蛋白质折叠，其可能进而减弱蛋白酶接近肽主链的能力。当与未修饰的dAb相比时，40K PEG化TAR1-5-19确实显示了更大程度的对全部蛋白酶的稳定性，除了胃蛋白之外。提高的稳定性可能归因于用这种大的可动聚合物对dAb的表面修饰。表面PEG可以″包被″蛋白质，防止蛋白酶结合并剪切肽主链，因而增强了dAbs对这些酶的稳定性。
两种形式对胃蛋白酶都完全降解的原因可能归因于测试期间dAbs所暴露到的低pH变性条件。较低的pH将会引起蛋白质解折叠，这将允许对肽主链的更大接近以便进行胃蛋白酶的剪切。
实施例15：利用Biacore进行PEG化TAR2-10-27的kd和Ka速率分析
利用Biacore研究PEG化作用对于TAR2-10-27对其抗原的结合亲和力的影响。利用TAR2-10-27cys生成全部PEG化形式(见实施例2)。利用下列方法确定每种PEG化的dAb形式对抗原的结合和解离速率。将生物素化的人TNFRI(大约1生物素每分子)以大约400RU的密度涂布到Biacore链霉抗生物素感应器芯片的单个流式细胞(flow cell)上。对TNFRI涂布的流式细胞和未涂布的流式细胞(链霉抗生物素)顺序注射(以30μl/ml的流速的45μl注射液)系列浓度的每种dAb或PEG化的dAb(2.6μM，770nM，260nM，77nM和2.6nM)(通过由TNFRI流式细胞曲线减去未涂布的流式细胞曲线生成减性曲线)。在注射每种样品之后分析解离速率5分钟，其后通过注射l0mM甘氨酸pH 3再生表面。
利用曲线适配软件(Biaevaluation 3.2)对产生自Biacore的数据进行适配并测定缔合常数(ka)和解离常数(kd)(表8)。
表8：各种PEG化形式的TAR2-10-27的结合和解离速率分析。利用N-乙基顺丁烯二酰亚胺生成封闭的TAR2-10-27
  形式   k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>S<sup>-1</sup>)   k<sub>d</sub>(S<sup>-1</sup>)   K<sub>D</sub>(来自平均k<sub>d</sub>/K<sub>a</sub>)(M)
TAR210-27   1.60E+06 8.52E-03 5.33E-09
TAR210-27封闭的   5.77E+05 5.96E-03 1.03E-08
TAR210-275K MAL PEG   9.00E+04 0.011 1.22E-07
  TAR210-272x10K MALPEG   1.20E+05 9.54E-03 7.95E-08
TAR210-2720K MAL PEG   7.99E+04 0.012 1.50E-07
TAR210-2730K MAL PEG   8.34E+04 7.69E-03 9.22E-08
  TAR210-272x20K MAL   7.47E+0   5.17E-03   6.92E-08
  PEG   4
由表8可见随着PEG链大小提高kD降低。这种kD的变化主要归因于随着PEG大小的提高，ka降低，而kd保持相对不变。
实施例16：PEG化的TARl-5-19在关节炎预防性模型中的效力研究
Tgl97小鼠对于人TNF-球蛋白杂交基因是转基因的并且杂合子在4-7周龄时发展成慢性进行性多关节炎，具有与类风湿性关节炎的共同组织学特征[Keffer，J.，Probert，L.，Cazlaris，H.，Georgopoulos，S.，Kaslaris，E.，Kioussis，D.，Kollias，G.(1991).Transgenic mice expressinghuman tumor necrosis factor：a predictive genetic model of arthritis.EMBO J.，Vol.10，pp.4025-4031。]
为了测试PEG化的dAb(PEG形式为具有2个dAb附着位点的2×20K分枝的[即40K mPEG2MAL2]，dAb为TARl-5-19cys)在Tgl97模型中预防关节炎的效力，将杂合性转基因小鼠分成10只动物的若干小组，具有相等数目的雄性和雌性。在3周龄时开始进行处理，每周一次腹膜内注射试验项目。TAR1-5-19cys单体的表达和PEG化作用列出在1.3.3节中，实施例1。所有的蛋白质制品都在磷酸盐缓冲溶液中并被测试内毒素的可接受水平。
实验是在不知情的情况下(blind)进行的。每周对动物称重并根据下列体系对关节炎的大表型性(macrophenotypic)症侯进行打分：0＝无关节炎(正常外观和弯曲)，1＝轻度关节炎(关节变形)，2＝中度关节炎(肿胀，关节畸形)，3＝重度关节炎(运动严重受损)。
研究结果清楚地表明10mg/kg PEG化的TARI-5-19抑制了关节炎的发展，生理盐水对照组和治疗组的关节炎评分之间有显著差异。lmg/kg剂量的PEG化TAR1-5-19也产生统计学意义上比盐水对照组显著更低的中位数关节炎分值(P＜0.05％，利用Wilcoxon Test的正常近似(normal approximation))。
实施例18：在关节炎治疗性模型中PEG化TAR1-5-19的效力研究
为了测试在Tgl97模型的关节炎治疗性模型中PEG化dAb的效力，将杂合性转基因小鼠分成10只动物的若干小组，具有相等数目的雄性和雌性。在6周龄当动物具有明显的关节炎表型时开始进行处理。每周两次以腹膜内注射试验项目来进行处理。样品制品和疾病评分如上在实施例17中所述的那样。
关节炎评分清楚地表明PEG化的TAR1-5-19在治疗性模型中抑制关节炎的进展。4.6mg/kg剂量的PEG化TAR1-5-19在第9周产生统计学意义上比盐水对照组显著更低的中位数关节炎分值(P＜0.01％，利用Wilcoxon Test的正常近似)。
实施例19：在缓释形式中的dAb效力
为了测试来自缓释形式的dAb的效力，将具有小PEG分子的dAb(其中PEG是4x5k，具有四个dAb附着位点，带有C末端cys残基，dAb为TAR1-5-19[即20K PEG 4臂MAL])加样入0.2ml渗透泵中。所述泵具有在4周内0.2ml的释放速率，在如上所述的治疗性Tgl97模型中于第六周将其皮下移植入小鼠中。当与用加载了盐水的泵移植的动物相比时，这些动物的关节炎评分以明显更慢的速率提高。这表明当由缓释形式递送时dAbs是有效的。
实施例20：利用TCEP作为还原剂进行VH和VL dAbs的PEG化作用
实施例1.3中所列出的方法在MAL PEG化作用之前使用二硫苏糖醇(DTT)还原dAb上的表面巯基。这种方法确实需要在PEG化作用之前通过凝胶过滤或透析去除还原剂，因为DTT将会与顺丁烯二酰亚胺-PEG快速反应，甚至是在低pH上，阻止聚合物-dAb缀合物的形成。另一种方法是使用诸如TCEP的还原剂。由于其还原电势，TCEP可以在更低的浓度下使用，并且还相对较慢地与游离的顺丁烯二酰亚胺反应，优先还原巯基。因而存在于dAb上的表面巯基可以用直接加入到反应混合物中的TCEP和MAL-PEG进行还原。不必在PEG化作用之前通过凝胶过滤去除TCEP。还有可能进行TCEP还原的重复循环，接着加入MAL-PEG，以便显著提高PEG化dAb的产量。
实施例21：VH和VL dAbs的N末端PEG化作用
另一种VH和VL dAbs的PEG化作用的方法是通过N末端PEG化作用。这能够以两种方式实现，第一种利用PEG-醛，其在适当的反应条件下可以用来选择性修饰蛋白质的N末端胺基。由于这样一种事实，即N末端胺基具有相对低的～6.5的pKa，这能够得以实现。第二，可以在蛋白质的N末端对半胱氨酸残基进行工程化以利用MAL-PEG进行位点特异性PEG化作用。同样，在偶联到所需大小的MAL-PEG上之前，将利用TCEP或DTT(见实施例1.3)把蛋白质还原。

Claims (33)

1.含有一个或两个抗体单一可变结构域的PEG连接的多肽，其中每个可变结构域都具有框架区和抗原结合位点，并且每个可变结构域都作为所述多肽中的单一抗体可变结构域结合抗原，其中所述多肽具有至少200kDa的流体动力学大小，其是通过将一个或多个PEG分子连接到至少一个所述抗体单一可变结构域框架区中的氨基酸上而获得的，所述一个或多个PEG分子具有20-60kDa的总PEG大小。
2.根据权利要求1的PEG连接的多肽，含有抗体单一可变结构域的多聚体。
3.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其中所述每个可变结构域都含有通用框架。
4.根据权利要求3的PEG连接的多肽，其中每个可变结构域都包含选自DP47，DP45和DP38的VH框架；或者VL框架为DPK9。
5.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其中所述多肽具有对于TNFα的特异性。
6.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其中所述PEG在所述单一抗体可变结构域的半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于所述抗体单一可变结构域。
7.根据权利要求6的PEG连接的多肽，其中所述半胱氨酸或赖氨酸残基存在于所述抗体单一可变结构域的C末端或N末端上。
8.根据权利要求6的PEG连接的多肽，其中所述PEG在半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于所述抗体单一可变结构域，所述半胱氨酸或赖氨酸残基存在于所述单一抗体可变结构域的C末端或N末端以外的位置上。
9.根据权利要求6的PEG连接的多肽，其中所述PEG在半胱氨酸或赖氨酸残基上连接于所述抗体单一可变结构域，所述半胱氨酸或赖氨酸残基距离C末端和/或N末端至少两个残基。
10.根据权利要求6的PEG连接的多肽，其中所述PEG连接于重链可变结构域，所述重链可变结构域包含在选自Gln13、Pro41或Leu115的位置上取代的半胱氨酸或赖氨酸残基。
11.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其中所述多肽具有在1.3至170小时之间的体内半寿期。
12.根据权利要求2的PEG连接的多肽，其中所述多聚体是抗体单一可变结构域的二聚体、三聚体或四聚体。
13.根据权利要求2的PEG连接的多肽，其含有抗体单一可变结构域的同源多聚体。
14.根据权利要求13的PEG连接的多肽，其中所述同源多聚体只包含第一和第二抗体单一可变结构域，其中所述同源二聚体的所述第一抗体单一可变结构域包含抗体单一可变结构域和重链恒定区CH1，并且其中所述同源二聚体的第二抗体单一可变结构域包含抗体单一可变结构域和轻链恒定区CL。
15.根据权利要求2的PEG连接的多肽，其包含抗体单一可变结构域的异源多聚体。
16.根据权利要求15的PEG连接的多肽，其中所述异源多聚体只包含第一和第二抗体单一可变结构域，其中所述异源多聚体的所述第一抗体单一可变结构域包含抗体单一可变结构域和重链恒定区CH1，并且其中所述异源多聚体的所述第二抗体单一可变结构域包含抗体单一可变结构域和轻链恒定区CL。
17.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其中所述PEG分子包含分枝的PEG。
18.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其以80nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
19.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其以3nM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
20.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其以100pM-30pM的Kd特异性结合靶抗原。
21.根据权利要求1的PEG连接的多肽，如通过表面等离子共振所测定的，其以50nM-20pM的解离常数Kd，和5x10-1-1x10-7S-1的Koff速率常数从人TNFα上解离。
22.根据权利要求21的PEG连接的多肽，其中所述结合被测量为所述PEG连接的多肽在标准的细胞分析中中和人TNFα或TNF受体1的能力。
23.根据权利要求22的PEG连接的多肽，其中所述PEG连接的多肽在标准的细胞分析中以500nM-50pM的ND50中和人TNFα或TNF受体1。
24.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其中所述PEG以PEG连接的N-羟基琥珀酰亚胺活性酯的形式连接于溶剂可接近的赖氨酸上。
25.根据权利要求24的PEG连接的多肽，其中所述N-羟基琥珀酰亚胺活性酯选自
PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS；PEG-O-CH2-NHS；PEG-O-CH2CH2-NHS；PEG-S-CH2CH2-CO-NHS；PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS；PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS；和PEG-O-CH2CO2-NHS；其中R是(CH2)4)NHCO2(mPEG).
26.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其中所述PEG通过选自顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜和硫醇的巯基选择性试剂连接于溶剂可接近的半胱氨酸上。
27.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其中所述多肽具有20-40kDa的总PEG大小。
28.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其中所述多肽具有20或40kDa的总PEG大小。
29.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其中所述PEG作为单一聚合物而提供。
30.根据权利要求1的PEG连接的多肽，其中所述dAb或者每个dAb都具有对于TNFα的特异性。
31.包含权利要求1的PEG连接的多肽和载体的药物制剂。
32.根据权利要求31的药物制剂，其中所述药物制剂适于口服给药或适于通过选自静脉内、肌内或腹膜内注射、植入、直肠和经皮给药的途径进行肠胃外给药。
33.根据权利要求31的药物制剂，其中所述药物制剂是延长释放肠胃外或口服剂型。
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