HRP20000234A2 - Modified vitamin k-dependent polypeptides - Google Patents

Modified vitamin k-dependent polypeptides Download PDF

Info

Publication number
HRP20000234A2
HRP20000234A2 HR20000234A HRP20000234A HRP20000234A2 HR P20000234 A2 HRP20000234 A2 HR P20000234A2 HR 20000234 A HR20000234 A HR 20000234A HR P20000234 A HRP20000234 A HR P20000234A HR P20000234 A2 HRP20000234 A2 HR P20000234A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
amino acid
polypeptide
vitamin
protein
factor
Prior art date
Application number
HR20000234A
Other languages
English (en)
Inventor
Gary L Nelsestuen
Original Assignee
Univ Minnesota
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Minnesota filed Critical Univ Minnesota
Publication of HRP20000234A2 publication Critical patent/HRP20000234A2/hr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Pozadina izuma
Proteini ovisni o vitaminu K sadrže 9 do 13 gama-karboksiglutaminskih kiselina (Gla) u 45 aminoterminalnih aminokiselina. Gla jedinke proizvode enzimi u jetri koji koriste vitamin K za karboksiliranje pokrajnjih lanaca glutaminske kiseline u prekursorima proteina. Proteini ovisni o vitaminu K sudjeluju u više bioloških procesa od kojih je najbolje opisana koagulacija krvi (pregled u Furie, B. and Furie, C., 1988, Cell, 53:505-508). Proteini ovisni o vitaminu K uključuju protein Z, protein S, protrombin, faktor X, faktor IX, protein C, faktor VII i Gas6. Ovaj posljednji protein djeluje u regulaciji rasta stanice. Matsubara etal., 1996, Dev. Biol.. 180:499-450. Gla aminokiseline su potrebne za ispravno vezanje kalcija i interakcije s membranom kod ovih proteina. Smatra se da se mjesto za kontakt s membranom faktoraX nalazi među aminokiselinama 1-37. Uvans i Nelsestuteg 1996, Protein Science, 5:suppl. 1, 163 Abs. lako područja plazma proteina koja sadrže Gla pokazuju visok stupanj homologije sekvence, imaju najmanje 1000-struki raspon membranskog afiniteta. McDonakU. F. etaL 1997. Biochemistrv, 36:5120-5137.
Faktor VII djeluje u početnom stupnju grušanja krvi i možda je ključni element u stvaranju krvnih ugrušaka. Neaktivni prekursor. ili zimogen, ima nisku enzimsku aktivnost koja se značajno povisuje proteolitičkim cijepanjem kako bi nastao faktor VIa. Ovo aktiviranje može se katalizirati faktorom Xa kao i VIIa tkivnim faktorom, integralnim membranskim proteinom koji se može naći u mnogim tipovima stanica. Fiore. M. M. etal., 1994, J. Biol. Chem.. 269:143-149. Aktiviranje pomoću tkivnog VIIa faktora naziva se autoaktiviranje. Uključeno je u aktiviranje (stvaranje faktora VIIa iz faktora VII) kao aktivnost faktora VIIa koja slijedi. Najvažniji put za aktiviranje in vivo nije poznat. Faktor VIIa može aktivirati faktore zgrušavanja krvi IX i X.
Tkivni faktor dolazi do ekspresije pri visokim količinama na površini nekih tumorskih stanica. Moguća je uloga tkivnog faktora i faktora VIIa u razvoju tumora i invaziji u tkiva. Vrana, J. A. et al., Cancer Res., 56:5063-5070. Stanična ekspresija i djelovanje tkivnog faktora je također glavni faktor u toksičnoj reakciji na endotoksični šok. Dackiv, A. AA. et al., 1996, Arch. Surg.. 131: 1273-1278.
Protein C aktivira se trombinom u prisutnosti trombomodulina, integralnog membranskog proteina endotelijalnih stanica. Esmon, N.L et aL 1982, J. Biol. Chem., 257: 859-864. Aktivirani protein C (APC) degradira faktore Va i VIIIa u kombinaciji sa svojim kofaktorom, proteinom S. Rezistencija na APC je najuobičajenija forma tromboznog oboljenja. Dahlback, B., 1995, Blood. 85:607-614. Inhibitori vitamina K uobičajeno se daju kao profilaksa za trombozna oboljenja.
Proteini ovisni o vitaminu K koriste se za liječenje nekih tipova hemofilije. Hemofiliju A karakterizira odsutnost aktivnog faktora VIII, faktora VIIIa, ili prisutnost inhibitora za faktor VIII. Hemofiliju B karakterizira odsutnost aktivnog faktora IX, faktora IXa. Manjak faktora VII, iako rijedak, dobro reagira na davanje faktoraVII. Bauer, K., A., 1996, Haemostasis, 26:155-158., suppl. 1. Terapija nadomještanja faktora VIII je ograničena uslijed razvoja visoko titarskih inhibitorskih antiitjela faktora VIII kod nekih pacijenata, Alternativno, faktor VIIa se može upotrijebiti za liječenje hemofilije A i B. Faktor IXa i faktor VIIIa aktiviraju faktor X. Faktor VIIa eliminira potrebu za faktorima IX i VIII aktiviranjem faktora X direktno i može savladati probleme manjka faktora IX i VIII uz malo imunoloških posljedica. Hedneretal., 1993, Transfus. Medi. Rev.. 7: 78-83; Nicolaisen, E. M. et al., 1996, Thromb. Haemost, 76: 200-204. Efektivne razine davanja faktora VIIa su često visoke (45 do 90 pg/kg tjelesne težine) i može biti potrebno da se davanje ponavlja svakih nekoliko sati. Shuimav, S. et al., 1996, Thromb. Haemost, 75: 432-436.
Nađeno je da je topljivi oblik tkivnog faktora (topljivi tkivni faktor ili sTF) koji nema područje za kontakt sa membranom efikasan u liječenju hemofolije kada se daje zajedno sa faktorom VIIa. U. S. Patent No. 5, 504, 064. Kod pasa je pokazano da sTF smanjuje količinu faktora VIIa potrebnu za liječenje hemofilije. Asocijacija membrane sa sTF-VIIa potpuno je ovisna o kontaktnom mjestu za membranu na faktoru VIIa. Ovo je suprotno normalnom kompleksu tkivni faktor - faktor VIIa koji se veže na membranu preko tkivnog faktora i faktora VII(a).
Sažetak izuma
Otkriveno je da modifikacije unutar y-karboksiglutaminske kiselinske (Gla) domene polipeptida ovisnih o vitaminu K pojačavaju njihove afinitete za vezanje na membranu. Polipeptidi ovisni o vitaminu K modificirani na ovaj način imaju pojačanu aktivnost i mogu se koristiti kao antikoagulanti, prokoagulanti ili za druge funkcije koje koriste proteine ovisne o vitaminu K. Na primjer, poboljšana molekula faktora VII može pružiti nekoliko prednosti snižavanjem potrebnog doziranja VIIa, relativne frekvencije davanja i/ili omogućavanjem kvalitativnih promjena koje dozvoljavaju efektivnije liječenje stanja deficijencije.
Izum prikazuje polipeptide ovisne o vitaminu K koji uključuju modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja polipeptida na membranu relativno u odnosu na odgovarajuće nativne polipeptide ovisne o vitaminu K. Modificirana GLA domena je od oko aminokisline 1 do oko aminokiseline 45 i uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline. Na primjer, supstitucija aminokiseline može biti na aminokiselini 11, 12, 29, 33 ili 34. Prednost ima supstitucija na aminokiselini 1, 33 ili 34. Modificirana GLA domena može uključiti redoslijed aminokiselina koji u stanju zasićenom kalcijem stvara tercijarnu strukturu koja ima kationsku jezgru s oblakom elektronegativnog naboja.
Polipeptidi ovisni o vitaminu K mogu biti, na primjer, protein C, aktivirani protein C, faktor IX, faktor IXa, faktor VII. faktor VIIa ili faktor VIIa s modificiranim aktivnim mjestom. Modificirana GLA domena proteina C ili aktiviranog proteina C može uključivati glutaminski kiselinski ostatak na mjestu aminokiseline 33 i aspartanski kiselinski ostatak na mjestu aminokiseline 34 (SEQ ID N0:19). Modificirana GLA domena proteina C ili aktiviranog proteina C može, također, uključivati glutamin ili glutaminsku kiselinu na mjestu aminokiseline 11 (SEQ ID N0:20 i SEQ ID N0: 21, redom). Dodatno, glicin se može supstituirati na mjestu aminokiseline 12 na GLA domeni proteina C ili aktiviranog proteina C (SEQ ID N0: 24 ili SEQ ID N0: 35). Modificirana GLA domena faktora VII, faktora VIIa i faktora VIIa s modificiranim aktivnim mjestom može imati supstituciju na mjestu aminokiselina 11 i 33. Na primjer, glutamin na mjestu aminokiseline 11 i glutaminska kiselina na mjestu aminokiseline 33 (SEQ ID N0: 30) mogu bit supstituirane.
Izum također prikazuje izoliranu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid ovisan o vitaminu K. Kako se ovdje upotrebljava, izraz izoliran (pročišćen) odnosi se na redoslijed koji odgovara dijelu ili cijelom genu koji kodira polipeptid ovisan o vitaminu K, ali bez sekvenci koje obično opasuju jednu ili obadvije strane genoma sisavca. Polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modifidranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membrane relativno u odnosu na odgovarajući polazni polipeptid ovisan o vitaminu K. Modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
Izum također prikazuje stanicu domaćina kod sisavca koja uključuje vektor nukleinskih kiselina koji kodira polipeptid ovisan o vitaminu K. Polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K. Modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline na, na primjer, mjestu aminokiseline 11, 12, 29, 33 ili 34. Polipeptid ovisano vitaminu K može, na primjer, biti faktor VII ili faktor VIIa i uključuje supstituciju aminokiseline na mjestu 11 i aminokiseline na mjestu 33. Na primjer, supstitucija aminokiseline može uključivati glutamin na mjestu aminokiseline 11 i glutaminsku kiselinu na mjestu aminokiseline 33(SEQ ID N0:30).
Izum također prikazuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač i količinu polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivnu da inhibira formiranje ugrušaka kod sisavca. Polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući polazni polipeptid ovisan o vitaminu K. Modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline. Polipeptid ovisan o vitaminu K može, na primjer, biti protein C, aktivirani protein C ili faktor VIIa modificiran na aktivnom mjestu. Protein C ili aktivirani protein C može, na primjer, uključivati glutaminsku kiselinu na mjestu aminokiseline 33 i apartansku kiselinu na mjestu aminokiseline 34 (SEQ ID N0: 19). Protein C ili aktivirani protein C može, dalje, uključivati glutamin na mjestu aminokiseline 11 (SEQ ID N0:20) ili glutaminsku kiselinu na mjestu aminokiseline 11 (SEQ ID N0: 21). Supstitucija aminokiseline može također uključivati glicin na mjestu aminokiseline 12 (SEQ ID N0: 24 ili SEQ ID N0: 35). Faktor VIIa s modificiranim aktivnim mjestom može uključivati, na primjer, glutamin na mjestu aminokiseline 11 i glutaminsku kiselinu na mjestu aminokiseline 33 (SEQ ID N0: 30).
Izum također prikazuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač i količinu polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivnu da poveća formiranje ugrušaka kod sisavaca. Polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući polazni polipeptid ovisan o vitaminu K. Modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline. Polipeptid ovisan o vitaminu K može, na primjer, biti faktor VII, faktor VIIa, faktor IX ili faktor IXa. Farmaceutska kompozicija može također uključivati topljivi tkivni faktor. Faktor VII ili faktor VIIa može uključivati supstituciju aminokiseline na mjestu 11 i aminokiseline na mjestu 33. Na primjer, glutamin može biti supstituiran na mjestu aminokiseline 11 i glutaminska kiselina može biti supstituirana na mjestu aminokiseline 33 (SEQ ID N0: 30).
Opisan je također polipeptid ovisan o vitaminu K za upotrebu u liječenju poremećaja zgrušavanja. Polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući izvorni polipeptid ovisan o vitaminu K. Modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline. Polipeptid ovisan o vitaminu K može, na primjer, biti protein C, aktivirani protein C, faktor VII, faktor VIIa i faktor VIIa s modificiranim aktivnim mjestom kao što je gore opisano.
Izum također prikazuje upotrebu polipeptida ovisnog o vitaminu K u proizvodnji medikamenta za liječenje poremećaja zgrušavanja. Polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući polazni polipeptid ovisan o vitaminu K. Modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline. Polipeptid ovisan o vitaminu K može, na primjer, biti protein C, aktivirani protein C, faktor VII, faktor VIIa, faktor VIIa s modificiranim aktivnim mjestom, faktor IX i faktor IXa kao što je gore opisano.
Također je opisana metoda za smanjivanje formiranja ugrušaka kod sisavca. Metoda uključuje davanje količine polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivne za smanjivanje formiranja ugruška kod sisavca. Polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući polazni polipeptid ovisano vitaminu K. Modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline. Polipeptid ovisan o vitaminu K može, na primjer, biti protein C, aktivirani protein C ili faktor VIIa s modificiranim aktivnim mjestom. Protein C ili aktivirani protein C može uključivati glutaminsku kiselinu na mjestu aminokiseline 33 i aspartansku kiselinu na mjestu aminokiseline 34 (SEQ ID N0:19). Dalje može biti supstituiran glutamin ili glutaminska kiselina proteina C ili aktiviranog proteina C (SEQ ID N0:20 ili SEQ ID N0:21). Dalje, glicin se može supstituirati na mjestu aminokiseline 12 na GLA domeni proteina C ili aktiviranog proteina C (SEQ ID N0: 24 ili SEQ ID N0: 35). Faktor VIIa s modificiranim aktivnim mjestom može uključivati glutamin na mjestu aminokiseline 11 i glutaminsku kiselinu na mjestu aminokiseline 33 (SEQ ID N0: 30).
Izum dalje prikazuje metodu za ubrzavanje formiranja ugrušaka kod sisavca. Metoda uključuje davanje količine polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivne da ubrza formiranje ugrušaka kod sisavaca. Polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K. Modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline. Polipeptid ovisan o vitaminu K može, na primjer, biti faktor VII, faktor VIIa, faktor IX ili faktor IXa. Faktor VII ili faktor VIIa može uključivati supstituciju aminokiseline na mjestu 11 i aminokiseline na mjestu 33. Na primjer, glutamin može biti supstituiran na mjestu aminokiseline 11 i glutaminska kiselina može biti supstituirana na mjestu aminokiseline 33 (SEQ ID N0:30).
Ako nije drukčije definirano, svi ovdje upotrijebljeni tehnički i znanstveni termini imaju isto značenje kao što se uobičajeno podrazumijeva kod stručnjaka u području kojem pripada ovaj izum. lako se metode i materijali slični ili ekvivalentni onima ovdje opisanim mogu upotrebljavati u primJeni izuma, dolje su opisani prikladni postupci i materijali. Sve publikacije, primjene patenta, patenti i druge reference ovdje spomenute, uključeni su u potpunosti prilikom spominjanja. U slučaju neslaganja, ova specifikacija, uključujući definicije, će određivati. Dodatno, materijali, postupci i primjeri su ilustrativni i nisu mišljeni da budu ograničavajući.
Drugi prikazi i prednosti bit će vidljivi iz detaljnog opisa koji slijedi kao i iz zahtjeva.
Kratak opis crteža
Redoslijed aminokiselina GLA domene divljeg tipa VIIa i VIIQ11E33 nalaze se u SEQ ID N0: 3 i SEQ ID N0: 30, istim redom. Redoslijed aminokiselina GLA domene goveđeg faktora X, goveđeg proteina C, humanog proteina C i goveđeg proteina C-H11 nalaze se u SEQ ID N0:18. SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:1 ili SEQ ID N0:23, istim redom.
Redoslijed aminokiselina GLA domene proteina C VQ33E, N34D nalaze se uSEQ ID N0: 19.
Slika 1 prikazuje vezanje, sa standardnim devijacijama, divljeg tipa VIIa (prazni krugovi), VIIQ11E33 (ispunjeni krugovi) i goveđeg faktora X (ispunjeni trokuti) na membrane.
Slika 2 prikazuje autoaktivaciju VIIQ11E33. Crtkana linija pokazuje aktivnost u odsutnosti fosfolipida.
Slika 3 prikazuje aktivaciju faktora X faktorom VIIa. Rezultati za divlji tip faktora VIIa (prazni krugovi) i VIIaQ11E33 (ispunjeni krugovi) dani su za koncentraciju 0.06 nM.
Slika 4 prikazuje koagulaciju humane plazme djelovanjem VIIa i VIIaQ11E33 s topljivim tkivnim faktorom.
Slika 5 prikazuje koagulaciju plazme djelovanjem faktor VII zimogena i normalnog tkivnog faktora.
Slika 6 prikazuje inhibiranje nastajanja ugruška djelovanjem faktora-VIIaQ11E33 s aktivnim mjestom (DEGR-VIIaQ11E33).
Slika 7 prikazuje cirkulatorno vrijeme faktora VIIQ11E33 kod štakora.
Slika 8 prikazuje interakciju s membranom kod normalnih i modificiranih proteina. Tabla A pokazuje interakciju divljeg tipa goveđeg proteina C (prazni krugovi) i goveđeg proteina C-H11 (ispunjeni krugovi) s mjehurićima. Tabla B pokazuje interakciju divljeg tipa goveđeg proteina C (prazni krugovi) i goveđeg proteina C-H11 (ispunjeni krugovi) s membranama. U oba slučaja, isprekidana linija označava rezultat kada bi sav dodani protein bio vezan na membranu.
Slika 9 prikazuje utjecaj aktiviranog proteina C na vrijeme zgrušavanja. Na tabli A, prikazane su srednja i standardna devijacija za tri određivanja vremena zgrušavanja za goveđu plazmu kod divljeg tipa goveđeg APC (prazni krugovi) i kod bAPC-HH (ispunjeni krugovi). Na tabli B prikazane su srednja i standardna devijacija za tri ponavljanja zgrušavanja humane plazme kod divljeg tipa humanog (prazni krugovi) i kod humanog APC-H11 (ispunjeni krugovi).
Slika 10 prikazuje inaktiviranje faktora Va djelovanjem goveđeg i humanog APC. Tabla A pokazuje inaktiviranje faktora Va djelovanjem divljeg tipa goveđeg APC (prazni krugovi) i goveđeg APC-H11 (ispunjeni krugovi). Tabla B pokazuje inaktiviranje faktora Va u plazmi deficijentnoj proteinom S djelovanjem divljeg tipa humanog APC (prazni krugovi) i humanog APC-H11 (ispunjeni krugovi).
Slika 11 prikazuje elektrostatsku distribuciju proteina Z. Vertikalne linije označavaju elektropozitivna područja a horizontalne linije označavaju elektronegativna područja.
Slika 12 prikazuje vezanje na membranu i aktivnost različitih proteina C. Tabla A pokazuje vezanje na membranu divljeg tipa proteina C (prazni krugovi), P11H mutanta proteina C (ispunjeni kvadrati), Q33E,N34D mutanta (ispunjeni krugovi) i goveđeg protrombina (prazni kvadati). Tabla 2 pokazuje inhibiranje koagulacije krvi djelovanjem ovih mutanata. Tabla C pokazuje inaktiviranje faktora Va.
Slika 13 uspoređuje vezanje na membranu i aktivnost mutanata humanog proteina C. Tabla A uspoređuje vezanje na membranu kod korištenja divljeg tipa (prazni krugovi), E33 (prazni trokuti) i E33D34 (ispunjeni krugovi).Tabla B uspoređuje vrijeme koagulacije kod korištenja divljeg tipa (prazni trokuti), E33 (prazni krugovi) i E33D34 (ispunjeni krugovi).
Slika 14 uspoređuje vezanje na membranu (tabla A) i inhibiranje koagulacije (tabla B) s korištenjem divljeg tipa (prazni kvadrati), H11 (ispunjeni krugovi), E33D34 (prazni trokuti) i trostrukog mutanta H11E33D34 (prazni krugovi) goveđeg proteina C.
Slika 15 prikazuje svojstva interakcije s membranom različitih proteina ovisnih o vitaminu K. Tabla A uspoređuje inerakciju s membranom humanog (ispunjeni krugovi) i goveđeg (prazni krugovi) faktora X. Tabla B pokazuje interakcije s membranom normalnog goveđeg protrombinskog fragmenta 1 (prazni krugovi), fragmenta 1 modificiranog s TNBS bez prisutnosti kalcija (ispunjeni krugovi) i fragmenta 1 modificiranog TNBSom uz 25 mM kalcija (ispunjeni kvadrati). Tabla C prikazuje brzinu vezanja proteina Z na mjehuriće kod pH 9 (ispunjeni krugovi) i 7,5 (prazni krugovi).
Detaljni opis
U jednom aspektu, izum predstavlja polipeptid ovisan o vitaminu K uključivši modificirani GLA domenu s pojačanim afinitetom vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući polazni polipeptid ovisan o vitaminu K. Polipeptidi ovisni o vitaminu K su grupa proteina koji koriste vitamin K u svom biosintetskom putu da karboksiliraju pokrajnje lance glutaminske kiseline u prekursorima proteina. GLA domena sadrži 9-13 y-karboksiglutaminske kiseline u N-terminalnom području polipeptida, tipično od aminokiseline 1 do oko aminokiseline 45. Protein Z, protein S, faktor X, faktor II (protrombin), faktor IX, protein C, faktor VII and Gas6 su primjeri polipeptida ovisnih o vitaminu K. Položaji aminokiselina na polipeptidima o kojima se ovdje govori numerirani su prema faktoru IX. Protein S, protein C, faktor X, faktor VII i humani protrombin svi imaju jednu aminokiselinu manje (položaj 4) i moraju se prema tome prilagoditi. Na primjer, stvarni položaj 10 goveđeg proteina C je prolin, ali se ovdje numerira kao aminokiselina 11 za lakše uspoređivanje u cjelini. Kao što se ovdje upotrebljava, izraz "polipeptid" je bilo koji lanac aminokiselina, bez obzira na duljinu ili post-translacijske modifikaciuje. Ovdje su aminokiseline označavane standardnim kraticama s tri slova i jednim slovom.
Modifikacije GLA domene uključuju najmanje jednu supstituciju aminokiseline. Supstitucije mogu biti konzervativne i nekonzervativne. Konzervativne supstitucije aminokiselina zamijene aminokiselinu s aminokiselinom iste klase, dok nekonzervativne supstitucije aminokiseline zamijene aminokiselinu s aminokiselinom drugačije klase. Nekonzervativne supstitucije mogu dovesti do značajne promjene u hidrofobnosti polipeptida ili u temeljnom dijelu pokrajnjeg lanca. Dodatno, nekonzervativne supstitucije mogu napraviti značajne promjene u naboju polipeptida kao što je smanjivanje elektropozitivnih ili uvođenje elektronegativnih naboja. Primjeri nekonzervativnih supstitucija uključuju bazičnu aminokiselinu umjesto nepolarne aminokiseline ili polarnu aminokiselinu umjesto kisele aminokiseline. Supstitucija aminokiseline može biti na aminokiselini 11, 12,29, 33 ili 34. Prednost ima supstitucija aminokiseline na aminokiselini 11, 33 ili 34. Modificirana GLA domena može uključiti redoslijed aminokiselina koji u stanju zasićenom kalcijem doprinosi stvaranju tercijarne strukture koja ima kationsku jezgru s oblakom elektronegativnog naboja. Bez ograničavanja određenom teorijom, pojačani afinitet za membranu može nastati uslijed određenog elektrostatskog uzorka koji se sastoji od elektropozitivne jezgre potpuno okružene elektronegativnom površinom.
Mnogi polipeptidi ovisni o vitaminu K su supstrati za enzime vezane za membranu. S obzirom da polipeptidi ovisni o vitaminu K ne pokazuju maksimalni potencijalni afinitet GLA domene za vezanje na membranu, svi moraju sadržavati aminokiseline čija je svrha da smanje afinitet za vezanje. Kao posljedica, mnogi polipeptidi ovisni o vitaminu K sadrže aminokiseline koje nisu optimalne sa stanovišta maksimalnog afiniteta. Ove aminokiseline efikasno ometaju mjesto vezanja da omoguće bržu izmjenu za enzimsku reakciju.
Smanjen afinitet za membranu može imati nekoliko svrha. Velik afinitet prati polagana izmjena što može ograničiti brzine reakcije. Na primjer, kada se enzim protrombinaza slaže na membranama s visokim afinitetom za supstrate, izmjena proteina iz membrane, a ne enzimska kataliza, je ograničavajući faktor. Lu, Y. i Nelsestuen, G. L, 1996, Biochemistrv. 35: 8201 -8209. Alternativno. prilagođavanje afiniteta membrane supstituiranjem neoptimalnih aminokiselina može izbalansirati kompetitivne procese prokoagulacije (faktor X, IX, VII i protrombin) i aantikoagulacije (protein C, S). lako afiniteti membrane izvornih proteina mogu biti optimalni za normalna stanja, povećanje afiniteta membrane može proizvesti proteine koji su korisni za in vitro proučavanje kao i poboljšanu terapiju za reguliranje zgrušavanja krvi kod patoloških stanja in vivo.
Različiti primjeri polipeptida ovisnih o vitaminu K s modifidranom GLA domenom opisani su dolje.
Polipeptidi ovisni o vitaminu K mogu biti protein C ili aktivirani protein C (APC). Redoslijedi aminokiselina GLA domene u divljem tipu humanog (hC) i goveđeg (bC) proteina C prikazani su u tablici 1. X je Gla ili Glu aminokiselina. Općenito, protein s neutralnim (npr. Q) ili anionskim (npr. D, E) aminokiselinama na položajima 11, 13, 33 i 34 imat će veći afinitet za membranu.
TABLICA 1
hC:
ANS-FLXXLRH11SSLXRXCIXX21ICDFXXAKXI31FQNVDDTLAF41WSKH (SEQ ID N0:1)
bC:
ANS-FLXXLRP11GNVXRXCSXX21VCXFXXARXI31FQNTXDTMAF41WSFY (SEQ ID N0:2)
Modificirana GLA domena proteina C ili APC može uključivati, na primjer, glutaminsku kiselinu na položaju aminokiseline 33 i aspartansku kiselinu na položaju aminokiseline 34 (SEQ ID N0:19). Glutaminska kiselina na položaju 33 može se dalje modificirati u y-karboksiglutaminsku kiselinu in vivo. Za optimalnu aktivnost, modificirana GLA domena može uključivati dodatnu supstituciju na aminokiselini 11. Na primjer, glutamin može biti supstituiran na mjestu aminokiseline 11 (SEQ ID N0:20) ili alternativno, glutaminska kiselina ili aspartanska kiselina (SEQ ID N0:21 i SEQ ID N0:22, redom) mogu biti supstituirane. Histidin može biti supstituiran na mjestu aminokiseline 11 u goveđem proteinu (SEQ ID N0:23). Dalja modifikacija može ukjučivati na mjestu aminokiseline 12 supstituciju glicina za serin (SEQ ID N0:24 i SEQ ID N0:35). Zamjena aminokiseline 29 femilalaninom, aminokiselinom koja se nalazi u protrombinu, je još Jedna korisna modifikacija (SEQ ID N0:25). Modificirani protein C s povećanim afinitetom za vezanje na membranu može se upotrijebiti umjesto drugih antikoagulanata za davanje injekcijom kao što je heparin. Heparin se tipično upotrebljava u većini tipova operacija, ali ima nizak omjer efikasnost / toksičnost. Dodatno, modificirani protein C s povećanim afiniteom za vezanje na membranu može se upotrijebiti umjesto oralnih antikoagulanata u porodici kumarina kao što je varfarin.
Ove modifikadje se također mogu provesti kod APC s modificiranim aktivnim mjestom. Aktivno mjesto na APC može se kemijski inaktivirati, na primjer s N-danzil-glutamilglicilarginilklormetilketonom (DEGR) ili mutagenezom aktivnog mjesta upravljanom mjestom. Sorensen, B. B. et aL 1997, J. Biol. Chem.. 272: 11863-11868. APC s modificiranim aktivnim mjestom djeluje kao inhibitor kompleksa protrombinaze. Povećani afinitet membrane APCa modificiranog na aktivnom mjestu može dovesti do terapeutski efektivnijeg polipeptida.
Polipeptid ovisan o vitaminu K može biti faktor VII ili aktivni oblik faktora VII, faktor VIIA. Izvorni ili oblik koji se javlja u prirodi polipeptida faktora VII ima nizak afinitet za membrane. Redoslijed aminokiselina GLA domene divljeg tipa humanog (hVII) i goveđeg (bVII) faktora VII prikazani su u tablici 2.
TABLICA 2
hVII: ANA-
FLXXLRP11GSLXRXCKXX21QCSFXXARXI31FKDAXRTKLF41WISY (SEQ ID N0:3)
bVII: ANG-
FLXXLRP11GSLXRXCRXX21LCSFXXAHXI31FRNXXRTRQP41WVSY (SEQ ID N0:4)
Modificirana GLA domena faktora VII ili faktora VIIa može uključivati, na primjer, glutaminsku kiselinu ili aspartansku kiselinu na položaju aminokiseline 11 (SEQ ID N0:26 i SEQ ID N0: 27, istim redom), fenilalanin na položaju aminokiseline 29 (SEQ ID N0; 28) ili aspartansku kiselinu na položaju aminokiseline 33 (SEQ ID N0: 29). Preferirano, GLA domena faktora VII ili faktora VIIa može uključivati, glutamin na položaju aminokiseline 11 i glutaminsku kiselinu na položaju aminokiseline 33 (SEQ ID N0: 30). Polipeptid ovisan o vitaminu K modificiran na taj način ima mnogo veći afinitet za membrane nego izvorni ili divlji tip polipeptida. Također ima mnogo veći aktivitet u autoaktivaciji, generaciji faktora Xa i u nekoliko proba zgrušavanja krvi. Aktivitet se naročito povećava kod rubnih uvjeta koagulacije, kao što su niske razine tkivnog faktora i/ili fosfolipida. Na primjer, modificirani faktor VII je oko 4 puta efektivniji u odnosu na izvorni VIIa pri optimalnim razinama tromboplastina, ali je oko 20-struko efektivan pri 1% optimalnih razina tromboplastina. Rubni prokoagulacijski signali su vjerojatno najviše dominantni in vivo. Sada raspoložive probe zgrušavanja koje koriste optimalne razine tromboplatina ne mogu detektirati razlike u vremenu zgrušavanja između normalne plazme i one od pacijenata s hemofilijom. Razlike u zgrušavanju između ovakvih uzoraka mogu se registrirati samo kada se u probama zgrušavanja koriste neoptimalne razine tromboplastina ili razrijeđeni tromboplastin.
Drugi primjer polipeptida ovisnog o vitaminu K Je faktor VIIa s modificiranim aktivnim mjestom. Aktivno mjesto faktora VIIa može se modificirati kemijski, na promjer, pomoću DEGR ili mutagenezom aktivnog mjesta upravljanom mjestom. Faktor VIIa modificiran pomoću DEGR je efektivan inhibitor koagulacije na nekoliko načina davanja. Arnljots, B. et al., 1997, J. Vasc. Surg., 25: 341 - 346. Modifikacije GLA domene mogu učiniti aktivno mjesto faktora VIIa efikasnijim uslijed većeg afiniteta za membranu. Modificirana GLA domena faktora VIIa s modificiranim aktivnim mjestom može uključivati, na primjer, glutamin na položaju aminokiseline 11 i glutaminsku kiselinu na položaju aminokiseline 33 (SEQ ID N0: 30).
Polipeptid ovisan o vitaminu K može također biti faktor IX ili aktivni oblik faktora IX, faktor IXa. Kao kod faktora VIIa s modificiranim aktivnim mjestom, faktor IXa i Xa s modificiranim aktivnim mjestom mogu biti inhibitori koagulacije. Redoslijed aminokiselina GLA domene divljeg tipa humanog (hIX) i goveđeg (bIX) faktora IX prikazani su u tablici 3. Na primjer, glutaminska kiselina ili aspartanska kiselina može biti supstituirana na položaju aminokiseline 11 (SEQ ID N0:31 i SEQ ID N0: 32, istim redom), fenilalanin na položaju aminokiseline 29 (SEQ ID N0: 33) ili aspartanska kiselina na položaju aminokiseline 34 (SEQ ID N0:34).
TABLICA 3
hIX:
YNSGKLXXFVQ11GNLXRXCMXX21KCSFXXARXV31FXNTXRTTXF41WKQY (SEQ ID N0:5)
bIX:
YNSGKLXXFVQ11GNLXRXCMXX21KCSFXXARXV31FXNTXKRTTXF41WKQ Y (SEQ ID N0:6)
U drugom aspektu, izum predstavlja stanicu domaćina sisavca uključujući polipeptid ovisan o vitaminu K s modificiranom GLA domenom koji pojačava afinitet vezanja polipeptida na membranu relativno u odnosu na odgovarajući izvorni polipeptid ovisan o vitaminu K. Modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline kako je gore raspravljeno. Stanica domaćin sisavca može, na promjer, uključivati modificirani faktor VII ili modifidrani faktor VIIa. Modificirana GLA domena modificiranog faktora VII ili modificiranog faktora VIIa može uključivati, na primjer. supstituciju na položaju aminokiseline 11 i na položaju aminokiseline 33. Prednost ima supstitucija aminokiseline koja uključuje glutamin na položaju aminokiseline 11 i glutaminsku kiselinu na položaju aminokiseline 33 (SEQ ID N0:30).
Prikladne stanice domaćina sisavca sposobne su da modificiraju glutamat polipeptida ovisnog o vitaminu K u v-karboksigluamat. Stanice sisavaca dobivene iz bubrega i jetre naročito su korisne kao stanice domaćini.
Izum također predstavlja farmaceutsku kompoziciju koja uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač i količinu polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivnu da inhibira formiranje ugruška kod sisavca. Polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modifidranu GLA domenu s najmanje jednom supstitucijom aminokiseline koja pojačava afinitet vezanja polipeptida na membranu u odnosu na odgovarajući izvorni polipeptid ovisan o vitaminu K. Korisni modificirani polipeptidi ovisni o vitaminu K farmaceutskih kompozicija mogu uključivati, bez ograničenja, protein C ili APC, APC s modificiranim aktivnim mjestom, faktor VIIa s modificiranim aktivnim mjestom, faktor IXa s modificiranim aktivnim mjestom i faktor Xa s modificiranim aktivnim mjestom kao što je gore razmatrano.
Koncentracija polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivnu da inhibira formiranje ugruška kod sisavca može varirati, ovisno o više faktora, uključujući i preferirano doziranje spoja koji se daje, kemijske karakteristike uključenih spojeva, formulaciji ekscipijenata spoja i načina davanja. Optimalna doza farmaceutske kompozicije koja se daje može također ovisiti o takvim varijablama kao što su općeniti zdravstveni status pojedinog pacijenta i relativna biološka efikasnost odabranog spoja. Ove farmaceutske kompozicije mogu se koristiti da se regulira koagulacija in vivo. Na primjer, kompozicije se općenito mogu koristiti za liječenje tromboze. Mijenjanjem samo nekoliko aminokiselina polipeptida kao što je gore opisano, općenito ne utječe na antigenost mutantnih polipeptida.
Polipeptidi ovisni o vitaminu K koji uključuju modificirane GLA domene mogu se formulirati u farmaceutske kompozicije miješanjem s farmaceutski prihvatljivim netoksičnim ekscipijentima ili nosačima. Takvi spojevi i kompozicije mogu se prirediti pareneralno davanje, naročito u obliku tekućih otopina ili suspenzija u vodenim fiziološkim puferskim otopinama; za oralno davanje, naročito u obliku tableta ili kapsula; ili za intranazalno davanje, naročito u obliku prašaka, kapljica za nos ili aerosola. Kompozicije za druge načine davanja mogu se prirediti, ako se želi, korištenjem standardnih metoda.
Formulacije za parenteralno davanje mogu sadržavati kao uobičajene ekscipijente sterilnu vodu ili slanu otopinu, polialkilen glikole kao polietilen glikol, ulja biljnog porijekla, hidrogenirane naftalene i slično. Osobito, biokompatibilni, biodegradabilni lactidni polimer, laktid/glikolid kopolimer ili polioksetilen - polioksipropilen kopolimeri su primjeri ekscipijenata za kontroliranje otpuštanja spoja izuma in vivo. Drugi prikladni parenteralni sistemi dostave uključuju etilen-vinil acetat kopolimer čestice. osmotske pumpe, implantabilne infuzijske sisteme i liposome. Formulacije za davanje inhalacijom mogu sadržavati ekscipijente kao što je laktoza, ako se želi. Inhalacijske formulacije mogu biti vodene otopine koje, na primjer, sadrže polioksietilen - 9 -lauril eter, glikokolat i deoksikolat ili mogu biti uljnate otopine za davanje u obliku kapljica za nos. Ako se želi, spojevi se mogu formulirati kao gel i davati intranazalno. Formulacije za parenteralno davanje mogu također uključivati glikokolate za bukalno davanje.
U alternativnoj izvedbi, izum također prikazuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač i količinu polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivnu da poveća formiranje ugruška kod sisavca. Polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modifidranu GLA domenu s najmanje jednom supstitucijom aminokiseline koja pojačava afinitet vezanja polipeptida na membranu u odnosu na odgovarajući izvorni polipeptid ovisan o vitaminu K. Ove farmaceutske kompozicije mogu biti korisne za liječenje poremećaja rušanja kao što je hemofilija A, hemofilija B i oboljenja jetre.
U ovoj izvedbi, korisni polipeptidi ovisni o vitaminu K farmaceutske kompozicije mogu uključivati, bez ograničenja, faktor VII ili aktivni oblik faktora VII, faktor VIIa. Modificirana GLA domena modificiranog faktora VII ili modificiranog faktora VIIa može uključivati, na primjer, supstituciju na položaju aminokiseline 11 i na položaju aminokiseline 33 (SEQ ID N0:30). Farmaceutska kompozicija može dalje sadržavati topljivi tkivni faktor. Faktor VII je naročito kritičan za koagulaciju krvi zbog svog položaja na inicijaciji kaskade grušanja i zbog sposobnosti da aktivira dva proteina, faktore IX l X. Direktno aktiviranje faktora X faktorom VIIa Je važno za moguće liječenje glavnih oblika hemofilije, tipova A l B, s obzirom da se koraci koji uključuju faktore IX i VII potpuno zaobilaze. Davanje faktora VII pacijentima pokazalo se kao efikasan način liječenja nekih oblika hemofilije. Poboljšanje afiniteta membrane faktora VII ili VIIa modificiranjem GLA domene stvara potencijal da se polipeptid učini više osjetljivim na mnoge uvjete koaguliranja, da se smanji potrebno doziranje VII/VIIa, da se povećaju intervalu u kojima se faktor VII/VIIa mora davati i da pruži dodatne kvalitativne promjene koje dovode do efikasnijeg liječenja. Sveukupno, poboljšanje membranskog mjesta kontakta faktora VII može ubrzati njegovu brzinu aktivacije kao i aktivitet faktora VUUa na faktor X ili IX. Ovi koraci mogu imati umnožavajući efekt na sveukupne brzine zgrušavanja krvi in vivo, što dovodi do veoma djelotvornog faktora VIIa za vrhunsko liječenje nekoliko poremećaja zgrušavanja krvi.
Drugi korisni polipeptidi ovisni o vitaminu K za pojačavanje stvaranja ugrušaka uključuju faktor IX i faktor IXa.
U drugom aspektu, opisani su postupci za smanjivanje formiranja ugrušaka kod sisavaca. Postupak uključuje davanje količine polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivne za smanjivanje formiranja ugruška kod sisavca. Polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući polazni polipeptid ovisan o vitaminu K. Modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline. Modifidrani protein C ili APC ili blokirani faktori s modificiranim aktivnim mjestom VIIa, IXa, Xa i APC mogu se upotrijebiti za ovaj postupak.
U drugom aspektu, izum također prikazuje metode za pojačavanje nastajanja ugrušaka kod sisavca koji uključuje davanje količine polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivne da poveća formiranje ugrušaka kod sisavaca. Polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući polazni polipeptid ovisan o vitaminu K. Modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline. Modificirani faktor VII ili VIIa i modificirani faktor IX i IXa mogu se upotrijebiti za ovaj postupak.
Izum će dalje biti opisan u sljedećim primjerima koji ne ograničavaju domet izuma opisanog u zahtjevima.
Primjeri
Primjer 1 - Faktor VII s povišenim afinitetom za membranu i povišenom aktivnošću
Nađeno je da se afinitet za vezanje na membranu humanog faktora VII za zgrušavanje krvi može povisiti mutagenezom usmjerenom mjestom. Svojstva mutanta P11Q.K33E (dovde označavanog kao faktor VIIQ11E33 ili mutantni faktor VII (SEQ ID N0:30)) su karakterizirana. Afinitet za membranu je povišen u odnosu na divlji tip proteina oko 20 puta. Autoaktivacija mutanta povećana je najmanje 100-struko u odnosu na divlji tip faktora VII. Aktivirani oblik VIIQ11E33 (označavan kao VIIaQ11E33) pokazao je oko 10-struko višu aktivnost prema faktoru X. Koagulacijska aktivnost VIIaQ11E33 s topljivim tkivnim faktorom u normalnoj plazmi bila je oko 10puta veća nego kod divljeg tipa VIIa. Koagulacijska aktivnost zimogena, VIIQ11E33, sa normalnim tkivnim faktorom (nabavljen kao 1 : 100 razrjeđenje tromboplastina - HS) bila je 20-struko veća u odnosu na divlji tip faktora VII. Stupanj do kojeg se povisila aktivnost ovisio je o uvjetima, pri čemu jeVIIQ11E33 bio naročito aktivan u uvjetima niskog stimuliranja koagulacije.
Općenito, koncentracije proteina određivane su Bradford probom uz upotrebu goveđeg serumskog albumina kao standarda. Bradford, M. M., 1976, Analvt. Biochem., 248-254. Molarne koncentracije dobivene su iz molekulskih težina od 50000 za faktor VII i 55000 za faktor X. Ako nije naznačeno, sva mjerenja aktivnosti provođena su u standardnom puferu (0,05MTris, pH 7,5, 100mM NaCI).
Proizvodnja mutantnog faktora VII
Mutantni faktor generiran je iz divljeg tipa faktora VII cDNA (GenMank Accession broj M13232, NID g182799). Petersen et al., 1990, Biochemistrv, 29:3451-3457). Mutacija P11Q (promjena aminokiseline 11 iz prolina u glutamin) i mutacija K33E (promjena aminokiseline 33 iz lizina u glutaminsku kiselinu) uvedena je u divlji tip faktora VII cDNA strategijom lančane reakcije polimeraze u osnovi kako je opisano kod Valette et al., 1989. Nucleic Acids Res., 17: 723--733. Za vrijeme ovog procesa, eliminiran je restrikcijski enzim Xn7alll za dijagnosticiranje mutacija. Četiri PCR klice konstruirane su da potaknu sintezu dva mutantna frgmenta M13232, jedan od Mlu\ do Bg/II, položaji 221 do 301, i drugi od Bg/II do SstII, položaji 302 do 787. Ove klice upotrijebljene su u standardnim PCR ciklizirajućim uvjetima (GENEAMP, Perkin Elmer) da potaknu sintezu fragmenata upotrebom 1 ng cDNA divljeg tipa faktora VII kao predložak. Nastali fragmenti pročišćeni su na gelu i obrađeni s MluI - BgIIl ili 6g/ll i SstII. Ova dva pročišćena fragmenta su onda spojena u cDNA faktora VII na ekspresijskom vektoru Yem219b iZ kojeg je odgovarajuća sekvenca divljeg tipa bila uklonjena kao MluI-SstII fragment. Petersen et al., 1990, kao gore. Mutiranim fragmentima određena je cjelokupna sekvenca da se potvrde supstitucije P11Q i K33E, kao i da se eliminira mogućnost drugih promjena sekvence induciranih djelovanjem PCR.
Transfekcija, selekcija i pročišćavanje
Bubrežne stanice bebe hrčka (BHK) uzgojene su Eagles mediju modificiranom po Dubecossu uz dodatak 10% fetalnog telećeg seruma i penicilina - streptomicina. Subkonfluentne stanice su transficirane ekspresijskim plazmidom faktora VII pomoću liptofectAMINE (Gibco BRL) prema preporuci proizvođača. Dva dana poslije transfekcije stanice su tripsinizirane i razrijeđene u selektivni medij koji sadrži 1 pM metotreksata (MTX).Transficirane stanice su nakon toga uzgojene u Eagles mediju modificiranom po Dubecossu bez seruma uz dodatak penicilina - streptomicina, 5pg/mL vitamina K1 i 1μm MTX te je skupljen prilagođeni medij. Prilagođeni medij dvaput je propušten kroz imunosfinitetnu kolonu sastavljenu od monoklonalnog antitijela ovisnog o kalciju (CaFVII22) vezanog na Affi-Gel 10. Nakagaki et al.,1991. Biochemistrv. 30: 10819-10824. Finalni pročišćeni faktor VIIQ11E33 prošao je kao jedna vrpca na elektroforezi na SDS poliakrilamid gelu bez zamijećene prisutnosti faktora VIIa u preparaciji. Čisti VII(P11Q, K33E) mutant pokazao je 1400-2800 jedinica faktora VII/mg.
Aktiviranije faktora VII
Aktivirani faktor VIIaQ11E33 napravljen je cijepanjem VIIQ11E33 pomoću goveđeg faktora Xa (težinski omjer 1 : 100, inkubacija 1 sat na 37°C). Alternativno, faktor VIIaQ11E33 dobiven je autoaktiviranjem (37°C, 20min) u smjesi koja je sadržavala 7 μM VIIQ11E33, 0,7 μM sTF i fosfolipid (fosfatidilserin / fosfatidilkolin (P3/PC), 25/75, 0,1 g/g proteina).
Divlji tip faktora VIIa je bio je homogeni rekombinantni protein (NOVO Nordisk). Dvije preparacije sastojale su se od komercijalnog liofiliziranog produkta i neliofiliziranog produkta. Ovaj drugi protein je dalje pročišćen na PPLC mono-Q i pokazao je specifičnu aktivnost 80000 Jedinica / mg, kalibrirano sa George King NPP standardom.
Povišena interakcija s membranom faktora VIIQ11E33
Fosfolipidni preparat, proba i mjerenje protein - membrana vezanja provedeno je metodom opisanim u Nelsestuen i Lim. 1977, Biochemistrv. 30: 10819-10824. Veliki jednolamelarni mjehurići (LUV) i mali jednolamelarni mjehurići (SUV) priređeni su prije opisanim metodama. Hope, M. J. et al., Biochem. Biophvs Acta. 812: 55 - 65; Huang, C., 1969, Biochemistrv, 8: 344 ~ 352. Visoko čist fosfatidilserin (goveđi mozak) i jajčani fosfatidilkolin (Sigma Chemical Co.) pomiješani su u kloroformu. Otapalo je uklonjeno pomoću mlaza plina dušika. Osušeni fosfolipidi suspendirani su u puferu. SUV su formirani pomoću zvučnih valova i el filtriranja dok su LUV formirani smrzavanjem - otapanjem i ekstrudiranjem. Koncentracije fosfolipida određene su organskom fosfatnom probom uz pretpostavku težinskog odnosa fosfor / fosfolipid od 25.
Priređeni su SUV od PS/PC (25/75) ili PS / PC (10/90). Protein je u fosfolipid dodan u težinskim odnosima prikazanim na slici 1. Vezanje protein - membrana mjereno je raspršenjem svjetla kod 90° metodom prema Nelsestuen i Lim, 1977, navedeno gore. Ukratko, mjeren je intenzitet raspršivanja svjetla samih mjehurića (I1) i nakon dodavanja proteina (I2) i korigiran za pozadinu iz pufera i nevezanog proteina. Odnos molekulske mase kompleksa protein - mjehurić (M2) prema masi samog mjehurića (M1) može se procijeniti iz odnosa u jednadžbi 1, gdje je δn/δc indeks loma vrste na koju se odnosi.
(jedn. 1)
Ako su poznate koncentracije fosfolipida i proteina, koncentracija vezanog [P * PL] i slobodnog [P] proteina može se odrediti. Ove vrijednosti, zajedno s maksimalnim kapacitetom za vezanje proteina [P * PLmax] mjehurića (pretpostavlja se da je 1,0 g/g za sve proteine) može se upotrijebiti da se dobije konstanta ravnoteže za interakciju protein -membrana pomoću odnosa u jednadžbi 2, gdje su sve koncentracije izražene kao molarne proteina ili mjesta vezanja proteina.
(jedn. 2)
Vezanje je ispitivano uz 5μM kalcija i izraženo kao omjer M2/M1.
Slika 1 prikazuje vezanje divljeg tipa VIIa (prazni krugovi) i faktora VIIQ11E33 (ispunjeni krugovi) na membrane ili PS/PC =25/75, 25 μg/ml (slika 1A) ili PS/PC = 10/90, 25 μg/ml (slika 1B). VIIQ11E33 ima puno veći afinitet nego protein divljeg tipa. Vezanje na PS / PC (25 / 75) je bilo na kvantitativnoj razini tako da je [Proteinslobodan] bila praktički 0. Uslijed toga, vrijednosti Kd nisu se mogle odrediti iz ovih podataka. Vezanje goveđeg faktora X (ispunjeni trokuti) na membrane prikazano je na slici 1 kao referenca. Goveđi faktor X je jedan od proteina s najvećim afinitetom u ovoj porodici, daje Kd od 40 nM za PS/PC (20/80) kod 2 mM. McDonald et al, 1977, Biochemistrv. 36: 5120-5127. Kd za goveđi faktor X, dobivena iz rezultata za omjer protein/fosfolipid 0,55 (slika 1) bila je 0,025 μM.
Vezanje divljeg tipa i mutantnog faktora VII na membrane od PS / PC (10/90) također je određivano (slika1B).VIIQ11E33 vezao se na manje nego kvantitativnoj razini što je omogućilo da se konstanta vezanja odredi iz odnosa u jednadžbi 3.
Kd = [Proteinslobodan] [Mjesta vezanjaslobodno] / [Proteinvezan] (jedn. 3)
[Mjesta vezanjaslobodno] određena je iz jednadžbe 4, uz pretpostavku da je maksimalni M2 / M1 1,0 (tj. [Mjesta vezanjaukupno] = [fosfolipidmasena konc. / proteinmc]). Ovo je uobičajena vrijednost opažena za nekoliko proteina ove porodice. Vidi McDonald et al., 1977, gore.
[Mjesta vezanjaslobodno] = [Mjesta vezanjaukupno] - [Proteinvezan] (jedn. 4)
Uz ove pretpostavke i podatke za odnos protein prema fosfolipidu od 0,37, Kd vrijednosti su bile 0,7 μM za goveđi faktor X, 5.5 μM za divlji tip faktora VII i 0,23 μM zaVIIQ11E33. Tako je jasno da je faktor VIIQ11E33 značajno povišen u afinitetu za vezanje na membranu u odnosu na divlji tip i imao je jedan od najviših afiniteta za vezanje na membranu među proteinima ovisnim o vitaminu K.
Pojačano aktiviranije faktora VIIQ11E33
Prvi korak u koagulaciji uključuje aktivacijski faktor VII. Autoaktiviranje VII provedeno je u otopini koja sadrži 100nM sTF (visoko pročišćen rekombinantni produkt od Dr. Walter Kiesel, Fioreetal., 1994, J Biol. Chem., 269: 143-149), 36 nM VIIQ11E33 i PS / PC (25/75, 22 μg/mL). Aktivnost VIIQ11E33 određivana je u različitim vremenskim intervalima dodavanjem 0,15mm S-2288 (Kabi) i mjerenjem brzine otpuštanja p-nitrofenilfosfatnog produkta putem promjene apsorbancije na 405 nm. Početna aktivnost VIIQ11E33 preparata bila je manje nego 4% od potpuno aktivnog VIIQ11 E33.
VIIQ11E33 se pokazao kao puno bolji supstrat za aktiviranje nego divlji tip faktora VII. Slika 2 pokazuje autoaktiviranje faktoraVHQ11E33. Podaci su analizirani odnosom u jednadžbi 5 (jednadžba 7 kod Fiore et al., 1994, navedeno gore).
(jedn. 5)
In[VIIa]t je koncentracija faktora VIIa u vremenu t, kcat je katalitička brzina reakcije za djelovanje faktora VIIa na faktor VII i y je frakcijsko zasićenje VIIa mjesta. Za divlji tip faktora VIIa, ovaj odnos i 1 μM sTF dali su kcat 0,0045/s i odnos kcat/Km 7*103 M'1 s-1. Vidi Fioreet al., 1994, navedeno gore. ZaVIIQ11E33 enzim, autoaktiviranje je bilo brzo (slika 2) i jedino se moglo odrediti donju granicu za kcat. To je dobiveno iz vremena udvostručenja za VIIa od oko 25 sekundi (kcat = (ln2) / ti/2). Dobivena vrijednost (kcatmin = 0,03 / s), uz koncentraciju supstrata u ovoj reakciji (3,6*10-8 M) i uz pretpostavku da y = 1,0, dobila se vrijednost za kcat / [S] = 8*105 M-1 s-1. Ovo bi trebalo biti puno ispod stvarne kcat / Km zaVIIaQ11E53 ali je oko 100 puta veće nego kcat/Km za divlji tip faktora VIIa/sTF procijenjen u Fiore et al., 1994, navedeno gore. Tako je kombinacija VIIaQ11E33 enzima i faktora VIIQ11E33 kao supstrata bolja nego divlji tip proteina u koraku aktiviranja kod koagulacije. Ovo sugerira da jeVIIQ11E33 superioran divljem tipu enzima kada su uvjeti koaguliranja minimalni.
Povišena aktivnost faktora VIIaQ11E33
Kada je jednom napravljen, faktor VIIa aktivira ili faktor X ili faktor IX. Aktiviranje goveđeg faktora X (0,1 μM) faktorom VIIa provedeno je u 50 μM Tris HCl puferu, pH 7,5, s 100ml NaCl, 5mM kalcija, različitim količinama fosfolipida (PS/PC. 25/75) i 1 mg/ml goveđeg serumskog albumina na 22,5°C. Faktor VIIa (0.06 nM VIIaQ11E33 ili 0.06 nM divljeg tipa VIIa) dodan je u vrijeme 0 i određena je Xa aktivnost u vremenskim točkama 1, 3 i 5 minuta. Alikvoti reakcijske smjese (0.2 ml) izmiješani su s puferom (0,2 ml) koji je sadržavao 10 mM EDTA i 0,4 mM S - 222 (Kabi), kromogenog supstrata za faktor Xa. Promjena apsorbancije na 405 nm određivana je Beckman DU8 spektrofotometrom. Količina generiranog faktora Xa izračunata je iz koeficijenta ekstinkcije (1*104 M-1 cm-1) p-nitrofenilfosfatnog reakcijsko produkta i brzine od 33/s za hidrolizu supstrata pomoću pročišćenog goveđeg Xa u uvjetima ove probe.
Slika 3 uspoređuje sposobnost divljeg tipa faktora VIIa (prazni krugovi) VIIaQ11E33 (ispunjeni krugovi) da aktivira faktor X u pročišćenom sistemu. Opet, VIIaQ11E33je bio puno superiorniji u odnosu na divlji tip faktora VIIa u ovoj reakciji. Razlika je bila najveća kod niskih koncentracija fosfolipida i smanjila se na 2-struku kod 200 μg fosfoliipida po mL Ove se očekivalo iz činjenice da visoke koncentracije membrane uzrokuju veći dio divljeg tipa faktora VIIa da se veže na membranu. ponovo, povećana funkcija VIIaQ11E33 bila je najveća u uvjetima niske izloženosti fosfolipidima.
Superiorna koagulacija VIIaQ11 E33
Probe zgrušavanja krvi provedene su na 37°C pomoću metode ručnog naginjanja za registriranje nastajanja ugrušaka. Humana plazma (0,1 mL) puštena je da se uravnoteži na 37° C kroz 1 minutu. Različiti -reagensi dodani su u volumen od 0,1 mL standardnog pufera. Topljivi tkivni faktor (50 nM) i fosfolipid (PS/PC, 10/90, 75 μg/mL) dodani su u plazmu, zajedno s faktorom VIIa koncentracije prikazane na slici 4 (0,1 –32 nM). Konačno, 0,1 mL 25 mM CaCl2 dodano je da započne reakciju. Mjereno je vrijeme potrebno za stvaranje ugruška. U većini slučajeva, objavljene su srednje i standardne devijacije ponovljenih uzoraka.
Slika 4 pokazuje vrijeme koagulacije divljeg tipa VIIa u odnosu na VIIaQ11E33 u normalnoj humanoj plazmi. Koagulacija je poduprta pomoću sTF i dodanih fosfolipidnih mjehurića. Endogeni divlji tip faktora VIIa je otprilike koncentracije 10 mM i praktički nema utjecaja na vrijeme koagulacije. Pozadinska koagulacija je bila 120 sekundi, sa ili bez sTF. Faktor VIIaQ11E33 pokazao je oko 8 puta veću aktivnost nego divlji tip faktora VIIa pod uvjetima ove probe. Slični rezultati su dobiveni s plazmom bez faktora VIII, što sugerira da glavni put za grušanje krvi u ovom sistemu uključuje direktnu aktivaciju faktora X faktorom VIIa. Sveukupno, faktorVIIaQ11E33je bio superiorniji u odnosu na divlji tip faktora VIIa u prokoagulirajućoj aktivnosti podržanoj membranskim mjehurićima i topljivim tkivnim faktorom. Divlji tip zimogena praktički nema aktivnosti u ovim uvjetima, što pokazuje slično pozadinsko vrijeme grušanja od 2 minute, bez obzira da li je sTF dodan.
Prokoaguliraiuća aktivnost s normalnim tkivnim faktorom
Aktivnost VIIa i/ili VIIaQ11E33 sa sTF mjerena je u normalnoj humanoj plazmi. Endogeni faktor VII izgleda da nema utjecaja na vrijeme koagulacije u ovoj probi; pozadinsko vrijeme grušanja je bilo 2 minute za plazmu sa ili bez topljivog tkivnog faktora. Topljivi tkivni faktor (50 mM konačna koncentracija) i VIIa dodani su u plazmu prije otopine kalcija. Vrijeme koagulacije određivano je za uzorke s različitim razinama VIIa ili VIIaQ11E33. Dvije preparacije humane plazme su ispitane, normalna i bez faktora VIII.
Koagulacija podržana normalnim tkivnim faktorom ispitana je standardnim tromboplastinom - HS iz zečjeg mozga (HS = visoka osjetljivost) s kalcijem (Sigma Chemical Co.). Smjesa sadrži fosfolipide i tkivni faktor vezan ne membranu. Tromboplastin - HS iz zečjeg mozga razrijeđen je 1 : 100u puferu i upotrijebljen za probu za VII (dodan u obliku normalne humane plazme koja sadrži 10 nM faktora VII) i VIIQ11E33 (dodan kao čisti protein). Tromboplastin (0,2 mL) je dodan plazmi (0,1 mL) da započne reakciju mjereno Je vrijeme potrebno za nastajanje krvnog ugruška. Probe su također provedene sa tromboplastinom pune jačine, kao što je opisao proizvođač.
Na optimalnim razinama humanog tromboplastina, divlji tip VII pokazao je normalnu aktivnost, oko 1500 jedinica po mg. Ovo je oko 25 puta manje nego aktivnost divljeg tipa faktora VIIa (80000 Jedinica po mg). VIIQ11E33 je dao oko 1500-3000 jedinica po mg u standardnim uvjetima ispitivanja, samo dva puta više nego divlji tip VII.
Razlika između divljeg tipa faktora VIIa i VIIQ11E33 je puno veća kada su uvjeti koagulacije suboptimalni. Slika 5 prikazuje vrijeme grušanja i koncentracije zimogena u probama koje sadrže 0,01 - puta do normalne razine tromboplastina. U ovim uvjetima, VIIQ11E33 je oko 20 puta aktivniji nego divlji tip faktora VII. Tako, veća efikasnost VIIQ11E33 mutanta je naročito vidljiva kada su uvjeti ograničeni, što Je relevantno za mnoge situacije in vivo.
Antikoagulacijske aktivnosti DEGR -VIIaQ11E33
Standardne probe koagulacije provedene su s normalnim humanim serumom i humanim tromboplastinom razrijeđenim na 1 : 10 s puferom. Aktivno mjesto faktoraVHQ11E33 modificirano je pomoću DEGR kao što je opisao Sorensen, B. B. et al., 1997, navedeno gore. Slika 6 pokazuje vrijeme grušanja za DEGR -VIIaQ11E33 (0-4 nm) inkubiran s tromboplastinom u kalcijevom puferu 15 sekundi prije dodavanja plazme. Vrijeme za nastajanje ugruška određeno je metodom ručnog naginjanja. Vrijeme zgrušavanja bilo je otprilike 45 sekundi s oko 1 nm DEGR -VIIaQ11E33.
Primjer 2- cirkulatorno vrijeme faktoraVIIQ11E33 kod štakora
Dva anestetizirana (natrij nembutol) Sprague Dawley štakora (325-350 g) injektirana su s 36 μg faktora VIIQ11E33 u vrijeme 0. Injekcija je provedena u vratnu venu u koju je bila smještena kanila. U vremenima prikazanim na slici 7, krv je izvađena iz karotidne arterije u koji je kirurški bila umetnuta kanila. Količina faktoraVIIQ11E33 u krvotoku određena je iz vremena grušanja humane plazme bez faktora VII u koju je dodan 1 μL 1 : 10 razrijeđene plazme štakora.. Tromboplastin -HS iz zečjeg mozga razrijeđen 1 : 100(Sigma Chemical Co.) je upotrijebljen. Zgrušavanje krvi ispitano je pomoću metode ručnog naginjanja kao što je opisano u primjeru 1. Ograđen je stupanj aktivnosti faktora VII u plazmi prije ubrizgavanjaVIIQ11E33 i oduzet kao nulta proba. Koncentracija faktora VIIQ11E33 u krvotoku dana je kao log nM. Kontrolni eksperiment u kojem Je treća životinja operirana i uvedena joj kanila ali nije ubrizgan VIIQ11E33 je proveden. Kolizina faktora VII u toj životinji nije se mijenjala kroz vrijeme eksperimenta (100 minuta). Na kraju eksperimenta, životinje su eutanazirane viškom natrij nembutola.
Štakori su djelovali normalno kroz eksperiment i nije bilo dokaza o koaguliranju. Prema tome, faktor VIIQ11E33 nije uzrokovao nediskriminirano koaguliranje, ček i kod štakora poslije operacije. Cirkulatorno vrijeme života VIIQ11E33 bilo je normalno (slika 7), otprilike 40% proteina se pročistilo nakon oko 60 minuta i još polaganije nestajanje preostalog proteina. Ovo je slično brzini nestajanja goveđeg protrombina iz štakora. Nelsastuen i Suttie, 1971, Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 45: 198-203. Ovo je bolje od divljeg tipa rekombinantnog faktora VIIa koji je imao cirkulatorno vrijeme poluživota za funkcionalne probe 20 - 45 minuta. Thomsen, M. K., 1993. Thromb. Haemost, 70:458-464. Ovo ukazuje da normalni protein nije prepoznao faktor VIIQ11E33 kao abnormalni protein i nije naglo uništen koagulacijskom aktivnošću. Izgledao je kao normalan protein i trebao bi imati standardno cirkulatorno vrijeme života u životinji.
Primjer 3 - Povećavanje mjesta na membrani i aktivnosti proteina C
Goveđi i humani protein C pokazuju visok stupanj homologije aminokiselina u GLA domeni (aminoterminalna 44 ostatka), iako humani protein ima oko 10puta veći afinitet za membranu. Goveđi i humani protein C Goveđi protein C ima prolin na položaju 11 humanog proteina C. Ispitivan je utjecaj zamjene prolina-11 u goveđem protein C histidinom, i obrnuta promjena u humanom proteinu C. U oba slučaja, protein sa prolinom-11 pokazao je niži afinitet za membranu, oko10 puta za goveđi protein C i 5 puta za humani protein C. Aktivirani humani protein C (hAPC) sa prolinom na mjestu 1 pokazao je 2,4 do 3,5 puta manju aktivnost nago divlji tip hAPC, ovisno o upotrijebljenoj probi. Goveđi protein C sa histidinom -11 pokazao je do 15 puta veću aktivnost nego divlji tip bAPC. Ovo je pokazalo mogućnost da se mutacijom poboljša kontakt s membranom i aktivnost.
Mutageneza proteina C
Potpuni cDNA klon humanog proteina C dobavio Je Dr. Johan Stenflo (Dept. of Clinical Chemistry, University Hospital, Malmč, Švedska). cDNA klon goveđeg proteina C dobavio Je Dr. Donald Foster (Zymogenetics, Inc., USA). Broj pristupa u GenBank za slijed nukleotida goveđeg proteina C je K02435, NID g163486. a za slijed nukleotida humanog proteina C je K02059, NID g190322.
Mutageneza upravljana mjestom provedena je metodom PCR. Za mutagenezu histidina -11 u prolin na humanom proteinu C, sintetizirani su sljedeći oligonukleotidi: A, 5' -AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCC AAG CTT-3' (SEQ ID N0:7) (odgovara nukleotidima 860-895 na vektoru pRc/CMV) da se dobije Hind III mjesto između pRc / CMV i proteina C. B, 5' - GCA CTC CCG CTC CAG GCT GCT GGG ACG GAG CTC CTC CAG GAA-3' (SEQ ID N0:8) (odgovara aminokiselinskim ostacima 4-17 na humanom proteinu C, osmi ostatak u ovoj sekvenci je mutiran iz onoga u humanom proteinu C u onaj u goveđem proteinu C, kao što je naznačeno pocrtavanjem).
Za mutagenezu prolina-11 u histidin na goveđem proteinu C, sintetizirani su sljedeći oligonukleotidi: A, (kao što je gore opisano); C, 5' - ACG CTC CAC GTT GCC GTG CCG CAG CTC CTC TAG GAA-3' (SEQ ID N0:9) (odgovara aminokiselinskim ostacima 4 -15 na goveđem proteinu C, šesta aminokiselina u ovoj sekvenci je mutirana iz one u goveđem proteinu C u onu u humanom proteinu C, kao što je naznačeno podcrtavanjem); D, 5' -TTC CTA GAG GAG CTG CGG CAC GGC AAC GTG GAG CGT-31 (SEQ ID N0:10) (odgovara aminokiselinskim ostacima 4-15 na goveđem proteinu C, sedma aminokiselina u ovoj sekvenci je mutirana iz one u goveđem proteinu C u onu u humanom proteinu C, mutirani nukleotidi su pocrtani); E, 5'-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA-3' (SEQ ID N0:11) (odgovara nukleotidima 984-1019 na vektoru pRc/ CMV) čime je stvoreno Xba l mjesto između pRc/CMV i proteina C).
cDNA humanog i goveđeg proteina C su obje klonirane u mjesta Hind III i Xba l na ekspresijskom vektoru pRc/CMV. cDNA humanog proteina C sa 5' terminusom do aminokiseline -17 pojačana je intaktnom cDNA humanog proteina C i klicama A i B. Volumen za PCR reakciju ja bio 100 μL i sadržavao je 0,25 μg DNA templata, 200 μM svakog od deosiribonukleotid trifosfata, 0,5 mM od svake klice i 2,5 U Pwo-DNA polimeraze (Boehringer Mannheim) i puferu Tris-HCl (10 mM Tris, 25 mM KCl, 5 mM (NN4)2SO4 i 2 nM MgSO4, pH 8,85). Uzorci su podvrgnuti 30 rundi PCR od po 2 minute perioda denaturiranja na 94°C, 2 minute perioda navezivanja na 55°C i 2 minute perioda elongacije na 72°C. Nakon pojačavanja, DNA je podvrgnuta elektroforezi kroz 0,8% agarozni gel u 40 mL Tris-acetatnog pufera s 1 mL EDTA. PCR produkti pročišćeni s opremom JET Plasmid Miniprep-Kit (Saveen Biotech AB, Švedska). cDNA humanog proteina C sa predviđenim mutacijama cijepana je pomoću Hind III i Bsr Bl, i onda klonirana upRc/CMV vektor koji je pocijepan pomoću Hind III / Xba l i sadržavao je fragment humanog proteina C od Bsr Bl do 3' terminusa da se dobije potpuna cDNA humanog proteina C sa mutacijom.
cDNA goveđeg proteina C sa 5' terminusom kroz aminokiselinu -11 pojačana je pomoću PCR intaktnom cDNA humanog proteina C i klicama A i C. cDNA goveđeg proteina C od aminokiselina 1 do 3' - terminusa pojačana je intaktnom cDNA humanog proteina C i klicama D i E. Ova dva cDNA fragmenta upotrijebljena su kao kalupi da se pojača cjelokupna cDNA goveđeg proteina C koja ima mutirane aminokiseline klicama A i E. Uvjeti PCR reakcije bili su identični onima za hAPC. cDNA goveđeg proteina C sa predviđenim mutacijama cijepana je pomoću Hind III i Bsu 361, i Hind III / Bsu 361 fragment je klonirana u pRc / CMV vektor koji ima intaktne fragmente goveđeg proteina C iz Bsu 361 do 3' terminusa da se dobije potpuna cDNA goveđeg proteina C sa mutacijom. Sve mutacije potvrđene su sekvenciranjem DNA prije transfekcije.
Stanična kultura i ekspresija
Linija 293 humanih stanica bubrega transficirana adenovirusom uzgajana je u DMEM mediju uz dodatak 10%telećeg seruma, 2 Mm L -glutamina, 100 U/ml penicilina, 100 U/ml streptomicina i 10 μg/ml vitamina K1. Transfekcija je provedena pomoću lipofektin metode. Felgner et al, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7414-7417. 2 μg DNA razrijeđeno je do 0,1 μL u DMEM s 2 Mm L-glutamin medija. 10 μL lipofektina (1 mg / ml) dodano Je u 100 μL DMEM s 2 Mm L-glutamin medija. DNA i lipofektin su promiješani i ostavljeni na sobnoj temperaturi 10-15 min. Stanični monoslojevi (25-50% konfluencija u 5 - cm petrijevim zdjelicama) isparani su dvaput s 2 mM L - glutamin medija. Smjesa DNA/lipid razrijeđena je na1,8 μL u DMEM s 2 Mm L-glutamin medija, dodana stanicama i inkubirana 16 sati. Stanice su nahranjene s 2 mL kompletnog medija s 10% telećeg seruma, ostavljene da se oporave još 48-72 sata i onda tripsinizirane te nasađene u 10-cm zdjelice sa selekcijskim medijem (DMEM sa 10% seruma i 400 μg/mL geneticina) u odnosu 1 : 5. Yan, S. C: B. et al., 1990, Bio / Technologv 655-661. Kolonije rezistentne na geneticin dobivene su nakon 3-5 tjedana selekcije. Dvadeset četiri kolonije iz svake DNA transfekcije su izabrane, uzgojene do konfluencije i mediji prgledani za ekspresiju proteina C pomoću probe točka-mrlja upotrebom monoklonalnog antitijela HPC4 ( za humani protein C) i monoklonalnog antitijela BPC5 ( za goveđi protein C). Klonovi koji su proizvodili velike količine proteina su izolirani i uzgojeni do konfluencije u prisustvu i 10 μg/ml vitamina K1.
Pročišćavanje rekombinantnog goveđeg proteina C i njegovog mutanta temelji se na metodi opisanoj prije sa nekim modifikacijama. Rezair, A. R. i Esmon, C.T., 1992, J. Biol. Chem.. 267:26104-26109. Prilagođeni medij bez seruma od stabilno transficiranih stanica centrifugiran je na 5000 okretaja u minuti na 4°C 10 minuta. Supernatant otfiltriran kroz 0,45 μm membrana celuloznog nitrata (Micro Filtration Systems, Japan). EDTA (5 mM, završna koncentracija) i PPACK (0,2 μM, konačna koncentracija) dodani su u prilagođeni medij iz 293 stanica, onda propušteni kroz Pharmada FFQ anionsku kolonu pri sobnoj temperaturi uz Milipore Con Sep LC100 (Milipore, USA). Protein je eluiran sa CaCl2 gradijentom (početna otopina 20 mM Tris - HCl/150 mM NaCl, pH 7,4; konačna otopina 20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl/ 30 mM CaCl2, pH 7,4). Nakon uklanjanja CaCl2 dijalizom i obradom s Chelex 100, protein je reapsorbiran na drugu FPQ kolonu i onda eluiran NaCl gradijentom (početna otopina 20 mM Tris - HCl/150 mM NaCl, pH 7,4; konačna otopina 20 mM Tris-HCl/500 mM NaCl, pH 7,4). Na ovom mjestu pročišćavanja, divlji tip i mutantni rekombinantni goveđi protein C bili su homogeni kako je utvrđeno putem SDS-PAGE i potom obilježavanjem srebrom. Proteini su koncentrirani pomoću YM 10 filtera (Amicon), dijaliziranl prema puferu 50 mM Tris-HCl/150 mM NaCl, pH 7,4) 12 sati i spremljeni na 70°C. Koncentracije proteina izmjerene su apsorbancijom na 280 nm.
Asociranje normalnih i mutiranih molekula proteina C sa membranama
LUV i SUV preparirani su postupcima opisnim i primjeru 1. Raspršivanje svjetla pod 90° u odnosu na upadni snop upotrijebljeno je da se kvantizira vezanje proteina s membranom kao što je, gore opisano za faktor VII (25 ug/mL PS/PC, (25/75) uz 5 mM kalcija (0,05 M Tris-0,1 M HCl pH 7,5). Goveđi protein C sa histidinom na mjestu 11 stupao je u interakciju smembranom s oko 10 puta većim afinitetom nego divlji tip proteina. Kada se prilagode na jednadžbu 2, podaci su dali vrijednosti KD od 930 ± 80 nM za protein C -H 11 i 9200 ± 950 za divlji tip proteina (slika 8A). Razlika u afinitetu odgovara oko 1,4kcal/mol na 25°C. U stvari, afinitet goveđeg proteina C -H11 bio je skoro identičan onome izvornog humanog proteina C (660 nM, slika 8B). Ovo ukazuje da prolin 11 tvori glavnu osnovu za razlike u mjestima vezanja na membranu goveđih i humanih proteina.
Obrnuta supstitucija, zamjena His -11 humanog proteina C prolinom, smanjila je afinitet za membranu (slika 8B). Kada se uvrste u jednadžbu 2, ovi podaci daju vrijednosti KD 660 ±90 nM za divlji tip humanog proteina C i 3350 j:110 nM za humani protein C-P11. Utjecaj uvođenja prolina je samo nešto manji nego onaj prolina u goveđim proteinima.
Uthjecaj prolina -11 na aktivnost aktiviranog proteina C
Aktivirani protein C generiran je trombinskim cijepanjem divljeg tipa i mutantnih proteina pod istim uvjetima. Otprilike 150 μg različitih proteinskih C preparata (1 mg / mL) pomiješano je s goveđim trombinom (3 μg) i inkubirano na 37°C 5 sati. Reakcijski produkt razrijeđen je do 0,025 M Tris puferom - 0,05 M NaCl i nanesen na 1 mL kolonu SP -Sephadex C - 50. Kolona je isprana s 1 mL istog pufera i eluat je skupljan kao aktivirani protein C. Skupljeno je oko 65 - 80 % proteina nanesenog na kolonu. APC aktivnost određivana je proteolizom S2366 (0,1 mM) na 25°C. Preparati su uspoređeni sa standardnim šrešaratima dobivenim u većoj. količini. Standardni humani APC dobavio je Dr. Walter Kisiel. Za goveđe proteine, standard je bila veća količina preparacije APC aktiviranog trombinom. Aktivost goveđeg APC bila je konzistentna za sve preparacije normalnih i mutantnih proteina Q: 5%). Dva preparata goveđeg APC upotrijebljena su za usporedbu. Humani APC generiran iz trombina bio je 55 do 60 % aktivan u odnosu na standard.
Standardni APTT test koristi goveđu ili humanu plazmu i standardni APTT reagens (Sigma Chemical Co.) prema uputama proizvođača. Altenativno, fosfolipid je dobiven u obliku mjehurića nastali iz visoko pročišćenih fosfolipida. U ovoj probi, goveđa plazma (0,1 mL) je inkubirana ili sa kaolinom (0,1 mL S mg/mL u 0,05 M Tris puferu, 0,1 M NaCl, pH 7,5) ili elagijsokm kiselinom (0,1 mM u puferu) 5 minuta na 35°C. Koaguliranje je započeto dodavanjem 0,1 mL pufera s fosfolipidom i prikazanih količina APC, a nakon toga 0,1 mL 25 mM kalcij klorida. Svi reagensi bili su u standardnom puferu od 0,05 M Tris pufera, 0.1 M NaCl, pH 7,5. Prosjek od 14 puta veće koncentracije divljeg tipa bAPC trebao je da udvostruči utjecaj H11 mutanta. Vrijeme koagulacije na 10 nM bAPC-HH bilo je veće nego 120 minuta. Standardni APTT (Sigma Chemical Co.) dao je vrijeme zgrušavanja oko 61 sekunde na 35°C s tom plazmom. Vrijeme potrebno da nastane ugrušak praćeno je ručnom metodom. Količina fosfolipida izabrana je da bude ograničavajuća komponenta u probi i da daje vrijeme zgrušavanja prikazano. Upotrijebljeni fosfolipidi su bili SUV (45 μg/0,4 mL u završnoj probi, PS/PC, 10/90) ili LUV (120 μg/0,4 mL u završnoj probi, PS/PC, 25/75).
Antikoagulirajuća aktivnost aktiviranog proteina C isprobana je u nekoliko proba. Slika 9 pokazuje utjecaj na APTT probu provedenu s ograničavajućim fosfolipidom. U uvjetima ove probe vrijeme koagulacije smanjivalo se u gotovo linearnom inverznom odnosu s koncentracijom fosfolipida. Otprilike 14 puta više divljeg tipa goveđeg proteina APC trebalo je da izjednači efekt goveđeg proteina APC-H11.
Dijelovi ispitivanja na slici 9 ponovljeni su za membrane PS/PC, (25/75, LUV). Opet, aktivnost je bila ograničena fosfolipidom i njegova koncentracija je podešena da se postigne kontrolno vrijeme zgrušavanja 360 sekundi (120 μg 25% PS u 0,4 mL probe). Otprilike 15 puta više divljeg tipa enzima je trebalo da izjednači efekt H11 mutanta. Konačno, standardni APTT reagens (Sigma Chemical Co., standardno vrijeme grušanja 50 ± 2 sekunde) je upotrijebljen. Otprilike 10 ± 0,7 nM divljeg tipa enzima je trebalo da udvostruči vrijeme koagulacije na 102 ± 5 sekundi. Isti efekt imalo je 2,2 ± 0.1 nM goveđeg APC-H11. Fosfolipid nije ograničavao brzinu u standardnoj probi pa se može očekivati manji utjecaj na afinitet za membranu. Rezultati za humani protein su prikazani na slici 8B. Oko 2,5 puta humanog APC sa prolinom -11 treba da se koaguliranje produži do vremena divljeg tipa APC. Manji utjecaj uvođenja prolina-11 može odražavati manje razlike u afinitetima za membranu humanih proteina (slika 9B).
Inaktiviranje faktora Va
Inaktiviranje faktora Va isprobano je metodom po Nicolaes et al., 1996, Thrombosis and Haemostasis. 76:404-410. Ukratko, za goveđe proteine, goveđa plazma je razrijeđena 1000 puta s 0.05 M Tris pufera, 0,1 M NaCl, 1 mg/mL goveđeg serumskog albumina i 5 mM kalcija kod pH 7,5. Mjehurići fosfolipida (5 μg / 0,24 mL probe i 5 μL 190 nM protrombina dodani su za aktiviranje faktora V. Nakon 10 minuta inkubacije na 37°C APC je dodan i inkubacija nastavljena 6 minuta. Goveđi protrombin (do 10 pM finalne koncentracije) i faktor Xa (0,3 nM finalne koncentracije) dodano je i reakcijska smjesa je inkubirana na 37°C jednu minutu. 20 pL uzorka ove reakcijske smjese dodano je u 0,38 mL pufera ( 0,05 M Tris pufera, 0,1 M NaCl, 5 mmol EDTA, pH 7,5) sa S2288 supstratom (60 μM). Količina trombina određena je promjenom u apsorbanciji na 405 nM (ε =1,0 x104 M-1 s'1, kcat za trombin = 100/s). Za humane proteine, plazma bez humanog proteina S (Biopool Canada, Inc) razrijeđena je 100 puta, faktor Va je aktiviran humanim trombinom i nastali faktor Va ispitan je reagensima koji korišteni za goveđe proteine.
Goveđi APC-H11 bio je 9,2 puta aktivniji nego divlji tip (slika 10A) za inaktiviranje faktora Va. Što se tiče vezanja na membranu, utjecaj prolina -11 manji je bio s humanim proteinima, uz prosječnu razliku 2.4 puta između krivulja povučenih za divlji tip i P -11 mutant (slika 10B). Slični rezultati dobiveni su s normalnom humanom plazmom.
Primjer 4 - Identifikacija arhetipa afiniteta za membranu za mjesto kontakta s membranom kod proteina ovisnih o vitaminu K
Usporedba različitih mutanata humanih i goveđih proteina C i drugih polipeptida ovisnih o vitaminu K dovela je do predloženog arhetipa kontaktnog mjesta s membranom. Elektrostatski arhetip sastoji se od elektropozitivne jezgre na jednoj površini proteina stvorene vezanim ionima kalcija okružene elektropozitivnim nabojem aminokiselina proteina. Što je član te porodice proteina bliži ovakvom elektrostatskom rasporedu, veći je njegov afinitet za membranu.
Mjehurići fosfolipida, divlji tip goveđeg proteina C, proučavanja interakcija protein - membrana, aktiviranje i kvantitativno određivanje proteina C i analiza aktivnosti opisani su u primjeru 3.
Rekombinantni mutantni protein C proizveden je sljedećim postupcima. Mutageneza upravljana mjestom napravljena je metodom PCR. Sintetizirani su sljedeći oligonukleotidi: A, kao što je opisano u primjeru 3; F, 5' - GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA - 3' (SEQ ID N0:11) (odgovara nukleotidima 984-1019 u vektoru pRc/CMV, stvara mjesto Xba I između pRc/CMV i proteina C;
G, 5' -GAA GGC CAT TGT GTC TTC CGT GTC GAA AAT CTC CCG AGC -3' (SEO ID N0:12) (odgovara aminokiselinskim ostacima 40-27 u goveđem proteinu C, osma i 9. aminokiselina su mutirane iz QN u ED kao što je označeno pocrtavanjem);
H, 5' - CAG TGT GTC ATC CAC ATC TTC GAA AAT CTT GGC -3' (SEQ ID N0:13) (odgovara aminokiselinskim ostacima 36-27 u humanom proteinu C, 6. i 7. aminokiselina su mutirane iz QN u ED kao što je označeno pocrtavanjem);
I. 5' -GCC AAG GAA ATT TTC GAA GAT GTG GAC ACA CTG ~ 3' (SEQ ID N0:14) (odgovara aminokiselinskim ostacima 27-38 u humanom proteinu C, 6. i 7. aminokiselina u ovoj sekvenci su mutirane iz QN u ED kao što je označeno pocrtavanjem);
J. 5' - CAG TGT GTC ATC CAC ATT TTC GAA AAT TTC CTT GGC -3' (SEQ ID N0:15) (odgovara aminokiselinskim ostacima 38-27 u humanom proteinu C, 7. aminokiselina je mutirana iz Q u E kao što je označeno pocrtavanjem);
K, 5' -GCC AAG GAA ATT TTC GAA AAT GTG GAT GAC ACA ATG -3' (SEQ !D N0:16) (odgovara aminokiselinskim ostacima 27-38 u humanom proteinu C, 6. aminokiselina je mutirana iz Q u E kao što je označeno pocrtavanjem);
Cijele cDNA goveđeg i humanog proteina C klonirane su obje u mjesta Hind III i Xba I na vektoru pRc/CMV. Da se dobije mutant E33D34 goveđeg proteina C, PCR pojačavanje ciljane DNA provedeno je kako slijedi. cDNA goveđeg proteina C sa 5' terminusom do aminokiseline na položaju 40 pojačana je intaktnim goveđim proteinom C i klicama A i B. Uvjeti PCR reakcije bili su kao što je opisano u primjeru 3. Uzorci su podvrgnuti 30 rundi PCR od po 2 minute perioda denaturiranja na 94°C, 2 minute perioda navezivanja na 55°C i 2 minute perioda elongacije na 72°C. Nakon pojačavanja, DNA je podvrgnuta elektroforezi kroz 0,8% agarozni gel u 40 mL Tris - acetatnog pufera s 1 mL EDTA. PCR produkti pročišćeni s opremom Geneclean III KIT (BIO 101, Inc. USA) i PCR fragment DNA goveđeg proteina C sa određenim mutacijama cijepan je pomoću Hind III i Bbs. Fragment Hind III / Bbs i fragment humanog proteina C (Bbs 1 - 3' terminus) klonirani su u Hind II i Xba mjesta na vektoru pRc/CMV kako bi se proizvela cijela cDNA goveđeg proteina C sa mutacijama. Mutant H11 E33 D34 goveđeg proteina C napravljen je na isti način, samo se kao kalup u PCR reakciji koristi goveđi protein C mutant H11.
cDNA humanog proteina C sa 5' terminusom do aminokiseline na položaju 38 pojačana je putem PCR intaktnom cDNA humanog proteina C i klicama A i D. cDNA humanog proteina C od aminokiseline 27 do 3' terminusa pojačana je intaktnom cDNA humanog proteina C i klicama B i E. Ova dva fragmenta korištena su kao kalupi za pojačavanje cijele cDNA za goveđi protein C sa mutiranim aminokiselinama (E33 D34) klicama A i B. E33 mutant humanog proteina C dobiven je sljedećim koracima: cDNA humanog proteina C sa 5' terminusom do aminokiseline na položaju 38 pojačana je intaktnom cDNA humanog proteina C i klicama A i F. cDNA humanog proteina C od aminokiseline 27 do 3' terminusa pojačana je intaktnom cDNA humanog proteina C i klicama B i G. Ova dva fragmenta korištena su kao kalupi za pojačavanje cijele cDNA za goveđi protein C sa mutiranim aminokiselinama (E33) klicama A i B. PCR smjesa i program opisani su gore. PCR produkti humanog proteina C cijepani su pomoću Hind III i Sal I, i onda je fragment (Hind III - Sal I) zajedno sa fragmentom intaktnog humanog proteina C (Sal I - 3' terminus) kloniran u Hind III i Xba mjesta na vektoru pRc/CMV kako bi se proizvela cijela cDNA humanog proteina C sa predviđenim mutacijama. Sve mutacije potvrđene su sekvenciranjem DNA prije transfekcije. Linija 293 humanih stanica bubrega transficirana adenovirusom uzgajana je kako je opisano u primjeru 3. Rekombinantni goveđi i humani protein C i mutanti pročišćeni su kako je opisano u primjeru 3.
Proteini ovisni o vitaminu K klasificirani su u četiri grupe na osnovu njihovih afiniteta prema standardnoj membrani. (tablica 4). Redoslijed aminokiselinskih ostataka nekih relevantnih proteina uključivši humani protein C (hC), goveđi protein C (bC), protrombin (bPT), goveđi faktor X (bX) i humani faktor VII (hVII) dani su kao referenca, gdje X je Gla (y karboksiglutaminska kiselina) ili Glu.
[image]
TABLICA 4 Naboji i afinitet
[image]
a Veća vrijednost afiniteta odgovara kdisocijacije / 1 x107M-1 s1';
nazivnik je tipična za kdisocijacije za druge proteine.
U tablici 4, mutanti polipeptida ovisnih o vitaminu K otisnuti su debelo. Ukupni naboj (ostaci 1 -34) uključuje 7 iona kalcija (+14) i aminoterminus (+1).
Protein Z pripisan je klasi l na osnovu konstante brzine disocijacije koja je 100 do 1000 puta sporija nego za druge proteine. Kada bi protein Z pokazivao normalnu konstantu brzine asocijacije (oko 107 M-1 s1'), KD bi bila oko 10-10. Wei, G. J. et al., 1982, Biochemistry, 21: 1949-1959. Ovaj zadnji afinitet mogao bi biti maksimalan moguć za proteine vitamina K. Proteini klase IV razlikuju se od klase III po prisutnosti prolina -11 koji može promijeniti afinitet neelektrostatskim putem.
Dok postoji relativno slaba korelacija između afiniteta za membranu i ukupnog negativnog naboja na ostacima 1 - 34, odlična korelacija je nađena kada se uzmu u obzir samo ostaci 5, 11, 29. 33 i 34 (tablica 4). Ove zadnje aminokiseline smještene su na površini proteina. Više proteina modelirano je supstitucijom aminokiselina u protrombinsku strukturu i njihovi elektrostatski potencijali procijenjeni su programom DelPhi. Skica napravljena prema elektrostatskom potencijalu goveđe proteina Z pokazana je na slici 11. Elektronegativni položaji na 7, 8, 26, 30, 33, 34 i 11 stvaraju oblak elektronegativnog naboja oko kationske jezgre stvorene šupljinom obrubljenom kalcijem. (slika 11). Što je struktura proteina bliža ovoj strukturi, veći je njegov afinitet za membranu. Ova korelacija je vidljiva iz proteina divljeg tipa, mutanata i kemijski modiiciranih proteina.
Motiv za druge strukture može se ekstrapolirati iz proučavanja nabojnih grupa kojih nema u drugim proteinima. Na primjer, Lys -11 i Arg -10 goveđeg protrombina generiraju visoko elektropozitivna područja u svojoj blizini; manjak Gla-33 u proteinu C i faktoru VII stvaraju manje elektronegativnosti u tim regijama proteina. U svim slučajevima, najviši afinitet odgovara strukturi s elektropozitivnom jezgrom koja je bila potpuno okružena elektronegativnom površinom proteina, kao što je pokazano za protein Z. Iznimke u ovom motivu su proteini s Pro-10 koji može smanjiti afinitet strukturalnim utjecajem, i sr -12 (humani potein C) koji je jedinstven ostatak bez naboja.
Da se dalje ispita hipoteza arhetipa za elektrostatsku distribuciju, mutageneza upravljana položajem upotrijebljena je da se Gln33Asn34 goveđeg i humanog proteina C nadomjesti s Glu33Asp34 (SEQ ID N0: 19). Glu 33 treba dalje modificirati u Gla tokom procesiranja proteina. Ove promjene promijenile su elektrostatski potencijal goveđeg proteina C u onaj goveđeg faktora X. Afinitet za membranu mutantnog proteina očekuje se da će biti niži nego kod faktora X uslijed prisutnosti prolina-11. I zaista, goveđi protein C mutant ima afinitet za membranu sličan onome kod goveđeg protrombina (slika 12A) i neznatno manji nego goveđi faktor X (tablica 4).
Zanimljivije je da inhibiranje ugruška APC om je veće za mutant nego za divlji tip enzima (slika 12B, C). Uključivanje rezultata za P11H mutant goveđeg proteina C iz primjera 3 pokazalo je da se može proizvesti porodicu proteina, svaki s različitim afinitetom za membranu i aktivnošću, variranjem supstitucija aminokiselina na položajima 11, 33 i 34.
Mutanti humanog proteina C s E33 i E33D34 doveli su do malog povećanja afiniteta vezanja za membranu (slika 13a). Aktivnost ovih mutanata bila je malo manja nego divljeg tipa enzima (slika 13b). Rezultati s mutantima goveđeg proteina C ukazuju neuspjeh mutacije E33D34 u humanom proteinu možda dolazi od H11 i/ili drugih jedinstvenih aminokiselina u proteinu. Slika 14A pokazuje da je H11 mutant goveđeg proteina C vezan na membranu s oko 10 puta većim afinitetom od divljeg tipa enzima, E33D34 mutant vezan na membranu s oko 70 puta većim afinitetom, ali trostruki mutant H11E33D34 je samo malo bolji nego H11 mutant. Ovaj odnos se reflektira na aktivnost APC nastalog iz ovih mutanata (slika 14B) Ovaj rezultat predlaže da prisustvo mi smanjuje utjecaj E33D34 na afinitet vezanja na membranu. ovi rezultati ukazuju da uvođenje E33D34 ne mora biti optimalno za sve proteine. Kao posljedica, druge mutacije mogu biti poželjne da stvore humani protein C koji će koristiti E33D34 i imati maksimalno povećan afinitet za membranu. Rezultat s goveđim protein predlaže da histidin 11 može biti primarni uzrok ovog fenomena. Kao posljedica, H11 može se izmijeniti u glutamin ili neku drugu aminokiselinu u humanom proteinu C, zajedno s E33D34 mutacijom. Druga aminokiselina koja može imati utjecaj na afinitet je serin na položaju 12, aminokiselina koja je potpuno jedinstvena humanom proteinu C. Ove dodatne promjene trebale bi proizvesti proteine s pojačanim afinitetom za membranu. Elektrostatski arhetip također je isproban za usporedbu humanog i goveđeg faktora X. Prisutnost lizina -11 u humanom faktoru X ukazuje da je trebao imati niži afinitet goveđi faktor X. Ovo predviđanje je ostvareno, prema rezultatu pokazanom na slici 15.
Ranije studije pokazuju da modifikacije trinitrobenzensulfonskom kiselinom (TNBS) humanog i goveđeg protrombinskog fragmenta 1 ima relativno slab utjecaj (0 do5 puta) na afinitet za membranu. Weber, D.J. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:4564-4569; Welsh, D. J. et al,1988, Biochemistrv, 27: 3933-4938. Uvjeti za ovu reakciju doveli su do derivatiziranja amino terminusa, promjena koja se povezuje s nižim afinitetom za membranu. Welsh, D. J. i Nelsestuten, G. L, 1988, Biochemistrv. 27:4939-4945. Modifikacija proteina u prisustvu kalcija koji štiti amino terminus, dovela je do TNBS modificiranog proteina s puno većim afinitetom za membranu nego izvorni fragment 1.
Prijedlog da protein Z čini arhetip temelji se na njegovoj konstanti brzine disocijacije i tome da bi normalna brzina dosocijacije dovela do KD =10-10 M. Nije sigurno da li se ova vrijednost može postići. Moguće je da mala brzina asocijacije proteina Z je uzrokovana nepropisnim slaganjem proteina, što rezultira niskom koncentracijom konformacije za vezanje na membranu. Ako se uvjeti mogu promijeniti da poboljšaju slaganje proteina, brzine asocijacije proteina Z bi se trebalo popraviti. I zaista, konstanta brzine asocijacije proteina Z poboljšana je promjenom pH. Osnova za ovo opažanje može se povezati s neuobičajenim svojstvom protrombinske strukture u kojoj je aminoterminus (+1 kod pH 7,5) blizu iona kalcija 2 i 3. Naboj +1 na amino terminusu odgovoran je za lagano elektropozitivno područje odmah iznad CA-1 u slici 1. Odbijanje naboja između kalcija i aminoterminala može destabilizirati slaganje proteina i moglo bi bit ozbiljan problem za protein koji ima malu stabilnost slaganja.
Tablica 5 pruža daljnju potporu za model arhetipa. Ona pokazuje odnos između udaljenosti ionskih grupa od iona stroncija 1 i 8 (odgovara kalciju 1 i dodatnom dvovalentnom metalnom ionu u Sr rendgenskoj kristalnoj strukturi potrombina. Ovaj raspored ukazuje da što je ionska grupa bliže tim metalnim ionima, to je veći njezin utjecaj na afinitet za membranu. Izuzetak je Arg-16 koji doprinosi naboju elektropozitivne jezgre. Veći afinitet se povezuje s elektronegativnim nabojem na svim drugim mjestima. Ova korelacija odnosi se također i na GLA ostatke.
TABLICA 5
Udaljenost do Sr - 1,8 i važnost iona
[image]
a Udaljenosti su od ovog atoma goveđeg protrombina (ostatak protrombina upotrijebljen u mjerenj dan u zakradi) do strondja 1 i 8 u strukturi fragmenta 1 strukture Sr - protrombin
bZa sve osim 16-R, kationi smanjuju afinitet i anioni povećavaju
afinitet.
cT
d Utjecaj Glu do Asp mutacija, udaljenosti su srednje vrijednosti za gama - karboksil - ugljike. KD(KM) podaci od
eVezanje je manjeg kapaciteta ili je uzrokovalo agregiranje čime
uspoređivanje postaje manje izvjesno.
Rezultati u slici 15C pokazuju da se brzina asocijacije za protein Z znatno povećala kod pH9 gdje bi aminoterminal trebao biti bez naboja. Konstanta brzine reakcije je oko 12puta veća kod pH 9 nago kod pH 7,5 (slika 15C).
Druge izvedbe
Treba razumjeti da, dok je izum opisan u vezi s njegovim detaljnim opisom, opis je mišljen da ilustrira a ne ograniči raspon izuma koji je definiran rasponom dodanih patentnih zahtjeva. Drugi aspekti, prednosti i modifikacije su unutar raspona sljedećih zahtjeva.
(Stari patentni zahtjevi)
1. Polipeptid ovisan o vitaminu K naznačen time da uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu navedenog polipeptida relativno u odnosu na odgovarajući izvorni polipeptid ovisan o vitaminu K, a modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
2. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da je navedena GLA domena od aminokiseline 1 do oko aminokiseline 45.
3. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da je navedena supstitucija aminokiseline na aminokiselini 11, 12, 29,33 ili 34.
4. Polipeptid prema zahtjevu 3 naznačen time da je navedena supstitucija aminokiseline na aminokiselini 11, 33 ili 34.
5. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da navedeni polipeptid uključuje protein C ili aktivirani protein C.
6. Polipeptid prema zahtjevu 5 naznačen time da navedena supstitucija aminokiseline uključuje ostatak glutaminske kiseline na aminokiselini 33 i ostatak aspartanske kiseline na aminokiselini 34 (SEQ ID N0:19).
7. Polipeptid prema zahtjevu 6 naznačen time da navedena supstitucija aminokiseline dalje uključuje glutamin na aminokiselini 11 (SEQ ID N0:20).
8. Polipeptid prema zahtjevu 6 naznačen time da navedena supstitucija aminokiseline dalje uključuje glutaminsku kiselinu na aminokiselini 11 (SEQ ID N0:21).
9. Polipeptid prema zahtjevima 6 ili 7 naznačen time da navedena supstitucija aminokiseline dalje uključuje glicin na aminokiselini 12 (SEQ ID N0:24 ili SEQ ID N0:35).
10. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da navedeni polipeptid uključuje faktor VII ili faktor VIIa.
11. Polipeptid prema zahtjevu 10 naznačen time da navedena supstitucija aminokiseline uključuje glicin na aminokiselini 11 i ostatak glutaminske kiseline na aminokiselini 33 (SEQ ID N0:30).
12. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da navedeni polipeptid uključuje faktor IX ili faktor IXa.
13. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da navedeni polipeptid uključuje faktor VIIa s modificiranim aktivnim mjestom.
14. Polipeptid prema zahtjevu 13 naznačen time da navedena supstitucija aminokiseline uključuje glutamin na aminokiselini 11 i ostatak glutaminske kiseline na aminokiselini 33 (SEQ ID N0:30).
15. Polipeptid ovisan o vitaminu K prema zahtjevu 1 naznačen time da modificirana GLA domena uključuje redoslijed aminokiselina koje u stanju zasićenom kalcijem čine tercijarnu strukturu s kationskim jezgrom i oblakom elektronegativnog naboja.
16. Izolirana nukleinska kiselina koja kodira polipeptid ovisan o vitaminu K naznačen time da navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu navedenog polipeptida relativno u odnosu izvorni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
17. Stanica domaćina kod sisavca naznačena time da uključuje vektor nukleinskih kiselina a navedeni vektor kodira polipeptid ovisan o vitaminu K i navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modifidrana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
18. Farmaceutska kompozicija naznačena time da se sastoji od farmaceutski prihvatljivog nosača i količine polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivne da inhibira formiranje ugruška kod sisavca gdje navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modifidrana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
19. Farmaceutska kompozicija naznačena time da se sastoji od farmaceutski prihvatljivog nosača i količine polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivne da poveća formiranje ugruška kod sisavca gdje navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
20. Polipeptid ovisan o vitaminu K naznačen time da je za upotrebu liječenja poremećaja zgrušavanja gdje navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
21. Upotreba polipeptida ovisnog o vitaminu K naznačena time da je za proizvodnju medikamenta za liječenje poremećaja zgrušavanja gdje navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
22. Postupak za smanjivanje formiranja ugruška kod sisavca naznačen time da se sastoji od davanja navedenom sisavcu količine polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivne da smanji formiranje ugruška kod sisavca gdje navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modifidranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
23. Postupak za pojačavanje formiranja ugruška kod sisavca naznačen time da se sastoji od davanja navedenom sisavcu količine polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivne da pojača formiranje ugruška kod sisavca gdje navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajud nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.

Claims (30)

1. Polipeptid ovisan o vitaminu K naznačen time da uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu navedenog polipeptida relativno u odnosu na odgovarajući izvorni polipeptid ovisan o vitaminu K, a navedena modificirana GLA uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline na ostatku 11, 12, 29 ili 34.
2. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da je navedena supstitucija aminokiseline na aminokiselini 11 ili 34.
3. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da navedeni polipeptid dalje uključuje supstituciju aminokiseline na aminokiselini 33.
4. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da navedeni polipeptid uključuje supstituciju aminokiseline na aminokiselini 11 i aminokiselini 33.
5. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da navedeni polipeptid povećava formiranje ugruška.
6. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da navedeni polipeptid inhibira formiranje ugruška.
7. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da navedeni polipeptid uključuje protein C ili aktivirani protein C.
8. Polipeptid prema zahtjevu 7 naznačen time da navedena supstitucija aminokiseline uključuje ostatak glutaminske kiseline na aminokiselini 33 i ostatak aspartanske kiseline na aminokiselini 34 (SEQ ID N0:20).
9. Polipeptid prema zahtjevu 8 naznačen time da navedena supstitucija aminokiseline dalje uključuje glutamin na aminokiselini 11 (SEQ ID N0:20).
10. Polipeptid prema zahtjevu 8 naznačen time da navedena supstitucija aminokiseline dalje uključuje glutaminsku kiselini na aminokiselini 11 (SEQ ID N0:21).
11. Polipeptid prema zahtjevima 9ili10 naznačen time da navedena supstitucija aminokiseline dalje uključuje glicin na aminokiselini 12 (SEQ ID N0:24 ili SEQ ID N0:35).
12. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da navedeni polipeptid uključuje faktor VII ili faktor VIIa.
13. Polipeptid prema zahtjevu 12 naznačen time da navedena supstitucija aminokiseline uključuje glutaminski ostatak na aminokiselini 11 i ostatak glutaminske kiseline na aminokiselini 33 (SEQ ID N0:30).
14. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da navedeni polipeptid uključuje faktor IX ili faktor IXa.
15. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da navedeni polipeptid uključuje faktor VIIa s modificiranim aktivnim mjestom.
16. Polipeptid prema zahtjevu 15 naznačen time da navedena supstitucija aminokiseline uključuje glutaminski ostatak na aminokiselini 11 i ostatak glutaminske kiseline na aminokiselini 33 (SEQ ID N0:30).
17. Polipeptid prema zahtjevu 1 naznačen time da modificirana GLA domena uključuje redoslijed aminokiselina koje u stanju zasićenom kalcijem čine tercijarnu strukturu s kationskim jezgrom i oblakom elektronegativnog naboja.
18. Polipeptid ovisan o vitaminu K naznačen time da navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu i aktivnost navedenog polipeptida relativno u odnosu izvorni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline gdje je navedeni polipeptid onaj koji inhibira formiranje ugruška.
19. Polipeptid prema zahtjevu 18 naznačen time da je navedena GLA domena od aminokiseline 1 do oko aminokiseline 45.
20. Polipeptid prema zahtjevu 18 naznačen time da je navedena supstitucija aminokiseline na aminokiselini 11, 12, 29,33 ili 34.
21. Izolirana nukleinska kiselina koja kodira polipeptid ovisan o vitaminu K naznačen time da navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu i aktivnost navedenog polipeptida relativno u odnosu na odgovarajući izvorni polipeptid ovisan o vitaminu K.
22. Stanica domaćina sisavca naznačena time da uključuje vektor nukleinskih kiselina a navedeni vektor kodira polipeptid ovisan o vitaminu K i navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu i aktivnost relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
23. Farmaceutska kompozicija naznačena time da se sastoji od farmaceutski prihvatljivog nosača i količine polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivne da inhibira formiranje ugruška kod sisavca gdje navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu i aktivnost relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
24. Farmaceutska kompozicija naznačena time da se sastoji od farmaceutski prihvatljivog nosača i količine polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivne da poveća formiranje ugruška gdje navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline na ostatku 11, 12, 29 ili 34.
25. Farmaceutska kompozicija prema zahtjevu 24 naznačena time da navedeni polipeptid dalje uključuje supstituciju aminokiseline na aminokiselini 33.
26. Farmaceutska kompozicija prema zahtjevu 24 naznačena time da navedena farmaceutska kompozicija dalje uključuje topljivi tkivni faktor.
27. Polipeptid ovisan o vitaminu K naznačen time daje za upotrebu kod liječenja poremećaja zgrušavanja gdje uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu i aktivnost navedenog polipeptida relativno u odnosu na odgovarajući izvorni polipeptid ovisan o vitaminu K, a navedena modificirana GLA uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
28. Upotreba polipeptida ovisnog o vitaminu K naznačena time da je za proizvodnju medikamenta za liječenje poremećaja zgrušavanja gdje navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu i aktivnost relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
29. Postupak za smanjivanje formiranja ugruška kod sisavca naznačen time da se sastoji od davanja navedenom sisavcu količine polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivne da smanji formiranje ugruška kod sisavca gdje navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu i aktivnost relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline.
30. Postupak za pojačavanje formiranja ugruška kod sisavca naznačen time da se sastoji od davanja navedenom sisavcu količine polipeptida ovisnog o vitaminu K efektivne da pojača formiranje ugruška kod sisavca gdje navedeni polipeptid ovisan o vitaminu K uključuje modificiranu GLA domenu koja pojačava afinitet vezanja na membranu relativno u odnosu na odgovarajući nativni polipeptid ovisan o vitaminu K i navedena modificirana GLA domena uključuje najmanje jednu supstituciju aminokiseline na ostatku 11, 12, 29 ili 34.
HR20000234A 1997-10-23 2000-04-20 Modified vitamin k-dependent polypeptides HRP20000234A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/955,636 US6017882A (en) 1997-10-23 1997-10-23 Modified vitamin K-dependent polypeptides
PCT/US1998/022152 WO1999020767A1 (en) 1997-10-23 1998-10-20 Modified vitamin k-dependent polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20000234A2 true HRP20000234A2 (en) 2001-08-31

Family

ID=25497114

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20000234A HRP20000234A2 (en) 1997-10-23 2000-04-20 Modified vitamin k-dependent polypeptides

Country Status (30)

Country Link
US (1) US6017882A (hr)
EP (2) EP1676919B1 (hr)
JP (1) JP4276379B2 (hr)
KR (1) KR20010031370A (hr)
CN (1) CN1246462C (hr)
AP (1) AP2000001811A0 (hr)
AR (2) AR020048A1 (hr)
AT (1) ATE390486T1 (hr)
AU (1) AU749279C (hr)
BR (1) BR9814611A (hr)
CA (1) CA2307175C (hr)
DE (1) DE69839313T2 (hr)
DK (1) DK1090128T3 (hr)
EA (1) EA200000449A1 (hr)
ES (2) ES2303362T3 (hr)
HR (1) HRP20000234A2 (hr)
HU (1) HU225993B1 (hr)
ID (1) ID26330A (hr)
IL (1) IL135603A0 (hr)
IS (1) IS5449A (hr)
MY (1) MY136336A (hr)
NO (1) NO20002025L (hr)
NZ (1) NZ504114A (hr)
PL (1) PL194194B1 (hr)
PT (1) PT1090128E (hr)
SG (1) SG105547A1 (hr)
TR (1) TR200001105T2 (hr)
TW (1) TW587081B (hr)
WO (1) WO1999020767A1 (hr)
ZA (1) ZA989597B (hr)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6693075B1 (en) * 1997-10-23 2004-02-17 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US7247708B2 (en) * 1997-10-23 2007-07-24 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US6747003B1 (en) 1997-10-23 2004-06-08 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US6998122B1 (en) 1999-04-30 2006-02-14 Eli Lilly And Company Protein C derivatives
JP2003514545A (ja) * 1999-11-19 2003-04-22 イーライ・リリー・アンド・カンパニー プロテインｃ誘導体
ES2234807T3 (es) 2000-02-02 2005-07-01 Eli Lilly And Company Derivados de proteina c.
EP1263943A1 (en) 2000-02-11 2002-12-11 Eli Lilly & Company Protein c derivatives
RU2278123C2 (ru) 2000-02-11 2006-06-20 Максиджен Холдингз Лтд. Молекулы, подобные фактору vii или viia
US7220837B1 (en) 2000-04-28 2007-05-22 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US7812132B2 (en) * 2000-04-28 2010-10-12 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US20030211094A1 (en) * 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
US7160540B2 (en) * 2000-06-30 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Methods for detecting activity of clottings factors
US6423826B1 (en) 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
US6828306B2 (en) * 2000-07-31 2004-12-07 Ottawa Heart Institute Research Corporation Charged lipid compositions and methods for their use
US6933367B2 (en) 2000-10-18 2005-08-23 Maxygen Aps Protein C or activated protein C-like molecules
CA2440092A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-12 T.A.C. Thrombosis And Coagulation Ab Protein c variants
JP2005518801A (ja) * 2002-03-01 2005-06-30 テイ・エイ・シー・スロムボシス・アンド・コアグラシヨン・アクテイエボラーク 組換えプロテインｃバリアント
US20030186862A1 (en) * 2002-04-02 2003-10-02 Nelsestuen Gary L. Factor VIIa compositions
PT1499719E (pt) 2002-04-30 2011-02-09 Bayer Healthcare Llc Variantes polipeptídicas do factor vii ou viia
US20030232075A1 (en) * 2002-05-06 2003-12-18 University Of Minnesota, A Minnesota Corporation Compositions for producing factor Xa
EP2283856B1 (en) 2002-06-21 2017-09-20 Novo Nordisk Health Care AG Stabilised solid compositions of factor VIIa polypeptides
US20040176704A1 (en) * 2003-03-04 2004-09-09 Stevens Timothy A Collection device adapted to accept cartridge for point of care system
WO2004083421A1 (en) 2003-03-18 2004-09-30 Novo Nordisk Health Care Ag Method for the production of gla-residue containing serine proteases
ATE431403T1 (de) 2003-03-20 2009-05-15 Bayer Healthcare Llc Fvii oder fviia varianten
RU2373282C2 (ru) 2003-06-19 2009-11-20 Байер Хелткэр Ллк ВАРИАНТЫ ДОМЕНА GLA ФАКТОРА VII ИЛИ VIIa
ES2381110T3 (es) 2003-09-09 2012-05-23 Novo Nordisk Health Care Ag Polipéptidos de factor VII de coagulación
KR100755967B1 (ko) * 2003-10-23 2007-09-06 한국타이어 주식회사 타이어의 비드와 휠의 갭 측정장치
EP2275432A1 (en) 2003-12-01 2011-01-19 Novo Nordisk Health Care AG Nanofiltration of factor VII solutions to remove virus
AU2004298789A1 (en) 2003-12-19 2005-06-30 Novo Nordisk Health Care Ag Stabilised compositions of factor VII polypeptides
ES2397241T3 (es) 2004-01-21 2013-03-05 Novo Nordisk Health Care Ag Conjugación de péptidos mediante transglutaminasa
KR101364001B1 (ko) 2004-12-23 2014-02-17 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 관심있는 비타민 ｋ-의존성 단백질을 포함한 조성물 중의단백질 오염물질의 양의 감소
US8206750B2 (en) 2005-03-24 2012-06-26 Cerenis Therapeutics Holding S.A. Charged lipoprotein complexes and their uses
US20080188400A1 (en) * 2005-04-26 2008-08-07 Maxygen Holdings Ltd. Methods For Treating Bleeding
WO2006134173A2 (en) 2005-06-17 2006-12-21 Novo Nordisk Health Care Ag Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprising at least one non-native cysteine
WO2007006808A1 (en) 2005-07-13 2007-01-18 Novo Nordisk Health Care Ag Host cell protein knock-out cells for production of therapeutic proteins
CN101268185B (zh) 2005-09-01 2013-03-27 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 因子ⅶ多肽的疏水作用色谱纯化
US20090055942A1 (en) 2005-09-14 2009-02-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Human Coagulation Factor VII Polypeptides
ES2531934T3 (es) 2006-09-01 2015-03-20 Novo Nordisk Health Care Ag Glicoproteínas modificadas
CA2673260A1 (en) * 2006-12-20 2008-07-03 Bayer Healthcare Llc Factor vii and viia compositions
SG174077A1 (en) 2007-04-13 2011-09-29 Catalyst Biosciences Inc Modified factor vii polypetides and uses thereof
US20080305157A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-11 University Of Maryland Office Of Technology Commercialization Encapsulation and separation of charged organic solutes inside catanionic vesicles
PT2235197T (pt) 2007-12-27 2017-10-11 Baxalta Inc Processos para cultura de células
TWI465247B (zh) * 2008-04-11 2014-12-21 Catalyst Biosciences Inc 經修飾的因子ｖｉｉ多肽和其用途
AU2010258752B2 (en) 2009-06-09 2015-07-09 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
EP2514760B1 (en) * 2009-12-14 2015-10-21 National University Corporation Hokkaido University Peptides imparting cell permeability to lipid membrane structure
TWI557135B (zh) 2010-11-03 2016-11-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
MX365612B (es) 2012-07-25 2019-06-07 Catalyst Biosciences Inc Polipeptidos de factor x modificados y usos de los mismos.
US11491212B1 (en) 2017-09-27 2022-11-08 Catalyst Biosciences, Inc. Subcutaneous administration of modified factor IX polypeptides and treatment of hemophilia B
US20210069306A1 (en) 2019-08-15 2021-03-11 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration and on-demand treatment
WO2021154414A2 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Catalyst Biosciences, Inc. Gene therapy for hemophilia b with a chimeric aav capsid vector encoding modified factor ix polypeptides

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI882746A (fi) * 1987-06-12 1988-12-13 Hoechst Japan Hybridprotein c och foerfarande foer dess framstaellning.
JPH0246296A (ja) * 1988-08-09 1990-02-15 Hoechst Japan Ltd 雑種プロテインｃ及びその製造方法
US5580560A (en) * 1989-11-13 1996-12-03 Novo Nordisk A/S Modified factor VII/VIIa
ATE180834T1 (de) * 1990-01-29 1999-06-15 Zymogenetics Inc Antikoagulierende proteine
US5504064A (en) * 1991-04-10 1996-04-02 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of bleeding with modified tissue factor in combination with an activator of FVII

Also Published As

Publication number Publication date
NO20002025L (no) 2000-06-19
ID26330A (id) 2000-12-14
EP1090128A1 (en) 2001-04-11
NZ504114A (en) 2002-10-25
SG105547A1 (en) 2004-08-27
CA2307175C (en) 2009-04-14
AP2000001811A0 (en) 2000-06-30
IS5449A (is) 2000-04-14
EA200000449A1 (ru) 2000-12-25
AU749279B2 (en) 2002-06-20
PT1090128E (pt) 2008-04-17
DE69839313D1 (de) 2008-05-08
TR200001105T2 (tr) 2000-09-21
JP4276379B2 (ja) 2009-06-10
HUP0102257A3 (en) 2003-09-29
IL135603A0 (en) 2001-05-20
JP2001520042A (ja) 2001-10-30
CA2307175A1 (en) 1999-04-29
PL194194B1 (pl) 2007-05-31
BR9814611A (pt) 2000-10-03
EP1676919B1 (en) 2014-07-23
CN1246462C (zh) 2006-03-22
NO20002025D0 (no) 2000-04-18
ES2303362T3 (es) 2008-08-01
TW587081B (en) 2004-05-11
DE69839313T2 (de) 2009-04-16
EP1676919A1 (en) 2006-07-05
DK1090128T3 (da) 2008-06-23
HUP0102257A2 (hu) 2001-09-28
PL340284A1 (en) 2001-01-29
CN1283231A (zh) 2001-02-07
AU749279C (en) 2004-09-16
AR035786A2 (es) 2004-07-14
US6017882A (en) 2000-01-25
WO1999020767A1 (en) 1999-04-29
AU2702499A (en) 1999-05-10
HU225993B1 (en) 2008-02-28
AR020048A1 (es) 2002-04-10
KR20010031370A (ko) 2001-04-16
ES2496104T3 (es) 2014-09-18
MY136336A (en) 2008-09-30
ATE390486T1 (de) 2008-04-15
EP1090128B1 (en) 2008-03-26
ZA989597B (en) 1999-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HRP20000234A2 (en) Modified vitamin k-dependent polypeptides
US6762286B2 (en) Modified vitamin K-dependent polypeptides
US8415457B2 (en) Modified vitamin K-dependent polypeptides
US20060264373A1 (en) Modified vitamin K-dependent polypeptides
US9493757B2 (en) Modified factor VII or factor VIIa polypeptides
MXPA00003916A (en) Modified vitamin k-dependent polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
AIPI Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application
ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20031010

Year of fee payment: 6

OBST Application withdrawn