ES2303362T3 - Polipeptidos dependientes de la vitamina k modificados. - Google Patents

Abstract

Una proteína C o un polipéptido de la proteína C activada que comprende un dominio GLA modificado que mejora la afinidad de la unión a la membrana en relación con una proteína C natural correspondiente o un polipéptido de la proteína C activada, comprendiendo dicho dominio GLA modificado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con al menos una sustitución de aminoácidos en el residuo 10, 11, 28 o 33, en donde dicha proteína C o dicho polipéptido de la proteína C activada es eficaz para disminuir la formación de coágulos en un mamífero.

Description

Polipéptidos dependientes de la vitamina K modificados.

Antecedentes de la invención

Las proteínas dependientes de la vitamina K contienen de 9 a 13 residuos de ácido gamma-carboxiglutámico (Gla) en sus 45 residuos amino-terminales. Los residuos Gla son producidos por enzimas del hígado que emplean la vitamina K para carboxilar las cadenas laterales de los residuos de ácido glutámico, en los precursores proteicos. Las proteínas dependientes de la vitamina K están implicadas en una variedad de procesos biológicos, entre los cuales el mejor descrito es la coagulación de la sangre (revisado por Furie, B. y Furie, B.C., 1988, Cell, 53:505-518). Las proteínas dependientes de la vitamina K incluyen la proteína Z, la proteína S, la protrombina, el factor X, el factor IX, la proteína C, el factor VII y Gas6. La última proteína actúa en la regulación del crecimiento celular. Matsubara y col., 1996, Dev. Biol., 180:499-510. Los residuos Gla son necesarios para unir de forma adecuada el calcio y para la interacción con la membrana a través de estas proteínas. El sitio de contacto con la membrana del factor X se cree que se encuentra en los residuos de aminoácidos 1-37. Evans y Nelsestuen, 1996, Protein Science 5: supl. 1, 163 Abs. Aunque las regiones de las proteínas plasmáticas que contienen Gla muestran un alto grado de homología en las secuencias, tienen al menos 1000 veces más afinidad hacia la membrana. McDonald, J.F. y col., 1997, Biochemistry, 36:5120-5137.

El factor VII actúa en la etapa inicial de la coagulación de la sangre y puede ser un elemento clave para la formación de coágulos sanguíneos. El precursor inactivo o zimógeno, tiene una actividad enzimática baja que se incrementa considerablemente mediante digestión proteolítica para formar el factor VIIa. Esta activación se puede catalizar con el factor Xa, así como con el factor tisular VIIa, una proteína integral de la membrana encontrada en una variedad de tipos celulares. Fiore, M.M., y col., 1994, J. Biol. Chem., 269:143-149. La activación con el factor tisular VIIa se denomina autoactivación. Está implicada en la activación (formación del factor VIIa a partir del factor VII) y en la actividad posterior del factor VIIa. La ruta más importante de la activación in vivo es desconocida. El factor VIIa puede activar los factores IX y X de la coagulación de la sangre.

El factor tisular se expresa con altos niveles en la superficie de algunas células tumorales. Es posible que el factor tisular y el factor VIIa tengan una función en el desarrollo de tumores y en la invasión de tejidos. Vrana, J.A. y col., Cancer Res., 56:5063-5070. La expresión celular y la actividad del factor tisular son también un factor principal en la respuesta tóxica al choque endotóxico. Dackiw, A.A., 1996, Arch. Surg., 131:1273-1278.

La proteína C se activa con trombina en presencia de trombomodulina, una proteína integral de la membrana de las células endoteliales. Esmon, N.L. y col., 1982, J. Biol. Chem., 257:859-864. La proteína C activada (APC) degrada los factores Va y VIIIa junto con su cofactor, la proteína S. La resistencia a APC es la forma más común de la enfermedad trombosis heredada. Dahlback, B., 1995, Blood, 85:607-614. Los inhibidores de la vitamina K se administran generalmente como una profilaxis de la trombosis.

Las proteínas dependientes de la vitamina K se emplean para tratar ciertos tipos de hemofilia. La hemofilia A se caracteriza por una ausencia de factor VIII activo, factor VIIIa o la presencia de inhibidores del factor VIII. La hemofilia B se caracteriza por la ausencia del factor IX activo, el factor IXa. La carencia de factor VII, aunque es rara, responde bien a la administración del factor VII. Bauer, K.A., 1996, Haemostasis, 26:155-158, supl. 1. La terapia de sustitución del factor VIII es limitada debido al desarrollo de títulos elevados de anticuerpos inhibidores del factor VIII en algunos pacientes. Alternativamente, el factor VIIa se puede utilizar en el tratamiento de la hemofilia A y B. El factor IXa y el factor VIIIa activan el factor X. El factor VIIa elimina la necesidad de los factores IX y VIII, inactivando directamente el factor X y pueden superar los problemas por deficiencias del factor IX y VIII, con pocas consecuencias inmunológicas. Hedner y col., 1993, Transfus. Medi. Rev., 7:78-83; Nicolaisen, E.M. y col., 1996, Thromb. Haemost., 76:200-204. Los niveles eficaces de administración del factor VIIa son frecuentemente altos (45 a 90 \mug/kg de peso corporal) y la administración puede ser que se tenga que repetir cada pocas horas. Shulmav, S. y col., 1996, Thromb. Haemost., 75:432-436.

Una forma soluble del factor tisular (factor tisular soluble o sTF) que no contiene la región de contacto con la membrana, se ha observado que es eficaz en el tratamiento de la hemofilia cuando se administra junto con el factor VIIa. Documento de patente de EE.UU. nº 5.504.064. En los perros, se observó que el sTF reduce la cantidad de factor VIIa, necesario para tratar la hemofilia. La asociación de la membrana con sTF-VIIa, depende totalmente del sitio de contacto con la membrana del factor VII. Esto se contrapone al complejo normal de tejido-factor VIIa que se une a la membrana a través de del factor tisular y de VII(a).

Zhang y Castellino (1993) The Journal of Biological Chemistry, vol., 268, nº 16, págs. 12040-12045 estudian las contribuciones de residuos individuales de ácido \gamma-carboxiglutámico en la unión dependiente de calcio, de la proteína C humana recombinante con vesículas de ácido fosfolípido.

McDonald y col., (1997) Biochemistry, vol. 36, nº 17, páginas 5120-5127, llevan a cabo una comparación de las proteínas dependientes de la vitamina K presentes en la naturaleza para investigar cualquier correlación entre las secuencias de aminoácidos y las propiedades de unión a la membrana.

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Perera y col., (1998) Biochemistry, vol. 37, páginas 10920-10927 investigaron la importancia relativa de las dos conformaciones de prolina 22 en el fragmento 1 de la protrombina bovina.

Smirnov y col. (1998) "The Journal of Biological Chemistry", vol. 273, nº 15, páginas 9031-9040, exponen la base estructural de la actividad de la proteína C activada (APC), dependiente de fosfatidiletanolamina (PE).

Sumario de la invención

Se ha descubierto que modificaciones en el dominio del ácido \gamma-carboxiglutámico de los polipéptidos dependientes de la vitamina K, mejoran sus afinidades de unión a la membrana. Los polipéptidos dependientes de la vitamina K, modificados de esta manera, tienen una actividad mejorada y se pueden emplear como anti-coagulantes, pro-coagulantes o para otras funciones que emplean proteínas dependientes de la vitamina K. Por ejemplo, una molécula mejorada del factor VII puede proporcionar algunos beneficios disminuyendo la dosificación de VIIa necesaria, la frecuencia relativa de la administración y/o proporcionando cambios cualitativos que permiten un tratamiento más eficaz de los estados de la deficiencia.

La invención caracteriza una proteína C o un polipéptido de la proteína C activada que comprende un dominio GLA modificado que mejora la afinidad de la unión a la membrana, en relación con una proteína C natural correspondiente o un polipéptido de la proteína C activada, comprendiendo dicho dominio GLA modificado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, con al menos una sustitución de aminoácidos en el residuo 10, 11, 28 o 33, en donde dicha proteína C o dicho polipéptido de la proteína C activada es eficaz para disminuir la formación de coágulos en un mamífero.

El dominio GLA modificado se extiende desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 45 e incluye al menos una sustitución de aminoácidos, tal y como se ha descrito anteriormente. Los aminoácidos sustituidos pueden ser el aminoácido 10, 11, 28, 32 o 33 (que se corresponden a las posiciones 11, 12, 29, 33 y 34 del factor IX). Preferentemente, la sustitución es en el aminoácido 10, 32 o 33. El dominio GLA modificado puede incluir una secuencia de aminoácidos que, en el estado saturado de calcio, forma una estructura terciaria que tiene un núcleo catiónico con un halo de carga electronegativa.

El polipéptido dependiente de la vitamina K de la presente invención es la proteína C o la proteína C activada. El dominio GLA modificado de la proteína C o de la proteína C activada, puede incluir un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 32 y un residuo de ácido aspártico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO: 19). El dominio GLA modificado de la proteína C o de la proteína C activada también puede incluir un residuo de glutamina o de ácido glutámico en el aminoácido 10 (SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, respectivamente). Adicionalmente, se puede sustituir un residuo de glicina en el aminoácido 11 en el dominio GLA de la proteína C o la proteína C activada (SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 35).

Tal y como se emplea en esta memoria, la expresión ácido nucleico aislado (purificado) que codifica un polipéptido dependiente de la vitamina K, se refiere a una secuencia que se corresponde en parte o completamente con el gen que codifica un polipéptido dependiente de la vitamina K, pero que está exento de las secuencias que flanquean normalmente uno o ambos lados del gen, en un genoma de mamífero. El polipéptido dependiente de la vitamina K incluye un domino GLA modificado que mejora la afinidad de la unión a la membrana del polipéptido, en relación con un polipéptido natural correspondiente dependiente de la vitamina K. El dominio GLA modificado incluye al menos una sustitución de aminoácidos.

La invención también caracteriza una célula hospedadora de mamífero que comprende un vector de ácido nucleico, en donde dicho vector codifica una proteína C o un polipéptido de la proteína C activada de la presente invención. El dominio GLA modificado incluye al menos una sustitución de aminoácidos, por ejemplo, en el aminoácido 10, 11, 28, 32 o 33.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende la proteína C o el polipéptido de la proteína C activada, tal y como se describe en esta memoria, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La proteína C o la proteína C activada de acuerdo con la presente invención, puede incluir por ejemplo, un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 32 y un residuo de ácido aspártico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO: 19). La proteína C o la proteína C activada puede incluir adicionalmente una glutamina en el aminoácido 10 (SEQ ID NO: 20) o un ácido glutámico en el aminoácido 10 (SEQ ID NO: 21). La sustitución de aminoácidos también puede incluir una glicina en el aminoácido 11 (SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 35).

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína C o un polipéptido de la proteína C activada que comprende un dominio GLA modificado que mejora la afinidad de la unión a la membrana, en relación con una proteína C natural correspondiente o un polipéptido de la proteína C activada, comprendiendo dicho dominio GLA modificado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, con al menos una sustitución de aminoácidos en el residuo 10, 11, 28 o 33, en donde dicha proteína C o dicho polipéptido de la proteína C activada es eficaz para disminuir la formación de coágulos en un mamífero, para usar como un medicamento, en particular para tratar una alteración de la coagulación.

La invención también caracteriza el uso de una proteína C o un polipéptido de la proteína C activada que comprende un dominio GLA modificado que mejora la afinidad de la unión a la membrana, en relación con una proteína C natural correspondiente o un polipéptido de la proteína C activada, comprendiendo dicho dominio GLA modificado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, con al menos una sustitución de aminoácidos en el residuo 10, 11, 28 o 33, en donde dicha proteína C o dicho polipéptido de la proteína C activada es eficaz para disminuir la formación de coágulos en un mamífero, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una alteración de la coagulación.

Un método para disminuir la formación de coágulos en un mamífero incluye administrar una cantidad de un polipéptido dependiente de la vitamina K, que sea eficaz para disminuir la formación de coágulos en el mamífero. El polipéptido dependiente de la vitamina K incluye un dominio GLA modificado que mejora la afinidad de la unión a la membrana del polipéptido, en relación con un polipéptido dependiente de la vitamina K natural correspondiente. El dominio GLA modificado incluye al menos una sustitución de aminoácidos. El polipéptido dependiente de la vitamina K es la proteína C o la proteína C activada. La proteína C o la proteína C activada puede incluir un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 32 y un residuo de ácido aspártico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO: 19). Una glutamina o un ácido glutámico puede sustituir adicionalmente la proteína C o la proteína C activada (SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21, respectivamente). Una glicina puede sustituir adicionalmente el aminoácido 11 (SEQ ID NO: 24 o NO: 35).

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos empleados en esta memoria tienen el mismo significado que el que entendería normalmente un experto en la técnica, a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden emplear métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria para poner en práctica la invención, se describen a continuación métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, que incluyen las definiciones, será la comprobación. Además, los materiales, los métodos y los ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes con la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las secuencias de aminoácidos del dominio GLA de VIIa de tipo silvestre y de VIIQ11E33 se encontraron en SEQ ID NO: 3 y en SEQ ID NO: 30, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos del dominio GLA del factor X bovino, la proteína C bovina, la proteína C humana y la proteína C-H11 bovina se encuentran en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 23, respectivamente. La secuencia de aminoácidos del dominio GLA de la proteína C VQ33E,N34D se encuentra en SEQ ID NO: 19.

La Figura 1 describe la unión, con desviaciones estándar, de VIIa de tipo silvestre (círculos blancos), VIIQ11E33 (círculos negros) y el factor X bovino (triángulos negros) a las membranas.

La Figura 2 describe la autoactivación de VIIQ11E33. La línea punteada muestra la actividad en ausencia de fosfolípido.

La Figura 3 describe la activación del factor X mediante el factor VIIa. Los resultados del factor VIIa de tipo silvestre (círculos blancos) y de VIIaQ11E33 (círculos negros) se proporcionan para una concentración de 0,6 nM.

La Figura 4 describe la coagulación de plasma humano mediante VIIa y VIIaQ11E33 con factor tisular soluble.

La Figura 5 describe la coagulación del plasma con zimógenos del factor VII y factor tisular normal.

La Figura 6 describe la inhibición de la formación de coágulos con el factor VIIaQ11E33 modificado en el sitio activo (DEGR-VIIaQ11E33).

La Figura 7 describe el tiempo de circulación del factor VIIQ11E33 en ratas.

La Figura 8 describe la interacción de la membrana con proteínas normales y modificadas. El panel A muestra la interacción de la proteína C bovina de tipo silvestre (círculos blancos) y la proteína C-H11 bovina (círculos negros) con vesículas. El panel B muestra la interacción de la proteína C humana de tipo silvestre (círculos blancos) y la proteína C-P11 humana (círculos negros) con membranas. En ambos casos, la línea punteada indica el resultado si toda la proteína añadida estuviera unida a la membrana.

La Figura 9 describe el efecto de la proteína C activada sobre los tiempos de coagulación. En el panel A, la media y la desviación estándar para las tres determinaciones de los tiempos de coagulación para el plasma bovino, se muestran para APC bovina de tipo silvestre (círculos blancos) y para bAPC-H11 (círculos negros). En el panel B, se muestra la media y la desviación estándar para tres replicados de la coagulación de plasma humano para APC humana de tipo silvestre (círculos blancos) y APC-P11 humana (círculos negros).

La Figura 10 describe la inactivación del factor Va mediante APC bovina y humana. El panel A describe la inactivación del factor Va mediante APC bovina de tipo silvestre (círculos blancos) y APC-H11 bovina (círculos negros). El panel B describe la inactivación del factor Va humano, en plasma que carece de proteína S, mediante APC humana de tipo silvestre (círculos blancos) y APC-H11 humana (círculos negros).

La Figura 11 describe la distribución electrostática de la proteína Z. Las líneas verticales indican las regiones electropositivas y las líneas horizontales indican las regiones electronegativas.

La Figura 12 describe la unión a la membrana y la actividad de diversas proteínas Cs. El panel A muestra la unión a la membrana de la proteína C de tipo silvestre (círculos blancos), el mutante P11H de la proteína C (cuadrados negros), el mutante Q33E,N34D (círculos negros) y la protrombina bovina (cuadrados blancos). El panel B muestra la inhibición de la coagulación sanguínea con estos mutantes. El panel C muestra la inactivación del factor Va.

La Figura 13 compara la unión a la membrana y la actividad de mutantes de la proteína C humana. El panel A compara la unión a la membrana del tipo silvestre (círculos blancos), E33 (triángulos blancos) y E33D34 (círculos negros). El panel B compara los tiempos de coagulación empleando el tipo silvestre (triángulos blancos), E33 (círculos blancos) y E33D34 (círculos negros).

La Figura 14 compara la unión a la membrana (panel A) y la inhibición de la coagulación (panel B) con el tipo silvestre (cuadrados blancos), H11 (círculos negros), E33D34 (triángulos blancos) y el triple mutante H11E33D34 (círculos blancos) de la proteína C bovina.

La Figura 15 describe las propiedades de la interacción con la membrana de diferentes proteínas dependientes de la vitamina K. El panel A compara la interacción con la membrana del factor X humano (círculos negros) y el factor X bovino (círculos blancos). El panel B muestra la interacción con la membrana a través del fragmento 1 de la protrombina bovina normal (círculos blancos), el fragmento 1 modificado con TNBS en ausencia de calcio (círculos negros) y el fragmento 1 modificado con TNBS en presencia de calcio 25 mM (cuadrados negros). El panel C muestra la tasa de unión de la proteína Z con vesículas a pH 9 (círculos negros) y a pH 7,5 (círculos blancos).

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Descripción detallada

En un aspecto, la invención caracteriza un polipéptido dependiente de la vitamina K que incluye un dominio GLA modificado, siendo dichos polipéptidos dependientes de la vitamina K, una proteína C o un polipéptido de la proteína C activada que comprende un dominio GLA modificado que mejora la afinidad de la unión a la membrana en relación con una proteína C natural correspondiente o un polipéptido de una proteína C activada, comprendiendo dicho dominio GLA modificado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con al menos una sustitución de aminoácidos en el residuo 10, 11, 28 o 33, en donde dicha proteína C o dicho polipéptido de la proteína C activada es eficaz para disminuir la formación de coágulos en un mamífero.

Los polipéptidos dependientes de la vitamina K son un grupo de proteínas que emplean la vitamina K en su ruta biosintética para carboxilar las cadenas laterales de los residuos de ácido glutámico en precursores proteicos. El dominio GLA contiene 9-13 residuos de ácido \gamma-carboxiglutámico en la región N-terminal del polipéptido, típicamente desde el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 45. La proteína Z, la proteína S, el factor X, el factor II (protrombina), el factor IX, la proteína C, el factor VII y Gas6 son ejemplos de polipéptidos dependientes de la vitamina K. Aparte de la referencia hecha a los polipéptidos de la proteína C modificada de la presente invención (que se numeran según la proteína C), las posiciones de los aminoácidos de los otros polipéptidos descritos en esta memoria (véanse los Ejemplos) se numeran según el factor IX. La proteína S, la proteína C, el factor X, el factor VII y la protrombina humana, todos tienen un aminoácido menos (posición 4) y se deben ajustar en consecuencia. Por ejemplo, la posición 10 real de la proteína C bovina es una prolina. Tal y como se emplea en esta memoria, el término "polipéptido" es cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o de las modificaciones posteriores a la traducción. Los aminoácidos se denominan en esta memoria con las tres letras convencionales y con abreviaturas de una letra.

Las modificaciones del dominio GLA incluyen al menos una sustitución de aminoácidos. Las sustituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras. En las sustituciones conservadoras de aminoácidos se sustituye un aminoácido por un aminoácido de la misma clase, mientras que en las sustituciones de aminoácidos no conservadoras, se sustituye un aminoácido por un aminoácido de una clase diferente. Las sustituciones no conservadoras pueden dar como resultado un cambio sustancial en la hidrofobicidad del polipéptido o en el la carga de una cadena lateral de residuos. Además, las sustituciones no conservadoras pueden producir un cambio sustancial en la carga del polipéptido, tal como reducir las cargas electropositivas o introducir cargas electronegativas. Ejemplos de sustituciones no conservadoras incluyen un aminoácido básico para un aminoácido no polar, o un aminoácido polar para un aminoácido ácido. Los aminoácidos sustituidos pueden ser los aminoácidos 10, 11, 28, 32 o 33. Preferentemente, los aminoácidos sustituidos pueden ser los aminoácidos 10, 32 o 33. El dominio GLA modificado puede incluir una secuencia de aminoácidos que en el estado de saturación de calcio, contribuya a la formación de una estructura terciaria que tenga un núcleo catiónico con un halo de carga electronegativa. Sin estar limitado a una teoría particular, la afinidad mejorada hacia la membrana puede ser el resultado de un patrón electrostático particular que consta de un núcleo electropositivo rodeado completamente por una superficie electronegativa.

Muchos polipéptidos dependientes de la vitamina K son sustratos para enzimas unidas a la membrana. Puesto que los polipéptidos no dependientes de la vitamina K muestran la máxima afinidad potencial de unión a la membrana de un dominio GLA, todos deben contener aminoácidos cuyo fin sea reducir la afinidad por la unión. En consecuencia, muchos polipéptidos dependientes de la vitamina K contienen aminoácidos que no son óptimos desde el punto de vista de la afinidad máxima. Estos residuos rompen eficazmente el sitio de unión para proporcionar un rápido recambio para una reacción enzimática.

Una afinidad reducida hacia la membrana, puede servir para diferentes fines. La alta afinidad está acompañada por un lento intercambio que puede limitar las tasas de la reacción. Por ejemplo, cuando la enzima protrombinasa se ensambla sobre membranas con alta afinidad hacia el sustrato, el intercambio de proteínas desde la membrana es el limitante más que la catálisis enzimática. Lu, Y. y Nelsestuen, G.L., 1996, Biochemistry, 35:8201-8209. Alternativamente, el ajuste de la afinidad hacia la membrana mediante la sustitución de aminoácidos que no sean óptimos, puede equilibrar los procesos competitivos de la procoagulación (factor X, IX, VII y protrombina) y de la anticoagulación (proteína C, S). Aunque las afinidades hacia la membrana de las proteínas naturales pueden ser óptimas para los estados normales, una mejora de la afinidad hacia la membrana puede producir proteínas que sean útiles para el estudio in vitro, así como agentes terapéuticos mejorados para regular la coagulación sanguínea en estados patológicos in vivo.

A continuación se describen diversos ejemplos de proteína C con el dominio GLA modificado o de proteína C activada (APC). Se pueden realizar modificaciones similares o equivalentes con otros polipéptidos dependientes de la vitamina K.

Las secuencias de aminoácidos del dominio GLA de la proteína C de tipo silvestre humana (hC) y bovina (bC), se muestran en la Tabla 1. X es un residuo Gla o Glu. En general, una proteína con residuos neutros (p. ej., O) o aniónicos (p. ej., D, E) en las posiciones 11, 33 y 34, tendrá una afinidad superior hacia la membrana.

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TABLA 1

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El dominio GLA modificado de la proteína C o de APC puede incluir, por ejemplo, un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 32 y un residuo de ácido aspártico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO: 19). El ácido glutámico en la posición 32 se puede modificar adicionalmente a ácido \gamma-carboxiglutámico in vivo. Para obtener una actividad óptima, el dominio GLA modificado puede incluir una sustitución adicional en el aminoácido 10. Por ejemplo, en el aminoácido 10, se puede sustituir con un residuo de glutamina (SEQ ID NO: 20) o alternativamente, se puede sustituir con un residuo de ácido glutámico o de ácido aspártico (SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO:22, respectivamente). Un residuo de histidina puede sustituir al aminoácido 10 en la proteína C bovina (SEQ ID NO: 23). Otra modificación puede incluir una sustitución en el aminoácido 11 de un residuo de serina por glicina (SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 35). La sustitución del aminoácido 28 por fenilalanina, el aminoácido se encontraba en la protrombina, es otra modificación útil (SEQ ID NO: 25). La proteína C modificada con una afinidad hacia la membrana mejorada, se puede emplear en lugar de otros anticoagulantes inyectables, tales como la heparina. La heparina se emplea típicamente en la mayoría de los tipos de cirugía, pero tiene una relación eficacia/toxicidad baja. Además, la proteína C modificada con una afinidad mejorada hacia la membrana, se puede utilizar en lugar de anticoagulantes orales en la familia de las cumarinas, tal como la warfarina.

Estas modificaciones también se pueden realizar con APC con modificación del sitio activo. El sitio activo de APC se puede inactivar químicamente, por ejemplo, mediante N-dansil-glutamil glicilarginilclorometilcetona (DEGR) o mediante mutagénesis dirigida al sitio activo. Sorensen, B.B. y col., 1997, J. Biol. Chem., 272:11863-11868. La APC modificada en el sitio activo actúa como un inhibidor del complejo protrombinasa. Una afinidad mejorada hacia la membrana de la APC con el sitio activo modificado, puede dar como resultado un polipéptido más eficaz terapéuticamente.

Aunque ninguna parte de la invención lo reivindica, otro polipéptido dependiente de la vitamina K que se puede modificar es el factor VII o la forma activa del factor VII, el factor VIIa. El polipéptido del factor VII natural o presente en la naturaleza tiene baja afinidad hacia las membranas. Las secuencias de aminoácidos del dominio GLA del factor VII de tipo silvestre humano (hVII) y bovino (bVII), se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

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El dominio GLA modificado del factor VII o del factor VIIa puede incluir, por ejemplo, un residuo de ácido glutámico o de ácido aspártico en el aminoácido 11 (SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27, respectivamente), un residuo de fenilalanina en el aminoácido 29 (SEQ ID NO: 28) o un residuo de ácido aspártico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO: 29). Preferentemente, el dominio GLA del factor VII o del factor VIIa puede incluir un residuo de glutamina en el aminoácido 11 y un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO: 30). El polipéptido dependiente de la vitamina K modificado de este modo, tiene mucha más afinidad hacia las membranas que el polipéptido natural o de tipo silvestre. También tiene una actividad muy superior en la autoactivación, en la generación del factor Xa y en algunos ensayos de coagulación de la sangre. La actividad se mejora particularmente en condiciones de coagulación marginales, tales como bajos niveles de factor tisular y/o fosfolípido. Por ejemplo, el factor VII modificado es aproximadamente 4 veces más eficaz que el VIIa natural con niveles óptimos de tromboplastina, pero es aproximadamente 20 veces más eficaz con 1% de los niveles óptimos de tromboplastina. Las señales de procoagulación marginales son probablemente más predominantes in vivo. Con ensayos de coagulación disponibles en la actualidad, que emplean niveles óptimos de tromboplastina, no se puede detectar las diferencias en el tiempo de coagulación entre el plasma normal y el plasma de pacientes hemofílicos. Las diferencias en la coagulación entre tales muestras sólo se detectan cuando se emplean niveles que no sean óptimos de tromboplastina o tromboplastina diluida en los ensayos de coagulación.

Otro ejemplo de un polipéptido dependiente de la vitamina K es el factor VIIa con el sitio activo modificado. El sitio activo del factor VIIa se puede modificar químicamente, por ejemplo, mediante DEGR o mediante mutagénesis dirigida al sitio activo. El factor VII modificado con DEGR es un inhibidor eficaz de la coagulación a través de diversas vías de administración. Arnljots, B. y col., 1997, J. Vasc. Surg., 25:341-346. Las modificaciones del dominio GLA pueden hacer que el factor VIIa modificado en el sitio activo sea más eficaz, debido a una mayor afinidad hacia la membrana. El dominio GLA modificado del factor VIIa modificado en el sitio activo, puede incluir, por ejemplo, un residuo de glutamina en el aminoácido 11 y un residuo de ácido glutámico en el aminoácido 33 (SEQ ID NO: 30).

Otro ejemplo de un polipéptido dependiente de la vitamina K es el factor IX o la forma activa del factor IX, el factor IXa. Del mismo modo que con el factor VIIa modificado en el sitio activo, el factor IXa y Xa modificados en el sitio activo, pueden ser inhibidores de la coagulación. Las secuencias de aminoácidos del dominio GLA del factor IX de tipo silvestre humano (hIX) y bovino (bIX) se muestran en la Tabla 3. Por ejemplo, un residuo de ácido aspártico o de ácido glutámico pueden sustituir al aminoácido 11 (SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, respectivamente), un residuo de fenilalanina al aminoácido 29 (SEQ ID NO: 33), o un residuo de ácido aspártico al aminoácido 34 (SEQ ID NO: 34).

TABLA 3

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En otro aspecto, la invención se refiere a una célula hospedadora de mamífero que comprende un vector de ácido nucleico, en donde dicho vector codifica una proteína C o un polipéptido de proteína C activada que comprende un dominio GLA modificado que mejora la afinidad de la unión a la membrana, en relación con una proteína C natural correspondiente o un polipéptido de la proteína C activada, comprendiendo dicho domino de GLA modificado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con al menos una sustitución de aminoácidos en el residuo 10, 11, 28 o 33, en donde dicha proteína C o dicho polipéptido de la proteína C activada es eficaz para disminuir la formación de coágulos en un mamífero. El dominio GLA modificado incluye al menos una sustitución de aminoácidos, tal y como se ha descrito anteriormente.

Las células hospedadoras de mamífero adecuadas son capaces de modificar los residuos de glutamato del polipéptido dependiente de la vitamina K, para formar \gamma-carboxiglutamato. Las células de mamífero obtenidas a partir de riñón y de hígado son especialmente útiles como células hospedadoras.

En otro aspecto, la invención también proporciona el uso de una célula hospedadora de mamífero para producir una proteína C modificada o una proteína C activada, tal y como se ha descrito anteriormente.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable y una proteína C o un polipéptido de la proteína C activada que comprende un dominio GLA modificado que mejora la afinidad de unión a la membrana en relación con una proteína C natural correspondiente o un polipéptido de una proteína C activada, comprendiendo dicho dominio GLA modificado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con al menos una sustitución de aminoácidos en el residuo 10, 11, 28 o 33, en donde dicha proteína C o dicho polipéptido de la proteína C activada es eficaz para disminuir la formación de coágulos en un mamífero.

La concentración de un polipéptido dependiente de la vitamina K que sea eficaz para inhibir la formación de coágulos en un mamífero puede variar, dependiendo de una variedad de factores que incluyen la dosificación preferida del compuesto que se va a administrar, las características químicas de los compuestos empleados, la formulación de los excipientes del compuesto y la vía de administración. La dosificación óptima de una composición farmacéutica que se va a administrar también puede depender de variables, tales como el estado general de salud del paciente en particular y la eficacia biológica relativa del compuesto seleccionado. Estas composiciones farmacéuticas se pueden emplear para regular la coagulación in vivo. Por ejemplo, las composiciones se pueden emplear generalmente para el tratamiento de la trombosis. La alteración de sólo unos pocos residuos de aminoácidos del polipéptido tal y como se ha descrito anteriormente, no afecta generalmente de forma significativa a la antigenicidad de los polipéptidos mutantes.

Los polipéptidos dependientes de la vitamina K que incluyen dominios GLA modificados, se pueden formular en composiciones farmacéuticas mediante la adición por mezcla de excipientes o vehículos no tóxicos, farmacéuticamente aceptables. Tales compuestos y composiciones se pueden preparar para administración por vía parenteral, particularmente en forma de soluciones líquidas o de suspensiones en soluciones tamponadas fisiológicas y acuosas; para la administración oral, particularmente en forma de comprimidos o cápsulas; o para la administración intranasal, particularmente en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles. Las composiciones para otras vías de administración se pueden preparar en la forma deseada, empleando métodos convencionales.

Las formulaciones para la administración parenteral pueden contener como excipientes comunes agua o solución salina estéril, polialquilenglicoles, tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. En particular, polímeros de lactida, copolímeros de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno biocompatibles y biodegradables, son ejemplos de excipientes para controlar la liberación de un compuesto de la invención in vivo. Otros sistemas de liberación parenteral adecuados, incluyen las partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, las bombas osmóticas, los sistemas de infusión implantables y los liposomas. Las formulaciones para la administración por inhalación pueden contener excipientes tales como la lactosa, si se desea. Las formulaciones para inhalación pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietilen 9-lauril éter, glicocolato y desoxicolato o pueden ser soluciones oleosas para administrar en forma de gotas nasales. Si se desea, los compuestos se pueden formular como geles para ser aplicados por vía intranasal. Las formulaciones para la administración por vía parenteral también pueden incluir glicocolato para la administración bucal.

El factor VII es especialmente decisivo para la coagulación sanguínea debido a su localización en el inicio de la cascada de la coagulación y su capacidad para activar dos proteínas, los factores IX y X. La activación directa del factor X mediante el factor VIIa tiene importancia debido a un posible tratamiento de las formas principales de la hemofilia, tipos A y B, puesto que se evitan completamente las etapas que implican los factores IX y VIII. Se ha observado que la administración del factor VII a pacientes es eficaz para el tratamiento de algunas formas de hemofilia. El perfeccionamiento de la afinidad a la membrana del factor VII o VIIa mediante la modificación del dominio GLA, proporciona el potencial para volver al polipéptido más sensible a muchos estados de coagulación, para disminuir las dosificaciones necesarias de VII/VIIa, para extender los intervalos en los que se debe administrar el factor VII/VIIa y para proporcionar cambios adicionales cualitativos que dan como resultado un tratamiento más eficaz. En general, perfeccionar el sitio de contacto con la membrana del factor VII, puede incrementar su tasa de activación, así como mejorar la actividad del factor VIIa sobre el factor X o IX. Estas etapas pueden tener un efector multiplicador sobre las tasas de coagulación de la sangre en general in vivo, dando como resultado un factor VIIa muy potente para un tratamiento superior de diversas enfermedades de la coagulación sanguínea.

Otros polipéptidos dependientes de la vitamina K útiles para incrementar la formación de coágulos, incluyen el factor IX y el factor IXa.

Los métodos para disminuir la formación de coágulos en un mamífero están descritos. El método incluye administrar una cantidad de polipéptido dependiente de la vitamina K que sea eficaz para disminuir la formación de coágulos en el mamífero. El polipéptido dependiente de la vitamina K incluye un dominio GLA modificado que mejora la afinidad hacia la membrana del polipéptido, en relación con un polipéptido natural dependiente de la vitamina K, correspondiente. El dominio GLA modificado incluye al menos una sustitución de aminoácidos. La proteína C modificada o APC se emplea para este método.

Los métodos para incrementar la formación de coágulos en un mamífero incluyen administrar una cantidad de polipéptido dependiente de la vitamina K que sea eficaz para incrementar la formación de coágulos en el mamífero. El polipéptido dependiente de la vitamina K incluye un dominio GLA modificado que mejora la afinidad de la unión a la membrana del polipéptido en relación con un polipéptido natural correspondiente, dependiente de la vitamina K. El dominio GLA modificado incluye al menos una sustitución de aminoácidos. El factor VII o VIIa modificado y el factor IX o IXa modificado se puede utilizar en este método.

La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos que no limitan el alcance de la invención descrito en las reivindicaciones.

En los Ejemplos, las posiciones de los aminoácidos se numeran según el factor IX. La proteína S, la proteína C, el factor X, el factor VII y la protrombina humana tienen todos un aminoácido menos (posición 4) y se deben ajustar de forma conveniente.

Ejemplos Ejemplo 1 Factor VII con afinidad hacia la membrana y actividad mejoradas

Se ha observado que la afinidad de la unión a la membrana del factor VII humano de la coagulación de la sangre, se puede incrementar mediante mutagénesis dirigida al sitio. Las propiedades de un mutante P11Q,K33E (denominado en esta memoria Factor VIIQ11E33 o factor VII mutante (SEQ ID NO: 30)) se han caracterizado. La afinidad hacia la membrana se incrementó sobre la de la proteína de tipo silvestre aproximadamente 20 veces. La autoactivación con el mutante se incrementó al menos 100 veces sobre la del factor VII de tipo silvestre. La forma activada de VIIQ11E33 (denominada VIIaQ11E33) mostraba una actividad aproximadamente 10 veces superior a la del factor X. La actividad coaguladora de VIIaQ11E33 con el factor tisular soluble en plasma normal, era aproximadamente 10 veces superior a la de VIIa de tipo silvestre. La actividad coaguladora del zimógeno, VIIQ11E33, con factor tisular normal (suministrado en una dilución de 1:100 de tromboplastina-HS) era 20 veces superior a la del factor VII de tipo silvestre. El grado en el que se mejoraba dicha actividad era dependiente de los estados, siendo VIIQ11E33 especialmente activo bajo condiciones de baja estimulación de la coagulación.

En general, las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo de Bradford, empleando seroalbúmina bovina como patrón. Bradford, M.M., 1976, Analyt., Biochem. 248-254. Las concentraciones molares se obtuvieron a partir de los pesos moleculares de 50.000 para el factor VII y 55.000 para el factor X. A no ser que se indique de otro modo, todas las mediciones de la actividad se realizaron en tampón convencional (Tris 0,05 M, pH 7,5, NaCl 100 mM).

Producción de factor VII mutante: El factor VII mutante se generó a partir del ADNc del factor VII de tipo silvestre (GenBank, número de entrada M13232, NID g182799). Petersen y col., 1990, Biochemistry 29:3451-3457. La mutación P11Q (cambio del aminoácido 11 desde un residuo de prolina a un residuo de glutamina) y la mutación K33E (cambio del aminoácido 33 desde un residuo de lisina a un residuo de ácido glutámico) se introdujeron en el ADNc del factor VII de tipo silvestre mediante una estrategia de la reacción en cadena de la polimerasa, esencialmente tal y como se describe en Vallette y col., 1989, Nucleic Acids Res. 17:723-733. Durante este proceso, se eliminó un sitio de la enzima de restricción XmaIII para diagnóstico por mutación. Se diseñaron cuatro cebadores para PCR para cebar la síntesis de dos fragmentos mutantes de M13232, uno de MluI a BglII, posiciones 221 a 301 y el otro de BglII a SstII, posiciones 302 a 787. Estos cebadores se emplearon bajo condiciones de ciclación con PCR convencionales (GENEAMP, Perkin Elmer) para cebar la síntesis de fragmentos empleando 1 ng del ADNc del factor VII de tipo silvestre como molde. Los fragmentos resultantes se purificaron en gel y se digirieron con MluI y BglII o BglII y SstII. Los dos fragmentos purificados se ligaron a continuación en el ADNc del factor VIII, en el vector de expresión Zem219b, del cual se había eliminado la secuencia de tipo silvestre correspondiente en forma de un fragmento MluI-SstII. Petersen y col., 1990, citado anteriormente. Los fragmentos mutados se secuenciaron en su totalidad para confirmar las sustituciones P11Q y K33E, así como para eliminar la posibilidad de otros cambios en las secuencias, inducidos por la PCR.

Transfección, selección y purificación: Células de riñón de hámster recién nacido (BHK) se dejaron crecer en medio Eagle modificado con Dulbecco, suplementado con 10% de suero de ternera fetal y penicilina-estreptomicina. Las células subconfluentes se transfectaron con el plásmido de expresión del factor VII, empleando lipofectAMINE (Gibco BRL) según las recomendaciones del fabricante. Dos días después de la transfección, las células se tripsinizaron y se diluyeron en medio selectivo que contenía metotrexato 1 \muM (MTX). Las células BHK transfectadas de forma estable se cultivaron posteriormente en medio Eagle modificado con Dulbecco exento de suero, suplementado con penicilina-estreptomicina, 5 \mug/ml de vitamina K_{1} y MTX 1 \muM, y el medio condicionado se recogió. El medio condicionado se aplicó dos veces a una columna de inmunoafinidad, compuesta por un anticuerpo monoclonal dependiente de calcio (CaFVII22) acoplado a Affi-Gel 10. Nakagaki y col., 1991, Biochemistry, 30:10819-10824. El factor VIIQ11E33 purificado final corría como una banda aislada en la electroforesis en gel de SDS poliacrilamida, sin tener una evidencia del factor VIIa en la preparación. El mutante VII (P11Q,K33E) puro mostraba 1400-2800 unidades/mg de
factor VII.

Activación del factor VII: El factor VIIaQ11E33 activado se formó mediante escisión del factor Xa bovino de VIIQ11E33 (proporción en peso de 1:100, incubación durante 1 h a 37ºC). Alternativamente, se obtuvo el factor VIIaQ11E33 mediante autoactivación (37ºC, 20 min) en una mezcla que contenía VIIQ11E33 7 \muM, sTF 0,7 \muM y fosfolípido (fosfatidilserina/fosfatidilcolina (PS/PC), 25/75, 0,1 g/g de proteína).

El factor VIIa de tipo silvestre era una proteína homogénea y recombinante (NOVO Nordisk). Dos preparaciones consistían en un producto comercial liofilizado y un producto no liofilizado. La última proteína se purificó adicionalmente sobre FPLC mono-Q y mostraba una actividad específica de 80.000 unidades/mg, calibrada con un un patrón George King NPP.

Interacción mejorada con la membrana mediante el factor VIIQ11E33: La preparación de fosfolípidos, el ensayo y la medición de la unión de la proteína a la membrana se realizó por el método descrito por Nelsestuen y Lim, 1977, Biochemistry, 30:10819-10824. Se prepararon vesículas unilamelares grandes (LUVs) y vesículas unilamelares pequeñas (SUVs) por los métodos descritos previamente. Hope, M.J. y col., Biochem. Biophys. Acta. 812:55-65; Huang, C., 1969, Biochemistry, 8:344-352. La fosfatidilserina muy pura (cerebro bovino) y la fosfatidilcolina de huevo (Sigma Chemical Col.) se mezclaron en cloroformo. El disolvente se retiró con una corriente de gas nitrógeno. Los fosfolípidos secos se suspendieron en tampón. Las SUVs. se formaron sometiendo a ultrasonidos y filtración en gel, mientras que las LUVs se formaron mediante congelación-descongelación y extrusión. Las concentraciones de fosfolípidos se determinaron con un ensayo de fosfato orgánico, asumiendo una relación en peso de fósforo:fosfolípido de 25.

Se prepararon SUVs de PS/PC (25/75) o PS/PC (10/90). La proteína se añadió al fosfolípido con las relaciones en peso mostradas en la Figura 1. La unión de la proteína a la membrana se sometió a ensayo mediante dispersión de la luz a 90º, por el método de Nelsestuen y Lim, 1977, citado anteriormente. Resumiendo, la intensidad de la dispersión de la luz de las vesículas de fosfolípidos por separado (I_{1}) y después de añadir proteína (I_{2}), se midió y se corrigió la señal de fondo del tampón y de la proteína no unida. La relación del peso molecular del complejo proteína-vesícula (M_{2}) con la de las vesículas aisladas (M_{1}) se puede estimar a partir de la razón en la ecuación 1, en donde \deltan/\deltac es el índice de refracción de las especies respectivas.

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Si se conocen las concentraciones de fosfolípido y de proteína, se puede estimar la concentración de [P*PL] unidas y de proteína libre [P]. Estos valores, junto con la capacidad máxima de unión de las proteínas [P*PL_{máx}] de las vesículas (asumiendo que sea de 1,0 g/g para todas las proteínas) se pueden utilizar para obtener la constante de equilibrio para la interacción proteína-membrana, mediante la razón de la ecuación 2, en donde todas las concentraciones se expresan como proteína molar o sitios de unión a las proteínas.

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La ecuación se determinó con calcio 5 mM y se expresa como la relación M2/M1.

La Figura 1 muestra la unión de VIIa de tipo silvestre (círculos blancos) y el factor VIIQ11E33 (círculos negros) a membranas de PS/PC =25/75, 25 \mug/ml (Figura 1A) o PS/PC = 10/90, 25 \mug/ml (Figura 1B). VIIQ11E33 tenía una afinidad muy superior a la de la proteína de tipo silvestre. La unión a PS/PC (25/75) era a nivel cuantitativo, de modo que la [Proteína_{libre}] era esencialmente cero. Por tanto, los valores de Kd no se podían estimar a partir de estos datos. La unión a la membrana del factor X bovino (triángulos negros) se muestra en la Figura 1 a modo de referencia. El factor X bovino es una de las proteínas con mayor afinidad en esta familia, proporcionando una Kd para PS/PC (20/80) con calcio 2 mM de 40 nM. McDonald y col., 1977, Biochemistry, 36:5120-5127. La Kd para el factor X bovino, obtenido a partir del resultado con una relación de proteína/fosfolípido de 0,55 (Figura 1), era 0,025 \muM.

La unión del factor VII de tipo silvestre y mutante a las membranas de PS/PC (10/90) también se determinó (Figura 1B). El VIIQ11E33 se unía a menos del nivel cuantitativo, lo que permitía estimar una constante de unión a partir de la razón de la ecuación 3.

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Los [Sitios de unión_{libres}] se estimaron a partir de la ecuación 4, asumiendo un máximo de M2/M1 de 1,0 (es decir, [Sitios de unión_{libres}] = [Fosfolípido_{conc. \ en \ peso}/Proteína_{PM}]). Este es un valor común observado para diversas proteínas de esta familia. Véase McDonald y col., 1997, citado anteriormente.

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Empleando estas premisas y los datos de una proporción de proteína a fosfolípido de 0,37, los valores de Kd eran 0,7 \muM para el factor X bovino, 5,5 \muM para el factor VII de tipo silvestre y 0,23 \muM para VIIQ11E33. Por tanto, estaba claro que el factor VIIQ11E33 mejoraba mucho en afinidad de unión a la membrana sobre el factor VII de tipo silvestre y tenía una de las afinidades más altas de unión a la membrana entre las proteínas dependientes de la vitamina K.

Activación mejorada del factor VIIQ11E33: La primera etapa en la coagulación implica la activación del factor VII. La autoactivación de VII se realizó en una solución que contenía sTF 100 nM (producto altamente purificado procedente del Dr. Walter Kisiel, Fiore y col., 1994, J. Biol. Chem., 269:143-149), VIIQ11E33 36 nM y PS/PC (25/75, 22 \mug/ml). La actividad de VIIaQ11E33 se estimó en varios intervalos de tiempo añadiendo 0,15 mm de sustrato S-2288 (Kabi) y determinando la tasa de liberación del producto p-nitrofenilfosfato mediante cambio de la absorbancia a 405 nm. La actividad inicial de la preparación de VIIQ11E33 era menor al 4% de VIIaQ11E33 totalmente activa.

VIIQ11E33 se encontró que era un sustrato mucho mejor para la activación que el factor VII de tipo silvestre. La Figura 2 muestra la autoactivación del factor VIIQ11E33. Los datos se analizaron mediante la razón de la ecuación 5 (ecuación 7 de Fiore y col., 1994, citado anteriormente).

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ln [VIIa]_{t} es la concentración de factor VIIa en el tiempo t, kcat es la constante de la tasa catalítica para el factor VIIa que actúa sobre VII e y es la saturación fraccional de los sitios de VIIa. Para el factor VIIa de tipo silvestre, esta relación y sTF 1 \muM proporcionaban una kcat de 0,0045/s y una proporción de kcat/Km de 7*10^{3} M^{-1}s^{-1}. Véase, Fiore y col., 1994, citado anteriormente. Para la enzima VIIQ11E33 la autoactivación fue rápida (Figura 2) y sólo era posible estimar un límite menor para kcat. Esto se obtuvo a partir del tiempo doble de VIIa de aproximadamente 25 segundos (kcat = (ln2) / t_{1/2}). El valor resultante (kcat_{min}= 0,03/s) junto con la concentración de sustrato de esta reacción (3,6*10^{-8} M) y asumiendo que y = 1,0, proporcionaba un valor para kcat/ [S] = 8*10^{5} M^{-1}s^{-1}. Esto debía ser muy inferior al de la verdadera kcat/km para VIIaQ11E33, pero era aproximadamente 100 veces superior al valor de kcat/Km para el factor VIIa/sTF de tipo silvestre estimado por Fiore y col., 1994, citado anteriormente. Por tanto, la combinación de la enzima VIIaQ11E33 y el sustrato del factor VIIQ11E33 era superior a las proteínas de tipo silvestre en la etapa de activación de la coagulación. Esto sugería que VIIQ11E33 era superior a la enzima de tipo silvestre cuando las condiciones de la coagulación eran mínimas.

Actividad mejorada de VIIaQ11E33: Una vez generado, el factor VIIa activa el factor X o el factor IX. La activación del factor X bovino (0,1 \muM) mediante el factor VIIa se realizó en tampón Tris HCl 50 mM, pH 7,5 que contenía NaCl 100 mM, calcio 5 mM, varias cantidades de fosfolípido (PS/PC, 25/75) y 1 mg/ml de seroalbúmina bovina a 22,5ºC. El factor VIIa (0,06 nM de VIIaQ11E33 o 0,6 nM de VIIa de tipo silvestre) se añadió a tiempo cero y se determinó la actividad de Xa en los puntos de tiempo de 1, 3 y 5 minutos. Se mezclaron partes alícuotas de la mezcla de reacción (0,2 mL) con tampón (0,2 ml) que contenía EDTA 10 mM y S-2222 0,4 mM (Kabi), un sustrato cromógeno para el factor Xa. El cambio en la absorbancia a 405 nm se determinó en un espectrofotómetro DU8 de Beckman. La cantidad de factor Xa generado se calculó a partir del coeficiente de extinción (1*10^{4} M^{-1}cm^{-1}) del producto de la reacción de p-nitrofenilfosfato y una velocidad de 33/seg para la hidrólisis del sustrato mediante Xa bovina purificada bajo las condiciones de este ensayo.

La Figura 3 compara la capacidad del factor VIIa de tipo silvestre (círculos blancos) y VIIaQ11E33 (círculos negros) para activar el factor X en un sistema purificado. De nuevo, VIIaQ11E33 era casi superior al factor VIIa de tipo silvestre en esta reacción. La diferencia era máxima con concentraciones inferiores de fosfolípido y disminuía hasta 2 veces con 200 \mug de fosfolípido por ml. Esto se esperaba, ya que altas concentraciones de la membrana causan una porción superior de factor VIIa de tipo silvestre para unirse a la membrana. De nuevo, la función incrementada de VIIaQ11E33 era superior bajo condiciones de baja exposición a fosfolípidos.

Coagulación superior de VIIaQ11E33: Los ensayos de coagulación sanguínea se realizaron a 37ºC empleando el método manual basculante para detectar la formación de coágulos. El plasma humano (0,1 ml) se pudo equilibrar a 37ºC durante 1 minuto. Se añadieron varios reactivos en un volumen de 0,1 ml de tampón convencional. El factor tisular soluble (50 nM) y el fosfolípido (PS/PC, 10/90, 75 \mug/ml) se añadieron al plasma, junto con la concentración del factor VIIa mostrada en la Figura 4 (0,1 - 32 nM). Finalmente, se añadieron 0,1 ml de CaCl_{2} 25 mM para iniciar la reacción. El tiempo para formar un coágulo se midió. En la mayoría de los casos de describe la media y la desviación estándar de las muestras replicadas.

La Figura 4 muestra los tiempos de coagulación de VIIaQ11E33 frente a VIIa de tipo silvestre en plasma humano normal. La coagulación se mantuvo con sTF y se añadieron vesículas de fosfolípido. El factor VII endógeno de tipo silvestre tiene aproximadamente una concentración de 10 nM y virtualmente no tiene efecto sobre los tiempos de coagulación. La coagulación de fondo eran 120 segundos con o sin sTF. El factor VIIaQ11E33 mostraba aproximadamente una actividad 8-10 veces superior a la de VIIa de tipo silvestre bajo estas condiciones del ensayo. Se obtuvieron resultados similares con plasma carente del factor VIII, sugiriendo que la ruta principal para la coagulación sanguínea en este sistema implicaba la activación directa del factor X a través del factor VIIa. En general, el factor VIIaQ11E33 era superior a VIIa de tipo silvestre en tanto a la actividad procoagulante sostenida por las vesículas de la membrana y el factor tisular soluble. El zimógeno de tipo silvestre virtualmente no tenía actividad bajo estas condiciones, tal y como se indicaba con los tiempos de coagulación similares de fondo de 2 minutos, añadiendo o no sTF.

Actividad procoagulante con factor tisular normal: La actividad de VIIa y/o VIIQ11E33 con sTF se midió en plasma humano normal. El factor VII endógeno parecía no tener efecto sobre el tiempo de coagulación en este ensayo; el tiempo de coagulación de fondo era 2 minutos para el plasma, con o sin factor tisular soluble. El factor tisular soluble (concentración final de 50 nM) y VIIa se añadieron al plasma antes de la solución de calcio. El tiempo de coagulación se determinó para las muestras que contenían varios niveles de VIIa o VIIaQ11E33. Se sometieron a ensayo dos preparaciones, la normal y la carente del factor VIII.

La coagulación mantenida por el factor tisular normal se sometió a ensayo con tromboplastina-HS convencional de cerebro de conejo (HS = alta sensibilidad) que contenía calcio (Sigma Chemical Co.). Esta mezcla contiene ambos fosfolípidos y el factor tisular unido a la membrana. La tromboplastina-HS de cerebro de conejo se diluyó 1:100 en tampón y se empleó en el ensayo de VII (añadido en forma de plasma humano normal, que contiene factor VII 10 nM) y VIIQ11E33 (añadido en forma de proteína pura). La tromboplastina (0,2 ml) se añadió al plasma (0,1 ml) para iniciar la reacción y se midió el tiempo requerido para formar un coágulo sanguíneo. Los ensayos se realizaron también con tromboplastina sin diluir, tal y como indicaba el fabricante.

A niveles óptimos de tromboplastina humana, el factor VII de tipo silvestre mostraba un nivel normal de actividad, aproximadamente 1500 unidades por mg. Esto es aproximadamente 25 veces menos que la actividad del factor VIIa de tipo silvestre (80.000 unidades por mg). VIIQ11E33 proporcionaba 1500-3000 unidades por mg bajo condiciones convencionales del ensayo, sólo dos veces superior al factor VII de tipo silvestre.

La diferencia entre VII de tipo silvestre y VIIQ11E33 era mucho mayor cuando las condiciones de la coagulación eran mejorables. La Figura 5 muestra los tiempos de coagulación y las concentraciones de zimógeno en los ensayos que contenían 0,01-veces el nivel normal de tromboplastina. Bajo estas condiciones, VIIQ11E33 era aproximadamente 20 veces más activo que el factor VII de tipo silvestre. Por tanto, era especialmente evidente una eficacia mayor del mutante VIIQ11E33 cuando las condiciones de coagulación se limitaban, lo que es importante para muchas situaciones in vivo.

Actividades anticoagulantes de DEGR-VIIaQ11E33: Los ensayos de coagulación convencionales se realizaron con suero humano normal y con tromboplastina humana que se había diluido 1:10 con tampón. El sitio activo del factor VIIaQ11E33 fue modificado por DEGR, tal y como describen Sorenson, B.B. y col., 1997, citado anteriormente. La Figura 6 muestra el tiempo de coagulación de DEGR-VIIaQ11E33 (0-4 nm) incubado con tromboplastina, en tampón con calcio, durante 15 segundos, antes de añadir el plasma. El tiempo para formar un coágulo se determinó con el método manual basculante. El tiempo de coagulación era aproximadamente 45 segundos con aproximadamente 1 nm de DEGR- VIIaQ11E33.

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Ejemplo 2 Tiempo de circulación del factor VIIQ11E33 en la rata

A dos ratas (325-350 g) Sprague Dawley anestesiadas (nembutol sódico), de les inyectó 36 \mug de factor VIIQ11E33 en el punto de tiempo cero. La inyección fue a través de la vena yugular, en la que se había introducido una cánula. En los puntos de tiempo indicados en la Figura 7, se retiró sangre de la arteria carótida en la que se había introducido una cánula mediante cirugía. La cantidad de factor VIIQ11E33 en la circulación se estimó a partir del tiempo de coagulación del plasma humano carente de factor VII, al que se había añadido 1 \mul de una dilución 1:10 de plasma de rata. Se empleó una dilución 1:100 de tromboplastina-HS de cerebro de conejo (Sigma Chemical Co.). La coagulación se determinó por el método manual de tubo basculante, tal y como se ha descrito en el Ejemplo 1. La cantidad de actividad del factor VII en el plasma antes de la inyección de VIIQ11E33, se determinó y se restó como ensayo en vacío. La concentración del factor VIIQ11E33 en la circulación se proporciona como log nM. Se realizó un experimento de simulación en el que un tercer animal padecía la operación y la canulación, pero sin factor VIIQ11E33. La cantidad de actividad del factor VII en este animal no cambió durante el tiempo de duración del experimento (100 minutos). Al final del experimento, los animales padecieron eutanasia por exceso de nembutol sódico.

Las ratas parecían normales durante el experimento, sin tener evidencias de coagulación. Por tanto, el factor VIIQ11E33 no causaba una coagulación indiscriminada, incluso en la rata post-operativa. El tiempo de vida en la circulación del VIIQ11E33 era normal (Figura 7), aclarándose aproximadamente el 40% de la proteína en aproximadamente 60 minutos e incluso con una desaparición más lenta de la proteína restante. Esto era similar a la tasa de aclaramiento de la protrombina bovina procedente de la rata. Nelsestuen y Suttie, 1971, Biochem. Biophys. Res. Commun., 45:198-203. Esto es superior al factor VIIa recombinante de tipo silvestre que proporcionaba un tiempo medio en la circulación para los ensayos funcionales de 20-45 minutos. Thomsen, M.K., y col., 1993, Thromb. Haemost., 70:458-464. Esto indicaba que el factor VIIQ11E33 no era reconocido como una proteína anormal y que no se destruía rápidamente por la actividad de la coagulación. Aparecía como una proteína normal y debía tener un tiempo medio convencional en la circulación en el animal.

Ejemplo 3 Mejora del sitio de la membrana y de la actividad de la proteína C

La proteína C bovina y humana mostraban un alto grado de homología en los aminoácidos de sus dominios GLA (44 residuos amino-terminales), a pesar de tener la proteína humana aproximadamente una afinidad hacia la membrana 10 veces superior. La proteína C bovina contiene una prolina en la posición 11 frente a una histidina en la posición 11 de la proteína C humana. El efecto de la sustitución de la prolina-11 en la proteína C bovina por una histidina, y el cambio inverso en la proteína C humana, fue examinado. En ambos casos, la proteína que contenía la prolina 11 mostraba menos afinidad hacia la membrana, aproximadamente 10 veces menos la proteína C bovina y 5 veces menos la proteína C humana. La proteína C humana activada (hAPC) que contiene prolina en la posición 11, mostraba una actividad de 2,4 a 3,5 veces menor que la de la hAPC de tipo silvestre, dependiendo del ensayo empleado. La APC bovina que contiene histidina-11, mostraba una actividad que era hasta 15 veces superior a la de la bAPC de tipo silvestre. Esto muestra la capacidad para mejorar el contacto con la membrana y la activación con la mutación.

Mutagénesis de la proteína C: Un clon de ADNc de la proteína C humana de longitud completa fue proporcionado por el Dr. Johan Stenflo (Dpto. de Química Clínica, University Hospital, Malmö, Suecia). El clon de ADNc de la proteína C bovina fue proporcionado por el Dr. Donald Foster (ZymoGenetics, Inc., EE.UU.). El número de entrada de GenBank para la secuencia de nucleótidos de la proteína C bovina es K02435, NID g163486 y para la secuencia de nucleótidos de la proteína C humana es K02059, NID g190322.

La mutagénesis dirigida al sitio se realizó según un método con PCR. Para la mutagénesis de la proteína C humana de histidina-11 a prolina, se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos: A, 5' -AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCC AAG CTT- 3' (SEQ ID NO: 7) (que se corresponde con los nucleótidos 860-895 en el vector pRc/CMV) para crear un sitio Hind III entre pRc/CMV y la proteína C. B, 5' -GCA CTC CCG CTC CAG GCT GCT GGG ACG GAG CTC CTC CAG GAA- 3' (SEQ ID NO: 8) (que se corresponde con los residuos de aminoácidos 4-17 en la proteína C humana, el 8º residuo en esta secuencia se había mutado del de la proteína C humana al de la proteína C bovina, tal y como se indica subrayando).

Para la mutagénesis en la proteína C bovina de la prolina-11 a histidina, se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos: A, (tal y como se ha descrito anteriormente); C, 5' -ACG CTC CAC GTT GCC GTG CCG CAG CTC CTC TAG GAA -3' (SEQ ID NO: 9) (que se corresponde con los residuos de aminoácidos 4-15 en la proteína C bovina, el 6º aminoácido se había mutado del de la proteína C bovina al de la proteína C humana, tal y como se marca subrayando); D, 5' -TTC CTA GAG GAG CTG CGG CAC GGC AAC GTG GAG CGT -3' (SEQ ID NO: 10) (que se corresponde con los residuos de aminoácidos 4-15 de la proteína C bovina, el 7º aminoácido se había mutado el de la proteína C bovina al de la proteína C humana; los nucleótidos mutados están subrayados); E, 5' -GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA -3' (SEQ ID NO: 11) (que se corresponde con los nucleótidos 984-1019 en el vector pRc/CMV), creando un sitio Xba I entre pRc/CMV y la proteína C.

Los ADNc de la proteína C humana y bovina se clonaron ambos en los sitios Hind III y Xba I del vector de expresión pRc/CMV. El ADNc de la proteína C humana que contiene el extremo 5' hasta el aminoácido 17, se amplificó mediante PCR con ADNc de la proteína C humana intacta y los cebadores A y B. El volumen para la reacción PCR era 100 \mul y contenía 0,25 \mug de ADN molde, 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatos, 0,5 mM de cada cebador y 2,5 U de la polimerasa de ADN Pwo (Boehringer Mannheim) en tampón Tris-HCl (Tris 10 mM, KCl 25 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 5 mM y MgSO_{4} 2 mM, pH 8,85). Las muestras se sometieron a 30 ciclos de PCR que consistían en un periodo de desnaturalización de 2 minutos a 94ºC, un periodo de reasociación de 2 minutos a 55ºC y un periodo de elongación de 2 minutos a 72ºC. Después de la amplificación, el ADN se sometió a electroforesis mediante un gel de agarosa al 0,8% en tampón Tris-acetato 40 mM que contenía EDTA 1 mM. Los productos de la PCR se purificaron con un equipo de reactivos JET Plasmid Miniprep-Kit (Saveen Biotech AB, Suecia). El ADNc de la proteína C humana que contenía las mutaciones respectivas se escindió con Hind III y Bsr BI y a continuación se clonó en el vector pRc/CMV que se había digerido con Hind III/Xba I y que contenía un fragmento de la proteína C humana desde Bsr BI hasta el extremo 3', para producir un ADNc de longitud completa de la proteína C humana, con la mutación.

El ADNc de la proteína C bovina que contenía el extremo 5'-terminal hasta el aminoácido 11, se amplificó con PCR con el ADNc de la proteína C humana intacta y los cebadores A y C. El ADNc de la proteína C bovina desde el aminoácido 11 hasta el extremo 3'-terminal se amplificó con ADNc de la proteína C humana intacta y los cebadores D y E. Estos dos fragmentos de ADNc se emplearon como moldes para amplificar el ADNc de la proteína C bovina de longitud completa, que contenía los aminoácidos mutados, con los cebadores A y E. Las condiciones de la reacción PCR eran idénticas a las empleadas para hAPC. El ADNc de la proteína C bovina que contenía las mutaciones respectivas se cortó con HInd III y Bsu 36I y el fragmento Hind III/Bsu 36I se clonó en el vector pRc/CMV que contenía fragmentos de la proteína C bovina intacta, desde Bsu 36I hasta el extremo 3'-terminal, para producir ADNc de la proteína C bovina de longitud completa, que contenía la mutación. Todas las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación del ADN antes de la transfección.

Cultivo celular y Expresión: La línea celular 293 de riñón humano transfectada con adenovirus, se dejó crecer en medio DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 U/ml de estreptomicina y 10 \mug/ml de vitamina K_{1}. La transfección se realizó empleando el método de la lipofectina. Felgner, P.L. y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417. Se diluyeron 2 \mug de ADN en 0,1 ml con DMEM que contenía medio de L-glutamina 2 mM. Se añadieron 10 \mul de lipofectina (1 mg/ml) a 100 \mul de DMEM que contenía medio de L-glutamina 2 mM. El ADN y la lipofectina se mezclaron y se dejaron a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Las monocapas celulares (25-50% de confluencia en placas petri de 5 cm) se lavaron dos veces en DMEM con medio de L-glutamina 2 mM. La mezcla de ADN/lípido se diluyó hasta 1,8 ml en DMEM que contenía medio de L-glutamina 2 mM, se añadió a las células y se incubó durante 16 horas. Las células se alimentaron con 2 ml de medio completo que contenía suero de ternera fetal al 10%, se dejaron recuperar durante otras 48-72 horas y a continuación se tripsinizaron y se sembraron en placas de 10 cm con medio de selección (DMEM que contenía 10% de suero y 400 \mug/ml de geneticina) a 1:5. Yan, S.C.B. y col., 1990, Bio/Technology 655-661. Las colonias resistentes a la geneticina se obtuvieron al cabo de 3-5 semanas de selección. Se seleccionaron 24 colonias de cada transfección de ADN, se dejaron crecer hasta confluencia y se escrutaron los medios en busca de expresión de la proteína C con un ensayo de transferencia de puntos, empleando el anticuerpo monoclonal HPC4 (para la proteína C humana) y el anticuerpo monoclonal BPC5 (para la proteína C bovina). Los clones que producían grandes cantidades de proteína se aislaron y se dejaron crecer hasta confluencia en presencia de 10 \mug/ml de vitamina K_{1}.

La purificación de la proteína C recombinante bovina y su mutante se basaron en el método descrito previamente con alguna modificación. Rezair, A.R., y Esmon, C.T., 1992, J. Biol. Chem., 267:26104-26109. El medio condicionado exento de suero procedente de las células transfectadas de forma estable, se centrífugo a 5000 rpm a 4ºC durante 10 minutos. El material sobrenadante se filtró a través de membranas de nitratocelulosa de 0,45 \mum (Micro Filtration Systems, Japón). Se añadió EDTA (concentración final 5 mM) y PPACK (concentración final 0,2 \muM) al medio condicionado procedente de células 293, a continuación se hizo pasar a través de una columna de intercambio aniónico de Pharmacia FFQ, a temperatura ambiente, empleando MIllipore Con Sep LC100 (Millipore, EE.UU.). La proteína se eluyó con un gradiente de CaCl_{2} (solución de partida, Tris-HCl 20 mM/NaCl 150 mM, pH 7,4; solución limitante, Tris-HCl 20 mM/NaCl 150 mM/CaCl_{2} 30 mM, pH 7,4). Después de retirar el CaCl_{2} mediante diálisis y tratamiento con Chelex 100, la proteína se reabsorbió en una segunda columna FFQ, a continuación se eluyó con un gradiente de NaCl (solución de partida, Tris-HCl 20 mM/NaCl 150 mM, pH 7,4; solución limitante, Tris-HCl 20 mM/NaCl 500 mM/, pH 7,4). En este momento de la purificación, las proteínas C bovinas de tipo silvestre y recombinante mutante eran homogéneas tal y como se determinó mediante SDS-PAGE.

La primera columna empleada para la purificación de la proteína C humana recombinante de tipo silvestre y mutante era la misma que la descrita para la proteína C bovina. El método cromatográfico descrito por Rezair y Esmon se empleó con algunas modificaciones descritas para el método de purificación de la proteína S. Rezair, A.R. y Esmon, C.T., 1992, citado anteriormente; He, Z. y col., 1995, Eur. J. Biochem., 227:433-440. Las fracciones que contenían la proteína C procedentes de la cromatografía de intercambio aniónico, se identificaron mediante transferencia de puntos. Las fracciones positivas se reunieron y se aplicaron a una columna de afinidad que contenía el anticuerpo HPC-4 dependiente de Ca^{2+}. La columna se equilibró con Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, que contenía benzamidina-HCl 5 mM y CaCl_{2} 2 mM. Después de la aplicación, la columna se lavó con el mismo tampón que contenía NaCl 1 M. La proteína C se eluyó a continuación con Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM y EDTA 5 mM, pH 7,4, que contenía benzamidina-HCl 5 mM. Después de la purificación, se estimó la pureza de todas las preparaciones de proteína C recombinante bovina y humana mediante SDS-PAGE, seguido de tinción con plata. Las proteínas se concentraron empleando filtros YM 10 (Amicon), a continuación se dializaron frente a tampón (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) durante 12 horas y se almacenaron a -70ºC. Las concentraciones de las proteínas se midieron mediante absorbancia a 280 nm.

Asociación con membranas de moléculas de proteína C normales y mutantes: LUVs y SUVs se prepararon según los métodos descritos en el Ejemplo 1. La dispersión de la luz a 90º con la luz incidente se empleó para cuantificar la unión proteína-membrana, tal y como se ha descrito anteriormente para el factor VII (25 \mug/ml de PS/PC, (25/75) con calcio 5 mM (tampón Tris 0,05 M - NaCl 0,1 M, pH 7,5).

La proteína C bovina que contenía histidina en la posición 11, interaccionaba con las membranas aproximadamente con una afinidad 10 veces superior a la de la proteína de tipo silvestre. Cuando se ajustaba a la ecuación 2, los datos proporcionaban valores de K_{D} de 930\pm 80 nM para la proteína C-H11 y 9200\pm950 nM para la proteína C de tipo silvestre (Figura 8A). La diferencia en la afinidad se correspondía a aproximadamente 1,4 kcal/mol a 25ºC. De hecho, la afinidad hacia la membrana de la proteína C H11 bovina era casi idéntica a la observada en la proteína C humana natural (660 nM, Figura 8B). Esto sugería que la prolina 11 formaba una base principal para las diferencias entre el sitio de unión a la membrana de las proteínas humana y bovina.

La sustitución inversa, reemplazar His-11 de la proteína C humana por prolina, disminuía la afinidad hacia la membrana (Figura 8B). Cuando se ajustaba a la ecuación 2, estos datos proporcionaban valores de K_{D} de 660\pm90 nM para la proteína C humana de tipo silvestre y 3350\pm110 nM para la proteína C P11 humana. El efecto de la introducción de prolina era sólo ligeramente menor que la de la prolina en las proteínas bovinas.

Efecto de la prolina-11 sobre la actividad de la proteína C activada: La proteína C activada se generó con la escisión de trombina, empleando condiciones idénticas para las proteínas de tipo silvestre y los mutantes. Aproximadamente 150 \mug de las diversas preparaciones de proteína C (1 mg/ml) se mezclaron con trombina bovina (3 \mug) y se incubaron a 37ºC durante 5 horas. El producto de la reacción se diluyó hasta obtener un tampón Tris 0,025 M - NaCl 0,05 M y se aplicó a una columna de un ml de SP-Sephadex C-50. La columna se lavó con un ml del mismo tampón y el flujo a través se recogió en forma de proteína C activada. Aproximadamente 65-80% de la proteína aplicada a la columna se recuperó. La actividad de APC se determinó por proteolisis de S2366 (0,1 mM) a 25ºC. Las preparaciones se compararon con preparaciones patrones obtenidas a gran escala. La APC humana patrón fue proporcionada por el Dr. Walter Kisiel. Para las proteínas bovinas, el patrón era una preparación a gran escala de APC activada con trombina. La actividad de la APC bovina era compatible con todas las preparaciones de proteínas normales y mutantes (\pm5%). Dos preparaciones de APC bovina se emplearon para las comparaciones. La APC humana generada a partir de trombina tenía una actividad que era 55 a 60% la del patrón. Las concentraciones mostradas en este estudio se basaron en la actividad frente a S2366, en relación con la del patrón.

El ensayo convencional APTT empleaba plasma bovino o humano y reactivo APTT convencional (Sigma Chemicals Co.), según las instrucciones del fabricante. Alternativamente, el fosfolípido se proporcionó en forma de vesículas formadas a partir de fosfolípidos altamente purificados. En este ensayo, el plasma bovino (0,1 ml) se incubó con caolín (0,1 ml de 5 mg/ml en tampón Tris 0,05 M, NaCl 0,1 M, pH 7,5) o ácido elágico (0,1 mM en tampón) durante 5 minutos a 35ºC. La coagulación se inició añadiendo 0,1 ml de tampón que contenía fosfolípido y las cantidades de APC mostradas, seguido de 0,1 ml de cloruro cálcico 25 mM. Todos los reactivos estaban en tampón convencional que contenía tampón Tris 0,05 M, NaCl 0,1 M, pH 7,5. Por término medio, se necesitaba una concentración 14 veces superior de bAPC de tipo silvestre, para duplicar el efecto del mutante H11. El tiempo de coagulación con bAPC-H11 10 nM era superior a 120 minutos. El reactivo APTT convencional (Sigma Chemical Co.) proporcionó un tiempo de coagulación de aproximadamente 61 segundos a 35ºC con este plasma. El tiempo necesario para formar un coágulo se registró con técnicas manuales. La cantidad de fosfolípido se diseñó para que fuera el componente limitante en el ensayo y proporcionar los tiempos de coagulación mostrados. Los fosfolípidos empleados eran SUVs (45 \mug/0,4 ml en el ensayo final, PS/PC, 10/90) o LUVs (120 \mug/0,4 ml en el ensayo final, PS/PC, 25/75).

La actividad anticoagulante de la proteína C activada se sometió a ensayo en diversos experimentos. La Figura 9 muestra el efecto sobre el ensayo APTT, realizado con fosfolípido limitante. Con las condiciones de este ensayo, los tiempos de coagulación disminuían en una relación inversa, casi lineal, a la concentración de fosfolípido. Se necesitaba aproximadamente 14 veces la cantidad APC bovina de tipo silvestre para igualar el efecto de la APC-H11 bovina.

Partes del estudio en la Figura 9 se repitieron para las membranas de PS/PC (25/75, LUV). De nuevo, la actividad se limitó con el fosfolípido y su concentración se ajustó para proporcionar un tiempo de coagulación convencional de 360 segundos (120 \mug de PS al 25% en el ensayo de 0,4 ml). Se necesitaba aproximadamente 15 veces más enzima de tipo silvestre para igualar el efecto del mutante H11. Finalmente, se utilizó el reactivo APTT convencional (Sigma Chemical Co., tiempo de coagulación convencional 50\pm2 segundos). Se necesitaba aproximadamente 10,0\pm0,7 nM de enzima de tipo silvestre para doblar el tiempo de coagulación a 102\pm5 segundos. El mismo efecto se produjo con 2,2\pm0,1 nM de APC-H11 bovina. El fosfolípido no era una tasa limitante en el ensayo convencional, ya que se podía esperar un efecto menor sobre la afinidad a la membrana.

Los resultados de las proteínas humanas se muestran en la Figura 8B. Se necesitaba aproximadamente 2,5 veces la cantidad de APC humana que contenía prolina-11, para prolongar la coagulación hasta el grado de la APC de tipo silvestre. Un efecto menor por la introducción de prolina-11, podía reflejar las diferencias menores en la afinidad a la membrana de las proteínas humanas (Figura 9B).

Inactivación del factor Va: La inactivación del factor Va se sometió a ensayo con el método de Nicolaes y col., 1996, Thrombosis and Haemostasis, 76:404-410. Resumiendo, para las proteínas bovinas se diluyó plasma bovina 1000 veces con Tris 0,05 M, NaCl 0,1 M, 1 mg/ml de seroalbúmina bovina y calcio 5 mM a pH 7,5. Las vesículas de fosfolípido (5 \mug/0,24 ml de ensayo) y 5 \mul de trombina 190 nM se añadieron al factor V activado. Después de incubar durante 10 minutos a 37ºC, se añadió APC y la incubación continuó durante 6 minutos. La protrombina bovina (hasta 10 \muM de concentración final) y el factor Xa (0,3 nM de concentración final) se añadieron y la reacción se incubó durante un minuto a 37ºC. Una muestra de 20 \mul de esta reacción de activación se añadió a 0,38 ml de tampón (Tris 0,05 M, NaCl 0,1 M, EDTA 5 mM, pH 7,5) que contenía sustrato S2288 (60 \muM). La cantidad de trombina se determinó por el cambio en la absorbancia a 405 nM (\varepsilon = 1,0*10^{4} M^{-1}s^{-1}, k_{cat} para trombina = 100/s). Para las proteínas humanas, el plasma carente de proteína S humana (Biopool Canada, Inc.) se diluyó 100 veces, el factor Va se activó con la trombina humana y el factor Va producido se sometió a ensayo con los reactivos empleados para las proteínas bovinas.

La APC-H11 bovina era 9,2 veces más activa que la de tipo silvestre (Figura 10A) para inactivar el factor Va. Del mismo modo que para la unión a la membrana (arriba), el efecto de la prolina-11 era menor con las proteínas humanas, con un promedio de 2,4 veces la diferencia entre las curvas dibujadas para el tipo silvestre y para el mutante P-11 (Figura 10B). Se obtuvieron resultados similares con el plasma humano normal.

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Ejemplo 4 Identificación de un prototipo de la afinidad hacia la membrana para el sitio de contacto de la membrana de las proteínas dependientes de la vitamina K

La comparación de diversos mutantes de la proteína C humana y bovina y de otros polipéptidos dependientes de la vitamina K, condujo a un prototipo propuesto para el sitio de contacto en la membrana. El prototipo electrostático consiste en un núcleo electropositivo sobre una superficie de la proteína, creado por iones de calcio unidos, rodeado por un halo de carga electronegativa procedente de aminoácidos de la proteína. Cuanto más se acerque un miembro de esta familia de proteínas a este patrón electrostático, mayor es su afinidad hacia las membranas.

Las vesículas de fosfolípidos, la proteína C bovina de tipo silvestre, los estudios de la interacción proteína-membrana, la activación y la cuantificación de la proteína C y el análisis de la actividad fueron tal y como se han descrito en el Ejemplo 3.

La proteína C mutante y recombinante se generó mediante los siguientes procedimientos. La mutagénesis dirigida al sitio se realizó por un método de PCR. Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos: A, tal y como se ha descrito en el Ejemplo 3; F, 5' -GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA -3' (SEQ ID NO: 11) (que se corresponde con los nucleótidos 984-1019 en el vector pRc/CMV), creando un sitio Xba I entre pRc/CMV y la proteína C; G, 5' -GAA GGC CAT TGT GTC TTC CGT GTC TTC GAA AAT CTC CCG AGC- 3' (SEQ ID NO: 12) (que se corresponde con los residuos de aminoácidos 40-27 en la proteína C bovina, los aminoácidos 8º y 9º se mutaron de QN a ED tal y como se marca subrayando); H, 5' -CAG TGT GTC ATC CAC ATC TTC GAA AAT TTC CTT GGC -3' (SEQ ID NO: 13) (que se corresponde con los residuos de aminoácidos 38-27 en la proteína C humana, los aminoácidos 6º y 7º de esta secuencia se mutaron de QN a ED tal y como se indica subrayando); I, 5' -GCC AAG GAA ATT TTC GAA GAT GTG GAT GAC ACA CTG -3' (SEQ ID NO: 14) (que se corresponde con los residuos de aminoácidos 27-38 en la proteína C humana, los aminoácidos 6º y 7º de esta secuencia se mutaron de QN a ED tal y como se indica subrayando); J, 5' -CAG TGT GTC ATC CAC ATT TTC GAA AAT TTC CTT GGC -3' (SEQ ID NO: 15) (que se corresponde con los residuos de aminoácidos 38-27 en la proteína C humana, el aminoácido 7º de esta secuencia se mutó de Q a E tal y como se indica subrayando); K, 5' -GCC AAG GAA ATT TTC GAA AAT GTG GAT GAC ACA CTG -3' (SEQ ID NO: 16) (que se corresponde con los residuos de aminoácidos 27-38 en la proteína C humana, el aminoácido 6º de esta secuencia se mutó de Q a E, tal y como se indica subrayando).

Los ADNc de longitud completa de la proteína C humana y bovina se clonaron en el sitio Hind III y Xba I del vector pRc/CMV. Para obtener el mutante E33D34 de la proteína C bovina, se realizó una amplificación con PCR del ADN diana del modo siguiente. El ADNc de la proteína C bovina que contenía el extremo 5'-terminal para el aminoácido en la posición 40, se amplificó con ADNc de la proteína C bovina intacta y los cebadores A y C. Las condiciones para la reacción PCR eran tal y como se han descrito en el Ejemplo 3. La muestra se sometió a 30 ciclos de PCR que constaban de un periodo de desnaturalización de 2 minutos a 94ºC, un periodo de reasociación de 2 minutos a 55ºC y un periodo de elongación de 2 minutos a 72ºC. Después de la amplificación, el ADN se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% en tampón Tris-acetato 40 mM que contenía EDTA 1 mM. Los productos de la PCR se purificaron con el equipo de reactivos de The Geneclean III (BIO 101, Inc. EE.UU.) y el fragmento de la PCR del ADNc de la proteína C bovina que contenía las mutaciones respectivas, se cortó con Hind III y Bbs I. El fragmento Hind III/Bbs I y el fragmento de la proteína C humana (Bbs I-extremo 3'-terminal) se clonaron en los sitios Hind III y Xba I del vector pRc/CMV, para producir un ADNc de la proteína C bovina de longitud completa, con las mutaciones. El mutante H11 E33 D34 de la proteína C bovina se creó del mismo modo, pero se empleó el mutante H11 de la proteína C bovina como molde en la reacción de la PCR.

El ADNc de la proteína C humana que contenía desde el extremo 5'-terminal hasta el aminoácido 38, se amplificó empleando PCR con ADNc de la proteína C humana intacta y los cebadores A y D. El ADNc de la proteína C humana desde el aminoácido 27 hasta el extremo 3'-terminal, se amplificó con ADNc de la proteína C humana y los cebadores B y E. Estos dos fragmentos de ADNc se emplearon como moldes para amplificar el ADNc de la proteína C bovina de longitud completa que contenía los aminoácidos mutados (E33 D34) con los cebadores A y B. El mutante E33 de la proteína C humana se obtuvo mediante las siguientes etapas: el ADNc de la proteína C humana que contenía el extremo 5'-terminal hasta el aminoácido 38, se amplificó con ADNc de la proteína C humana intacta y los cebadores A y F. El ADNc de la proteína C humana desde el aminoácido 27 hasta el extremo 3'-terminal, se amplificó con el ADNc de la proteína C humana intacta y los cebadores B y G. Estos dos fragmentos de ADNc se emplearon como moldes para amplificar el ADNc de la proteína C bovina de longitud completa que contenía aminoácidos mutados (E33) con los cebadores A y B. La mezcla de la PCR y el programa se han descrito anteriormente. Los productos de la PCR de la proteína C humana que contenían las mutaciones respectivas, se cortaron con Hind III y Sal I y a continuación el fragmento (Hind III - Sal I) junto con el fragmento de la proteína C humana intacta (Sal I - extremo 3'-terminal) se clonaron en los sitios Hind III y Xba I del vector pRc/CMV para producir el ADNc de la proteína C humana de longitud completa, con las mutaciones respectivas. Todas las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación del ADN antes de la transfección.

La línea celular 293 de riñón humano, transfectada con adenovirus se cultivó y se transfectó tal y como se describe en el Ejemplo 3. La proteína C recombinante humana y bovina y los mutantes se purificaron tal y como se describe en el Ejemplo 3.

Las proteínas dependientes de la vitamina K se clasificaron en cuatro grupos basándose en sus afinidades hacia una membrana convencional (Tabla 4). Las secuencias de los residuos aminoterminales de algunas proteínas relevantes, que incluyen la proteína C humana (hC), la proteína C bovina (bC), la protrombina bovina (bPT), el factor X bovino (bX) y el factor VII humano (hVII) se proporcionan a modo de referencia, en donde X es Gla (ácido \gamma-carboxiglutámico) o Glu.

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TABLA 4 Cargas y Afinidad

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En la Tabla 4, los mutantes del polipéptido dependiente de la vitamina K aparecen en negrita. La carga total (residuos 1-34) incluye 7 iones de calcio (+14) y el extremo amino-terminal (+1).

La proteína Z fue asignada a la clase I, basándose en su constante de la tasa de disociación que era 100 a 1000 veces más lenta que la de otras proteínas. Si la proteína Z mostraba una constante de la tasa de asociación normal (aproximadamente 10^{7} M^{-1}s^{-1}) la K_{D} podría ser aproximadamente 10^{-10} M. Wei, G.J. y col., 1982, Biochemistry, 21:1949-1959. La última afinidad puede el máximo posible para las proteínas de la vitamina K. Las proteínas de la clase IV difieren de las de la clase III en la presencia de prolina-11 que puede alterar la afinidad por medios no electrostáticos.

Aunque había una correlación relativamente débil entre la afinidad hacia la membrana y la carga negativa neta en los residuos 1-34, se observó una excelente correlación cuando sólo se consideraban los residuos 5, 11, 29, 33 y 34 (Tabla 4). Los últimos aminoácidos están localizados en la superficie de la proteína. Se diseñó una variedad de proteínas mediante sustitución de aminoácidos, dentro de la estructura de la protrombina y se estimaron sus potenciales electrostáticos mediante el programa DelPhi. En la Figura 11 se muestra un croquis sistematizado según el potencial electrostático de la proteína Z bovina. Los sitios electronegativos 7, 8, 26, 30, 33, 34 y 11 producen un halo de carga electronegativa rodeando un núcleo catiónico, producido por el poro de calcio revestido (Figura 11). Cuanto más se aproxime una estructura proteica a esta estructura, mayor será su afinidad hacia la membrana. Esta correlación es evidente en las proteínas de tipo silvestre, los mutantes y las proteínas modificadas químicamente.

El modelo para otras estructuras se puede extrapolar a partir del examen de los grupos cargados que están ausentes en otras proteínas. Por ejemplo, Lys-11 y Arg-10 de la protrombina bovina generan regiones altamente electropositivas en su proximidad; la carencia de Gla-33 en la proteína C y el factor VII, crea menos electronegatividad en esas regiones proteicas. En todos los casos, la mayor afinidad se corresponde con una estructura con un núcleo electropositivo que estaba completamente rodeado por una superficie proteica electronegativa, tal y como se muestra para la proteína Z. Las excepciones a este modelo son las proteínas con Pro-11 que pueden tener menor afinidad mediante un efecto estructural y Ser-12 (proteína C humana) que es un residuo exclusivo sin carga.

Para estudiar más a fondo la hipótesis de un prototipo para la distribución electrostática, se empleó la mutagénesis dirigida al sitio para sustituir Gln33Asn34 de la proteína C bovina y humana por Glu33Asp34 (SEQ ID NO: 19). Glu33 se tiene que modificar adicionalmente a Gla durante el procesamiento de la proteína. Estos cambios alteraban el potencial electrostático de la proteína C bovina al del factor X bovino. La afinidad hacia la membrana de la proteína mutante se esperaba que fuera menor que el del factor X, debido a la presencia de prolina-11. Además, el mutante de la proteína C bovina proporcionaba una afinidad a la membrana similar a la de la protrombina bovina (Figura 12A) y ligeramente menor que la del factor X bovino (Tabla 4).

Más interesante era que la inhibición de la coagulación con APC era superior para el mutante que para la enzima de tipo silvestre (Figura 12B, C). La inclusión de resultados para el mutante P11H de la proteína C bovina del Ejemplo 3, mostraba que se podía producir una familia de proteínas, cada una con una afinidad hacia la membrana y una actividad diferentes, variando las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 11, 33 y 34.

Los mutantes de la proteína C humana que contienen E33 y E33D34 daban como resultado un ligero incremento de la afinidad de la unión a la membrana (Figura 13a). La actividad de estos mutantes era ligeramente menor que la de la enzima de tipo silvestre (Figura 13b). Los resultados con mutantes de la proteína C bovina sugieren que el fracaso de la mutación E33D34 en la proteína humana puede proceder de H11 y/o de otros aminoácidos exclusivos en la proteína. La Figura 14A muestra que el mutante H11 de la proteína C bovina se une a la membrana con aproximadamente 10 veces más afinidad que la proteína de tipo silvestre, el mutante E33D34 se une con aproximadamente 70 veces más afinidad, pero el triple mutante, H11E33D34, era sólo ligeramente mejor que el mutante H11. Esta razón se reflejaba en la actividad de la APC formada a partir de esos mutantes (Figura 14B). Este resultado sugiere que la presencia de H11 reduce el efecto de E33D34 sobre la afinidad de unión a la membrana.

Estos resultados indicaban que la introducción de E33D34 puede no ser óptima para todas las proteínas. En consecuencia, pueden ser deseables otras mutaciones para crear proteína C humana que emplearían E33D34 y tendrían una afinidad hacia la membrana incrementada al máximo. El resultado con la proteína bovina sugiere que la histidina 11 puede ser la causa principal de este fenómeno. Por tanto, H11 se puede alterar a glutamina o a otro aminoácido en la proteína C humana, junto con la mutación E33D34. Otro aminoácido que puede tener un efecto sobre la afinidad es la serina en la posición 12, un aminoácido que es totalmente exclusivo de la proteína C humana. Estos cambios adicionales producirían proteínas con una afinidad hacia la membrana mejorada.

El prototipo electrostático también se sometió a ensayo, comparando el factor X humano y bovino. La presencia de lisina-11 en el factor X humano, sugiere que debe haber menos afinidad que con el factor X bovino. Esta predicción se confirmó con el resultado mostrado en la Figura 15.

Estudios previos han mostrado que la modificación del ácido trinitrobenzosulfónico (TNBS) del fragmento 1 de la protrombina bovina y humana, tenía relativamente poco efecto (de 0 a 5 veces) sobre la afinidad a la membrana. Weber, D.J. y col., 1992, J. Biol. Chem., 267:4564-4569; Welsch, D.J. y col., 1988, Biochemistry, 27:4933-4938.

Las condiciones empleadas en la reacción daban como resultado la derivatización del extremo amino-terminal, un cambio que está ligado a una menor afinidad hacia la membrana. Welsch, D.J. y Nelsestuen, G.L., 1988, Biochemistry, 27:4939-4945. La modificación de la proteína en presencia de calcio, que protege el extremo amino-terminal, daba como resultado la proteína modificada en TNBS, con una afinidad muy superior hacia la membrana que el fragmento 1 natural.

La sugerencia de que la proteína Z constituye el prototipo se basó en su constante de la tasa de disociación y en que una tasa de asociación normal generaría una K_{D} = 10^{-10} M. Si ese valor se puede alcanzar, es inseguro. Es posible, que la tasa de asociación lenta de la proteína Z, sea debida a un plegamiento inadecuado de la proteína, dando como resultado una menor concentración de la conformación de unión a la membrana. Si se pueden alterar las condiciones para mejorar el plegamiento de la proteína, las tasas de asociación de la proteína Z deberían mejorar. Además, la constante de la tasa de asociación para la proteína Z se mejoró alterando el pH. La base para esta observación puede estar relacionada con una característica inusual de la estructura de la protrombina que es la posición cercana del extremo amino-terminal (+1 a pH 7,5) a los iones de calcio 2 y 3. La carga +1 en el extremo amino-terminal es responsable de la región ligeramente electropositiva justo encima de Ca-1 en la Figura 11. La repulsión de cargas entre Ca y el extremo amino-terminal puede desestabilizar el plegamiento de la proteína y podría ser un problema grave para una proteína que tenga una estabilidad baja de plegamiento.

La Tabla 5 proporciona un soporte adicional para el modelo del prototipo. Se muestra la relación entre la distancia de los grupos iónicos de los iones estroncio 1 y 8 (que se corresponden a calcio 1 y a un ión metálico divalente extra, encontrado en la estructura cristalina de Sr con rayos X de la protrombina). El modelo sugiere que cuanto más próximo esté el grupo iónico a estos iones metálicos, mayor será su efecto sobre la afinidad hacia la membrana. La excepción es Arg-16, que contribuye a la carga del núcleo electropositivo. Una afinidad superior se correlaciona con una carga electronegativa en todos los otros sitios. Esta correlación también se aplica a los residuos GLA.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5 Distancia a Sr-1, 8 e importancia iónica

12

Los resultados en la Figura 15C muestran que la tasa de asociación para la proteína Z mejoraba sustancialmente a pH 9, en donde un amino terminal debía estar sin carga. La constante de la tasa obtenida a partir de estos datos era aproximadamente 12 veces superior a pH 9 que a pH 7,5 (Figura 15C).

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Otras realizaciones

Se debe tener en cuenta que aunque la invención se ha descrito junto con la memoria descriptiva detallada de la misma, la memoria descriptiva anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones anejas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

<110> Regents of the University of Minnesota

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<120> POLIPÉPTIDOS MODIFICADOS DEPENDIENTES DE LA VITAMINA K

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<130> 09531/002W01

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<150> 08/955.636

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<151> 1997-10-23

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<160> 35

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<170> FastSEQ para la versión 3.0 de Windows

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<210> 1

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<211> 44

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> MOD_RES

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<210> 2

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<211> 44

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<221> MOD_RES

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 44

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<400> 3

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<210> 4

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<211> 44

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<221> MOD_RES

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<210> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<400> 5

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<221> MOD_RES

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<400> 6

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19

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<210> 7

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido mutagénico de la proteína C

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<400> 7

20

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<210> 8

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Oligonucleótido mutagénico de la proteína C

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<400> 8

21

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<210> 9

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido mutagénico de la proteína C

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<400> 9

22

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<210> 10

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Oligonucleótido mutagénico de la proteína C

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<400> 10

23

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<210> 11

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido mutagénico de la proteína C

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<400> 11

24

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<210> 12

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Oligonucleótido mutagénico de la proteína C

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<400> 12

25

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<210> 13

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido mutagénico de la proteína C

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<400> 13

26

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<210> 14

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido mutagénico de la proteína C

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<400> 14

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<210> 15

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido mutagénico de la proteína C

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido mutagénico de la proteína C

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<210> 17

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<211> 45

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<221> MOD_RES

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<221> MOD_RES

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<400> 19

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<210> 20

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<211> 44

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<400> 20

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<211> 44

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<400> 22

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<210> 23

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<211> 44

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<221> MOD_RES

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<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (0)...(0)

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

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<211> 45

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

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<211> 45

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (0)...(0)

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<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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<400> 34

47

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<210> 35

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<211> 44

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa=ácido gamma carboxiglutámico o ácido glutámico

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

48

Claims (21)

1. Una proteína C o un polipéptido de la proteína C activada que comprende un dominio GLA modificado que mejora la afinidad de la unión a la membrana en relación con una proteína C natural correspondiente o un polipéptido de la proteína C activada, comprendiendo dicho dominio GLA modificado la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con al menos una sustitución de aminoácidos en el residuo 10, 11, 28 o 33, en donde dicha proteína C o dicho polipéptido de la proteína C activada es eficaz para disminuir la formación de coágulos en un mamífero.

2. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada de la reivindicación 1, en donde dicha al menos una sustitución de aminoácidos es en el residuo 10.

3. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada de la reivindicación 1, en donde dicha al menos una sustitución de aminoácidos es en el residuo 11.

4. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada de la reivindicación 1, en donde dicha al menos una sustitución de aminoácidos es en el residuo 28.

5. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada de la reivindicación 1, en donde dicha al menos una sustitución de aminoácidos es en el residuo 33.

6. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho dominio GLA modificado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con tres sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas entre el grupo consistente en los residuos 10, 11, 28, 32 y 33.

7. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada según la reivindicación 6, en donde dichas tres sustituciones de aminoácidos son en los residuos 11, 32 y 33.

8. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada según la reivindicación 7, en donde el residuo 32 es ácido glutámico.

9. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada según la reivindicación 7, en donde el residuo 33 es ácido aspártico.

10. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada según la reivindicación 7, en donde el residuo 32 es ácido glutámico y el residuo 33 es ácido aspártico.

11. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada según la reivindicación 10, en donde el residuo 11 es glicina.

12. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la proteína C o la proteína C activada es una proteína C recombinante humana o una proteína C activada recombinante humana.

13. Una composición farmacéutica que comprende la proteína C o el polipéptido de la proteína C activada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para uso como un medicamento.

15. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada según la reivindicación 14, para uso en el tratamiento de la trombosis en un mamífero.

16. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada según la reivindicación 14, para emplear en la disminución de la formación de coágulos en un mamífero.

17. La proteína C o el polipéptido de la proteína C activada según la reivindicación 15 ó 16, para uso en la administración parenteral.

18. Uso de una proteína C o un polipéptido de la proteína C activada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para preparar un medicamento para el tratamiento de un trastorno de la coagulación.

19. Una célula hospedadora de mamífero que comprende un vector de ácido nucleico, en donde dicho vector codifica una proteína C o un polipéptido de la proteína C activada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
12.

\newpage

20. Uso de una célula hospedadora de mamífero para producir la proteína C o el polipéptido de la proteína C activada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

21. El uso según la reivindicación 20, en donde la célula hospedadora de mamífero es una célula 293 de riñón humano transfectada con adenovirus.