CN103619876A - 双特异性三链抗体样分子 - Google Patents

双特异性三链抗体样分子 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新颖的双特异性三链抗原结合多肽及其制备方法以及在治疗和/或诊断各种疾病中的用途，并且还涉及能够活化免疫效应细胞的双特异性三链抗体样分子(TCAs)及其在在诊断和/或治疗各种疾病中的用途。

Description

双特异性三链抗体样分子
发明领域
本发明涉及新型的双特异性三链抗原结合多肽及其制备方法以及在治疗和/或诊断各种疾病中的用途。本发明特别涉及能够活化免疫效应细胞的双特异性三链抗体样分子(TCA)及其在在诊断和/或治疗各种疾病中的用途。本发明特别涉及对CD3抗原复合物具有结合亲和力的双特异性三链多肽、其制备以及在癌症疗法中的用途。
发明背景
抗体对免疫效应细胞的活化
身体免疫系统起到防御感染、损伤和癌症的作用。体液免疫系统和细胞免疫系统是两个独立但相互关联的系统，两者协同工作以保护身体。体液系统由称为抗体的可溶性因子介导，所述可溶性因子中和被身体识别为外来物的产物。相比之下，细胞系统包括除去和中和外来侵入物的细胞，例如T细胞和巨噬细胞
T细胞的活化对于刺激免疫反应而言至关重要。T细胞表现出免疫特异性并且引导大多数细胞免疫反应。尽管T细胞不分泌抗体，但其需要B淋巴细胞分泌抗体。T细胞活化需要诸多细胞表面分子的参与，例如T细胞受体复合物和CD4或CD8分子。抗原特异性T细胞受体(TcR)由二硫键连接的异源二聚体、膜糖蛋白和阿尔法和贝它(α和β)链或伽马和德耳塔(γ和δ)链构成。TcR与不变蛋白的复合物(称为CD3)非共价连接。
TcR赋予抗原特异性并且CD3结构将活化信号转导给T细胞。CD3复合物包含四个亚基。它们可包含两个ζ亚基，一个ε亚基以及γ亚基或δ亚基中的任一个。抗原结合导致TCR复合物的交联和活化。T细胞受体信号传导导致T细胞活化和IL-2产生以及在复杂过程中产生其它细胞因子。
TcR的配体是靶细胞(如病毒感染的细胞)表面上的MHC-肽复合物。在识别靶细胞上的MHC-肽之后，T细胞可对靶细胞具有细胞毒性作用或凋亡作用。尤其是细胞毒性T细胞(CD8阳性T细胞)可通过直接除去病毒感染细胞而具有有利的作用。细胞免疫反应的这种防护(arm)是特别有利的，并且对于对抗病毒感染和消除肿瘤细胞而言至关重要。
细胞毒性T细胞的活化可通过直接结合CD3抗原来进行，而无需通过TcR对MHC-肽复合物进行识别。这种替代活化途径可通过抗-CD3抗体来实现。已针对一些抗CD3链(亚基)开发了非人单克隆抗体，如鼠抗体OKT3、SP34、UCHT1或64.1所例示。(参见例如，June等人，J.Immunol.136:3945-3952(1986)；Yang等人，J.Immunol.137:1097-1100(1986)；和Hayward等人，Immunol.64:87-92(1988))。
许多这些抗-CD3抗体结合导致形成高度活化T细胞的ε链。使用普通的单克隆抗体的癌症免疫疗法不能活化T-淋巴细胞，因为这些细胞缺乏Fcγ受体。因此，识别人CD3的一个臂和识别肿瘤抗原的另一个臂在体外动物癌症模型中具有较高的细胞毒性潜力。在临床试验中，极低剂量的BiTE抗体在非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)患者中是有效的(Bargou等人，Science321，第974-977页，2008)。最低有效剂量为约0.015mg/m2/天(毫克/平方米体表面积/天)，比普通抗体低几个数量级。
CD3抗体公开于（例如）美国专利号5,585,097；5,929,212；5,968,509；6,706,265；6,750,325；7,381,803；7,728,114中。具有CD3结合特异性的双特异性抗体公开于（例如）美国专利号7,262,276；7,635,472和7,862,813中。
双特异性抗体
双特异性抗体在治疗和检测癌症方面已表现出明显优于单特异性抗体的有益效果。有效／低成本的制备方法、双特异性多肽稳定性的缺乏和人体内长半衰期的缺乏妨碍了双特异性抗体的广泛商业应用。在过去的几十年，已开发了多种方法来制备双特异性单克隆抗体(BsMAB)。
第一代BsMAbs由两条重链和两条轻链组成，其中每一个来自两种不同的抗体。两个Fab区针对两种抗原。Fc区由两条重链组成并且与免疫细胞上的Fc受体形成第三结合位点，因此也称为三功能抗体(H.Lindhofer等人，TheJournal of Immunology，第155卷，第219-225页，1995)。在一个细胞系中引入两种不同的抗体导致在由各种重链和轻链组合组成的10种不同IgG分子的上清液中表达。因此，功能性双特异性抗体的产量较低，并且纯化往往较为复杂。为了克服该缺点，已使来自不同物种的抗体在一个细胞系中表达，该细胞系由于正确配对的Ab的发生率增加而促进BsMAbs的产生。例如，由于适宜物种限制的重链和轻链配对，表达大鼠和小鼠抗体的细胞系会分泌功能性双特异性Ab。使用标准方法来纯化这些大鼠/小鼠BsMAb。大鼠/小鼠杂交BsMAb(Removab，卡妥索单抗(catumaxomab))已被批准供人类使用。这些非人(源化)BsMAb产物在重复施用后诱导强免疫反应，因此仅指定供非长期使用。卡妥索单抗的作用机理是，一个Fab针对EpCAM(肿瘤抗原)，而另一个针对CD3(T-淋巴细胞抗原)。Fc区另外结合表达Fc受体的细胞，如巨噬细胞、天然杀伤细胞或树突细胞。总之，肿瘤细胞连接至一种或两种免疫系统细胞，随后被所述免疫系统细胞破坏。
已设计出其它类型的双特异性抗体来克服大鼠/小鼠三功能抗体的某些问题，例如短半衰期、免疫原性和细胞因子释放所导致的副作用。它们包括化学连接的Fab，其仅由Fab区组成。两个化学连接的Fab或Fab2片段形成人工抗体，该抗体结合两种不同的抗原，从而使其成为一种双特异性抗体。两种不同单克隆抗体的抗原结合片段(Fab或Fab2)通过化学方式(如硫醚)产生和连接(Glennie，MJ等人，Journal of immunology139，第2367–75页，1987)。通常，其中一个Fab结合肿瘤抗原(如CD30)，而另一个结合免疫细胞表面上的蛋白，例如巨噬细胞上的Fc受体或T细胞上的CD3。这样，肿瘤细胞附着至破坏其的免疫细胞。针对癌症治疗进行化学连接的Fab的临床试验，该实验获得令人满意的结果(Peter Borchmann等人，Blood，第100卷，第9期，第3101-3107页，2002)。因为制备成本高，所以放弃了对这种方法的进一步开发。
已通过重组融合两种抗体的可变域开发了用于制备多价人工抗体的多种其它方法。单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白，所述重链(VH)和轻链(VL)可变区与10至约25个氨基酸的短接头肽连接。所述接头通常富含甘氨酸而具有挠性，以及富含丝氨酸或苏氨酸而具有溶解性，并且可将VH的N-末端与VL的C末端连接，反之亦然。可通过连接两个具有不同特异性的scFv对双特异性单链可变片段(di-scFvs,bi-scFvs)进行工程改造。产生具有两个VH和两个VL区的单一肽链，从而得到二价scFv。对这些片段的最大程度的开发是双特异性串联scFv，称为双特异性T细胞衔接器(bi-specific T-cell engager，BiTE)。第一BiTE抗体经由一个scFv结合至T细胞(经由CD3受体)，并经由另一个scFv结合至肿瘤细胞(经由肿瘤特异性分子)。例如，正在开发Blinatumomab(MT103)用于治疗非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴母细胞性白血病；并且其针对CD19(B细胞上表达的表面分子)和CD3(T细胞上表达的表面分子)。类似地，正在开发MT110用于治疗胃肠癌和肺癌；其针对肿瘤细胞上的EpCAM抗原和CD3。利用相同的技术，对黑素瘤(以MCSP特异性BiTE)和急性骨髓性白血病(以CD33特异性BiTE)进行靶向。另一种可能是形成含接头肽的双特异性scFv、所述接头肽太短(约五个氨基酸)而不能使两个可变区折叠在一起，从而迫使scFv二聚化。这种类型被称为双抗体(Adams等人，British journal of cancer77，第1405–12页，1998)。此外，这些形式可由对两种不同抗原具有特异性的可变片段构成，在此情况下其为双特异性双抗体类型。所有这些技术均产生具有非人序列的蛋白，该蛋白可在多次给药后导致免疫原性和短的半衰期。双特异性双抗体和BiTE本身具有几小时至几天的短半衰期。相比之下，天然抗体具有几周的半衰期。
另一种人工抗体平台是双亲和力重新靶向(Dual-Affinity Re-Targeting，DART)平台技术(Macrogenics,Rockville,Maryland)。这种融合蛋白技术在约55kDa的单一肽链上使用不同抗体的两个单链可变片段(scFv)。
SCORPION疗法(Emergent Biosolutions,Inc.,Seattle,WA)是一种将两个抗原结合结构域组合在单链蛋白中的平台技术。一个结合结构域位于效应结构域的C-末端，第二个结合结构域位于效应结构域的N末端(基于免疫球蛋白Fc区)。
四价双特异性抗体样蛋白为DVD-Ig，其由两个单克隆抗体经工程改造而来(Wu，C.等人，Nature Biotechnology，25，第1290-1297页，2007)。为了构建DVD-Ig分子，两个mAb的V结构域与位于N末端的第一抗体轻(VL)链的可变域，然后是其它抗体VL和Ck通过短接头(TVAAP)串联融合，从而形成DVD-Ig蛋白轻链。类似地，两个mAb的重(VH)链可变区与位于N末端的第一抗体，然后是其它抗体和重链恒定域通过短接头(ASTKGP)串联融合，从而形成DVD-Ig蛋白重链(VH1/VL1)。在DVD-Ig设计中保留所有轻链和重链恒定域，因为它们对于形成二硫键连接的完整IgG-样分子而言至关重要。用编码DVD-Ig轻链和重链的表达载体共转染哺乳动物细胞导致分泌单一的IgG-样分子物质，其分子量为约200kDa。此分子现具有四个结合位点，每个mAb提供2个结合位点。
发明概述
在一个方面，本发明涉及一种双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含
(a)抗体重链和轻链对或其功能片段，其包含与第一结合靶特异性结合的抗原结合区和至少一个重链恒定区序列；和
(b)重链抗体，其包含与第二结合靶特异性结合的抗原结合区，以及CH2、CH3和/或CH4区，但不含CH1区。
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含此类双特异性TCA与药学上可接受的成分的混合物。
在另一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括含有本发明药物组合物的双特异性TCA的容器，和指导使用者使用双特异性TCA或药物组合物的说明书。
在另一方面，本发明涉及一种制备本发明双特异性的TCA的方法，其包括在单一宿主细胞中表达抗体重链和轻链对以及重链抗体。
在各实施方案中，宿主细胞可为原核或真核细胞，例如哺乳动物细胞。
在另一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，其包括将有效量的本发明双特异性TCA施用给被诊断患有所述癌症的受试者。
在各实施方案中，癌症选自由以下组成的组：卵巢癌、乳腺癌、胃肠癌、脑癌、头颈癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、癌瘤、神经细胞瘤、鳞状细胞癌瘤、胚细胞瘤、转移瘤、未分化肿瘤、精原细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、混合型细胞瘤和传染物引起的瘤形成。
在另一方面，本发明涉及一种治疗自身免疫疾病或炎性病状的方法，其包括将有效量的本发明双特异性TCA施用给有需要的受试者。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗由细菌、病毒或寄生虫引起的传染病的方法，其包括将有效量的本发明双特异性TCA施用给有需要的受试者。
在所有方面，双特异性TCA可存在于各个实施方案中。
因此，在一个实施方案中，在双特异性TCA中，抗体重链和轻链对包含与第一结合靶特异性结合的抗原结合区和CH1序列。
在另一个实施方案中，在双特异性TCA中，抗体重链和轻链对包含与第一结合靶特异性结合的抗原结合区以及CH1和CH2序列。
在另一个实施方案中，在双特异性TCA中，抗体重链和轻链对包含与第一结合靶特异性结合的抗原结合区以及CH1、CH2和CH3序列。
在其它实施方案中，在双特异性TCA中，抗体重链和轻链对还包含铰链区。
在另一个实施方案中，在双特异性TCA中，抗体重链和轻链或其功能片段彼此共价连接。
在更具体的实施方案中，在双特异性TCA中，抗体重链和轻链或其功能片段通过二硫键连接。
在一个不同的实施方案中，在双特异性TCA中，重链抗体包含与第二结合靶特异性结合的抗原结合区和CH2区，但不含CH1区。
在另一个实施方案中，在双特异性TCA中，重链抗体还包含CH3区，但不含CH1区。
在另一个实施方案中，在双特异性TCA中，重链抗体还包含CH4区，但不含CH1区。
在另一个实施方案中，重链抗体还包含铰链区。
在其它实施方案中，第一结合靶和第二结合靶可为两种不同的抗原或同一抗原上的不同表位。
在另一个实施方案中，本文中的双特异性TCA可结合由靶细胞表达的细胞表面抗原以及由效应细胞表达的抗原。
在具体实施方案中，第一结合靶和第二结合靶中的至少一个为CD3复合物的一部分，例如CD3ε。
在所有实施方案中，本文中的双特异性TCA可为人源化的或人类的。
附图简述
图1。人重链多肽、人IgG抗体和人双特异性3-链多肽的示意图。重链多肽和人抗体在宿主细胞系中的共表达在上清液中产生所有三种分子。通过使用标准蛋白质纯化技术例如亲和(蛋白A)色谱法、尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法来实现各个多肽的纯化。
发明详述
I.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术、符号和其它科学术语均旨在具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考的目的，本文定义了具有通常所理解的含义的术语，并且将此类定义并入本文不应必然理解为表示与本领域通常所理解的含义相比具有实质性的区别。本领域技术人员一般能充分理解本文中所描述或引用的技术和工序，并通常可使用常规方法对其进行利用，例如，Sambrook等人在Molecular Cloning:A Laboratory Manual第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.中描述的已被广泛应用的分子克隆方法。同样，例如，Current Protocols in Molecular Biology，增刊93，2011年1月，John Wiley&Sons,Inc.。适当时，通常根据制造商规定的方案和/或参数来实施包括使用市售试剂盒和试剂的工序，除非另外说明。
必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数个指代物，除非上下文另外明确指出。
在说明书和权利要求书的通篇中，措辞“包含”或其变形如“含有”或“包括”将被理解为暗示包括所指出的整体或整体集但不排除任何其它整体或整体集。
当在本文中使用商品名时，申请人意欲独立地包括商品名产品制剂、仿制药以及商品名产品的(多种)活性药物成分。
本文提及的所有出版物和其它参考文献均以引用方式并入以公开和描述连同这些出版物被引用的方法和/或材料。就本文所引用的出版物而言，其被引用的是其在本发明的申请日之前的公开内容。这里的任何内容均不应被理解为承认发明人无权基于更早的优先权日期或在先的发明日期使这些出版物日期提前。此外，实际出版日期可能与所示日期不同，需要独立核实。
除非另有说明，本文中所用的以下术语和短语旨在具有下列含义：
术语“抗原”是可与抗体结合或触发细胞免疫反应的实体或其片段。免疫原是指可在生物体、特别是动物、更特别是哺乳动物(包括人体)中引发免疫反应的抗原。术语抗原包含称为抗原决定簇或表位的区域。
如本文所用，术语“免疫原性”是指诱导抗体产生和/或活化T细胞和/或其它针对免疫原抗原的反应性免疫细胞的物质。
当个体针响应于所施用的免疫原性组合物而产生足够的抗体、T细胞和其它反应性免疫细胞时发生免疫反应。
如本文所用，术语免疫原性是指当对接受者施用时，抗原引起免疫反应(体液或细胞)的能力的度量。本发明涉及降低目标人嵌合抗体或人源化抗体的免疫原性的方法。
术语“双特异性”是指识别两种不同抗原的结合多肽。在一个实施方案中，“双特异性”多肽是三链抗原结合抗体样分子，其由于具有至少一个对第一抗原或半抗原具有特异性的第一抗原结合位点和至少一个对第二抗原或半抗原具有特异性的第二抗原结合位点而可识别两种不同的抗原。此类多肽可通过重组DNA方法和/或通过化学合成来制备。对每种抗原具有两个或两个以上识别位点的双特异性多肽明确包括在该定义内。
本文所用的术语“双特异性三链抗体样分子”或“TCA”是指抗体样分子，其包含3个多肽亚基、基本上由3个多肽亚基组成或由3个多肽亚基组成，所述3个多肽亚基中的两个包含单克隆抗体的一条重链和一条轻链，或此类抗体链的功能性抗原结合片段(包含抗原结合区和至少一个CH结构域)，基本上由单克隆抗体的一条重链和一条轻链或此类抗体链的功能性抗原结合片段组成或由单克隆抗体的一条重链和一条轻链或此类抗体链的功能性抗原结合片段组成。该重链/轻链对对于第一抗原具有结合特异性。第三个多肽亚基包含含有Fc部分的仅有重链抗体，基本上由含有Fc部分的仅有重链抗体组成或由含有Fc部分的仅有重链抗体组成，所述Fc部分包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域，但不含CH1结构域，以及结合第二抗原的表位或第一抗原的不同表位的抗原结合结构域，其中此类结合结构域衍生自抗体重链或轻链的可变区或与其具有序列同一性。此类可变区的部分可通过VH和/或VL基因区段、D和JH基因区段或JL基因区段进行编码。可变区可通过重排的VHDJH、VLDJH、VHJL或VLJL基因区段进行编码。
抗体也称为免疫球蛋白，其包含两条相同的重链和两条相同的轻链。每条重链和轻链包含可变的氨基末端结构域和恒定的羧基末端。来自一条重链的可变域(VH)和来自一条轻链的可变域(VL)一起形成抗体的抗原结合位点。因此，天然抗体通常具有两个抗原结合位点。通常，两条重链通过二硫键彼此共价结合在恒定区(CH)，并且每条重链共价结合至轻链之一的恒定区(CL)。本文术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性(Miller等人(2003)Jour.of Immunology170:4854-4861)。抗体可以为鼠的、人的、人源化的、嵌合的、或源于其它物种的抗体。抗体是由能够识别和结合特异性抗原的免疫系统所产生的蛋白质。(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immuno Biology，第5版，GarlandPublishing,New York)。靶抗原通常具有由多种抗体上的CDR所识别的许多结合位点，也称为表位。每种特异性结合不同表位的抗体均具有不同的结构。因此，一种抗原可具有一种以上的相应抗体。抗体包含全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合目标靶抗原的抗原结合位点或其部分的分子，此类靶包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫病相关的自身免疫抗体的细胞。本文公开的免疫球蛋白可为任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可源自任何物种。然而，在一个方面，免疫球蛋白是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、兔子或鸡来源。术语“可变”是指抗体中可变域的某些部分在序列中差异非常大，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在抗体的整个可变域中并非均匀分布。在轻链和重链可变域中，其集中在三个称为高变区的区段中。可变域的更加高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采用β-折叠构型，由三个高变区连接，其形成连接β-片层结构的环，有时构成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起为抗体的抗原结合位点的形成作出贡献(参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质抗体的群体获得的抗体，即，包含该群体的各个抗体是相同的，除了可以微量存在的可能的天然存在的突变。单克隆抗体具有高度特异性(针对单一抗原位点)。另外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以被合成但不被其它抗体所污染。。修饰语“单克隆”指示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特性并且不应解释为需要通过任何特定方法产生该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由
Figure BDA0000410494110000091
等人(1975)Nature256:495首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567；美国专利号5,807,715)制备。例如，单克隆抗体也可以利用Clackson等人(1991)Nature,352:624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597描述的技术由噬菌体抗体库分离。
本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，以及此类抗体的片段，其中重链和/或轻链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，而链的其余部分与源于其它物种或属于其它抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，只要其表现出所需的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。本文中的目标嵌合抗体包含“灵长类化(primatized)”抗体，其包含源于非人灵长类(例如，旧世纪猴(Old World Monkey)、猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。
本文中的“完整抗体”为包含VL和VH结构域，以及轻链恒定域(CL)和重链恒定域CH1、铰链、CH2和CH3(针对分泌的IgG)的抗体。其它同种型(例如IgM或IgA)可具有不同的CH结构域。恒定区可为天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，其是指可归因于抗体Fc恒定域(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用和细胞表面受体的下调。
依据其重链恒定域的氨基酸序列，可以将完整抗体指定为不同的“类别”。有五种主要的完整免疫球蛋白抗体类别∶IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。Ig形式包括包括铰链修饰形式或无铰链形式(Roux等人(1998)J.Immunol.161:4083-4090;Lund等人(2000)Eur.J.Biochem.267:7246-7256；US2005/0048572；US2004/0229310)。基于其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链均可指定为两种明显不同类型(称为κ和λ)中的一种。
本文中使用术语"高变区"时是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补性决定区”或"CDR"的氨基酸残基(例如，轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，同上)和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.,196:901-917)。“框架区”或“FR”残基为除了本文所定义的高变区残基之外的那些可变域残基。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为"Fab"片段，每条均具有单一抗原结合位点，和残余的"Fc"片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
"Fv"是包含完全抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密非共价结合的一条重链可变域和一条轻链可变域的二聚体组成。正是以这种每个可变域的三个高变区相互作用的构型限定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个高变区共同对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即便是单一可变域(或是仅包含对抗原具有特异性的三个高变区的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，尽管其亲合力低于完整的结合位点。
Fab片段也包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于其在重链CH1域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。本文中将其中恒定域的(多个)半胱氨酸残基具有至少一个游离硫醇基的Fab'称为Fab'-SH。F(ab’)2抗体片段起初以Fab'片段对的形式产生，所述Fab'片段对在Fab'片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联物也是已知的。
非人(例如，啮齿类)抗体的“人源化”形式为包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体(包括单链抗体)。人源化是将鼠抗原结合信息转移至非免疫原性人抗体受体的方法，并且已经产生了许多治疗上有用的药物。人源化方法一般通过将所有6个鼠互补性决定区(CDR)转移到人抗体框架上而开始(Jones等人，(1986)Nature321:522-525)。这些CDR移植的抗体通常不会保持其对抗原结合的初始亲和力，并且事实上，亲和力通常严重受损。除CDR外，还必须并入选定的非人抗体构架残基以维持正确的CDR构象(Chothia等人(1989)Nature342:877)。已经证实，将关键的小鼠框架残基转移至人受体以支持所移植CDR的结构构象可恢复抗原结合和亲和力(Riechmann等人，(1992)J.Mol.Biol.224,487-499；Foote和Winter，(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；Presta等人(1993)J.Immunol.151,2623-2632；Werther等(1996)J.Immunol.Methods157:4986-4995；Presta等(2001)Thromb.Haemost.85:379-389)。在大多数情况下，人源化抗体是其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的具有期望特异性、亲和力和能力的高变区残基置换的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体不存在的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个以及通常两个可变域，其中所有的或者基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有的或者基本上所有的FR为人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定域(Fc)（通常是人免疫球蛋白恒定域）的至少一部分。关于进一步细节，请参见美国专利号5,225,539；6,548,640；6,982,321；5,585,089；5,693,761；6,407,213；Jones等人(1986)Nature,321:522-525；Riechmann等人(1988)Nature332:323-329。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合域(例如抗体可变域)组合，并可采用例如本文中定义所公开的各种测定法进行评价。
“天然序列Fc区”包含与自然中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区，以及它们的天然存在的变体。
“变体Fc区”包含以至少一个氨基酸修饰(优选一个或多个氨基酸取代)而区别于天然序列Fc区氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中存在约1至约10个氨基酸取代，优选约1至约5个氨基酸取代。本文中的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80%同源性，最优选与其具有至少约90%同源性，更优选与其具有至少约95%同源性。
两个序列之间的“同源性”通过序列同一性来确定。如果被相互比较的两个序列的长度不同，则序列同一性优选地指较短序列中与较长序列核苷酸残基完全相同的核苷酸残基的百分数。序列同一性可以通过使用诸如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，用于Unix的版本8，Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive Madison,Wis.53711)的计算机程序常规确定。Bestfit利用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics2(1981),482-489的局部同源性算法来寻找两序列间具有最高序列同一性的区段。当使用Bestfit或其它序列比对程序来确定特定序列是否与本发明的参考序列具有例如95%的序列同一性时，优选调整参数，以使序列同一性百分比在参考序列全长范围内计算，并允许高达参考序列中核苷酸总数5%的同源性空位。当使用Bestfit时，所谓的任选参数优选置于其预设(“默认”)值。在给定序列和上述本发明序列的比较中出现的偏差可能是由例如添加、缺失、取代、插入或重组所致。此类序列比较也可优选地利用程序"fasta20u66"(2.0u66版，1998年9月，William R.Pearson和University ofVirginia；也参见W.R.Pearson(1990)，Methods in Enzymology183,63-98，所附实例和http://workbench.sdsc.edu/)进行实施；http://workbench.sdsc.edu/).为此目的，可以使用“默认”参数设置。
术语“含Fc区抗体”是指包含Fc区的抗体。可例如在纯化抗体期间或通过重组工程改造编码抗体的核酸来除去Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统残基447)。因此，根据本发明的具有Fc区的抗体可包括具有或不具有K447的抗体。
如本文所用,术语“单链抗体”是指包含一个或多个结合抗原表位的抗原结合结构域的单一多肽链，其中此类结构域源自抗体重链或轻链可变区或与该可变区具有序列同一性。此类可变区的部分可通过VH或VL基因区段、D和JH基因区段或JL基因区段进行编码。可变区可通过重排的VHDJH、VLDJH、VHJL或VLJL基因区段进行编码。V、D和J基因区段可来自人类和各种动物，包括鸟、鱼、鲨鱼、哺乳动物、啮齿类动物、非人灵长类动物、骆驼、美洲驼马、兔等。
如本文用，术语“仅有重链抗体”或“重链抗体”或“重链多肽”是指包含重链CH2和/或CH3和/或CH4但不含CH1结构域的单链抗体。在一实施方案中，重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少部分以及CH2和CH3结构域构成。在另一个实施方案中，重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少部分以及CH2结构域构成。在另一个实施方案中，重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少部分和CH3结构域构成。其中CH2和/或CH3结构域被截短的重链抗体的也包括在本文中。在另一个实施方案中，重链由抗原结合结构域和至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)结构域构成，但不含铰链区。仅有重链抗体可呈二聚体形式，其中两条重链以二硫键连接，或以其它方式彼此共价或非共价连接。重链抗体可属于IgG亚类，但属于其它亚类例如IgM、IgA、IgD和IgE亚类的抗体也包括在本文中。在具体实施方案中，抗体重链为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，特别是IgG1亚型。
重链抗体构成由骆类例如骆驼和骆马产生的IgG的约四分之一(Hamers-Casterman C.,等人，Nature.363,446-448(1993))。这些抗体由两条重链形成但不含轻链。因此，可变抗原结合部分称为VHH结构域并且代表最小的天然存在的完整抗原结合位点，仅具有约120个氨基酸的长度(Desmyter,A.等人，J.Biol.Chem.276,26285-26290(2001))。可通过免疫作用产生针对多种抗原的具有高特异性和亲和力的重链抗体(van der Linden,R.H.等人，Biochim.Biophys.Acta.1431，37-46(1999))，并且VHH部分可易于在酵母中克隆和表达(Frenken,L.G.J.等人，J.Biotechnol.78,11-21(2000))。它们的表达水平、溶解性和稳定性显著高于典型的F(ab)或Fv片段(Ghahroudi,M.A.等人，FEBS Lett.414,521-526(1997))。也已证实，鲨鱼在其称VNAR的抗体中具有单一VH样结构域。(Nuttall等人，Eur.J.Biochem.270,3543-3554(2003)；Nuttall等人，Function and Bioinformatics55,187-197(2004)；Dooley等人，Molecular Immunology40,25-33(2003)。
“特异性结合”或“特异性针对”特定多肽或特定多肽上的表位的抗体和结合分子(包括本文中的仅有重链抗体和双特异性三链抗体样分子(TCA))是特异性结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的抗体和结合分子。
“结合”目标抗原的抗体或结合分子(包括本文中的仅有重链抗体和双特异性三链抗体样分子(TCA))是以足够的亲和力结合抗原以使得抗体或结合分子可作为靶向抗原的诊断和/或治疗剂并且不与其它蛋白发生显著交叉反应的抗体或结合分子。在此类实施方案中，抗体或其它结合分子与非靶向抗原的结合程度将不超过10%，如通过荧光激活细胞分选术(FACS)分析或放射免疫沉淀法(RIA)所测定。
“补体依赖性细胞毒性”或"CDC"指在补体的存在下靶标的裂解。补体活化途径由补体系统的第一组分(C1q)结合到与关联抗原复合的分子(例如抗体)所启动。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体或其它结合分子)的单一结合位点与其结合伴侣(例如抗原或受体)之间全部非共价相互作用总和的强度。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表示。亲和力可通过本领域的常用方法(包括本文中描述的那些方法)进行测量。低亲和力抗体较弱地结合抗原(或受体)并且往往易于解离，而高亲和力抗体更紧密地结合抗原(或受体)并且保持结合更长的时间。
“功能性”或“生物活性”抗体或结合分子(包括本文中的仅有重链抗体和双特异性三链抗体样分子(TCA))是能够在结构、调节、生物化学或生物物理学事件中发挥其一种或多种天然活性的抗体或结合分子。例如，功能性抗体或其它结合分子(例如TCA)可具有特异性结合抗原的能力，并且该结合又可诱导或改变诸如信号转导或酶活性的细胞或分子事件。功能性抗体或其它结合分子(例如TCA)也可阻断受体的配体活化或用作激动剂或拮抗剂。抗体或其它结合分子(例如TCA)发挥其一种或多种天然活性的能力取决于若干因素，包括多肽链的正确折叠和装配。
如本文所用，术语“载体”是指能够转运已与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”，其是指其中可连接额外DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体为病毒载体，其中可将额外DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与其可操作性连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最最常用的载体形式。
如本文所用，术语“宿主细胞”(或“重组宿主细胞”)意指已经发生遗传改变或者能够通过引入外源多核苷酸(如重组质粒或载体)而发生遗传改变的细胞。应理解，此类术语不仅意指特定的主体细胞，而且意指此类细胞的后代细胞。在接续传代中由于突变或环境影响而可能发生某些修饰，因此此类后代可能实际上并不等同于亲代细胞，但其仍包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。
用于治疗目的的“哺乳动物”是指任何归类为哺乳动物的动物，包括人、非人类灵长类动物、家畜和农场动物以及动物园动物、体育动物或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。定义中具体包括的是啮齿类动物，例如小鼠和大鼠以及通过基因转换产生抗体多样性的动物。
II.发明的实施方式
1.双特异性三链抗体样分子(TCA)
本发明公开了新型特异性抗体样分子(结合多肽)，其可用于例如治疗和/或诊断人类疾病。所述新颖双特异性的抗体样分子由三条多肽链组成并且称为三链抗体(TCA)。此类多肽链中的两条至少包含形成抗原结合结构域所需的抗体重链和轻链的一部分和至少一个抗体重链恒定区序列，即CH1和/或CH2和/或CH3区和/或CH4区序列。在某些实施方案中，重链序列还可包括铰链区。在一个实施方案中，这两条多肽链为与第一抗原特异性结合的单克隆抗体的一条重链和一条轻链。
第三条多肽链为仅有重链抗体，其包含含有CH2和/或CH3和/或CH4结构域但不含CH1结构域的Fc部分以及结合第二抗原表位的抗原结合结构域，其中此类结合结构域源自抗体重链或轻链的可变区或与其具有序列同一性。此类可变区的部分可通过VH或VL基因区段、D和JH基因区段或JL基因区段进行编码。可变区可通过重排的VHDJH、VLDJH、VHJL或VLJL基因区段进行编码。V、D和J基因片段可以来自人类和各种动物，包括但不限于鸟、鱼。第一抗原和第二抗原彼此不同，即，TCA是双特异性的。
在某些实施方案中，CH区可以被截短，条件是其余序列足以保持全长CH区的功能。
尽管双特异性TCA可通过化学合成来制备，但其通常通过重组DNA技术的方法来制备，例如在单一重组宿主细胞中共表达构成分子的三条链，或共表达重链多肽和抗体例如人抗体。此外，也可使用单一多顺反子表达载体来表达抗体重链和轻链。TCA的抗体组分还可通过噬菌体展示来产生。在单一宿主细胞中共表达重链多肽和抗体在上清液中产生三种分子(抗体、重链多肽和TCA)。通过使用标准蛋白质纯化技术例如亲和(蛋白A)色谱法、尺寸排阻色谱法和/或疏水相互作用色谱法来实现各个多肽的纯化。TCA在尺寸和疏水性方面的不同程度足以使得可用标准工序进行纯化。
单一宿主细胞中产生的抗体和重链多肽的量可通过对抗体的恒定区和重链进行工程改造以使得同源二聚化优于异源二聚化(例如，通过引入自互补相互作用)来减至最小(关于可能性，参见例如WO98/50431，例如“突起-进入-腔体(protuberance-into-cavity)”策略(参见WO96/27011))。因此，本发明的另一方面提供一种在重组宿主中制备TCA的方法，所述方法包括以下步骤：在重组宿主细胞中表达编码至少抗体和重链多肽的核酸序列，其中所述抗体与所述重链多肽的不同程度足以减少或防止同源二聚体形成但却增加TCA的形成。
可制备不含任何非人氨基酸序列的TCA。此类TCA为半衰期与人类天然抗体的半衰期类似的非免疫原性的稳定分子。
与常规单克隆抗体相比，TCA的效力增加。
在一个实施方案，本发明涉及结合两种细胞表面抗原的TCA。
本发明特别涉及特异性结合人CD3的TCA。例如，仅有重链抗体多肽可与来自单克隆抗体的重链和轻链或其功能片段(包含至少抗原结合结构域以及CH1、CH2、CH3和CH4结构域中的至少一个)组合。仅有重链抗体可对人CD3具有特异性，而TCA的单克隆抗体(mAb)部分可对靶细胞具有特异性，包括癌细胞，例如卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、胃肠癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞和肺癌细胞等，以及血液系统肿瘤细胞例如B细胞肿瘤细胞，包括白血病细胞、淋巴瘤细胞、肉瘤细胞、癌瘤细胞、神经细胞瘤细胞、鳞状细胞癌瘤细胞、胚细胞肿瘤细胞、转移瘤细胞、未分化肿瘤细胞、精原细胞瘤细胞、黑素瘤细胞、骨髓瘤细胞、成神经细胞瘤细胞、混合型细胞瘤细胞、传染物引起的瘤形成细胞和其它恶性肿瘤细胞、病原体感染的细胞、引起炎症和/或自身免疫性的自身反应性细胞。在某些实施方案中，TCA将对CD3和肿瘤抗原具有结合特异性，例如，HER-2/Neu受体、其它生长因子受体例如EGFR、HER3、HER4、VEGFR1和VEGFR2受体、B-细胞标记物例如CD19、CD20、CD22、CD37、CD72等，T细胞标记物例如CD25或CD11b、其它白细胞细胞表面标记物例如CD33或HLA-DR等，细胞因子例如TNF、白介素、这些细胞因子的受体例如TNF受体家族的成员，等等。
在其它实施方案，本文的双特异性TCA可对病原体(例如病毒、细菌或寄生虫)所表达的蛋白具有结合特异性。在另一个实施方案中，双特异性TCA特异性结合病毒感染的细胞或在感染细胞或病毒颗粒的表面上表达的病毒蛋白。在其它实施方案中，双特异性TCA特异性结合在具有胞内寄生虫的细胞表面上表达的寄生虫蛋白。
可并入本发明双特异性TCA中的示例性抗CD3单克隆抗体包括但不限于OKT3(Otho)及其变体，包括非糖基化变体。优选地，抗体为完全人抗体。通常，抗-CD3抗体具有一个或多个以下特征：该抗体结合CD3阳性(CD3+)细胞而非CD3阴性(CD3-)细胞；抗-CD3抗体诱导抗原调变，其包括改变(例如降低)细胞表面表达水平或CD3或T细胞受体(TcR)的活性。
例如，CD3特异性重链抗体可与诸如以下的mAb的重链和轻链结合：
Figure BDA0000410494110000181
(对包括B细胞肿瘤细胞在内的B细胞上的CD20具有特异性)、
Figure BDA0000410494110000182
(贝伐单抗(bevacizumab)、抗-VEGF抗体)、
Figure BDA0000410494110000183
(曲妥单抗(trastuzumab)、抗-HER2抗体)等。CD3特异性单链肽还可与对其它肿瘤抗原如PMSA(前列腺特异性膜抗原)具有特异性的抗体等结合。CD3特异性单链肽还可与识别流感病毒、HIV、登革热病毒(Dengue virus)或其它病毒感染的细胞配对。
本发明还公开了与细胞表面抗原或可溶性抗原结合的TCA。
本发明还涉及结合两种可溶性抗原或一种抗原(例如一种可溶性抗原)上的两种不同表位的TCA。因此，例如结合HER2抗原上或CD3上的两种不同表位的TCA也明确包括在本文中。
结合两种可溶性抗原或一种可溶性抗原上的两种不同表位的TCA可使此类抗原交联。对动物或人施用此类TCA可导靶抗原从循环中清除。
2.TCA的重组制备
如上所述，本文中的TCA通常通过重组DNA技术的方法(例如在单一重组宿主细胞中共表达构成分子的三条链)来制备。
为了重组制备本文中的TCA，将编码三条链的码核酸分离并插入可复制载体中以便进一步克隆(DNA扩增)或进行表达。编码所需单链抗体的DNA可被容易地分离并使用常规工序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体变体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行测序。许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
所选异源信号序列优选地为由宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切割)的序列。对于不能识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，用原核信号序列代替所述信号序列，所述原核信号序列选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，天然信号序列可用下述序列代替，例如酵母转化酶前导序列，α因子前导序列(包括糖酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α-因子前导序列)，或酸性磷酸酶前导序列，白色念珠菌(C.Albicans)葡萄糖淀粉酶前导序列，或WO90/13646中所述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
将此类前体区域的DNA与编码抗体的DNA连接在阅读框架内。
表达载体和克隆载体均包含能使载体在一个或多个所选宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，此序列为能使载体独立于宿主染色体DNA而复制的序列，并且包括复制起始点或自主复制序列。就各种细菌、酵母和病毒而言，此类序列是众所周知的。来自质粒pBR322的复制起始点适于大部分革兰氏阴性菌，2μ质粒起始点适于酵母，而各种病毒起始点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常，对于哺乳动物表达载体而言并不需要复制起始点组分(通常仅使用SV40起始点，因为其包含早期启动子)。
表达载体和克隆载体可包含选择基因，其也被称为可选择标记物。典型的选择基因编码蛋白，该蛋白(a)赋予对抗生素或其它毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供从复合培养基中无法获得的关键营养物质，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用药物来抑制宿主细胞的生长。那些用异源基因成功转化的细胞产生赋予抗药性的蛋白，并因此在选择方案中存活。这种显性选择的实例利用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的合适可选择标记物的另一个实例是那些能够鉴定竞争摄取抗体核酸的细胞的可选择标记物，例如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II(优选灵长类金属硫蛋白基因)，腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过在含有氨甲喋呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有的转化体来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当采用野生型DHFR时，适当的宿主细胞为缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，通过在含有针对可选择标记物的选择试剂(例如氨基糖苷类抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中使细胞生长，可选择用编码抗体、野生型DHFR蛋白和另一种可选择标记物例如氨基糖苷类3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(尤其是含有内源性DHFR的野生型宿主细胞)。参见美国专利号4,965,199。
用于酵母中的合适选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trpl基因(Stinchcomb等人，Nature，282:39(1979))。所述trpl基因为不能在色氨酸中生长的酵母突变株提供了选择标记物，所述突变株例如ATCC No.44076或PEP4-1.Jones，Genetics，85:12(1977)。在酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在随后提供了用于检测缺乏色氨酸条件下生长的转化的有效环境。类似地，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC20,622或38,626)是由携带Leu2基因的已知质粒补充。
此外，可以将源自1.6μm环状质粒pKD1的载体用于转化克鲁维酵母属酵母。或者，用于大规模制备重组小牛凝乳酶的表达系统已被报道，K.lactis.Van den Berg,Bio/Technology,8:135(1990)。用于通过克鲁维酵母属工业菌株分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定型多拷贝表达载体也已公开。Fleer等人，Bio/Technology，9:968-975(1991)。
表达和克隆载体通常包含由宿主生物体识别并且可操作性连接至抗体核酸的启动子。适于与原核宿主细胞一起使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子如tac启动子。然而，其它已知细菌启动子也是合适的。用于细菌系统中的启动子还包含与编码抗体的DNA可操作性连接的Shine-Dalgarno(SD)序列。
用于真核细胞的启动子序列是已知的。实际上，所有真核基因均具有富含AT的区域，其位于转录起始位点上游约25个碱基处。在许多基因的转录起始位点上游70-80个碱基处存在的另一个序列是其中N可为任何核苷酸的CNCAAT区。在大部分真核基因的3'端是AATAAA序列，其为在编码序列的3'端添加polyA尾的信号序列。所有这些序列均适于插入真核表达载体。
用于与酵母宿主一起使用的适合启动子序列的实例包括以下各项的启动子序列：3-磷酸甘油激酶或其它糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。其它酵母启动子(其为具有由生长条件控制的额外转录优势的诱导型启动子)是以下各项的启动子区：乙醇脱氢酶2、异细胞色素(isocytochrome)C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。用于酵母表达的合适载体和启动子进一步描述于EP73,657中。酵母增强子还可有利地与酵母启动子一起使用。
通过启动子对哺乳动物宿主细胞中载体的抗体转录进行控制，条件是此类启动子与宿主细胞系统相容，所述启动子可获自病毒基因组如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，并且最优选猿猴病毒40(SV40)；异源哺乳动物的启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；热休克启动子。
SV40病毒的早期和晚期启动子可以同样包含SV40病毒复制起始点的SV40限制性片段的形式方便地获得。人巨细胞病毒的即时早启动子可以HindIII E限制性片段的形式方便地获得。在美国专利号4,419,446中公开了一种将牛乳头瘤病毒用作载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利号4,601,978描述了对该系统的改进。或者，可将劳氏肉瘤病毒长末端重复序列用作启动子。
通常通过将增强子序列插入载体中来增加高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起始点后侧(late side)的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起始点后侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子。还可参见Yaniv，Nature297:17-18(1982)关于激活真核启动子的增强元件。增强子可剪接入载体中抗体编码序列的5'位或3'位，但是优选位于启动子的5'位点。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)的表达载体还包含对终止转录和稳定mRNA而言所必须的序列。此类序列通常可得自真核或病毒DNA或cDNA的5'(有时为3')非翻译区。这些区包含转录为编码抗体的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分为牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
多顺反子表达载体(例如美国专利No.4,713,339中所述)也可用于表达本文中双特异性TCA的亚基。在多顺反子表达载体中，亚基的编码序列可由适当的切割位点分隔。
用于克隆或表达本发明载体中DNA的合适宿主细胞是上述原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。适于此目的的原核细胞包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科如埃希氏菌属(Escherichia)，如大肠杆菌(E.coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD266,710中地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌菌(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，但其他菌株例如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC31,537)，和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些实施例是示例性的而非限制性的。
除原核生物外，真核微生物例如丝状真菌(filamentous fungi)或酵母也适是抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母(common baker's yeast)是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、种和菌株通常是可获得的并且可用于本发明中，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主(Kluyveromyces host)例如乳克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragili)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威肯克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、克鲁雄酵母(K.waltii)(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；西洋蓍霉(yarrowia)(EP402,226)；巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；假丝酵母(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如许旺酵母菌(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌例如链孢霉属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主例如构巢曲霉(A.nidulan)和黑曲霉(A.niger)。
无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定出许多杆状病毒菌株和变体以及相应的许可性昆虫宿主细胞，所述宿主细胞来自诸如以下的宿主：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)，以及家蚕(Bombyx mori)。多种用于转染的病毒毒株可由公众获得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5毒株，此类病毒可以作为本发明的病毒，特别用于转染草地贪夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
植物中合成的TCA可以多种方式产生。由于首次报道抗体是在烟草(N.tabacum)植物中产生(Hiatt等人，1989,Nature,342:76-78)，因此抗体已在苔藓中表达(综述参见Decker和Reski，2008,Bioprocess Biosyst.Eng.,31,3–9)，在藻类中表达(综述参见Franklin和Mayfield,2005,Expert Opin.Biol.Ther.,5,225–235)以及在各种双子叶和单子叶物种例如烟草、大米中表达。综述参见例如De Muynck等人，2010,Plant Biotechnology Journal,8(5):529-563。产生抗体的转基因植物或植物细胞也已有描述(Hiatt等人，1989,Nature,342:76-78)，并且可用于此目的的植物包括玉米、玉蜀黍、烟草、大豆、苜蓿、玉米等。可例如用于植物细胞中的组成型启动子为CaMV35S和19S启动子，和土壤杆菌属启动子nos和ocs。其它有用的启动子为光诱导型启动子，例如rbcS。组织特异启动子可例如为种子特异的，例如来自玉米醇溶蛋白(zein)、油菜籽蛋白(napin)、β-菜豆球蛋白、泛素的启动子，或块茎特异的、叶子特异的(例如在烟草中有用的)、根特异的等等。还可通过同源重组转化质体细胞器以便在植物中表达蛋白质。在重组植物或其部分或重组植物细胞培养物中表达蛋白质的方法和装置是本领域技术人员已知的，并且已例如在(Giddings等人，2000；WO01/64929；WO97/42313；美国专利5888789、6080560；实用指南参见：Methods In Molecular Biology，第49卷，"Plant GeneTransfer And Expression Protocols",Jones H,1995)中加以描述。
然而，最关注的是脊椎动物细胞，并且在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系(亚克隆的293或293细胞，生长于悬浮培养物中，Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼年仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(mouse sertoli cell)(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A,ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562,ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。
将宿主细胞用上述用于产生抗体的表达或克隆载体转化并在适当改良的用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中进行培养。
市售的培养基，例如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基(MinimalEssential Medium)((MEM),(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)以及达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM),Sigma)，适于培养宿主细胞。此外，Ham等人，Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762，4,560,655或5,122,469、WO90/03430，WO87/00195；或美国再版专利30,985中描述的任何培养基均可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种可根据需要用激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁及磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷)、抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等量的能量源进行补充。也可以本领域技术人员已知的适当浓度包含任何其它必需补充剂。培养条件，例如温度，pH等，是此前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对本领域普通技术人员而言将是显而易见的。
在优选的实施方案中，根据本发明方法的宿主细胞能够高水平表达人免疫球蛋白，即至少1皮克/细胞/天，优选至少10皮克/细胞/天，甚至更优选至少20皮克/细胞/天或更多，而无需在所述宿主细胞中扩增编码单链的核酸分子。
优选地，根据本发明的宿主细胞在其基因组中包含每种待表达重组核酸的1至10个拷贝。在本领域，在例如CHO细胞中编码目标蛋白的核酸序列拷贝数的扩增可用于提高细胞对重组蛋白的表达水平(参见例如BendigM.M.(1988)Genet.Sci.Eng.7:91-127；Cockett等人，1990,Bio/technology8:662-667；和美国专利4,399,216)。这是目前广泛使用的方法。然而，建立具有所需高拷贝数和高表达水平的克隆相当耗时费力，而且携带极高拷贝数(高达数百个)的表达盒的克隆常常不稳定(例如，Kim等人，1998,Biotechnol.Bioeng.58:73-84)。因此本发明的一个优选实施方案使用不需要此类针对目标双特异性TCA的高水平表达的扩增策略的宿主细胞。这样使得以一致的方式快速产生表达根据本发明的单链抗体混合物的宿主细胞的稳定克隆。我们提供了根据本发明的宿主细胞可被获得、亚克隆和进一步繁殖至少大约30个细胞分裂(群体倍增)，同时在没有选择压力下以稳定方式表达根据本发明的单链抗体混合物的证据。因此，在某些方面，本发明的方法包括培养细胞至少20、优选25、更优选30个群体倍增，在其它方面，根据本发明的宿主细胞已经进行了至少20、优选25、更优选30个群体倍增并且仍能够表达根据本发明的TCA。
可通过本领域技术人员通常已知的方法从细胞中回收或优选从细胞培养基中回收根据本发明的由细胞表达的TCA。此类方法可包括下列中的一种或多种：沉淀、离心、过滤、病毒过滤、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、阳离子和/或阴离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法等。
3.药物组合物
本发明的另一个方面提供药物组合物，其包含本发明的一种或多种TCA与合适的药学上可接受的载体的混合物。本文所用的药学上可接受的载体例如但不限于佐剂、固体载体、水、缓冲液或在本领域中用来支持治疗组分的其它载体或它们的组合。
可以制备所述抗体变体的治疗配制剂用于保存，通过将具有所需纯度的双特异性TCA与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备根据本发明使用的TCA治疗制剂以供储存(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编著(1980))，例如，形式为冻干制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子如钠离子；金属络合物(如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
将用于体内施用的制剂必须是无菌的。这易于通过经由无菌过滤膜过滤来实现。
可制备缓释制备剂。缓释制备剂的合适实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的半透过性基质，所述基质为成形制品形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物以及聚D-(-)-3-羟丁酸。
抗-CD3抗体制剂公开在例如美国专利公开号20070065437中，其全部公开内容以引用的方式明确并入本文中。类似的制剂可用于本发明双特异性的TCA。此类制剂的主要组分是在3.0至6.2范围内有效的pH缓冲剂、盐、表面活性剂和有效量的具有抗-CD3特异性的TCA。
4.治疗和诊断
本发明的另一方面提供用于治疗或诊断人或动物受试者的TCA。用本文中的双特异性TCA治疗人类受试者(包括但不限于癌症患者)的方法明确地本发明的范围之内。在另一方面，本发明提供了TCA在制备用于治疗或诊断人或动物受试者的疾病或障碍的药物的用途。在某些实施方案中，疾病或病状为肿瘤，例如癌，例如卵巢癌、乳腺癌、胃肠癌、脑癌、头颈癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、血液系统肿瘤如B细胞肿瘤细胞，包括白血病、淋巴瘤、肉瘤、癌瘤、神经细胞瘤、鳞状细胞癌瘤、胚细胞肿瘤、转移瘤、未分化肿瘤、精原细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、混合型细胞瘤、传染物引起的瘤形成和其它恶性肿瘤细胞。
除了癌症免疫疗法之外，本发明的双特异性TCA可用于治疗各种自身免疫性疾病和炎性病状，包括移植排斥和/或I型糖尿病，或由细菌、病毒或寄生虫引起的传染病。
自身免疫疾病包括，例如，获得性免疫缺陷综合征(AIDS，具有自体免疫组分的病毒性疾病)、斑秃、关节强硬性脊椎炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病(Behcet's disease)、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎；慢性疲劳免疫功能异常综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(CIPD)、瘢痕类天疱疮、冷凝集素疾病、crest综合征、克罗恩氏病(Crohn's disease)、德戈斯氏病(Degos'disease)、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、格－巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖性糖尿病(I型糖尿病)、青少年慢性关节炎(斯提耳病(Still's disease))、青少年类风湿性关节炎、美尼尔氏病(Meniere's disease)、混合型结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺现象(Raynaud's phenomena)、莱特尔氏综合征(Reiter'ssyndrome)、风湿热、结节病、硬皮病(进行性系统性硬化病(PSS)，也称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征(jogren's syndrome)、全身肌强直综合征(stiff-man syndrome)、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格内氏肉芽肿症(Wegener'sgranulomatosis)。
炎性病症包括例如慢性和急性炎性病症。炎性病症的实例包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、哮喘、特应性变态反应、变态反应、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主疾病、溶血性贫血、骨关节炎、败血症、中风、组织和器官移植、脉管炎、糖尿病性视网膜病和呼吸机诱导的肺损伤。
传染病的实例包括但不限于由病毒引起的疾病，例如人免疫缺陷病毒(HIV)；流感病毒(INV)；脑心肌炎病毒(EMCV)、口腔炎病毒(VSV)、副流感病毒；鼻病毒；甲型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；丙型肝炎病毒；aptho病毒(apthovirus)；柯萨奇病毒(coxsackievirus)；风疹病毒；轮状病毒；登革热病毒(Dengue virus)；黄热病毒；日本脑炎病毒；传染性支气管炎病毒；猪传染性胃肠道病毒；呼吸道合胞病毒；乳头瘤病毒；单纯性疱疹病毒；水痘病毒；巨细胞病毒；天花病毒；牛痘病毒；猪痘病毒和冠状病毒。
传染病的其它实例包括但不限于微生物引起的疾病，例如伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)；卡介苗(Bacille Calmette-Gurin)；皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)；百日咳杆菌(Bordetella pertussis)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter consisus)；直肠弯曲杆菌(Campylobacter recta)；白色念珠菌(Candida albicans)；二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga sp.)；砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)；啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)；痢疾内阿米巴(Entamoeba histolitica)；肠球菌属(Enterococcus sp.)；大肠杆菌；优杆菌属(Eubacterium sp.)；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、利什曼原虫属(Leishmania sp.)；单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)；淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)；脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)；诺卡氏菌属(Nocardia sp.)；多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)；恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)；牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)；中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)；铜绿假单胞菌；龋齿罗氏菌(Rothia dentocarius)；伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)；鼠伤寒沙门氏菌；粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、志贺氏菌属(Shigelladysenteriae)；链球菌突变体；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)；齿垢密螺旋体(Treponema denticola)；克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)；霍乱弧菌(Vibrio cholera)；和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)。
通过以下非限制性实施例来说明本发明的进一步细节。
实施例1：产生表达仅有重链抗体的基因工程大鼠
在YAC和BAC上构建经修饰的人Ig基因座。
人IgH基因座分若干部分进行构建和装配，其包括修饰和接合大鼠C区基因，然后将大鼠C区基因接合在人VH6-D-JH区的下游。然后将具有独立人VH基因簇的两种BAC[BAC3和BAC6]与编码装配的人VH6-D-JH-大鼠C)片段的BAC共同注射。
对于大鼠，鉴定出恒定区的三个BAC[N12、M5和I8]。对这些BAC分别进行修整，同时将与修整的M5的5’端匹配的170bp的同源臂添加至修整的N12的3’端，将与修整的I8的5’端匹配的100bp的同源臂添加至修整的M5的3’端。这些经修饰的BAC放在一起时包含大部分的大鼠恒定(C)区，包括E(增强子)μ、s(转换区)μ、Cμ、Cδ、sγ2b、Cγ2b、sε、Cε、sα、Cα和3’E。分别除去位于修整的N12和18中的大鼠Cμ和大鼠Cγ2b的CH1区。然后将经修饰的N12和M5接合以产生BAC N12M5。使用
Figure BDA0000410494110000291
/ET重组工程技术进行这些BAC修饰。
由于大肠杆菌中的多个BAC修饰往往缺失重复区例如转换序列和增强子，因此进行技术开发以将在酿酒酵母(S.cerevisiae)中具有重叠端的序列装配成环状YAC(cYAC)，随后将此cYAC转化成BAC。YAC的优点包括其大的尺寸、在酵母宿主中易于同源改变以及序列稳定性，而在大肠杆菌中增殖的BAC则提供了制备容易和产率大的优点。另外，与YAC相比，可在BAC中更好地实现详细的限制性内切图谱和测序分析。构建出两种自主复制的酿酒酵母两个酿酒酵母/肠杆菌穿梭载体：pBelo-CEN-URA和pBelo-CEN-HYG。简言之，将酿酒酵母CEN4自pYAC-RC切割为AvrII片段(Marchuk和Collins，1988)，并连接到SpeI-线性化pAP599。得到的质粒含有在URA3和HygR之间克隆的CEN4。从该质粒起，切割含有URA3(后接CEN4)的ApaLI–BamHI片段，或含有HygR(后接CEN4)的PmlI–SphI片段，并连接至ApaLI和BamHI或HpaI和SphI消化的pBACBelo11(New EnglandBiolabs)，以产生pBelo-CEN-URA和pBelo-CEN-HYG。
对经修饰的I8的限制性内切酶分析显示，此BAC中的sγ2b区为2.5至3kb，比预期的短。为了装配缺少CH1(Cμ中)以及Cγ2b(N12M5I8)的约125kb大鼠C区并保持其真实的构型，将等摩尔的以下纯化片段进行混合：来自经修饰的N12M5,6.5kb XbaI片段的51kb SwaI–NotI，所述片段涵盖真实sγ2b区以替换经修饰的I8中的截短sγ2b(先前克隆到pBeloBAC11中)；来自经修饰的I8的81kb NruI片段；以及含有同源臂(65bp)的PCR-扩增pBelo-CEN-URA，所述同源臂位于与紧接大鼠JH(N12中)下游的序列以及I8中大鼠C区的3’端对应的任一端(引物321和322)。使用标准原生质球转化工序将其中每个片段从65bp至15kb重叠并且其相邻片段同时位于5’和3’端的DNA混合物转化成酿酒酵母AB1380细胞，以选出URA+克隆(Nelsonand Brownstein,1994)。通过酵母中与转化相关的同源重组，装配预期构型的含有N12M5I8的cYAC。所得cYAC中相邻片段的重叠接点通过将酵母基因组DNA用作模板的PCR分析进行确认。纯化后，通过电穿孔将cYAC转化成大肠杆菌DH10感受态细胞(Invitrogen)。通过广泛的限制性内切图谱和测序鉴定正确的BAC N12M5I8。
分3步修饰BAC1以得到含有人VH6-D-JH区的修整的BAC1。首先，将BAC1通过PvuI部分消化并且再连接以除去位于人VH6-1上游的序列。第二，在紧接人JHs下游的PacI位点处以及载体骨架的AscI位点处消化所得截短的BAC1以除去41kb片段。然后，将紧接大鼠JHs下游的2.5kb片段自大鼠基因组DNA扩增并且侧接PacI和AscI位点(引物140和141)。将向经修饰的N12的5’端提供重叠的该PacI–AscI与PacI和AscI双重消化截短的BAC1连接在一起以产生修整的BAC1。
随后，通过cYAC/BAC策略构建BAC3-1N12M5I8。此BAC包含下列从5’到3’的区域：来自BAC3的3’端的11.3kb序列(当共注入大鼠基因组中时向BAC3提供重叠)、整个修整的BAC1以及随后的整个N12M5I8。适宜地，BAC3的3’端与修整的BAC1的5’端重叠5.5kb。为了装配3-1N12M5I8，通过PCR扩增11.3kb BAC3片段，然后与下列片段混合：来自修整的BAC1的PvuI–AscI片段；涵盖整个N12M5I8的MluI片段；以及具有同源臂的扩增pBelo-CEN-URA，所述同源臂位于与11.3kb BAC3片段的5’端和I8的3’对应的两端。此DNA混合物用于转化AB1380细胞。转化过程中每个片段的正确接合通过PCR分析进行确认。将装配的3-1N12M5I8区转化成BAC后，通过限制性内切图谱对其进行充分检查。可将BAC3-1N12M5I8中的重链基因区与位于其3’端的酿酒酵母URA3基因一起整体切割为NotI片段。当整合到大鼠基因组中时，此大DNA片段中URA3的存在有利于对转基因的鉴定。
最后，将位于BAC3中的人VH基因座5’端的10.6kb片段用引物411、412扩增并整合到BAC6中以向BAC3提供重叠。将这种经修饰的BAC命名为BAC6(+3)。BAC6中人VH基因座的3’含有高度重复的序列，这使得经由重组的操作在此区域中非常困难。因此，我们选择将BAC3片段整合到BAC6的载体骨架中。为实现这一点，使用引物427和414扩增65bp同源臂加至分别与10.6kb BAC3的3’端重叠以及与BAC6中人VH基因座的5’端重叠的任一端的pBelo-CEN+URA载体。将包含等摩尔的10.6kb BAC3片段、扩增的pBelo-CEN+URA和未切割BAC6的DNA混合物转化成AB1380酿酒酵母原生质球，并且选择URA+转化体。使用PCR分析来鉴定正确的整合体，所述整合体含有BAC3片段和随后的pBelo-BAC+URA，该pBelo-BAC+URA位于BAC6的载体骨架与BAC6人VH基因座的5’端之间。将此cYAC转化成BAC后，通过限制性内切图谱对其进行充分检查。用AscI消化BAC6(+3)释放大约220kb含有整个BAC6人VH基因座的片段，并且在其3’端，有10.6kb与BAC3片段重叠。
DNA纯化
使用ElutrapTM(Schleicher和Schuell)(Gu等人，1992)从切割自常规操作的0.8%琼脂糖凝胶或得自脉冲场凝胶电泳(PFGE)的条带进行电洗脱来纯化消化后的线性YAC、环状YAC和BAC片段。DNA浓度通常为～100μl的体积中若干个ng/μl。对于多达～200kb的片段，使DNA沉淀并重新溶于微注射缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5、100mM EDTA pH8和100mM NaCl，但不含精胺/亚精胺)达到所需浓度。
使用Nucleobond AX二氧化硅基阴离子交换树脂(Macherey-Nagel,Germany)进行来自酵母的环状YAC的纯化。简言之，使用藤黄节杆菌酶(zymolyase)或溶细胞酶来制备原生质球并使其沉淀(Davies等人，1996)。然后细胞进行碱裂解，结合AX100柱并洗脱，如用于低拷贝质粒的Nucleobond方法所述。将污染的酵母染色体DNA用Plamid–SafeTMATP-依赖性脱氧核糖核酸酶(Epicentre Biotechnologies)水解，然后用SureClean(Bioline)进行最终的清洗步骤。然后用环状YAC转化DH10电感受态细胞(Invitrogen)的等分试样以得到BAC克隆。为了将显微注射用插入DNA(150-200kb)与BAC载体DNA(～10kb)分离，使用琼脂糖凝胶4B-CL进行过滤步骤(Yang等人，1997)。
凝胶分析
通过在常规0.7%琼脂糖凝胶上进行限制性内切酶消化和分离来对纯化的YAC和BAC DNA进行分析(Sambrook和Russell，2001)。在8℃下，通过PFGE(Biorad Chef MapperTM)，使用0.5%TBE中的0.8%PFC琼脂糖凝胶，保持2-20秒的转换时间16小时(6V/cm、10mA)来分离较大的片段(50-200kb)。纯化使得可对所得片段与获自序列分析预测大小进行直接比较。通过PCR分析和测序来分析改变。
显微注射
将远系杂交的SD/Hsd系动物根据实验动物评估和认可管理委员会(AAALAC)认可的动物设施中的获批动物管理方案圈养在标准微型隔离笼中。将大鼠保持在14-10小时光/暗循环中，随意进食和饮水。在与远系杂交的SD/Hsd雄性大鼠配种之前，对四至五周老龄SD/Hsd雌性大鼠注射20-25IU PMSG(Sigma-Aldrich)，48小时后注射20-25IU hCG(Sigma-Aldrich)。收集受精的1-细胞期胚胎用于随后的显微注射。将经操作的胚胎转移到假孕SD/Hsd雌性大鼠以进行分娩。
将编码重组免疫球蛋白基因座的纯化DNA重悬在含有10mM精胺和10mM亚精胺的显微注射缓冲液中。将DNA以0.5至3ng/μl的各种浓度注射到受精的卵母细胞中。
将编码对大鼠免疫球蛋白基因具有特异性的ZFN的质粒DNA或mRNA以0.5至10ng/μl的各种浓度注射到受精的卵母细胞中。
锌指核酸酶(ZFN)
产生对大鼠免疫球蛋白基因具有特异性的ZFN。
对大鼠Ckappa具有特异性的ZFN具有以下结合位点：ATGAGCAGCACCCTCtcgttgACCAAGGCTGACTATGAA(SEQ ID NO:1)
对大鼠J-基因座序列具有特异性的ZFN具有以下结合位点：
CAGGTGTGCCCATCCagctgaGTTAAGGTGGAG(SEQ ID NO:2)和
CAGGACCAGGACACCTGCAgcagcTGGCAGGAAGCAGGT(SEQ IDNO:3)
具有转基因座(transloci)的大鼠。
产生携带呈未重排构型的人工重链免疫球蛋白基因座的转基因大鼠。所包括的恒定区基因编码IgM、IgD、IgG2b、IgE、IgA和3’增强子。对转基因大鼠的RT-PCR和血清分析(ELISA)显示转基因免疫球蛋白基因座的有效重排以及各种同种型的仅有重链抗体在血清中的表达。对转基因大鼠的免疫导致产生高亲和力抗原特异性仅有重链抗体。
新颖的锌指核酸酶敲除技术。
为了进一步优化转基因大鼠中仅有重链抗体的产生，产生含有灭活内源性大鼠免疫球蛋白基因座的敲除大鼠。
为了使大鼠免疫球蛋白重链和大鼠轻链表达失活，将ZFN显微注射到单细胞大鼠胚胎中。随后，将胚胎转移到假孕雌性大鼠并进行分娩。通过PCR鉴定具有突变重链和轻链基因座的动物。对此类动物表的分析证实了突变大鼠中大鼠免疫球蛋白重链和轻链表达的失活。
实施例2：大鼠中抗原特异性仅有重链抗体的产生
为了在大鼠中产生抗原特异性仅有重链抗体，以各种方式对表达仅有重链抗体的基因工程大鼠进行免疫。
用灭活病毒进行免疫
由Immunology and Pathogenesis Branch,Influenza Division,CDC,Atlanta,GA提供具有多种不同血凝素和神经氨酸酶基因的流感病毒。使病毒原液在10天龄的含胚鸡蛋的尿囊腔中增殖，并通过10%-50%蔗糖梯度以超速离心的方式纯化。将病毒重悬于磷酸盐缓冲盐水中并通过在4℃下用0.05%福尔马林处理2周将其灭活。将灭活病毒和alumn溶液(Pierce)以3:1的比率混合并在室温下培育1小时，然后进行免疫。用全部灭活物对表达仅有重链抗体的基因工程大鼠进行免疫。
利用蛋白质或肽进行免疫
通常，将免疫原(蛋白质或肽)用无菌盐水稀释至0.05-0.15ml，然后与佐剂混合至0.1-0.3ml的终体积。许多合适的佐剂是可用的(即热灭活的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、氢氧化铝凝胶、Quil A或皂苷、细菌脂多糖或抗-CD40)，但均不具有完全弗氏佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)的活性。可溶性免疫原(例如蛋白和肽)在最终制备剂中的浓度例可在5μg和5mg之间变化。在腹膜内和/或皮下和/或肌内施用通过CFA中的免疫原进行的初次免疫(免疫启动(priming))。如果将完整细胞用作免疫原，其最好是腹膜内和/或静脉内注射。将细胞稀释在盐水中，每次注射施用100万至2000万个细胞。在大鼠体内存活的细胞将产生最佳免疫效果。在用CFA中的免疫原进行首次免疫后，通常在4周后在IFA中进行二次免疫(加强免疫)。该顺序导致形成产生高亲和力抗体的B细胞。如果免疫原较弱，则每2周施用加强免疫直至实现强体液反应。免疫原浓度在加强免疫中可较低，并且可用静脉内途径。每2周收集大鼠的血清以测定体液反应。
为了产生抗-人CD3e抗体，将基因工程大鼠用his标记的重组人CD3e(Creative Biomart,Shirley,NY)免疫。
利用细胞免疫
使人Jurkat细胞在组织培养物中生长。通过用单克隆抗体OKT3培育Jurkat细胞来分析人CD3e的表达。随后，通过洗涤细胞除去未结合的OKT3，检测结合的细胞，并且用与荧光素缀合的抗-小鼠IgG和流式细胞仪分析来检测结合的OKT3。
通过用所述的编码人CD3的真核表达质粒进行电穿孔来转染大鼠T细胞杂交瘤细胞(Transy等人，1989)。表达人CD3的转染子通过FACS富集并且在组织培养中增殖。
通过腹膜内注射30x10(6)个Jurkat细胞来免疫表达HCO抗体的遗传工程大鼠。在初次免疫后四周和八周后，用表达人CD3的大鼠T细胞免疫大鼠。表达仅有重链抗体的抗-人CD3e的动物用于分离单克隆仅有重链抗-CD3e抗体。
基于DNA的免疫方案
基因疫苗或使用编码抗原的DNA进行免疫代表了一种在大鼠中形成强抗体反应的替代方法。
DNA接种的途径通常是通过皮肤、肌肉和支持抗原转染和表达的任何其它途径。使用已被设计用于表达抗原例如流感病毒血凝素糖蛋白或其它人或病毒抗原的纯化质粒DNA。DNA接种的途径包括以下各项：静脉内(尾静脉)、腹膜内(双侧四头肌)、肌内(双侧股四头肌)、鼻内、皮内(例如足垫)和皮下(例如颈背)。通常，每个接种部位以100μl盐水施用10-100μg的DNA，或用适当的媒介物(例如金颗粒或有利于细胞吸收和转染的某些制剂(http://www.incellart.com/index.php?page=genetic-immunization&menu=3.3))施用DNA。免疫方案类似于上述方案；进行初次免疫，然后进行加强免疫。
仅有重链抗体的纯化。
为了纯化抗体，收集免疫大鼠的血液，并通过离心获得血清或血浆，离心使得凝结的细胞沉淀与含有血清抗体的液体顶相分离。通过标准程序纯化来自血浆血清中的抗体。此类程序包括沉淀、离子交换色谱法和/或亲和色谱法。为了纯化IgG，可使用蛋白A或蛋白G(Brüggemann等人，JI,142,3145,1989)。
实施例3：从大鼠中分离表达抗体的B细胞。
从从脾、淋巴结或外周血分离B细胞
由免疫大鼠的脾或淋巴结制备单细胞悬液。在除去红细胞或分离B细胞、记忆B细胞，抗原特异性B细胞或浆细胞之后，可在无需进一步富集的情况下使用细胞。推荐最低限度地除去红细胞，因此富集可产生更佳的结果。通过排除不需要的细胞和随后的阳性选择来分离记忆B细胞。通过使用针对CD2、CD14、CD16、CD23、CD36、CD43和CD235a的抗体(血型糖蛋白A)的混合物来排除不需要的细胞，例如T细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞、粒细胞、血小板和红细胞系细胞。利用对IgG或CD19具有特异性的抗体进行阳性选择导致高度富集的B细胞(介于50%-95%之间)。通过将细胞暴露于用荧光标记物和/或磁珠的(多种)抗原来获得抗原特异性B细胞。随后，使用(流式细胞仪或荧光激活细胞分选仪〔FACS〕)FACS分选仪和/或磁铁来分离用荧光染料和/或磁珠标记的细胞。当浆细胞可表达很少的表面Ig时，可施加胞内染色。使用对IgM和CD27具有特异性的抗体来分离IgM阳性B细胞记忆细胞。
通过荧光激活细胞分选B细胞
使用基于FACS的方法，根据细胞各自的特性对其进行分离。重要的是细胞处于单细胞悬液中。将由免疫大鼠的外周血、脾或其它器官制备的单细胞悬液与对B细胞标记物(如CD19、CD138和CD27)具有特异性的荧光染料标记抗体混合。或者，用荧光染料标记的抗原培育细胞。适当缓冲液例如PBS中的细胞浓度为100万-2000万个细胞/毫升。例如，可通过选择对CD27呈阳性而对CD45R呈阴性的细胞来分离记忆B细胞。可通过选择对CD138呈阳性而对CD45R呈阴性的细胞来分离浆细胞。将细胞装载到FACS机上并将分类细胞沉积到含有培养基的96孔板或管中。如果需要，在实验中使用每种荧光染料的阳性对照，这允许本底扣除以计算补偿。
从骨髓分离B细胞。
骨髓浆细胞(BMPC)分离自所述的免疫动物(Reddy等人，2010)。将肌肉和脂肪组织从收获的胫骨和股骨中除去。用外科手术剪刀修剪胫骨和股骨的端部并用26规格胰岛素注射器用外科手术剪刀修剪冲洗骨髓（BectonDickinson,BD）。将骨髓收集在1号无菌过滤缓冲液中(PBS,0.1%BSA,2mMEDTA)。通过机械破碎并经由细胞过滤网(BD)过滤来收集骨髓细胞，用20mlPBS洗涤并收集在50ml管(Falcon,BD)中。将骨髓细胞在4℃下以335g离心10min。轻轻倒出上清液并将细胞沉淀重悬于3ml红细胞裂解缓冲液(eBioscience)，在25℃下轻轻振摇5分钟。将细胞悬液用20ml PBS洗涤并在4℃下以335g离心10min。轻轻倒出上清液并将细胞沉淀重悬于1ml 1号缓冲液中。
用生物素化的抗-CD45R和抗-CD49b培育骨髓细胞悬液。然后将细胞悬液在4℃下旋转20分钟。然后在4℃下以930g离心6分钟，除去上清液，将细胞沉淀重悬于1.5ml1号缓冲液中。根据制造商的方案对链霉亲和素缀合的M28磁珠(Invitrogen)进行洗涤和重悬。将磁珠(50μl)加入每种细胞悬液中并将混合物在4℃下旋转20分钟。然后将细胞悬液置于戴诺磁珠(Dynabeadmagnet)(Invitrogen)上，收集上清液(阴性部分，未与珠缀合)并弃去与珠结合的细胞。
将预先洗涤的链霉亲和素M280素磁珠用生物素化的抗-CD138在4℃下培育30分钟，其中每25ul磁珠混合物中配以0.75ug抗体。然后将珠根据制造商的方案进行洗涤并重悬浮于1号缓冲液中。将阴性细胞部分(缺乏CD45R+和CD49b+细胞)按上述方法收集，与50ul CD138-缀合的磁珠一起培养，并将悬浮液在4℃下旋转30分钟。将含有结合CD138+的细胞的珠通过磁铁分离，用1号缓冲液洗涤3次，并弃去与珠未结合的阴性(CD138-)细胞。将结合CD138+珠的阳性细胞收集并在4℃下储存直至进一步处理。
实施例4：杂交瘤的产生
通过与所述的诸如X63或YB2/0细胞的骨髓瘤细胞融合使分离的B细胞永生化(
Figure BDA0000410494110000361
和Milstein，Nature,256,495,1975)。将杂交瘤细胞在选择培养基中培养并通过有限稀释或细胞分选得到产生抗体的杂交瘤细胞。
实施例5：编码仅有重链抗体的cDNA的分离
由分离的细胞产生cDNA序列
将分离的细胞在4℃下以930g离心5分钟。将细胞用TRI试剂裂解，并根据制造商的方案在Ribopure RNA分离试剂盒(Ambion)中分离总RNA。根据制造商的方案用低聚dT树脂和Poly(A)purist试剂盒(Ambion)将mRNA从总RNA中分离。用ND-1000分光光度计(Nanodrop)测量mRNA的浓度。
通过用Maloney鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT,Ambion)进行逆转录将分离的mRNA用于第一链cDNA合成。根据Retroscript(Ambion)的制造商方案，使用50ng mRNA模板和低聚dT引物经由RT-PCR引物法(priming)进行cDNA合成。在cDNA构建后，进行PCR扩增以扩增仅有重链抗体。引物清单在表1中示出：
表1：
Figure BDA0000410494110000371
50ul PCR反应物由以下各项组成：0.2mM正向和反向引物混合物、5ulThermopol缓冲液(NEB)、2ul未纯化cDNA、1ul Taq DNA聚合酶(NEB)和39ul重馏H2O。PCR热循环程序为92oC下进行3分钟；4个循环(92oC下进行1分钟，50oC下进行1分钟，72oC下进行1分钟)，4个循环(92oC下进行1分钟，55℃下进行1分钟，72oC下进行1分钟)，20个循环(92oC下进行1分钟，63oC下进行1分钟，72oC下进行1分钟)；72oC下进行7分钟，在4℃下储存。对PCR基因产物进行凝胶纯化和DNA测序。
实施例6：重组仅有重链抗体的克隆和表达
将PCR产物亚克隆到质粒载体中。为了在真核细胞中表达，将编码仅有重链抗体的cDNA克隆到所述的表达载体中(Tiller等人，2008)。
或者，将编码仅有重链抗体的基因克隆到如所述产生质粒的小环中(Kay等人，2010)。
或者，使用改进的热力学平衡内面向外成核PCR(Gao等人，2003)由重叠的寡核苷酸合成编码仅有重链抗体的基因并该基因克隆到真核表达载体中。
或者，合成编码仅有重链抗体的基因并克隆到质粒中。
为了在人工染色体中装配多个编码各种仅有重链抗体的表达盒编，将多个表达盒相互连接，然后克隆到BAC载体中，其在细菌中增殖。对于转染，使用来自Invitrogen的ElectroMAXTM DH10BTM细胞(http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/18290015.pdf)。或者，将连接的表达盒进一步与酵母人工染色体臂连接，其在酵母细胞中增殖(Davies等人，1996)。
质粒纯化
使用来自Sigma-Aldrich的GenEluteTM质粒小提试剂盒从～5ml(或较大)过夜细菌培养物中分离质粒(http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/dna-and-rna-purifi cation/plasmid-miniprep-kit.html)。这包括通过离心，然后通过碱裂解收获细菌细胞。然后使DNA结合到柱上，将其洗涤并洗脱DNA，准备用于消化和测序。
BAC纯化
来自Clontech的NucleoBondR BAC100是设计用于BAC纯化的试剂盒(http://www.clontech.com/products/detail.asp?tabno=2&product_id=186802)。就此而言，从200ml培养物中收获细菌并使用改进的碱/SDS工序进行裂解。将细菌裂解物通过过滤澄清并装载到平衡柱上，其中质粒DNA与阴离子交换树脂结合。在随后的冲洗步骤后，将纯化的质粒DNA在高盐缓冲液中洗脱并用异丙醇沉淀。将质粒DNA复溶TE缓冲液中以供进一步使用。
YAC纯化
使用ElutrapTM(Schleicher and Schuell)(Gu等人，1992)从切割自常规操作的0.8%琼脂糖凝胶或得自脉冲场凝胶电泳(PFGE)的条带进行电洗脱来纯化消化后的线性YAC、环状YAC和BAC片段。使纯化的DNA沉淀，并重新溶解在缓冲液中至所需浓度。
使用Nucleobond AX二氧化硅基阴离子交换树脂(Macherey-Nagel,Germany)纯化来自酵母的环状YAC。简言之，使用藤黄节杆菌酶(zymolyase)或溶细胞酶来制备原生质球并使其沉淀(Davies等人，1996)。然后细胞进行碱裂解，结合AX100柱并洗脱，如用于低拷贝质粒的Nucleobond方法所述。将污染的酵母染色体DNA用Plamid–SafeTMATP-依赖性脱氧核糖核酸酶(Epicentre Biotechnologies)水解，然后用SureClean(Bioline)进行最终的清洗步骤。然后用环状YAC转化DH10电感受态细胞(Invitrogen)的等分试样以得到BAC克隆(参见上文)。为了将插入DNA(150-200kb)与BAC载体DNA(～10kb)分离，使用琼脂糖凝胶4B-CL进行过滤步骤(Yang等人，1997)。
用质粒或BAC DNA转染细胞
为了表达重组仅有重链抗体，将真核细胞按照所述进行转染(Andreason和Evans，1989；Baker和Cotton，1997；使用各种选择方法将表达仅有重链抗体的细胞分离。http://www.millipore.com/cellbiology/cb3/mammaliancell).使用有限稀释或细胞分选来分离单细胞。分析克隆的仅有重链抗体的表达。
实施例7：与CD3-ε具有反应性的单重链多肽的制备
按照美国专利号7,728,114B2对HCOA大鼠进行免疫。
使大鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并对B-细胞杂交瘤进行筛选以表达抗-人CD3e抗体。
或者，按照所述对大鼠B细胞进行分离和培育(J Immunol Methods1993,160(1):117-127)。筛选培养物上清液中抗-人CD3e抗体的存在，并通过RT-PCR从分离的RNA产生编码此类抗体的cDNA。
实施例8：双特异性TCA的制备
用编码抗体重链、抗体轻链和抗-CD3仅有重链抗体的三种表达质粒转染CHO细胞。选择表达TCA的转染子后，使细胞在组织培养基中进一步增殖。通过蛋白A色谱法，然后进行离子交换色谱法和/或亲和色谱法从培养物上清液纯化TCA。
通过分析型阳离子交换色谱法以及所述基于质谱法的技术(Persson等人，2010)分析纯化的重组仅有重链抗体的组成。
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Claims (28)

1.一种双特异性三链抗体样分子(TCA)，其包含
(a)抗体重链和轻链对或其功能片段，其包含与第一结合靶特异性结合的抗原结合区和至少一个重链恒定区序列；和
(b)重链抗体，其包含与第二结合靶特异性结合的抗原结合区，以及CH2、CH3和/或CH3区，但不含CH1区。
2.根据权利要求1所述的双特异性TCA，其中所述抗体重链和轻链对包含与第一结合靶特异性结合的抗原结合区和CH1序列。
3.根据权利要求1所述的双特异性TCA，其中所述抗体重链和轻链对包含与第一结合靶特异性结合的抗原结合区以及CH1和CH2序列。
4.根据权利要求1所述的双特异性TCA，其中所述抗体重链和轻链对包含与第一结合靶特异性结合的抗原结合区以及CH1、CH2和CH3序列。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的双特异性TCA，其中所述抗体重链和轻链对进一步包含铰链区。
6.根据权利要求1所述的双特异性TCA，其中所述抗体重链和轻链或其功能性片段彼此共价连接。
7.根据权利要求6所述的双特异性TCA，其中所述抗体重链和轻链或其功能性片段通过二硫键连接。
8.根据权利要求1所述的双特异性TCA，其中所述重链抗体包含与第二结合靶特异性结合的抗原结合区和CH2区，但不含CH1区。
9.根据权利要求8所述的双特异性TCA，其中所述重链抗体包含CH3区，但不含CH1区。
10.根据权利要求9所述的双特异性TCA，其中所述重链抗体包含CH4区，但不含CH1区。
11.根据权利要求8、9或10所述的双特异性TCA，其中所述重链抗体进一步包含铰链区。
12.根据权利要求1所述的双特异性TCA，其中所述第一结合靶和第二结合靶为两种不同的抗原。
13.根据权利要求12所述的双特异性TCA，其中所述第一抗原为由靶细胞表达的细胞表面抗原，且所述第二抗原由效应细胞表达。
14.根据权利要求1所述的双特异性TCA，其中所述第一结合靶和第二结合靶为同一抗原上的两种不同的表位。
15.根据权利要求1所述的双特异性TCA，其中所述第一结合靶和第二结合靶中的至少一个为CD3复合物的一部分。
16.根据权利要求1所述的双特异性TCA，其中所述第一结合靶和第二结合靶中的至少一个为CD3抗原。
17.根据权利要求16所述的双特异性TCA，其中所述CD3抗原为CD3ε。
18.根据权利要求1所述的双特异性TCA，其为人源化的或人类的。
19.一种药物组合物，其包含权利要求1或权利要求12-18中任一项所述的双特异性TCA。
20.一种试剂盒，其包括含有根据权利要求1所述的双特异性TCA或根据权利要求19所述的药物组合物的容器，和指导使用者使用所述组合物的说明书。
21.一种制备根据权利要求1所述的双特异性TCA的方法，其包括在单一宿主细胞中表达所述抗体重链和轻链对以及所述重链抗体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
25.一种治疗癌症的方法，其包括将有效量的根据权利要求1所述的双特异性TCA施用给被诊断患有所述癌症的受试者。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：卵巢癌、乳腺癌、胃肠癌、脑癌、头颈癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、癌瘤、神经细胞瘤、鳞状细胞癌瘤、胚细胞瘤、转移瘤、未分化肿瘤、精原细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、混合型细胞瘤和传染物引起的瘤形成。
27.一种治疗自身免疫疾病或炎性病状的方法，其包括将有效量的根据权利要求1所述的双特异性TCA施用给有需要的受试者。
28.一种治疗由细菌、病毒或寄生虫引起的传染病的方法，其包括将有效量的根据权利要求1所述的双特异性TCA施用给有需要的受试者。
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