ES2327811T3 - Polipeptidos de factor viia modificados. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido del Factor VIIa que comprende un dominio GLA modificado que aumenta la afinidad de unión a la membrana de dicho polipéptido con respecto al correspondiente polipéptido del Factor VIIa nativo, comprendiendo dicho dominio GLA modificado: una inserción de aminoácido en la posición 4; donde las posiciones de los aminoácidos del polipéptido del Factor VIIa se numeran de acuerdo con el Factor IX.
Description
Polipéptidos de factor VIIa modificados.
Los fondos para el trabajo descrito en la
presente memoria fueron proporcionados por el gobierno federal, que
tiene ciertos derechos en la invención.
Las proteínas dependientes de vitamina K
contienen de 9 a 13 restos ácido
gamma-carboxiglutámico (Gla) en sus 45 restos amino
terminales. Los restos Gla son producidos por enzimas en el hígado
que utilizan vitamina K para carboxilar las cadenas laterales de
los restos ácido glutámico en los precursores de proteínas. Las
proteínas dependientes de vitamina K están implicadas en numerosos
procedimientos biológicos, de los cuales el mejor descrito es la
coagulación de la sangre (revisado por Furie, B. y Furie, B.C. 1988,
Cell, 53:505-518). Las proteínas
dependientes de vitamina K incluyen la proteína Z, la proteína S, la
protrombina, el factor X, el factor IX, la proteína C, el factor
VII y Gas6. La última proteína funciona en la regulación del
crecimiento celular. Matsubara et al., 1996, Dev.
Biol., 180-499-510. Los restos
Gla son necesarios para la apropiada unión del calcio y la
interacción con la membrana por medio de estas proteínas. Se piensa
que el sitio de contacto con la membrana del factor X reside en los
restos aminoácido 1-37. Evans y Nelsestuen, 1996,
Protein Sci., 5: supl. 1, 163 Abs. Aunque las regiones que
contienen Gla de las proteínas del plasma muestran un alto grado de
homología de secuencia, tienen al menos un orden de afinidad por la
membrana de 1.000 veces. McDonald et al., 1997,
Biochemistry, 36:5120-5137.
El factor VII funciona en la fase inicial de
coagulación de la sangre y puede ser un elemento clave en la
formación de coágulos sanguíneos. El precursor inactivo, o zimógeno,
tiene una baja actividad enzimática que aumenta enormemente por la
escisión proteolítica en el enlace R152I153 para formar el factor
VIIa. Esta activación puede ser catalizada por el factor Xa así
como por el factor tisular VIIa, una proteína integrante de la
membrana encontrada en numerosos tipos celulares. Fiore et
al., 1994, J. Biol. Chem., 269:143-149. La
activación por el factor tisular VIIa es referida como
autoactivación. Está implicada tanto en la activación (formación del
factor VIIa a partir del factor VII) como en la subsiguiente
actividad del factor VIIa. La ruta más importante para la
activación in vivo no es conocida. El factor VIIa puede
activar los factores de coagulación sanguínea IX y X.
El factor tisular es expresado a niveles
elevados en la superficie de algunas células tumorales. Es posible
un papel para el factor tisular, y para el factor VIIa, en el
desarrollo de tumores y la invasión de tejidos. Vrana et
al., Cancer Res., 56:5063-5070. La expresión
celular y la acción del factor tisular también es un factor
principal en la respuesta tóxica al choque endotóxico. Dackiw et
al., 1996, Arch. Sure., 131:1273-1278.
La proteína C es activada por la trombina en
presencia de trombomodulina, una proteína integrante de la membrana
de las células endoteliales. Esmon et al., 1982, J. Biol.
Chem., 257:859-864. La proteína C activada (APC)
degrada los factores Va y VIIIa en combinación con su cofactor, la
proteína S. La resistencia a la APC es la forma más común de la
enfermedad trombótica heredada. Dahlback, 1995, Blood,
85:607-614. Los inhibidores de vitamina K son
administrados comúnmente como profilaxis para enfermedades
trombóticas.
Las proteínas dependientes de vitamina K se
utilizan para tratar ciertos tipos de hemofilia. La hemofilia A se
caracteriza por la ausencia de factor VIII activo, factor VIIIa, o
la presencia de inhibidores del factor VIII. La hemofilia B se
caracteriza por la ausencia de factor IX activo, factor IXa. La
deficiencia de factor VII, aunque rara, responde bien a la
administración de factor VII. Bauer, 1996, Haemostasis,
26:155-158, supl. 1. La terapia de sustitución del
factor VIII es limitada debido al desarrollo de un elevado título de
anticuerpos del factor VIII inhibidores en algunos pacientes.
Alternativamente, se puede utilizar el factor VIIa en el
tratamiento de la hemofilia A y B. El factor IXa y el factor VIIIa
activan el factor X. El factor VIIa elimina la necesidad de
factores IX y VIII activando directamente el factor X, y puede
superar los problemas de las deficiencias de factor IX y VIII con
escasas consecuencias inmunológicas. Hedner et al., 1993,
Transfus. Medi. Rev., 7:78-83; Nicolaisen et
al., 1996, Thromb. Haemost., 76:200-204. Los
niveles eficaces de administración de factor VIIa son a menudo
elevados (45 a 90 \mug/kg de peso corporal) y puede ser necesario
repetir la administración cada pocas horas. Shulmav et al.,
1996, Thromb. Haemost., 75:432-436.
Se ha encontrado que una forma soluble de factor
tisular (factor tisular soluble o sTF) que no contiene la región de
contacto con la membrana es eficaz en el tratamiento de la hemofilia
cuando se administra simultáneamente con el factor VIIa. Véase, por
ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.504.064. En perros,
se demostró que el sTF reducía la cantidad de factor VIIa necesaria
para tratar la hemofilia. La asociación con la membrana de
sTF-VIIa es completamente dependiente del sitio de
contacto con la membrana del factor VII. Esto contrasta con el
complejo de tejido normal-factor VIIa, que se une a
la membrana a través tanto del factor tisular como de VII (a).
Se ha descubierto que las modificaciones en el
dominio de ácido gamma-carboxiglutámico (GLA) de los
polipéptidos dependientes de vitamina K potencian sus afinidades de
unión a la membrana. Los polipéptidos dependientes de vitamina K
modificados de esta manera tienen un aumento de actividad y se
pueden utilizar como anti-coagulantes,
pro-coagulantes, o para otras funciones que utilizan
proteínas dependientes de vitamina K. Por ejemplo, una molécula de
factor VII mejorada puede proporcionar numerosos beneficios
disminuyendo la dosificación de VIIa necesaria, reduciendo la
frecuencia relativa de administración y/o proporcionando cambios
cualitativos que permitan un tratamiento más eficaz de los estados
de deficiencia.
La invención se expone en las
reivindicaciones.
La invención ofrece polipéptidos del Factor VIIa
dependientes de vitamina K que incluyen un dominio GLA modificado
que intensifica la afinidad de unión a la membrana del polipéptido
con respecto al correspondiente polipéptido dependiente de vitamina
K nativo. La actividad del polipéptido dependiente de vitamina K
también resulta intensificada. El dominio GLA modificado comprende
una inserción de aminoácido en la porción 4. El dominio puede
incluir otra sustitución de aminoácido. Por ejemplo, la sustitución
de aminoácido puede estar en el aminoácido 2, 5, 9, 11, 12, 29,
33, 34, 35, o 36, y sus combinaciones. En particular, la sustitución
puede estar en los aminoácidos 11, 12, 29, 33, o 34, en los
aminoácidos 11, 12, 29, 34, o 35, en los aminoácidos 2, 5, o 9, en
los aminoácidos 5, 9, 35, o 36, en los aminoácidos 11, 12, en los
aminoácidos 29 o 33, o en los aminoácidos 34, 35, o 36, y sus
combinaciones. El dominio GLA modificado puede incluir una secuencia
de aminoácidos, que, en el estado saturado de calcio, forma una
estructura terciaria que tiene un núcleo catiónico con un halo de
carga electronegativa. Los polipéptidos dependientes de vitamina K
pueden ser utilizados para tratar trastornos de la coagulación y
pueden incrementar la formación de coágulos.
El dominio GLA modificado del factor VIIa, y
factor VIIa con el sitio activo modificado pueden contener una
sustitución en los aminoácidos 11, 29, 33, 34, o 35, y sus
combinaciones. Por ejemplo, se puede sustituir un resto glutamina,
ácido glutámico, ácido aspártico, o asparagina en el aminoácido 11,
se puede sustituir un resto ácido glutámico o fenilalanina en el
aminoácido 29, o se puede sustituir un resto ácido glutámico en el
aminoácido 33, y sus combinaciones tales como las sustituciones en
11 y 29, 11, 29, y 33, y 11 y 33. La sustitución de un resto
glutamina en el aminoácido 11 es particularmente útil. En una
realización, se sustituye un resto glutamina en el aminoácido 11 y
un resto ácido glutámico en el aminoácido 33. El dominio GLA
modificado puede incluir adicionalmente al menos un resto hidrófobo
en los aminoácidos 34 o 35. Se puede sustituir un resto
fenilalanina, leucina, o isoleucina en el aminoácido 34, y/o un
resto ácido aspártico o ácido glutámico en el aminoácido 35.
El dominio GLA modificado de los polipéptidos
dependientes de vitamina K puede incluir adicionalmente un sitio de
escisión inactivado.
La invención ofrece un polipéptido dependiente
de vitamina K que incluye un dominio GLA modificado que potencia la
afinidad de unión a la membrana y la actividad del polipéptido. El
dominio GLA modificado incluye al menos una inserción de aminoácido
en el aminoácido 4. El polipéptido es el factor VIIa, y puede
incluir la inserción de un resto tirosina o glicina en la posición
4.
La invención también ofrece una célula
anfitriona de mamífero que incluye un polipéptido del factor VIIa
dependiente de vitamina K como se ha definido antes. El polipéptido
incluye un dominio GLA modificado que intensifica la afinidad de
unión a la membrana del polipéptido con respecto al correspondiente
polipéptido dependiente de vitamina K nativo. El dominio GLA
modificado incluye al menos una sustitución de aminoácido como se ha
descrito
antes.
antes.
La invención también hace referencia a una
composición farmacéutica que incluye un portador farmacéuticamente
aceptable y una cantidad de polipéptido del factor VIIa dependiente
de vitamina K como se ha definido antes. El polipéptido dependiente
de vitamina K incluye un dominio GLA modificado que intensifica la
afinidad de unión a la membrana del polipéptido con respecto al
correspondiente polipéptido dependiente de vitamina K nativo.
También se intensifica la actividad del polipéptido. El dominio GLA
modificado del polipéptido dependiente de vitamina K incluye al
menos una sustitución de aminoácido como se ha descrito antes. La
composición puede incluir adicionalmente factor tisular
soluble.
La invención también ofrece un polipéptido del
factor VIIa dependiente de vitamina K como se ha definido antes
para su uso como medicamento. El polipéptido dependiente de vitamina
K incluye un dominio GLA modificado que intensifica la afinidad de
unión a la membrana del polipéptido con respecto al correspondiente
polipéptido dependiente de vitamina K nativo.
La invención también incluye un polipéptido de
la invención para su uso en el incremento de la formación de
coágulos en el mamífero. El uso puede incluir la administración de
una cantidad de un polipéptido dependiente de vitamina eficaz para
incrementar la formación de coágulos en el mamífero. El polipéptido
del factor VIIa dependiente de vitamina K incluye un dominio GLA
modificado que intensifica la afinidad de unión a la membrana del
polipéptido con respecto al correspondiente polipéptido dependiente
de vitamina K nativo. El dominio GLA modificado incluye al menos
una inserción de aminoácido en el aminoácido 4 y puede incluir al
menos una sustitución de aminoácido como se ha descrito antes.
Los polipéptidos dependientes de vitamina K de
la invención se pueden utilizar en la fabricación de medicamentos
para el tratamiento de los trastornos de coagulación.
A menos que se defina de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria
tienen el mismo significado comúnmente comprendido por los expertos
en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque se pueden
utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los
descritos en la presente memoria para poner en práctica la
invención, los métodos y materiales adecuados se describen más
abajo. En caso de conflicto, se impondrá la presente memoria,
incluyendo las definiciones. Además, los materiales, los métodos, y
los ejemplos son meramente ilustrativos y no se pretende que sean
limitantes.
Otras características y ventajas de la invención
se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada,
y a partir de las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 representa la unión, con
desviaciones típicas, de VIIa de tipo salvaje (círculos vacíos),
VIIQ11E33 (círculos rellenos), y factor X bovino (triángulos
rellenos) a las membranas.
La Figura 2 representa la autoactivación de
VIIQ11E33. La línea discontinua muestra la actividad en ausencia de
fosfolípido.
La Figura 3 representa la activación del factor
X por el factor VIIa. Los resultados para el factor VIIa de tipo
salvaje (círculos vacíos) y VIIaQ11E33 (círculos rellenos) se dan
para una concentración 0,06 nM.
La Figura 4 representa la coagulación de plasma
humano por medio de VIIa y VIIaQ11E33 con factor tisular
soluble.
La Figura 5 representa la coagulación de plasma
por medio de zimógenos del factor VII y factor tisular normal.
La Figura 6 representa la inhibición de la
formación de coágulos por medio del factor VIIaQ11E33 con el sitio
activo modificado (DEGR-VIIaQ11E33).
La Figura 7 representa el tiempo en circulación
del factor VIIQ11E33 en ratas.
La Figura 8 representa la interacción con la
membrana por medio de proteínas normales y modificadas. El panel A
muestra la interacción de la proteína C bovina de tipo salvaje
(círculos vacíos) y la proteína C-H11 bovina
(círculos rellenos) con las vesículas. El panel B muestra la
interacción de la proteína C humana de tipo salvaje (círculos
vacíos) y la proteína C-P11 humana (círculos
rellenos) con las membranas. En ambos casos, la línea discontinua
indica el resultado si toda la proteína añadida se unía a la
membrana.
La Figura 9 representa la influencia de la
proteína C activada sobre los tiempos de coagulación. En el panel
A, se muestran la media y la desviación típica para tres
determinaciones de tiempos de coagulación para plasma bovino para
APC bovina de tipo salvaje (círculos vacíos) y para
bAPC-H11 (círculos rellenos). En el panel B, se
muestran la media y la desviación típica de tres réplicas de
coagulación de plasma humano para humana de tipo salvaje (círculos
vacíos) y APC-P11 humana (círculos rellenos).
La Figura 10 representa la inactivación del
factor Va por medio de APC bovina y humana. El panel A representa
la inactivación del factor Va por APC bovina de tipo salvaje
(círculos vacíos) y APC-H11 bovina (círculos
rellenos). El panel B representa la inactivación del factor Va
humano en plasma deficiente en proteína S por medio de APC humana
de tipo salvaje (círculos vacíos) y APC-H11 humana
(círculos rellenos).
La Figura 11 representa la distribución
electrostática de la proteína Z. Las líneas verticales indican
regiones electropositivas y las líneas horizontales indican
regiones electronegativas.
La Figura 12 representa la unión a la membrana y
la actividad de diversas proteínas C. El panel A muestra la unión a
la membrana por medio de la proteína C de tipo salvaje (círculos
vacíos), el mutante P11H de la proteína C (cuadrados rellenos),
Q33E, el mutante N34D (círculos rellenos) y la protrombina bovina
(cuadrados vacíos). El panel B muestra la inhibición de la
coagulación de la sangre por medio de estos mutantes. El panel C
muestra la inactivación del factor Va.
La Figura 13 compara la unión a la membrana y la
actividad de mutantes de la proteína C humana. El panel A compara
la unión a la membrana del tipo salvaje (círculos vacíos), E33
(triángulos vacíos) y E33D34 (círculos rellenos). El panel B
compara los tiempos de coagulación utilizando el tipo salvaje
(triángulos vacíos), E33 (círculos vacíos) y E33D34 (círculos
rellenos).
La Figura 14 compara la unión a la membrana
(Panel A) y la inhibición de la coagulación (Panel B) con el tipo
salvaje (cuadrados vacíos), H11 (círculos rellenos), E33D34
(triángulos vacíos) y el mutante triple H11E33D34 (círculos vacíos)
de la proteína C bovina.
La Figura 15 representa las propiedades de
interacción con la membrana de diferentes proteínas dependientes de
vitamina K. El panel A compara la interacción con la membrana del
factor X humano (círculos rellenos) y bovino (círculos vacíos). El
panel B muestra la interacción con la membrana por medio del
fragmento 1 de la protrombina bovina normal (círculos vacíos), el
fragmento 1 modificado con TNBS en ausencia de calcio (círculos
rellenos) y el fragmento 1 modificado con TNBS en presencia de
calcio 25 mM (cuadrados rellenos). El panel C muestra la velocidad
de unión de la proteína Z a las vesículas a pH 9 (círculos rellenos)
y 7,5 (círculos vacíos).
Las Figs. 16A-16C son informes
del Clot Signature Analyzer de la formación de trombos inducida por
colágeno (CITF) para sangre normal (A), para sangre que contiene
APC de tipo salvaje 30 nM (B), y sangre que contiene APC(C)
VIIQ12E33D34 6 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto, la invención ofrece un
polipéptido dependiente de vitamina K que incluye un dominio GLA
modificado con una afinidad de unión a la membrana intensificada
con respecto al correspondiente polipéptido dependiente de vitamina
K nativo como se muestra en las reivindicaciones. Se intensifica la
actividad del polipéptido dependiente de vitamina K. Los
polipéptidos dependientes de vitamina K son un grupo de proteínas
que utilizan la vitamina K en su ruta biosintética para carboxilar
las cadenas laterales de los restos ácido glutámico en los
precursores de la proteína. El dominio GLA contiene
9-13 restos ácido
\gamma-carboxiglutámico en la región
N-terminal del polipéptido, típicamente desde el
aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 45. Las posiciones de
los aminoácidos de los polipéptidos comentados en la presente
memoria se numeran de acuerdo con el factor IX. El factor VII tiene
un aminoácido menos (posición 4) y por consiguiente debe ser
ajustado. Por ejemplo, la posición 10 real de la proteína C bovina
es una prolina, pero en la presente memoria es numerada como
aminoácido 11 para facilitar la comparación total. Según se utiliza
en la presente memoria, el término "polipéptido" es cualquier
cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o de la
modificación post-traduccional. Los aminoácidos han
sido designados en la presente memoria por medio de las abreviaturas
de tres letras y de una letra convencionales.
Las modificaciones del dominio GLA incluyen al
menos una inserción en la posición 4. Además el dominio GLA puede
incluir al menos una sustitución de aminoácido (p. ej., de una a 10
sustituciones). Las sustituciones pueden ser conservativas o no
conservativas. Las sustituciones de aminoácidos conservativas
sustituyen un aminoácido por otro aminoácido de la misma clase,
mientras las sustituciones de aminoácidos no conservativas
sustituyen un aminoácido por otro aminoácido de una clase diferente.
Las sustituciones no conservativas pueden dar como resultado un
cambio sustancial en la hidrofobicidad del polipéptido o en el
volumen de una cadena lateral del resto. Además, las sustituciones
no conservativas pueden realizar un cambio sustancial en la carga
del polipéptido, por ejemplo reduciendo las cargas electropositivas
o introduciendo cargas electronegativas. Los ejemplos de las
sustituciones no conservativas incluyen un aminoácido alcalino por
un aminoácido no polar, o un aminoácido polar por un aminoácido
ácido. La sustitución de aminoácidos puede estar en el aminoácido
2, 5, 9, 11, 12, 29, 33, 34, 35, o 36, y sus combinaciones. El
dominio GLA modificado puede incluir una secuencia de aminoácidos,
que, en el estado saturado con calcio, contribuye a la formación de
una estructura terciaria que tiene un núcleo catiónico con un halo
de carga electronegativa. Las proteínas con la afinidad más elevada
muestran una carga electronegativa que se extiende a los aminoácidos
35 y 36. Sin estar ligado a una teoría concreta, el aumento de
afinidad por la membrana puede resultar de un patrón electrostático
concreto que consiste en un núcleo electropositivo completamente
rodeado por una superficie
electronegativa.
electronegativa.
Las modificaciones del dominio GLA incluyen una
inserción de un resto en la posición cuatro de un polipéptido del
factor VIIa dependiente de vitamina K. El factor VII carece de un
aminoácido en esta posición basándose en los alineamientos de
secuencia de los polipéptidos dependientes de vitamina K.
Muchos polipéptidos dependientes de vitamina K
son sustratos para enzimas unidas a la membrana. Puesto que los
polipéptidos no dependientes de vitamina K presentan la máxima
afinidad de unión a la membrana potencial de un dominio GLA, todos
deben contener aminoácidos cuyo propósito es reducir la afinidad de
unión. Por consiguiente, muchos polipéptidos dependientes de
vitamina K contienen aminoácidos que no son óptimos desde el punto
de vista de la máxima afinidad de unión a la membrana. Estos restos
interrumpen eficazmente el sitio de unión para proporcionar un
recambio más rápido para una reacción enzimática.
La disminución de afinidad por la membrana puede
servir para muchos fines. La elevada afinidad está acompañada de un
lento intercambio, que puede limitar las velocidades de reacción.
Por ejemplo, cuando la enzima protrombinasa es ensamblada sobre las
membranas con una elevada afinidad por el sustrato, el intercambio
de proteínas desde la membrana, en lugar de la catálisis
enzimática, es la etapa limitante. Lu y Nelsestuen, 1996,
Biochemistry, 35:8201-8209. Alternativamente, el
ajuste de la afinidad por la membrana mediante la sustitución por
aminoácidos no óptimos puede equilibrar los procesos competitivos
de la procoagulación (factor X, IX, VII, y protrombina) y la
anticoagulación (proteína C, S). Aunque las afinidades por la
membrana de las proteínas nativas pueden ser óptimas para estados
normales, la intensificación de la afinidad por la membrana puede
producir proteínas que son útiles para el estudio in vitro y
también como agentes terapéuticos mejorados para regular la
coagulación de la sangre en condiciones patológicas in
vivo.
Más abajo se describen diversos ejemplos de
polipéptidos dependientes de vitamina K con el dominio GLA
modificado.
\newpage
El polipéptido dependiente de vitamina K es la
forma activa del factor VII, el factor VIIa. El polipéptido del
factor VII nativo o de origen natural tiene una baja afinidad por
las membranas. Las secuencias de aminoácidos de los dominios GLA
del factor VII humano de tipo salvaje (hVII, SEQ ID NO: 3) y bovino
(bVII, SEQ ID NO: 4) se muestran en la Tabla 2
El dominio GLA del factor VIIa contiene una
inserción de aminoácido en la posición 4 (p. ej. un resto tirosina
o glicina).
El dominio GLA del factor VIIa también puede
contener una sustitución, por ejemplo en el aminoácido 11, 29, 33,
34, 35, o 36, y sus combinaciones. El dominio GLA modificado del
factor VIIa puede incluir, por ejemplo, un resto ácido glutámico,
una glutamina, una asparagina, o un ácido aspártico en el aminoácido
11, un resto fenilalanina o ácido glutámico en el aminoácido 29, o
un resto ácido aspártico o ácido glutámico en los aminoácidos 33 o
35. También pueden estar sustituidos en estas posiciones otros
restos neutros. El dominio GLA modificado puede incluir restos
hidrófobos en una o más de las posiciones 34, 35, y 36. El dominio
GLA modificado puede incluir combinaciones de tales sustituciones
en los restos aminoácido 11 y 29, 11 y 33, 11 y 35, 11, 33, y 35,
11, 29, y 33, 11, 29, 33, y 35, 29 y 33, 29 y 35, o 29, 33, y 35.
Por ejemplo, el dominio GLA modificado del factor VIIa puede
incluir un resto glutamina en el aminoácido 11 y un resto ácido
glutámico en el aminoácido 33, o un resto glutamina en el
aminoácido 11 y un resto fenilalanina en el aminoácido 29. El
dominio GLA modificado también puede incluir una sustitución en el
aminoácido 34 combinado con una o más sustituciones descritas antes
en las posiciones 11, 29, 33, y 35. Por ejemplo, un resto
fenilalanina u otro resto hidrófobo tal como leucina o isoleucina
puede ser sustituido en los aminoácidos 34, 35, y/o 36. El factor
VII que contiene una inserción de un resto tirosina en la posición
4 combinada con una glutamina en 11, un ácido glutámico en 33, y
una fenilalanina en 34 da como resultado una actividad 160 veces
mayor que la del factor VIIa de tipo salvaje.
El factor VIIa modificado de estas maneras tiene
una afinidad mucho mayor por las membranas que el polipéptido
nativo o de tipo salvaje. El factor VIIa también tiene una actividad
mucho mayor en la autoactivación, en la generación de factor Xa y
en diversos análisis de coagulación de la sangre. La actividad
resulta particularmente intensificada en condiciones de coagulación
marginales, tales como bajos niveles de factor tisular y/o
fosfolípidos. Por ejemplo el factor VII modificado es
aproximadamente 4 veces más eficaz que el VIIa nativo a niveles de
tromboplastina óptimos, pero es aproximadamente 20 veces más eficaz
a un 1% de niveles de tromboplastina óptimos. Las señales de
procoagulación marginales son probablemente muy predominantes in
vivo. Los análisis de coagulación disponibles en la actualidad
que utilizan niveles óptimos de tromboplastina no pueden detectar
las diferencias en los tiempos de coagulación entre el plasma normal
y aquellos de pacientes con hemofilia. Las diferencias en la
coagulación entre semejantes muestras solamente son detectadas
cuando se utilizan en los análisis de coagulación niveles no
óptimos de tromboplastina o tromboplastina diluida.
Otro ejemplo de polipéptido dependiente de
vitamina K es el Factor VIIa con el sitio activo modificado. El
sitio activo del factor VIIa puede ser modificado químicamente, por
ejemplo mediante DEGR, FFR, o mediante mutagénesis dirigida al
sitio del sitio activo. El factor VII modificado con DEGR es un
inhibidor eficaz de la coagulación mediante diversas rutas de
administración. Arnljots et al., 1997, J. Vasc. Surg.,
25:341-346. Las modificaciones del dominio GLA
pueden volver más eficaz el Factor VIIa con el sitio activo
modificado. Las sustituciones o inserciones adecuadas se han
descrito antes.
Los polipéptidos dependientes de vitamina K de
la invención también pueden incluir un sitio de escisión inactivado
de manera que los polipéptidos no son convertidos en una forma
activa. En general, se encuentra un resto arginina en el sitio de
escisión de los polipéptidos dependientes de vitamina K. Cualquier
resto puede ser sustituido por la arginina en esta posición para
inactivar el sitio de escisión. Los polipéptidos dependientes de
vitamina K de la invención que contienen adicionalmente un sitio de
escisión inactivado actúan como inhibidores.
En otro aspecto, la invención ofrece una célula
anfitriona de mamífero que incluye un polipéptido dependiente de
vitamina K que tiene un dominio GLA modificado que intensifica la
afinidad de unión a la membrana del polipéptido con respecto al
correspondiente polipéptido dependiente de vitamina K nativo. La
actividad de los polipéptidos dependientes de vitamina K es
intensificada. Los polipéptidos dependientes de vitamina K adecuados
y las modificaciones del dominio GLA se comentan más arriba. La
célula anfitriona de mamífero incluye, por ejemplo, el factor VIIa
modificado. El dominio GLA del factor VIIa modificado puede contener
una sustitución de aminoácido en el aminoácido 11 y en el
aminoácido 33. Preferiblemente, la sustitución de aminoácido incluye
un resto glutamina en el aminoácido 11 y un resto ácido glutámico
en el aminoácido 33 del factor VIIa. Las células anfitrionas de
mamífero adecuadas pueden modificar los restos glutamato del
polipéptido dependiente de vitamina K a
\gamma-carboxiglutamato. Las células de mamífero
derivadas de riñón e hígado son especialmente útiles como células
anfitrionas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las moléculas de ácido nucleico aisladas que
codifican los polipéptidos dependientes de vitamina K modificados
de la invención pueden ser producidas mediante mecanismos
convencionales. Según se utiliza en la presente memoria,
"aislado" hace referencia a una secuencia correspondiente a
parte o todas las secuencias del gen que codifican un polipéptido
dependiente de vitamina K modificado, pero libre de secuencias que
normalmente flanquean uno o ambos lados del gen de tipo salvaje en
un genoma de mamífero. Un polinucleótido aislado puede ser, por
ejemplo, una molécula de ADN recombinante, siempre que una de las
secuencias de ácido nucleico encontradas normalmente flanqueando
inmediatamente esa molécula de ADN recombinante en un genoma de
origen natural sea separada o esté ausente. De este modo, los
polinucleótidos aislados incluyen, sin limitación, un ADN que existe
como molécula separada (p. ej., un fragmento de ADNc o ADN genómico
producido mediante PCR o tratamiento con endonucleasa de
restricción) independiente de otras secuencias así como ADN
recombinante que es incorporado a un vector, un plásmido
autónomamente replicante, un virus (p. ej., un retrovirus,
adenovirus, o herpesvirus), o en el ADN genómico de un procariota o
un eucariota. Además, un polinucleótido aislado puede incluir una
molécula de ADN recombinante que es parte de un polinucleótido
híbrido o de fusión.
Resultará evidente para los expertos en la
técnica que un polinucleótido que existe entre miles a millones de
otros polinucleótidos, por ejemplo, de genotecas de ADNc o
genómicas, o porciones de gel que contienen un producto digerido
con enzimas de restricción de ADN genómico, no es considerado un
polinucleótido aislado.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas tienen
al menos aproximadamente 14 nucleótidos de longitud. Por ejemplo,
la molécula de ácido nucleico puede tener aproximadamente de 14 a
20, 20-50, 50-100, o más de 150
nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, las moléculas de
ácido nucleico aisladas codifican un polipéptido dependiente de
vitamina K modificado completo. Las moléculas de ácido nucleico
pueden ser ADN o ARN, lineal o circular, y en orientación efectora
o antisentido.
Se pueden introducir cambios puntuales
específicos en las secuencias del ácido nucleico que codifican los
polipéptidos dependientes de vitamina K de tipo salvaje, por
ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al oligonucleótido. En este
método, el cambio deseado es incorporado en un oligonucleótido, que
después es hibridado con el ácido nucleico de tipo salvaje. El
oligonucleótido es prolongado con una ADN polimerasa, creando un
heterodúplex que contiene un emparejamiento erróneo en el cambio
puntual introducido, y una muesca monocatenaria en el extremo 5',
que es sellada por una ADN ligasa. El emparejamiento erróneo es
reparado tras la transformación de E. coli u otro organismo
apropiado, y el gen que codifica el polipéptido dependiente de
vitamina K modificado puede ser aislado de nuevo de E. coli
u otro organismo apropiado. Los kits para introducir mutaciones
dirigidas al sitio pueden ser adquiridos comercialmente. Por
ejemplo, los kits de mutagénesis in vitro
Muta-Gene7 pueden ser adquiridos de
Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, Calif.).
Las técnicas de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) también pueden ser utilizadas para introducir
mutaciones. Véase, por ejemplo, Vallette et al., 1989,
Nucleic Acids Res., 17(2):723-733. La PCR
hace referencia aun procedimiento o técnica en la que los ácidos
nucleicos diana son amplificados. Típicamente se emplea la
información de la secuencia de los extremos de la región de interés
o más allá para diseñar cebadores oligonucleotídicos que tienen una
secuencia idéntica a las hebras opuestas del molde que se va a
amplificar, mientras para la introducción de mutaciones, se
utilizan los oligonucleótidos que incorporan el cambio deseado para
amplificar la secuencia de ácido nucleico de interés. Se puede
utilizar la PCR para amplificar secuencias específicas a partir de
ADN así como de ARN, incluyendo secuencias de ADN genómico total o
ARN celular total. Los cebadores tienen típicamente de 14 a 40
nucleótidos de longitud, pero pueden oscilar de 10 nucleótidos a
cientos de nucleótidos de longitud. Las técnicas de PCR generales
se describen, por ejemplo en PCR Primer: A Laboratory Manual, ed.
por Dieffenbach y Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
995.
Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos
dependientes de vitamina K modificados también pueden ser
producidos mediante síntesis química, ya sea en forma de una única
molécula de ácido nucleico o en forma de una serie de
oligonucleótidos. Por ejemplo, se pueden sintetizar uno o más pares
de oligonucleótidos largos (p. ej., >100 nucleótidos) que
contengan la secuencia deseada, conteniendo cada par un segmento
corto de complementariedad (p. ej., aproximadamente 15 nucleótidos)
de manera que se forme un dúplex cuando el par de oligonucleótidos
sea hibridado. Se utiliza ADN polimerasa para prolongar los
oligonucleótidos, dando como resultado una molécula de ácido
nucleico de doble hebra por par de oligonucleótidos, que después
puede ser ligada en un
vector.
vector.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos dependientes de vitamina K
modificados de la invención pueden ser producidos ligando una
secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido en un
constructo de ácido nucleico tal como un vector de expresión, y
transformando una célula bacteriana o eucariótica con el vector de
expresión. En general, los constructos de ácido nucleico incluyen
una secuencia reguladora conectada operablemente a una secuencia de
ácido nucleico que codifica un polipéptido dependiente de vitamina
K. Las secuencias reguladoras no codifican típicamente un producto
génico, sino que en lugar de eso afectan a la expresión de la
secuencia de ácido nucleico. Según se utiliza en la presente
memoria, "conectado operablemente" hace referencia a la
conexión de las secuencias reguladoras con la secuencia de ácido
nucleico de tal manera que permita la expresión de la secuencia de
ácido nucleico. Los elementos reguladores pueden incluir, por
ejemplo, secuencias promotoras, secuencias intensificadoras,
elementos de respuesta, o elementos inducibles.
En los sistemas bacterianos, se puede utilizar
una cepa de E. coli tal como BL-21. Los
vectores de E. coli adecuados incluyen, sin limitación, la
serie de vectores pGEX que producen proteínas de fusión con
glutation S-transferasa (GST). Las E. coli
transformadas se hacen crecer exponencialmente, después se estimulan
con isopropiltiogalactopiranosido (IPTG) antes de cosecharlas. En
general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser
purificadas fácilmente a partir de células lisadas mediante
adsorción a cuentas de glutation-agarosa seguido de
elución en presencia de glutation libre. Los vectores pGEX se
diseñan para incluir sitio de escisión de la proteasa trombina o
factor Xa de manera que el producto génico diana clonado pueda ser
liberado del radical GST.
En células anfitrionas eucarióticas, se pueden
utilizar numerosos sistemas de expresión basados en virus para
expresar polipéptidos dependientes de vitamina K modificados. Se
puede clonar un ácido nucleico que codifica un polipéptido
dependiente de vitamina K, por ejemplo, en un vector baculoviral tal
como pBlueBac (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y después utilizarlo
para co-transfectar células de insecto tales como
células de Spodoptera frugiperda (Sf9) con ADN de tipo
salvaje de virus de la polihedrosis nuclear de envoltura múltiple de
Autographa californica (AcMNPV). Los virus recombinantes que
producen los polipéptidos dependientes de vitamina K modificados
pueden ser identificados mediante metodología convencional.
Alternativamente, se puede introducir un ácido nucleico que
codifica un polipéptido dependiente de vitamina K en un vector de
SV40, retroviral, o viral basado en vaccinia y utilizarlo para
infectar células anfitrionas adecuadas.
Las líneas celulares de mamífero que expresan
establemente los polipéptidos dependientes de vitamina K modificados
pueden ser producidas utilizando vectores de expresión con los
elementos de control apropiados y un marcador seleccionable. Por
ejemplo, el vector de expresión eucariótico pcDNA.3.1+ (Invitrogen)
es adecuado para la expresión de polipéptidos dependientes de
vitamina K modificados, por ejemplo, en células COS, células HEK293,
células de riñón de cría de hámster. Tras la introducción del
vector de expresión mediante electroporación, transfección mediada
por DEAE dextrano, fosfato de calcio, liposomas, u otro método
adecuado, se pueden seleccionar líneas celulares estables.
Alternativamente, se utilizan líneas celulares transfectadas
transitoriamente para producir polipéptidos dependientes de
vitamina K modificados. Los polipéptidos dependientes de vitamina K
modificados también pueden ser transcritos y traducidos in
vitro utilizando extracto de germen de trigo o producto lisado
de reticulocitos de
conejo.
conejo.
Los polipéptidos dependientes de vitamina K
modificados pueden ser purificados a partir de medio celular
aplicando el medio a una columna de inmunoafinidad. Por ejemplo, se
puede utilizar un anticuerpo que tenga afinidad de unión específica
por el Factor VII para purificar el Factor VII modificado.
Alternativamente, se puede utilizar cromatografía con concanavalina
A (Con A) y cromatografía de intercambio aniónico (p. ej., DEAE)
junto con cromatografía de afinidad para purificar el factor VII.
Los anticuerpos monoclonales dependientes o independientes de
calcio que tienen afinidad de unión específica por el factor VII
pueden ser utilizados en la purificación del Factor
VII.
VII.
Los polipéptidos dependientes de vitamina K
modificados también pueden ser sintetizados químicamente utilizando
técnicas convencionales. Véase, Muir y Kent, 1993, Curr. Opin.
Biotechnol., 4(4):420-427, para una revisión
de las técnicas de síntesis de proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también ofrece una composición
farmacéutica que incluye un portador farmacéuticamente aceptable y
una cantidad de polipéptido dependiente de vitamina K de acuerdo con
la invención. El polipéptido del factor VIIa dependiente de
vitamina K incluye un dominio GLA modificado con al menos una
inserción de aminoácido en la posición 4 que intensifica la
afinidad de unión a la membrana del polipéptido con respecto al
correspondiente polipéptido dependiente de vitamina K nativo.
También se puede intensificar la actividad del polipéptido
dependiente de vitamina K. Las composiciones farmacéuticas también
pueden incluir un factor tisular soluble.
La concentración de polipéptido dependiente de
vitamina K eficaz para inhibir la formación de coágulos en un
mamífero puede variar, dependiendo de numerosos factores, incluyendo
la dosificación preferida del compuesto que se va a administrar,
las características químicas de los compuestos empleados, la
formulación de los excipientes del compuesto y la ruta de
administración. La dosificación óptima de la composición
farmacéutica que se va a administrar también puede depender de
variables tales como el estado general de salud del paciente
concreto y la eficacia biológica relativa del compuesto
seleccionado. Estas composiciones farmacéuticas se pueden utilizar
para regular la coagulación in vivo. Por ejemplo, las
composiciones se pueden utilizar generalmente para el tratamiento
de la trombosis. La alteración de sólo unos pocos restos aminoácido
del polipéptido como se ha descrito antes, generalmente no afecta
significativamente a la antigenicidad de los polipéptidos
mutantes.
Los polipéptidos dependientes de vitamina K que
incluyen dominios GLA modificados pueden ser formulados en
composiciones farmacéuticas mediante combinación con excipientes o
portadores no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Tales
compuestos y composiciones pueden ser preparados para la
administración parenteral, concretamente en forma de soluciones o
suspensiones líquidas en soluciones acuosas de tampones
fisiológicos; para la administración oral, concretamente en forma
de comprimidos o cápsulas; o para la administración intranasal,
concretamente en forma de polvos, gotas nasales, o aerosoles. Las
composiciones para otras rutas de administración se pueden preparar
según se desee utilizando métodos convencionales.
Las formulaciones para la administración
parenteral pueden contener como excipientes comunes agua o solución
salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de
origen vegetal, naftalenos hidrogenados estériles, y similares. En
particular, el polímero de lactida biocompatible, biodegradable, el
copolímero de lactida/glicólido, o los copolímeros de
polioxietileno-polioxipropileno son ejemplos de
excipientes para controlar la liberación de un compuesto de la
invención in vivo. Otros sistemas de liberación parenteral
adecuados incluyen partículas de copolímero de
etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas,
sistemas de infusión implantables, y liposomas. Las formulaciones
para la administración por inhalación pueden contener excipientes
tales como lactosa, si se desea. Las formulaciones para inhalación
pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo,
polioxietilen-9-lauriléter,
glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones oleosas para la
administración en forma de gotas nasales. Si se desea, los
compuestos pueden ser formulados en forma de geles para ser
aplicados intranasalmente. Las formulaciones para la administración
parenteral también pueden incluir glicocolato para la
administración bucal.
Estas composiciones farmacéuticas pueden ser
útiles para el tratamiento de los trastornos de la coagulación
tales como la hemofilia A, la hemofilia B y las enfermedades del
hígado.
En una realización alternativa, la invención
también ofrece un polipéptido del factor VIIa dependiente de
vitamina K para su uso como medicamento. El polipéptido dependiente
de vitamina K incluye un dominio GLA modificado con al menos una
inserción de aminoácido en la posición 4 que intensifica la afinidad
de unión a la membrana del polipéptido con respecto al
correspondiente polipéptido dependiente de vitamina K nativo.
El dominio GLA modificado del Factor VIIa puede
incluir sustituciones en el aminoácido 11 y el aminoácido 33, por
ejemplo, un resto glutamina en el aminoácido 11 y un resto ácido
glutámico en el aminoácido 33.
El factor VII es especialmente crítico para la
coagulación de la sangre debido a su localización en el inicio de
la cascada de coagulación, y su capacidad para activar dos
proteínas, los factores IX y X. La activación directa del factor X
por el factor VIIa es importante para el posible tratamiento de las
formas principales de hemofilia, tipos A y B, puesto que las etapas
que implican a los factores IX y VIII son completamente evitadas.
Se ha encontrado que la administración de factor VII a los pacientes
es eficaz para el tratamiento de algunas formas de hemofilia. La
mejora de la afinidad por la membrana del factor VIIa mediante la
modificación del dominio GLA proporciona el potencial para volver
el polipéptido más sensible a muchas condiciones de coagulación,
para disminuir la dosificaciones de VIIa necesarias, para ampliar
los intervalos en los cuales puede ser administrado el factor VIIa,
y para proporcionar cambios cualitativos adicionales que dan como
resultado un tratamiento más eficaz. En conjunto, la mejora del
sitio de contacto con la membrana del factor VII puede aumentar su
velocidad de activación así como mejorar la actividad del factor
VIIa sobre el factor X o IX. Estas etapas pueden tener un efecto
multiplicativo sobre las velocidades de coagulación globales in
vivo, dando como resultado un factor VIIa muy potente para un
tratamiento superior de numerosos trastornos de la coagulación de la
sangre.
En otro aspecto, la invención también incluye el
polipéptido de la invención para su uso en el incremento de la
formación de coágulos en un mamífero que incluye administrar una
cantidad de polipéptido dependiente de vitamina K eficaz para
incrementar la formación de coágulos en el mamífero. El factor VIIa
dependiente de vitamina K incluye un dominio GLA modificado que
intensifica la afinidad de unión a la membrana del polipéptido con
respecto al correspondiente polipéptido dependiente de vitamina K
nativo. El dominio GLA modificado incluye al menos una inserción de
aminoácido en el aminoácido 4 y puede incluir al menos una
sustitución de aminoácidos.
En otro aspecto, la invención incluye el uso de
un polipéptido de la invención para la fabricación de un medicamento
pre-coagulante para el tratamiento de trastornos de
la coagulación.
La invención se describirá adicionalmente en los
siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Factor VII con Afinidad por la Membrana y
Actividad Mejoradas: Se ha descubierto que la afinidad de unión
a la membrana del factor VII de coagulación humano puede ser
incrementada mediante mutagénesis dirigida al sitio. Se han
caracterizado las propiedades de un mutante P11Q, K33E (referido en
la presente memoria como Factor VIIQ11E33 o factor VII mutante). La
afinidad por la membrana aumentó sobre la de la proteína de tipo
salvaje aproximadamente 20 veces. La autoactivation por el mutante
aumentó al menos 100 veces por encima de la del factor VII de tipo
salvaje. La forma activada de VIIQ11E33 (referida como VIIaQ11E33)
presentó una actividad hacia el factor X aproximadamente 10 veces
superior. La actividad de coagulación de VIIaQ11E33 con el factor
tisular soluble en plasma normal fue aproximadamente 10 veces
superior que la de VIIa de tipo salvaje. La actividad de
coagulación del zimógeno, VIIQ11E33, con el factor tisular normal
(suministrado en forma de una dilución 1:100 de
tromboplastina-HS), fue 20 veces superior que la del
Factor VII de tipo salvaje. El grado al cual se intensificó la
actividad dependió de las condiciones, siendo especialmente activo
VIIQ11E33 en las condiciones de estímulos de coagulación bajos.
En general, las concentraciones de proteína
fueron determinadas mediante el análisis de Bradford utilizando
albúmina de suero bovino como patrón. Bradford, 1976, Analyt.
Biochem. 248-254. Las concentraciones molares se
obtuvieron a partir de pesos moleculares de 50.000 para el factor
VII y 55.000 para el factor X. A menos que se indique, todas las
medidas de actividad se realizaron en tampón convencional (Tris 0,05
M, pH 7,5, NaCl 100 mM).
Producción de Factor VII Mutante: El
factor VII mutante se generó a partir de ADNc de factor VII de tipo
salvaje (Número de Acceso GenBank M13232, NID g182799). Petersen
et al., 1990, Biochemistry 29:3451-3457. Se
introdujeron la mutación P11Q (cambio del aminoácido 11 de un resto
prolina a un resto glutamina) y la mutación K33E (cambio del
aminoácido 33 de un resto lisina a un resto ácido glutámico) en el
ADNc del factor VII de tipo salvaje mediante una estrategia de
reacción en cadena de la polimerasa esencialmente como describen
Vallette et al., 1989, Nucleic Acids Res.
17:723-733. Durante este procedimiento, se eliminó
un sitio para la enzima de restricción XmaII para el diagnóstico de
la mutación. Se diseñaron cuatro cebadores de PCR para cebar la
síntesis de dos fragmentos mutantes de M13232, uno de MluI a BglII,
posiciones 221 a 301, y el otro de BglII a SstII, posiciones 302 a
787. Estos cebadores se utilizaron en condiciones de ciclos de PCR
convencionales (GENEAMP, Perkin Elmer) para cebar la síntesis de
fragmentos utilizando 1 ng del ADNc del factor VII de tipo salvaje
como molde. Los fragmentos resultantes se purificaron en gel y se
digirieron con MluI y BglII o BglII y SstII. Los dos fragmentos
purificados se ligaron después en el ADNc del factor VII en el
vector de expresión Zem219b del cual se había separado la
correspondiente secuencia de tipo salvaje en forma de un fragmento
MluI-SstII. Petersen et al., 1990
supra. Los fragmentos mutados se secuenciaron en su totalidad
para confirmar las sustituciones P11Q y K33E, así como para
eliminar la posibilidad de otros cambios de secuencia inducidos por
la PCR.
Transfección, Selección y Purificación:
Se hicieron crecer células de riñón de cría de hámster (BHK) en
medio de Eagle modificado por Dulbecco con un suplemento de suero
de ternera fetal al 10% y penicilina-estreptomicina.
Las células subconfluentes se transfectaron con el plásmido de
expresión del factor VII utilizando lipofectAMINE (Gibco BRL) de
acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Dos días después de
la transfección, las células se tripsinizaron y se diluyeron en un
medio selectivo que contenía metotrexato 1 \muM (MTX). Las células
BHK transfectadas establemente se cultivaron con posterioridad en
medio de Eagle modificado por Dulbecco sin suero con un suplemento
de penicilina-estreptomicina, 5 \mug/mL de
vitamina K_{1} y metotrexato 1 \muM, y el medio acondicionado
se recogió. El medio acondicionado se aplicó dos veces a una columna
de inmunoafinidad compuesta por anticuerpo monoclonal dependiente
de calcio (CaFVII22) acoplado a Affi-Gel 10.
Nakagaki et al., 1991, Biochemistry,
30:10819-10824. El Factor VIIQ11E33 purificado final
corrió en forma de una única banda en la electroforesis en gel de
poliacrilamida SDS, sin evidencia de factor VIIa en la preparación.
El mutante VII(P11Q,K33E) puro mostró
1.400-2.800 unidades de factor VII/mg.
Activación del Factor VII: Se formó
Factor VIIaQ11E33 Activado mediante escisión con factor Xa bovino de
VIIQ11E33 (razón en peso 1:100, incubación durante 1 hora a 37ºC).
Alternativamente, se obtuvo Factor VIIaQ11E33 mediante
autoactivación (37ºC, 20 minutos) en una mezcla que contenía
VIIQ11E33 7 \muM, sTF 0,7 \muM y fosfolípido
(fosfatidilserina/fosfatidilcolina (PS/PC), 25/75, 0,1 g/g de
proteína).
El factor VIIa de tipo salvaje era una proteína
recombinante, homogénea (NOVO Nordisk). Las dos preparaciones
consistían en un producto liofilizado y un producto no liofilizado
comercial. La última proteína se purificó adicionalmente sobre FPLC
mono-Q y demostró una actividad específica de 80.000
unidades/mg, calibrado con un patrón George King NPP.
Interacción intensificada con la membrana por
el Factor VIIQ11E33: La preparación de fosfolípidos, el
análisis, y la medida de la unión proteína-membrana
se realizaron mediante los métodos descritos por Nelsestuen y Lim,
1977, Biochemistry 16:4164-44170. Se prepararon
vesículas unilamelares grandes (LUV) y vesículas unilamelares
pequeñas (SUV) mediante los métodos descritos previamente. Hope
et al., Biochem. Biothys. Acta., 812:55-65;
y Huang, 1969, Biochemistry 8:344-352. Se mezclaron
en cloroformo fosfatidilserina altamente pura (cerebro bovino) y
fosfatidilcolina de huevo (Sigma Chemical Co.). El disolvente se
separó mediante una corriente de gas nitrógeno. Los fosfolípidos
secos se suspendieron en tampón. Las SUV se formaron mediante
sonicación y filtración en gel mientras las LUV se formaron
mediante congelación-descongelación y extrusión. Las
concentraciones de fosfolípidos se determinaron mediante análisis
de fosfato orgánico suponiendo una razón en peso
fosforoso:fosfolípido de 25.
Se prepararon SUV de PS/PC (25/75) o PS/PC
(10/90). Se añadió la proteína al fosfolípido a las razones en peso
mostradas en la Figura 1. La unión proteína-membrana
se analizó mediante dispersión de luz a 90º mediante el método de
Nelsestuen y Lim, 1977, supra. En resumen, se midieron la
intensidad de la dispersión de luz de las vesículas de fosfolípido
solas (I_{1}) y después de la adición de proteína (I_{2}) y se
corrigieron para el fondo de tampón y proteína no unida. La razón
de peso molecular del complejo proteína-vesícula
(M_{2}) con respecto al de las vesículas solas (M_{1}), puede
ser estimada a partir de la relación de la ecuación 1, donde
\deltan/\deltac es el índice de refracción de las respectivas
especies.
(ec.
1)I_{2}/I_{1} = (M_{2}/M_{1})^{2}(\delta n/\delta
c_{2}/\delta n/\delta
c_{1})^{2}
\newpage
Si se conocen las concentraciones de fosfolípido
y proteína, se puede estimar la concentración de [P*PL] unida y
proteína [P] libre. Estos valores, junto con la capacidad de unión
máxima a la proteína [P*PL_{max}] de las vesículas (que se supone
que es de 1,0 g/g para todas las proteínas) se pueden utilizar para
obtener la constante de equilibrio para la interacción
proteína-membrana por medio de la relación de la
ecuación 2, donde todas las concentraciones se expresan en forma de
moles de proteína o sitios de unión a la proteína.
(ec. 2)K_{D} =
[P][P*PL_{max}-P*PL]/[P*PL]
La unión se evaluó en calcio 5 mM y se expresa
como la razón, M2/M1.
La Figura 1 muestra la unión de VIIa de tipo
salvaje (círculos vacíos) y del factor VIIQ11E33 (círculos rellenos)
a las membranas de PS/PC=25/75, 25 \mug/ml (Figura 1A) o
PS/PC=10/90, 25 \mug/ml (Figura 1B). VIIQ11E33 tenía una afinidad
mucho mayor que la proteína de tipo salvaje. La unión a PS/PC
(25/75) fue a nivel cuantitativo de manera que la
[Proteína_{libre}] era esencialmente cero. Por consiguiente, los
valores de Kd no pudieron ser estimados a partir de estos datos. La
unión a la membrana del factor X bovino (triángulos rellenos) se
muestra en la Figura 1 como referencia. El factor X bovino es una de
las proteínas de más alta afinidad de esta familia, dando una Kd
para PS/PC (20/80) en calcio 2 mM de 40 nM. McDonald et al.,
1997, Biochemistry. 36:5120-5127. La Kd para el
factor X bovino, obtenida a partir del resultado a una razón de
proteína/fosfolípido de 0,55 (Figura 1), fue de 0,025 \muM.
También se determinó la unión del Factor VII de
tipo salvaje y mutante a membranas de PS/PC (10/90) (Figura 1B). El
VIIQ11E33 se unía a un nivel menor del cuantitativo, lo que permitió
estimar una unión constante a partir de la relación de la ecuación
3.
(ec. 3)Kd =
[\text{Proteína}_{libre}][Sitios\ de\
unión_{libres}]/[\text{Proteína}_{unida}]
Los [sitios de unión_{libres}] se estimaron a
partir de la ecuación 4, suponiendo un M2/M1 máximo de 1,0 (esto
es, [Sitios de unión_{totales}]=[Fosfolípido_{conc.\ en\
peso}/Proteína_{PM}]). Este es un valor común observado para
diversas proteínas de esta familia. Véase McDonald et al.,
1997, supra.
(ec.
4)[Sitios\ de\ unión_{libres}]=[Sitios\ de\
unión_{totales}]-[\text{Proteína}_{unida}]
Utilizando estas suposiciones y los datos a una
razón de proteína con respecto a fosfolípido de 0,37, los valores
de la Kd fueron 0,7 \muM para el factor X bovino, 5,5 \muM para
el factor VII de tipo salvaje y 0,23 \muM para VIIQ11E33. De este
modo, estaba claro que el factor VIIQ11E33 tenía una afinidad de
unión a la membrana enormemente mejorada sobre el factor VII de
tipo salvaje y tenía una de las mayores afinidades de unión a la
membrana entre las proteínas dependientes de vitamina K.
También se ha observado que la diferencia entre
VIIa de tipo salvaje y VIIa-Q11E33 variaba algo con
la composición de las vesículas de fosfolípido que se habían
utilizado. Por ejemplo, las membranas que contenían PS/PE/PC
(20/40/40) producían una actividad 33 veces mayor para VIIaQ11E33,
mientras ciertas preparaciones de PS/PC (20/80 a 25/75) mostraban
una actividad 10 a 19 veces mayor para VIIaQ11E33.
Activación intensificada del factor
VIIQ11E33: La primera etapa de la coagulación implica la
activación del factor VII. La autoactivación de VII se realizó en
una solución que contenía sTF 100 nM (producto recombinante
altamente purificado del Dr. Walter Kisiel, Fiore et al.,
1994, J. Biol. Chem. 269:143-149), VIIQ11E33 36 nM
y PS/PC (25/75, 22 \mug/mL). La actividad de VIIaQ11E33 se estimó
a diversos intervalos de tiempo mediante la adición de sustrato
S-2288 de 0,15 mm (Kabi) y evaluación de la
velocidad de liberación de fosfato de p-nitrofenilo
producto mediante cambio de absorbancia a 405 nm. La actividad
inicial de la preparación VIIQ11E33 fue un 4% menor que la del
VIIaQ11E33 completamente activo.
Se encontró que VIIQ11E33 era un sustrato mucho
mejor para la activación que el factor VII de tipo salvaje. La
Figura 2 muestra la autoactivación del factor VIIQ11E33. Los datos
fueron analizados mediante la relación de la ecuación 5 (ecuación 7
de Fiore et al., 1994, supra).
(ec.
5)In[VIIa]_{t} = In\
[VIIa]_{0}+kcat*y*t
In[VIIa]_{t} es la concentración
de factor VIIa a tiempo t, kcat es la constante de velocidad
catalítica para el factor VIIa que actúa sobre VII e y es la
saturación fraccionada de los sitios de VIIa. Para el factor VIIa
de tipo salvaje, esta relación y sTF 1 \muM dieron una kcat de
0,0045/s y una razón kcat/Km de 7*10^{3} M^{-1}s^{-1}. Véase,
Fiore et al., 1994, supra. Para la enzima VIIQ11E33,
la autoactivación fue rápida (Figura 2) y solamente fue posible
estimar un límite inferior para kcat. Este se obtuvo a partir de un
tiempo de duplicación de VIIa de aproximadamente 25 segundos
(kcat=(In 2)/t_{1/2}). El valor resultante (kcat_{min} =
0,03/s), junto con la concentración de sustrato de esta reacción
(3,6*10^{-8} M) y la suposición de que y=1,0, dieron un valor
para kcat/[S]=8*10^{5} M^{-1}s^{-1}. Esto debe estar bastante
por debajo de la verdadera kcat/Km para VIIaQ11E33, pero era
aproximadamente 100 veces mayor que el valor de kcat/Km para el
factor VIIa de tipo salvaje/sTF estimado por Fiore et al,
1994, supra. De este modo, la combinación de la enzima
VIIaQ11E33 y el Factor VIIQ11E33 sustrato fue superior a las
proteínas de tipo salvaje en la etapa de activación de la
coagulación. Esto sugirió que VIIQ11E33 era superior a la enzima de
tipo salvaje cuando las condiciones de coagulación eran
mínimas.
Actividad intensificada de VIIaQ11E33:
Una vez generado, el factor VIIa activa el factor X o el factor IX.
La activación de factor X bovino (0,1 \muM) por el factor VIIa se
llevó a cabo en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 que
contenía NaCl 100 mM, calcio 5 mM, diversas cantidades de
fosfolípido (PS/PC, 25/75) y 1 mg/mL de albúmina de suero bovino
22,5ºC. El factor VIIa (0,06 nM de VIIaQ11E33 o 0,6 nM de VIIa de
tipo salvaje) se añadió a tiempo cero y se determinó la actividad
de Xa en los puntos de tiempo de 1, 3 y 5 minutos. Las alícuotas de
la mezcla de reacción (0,2 mL) se mezclaron con tampón (0,2 mL) que
contenía EDTA 10 mM y S-2222 (Kabi) 0,4 mM, un
sustrato cromogénico para el factor Xa. El cambio de absorbancia a
405 nm se determinó en un espectrofotómetro Beckman DU8. La
cantidad de factor Xa generado se calculó a partir del coeficiente
de extinción (1*10^{4}M^{-1}cm^{-1}) del producto de reacción
de fosfato de p-nitrofenilo y una velocidad de
33/seg para la hidrólisis del sustrato por Xa bovino purificado en
las condiciones de este análisis.
La Figura 3 compara la capacidad del factor VIIa
de tipo salvaje (círculos vacíos) y VIIaQ11E33 (círculos rellenos)
para activar el factor X en un sistema purificado. De nuevo,
VIIaQ11E33 fue bastante superior al factor VIIa de tipo salvaje en
esta reacción. La diferencia fue máxima a bajas concentraciones de
fosfolípidos y disminuyó al doble a 200 \mug de fosfolípido por
mL. Esto se esperaba a partir del hecho de que las concentraciones
de membrana elevadas hacen que una porción más grande de VIIa de
tipo salvaje se una a la membrana. Una vez más, el incremento de la
función de VIIaQ11E33 fue máxima en condiciones de baja exposición a
fosfolípidos.
Asimismo se determinó la capacidad del factor
VIIa para activar el factor X sobre las superficies de plaquetas
activadas. Las plaquetas se aislaron mediante técnicas
convencionales que consistían en la centrifugación sobre un colchón
de albúmina de suero bovino y filtración en gel para obtener
plaquetas monoméricas. Las plaquetas se activaron con ionóforo de
calcio (A23187) y se diluyeron a una concentración de 2x10^{8}/mL.
El tampón fue Tris 0,05 M, pH 7,5-NaCl 0,1 M y
contenía CaCl_{2} 5 mM. Se añadieron factor VIIa o
Q11E33-VIIa (50 nM) junto con factor X 200 nM. A
diversos intervalos de tiempo, se sofocó la reacción añadiendo EDTA
en exceso. La cantidad de factor Xa generada fue determinada
mediante su actividad hacia S-2222, un sustrato
específico del factor Xa. La cantidad de factor Xa se calculó
mediante comparación con concentraciones conocidas de factor Xa. A
los 20 minutos la reacción que contenía VIIa de tipo salvaje había
generado Xa 0,34 nM mientras la que contenía
Q11E33-VIIa había generado Xa 7,7 nM. Este análisis
es independiente del factor tisular y utiliza una membrana
biológica.
Se realizó otro análisis con membranas
biológicas con células J82. Esta línea celular expresa niveles
elevados de factor tisular sobre su superficie y a menudo se
utiliza para estudiar la unión del factor VII al factor tisular (p.
ej., Sakai, et al., 1989, J. Biol. Chem. 264,
9980-9988). Las células se hicieron crecer en forma
de monocapas mediante métodos convencionales y se liberaron de la
superficie mediante tratamiento con tripsina suave. La velocidad de
generación de factor Xa por las células en suspensión se determinó
en presencia de factor VIIa con el sitio activo modificado 2 nM
(DEGR-VIIa). El DEGR-VIIa es un
inhibidor y debe ser desplazado del factor tisular por el VIIa
activo añadido a la reacción. Esta es una reacción competitiva. La
velocidad de generación de factor Xa se utilizó como medida del
desplazamiento por VIIa de VIIa con el sitio activo modificado del
factor tisular. El Q11E33-VIIa desplazó al
DEGR-VIIa a una vigésimo octava parte de la
concentración requerida por el VIIa de tipo salvaje. Esta
superioridad fue similar a la observada en muchos otros análisis
competitivos.
Coagulación superior de VIIaQ11E33: Los
análisis de coagulación de sangre se realizaron a 37ºC utilizando
el método de inclinación manual para detectar la formación de
coágulos. Se dejó que el plasma humano (0,1 mL) se equilibrara (0,1
mL) a 37ºC durante 1 minuto. Se añadieron diversos reactivos en un
volumen de 0,1 mL de tampón convencional. Se añadieron factor
tisular soluble (50 nM) y fosfolípido (PS/PC, 10/90, 75 \mug/mL)
al plasma, junto con la concentración de factor VIIa mostrada en la
Figura 4 (0,1-32 nM). Finalmente, se añadieron 0,1
mL de CaCl_{2} 25 mM para iniciar la reacción. Se midió el tiempo
hasta la formación de los coágulos. En la mayoría de los casos, se
informó de la media y las desviaciones típicas de muestras
replicadas.
La Figura 4 muestra los tiempos de coagulación
de VIIa de tipo salvaje frente a VIIaQ11E33 en plasma humano
normal. La coagulación estuvo apoyada por sTF y se añadieron
vesículas de fosfolípidos. El factor VII de tipo salvaje endógeno
tenía una concentración aproximadamente 10 nM, y no tenía
virtualmente impacto sobre los tiempos de coagulación. La
coagulación de fondo fue de 120 segundos, con o sin sTF. El factor
VIIaQ11E33 mostró una actividad aproximadamente 8 veces mayor que
el VIIa de tipo salvaje en estas condiciones de análisis. Se
obtuvieron resultados similares con plasma deficiente en factor
VIII, sugiriendo que la ruta principal para la coagulación
sanguínea en este sistema implicaba la activación directa del factor
X por el factor VIIa. En resumen, el factor VIIaQ11E33 era superior
al VIIa de tipo salvaje en cuanto a actividad procoagulante
soportada por vesículas de membrana y factor tisular soluble. El
zimógeno de tipo salvaje no tenía virtualmente actividad en estas
condiciones, como indicaron tiempos de coagulación de fondo
similares de 2 minutos, se añadiera o no sTF.
Actividad procoagulante con factor tisular
normal: La coagulación apoyada por factor tisular normal fue
analizada con tromboplastina de cerebro de conejo
convencional-HS (HS=alta sensibilidad) que contenía
calcio (Sigma Chemical Co.). Esta mezcla contiene tanto
fosfolípidos como factor tisular unido a membrana. Se diluyó
tromboplastina de cerebro de conejo-HS 1:100 en
tampón y se utilizó en el análisis de VII (añadido en forma de
plasma humano normal, que contiene factor VII 10 nM) y VIIQ11E33
(añadido en forma de proteína pura). La tromboplastina (0,2 mL) se
añadió al plasma (0,1 mL) para iniciar la reacción y se midió el
tiempo requerido para formar un coágulo de sangre. Los análisis
también se realizaron con tromboplastina completa, como describe el
fabricante.
A niveles óptimos de tromboplastina humana, el
VII de tipo salvaje mostró un nivel normal de actividad,
aproximadamente 1.500 unidades por mg. Esta es aproximadamente 25
veces menor que la actividad del factor VIIa de tipo salvaje
(80.000 unidades por mg). El VIIQ11E33 dio aproximadamente
1.500-3.000 unidades por mg en las mismas
condiciones de análisis convencionales, solamente 2 veces mayor que
el VII de tipo salvaje.
La diferencia entre VII de tipo salvaje y
VIIQ11E33 fue mucho mayor cuando las condiciones de coagulación
fueron sub-óptimas. La Figura 5 muestra los tiempos de coagulación y
las concentraciones de zimógeno en los análisis que contenían 0,01
veces el nivel de tromboplastina normal. En estas condiciones,
VIIQ11E33 fue aproximadamente 20 veces más activo que el factor VII
de tipo salvaje. De este modo, la mayor eficacia del mutante
VIIQ11E33 fue especialmente evidente cuando las condiciones de
coagulación fueron limitadas, lo que resulta relevante para muchas
situaciones in vivo.
Actividades Anticoagulantes de
DEGR-VIIaQ11E33: Se realizaron análisis de
coagulación convencionales con suero humano normal y tromboplastina
humana que se había diluido 1:10 con tampón. El sitio activo del
factor VIIaQ11E33 fue modificado mediante DEGR como describen
Sorenson, B. B. et al., 1997, supra. La Figura 6
muestra el tiempo de coagulación de DEGR-VIIaQ11E33
(0-4 nM) incubado con tromboplastina, en tampón
calcio, durante 15 segundos antes de la adición del plasma. Se
determinó el tiempo para formar un coágulo con el método de
inclinación manual. El tiempo de coagulación fue de aproximadamente
45 segundos con aproximadamente 1 nM de
DEGR-VIIaQ11E33. El Factor VIIaQ11E33 con el sitio
activo modificado tenía una actividad de anticoagulación
incrementada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Purificación de Factor VII: Se purificó
el Factor VII (de tipo salvaje o mutante) por medio de
Concanavalina A (Con A), DEAE, y cromatografía de afinidad. Los
medios brutos de células 293 transfectadas se incubaron con resina
con Con A (Pharmacia) durante 4 horas a 4ºC. Después la resina se
lavó con una solución que contenía Tris 50 mM, pH 7,5, benzamidina
10 mM, CaCl_{2} 1 mM, y MgCl_{2} 1 mM, y se hizo eluir el
factor VII con D-metilmanósido 0,2 M, NaCl 0,5 M en
tampón Tris 50 mM, pH 7,5. El factor VII se sometió a diálisis
frente a Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, benzamidina 10 mM, y
D-metilmanósido 25 mM durante la noche.
Después se incubó el factor VII sometido a
diálisis con resina de DEAE (Pharmacia) durante una hora y la mezcla
se cargó en una columna. La columna de DEAE se lavó con Tris 50 mM,
pH 8,0, Benzamidina 10 mM, y NaCl 50 mM, y el factor VII se hizo
eluir con un gradiente de NaCl de 50 mM a 500 mM en tampón Tris 50
mM, pH 8,0 a una velocidad de flujo de 2 mL/min. Las fracciones que
contenían actividad de factor VII se reunieron y se sometieron a
diálisis frente a Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, y CaCl_{2} 5 mM
durante la noche. El factor VII parcialmente purificado con Con A y
DEAE fue activado por medio de factor Xa bovino (razón en peso 1:10,
Enzyme Research Laboratory) a 37ºC durante una hora.
El factor VII activado fue purificado mediante
cromatografía de afinidad. Se acopló un anticuerpo monoclonal
independiente de calcio para el factor VII (Sigma) a
affigel-10 (Bio-Rad Laboratory) como
describen Broze et al., J. Clin. Invest., 1985,
76:937-946, y se incubó con la columna de afinidad
durante la noche a 4ºC. La columna se lavó con Tris 50 mM, pH 7,5,
NaCl 0,1 M, y el factor VIIa se hizo eluir con Tris 50 mM, pH 7,5,
NaSCN 3 M a una velocidad de flujo de 0,2 mL/min. Las fracciones
eluidas se diluyeron inmediatamente cinco veces en Tris 50 mM, pH
7,5, NaCl 0,1 M. Las fracciones que contenían actividad del factor
VIIa se reunieron, se concentraron, y se sometieron a diálisis
frente a Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,1 M durante la noche.
La concentración de proteína del factor VIIa se
determinó con un kit de análisis de proteínas
Bio-Rad, utilizando BSA como patrón. La pureza del
factor VIIa se analizó por medio de gel de Coomassie y Transferencia
Western en condiciones reductoras y desnaturalizantes. La actividad
proteolítica del factor VIIa se midió utilizando un sustrato
peptídico sintético Spectrozyme-FVIIa (American
Diagnostica) en presencia de tromboplastina (Sigma). El factor VIIa
purificado se almacenó en 0,1 mg/ml de BSA, NaCl 0,1 M, Tris 50 mM,
pH 7,5 a -80ºC.
La eficacia procoagulante de los mutantes del
factor VIIa se evaluó utilizando análisis de coagulación in
vitro convencionales (y sus modificaciones); específicamente, el
análisis de tiempo de protrombina (PT) y el análisis de
tromboplastina parcialmente activada (aPTT). Las diversas
concentraciones de los mutantes del Factor VIIa se evaluaron en
plasma de donantes humanos normales reunidos y en plasmas humanos
deficientes en factor de coagulación (Factor VIII, Factor IX,
Factor VII) (Sigma). Se determinaron los tiempos de coagulación a
37ºC utilizando un fibrómetro FibroSystem (BBL) con una sonda de 0,3
mL y un Analizador de la Coagulación Automatizado Sysmex
CA-6000 (Dade Behring).
Se preparó plasma pobre en plaquetas (PPP) a
partir de sangre de donantes humanos normales reunida. La sangre
(4,5 mL) se recogió de cada donante sano en tubos Vacutainer
tratados con citrato (0,5 mL de citrato de sodio tamponado al
3,2%). Se obtuvo el plasma tras una centrifugación a 2.000 g durante
diez minutos y se mantuvo sobre hielo antes de su uso. Los plasmas
deficientes en factor adquiridos se reconstituyeron de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. Todas las diluciones seriadas de
cada solución de partida de mutante de Factor VIIa se prepararon en
plasma. Todos los plasmas (con o sin mutantes del Factor VIIa) se
mantuvieron en hielo antes de su uso. En todos los casos, se midió
el tiempo para formar un coágulo. Se informó de la media y la
desviación típica de las muestras replicadas.
El análisis de tiempo de protrombina (PT) se
realizó en plasmas (con o sin diluciones seriadas de mutantes de
FVIIa añadidos) utilizando cualquiera de los siguientes reactivos de
PT: Tromboplastina C-Plus (Dade), Innovin (Dade),
Tromboplastina Con Calcio (Sigma), o Tromboplastina HS Con Calcio
(Sigma). Los análisis se realizaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Además de utilizar reactivos de PT a
la concentración de total intensidad fabricada, el análisis de PT
también se realizó utilizando diversas diluciones de reactivos de
PT. En todos los casos, se midió el tiempo para formar un coágulo.
Se informó de la media y la desviación típica de muestras
replicadas.
El análisis de tromboplastina parcial activada
(aPTT) se realizó en plasmas (con o sin diluciones seriadas de
mutantes de Factor VIIa añadidas) utilizando Actin FS (Dade) o
reactivo APTT (Sigma). La coagulación se inició utilizando
CaCl_{2} 0,025 M (Dade) para Actin FS (Dade) o CaCl_{2} 0,02M
(Sigma) para el reactivo APTT (Sigma). Los análisis se realizaron
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Además de utilizar
reactivos aPTT a la concentración de total intensidad fabricada, el
análisis de aPTT también se realizó utilizando diversas diluciones
de reactivo aPTT. En todos los casos, se midió el tiempo para formar
un coágulo. Se informó de la media y la desviación típica de
muestras replicadas.
También se realizaron análisis de coagulación a
37ºC en los que se añadieron diferentes concentraciones de
vesículas de fosfolípidos [a concentraciones variables de PS/PC o
PS/PC/PE (PE=fosfatidiletanolamina)] a plasmas (con o sin
diluciones seriadas de mutantes de FVIIa añadidos). La coagulación
se inició mediante la adición de CaCl_{2} 20 mM. Se añadieron
diversos reactivos en tampón convencional. En todos los casos, se
midió el tiempo para formar un coágulo. Se informó sobre la media y
la desviación típica de muestras replicadas.
Se evaluó la actividad de coagulación del Factor
VIIa específico en los plasmas (con o sin mutantes del Factor VIIa
añadidos) utilizando el kit STACLOT VIIa-rTF
(Diagnostica Stago), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Este kit se basa en el análisis de coagulación cuantitativa para
FVII activado (Morrissey et al., 1993, Blood,
81(3):734-744). Se determinaron los tiempos
de coagulación utilizando un fibrómetro FibroSystem (BBL) con una
sonda de 0,3 mL y un Analizador de la Coagulación Automatizado
Sysmex CA-6000 (Dade Behring).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Tiempo Circulatorio del Factor VIIQ11E33 en
Rata: Se inyectaron 36 \mug de Factor VIIQ11E33 en ratas
Sprage Dawley (325-350 g) anestesiadas (nembutol
sódico) a tiempo cero. La inyección fue a través de la vena
yugular, en la cual se había colocado una cánula. En los tiempos
mostrados en la Figura 7, se recogió sangre de la arteria carótida,
en la cual se había insertado una cánula mediante cirugía. La
cantidad de factor VIIQ11E33 en la circulación se estimó a partir
del tiempo de coagulación de plasma deficiente en factor VII
humano, al que se había añadido 1 \muL de una dilución 1:10 de
plasma de rata. Se utilizó una dilución 1:100 de tromboplastina de
cerebro de conejo-HS (Sigma Chemical Co.). Se evaluó
la coagulación mediante el método de inclinación manual del tubo
como se describe en el Ejemplo 1. Se determinó la cantidad del
factor VII en plasma antes de la inyección de VIIQ11E33 y se
sustrajo como blanco. La concentración de factor VIIQ11E33 en la
circulación se da como el log nM. Se realizó un experimento simulado
en el que un tercer animal experimentó la operación y la canulación
pero no el factor VIIQ11E33. La cantidad de actividad del factor VII
en ese animal no cambió durante el tiempo del experimento (100
minutos). Al final del experimento, los animales fueron sometidos a
eutanasia mediante un exceso de nembutol sódico.
Las ratas parecían normales a lo largo de todo
el experimento sin evidencia de coagulación. Por lo tanto, el
factor VIIQ11E33 no causaba una coagulación indiscriminada, ni
siquiera en la rata después de la cirugía. El tiempo de vida en la
circulación del VIIQ11E33 fue normal (Figura 7), aclarándose
aproximadamente el 40% de la proteína en aproximadamente 60 minutos
y con una desaparición incluso más lenta de la proteína restante.
Esta fue similar a la velocidad de aclaramiento de la protrombina
bovina de la rata. Nelsestuen y Suttie, 1971, Biochem. Biophys.
Res. Commun., 45:198-203. Esta es superior a la del
factor VIIa recombinante de tipo salvaje que dio un tiempo medio en
la circulación para los análisis funcionales de
20-45 minutos. Thomsen et al., 1993, Thromb.
Haemost., 70:458-464. Esto indicó que el factor
VIIQ11E33 no era reconocido como una proteína anormal y que no era
rápidamente destruida por la actividad de coagulación. Parecía una
proteína normal y debía tener una vida en la circulación
normalizada en el animal.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Potenciación del sitio de membrana y
actividad de la proteína C: La proteína C bovina y humana
muestran un alto grado de homología en los aminoácidos de sus
dominios GLA (44 restos amino terminales), a pesar de una afinidad
de membrana aproximadamente 10 veces superior de la proteína humana.
La proteína C bovina contiene una prolina en la posición 11
versus una histidina en la posición 11 de la proteína C
humana. Se examinó el impacto de remplazar la prolina 11 de la
proteína C humana por histidina, y el cambio inverso en la proteína
C humana. En ambos casos, la proteína que contenía la prolina 11
mostró una afinidad de membrana inferior, aproximadamente 10 veces
para la proteína C bovina y 5 veces para la proteína C humana. La
proteína C humana activada (hAPC) que contenía prolina en la
posición 11 mostró una actividad 2,4 a 3,5 inferior que la hAPC de
tipo salvaje, dependiendo del análisis utilizado. La APC bovina que
contenía histidina 11 presentó una actividad hasta 15 veces
superior que la de bAPC de tipo salvaje. Esto demostró la capacidad
para mejorar tanto el contacto con la membrana como la actividad
por medio de la mutación.
Mutagénesis de la Proteína C: El clon de
ADNc de la proteína C humana completa fue proporcionado por el Dr.
Johan Stenflo (Dept. of Clinical Chemistry, University Hospital,
Malmo, Suecia). El clon de ADNc de la proteína C bovina fue
proporcionado por el Dr. Donald Foster (ZymroGenetics, Inc., EEUU).
El número de acceso GenBank para la secuencia de nucleótidos de la
proteína C bovina es KO2435, NID g163486 y es K02059, NID g190322
para la secuencia de nucleótidos de la proteína C humana.
La mutagénesis dirigida al sitio fue realizada
mediante el método de PCR. Para la mutagénesis de la proteína C
humana de histidina 11 a prolina, se sintetizaron los siguientes
oligonucleótidos: A, 5'-AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA
GGG AGA CCC AAG CTT-3' (correspondiente a los
nucleótidos 860-895 del vector pRc/CMV, SEQ ID NO:
7) para crear un sitio Hind III entre pRc/CMV y la proteína C. B,
5'-GCA CTC CCG CTC CAG GCT GCT GGG ACG GAG CTC CTC
CAG GAA-3' (correspondiente a los restos aminoácido
4-17 de la proteína C humana, el 8º resto de esta
secuencia se mutó a partir del de la proteína C humana al de la
proteína C bovina, como se indica por medio del subrayado, SEQ ID
NO: 8).
Para la mutagénesis de la proteína C bovina de
prolina 11 a histidina, se sintetizaron los siguientes
oligonucleótidos: A, (como se ha descrito antes); C,
5'-ACG CTC CAC GTT GCC GTG CCG CAG CTC CTC TAG
GAA-3' (correspondiente a los restos aminoácido
4-15 de la proteína C bovina, el 6º aminoácido se
mutó del de la proteína C bovina al de la proteína C humana como se
marca con el subrayado SEQ ID NO: 9); D, 5'-TTC CTA
GAG GAG CTG CGG CAC GGC AAC GTG GAG CGT-3'
(correspondiente a los restos aminoácido 4-15 en la
proteína C bovina, el 7º aminoácido se mutó del de la proteína C
bovina al de la proteína C humana; los nucleótidos mutados están
subrayados, SEQ ID NO: 10); E, 5'-GCA TTT AGG TGA
CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA-3' (correspondiente
a los nucleótidos 984-1019 en el vector pRc/CMV),
creando un sitio Xba I entre pRc/CMV y la proteína C, SEQ ID NO:
11).
Se clonaron los ADNc de la proteína C tanto
humana como bovina en los sitios Hind III y Xba I del vector de
expresión pRc/CMV. El ADNc de la proteína C humana que contenía del
extremo 5' al aminoácido 17 fue amplificado mediante PCR con ADNc
de proteína C humana intacta y los cebadores A y B. El volumen para
la reacción de PCR fue de 100 \mul y contenía 0,25 \mug de ADN
molde, 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxirribonucleósidos
trifosfato, 0,5 mM de cada cebador y 2,5 U de ADN polimerasa Pwo
(Boehringer Mannheim) en tampón Tris-HCl (Tris 10
mM, KCl 25 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 5 mM, y MgSO_{4} 2
mM, pH 8,85). Las muestras se sometieron a 30 ciclos de PCR que
consistieron en un período de desnaturalización de 2 minutos, 94ºC,
un período de hibridación de 2 minutos a 55ºC, y un período de
elongación de 2 minutos a 72ºC. Después de la amplificación, el ADN
se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa al 0,8%
en tampón Tris-acetato 40 mM que contenía EDTA 1
mM. Los productos de la PCR se purificaron con el JET Plasmid
Miniprep-Kit (Saveen Biotech AB, Suecia). El ADNc
de la proteína C humana que contenía las respectivas mutaciones se
escindió por medio de Hind III y Bsr BI, y después se clonó en el
vector pRc/CMV que fue escindido con Hind III/Xba I y que contenía
un fragmento de la proteína C humana desde Bsr BI al extremo 3'
para producir un ADNc completo de la proteína C humana con la
mutación.
El ADNc de la proteína C bovina, que contenía
del extremo 5' al aminoácido 11, se amplificó mediante PCR con ADNc
de proteína C humana intacta y los cebadores A y C. El ADNc de la
proteína C bovina desde el aminoácido 11 al extremo 3' se amplificó
con ADNc de proteína C humana intacta y los cebadores D y E. Se
utilizaron estos dos fragmentos de ADNc como moldes para amplificar
el ADNc de la proteína C bovina completa que contenía los
aminoácidos mutados con los cebadores A y E. Las condiciones de la
reacción de PCR fueron idénticas a las utilizadas para la hAPC. El
ADNc de la proteína C bovina que contenía las respectivas mutaciones
se escindió mediante Hind III y Bsu 36I, y el fragmento Hind
III/Bsu36I se clonó en el vector pRc/CMV que contenía fragmentos de
la proteína C bovina intacta desde Bsu 36I al extremo 3' para
producir ADNc de la proteína C bovina completa que contenía la
mutación. Todas las mutaciones fueron confirmadas mediante
secuenciación del ADN antes de la
transfección.
transfección.
Cultivo Celular y Expresión: Se hizo
crecer la línea de células de riñón humanas transfectadas con
adenovirus 293 en medio DMEM con un suplemento de suero de ternera
fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de
penicilina, 100 U/ml de estreptomicina y 10 \mug/ml de vitamina
K_{1}. La transfección se realizó utilizando el método de la
Lipofectina. Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci.
EEUU 84:7413-7417. Se diluyeron 2 \mug de ADN
hasta 0,1 mL con DMEM que contenía medio de 2 mM de
L-glutamina. Se añadieron 10 \muL de Lipofectina
(1 mg/ml) a 100 \muL de DMEM que contenía medio de
L-glutamina 2 mM. Se mezclaron el ADN y la
Lipofectina y se dejaron a la temperatura ambiente durante
10-15 min. Las monocapas de células (confluencia del
25-50% en placas petri de 5 cm) se lavaron dos
veces en DMEM con medio de L-glutamina 2 mM. La
mezcla de ADN/lípido se diluyó hasta 1,8 mL en DMEM que contenía
medio de L-glutamina 2 mM, se añadió a las células y
se incubó durante 16 horas. Las células se alimentaron con 2 mL de
medio completo que contenía suero de ternera al 10%, se dejó que se
recuperara durante otras 48-72 horas y después se
trató con tripsina y se sembró en placas de 10 cm con medio de
selección (DMEM que contenía suero al 10% y 400 \mug/mL de
Geneticina) a 1:5. Yan et al., 1990, Bio/Technology
655-661. Se obtuvieron colonias resistentes a
Geneticina después de 3-5 semanas de selección. Se
escogieron veinticuatro colonias de cada transfección con ADN, se
hicieron crecer hasta la confluencia y se escrutó el medio en busca
de expresión de proteína C con un análisis de transferencia puntual
utilizando un anticuerpo monoclonal HPC4 (para proteína C humana) y
anticuerpo monoclonal BPC5 (para proteína C bovina). Los clones que
produjeron elevadas cantidades de proteína se aislaron y se hicieron
crecer hasta la confluencia en presencia de 10 \mug/mL de
vitamina K_{1}.
La purificación de la proteína C recombinante
bovina y su mutante se basó en el método descrito previamente con
algunas modificaciones. Rezair y Esmon, 1992, J. Biol. Chem.,
267:26104-26109. El medio sin células acondicionado
de las células transfectadas establemente se centrifugó a 5.000 rpm
a 4ºC durante 10 minutos. El sobrenadante se filtró a través de
membranas de nitrato de celulosa 0,45 \mum (Micro Filtration
Systems, Japón). Se añadieron EDTA (5 mM, concentración final) y
PPACK (0,2 \muM, concentración final) al medio acondicionado de
células 293, después se hicieron pasar a través una columna de
intercambio aniónico Pharmacia FFQ a la temperatura ambiente
utilizando Millipore Con Sep LC100 (Millipore, EEUU). La proteína se
hizo eluir con un gradiente de CaCl_{2} (solución de partida,
Tris-HCl 20 mM/NaCl 150 mM, pH 7,4; solución
limitante, Tris-HCl 20 mM/NaCl 150 mM/CaCl_{2} 30
mM, pH 7,4). Tras la separación del CaCl_{2} mediante diálisis y
tratamiento con Chelex 100, la proteína se readsorbió en una
segunda columna FFQ, después se hizo eluir con un gradiente de NaCl
(solución de partida Tris-HCl 20 mM/NaCl 150 mM, pH
7,4; solución limitante, Tris-HCl 20 mM/NaCl 500 mM,
pH 7,4). En este punto de la purificación, la proteína C bovina
recombinante mutante y de tipo salvaje eran homogéneas como se
determinó mediante SDS-PAGE.
La primera columna utilizada para la
purificación de la proteína C humana recombinante mutante y de tipo
salvaje fue la misma descrita para la proteína C bovina. Se empleó
el método cromatográfico descrito por Rezair y Esmon con algunas
modificaciones descritas para el método de purificación de la
proteína S. Rezair y Esmon, 1992, supra; He et al.,
1995, Eur. J. Biochem., 227:433-440. Las fracciones
que contenían proteína C de la cromatografía de intercambio
aniónico fueron identificadas mediante transferencia puntual. Las
fracciones positivas se reunieron y se aplicaron a una columna de
afinidad que contenía el anticuerpo dependiente de Ca^{2+}
HPC-4. La columna se equilibró con
Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, que contenía
Benzamidina-HCl 5 mM y CaCl_{2} 2 mM. Tras la
aplicación, la columna se lavó con el mismo tampón que contenía NaCl
1 M. La proteína C se hizo eluir después con
Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM y EDTA 5 mM, pH 7,4, que
contenía Benzamidina-HCl 5 mM. Después de la
purificación, se estimó la pureza de todas las preparaciones de
proteína C recombinante bovina y humana mediante
SDS-PAGE seguido de tinción con plata. Las proteínas
se concentraron utilizando filtros YM 10 (Amicon), después se
sometieron a diálisis frente a tampón (Tris-HCl 50
mM y NaCl 150 mM, pH 7,4) durante 12 horas a -70ºC. Las
concentraciones de las proteínas se midieron mediante absorbancia a
280 nm.
Asociación de moléculas de proteína C
mutantes y normales con membranas: Se prepararon LUV y SUV
mediante los métodos descritos en el Ejemplo 1.Se utilizó la
dispersión de luz a 90º para cuantificar la unión
proteína-membrana como se ha descrito antes para el
Factor VII (25 \mug/mL de PS/PC, (25/75) en calcio 5 mM (tampón
Tris 0,05 M-NaCl 0,1 M, pH 7,5).
La proteína C bovina que contenía histidina en
la posición 11 interaccionaba con las membranas con una afinidad
aproximadamente 10 veces superior que la proteína de tipo salvaje.
Cuando se ajustó a la ecuación 2, los datos dieron valores de
K_{D} de 930,080 nM para la proteína C-H11 y
920,0950 nM para la proteína C de tipo salvaje (Figura 8A). La
diferencia en la afinidad correspondía a aproximadamente 1,4
kcal/mol a 25ºC. De hecho, la afinidad por la membrana de la
proteína C-H11 bovina fue casi idéntica a la de la
proteína C humana nativa (660 nM, Figura 8B). Esto sugirió que la
prolina 11 formaba una base principal para las diferencias entre el
sitio de unión a la membrana de las proteínas humanas y bovinas.
La sustitución inversa, el remplazo de
His-11 de la proteína C humana por prolina,
disminuyó la afinidad por la membrana (Figura 8B). Cuando se
ajustaron a la ecuación 2, estos datos dieron valores de K_{D} de
660,090 nM para la proteína C humana de tipo salvaje y 3350,110 nM
para la proteína C-P11 humana. El impacto de la
introducción de prolina solamente fue ligeramente menor que el de la
prolina en las proteínas bovinas.
Impacto de la prolina-11
sobre la actividad de la proteína C activada: Se generó proteína
C activada mediante escisión con trombina, utilizando condiciones
idénticas para las proteínas de tipo salvaje y mutante. Se mezclaron
aproximadamente 150 \mug de las diversas preparaciones de
proteína C (1 mg/mL) con trombina bovina (3 \mug) y se incubaron
a 37ºC durante 5 horas. El producto de reacción se diluyó a tampón
Tris 0,025 M-NaCl 0,05 M y se aplicó a una columna
de 1 mL de SP-Sephadex C-50. La
columna se lavó con 1 mL del mismo tampón y se reunió el flujo
continuo en forma de proteína C activada. Se recuperó
aproximadamente un 65-80% de la proteína aplicada a
la columna. Se determinó la actividad de APC mediante proteolisis de
S2366 (0,1 mM) a 25ºC. Las preparaciones se compararon con
preparaciones normalizadas obtenidas a mayor escala. La APC humana
patrón fue proporcionada por el Dr. Walter Kisiel. Para las
proteínas bovinas, el patrón fue una preparación a escala de APC
activada con trombina. La actividad de la APC bovina fue constante
para todas las preparaciones de proteínas mutantes y normales (5%).
Se utilizaron dos preparaciones de APC bovina para las
comparaciones. La APC humana generada a partir de trombina fue de
55 a 60% más activa que el patrón. Las concentraciones referidas en
este estudio se basaron en la actividad hacia S2366, con respecto a
la del patrón.
El ensayo APTT patrón utilizó plasma humano o
bovino y reactivo APTT patrón (Sigma Chemical Co.) de acuerdo con
las instrucciones de los fabricantes. Alternativamente, se
proporcionó fosfolípido en forma de vesículas formadas a partir de
fosfolípidos altamente purificados. En este análisis, se incubó
plasma bovino (0,1 mL) con caolín (0,1 mL de 5 mg/mL en tampón Tris
0,05 M, NaCl 0,1 M, pH 7,5) o ácido elágico (0,1 mM en tampón)
durante 5 minutos a 35ºC. La coagulación se inició añadiendo 0,1 mL
de tampón que contenía fosfolípido y las cantidades de APC
mostradas, seguido de 0,1 mL de cloruro de calcio 25 mM. Todos los
reactivos estaban en tampón convencional que contenía tampón Tris
0,05 M, NaCl 0,1 M, pH 7,5. Se necesitó una media de concentración
14 veces superior de bAPC de tipo salvaje para duplicar el impacto
del mutante de H11. El tiempo de coagulación a
bAPC-H11 10 nM fue mayor de 120 minutos. El reactivo
APTT patrón (Sigma Chemical Co.) dio un tiempo de coagulación de
aproximadamente 61 segundos a 35ºC con este plasma. El tiempo
requerido para formar un coágulo se registró por medio de una
técnica manual. La cantidad de fosfolípido se diseñó para que fuera
el componente limitante en el análisis y para dar los tiempos de
coagulación mostrados. Los fosfolípidos utilizados fueron SUV (45
\mug/0,4 mL en el análisis final, PS/PC, 10/90) o LUV (120
\mug/0,4 mL en el análisis final, PS/PC, 25/75).
La actividad anticoagulante de la proteína C
activada se sometió a ensayo en diversos análisis. La Figura 9
muestra el impacto sobre el análisis de APTT, realizado con
fosfolípido limitante. En las condiciones de este análisis, los
tiempos de coagulación disminuyeron en una relación inversa, casi
lineal con la concentración de fosfolípido. Se necesitaron
aproximadamente 14 veces más de APC bovina de tipo salvaje para
igualar el efecto de la APC-H11 bovina.
Se repitieron partes del estudio de la Figura 9
para membranas de PS/PC (25/75, LUV). De nuevo, la actividad estuvo
limitada por el fosfolípido, y su concentración se ajustó para dar
un tiempo de coagulación de control de 360 segundos (120 \mug PS
al 25% en el análisis de 0,4 mL). Se necesitaron aproximadamente 15
veces más de enzima de tipo salvaje para igualar el impacto del
mutante de H11. Finalmente, se utilizó reactivo APTT patrón (Sigma
Chemical Co., tiempo de coagulación del patrón 502 segundos). Se
necesitaron aproximadamente 10,007 nM; de enzima de tipo salvaje
para duplicar el tiempo de coagulación hasta 102,5 segundos. Se
produjo el mismo impacto por medio de APC-H11
bovina 2,20,1 nM. El fosfolípido no era limitante de la velocidad en
el análisis convencional de manera que se puede esperar un impacto
más pequeño sobre la afinidad por la membrana.
Los resultados para las proteínas humanas se
muestran en la Figura 8B. Se requirieron aproximadamente 2,5 veces
más de APC humana que contenía prolina 11 para prolongar la
coagulación hasta el punto de la APC de tipo salvaje. Un impacto
inferior de la introducción de prolina 11 puede reflejar diferencias
más pequeñas en la afinidad por la membrana de las proteínas
humanas (Figura 9B).
Inactivación del factor Va: Se analizó la
inactivación del factor Va mediante el método de Nicolaes et
al., 1996, Thrombosis y Haemostasis 76:404-410.
En resumen, para las proteínas bovinas, se diluyó plasma bovino
1000 veces en Tris 0,05 M, NaCl 0,1 M, 1 mg/mL de albúmina de suero
bovino y calcio 5 mM a pH 7,5. Se añadieron vesículas de
fosfolípidos (5 \mug/0,24 mL de análisis) y 5 \muL de trombina
190 nM para activar el factor V. Tras una incubación de 10 minutos
a 37ºC, se añadió APC y la incubación continuó durante 6 minutos. Se
añadieron protrombina bovina (a una concentración final 10 \muM)
y factor Xa (concentración final 0,3 nM) y la reacción de
activación se incubó durante un minuto a 37ºC. Se añadió una muestra
de 20 \muL de esta reacción de activación a 0,38 mL de tampón
(Tris 0,05 M, NaCl 0,1 M, EDTA 5 mM, pH 7,5) que contenía sustrato
S2288 (60 \muM). La cantidad de trombina se determinó mediante el
cambio de absorbancia a 405 nM (\varepsilon = 1,0*10^{4}
M^{-1}s^{-1}, k_{cat} para la trombina = 100/s). Para las
proteínas humanas, se diluyó plasma deficiente en proteína S humana
(Biopool Canadá, Inc.) 100 veces, se activó el factor Va por medio
de trombina humana y se analizó el factor Va producido con los
reactivos utilizados para las proteínas
bovinas.
bovinas.
La APC-H11 bovina fue 9,2 veces
más activa que el tipo salvaje (Figura 10A) en la inactivación del
factor Va. En cuanto a la unión a la membrana (anterior), el
impacto de la prolina 11 fue menor con las proteínas humanas, con
una media de diferencia de 2,4 veces entre las curvas trazadas para
el tipo salvaje y el mutante P-11 (Figura 10B). Se
obtuvieron resultados similares con el plasma humano normal.
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Ejemplo
5
Identificación de una afinidad de membrana
arquetipo para el sitio de contacto con la membrana de las
proteínas dependientes de vitamina K: La comparación de diversos
mutantes de proteína C humana y bovina y otros polipéptidos
dependientes de vitamina K condujo a un arquetipo del sitio de
contacto con la membrana propuesto. El arquetipo electrostático
consiste en un núcleo electropositivo sobre una superficie de la
proteína, creado por iones calcio unidos, rodeado por un halo de
carga electronegativa de aminoácidos de la proteína. Cuanto más se
acerca un miembro de esta familia de proteínas a este patrón
electrostático, mayor es su afinidad por las membranas.
Las vesículas de fosfolípido, la proteína C
bovina de tipo salvaje, los estudios de interacción
proteína-membrana, la activación y la
cuantificación de proteína C, y el análisis de la actividad fueron
los descritos en el Ejemplo 4.
Se generó proteína C mutante, recombinante
mediante los siguientes procedimientos. La mutagénesis dirigida al
sitio se realizó mediante un método de PCR. Se sintetizaron los
siguientes oligonucleótidos: A, como se describe en el Ejemplo 4;
F, 5'-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT
AGA-3' (correspondiente a los nucleótidos
984-1019 del vector pRc/CMV, SEQ ID NO:11), creando
un sitio Xba I entre pRc/CMV y la proteína C; G,
5'-GAA GGC CAT TGT GTC TTC CGT GTC TTC GAA AAT CTC
CCG AGC-3' (correspondiente a los restos aminoácido
40-27 de la proteína C bovina, los aminoácidos 8º y
9º se mutaron de QN a ED como se indica con el subrayado, SEQ ID
NO: 12); H, 5'-CAG TGT GTC ATC CAC ATC TTC GAA AAT
TTC CTT GGC-3' (correspondiente a los restos
aminoácido 38-27 de la proteína C humana, los
aminoácidos 6º y 7º de esta secuencia se mutaron de QN a ED como se
indica con el subrayado, SEQ ID NO: 13); I, 5'-GCC
AAG GAA ATT TTC GAA GAT GTG GAT GAC ACA CTG-3'
(correspondiente a los restos aminoácido 27-38 de
la proteína C humana, los aminoácidos 6º y 7º de esta secuencia se
mutaron de QN a ED como se indica en el subrayado, SEQ ID NO: 14);
J, 5'-CAG TGT GTC ATC CAC ATT TTC GAA AAT TTC CTT
GGC-3 (correspondiente a los restos aminoácido
38-27 de la proteína C humana, el 7º aminoácido de
esta secuencia se mutó de Q a E como se indica con el subrayado,
SEQ ID NO: 15); K, 5'-GCC AAG GAA ATT TTC GAA AAT
GTG GAT GAC ACA CTG-3' (correspondiente a los
restos aminoácido 27-38 de la proteína C humana, el
6º aminoácido de esta secuencia se mutó de Q a E como se indica con
el subrayado, SEQ ID NO: 16);
Se clonaron los ADNc completos de la proteína C
humana y bovina en el sitio Hind III y Xba I del vector pRc/CMV.
Para obtener el mutante de la proteína C bovina E33D34, se realizó
la amplificación por PCR del ADN diana como sigue. El ADNc de la
proteína C bovina que contenía del extremo 5' al aminoácido de la
posición 40, se amplificó con ADNc de proteína C bovina intacta y
los cebadores A y C. Las condiciones de reacción de la PCR fueron
las descritas en el Ejemplo 3. La muestra se sometió a 30 ciclos de
PCR que consistieron en un período de desnaturalización de 2
minutos a 94ºC, un período de hibridación de 2 min a 55ºC y un
período de elongación de 2 min a 72ºC. Tras la amplificación, el
ADN se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa al
0,8% en tampón Tris-acetato 40 mM que contenía EDTA
1 mM. Los productos de la PCR se purificaron con el kit Geneclean
III (BIO 101, Inc. EEUU), y el fragmento de la PCR del ADNc de la
proteína C bovina que contenía las respectivas mutaciones se
escindió por medio de Hind III y Bbs I. El fragmento Hind III/Bbs I
y el fragmento de la proteína C humana (Bbs
I-extremo 3') se clonaron en los sitios Hind III y
Xba I del vector pRc/CMV para producir un ADNc de la proteína C
bovina completa con las mutaciones. El mutante de la proteína C
bovina H11 E33 D34 se creó del mismo modo, pero utilizando el
mutante de la proteína C bovina H11 como molde en la reacción de
PCR.
El ADNc de la proteína C humana que contenía del
extremo 5' al aminoácido 38 fue amplificado mediante PCR con el
ADNc de la proteína C humana intacto y los cebadores A y D. El ADNc
de la proteína C humana desde el aminoácido 27 al extremo 3' se
amplificó con ADNc de la proteína C humana intacto y los cebadores B
y E. Estos dos fragmentos de ADNc se utilizaron como moldes para
amplificar el ADNc de la proteína C bovina completo que contenía
los aminoácidos mutados (E33 D34) con los cebadores A y B. Se obtuvo
el mutante de la proteína C humana E33 mediante las siguientes
etapas: se amplificó el ADNc de la proteína C humana que contenía
del el extremo 5' al aminoácido 38 con el ADNc de la proteína C
humana intacto y los cebadores A y F. El ADNc de la proteína C
humana desde el aminoácido 27 al extremo 3' se amplificó con el ADNc
de la proteína C humana intacto y los cebadores B y G. Se
utilizaron estos dos fragmentos de ADNc como moldes para amplificar
el ADNc de la proteína C bovina completo que contenía los
aminoácidos mutados (E33) con los cebadores A y B. La mezcla y el
programa de la PCR se han descrito antes. Los productos de la PCR de
la proteína C humana que contenían las respectivas mutaciones se
escindieron por medio de Hind III y Sal I, y después se clonaron el
fragmento (Hind III-Sal I) con el fragmento de la
proteína C humana intacto (Sal I-extremo 3') en los
sitios Hind III y Xba I del vector pRc/CMV para producir el ADNc de
la proteína C humana completo con las respectivas mutaciones.
También se elaboró la proteína C humana que contenía un resto
glicina en la posición 12, junto con las mutaciones E33D34. Todas
las mutaciones fueron confirmadas mediante secuenciación del ADN
antes de la transfección.
La línea de células de riñón humano 293
transfectadas con adenovirus se cultivó y se transfectó como se ha
descrito en el Ejemplo 4. Se purificaron la proteína C humana
recombinante y los mutantes como se ha descrito en el Ejemplo
4.
Las proteínas dependientes de vitamina K se
clasificaron en cuatro grupos basándose en sus afinidades por una
membrana patrón (Tabla 5). Se dan las secuencias de los restos amino
terminales de algunas proteínas relevantes incluyendo la proteína C
humana (hC, SEQ ID NO: 1), proteína C bovina (bC, SEQ ID NO: 2),
protrombina bovina (bPT, SEQ ID NO:17), factor X bovino (bX, SEQ ID
NO: 18), factor VII humano (hVII, SEQ ID NO: 3), proteína Z humana
(hZ, SEQ ID NO: 20), y proteína Z bovina (bZ, SEQ ID NO: 21) como
referencia, donde X es Gla (ácido
\gamma-carboxiglutámico) o Glu.
bPT:
ANKGFLXXVRK_{11}GNLXRXCLXX_{21}PCSRXXAFXA_{31}LXSLSATDAF_{41}WAKY
bX: ANS-
FLXXVKQ_{11}GNLXRXCLXX_{21}ACSLXXARXV_{31}FXDAXQTDXF_{41}WSKY
hC: ANS-
FLXXLRH_{11}SSLXRXCIXX_{21}ICDFXXAKXI_{31}FQNVDDTLAF_{41}WSKH
bC: ANS-
FLXXLRP_{11}GNVXRXCSXX_{21}VCXFXXARXI_{31}FQNTXDTMAF_{41}WSFY
hVII: ANA-
FLXXLRP_{11}GSLXRXCKXX_{21}QCSFXXARXI_{31}FKDAXRTKLF_{41}WISY
hZ:
AGSYLLXXLFX_{11}GNLXKXCYXX_{21}ICVYXXARXV_{31}FXNXVVTDXF_{41}WRRY
bZ:
AGSYLLXXLFX_{11}GHLXKKCWXX_{21}ICVYXXARXV_{31}FXDDXTTDXF_{41}WRTY
^{a}Un Valor de afinidad superior iguala la
K_{disociación}/1*10^{7}M^{-1}S^{-1}; el denominador es una
K_{asociación} típica para otras proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 5, los mutantes de polipéptidos
dependientes de vitamina K están en negrita. La carga total (restos
1-34) incluye 7 iones calcio (+14) y el extremo
amino (+1).
\newpage
La proteína Z fue asignada a la clase I
basándose en su constante de la velocidad de disociación, que era
de 100 a 1.000 veces más lenta que la de otras proteínas. Si la
proteína Z presentaba una constante de la velocidad de disociación
normal (aproximadamente 10^{7} M^{-1}s^{-1}) la K_{D} sería
aproximadamente 10^{-10} M. Wei et al., 1982,
Biochemistry, 21:1949-1959. La última afinidad puede
ser la máxima posible para las proteínas dependientes de vitamina
K. La proteína Z es un candidato para la terapia de anticoagulación
como cofactor para la inhibición del factor Xa por medio del
inhibidor de la proteasa dependiente de proteína Z (ZPI). La
incubación de la proteína Z y ZPI con el factor Xa reduce la
actividad procoagulante del factor Xa. Véase, por ejemplo, Han
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 1998,
95:9250-9255. La potenciación de la cinética de
asociación aceleraría las velocidades de inhibición e incrementaría
la afinidad de unión en equilibrio. La proteína Z contiene
gly-2, que se piensa que anula la interacción de la
asn-2 con el calcio unido en otras proteínas. La
presencia de un resto glicina en la posición 2 puede desestabilizar
el plegamiento de la proteína y disminuir la cinética de
asociación. Además, la menor afinidad de la proteína Z con respecto
a la de la proteína Z bovina puede provenir de cargas aniónicas
inferiores en las posiciones 34-36 (Tabla 5).
Las proteínas de la Clase IV diferían de las de
clase III en la presencia de prolina-11, que puede
alterar la afinidad mediante métodos no electrostáticos.
Si bien existía una correlación relativamente
débil entre la afinidad por la membrana y la carga negativa neta de
los restos 1-34, se encontró una excelente
correlación solamente cuando se tenían en cuenta los restos 5, 11,
29, 33 y 34 (Tabla 5). Los últimos aminoácidos están localizados
sobre la superficie de la proteína. Se modelaron numerosas
proteínas mediante sustitución de aminoácidos en la estructura de la
protrombina y se estimaron sus potenciales electrostáticos por
medio del programa DelPhi. En la Figura 11 se muestra un boceto
diseñado según el potencial electrostático de la proteína Z bovina.
Los sitios electronegativos en 7, 8, 26, 30, 33, 34 y 11 producen
un halo de carga electronegativa que rodea un núcleo catiónico
producido por el poro recubierto de calcio (Figura 11). Cuanto más
se aproxima una estructura de proteína a esta estructura, mayor es
su afinidad por la membrana. Las proteínas de mayor afinidad
muestran una carga electronegativa que se extiende a los
aminoácidos 35 y 36. Esta correlación es evidente a partir de las
proteínas de tipo salvaje, los mutantes y las proteínas modificadas
química-
mente.
mente.
El patrón para otras estructuras puede ser
extrapolado a partir del examen de los grupos con carga que están
ausentes en otras proteínas. Por ejemplo, Lys-11 y
Arg-10 de la protrombina bovina generan regiones
altamente electropositivas en sus proximidades; la carencia de
Gla-33 en la proteína C y el Factor VII crea menos
electronegatividad en esas regiones de la proteína. En todos los
casos, la mayor afinidad correspondía a una estructura con un
núcleo electropositivo que estaba completamente rodeado por una
superficie electronegativa de la proteína, como se muestra para la
proteína Z. Las excepciones a este patrón son las proteínas con
Pro-11, que pueden disminuir la afinidad mediante
un impacto estructural y ser-12 (proteína C humana),
que es un resto no cargado único.
Para someter a ensayo adicionalmente la
hipótesis de un arquetipo para la distribución electrostática, se
utilizó la mutagénesis dirigida al sitio para remplazar Gln33Asn34
de la proteína C bovina y humana por Glu33Asp34. Glu33 debe ser
modificada adicionalmente a Gla durante el procesamiento de la
proteína. Estos cambios alteraban el potencial electrostático de la
proteína C bovina al del factor X bovino. Se esperaba que la
afinidad por la membrana de la proteína mutante fuera inferior a la
del factor X debido a la presencia de prolina-11. En
efecto, el mutante de la proteína C bovina dio una afinidad por la
membrana similar a la de la protrombina bovina (Figura 12A), y
ligeramente menor que la del factor X bovino (Tabla 5).
Fue más interesante que la inhibición de la
coagulación por APC fuera mayor para el mutante que para la enzima
de tipo salvaje (Figura 12B, C). La inclusión de los resultados para
el mutante P11H de la proteína C bovina del Ejemplo 3 demostró que
se podía producir una familia de proteínas, cada una con una
afinidad y por la membrana y una actividad diferentes, variando las
sustituciones de los aminoácidos de las posiciones 11, 33 y
34.
34.
Los mutantes de la proteína C humana que
contenían E33 y E33D34 dieron como resultado un pequeño incremento
en la afinidad de unión a la membrana (Figura 13a). La actividad de
estos mutantes fue ligeramente menor que la de la enzima de tipo
salvaje (Figura 13b). Los resultados con los mutantes de la proteína
C bovina sugieren que el fracaso de la mutación E33D34 en la
proteína humana puede proceder de H11 y/u otros aminoácidos únicos
en la proteína. La Figura 14A muestra que el mutante H11 de la
proteína C bovina se unía a la membrana con una afinidad
aproximadamente 10 veces mayor que la de la proteína de tipo
salvaje, el mutante E33D34 se unía con aproximadamente 70 veces la
afinidad, pero que el triple mutante, H11E33D34, sólo era
ligeramente mejor que el mutante H11. Esta relación se reflejó en
la actividad de APC formada a partir de estos mutantes (Figura
14B). Este resultado sugirió que la presencia de H11 reducía el
impacto de E33D34 sobre la afinidad de unión a la
membrana.
membrana.
Estos resultados indicaban que la introducción
de E33D34 sólo puede no ser óptima para todas las proteínas. Por
consiguiente, pueden ser deseables otras mutaciones para crear la
proteína C humana que utilicen E33D34 y tengan una afinidad de
membrana incrementada máxima. El resultado con la proteína bovina
sugirió que la histidina 11 podía ser la causa principal de este
fenómeno. Por consiguiente, H11 podía ser alterada a glutamina u
otro aminoácido en la proteína C humana, junto con la mutación
E33D34. Otro aminoácido que puede tener impacto en la afinidad es
la serina de la posición 12, un aminoácido que es absolutamente
único en la proteína C humana. Estos cambios adicionales deben
producir proteínas con una afinidad de membrana intensificada. La
sustitución de un resto glicina por una serina en la posición 12 de
la proteína C humana activada, junto con E33D34 dio como resultado
una actividad 9 veces superior que la de la proteína C humana
activada de tipo salvaje. La actividad del mutante G12E33D34 fue
evaluada con un análisis de tromboplastina diluida utilizando un
tiempo de coagulación de control de 30 segundos y plasma humano
normal. El arquetipo electrostático también fue sometido a ensayo
mediante la comparación del factor X bovino y humano. La presencia
de lisina-11 en el factor X humano sugiere que debe
tener una afinidad menor que la del factor X bovino. Esta predicción
fue confirmada, por el resultado mostrado en la Figura
15.
15.
Estudios anteriores han demostrado que la
modificación con ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) del fragmento
1 de la protrombina humana y bovina tenía un impacto relativamente
pequeño (0 a 5-veces) sobre la afinidad por la
membrana. Weber et al., 1992, J. Biol. Chem.,
267:4564-4569; Welsch et al., 1988,
Biochemistry 27:4933-4938. Las condiciones
utilizadas para la reacción dieron como resultado la derivatización
del extremo amino, un cambio que está ligado a la disminución de la
afinidad por la membrana. Welsch y Nelsestuen, 1988, Biochemistry,
27:4939-4945. La modificación de la proteína en
presencia de calcio, que protege el extremo amino, dio como
resultado una proteína modificada con TNBS con una afinidad por la
membrana muy superior a la del fragmento 1
nativo.
nativo.
La sugerencia de que la proteína Z constituye el
arquetipo se basó en su constante de la velocidad de disociación y
en que una velocidad de asociación normal generaría una K_{D} =
10^{-10} M. Es dudoso que este valor pueda ser alcanzado. Es
posible que la velocidad de asociación lenta de la proteína Z esté
causada por un plegamiento no apropiado de la proteína, dando como
resultado una baja concentración de la conformación de unión a la
membrana. Si se pueden alterar la condiciones para mejorar el
plegamiento de la proteína, deben mejorar las velocidades de
asociación de la proteína Z. En efecto, la constante de la velocidad
de asociación para la proteína Z fue mejorada mediante la
alteración del pH. La base para esta observación puede estar
relacionada con un rasgo inusual de la estructura de la
protrombina, que es la próxima situación del extremo amino (+1 a pH
7,5) a los iones calcio 2 y 3. La carga +1 sobre el extremo amino es
responsable de la región ligeramente electropositiva inmediatamente
por encima de Ca-1 en la Figura 11. La repulsión de
la carga entre Ca y el extremo amino puede desestabilizar el
plegamiento de la proteína y podría ser un serio problema para una
proteína que tuviera una baja estabilidad de
plegamiento.
plegamiento.
La Tabla 6 proporciona un apoyo adicional para
el modelo del arquetipo. Muestra la relación entre la distancia de
los grupos iónicos de los iones estroncio 1 y 8 (correspondientes al
calcio 1 y un ión metálico divalente extra encontrado en la
estructura cristalina por rayos x del Sr de la protrombina). El
patrón sugiere que cuanto más próximo está un grupo iónico a estos
iones metálicos, mayor es su impacto sobre la afinidad por la
membrana. La excepción es la Arg-16, que contribuye
a la carga del núcleo electropositivo. La mayor afinidad se
corresponde con la carga electronegativa en todos los demás sitios.
Esta correlación también se aplica a los restos GLA.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
^{a}Las distancias son desde este
átomo de la protrombina bovina (el resto de la protrombina utilizado
en la medida se da entre paréntesis) al estroncio 1 y 8 de la
estructura del fragmento 1 de Sr-Protrombina.
Seshadri et al. 1994, Biochemistry 33:
1087-1092.
\newpage
^{b}Para todos menos para
16-R, los cationes disminuyen la afinidad y los
aniones incrementan la
afinidad.
^{c}Thariath et al. 1997
Biochem. J. 322:
309-315.
^{d}Impacto de las mutaciones Glu
a Asp, las distancias son las medias para los carbonos gamma
carboxílicos. Los datos de K_{D}(K_{M}) son de Ratcliffe
et al. 1993 J. Biol. Chem. 268:
24339-45.
^{e}La unión fue de baja
capacidad o causó agregación, haciendo las comparaciones menos
seguras.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la Figura 15C muestran que la
velocidad de asociación para la proteína Z era sustancialmente
mejorada a pH 9, donde un amino terminal debe estar no cargado. La
constante de velocidad obtenida a partir de estos datos fue
aproximadamente 12 veces superior a pH 9 que a pH 7,5 (Figura
15C).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Análisis de Competición para Evaluar la
Afinidad del Factor VII Modificado: Se evaluó la actividad de
coagulación de VIIaQ11E33 y de tipo salvaje utilizando factor
tisular reconstituido (Innovin, Dade) y membrana. Se utilizaron
cantidades saturantes de factor VIIa (aproximadamente 0,7 \mul de
Innovin/0,15 ml de análisis). Se añadieron el factor VIIa y el
Innovin a tampón sin plasma (CaCl_{2} 6,7 mM, Tris 50 mM, pH 7,5,
NaCl 100 mM) en 112,5 \mul. Después de 15 minutos, se añadieron
37,5 \mul de plasma deficiente en factor VII y se registró el
tiempo de coagulación. La actividad de VIIaQ11E33 dependiente del
factor tisular fue similar a la de la proteína de tipo salvaje
cuando se analizo de esta manera. Como el uso de plasma carente de
Factor VII no es representativo de las condiciones in vivo,
la afinidad relativa del factor VII modificado para el tejido unido
a la membrana fue evaluada en presencia de una proteína competidora.
En particular, se utilizó el factor VIIa con el sitio activo
modificado como proteína competidora y estuvo presente en abundancia
(2 nM). El factor VII modificado que se iba a evaluar se utilizó
por encima de la concentración del factor tisular. En estas
condiciones, las concentraciones de proteína libre de todas las
proteínas fueron aproximadamente iguales a las proteínas totales
añadidas. La sustracción de la proteína unida de la total para
obtener las concentraciones de proteína libre representa una
pequeña corrección. Basándose en el análisis competitivo, el factor
VIIaQ11E33 fue 41 veces más eficaz que el VIIa de tipo salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Afinidad de unión a la membrana y actividad
intensificadas del Factor VII, la Proteína S, y otros polipéptidos
dependientes de vitamina K: La proteína S (número de Acceso
GenBank M57853 J02917) es una proteína de unión a la membrana de
alta afinidad y un cofactor para la acción de la APC. La deficiencia
en proteína S es un potente indicador de enfermedad trombótica y
puede ser utilizada en pacientes que tienen bajos niveles de esta
proteína o que presentan un incremento de riesgo de trombosis.
Véase, por ejemplo, Dahlback, Blood, 1995,
85:607-614 y Patente de los Estados Unidos Núm.
5.258.288.
Las sustituciones de los aminoácidos 5 o 9
pueden intensificar la afinidad de unión a la membrana y la
actividad de la Proteína S. El resto 9 de la Proteína S es un resto
treonina, mientras la mayoría de las proteínas dependientes de
vitamina K contienen un resto hidrófobo en esta posición. Véase, por
ejemplo, McDonald et al., Biochemistry, 1997,
36:5120-5127. El remplazo del resto análogo en la
Proteína C humana (un resto leucina) por glutamina, un remplazo de
hidrófobo por hidrófilo, dio como resultado una grave pérdida de
actividad. Véase, Christiansen et al., 1995, Biochemistry,
34:10376-10382. De este modo, existe confusión sobre
la importancia de la posición 8 en la asociación con la membrana de
las proteínas dependientes de vitamina K.
El factor VII humano que contiene una
sustitución de treonina en el aminoácido 9 junto con las mutaciones
de Q11E33 descritas antes, fueron preparados por los ATG
Laboratories, Inc. y proporcionados en un vector apropiado para la
transfección en la línea celular de riñón humano 293, como se ha
descrito antes en el Ejemplo 4.
El vector que contiene la secuencia de ácido
nucleico que codifica el factor VII mutante fue transfectado en una
línea celular de riñón humano 293, utilizando kits disponibles en el
mercado. Las células se hicieron crecer y se seleccionaron las
colonias que proporcionaban niveles elevados de antígeno del factor
VII mediante análisis de transferencia puntual, como se ha descrito
para la proteína C, utilizando anticuerpos policlonales disponibles
en el mercado. La cantidad de factor VII del medio acondicionado
también se determinó mediante un análisis de coagulación,
utilizando el análisis de competición descrito en el Ejemplo 6. En
general, el Factor VII se convirtió en el VIIa mediante incubación
con factor tisular antes del inicio de la coagulación. Se
utilizaron cantidades idénticas de VIIa-Q11E33 y
VIIa-T9Q11E33 en los análisis. Los polipéptidos de
factor VII se mezclaron con una cantidad apropiada de factor
tisular asociado a la membrana (Innovin, Dade). Se añadió VIIa con
el sitio activo modificado (FFR-VIIa) (0 a 3,5 nM) y
se permitió que las reacciones se equilibraran durante 60 minutos
en 112,5 \muL de tampón que contenía CaCl_{2} 6,7 mM, Tris 50
mM, pH 7,5, y NaCl 100 m. Finalmente, se añadió plasma deficiente
en factor VII y se midió el tiempo requerido para formar un coágulo.
Se determinó la eficacia por medio del tiempo de coagulación como
una función del inhibidor añadido. El factor VIIa T9Q11E33 humano
mostró una grave pérdida de afinidad de unión competitiva. De este
modo, un resto treonina no fue óptimo en esta posición. La
introducción de un resto leucina en la proteína 9 de la proteína S
debe aumentar la afinidad por la membrana y la actividad de la
proteína S en muchas
condiciones.
condiciones.
La base para una elevada afinidad por la
membrana de la proteína S, a pesar de la presencia de restos
sub-óptimos sustanciales, puede proceder de otras partes de su
estructura. Esto es, la proteína S contiene una región de la
secuencia conocida como "segundo bucle disulfuro" o región
sensible a la trombina (restos 46 a 75 del polipéptido maduro). La
protrombina también contiene un segundo bucle disulfuro en una
versión más corta. La escisión proteolítica del bucle de la
protrombina produce la pérdida de afinidad por la membrana. Véase,
Schwalbe et al., J. Biol. Chem., 1989,
264:20288-20296. La escisión puede estar implicada
en la regulación de la actividad de la proteína S proporcionando un
control negativo de la acción de la proteína S. El segundo bucle
disulfuro puede servir para producir un sitio de unión a la membrana
óptimo de manera que los restos 46-75 se plieguen
hacia atrás sobre los restos 1-45 para crear un
sitio de unión óptimo. Los restos 1-45 aislados de
la proteína S no se asocian con membranas de una manera dependiente
de calcio, lo que difiere de los restos 1-41 o
1-38 de la protrombina, los restos
1-44 del factor X, los restos 1-41
de la proteína C, o los restos 1-45 de la proteína
Z que se unen a las membranas de una manera dependiente de calcio.
De este modo, a pesar de que la proteína S intacta tiene una
elevada afinidad, los resultados con el dominio 1-45
GLA aislado de la proteína S sugieren que la proteína intacta
experimenta una pérdida sustancial de afinidad en el dominio
GLA.
La proteolisis evita la función apropiada del
segundo bucle disulfuro en este papel, y la proteína S resultante
muestra pérdida de actividad a medida que la afinidad por la
membrana disminuye hasta la esperada por los aminoácidos de los
restos 1-45. De este modo, el aumento de la afinidad
por la membrana mediante la introducción de Leu9 y otros cambios
(véase más abajo), crearía una proteína S que ya no es regulada a la
baja por la proteolisis y que sería un anticoagulante más
eficaz.
Un resto conservado en la mayoría de las
proteínas dependientes de vitamina K es el de la posición 5. En esta
posición se encuentra leucina tanto en la proteína S como en la
proteína Z. La proteína C, los factores X y VII, y la protrombina
contienen fenilalanina, otro resto hidrófono, en la posición
correspondiente. El factor IX contiene una lisina en el resto 5,
una desviación importante de otras proteínas. Parece no haber
conexión aparente para este resto no conservado y la afinidad por
la membrana del factor IX, haciendo ambiguo el papel de la posición
5.
La sustitución de un resto glutamina en la
posición 5 de la proteína C humana dio como resultado una proteína
que presentaba una afinidad similar por las membranas y titulaciones
de calcio similares, con una reducción de la actividad de
coagulación. La sustitución de una leucina por un resto fenilalanina
en la posición 5 del factor VII (que contenía las mutaciones
Q11E33) se llevó a cabo mediante los métodos descritos antes. El
producto, L5Q11E33, tuvo solamente 33% de la actividad del mutante
Q11E33 cuando se analizó mediante el método de competición con VIIa
con el sitio activo modificado (0-3,2 nM) descrito
antes. De este modo, se puede mejorar la actividad de la proteína S
mediante sustitución, por ejemplo, de un resto fenilalanina en la
posición 5. La sustitución de F5K en el también dio como resultado
una proteína con 33% de la actividad del Factor VII de tipo salvaje
cuando se analizó mediante el análisis competitivo descrito en el
Ejemplo 6. La afinidad de unión a la membrana del Factor IX puede
ser intensificada por una mutación K5E. La sustitución de P11Q en el
Factor VII tuvo un impacto positivo, mientras un cambio adicional
de Q11E (para hacer esta posición como la de la proteína Z), no
tuvo un impacto adicional, esto es P11Q y P11E fueron ambos mejores
que el tipo salvaje, pero no fueron mejores uno que otro. Por
consiguiente, el impacto de las sustituciones de los restos
individuales varía con la proteína. Sin embargo, las sustituciones
combinadas apropiadas elucidan la importancia universal de estos
restos.
Se produjo una molécula de factor VIIa mediante
los procedimientos esbozados antes. Este mutante contenía las
mutaciones Q11E33 y también contenía las mutaciones R29F y D34F
(Q11F29E33F34). Este mutante tenía una actividad 2,5 veces superior
a la del mutante Q11E33 solo cuando se analizó en el análisis de
competición descrito en el Ejemplo 6. De este modo, la combinación
correcta de restos aminoácido en los sitios importantes descritos,
es necesaria para maximizar la función de los grupos carboxilo
importantes en la proteína. La combinación óptima de estos sitios
puede incluir restos aniónicos así como neutros e hidrófobos.
La importancia de la posición 35 está indicada
por la modificación del mutante del Factor VII Q11E33F34 para
incluir adicionalmente A351. La actividad del mutante Q11E33F34I35
fue 60% la del mutante Q11E33F34 cuando se evaluó en el análisis
competitivo descrito en el Ejemplo 6. Se produjo otro mutante,
Q11E33I34F35 y desplegó una actividad similar a la del mutante
Q11E33F34I35. Estos resultados indican que no es deseable la
presencia de un grupo hidrófobo grande en la posición 35.
La estabilidad del mutante Q11E33F34 en el medio
de cultivo celular se redujo un 75% con respecto a la del mutante
Q11E33. La reducción de la estabilidad dio como resultado una
disminución del rendimiento del medio de cultivo. La pérdida de
estabilidad parecía proceder de la proteolisis. Se puede requerir la
modificación de la posición 35 a Gla para incrementar la
estabilidad de la proteína con la actividad más alta, ya que los
restos Gla evitan la proteolisis. La introducción de la mutación
A35E puede incrementar la estabilidad del mutante Q11E33F34.
La importancia de la posición 36 estaba indicada
por la adición de una mutación E36D al mutante del factor VII
Q11E33. El mutante resultante, Q11E33D36, tenía un 70% de la
actividad del mutante Q11E33 en el análisis competitivo descrito en
el Ejemplo 6.
Las modificaciones de las posiciones
34-36 parecían tener el mayor impacto sobre la
proteína C humana, donde la proteína de tipo salvaje contiene
N34V35D36. La introducción de F34X35E36, donde X es un aminoácido
resistente a la digestión proteolítica puede intensificar la
afinidad de unión a la membrana de la proteína C humana.
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Ejemplo
8
Inserción de Restos en el Aminoácido 4:
El factor VII que contenía un resto tirosina fue preparado por ATG
Laboratories, Inc. y analizado mediante el análisis de competición
descrito en el Ejemplo 6. El factor VII fue activado mediante
incubación con Innovin (20 ml) en calcio 5 mM. Las muestras que
contenían cantidades suficientes de Innovin para dar un tiempo de
coagulación mínimo de 28 segundos (aproximadamente 0,7 \mul)
fueron transferidas a tampón. Se añadió el plasma deficiente en
factor VII y se registraron los tiempos de coagulación. Se
analizaron las muestras en diversos momentos hasta que se alcanzó la
actividad máxima (normalmente \leq 30 min.). Se determinó la
cantidad de Factor VII en el medio acondicionado necesaria para
generar un tiempo de coagulación de 30 segundos. Esta razón de
medio/Innovin representa una primera razón 1:1 de factor
VIIa/Factor Tisular. Tras la activación, se diluyeron las muestras
de medio/Innovin suficientes para dar un tiempo de coagulación de
19 segundos (aproximadamente 4 \mul de Innovin) a 112,5 \mul con
tampón que contenía calcio y BSA (1 g/L). Se añadieron diversas
cantidades de factor VIIa con el sitio activo modificado
(DEGR-VIIa) y se dejaron incubando hasta que se
alcanzó el equilibrio; típicamente 60 minutos a 37ºC. Se añadió
plasma deficiente en factor VII humano (37,5 \mul) y se midieron
los tiempos de coagulación. Se compararon los resultados con
experimentos similares realizados con medio que contenía VIIa de
tipo salvaje. Basándose en los resultados del análisis de
desplazamiento competitivo, el factor VII humano que contenía un
resto tirosina en la posición 4 tenía una actividad dos veces
superior que una molécula de factor VIIa similar que carecía de
este resto.
La combinación de las mutaciones beneficiosas se
llevó a cabo para generar un mutante del factor VII, Q11E33F34 con
una Tirosina insertada en la posición 4. Este mutante mostró una
actividad 5 veces mayor que la del mutante Q11E33 del factor VII en
el análisis competitivo descrito antes. En resumen, este mutante
tiene una actividad 160 veces mayor que la del factor VIIa de tipo
salvaje en el análisis de competición descrito en el Ejemplo 6.
Este resultado demostró que los beneficios de los restos
individuales son aditivos cuando se presentan combinados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Anticoagulación de sangre humana por proteína
C activada (APC). Se utilizó el aparato Clot Signature Analyzer
(CSA) (Xylum Company, Scarsdale, N.Y.) para someter a ensayo la
eficacia relativa de APC de tipo salvaje frente al mutante
Q11G12E33D34. En un análisis, este aparato bombea sangre recién
recogida (<2 min), no tratada con anticoagulante a través de un
tubo que contiene una fibra que tiene una superficie de colágeno.
La presión del flujo de sangre (mm Hg) es similar a la del sistema
circulatorio. Las plaquetas de la sangre se unen al colágeno, se
activan y ayudan a la coagulación. El aparato detecta la presión en
la salida del tubo, como se muestra en la Figura 16. Tras la
formación del coágulo, la presión a la salida del tubo disminuye y
el punto medio de la reacción se describe como el tiempo de
"Formación del Trombo Inducido por Colágeno" (CITF). Sin
aditivos, el tiempo CITF para el sujeto humano fue de 5,0 minutos
(Figura 16A). El tiempo de fondo se resta del valor de la Figura 16
para obtener el CITF. Con APC de tipo salvaje 30 mM añadida a la
sangre, el tiempo CITF medio fue de 6,5 min (5 determinaciones) para
el mismo sujeto (Figura 16B). El tiempo CITF medio fue de 15,5 min
con la APC mutante (Q11G12E33D34) 6 nM, basándose en 5
determinaciones (Figura 16C), y fue de 9,5 min con 3 nM de la misma
APC mutante, basándose en 5 determinaciones. De este modo, la APC
mutante fue al menos 10 veces más eficaz que la APC de tipo salvaje
para la inhibición de la formación de coágulos en sangre humana
completa a una presión de flujo, utilizando membranas de plaquetas
humanas activadas como fuente de fosfolípidos. En un experimento
adicional, en el que se evaluó el CITF en un sujeto que había
ingerido dos aspirinas, se observó una diferencia incluso mayor
entre la APC mutante y la de tipo salvaje. La actividad de membrana
más baja se puede corresponder con un mayor impacto del mutante.
Este resultado difirió de la consecuencia de un
ensayo de coagulación in vitro utilizando el procedimiento
de análisis de inclinación manual, descrito antes en este documento.
Utilizando las condiciones normalizadas y los reactivos de total
intensidad para el ensayo APTT (materiales obtenidos de, y
procedimientos descritos por el fabricante Sigma Chemical Co., St.
Louis, Mo., 1998), la proteína mutante mostró una actividad
solamente 1,5 veces superior a la de la proteína de tipo salvaje.
El análisis APTT, sin embargo, contiene elevados niveles de
fosfolípido, una condición que minimiza la diferencia entre las
proteínas mutante y de tipo salvaje. Una vez más, estos resultados
indican que las condiciones del análisis son importantes en la
caracterización de las ventajas de las proteínas mutantes
producidas por esta invención y que la baja concentración de
fosfolípido es característica de la membrana biológica
proporcionada por las plaquetas.
Se sometió a ensayo el impacto de una proteína
procoagulante sobre la sangre de dos pacientes con hemofilia en el
CSA. El CITF para el primer paciente con hemofilia fue de 13,2
minutos y el coágulo fue inestable con continuas roturas (con
incrementos de la presión) similares a las mostradas para sangre
anticoagulada de la figura 6. En una segunda muestra, se añadió
factor VIIa de tipo salvaje 60 nM a la sangre antes del análisis.
Esta dosis se corresponde con los niveles terapéuticos. El tiempo
CITF (9,7 min) se acortó y el coágulo fue más estable. Una tercera
muestra utilizó factor VIIa Q11E33 60 nM. El tiempo CITF (3,7 min)
estuvo por debajo del intervalo para los individuos normales y el
coágulo fue estable. El segundo paciente con hemofilia produjo
respuestas similares.
El CSA representa un importante análisis puesto
que utiliza membranas biológicas para ayudar a la coagulación de la
sangre. También se sometió a ensayo otro análisis que utiliza
membranas biológicas. El análisis proporcionado por Hemochron Jr
Signature Whole Blood Microcoagulation System es una herramienta
común para someter a ensayo la coagulación en situaciones clínicas.
Se recoge sangre completa en un casete y se determina el tiempo para
alcanzar la coagulación. Utilizando este sistema, el mutante
Q11G12E33D34 de la proteína C activada fue de 5 a 10 veces más
activo que la proteína C activada humana de tipo salvaje. Esta
actividad refleja la ventaja del mutante en muchos otros
análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Estado de Carboxilación de Polipéptidos
Modificados: Se evaluó la carboxilación del dominio GLA de los
polipéptidos dependientes de vitamina K mediante espectrometría de
Masas MALDI-TOF después de la liberación del
dominio GLA de la proteína intacta mediante digestión suave con
quimotripsina (1:500, proteasa:proteína sustrato, pH 7,5 a 37ºC
durante 3 horas). La quimotripsina escinde preferentemente en torno
a los restos 40-45 de las proteínas dependientes de
vitamina K, liberando los dominios GLA que pueden ser aislados para
su estudio. Se eliminaron las sales de los péptidos mediante
adsorción sobre un gel de fase inversa C18 y elución con
acetonitrilo al 75% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Se utilizó
ácido
2-hidroxi-5-metoxibenzoico
como matriz. Este análisis demostró que el factor VIIa recombinante
de tipo salvaje (NOVO Nordisk) tenía un resto Gla menos de lo
esperado. El producto principal formado a partir de la digestión con
quimotripsina fue el péptido 1-40, que proporcionó
un ión M+1 de 5145,6 unidades de masa, aproximadamente un grupo
carboxilo (44 unidades de masa) menos que el valor teórico para el
péptido 1-40 completamente carboxilado (teórico =
5190,4 unidades de masa). El factor VIIa derivado de plasma fue
adquirido de Enzyme Research Laboratories. El ión M+1 para el
péptido 1-40 tenía 5189,8 unidades de masa, igual al
dominio Gla completamente carboxilado. Se observó un segundo ión
para el producto VIIa recombinante de NOVO correspondiente a los
restos 1-32. El ión M+1 para este péptido tenía
4184,6 unidades de masa, igual al valor teórico para el péptido
1-32 completamente carboxilado (teórico = 4185,3
unidades de masa). De este modo, el factor VIIa de tipo salvaje
recombinante está seriamente infracarboxilado, con casi toda de
ésta expresada en la posición 36. En contraste con este resultado,
el mutante Q11E33 del factor VII dio iones M+1 de 5312,8 y 5269,0
en una abundancia aproximadamente igual. El M+1 para este péptido
completamente carboxilado es de 5311,4. El segundo pico corresponde
a un péptido con un grupo carboxilo menos (~44 unidades de masa).
Este resultado demuestra que la incorporación de las mutaciones
Q11E33 producía un dominio Gla completamente carboxilado tras la
producción en el cultivo de tejidos. Una ventaja del mutante Q11E33
puede surgir de la carboxilación más completa de la posición 36. En
resumen, la producción de proteína con un dominio Gla óptimo supone
la selección de restos que facilitan la completa carboxilación en
el cultivo de tejidos. La selección apropiada de los restos en las
posiciones 33-36 parece importante en este
aspecto.
Se debe entender que si bien la invención ha
sido descrita junto con la descripción detallada de la misma, la
descripción precedente está destinada a ilustrar y no a limitar el
alcance de la invención, que se define por el alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
Claims (23)
1. Un polipéptido del Factor VIIa que comprende
un dominio GLA modificado que aumenta la afinidad de unión a la
membrana de dicho polipéptido con respecto al correspondiente
polipéptido del Factor VIIa nativo, comprendiendo dicho dominio GLA
modificado:
una inserción de aminoácido en la posición
4;
donde las posiciones de los
aminoácidos del polipéptido del Factor VIIa se numeran de acuerdo
con el Factor
IX.
2. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1, donde un resto tirosina es insertado en el
aminoácido 4.
3. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dicho dominio GLA
modificado comprende adicionalmente la sustitución de un resto
aminoácido hidrófobo o un resto ácido glutámico en el aminoácido
35.
4. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 3, donde el resto aminoácido hidrófobo es un resto
fenilalanina, leucina o isoleucina.
5. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, donde dicho dominio GLA modificado
comprende adicionalmente una sustitución de un aminoácido en el
aminoácido 11.
6. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 5, donde un resto glutamina, ácido glutámico, ácido
aspártico, o asparagina es sustituido en el aminoácido 11.
7. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 6, donde un resto glutamina es sustituido en el
aminoácido
11.
11.
8. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, donde dicho dominio GLA modificado
comprende adicionalmente una sustitución de un aminoácido en el
aminoácido 33.
9. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 8, donde un resto ácido glutámico es sustituido en el
aminoácido 33.
10. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, donde dicho dominio GLA
modificado comprende adicionalmente una sustitución de un aminoácido
en el aminoácido 34.
11. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 10, donde un resto hidrófobo es sustituido en el
aminoácido 34.
12. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 11, donde un resto fenilalanina, leucina o isoleucina
es sustituido en el aminoácido 34.
13. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 12, donde un resto fenilalanina es sustituido en el
aminoácido 34.
14. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, donde dicho dominio GLA
modificado comprende adicionalmente una sustitución de un aminoácido
en el aminoácido 29.
15. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 14, donde un resto fenilalanina o ácido glutámico es
sustituido en el aminoácido 29.
16. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 15, donde un resto fenilalanina es sustituido en el
aminoácido 29.
17. Una molécula de ácido nucleico aislada,
comprendiendo dicha molécula una secuencia de ácido nucleico que
codifica el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-16.
18. Un vector de expresión que comprende la
secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 17.
19. Una célula anfitriona de mamífero que
comprende el vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación
18.
18.
20. Una composición farmacéutica que comprende
un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-16 y un portador farmacéuticamente aceptable.
\newpage
21. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1-16 para su uso como
medicamento.
22. El uso de un polipéptido de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para la
fabricación de un medicamento pro-coagulante para
el tratamiento de los trastornos de la coagulación.
23. El uso de un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 22, donde dicho trastorno de la coagulación es la
hemofilia A, la hemofilia B o una enfermedad del hígado.
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