ES2353084T3 - Complejo covalente de factor vii y factor tisular. - Google Patents
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Abstract
Complejo covalente de un polipéptido de factor VII funcionalmente activo y un polipéptido de factor tisular, donde dichos polipéptido de factor VII y polipéptido de factor tisular están vinculados de manera covalente mediante una o más uniones directas entre cadenas laterales de aminoácidos de conjuntos de (i) un aminoácido del polipéptido de factor VII y (ii) un aminoácido del polipéptido de factor tisular.
Description
Complejo covalente de factor VII y factor
tisular.
La presente invención se refiere a nuevos
complejos covalentes de un polipéptido de factor VII y un
polipéptido de factor tisular, en particular a tales complejos los
cuales son funcionalmente activos y tienen una actividad
proteolítica de factor X mejorada en comparación con el polipéptido
de factor VII libre correspondiente. Tales complejos se creen
particularmente útiles en el tratamiento de trastornos de
sangrado.
Los polipéptidos de factor VIIa con actividad
biológica aumentada son moléculas deseables para el tratamiento de
sangrados descontrolados que son parcialmente o completamente
refractarias a la terapia de factor VIIa recombinante convencional
debido a la fuerza subóptima del factor VIIa recombinante. Enfoques
actuales para mejorar la potencia reflejan el mecanismo de acción
del factor VIIa recombinante el cual parece ser la activación de
factor X directa en la plaqueta activada independiente de factor
tisular.
El factor tisular es un receptor de
glicoproteína de membrana integral de 263 aminoácidos residiendo en
las células de la adventitia vascular. Consiste en una parte
extracelular plegada en dos dominios de tipo III de fibronectina
compactos (1-219) cada uno estabilizado por una
única unión disulfuro, un segmento de transmembrana
(220-242), y una cola citoplásmica corta
(243-263). Éste sirve como el factor determinante de
coagulación formando un complejo apretado dependiente de Ca^{2+}
con factor VII el cual se captura a partir de la circulación en una
lesión vascular. El factor tisular también aumenta inmensamente la
actividad proteolítica del factor VIIa hacia sus sustratos
fisiológicos de factor IX y factor X proporcionando un andamio para
interacciones de exositio macromoleculares óptimas e induciendo a
cambios conformacionales en el dominio de la proteasa de factor
VIIa dando como resultado la definición correcta de la región de
sitio activo. La activación conformacional de FVIIa mediante TF la
cual resulta de la interacción directa
proteína-proteína, se puede recapitular in
vitro suministrando factor VIIa con el ectodominio soluble del
factor tisular (sTF).
Miyata et al., Biochemistry, 36, 1997,
5120-5127, revela un complejo covalente de factor
VIIa recombinante y factor tisular soluble estando químicamente
reticulado mediante un reactivo amina-específico
homo-bifuncional. No obstante el complejo
reticulado no mostró actividad proteolítica hacia el factor X.
La presente invención se refiere a nuevos
complejos covalentes de un polipéptido de factor VII y un
polipéptido de factor tisular. Los complejos mostraron una actividad
proteolítica mejorada hacia el factor X de sustrato macromolecular
en relación al polipéptido de factor VII libre correspondiente.
Más particularmente, la presente invención se
refiere a un complejo covalente de un polipéptido de factor VII y
un polipéptido de factor tisular, donde el polipéptido de factor VII
y el polipéptido de factor tisular están vinculados covalentemente
mediante uno o más enlaces designados entre cadenas laterales de
aminoácido de conjuntos de (i) un aminoácido del polipéptido de
factor VII y (ii) un aminoácido del polipéptido de factor
tisular.
Por otra parte, la presente invención también se
refiere a un complejo covalente de un polipéptido de factor VIIa y
un polipéptido de factor tisular, donde el polipéptido de factor
VIIa y el polipéptido de factor tisular están vinculados
covalentemente mediante uno o más enlaces entre cadenas laterales de
aminoácidos de conjuntos de (i) un aminoácido del polipéptido de
factor VIIa y (ii) un aminoácido del polipéptido de factor tisular,
donde la actividad proteolítica del polipéptido de factor VIIa es al
menos 2 veces, tal como al menos 50 veces, por ejemplo al menos 100
veces, tal como al menos 200 veces, o al menos 250 veces, de la
cantidad de factor VIIa libre nativo (de tipo salvaje), como se
determina por el ensayo proteolítico in vitro definido
aquí.
La presente invención también se refiere a un
método para la producción de un complejo de un polipéptido de
factor VII y un polipéptido de factor tisular tal y como se define
aquí, el método comprendiendo a) transfectar una célula con (i) un
vector de expresión comprendiendo una molécula de ácido nucleico
codificando el polipéptido de factor VII y regiones de control de
expresión operativamente vinculados a la misma y (ii) y un vector de
expresión comprendiendo una molécula de ácido nucleico codificando
el polipéptido de factor tisular y regiones de control de expresión
operativamente vinculados a la misma, b) cultivar la célula
modificada bajo condiciones para la expresión del polipéptido de
factor VII y el polipéptido de factor tisular, y c) aislar el
complejo expresado por medios adecuados.
La Figura 1 muestra un modelo del complejo
covalente de factor VIIa y el factor tisular soluble conteniendo un
bisulfuro de extensión por palmos de interfaz entre v207C en factor
tisular soluble y f40C en factor VIIa. La
C_{o}-distancia de v207C o f40C con los residuos
de cisteína nativos (tipo salvaje) a través de la interfaz es
significativamente mayor de 7 \ring{A} lo cual excluye la
formación de parejas de bisulfuro no intencionadas entre las dos
moléculas.
La Figura 2 muestra un gel de
SDS-poliacrilamida manchado de Coomassie de factor
VIIa nativo (tipo salvaje) (vía A) y el complejo de factor VIIa
purificado F40C-sTF(1-219)
v207C (vía B) bajo condiciones no reductoras y reductoras,
respectivamente. HC y LC representan las cadenas pesada y ligera del
factor VIIa.
La Figura 3 muestra una inmunotransferencia de
factor VIIa de tipo salvaje (vía A), un medio acondicionado a
partir de la coexpresión transitoria de q64C y
sTF(1-219) g109C (vía B) de factor VII, y
complejo F40C-sTF(1-219)
v207C (vía C) de factor VIIa purificado.
La presente invención, i.a., se refiere a un
complejo covalente de un polipéptido de factor VII y un polipéptido
de factor tisular, donde el polipéptido de factor VII y el
polipéptido de factor tisular están enlazados covalentemente
mediante uno o más enlaces designados entre cadenas laterales
de aminoácido de conjuntos de (i) un aminoácido del polipéptido de
factor VII y (ii) un aminoácido del polipéptido de factor
tisular.
En el presente contexto, el término "complejo
covalente" se refiere a dos moléculas (aquí: un polipéptido de
factor VII y un polipéptido de factor tisular) asociadas por al
menos un enlace o unión covalente y una pluralidad de interacciones
no covalentes, por ejemplo uniones de hidrógeno, interacciones
hidrofóbicas, etc. Por lo tanto, el polipéptido de factor VII y el
polipéptido de factor tisular están vinculados covalentemente de
esta manera.
Los dos polipéptidos se vinculan mediante uno o
más enlaces designados entre cadenas laterales de aminoácidos de
conjuntos de (i) un aminoácido del polipéptido de factor VII y (ii)
un aminoácido del polipéptido de factor
tisular.
tisular.
Cuando se usa aquí, el término "polipéptido de
factor VII" comprende factor VII de tipo salvaje (es decir, un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la
patente EEUU nº. 4.784.950), al igual que variantes de factor VII,
derivados de factor VII y conjugados de factor VII mostrando
sustancialmente una actividad biológica igual o mejorada en
relación al factor VII de tipo salvaje. El término "factor VII"
se utiliza para expresar polipéptidos de factor VII en sus formas
no divididas (zimógenos), al igual que aquellos que se han
procesado proteolíticamente para producir sus formas bioactivas
respectivas, las cuales pueden designarse como factor VIIa.
Típicamente, el factor VII se divide entre los residuos 152 y 153
para producir factor VIIa. El término "polipéptido de factor
VII" también comprenden polipéptidos, incluyendo variantes, en
los cuales la actividad biológica de factor VIIa se ha modificado
sustancialmente o se ha reducido en cierta medida en relación a la
actividad de factor VIIa de tipo salvaje. Estos polipéptidos
incluyen, sin limitación, factor VII o factor VIIa en los cuales se
han introducido alteraciones de secuencias de aminoácidos
específicas que modifican o disgregan la bioactividad del
polipép-
tido.
tido.
La actividad biológica del factor VIIa en la
coagulación sanguínea deriva de su capacidad para (i) enlazarse con
factor tisular (TF) y (ii) catalizar la escisión proteolítica de
factor IX o factor X para producir factor IX o X activado (factor
IXa o Xa, respectivamente).
En el presente contexto, el término
"polipéptido de factor VII funcionalmente activo" se refiere a
"polipéptido de factor VII" que se ha procesado
proteolíticamente para producir sus formas bioactivas respectivas,
y que frecuentemente son referidos como "polipéptidos de factor
VIIa".
En algunas formas de realización importantes, el
polipéptido de factor VII es funcionalmente activo.
Como se utiliza en este caso "FVIIa humano de
tipo salvaje" es un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos descrita en la patente estadounidense nº. 4.784.950.
El término "derivado de factor VII" como se
utiliza en este caso, se utiliza para designar un polipéptido FVII
exhibiendo sustancialmente una actividad biológica igual o mejorada
en relación al factor VII de tipo salvaje, en el cual uno o más de
los aminoácidos del péptido progenitor se ha modificado
genéticamente y/o químicamente y/o enzimáticamente, por ejemplo por
alquilación, glicosilación, PEGilación, acilación, formación de
éster o formación de amida o similar. Éste incluye, pero no se
limita a factor VIIa humano pegilado, factor VIIa humano de
cisteína pegilado y variantes de los mismos. Ejemplos no limitativos
de derivados de factor VII incluyen derivados de FVII
GlicoPegilados como se describe en WO 03/31464 y en las solicitudes
de patente estadounidense nos. 20040043446, 20040063911,
20040142856, 20040137557, y nos. 20040132640 (Neose Technologies,
Inc.); conjugados de FVII como se describe en WO 01/04287, la
solicitud de patente estadounidense 20030165996, WO 01/58935, WO
03/93465 (Maxygen ApS) y WO 02/02764, la solicitud de patente
estadounidense 20030211094 (University of
Minnesota).
Minnesota).
El término "actividad biológica mejorada"
se refiere a polipéptidos de FVII con i) sustancialmente una
actividad proteolítica igual o aumentada en comparación con el
factor VIIa humano de tipo salvaje recombinante o ii) con
polipéptidos de FVII con una actividad de unión TF sustancialmente
igual o aumentada en comparación con el factor VIIa humano de tipo
salvaje recombinante o iii) con polipéptidos de FVII con una vida
media en plasma sanguíneo sustancialmente igual o aumentada en
comparación con el factor VIIa humano de tipo salvaje recombinante.
El término "factor VIIa humano PEGilado" significa factor VIIa
humano, teniendo una molécula PEG conjugada a un polipéptido de
factor VIIa humano. Debe entenderse, que la molécula PEG se puede
fijar a cualquier parte del polipéptido de factor VIIa incluyendo
cualquier residuo de aminoácido o fracción de carbohidrato del
polipéptido de factor VIIa. El término "factor VIIa humano
PEGilado de cisteina" significa factor VIIa con una molécula PEG
conjugada a un grupo sulfhidrilo de una cisteína introducida en
factor VIIa humano.
Ejemplos no limitativos de sustituciones
adicionales de aminoácidos en el polipéptido de factor VII
proporcionando polipéptidos de factor VII con una actividad
proteolítica sustancialmente igual o aumentada en comparación con
el factor VIIa humano de tipo salvaje recombinante incluyen s52A,
s60A (Lino et al., arcoArch. Biochem. Biophys. 352:
182-192, 1998); sustituciones proporcionando
polipéptidos de FVIIa mostrando una estabilidad proteolítica
aumentada como se describe en la patente EEUU nº. 5.580.560;
sustituciones de polipéptidos de FVIIa que han sido
proteolíticamente divididos entre los residuos 290 y 291 o entre los
residuos 315 y 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng.
48:501-505, 1995); formas oxidadas de factor VIIa
(Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys.
363:43-54, 1999); sustituciones en polipéptidos de
FVIIa como se describen en WO 02/077218; y sustituciones en
polipéptidos de FVIIa, los cuales exhiben una estabilidad
proteolítica aumentada como se describe en WO 02/38162 (Scripps
Research Institute); sustituciones en polipéptidos FVIIa, las cuales
proporcionan polipéptidos teniendo un dominio Gla modificado y
exhibiendo una unión de membrana mejorada como se describe en WO
99/20767, las patentes US 6017882 y US 6747003, la solicitud de
patente US 20030100506 (University of Minnesota) y WO 00/66753, las
solicitudes de patente estadounidense US 20010018414, US 2004220106,
y US 200131005, las patentes US 6762286 y US 6693075 (University of
Minnesota); y sustituciones en polipéptidos de FVIIa como se
describen en WO 01/58935, la patente estadounidense US 6806063, la
solicitud de patente estadounidense US 20030096338 (Maxygen ApS),
WO 03/93465 (Maxygen ApS), WO 04/029091 (Maxygen ApS), WO 04/083361
(Maxygen ApS), y WO 04/111242 (Maxygen ApS), al igual que en WO
04/108763 (Chemo-Sero-Therapeutic
Res Inst.).
Ejemplos no limitativos de otras sustituciones
en polipéptidos de FVIIa proporcionando polipéptidos de FVII
teniendo una actividad biológica aumentada en comparación con el
FVIIa de tipo salvaje incluyen sustituciones como se describen en
WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, WO 03/027147, WO 04/029090,
WO 03/027147; WO 02/38162 (Scripps Research Institute); y
polipéptidos de FVIIa con actividad mejorada como se describe en JP
2001061479
(Chemo-Sero-Chemo-Sero-Therapeutic
Res Inst.).
Ejemplos de otras sustituciones en los
polipéptidos de FVIIa de la presente invención incluyen, sin
limitación, l305V, l305V/M306D/D309S, l305I, l305T, f374P,
v158T/M298Q, v158D/E296V/M298Q, k337A, M298Q, v158D/
M298Q, l305V/K337A, v158D/E296V/M298Q/L305V, v158D/E296V/M298Q/K337A, v158D/E296V/M298Q/
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K337A/E296V, K316Q/l305V/K337A/V158D, K316Q/l305V/V158D/M298Q, K316Q/l305V/V158D/E296V,
K316Q/l305V/V158T/M298Q, K316Q/L305V/V158T/E296V, K316Q/L305V/E296V/M298Q, K316Q/L305V/
V158D/E296V/M298Q, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q, K316Q/L305V/V158T/K337A/M 298Q, K316Q/
L305V/V158T/E296V/K337A, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A,
K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A, F374Y/k337A,
F374Y/V158D, F374Y/E296V, F374Y/M298Q, F374Y/V158T, F374Y/S314E, F374Y/l305V, F374Y/l305V/K337A, F374Y/l305V/V158D, F374Y/l305V/E296V, F374Y/l305V/M298Q, F374Y/l305V/V158T, F374Y/L305V/S314E,
F374Y/K337A/S314E, F374Y/K337A/V158T, F374Y/K337A/M298Q, F374Y/K337A/E296V, F374Y/K337A/
V158D, F374Y/V158D/S314E, F374Y/v158D/M298Q, F374Y/V158D/E296V, F374Y/V158T/S314E, F374Y/
v158T/ M298Q, F374Y/V158T/E296V, F374Y/E296V/S314E, F374Y/S314E/M298Q, F374Y/E296V/M298Q,
F374Y/l305V/K337A/V158D, F374Y/l305V/K337A/E296V, F374Y/l305V/K337A/M298Q, F374Y/l305V/K337A/
V158T, F374Y/L305V/K337A/S314E, F374Y/l305V/V158D/E296V, F374Y/l305V/V158D/M298Q, F374Y/L305V/
V158D/S314E, F374Y/L305V/E296V/M298Q, F374Y/L305V/E296V/V158T, F374Y/L305V/E296V/S314E,
F374Y/L305V/M298Q/V158T, F374Y/L305V/M298Q/S314E, F374Y/L305V/V158T/S314E, F374Y/K337A/
S314E/V158T, F374Y/K337A/S314E/M298Q, F374Y/K337A/S314E/E296V, F374Y/K337A/S314E/V158D, F374Y/
K337A/V158T/M298Q, F374Y/K337A/V158T/E296V, F374Y/K337A/M298Q/E296V, F374Y/K337A/M298Q/
V158D, F374Y/K337A/E296V/V158D, F374Y/V158D/S314E/M298Q, F374Y/V158D/S314E/E296V, F374Y/
V158D/M298Q/E296V, F374Y/V158T/S314E/E296V, F374Y/V158T/S314E/M298Q, F374Y/V158T/M298Q/
E296V, F374Y/E296V/S314E/M298Q, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E, F374Y/L305V/E296V/K337A/
S314E, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A, F374Y/L305V/E296V/
M298Q/S314E, F374Y/v158D/E296V/M298Q/K337A, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E, F374Y/L305V/
V158D/K337A/S314E, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E, F374Y/
L305V/V158D/E296V/M298Q, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A,
F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E, F374Y/V158T/E296V/
M298QJK337A, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E, F374Y/V158T/
M298Q/K337A/S314E, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q, F374Y/
L305V/V158T/M298Q/K337A, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E,
F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E, F374Y/V158D/E296V/
M298Q/K337A/S314E, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/
S314E, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E, F374Y/
L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A, F374Y/L305V/V158D/
E296V/K337A/S314E, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/
V158T/S314E, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E, s52A, s60A; R152E, S344A, T106N, K143N/
N145T, V253N, R290N/A292T, G291N, R315N/V317T, K143N/N/45T/R315N/V317T; y sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos de 233Tr a 240Asn; sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos de 304Arg a 329Cis; y sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos de 153Ile a 223Arg.
M298Q, l305V/K337A, v158D/E296V/M298Q/L305V, v158D/E296V/M298Q/K337A, v158D/E296V/M298Q/
L305V/K337A, k157A, E296V, E296V/M298Q, V158D/E296V, v158D/M298K, y s336G, l305V/K337A, l305V/
V158D, l305V/E296V, l305V/M298Q, l305V/V158T, l305V/K337A/V158T, l305V/K337A/M298Q, l305V/K337A/
E296V, l305V/K337A/V158D, l305V/V158D/M298Q, l305V/V158D/E296V, l305V/V158T/M298Q, l305V/V158T/
E296V, l305V/E296V/M298Q, l305V/v158D/E296V/M298Q, l305V/V158T/E296V/M298Q, l305V/V158T/K337A/
M298Q, l305V/V158T/E296V/K337A, l305V/V158D/K337A/M298Q, l305V/V158D/E296V/K337A, l305V/v158D/
E296V/M298Q/K337A, l305V/V158T/E296V/M298Q/K337A, S314E/K316H, S314E/K316Q, S314E/l305V,
S314E/k337A, S314E/V158D, S314E/E296V, S314E/M298Q, S314E/V158T, K316H/l305V, K316H/k337A, K316H/
V158D, K316H/E296V, K316H/M298Q, K316H/V158T, K316Q/l305V, K316Q/k337A, K316Q/V158D, K316Q/
E296V, K316Q/M298Q, K316Q/V158T, S314E/l305V/K337A, S314E/l305V/V158D, S314E/l305V/E296V, S314E/
l305V/M298Q, S314E/l305V/V158T, S314E/l305V/K337A/V158T, S314E/l305V/K337A/M298Q, S314E/l305V/
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L305V/V158T/K337A/M298Q, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q,
K316H/L305V/V158D/E296V/K337A, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A, K316H/L305V/V158T/
E296V/M298Q/K337A, K316Q/l305V/K337A, K316Q/l305V/V158D, K316Q/l305V/E296V, K316Q/L30SV/
M298Q, K316Q/l305V/V158T, K316Q/l305V/K337A/V158T, K316Q/l305V/K337A/M298Q, K316Q/l305V/
K337A/E296V, K316Q/l305V/K337A/V158D, K316Q/l305V/V158D/M298Q, K316Q/l305V/V158D/E296V,
K316Q/l305V/V158T/M298Q, K316Q/L305V/V158T/E296V, K316Q/L305V/E296V/M298Q, K316Q/L305V/
V158D/E296V/M298Q, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q, K316Q/L305V/V158T/K337A/M 298Q, K316Q/
L305V/V158T/E296V/K337A, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A,
K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A, F374Y/k337A,
F374Y/V158D, F374Y/E296V, F374Y/M298Q, F374Y/V158T, F374Y/S314E, F374Y/l305V, F374Y/l305V/K337A, F374Y/l305V/V158D, F374Y/l305V/E296V, F374Y/l305V/M298Q, F374Y/l305V/V158T, F374Y/L305V/S314E,
F374Y/K337A/S314E, F374Y/K337A/V158T, F374Y/K337A/M298Q, F374Y/K337A/E296V, F374Y/K337A/
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v158T/ M298Q, F374Y/V158T/E296V, F374Y/E296V/S314E, F374Y/S314E/M298Q, F374Y/E296V/M298Q,
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F374Y/L305V/M298Q/V158T, F374Y/L305V/M298Q/S314E, F374Y/L305V/V158T/S314E, F374Y/K337A/
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K337A/V158T/M298Q, F374Y/K337A/V158T/E296V, F374Y/K337A/M298Q/E296V, F374Y/K337A/M298Q/
V158D, F374Y/K337A/E296V/V158D, F374Y/V158D/S314E/M298Q, F374Y/V158D/S314E/E296V, F374Y/
V158D/M298Q/E296V, F374Y/V158T/S314E/E296V, F374Y/V158T/S314E/M298Q, F374Y/V158T/M298Q/
E296V, F374Y/E296V/S314E/M298Q, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E, F374Y/L305V/E296V/K337A/
S314E, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A, F374Y/L305V/E296V/
M298Q/S314E, F374Y/v158D/E296V/M298Q/K337A, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E, F374Y/L305V/
V158D/K337A/S314E, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E, F374Y/
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E296V/K337A/S314E, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/
V158T/S314E, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E, s52A, s60A; R152E, S344A, T106N, K143N/
N145T, V253N, R290N/A292T, G291N, R315N/V317T, K143N/N/45T/R315N/V317T; y sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos de 233Tr a 240Asn; sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos de 304Arg a 329Cis; y sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos de 153Ile a 223Arg.
Los términos "variante" o "variantes",
como se utilizan en este caso, se utilizan para designar el factor
VII teniendo la secuencia de aminoácidos descrita en la patente EEUU
nº. 4.784.950, donde uno o más aminoácidos de la proteína
progenitora se han sustituido por otro aminoácido y/o donde uno o
más aminoácidos de la proteína progenitora se han delecionado y/o
donde uno o más aminoácidos se han insertado en proteína y/o donde
uno o más aminoácidos se han añadido a la proteína progenitora. Tal
adición puede tener lugar o bien en el extremo
N-terminal o en el extremo
C-terminal de la proteína progenitora o en ambos. La
"variante" o "variantes" dentro de esta definición
todavía tiene actividad de FVII en su forma activada. En una forma
de realización una variante es idéntica en un 70% a la secuencia de
aminoácidos descrita en la patente EEUU nº. 4.784.950. En una forma
de realización una variante es idéntica en un 80% a la secuencia de
aminoácidos descrita en la patente EEUU nº. 4.784.950. En otra
forma de realización una variante es idéntica en un 90% a la
secuencia de aminoácidos descrita en la patente EEUU nº. 4.784.950.
En otra forma de realización una variante es idéntica en un 95% a
la secuencia de aminoácidos descrita en la patente EEUU nº.
4.784.950.
En el presente contexto, el término
"polipéptido de factor tisular" se refiere a un polipéptido
comprendiendo el ectodominio soluble de factor tisular, es decir
los aminoácidos 1-219 (en lo sucesivo referidos como
sTF o sTF(1-219)), o una variante funcional
o forma truncada del mismo. Preferiblemente, el polipéptido de
factor tisular al menos comprende un fragmento correspondiente a la
secuencia de aminoácidos 6-209 de factor tisular.
Ejemplos de esto son, en particular,
sTF(6-209), sTF(1-209)
y sTF(1- 219).
La secuencia de aminoácidos de factor tisular
humano maduro (1-263) se da en la SEC ID NO:2 y se
describe en Spicer et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.
EEUU, 84, 5148-5152.
En el presente contexto, los términos "enlace
designado" y "enlaces designados" significan que el
polipéptido de factor VII y el polipéptido de factor tisular están
vinculados covalentemente mediante uno o más conjuntos de cadenas
laterales de aminoácido vinculadas covalentemente (posiblemente via
una fracción enlazadora), donde el/los
conjunto(s) para al menos un 90% de las especies complejas es/son idéntico(s) con respecto a la posición y el tipo de al menos uno de los dos aminoácidos dentro de cada uno del/de los conjunto(s) en una población de especies complejas. Tales enlaces pueden o bien establecerse como uniones directas entre cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo en forma de un puente S-S entre cadenas laterales de aminoácidos de cisteína, o por medio de una fracción enlazadora conectando cadenas laterales de aminoácidos.
conjunto(s) para al menos un 90% de las especies complejas es/son idéntico(s) con respecto a la posición y el tipo de al menos uno de los dos aminoácidos dentro de cada uno del/de los conjunto(s) en una población de especies complejas. Tales enlaces pueden o bien establecerse como uniones directas entre cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo en forma de un puente S-S entre cadenas laterales de aminoácidos de cisteína, o por medio de una fracción enlazadora conectando cadenas laterales de aminoácidos.
Preferiblemente, al menos un 95%, o incluso al
menos un 98%, o incluso prácticamente la totalidad de las especies
complejas son idénticas con respecto a la posición y tipo de al
menos uno de los dos aminoácidos dentro de cada uno del/de los
conjunto(s) en todas partes de una población de especies
complejas.
El número de conjuntos de cadenas laterales de
aminoácidos vinculadas de manera covalente no es particularmente
crítico, pero en vista de los presentes resultados experimentales,
se cree que sólo es necesario un conjunto. Debido a que los enlaces
están "designados", es decir la posición y el tipo de al menos
uno de los dos aminoácidos dentro de cada uno del/de los
conjunto(s) están predeterminados, se debe entender que la
funcionalidad y la actividad proteolítica de los polipéptidos
implicados se pueden mantener e incluso mejorar, a diferencia de un
enfoque "shotgun" usando unos agentes
(homo)bifuncionales de reticulación comunes. Estando dicho
esto, se cree que el número de conjuntos de cadenas laterales de
aminoácido vinculadas de manera covalente está típicamente en el
rango de 1-10, por ejemplo 1-5, tal
como 1-4, ó 1-3,
1-2, ó 2-4, ó 2-3, ó
1 ó 2 conexión(es), en particular 1 ó 2 enlaces,
preferiblemente sólo una conexión.
La formación de uno o más enlaces designados se
puede realizar o bien por incorporación de uno o más aminoácidos en
uno o ambos polipéptido(s) cada uno de los cuales es capaz de
reaccionar con un aminoácido del otro polipéptido, o por adición de
un agente de reticulación (más preferiblemente un agente de
reticulación heterobifuncional) que sea capaz de reaccionar con uno
o más aminoácidos específicos (preferiblemente sólo
1-10 aminoáci-
dos).
dos).
En una forma de realización importante, cada uno
de los polipéptidos de factor VII y el polipéptido de factor
tisular incluyen uno o más aminoácidos de cisteína no designados
para establecer un enlace de bisulfuro intramolecular, pero el cual
es capaz de formar enlaces de disulfuro intermoleculares entre el
polipéptido de factor VII y el polipéptido de factor tisular, es
decir enlaces covalentes.
Con el fin de preservar la actividad
proteolítica del polipéptido de factor VII, es ventajoso si tales
aminoácidos de cisteína se localizan en la interfaz nativa entre el
polipéptido de factor VII y el polipéptido de factor tisular en el
complejo vinculado de manera no covalente correspondiente, por
ejemplo como se ilustra en la Figura 1. Si la unión disulfuro
intramolecular está bien diseñada, ésta estabilizará el complejo y
promoverá la conformación catalíticamente competente del factor
VIIa. El diseño de disulfuro se ha realizado aplicando estructuras
de rayos X de factor VIIA/complejo de factor tisular (en particular
la estructura con código de introducción PDB 1DAN (Banner et
al. (1996) Nature, 380, 41-46)). Un criterio
importante para establecer una unión disulfuro entre dos
aminoácidos de cisteína introducidos es que la distancia entre sus
átomos C_{\alpha} es de menos de 7 \ring{A}ngstrom (Petersen
et al. (1999) Protein Eng., 12, 535-548). El
cálculo de distancias entre átomos C_{\alpha} en factor VIIa y
factor tisular en el complejo factor VIIa-factor
tisular resulta en 17 pares de cisteína potenciales. Otra
evaluación de la posibilidad de formación de uniones disulfuro entre
éstas se ha realizado modelando los disulfuros (usando el paquete
CHARMM, Accelrys, SanDiego) seguido de una inspección visual.
Los disulfuros ejecutando el criterio
establecido por Petersen et al (1999) Protein Eng., 12,
535-548 están entonces considerados como candidatos
para evaluación bioquímica.
En otra forma de realización, el polipéptido de
factor VII y/o el polipéptido de factor tisular incluyen uno o más
aminoácidos reactivos, en particular aminoácidos fotorreactivos los
cuales, en la fotoactivación, son capaces de formar uniones
intermoleculares correspondientes entre el polipéptido de factor VII
y el polipéptido de factor tisular, es decir enlaces covalentes.
Ejemplos de tales aminoácidos fotorreactivos son fotoisoleucina
(foto-Ile), fotometionina
(foto-Met), y fotoleucina (foto-Leu)
desarrollados por Suchanek et al: (Suchanek et al.
2005; véase el Esquema 1), y
p-benzoil-L-fenilalanina.
\newpage
Esquema
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La incorporación de foto-Ile,
foto-Met, y foto-Leu en proteínas y
la posterior reticulación fotoinducida se han descrito por Suchanek
et al. (2005) Nature methods, 2, 261-267.
Alternativamente, el o los enlaces designados se
establecen mediante una fracción enlazadora entre cadenas laterales
de aminoácidos de uno o más conjuntos de un aminoácidos del
polipéptido de factor VII y un aminoácido del polipéptido de factor
tisular. Ejemplos de tales fracciones enlazadoras son aquellas
derivadas de un reactivo heterobifuncional el cual es capaz de
reaccionar con una cadena lateral de aminoácidos específica, por
ejemplo unas cadenas laterales de cisteína en uno de los
polipéptidos, y posteriormente con otra cadena lateral de
aminoácidos que esté espacialmente cerca de la cadena lateral de
aminoácidos específica cuando el polipéptido de factor VII y el
polipéptido de factor tisular forman un complejo vinculado de manera
no covalente.
Ejemplos de reactivos heterobifuncionales
especialmente adecuados son aquellos que son capaces de reaccionar
en primer lugar con una cadena lateral de aminoácido de cisteína, y
posteriormente (preferiblemente en la activación, por ejemplo
fotoactivación o rodio catalizado) con otra cadena lateral de
aminoácido la cual esté espacialmente cerca. Ejemplos particulares
de esto son los descritos por Zhang et al. (Biochem. Biophys.
Res. Comm., Vol. 217, 3, 1995, 1177-1184), por
ejemplo p-azidoiodoacetanilida, de
p-azidofenacil bromuro y
p-azidobromoacetanilida, y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
N-(4-azido-2,
3,5,6-tetrafluorobenzil)-3-maleimidilpropionamida,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzamidocisteina
metanotiosulfonato,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
N-(2-((2-(((4-azido-2,3,5,6-tetrafluoro)benzoil)amino)etil)di
tio)etil)maleimida,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
N-[4-(p-azidosalicilamido)butil]-3'-(2'-piridilditio)propionamida,
N-((2-piridilditio)etil)-4-azidosalicilamida,
[1-(p-azidosalicilamido)-4-(iodoacetamido)butano],
etc.
Visto lo anterior, está claro que las formas de
realización donde se establece el enlace covalente mediante una
cadena lateral reactiva o por un reactivo heterobifuncional puede
dar lugar a una población de especies complejas donde no todas las
especies son idénticas. Esto se debe al hecho de que una cadena
lateral reactiva (p. ej. una cadena lateral fotoreactiva) y un
reactivo heterobifuncional (incluso después de una reacción
específica con una cadena lateral de aminoácido) puede experimentar
más de un "compañero de reacción" potencial en otras
reacciones, aunque el número de "compañeros de reacción" puede
reducirse espectacularmente si el tamaño (longitud) de la cadena
lateral/reactivo se reduce. No obstante en algunas formas de
realización es posible seleccionar las cadenas laterales de
aminoácidos implicadas (o el reactivo bifuncional) de manera que
prácticamente existen en un posible "compañero de reacción".
Esto es particularmente cierto cuando la conexión está en forma de
un enlace bisulfuro, debido a que la abundancia de "compañeros de
reacción" (es decir, otra cisteína) posibles es muy
limitada.
Por lo tanto en una forma de realización
preferida, la presente invención proporciona el complejo tal y como
se define anteriormente, donde el polipéptido de factor VII y el
polipéptido de factor tisular están vinculados de manera covalente
mediante uno o más enlaces específicos entre cadenas
laterales de aminoácidos de grupos de (i) un aminoácido del
polipéptido de factor VII y (ii) un aminoácido del polipéptido de
factor tisular.
En el presente contexto, los términos "enlace
específico" y "enlaces específicos" significan que el
polipéptido de factor VII y el polipéptido de factor tisular están
vinculados covalentemente mediante uno o más conjuntos de cadenas
laterales de aminoácido vinculadas de manera covalente (posiblemente
via una fracción enlazadora), donde el/los conjunto(s) para
al menos el 90% de las especies complejas son idénticos con respecto
a la posición y el tipo de cada aminoácido dentro de cada uno
del/de los conjunto(s) en todas partes de una población de
especies complejas.
Preferiblemente, al menos un 95%, o incluso al
menos un 98%, o incluso prácticamente todas, de las especies
complejas son idénticas con respecto a la posición y el tipo de cada
aminoácido dentro de cada uno del/de los conjunto(s)
en todas partes de una población de especies complejas.
en todas partes de una población de especies complejas.
Incluso más preferiblemente, uno o más enlaces
específicos están establecidos como una o más uniones directas
entre cadenas laterales de aminoácidos de uno o más conjuntos de un
aminoácido del polipéptido del factor VII y un aminoácido del
polipéptido de factor tisular.
Por lo tanto la presente invención además
proporciona el complejo definido anteriormente, donde el
polipéptido de factor VII y el polipéptido de factor tisular están
vinculados covalentemente mediante una o más uniones
directas entre cadenas laterales de aminoácido de grupos de (i)
un aminoácido del polipéptido de factor VII y (ii) un aminoácido
del polipéptido de factor tisular.
En el presente contexto, los términos "unión
directa" y "uniones directas" significan que al menos una
conexión covalente entre una cadena lateral de aminoácidos del
polipéptido del factor VII y una cadena lateral de aminoácidos del
polipéptido de factor tisular no incluye residuos derivados de
agentes de reticulación, reactivos, etc., pero se forma por átomos
derivados de las cadenas laterales de aminoácidos respectivas, por
ejemplo en forma de un puente S-S entre cadenas
laterales de aminoácido de cisteína, no obstante, teniendo en
cuenta que tales aminoácidos no necesitan ser aminoácidos naturales,
pero pueden, sino que ejemplo, pueden ser cadenas laterales
fotoreactivas. Consecuentemente, la formación de la unión directa no
incluye reactivos bifuncionales y similares.
En vista de lo anterior, se prefiere que los
conjuntos de aminoácidos comprendan uno o más aminoácidos de
cisteína.
En una variante, cada uno de los conjuntos
comprende un aminoácido de cisteína, por ejemplo para su uso
durante el acoplamiento a un reactivo heterobifuncional.
En otra variante, cada uno de los conjuntos
comprende dos aminoácidos de cisteína. En esta variante está
establecida una conexión de bisulfuro.
Se ha descubierto que la actividad proteolítica
principalmente se conserva o incluso se mejora. Por tanto, formas
de realización preferidas son aquellas donde la actividad
proteolítica del polipéptido de factor VIIa es de al menos 2 veces,
tal como de al menos 50, por ejemplo de al menos 100 veces, tal como
de al menos 200 veces, o de al menos 250 veces, la del factor VIIa
nativo libre (de tipo salvaje), como se determina por el ensayo de
proteolisis in vitro definido aquí.
Por lo tanto, la invención también se refiere a
un complejo covalente de un polipéptido de factor VIIa y un
polipéptido de factor tisular, donde el polipéptido de factor VIIa y
el polipéptido de factor tisular están vinculados covalentemente
mediante uno o más enlaces entre cadenas laterales de aminoácido de
grupos de (i) un aminoácido del polipéptido de factor VIIa y (ii)
un aminoácido del polipéptido de factor tisular, donde la actividad
proteolítica del polipéptido de factor VIIa es de al menos 2 veces,
tal como de al menos 50 veces, por ejemplo de al menos 100 veces,
tal como de al menos 200 veces, o de al menos 250 veces, la del
factor VIIa nativo libre (de tipo salvaje), como se determina por el
ensayo de proteólisis in vitro definido aquí.
Como se ha mencionado anteriormente, el
polipéptido de factor tisular es el ectodominio soluble de factor
tisular (1-219) o una variante funcional o forma
truncada del mismo.
En algunas formas de realización importantes, al
menos uno de los aminoácidos en las posiciones Thr17, Lys20, Ile22,
Ser42, Gly43, Asp44, Trp45, Lys46, Ser47, Phe50, Cys57, Asp58,
Asp61, Gly109, Gln110, Leu133, Ser205, Pro206 y Val207 en el
polipéptido de factor tisular soluble, en particular Trp45, Asp58,
Gly109, Pro206 y Val207 en el polipéptido de factor tisular
soluble, se ha sustituido por un aminoácido con una cadena lateral
reactiva que da lugar a una conexión designada, tal como una
conexión específica, en particular una unión directa. En una
variante preferida, al menos un aminoácido es un aminoácido de
cisteína.
En otras formas de realización importantes, las
cuales preferiblemente se combinan con la anterior, al menos uno de
los aminoácidos en las posiciones Leu39, Phe40, Ile42, Ser43, Tyr44,
Gln64, Leu65, Ile69, Glu77, Gly78, Arg79, Val92, Phe275, Val276,
Arg277, Met306, Thr307, y Glu325 del polipéptido de factor VII, en
particular Phe40, Ser43, Gln64 Glu77 y Phe275 del polipéptido de
factor VII, se ha sustituido por un aminoácido con una cadena
lateral reactiva que da lugar a una conexión designada, tal como una
conexión específica, en particular un enlace directo. En una
variante preferida, al menos un aminoácido es un aminoácido de
cisteína.
Más particularmente, uno o ambos aminoácidos de
al menos uno de los conjuntos de aminoácidos
FVII-Ile69 -
sTF-Thr17,
FVII-Ile69 -
sTF-Lys20,
FVII-Arg79 -
sTF-Ile22,
FVII-Val92 -
sTF-Ser47,
FVII-Val92 -
sTF-Phe50,
FVII-Gly78 -
sTF-Cys57,
FVII-Glu77 -
sTF-Asp58,
FVII-Gly78 -
sTF-Asp58,
FVII-Arg79 -
sTF-Asp58,
FVII-Arg277 -
sTF-Ser42,
FVII-Val276 -
sTF-Gly43,
FVII-Arg277 -
sTF-Gly43,
FVII-Phe275 -
sTF-Asp44,
FVII-Val276 -
sTF-Asp44,
FVII-Arg277 -
sTF-Asp44,
FVII-Phe275 -
sTF-Trp45,
FVII-Val276 -
sTF-Trp45,
FVII-Arg134 -
sTF-Trp45,
FVII-Phe275 -
sTF-Lys46,
FVII-Gln64 -
sTF-Gly109,
FVII-Gln64 -
sTF-Gln110,
FVII-Leu65 -
sTF-Gln110,
FVII-Phe71 -
sTF-Leu133,
FVII-Ser43 -
sTF-Ser205,
FVII-Leu39 -
sTF-Pro206,
FVII-Phe40 -
sTF-Pro206,
FVII-Ile42 -
sTF-Pro206,
FVII-Ser43 -
sTF-Pro206,
FVII-Tyr44 -
sTF-Pro206,
FVII-Leu39 -
sTF-Val207,
FVII-Phe40 -
sTF-Val207, y
FVII-Ser43 -
sTF-Val207,
en particular al menos uno de los conjuntos de
aminoácidos
FVII-Phe40 -
sTF-Val207,
FVII-Ser43 -
sTF-Pro206,
FVII-Gln64 -
sTF-Gly109,
FVII-Glu77 -
sTF-Asp58, y
FVII-Phe275 -
sTF-Trp45,
se ha sustituido por un aminoácido con una
cadena lateral reactiva que da lugar a una conexión designada, tal
como una conexión específica, en particular una unión directa.
En una variante preferida, al menos una unión
directa es una unión disulfuro, es decir un enlace entre dos
aminoácidos de cisteína. Más preferiblemente, todos los enlaces
covalentes son uniones directas en forma de uniones disulfuro. En
particular, el número de tales uniones es de 1-5, en
particular 1 enlace.
En otra variante, al menos una unión directa
está formada vía un aminoácido fotorreactivo, en particular
seleccionado del grupo que consiste en foto-Ile,
foto-Leu y foto-Met.
En otra forma de realización, el polipéptido de
factor VII y el polipéptido de factor tisular están vinculados
covalentemente mediante una fracción enlazadora entre cadenas
laterales de aminoácidos de uno o más conjuntos de (i) un
aminoácido del polipéptido de factor VII y (i) un aminoácido del
polipéptido de factor tisular. En particular, la fracción
enlazadora se deriva de un reactivo heterobifuncional.
\vskip1.000000\baselineskip
En una variante interesante, el método para la
preparación del complejo implica la producción de una variante de
cisteína de factor tisular soluble, la etiquetación posterior de la
cisteína en factor tisular soluble con un reactivo
heterobifuncional en el cual una de las funcionalidades es cisteína
reactiva, y finalmente la reticulación a factor VIIa en virtud de
la segunda funcionalidad del reactivo. Métodos para la clonación y
la expresión de variantes de cisteína de factor tisular en
Escherichia coli al igual que la etiquetación posterior con
un reactivo específico de cisteína se han descrito previamente
(Stone et al. (1995) Biochem. J., 310,
605-614; Freskg\ring{a}rd et al. (1996)
Protein Sci., 5, 1521-1540; Owenius et al.
(1999) Biophys. J., 77, 2237-2250; Österlund et
al. (2001) Biochemistry, 40, 9324-9328). La
fotorreticulación de proteínas usando reactivos heterobifuncionales
conteniendo una cisteína específica y una funcionalidad
fotoactivable se ha descrito por Zhang et al. (1995)
Biochem. Biophys. Res. Commun., 217, 1177-
1184.
1184.
\vskip1.000000\baselineskip
En una variante particularmente interesante, el
método para la preparación del complejo implica la coexpresión del
polipéptido de factor VII y el polipéptido de factor tisular, donde
la conexión covalente entre los dos polipéptidos se puede
establecer fácilmente.
Más particularmente, la presente invención
también se refiere a un método para la producción de un complejo de
un polipéptido de factor VII y un polipéptido de factor tisular tal
y como se define aquí, el método comprendiendo a) transfectar una
célula con (i) un vector de expresión comprendiendo una molécula de
ácido nucleico codificando el polipéptido de factor VII y regiones
de control de la expresión operativamente vinculadas a la misma y
(ii) y un vector de expresión comprendiendo una molécula de ácido
nucleico codificando el polipéptido de factor tisular y regiones de
control de la expresión operativamente vinculados a la la misma, b)
cultivar la célula modificada bajo condiciones para la expresión del
polipéptido de factor VII y el polipéptido de factor tisular, y c)
aislar el complejo expresado por medios adecuados.
En una forma de realización particularmente
interesante de lo mismo, los dos polipéptidos se vinculan mediante
una conexión específica, más particularmente mediante una conexión
directa, tal como uno o más enlaces disulfuro entre el polipéptido
de factor VII y el polipéptido de factor tisular.
La expresión de proteína en células es bien
conocida por el experto en la técnica de producción de proteína. Al
practicar el método de la invención, las células son típicamente
células eucariotas, más preferiblemente una línea celular eucariota
establecida, incluyendo, sin limitación, las líneas celulares CHO
(p. ej., ATCC CCL 61), COS-1 (p. ej., ATCC CRL
1650), riñón de cría de hámster (BHK), y HEK293 (p. ej., ATCC CRL
1573 Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72,
1977). Una línea celular BHK preferida es la línea celular BHK
tk^{-} ts13 (Waechter y Baserga, Proc. Narl. Acad. Sci. EEUU
79:1106-1110, 1982), de ahora en adelante referidas
como células BHK-570. La línea celular
BHK-570 está disponible a través de la American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, bajo
el número de acceso ATCC CRL 10314. Una línea celular tk^{-} ts13
BHK también está disponible a través de la ATCC bajo el número de
acceso CRL 1632. Una línea celular CHO preferida es la línea
celular CHO K1 disponible a través de la ATCC bajo el número de
acceso CCl61.
Otras líneas celulares adecuadas incluyen, sin
limitación, Hep I de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), rata
Enterada II (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139),
pulmón humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1); células
DUKX (línea celular CHO) (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.
EEUU 77:4216-4220, 1980) (las células DUKX estando
también referidas como células DXB11), y DG44 (línea celular CHO)
(Cell, 33: 405, 1983, y Somatic Cell and Molecular Genetics 12:
555, 1986). También son útiles las células 3T3, las células
Namalwa, las mielomas y las fusiones de mielomas con otras células.
En algunas formas de realización, las células pueden ser células
recombinantes o mutantes, tales como, por ejemplo, células que
expresan un espectro cualitativa o cuantitativamente diferente de
enzimas que catalizan una modificación postraduccional de proteínas
(p. ej., enzimas de glicosilación tales como transferasas de
glicosil y/o glicosidasas, o enzimas de procesamiento tales como
propéptidos) del tipo de células de las cuales éstas están
derivadas. Líneas celulares de insecto adecuadas también incluyen,
sin limitación, líneas celulares de lepidópteros, tales como células
de Spodoptera frugiperda o células de Trichoplusia ni
(véase, por ejemplo, US 5.077.214).
En algunas formas de realización, las células
usadas al poner en práctica la invención son capaces madurar en
cultivos de suspensión. Como se utilizan en este caso, las células
competentes para suspensión son aquellas que pueden crecer en
suspensión sin formar agregados grandes y firmes, es decir, células
que son monodispersas o crecen en agregados sueltos con sólo unas
pocas células por agregagado. Células competentes para suspensión
incluyen, sin limitación, células que crecen en suspensión sin
adaptación o manipulación (tales como, por ejemplo, células
hematopoyéticas o células linfoides) y células que se han hecho
competentes para suspensión por adaptación gradual de células
dependientes de fijación (tales como, por ejemplo, las células
epiteliales o de fibroblasto) para el crecimiento de la
suspensión.
Las células usadas en para poner en práctica la
invención pueden ser células de adhesión (también conocidas como
células dependientes de fijación o dependientes de anclaje). Como se
utilizan en este caso, las células de adhesión son las que se deben
adherir o anclar a una superficie adecuada para la propagación y el
crecimiento. En una forma de realización de la invención, las
células usadas son células de adhesión. En estas formas de
realización, las fases de propagación y la fase de producción
incluyen el uso de microportadores. Las células de adhesión usadas
deberían ser capaces de migrar sobre los portadores (y en la
estructura interior de los portadores si se usa un portador
macroporoso) durante la(s) fase(s) de propagación y
para migrar a portadores nuevos estando transferidas al biorreactor
de producción. Si las células de adhesión no son suficientemente
capaces de migrar a portadores nuevos por sí mismos, estas pueden
ser liberadas de los portadores poniendo en contacto los
microportadores conteniendo células con enzimas proteolíticas o
EDTA. El medio usado (particularmente cuando está libre de
componentes derivados de animales) debería contener además
componentes adecuados para dar soporte a células de adhesión;
medios adecuados para cultivar células de adhesión están disponibles
a través de proveedores comerciales, tales como, por
ejemplo,
Sigma.
Sigma.
Las células también pueden estar adaptar para
suspensión o ser células competentes para suspensión. Si se usan
tales células, la propagación de células se puede realizar en
suspensión, así los microportadores sólo se usan en la fase de
propagación final en el mismo vaso de cultivo de producción y en la
fase de producción. En caso de células adaptadas para suspensión
los microportadores usados son típicamente portadores macroporosos
donde las células están fijadas mediante atrapamiento físico dentro
de la estructura interna de los portadores. En tales formas de
realización, la célula eucariótica se selecciona típicamente de
entre CHO, BHK, HEK293, células de mieloma,
etc.
etc.
El polipéptido de factor VII y el polipéptido de
factor tisular también se pueden coexpresar en E. coli. o en
bacterias o en animales transgénicos, por ejemplo como describe la
solicitud de patente internacional con número de publicación WO
05/075635.
\vskip1.000000\baselineskip
La terminología para las sustituciones de
aminoácido usada en los siguientes ejemplos es la siguiente. La
primera letra representa el aminoácido presente de forma natural en
una posición de la SEC ID NO:1 o la SEC ID NO:2. El siguiente
número representa la posición en la SEC ID NO:1 o la SEC ID NO:2. La
segunda letra representa el aminoácido diferente que substituye al
aminoácido natural. Un ejemplo es F40C de factor VIIa, donde una
fenilalanina en la posición 40 de la SEC ID No:1 se sustituye por
una cisteína. En otro ejemplo, sTF(1-219)
V207C, la valina en la posición 207 de la SEC ID NO:2 se sustituye
por una cisteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Materiales -
D-Phe-Phe-Arg-clorometilo
cetona se compraron a través de Bachem. Los sustratos cromogénicos
Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida
(S-2765), y
H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida
(S-2288) se obtuvieron a través de Chromogenix
(Suecia). El factor X derivado de plasma humano (hFX), Factor Xa
(hFXa), y IXa de factor (hFIXa) se obtuvieron a partir de Enzyme
Research Laboratories Ltd. (South Bend, IN). La genoteca de ADNc
Cerebro humano entero Preparado maratón de de se obtuvo de
Clontech (vista de montaña, CA). Se preparó factor tisular soluble
1-219 (sTF(1-219)) expresado
en Escherichia coli según los procedimientos publicados
(Freskg\ring{a}rd et al. (1996) Protein Sci., 5,
1531-1540). La expresión y purificación de factor
VIIa recombinante se realizó como se describe previamente (Thim
et al. (1988) Biochemistry, 27, 7785-7793;
Persson et al. (1996) FEBS Lett., 385,
241-243). Todos los demás productos químicos eran de
calidad analítica o mejor.
Construcción de ADN codificando factor VII y
factor VII F40C mutante - La secuencia de codificación de ADN
de factor VII incluyendo su pre (secuencia señal) y
pro-regiones se amplificó por PCR usando el sistema
de PCR Expand High Fidelity (Roche Diagnostics Corporation,
Indianapolis, IN) según las recomendaciones del fabricante y los
cebadores oHOJ104-f y oHOJ104-r,
introduciendo los sitios de restricción NheI y NotI flanqueantes
(las secuencias de cebador se catalogan en la Tabla 1). El patrón de
ADN para la reacción de PCR fue pLN174 como se describe en la
solicitud de patente internacional con número de publicación WO
02/077218. El producto de PCR purificado se cortó con NheI y NotI y
después se ligó en los sitios correspondientes de
pCI-neo (Promega, Madison, WI) para obtener fOJ300.
El aminoácido de factor VII (de tipo salvaje) nativo se da en la SEC
ID NO:1. La secuencia de ADN de factor VII (de tipo salvaje) nativo
incluyendo su pre (secuencia señal) y pro-regiones
se da en la SEC ID
NO:3.
NO:3.
El plásmido fOJ344 codificando factor VII f40C
fue construido mediante mutagénesis dirigida QuickChange® usando
los cebadores oHOJ143-f y oHOJ143-r
y fOJ300 como patrón según las instrucciones del fabricante
(Stratagene, la Jolla, CA). La identidad correcta de todas las
secuencias clonadas se verificó mediante secuenciación del ADN.
Construcción de ADN codificando
sTF(1-219) y
sTF(1-219) v207C mutante - La secuencia
de codificación de ADN de sTF(1-219)
incluyendo su secuencia de señal se amplificó a partir de una
genoteca de ADNc de cerebro humano entera
(Marathon-ready cDNA; Clontech Laboratories Inc.,
Mountain View, CA) por PCR usando el sistema de PCR Expand High
Fidelity (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) según las
recomendaciones del fabricante y los cebadores
oHOJ152-f y oHOJ152-r, introduciendo
los sitios de restricción NheI y XhoI flanqueantes (las secuencias
de cebador se catalogan en la Tabla 1). El producto de PCR
purificado se cortó con NheI y XhoI y después se ligó en los sitios
correspondientes de pCI-neo (Promega, Madison, WI)
para obtener
fOJ356.
fOJ356.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El aminoácido de
sTF(1-219) se da en la SEC ID NO:4. La
secuencia de ADN de sTF(1-219) incluyendo su
secuencia señal se da en la SEC ID NO:5.
El plásmido fOJ357 codificando
sTF(1-219) v207C se construyó mediante
mutagénesis dirigida QuickChange® usando los cebadores
oHOJ144-f y oHOJ144-r y fOJ356 como
patrón según las instrucciones del fabricante (Stratagene, La
Jolla, CA). La identidad correcta de todas las secuencias clonadas
se verificó por secuenciación de
ADN.
ADN.
Coexpresión de factor VII f40C y
sTF(1-219) v207C - Factor VIIA f40C y
sTF(1-219) v207C fueron
co-expresadas por expresión transitoria en el
sistema de expresión Freestyle^{TM} 293 (Invitrogen, Carlsbad,
CA) según las instrucciones del fabricante. En concreto, las células
HEK293F (Invitrogen, Carlsbad, CA) se propagaron a partir de un
cultivo crioconservado de manera que en primer lugar se establece un
72-ml cultivo para agitador de 1,5x10^{7} células
en Medio de Expresión FreeStyle^{TM} 293 (Invitrogen, Carlsbad,
CA). El cultivo se expandió a 2000 ml de 2,2x10^{9} células
durante un periodo de 12 días. Las células se cultivaron en
matraces PEGT cónicos disipados con cápsulas libres (Nunc,
Dinamarca) a 37ºC, con un 8% de CO_{2}, y a
100-125 r.p.m. en un incubadora de agitación
orbital (Multitron II, Infors, Suiza). La densidad celular nunca
excedió 1,4x10^{6} células/ml antes de la expansión del cultivo,
y el volumen matraz:cultivo se mantuvo en aproximadamente 3:1.
Excepto el cultivo de 72-ml inicial, el medio de
crecimiento proporcionado se suplementó con vitamina K1 a 5 ppm
(Sigma) requerida para la gamma-carboxilación
postraduccional de factor VII. El cultivo HEK293F expandido (2000
ml, 2,2x10^{9} células) se modificó después con una mezcla
conteniendo de 800 \mug de plásmido fOJ344 (1 \mug/\mul) y
1500 \mug de ADN plásmido fOJ357 (1 \mug/\mul). La adición de
ADN plásmido y 239fectin^{TM} (Invitrogen, Carlsbad, CA) a la
solución Opti-MEM® I (Invitrogen, Carlsbad, CA), al
igual que la mezcla de éstas y la posterior adición de los complejos
de ADN de lípidos formado para el cultivo celular se realizaron
gota a gota mientras se agita suavemente en movimientos circulares
la solución recibida y según las instrucciones del fabricante. Tras
la incubación del cultivo modificado durante 96 horas a 37ºC, con
un 8% de CO_{2}, y a 100 r.p.m., el medio de cultivo conteniendo
el complejo de factor VIIa
F40C-sTF(1-219) v207C se
recuperó por centrifugado y se almacenó a -80ºC hasta posterior
tratamiento.
Purificación del complejo de factor VII
F40C-sTF(1-219) v207C -
medio acondicionado al cual se le ha añadido CaCl_{2} en una
concentración de 10 mM se introdujo en una columna de 25 ml
conteniendo el anticuerpo monoclonal F1A2 (Novo Nordisk A/S,
Bagsvaerd, Dinamarca) acoplada a sefarosa 4B activado CNBr (Amersham
Biosciences, GE Healtcare). La columna se equilibró con 50 mM de
HEPES, 100 mM de NaCl, 10 mM de CaCl_{2}, a pH 7.5. Después se
lavó con tampón de equilibrado y tampón de equilibrado conteniendo 2
M de NaCl, el material enlazado se eluyó con tampón de equilibrado
conteniendo 10 mM de EDTA en vez de CaCl_{2}. Posteriormente se
añadió cloruro de calcio a la fracción de valor máximo recogida
hasta obtener una concentración final de 20 mM.
Para eliminar cantidades pequeñas de factor VIIa
F40C libre, la preparación se pasó a través de una columna de
1-ml HiTrap NHS (GE Healthcare) a la cual se le han
acoplado 4 mg de sTF(1-219) según las
instrucciones del fabricante. Antes de la carga, la columna se
equilibró en 50 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 10 mM de CaCl_{2}, a
pH 7.5. Se recogió el flujo conteniendo complejo de factor VII
F40C-sTF(1-219) v207C, y
desprovisto de factor VII f40C y sTF(1-219)
v207C detectable libre.
Para promover la activación del complejo de
factor VII F40C-sTF(1-219)
v207C, se añadió factor IXa humano hasta obtener una concentración
final de 0,1 mg/ml. Después de la activación completa como se ha
verificado reduciendo SDS-PAGE, el complejo de
factor VIIa F40C-sTF(1-219)
v207C se purificó por cromatografía de afinidad F1A2 de sefarosa 4B
como se ha descrito anteriormente, a excepción de que se usó una
columna de 5-ml y el tampón de equilibrado era de
10 mM de MES, 100 mM NaCl, 10 mM de CaCl_{2}, pH 6.0. La
preparación de proteína final se almacenó en partes alícuotas a
-80ºC.
Ensayo de titulación de sitio activo -
Las concentraciones de sitio activas de factor VIIA (de tipo
salvaje) nativo y de factor VIIA F40C-
sTF(1-219) v207C se determinaron a partir de
la pérdida irreversible de actividad amidolítica por la titulación
con niveles sub-estequiométricos de
D-Phe-Phe-Arg-clorometilo
cetona (FFR-cmk) esencialmente como se describe en
otro sitio (Bock P.E. (1992) J. Biol. Chem., 267,
14963-14973). En concreto, cada proteína se diluyó
en un tampón de 50 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 10 mM de CaCl_{2},
0,01% de Tween 80, a pH 7.0 hasta obtener una concentración
aproximada de 300 nM. La proteína diluida (20 \mul) se combinó
después con 20 \mul 1,5 \muM sTF en el caso del factor VIIa
libre y 20 \mul de tampón en el caso de factor VIIa
F40C-sTF(1-219) v207C, y
finalmente 20 \mul 0-1.2 \muM
FFR-cmk (recién preparado en tampón a partir de una
materia prima de FFR-cmk disuelta en DMSO y
almacenada a -80ºC). Después de una noche de incubación a
temperatura ambiente, se midió la actividad residual amidolítica. El
ensayo de actividad se llevó a cabo en placas de microtitulación de
poliestireno (Nunc, Dinamarca) en un volumen final de 200 \mul de
tampón de ensayo (50 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 5 mM de
CaCl_{2}, 0,01% de Tween 80, a pH 7.4) conteniendo aprox. 10 nM
de complejo de factor VIIa o factor VIIA-sTF,
correspondiente a 10 veces las diluciones de las muestras. Después
de 15 min de preincubación a temperatura ambiente, se añadió 1 mM de
sustrato cromogénico S-2288 y la absorbencia se
vigiló continuamente a 405 nm durante 10 min en un espectrofotómetro
de microplaca SpectraMax^{TM} 340 equipado con el software
SOFTmax PRO (v2.2; Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA). La
actividad amidolítica se registró como la pendiente de las curvas de
progreso lineal tras la sustracción sin procesar. Las
concentraciones de sitio activo se determinaron por extrapolación a
actividad cero, correspondiente a la concentración mínima de
FFR-cmk anulando completamente la actividad
amidolítico.
amidolítico.
Ensayo de proteolisis in vitro -
factor VIIa (de tipo salvaje) y factor VIIa
F40C-sTF(1-219) v207C
nativos se sometieron a ensayo en paralelo para comparar
directamente sus actividades específicas. El ensayo se efectuó en
una placa de microtitulación (Nunc, Dinamarca). Factor VIIa (300 nm)
o factor VIIa F40C-sTF(1-219)
v207C (15 nm) y factor humano X (0,2 \muM) en tampón de 100
\mul 50 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 5 mM de CaCl_{2}, 0,01% de
Tween 80, a pH 7.4 se incubaron durante 20 min a temperatura
ambiente. La activación de factor X se detuvo entonces mediante la
adición de un tampón de 50 \mul 50 mM de HEPES, 100 mM de NaCl,
40 mM de EDTA, 0,01% de Tween 80, a pH 7.4 conteniendo 0,5 \muM de
anticuerpo TF8-5G9 bloqueando el sitio de unión FX
en TF (Ruf et al. (1991) Thromb. Haemost., 66,
529-533). La cantidad de FXa generado se midió por
adición de 50 \mul del sustrato cromogénico
Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida
(S-2765) hasta obtener una concentración final de
0,5 mM. La absorbancia a 405 nm se midió continuamente en un
espectrofotómetro de microplaca SpectraMax^{TM} 340 equipado con
el software SOFTmax PRO (v2.2; Molecular Devices Corp., Sunnyvale,
CA). Las actividades amidolíticas específicas, registradas como la
pendiente de las curvas de progreso lineales tras la sustracción
sin procesar dividida por la concentración de proteína en el ensayo,
se usaron para calcular la proporción entre las actividades
proteolíticas específicas del complejo de factor
VIIA-sTF y el factor VIIa de tipo salvaje:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los resultados se dan en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis SDS-PAGE - Factor
VIIA y factor VIIA
F40C-sTF(1-219) v207C (aprox
1,5 \mug de cada uno) se analizaron por SDS-PAGE
no-reductor y reductor en un 4-12%
de gel NuPAGE® de Bis-Tris (Invitrogen Life
Technologies, Carlsbad, CA) llevado a cabo a 200 V durante 35 min en
tampón MES (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) según las
recomendaciones del fabricante. Los geles se lavaron con agua y se
mancharon con SafeStain Simply Blue^{TM} (Invitrogen Life
Technologies, Carlsbad, CA) según las recomendaciones del
fabricante. El gel se muestra en la Figura 2.
SEC ID NO:1 - Secuencia de aminoácidos
(1-406) de factor VII humano (de tipo salvaje)
nativo. La indicación de tres letras "GLA" significa ácido
4-carboxiglutámico
(y-carboxiglutamato)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID NO:3 - Secuencia de ADN de factor
VII (de tipo salvaje) nativo incluyendo su pre (secuencia señal) y
sus pro-regiones (subrayadas).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NO:4 - Secuencia de aminoácidos de
sTF(1-219)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID NO:5 - Secuencia de ADN de
sTF(1-219) incluyendo su secuencia señal
(subrayada)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Construcción de ADN codificando
sTF(1-219) W45C,
sTF(1-219) D58C,
sTF(1-219) g109C, y
sTF(1-219)
P206C - Los mutantes de sTF(1-219) se construyen por mutagénesis dirigida QuickChange® usando pares de cebadores (inversos y directos) listados en la Tabla 3 y fOJ356 como patrón según las instrucciones del fabricante (Stratagene, La Jolla, CA). La identidad correcta de todas las secuencias clonadas se verifica por secuenciación del
ADN.
P206C - Los mutantes de sTF(1-219) se construyen por mutagénesis dirigida QuickChange® usando pares de cebadores (inversos y directos) listados en la Tabla 3 y fOJ356 como patrón según las instrucciones del fabricante (Stratagene, La Jolla, CA). La identidad correcta de todas las secuencias clonadas se verifica por secuenciación del
ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
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Construcción de ADN codificando factor VII S43C,
factor VII Q64C, factor VII E77C, y factor VII F275C - Los mutantes
de factor VII se construyen por mutagénesis dirigida QuickChange®
usando pares de cebador (directos e inversos) listados en la Tabla
4 y pHOJ300 como patrón según las instrucciones del fabricante
(Stratagene, La Jolla, CA). La identidad correcta de todas las
secuencias clonadas se verifica por secuenciación de ADN.
La co-expresión de factor VII
S43C-sTF(1-219) P206C, factor
VII Q64C-sTF(1-219) G109C,
factor VII E77C- sTF(1-219) D58C, y factor
VII F275C-sTF(1-219) W45C -
Las variantes de cisteína de factor VIIA y
sTF(1-219) son co-expresadas
por expresión transitoria en el Sistema de Expresión
Freestyle^{TM} 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las
instrucciones del fabricante y según se detalla en el Ejemplo 1.
Detección de la
inmuno-transferencia de factor VII
Q64C-sTF(1-219) G109C - El
medio acondicionado a partir de la co-expresión
transitoria de factor VII q64C y sTF(1-219)
G109C se analizó por SDS-PAGE no reductor en un
4-12% de gel de Bis-Tris NuPAGE®
(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) llevado a cabo a 200 V
durante 35 min en tampón MES (Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad, CA) según las recomendaciones del fabricante. Los
complejos se detectaron posteriormente por inmunotransferencia como
es sabido por gente experta en la técnica usando una mezcla de
FVIIa anti-humano de ratón monoclonal y anticuerpos
primarios de TF anti-humanos y anticuerpo de
anti-ratón de conejo conjugado con peroxidasa de
rábano secundaria (HRP). Los inmuno-complejos se
detectaron usando el equipo de detección quimioluminiscente
SuperSignal® West Pico Chemiluminescent (Pierce) y un lector de
imagen LAS-3000 Image Reader (FUJIFILM Corporation).
Los resultados se muestran en la Figura 3.
Ejemplo
3
Construcción de ADN codificando
sTF(1-209) y
sTF(1-209) v207C - La secuencia de
codificación de ADN de TF(1-209) incluyendo
su péptido señal se amplifica a partir de una biblioteca de ADNc
entera de cerebro humano (Marathon-ready cDNA;
Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA) por PCR usando el
sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche Diagnostics Corporation,
Indianapolis, IN) según las recomendaciones del fabricante y los
cebadores oHOJ152-f (secuencia listada en la Tabla
1) y oHOJ178-r (secuencia listada en la Tabla 5),
introduciendo los sitios de restricción NheI y XhoI flanqueantes. El
producto de PCR purificado se corta con NheI y XhoI y entonces se
liga en los sitios correspondientes de pCI-neo
(Promega, Madison, WI). El plásmido resultante sirve entonces como
patrón para la construcción de sTF(1-209)
v207C usando la mutagénesis dirigida QuickChange® y los cebadores
oHOJ179-f y oHOJ179-r (secuencias
listadas en la Tabla 5) según las instrucciones del fabricante
(Stratagene, La Jolla, CA). La identidad correcta de todas las
secuencias clonadas se verifica por secuenciación de ADN.
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<120> COMPLEJO DE FACTOR
VII-FACTOR TISULAR
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<130> 7275.205-EP
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<160> 21
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<170> PatentIn version 3.3
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<210> 1
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<211> 406
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)..(406)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa significa ácido
4-carboxiglutámico
(gamma-carboxiglutamato)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 263
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<212> PRT
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<213> Humano
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<400> 2
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 3
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<211> 1335
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<212> ADN
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<213> Humano
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<400> 3
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\hskip0,8cm
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<210> 4
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<211> 219
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<212> PRT
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<213> Humano
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<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\newpage
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<210> 5
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<211> 756
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<212> ADN
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<213> Humano
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<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\hskip0,8cm
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<210> 8
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<211> 40
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
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<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
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<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (13)
1. Complejo covalente de un polipéptido de
factor VII funcionalmente activo y un polipéptido de factor tisular,
donde dichos polipéptido de factor VII y polipéptido de factor
tisular están vinculados de manera covalente mediante una o más
uniones directas entre cadenas laterales de aminoácidos de conjuntos
de (i) un aminoácido del polipéptido de factor VII y (ii) un
aminoácido del polipéptido de factor tisular.
2. Complejo según la reivindicación 1, donde la
actividad proteolítica del polipéptido de factor VII es al menos 2
veces, tal como al menos 50 veces, por ejemplo al menos 100 veces,
tal como al menos 200 veces, o al menos 250 veces, la del factor
VIIa libre nativo (de tipo salvaje), como se determina por el ensayo
de proteólisis in vitro.
3. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde los conjuntos de aminoácidos
comprenden uno o más aminoácidos de cisteína.
4. Complejo según la reivindicación 3, donde
cada uno de los conjuntos comprende un aminoácido de cisteína.
5. Complejo según la reivindicación 3, donde
cada uno de los conjuntos comprende dos aminoácidos de cisteína.
6. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde al menos uno de los aminoácidos
en las posiciones Tr17Thr17, Lys20, Ile22, Ser42, Gly43, Asp44,
Trp45, Lys46, Ser47, Phe50, Cys57, Asp58, Asp61, Gly109, Gln110,
Leu133, Ser205, Pro206 y Val207 del polipéptido de factor tisular
soluble, en particular Trp45, Asp58, Gly109, Pro206 y Val207 del
polipéptido de factor tisular soluble, se ha sustituido por un
aminoácido con una cadena lateral reactiva que da lugar a
dicha(s) unión(es) directa(s).
7. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde al menos uno de los aminoácidos
en las posiciones Leu39Leu39, Phe40, Ile42, Ser43, Tyr44, Gln64,
Leu65, Ile69, Glu77, Gly78, Arg79, Val92, Phe275, Val276, Arg277,
Met306, Thr307, y Glu325 del polipéptido de factor VII, en
particular Phe40, Ser43, Gln64 Glu77 y Phe275 del polipéptido de
factor VII, se ha sido sustituido por un aminoácido con una cadena
lateral reactiva que da lugar a dicha(s) unión(es)
directa(s).
8. El complejo según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde uno o ambos aminoácidos de al
menos uno de los conjuntos de aminoácidos
FVII-Ile69 -
sTF-Thr17,
FVII-Ile69 -
sTF-Lys20,
FVII-Arg79 -
sTF-Ile22,
FVII-Val92 -
sTF-Ser47,
FVII-Val92 -
sTF-Phe50,
FVII-Gly78 -
sTF-Cys57,
FVII-Glu77 -
sTF-Asp58,
FVII-Gly78 -
sTF-Asp58,
FVII-Arg79 -
sTF-Asp58,
FVII-Arg277 -
sTF-Ser42,
FVII-Val276 -
sTF-Gly43,
FVII-Arg277 -
sTF-Gly43,
FVII-Phe275 -
sTF-Asp44,
FVII-Val276 -
sTF-Asp44,
FVII-Arg277 -
sTF-Asp44,
FVII-Phe275 -
sTF-Trp45,
FVII-Val276 -
sTF-Trp45,
FVII-Argl34 -
sTF-Trp45,
FVII-Phe275 -
sTF-Lys46,
FVII-Gln64 -
sTF-Gly109,
FVII-Gln64 -
sTF-Gln110,
FVII-Leu65 -
sTF-Gln110,
FVII-Phe71 -
sTF-Leu133,
FVII-Ser43 -
sTF-Ser205,
FVII-Leu39 -
sTF-Pro206,
FVII-Phe40 -
sTF-Pro206,
FVII-Ile42 -
sTF-Pro206,
FVII-Ser43 -
sTF-Pro206,
FVII-Tyr44 -
sTF-Pro206,
FVII-Leu39 -
sTF-Val207,
FVII-Phe40 -
sTF-Val207, y
FVII-Ser43 -
sTF-Val207,
En particular al menos uno de los conjuntos de
aminoácidos
FVII-Phe40 -
sTF-Val207,
FVII-Ser43 -
sTF-Pro206,
FVII-Gln64 -
sTF-Gly109,
FVII-Glu77 -
sTF-Asp58, y
FVII-Phe275 -
sTF-Trp45,
se han sustituido por un aminoácido con una
cadena lateral reactiva que da lugar a dicha(s)
unión(es) directa(s).
9. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde al menos una unión directa está
situada entre dos aminoácidos de cisteína.
10. Complejo según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde al menos una unión directa está
formada vía un aminoácido fotorreactivo.
11. Complejo según la reivindicación 10, donde
dicho aminoácido fotorreactivo está seleccionado del grupo que
consiste en foto-Ile, foto-Leu y
foto-Met.
12. Complejo covalente de un polipéptido de
factor VII funcionalmente activo y un polipéptido de factor tisular,
donde dicho polipéptido de factor VII y dicho polipéptido de factor
tisular están vinculados de manera covalente mediante una fracción
enlazadora entre cadenas laterales de aminoácidos de uno o más
conjuntos de (i) un aminoácido del polipéptido de factor VII y (ii)
un aminoácido del polipéptido de factor tisular, donde dicha
fracción enlazadora se deriva de un reactivo heterobifuncional.
13. Método para la producción de un complejo de
un polipéptido de factor VII funcionalmente activo y un polipéptido
de factor tisular tal y como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, dicho método comprendiendo
a) transfectar una célula con (i) un vector de expresión
comprendiendo una molécula de ácido nucleico codificando el
polipéptido de factor VII y regiones de control de expresión
operativamente vinculadas a ella y (ii) y un vector de expresión
comprendiendo una molécula de ácido nucleico codificando el
polipéptido de factor tisular y regiones de control de expresión
operativamente vinculadas a ella, b) cultivar la célula modificada
bajo condiciones para la expresión del polipéptido de factor VII y
el polipéptido de factor tisular, y c) aislar el complejo expresado
por medios adecuados.
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