PL194194B1

PL194194B1 - Polipeptydy białka C lub aktywowanego białka C, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie polipeptydubiałka C lub aktywowanego białka C oraz sposoby wytwarzania polipeptydów białka C lub aktywowanego białka C

Info

Publication number: PL194194B1
Application number: PL98340284A
Authority: PL
Inventors: Gary L. Nelsestuen
Original assignee: Univ Minnesota
Priority date: 1997-10-23
Filing date: 1998-10-20
Publication date: 2007-05-31
Also published as: BR9814611A; HUP0102257A3; PT1090128E; EA200000449A1; KR20010031370A; US6017882A; HU225993B1; EP1676919A1; NO20002025L; EP1090128B1; CA2307175C; ATE390486T1; DK1090128T3; NO20002025D0; AP2000001811A0; CA2307175A1; DE69839313D1; SG105547A1; IL135603A0; JP4276379B2

Abstract

1. Polipeptyd bia lka C lub aktywowanego bia lka C, znamienny tym, ze zawiera modyfikowan a domen e GLA obejmuj ac a sekwencj e aminokwasow a oznaczon a SEQ ID. NO:1, przy czym modyfiko- wana domena GLA obejmuje przynajmniej jedn a substytucj e aminokwasow a, która to substytucja aminokwasowa wyst epuje w pozycji wybranej z grupy sk ladaj acej si e z reszt 10, 11, 28 lub 33. 7. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze zawiera polipeptyd bia lka C lub aktywo- wanego bia lka C w polaczeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym no snikiem, przy czym polipeptyd bia lka C lub aktywowanego bia lka C zawiera modyfikowan a domen e GLA obejmuj ac a sekwencj e aminokwasow a oznaczon a SEQ ID. NO:1 z przynajmniej jedn a substytucj a aminokwasow a, i przy czym ta substytucja aminokwasowa wyst epuje w pozycji wybranej z grupy sk ladaj acej si e z reszt 10, 11, 28 lub 33. 8. Zastosowanie polipeptydu bia lka C lub aktywowanego bia lka C do wytwarzania leku, przy czym polipeptyd bia lka C lub aktywowanego bia lka C zawiera modyfikowan a domen e GLA obejmuj a- c a sekwencj e aminokwasow a oznaczon a SEQ ID. NO:1 z przynajmniej jedn a substytucj a aminokwa- sow a, i przy czym ta substytucja aminokwasowa wyst epuje w pozycji wybranej z grupy sk ladaj acej si e z reszt 10, 11, 28 lub 33. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są polipeptydy białka C lub aktywowanego białka C, zawierające modyfikowaną domenę GLA, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie polipeptydu białka C lub aktywowanego białka C oraz sposoby wytwarzania polipeptydów białka C lub aktywowanego białka C.

Białka zależne od witaminy K zawierają od 9 do 13 reszt kwasu gammakarboksyglutaminowego (Gla) w obrębie 45 aminokwasów na końcu aminowym. Reszty Gla są wytwarzane przez enzymy w wą trobie, które wykorzystują witaminę K do karboksylowania ł a ń cuchów bocznych reszt kwasu glutaminowego w prekursorach białkowych. Białka zależne od witaminy K biorą udział w licznych procesach biochemicznych, z których najlepiej opisane jest krzepnięcie krwi (artykuł przeglądowy Furie, B i Furie, B.C., Cell, 53:505-518). Biał ka zależ ne od witaminy K obejmują białko Z, biał ko S, protrombinę, czynnik X, czynnik IX, białko C, czynnik VII i Gas6. Ostatnie z tych białek uczestniczy w regulacji wzrostu komórek. Matsubara i wsp., Dev. Biol., 180:499-510. Reszty Gla są potrzebne dla prawidłowego wiązania wapnia i oddziaływań błonowych tych białek. Uważa się, że miejsce kontaktu z błoną w czynniku X znajduje się w obrę bie aminokwasów 1-37. Evans i Nelsestuen, 1966, Protein Science 5:sup. 1, 163 Abst. Jakkolwiek regiony zawierające Gla białek osocza wykazują wysoki stopień homologii sekwencji, różnią się one od siebie 1000-krotnie pod względem powinowactwa błonowego. McDonald, J.F. i wsp., 1997, Biochemistry, 36:5120-5137.

Czynnik VII działa na początkowym etapie krzepnięcia krwi i może być kluczowym pierwiastkiem w tworzeniu się skrzepów we krwi. Prekursor nieaktywny, lub zymogen, ma niską aktywność enzymatyczną, która bardzo wzrasta po cięciu proteolitycznym prowadzącym do wytworzenia czynnika VIIa. Aktywacja ta może być katalizowana przez czynnik Xa, jak również przez czynnik tkankowy VIla, białko wchodzące w skład błony, znajdywane w licznych rodzajach komórek. Fiore, M.M., i wsp., 1994, J. Biol. Chem., 269:143-149. Aktywacja przez czynnik VIla-czynnik tkankowy jest określana jako autoaktywacja. Uczestniczy ona zarówno w aktywacji (tworzeniu czynnika VIIa z czynnika VII), jak i dalszej aktywności czynnika VIIa. Najważ niejszy szlak aktywacji in vivo nie jest znany. Czynnik VIIa może aktywować czynniki krzepnięcia IX i X.

Czynnik tkankowy podlega ekspresji na wysokim poziomie na powierzchni niektórych komórek rakowych. Możliwe, że czynnik tkankowy i czynnik VIIa odgrywają rolę w rozwoju raka i inwazji tkanek. Vrana, J.A. i wsp., Cancer Res., 56:5063-5070. Ekspresja w komórkach i działanie czynnika tkankowego jest również głównym czynnikiem odpowiedzi toksycznej na wstrząs endotoksyczny. Dackiw, A.A. i wsp., 1996, Arch. Surg., 131:1273-1278.

Białko C jest aktywowane przez trombinę w obecności trombomoduliny, integralnego białka błonowego komórek śródbłonka. Esmon, N.L. i wsp., 1982, J. Biol. Chem., 257:859-864. Aktywowane białko C (APC) rozkłada czynniki Va i VIlla w połączeniu ze swoim kofaktorem, białkiem S. Oporność na APC jest najczęściej spotykaną postacią wrodzonej zakrzepicy. Dahlback, B., 1995, Blood, 85:607614. Inhibitory witaminy K są zazwyczaj podawane przy profilaktyce zakrzepicy.

Białka zależne od witaminy K są stosowane w leczeniu pewnych rodzajów hemofilii. Hemofilia A charakteryzuje się nieobecnością aktywnego czynnika VIII, czynnika VIIIa lub obecnością inhibitorów czynnika VIII. Hemofilia B charakteryzuje się nieobecnością aktywnego czynnika IX, czynnika IXa. W przypadku niedoboru czynnika VII, jakkolwiek rzadkiego, uzyskuje się dobrą odpowiedź na podawanie czynnika VII. Bauer, K.A., 1996, Haemostasis, 26:155-158, sup. 1. Terapia zastępcza czynnikiem VIll jest ograniczona na skutek powstawania u niektórych pacjentów wysokich mian przeciwciał wobec czynnika VIII. Ewentualnie, w leczeniu hemofilii A i B można zastosować czynnik VIla. Czynnik IXa i czynnik VIIIa aktywują czynnik X. Czynnik VIIa eliminuje zapotrzebowanie na czynniki IX i VIII, poprzez bezpośrednią aktywację czynnika X i może przezwyciężyć problem niedoboru czynników IX i VIIl z niewielkimi konsekwencjami immunologicznymi. Hedner i wsp., 1993, Transfus. Medi. Rev.,

7:78-83; Nicolaisen, E.M. i wsp., 1996, Thromb. Haemost., 76:200-204. Skuteczne poziomy podawania czynnika VIIa są często wysokie (45 do 90 μg/kg masy ciała) i może wystąpić potrzeba powtarzania podawania, co kilka godzin. Shulmav, S. i wsp., 1996, Thromb. Haemost., 75:432-436.

Stwierdzono, że rozpuszczalna postać czynnika tkankowego (rozpuszczalny czynnik tkankowy lub sTF), która nie zawiera regionu kontaktu z błoną, jest skuteczna w leczeniu hemofilii przy podawaniu razem z czynnikiem VIIa. (Patent USA Nr 5504064). U psów wykazano, że sTF zmniejsza ilość czynnika VIIa wymaganego do leczenia hemofilii. Połączenie sTF-VIIa z błoną jest całkowicie zależne od miejsca kontaktu z błoną czynnika VII. W przeciwieństwie do tego w normalny kompleks czynnik tkankowy-VIIa, jest związany z błoną zarówno poprzez czynnik tkankowy, jak i czynnik VII(a).

PL 194 194 B1

Stwierdzono, że modyfikacje w obrębie domeny z kwasem γ-karboksyglutaminowym (GLA) w polipeptydach zależnych od witaminy K zwiększają ich powinowactwo wiązania się z błoną.

Polipeptydy zależne od witaminy K zmodyfikowane w taki sposób mają zwiększoną aktywność i mogą być zastosowane jako czynniki przeciwdziałające krzepnięciu, stymulujące krzepnięcie lub w innych procesach, które wykorzystują białka zależne od witaminy K. Przykładowo, cząsteczka ulepszonego czynnika VII może zapewniać korzyści przez obniżenie dawki wymaganego czynnika VIIa, zmniejszenie częstości podawania i/lub dostarczenie różnic jakościowych, które umożliwiają bardziej skuteczne leczenie stanów chorobowych.

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C charakteryzujący się tym, że zawiera modyfikowaną domenę GLA obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID. NO: 1, przy czym modyfikowana domena GLA obejmuje przynajmniej jedną substytucję aminokwasową, która to substytucja aminokwasowa występuje w pozycji wybranej z grupy składającej się z reszt 10, 11, 28 lub 33.

Korzystnie przynajmniej jedna substytucja aminokwasowa dotyczy reszty 10.

Korzystnie przynajmniej jedna substytucja aminokwasowa dotyczy reszty 11.

Korzystnie przynajmniej jedna substytucja aminokwasowa dotyczy reszty 28.

Korzystnie przynajmniej jedna substytucja aminokwasowa dotyczy reszty 33.

Korzystnie polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C stanowi ludzkie rekombinowane białko C lub ludzkie rekombinowane aktywowane białko C.

Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, przy czym polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C zawiera modyfikowaną domenę GLA obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID. NO:1 z przynajmniej jedną substytucją aminokwasową, i przy czym ta substytucja aminokwasowa występuje w pozycji wybranej z grupy składającej się z reszt 10, 11, 28, lub 33.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie polipeptydu białka C lub aktywowanego białka C do wytwarzania leku, przy czym polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C zawiera modyfikowaną domenę GLA obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID. NO:1 z przynajmniej jedną substytucją aminokwasową, i przy czym ta substytucja aminokwasowa występuje w pozycji wybranej z grupy składającej się z reszt 10, 11, 28, lub 33.

Korzystnie lek przeznaczony jest do leczenia zakrzepicy u ssaka.

Korzystnie lek przeznaczony do zmniejszania tworzenia skrzepu u ssaka.

Korzystniej lek przeznaczony do podawania pozajelitowego pacjentowi będącemu człowiekiem.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania polipeptydu białka C lub aktywowanego białka C określonego powyżej, polegający na tym, że obejmuje etapy, w których transfekuje się ssacze komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierającym kwas nukleinowy kodujący polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C określony powyżej, hoduje się te komórki w warunkach pozwalających na ekspresję polipeptydu białka C lub aktywowanego białka C i oczyszcza się polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C ze ssaczych komórek gospodarza.

Korzystnie jako ssaczą komórkę gospodarza stosuje się ludzką komórkę nerki 293 transfekowaną adenowirusem.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C, charakteryzujący się tym, że zawiera modyfikowaną domenę GLA obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID. NO:1, przy czym modyfikowana domena GLA obejmuje trzy substytucje aminokwasowe, które to substytucje aminokwasowe występują w pozycjach wybranych z grupy składającej się z reszt 10, 11, 28, 32 i 33.

Korzystnie trzy substytucje aminokwasowe dotyczą reszt 11, 32 i 33.

Korzystniej resztę 32 stanowi kwas glutaminowy.

Korzystniej resztę 33 stanowi kwas asparaginowy.

Korzystniej resztę 32 stanowi kwas glutaminowy a resztę 33 stanowi kwas asparaginowy.

Jeszcze korzystniej resztę 11 stanowi glicyna.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania polipeptydu białka C lub aktywowanego białka C określonego powyżej, polegający na tym, że obejmuje etapy, w których transfekuje się ssacze komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierającym kwas nukleinowy kodujący poli4

PL 194 194 B1 peptyd białka C lub aktywowanego białka C określony powyżej, hoduje się te komórki w warunkach pozwalających na ekspresję polipeptydu białka C lub aktywowanego białka C i oczyszcza się polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C ze ssaczych komórek gospodarza.

Polipeptydy według wynalazku, zależne od witaminy K, zawierają modyfikowaną domenę GLA, która zwiększa powinowactwo wiązania się z błoną polipeptydu w stosunku do odpowiedniego natywnego polipeptydu zależnego od witaminy K. Zmodyfikowana domena GLA obejmuje aminokwasy od około 1 do około 45 i zawiera, co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe. Przykładowo, podstawienie może dotyczyć aminokwasów 10, 11, 28, 32 lub 33. Korzystnie, jeżeli podstawienie aminokwasowe dotyczy aminokwasu 10, 32 lub 33. Modyfikowana domena GLA może zawierać sekwencję aminokwasową, która w postaci wysyconej wapniem, tworzy strukturę trzeciorzędową, mającą rdzeń kationowy z halo ładunku elektroujemnego.

Polipeptydem zależnym od witaminy K jest białko C oraz aktywowane białko C. Przykładami innych polipeptydów zależnych od witaminy K są czynnik IX, czynnik IXa, czynnik VII, czynnik VIIa lub czynnik VIIa ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym. Modyfikowana domena GLA białka C lub aktywowanego białka C może zawierać resztę kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 32 i resztę kwasu asparaginowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:19). Modyfikowana domena GLA białka C lub aktywowanego białka C, może również zawierać resztę glutaminy lub kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 10 (SEQ ID NO:20 lub SEQ ID NO:21, odpowiednio). Dodatkowo, reszta glicyny może być podstawiona w pozycji aminokwasowej 12 w domenie GLA białka C lub aktywowanego białka C (SEQ ID NO:24 lub SEQ ID NO:35). Modyfikowana domena GLA czynnika VII, czynnika VIIa i czynnika VIIa zmodyfikowanego w miejscu aktywnym może zawierać podstawienie w pozycjach aminokwasowych 11 i 33. Przykładowo, można dokonać podstawienia reszty glutaminy w pozycji aminokwasowej 11 i reszty kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:30).

Polipeptydy według wynalazku mogą być kodowane przez wyizolowany kwas nukleinowy. Stosowany tu termin wyizolowany (oczyszczony) oznacza sekwencję odpowiadającą części lub całemu genowi kodującemu polipeptyd zależny od witaminy K, ale wolnemu od sekwencji, które normalnie otaczają w ssaczym genomie gen z jednej lub obu stron. Polipeptyd zależny od witaminy K zawiera modyfikowaną domenę GLA, która zwiększa powinowactwo wiązania się z błoną polipeptydu w stosunku do natywnego polipeptydu zależnego od witaminy K. Modyfikowana domena GLA zawiera co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe.

Polipeptydy według wynalazku mogą być kodowane przez wektor kwasu nukleinowego zawarty w ssaczych komórkach gospodarza. Polipeptyd zależ ny od witaminy K zawiera modyfikowaną domenę GLA, która zwiększa powinowactwo wiązania się z błoną polipeptydu w stosunku do natywnego polipeptydu zależnego od witaminy K. Modyfikowana domena GLA zawiera, co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe, na przykład w pozycji aminokwasowej 10, 11, 28, 32 lub 33. Polipeptydem zależnym od witaminy K może być na przykład czynnik VII lub czynnik VIIa i może on zawierać podstawienie aminokwasowe w pozycji aminokwasowej 11 i w pozycji aminokwasowej 33. Przykładowo, podstawienie aminokwasowe może obejmować resztę kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:30).

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i polipeptyd według wynalazku, zależny od witaminy K, w ilości skutecznej do hamowania tworzenia skrzepów u ssaków. Polipeptyd zależny od witaminy K zawiera modyfikowaną domenę GLA, która zwiększa powinowactwo wiązania się z błoną polipeptydu w stosunku do natywnego polipeptydu zależnego od witaminy K. Modyfikowana domena GLA, zawiera co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe. Polipeptydem zależnym od witaminy K jest białko C oraz aktywowane białko C. Innym przykładem polipeptydu zależnego od witaminy K może być aktywowane białko VII ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym. Białko C lub aktywowane białko C według wynalazku mogą zawierać resztę kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 32 i resztę kwasu asparaginowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:19). Białko C lub aktywowane białko C według wynalazku może ponadto zawierać resztę glutaminy w pozycji aminokwasowej 10 (SEQ ID NO:20) lub kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 10 (SEQ ID NO:21). Podstawienie aminokwasowe może również obejmować glicynę w pozycji aminokwasowej 11 (SEQ ID NO:24 lub SEQ ID NO:35). Czynnik VIIa zmodyfikowany w miejscu aktywnym może zawierać na przykład resztę glutaminy w pozycji aminokwasowej 11 i resztę kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:30).

PL 194 194 B1

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i polipeptyd według wynalazku, zależny od witaminy K, w ilości skutecznej do zwiększenia wytwarzania skrzepów u ssaków. Polipeptyd zależny od witaminy K zawiera modyfikowaną domenę GLA, która zwiększa powinowactwo wiązania się z błoną polipeptydu w stosunku do natywnego polipeptydu zależnego od witaminy K. Modyfikowana domena GLA zawiera co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe. Polipeptydem zależnym od witaminy K może być na przykład czynnik VII, czynnik VIIa, czynnik IX lub czynnik IXa. Kompozycja farmaceutyczna może również zawierać rozpuszczalny czynnik tkankowy. Czynnik VlI lub czynnik Vlla mogą zawierać podstawienie aminokwasowe w pozycji aminokwasowej 11 i w pozycji aminokwasowej 33. Przykładowo może zostać podstawiona reszta glutaminy w pozycji aminokwasowej 11 i reszta kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:30).

Polipeptydy według wynalazku, zależne od witaminy K, mogą być zastosowane do leczenia zaburzeń krzepnięcia krwi. Polipeptyd zależny od witaminy K zawiera modyfikowaną domenę GLA, która zwiększa powinowactwo wiązania się z błoną polipeptydu w stosunku do natywnego polipeptydu zależnego od witaminy K. Modyfikowana domena GLA zawiera co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe. Przydatne zmodyfikowane polipeptydy zależne od witaminy K to białko C oraz aktywowane białko C. Inne przykłady przydatnych polipeptydów to czynnik VII, czynnik VIIa, czynnik VIIa ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym, czynnik IX lub czynnik IXa, jak opisano powyżej.

Sposób zmniejszania wytwarzania skrzepów u ssaków może obejmować podawanie ilości polipeptydu zależnego od witaminy K skutecznej dla zmniejszenia wytwarzania skrzepów u ssaków. Polipeptyd zależny od witaminy K zawiera modyfikowaną domenę GLA, która zwiększa powinowactwo wiązania się z błoną polipeptydu w stosunku do natywnego polipeptydu zależnego od witaminy K. Modyfikowana domena GLA zawiera co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe. Polipeptydem zależnym od witaminy K jest białko C oraz aktywowane białko C. Innym przykładem polipeptydu zależnego od witaminy K może być czynnik VIIa ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym. Białko C lub aktywowane białko C według wynalazku może zawierać resztę kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 32 i resztę kwasu asparaginowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:19). Glutamina lub kwas glutaminowy mogą być ponadto podstawione w białku C lub aktywowanym białku C (SEQ ID NO:20 lub SEQ ID NO:21, odpowiednio). Może być również podstawiona glicyna w pozycji aminokwasowej 11 (SEQ ID NO:24 lub SEQ ID NO:35). Czynnik VIIa zmodyfikowany w miejscu aktywnym może zawierać resztę glutaminy w pozycji aminokwasowej 11 i resztę kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:30).

Sposób zwiększania wytwarzania skrzepów u ssaków może obejmować podawanie ilości polipeptydu zależnego od witaminy K skutecznej dla zwiększania wytwarzania skrzepów u ssaków. Polipeptyd zależny od witaminy K zawiera modyfikowaną domenę GLA, która zwiększa powinowactwo wiązania się z błoną polipeptydu w stosunku do natywnego polipeptydu zależnego od witaminy K. Modyfikowana domena GLA zawiera, co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe. Polipeptydem zależnym od witaminy K może być na przykład czynnik VII, czynnik VIla, czynnik IX lub czynnik IXa. Czynnik VII lub czynnik VIIa mogą zawierać podstawienie aminokwasowe w pozycji aminokwasowej 11 i w pozycji aminokwasowej 33. Przykł adowo moż e zostać podstawiona reszta glutaminy w pozycji aminokwasowej 11 i kwas glutaminowy w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:30).

Jeżeli nie zdefiniowano inaczej, wszystkie zastosowane tu terminy techniczne i naukowe mają takie samo znaczenie, jak powszechnie rozumiane przez specjalistów w dziedzinie, do której należy ten wynalazek. Jakkolwiek sposoby i materiały podobne lub równoważne opisanym tutaj można zastosować przy wykonywaniu tego wynalazku, odpowiednie metody i materiały są opisane poniżej. Wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, patenty i inne wspomniane tu odnośniki są włączone jako odniesienie w całości. Ponadto, materiały, metody i przykłady stanowią jedynie ilustrację i nie jest zamiarem, aby stanowiły ograniczenie.

Sekwencje aminokwasowe domeny GLA czynników VIIa i VIIQ11E33 typu dzikiego znajdują się w SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:30, odpowiednio. Sekwencje aminokwasowe domeny GLA wo ł owego czynnika X, wolowego białka C, ludzkiego białka C i wołowego białka C-H11 znajdują się w SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:23, odpowiednio. Sekwencja aminokwasowa domeny GLA białka C VQ33E, N34D znajduje się w SEQ ID NO:19.

Figura 1 przedstawia wiązanie, z odchyleniem standardowym, czynnika VIIa typu dzikiego (puste kółka), VIIQ11E33 (wypełnione kółka) oraz wołowego czynnika X (wypełnione trójkąty) z błonami.

PL 194 194 B1

Figura 2 przedstawia autoaktywację VIIQ11E33. Przerywane linie pokazują aktywność w nieobecności fosfolipidu.

Figura 3 przedstawia aktywację czynnika X przez czynnik VlIa. Wyniki dla czynnika VlIa typu dzikiego (puste kółka) i VIIaQ11E33 (wypełnione kółka) są podane dla stężenia 0,06 nM.

Figura 4 przedstawia krzepnięcie ludzkiego osocza przy udziale czynnika VlIa, VIIaQ11E33 i rozpuszczalnego czynnika tkankowego.

Figura 5 przedstawia krzepnięcie ludzkiego osocza przy udziale zymogenów czynnika VIl i prawidłowego czynnika tkankowego.

Figura 6 przedstawia hamowanie wytwarzania skrzepów przez czynnik VIIaQ11E33 ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym (DEGR - VIIaQ11E33).

Figura 7 przedstawia czas krążenia czynnika VIIQ11E33 u szczurów.

Figura 8 przedstawia oddziaływanie normalnych i zmodyfikowanych białek z błonami. Część A pokazuje oddziaływania wołowego białka C typu dzikiego (otwarte kółka), i wołowego białka C-H11 (wypełnione kółka) z pęcherzykami. Część B pokazuje oddziaływania ludzkiego białka C typu dzikiego (otwarte kółka) i ludzkiego białka C-P11 (wypełnione kółka) z błonami. W obydwu przypadkach przerywane linie wskazują na wynik, gdzie całe dodane białko jest związane z błoną.

Figura 9 przedstawia wpływ aktywowanego białka C na czas krzepnięcia. Część A, pokazuje średnią i odchylenie standardowe dla trzech pomiarów krzepnięcia dla osocza wołowego: dla osocza typu dzikiego (puste kółka) i bAPC-H11 (wypełnione kółka). Część B pokazuje średnią i odchylenie standardowe dla trzech powtórzeń krzepnięcia osocza ludzkiego: dla ludzkiego osocza typu dzikiego (puste kółka) i ludzkiego APC-P11(wypełnione kółka).

Figura 10 przedstawia inaktywację czynnika Va przez wołowy i ludzki APC. Część A przedstawia inaktywację czynnika Va przez wołowy APC typu dzikiego (puste kółka) i wołowy bAPC-H11 (wypełnione kółka). Część B przedstawia inaktywację ludzkiego czynnika Va w osoczu pozbawionego białka S, bądź przez ludzki APC typu dzikiego (puste kółka), bądź ludzki APC-H11 (wypełnione kółka).

Figura 11 przedstawia rozmieszczenie ładunku elektrostatycznego w białku Z. Linie pionowe oznaczają regiony elektrododatnie, a linie poziome oznaczają regiony elektroujemne.

Figura 12 przedstawia wiązanie się z błonami i aktywność różnych białek Cs. Część A przedstawia wiązanie się z błonami białka C typu dzikiego (puste kółka), zmutowanego białka C P11H (wypełnione kółka), mutanta Q33E, N34D (wypełnione kółka) i wołowej protrombiny (puste kwadraty). Część B przedstawia hamowanie krzepnięcia osocza przez te mutanty. Część C pokazuje inaktywację czynnika Va.

Figura 13 porównuje wiązanie się z błonami i aktywność mutantów ludzkiego białka C. Część A porównuje wiązanie się z błonami typu dzikiego (puste kółka), E33 (puste trójkąty) i E33D34 (wypełnione kółka). Część B porównuje czas krzepnięcia przy użyciu typu dzikiego (puste trójkąty), E33 (puste kółka) i E33D34 (wypełnione kółka).

Figura 14 porównuje wiązanie się z błonami (Część A) i hamowanie krzepnięcia (Część B) z wołowym białkiem C typu dzikiego (puste kwadraty), H11 (wypełnione kółka), E33D34 (puste trójkąty) i potrójnego mutanta H11E33D34.

Figura 15 przedstawia właściwości oddziaływania z błonami różnych białek zależnych od witaminy K. Część A porównuje oddziaływanie z błonami ludzkiego (puste kółka) i wołowego (wypełnione kółka) czynnika X. Część B pokazuje oddziaływanie z błonami fragmentu 1 prawidłowej wołowej protrombiny (puste kółka), fragmentu 1 zmodyfikowanego TNBS w nieobecności wapnia (wypełnione kółka) i fragmentu 1 zmodyfikowanego TNBS w obecności 25 mM wapnia (wypełnione kwadraty). Część C pokazuje tempo wiązania się białka z pęcherzykami przy pH 9 (wypełnione kółka) i 7,5 (otwarte kółka).

W jednym z aspektów polipeptyd według wynalazku, zależ ny od witaminy K, zawiera modyfikowaną domenę GLA o zwiększonym powinowactwie wiązania się z błoną w stosunku do odpowiedniego natywnego polipeptydu zależnego od witaminy K.

Białka zależne od witaminy K stanowią grupę białek, które w swoim szlaku biosyntetycznym wykorzystują witaminę K do karboksylowania łańcuchów bocznych reszt kwasu glutaminowego w prekursorach białkowych. Domena GLA zawiera 9-13 reszt kwasu γ-karboksyglutaminowego w N-końcowym regionie polipeptydu, zazwyczaj od aminokwasu 1 do około 45 aminokwasu. Białko Z, białko

S, czynnik X, czynnik ll (protrombina), czynnik IX, białko C, czynnik VII i Gas6 są przykładami polipeptydów zależnych od witaminy K. Pozycje aminokwasowe dyskutowanych tu polipeptydów są numerowane według czynnika IX. Białko S, białko C, czynnik X, czynnik VII i ludzka protrombina wszystkie mają o jeden aminokwas mniej (pozycja 4) i muszą być odpowiednio dopasowane. Przykładowo,

PL 194 194 B1 w pozycji 10 wołowego białka C znajduje się prolina, ale tutaj jest ona pod numerem 11 dla łatwiejszego porównywania. Stosowany tu termin polipeptyd oznacza dowolny łańcuch aminokwasowy, niezależnie od długości czy modyfikacji potranslacyjnych. Aminokwasy zostały tu oznaczone według standardowego trzyliterowego lub jednoliterowego systemu oznaczeń.

Modyfikacje domeny GLA obejmują, co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe. Podstawienia mogą być konserwatywne albo nie-konserwatywne. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe zamieniają aminokwas na aminokwas tej samej klasy, podczas gdy niekonserwatywne podstawienia aminokwasowe zamieniają aminokwas na aminokwas odmiennej klasy. Niekonserwatywne podstawienia mogą prowadzić w rezultacie do istotnej zmiany hydrofobowości polipeptydu lub większej części łańcucha bocznego. Ponadto, niekonserwatywne podstawienia mogą spowodować zasadniczą zmianę w ładunku polipeptydu, taką jak zmniejszenie ładunku elektrododatniego lub wprowadzenie ładunków elektroujemnych. Przykłady niekonserwatywnych podstawień obejmują zamianę aminokwasu zasadowego na aminokwas niepolarny lub aminokwasu polarnego na aminokwas kwaśny. Podstawienia aminokwasowe mogą być w pozycjach 10, 11, 28, 32 lub 33. Korzystne jest, jeżeli podstawienie aminokwasowe dotyczy pozycji 10, 32 lub 33. Modyfikowana domena GLA może zawierać sekwencję aminokwasową, która w stanie wysycenia wapniem, uczestniczy w tworzeniu się struktury trzeciorzędwej z kationowym rdzeniem i halo ładunku elektroujemnego. Bez wiązania się z konkretną teorią, zwiększone powinowactwo błonowe może być rezultatem szczególnego wzoru elektrostatycznego, na który składa się rdzeń elektrododatni całkowicie zagłębiony w otoczce elektroujemnej.

Wiele polipeptydów zależnych od witaminy K stanowi substraty dla enzymów związanych z błonami. Ze względu na to, że żaden z polipeptydów zależnych od witaminy K nie wykazuje maksimum powinowactwa potencjalnego wiązania z błonami, wszystkie muszą zawierać aminokwasy, których celem jest zmniejszenie powinowactwa wiązania. W konsekwencji wiele polipeptydów zależnych od witaminy K zawiera aminokwasy, które nie są optymalne z punktu widzenia maksimum powinowactwa. Reszty te skutecznie niszczą miejsce wiązania umożliwiając szybszy obrót w reakcji enzymatycznej.

Zmniejszone powinowactwo błonowe może służyć kilku celom. Wysokiemu powinowactwu towarzyszy wolna wymiana, co może ograniczać szybkości reakcji. Przykładowo, kiedy prototrombinaza jest połączona z błonami z dużym powinowactwem do substratu, bardziej limitująca jest wymiana białkowa z błoną niż kataliza enzymatyczna. Lu, Y. I Nelsestuen, G.L., 1996, Biochemistry, 35:8201-8209. Ewentualnie, zmiana powinowactwa błonowego poprzez podstawienie nie-optymalnym aminokwasem może zrównoważyć współzawodniczący proces prokoagulacyjny (czynniki X, IX, VII i protrombina) i antykoagulacyjny (biał ka C i S). Jakkolwiek powinowactwa bł onowe natywnych bia ł ek mogą być optymalne w stanach normalnych, zwiększenie powinowactwa błonowego może prowadzić do wytworzenia białek, które są przydatne w badaniach in vitro, jak również jako ulepszone leki do regulowania krzepnięcia krwi w stanach patologicznych in vivo.

Rozmaite przykłady polipeptydów zależnych od witaminy K ze zmodyfikowaną domeną GLA opisano poniżej. Podobne lub równoważne modyfikacje mogą być wprowadzone do innych polipeptydów zależnych od witaminy K.

Polipeptydem według wynalazku, zależnym od witaminy K, jest białko C lub aktywowane białko C (APC). Sekwencje aminokwasowe domeny GLA ludzkiego białka C typu dzikiego (hc) i wołowego białka C (bC) są pokazane w tabeli 1. X jest resztą Gla lub Glu. Generalnie, białko z resztami obojętnymi (np. Q) lub anionowymi (np. D, E) w pozycjach 11, 33 i 34 będzie miało większe powinowactwo błonowe.

T a b e l a 1 hC: ANS-FLXXLRH11SSLXRXCIXX21ICDFXXAKXI31FQNVDDTLAF41WSKH (SEQ ID NO:1) bC: ANS-FLXXLRP11GNVXRXCSXX21VCXFXXARXl31FQNTXDTMAF41WSFY (SEQ ID NO:2)

Modyfikowana domena GLA białka C lub APC według wynalazku może zawierać resztę kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 32 i resztę kwasu asparaginowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:19). Reszta kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 32 może być dalej modyfikowana do kwasu γ-karboksyglutaminowego in vivo. Dla optymalnej aktywności, modyfikowana domena GLA może zawierać dodatkowe podstawienia w pozycji aminokwasowej 10. Przykładowo, może być podstawiona reszta glutaminy w pozycji aminokwasowej 10 (SEQ ID NO:30) lub alternatywnie mogą być podstawione reszty kwasu glutaminowego albo asparaginowego w (SEQ ID NO:21 i SEQ ID NO:22, odpowiednio). Może być podstawiona reszta histydyny w pozycji aminokwasowej 10 wołowego białka C (SEQ ID NO:23). Dalsze modyfikacje mogą obejmować podstawienia reszty glicy8

PL 194 194 B1 ny seryną w pozycji aminokwasowej 11 wołowego białka C (SEQ ID NO:21 lub SEQ ID NO:35). Zastąpienie aminokwasu 28 fenyloalaniną, aminokwasem znajdującym się w protrombinie, jest kolejną przydatną modyfikacją (SEQ ID NO:25). Zmodyfikowane białko C ze zwiększonym powinowactwem błonowym może być zastosowane zamiast innych przydatnych do wstrzyknięć czynników zapobiegających krzepnięciu, takich jak heparyna. Heparyna jest zwykle stosowana w większości przypadków zabiegów chirurgicznych, ale jej wadą jest niski stosunek skuteczność/toksyczność. Ponadto, zmodyfikowane białko C o zwiększonym powinowactwie błonowym można zastosować zamiast doustnych środków antykoagulacyjnych z rodziny kumaryny, takich jak warfaryna.

Modyfikacji tych można również dokonać w odniesieniu do APC ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym. APC ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym można zinaktywować chemicznie, na przykład przez N-dansylo-glutamylo-glicyloarginylochlorometyloketon (DEGR) lub przez mutagenezę ukierunkowaną miejsca aktywnego. Sorensen, B.B. i wsp., 1997, J. Biol. Chem., 272:11863-11868. APC ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym działa jako inhibitor kompleksu protrombinazy. Zwiększone powinowactwo błonowe APC ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym może prowadzić w rezultacie do powstania polipeptydu bardziej skutecznego leczniczo.

Innym przykładem polipeptydu zależnego od witaminy K może być czynnik VII lub aktywna postać czynnika VII, czynnik VIIa. Natywny lub naturalnie występujący czynnik VII ma niskie powinowactwo wobec błon. Sekwencje aminokwasowe domeny GLA ludzkiego czynnika VII typu dzikiego (hVII) i wołowego czynnika VII (bVII) są pokazane w tabeli 2.

T a b e l a 2 hVII: ANA-FLXXLRP11GSLXRXCKXX21QCSFXXARXI31FKDAXRTKLF41WISY (SEQ ID NO:3) bVII: ANG-FLXXLRP11GSLXRXCRXX21LCSFXXAHXI31FRNXRTRQF41WVSY (SEQ ID NO:4)

Modyfikowana domena GLA czynnika VII lub czynnika VIIa może zawierać, przykładowo resztę kwasu glutaminowego lub asparaginowego w pozycji aminokwasowej 11 (SEQ ID NO:26 i 25 SEQ ID NO:27, odpowiednio), resztę fenyloalaniny w pozycji aminokwasowej 29 (SEQ ID NO:28) lub resztę kwasu asparaginowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:29). Zalecane jest, jeżeli domena GLA czynnika VII lub czynnika VIla zawiera resztę kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 11 i resztę kwasu asparaginowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:30). Polipeptyd zależ ny od witaminy K zmodyfikowany w taki sposób ma znacznie większe powinowactwo wobec błon niż polipeptyd natywny albo typu dzikiego. Ma on również znacznie większą aktywność przy autoaktywacji, przy wytwarzaniu czynnika Xa i kilku innych testach krzepliwości krwi. Aktywność jest zwiększona szczególnie przy marginesowych warunkach krzepnięcia, takich jak niski poziom czynnika tkankowego i/lub fosfolipidu. Przykładowo, zmodyfikowany czynnik VII jest około 4-krotnie efektywniejszy niż natywny czynnik VlIa przy optymalnych poziomach tromboplastyny, ale około 20-krotnie efektywniejszy przy poziomach tromboplastyny stanowiących 1% poziomu optymalnego. ln vivo prawdopodobnie najczęściej występują marginalne sygnały prokoagulacyjne. Dostępne obecnie testy krzepliwości, które stosują optymalne poziomy protrombiny nie mogą wykrywać różnic w czasie krzepnięcia pomiędzy prawidłowym osoczem i osoczem od pacjentów z hemofilią. Różnice w krzepliwości pomiędzy takimi próbkami są wykrywane jedynie wówczas, gdy w teście krzepliwości stosuje się nie-optymalne poziomy tromboplastyny lub rozcieńczoną tromboplastynę.

Innym przykładem polipeptydu zależnego od witaminy K może być czynnik VIIa ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym. Miejsce aktywne czynnika VIIa może być modyfikowane chemicznie, na przykład przez DEGR, lub poprzez mutagenezę ukierunkowaną miejsca aktywnego. Czynnik VIIa zmodyfikowany przez DEGR jest skutecznym inhibitorem krzepnięcia podawanym różnymi drogami. Arnljots, B. i wsp., 1997, J. Vasc. Surq., 25:341-346. Modyfikacje domeny GLA mogą uczynić miejsce aktywne zmodyfikowanego czynnika VIIa bardziej skutecznym na skutek większego powinowactwa błonowego. Modyfikowana domena GLA czynnika VIIa ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym może zawierać, przykładowo, resztę glutaminy w pozycji aminokwasowęj 11 i resztę kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:30).

Polipeptydem zależnym od witaminy K może być również czynnik IX lub postać aktywna czynnika IX, czynnik IXa. Tak jak w przypadku czynnika VlIa ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym, czynniki IXa i Xa ze zmodyfikowanym miejscem aktywnym mogą być inhibitorami krzepnięcia. Sekwencje aminokwasowe domeny GLA ludzkiego czynnika IX typu dzikiego (hIX) i wołowego czynnika IX (bIX) są pokazane w tabeli 3. Przykładowo, reszta kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowePL 194 194 B1 go może być podstawiona w pozycji aminokwasowej 11 (SEQ ID NO:31 i SEQ ID NO:27, odpowiednio), reszta fenyloalaniny w pozycji aminokwasowej 29 (SEQ ID NO:33) lub reszta kwasu asparaginowego w pozycji aminokwasowej 34 (SEQ ID NO:34).

T a b e l a 3 hIX: YNSGKLXXFVQ11GNLXRXCMXX21KCSFXXARXV31FXNTXRTTXF41WKQY (SEQ ID NO:5) bIX: YNSGKLXXFVQ11GNLXRXCMXX21KCSFXXARXV31FXNTXKRTTXF41WKQY (SEQ ID NO:6)

Polipeptydy według wynalazku mogą być zawarte w ssaczych komórkach gospodarza.

Odpowiednie komórki gospodarza mają zdolność do modyfikowania reszty glutaminy polipeptydu zależnego od witaminy K do γ-karboksyglutaminianu. Szczególnie przydatne jako komórki gospodarza są komórki ssacze pochodzące z nerki i wątroby.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i polipeptyd według wynalazku, zależny od witaminy K, w ilości skutecznej do hamowania tworzenia skrzepów u ssaków.

Stężenie polipeptydu zależnego od witaminy K skuteczne dla hamowania wytwarzania skrzepów u ssaków może wahać się w zależności od wielu czynników, między innymi dogodnej dawki związku, który ma być podawany, właściwości chemicznych zastosowanych związków, składu związków stanowiących zaróbkę i drogi podawania. Optymalna dawka kompozycji farmaceutycznej, która ma być podana może również zależeć od takich zmiennych, jak ogólny stan zdrowia konkretnego pacjenta i względnej skuteczności biologicznej wybranego związku. Te kompozycje farmaceutyczne można zastosować do regulowania krzepnięcia in vivo. Przykładowo, kompozycje można zastosować gene- ralnie do leczenia zakrzepicy. Zmiana jedynie kilku reszt aminokwasowych polipeptydu, jak opisano powyżej, na ogół nie wpływa znacząco na antygenność zmutowanych polipeptydów.

Polipeptydy według wynalazku, zależne od witaminy K, zawierają zmodyfikowane domeny GLA i mogą tworzyć kompozycje farmaceutyczne po zmieszaniu z farmaceutycznie dopuszczalnymi nietoksycznymi zaróbkami i/lub nośnikami. Takie związki i kompozycje można przygotować do podawania pozajelitowego, szczególnie w postaci ciekłych roztworów lub zawiesin w wodnych roztworach buforów fizjologicznych, albo do podawania doustnego, w szczególności w postaci tabletek lub kapsułek, albo do podawania donosowego, w szcególności w postaci proszków, kropli do nosa lub aerozoli. Kompozycje podawane innymi drogami można przygotować zgodnie z potrzebami przy zastosowaniu standardowych sposobów.

Kompozycje podawane pozajelitowo mogą zawierać jako typowe zaróbki jałową wodę lub roztwór soli fizjologicznej, glikole polialkilenowe, takie jak glikol polietylenowy, oleje pochodzenia roślinnego, uwodornione naftaleny i temu podobne. Konkretnymi przykładami zaróbek do kontrolowania uwalniania związków według wynalazku in vivo jest biologicznie dopuszczalny, podlegający biodegradacji polimer laktydowy, kopolimer laktyd/glikolid lub kopolimery polioksoetylenonopolipropylenowe. lnne przydatne układy po dawania pozajelitowego obejmują cząstki kopolimeru etylen-octan winylowy, pompy osmotyczne, wszczepialne systemy infuzyjne i liposomy. Kompozycje do podawania poprzez inhalację mogą być wodnymi roztworami zawierającymi na przykład eter polioksoetyleno-9-laurylowy, glikocholan i deoksycholan albo mogą być oleistymi roztworami do zastosowania w postaci kropli do nosa. Jeśli jest to pożądane, składniki mogą być przygotowane jako żele do stosowania donosowego. Kompozycje do podawania pozajelitowego mogą również zawierać glikocholan do podawania policzkowego.

W alternatywnym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna może zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i polipeptyd według wynalazku, zależny od witaminy K, w ilości skutecznej do zwiększenia wytwarzania skrzepów u ssaków.

W tym wykonaniu, przykładami innych przydatnych polipeptydów zależnych od witaminy K mogą być między innymi czynnik VII lub aktywna postać czynnika VII, czynnik VIIa.

Zmodyfikowana domena GLA czynnika VII lub czynnika VIIa może zawierać podstawienie aminokwasowe w pozycji aminokwasowej 11 i w pozycji aminokwasowej 33: na przykład może zostać podstawiona reszta glutaminy w pozycji aminokwasowej 11 i reszta kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasowej 33 (SEQ ID NO:30). Kompozycja farmaceutyczna może ponadto zawierać rozpuszczalny czynnik tkankowy. Czynnik VII jest szczególnie krytyczny dla krzepnięcia krwi ze względu na umiejscowienia na początku kaskady krzepnięcia i jego zdolność do aktywacji dwóch białek, czynnika IX i X. Bezpośrednia aktywacja czynnika X przez czynnik VIIa jest ważna dla potencjalnego leczenia

PL 194 194 B1 głównych postaci hemofilii A i B, ponieważ etapy w których uczestniczą czynniki IX i VII można całkowicie obejść. Stwierdzono, że podawanie czynnika VII pacjentom jest skuteczne w leczeniu niektórych postaci hemofilii. Zwiększenie powinowactwa błonowego czynników VII i VIIa poprzez modyfikacje domeny GLA stanowi potencjalną możliwość uzyskania polipeptydu, który lepiej odpowiada na wiele warunków krzepnięcia, co umożliwia obniżenie wymagania dawki VlI/VIIa, i wydłużenie przerw między podawaniem kolejnej niezbędnej dawki czynników VII/VIIa, i dostarcza dodatkowych zmian jakościowych, które prowadzą w rezultacie do bardziej skutecznego leczenia. Ogólnie rzec biorąc, polepszenie miejsca kontaktu czynnika VII z błoną może zwiększyć zarówno jego tempo aktywacji, jak również polepszyć aktywność czynnika VIIa względem czynnika X i IX. Etapy te mogą mieć wieloraki wpływ na ogólną szybkość krzepnięcia krwi in vivo, prowadząc w rezultacie do powstania bardzo wydajnego czynnika VIIa dla lepszego leczenia wielu zaburzeń krzepnięcia krwi.

lnne przydatne polipeptydy zależne od witaminy K do zwiększenia wytwarzania skrzepów mogą obejmować czynnik IX i czynnik IXa.

Sposoby zmniejszania wytwarzania skrzepów u ssaków obejmują podawanie polipeptydu według wynalazku, zależnego od witaminy K, w ilości skutecznej do zmniejszenia wytwarzania skrzepów u ssaków. Polipeptyd zależny od witaminy K zawiera zmodyfikowaną domenę GLA, która zwiększa powinowactwo wiązania się z błoną polipeptydu w stosunku do natywnego polipeptydu zależnego od witaminy K. Zmodyfikowana domena GLA zawiera, co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe. W takim sposobie stosuje się zmodyfikowane białko C lub APC, ale można zastosować zmodyfikowane czynniki VlIa, IXa, Xa i APC z zablokowanym miejscem aktywnym.

Sposoby zwiększania wytwarzania skrzepów u ssaków obejmują podawanie polipeptydu według wynalazku, zależnego od witaminy K, w ilości skutecznej do zwiększenia wytwarzania skrzepów u ssaków. Polipeptyd zależny od witaminy K zawiera zmodyfikowaną domenę GLA, która zwiększa powinowactwo wiązania się z błoną polipeptydu w stosunku do natywnego polipeptydu zależnego od witaminy K. Zmodyfikowana domena GLA obejmuje co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe. W takim sposobie można zastosować czynnik VII lub czynnik VIIa albo zmodyfikowany czynnik IX lub czynnik IXa.

Wynalazek opisano w następujących przykładach, które nie ograniczają zakresu wynalazku opisanego w zastrzeżeniach.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Czynnik VII o wzmocnionym powinowactwie błonowym i aktywności

Wykryto, że powinowactwo do wiązania się z błoną czynnika VII krzepnięcia krwi można podwyższyć przez mutagenezę ukierunkowaną. Scharakteryzowano właściwości mutantów P11Q, K33E (cytowane w niniejszym opisie jako czynnik VIlQ11E33 lub zmutowany czynnik VII (SEQ ID NO: 30)). Powinowactwo błonowe wzrastało 20-krotnie w porównaniu do białka dzikiego. Autoaktywacja przez mutanta wzrastała o przynajmniej 100-krotnie w porównaniu z dzikim czynnikiem VII. Zaktywowana forma VIIQ11E33 (cytowanego jako VIIaQ11E33) wykazywała około 10-krotnie wyższą aktywność względem czynnika X. Aktywność koagulująca VIIaQ11E33 z rozpuszczalnym czynnikiem tkankowym w normalnym osoczu była około 10-krotnie wyższa niż w przypadku VIIa typu dzikiego. Aktywność koagulująca zymogenu, VIIQ11E33, z normalnym czynnikiem tkankowym (dostarczonym jako rozcieńczenie tromboplastyny-HS w stosunku 1:100), była 10 razy wyższa niż czynnika VII typu dzikiego. Stopień do którego następowało wzmocnienie zależał od warunków, przy czym VIIQ11E33 był szczególnie aktywny w warunkach niskiej stymulacji koagulacyjnej.

Ogólnie, stężenia białka określano przy użyciu oznaczenia Bradford, stosując jako standard albuminę surowicy bydlęcej. Bradford, M.M., 1976, Analyt. Biochem. 248-254. Stężenia molowe otrzymano z mas molowych wynoszących 50000 dla czynnika VII i 55000 dla czynnika X. Jeśli nie wskazano inaczej, wszystkie pomiary aktywności przeprowadzano w buforze standardowym (0,05 M Tris; pH 7,5; 100 mM NaCl).

Wytwarzanie zmutowanego czynnika VII

Zmutowany czynnik VII utworzono z cDNA czynnika VII typu dzikiego (GenBank, numer dostępu M13232, NID g182799). Petersen et al., 1990, Biochemistry 29:3451-3457. Mutację P11Q (zmiana aminokwasu 11 z reszty proliny na resztę glutaminy) i mutację K33E (zmiana aminokwasu 33 z reszty lizyny na resztę kwasu glutaminowego) wprowadzono do cDNA czynnika VII typu dzikiego stosując strategię reakcji łańcuchowej polimerazy, zasadniczo jak opisano przez Vallette i wsp., 1989, Nucleic Acids Res. 17:723-733. W czasie tego procesu wyeliminowano diagnostyczne pod względem mutacji miejsce dla enzymu restrykcyjnego Xmalll. Zaprojektowano cztery startery do PCR do rozpoczęcia

PL 194 194 B1 syntezy dwóch zmutowanych fragmentów M13232, jednego od Mlul do Bglll, pozycje 221 do 301 i drugiego od Bglll do Sstll, pozycje 302 do 787. Startery stosowano w standardowych warunkach cykli (GENAMP, Perkin Elmer) jako matrycę do rozpoczęcia syntezy stosując 1 ng cDNA czynnika VII typu dzikiego. Uzyskane fragmenty oczyszczano w żelu i trawiono Mlul i Bglll lub Bglll i Sstll. Dwa oczyszczone fragmenty ligowano w cDNA czynnika VII w wektorze ekspresyjnym Zem219b z którego usunięto odpowiadającą sekwencję typu dzikiego jako fragment MluI-Sstll. Petersen i wsp., 1990 supra. Zmutowane fragmenty w całości sekwencjonowano by potwierdzić podstawienia P11Q i K33E i aby wykluczyć możliwość innych zmian sekwencji wprowadzonych przy PCR.

Transformacja, selekcja i oczyszczanie

Komórki nerki noworodków chomika (BHK) hodowano na modyfikowanej przez Dubecco pożywce Eagle'a, uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą i penicyliną-streptomycyną. Komórki subkonfluentne transfekowano plazmidem ekspresyjnym z czynnikiem VII stosując lipofectAMlNE (Gibco

BRL) zgodnie z zaleceniami producenta. Dwa dni po transfekcji komórki trypsynizowano i rozcieńczano w pożywce selekcyjnej zawierającej 1 μΜ metotreksat (MTX). Stabilnie stransfekowane komórki BHK hodowano następnie w wolnej od surowicy zmodyfikowanej przez Dubecco pożywce Eagle'a, uzupełnionej penicyliną-streptomycyną, 5 μg/ml witaminy K₁ i 1 μM MTX, i zebrano tak traktowaną pożywkę. Tak traktowaną pożywkę przepuszczono dwukrotnie przez kolumnę powinowactwa złożoną z zależnymi od wapnia przeciwciałami monoklonalnymi (CaFVIl22) związanymi z Affi-Gel 10. Nakagaki i wsp., 1991, Biochemistry, 30:10819-10824. Końcowy, oczyszczony czynnik VIlQ11E33 migrował jako pojedynczy prążek przy elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS, bez śladu czynnika VIIa w preparacie. Czysty mutant VII (P11Q, K33E) wykazywał 1400-2800 jednostek/mg czynnika VII.

Aktywacja czynnika VII

Aktywowany czynnik VllQ11E33 stworzono przez cięcie VIlQ11E33 bydlęcym czynnikiem Xa (stosunek wagowy 1:100, inkubacja przez 1 godz. w 37°C). Ewentualnie, czynnik VIlaQ11E33 otrzymano przez autoaktywację (37°C, 20 min.) w mieszaninie zawierającej 7 μM VIIQ11E33, 0,7 μM sTF i fosfolipid (fosfatydyloseryna/fosfatydylocholina (PS/PC), 25/75, 0,1 g/g białka).

Czynnik VIIa typu dzikiego był homogennym zrekombinowanym białkiem (NOVO Nordisk). Dwa preparaty składały się z komercyjnego, liofilizowanego produktu i nieliofilizowanego produktu. Drugie białko następnie oczyszczono na FPLC mono-Q i wykazano specyficzną aktywność 80 000 jednostek/mg, kalibrowaną standardem George King NPP.

Wzmocnione oddziaływania błonowe przez czynnik VIIQ11E33

Preparat fosfolipidowy, oznaczenie i pomiary wiązania białko-błona przeprowadzono metodą opisaną przez Nelsestuen i Lim, 1997, Biochemistry, 30:10819-10824. Duże pęcherzyki jednolamellarne (LUV) i małe pęcherzyki jednolamellarne (SUV) preparowano wcześniej opisaną metodą. Hope, M.J., i wsp., Biochem. Biophys. Acta., 812:55-65; Huang, C., 1969, Biochemistry, 8:344-352. Silnie oczyszczoną fosfatydyloserynę (mózg bydlęcy) i fosfatydylocholinę jaja (Sigma Chemical Co.) zmieszano w chloroformie. Rozpuszczalnik usunięto strumieniem gazowego azotu. Wysuszone fosfolipidy rozpuszczono w buforze. Wytworzono SUV przez sonikację i filtrację żelową a LUV stworzono techniką Freeze-thaw i wyciskania. Stężenia fosfolipidów ustalono przez oznaczenie organicznego fosforanu, stwierdzając stosunek fosfor:fosfolipid wynoszący 25.

Wytworzono SUV zarówno PS/PC (25/75), jak i PS/PC (10/90). Do fosfolipidu dodawano białko w stosunkach wagowych pokazanych na figurze 1. Wiązanie białko-błona oznaczano przez rozpraszanie światła przy 90° metodą Nelsestuen i Lim, 1977 supra. Krótko, intensywność rozpraszania światła samych pęcherzyków fosfolipidowych (l1) i po dodaniu białka (l2) mierzono i korygowano ze względu na tło buforu i niezwiązanego białka. Stosunek mas cząsteczkowych kompleksu białkopęcherzyk (M₂) można ocenić ze związku w równaniu 1 gdzie δn/δc oznacza indeks refrakcyjny odpowiednich rodzajów.

l₂/Ii=(M₂/Mi)²0n^c₂^n^c-i)² (rów. 1)

Jeśli stężenia fosfolipidu i białka są znane można ustalić stężenie związanego [P*PL] i wolnego białka [P]. Wartości te, wraz z maksymalną zdolnością wiązania białka [P*Pmax] przez pęcherzyki (ocenianą na 1,0 g/g dla wszystkich białek) można wykorzystać do otrzymania stałej równania dla oddziaływań białko-błona przez związek w równaniu 2, gdzie wszystkie stężenia wyrażono jako mole białka lub miejsc wiązania białka.

KD=[P] [P*Pmax-P*PL] / [P*PL] (rów. 2)

Wiązanie oceniano w 5 mM wapniu i wyrażano jako stosunek M2/M1.

PL 194 194 B1

Figura 1 pokazuje wiązanie VlIa typu dzikiego (puste kółka) i czynnika VIlQ11E33 (pełne kółka) z błonami PS/PC=25/75, 25 pg/ml (figura 1A) lub PS/PC=10/90, 25 pg/ml (figura 1B). VIIQ11E33 miał znacznie wyższe powinowactwo niż białko typu dzikiego. Wiązanie z PS/PC (25/75) na poziomie ilościowym takim, że [Białkowolne] wynosił zasadniczo zero. W konsekwencji wartości Kd nie można było oszacować z tych danych. Wiązanie się z błoną przez bydlęcy czynnik X (pełne trójkąty) pokazano na figurze 1 jako odniesienie. Bydlęcy czynnik X jest jednym z białek o najwyższym powinowactwie w tej rodzinie, dając Kd 40 nM dla PS/PC (20/80) w 2 mM wapniu. McDonald i wsp., 1997, Biochemistry, 36:5120-5127. Kd dla bydlęcego czynnika X otrzymane z wyniku dla stosunku białko/fosfolipid wynoszącego 0,55 (figura 1), wynosiło 0,025 pM.

Ustalono także wiązanie dzikiego i zmutowanego czynnika VII z błonami PS/PC (10/90) (figura 1B). VIIQ11E33 wiązał się na poziomie niższym niż poziom czułości metody, który pozwalał na oszacowanie stałej wiązania ze związku w równaniu 3.

Kd=[Białko_wolne] [Miejsca wiążące_wolne] / [Białko_związane] (rów. 3)

[Miejsca wiążącewolne] oszacowano z równania 4, ustalając maksimum M2/M1 na 1,0 (to jest, [Miejsca wiążącecałkowite] = [Fosfolipidstęż. wag./Białkonw]). Jest to powszechna wartość obserwowana dla kilku białek z tej rodziny. Patrz McDonald i wsp., 1997, supra.

[Miejsca wiążącewolne] = [Miejsca wiążącecałkowite] - [Białkozwiązane] (rów. 4)

Używając tych wniosków i danych dla stosunku białka do fosfolipidów wynoszącego 0,37, uzyskano wartości Kd wynoszące 0,7 pM dla bydlęcego czynnika X, 5,5 pM dla czynnika VII typu dzikiego i 0,23 pM dla VIIQ11E33. Tak więc jasne było, że VIIQ11E33 został znacznie ulepszony pod względem powinowactwa wiązania się z błonami w porównaniu z czynnikiem VII typu dzikiego i miał jedne z największych powinowactw wiązania się z błoną spośród białek zależnych od witaminy K.

Wzmocniona aktywacja czynnika VlIQ11E33

Pierwszym etapem koagulacji jest aktywacja czynnika VII. Autoaktywację czynnika VII przeprowadzono w roztworze zawierającym 100 mM sTF (dokładnie oczyszczony rekombinowany produkt od Dr. Walter Kisiel, Fiore i wsp., 1994, J. Biol. Chem., 269:143-149), 36 nM VIIQ11E33 i PS/PC (25/75, 22 pg/ml). Aktywność VIIQ11E33 oszacowano w różnych przedziałach czasowych przez dodanie 0,15 mm substratu S-2288 (Kabi) i oceniono poziom uwalniania produktu, p-nitrofenylofosforanu przez zmianę absorbancji przy 405 nm. Początkowa aktywność preparatu VIIQ11E33 wynosiła mniej niż 4% wykazywanej przez w pełni aktywny VIlQ11E33.

Stwierdzono, że VlIQ11E33 jest znacznie lepszym substratem do aktywacji niż czynnik VII typu dzikiego. Figura 2 pokazuje autoaktywację czynnika VIlQ11E33. Dane analizowano przez związek w równaniu 5 (równanie 7 z Fiore i wsp., 1994, supra).

ln[VIIa]t = ln[VIIa]c +kcat*y*t (rów. 5) ln[VIla]t oznacza stężenie czynnika VIIa po czasie t, ckat oznacza stałą katalityczną dla czynnika VIIa działającą na VII i y oznacza ułamkowe wysycenie miejsc VIIa. Dla czynnika VIIa typu dzikiego, związek ten i 1 pM sTF dały kcat 0,0045/s i stosunek kcat/Km 7*10³ M^-1s^-1. Patrz Fiore i wsp., 1994, supra. Dla enzymu VIIQ11E33, aktywacja była szybka (figura 2) i możliwe było jedynie oszacowanie dolnego zakresu kcat. Otrzymano go z czasu podwojenia VIIa wynoszącego około 25 sekund (kcat= (ln2/t1/2). Uzyskana wartość (kcat-min=0,03/s), wraz ze stężeniem substratu tej reakcji (3,6*10^-8M) i założeniem, że y=1, dała wartość dla kcat/[S] = 8*10⁵ M^-1s^-1. Powinno to być znacznie poniżej prawdziwego kcat/Km dla VIIaQ11E33, ale było około 100-krotnie większe niż wartość kcat/Km dla czynnika VlIa/sTF typu dzikiego oszacowana przez Fiore i wsp., 1994 supra. Tak więc, kombinacja enzymu VIIaQ11E33 i substratu czynnika VIIQ11E33 była lepsza niż białka typu dzikiego w etapie aktywacyjnym koagulacji. Sugeruje to, że VIIQ11E33 było lepsze niż enzym typu dzikiego, gdy warunki koagulacji były minimalne.

Wzmocniona aktywność VIIaQ11E33

Po utworzeniu, czynnik VlIa aktywuje czynnik X albo czynnik IX. Aktywację bydlęcego czynnika X (0,1 pM) przez czynnik VIIa przeprowadzano w 50mM buforze Tris-HCL, pH 7,5 zawierającym 100 mM NaCl, 5 mM wapń, różne ilości fosfolipdów (PS/PC, 25/75) i 1 mg/ml bydlęcej albuminy osocza

PL 194 194 B1 w 22,5°C. Czynnik VIIa (0,06 nM VIlaQ11E33 lub 0,6 nM dzikiego VIIa) dodawano w czasie zerowym ustalano aktywność Xa po 1, 2 i 5 minutach. Próbki mieszaniny reakcyjnej (0,2 ml) mieszano z buforem zawierającym 10 mM EDTA i 0,4 mM S-2222 (Kabi) chromogenny substrat dla czynnika Xa. W spektrofotometrze Beckman DU8 ustalano zmianę absorbancji przy 405 nm. Ilo ść powstał ego czynnika Xa obliczano z współczynnika absorbancji (1*10⁴M^-1cm^-1), produktu reakcji p-nitrofenylofosforanu i szybkości 33/s dla hydrolizy substratu przez oczyszczony bydlęcy Xa w warunkach tego oznaczenia.

Figura 3 porównuje zdolność czynnika VIla typu dzikiego (puste kółka) i VIIaQ11E33 (pełne kółka) do aktywacji czynnika X w układzie oczyszczonym. Znów VIIaQ11E33 był lepszy w tej reakcji niż czynnik VIIa typu dzikiego. Różnica była największa przy niskich stężeniach fosfilipidu i zmniejszała się do 2 razy przy stężeniu fosfolipidu 200 μg na ml. Oczekiwano takiego wyniku na podstawie faktu, że duże stężenia błony powodują związanie się większej ilości dzikiego VIIa z błoną. Raz jeszcze, zwiększone działanie VIIaQ11E33 było najwyższe w warunkach małej ilości fosfolipidów.

Lepsza koagulacja VIlaQ11E33

Oznaczenia krzepnięcia krwi przeprowadzano w 37°C stosując do wykrywania powstawania skrzepu metodę „przechylania ręcznego (ang. hand tilt). Osoczu ludzkiemu (0,1 ml) pozwalano dojść do równowagi w 37°C przez 1 minutę. Różne reagenty dodawano w objętości 0,1 ml standardowego buforu. Rozpuszczalny czynnik tkankowy (50 nM) i fosfolipid (PS/PC 10/90, 75 μg/ml) dodawano do osocza wraz ze stężeniem czynnika VIIa pokazanym na figurze 4 (0,1-32 nM). Na końcu dodawano 0,1 ml 25 mM CaCl2 by zapoczątkować reakcję. Mierzono czas tworzenia skrzepu. W większości przypadków określono średnią i odchylenie standardowe dla powtarzanych prób.

Figura 4 pokazuje czasy koagulacji dzikiego VIIa względem VIIaQ11E33 w normalnym osoczu ludzkim. Koagulacja wspomagana była sTF i dodanymi pęcherzykami fosfolipidowymi. Endogenny czynnik VII typu dzikiego ma stężenie około 10 nm i faktycznie nie miał wpływu na czasy koagulacji. Tło koagulacji wynosiło 120 sekund, z lub bez sTF. Czynnik VIIaQ11E33 wykazywał około 8 razy wyższą aktywność niż VIIa typu dzikiego w warunkach tego oznaczenia. Podobne wyniki otrzymano dla osocza bez czynnika VII, co sugeruje, że główny szlak dla krzepnięcia krwi w tym układzie angażował bezpośrednio aktywację czynnika X przez czynnik VIIa. Ogólnie, czynnik VIIaQ11E33 był nadrzędny dla VIIa typu dzikiego w aktywności prokoagulanta, wspomaganej przez pęcherzyki błonowe i rozpuszczalny czynnik tkankowy. Zymogen typu dzikiego w tych warunkach faktycznie nie wykazywał aktywności, na co wskazywały podobne czasy krzepnięcia dla tła, wynoszące 2 minuty bez względu na to czy sTF dodano czy nie.

Aktywność prokoagulanta z normalnym czynnikiem tkankowym

Aktywność VIIa i/lub VIIQ11E33 z sTF mierzono w normalnym osoczu ludzkim. Endogenny czynnik VII nie miał wpływu na czas koagulacji w tym oznaczeniu; czas krzepnięcia stanowiący tło wynosił 2 minuty dla osocza z lub bez rozpuszczalnego czynnika tkankowego. Przed roztworem wapnia, do osocza dodano rozpuszczalny czynnik tkankowy (stężenie końcowe 50 nM) i VIIa. Czas koagulacji oceniano dla próbek zawierających różne poziomy VIIa lub VIIaQ11E33. Testowano dwa preparaty osocza, normalny i niezawierający czynnika VII.

Koagulację wspomaganą przez normalny czynnik tkankowy oznaczano ze standardową tromboplastyną-HS z mózgu królika (HS=high sensivity) zawierającą wapń (Sigma Chemical Co.). Mieszanina ta zawiera oba fosfolipidy i związany z błoną czynnik tkankowy. Tromboplastynę-HS z mózgu królika rozcieńczono w stosunku 1:100 w buforze i używano w oznaczeniu czynnika VII (dodawanego w formie normalnego osocza ludzkiego, zawierającego 10 nM czynnika VII) i VIIQ11E33 (dodanego jako czyste białko). W celu zapoczątkowania reakcji do osocza (0,1 ml) dodano tromboplastynę (0,2 ml) i zmierzono czas niezbędny do wytworzenia skrzepu. Oznaczenia przeprowadzono także z tromboplastyną o pełnej sile, jak opisano przez producenta.

W optymalnym stężeniu ludzkiej tromboplastyny, czynnik VII typu dzikiego wykazywał normalny poziom aktywności, około 1500 jednostek na mg. Jest to około 25-krotnie mniej niż aktywność czynnika VIIa typu dzikiego (80 000 jednostek na mg). VIIQ11E33 dawał około 1500-3000 jednostek na miligram w standardowych warunkach oznaczania, tylko 2-krotnie więcej niż czynnik VII typu dzikiego.

Różnica między VII typu dzikiego i VIlQ11E33 była znacznie większa, gdy warunki koagulacji były prawie optymalne. Figura 5 pokazuje czasy krzepnięcia i stężenia zymogenu w oznaczeniach zawierających poziom tromboplastyny stanowiący 0,01 normalnego. W tych warunkach, VIIQ11E33 był około 20-krotnie bardziej aktywny niż czynnik VII typu dzikiego. Tak więc wyższa wydajność mu14

PL 194 194 B1 tanta VIIQ11E33 była szczególnie widoczna gdy warunki koagulacji były ograniczone, co odpowiada wielu sytuacjom in vivo.

Antykoagulacyjne aktywności DEGR-VIIaQ11E33

Standardowe oznaczenia koagulacji przeprowadzano z normalną surowicą ludzką i ludzką tromboplastyną rozcieńczoną buforem w stosunku 1:10. Miejsce aktywne czynnika VIIaQ11E33 zmodyfikowano przez DEGR jak opisano w Sorenson, B.B. i wsp., 1997, supra. Figura 6 pokazuje czas krzepnięcia DEGR-VIIaQ11E33 (0-4 nm) inkubowanego z tromboplastyną w buforze wapniowym, przez 15 sekund przed dodaniem osocza. Czas tworzenia skrzepu ustalono metodą ręcznego przechylania (ang. hand tilt). Czas krzepnięcia wynosił około 45 sekund przy około 1 nm DEGRVIlaQ11E33.

P r z y k ł a d 2

Czas krążenia czynnika VIIQ11E33 w organizmie szczura

Dwóm znieczulonym (nembutolem sodu) szczurom Sprague Dawley (325-350 g) wstrzyknięto w czasie zero 36 μg czynnika VIIQ11E33. Czynnik podano do zakaniulowanej żyły jarzmowej. W punktach czasowych przedstawionych na fig. 7 pobierano krew z tętnicy szyjnej, do której wprowadzono kaniulę na drodze zabiegu chirurgicznego. Poziom czynnika VIIQ11E33 w układzie krążenia szacowano na podstawie czasu krzepnięcia ludzkiego osocza z niedoborem czynnika VII, do którego dodawano 1 μl osocza szczurzego rozcieńczonego w stosunku 1:10. Stosowano rozcieńczenie 1:100 tromboplastyny-HS z mózgu królika (Sigma Chemical Co.). Koagulację oszacowano ręczną metodą przechylania probówki jak przedstawiono w przykładzie 1. Określano poziom aktywności czynnika VII w osoczu przed wstrzyknięciem VIlQ11E33 i odejmowano jako próbę zerową. Stężenie czynnika VIIQ11E33 w układzie krążenia przedstawiono jako log nM. Przeprowadzano symulowany eksperyment, w którym trzecie zwierzę poddano operacji i zakaniulowano, lecz nie podano czynnika VIIQ11E33. Poziom aktywności czynnika VII dla tego zwierzęcia nie uległ zmianie przez cały czas eksperymentu (100 min.). Eksperyment zakończono uśmierceniem zwierząt przez zwiększenie dawki nembutolu sodu.

W czasie całego eksperymentu szczury wyglądały prawidłowo, bez oznak koagulacji. Zatem VlIQ11E33 nie wywoływał ogólnej koagulacji, nawet w okresie pooperacyjnym. Czas trwania czynnika VIlQ11E33 w układzie krążenia był w normie (fig. 7) i w przybliżeniu 40% białka zanikało w około 60 minut a zanikanie pozostałego białka było nawet wolniejsze.

Był to poziom zanikania podobny jak w przypadku wołowej protrombiny u szczura, Nelsestuen i Suttie, 1971, Biochem. Biophys. Res. Commun., 45:198-203. Jest on wyższy niż dla zrekombinowanego czynnika VIIa dzikiego typu, którego okres półtrwania, w teście funkcjonalnym, wynosi 20-45 minut, Thomsen M.K. i wsp., 1993, Thromb. Haemost. 70:458-464. Świadczy to o tym, że czynnik VIIQ11E33 nie był rozpoznawany jako białko nieprawidłowe oraz, że nie był gwałtownie nisz- czony przez aktywność koagulacyjną. Stanowi normalne białko i powinno posiadać standardowy czas trwania u zwierząt.

P r z y k ł a d 3

Wzmocnienie miejsca błonowego i aktywności białka C

Wołowe i ludzkie białka C wykazują wysoki stopień homologii, na poziomie aminokwasowym w swoich domenach GLA (44 reszty na końcu aminowym), pomimo tego, że białko ludzkie wykazuje około 10-krotnie wyższe powinowactwo do błony. Wołowe białko C zawiera prolinę w pozycji 11 w przeciwieństwie do ludzkiego białka C, które w pozycji 11 posiada histydynę.

Badano wpływ zamiany proliny-11 w wołowym białku C na histydynę oraz zmiany odwrotnej w ludzkim białku C. W obu przypadkach białko zawierające prolinę-11 wykazywało niższe powinowactwo do błony, około 10-krotnie dla wołowego białka C i 5-krotnie dla ludzkiego białka C. Aktywowane ludzkie białko C (hAPC), zawierające prolinę w pozycji 11, wykazuje, w zależności od zastosowanego testu, od 2,4 do 3,5-krotnie niższą aktywność niż hAPC typu dzikiego. Wołowe APC zawierające histydynę-11 wykazuje do 15-krotnie wyższą aktywność niż bAPC typu dzikiego. Wskazuje to na możliwość ulepszenia zarówno kontaktu z błoną, jak i aktywności dzięki wprowadzeniu mutacji.

Mutageneza białka C

Pełnej długości klon cDNA dla ludzkiego białka C dostarczył Dr Johan Stenflo (Dept. of Clinical Chemistry, University Hospital, Malmo, Szwecja). Klon cDNA dla wołowego białka C dostarczył Dr Donald Foster (ZymoGenetics, Inc., USA). Nr dostępu w GenBank dla sekwencji nukleotydowej wołowego białka C KO2435, NID g163486 oraz K02059, NlD g190322 dla sekwencji nukleotydowej ludzkiego białka C.

PL 194 194 B1

Ukierunkowaną mutagenezę prowadzono metodą PCR. Dla mutagenezy histydyny 11 w prolinę w ludzkim białku C zsyntetyzowano następujące oligonukleotydy: A, 5'-AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCC AAG CTT-3' (SEQ ID NO:7) (odpowiadający nukleotydom 860-895 w wektorze pRc/CMV) dla wytworzenia miejsca Hindlll pomiędzy pRC/CMV i białkiem C.; B, 5'-GCA CTC CCG CTC CAG GCT GCT GGG ACG GAG CTC CTC CAG GAA-3' (SEQ ID NO:8) (odpowiadający resztom aminokwasowym 4-17 w ludzkim białku C, ósmą resztę w tej sekwencji zmutowano z występującej w ludzkim białku C na występującą w wołowym białku C, co zaznaczono przez podkreślenie).

Dla zmutowania proliny-11 w histydynę w wołowym białku C zsyntetyzowano następujące oligonukleotydy: A, (jak opisano powyżej); C, 5'-ACG CTC CAC GTT GCC GTG CCG CAG CTC CTC TAG GAA-3' (SEQ ID NO:9) (odpowiadający resztom aminokwasowym 4-15 w wołowym białku C, szósty aminokwas zmutowano z występującego w wołowym białku C na występujący w ludzkim białku C, co zaznaczono przez podkreślenie); D, 5'-TTC CTA GAG GAG CTG CGG CAC GGC AAC GTG GAG CGT-3' (SEQ lD NO:10) (odpowiadający resztom aminokwasowym 4-15 w wołowym białku C, siódmy aminokwas zmutowano z występującego w wołowym białku C na występujący w ludzkim białku C; zmutowane nukleotydy podkreślono); E, 5'-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA-3' (SEQ ID NO:11) (odpowiadający nukleotydom 984-1019 w wektorze pRc/CMV; tworzący miejsce Xbal pomiędzy pRc/CMV i białkiem C).

Oba cDNA dla białek C ludzkiego i wołowego sklonowano w wektorze ekspresyjnym pRc/CMV w miejscach Hindlll i Xbal. cDNA dla ludzkiego białka C zawierający 5' koniec do aminokwasu-17 amplifikowano metodą PCR stosując niezmieniony cDNA dla ludzkiego białka C oraz startery A i B. 100 μl mieszaniny reakcyjnej PCR zawierało 0,25 μg matrycowego DNA, 200 μM każdego z czterech trójfosforanów deoksyrybonukleotydow, 0,5 mM każdego ze starterów i 2,5 jedn. polimerazy Pwo (Boehringer Mannheim) w buforze Tris-Cl (10 mM Tris, 25 mM KCl, 5 mM (NH4)2SO4, oraz 2 mM MgSO4, pH 8,85). Przeprowadzano 30 cykli PCR o profilu: 2 min. 94°C, denaturacja, 2 min. 55°C hybrydyzacja oraz 2 min. 72°C, wydłużanie. Po amplifikacji, DNA poddawano rozdziałowi elektroforetycznemu w 0,8% żelu agarozowym w buforze 40 mM Tris-octan zawierającym 1 mM EDTA. Produkty PCR oczyszczano za pomocą zestawu JET Plasmid Miniprep-Kit (Saveen Biotech AB, Szwecja). Celem wytworzenia pełnej długości cDNA dla ludzkiego białka C z mutacją, cDNA dla ludzkiego białka C, zawierający odpowiednie mutacje, trawiono enzymami Hindlll i BsrBl a następnie klonowano w wektorze pRc/CMV trawionym Hindlll/Xbal i zawierającym fragment ludzkiego białka C od BsrBl do 3' końca.

cDNA dla wołowego białka C, zawierający koniec 5' z aminokwasem-11, amplifikowano w PCR stosując niezmieniony cDNA dla ludzkiego białka C oraz startery A i C. cDNA dla wołowego białka C od aminokwasu 11 do końca 3' powielano stosując niezmieniony cDNA ludzkiego białka C oraz startery D i E. Te dwa fragmenty cDNA stosowano jako matryce do amplifikacji, przy użyciu starterów A i E, pełnej długości cDNA dla wołowego białka C, zawierającego zmutowane aminokwasy. Warunki reakcji PCR były identyczne ze stosowanymi dla hAPC. Celem wytworzenia pełnej długości cDNA wołowego białka C zawierającego mutację cDNA dla wołowego białka C zawierający odpowiednie mutacje trawiono enzymami HindllI i Bsu36l i fragment Hindlll/Bsu36l klonowano w wektorze pRc/CMV zawierającym niezmienione fragmenty wołowego białka C od Bsu36l do końca 3'. Przed transfekcją potwierdzono obecność wszystkich mutacji poprzez sekwencjonowanie DNA.

Hodowla komórek i ekspresja

Transfekowaną adenowirusem linię komórkową 293 z ludzkiej nerki hodowano na pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 2 mM L-glutaminą, 100 jedn./ml penicyliny, 100 jedn./ml streptomycyny i 10 μg/ml witaminy K. Transfekcję przeprowadzano stosując metodę lipofekcji, Felgner, P.L. i wsp., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417. Dwa μg DNA rozpuszczano w 0,1 ml pożywki DMEM zawierającej 2 mM L-glutaminę. Dziesięć μl lipofektyny (1 mg/ml) dodawano do 100 μl pożywki DMEM zawierającej 2 mM L-glutaminę. DNA i lipofektynę mieszano i pozostawiano w temperaturze pokojowej na 10-15 min. Jednowarstwowe komórki (25-50% konfluencji w 5-cm szalkach Petriego) dwukrotnie płukano w pożywce DMEM z 2 mM L-glutaminą. Mieszaninę DNA/lipid rozcieńczano do objętości 1,8 ml w podłożu DMEM zawierającym 2 mM L-glutaminę, dodawano do komórek i inkubowano przez 16 godz. Komórki dokarmiano 2 ml kompletnej pożywki zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą, pozostawiano do powrotu do normy na kolejne 48-72 godz. a następnie trypsynizowano i przenoszono do 10 cm szalek z pożywką selekcyjną (DMEM z 10% surowicą cielęcą i 400 μg/ml Genetycyny) 1:5, Yan, S.C.B. i wsp., 1990, Bio/Technology 655-661. Kolonie oporne na genetycynę otrzymywano po 3-5 tygodniach selekcji. Zbierano po dwadzieścia cztery kolonie z każdej transfekcji DNA, hodowano do stanu konfluencji a pożywki przeszukiwano na obecność wy16

PL 194 194 B1 twarzania białka C z użyciem testu typu dot-blot stosując przeciwciała monoklonalne HPC4 (dla ludzkiego białka C) oraz przeciwciała monoklonalne BPC5 (dla wołowego białka C). Izolowano klony wytwarzające wysokie ilości białka i hodowano do konfluencji w obecności 10 μg/ml witaminy K₁.

Oczyszczanie zrekombinowanego wołowego białka C i jego zmutowanej formy oparte było na metodzie opisanej wcześniej, poddanej pewnym modyfikacjom, Rezair, A.R. oraz Esmon, C.T., 1992, J. Biol. Chem., 267:26104-26109. Wolną od surowicy pożywkę, w której rosły komórki stabilnie stransfekowane wirowano przy 5000 rpm w 4°C przez 10 min. Supernatant filtrowano przez 0,45 Lim membrany nitrocelulozowe (Micro Filtration Systems, Japonia). Do pożywki, w której rosły komórki 293 dodawano EDTA (5 mM, końcowe stężenie) i PPACK (0,2 L M, stężenie końcowe) a następnie przepuszczano je przez kolumnę aniono-wymienną Pharmacia FFQ w temperaturze pokojowej, stosując Millipore Con Sep LC100 (Millipore, USA). Białko wypłukiwano gradientem CaCl2 (początkowy roztwór, 20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl, pH 7,4; roztwór ograniczający, 20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl/30 mM CaCl2, pH 7,4). Po usunięciu CaCl2 poprzez dializę i poddanie działaniu Chelex 100, białko ponownie absorbowano na drugiej kolumnie FFQ a następnie wypłukiwano gradientem NaCl (początkowy roztwór, 20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl, pH 7,4; roztwór ograniczający, 20 mM Tris-HCl/500 mM NaCl, pH 7,4). W tym punkcie oczyszczania zrekombinowane wołowe białko C dzikiego typu lub zmutowane było homogenne, co wykazano poprzez SDS-PAGE.

Pierwsza kolumna stosowana do oczyszczania zrekombinowanego ludzkiego białka C dzikiego typu lub formy zmutowanej była taka sama jak opisana dla białka C wołowego. Zastosowano metodę chromatograficzną opisaną przez Rezair i Esmon z tymi samymi modyfikacjami, które opisano dla metody oczyszczania białka S, Rezair, A.R. i Esmon, C.T., 1992, powyżej; He, Z. i wsp., 1995, Eur. J. Biochem. 227:433-440. Frakcje zawierające białko C pochodzące z chromatografii aniono-wymiennej identyfikowano metodą typu dot-blot. Dodatnie frakcje łączono i nanoszono na kolumnę powinowactwa zawierającą Ca²⁺ - zależne przeciwciała HPC-4. Kolumnę równoważono 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4, zawierającym 5 mM Benzamidyno-HCl i 2 mM CaCl2. Po naniesieniu, kolumnę przepłukiwano tym samym buforem zawierającym 1 M NaCl. Białko C wypłukiwano 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl i 5 mM EDTA, pH 7,4, zawierającym 5 mM Benzamidyno-HCl. Po oczyszczeniu, czystość wszystkich preparatów ludzkich i wołowych zrekombinowanych białek C określano poprzez SDSPAGE i barwienie srebrem. Białka zatężano przy użyciu filtrów YM 10 (Amicon), następnie dializowano wobec buforu (50 mM Tris-HCl i 150 mM NaCl, pH 7,4) przez 12 godz. i przechowywano w -70°C. Stężenie białek mierzono na podstawie absorbancji przy 280 nm.

Asocjacja z błonami cząsteczek białka C normalnego i formy zmutowanej

LUV i SUV przygotowywano metodami opisanymi w przykładzie 1. Stosunek rozproszenia światła przy 90° do światła padającego stosowano przy ilościowych pomiarach wiązania białka z błoną, jak opisano powyżej dla czynnika VII (25 L g/ml PS/PC, (25/75) w 5 mM wapniu (0,05 M bufor Tris-0,1 M NaCl, pH 7,5).

Wołowe białko C zawierające histydynę w pozycji 11 oddziałuje z błonami z około 10-krotnie wyższym powinowactwem niż białko dzikiego typu. Podstawienie do wzoru 2 danych, daje wartości KD 930±80 nM dla białka C-H11 i 9200±950 nM dla białka C dzikiego typu (fig. 8A). Różnice w powinowactwie odpowiadają około 1,4 kcal/mol w 25°C. Faktycznie powinowactwo do błony wołowego białka C-H11 było prawie identyczne z tym jaki posiada ludzkie białko C (660 nM, fig. 8B). Sugeruje to, że prolina 11 jest głównym źródłem różnic pomiędzy miejscem wiązania się z błoną w ludzkim i wołowym białku.

Podstawienie odwrotne, zamiana His-11 z ludzkiego białka C na prolinę, obniża powinowactwo błonowe (fig. 8B). Podstawienie do wzoru 2 tych danych, daje wartości KD 660 ± 90 nM dla ludzkiego białka C dzikiego typu i 3350 ± 110 nM dla ludzkiego białka C-P11. Wpływ wprowadzonej proliny był niewiele mniejszy niż ten przy wprowadzeniu proliny do wołowych białek.

Wpływ proliny-11 na aktywność aktywowanego białka C

Aktywowane białko C wytwarzano poprzez cięcie trombiną, stosując identyczne warunki zarówno dla białka dzikiego typu jak formy zmutowanej. Około 150 L g różnych preparatów białka C (1 mg/ml) mieszano z wołową trombiną (3 L g) i inkubowano w 37°C przez 5 godz. Produkt reakcji rozcieńczano w 0,025 M buforze Tris, 0,05 M NaCl i nanoszono na kolumnę z SP-Sephadex C-50. Kolumnę przepłukiwano jednym ml tego samego buforu a wypływ z kolumny zbierano jako aktywowane białko C. Odzyskiwano około 65-80% białka nanoszonego na kolumnę. Aktywność APC określano poprzez proteolizę S2366 (0,1 mM) w 25°C. Preparaty porównywano z preparatami standardowymi, wytworzonymi na większą skalę. Standardowe ludzkie APC otrzymano od Dr Walter Kisiel. Dla białek wołowych standardem było wytworzone na dużą skalę APC aktywowane trombiną. Aktywność

PL 194 194 B1 wołowego APC była spójna dla wszystkich preparatów białek normalnych i form zmutowanych (± 5%). Do porównania użyto dwa preparaty wołowego APC. Ludzkie APC wytworzone z użyciem trombiny wykazywało 55 do 60% aktywności standardu. W badaniach tych przedstawione stężenia określano na podstawie aktywności wobec S2366, w porównaniu ze standardem.

Standardowy test APTT wykorzystuje osocze wołowe lub ludzkie oraz standardowy odczynnik APTT (Sigma Chemical Co.) zgodnie z zaleceniem producenta. Ewentualnie, fosfolipid dostarczano w formie pęcherzyków utworzonych z wysoko oczyszczonych fosfolipidów. W teście tym osocze wołowe (0,1 ml) inkubowano z kaolinem (0,1 ml z 5 mg/ml w 0,05 M buforze Tris, 0,1 M NaCl, pH 7,5) lub z kwasem elagowym (0,1 mM w buforze) przez 5 min w 35°C. Koagulację rozpoczynano poprzez dodanie 0,1 ml buforu zawierającego fosfolipid a APC uwidaczniano po dodaniu 0,1 ml 25 mM chlorku wapnia. Do wszystkich odczynników stosowano standardowy bufor zawierający 0,05 M bufor Tris, 0,1 M NaCl, pH 7,5. Średnio 14-krotnie wyższe stężenie dzikiego typu bAPC było konieczne do osiągnięcia działania mutanta H11. Czas koagulacji przy 10 nM bAPC-H11 był dłuższy niż 120 min. Standardowy odczynnik APTT (Sigma Chemical Co.) dawał z tym osoczem czas krzepnięcia około 61 sek. w 35°C. Czas wymagany do wytworzenia skrzepu rejestrowano techniką ręczną. Zaplanowano, że ilość fosfolipidu jest limitującym składnikiem w teście i daje przedstawiony czas krzepnięcia. Stosowano fosfolipidy SUV (45 μg/0,4 ml w końcowym teście, PS/PC, 10/90) lub LUV (120 μg/0,4 ml w końcowym teście, PS/PC, 25/75).

Aktywność antykoagulacyjną aktywowanego białka C badano wieloma testami. Na fig. 9 przedstawiono wynik testu APTT prowadzonego z ograniczającym fosfolipidem. W warunkach tego testu czas koagulacji maleje prawie liniowo, w odwrotnej zależności od stężenia lipidu. Potrzeba około 14krotnie więcej wołowego APC dzikiego typu do wyrównania wpływu wołowego APC-H11.

Część badań przedstawionych na fig. 9 powtórzono dla błon PS/PC (25/75, LUV). Ponownie, aktywność ograniczano fosfolipidem i jego stężenie było dostosowane tak, aby czas krzepnięcia wynosił 360 sek. (120 μg z 25% PS w 0,4 ml teście). Około 15-krotnie więcej enzymu dzikiego typu było wymagane do zrównoważenia działania mutanta H11. W końcu zastosowano standardowy odczynnik APTT (Sigma Chemical Co., standardowy czas krzepnięcia 50 ± 2 sek.). Około 10,0 ± 0,7 nM enzymu dzikiego typu potrzeba do podwojenia czasu krzepnięcia do 102 ± 5 sek. Ten sam wpływ wykazywał 2,2 ± 0,1 nM wołowego APC-H11. Ze względu na to, że fosfolipid nie był wartością limitującą w standardowym teście zatem można się spodziewać mniejszego wpływu na powinowactwo błonowe.

Wyniki dla ludzkich białek przedstawiono na fig. 8B. Około 2,5-krotnie więcej ludzkiego APC zawierającego prolinę-11 wymagane jest do wydłużenia krzepnięcia do wysokości dla dzikiego typu APC. Niższy wpływ wprowadzenia proliny-11 może wskazywać na mniejsze zróżnicowanie w powinowactwie ludzkich białek do błon (fig. 9B).

lnaktywacja czynnika Va lnaktywację czynnika Va badano metodą według Nicolaes i wsp., 1996, Thrombosis and Haemostasis, 76:404-410. Streszczając, dla białek wołowych, osocze wołowe rozcieńczono 1000-krotnie roztworem 0,05 M Tris, 0,1 M NaCl, 1 mg/ml albuminy surowicy wołowej i 5 mM wapń o pH 7,5. W celu aktywacji czynnika V dodawano pęcherzyki fosfolipidowe (5 μg/0,24 ml oznaczenia) i 5 μl 190 nM trombiny. Po 10 min. inkubacji w 37°C, dodawano APC i inkubację kontynuowano przez 6 min. Dodawano wołową protrombinę (do 10 μM stężenie końcowe) oraz czynnik Xa (0,3 nM końcowe stężenie) i reakcję dalej prowadzono przez jedną min. w 37°C. 20 μl próbki tej reakcji aktywacji dodawano do 0,38 ml buforu (0,05 M Tris,), 1 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,5) zawierającego substrat S2288 (60 μM). Ilość trombiny określano na podstawie zmiany absorbancji przy 405 nM (ε=1,0*10⁴ M^-1s^-1, k_cat dla trombiny=100/s). W przypadku ludzkich białek, ludzkie osocze z niedoborem białka S (Biopool Canada, lnc.) rozcieńczano 100-krotnie, czynnik V aktywowano za pomocą ludzkiej trombiny i wytwarzany czynnik Va oznaczano za pomocą czynnika używanego dla białek wołowych.

Wołowy APC-H11 był 9,2-krotnie bardziej aktywny w inaktywowaniu czynnika Va niż białko dzikiego typu (fig. 10A). Jak dla wiązania błonowego (powyżej) wpływ proliny-11 był mniejszy dla białek ludzkich, ze średnio 2,4-krotną różnicą pomiędzy krzywą wykreśloną dla dzikiego typu i zmutowanej formy P-11 (fig. 10B). Podobne wyniki otrzymano dla ludzkiego osocza.

P r z y k ł a d 4

Identyfikacja prototypowego powinowactwa do błony dla miejsca kontaktu z błoną białek zależnych od witaminy K

Porównanie różnych mutantów ludzkiego i wołowego białka C i innych polipeptydów zależnych od witaminy K doprowadziło do zaproponowania prototypowego miejsca kontaktu z błoną. Elektrostatyczny

PL 194 194 B1 prototyp składa się z elektrododatniego rdzenia na jednej powierzchni białka, tworzonego przez związane jony wapnia, otoczonego przez halo elektroujemnych aminokwasów białka. Im bardziej przedstawiciel tej rodziny jest bliski temu wzorowi elektrostatycznemu tym większe jest jego powinowactwo do błon.

Pęcherzyki fosfolipidowe, dzikiego typu wołowe białko C, badania; oddziaływania białko-błona, aktywacja i oznaczenia ilościowe białka C oraz analiza aktywności były takie same jak opisano w przykładzie 3.

Zrekombinowane, zmutowane białko C wytwarzano stosując następujące procedury. Ukierunkowaną mutagenezę prowadzono metodą PCR. Zsyntetyzowano następujące oligonukleotydy: A, jak opisano w przykładzie 3; F, 5'-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA-3' (SEQ lD NO:11) (odpowiadający nukleotydom 984-1019 w wektorze pRc/CMV) tworzący miejsca Xbal pomiędzy pRC/CMV i białkiem C; G, 5'-GAA GGC CAT TGT GTC TTC CGT GTC TTC GAA AAT CTC CCG AGC -3' (SEQ ID NO:12) (odpowiadający resztom aminokwasowym 40-27 w wołowym białku C, 8 i 9 aminokwas zmutowano z QN na ED, co zaznaczono przez podkreślenie); H, 5'-CAG TGT GTC ATC CAC ATC TTC GAA AAT TTC CTT GGC-3' (SEQ ID NO:13) (odpowiadający resztom aminokwasowym 38-27 w ludzkim białku C, 6 i 7 aminokwas w tej sekwencji zmutowano z QN na ED, co zaznaczono przez podkreślenie); l, 5'-GCC AAG GAA ATT TTC GAA GAT GTG GAT GAC ACA CTG-3' (SEQ ID NO:14) (odpowiadający resztom aminokwasowym 27-38 w ludzkim białku C, 6 i 7 aminokwas w tej sekwencji zmutowano z QN na ED, co zaznaczono przez podkreślenie); J, 5'-CAG TGT GTC ATC CAC ATT TTC GAA AAT TTC CTT GGC-3' (SEQ lD NO:15) (odpowiadający resztom aminokwasowym 38-27 w ludzkim białku C, 7 aminokwasy w tej sekwencji zmutowano z Q na E, co zaznaczono przez podkreślenie); K, 5'-GCC AAG GAA ATT TTC GAA AAT GTG GAT GAC ACA CTG-3' (SEQ ID NO:16) (odpowiadający resztom aminokwasowym 27-38 w ludzkim białku C, 6 aminokwas w tej sekwencji zmutowano z Q na E, co zaznaczono przez podkreślenie).

Oba pełnej długości cDNA dla białka C wołowego i ludzkiego sklonowano w miejsca HindllI i Xbal wektora pRc/CMV. W celu wytworzenia zmutowanej formy E33D34 wołowego białka C przeprowadzano amplifikację PCR docelowego DNA w następujący sposób. cDNA wołowego białka C zawierający koniec 5' do aminokwasu w pozycji 40 amplifikowano stosując niezmieniony cDNA wołowego białka C oraz startery A i C. Stosowano warunki reakcji PCR jak opisano w przykładzie 3. Przeprowadzano 30 cykli PCR o profilu: 2 min. denaturacji w 94°C, 2 min. hybrydyzacji w 55°C oraz 2 min. wydłużania w 72°C. Po amplifikacji, DNA poddawano rozdziałowi elektroforetycznemu w 0,8% żelu agarozowym w buforze 40 mM Tris-octan zawierającym 1 mM EDTA. Produkty PCR oczyszczano stosując zestaw The Geneclean lll Kit (BlO 101, Inc., USA) a fragment PCR cDNA dla wołowego białka C zawierający odpowiednie mutacje trawiono enzymami Hindlll i Bbsl. Fragment HindIll/Bbsl oraz fragment ludzkiego białka C (Bbsl-koniec 3') klonowano w miejscach HindllI i Xbal wektora pRc/CMV dla wytworzenia pełnej długości cDNA dla wołowego białka C z mutacjami. Zmutowaną formę wołowego białka C H11 E33 D34 wytworzono na tej samej drodze, lecz wykorzystując DNA zmutowanej formy H11 wołowego białka C jako matrycę w reakcji PCR.

cDNA dla ludzkiego białka C zawierający koniec 5' do aminokwasu 38 amplifikowano stosując niezmieniony cDNA dla i ludzkiego białka C oraz startery A i D. cDNA dla ludzkiego białka C od aminokwasu 27 do końca 3' amplifikowano stosując niezmieniony cDNA dla ludzkiego białka C oraz startery B i E. Te dwa fragmenty cDNA stosowano jako matryce do amplifikacji pełnej długości cDNA dla wołowego białka C zawierającego zmutowane aminokwasy (E33 D34) wraz ze starterami A i B. Zmutowaną formę E33 ludzkiego białka C wytworzono następującymi etapami: cDNA dla ludzkiego białka C zawierający koniec 5' do aminokwasu 38 amplifikowano stosując niezmieniony cDNA dla ludzkiego białka C oraz startery A i F. cDNA dla ludzkiego białka C od aminokwasu 27 do końca 3' amplifikowano stosując niezmieniony cDNA dla ludzkiego białka C oraz startery B i G. Te dwa fragmenty cDNA stosowano jako matryce do amplifikacji pełnej długości cDNA dla wołowego białka C zawierającego zmutowane aminokwasy (E33) wraz ze starterami A i B. Mieszaninę do PCR oraz program opisano powyżej. Produkty PCR ludzkiego białka C zawierające odpowiednie mutacje trawiono enzymami Hindlll i SalI a następnie fragment (Hindlll-Sall) razem z niezmienionym fragmentem ludzkiego białka C (SalI- koniec 3') klonowano w miejsca Hindlll i Xbal wektora pRc/CMV celem wytworzenia pełnej długości cDNA dla ludzkiego białka C z odpowiednimi mutacjami. Przed transformacją obecność wszystkich mutacji potwierdzono sekwencjonowaniem DNA.

Transfekowaną adenowirusem linię komórkową 293 z ludzkiej nerki hodowano i transfekowano jak opisano w przykładzie 3. Wołowe i ludzkie zrekombinowane białka C oraz ich zmutowane formy oczyszczano jak opisano w przykładzie 3.

PL 194 194 B1

Białka zależne od witaminy K podzielono na cztery klasy na podstawie ich powinowactwa do standardowej błony (tabela 4). Jako odniesienia podane są sekwencje reszt z końca aminowego niektórych istotnych białek, w tym ludzkiego białka C(hC), wołowego białka C(bC), wołowej protrombiny (BPT), wołowego czynnika X(bX) oraz ludzkiego czynnika Vll(hVll), gdzie X jest Gla (kwas γ-karboksyglutaminowy) lub Glu.

bPT: ANKGFLXXVRK11GNLXRXCLXX21PCSRXXAFXA31LXSLSATDAF41WAKY (SEQ ID NO:17) bX: ANS-FLXXVKQ11GNLXRXCLXX21ACSLXXARXV31FXDAXQTDXF41WSKY (SEQ ID NO:18) hC: ANS-FLXXLRH11SSLXRXCIXX21ICDFXXAKXI31FQNVDDTLAF41WSKH (SEQ ID NO:1) bC: ANS-FLXXLRP11GNVXRXCSXX21VCXFXXARXl31FQNTXDTMAF41WSFY (SEQ ID NO:2) hVII: ANA-FIXXLRP11GSLXRXCKXX21QCSFXXARXI31FKDAXRTKLF41WISY (SEQ ID NO:3)

T a b e l a 4 Ładunki i powinowactwo

	RESZTA
	11+29+33+34=Suma	Całk.	KD(nM)
Klasa I
bZ	-2	+	-2	-1	-4	-6	0.2^a-32
hZ	-2	+	-2		-3	-5	2.0^a-170
Klasa II
bPT-TNBS			-2		-2	-1	<10
hVII-Q11E33		+	-2	-1	-2	-2	10
hS		+	-2	-1	-2	-2	40
bX		+	-2	-1	-2	-3	40
bC-E33D34	P	+	-2	-1	-2	-4	125
hX	+	+	-2	-1	-1	-2	160
bPT	+		-2		-1	0	100
hPT	+		-2		-1	-1	-
bS	+	+	-2		0	0	120
Klasa III
bIX		+	-2		-1	-1	1000
hIX		+	-2		-1	-1	1000
hC		+			+ 1	-2	660
bC-H11		+			+ 1	-1	930
Klasa IV
hC	P	+			+1	-2	3300
hVII	P	+	+	-1	+ 1	+ 1	4000
bC	P	+			+ 1	-1	9200
bVII	P	+	+		+ 1	0	15000

^a Równania wartości wyższego powinowactwa kdysocjacji/1*10⁷M^-1S^-1; mianownik jest typową kasocjacji dla innych białek.

Zmutowane formy polipeptydów zależnych od witaminy K są w tab. 4 zaznaczone pogrubioną czcionką. Całkowity ładunek (reszty 1-34) obejmuje 7 jonów wapnia (+14) i koniec aminowy (+1).

Białko Z przypisano do klasy l na podstawie wielkości jego stałej dysocjacji, która była 100 do 1000-krotnie niższa niż dla innych białek. Dla białka Z wykazującego normalną stałą dysocjacji (około 10⁷ M^-1 s^-1) KD byłaby 10^-10 M,; Wei, G. J. i wsp., 1982, Biochemistry, 21:1949-1959. Ta ostatnia war20

PL 194 194 B1 tość powinowactwa może być możliwym maksimum dla białek zależnych od witaminy K. IV klasa białek, różni się od lll obecnością proliny-11, która może zmieniać powinowactwo na drodze innej niż elektrostatyczna.

Podczas gdy istnieje relatywnie niska korelacja pomiędzy powinowactwem błonowym i wypadkowym ładunkiem ujemnym dla reszt 1-34, doskonałą korelację znaleziono, kiedy rozpatrywano jedynie reszty 5, 11, 29, 34 (tabela 4). Te ostatnie aminokwasy są położone na powierzchni białka. Modelowano szereg białek poprzez podstawienia aminokwasowe do struktury protrombiny a ich potencjały elektrostatyczne określano za pomocą programu DelPhi. Naszkicowany wzór po potencjałach elektrostatycznych wołowego białka Z jest przedstawiony na fig. 11. Elektroujemne miejsca 7, 8, 26, 30, 33, 34 oraz 11 wytwarzają halo o elektroujemnym ładunku otaczające rdzeń kationowy wytwarzany przez pory wypełnione wapniem (fig. 11). Im bardziej struktura białka przypomina tę strukturę tym większe jest jego powinowactwo do błon. Korelacja ta jest widoczna dla białek dzikiego typu, form zmutowanych i białek chemicznie zmodyfikowanych.

Wzór dla innych struktur można ekstrapolować na podstawie badania nieobecnych w innych białkach grup niosących ładunek. Przykładowo, Lys-11 i Arg-10 wołowej protrombiny wytwarzają w swoim sąsiedztwie obszary silnie elektrododatnie; utrata Gla-33 w białku C i czynniku VII powoduje obniżenie elektroujemności w tych obszarach białek. We wszystkich przypadkach, wyższe powinowactwo odpowiadało strukturze z elektrododatnim rdzeniem, który był całkowicie otoczony przez elektroujemną powierzchnię białka, jak pokazano dla białka Z. Wyjątek od tego wzoru stanowią białka z Pro-11, która może obniżać powinowactwo poprzez wpływ na strukturę oraz Ser-12 (ludzkie białko C), która jest wyjątkową resztą nie posiadającą ładunku.

Dla dalszego testowania hipotezy o prototypie rozmieszczenia elektrostatycznego, zastosowano mutagenezę ukierunkowaną prowadzącą do zamienienia GLN33Asn34 z wołowego i ludzkiego białka C przez Glu33 Asp34 (SEQ ID NO: 19). Glu33 powinien być dalej modyfikowany do Gla podczas obróbki białka. Zamiany te powodują zmiany potencjału elektrostatycznego wołowego białka C do takiego jaki posiada wołowy czynnik X. Spodziewano się, że powinowactwo błonowe zmutowanej formy białka będzie niższe niż dla czynnika X, ze względu na występującą prolinę-11. Rzeczywiście zmutowana forma wołowego białka C ma powinowactwo błonowe podobne do tego jakie ma protrombina (fig. 12A) i niewiele mniejsze niż wołowy czynnik X (tab. 4).

Bardziej interesujący był fakt, że zmutowana forma enzymu APC miała większy wpływ na hamowanie krzepnięcia niż forma dzikiego typu (fig. 12B, C). Dołączenie do tego wyników dla zmutowanej formy P11H wołowego białka C z przykładu 3 pokazuje, że poprzez zmianę podstawień w pozycjach 11, 33 i 34 można wytworzyć rodzinę białek, z których każde różni się powinowactwem błonowym i aktywnością.

Zmutowane ludzkie białka C zawierające E33 oraz E33D34 charakteryzują się niewielkim podwyższeniem powinowactwa wiązania do błony (fig. 13a). Powinowactwo tych mutantów było niewiele niższe niż dla enzymu dzikiego typu (fig. 13b). Wyniki ze zmutowanymi formami wołowego białka C sugerują, że uszkodzenie spowodowane mutacją E33D34 w ludzkim białku może wynikać z obecności H11 i/lub innego unikalnego aminokwasu w białku. Na fig. 14A pokazano, że zmutowana forma H11 wołowego białka C wiąże się z błoną z około 10-krotnie wyższym powinowactwem niż białko dzikiego typu, zmutowana forma E33D34 wiąże się z 70-krotnie wyższym powinowactwem, natomiast potrójnie zmutowana forma, H11E33D34, była jedynie niewiele wydajniejsza niż zmutowana forma H11. Zależność ta miała odzwierciedlenie w aktywności APC wytwarzanego z tych zmutowanych form (fig. 14B). Wynik ten sugeruje, że obecność H11 redukuje wpływ E33D34 na powinowactwo wiązania błonowego.

Wyniki te pokazują, że wprowadzenie E33D34 może nie być optymalne dla wszystkich białek. W konsekwencji, mogą być pożądane inne mutacje do wytwarzania ludzkiego białka C, wykorzystujące E33D34 i posiadające maksymalnie wysokie powinowactwo błonowe. Wyniki otrzymane dla wołowego białka sugerują, że pierwotną przyczyną tego zjawiska może być histydyna 11. W konsekwencji H11 można zmienić w glutaminę lub w inny aminokwas w ludzkim białku C, w połączeniu z mutacją E33D34. Innym aminokwasem, który może mieć wpływ na powinowactwo jest seryna w pozycji 12, aminokwas, który jest zupełnie unikalny dla ludzkiego białka C. Te dodatkowe zmiany powinny pozwalać na wytworzenie białek o wzmocnionym powinowactwie błonowym.

Elektrostatyczny prototyp testowano także przez porównanie ludzkiego i wołowego czynnika X. Obecność lizyny-11 w ludzkim czynniku X sugeruje, że powinien on mieć niższe powinowactwo niż wołowy czynnik X. Przypuszczenie to potwierdzone jest przez wynik przedstawiony na fig. 15.

PL 194 194 B1

Wcześniejsze badania wykazały, że modyfikacje kwasem trinitrobenzenosulfonowym (TNBS) fragmentu 1 wołowej i ludzkiej protrombiny mają stosunkowo niski wpływ (0 do 5 krotny) na powinowactwo błonowe, Weber, D.J. i wsp., 1992, J. Biol. Chem., 267: 4564-4569; Welsch, D. J. i wsp., 1988, Biochemistry, 27: 4933-4938. Warunki stosowane w reakcji wywołały zróżnicowanie końca aminowego, zmianę związaną z obniżeniem powinowactwa błonowego, Welsch, D. J. i Nelsestuen, G.L., 1988, Biochemistry, 27: 4939-4945. Modyfikacja białka w obecności wapnia, protegująca koniec aminowy nadaje białku modyfikowanemu TNBS wiele większe powinowactwo do błony niż posiada natywny fragment 1.

Sugestia, że białko Z stanowi prototyp oparta była na wielkości stałej dysocjacji i na tym, że normalna wielkość asocjacji daje KD=10^-10 M. Nie jest pewne czy wartość ta zostanie osiągnięta. Możliwe, że wolny poziom asocjacji białka Z spowodowany jest nieprawidłowym fałdowaniem białka, dającym niskie stężenie takiej konformacji, która umożliwia wiązanie do błony. Zmiana warunków na takie, które polepszą fałdowanie białka powinna poprawić stopień asocjacji białka Z. Rzeczywiście, wielkość stałej asocjacji dla białka Z jest poprawiona dzięki zmianie pH. Wynik ten może zależeć od niezwykłej cechy struktury protrombiny, którą jest bliskie położenie końca aminowego (+1 przy pH 7,5) przy jonach wapnia 2 i 3. Ładunek +1 na końcu aminowym jest odpowiedzialny za występowanie nieznacznie elektrododatniego regionu zaraz powyżej Ca-1 na fig. 11. Odpychanie ładunku pomiędzy Ca i końcem aminowym może destabilizować fałdowanie białka i może być poważnym problemem dla białka o niskiej stabilności fałdowania. W tab. 5 przedstawiono dodatkowe dane popierające prototypowy model. Pokazano, że wzajemne zależności pomiędzy odległością grup jonowych od jonu strontu 1 i 8 (odpowiadający wapniowi 1 i dodatkowemu dwuwartościowemu jonowi znalezionemu w Sr strukturze krystalicznej za pomocą promieniowania X protrombiny). Wzór sugeruje, że im grupy jonowe leżą bliżej jonów tych metali tym większy jest wpływ na powinowactwo błonowe. Wyjątek stanowi Arg-16, która nadaje elektrododatni ładunek rdzeniowi. Wyższe powinowactwo jest skorelowane z elektroujemnym ładunkiem we wszystkich innych miejscach. Korelacja ta także odnosi się do reszty GLA.

T a b e l a 5

Odległość do Sr-1, 8 oraz istotność jonu

	Odległość (A) do wpływ/jon
Pozycja	Atom^a	Sr-1	Sr-8	na Kd(Km)
1	2	3	4	5
(A.A-Białko)
3(K-PT)	ε-N	22.1	21.7	Niska lub nieznana
5(K-IX)	para-C(F)	20.1	20.8
19(K/R-VII)	C5(L)	20.2	17.8
22(K-IX)	C4(P)	17.0	18.5
10(R)	C6(R)	16.8	12.9
25(R-PT)	C6(R)	11.2	13.8
24(X/D-PC)	O(S)	8.1	12.0
11(K-PT, hx, bS; Gla-PZ)
	8-C(K)	14.7	7.4	3-10-razy^b
33(Gla)	Y-C(E)	11.6	7.5	„
34(D)	O(S)	15.3	12.1	„

PL 194 194 B1 cd. tabeli 5

1	2	3	4	5
29(R)	para-C(F)	7.5	8.4	„
16(R)	C6(R)	14.2	10.6	„
Gla reszta^d
Niska istotność:
7		12.8	13.3	+2(<2)
15		20	16	<2(<2)
20		19.4	17.8	<2(<2)
21		17.2	15	4(3)
33		11.6	7.5	?^e(<2)
Wysoka istotność:
8		8.7	10.9	?^e(20)
26		3.6	9.5	?^e(50)
17		11.1	9.1	>200(100)
27		8.4	10.6	>200(85)
30		3.4	4.2	>200(25)

^a Odległ ości podane od tego atomu w wołowej protrombinie (reszta protrombiny zastosowana w pomiarach jest podana w nawiasach) do strontu 1 i 8 w strukturze fragmentu 1 Sr-protrombiny, Seshardi i wsp., 1994, Biochemistry 33:1087-1092.

^b Dla wszystkich z wyjątkiem 16-R, kationy obniż ają a aniony podwyższają powinowactwo. ^c Tharith i wsp., 1997 Biochem. J. 322:309-315.

^d Wpł yw mutacji Glu w Asp, odległości odpowiadają średnim dla gamma-karboksylowych atomów wę gla. Dane KD(KM) pochodzą z Ratc-liffe i wsp., 1993 J. Biol. Chem. 268:24339-45.

^e Wiązanie miało niższą wydajność lub wywoływało tworzenie agregatów co dawało mniej oczywiste porównanie.

Wyniki przedstawione na fig. 15C pokazują, że szybkość asocjacji dla białka Z była zasadniczo poprawiona przy pH 9, kiedy koniec aminowy nie powinien posiadać ładunku. Wielkość stałej otrzymana z tych danych była około 12-krotnie wyższa przy pH 9 niż przy pH 7,5 (fig. 15C).

Inne wykonania

Powinno być zrozumiałe, że chociaż wynalazek jest opisany w połączeniu z jego szczegółowym opisem przedstawione opisy mają na celu zobrazowanie a nie ograniczenie zakresu wynalazku, który jest zdefiniowany zakresem załączonych zastrzeżeń.

PL 194 194 B1

Lista sekwencji <151> 1997-10-23 <160> 35 <170> FastSEQ dla Windows wersja 3,0 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0) . . . (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 1

Ala

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

His

Ser

Leu

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Ile

Xaa

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa

Ala

Lys

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Gin

Asn

Val

Asp

Thr

Leu

Ala

Phe

Trp

Ser

Lys

His

35

40

<210> 2 <211> 44 <212> PRT <213> Bos taurus <220>

<221> MOD_RES <222> ¢0)..,(0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 2

Ala

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

Pro

Gly

Asn

Val

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Ser

Xaa

Val

Cys

Xaa

Phe

Xaa

Ala

Arg

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Gin

Asn

Thr

Xaa

Asp

Thr

Met

Ala

Phe

Trp

Ser

Phe

Tyr

35

40

<210>	3
<211>	44
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<220>

PL 194 194 B1 <221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 3

Ala 1

Asn Ala

Phe

Leu 5

Xaa Xaa

Leu

Arg

Pro 10

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg 15

Xaa

Cys

Lys

Xaa

Gin

Cys

Ser

Phe

Xaa

Ala

Arg

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Lys

Asp

Ala

Xaa

Arg

Thr

Lys

Leu

Phe

Trp

Ile

Ser

Tyr

35

40

<210> 4 <211> 44 <212> PRT <213> Bos taurus <220>

<221> MOD_RES <222> (0) ... (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 4

Ala

Asn

Gly

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Arg

Xaa

Leu

Cys

Ser

Phe

Xaa

Ala

His

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Arg

Asn

Xaa

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Trp

Val

Ser

Tyr

35

40

<210> 5 <211> 44 <212> PRT .

<213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 5

Tyr

Asn

Ser

Gly

Lys

Leu

Xaa

Phe

Val

Gin

Gly

Asn

Leu

Xaa

1

5

10

15

Arg

Xaa

Cys

Met

Xaa

Lys

Cys

Ser

Phe

Xaa

Ala

Arg

Xaa

20

25

30

Val

Phe

Xaa

Asn

Thr

Xaa

Arg

Thr

Xaa

Phe

Trp

Lys

Gin

Tyr

35

40

45

<210> 6 <211> 44 <212> PRT <213> Bos taurus

PL 194 194 B1 <220>

<221> MOD_RES <222> (0) . . . ¢0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 6

Tyr

Asn

Ser

Gly

Lys

Leu

Xaa

Phe

Val

Gin

Gly

Asn

Leu

Xaa

1

5

10

15

Arg

Xaa

Cys

Met

Xaa

Lys

Cys

Ser

Phe

Xaa

Ala

Arg

Xaa

20

25

30

Val

Phe

Xaa

Asn

Thr

Xaa

Lys

Arg

Thr

Xaa

Phe

Trp

Lys

Gin

35

40

45

Tyr <210> 7 <211> 46 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd mutagenny dla Białka c <400> 7 aaattaatac gactcactat agggagaccc aagctt <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd mutagenny dla Białka c <400> 8 gcactcccgc tccaggctgc tgggacggag ctcctccagg aa <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd mutagenny dla Białka c <400> 9 acgctccacg ttgccgtgcc gcagctcctc taggaa <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

PL 194 194 B1 <223> Oligonukleotyd mutagenny dla Białka c <400> 10 ttcctagagg agctgcggca cggcaacgtg gagcgt <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd mutagenny dla Białka c <400> 11 gcatttaggt gacactatag aatagggccc tctaga <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> Oligonukleotyd mutagenny dla Białka c <400> 12 gaaggccatt gtgtcttccg tgtcttcgaa aatctcccga gc <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> Oligonukleotyd mutagenny dla Białka c <400> 13 cagtgtgtca tccacatctt cgaaaatttc cttggc <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> Oligonukleotyd mutagenny dla Białka c <400> 14 · gccaaggaaa ttttcgaaga tgtggatgac acactg <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

PL 194 194 B1 <223> Oligonukleotyd mutagenny dla Białka c <400> 15 cagtgtgtca tccacatttt cgaaaatttc cttggc <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> Oligonukleotyd mutagenny dla Białka c <400> 16 gccaaggaaa ttttcgaaaa tgtggatgac acactg <210> 17 <211> 45 <212> PRT <213> Bos taurus <220> ' <221> MOD_RES <222> ¢0)...(0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 17

Ala

Asn

Lys

Gly

Phe

Leu

Xaa

Val

Arg

Lys

Gly

Asn

Leu

Xaa

1

5

10

15

Arg

Xaa

Cys

Leu

Xaa

Pro

Cys

Ser

Arg

Xaa

Ala

Phe

Xaa

20

25

30

Ala

Leu

Xaa

Ser

Leu

Ser

Ala

Thr

Asp

Ala

Phe

Trp

Ala

Lys

Tyr

35

40

45

<210> 18 <2U> 44 <212> PRT <213> Bos taurus <220>

<221> MOD_RES <222> ¢0)...(0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 18

Ala

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Val

Lys

Gin

Gly

Asn

Leu

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Leu

Xaa

Ala

Cys

Ser

Leu

Xaa

Ala

Arg

Xaa

Val

20

25

30

Phe

Xaa

Asp

Ala

Xaa

Gin

Thr

Asp

Xaa

Phe

Trp

Ser

Lys

Tyr

35

40

<210> 19

PL 194 194 B1 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 19

Ala

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

His

Ser

Leu

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Ile

Xaa

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa

Ala

Lys

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Glu

Asp

Val

Asp

Thr

Leu

Ala

Phe

Trp

Ser

Lys

His

35

40

<210> 20 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> ¢0)...(0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 20

Ala

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

Gin

Ser

Leu

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Ile

Xaa

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa

Ala

Lys

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Glu

Asp

Val

Asp

Thr

Leu

Ala

Phe

Trp

Ser

Lys

His

35

40

<210> 21 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0) .,. (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 21

Ala

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

Glu

Ser

Leu

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Ile

Xaa

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa

Ala

Lys

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Glu

Asp

Val

Asp

Thr

Leu

Ala

Phe

Trp

Ser

Lys

His

PL 194 194 B1

40 <210> 22 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0) ... (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 22

Ala

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

Asp

Ser

Leu

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Ile

Xaa

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa

Ala

Lys

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Glu

Asp

Val

Asp

Thr

Leu

Ala

Phe

Trp

Ser

Lys

His

35

40

<210> 23 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0) . .. (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 23

Ala Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

His

Gly

Asn

Val

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Ser

Xaa

Val

Cys

Xaa

Phe

Xaa

Ala

Arg

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Gin

Asn

Thr

Xaa

Asp

Thr

Met

Ala

Phe

Trp

Ser

Phe

Tyr

40 <210> 24 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0)... (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 24

Ala

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu Arg

Gin

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Ile

Xaa

Ile

Cys

Asp Phe

Xaa

Ala

Lys

Xaa

Ile

PL 194 194 B1

25 30

Phe Glu Asp Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His

40 <210> 25 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 25

Ala 1

Asn

Ser

Phe

Leu Xaa Xaa 5

Leu

Arg

His 10

Ser

Leu Xaa

Arg 15

Xaa

Cys

Ile

Xaa

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa

Ala

Phe

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Glu

Asp

Val

Asp

Thr

Leu

Ala

Phe

Trp

Ser

Lys

His

40 <210> 26 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0) ... (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 26

Ala 1

Asn

Ala

Phe

Leu 5

Xaa

Leu

Arg

Glu 10

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg 15

Xaa

Cys

Lys

Xaa

Xaa 20

Gin

Cys

Ser

Phe

Xaa 25

Xaa

Ala

Arg

Xaa

Ile 30

Phe

Lys

Asp

Ala

Xaa 35

Arg

Thr

Lys

Leu

Phe 40

Trp

Ile

Ser

Tyr

<210> 27 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0).. . (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 27

Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Asp Gly Ser Leu Xaa Arg 15 10 15

PL 194 194 B1

Xaa Cys Lys Xaa Xaa Gin Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile 20 25 30

Phe Lys Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr 35 40 <210> 28 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0) . . . (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 28

Ala

Asn

Ala

Phe

Leu Xaa

Xaa

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Lys

Xaa

Xaa Gin

Cys

Ser

Phe

Xaa

Ala

Phe

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Lys

Asp

Ala

Xaa Arg

Thr

Lys

Leu

Phe

Trp

Ile

Ser

Tyr

35

40

<210> 29 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 29

Ala 1

Asn

Ala

Phe

Leu 5

Xaa Xaa

Leu

Arg

Pro 10

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arcj 15^

Xaa

Cys

Lys

Xaa

Gin

Cys

Ser

Phe

Xaa

Ala

Arg

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Asp

Ala

Xaa

Arg

Thr

Lys

Leu

Phe

Trp

Ile

Ser

Tyr

35

40

<210> 30 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0) ... (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 30

PL 194 194 B1

Ala

Asn

Ala

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

Gin

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Lys

Xaa

Gin

Cys

Ser

Phe

Xaa

Ala

Arg

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Glu

Asp

Ala

Xaa

Arg

Thr

Lys

Leu

Phe

Trp

Ile

Ser

Tyr

40 <210> 31 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0).- - (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 31

Tyr

Asn

Ser

Gly

Lys

Leu

Xaa

Phe

Val

Asp

Gly

Asn

Leu

Xaa

1

5

10

15

Arg

Xaa

Cys

Met

Xaa

Lys

Cys

Ser

Phe

Xaa

Ala

Arg

Xaa

20

25

30

Val

Phe

Xaa

Asn

Thr

Xaa

Arg

Thr

Xaa

Phe

Trp

Lys

Gin

Tyr

35

40

45

<210> 32 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0)... (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 32

Tyr

Asn

Ser

Gly

Lys

Leu

Xaa

Phe

Val

Glu

Gly

Asn

Leu

Xaa

1

5

10

15

Arg

Xaa

Cys

Met

Xaa

Lys

Gys

Ser

Phe

Xaa

Ala

Arg

Xaa

20

25

30

Val

Phe

Xaa

Asn

Thr

Xaa

Arg

Thr

Xaa

Phe

Trp

Lys

Gin

Tyr

35

40

45

<210> 33 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD^RES <222> (0) ... (0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy

PL 194 194 B1 <400> 33

Tyr

Asn

Ser

Gly

Lys

Leu

Xaa

Phe

Val

Gin

Gly

Asn

Leu

Xaa

1

5

10

15

Arg

Xaa

Cys

Met

Xaa

Lys

Cys

Ser

Phe

Xaa

Ala

Phe

Xaa

20

25

30

Val

Phe

Xaa

Asn

Thr

Xaa

Arg

Thr

Xaa

Phe

Trp

Lys

Gin

Tyr

35

40

45

<210> 34 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0) . . .(0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 34

Tyr

Asn

Ser

Gly

Lys

Leu

Xaa

Phe

Val

Gin

Gly

Asn

Leu

Xaa

1

5

10

15

Δ rrr

V=> o

Pwo θ’j ij

Mdl· 14 0. O.

Łł

V o os

T wo u?

Pve u

Qdr

Phe

Xaa

A. la

Δ vn 4 44- >-J

Xaa

20

25

30

Val

Phe

Xaa

Asp

Thr

Xaa

Arg

Thr

Xaa

Phe

Trp

Lys

Gin

Tyr

35

40

45

<210> 35 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=kwas gamma karboksyglutaminowy lub kwas glutamino wy <400> 35

Ala

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

Glu

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Ile

Xaa

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa

Ala

Lys

Xaa

Ile

20

25

30

Phe

Glu

Asp

Val

Asp

Thr

Leu

Ala

Phe

Trp

Ser

Lys

His

35

40

Claims

1. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C, znamienny tym, że zawiera modyfikowaną domenę GLA obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID. NO:1, przy czym modyfikowana domena GLA obejmuje przynajmniej jedną substytucję aminokwasową, która to substytucja aminokwasowa występuje w pozycji wybranej z grupy składającej się z reszt 10, 11, 28 lub 33.

2. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C według zastrz. 1, znamienny tym, że przynajmniej jedna substytucja aminokwasowa dotyczy reszty 10.

3. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C według zastrz. 1, znamienny tym, że przynajmniej jedna substytucja aminokwasowa dotyczy reszty 11.

4. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C według zastrz. 1, znamienny tym, że przynajmniej jedna substytucja aminokwasowa dotyczy reszty 28.

5. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C według zastrz. 1, znamienny tym, że przynajmniej jedna substytucja aminokwasowa dotyczy reszty 33.

6. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C stanowi ludzkie rekombinowane białko C lub ludzkie rekombinowane aktywowane białko C.

7. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, przy czym polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C zawiera modyfikowaną domenę GLA obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID. NO:1 z przynajmniej jedną substytucją aminokwasową, i przy czym ta substytucja aminokwasowa występuje w pozycji wybranej z grupy składającej się z reszt 10, 11, 28 lub 33.

8. Zastosowanie polipeptydu białka C lub aktywowanego białka C do wytwarzania leku, przy czym polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C zawiera modyfikowaną domenę GLA obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID. NO:1 z przynajmniej jedną substytucją aminokwasową, i przy czym ta substytucja aminokwasowa występuje w pozycji wybranej z grupy składającej się z reszt 10, 11, 28 lub 33.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że lek przeznaczony jest do leczenia zakrzepicy u ssaka.

10. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że lek przeznaczony do zmniejszania tworzenia skrzepu u ssaka.

11. Zastosowanie według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że lek przeznaczony do podawania pozajelitowego pacjentowi będącemu człowiekiem.

12. Sposób wytwarzania polipeptydu białka C lub aktywowanego białka C określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etapy w których transfekuje się ssacze komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierającym kwas nukleinowy kodujący polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C określony w zastrz. 1, hoduje się te komórki w warunkach pozwalających na ekspresję polipeptydu białka C lub aktywowanego białka C i oczyszcza się polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C ze ssaczych komórek gospodarza.

13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako ssaczą komórkę gospodarza stosuje się ludzką komórkę nerki 293 transfekowaną adenowirusem.

14. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C, znamienny tym, że zawiera modyfikowaną domenę GLA obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID. NO:1, przy czym modyfikowana domena GLA obejmuje trzy substytucje aminokwasowe, które to substytucje aminokwasowe występują w pozycjach wybranych z grupy składającej się z reszt 10, 11, 28, 32 i 33.

15. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C według zastrz. 14, znamienny tym, że trzy substytucje aminokwasowe dotyczą reszt 11, 32 i 33.

16. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C według zastrz. 15, znamienny tym, że resztę 32 stanowi kwas glutaminowy.

17. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C według zastrz. 15, znamienny tym, że resztę 33 stanowi kwas asparaginowy.

18. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C według zastrz. 15, znamienny tym, że resztę 32 stanowi kwas glutaminowy a resztę 33 stanowi kwas asparaginowy.

19. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C według zastrz. 18, znamienny tym, że resztę 11 stanowi glicyna.

PL 194 194 B1

20. Polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C według zastrz. 14 albo 15, albo 16, albo 17, albo 18, znamienny tym, że polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C stanowi ludzkie rekombinowane białko C lub ludzkie rekombinowane aktywowane białko C.

21. Sposób wytwarzania polipeptydu białka C lub aktywowanego białka C określonego w zastrz. 14, znamienny tym, że obejmuje etapy w których transfekuje się ssacze komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierającym kwas nukleinowy kodujący polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C określony w zastrz. 14, hoduje się te komórki w warunkach pozwalających na ekspresję polipeptydu białka C lub aktywowanego białka C i oczyszcza się polipeptyd białka C lub aktywowanego białka C ze ssaczych komórek gospodarza.

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że jako ssaczą komórkę gospodarza stosuje się ludzką komórkę nerki 293 transfekowaną adenowirusem.