KR20010031370A

KR20010031370A - 변형된 비타민 ｋ-의존성 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20010031370A
Application number: KR1020007004378A
Authority: KR
Inventors: 넬세스투엔개리엘
Original assignee: 미네소타대학리전트
Priority date: 1997-10-23
Filing date: 1998-10-20
Publication date: 2001-04-16
Also published as: NO20002025L; ID26330A; EP1090128A1; NZ504114A; SG105547A1; CA2307175C; AP2000001811A0; IS5449A; EA200000449A1; AU749279B2; PT1090128E; DE69839313D1; TR200001105T2; JP4276379B2; HUP0102257A3; IL135603A0; JP2001520042A; CA2307175A1; PL194194B1; BR9814611A

Abstract

본 발명은 향상된 막 결합 친화성을 가진 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 제공한다. 이들 폴리펩티드는 포유동물에서 응혈의 형성을 조절하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 응혈의 형성을 조절하는 방법에 대해 설명하고 있다.

Description

변형된 비타민 Ｋ-의존성 폴리펩티드{MODIFIED VITAMIN K-DEPENDENT POLYPEPTIDES}

비타민 K-의존성 단백질은 아미노 말단의 45 잔기에 9 내지 13개의 감마-카르복시글루탐산 잔기(Gla)를 함유한다. Gla 잔기는 단백질 전구체 중의 비타민 K를 이용하여 글루탐산 잔기의 측쇄를 카르복실화시키는 간에 있는 효소에 의해 생성된다. 비타민 K-의존성 단백질은 다수의 생물학적 공정에 관계되어 있고, 가장 잘 알려진 것은 혈액 응집이다(reviewed in furie, B. and Furie, B.C., 1988, Cell, 53:505-518). 비타민 K-의존성 단백질은 단백질 Z, 단백질 S, 프로트롬빈, 인자 X, 인자 IX, 단백질 C, 인자 VII 및 가스6(Gas6)을 포함한다. 후자의 단백질은 세포의 성장 조절 작용을 한다[Masubara et al., 1996, Dev. Biol., 180:499-510]. Gla 잔기는 이들 단백질에 의한 적절한 칼슘 결합 및 세포막 상호 작용에 필요하다. 인자 X의 막 접촉 부위는 아미노산 잔기 1-37내에 위치하는 것으로 생각된다[Evans and Nelsestuen, 1996, Protein Science 5: suppl. 1, 163 Abs]. 혈장 단백질의 Gla-함유 부위는 고도의 서열 상동성을 나타내지만, 이들은 세포막 친화성에 있어서 1000배 이상이다[McDonald, J.F. et al., 1997, Biochemistry, 36:5120-5137].

인자 VII는 혈액 응고의 초기 단계에서 작용하며 혈병을 형성하는데 중요한 요소일 수 있다. 불활성 전구체 또는 효소원(zymogen)은 인자 VIIa를 형성하기 위해 단백질분해적 분해에 의해 크게 증가되는 낮은 효소 활성을 가진다. 이 활성화는 다수의 세포 형태에서 발견되는 중요한 막 단백질인 VIIa-조직 인자 및 인자 Xa에 의해 촉매화될 수 있다[Fiore, M.M., et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:143-149]. VIIa-조직 인자의 활성화는 자가활성화로서 언급된다. 이것은 인자 VIIa의 활성화(인자 VII로부터 인자 VIIa의 형성) 및 연속적인 활성화 모두에 관계되어 있다. 생체내 활성화에 대한 가장 중요한 경로는 알려져 있지 않다. 인자 VIIa는 혈액 응고 인자 IX 및 X을 활성화시킬 수 있다.

조직 인자는 일부 종양 세포의 표면에서 고도로 발현된다. 종양의 발달 및 조직의 침입에서 조직 인자 및 인자 VIIa이 역할을 할 가능성이 있다[Vrana, J.A. et al., Cancer Res., 56: 5063-5070]. 또한, 조직 인자의 세포 발현 및 작용은 내인성 쇽에 대한 독성 반응에서 중요한 인자이다[Dackiw, A.A. et al., 1996, Arch. Surg. 131: 1273-1278].

단백질 C는 내피 세포의 중요한 막 단백질인 트롬보모둘린의 존재하 트롬빈에 의해 활성화된다[Esmon, N.L. et al., 1982, J. Biol. Chem., 257:859-864]. 활성화된 단백질 C(APC)는 그것의 보조 인자인 단백질 S와 함께 인자 Va 및 VIIIa를 분해한다. APC에 대한 저항성은 유전되는 혈전성 질병의 가장 일반적인 형태이다. [Dahlback, B., 1995, Blood, 85:607-614]. 비타민 K 저해제는 일반적으로 혈전성 질병의 예방적 용도로 투여된다.

비타민 K-의존성 단백질은 특정한 형태의 헤모필리아(haemophilia)를 치료하는 데 사용된다. 헤모필리아 A는 활성 인자 VIII, 인자 VIIIa의 부재 또는 인자 VIII에 대한 저해제의 존재를 특징으로 한다. 헤모필리아 B는 활성 인자 IX, IXa의 부재를 특징으로 한다. 희귀하기는 하나 인자 VII 결핍증은 인자 VII 투여에 양호하게 반응한다[Bauer, K.A., 1996, Haemostasis, 26:155-158, suppl. 1]. 인자 VIII 대체 요법은 일부 환자에서 높은 역가의 억제 인자 VIII 항체의 개발에 기인하여 제한된다. 대안적으로, 인자 VIIa는 헤모필리아 A 및 B의 치료에서 사용될 수 있다. 인자 IXa 및 인자 VIIIa는 인자 X를 활성화한다. 인자 VIIa는 인자 X를 직접 활성화함으로써 인자 IX 및 VIII에 대한 필요성을 제거하고 면역학적 결과없이 인자 IX 및 VIII 결핍증의 문제를 극복할 수 있다[Hedner et al., 1993, Transfus. Medi. Rev., 7:78-83; Nicolaisen, E.M. et al., 1996, Thromb, Haemost., 76:200-204]. 인자 VIIIa의 유효한 투여 레벨은 종종 높고(체중 kg 당 45 내지 90 ㎍/kg), 투여는 수시간마다 반복되어야 할 필요가 있다[Shulmav, S. et al., 1996, Thromb. Haemost., 75:432-436].

막 접촉 부위를 보유하지 않는 조직 인자의 가용성 형태는 인자 VIIa와 함께 투여될 때, 헤모필리아의 치료에 유효하다는 것이 밝혀졌다[참조: 미국 특허 제 5,504,064호]. 개에 있어서, sTF는 헤모필리아의 치료에 필요한 인자 VIIa의 양을 감소시킨다. sTF-VIIa는 인자 VII의 막 접촉 부위에 전적으로 의존한다. 이는 조직 인자 및 VIIa를 통해 막에 결합된 정상적인 조직-인자 VIIa 복합체와 대조적이다.

본 발명은 향상된 막 결합 친화성을 가진 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 관한 것이다. 이들 폴리펩티드는 포유동물에서 응혈 형성을 조절하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 응괴의 형성을 조절하는 방법에 관한 것이다.

야생형 VIIa 및 VIIQ11E33의 GLA 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 3 및 서열 번호 30에서 각각 발견된다. 소의 인자 X, 소의 단백질 C, 인간의 단백질 C 및 소의 단백질 C-H11은 서열 번호 18, 서열 번호 2, 서열 번호 1 및 서열 번호 23에서 각각 발견된다. 단백질 C VQ33E, N34D의 GLA 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 19에서 발견된다.

도1은 표준 편차를 가진, 막에 대한 야생형 VIIa(채색되지 않은 원), VIIQ11E33(채색된 원), 및 소의 인자 X(채색된 삼각형)의 결합에 대해 도시한 것이다.

도2는 VIIQ11E33의 자가활성화를 도시한 것이다. 점선은 인지질이 없는 경우의 활성을 도시한 것이다.

도3은 인자 VII에 의한 인자 X의 활성화에 대해 도시하고 있다. 야생형 인자 VIIa(채색되지 않은 원) 및 VIIaQ11E33(채색된 원)은 0.06 nM의 농도로 주어진다.

도4는 가용성 조직 인자를 가진 VIIa 및 VIIAQ11E33에 의한 인간 혈장의 응집에 대해 도시한 것이다.

도5는 인자 VII 효소원 및 정상 조직 인자에 의한 혈장의 응집에 대해 도시하고 있다.

도6은 활성 부위가 변형된 인자 VIIaQ11E33(DEGR-VIIQ11E33)에 의한 응혈 형성 억제에 대해 도시하고 있다.

도7은 래트레서 인자 VIIQ11E33의 순환 시간에 대해 도시하고 있다.

도8은 정상 및 변형된 단백질에 의한 막 상호작용에 대해 도시하고 있다. 판넬 A는 베지클과 야생형 소의 단백질 C(채색되지 않은 원) 및 소의 단백질 C-H11(채색된 원)의 상호작용에 대해 도시하고 있다. 판넬 B는 야생형 인간 단백질 C(채색되지 않은 원) 및 인간의 단백질 C-P11(채색된 원)과 막의 상호작용에 대해 도시하고 있다. 둘다에 있어서, 첨가된 단백질 모두가 막에 결합된었다면 점선은 결과를 나타낸다.

도9는 활성화된 단백질 C가 응고 시간에 대해 미치는 영향을 도시하고 있다. 판넬 A에서, 야생형 소의 APC(채색되지 않은 원) 및 bAPC-H11(채색된 원)에 대한 소의 혈장의 응집 시간을 3회 측정하여 그평균과 표준편차를 도시하고 있다. 판넬 B에서, 야생형 인간(채색되지 않은 원) 및 인간 APC-P11(채색된 원)에 대한 3회의 반복된 인간 혈장 응집 결과의 평균과 표준편차에 대해 도시하고 있다.

도10은 소 및 인간 APC에 의한 인자 Va의 불활성화에 대해 도시하고 있다. 판넬 A는 야생형 소의 APC(패색되지 않은 원) 및 소의 APC-H11(채색된 원)에 의한 인자 Va 의 불활성화에 대해 도시하고 있다. 판넬 B는 야생형 인간 APC(채색되지 않은 원) 및 인간 APC-H11(채색된 원)에 의한 단백질 S가 결핍된 혈장에서 인간의 인자 Va의 불활성화에 대해 도시하고 있다.

도11은 단백질 Z의 정전기적 분포에 대해 도시하고 있다. 수직선은 전기적 양성을 띄고 있는 부위를 나타내고, 수평선은 전기적 음성을 띄고 있는 부위를 나타낸다.

도12는 다양한 단백질 Cs의 막 결합 및 활성을 도시하고 있다. 판넬 A는 야생형 단백질 C(채섹되지 않은 원), 단백질 C의 P11H 돌연변이체(채색된 사각형), Q33E, N34D 돌연변이체(채색된 원) 및 소의 프로트롬빈(채색되지 않은 사각형)에 의한 막 결합을 도시하고 있다. 판넬 B는 이들 돌연변이체에 의한 혈액 응집의 억제에 대해 도시하고 있다. 판넬 C는 인자 Va의 불활성화에 대해 도시하고 있다.

도13은 인간 단백질 C 돌연변이체의 활성 및 막 결합에 대해 도시하고 있다. 판넬 A는 야생형(채색되지 않은 원), E33(채색되지 않은 삼각형) 및 E33D34(채색된 원)의 막 결합을 비교하고 있다. 판넬 B는 야생형(채색되지 않은 삼각형), E33(채색되지 않은 원) 및 E33D34(채색된 원)를 사용하여 응집 시간을 비교하고 있다.

도14는 야생형(채색되지 않은 사각형), H11(채색된 삼각형), E33D34(채색되지 않은 삼각형) 및 소의 단백질 C의 3중 H11E33D34 돌연변이체(채색되지 않은 원)을 사용한 막 결합(판넬 A) 및 응집 억제(판넬 B)에 대해 도시하고 있다.

도15는 다른 비타민 K-의존성 폴리펩티드의 막 상호작용 특성에 대해 나타내고 있다. 판넬 A는 인간(채색된 원) 및 소(채색되지 않은 원)의 인자 X의 막 상호작용을 비교하고 있다. 판넬 B는, 정상 소의 프로트롬빈 단편 1(채색되지 않은 원), 칼슘이 없는 상태에서 TNBS로 변형된 단편 1(채색된 원) 및 25 mM 칼슘의 존재하에 TNBS로 변형된 단편 1(채색된 사각형)과의 막 상호작용에 대해 도시하고 있다. 판넬 C는 pH 9(채색된 원) 및 pH 7.5(채색되지 않은 원)에 대한 단백질 Z의 결합 속도에 대해 도시하고 있다.

발명의 개요

비타민 K-의존성 폴리펩티드의 감마-카르복시글루탐산(GLA) 도메인내의 변형이 이것의 막 결합 친화성을 향상시킨다는 사실이 발견되었다. 이러한 방법으로 변형된 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 향상된 활성을 가지며 항응고제, 준응고제(pro-coagulant)로서, 또는 비타민 K-의존성 단백질을 이용하는 다른 작용에 기인하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 개선된 인자 VII 분자는 필요한 VIIa의 투여량, 상대적인 투여 빈도를 감소시키거고/거나 결핍 상태를 보다 효과적으로 치료하는 질적인 변화를 제공함으로써 몇가지 이점을 제공할 수 있다.

본 발명은 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시킨 변형된 GLA 도메인을 포함하는 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 특징으로 한다. 변형된 GLA 도메인은 약 제1 아미노산 내지 약 제45 아미노산이고, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 치환은 제1, 12, 29, 33 또는 34 아미노산에서 일어날 수 있다. 제11, 33 또는 34 아미노산이 치환된 것이 바람직하다. 변형된 GLA 도메인은 칼슘이 포화된 상태에서 양이온성 코어에 전기적 음전하를 띈 할로를 보유한 3차 구조를 형성하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

비타민 K-의존성 폴리펩티드는 예를 들어 단백질 C, 활성화된 단백질 C, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 VII, 인자 VIIa 또는 활성 부위가 변형된 인자 VIIa일 수 있다. 단백질 C 또는 활성화된 단백질 C의 변형된 GLA 도메인은 제33 아미노산에서 글루탐산 잔기를, 그리고 제34 아미노산에서 아스파르트산 잔기를 포함할 수 있다(서열 번호: 19). 또한, 단백질 C 또는 활성화된 단백질 C의 변형된 GLA 도메인은 제11 아미노산에서 글루타민 또는 글루탐산 잔기를 포함할 수 있다(각각, 서열 번호: 20 및 서열 번호:21). 또한, 단백질 C 또는 활성화된 단백질 C의 GLA 도메인에 있는 제 12 아미노산에서 글리신 잔기가 치환될 수 있다(서열 번호: 24 또는 서열 번호:35). 인자 VII, 인자 VIIa 및 활성 부위가 변형된 인자 VIIa의 변형된 GLA 도메인은 제11 아미노산 및 제33 아미노산에서 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제11 아미노산에 있는 글루타민 잔기 및 제33 아미노산에 있는 글루탐산 잔기가 치환될 수 있다(서열 번호: 30).

본 발명은 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산을 특징으로 한다. 본원 명세서에 사용된 용어인 ″분리된(정제된)″은 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 일부 또는 전부에 상응하며 포유동물의 게놈에서 유전자의 한 쪽 또는 양 쪽의 측면에 정상적으로 위치하는 서열이 없는 서열을 의미한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 대해 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시킨 변형된 GLA 도메인을 포함한다. 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 가진다.

본 발명은 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 벡터를 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함한다. 변형된 GLA 도메인은 예를 들어 제11, 12, 29, 33 또는 34 아미노산에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 예를 들어, 인자 VII 또는 인자 VIIa일 수 있고, 제11 아미노산 및 제33 아미노산에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 제11 아미노산에서 글루타민 잔기 및 제33 아미노산에 글루탐산 잔기를 포함할 수 있다(서열 번호: 30).

또한, 본 발명은 약학적 허용 담체 및 포유동물에서 응혈(clot)의 형성을 방지하는 데 유효한 양의 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함한다. 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 예를 들어 단백질 C, 활성화된 단백질 C 또는 활성 부위가 변형된 인자 VIIa일 수 있다. 단백질 C 또는 활성화된 단백질 C는 예를 들어 제33 아미노산에 있는 글루탐산 잔기 및 제34 아미노산에 있는 아스파르트산 잔기를 포함할 수 있다(서열 번호: 19). 단백질 C 또는 활성화된 단백질 C는 제11 아미노산에 글루타민(서열 번호: 20) 또는 제11 아미노산에 글루탐산(서열 번호: 21)을 추가로 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 제12 아미노산에서의 글리신을 포함할 수 있다(서열 번호: 24 또는 서열 번호: 35). 활성 부위가 변형된 인자 VIIa는 예를 들어 제11 아미노산에서 글루타민 잔기를, 제33 아미노산에서 글루탐산 잔기를 포함할 수 있다(서열 번호: 30).

또한, 본 발명은 포유동물에서 응혈의 형성을 증가시키기에 유효한 양의 비타민 K-의존성 폴리펩티드 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함한다. 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 예를 들어, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 IX 또는 인자 IXa일 수 있다. 약학 조성물은 가용성 조직 인자를 포함할 수 있다. 인자 VII 또는 인자 VIIa는 제11 아미노산 및 제33 아미노산에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 글루타민 잔기는 제11 아미노산에서 치환될 수 있고 글루탐산 잔기는 제33 아미노산에서 치환될 수 있다(서열 번호: 30).

응고성 질병을 치료하는 데 사용하기 위한 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 대해 설명하고 있다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함한다. 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 유용한 변형된 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 예를 들어, 전기한 바와 같은 단백질 C, 활성화된 단백질 C, 인자 VII, 인자 VIIa, 활성 부위가 변형된 인자 VIIa, 인자 IX 및 인자 IXa를 포함한다. 약학 조성물은 가용성 조직 인자를 포함할 수 있다.

또한, 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 응고성 질병 치료용 의약을 제조하는 데 있어서 비타민 K-의존성 폴리펩티드의 용도에 대해 기재하고 있다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함한다. 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 예를 들어 전기한 단백질 C, 활성화된 단백질 C, 인자 VII, 인자 VIIa, 활성 부위가 변형된 인자 VIIa, 인자 IX, 및 인자 IXa일 수 있다.

포유동물에서 응혈의 형성을 감소시키는 방법을 또한 기재하고 있다. 이 방법은 포유동물에서 응혈의 형성을 감소시키기에 유효한 양의 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함한다. 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 예를 들어 단백질 C, 활성화된 단백질 C 또는 활성 부위가 변형된 인자 VIIa일 수 있다. 단백질 C 또는 활성화된 단백질 C는 제33 아미노산에서 글루탐산 잔기 및 제34 아미노산에서 아스파르트산 잔기를 포함할 수 있다(서열 번호: 19). 글루타민 또는 글루탐산은 단백질 C 또는 활성화된 단백질 C에서 추가로 치환될 수 있다(각각은 서열 번호:20 또는 서열 번호: 21). 글리신은 제12 아미노산에서 추가로 치환될 수 있다(서열 번호: 24 또는 서열 번호: 35). 활성 부위가 변형된 인자 VIIa는 제11 아미노산에서 글루탐산 잔기를, 제33 아미노산에서 글루타민 잔기를 포함할 수 있다(서열 번호: 30).

또한, 본 발명은 포유동물에서 응혈의 형성을 증가시키는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 포유동물에게 응혈의 형성을 증가시키기에 유효한 양의 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 막 결합 친화성이 향상된 변형된 GLA 도메인을 포함한다. 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 예를 들어 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 IX 또는 인자 IXa일 수 있다. 인자 VII 및 인자 VIIa는 제11 아미노산 및 제33 아미노산에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 제11 아미노산에서 글루타민 잔기 및 제33 아미노산에서 글루탐산 잔기를 포함할 수 있다(서열 번호: 30).

특별히 정의되지 않았다면, 본원 명세서 중에 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속한 당해 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원 명세서 중에 기재된 것과 유사하거나 동일한 물질과 방법이 본 발명을 수행하기 위해 사용될 수 있지만, 적당한 방법과 물질은 다음에 제시되어 있다. 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 인용 문헌은 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 비롯한 본원 명세서는 조절될 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시의 목적이며 제한의 목적이 아니다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.

상세한 설명

하나의 측면에서, 본 발명은 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함하는 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 특징으로 한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 이들의 생합성 경로에서 비타민 K를 이용하여 단백질 전구체에서 글루탐산 잔기의 측쇄를 카르복실화시키는 일군의 단백질이다. GLA 도메인은 폴리펩티드의 N-말단 부위, 통상적으로 제1 아미노산 내지 제45 아미노산에 9-13개의 감마-카르복시글루탐산 잔기를 함유한다. 단백질 Z, 단백질 S, 인자 X, 인자 II(트롬빈), 인자 IX, 단백질 C, 인자 VII 및 가스6은 비타민 K-의존성 폴리펩티드의 예이다. 본원 명세서에 논의된 폴리펩티드의 아미노산 위치는 인자 IX에 따라 번호를 정한다. 단백질 S, 단백질 C, 인자 X, 인자 VII 및 인간의 프로트롬빈 모두는 하나 작은 아미노산(위치 4)을 가지므로, 조정되어야 한다. 예를 들어, 소의 단백질 C의 실제 위치 10은 프롤린이지만, 본원에서는 비교를 쉽게 하기 위해 제11 아미노산으로 정한다. 본원 명세서에 사용된 용어 ″폴리펩티드″는 길이 또는 번역 후의 변형에 관계없이 아미노산의 임의의 쇄를 의미한다. 보통 3개의 문자 및 하나의 문자로 된 약자는 아미노산을 가리킨다.

GLA 도메인의 변형은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 치환은 보존적 및 반보존적일 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산을 동일한 부류의 아미노산으로 치환될 수 있으나, 반보존적 아미노산 치환은 아미노산을 다른 부류의 아미노산으로 치환시킨다. 반보존적 치환 결과, 거대한 잔기 측쇄 또는 폴리펩티드의 소수성에 있어서 실질적인 변화가 일어날 수 있다. 또한, 반보존적 치환은 양전기적 전하를 감소시키거나 음전기적 전하를 도입하는 것과 같은 폴리펩티드의 전하에 실질적인 변화를 일으킬 수 있다. 반보존적인 치환의 예는 비극성 아미노산에 대한 염기성 아미노산 또는 산성 아미노산에 대한 극성 아미노산을 포함한다. 아미노산 치환은 제11, 12, 29, 33 또는 34 아미노산에서 일어날 수 있다. 아미노산의 치환은 제11, 33 또는 34 아미노산에서 일어나는 것이 바람직하다. 변형된 GLA 도메인은 칼슘으로 포화된 상태에서 음전기적 전하를 보유한 양이온성 코어를 가진 3차 구조의 형성에 기여하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정한 이론에 구속됨이 없이, 음전기적 표면에 의해 완전히 둘러싸인 양전기적 코어로 구성된 특정한 정전기적 패턴으로부터 막 친화성이 향상될 수 있다.

다수의 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 막과 결합된 효소에 대한 기질이다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드가 GLA 도메인의 가능한한 최대의 막-결합 친화성을 나타내지 않기 때문에, 모든 펩티드는 결합 친화성을 감소시키는 아미노산을 함유할 수 있다. 결과적으로, 다수의 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 최대 친화성의 관점에서, 최적이 아닌 아미노산을 함유한다. 이들 잔기는 유효하게 결합 부위를 파괴하여 효소 반응에 있어서 보다 신속한 반전을 제공한다.

막 친화성의 감소는 몇가지 목적에 기여할 수 있다. 높은 친화성은 반응 속도를 제한할 수 있는 느린 교환을 수반한다. 예를 들어, 프로트롬비나아제 효소가 기질에 대한 높은 친화성을 가진 막 위에 결합하면, 효소 촉매화 보다는 막으로부터의 단백질 교환이 제한된다[Lu, Y. and Nelsestuen, G.L., 1996, Biochemistry, 35:8201-8209]. 대안적으로, 비최적 아미노산의 치환에 의한 막 친화성을 조절함으로써 준응집(인자 X, IX, VII 및 프로트롬빈) 및 항응집(단백질 C, S)의 과정을 조화시킬 수 있다. 천연 단백질의 막 친화성은 정상적인 상태에 대해서는 최적이지만, 막 친화성을 향상시킴으로써 시험관내 실험에서 유용한 단백질 및 생체내의 병적 상태에서 혈액 응고를 조절하는 개선된 치료제를 생성할 수 있다.

GLA 도메인으로 변형된 비타민 K-의존성 폴리펩티드의 다양한 예들이 다음에 기재되어 있다.

비타민 K-의존성 폴리펩티드는 단백질 C 또는 활성화된 단백질 C(APC)일 수 있다. 야생형 인간(hC) 및 소(bC)의 단백질 C GLA 도메인의 아미노산 서열이 표 1에 나타나 있다. X는 Gla 또는 Glu 잔기이다. 일반적으로, 제11, 33 및 34 위치에 중성(예를 들어, Q) 또는 음이온성 잔기(예를 들어, D, E)를 가진 단백질은 더 높은 막 친화성을 가질 것이다.

hC: 서열 번호 1, bC: 서열 번호 2

단백질 C 또는 APC의 변형된 GLA 도메인은 예를 들어 제33 아미노산에서 글루탐산 잔기를, 제34 아미노산에서 아스파르트산 잔기를 포함할 수 있다(서열 번호: 19). 제33 위치의 글루탐산은 생체내에서 감마-카르복시글루탐산으로 또한 변형될 수 있다. 최적의 활성을 위해서, 변형된 GLA 도메인는 제11 아미노산에서 추가의 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 제11 아미노산에서 글루타민 잔기가 치환되거나(서열 번호: 20), 또 다르게는 글루탐산 또는 아스파르트산 잔기(각각, 서열 번호: 21 및 서열 번호: 22)가 치환될 수 있다. 소의 단백질 C(서열 번호: 23)에 있는 제11 아미노산에서 히스티딘 잔기가 치환될 수 있다. 추가의 변형은 제12 아미노산에서 글리신 잔기가 세린으로 치환된 것을 포함한다(서열 번호: 23). 제29 아미노산이 프로트롬빈에서 발견되는 아미노산인 페닐알라닌으로 치환된 것은 다른 유용한 변형이다(서열 번호: 25). 향상된 막 결합 친화성을 가진 변형된 단백질 C는 헤파린과 같은 기타 주사용 항응고제 대신에 사용될 수 있다. 헤파린은 대부분의 유형의 외과술에서 사용되지만, 낮은 효능/독성 비의 단점을 가진다. 또한, 향상된 막 친화성을 가진 변형된 단백질 C는 와파린과 같은 쿠마린류에서 경구 항응고제 대신에 사용될 수 있다.

이러한 변형은 활성 부위가 변형된 APC로 제조될 수 있다. APC의 활성 부위는 예를 들어 N-단실-글루타밀글리실아르기밀클로로메틸케톤(DEGR) 또는 활성 부위의 부위 특이적 돌연변이에 의해 화학적으로 불활성화될 수 있다[Sorensen, B.B. et al., 1997, J. Biol. Chem., 272:11863-11868]. 활성 부위가 변형된 APC는 프로트롬빈 복합체의 저해제로서 작용한다. 활성 부위가 변형된 APC의 막 친화성이 향상됨으로써, 치료적으로 보다 유효한 폴리펩티드가 제조될 수 있다.

비타민 K-의존성 폴리펩티드는 인자 VII, 인자 VII의 활성형, 즉 인자 VIIa일 수 있다. 천연 또는 자연 발생적인 인자 VII 폴리펩티드는 막에 대한 낮은 친화성을 가진다. 야생형 인간(hVII) 및 소(bVII)의 인자 VII GLA 도메인의 아미노산 서열이 표 2에 제시되어 있다.

hvII: 서열 번호 3

bVII: 서열 번호 4

인자 VII 또는 인자 VIIa의 변형된 GLA 도메인은 예를 들어 제1 아미노산에 글루탐산 또는 아스파르트산 잔기를(각각, 서열 번호: 26 및 서열 번호: 27), 제29 아미노산에 페닐알라닌 잔기를(서열 번호: 28), 제33 아미노산에 아스파르트산 잔기를(서열 번호: 29) 포함할 수 있다. 인자 VII 또는 인자 VIIa의 GLA 도메인가 제11 아미노산에 글루타민 잔기 및 제33 아미노산에 글루탐산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다(서열 번호: 30). 이러한 방식으로 변형된 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 천연 또는 야생형 폴리펩티드에 비해 높은 친화성을 가진다. 이것은 자가활성화, 인자 Xa 생성 및 몇가지 혈액 응고 분석에서 더 높은 활성을 가진다. 활성은 낮은 수준의 조직 인자 및/또는 인지질과 같은 광범위한 응집 조건에서 특히 향상된다. 예를 들어, 변형된 인자 VII는 최적의 트롬보플라스틴 수준에서는 천연 VIIa에 비해 약 4배 유효하지만, 최적의 트롬보플라스틴 수준인 1%에서 약 20배 유효하다. 광범위한 준응집 시그날이 생체내에서 가장 두드러질 것이다. 최적의 트롬보플라스틴 수준을 사용한 현재 이용되고 있는 응고 분석은 정상 혈장과 헤모필리아 환자로부터 얻은 혈장 사이의 응고 시간 차이를 검출할 수없다. 이러한 샘플 사이의 응고 차이는, 응고 분석에서 비최적 수준의 트롬보플라스틴 또는 희석한 트롬보플라스틴이 사용된 경우에만 검출된다.

비타민 K-의존성 폴리펩티드의 다른 예는 활성 부위가 변형된 인자 VIIa이다. 인자 VIIa의 활성 부위는 예를 들어 DEGR 또는 활성 부위의 부위 특이적인 돌연변이화에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. DEGR에 의해 변형된 인자 VII는 다양한 투여 경로에 의해 효과적인 응집 저해제이다[Arnljots, B. et al., 1997, J. Vasc. Surg., 25:341-346]. GLA 도메인의 변형으로 인해 막 친화성이 높아지므로, 활성 부위가 변형된 인자 VIIa가 보다 유효하게 된다. 활성 부위가 변형된 인자 VIIa의 변형된 GLA 도메인은 예를 들어 제11 아미노산에 글루타민 잔기를, 그리고 제33 아미노산에 글루탐산 잔기를 포함할 수 있다(서열 번호: 30).

또한, 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 인자 IX 또는 인자 IX의 활성형, 즉 인자 IXa일 수 있다. 활성 부위가 변형된 인자 VIIa에 있어서, 활성 부위가 변형된 IXa 및 Xa는 응집 저해제일 수 있다. 야생형 인간(hIX) 및 소(bIX)의 인자 IX GLA 도메인의 아미노산 서열이 표 3에 도시되어 있다. 예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기는 제11 아미노산에서 치환될 수 있고(각각, 서열 번호: 31 및 서열 번호: 32), 제29 아미노산에서 페닐알라닌 잔기가(서열 번호: 33), 또는 제34 아미노산에서 아스파르트산 잔기가 치환될 수 있다(서열 번호: 34).

hIX: 서열 번호 5

bIX: 서열 번호 6

다른 측면에서, 본 발명은 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 보유한 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 포함하는 포유동물을 특징으로 한다. 변형된 GLA 도메인은 전기한 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 포유동물의 숙주 세포는 예를 들어 변형된 인자 VII 또는 변형된 인자 VIIa를 포함할 수 있다. 변형된 인자 VII 또는 변형된 인자 VIIa의 GLA 도메인은 제1 아미노산 및 제33 아미노산에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 제11 아미노산에서 글루타민 잔기 및 제33 아미노산에서 글루탐산 잔기를 포함한다(서열 번호: 30).

적합한 포유동물의 숙주 세포는 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 감마-카르복시글루타메이트로 변형시킬 수 있다. 신장 및 간장 유래에서 유래된 포유동물의 세포는 숙주 세포로서 특히 유용하다.

또한, 본 발명은 포유동물에서 응혈의 형성을 억제하는 데 유효한 양의 비타민 K-의존성 폴리펩티드 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 막 결합 친화성이 향상된 변형된 GLA 도메인을 포함한다. 약학 조성물의 유용한 변형된 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 단백질 C, 활성 부위가 변형된 APC, 활성 부위가 변형된 인자 VIIa, 활성 부위가 변형된 인자 IXa 및 활성 부위가 변형된 인자 Xa를 비제한적으로 포함할 수 있다.

포유동물에서 응혈의 형성을 저해하는 데 유용한 비타민 K-의존성 폴리펩티드의 농도는 투여되는 화합물의 바람직한 용량, 사용된 화합물의 화학적 특징, 화합물 부형제의 제제 및 투여 경로를 비롯한 다수의 인자에 따라 좌우될 수 있다. 투여되는 약학 조성물의 최적 투여량은 특정한 환자의 전반적인 건강 상태 및 선택된 화합물의 관련된 생물학적 유효성과 같은 변수에 따라 좌우될 수 있다. 이들 약학 조성물은 생체내에서 응집을 조절하기 위해 사용된다. 예를 들어, 조성물은 혈전증의 치료를 위해 일반적으로 사용될 수 있다. 전술한 바와 같은 폴리펩티드의 일부 아미노산 잔기를 변화시키는 것은 일반적으로 돌연변이 폴리펩티드의 항원성에 유의성 있는 영향을 주지 않는다.

변형된 GLA 도메인을 포함하는 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 약학적으로 허용되는 비독성 부형제 또는 담체를 혼합함으로써 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 이러한 화합물 및 조성물은 특히 액체 용액 또는 생리학적 완충 수용액 중의 현탁액의 형태로 비경구 투여; 특히 정제 또는 캡슐의 형태로 경구 투여; 특히 분말, 비강 점적 또는 에어로졸의 형태로 비강내 투여를 위해 제제화될 수 있다. 다른 투여 경로를 위한 조성물도 표준 방법을 사용하여 바람직하게 제조될 수 있다.

비경구 투여용 제제는 통상의 부형제로서 멸균 용수 또는 염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물유, 수소첨가된 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 특히, 생체적합성, 생체분해가능한 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체는 생체내에서 본 발명의 화합물을 제어 방출하기 위한 부형제의 예이다. 다른 적합한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투압 펌프, 이식가능한 주입 시스템 및 리포좀을 포함한다. 필요한 경우, 흡입 투여용 제제는 유당과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 흡입 제제는 예를 들어 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 함유하는 수용액일 수 있거나, 비강 점적의 형태로 투여하기 위한 유성 용액일 수 있다. 협측 투여용 비경구 제제는 글리코콜레이트를 포함할 수 있다.

대안적인 구체에에서, 본 발명은 또한 포유동물에서 응혈의 형성을 증가시키기에 유효한 양의 비타민 K-의존성 폴리펩티드 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 변형된 GLA 도메인을 포함한다. 이들 약학 조성물은 헤모필리아 A, 헤모필리아 B, 간질환과 같은 응고성 질환의 치료에 유용할 수 있다.

다른 구체예에서, 약학 조성물의 유용한 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 인자 VII 또는 인자 VII의 활성형, 즉 인자 VIIa를 비제한적으로 포함한다. 인자 VII 또는 인자 VIIa의 변형된 GLA 도메인은 제11 아미노산 및 제33 아미노산에서, 예를 들어 제11 아미노산에서 글루타민 잔기 및 제33 아미노산에서 글루탐산 잔기의 치환(서열 번호: 30)을 포함한다. 약학 조성물은 가용성 조직 인자를 포함할 수 있다. 연속된 응고 단계의 초기에서 인자 VII의 위치, 및 2개의 단백질인 인자 IX 및 X를 활성화시키는 능력 때문에, 인자 VII는 혈액 응집에서 특히 중요하다. 인자 VIIa에 의한 인자 X의 직접적인 활성화는 헤모필리아의 주된 형태인 A형 및 B형의 치료 가능성에 있어서 중요한데, 그 이유는 인자 IX 및 VIII가 관계된 단계를 전적으로 우회하기 때문이다. 인자 VII를 환자에게 투여하는 것은 일부 형태의 헤모필리아 치료에 있어서 유효하다는 것이 밝혀졌다. GLA 도메인의 변형에 의해 인자 VII 또는 인자 VIIa의 막 친화성이 향상되면 다수의 응집 조건에 대해 더 반응성이 큰 폴리펩티드가 생성되고, 인자 VII/VIIa의 투여 간격이 연장되고, 보다 효과적인 치료를 제공하는 투가의 질적인 변화를 일으킬 수 있는 가능성을 제공한다. 전반적으로, 인자 VII의 막 접촉 부위의 개선으로 인해 그것의 활성화 속도가 증가될 /뿐 아니라, 인자 X 또는 인자 Xa에 대한 인자 VIIa의 활성이 증가된다. 이들 단계는 생체내에서 전반적인 혈액 응고 속도에 복합적인 작용을 하여, 몇가지 혈액 응고성 질병의 양호한 치료에 매우 효능이 큰 인자 VIIa를 생성할 수 있다.

혈괴 형성을 증가시키는 다른 유용한 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 인자 IX 및 인자 IXa를 포함한다.

다른 측면에서, 포유동물에서 혈괴 형성을 감소시키는 방법에 대해 설명하고 있다. 이 방법은 포유동물에서 혈괴 형성을 감소시키는 데 유효한 양의 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 변형된 GLA 도메인을 포함한다. 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 변형된 단백질 C 또는 APC 또는 변형된 활성 부위에 의해 차단된 인자 VIIa, IXa, Xa 및 APC는 이 방법에서 사용될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 혈괴 형성을 증가시키는 데 유효한 양의 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 혈괴 형성을 증가시키는 방법을 또한 특징으로 한다. 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 변형된 GLA 도메인을 포함한다. 변형된 GLA 인자 VII 또는 변형된 인자 IX 또는 인자 IXa는 이 방법에서 사용될 수 있다.

본 발명은 특허청구범위에 기재된 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에 의해 더 상세히 설명될 것이다.

실시예 1

막 친화성 및 활성이 향상된 인자 VII

인간의 혈액 응집 인자 VII의 막 결합 친화성은 부위 특이적 돌연변이화에 의해 증가될 수 있음이 밝혀졌다. P11Q, K33E 돌연변이체[본원 명세서에서 인자 VIIQ11E33 또는 돌연변이 인자 VII로 불림(서열 번호: 30)]의 특성이 규명되어 왔다. 막 친화성은 야생형 단백질에 비해 약 20배까지 증가되었다. 돌연변이체에 의한 자가활성화는 야생형 인자 VII에 비해 100 배 이상 증가되었다. VIIQ11E33의 활성형(VIIaQ11E33으로 불림)은 인자 X에 대해 약 10배 높은 활성을 나타내었다. 정상 혈장중에서 가용성 조직 인자를 가진 VIIQ11E33의 응집 활성은 야생형 VIIa에 비해 약 10배 높았다. 정상 조직 인자를 가진 효소원, 즉 VIIQ11E33(트롬보플라스틴-HS의 1:100 희석액으로서 제공됨)의 응집 활성은 야생형 인자 VII에 비해 20배 높았다. 활성이 증가된 정도는 조건에 따라 달라졌고, VIIQ11E33는 낮은 응집 자극 조건하에서 특히 활성을 가지고 있었다.

일반적으로, 단백질 농도는 표준 물질로서 소의 혈청 알부민을 사용하는 브랜포드 분석에 의해 측정되었다[Branford, M.M., 1976, Analyt. Biochem, 248-254]. 몰 농도는 인자 VII에 대해서는 분자량이 50,000이었고, 인자 X에 대해서는 분자량이 55,000이었다. 특별한 지시가 없는 한, 모든 활성의 측정은 표준 완충액(0.05 M Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl) 중에서 수행되었다.

돌연변이 인자 VII의 제조:

야생형 VII cDNA로부터 돌연변이 인자 VII를 제조하였다(진뱅크 기탁 번호: M13232, NID g182799). 페터슨 등의 문헌(Petersen et al., 1990, Biochemistry 29:3451-3457) 참조. 발레트 등의 문헌(Vallette et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:723-733)에 기재된 바와 거의 동일한 중합 효소 연쇄 반응 기법에 의해 P11Q 돌연변이(제11 아미노산의 프롤린 잔기에서 글루타민 잔기로의 변화) 및 K33E 돌연변이(제33 아미노산의 리신 잔기에서 글루탐산 잔기로의 변화)가 야생형 인자 VII cDNA로 도입되었다. 이 과정에서, 돌연변이를 진단하는 XmaIII 제한 효소 부위가 제거되었다. M3232 2개의 돌연변이 단편(221 내지 301에 위치한 MluI 내지 BglII로부터 1개, 및 302 내지 787에 위치한 BglII 내지 SstII로부터 1개)의 합성을 시작하기 위해 4개의 PCR 프라이머를 설계하였다. 이들 프라이머를 PCR 순환 조건(GENEAMP, Perkin Elmer) 하에서 사용하여 야생형 인자 VII cDNA 1 ng을 주형으로서 이용하는 단편 합성을 시작하였다. 생성된 단편을 겔 정제하고 MluI 및 BglII 또는 BglII 및 SstII로 분해하였다. 이어서, 2개의 정제된 단편을, 상응하는 야생형 서열이 MluI-SstII 단편으로서 제거된 발현 벡터 Zem219b내의 인자 VIII cDNA에 연결시켰다[Peterson et al., 1990 supra]. P11Q 및 K33E 치환을 확인하고 기타 PCR로 유도된 서열 변화의 가능성을 배제하기 위해 돌연변이화된 단편 전체를 서열결정하였다.

형질감염, 선택 및 정제:

새끼 햄스터 신장(BHK) 세포를 10% 태아 송아지 혈청 및 페니실린-스트렙토마이신으로 보충한 둘베코의 변형된 이글스 배지 내에서 성장시켰다. 제조자의 권고 사항에 따라 리포펙트아민(lipofectAMINE, Gibco BRL)을 사용하여 인자 VII 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 후 2일이 경과하였을 때, 세포를 트립신으로 분해하고, 1 μM의 메토트렉세이트(MTX)를 함유하는 선택적인 배지에 희석시켰다. 이어서, 안정하게 형질감염된 BHK 세포를 페니실린-스트렙토마이신, 5 ㎍/ml의 비타민 K₁, 및 1μM의 MTX로 보충한 무혈청 둘베코의 변형된 이글스 배지 중에서 배양하였고, 조절된 배지를 수집하였다. 이 조절된 배지를 애피-겔(Affi-Gel) 10에 결합된 칼슘 의존성 모노클론성 항체(CaFVII22)로 구성된 면역친화성 컬럼에 2회 적용하였다[Nakagaki et al., 1991, Biochemistry, 30:10819-10824]. 최종 정제된 인자 VIIQ11E33는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 상에서 단일 밴드로서 나타났고, 제제내에 인자 VIIa이 존재한다는 증거는 없었다. 순수한 VII(P11Q, K33E) 돌연변이체는 400-2800 인자 VII 유닛/mg을 나타내었다.

인자 VII의 활성화:

활성화된 인자 VIIaQ11E33는 VIIQ11E33을 소의 인자 Xa로 분해시켜 형성하였다(1:100 중량비, 37℃에서 1시간동안 항온처리). 대안적으로, 인자 VIIQ11E33는 7 μM의 VIIQ11E33, 0.7 μM의 sTF 및 인지질(포스파티딜세린/포스파티딜콜린 (PS/PC), 25/75, 0.1 g/g 단백질)을 함유하는 혼합물 중에서 자가활성화(37℃, 20분)에 의해 얻었다.

야생형 인자 VIIa는 균일한 재조합 단백질(노보 노르디스크)이었다. 2개의 제제는 시판되는 동결건조된 제품 및 비동결건조된 제품으로 구성되었다. 후자의 단백질은 FPLC 모노-Q 상에서 추가로 정제되었고, 조지 킹 NPP 표준 물질을 사용하여 측정하였을 때, 80,000 유닛/mg의 특정 활성도를 나타내었다.

인자 VIIQ11E33에 의해 향상된 막 상호작용

넬세스투엔 및 림의 문헌[Nelsestuen and Lim, 1977, Biochemistry, 30:10819-10824]에 기재된 방법에 의해 단백질-막 결합의 측정, 인지질 제제 및 분석을 수행하였다. 튼 단일층 베지클(large unilamellar vesicle; LUV) 및 작은 단일층 베지클(small unilamellar vesicle; SUV)을 전술한 방법에 의해 제조하였다[Hope, M.J., et al., Biochem, Biophys. Acta, 182:55-65; Huang, C., 1969, Biochemistry, 8:344-352]. 매우 순수한 포스파티딜세린(소의 뇌) 및 에그 포스파티딜콜린(시그마 케미칼 컴퍼니)을 클로로포름 중에서 혼합하였다. 용매를 질소 기체의 기류하에서 제거하였다. 건조된 인지질을 완충액 중에서 현탁시켰다. 초음파 및 겔 여과에 의해 SUV를 형성시켰고, 냉동-해동 및 압출을 사용하여 LUV를 형성시켰다. 인:인지질의 중량비가 25라고 가정하여, 유기 인산염 분석에 의해 인지질 농도를 측정하였다.

PS/PC(25:75) 또는 PS/PC(10/90)의 SUV를 제조하였다. 도1에 도시된 중량비로 단백질을 인지질에 첨가하였다. 단백질-막 결합은 넬세스투엔 및 림의 방법에 의해 90°에서 광 산란법에 의해 분석되었다. 간단히 말해서, 인지질 베지클 단독의 광산란도(I₁) 및 단백질을 첨가한 후의 광산란도(I₂)를 측정하고, 완충액 및 비결합된 단백질로부터 백그라운드용으로 수집하였다. 단백질-베지클 복합체의 분자량비(M₂) 대 베지클 단독의 분자량비(M₁)는 수학식 1의 관계로부터 계산될 수 있다. 여기서,n/c는 각각의 종의 굴절 지수이다.

인지질 및 단백질의 농도가 알려져 있다면, 결합된 것의 농도[P*PL] 및 유리 단백질의 농도[P]는 측정될 수 있다. 베지클의 단백질 결합능[P*PL_max]의 최대값(모든 단백질에 대해 1.0 g/g이라고 가정하는 경우)과 함께 이들 수치는 수학식 2의 관계에 의해 단백질-막 상호작용에 대한 평형 상수를 구하기 위해 사용될 수 있다. 여기서, 모든 농도는 단백질 또는 단백질 결합 부위의 몰로써 표시된다.

결합은 5 mM의 칼슘에서 측정되었고, M₂/M₁의 비로서 표현된다.

도1은 PS/PC=25/75, 25㎍/ml(도1A) 또는 PS/PC=10/90, 25㎍/ml(도1B)의 막에 대한 야생형 VIIa(채색되지 않은 원) 및 인자 VIIQ11E33(채색디된 원)의 결합을 도시하고 있다. VIIQ11E33는 야생형 단백질보다 높은 친화성을 가졌다. PS/PC(25/75)에 대한 결합은 정량적인 수준이므로, [단백질_유리]은 거의 0이었다. 결과적으로, Kd 수치는 이 데이터로부터 계산될 수 없었다. 소의 인자 X(채색된 삼각형)의 막 결합은 도1에 참고로 도시되어 있다. 소의 인자 X는 이 부류의 단백질 중 가장 친화성이 큰 것으로서, 40 nM의 2 mM 칼슘 농도에서 PS/PC(20/80)에 대한 Kd를 제공한다[Mcdonald et al., 1997, Biochemistry, 36:5120-5127]. 0.55의 단백질/인지질 비에서 결과로서 얻어진 소의 인자 X에 대한 Kd는 0.025 μM이었다.

또한, PS/PC(10/90)의 막에 대한 야생형 및 돌연변이 인자 VII의 결합을 측정하였다(도1B). 정량적인 수준에 비해 적게 결합된 VIIQ11E33에 의해 수학식 3으로부터 결합 상수를 계산하였다.

Kd=[단백질_유리][결합 부위_유리]/[단백질_결합]

M2/M1의 최대값이 1.0이라 가정하면(즉, [결합 부위_전체]=[인지질_{중량 농도}/단백질_분자량]), [결합 부위_유리]가 수학식 4로부터 계산되었다. 이것은 이 부류의 몇가지 단백질에 대해 공통적인 수치이다. 문헌 참고[McDonald et al., 1997, supra].

[결합 부위_유리]=[결합 부위_전체]-[단백질_결합]

단백질 대 인지질의 비가 0.37에서 이들 가정 및 데이터를 사용하면, Kd 값은 소의 인자 X에 대해서는 0.7 μM이고, VIIQ11E33에 대해서는 0.23μM이다. 그러므로, 인자 VIIQ11E33가 비타민 K-의존성 폴리펩티드 사이에서 가장 높은 막 결합 친화성을 가진 것 중의 하나를 가지며 야생형 인자 VII에 비해 막 결합 친화성이 크게 개선되었다.

인자 VIIQ11E33의 향상된 활성화:

응집에서 제1 단계는 인자 VII의 활성화를 포함한다. VII의 자가활성화는 100 nM sTF(발터 키시엘 박사로부터 얻은 고도로 정제된 재조합 산물, Fiore et al., 1994, J. Biol. Chem., 269;143-149), 36 nM의 VIIQ11E33 및 PS/PC(25/75, 22 ㎍/ml)를 함유하는 용액중에서 수행되었다. 0.15 mm 기질 S-2288(카비)를 첨가하여 VIIQ11E33의 활성도를 다양한 시간 간격으로 측정하였고, 405 nm에서 흡광도의 변화에 의해 니트로페닐포스페이트 생성물의 방출 속도를 평가하였다. VIIQ11E33 제제의 초기 활성은 완전히 활성인 VIIQ11E33의 4% 이하였다.

VIIQ11E33는 야생형 인자 VII에 비해 활성화를 위한 보다 양호한 기질로서 밝혀졌다.도2는 인자 VIIQ11E33의 자가활성화를 나타낸다. 데이터는 수학식 5에서의 관계에 의해 분석되었다(피오레 등의 수학식 7., 1994).

In[VIIa]_t=In[VIIa]₀+kcat*y*t

In[VIIa]_t는 시간 t에서의 인자 VIIa 농도이고, kcat는 VII 상에 작용하는 인자 VIIa에 대한 촉매 속도 상수이며, y는 VIIa 부위의 포화 분율이다. 야생형 인자 VIIa에 있어서, 이 관계식 및 1 μM의 sTF는 0.0045/s의 kcat 및 7*10³M^-1s^-1의 kcat/Km 비를 제공하였다[Fiore et al., 1994]. VIIQ11E33 효소에 있어서, 자가활성화는 신속하고(도2) kcat에 대해 단지 더 낮은 한계치만을 측정가능하게 한다. 이는 VIIa로부터 얻어지며, 약 25초의 2배였다[kcat=(ln2)/t_1/2]. 생성된 수치(kcat_min=0.03/s) 및 이 반응의 기질 농도(3.6*10^-8M) 및 가정(y=1.0)으로부터 kcat/[s]=8*10⁵M^-1s^-1에 대한 수치가 얻어졌다. 이것은 VIIQ11E33에 대해서는 진정한 kcat/Km에 비해 훨씬 작지만, 피오레 등에 의해 측정된 야생형 인자 VIIa/sTF에 대한 kcat/Km의 값의 약 100배 이상이었다. 그러므로, VIIQ11E33 효소 및 인자 VIIQ11E33 기질의 조합은 응집의 활성화 단계에서 야생형 단백질에 비해 우수했다. 이는 응집 조건이 최소인 경우에 VIIQ11E33 야생형 효소에 비해 우수하였음을 나타내었다.

VIIQ11E33 활성의 향상:

인자 VIIa가 일단 생성되면, 인자 X 또는 인자 IX를 활성화한다. 인자 VIIa에 의한 소의 인자 X(0.1 μM)의 활성화는 22.5℃에서 100 mM의 NaCl, 5 mM의 칼슘, 다양한 양의 인지질(PS/PC, 25/75) 및 1 mg/ml의 소의 혈청 알부민을 함유하는 50 mM의 트리스 HCl 완충액(pH 7.5) 중에서 수행되었다. 시간 0에서 인자 VIIa(0.06 nM의 VIIQ11E33 또는 0.6 nM의 야생형 VIIa)를 첨가하고, 1, 3 및 5 초가 되는 시간에 Xa 활성을 측정하였다. 이 반응 혼합물의 분액(0.2 ml)를 10 mM의 EDTA 및 인자 Xa에 대한 크로모젠성(chromogenic) 기질인 0.4 mM의 S-2222(카비)를 함유하는 완충액 중에 혼합하였다. 베크만 DU8 분광분석기 내의 405 nm에서의 흡광도의 변화를 측정하였다. 생성된 인자 Xa의 양은 p-니트로페닐포스페이트 반응 생성물의 흡광 상수, 및 이 분석의 조건하에서 정제된 소의 Xa의 기질 가수분해에 대해서 33/초의 속도로부터 계산되었다.

도3은 야생형 인자 VIIa(채색되지 않은 원) 및 VIIQ11E33(채색된 원)가 정제된 시스템에서 인자 X를 활성화시키는 능력을 비교하고 있다. 다시, 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 이 반응에서 야생형 인자 VIIa에 비해 매우 우수하였다. 차이는 낮은 인지질 농도에서 가장 컸으며, ml 당 20 ㎍의 인지질에서 2배로 감소되었다. 이는, 높은 막 농도가 더 많은 부분의 야생형 VIIa를 막에 결합시킨다는 사실로부터 예측되었다. 다시 한 번, VIIQ11E33의 향상된 기능은 낮은 인지질 노출 조건하에서 가장 크다.

VIIaQ11E33의 양호한 응집:

응집 형성을 검출하기 위하여 37℃에서 수동 경사 방법(hand tilt method)을 사용하여 혈액 응고 분석을 수행하였다. 인간의 혈장(0.1 ml)을 37℃에서 1분간 방치하여 평형화하였다. 다양한 시약을 0.1 ml 부피의 표준 완충액 중에 첨가하였다. 가용성 조직 인자(50 nM) 및 인지질(PS/PC, 10/90, 75㎍/ml)을 혈장에 첨가하였는데, 인자 VIIa의 농도는 도4(0.1 -32 nM)에 도시된 바와 같았다. 결국, 25 mM CaCl₂를 0.1 mL 첨가하여 반응을 시작하였다. 응혈을 형성하는 시간을 측정하였다. 대부분의 경우에, 복제 샘플의 평균 그리고 표준 편차를 기록하였다.

도4는 인간의 정상 혈장에서 야생형 VIIa 대 VIIaQ11E33의 응집 시간을 도시한 것이다. 응집은 sTF에 의해 지지되었고, 인지질의 베지클에 첨가되었다. 내인성 야생형 인자 VII는 약 10 nM의 농도이고, 응집 시간에 있어서 눈에 띄는 영향을 주지 않았다. 백그라운드 응집은 sTF의 유뮤에 관계없이 120초였다. 인자 VIIQ11E33는 이 분석 조건하에서 야생형에 비해 약 8배 높은 활성을 나타내었다. 인자 VIII가 결핍된 혈장에서 유사한 결과를 얻었는데, 이것이 인자 VIIa에 의한 인자 X의 직접적인 활성화에 관계된 이 시스템에서 혈액 응고의 주된 경로임을 시사한다. 전반적으로, 인자 VIIaQ11E33는 막 베지클 및 가용성 조직 인자에 의해 지지되는 준응집 활성에 있어서 야생형 VIIa 에 비해 우수했다. 야생형 효소원은 이 조건하에서 sTF가 첨가되었는가의 여부와 무관히 유사한 백그라운드 응고 시간인 2분에 의해 지시되는 바와 같이, 시각적인 활성을 나타내지 않았다.

정상적인 조직 인자를 가진 준응집 활성:

sTF를 사용한 VIIa 및/또는 VIIQ11E33의 활성은 인간의 정상 혈장에서 측정하였다. 내인성 인자 VII는 이 분석에서 응집 시간에 대해 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 보였다. 가용성 조직 인자(50 nM의 최종 농도) 및 VIIa, 칼슘 용액의 순서로 혈장에 첨가하였다. 다양한 레벨의 VIIa 또는 VIIaV11E33를 함유하는 샘플에 대해 응집 시간을 측정하였다. 정상 및 인자 VIII가 결여된 인간의 혈장 제제를 시험하였다.

정상 조직 인자에 의한 응집은, 칼슘(시그마 케미칼 컴퍼니)을 함유하는 표준 토끼 뇌의 트롬보플라스틴-HS(HS=고민감성)를 사용하여 분석되었다. 이 혼합물은 인지질 및 막과 결합된 조직 인자 둘다를 함유한다. 토끼의 뇌 트롬보플라스틴-HS를 완충액 중에서 1:100으로 희석하였고, VII(10 nM의 인자 VII를 함유하는 인간의 정상 혈장의 형태로 첨가됨) 및 VIIQ11E33(순수한 단백질로서 첨가됨)의 분석 중에서 사용되었다. 트롬보플라스틴(0.2 ml)을 혈장(0.1 ml)에 첨가하여 반응을 시작하였고, 혈액의 응괴를 형성하는 데 필요한 시간을 측정하였다. 분석은, 제조자의 지시에 따라 완전한 강도의 트롬보플라스틴을 사용하여 측정되었다/

최적의 인간 트롬보플라스틴 수준에서, 야생형 VII는 정상 레벨의 활성, 즉 mg당 약 1500 유닛의 활성을 나타내었다. 이는 야생형 인자 VIIa(mg 당 80,000유닛)의 활성에 비해 약 25배 작은 것이다. 이 VIIQ11E33는 표준 분석 조건 하에서 야생형 VII에 비해 단지 2배 이상인 mg 당 약 1500 내지 3000 유닛을 제공하였다.

야생형 VII 및 VIIQ11E33의 차이는 응집 조건이 부분적으로 최적인 경우에 더 커졌다. 도5는 정상 트롬보플라스틴 레벨의 0.01배를 함유하는 분석에서 응고 시간과 효소원 농도를 나타낸다. 이러한 조건하에서, VIIQ11E33는 활성 야생형 인자 VII에 비해 약 20배 크다. 그러므로, 응집 조건이 제한되어 있을 때, 생체내에서 다수의 상황에 관계된 VIIQ11E33 돌연변이체가 더 큰 효능을 가질 것임은 명맥하다.

DEGR-VIIaQ11E33의 항응집 활성:

완충액 중에서 1:10으로 희석된 인간의 정상 혈청 및 인간의 트롬플라스틴을 사용하여 표준 응집 분석을 수행하였다. 인자 VIIaQ11E33의 활성 부위는 소렌슨의 문헌[Sorenson, B.B. et al., 1997, supra]에 기재된 바와 같이 DEGR에 의해 변형되었다. 도6은 혈장을 첨가하기 전 15초 동안 칼슘 완충액 중에 트롬보플라스틴으로 배양한 DEGR-VIIQ11E33(0-4 nm)의 응집 시간을 도시하고 있다. 수동 경사 방법에 의해 응혈을 형성하는데 소요된 시간을 측정하였다. 응집 시간은 DEGR-VIIQ11E33 1 nm에 대해 약 45초였다.

실시예 2

래트에서 인자 VIIQ11E33의 순환 시간:

2개의 마취시킨(나트륨 냄부톨) 스프라그 다울리 래트(325-350 g)에게 시간 0에서 인자 VIIQ11E33 36 ㎍을 주사하였다. 캐뉼라가 위치한 저글러 정맥(juggler vein)을 통해 주사되었다. 도7에 도시된 시간에서, 외과술에 의해 캐뉼라를 삽입한 경동맥으로부터 혈액을 제거하였다. 순환에서 인자 VIIQ11E33의 양은 인간의 인자 VII가 결핍된 혈장의 응고 시간으로부터 예측되었고, 여기에 래트의 혈장의 1:10 희석액 1 ㎕를 첨가하였다. 토끼의 뇌 트롬보플라스틴-HS(시그마 케미칼 컴퍼니)의 1:100 희석액을 사용하였다. 실시예 1에 기재된 수동 튜브 경사 방법에 의해 응집을 평가하였다. VIIQ11E33를 첨가하기 전 혈장내 인자 VII 활성의 양을 측정하였고, 공시험값으로서 감했다. 순환에서 인자 VIIQ11E33의 농도는 로그 nM로서 주어진다. 제3 동물이 수술 및 캐뉼라 삽입을 받았지만, 인자 VIIQ11E33는 없는 샴 실험이 수행되었다. 이 실험의 말미에, 동물을 과량의 나트륨 넴부톨로 안락사시켰다.

래트는 명맥한 응집의 징후없이 실험을 수행하는 동안에 정상적으로 보였다. 그러므로, 인자 GLA 도메인은 수술 후의 래트에서도 무작위적인 응집을 유발하지는 않았다. VIIQ11E33의 순환 반감기는 정상적이었는데, 약 60분 후에 약 40%의 단밸질이 제거되고 남아있는 단밸질은 더 느리게 소실되었다(도7). 이는 래트로부터 소의 프로트롬빈의 제거율과 유사했다[Nelsestuen and Suttie, 1971, Biochem, Biophys. Res. Commun., 45:198-203]. 이는 20-45초의 기능 분석에 대해 순환 반감기를 제공하는 야생형 재조합 인자 VIIa에 비해 양호하다[Thomsen, M.K., et al., 1993, Thromb, Haemost., 70:458-464]. 이는 인자 VIIQ11E33가 비정상적인 당백질로서 인식되지 않으며 응집 활성에 의해 신속해 파괴되지 않는다는 사실을 나타내었다. 이는 정상적인 당백질로서 나타나며, 동물에서 표준 순환 반감기를 가져야 한다.

실시예 3

단백질 C의 막 부위 및 활성의 향상

소 및 인간의 단밸질 C는 인간의 단백질의 약 10배 이상 높은 막 친화도에도 불구하고 GLA 도메인의 아미노산(아미노 말단의 44 잔기)에서 더 높은 상동성을 나타낸다. 소의 단백질 C는 제11 위치에 프롤린을 가진 데 비해, 인간의 단백질 C는 제11 위치에 히스티딘을 가지고 있다. 소의 단백질 C의 프롤린-11을 히스티딘으로 치환하는 데 따른 영향 및 인간의 단백질 C에서 역 변화를 검사하였다. 두가지 경우에서, 프롤린-11을 함유하는 단백질은 인간의 단백질 C에 대해 5배, 소의 단백질 C에 대해 약 10배 낮은 막 친화성을 나타내었다. 제1 위치에서 프롤린을 함유하는 활성화된 인간의 단백질 C(hAPC)는 사용된 분석에 따라 야생형 hAPC에 비해 2.4 내지 3.5 배 낮은 활성을 나타내었다. 히스티딘-11을 함유하는 소의 APC는 야생형 bAPC에 비해 15배 이상의 높은 활성을 나타내었다. 이는 돌연변이화가 막 접촉 및 활성 모두를 향상시키는 능력이 있다는 것을 입증하였다.

단백질 C의 돌연변이화:

완전한 길이의 인간의 단백질 C cDNA 클론은 문헌[Dr, Johan Stenflo(Dept. of Clinical Chemistry, University Hospital, Malmo, Sweden]에 의해 제공되었다. 소의 단백질 C cDNA 클론은 도날드 포스터 박사(미국의 자이모게네틱스 인코포레이티드에서 시판)에 의해 제공되었다. 소의 단백질 C의 뉴클레오티드 서열의 진뱅크 기탁 번호는 KO2435, NID g163486이고 인간의 단백질 C의 뉴클레오티드 서열의 기탁 번호는 K02059, NID g190322이다.

부위 특이적 돌연변이화는 PCR 방법에 의해 수행되었다. 히스티딘-11 내지 프롤린의 인간 단백질 C 돌연변이화에 있어서, 하기 올리고뉴클레오티드가 합성되었다: A, 5′- AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCC AAG CTT-3′(서열 번호: 8)(인간의 당백질 C에서 아미노산 잔기 4-17에 상응함, 이 서열에서 8번째 잔기는 밑중에 의해 나타난 바와 같이 인간의 단백질 C에 대한 것으로뷰ㅜ터 소의 단백질 C까지 돌연변이되었다.

프롤린-11 내지 히드티딘까지 소의 단백질 C 돌연변이에 있어서, 이어지는 올리고뉴클레오티드가 합성되었다: A, (전기한 바와 같음); C, 5′-ACG CTC CAC GTT GCC GTG CCG CAG CTC CTC TAG GAA-3′(서열 번호: 9)(소의 단백질 C의 아미노산 잔기 4-15에 상응하여, 제6 아미노산은 밑줄친 바와 같이 소의 당백질 C의 것으로부터 인간의 단백질 C까지 돌연변이되었다); D, 5′-TTC CTA GAG GAG CTG CGG CAC GGC AAC GTG GAG CGT-3′(서열 번호: 10)(소의 단백질 C에서 아미노산 잔기 4-15에 상응하며, 제7 아미노산은 소의 단백질에 대한 것으로부터 인간의 단백질 C까지 돌연변이되었다; 돌연변이된 뉴클레오티드는 밑줄로 나타낸다); E, 5′-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TAT AGA-3′(서열 번호: 11)(벡터 pRc/CMV에서 뉴클레오티드 984-1019에 해당함, pRc/CMV 및 단백질 C 사이에 Xba I 부위를 생성함).

인간 및 소의 당백질 C cDNA 모두를 발현 벡터 pRc/CMV의 힌드 III 및 Xba I 부위로 클론시켰다. 5′말단 내지 아미노산-17을 함유하는 인간이 단백질 C cDNA를 완전한 인간의 단백질 C cDNA 및 프라이머 A 및 B를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 반응용 부피는 100ㅍ㎕였고, 트리스-HCl 완충액(10 mM 트리스, 25 mM KCl, 5 mM (NH₄)₂SO₄및 2 mM MgSO₄, pH 8,85) 중에 주형 DNA 0.25㎍, 200 μM, 4개의 데옥시리보뉴클레오시드 트리포페이트 각각 200ㅍμM, 각각의 프라이머 0.5 mM 및 Pwo-DNA 중합효소(베링거 만하임) 2.5 U를 함유하였다. 샘플은, 94℃에서 2분간의 변성, 72℃에서 연장 기간으로 구성된 PCR을 30회 반복하였다. 증폭 후, 1 mM EDTA를 함유하는 40 mM의 트리스-아세테이트 완충액 중에 0.8%의 아가로오스 겔을 통해 DNA를 전기영동시켰다. PCR 생성물을 JET 플라스미드 미니프레프-키트로 정제시켰다(스웨덴의 사ㅣㄴ 바이오테크 아베). 각각의 돌연변이를 함유하는 인간 단백질 C cDNA를 힌드 III 및 Bsr BI로 분해한 다음, 힌드 III/Xba I에 의해 분해되고 Bsr BI 내지 3′ 말단에 인간 단백질 C 단편을 함유하는 pRc/CMV 벡터내로 클론시켜, 돌연변이를 가진 인간 단백질 C의 완전한 길이의 cDNA를 제조하였다.

5′말단에서 아미노산-11까지를 함유하는 소의 단백질 C cDNA는 완전한 인간의 단백질 C cDNA 및 프라이머 A 및 C로 PCR 증폭되었다. 소의 단백질 C cDNA는 완전한 인간 단백질 C cDNA 및 프라이머 D 및 E로 증폭외었다. 이들 2개의 cDNA 단편은 주형으로 사용하여 프라이머 A 및 E를 이용하여 완전한 길이의 소의 단백질 C cDNA를 포함하는 돌연변이된 아미노산을 증폭되었다. PCR 반응 조건은 hAPC에 대해 사용한 것고 동일하였다. 소의 단백질 C cDNA를 포함하는 각각의 돌연변이를 힌드 III 및 Bsu 36I로 분해하고, Bsu 36I 내지 3′말단에 완전한 소의 단백질 C 단편을 함유하는 pRc/CMV 벡터내로 클론시켜 완전한 길이를 가진 소의 단백질 C cDNA를 함유하는 돌연변이를 제조하였다. 형질 감염전에 DNA 서열결정에 의해 모든 독연변이를 확인하였다.

세포 배양 및 발현:

아데노바이러스로 감염된 인간의 신장 세포주 293을 10%의 태아 송아지 혈청, 2 mM의 L-글루타민, 100U/ml의 페니실린, 100 U/ml의 스트렙토마이신 및 10 ㎍/ml의 비타민 K₁으로 보충한 DMEM 배지중에서 배양하였다. 리포펙틴 방법을 사용하여 형질감염을 수행하였다[felgner, P.L. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-1417]. 2 ㎍의 DNA를 2 mM의 L-글루타민을 함유하는 DMEM을 사용하여 0.1 ml로 희석하였다. 2 mM의 L-글루타민 베지를 함유하는 DMEM 100㎕에 10 ㎕의 리포펙틴(1 mg/ml)을 첨가하였다. DNA 및 리포펙틴을 혼합하고 실온에서 10-15분간 방치하였다. 단층의 세포(5 cm의 페트리 접시에 25-50%의 군집)를 2 mM의 L-글루타민 배지를 함유한 DMEM 중에서 2회 세척하였다. 2 mM의 L-글루타민 배지를 함유하는 DMEM중에 DNA/지질 혼합물을 1.8 ml로 희석한 다음, 세포에 첨가하여 16시간동안 배양하였다. 10%의 송아지 혈청을 함유하는 완전 배지 2 ml를 세포에 공급하고 추가로 48-72시간동안 방치하여 회수한 다음, 트립신으로 분해하고 선택 배지(10% 혈청 및 400㎍/ml의 게네티신)를 함유한 10 cm의 접시중에 1:5로 식종했다[Yan, S.C.B. et al., 1990, Bio/Technology 655-661]. 선택 후 305일이 경과한 후에 게네티신-저항성 콜로니를 얻었다. 각각의 DNA 형질감염으로부터 24개의 콜로니를 수거하여 융합시키고, 단일클론 항체 HPC4(인간의 단백질 C에 대해) 및 모노클론 항체 BPC5(소의 단백질 C에 대해)를 사용하는 도트 블롯법(dot-blot)으로 단백질 C 발현에 대해 배지를 스크린하였다. 다량의 단백질을 제조하는 클론을 분리하고 10㎕/ml의 비타민 K1 존재하에 융합될 때까지 성장시켰다.

소의 재조합 단백질 C 및 이것의 돌연변이체의 정제는 몇가지 변형에서 이전에 사용한 방법을 기초로 하였다[Rezair, A.R., and Esmon, C.T., 1992, J. Biol. Chem. 267:26104-26109]. 조절된 무혈청 배지를 4℃에서 약 10분간 5000 rpm에서 원심분리시켰다. 상청액을 0.45 ㎛의 셀룰로오스 나이트레이트 막(일본의 마이크로 필트레이션 시스템즈)을 통해 여과시켰다. 293개의 세포로부터 상태조절된 배지에 EDTA(최종 농도 5 μM) 및 PPACK(최종 농도 0.2 μM)을 첨가한 후, 밀리포어 콘 셉 LC100(미국의 밀리포어에서 시판)을 사용하여 실온에서 파마시아 FFQ 음이온 교환 컬럼을 통과시켰다. CaCl₂구배(출발 용액, 20 mM의 트리스 HCl/150 밀리 몰의 NaCl, pH 7.4; 제한 용액, 20 mM 트리스-HCl/150 mM의 NaCl/ 30 mM의 염화칼슘, pH 7.4)를 사용하여 단백질을 용출시켰다. 투석 및 셀렉스(Chelex) 100 처리에 의해 염화칼슘을 제거한 다음, NaCl 구배를 이용하여 용출시켰다(출발 용액, 20 mM의 트리스-HCl/150 mM의 NaCl, pH 7.4; 제한 용액, 20 mM의 트리스-HCl/500 mM의 NaCl, pH 7.4). 정제 중 이 시점에서, 소의 단백질 C의 야생형 및 재조합 돌연변이체는 SDS-PAGE에 의해 측정되었을 때 균질했다.

인간의 단백질 C의 야생형 및 재조합 돌연변이체의 정제용으로 사용되는 제1 칼럼은 소의 단백질 C에 대해 기재된 것과 동일하였다. 단백질 S 정제의 방법으로 기재된 몇가지 변형에 의해 레자이어 및 에스몬의 크로마토그래피법을 사용하였다[Rezair, A.r., and Esmon C.T., 1992, supra; He, Z. et al., 1995, Eur, J, Biochem., 227:433-440]. 음이온 교환 크로마토그래피로부터 단백질 C를 함유하는 분획은 도트 블롯법에 의해 확인되었다. 양성 분획을 모아서 칼슘 이온 의존성 항체 HPC-4를 함유하는 친화성 컬럼에 적용시켰다. 컬럼은 5 mM의 벤자미딘-HCl 및 2 mM의 염화칼슘을 함유하는 20 mM의 트리스-HCl, 150 mM의 NaCl, (pH 7.4)을 사용하여 평형화시켰다. 적용한 다음, 컬럼을 ㅁ 몰의 NaCl을 포함하는 동일한 완충액으로 세척하였다. 이어서, 단백질 C를 5 mM의 벤자미딘-염사염을 함유하는 20 mM의 트리스-HCl, 150 mM의 NaCl 및 5 mM의 EDTA를 사용하여 용출시켰다. 정제한 다음, 모든 인간 및 소의 재조합 단백질 C 제제를 SDS-PAGE에 이어서 은 염색에 의해 측정하였다. YM 10 필터(아미콘)을 사용하여 당백질을 농축한 다음, 완충액(50 mM의 트리스-HCl 및 150 mM의 NaCl, pH 7,4)에 대해 투석하여 -70℃에서 저장하였다. 단백질의 농도는 280 nm의 흡광도에서 측정되었다.

정상 및 돌연변이 단백질 C 분자와 막의 결합:

LUV 및 SUV는 실시예 1에 기재된 방법에 의해 제조되었다. 90℃에서 입사광에 대한 광 산란법을 사용하여 인자 VII에 대해 기재된 바와 같이 단백질-막 결합을 정량하였다.

제11 위치에 히스티딘을 함유한 소의 단백질 C는 야생형 단백질 보다 10배 친화성이 큰 막과 상호작용하였다. 수학식 2에 적합한 경우, 데이터는 단백질 C-H11 에 대해서는 930 ±80 nM의 K_D값을 제공하고 야생형 단백질 C에 대해서는 9200±950 nM의 값을 제공한다(도8). 친화성에서의 차이는 25℃에서 약 1.4 kcal/mol에 상응한다. 사실상, 소의 단백질 C H11의 막 친화성은 인간의 천연 단백질 C의 막 친화성(660 nM, 도8)과 거의 동일하다. 이는 프롤린 11이 인간 및 소의 단백질의 막 결합 부위 사이의 차이에 대한 주된 원인을 형성한다.

역의 치환, 프롤린에 의해 인간의 단백질 C를 히스티딘-11로 치환하는 것은 막 친화성을 감소시켰다(도8B). 수학식 2에 적합한 경우, 이들 데이터는 야생형 인간의 단백질 C에 대해서는 660±90 nM의 K_D값을 제공하고 인간의 단백질 C-P11에 대해서는 3350 ±110 nM의 값을 제공한다. 프롤린 도입에 따른 영향은 소의 단백질에서 프롤린의 경우에 비해 단지 조금 적다.

활성화된 단백질 C의 활성에 대한 프롤린-11의 영향:

활성화된 단백질 C는 야생형 및 돌연변이 단백질에 대한 동일한 조건을 사용하는 트롬빈 분해에 의해 생성되었다. 약 150 ㎍의 다양한 단백질 C 제제(1 mg/ml)를 소의 트롬빈(3 ㎍)과 혼합하고 5시간동안 약 37℃에서 배양하였다. 이 반응 생성물을 0.025 M 트리스 완충액-0.05 M NaCl에 희석하고 Sp-세파덱스 C-50의 1 ml 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 동일한 완충액 1 ml로 세척하고 이를 통한 유동액을 활성화된 단백질 C로서 모았다. 컬럼에 적용된 단백질 약 65-80%를 수거하였다. 25℃에서 S2366(0.1 mM)을 단백질 분해하여 APC 활성을 측정하였다. 제제를 더 큰 단위에서 얻은 표준 제제와 비교하였다. 표준 인간 APC는 월터 키시엘 박사로부터 얻었다. 소의 단백질에 있어서, 표준 물질은 트롬빈에 의해 활성화된 APC의 큰 단위의 제제였다. 소의 APC의 활성은 정상 및 돌연변이 단백질(±5%)의 모든 제제와 일치했다. 소의 APC의 2가지 제제를 비교용으로 사용하였다. 트롬빈으로부터 생성된 인간의 APC는 표준 물질 활성의 55 내지 60%였다. 이 연구에서 기록된 농도는 표준 물질에 비해 S2366을 향한 활성에 기초한 것이었다.

표준 APTT 시험은 제조자의 지시에 따라 인간의 혈장 및 표준 APTT 제제(시그마 케미칼 컴퍼니)를 사용하였다. 대안적으로, 인지질은 고도로 정제된 인지질로부터 제조된 베지클의 형태로 제공되었다. 이 분석에서, 소의 혈장(0.1 ml)을 카롱린(0.5 mM의 트리스 완충액 내 5 mg/ml의 0.5 ml, 0.1 M NaCl, pH 7.5) 또는 엘라진산(완충액 중 0.1 mM)를 사용하여 35℃에서 5분간 항온처리하였다. 도시된 양의 APC 및 인지질을 함유하는 완충액 0.1 ml를 첨가한 후 25 mM 염화칼슘 0.1 ml를 첨가함으로써 응집이 시작되었다. 모든 시약은 0.05몰의 트리스 완충액, 0.1 몰의 NaCl(pH 7.5)을 함유하는 표준 완충액 중에 있었다. H11 돌연변이체의 영향을 2배로 하는데데야생형 bAPC의 평균 14배 이상의 농도가 필요하였다. 10 nM bAPC-H11에서 응집 시간은 120분 이상이었다. 표준 APTT 시약(시그마 케미칼 컴퍼니)은 이 혈장을 사용하여 35℃에서 약 61초의 응집 시간을 제공하였다. 응혈 형성에 요구되는 시간을 수동 기법에 의해 기록하였다. 인지질의 양은 분석에서 성분을 제한하기 위해 설계되고 도시된 응집 시간을 제공한다. 사용된 인지질은 SUV(최종 분석에서 45 ㎍/0.4 ㅢ, PS/PC, 10/90) 또는 LUV(최종 분석에서 120㎍/0.4 ml, PS/PC, 25/75)였다.

활성화된 단백질 C의 항응집 활성은 수차례의 분석에서 시험되었다. 도9는 인지질을 제한하면서 수행된 APTT 분석에 대한 영향을 도시하고 있다. 이 분석 조건하에서, 응집 시간은 인지질 농도와 역의 관계로 거의 선형으로 감소하였다. 소의 APC-H11의 효과와 같아지기 위해서 야생형 소의 APC의 약 14배가 필요했다.

도9에서의 연구의 일부를 PS/PC(25/75, LUV)의 막에 대해서 반복하였다. 다시, 인지질에 의해 활성을 제한하고 그것의 농도를 360초의 조절 응고 시간을 생성하도록 조정하였다(0.4 ml 분석에서 25% PS 120㎍). H11 돌연변이체의 영향을 동일하게 하기 위해 약 15배 이상의 야생형 효소가 필요하였다. 결국, 표준 APTT 시약(시그마 케미칼 컴퍼니, 표준 응고 시간 50 ±2초)을 사용하였다. 응집 시간을 102±5초로 2배화하는 데 약 10.0±0.7 nM의 야생형 효소가 필요하였다. 동일한 효고는 2.2±0.1 nM 소의 APC-H11에 의해 생성되었다. 인지질은 표준 분석에서 속도 제한 인자가 아니므로, 막 친화성에 작은 영향을 줄 것으로 예상될 수 있다.

인간의 단백질로부터 얻은 결과를 도 8B에 도시하고 있다. 프롤린-11을 함유하는 인간 APC의 약 2.5 배의 시간이 야생형 APC의 정도로 응집을 연장시키는 데 필요하였다. 프롤린-11을 도입하는 데 따른 더 낮은 영향은 인간 단백질의 막 친화성에서 보다 작은 차이를 반영할 수 있다.

인자 Va의 불활성화:

인자 Va 불활성화를 니콜라스 등의 문헌[Nicolaes et al., 1996, thrombosis and Haemostasis, 76:404-410]에 기재된 방법에 의해 분석되었다. 간단히 말해, 소의 단백질, 소의 혈청을 0.05 M 트리스, 0.1 M NaCl, 1 mg/ml의 소의 혈청 알부민 및 5 mM의 칼슘(pH 7.5)으로 1000배 희석하였다. 인지질 베지클(5㎍/0.24 ml 분석) 및 190 nM 트롬빈 5㎕를 활성 인자 V에 첨가하였다. 37℃에서 10분간 항온처리한 다음, APC를 첨가하고 항온처리를 6분간 지속하였다. 소의 프로트롬빈(최종 농도 10 μM) 및 인자 Xa(최종 농도 0.3 nM)를 펌가하고 반응물을 37℃에서 1분간 항온처리하였다. 이 활성화 반응의 20㎕ 샘플을 S2288 기질(60 μM)을 함유하는 완충액(0.05 M 트리스, 0.1 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.5) 3.8 ml에 첨가되었다. 405 nM에서 흡광도의 변화에 트롬빈의 양을 측정하였다(=1.0*10⁴M^-1s^-1, 트롬빈에 대한 k_cat=100/s). 인간 단백질에 있어서, 인간의 단백질 S가 결핍된 혈장(바이오풀 캐나다 인코포레이티드)을 100배로 희석하고, 인자 Va는 인간의 트롬빈에 의해 활성화되었고, 소의 단백질에 대해 사용된 시약으로 생성된 인자 Va를 분석하였다.

소의 APC-H11은 인자 Va를 불활성화하는 데 있어서 야생형(도10A)보다 9.2 배 활성을 가지고 있었다. 막 결합(위)에 대한 것과 같이, 프롤린-11의 영향은 인간의 단백질에 비해 적었고, 야생형 및 P11 돌연변이체(도10B)에 대한 곡선의 차이는 평균 2.4배로 나타났다. 유사한 결과가 인간의 정상 혈장에 대해 얻어졌다.

실시예 4

비타민 K-의존성 단백질의 막 접촉 부위에 대한 원형 막 친화성의 확인

다양한 인간 및 소의 단백질 C 돌여변이체 및 다른 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 비교한 결과, 막 접촉 부위 원형을 제안하게 되었다. 정전기적 원형은 결합된 칼슘 이온에 의해 생성된, 단백질의 아미노산으로부터 음전하를 띈 할로에 의해 둘러싸인 단백질의 표면상에 양전하를 띄 코어로 구성되어 있다. 이 단백질 부류는 이러한 정전기적 패턴에 접근할수록, 막에 대한 친화성이 증가된다.

인지질 베지클, 야생형 소의 단백질 C, 단백질-막 상호작용 연구, 활성화 및 단백질 C의 정량 및 활성 분석은 실시예 3에 기재되어 있다.

재조합, 돌연변이된 단백질 C는 하기의 절차에 의해 생성되었다: A, 실시예 3에서 기재한 바와 같음; F, 단백질 C 및 pRc/CMV 사이에 Xba I 부위를 5′-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA-3′(서열 번호: 11)(벡터 pRc/CMV 및 단백질 C 사이에 Xba I를 생성한는 뉴클레오티드 984-1019에 상응함); G, 5′-GAA GGC CAT TGT GTC TTC CGT GTC TTC GAA AAT CTC CCG AGC-3′(서열 번호: 12)(소의 단백질 C에서 제8 내지 제9 잔기에 상응함, 이 서열의 제6 및 제7 아미노산은 밑줄친 바와 같이 QN부터 ED까지 돌연변이되었다); H, 5′-CAG TGT GTC ATC CAC ATC TTC GAA AAA TTC CTT GGC-3′(서열 번호: 13)(소의 단백질 C에서 아미노산 잔기 38-27에 상응함, 이 서열의 제6 및 제7 아미노산 잔기는 밑줄틴 바와 같이 QN 에서 ED로 돌연변이되었다);I, 5′-GCC AAG GAA ATT TTC GAA GAT GTG GAT GAC ACA CTG-3′(서열 번호: 14)(인간의 단백질 C에서 아미노산 잔기에 상응함, 이 서열에서 제6 및 제7 아미노산은 밑줄친 바와 같이 QN에서부터 ED까지 돌연변이되었다); J, 5′-CAG TGT GTC ATC CAC ATT TTC GAA AAT TTC CTT GGC-3′(서열 번호: 15)(인간 단백질 C에서 제28-27 아미노산 잔기에 상응함, 이 서열에서 제7 아미노산이 밑줄 친 바와 같이 Q에서부터 E까지 돌연변이되었다); K, 5′-GCC AAG GAA ATT TTC GAA AAT GTG GAT GAC ACA CTG-3′(서열 번호: 16)(인간 단백질 C에서 제27 내지 제38 아미노산 잔기에 상응함, 이 서열에서 제6 아미노산이 밑줄친 바와 같이 Q 내지 E로 돌연변이되었다).

완전한 길이의 인간 및 소의 당백질 C cDNA 모두를 발현 벡터 pRc/CMV의 힌드 III 및 Xba I 부위로 클론시켰다. 소이 단백질 C 돌연변이체 E33D34를 얻기 위해 표적 DNA를 다음과 같이 PCR 증폭시켰다. 5′ 말단에서 제40 위치에 있는 아미노산까지를 함유한 소의 단백질 C cDNA를 완전한 소의 단백질 C cDNA 및 프라이머 A 및 C를 사용하여 증폭시켰다. 샘플은, 94℃에서 2분간의 변성, 72℃에서 연장 기간으로 구성된 PCR을 30회 반복하였다. 증폭 후, 1 mM EDTA를 함유하는 40 mM의 트리스-아세테이트 완충액 중에 0.8%의 아가로오스 겔을 통해 DNA를 전기영동시켰다. PCR 생성물을 진클리인 III 키트(BIO, Inc. USA)로 정제시켰다. 각각의 돌연변이를 함유하는 소의 단백질 C cDNA의 PCR 단편을 힌드 III 및 Bbs I로 분해하였다. 힌드 III/Bbs I 단편 및 인간 단백질 C 단편(Bbs I-3′ 말단)을 pRc/CMV 벡터의 힌드 II 및 Xba I 부위로내로 클론시켜, 돌연변이를 가진 완전한 길이의 소 단백질 C cDNA를 제조하였다. 소의 단백질 C 돌연변이체 H11 E33 D34는, 소의 단백질 C 돌연변이체 H11이 PCR 반응에서 주형으로 사용된 것을 제외하고는 동일한 방식으로 생성되었다.

5′말단에서 아미노산-38까지를 함유하는 인간 단백질 C cDNA는 완전한 인간의 단백질 C cDNA 및 프라이머 A 및 D로 PCR 증폭되었다. 아미노산 27 내지 3′ 말단의 인간 단백질 C cDNA는 완전한 인간 단백질 C cDNA 및 프라이머 B 및 E로 증폭외었다. 이들 2개의 cDNA 단편을 주형으로 사용하여 프라이머 A 및 B를 이용하여 완전한 길이의 소의 단백질 C cDNA를 포함하는 돌연변이된 아미노산을 증폭시켰다. 인간 단백질 C 돌연변이 E33은 다음의 단계에 따라 얻어졌다: 5′으로부터 제38 아미노산까지를 함유하는 인간의 단백질 C CDNA는 완전한 인간의 단백질 C cDNA 및 프라이머 A 및 F를 사용하여 증폭되었다. 인간의 단백질 C cDNA는 완전한 인간 단백질 C cDNA 및 프라이머 B 및 G를 사용하여 증폭되었다/ 이들 2개의 CDNA 단편은 프라이머 A 및 B를 함유하는 돌연변이된 아미노산을 함유하는 완전한 길이의 소 단백질 C cDNA를 주형으로 사용하였다. PCR 혼합물 및 프로그램은 전술한 바와 동일하였다. 힌드 III 및 Sal I에 의해 각각의 돌연변이를 포함하는 인간 단백질 C PCR 생성물을 분해한 다음, 완전한 인간 단백질 C 단편(Sal I-3′ 말단)과 함께 단편(힌드 III-Sal I)을 pRc/CMV 벡터의 힌드 III 및 Xba I 부위로 클론시켜 각각의 돌연변이를 함유하는 완전한 길이의 인간 단백질 C cDNA를 제조하였다. 형질 감염전에 DNA 서열결정에 의해 모든 돌연변이를 확인하였다.

아데노바이러스로 형질감염된 인간 신장 세포주 293을 배앙하고 실시예 3에서와 같이 형질감염시켰다. 소 및 인간 재조합 단백질 C 및 돌연변이체는 실시예 3에 기재된 것과 같이 정제되었다.

비타민 K-의존성 단백질은 표준 막에 대한 이들의 친화성에 따라 4개의 군으로 분류되었다(표 4). 인간 단백질 C(hC), 소의 단백질 C(bC), 소의 프로트롬빈(bPT), 소의 인자 X(bX) 및 인간 인자 VII를 비롯한 몇가지 관련된 단백질의 아미노 말단 잔기의 서열이 참고로 주어진다. 여기서, X는 GlA(감마-카르복시굴루탐산) 또는 Glu이다.

bPT: 서열 번호 17

bX: 서열 번호 18

hC: 서열 번호 1

bC: 서열 번호 2

hVII: 서열 번호 3

전하 및 친화성

	잔기
	11 + 29 + 33 + 34 = 합계	총계	K_D(nM)
제1군
bz	-2	+	-2	-1	-4	-6	0.2^a-32
hz	-2	+	-2		-3	-5	2.0^a-170

제2군
bPT-TNBS			-2		-2	-1	〈10
hVII-Q11E33		+	-2	-1	-2	-2	10
hS		+	-2	-1	-2	-2	40
bX		+	-2	-1	-2	-3	40
bC-E33D34	P	+	-2	-1	-2	-4	125
hX	+	+	-2	-1	-1	-2	160
bPT	+		-2		-1	-	100
hPT	+		-2		-1	-1	-
bS	+	+	-2		0	0	120

제3군
bIX		+	-2		-1	-1	1000
hIX		+	-2		-1	-1	1000
hC		+			+1	-2	660
bC-H11		+			+1	-1	930

제4군
hC	P	+			+1	-2	3300
hVII	P	+	+	-1	+1	+1	4000
bC	P	+			+1	-1	9200
bVII	P	+	+		+1	0	15000

^a높은 친화성 수치가 k_해리/1*10⁷M^-1S^-1; 공통 요소는 다른 단백질에 대한 통상의 k_해리이다.

표 4에서는, 비타민 K-의존성 폴리펩티드 돌연변이체가 현저하다. 총 전하(제1 내지 34 잔기)는 7개의 칼슘 이온(+14) 및 아미노 말단(+1)을 포함한다.

단백질 Z는 다른 단백질에 비해 100 내지 1000배 느린 해리 속도 상수에 기인하여 제1군으로 분류되었다. 단백질 Z가 정상의 해리 속도 상수(약 10⁷M^-1s^-1)를 나타내는 경우, K_D는 약 10^-10몰일 수 있다(Wek, g.j. et al., 1982, Biochemistry, 21: 1949-1959). 후자의 친화성은 비타민 K 단백질에 대해서 최대일 가능성이 있다. 제4군의 단백질은 프롤린-11의 존재에서 제3군의 단백질과 다르며, 비정전기적 수단에 의해 친화성을 변화시킬 수 있다.

제1 내지 34 잔기상의 막 친화성 및 총 음전하 사이에 비교적 약한 관게가 있지만, 제5, 11, 29, 33 및 34 잔기에서만 양호한 관계가 발견되었다. 후자의 아미노산은 단백질의 표면상에 존재하고 있다. 다수의 단백질은 프로트롬빈내로 아미노산 치환에 의해 모델화되었고, 이들의 정전기적 준위는 프로그램 델피에 의해 측정되었다. 소의 단백질 Z의 정전기적 준위 후에 패턴화된 스케치를 도 1에서 도시하고 있다. 제7, 8, 26, 30, 33, 34 및 11에 있는 전기음성적 부위는 칼슘이 충전된 세공에 의해 생성된 양이온성 코어를 둘러싸는 전기음성적 전하의 할로를 생성한다(도 11). 단백질 구조가 이 구조에 가까워질수록, 막에 대한 친화성을 커진다. 이 관계는 야생형 단백질, 돌연변이체 및 화학적으로 변형된 단백질로부터 명백하다.

다른 단백질에 없는 전하 기를 시험함으로써 다른 구조에 대한 패턴을 추정할 수 있다. 예를 들어, 소의 프로트롬빈의 Lys-1 및 Arg-10은 이들의 근접도에 있어서 매우 전기적으로 양성인 부위를 생성하고; 단백질 C 및 인자 VII에서 Gla-33의 결핍은 이렇한 단백질 부위에서 보다 덜 음전기적인 성질을 띄게 한다. 모든 경우에 있어서, 가장 높은 친화도는 단백질 Z에 대해 도시된 것과 같이, 전기음성적 단백질 표면에 의해 완전히 둘러싸여진 전기적으로 양성의 코어를 보유한 구조에 상응한다. 이 패턴에 대한 에외는 Pro-11을 가진 단백질인데, 이는 구조적 효과 및 Ser-12에 의해 친화성이 낮아질 수 있으며, 상기 Ser-12(인간 단백질 C)는 특이한 전하를 띄지 않는 잔기이다.

정전기적 분포에 대한 원형의 가설을 추가로 시험하기 위하여, 부위 특이적 돌연변이화를 사용하여 소의 Gln22Asn34 및 인간 단백질 C를 Glu33asp34로 치환하였다(서열 번호: 19). Glu33은 단백질 공정에서 Gla로 변형될 수 있다. 이들 변화는 소의 단백질 C의 정전기적 준위를 소의 인자 X의 정전기적 준위로 변화시켰다. 돌연변이 단백질의 막 친화성은 프롤린-11의 존재에 기인하여 인자 X의 막 친화성에 비해 낮아지는 것으로 예상된다. 실제로, 소의 단백질 C 돌연변이는 소의 프로트롬빈의 것과 유사한 막 친화성을 생성하였고(도12A), 소의 인자 X의 막 친화성에 비해 약간 작았다.

더 큰 관심하는 APC에 의한 응혈의 저해는 야생형 효소보다는 돌연변이에 있어서 더 크다(도 12B, C). 실시예 3으로부터 소의 단백질 C의 P11H 돌연변이에 대한 결과는, 제11 및 제34 위치에서 아미노산 치환을 변화시킴으로써 막 친화성 및 활성이 다른 단백질 부류를 생성할 수 있었다.

E33 및 E33D34를 함유하는 인간 단백질 C 돌연변이는 막 결합 친화성이 약간 증가되었다(도 13a). 이들 돌연변이체의 활성은 야생형 효소에 비해 약간 작았다9도13b). 소의 단백질 C의 돌연변이를 사용한 결과는 인간 단백질의 E33D34 돌연변이가 단백질에서 H11 및/또는 다른 특정한 아미노산로부터 생겨날 수 있다. 도 14A는 소의 단백질 C가 야생형 단백질에 비해 약 10배 높은 친화성으로 막에 결합하고, E33D34 돌연변이는 약 70배의 친화성으로 결합하며, 3중 돌연변이인 H11E33D34는 H11 돌연변이체에 비해 약간만 양호했다. 이 관계는 이들 돌연변이로부터 형성된 활성에 반영되었다. 이 결과는 H11의 존재가 막 결합 친화성에 있어서 E33D34의 영향력의 감소를 의미하였다.

이들 결과는 E33D34의 도입이 모든 단백질에 대해 최적일 수 없음은 나타내었다. 결과적으로, 다른 돌연변이는 최대로 증가된 막 친화성을 가지고 E33D34를 사용하는 인간 단백질 C를 생성하는 데 바람직할 수 있다. 소의 단백질 c를 이용한 격과는 이 현상의 주된 원인이 될 수 있다. 결과적으로, H11은 E33D34 돌연변이와 함께 인간 단백질 C에서 다른 아미노산 또는 글루타민으로 변형될 수 있다. 친화성에 영향을 줄 수 있는 다른 아미노산은 인간 단백질 C에 전적으로 특수한 아미노산인 제12 위치에 세린이다. 추가적인 변화는 막 친화성이 증가된 단백질을 생성한다.

또한, 정전기적인 원형은 인간 및 소의 인자 X와의 비교에 의해 시험될 수 있다. 인간의 인자 X에서 리신-11의 존재는 소의 인자 X에 비해 낮은 친화성을 가져야 한다. 이 예상은 도15에 도시된 결과로부터 나온 것이다.

초기의 연구는 소 및 인간 프로트롬빈 단편 1의 트리니트로벤젠설폰산(TNBS)변형이 막 친화성에 거의 영향을 주지 않았다는 것을 보여준다[Weber, D.J. et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:4564-4569; Welsch, D.J.et al., 1988, Biochemistry, 27:2933-2938]. 반응에 사용된 조건은 아미노 말단을 유도체화할 수 있고, 그 변화는 낮은 막 친화성에 관련되어 있다[Welsch, D.J. and Nelsestuen, G.ㅣ., 1988, Biochemistry, 27:4939-4945]. 칼슘의 존재하에 단백질의 변형은 천연형 단편 1에 비해 막에 대한 친화ㅘ성이 보다 튼, TNBS에 의해 변형된 단백질을 생성하였다.

단백질 Z가 원형을 구성한다는 이러한 제안은 해리 속도 상수에 기초를 둔 것이고, 정상 해리 속도는 K_D=10^-10M을 생성할 것이다. 이 값에 도달되는가의 여부는 불명확하다. 단백질 Z의 느린 속도 상수는 부적절한 단백질 폴딩에 의해 일어나므로 구성원이 결합된 형태의 농도가 낮아지게 된다. 조건이 단백질 폴딩을 개선시키는 쪽을 변화된다면, 단백질 Z의 해리 속도가 개선될 것이다. 실제로, 단백질 Z에 대한 해리 속도 상수가 pH의 변화에 의해 개선되었다. 이 관찰에 대한 기초는 칼슘 이온 2 및 3에 대한 아미노 말단(pH 7.5에서 +1)에 가까운 위치에 있는 특이한 형태의 프로트롬빈 구조와 관련될 것이다. 아미노 말단의 +1 전하는 도1에 있는 상기 Ca-1 바로 위에 있는 전기적으로 약한 양전하를 띈 부위를 담당한다. Ca 및 아미노 말단의 전하 반발은 단백질 폴딩을 탈안정화시킬 수 있고, 낮은 폴딩 안정성을 가진 단백질에 있어서는 심각한 문제가 될 수 있다.

표 5는 원형 모델에 대한 추가적인 자료를 제시한다. 이는 스트론튬 이온 1 및 8(프로트롬빈의 Sr X-선 결정 구조로부터 발견되는 칼슘 1 및 잉여 2가 금속 이온에 상응함) 이온성 기의 거리 사이 관계를 나타낸 것이다. 채턴은, 이온기가 이들 금속 이온에 가까워질수록 , 막 친화성에 대한 영향력이 커짐을 의미한다. 그 예외는 Arg-16인데, 이는 전기양성적 코어의 전하에 기여한다. 높은 친화성은 모든 다른 부위에서 전기음성적 전하와 관련되어 있다. 이 관계는 또한 GLA 잔기에 적용된다.

Sr-1, 8까지의 거리 및 이온 중요도

	거리(Å):영향/이온
위치	원자^a	Sr-1	Sr-8	K_D(K_M)
(A,A- 단백질)
3(K-PT)	-N	22.1	21.7	낮거나 알려져 있지 않음
5(K-IX)	para-C(F)	20.1	20.8	″
19(K/R-VII)	C5(L)	20.2	17.8	″
22(K-IX)	C4(P)	17.0	18.5	″
10(R)	C6(R)	16.8	12.9	″
25(R-PT)	C6(R)	11.2	13.8	″
24(X/D-PT)	O(S)	8.1	12.0	″
11(K-PT, hX, bS; Gla-PZ)	-C(K)	14.7	7.4	3-10-폴드^b
33(Gla)	γ-C(E)	11.6	7.5	″
34(D)	O(S)	15.3	12.1	″
29(R)	para-C(F)	7.5	8.4	″
16(R)	C6(R)	14.2	10.6	″^c
Gla 잔기^d
낮은 중요도:
7		12.8	13.3	+2(〈2)
15		20	16	〈2(〈2)
20		19.4	17.8	〈2(〈2)
21		17.2	15	4(3)
33		11.6	7.5	?^e(〈2)
높은 중요도:
8		8.7	10.9	?^e(20)
26		3.6	9.5	?^e(50)
17		11.1	9.1	〉200(100)
27		8.4	10.6	〉200(85)
30		3.4	4.2	〉200(25)

^a거리는 소의 프로트롬빈의 이 원자(측정에 사용된 프로트롬빈의 잔기는 괄호에서 주어짐)로부터 Sr-프로트롬빈 단편 1 구조의 스트론튬 1 및 8까지의 거리[Seshadri et al. 1994, Boichemistry 33:1087-1092].

^b16-R을 제외한 모든 것에 있어서, 양이온은 친화성을 저하시키고 음이온은 친화성을 증가시킨다.

^cThariath et al. 1997 Bioche. J. 322:309-315

^dAsp 돌연변이에 대한 영향, 감마-카르복실-카본에 대한 평균 거리

^e결합은 낮은 용량이거나 응집을 유발하고, 비교가 불확실함.

도 15C에 도시된 결과는 단백질 Z의 해리 속도가 pH 9에서 실질적으로 향상되었음을 보여준다. 여기서, 아미노 말단은 전하를 띄지 않아야 한다. 이 데이터로부터 얻어진 속도 상수는 pH 7.5에서 보다 pH 9에서 약 12배였다(도 15C).

기타 구체예

본 발명은 상세한 설명과 함께 기재되어 있지만 전술한 설명은 본 발명을 예시하기 위함이며, 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 목적이 아니라는 것을 이해하여야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 특허청구범위의 범위내이다.

[서열 목록]

Claims

상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함하는 비타민 K-의존성 폴리펩티드로서, 상기 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 비타민 K-의존성 폴리펩티드.
제1항에 있어서,

상기 GLA 도메인이 제1 아미노산에서부터 약 제45 아미노산까지인 폴리펩티드.
제1항에 있어서,

상기 아미노산 치환이 제11, 제12, 제29, 제33 또는 제34 아미노산에서 일어나는 폴리펩티드.
제3항에 있어서,

상기 아미노산 치환이 제11, 제33 또는 제34 아미노산에서 일어나는 폴리펩티드.
제1항에 있어서,

상기 폴리펩티드가 단백질 C 또는 활성화된 단백질 C를 포함하는 폴리펩티드.
제5항에 있어서,

상기 아미노산 치환이 제33 아미노산에서 글루탐산 잔기를 포함하고 제34 아미노산에서 아스파르트산 잔기를 포함하는 폴리펩티드(서열 번호: 19).
제6항에 있어서,

상기 아미노산 치환이 제11 아미노산에서 글루타민을 추가로 포함하는 폴리펩티드(서열 번호: 20).
제6항에 있어서,

상기 아미노산 치환이 제11 아미노산에서 글루탐산을 추가로 포함하는 폴리펩티드(서열 번호: 21).
제7항 또는 제8항에 있어서,

상기 아미노산 치환이 제12 아미노산에서 글리신을 추가로 포함하는 폴리펩티드(서열 번호: 24 또는 서열 번호: 35).
제1항에 있어서,

상기 폴리펩티드가 인자 VII 또는 인자 VIIa를 포함하는 폴리펩티드.
제10항에 있어서,

상기 아미노산 치환이 제11 아미노산에서 글루타민 잔기를 포함하고, 제33 아미노산에서 글루탐산 잔기를 포함하는 폴리펩티드(서열 번호: 30).
제1항에 있어서,

상기 폴리펩티드가 인자 IX 또는 인자 IXa를 포함하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서,

상기 폴리펩티드는 활성 부위가 변형된 인자 VIIa를 포함하는 폴리펩티드.
제13항에 있어서,

상기 아미노산 치환이 제11 아미노산에서 글루타민 잔기를 포함하고, 제33 아미노산에서 글루탐산 잔기를 포함하는 폴리펩티드(서열 번호: 30).
제1항에 있어서,

상기 변형된 GLA 도메인이 칼슘으로 포화된 상태에서 전기적으로 음전하를 띈 할로를 보유한 양이온성 코어를 가진 3차 구조를 형성하는 아미노산 서열을 포함하는 비타민 K-의존성 폴리펩티드.
비타민 K-의존성 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산으로서, 상기 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 상기 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함하고, 상기 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 분리된 핵산.
핵산 벡터를 포함하는 포유동물의 숙주 세포로서, 상기 벡터는 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 암호화하고 상기 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 상기 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함하고, 상기 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 포유동물의 숙주 세포.
포유동물에서 응혈의 형성을 억제하는 데 유효한 양의 비타민 K-의존성 폴리펩티드 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 상기 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함하고, 상기 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 약학 조성물.
포유동물에서 응혈의 형성을 증가시키는 데 유효한 양의 비타민 K-의존성 폴리펩티드 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 상기 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함하고, 상기 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 약학 조성물.
응혈성 질병을 치료하는 데 사용하기 위한 비타민 K-의존성 폴리펩티드로서, 상기 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 상기 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함하고, 상기 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 비타민 K-의존성 폴리펩티드.
응혈성 질병을 치료하기 위한 의약을 제조하는 데 있어서 비타민 K-의존성 폴리펩티드의 용도로서, 상기 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 상기 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함하고, 상기 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 용도.
포유동물에서 응혈의 형성을 감소시키는 데 유효한 양의 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 응혈의 형성을 감소시키는 방법으로서, 상기 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 상기 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함하고, 상기 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 방법.
포유동물에서 응혈의 형성을 증가시키기에 유효한 양의 비타민 K-의존성 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 응혈의 형성을 증가시키는 방법으로서, 상기 비타민 K-의존성 폴리펩티드는 상응하는 천연의 비타민 K-의존성 폴리펩티드에 비해 상기 폴리펩티드의 막 결합 친화성을 향상시키는 변형된 GLA 도메인을 포함하고, 상기 변형된 GLA 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 방법.